CA2182118A1 - Composition contenant des acides nucleiques, preparation et utilisations - Google Patents

Composition contenant des acides nucleiques, preparation et utilisations

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CA2182118A1 CA002182118A CA2182118A CA2182118A1 CA 2182118 A1 CA2182118 A1 CA 2182118A1 CA 002182118 A CA002182118 A CA 002182118A CA 2182118 A CA2182118 A CA 2182118A CA 2182118 A1 CA2182118 A1 CA 2182118A1
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acids
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Abstract

La présente invention concerne des compositions comprenant des acides nucléiques et des oligopeptides cationiques capables de former des structures secondaires, et leur utilisation en thérapeutique et en thérapie génique, notamment pour le transfert d'acides nucléiques dans les cellules.

Description

WO9SI21931 21821 18 PcrlFRss/00098 COMPOSITION CONTENANT DES ACIDES NUCLEIOUES.
PREPA RATION ET UTILISATIONS
La présente invention co~lre~ne des composilions à base d'acides nucléiques, leur pl~p&t.lion et leur utili~ti~n- Plus particulièr~ , elle con~ des S oo~ )oc;~ co,llpr~nan~ des acides n.)rli ql.~ et des oligope~ s et leur uhliQstion en thérapie génique, nol~n~ e~ pour le ~ ell d'acides n~J~lo~;q,;F ~, La thérapie génique co~lc~l~ à corriger une d~rir~ e ou une s~l~n~Iite (mut~tion~ e~p~ssion ~be~ e, etc) par illtlod.J~-l;on d'une ,,,ro~ n 6_.léLque dans la cellule ou l'organe affecté. Cette inf(Ym~tion ,~PnPti~ e peut être in~roduite soit 10 in vitro dans une cellule ex~raite de l'organe, la cellule m~ifie étant alo~ ule dans raganisme, soit d;~ in vivo dans le tissu app~pie. ~ff~es ~cl~q~s ont été ~-;t~S pour le ~ l de cette infm~ g~nétique, parmi lesquelles des tecl~qu~s divel~s de h~f~io~ pl;~ 1 des oomplexes d'ADN et de DEAE-dextran (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), d'ADN et de pl~t;~es n~lcléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), d'ADN et de lipides (Felgner et aL, PNAS 84 (1987) 7413), l'emploi de l;~oss~ s (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431), etc. Plus récemment, l'emploi de virus comme v~u~ pour le lla.~re,l de gènes est apparu comme une ah~ tive p~ellæ~ce à ces techniques pl~ ;qu~s de transfection. A cet égard, dirr~ virus ont été testés pour leur c~ae;l~ à ~f~r 20 c~ines populationc c~ ires. En particulier, les l~h~ s (RSV, HMS, MMS, etc), le vi~us HSV, les vinus adéno ~ s et lec adc ,o.~us.
To.lterois, les becl~iq~les d~ Qppé~s jusqu'à pr~sent ne ~ pas de ~oud.~ de .,lanlcle ~qt;~A ~ .te les ~ liées au ~ de gènes dans les oellules etlou l~ n:c ~ e En particulier, les problèmes liés à la p~n.'l~ de l'acide 25 n.~ q~ dans les oellules ne sont pas e~ solus. En e~fet, la nature PO1~A~ n~qUe des acides n ~ U~ p,~ leur passage à traver.s les ...r!..~k~ F~
i~s S'il a été montré que les acides ~ u~ nus sont capables de llav~r la membrane plasmique ex vivo (voir ~.olA~ ?nt la de..~ e n WO90/11092), rerGcacil~ de t ~- sr~ion reste assez faible. De plus, les acides n..~le;1.)e nus ont une 30 demi-vie p~ ti~lue courte, en raison de leur dégradation par les e~ s et de leur éli,)~inalion par les voies ~"~ai,es. Par ailleurs, si les virus reGomhin~nt~ p~me~ nt d'améliorer l'efficacite de ~ srell des acides nucle;ques, leur emploi pl~lte ce.~;ns wo gsl2lg3l ~21 8~ 1 ~ 8 ~ lir~S/00098 risques tels que la pathogénicité, la transmission, la réplication, la recombinaison, la transformation, etc.
La présente invention apporte une soll~ticn av~nt~çuse à ces dir~le,l~
problèmes. La ~e...An~,resse a en effet montré qu'il est possible de former des paires 5 d'ions entre des oligopep~ ~ c-At~oniques pA~ iP~ et les g,o .~ .--~.~ pl-os~k~les des acides nucléiques, et que les complexes ainsi formés sont stables, et sont ca~Abl~
de pené~.er les cellules ou d'être ~A~ S dans des v~,, de 1~l tels que des liposomes, des nAnop~ Lcules ou des lipol~lGte;nes de faible densité (LDL) avec des rendements élevés.
Un pl~ iCI' objet de l',-,~w~Lon réside donc dans une c~ pos;~;on c~ nan~
un acide n.,cle.q.~e et un oligopey1;~le r~ n ~u~ capable de former des stmctures sea~n~A;~es. Le tenne ;~l~u ,~e S~D~ d~signe les pc~ f s capables d'adopter une conro"ndlion spp~c:zle p~Lcul;w~, dans des c~ ihl~ ph~ ~s, par oppQs;l;~n aux peptides ne pl~ .~ pas d'o~g~n;YI;on paLLcl~li~e de leur ~h~e pfima~æ La 15 structure secondai,e peut apparaitre soit dans ce~lains s~lv~lt~, soit en sol-~hon aqueuse, soit après complexation avec l'acide nucléique.
Plus particulièrement, les oligo~e~tides utilisés dans le cadre de rinvention sont capables de former des hélices a ou des feuillets ~.

La cornp~ ~tion d'un acide n..~l~;q~le avec une p~lylrsln~ a d~à été décrite 20 dans l'art &llt~;cur. c~ qrlc ~ le taux de complexation et la s~ ~ du ~ntrl~xe formé avec la polyl~ine sont relati~ l faibles, et ces complexes ne pe~lvenl être enc~rJslJIés dans des ve~ de l,~reft de façon ~t;~ te (voir exemples). Au conllaile, les ~.~ ~ selon l'invention, qui ;~n~l;q"e.~1 des c~ ,n~ ~ c~ioniq~les c~p~bles de former des :,h~ C~ 9;~ ~élices a, ~-;11~ ~) p~entent une 25 st~bilité élevée, pe..~el~L être obtenus avec des le~ e~--F h~ plocl es de 100%, et sont c~pablF~ d'être ellcar~ 5 avec des ~ e ~ t~ élevés dans des v~;i de h~s~e~L.
Ces complexes con~;~uenl donc des outils particulie,c.,lenl avarta~Y pour le transfert d'acides ntlclF.;ques dans les c~lhll~os~ Par ~ F..~S, selon la nature du vecteur de transfert utilisé, les cG~I~positions de l'inv~ltic.n peuvt:~lt être ~li~c sur des 30 cellules extraites de l'o.~-~ --e (ex vivo) en vue de leur rea(1~ `h aLOn, OU directement in vivo.

2l 821 1 8 WO 9S121931 P~, l/r~5S/00098 Plus particulièrement, les oligopeptides utilisés dans le c,adre de la présente invention répondent à la forrnulé (AOAyAyAO)n ou (AOAyAOAy)n dans laquelle Ao est un acide aminé hycl~ophobe, Ay est un acide arniné llyd~pllile~ et n est un nombre entier supérieur ou égal à 4. La clem~n~leresse a en effet montré que de tels 5 oligopel~tides sont c~rables, une fois complexés aux acides nuclc;q. es, de former des s~uctures s~n~ s qui st~ki~ nt f~ t lesdits complexes.
Plus plérélen~;ellement~ l'acide aminé hyd~v~hol~e est c~oisi parmi la l~t~cine,la valine, l'icclet:cine et la pl~,~ nine; et l'acide aminé l,~o~hile est choisi parmi la Iysine, I'a~inine et l~hi~
La cApac;l~ des o~ ;dPs à former des structures s~4n~lD;~t s peut être vérifiée par dicll,o.s",e c..c~ .e ou en RMN, comme indiqué dans les exemples.
~ ncore~pltlsp;f~h~dl~ ..Pn~ ro~ ;dr,~sel~-l'~t;a~ est-dloisi parmi les oligopepl;d~ de fo,ll.llle (LKKL)n, (IXIK)n, (LRRL)n, dans lesquelles n est défini comme p,ecécle~....~e ~1 D'une ,l1anie1~ générale, dans les o~ opeptid~Ps de l'invention, n peut varier entre 4 et 100, de p1efSence entre 10 et 50. La valeur de n est adaptée par 1 no.~ P du métier en fonction de la longueur et de la nature de l'acide nucléique, de la composition de l'oligopeptide, de l'uti1i.c~tion recl erel,ée, etc.
Pour obtenir un effet op~ .. dec c~ de l~..~;a~, les 20 p~xillions especlives de r~ e et de racide ~-Jrl~-l-,e ~cont de p~ oe ~le~m;n~s de sorte que le rappont clurgec posiliv~s de rolig~ e / cl~arges neg~iv~s de l'acide mlrlpiqtle soit égal ou 5ul~ à 1 (ce rapport ect ~Pci~ R dans les ~Y.eTnrl~s). Ainci, pluc racide ~vc~ P est long, plus le nnm~e de ~ g~s posilives apporté par l'o1i~,ope~t;-1e doit être élevé pour obtenir un effet .~
25 Ceci peut se traduire soit par l`uti~ >n d'o~ o~ Ps dans l~ fl~ la valeur de n est plus élevée, soit par l'utili~ti~)n de qu~ ;lés plus élevées d'~ ,opep1;~es, soit encore par les deux.
Les oligopeptides utilisés dans le cadre de la pl~s~lle irlv~.lion peu~ t être préparés par toute technique connue de l'homme du métier. P~i:~e~ mf~nt ils sont30 sy1ll},e~isés par voie chimique, au moyen d'un srth~-ti~ r de pepti~les~ en l)tili~nt tout type de chimie connue de l'homme du métier (F-moc, T-boc, etc). Lorsque les valeurs wogsnlg3l 21 821 18 l~lir~100098 de n sont élevées, il est par ailleurs possible de synthétiser les oligopeptides en plusieurs- fra~ment.c qui sont ensuite assemblés. Par ailleurs, selon la technique de synthèse utilisée (par exemple en phase homogène), l'oligopeptide obtenu peut être non pas un cGmyosé défini, mais un rrpl~nge d'oligopey~ides ayant des longueurs 5 dirré,~ es ce.~es autour d'une ~ ,nne. Dans ce cas, la valeur de n de la formule de r~lv~llion ~ s~,l~ Ia Illoyel~ne des valeurs des n des dirr~ con~ c du m~1~nE,ç, Des m~.th~Ps de ~l~lhese a~)p~pnées sont ~IQnnPPs dans les lechniq~es générales de biologie moléc~ ire et dans les exçmrles Au sens de la p,~sc~le invention, le terme acide nudéique co",~rend aussi 10 bien les acide-c désoxyribol-uclP;1ues que les scides ribon~ lPiques. Il peut s'agir de sequellces d'origine naturelle ou artificie1le~ et n~A~ .nl d'ADN génomique, d'ADNc, d'ARNm, d'ARNt, d'ARNr, de si~.,e!~cP-c hybrides ou de seq~e.;~c ~ es acides~ qv~~ être d'o~ g~ne h~ ne~ animale, végi;tale, bzc~énenne, virale, etc. Ils peuvenl être obt~pnl~c par toute 15 technique connue de l'hornme du métier, et nol~n~ nt par cribls(~P de bsnques, par synthèse chimique, ou encore par des métho~es mixtes ;nc~ nt la modification chimique ou el1~ll,aliqe de séquences obtenues par criblage de banques. Ils peuvent par ailleurs être incol~oles dans des vecteurs, tels que des væleuls p1~cmirliques.
C~ n~ n~ plus particulid~e,nenl les acides déso~libom~cl~iques, ils peuvent 20 être simple ou double brirL Ces acides désoAylibcn.r1e;qll~Pc peuvt:lll porter des gènes 11~ al~, l;ques, des ~qunces r~ ~i~c de la ~ ;plion, des sequences ~ PQC, des régions de liaison à d~tlcs con.l~ cçIIl.l~ires, etc.
Au sens de ri.lvt:lllion, on entend par gène the~ l;que noI~ I tout gène codant pour une ou des pl~t~l~ (ou peptide ou pol~p1;~le) ayant une activité
25 phal n acol~ peut slagir ~ nl~, d'h~ o~ c, de f~t~ .c de c~ , de lymphokines, d`~ ;~plolé;~c~ etc. Par sequence A.~ c, on entend toute s~llP~nGe c~r~ble di,e~1e~.~en1 ou i,~d;.~..e~l (après ll~nsc.;ption en ARN) de réduire lec niveaux d'e~lcssion d'une protéine désirée, voire de les suppri-l.er (EP 140 308). Les antisens co~ ~nnent é~leme~t les séquences codant pour des ribozymes, qui sont 30 capables de détruire sélecLive.~.enl des ARN cibles (EP 321 201).
Concern~nt plus particuliel~.,.en~ les acides ribcn~ leiquec (ARN), il peut s'agir d'ARN ~nticenc, capables de bloquer au moins partiell~m~nt la traduction d'ARNm cibles (ce~ ires~ viraux, bactériens, etc); ou également de ribo~~ s ou wo gsnlg3l 2 1 8Z 1 1 8 r~/r~S/00098 -d'acides nucléiques capables de se lier à un autre acide nucléique par formation d'une triple hélice.
Les compo~ition.~ selon l'invention peuvent être utilisés in vitro, ex vivo ou in vivo. In vitro, elles peuv~ pe~ Le de lL~u~é~ à des lignées ~~ res des 5 seqw~nces d'acides nuc~ tl~s dé~LL~es, par exemple dans le but ~-pr;.~f,r une pl~3teine recombinante ou une activité ~nl;~n~, Ou dans le but ~l'iL~ une P~O~LI~, par fi~tion de ladite ploleine sur l'acide nucle;que. Ex vivo, elles p~U~_~lt ~être utilisés pour le tl~-~rell lll~apeulique d'un acide n~ eilue dans une oellule issue d'un o ~,ai~isllle, en vue de con~elel à ladite cellule des propriétés nouvelles ou ~ ror~s, 10 avant sa l;~A~l~;n;.~1~alion à un ol~-~;~.ne In vivo, elles p~L-c~lt être utilisés pour ll&dlll;n;~llation directe d'acide n.lcl~iq.le.
Un autre objet de r ~ side donc dans l~lisa~ un ~ e c~tioni-lue capable de former des ~hu~uLes S~COn~lA;~,S pour le h~3f~l d'acides nUclpiques dans les ~~ lp~s Comme indiqué plus haut, ce llarL~rcll peut être ~r~t.
1~ in vitro, ex vivo ou in vivo.
Les compositions selon l'invention peuvent permettre de llcu~re~er des acides nucléiques dans des types variés de c~ le~ F~t:rél~ ;PllPmPnt~ il s'agit de oellules animales, de p,éfélence h...l~;ne Il peut s'agir no~ F ~-1 de oellules he,l,zlopoiétiques, endothPli~lP~s~ Ir.~obl~tiques, etc. Par ~ille~ il peut s'agir aussi 20 bien de oellules saines que de oellules ~rræt~es par des ~ C-t~nr~F~ ulleu~, Ln~e.,tion virale, etc).
L'invention cQnCprne ~lprnen~ un procédé pour le lla.~Çc~l d'un acide nucléique dans une cellule c&.-c~dce en ce que l'on cultive hdit~e cellule en ~sence de l'acide nucléique et d'un Oligo~Jeptide c~tionique c?p~e de former des ~ ct~es 25 s~d~; cs.
Par ~ille~, les complexes acide nucléique-oli~yt;Ae de la ~senle ~velllion pe-l"~u~"l é~le~n~ont re~ ,s~ ti~n des acides ~ F q~.~s dans des vecle~
de t~als~ll avec des ~,.-de...~-lt~i cc~n~ erabletn~nt améliorés. Pour A;~ uçr les problèrnes de st~bilité et de pénétration dans les ~l~ s~ les acides n~e~l~;qllles peuvenl 30 en effet été associés à des kanspo-leurs ou à des ve~;~eul~ de ..~ 1 ap~lu~,;es.
L'Pnc~rs~ tion des acides nudéiques dans de tels vecteurs de ~ sr~l permet de les protéger des nucléases sériques, de faciliter leur pénétration dans les ce~ p~ où se trouve leur cible pharmacologique, et de ralentir leur P~ ;O~- Tou~fols, la W09S/21931 2 1 ~2 t 18 ~ /r~9S100098 difficulté majeure limitant l'utilisation de ces vecteurs réside dans les faibles rendements d'encapsulation des acides nucléiques. La ~m~n~eresse a maintenant montré que les complexes acide nucléique-oligopeptides de l'invention peuvent être ~n~rsu1~s dans des vecteurs de t~YLnsr~L~ avec des I~nd~lnentc élevés. Plus S particulièrement, les r~,ncle...e~ d~e-n~ s~ tio~ des co.n~ ~ de rinve~Iti~n dans des n~nopz. Iicules sont supérie1~ à 50'3'o, alors qu'ils sont ilïf~if~L~ à 1% avec des acides nucléiques nus, ou avec d'autres oligopept;dP~ ne fo~ dl~l pas de ~h Lc~ e se~ ires (Cf exemples).
Un autre objet de l'invention réside donc dans l'~ti1i~ticn d'un oligopeptide 10 cationique capable de former des ~ILUCtUI~S S~Ql~tlz;~s pour rP~c~r s~ tion d'acides nucléiques dans un vecteur de ~allsr~-L
L'invention a e~ PmP~n~ pour ob~et les V~t~,~L;~ de ~ansfert d'acides nucléique colllpLèndnl une co-"~silion tel1e que défînie ci-avant.
Parmi les dirré~"~s v~ euLs de ILal~re,I, on préfère utiliser dans le cadre de 15 la présente invention des vecteurs biocc,..pal;b1~Ps, biodégrac~b1o~s, hydrophobes et de nature protéique ou polymérique. En particulier, les Vel.,~UL~ p~éféLes selon rinvention sont les liposomes, les nanoparticules ou les lipop~ines de faible densité (LDL).
Les lipl~sornes sont des vésicules rho~ho1ipidiques comportant une phase a4ue~se interne dans laquelle les acides ~-,c~ f~ pe~ t être ~-n~apsll1~. La 20 synthèse de liposc,n,es et leur utilisation pour le h~.S~L~ d'acides n~ ~ estconnue dans l'art antérieur (W091/06309, W092119752, W092119730). L'utilis~tion de complexes selon l'invention permet d'~ èr l~rfil~a~ d~e~l~aps~Jlation des acides nucléiques dans les li~sc ...~_, Les nanoparticules sont des par~icules de petite ~ n, g~,nP.~1PmPnt 25 inférieure à 500 nm, capables de ~ ~ ou de ~lo~ un ~;~c;l e actif (tel qu'un acide nucléique) dans les cellules ou dans la circu1~ti-~n sanguine. La plt sen~e u~venIion permet e~ rnPnt d'améliorer ~n~;dpra~lement les rPml~m~nt~
d'çncapsl-lation d'acides nucléiques dans des n~n~p~ lic~les~ éI~.LiP-ll~-ment, les nanoparticules selon l'invention sont cor~ ~s par des polrllleI~s comportant une30 majorité de motifs dégradables tels que racide polylactique, éventl.Pllçrnentcopolymérisé à du polyéthylène glycol. D'autres poly~l.èIes uti~ es dans la 218~1 ~8 WO 9~/21931 1 .,lir~5S/00098 réalisation de nanoparticules ont été décrits dans l'art antérieur (voir par exemple EP 275 796; EP 520 889). - :
L'invention conce,l,e donc é~alçm~nt un procédé d'em~rs~JlAtion d'acides nucléiques dans des vecteurs de II~L~el~ selon lequel on met en contact le vecteur de 5 ll~ulsrc.l ou les co~-~pos~nl~ le con~ ..l racide ~ el~q-,e et un oli~npeptidecAtionique capable de former des ;~huctuLes ~n~A;~s, ou ;.~n~ .m~nt ~m co...l le ~e acide nucléique - oligope~t;~le déjà formé, dans des c1~nrlition~ p~rrnett~nt l'enc~l s--1~1;o~ de l'acide nudéique dans ledit vecteur de l.~r~Ll, puis on n~cupère le vè-CtèUI de llalLsrell formé. Comme indiqué plus haut, le procédé selon llinvention est 10 plèté~nl;~llernent appliqué pour la plép~dl;on de l;p~ s, de nanoparticules ou de lipop~lé,nes de faible densité
L~ tion o;~n~ lPm~nt des c~ rh~rnA~euti~lues co,npnE"~II un acide n~ ;que t~-Al~;que et un oligo~Lde c~tirmique capable de former des structures s~on~ es, éventuellement en~ r~ s dans un vecteur de tLa~
La présente invention sera plus complet~....onl décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent êt~e con~i~fi.rés comme illustratifs et non limitatif~
Exemple 1: Préparation des olieopeptides Les trois ol~ )pep1;~l~s SuiValllS ont été synlh~l;~s 20 1.1. -(H)-(~uci~e-Lysine-Lysine-Leucine)lo-(OH) ou (LKKL)lo~
Cet oli~,ope~t;d~ a été sy~ é sous forme de sel d'acide ~;tli~G,~0~.~1;que au moyen d'un b,~ ;Se ~ de pepti~ Applied Bi~sy~ l 431A, sur une résine HMP (Applied Bio~ l) et selon une ~ .g;e F-MOC. Après la ~Il~l~, le peptide a été libéré de la resine par t.~;~e...~.~1 90 ...;~ ~ en p~sence d'une sc.l~;on TFA/eau 95/5 (v/v), 25 PLCe;P;Ié par atl~lition d'ether ~LL;obulyl.l.é~llyl;q,le, pl~is purifié par HPLC phase inverse sur colonne C18 100 A (Biorad RSL). La pureté du peptide obtenu est supérieure à 95 % et sa solubilité dans l'eau de 50 mg/ml. Il a été montré que le poly~ pepLide LKKL, non structuré dans l'eau, adopte une c~l~o~mation en hélice oc en solution saline. Cette conformation devrait améliorer la st~hilhe du complexe par 30 formation de paires d'ions entre les charges positives des ly~;ines de l'oligopeptide et les phosphat.os ionisés à pH physiologique de l'acide nucléique.

WO 95/21931 I ~, llrl~5S/00098 ~.2. -(H)-(Leucine-Lysine-Leucine-Lysine)lo-(OH) ou (LKLK)1o Cet oligopeptide a été synthétisé sous forme de sel d'acide trifluo~oacétique en suivant le protocole décrit ci-dessus. La pureté du peptide obtenu est supérieure à 90% et sa soll~bilité dans l'eau de 100 mg/ml. Il a été montré que le polylét Apept;~lP L~LK, non S structuré dans l'eau, adopte une cal~o~ ;on en feuillets 13 en sollltil n saline ou en ~lesence d'acides n~lcléiques, en raison de l'int~çti~m entre phosl~h~tes et gl~oupe~ nt~ aminés. Le long d'un feuillet 13- la ~ e séf~ 2 .-hAr~3~es positives est de 6,9 A, ce qui est oo...l~al;ble avec les 6,2 A sépa.anl 2 glo..~...~ ; phQSFh~te d'un acide nucléique simple brin. Cette conforrn~liQn devrait donc ~meli~rer la stabilité
10 du complexe.
1.3. -(H)-tProline-T,ysine-Ly.sine-T P~ine)lo-(OH) ou (PKIC~
Ce peptide (fourni par A. Brack, Centre de Biophysique M~'é^~laire~ Otiéans) n'est pas stmcturé en solutio~ saline et a été utilisé comme controle.
1.4. Polylysine.
15 La polylysine utilisée est d'origine commerciale. Ce peptide n'est pas stmcturé en solution saline et a été utilisé comme controle.
Exen~ple 2: Acid~c mlcléi~u~ utilic~
2.1. Acides nucléiq~Jes ~lise~s anti-ras Vall2 Des acides n cle;ques a~l;~n.~ anti ras ont été pr~pa,c s. Ces acides l~uct~ q.,~s sont des 20 oli~onucleoticles de 12 et 13 n~ s clus, s~.~ 5tises par la société Eurogentec (Belgique).
Ces oli~nucléotide~s sont dirigés contre une séquence de rARNm de ras muté au niveau du ~ .e codon. Les acides - ~rl~ qU~ utilisés sont r~ (AS-Val), son inverse (INV-Val: la s~quc~ce est ide.l~ique mais or~ntée dans le sens inverse), ainsi que r~ ns de l'ARNm ras nonnal (AS-Gly) et qu'un acide m~ )e témoin 25 comportant 2 nucléotides non arp~ri~s au rnilieu de la séquence (A~mut2). La séquences de ces acides nucléiques est la suivante:
3'-CGCGGCAGCCAC-5' (AS-Val12) 3'- GCGGCAGCCACAC-5' (AS-Val13) 3'-CACCGACGGCGC-5' (INV-Val12) W09S~1931 ~18~1 18 P~ A9s~o~M~

3'-CACACCGACGGCG-5' (INV-Val13) 3'-CGCGGCCGCCAC-5' (AS-Gly12) 3'-CGCCGGAGCCAC-5' AS-mut212) 2.2. Acide nucléi~ue (d(Tp)lST) 5 L'acide mlrlP;1ue (d(Tp)15T) est co...l osé de 16 lh,~ ;"es. n est d'origine co....Y.~;ale (Ph&."acia).
FYemple 3: ~t~-de de comDlexation Cet ~e~l ple illustre la forrnation de comrleYes entre les acides n~lrle;lu~ ~ ~I;~ns décrits dans l~e~e~ J1e 2 et les oligope~ Ps décrits dans i'exemple 1, dans dirrc~entes 10 condh;~ de fo~ce iot~ique et de ccn~ nl;~ (toutes les ~ ~i en acides ;q ~ sont ~ ; ..~s en ~ te). n montre que des rer 1~ ~ de compl~P~tion très élevés peuve,lt être obte-~,s, t~mo~ nt ainsi de la s~hlité des complexes.
3.1. Complexation en tampon phosphate L'acide nucléique (10-4 M exprimé en phosph~te: Cp~osph~te = 12 X Cacide nucléique) et l'oligopeptide (concentration variant entre 2.10-3, 104 et 2.10-5 e~r~ ;n~ en charges posilives) ont été mis en contact d~ms un t~ ~n rhosE!h~9~te 50 mM pH 7,4. La sollltion a ensuite été cen~ugée, et r~ ~ (A) à 256 ~n (Ill&~lllIUIII d absolption des acides nucléiques) ~ n~;n~e dans le i"~ 9~ PoUI
20 chaque valeur du rapport R (Nombre de charges posiliv~s de l'~ e / Nombre de cha~es négatives de l'acide nucle;que) testée, la valeur A/A0 est d~lÇ~ ;n~.
permettant d'évaluer la fraction d'acide nu~l~iqlle libre et, par dirrw~oe, la f~ction complexée. Pour un rapport R = 1, la conc~flhalion en oli~ cle P l~;-,~ en lysine est donc de 10-4 M.
25 Les résultats obtenus montrent que la ~ on de complexe p~ nl AS
Val13/LKKL1o ou INV-Vall3/LKKLlo est de 85 ~ pour un lappci~l R = 2. Pour un rapport R = 1, la fraction de complexe pl~;p;l~nl AS-Vall3/L~ClK10 et INV-Vall3/LKLK10 est inférieure: 30 %. Ces résultats peuvent s'expliquer par une compétition entre les phosphates du tampon et les phosph~tes de l'acide nucléique 30 pour la formation du complexe. Ces résultats sont cependant sup~rie~lris à ceux .

wogsnlg3l 2 18 21 18 1 1/r~S100098 obtenus avec l'oligopeptide controle: 15 ~o de complexe INV-Vall3/PKKL10 précipitant seulement.
3.2. Complexation en tampon Tris-HCI
L'acide nucléique (10-4 M) et l'. Ii~ -peptide (collr~ at;on varriable) ont été m~s en 5 contact dans un tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,4. La ,co~ o~ a ensuite (été
cenl~itugée, et l'al)so,Lance à 256 nm ~ e~ ée dans le s~nag~o~nt Pour chaque valeur du rapport R testée, la valeur A/A0 est ~ ee comme pl~cle~ nt Les résultats obtenus ,nonllenl que la fraction de complexe p~;; ;p;t~..t AS
Vall3/LKKL10 et AS-Vall3~KLK10 est de 100 % pour un la~poLI R - 1. Pour un rapport R - 2, la fraction de complexe pf~clpi~ll AS-Vall3/L~C10 est é.~1PmPnt de 100%. Par ailleurs, 100% de complexe p.~ Asvpll3~ o ont é~l~ment été obten~Jc avec une c~ns~ ;on d'acide nucl~ q,~ de 2.1~5 M et un rapport R = 1.
En revanche, en ce qui conc~orne le ~ r l"xf~ AS-Vall3/PKKL10, s~l~mP!nt 70 % des 15 acides nucléiques impliqués dans le CO~ æ p~c;pile ce qui ~ ..l.e que l`alt~i~
des oligopeptides selon l'invention est supérieure.
3.3. Complexation dans l'eau Le protocole ci-dessus a été répété en rernp~ nt le tampon TnsMCl par de realL Les mêmes r~ t~ ont été obte-m~s (100 % de complexation pour R = 1), de-l~o 20 l'att;ni~ élevée des o~ >epti~les de l'in~ lion pour les acides n.lcl~iquas.
3.4 Conclusions L'en!;emb'e de ces reSu1tat~ d~ he le ~n~ levé de complexa~ des o~ vtide~s de l'illve~ltion aux acides nllcl~;ques, et le fait que ce ,~de~ est in(li~penfl~nt de la sequence et de la c~n~ ;o~l de l'acide norl~;~e u~ilis~ Par25 ~ille ~s, comme le montre le tableau ci-après, l'étude des specl.~s dichro~ques a permis de co,ltilll,er les structures se~on~ s adoptées par les oligopepLdes cd1;on;ques utilisés, en solution ou après complexation.

WO 9St21931 2 ~ ~ 2 1 ~ 8 P~ir~/ooog8 PeptideTam~)on Pho~)hale ~ampon Phosphate Eau Eau/ acide 50mM 50mM / NaCI 0 2M nucléique LKKL hélice a hélice anon :jlLuClu~e hélice ~x LKlK feuillet 13 feuillet 13 non b1.1U~IUi~ feuillet 13 PKKL non structuré non structuré non ~ uc~uie non ~1~uClulè

F~ le 4: Fh-~le de l-'en-~pc.-~ffon danc un V~'-t~'` de ~cfert: l~c nanoparticulec.
Cet e~cemple illustre les p~pn~t~s très av~ntflgp"~d des c~mplexes de rinvention, pe~ n~ nl l'~.nr~p~ tion d'acide ~ q, e ~s des ~_~,~s de ll.~r~l avec des 5 lG~de~l-e~ j très élevés.
4.~. Nanopa,licules utilisées: Les nanopa~lic-ules uti~ s dans cet ~ -P.~ple sont des copoly,nè,~s dibloc constituées d'un poly (D,L acide lactique) lié par une liaison ester à un poly (éthylène glycol): PLAp(M)-PEG(N) où M et N sont n~spe~ive,nent les masses moléculaires ~oyeimes (en kD) du PLA et du PEG, et p, le po~cenlage d'acide L-lactique. Les 2 types de nanoparticules utilisés sont du PLA50(30)-PEG(2) et du PLA50(30)-PEG(5). Ces copoly~llèlès pèuvelll être synth~.ti~ par toute t~.hniqlle connue de l'homme du métier (Yoir par ~e~..p~e EP 520 889).
4.2. Marqlla~e radioactif des acides ,~uclc;q~ès:
Les acides nucléiques ont été traités avec de la polr.~ ;de kinase du phage T4 15 (R:ol~s) en p.~ce d'ATP.y32P (~ .e..~ ) dans un ~npon kina~se. Apres 30 min d incu~al;on à 37C, l'acide nucle.que a été séparé de rATP n'ayant pas réagi par dépot sur colonne S~pha~'ex G25 (Quick Spin) et ce~ ;c n 4.3. Encapsulation de l'acide nucléique INV-Vall3 Cet exemple décrit l'enc~ps.ll~tion de l'acide nucléique INV-Vall3 dans une 20 nanoparticule de PLAso(30)-PEG(2) en présence ou en rabsenc~e d'oligopeptide (LKKL) 10-wog5nl931 2 1 ~ irh5~100098 Le polymère utilisé (PLA50(30)-PEG(2)) a été solubilisé dans 1 ml d'acétone à une concentration de 10 g/l. La dilution isotopique de l'acide nucléique (concentration finale 10-5 M) a été ajoutée, puis l'oligopeptide (à une c-.ncçntratio~ telle que R = 1~.
La solution organique obtenue a ensuite été versée goutte à goutte dans 5 ml d'une
5 solution aqueuse (l~n~pon Tris-HCl 50 mM, pH 7,4), sous a~tqtion- Le polymère in~ ble dans le m-5J~-t~ eau/acétone p~c;pite sous fo~ne de nq~o~- Lcules, e~ -nqo~ Ie complexe acide nucléique-oli~ t;~ L'~ e a ensuite été
iminé~ par évapolation sous vide partiel, jusqu'à un volume final de 2,5 mL Enfin, la su~ens;o~ op~-l;c--lq,ire a été filtrée à travers un filtre S~l~Li~lS de porosité
10 1,2 ,urn, qui tient lieu de crible de dispersion et d'injectvbilit~
Une eA~æ~;enoe controle a été err~.i~e dans les mêmes con~;(;ol~c~ mais en l~qbsenne de l~olie,o (LKKL)lo.
Les résultats ol)te~ "~ que le l.-nflef~ a~svl9tic~n de INV-Val13 dans la nanopar~cule est de 56 % en pl~c~ce de l'oli~opeptide~ et de 5 ~b sF~lFmF~nt sans 15 I'oligo~pt;cle Le rendement d'F ~C~l~sul~tion cGI~spond au poL~eel tage d'acide nucléique on~ppslllé
dans les nanopal~icules, par rapport à la quantité totale d'acide nucléique présente au départ.
4.4. Enc~rsulationdel'acidenucléique (d(Tp)lST) 20 Le ~ F'...~ d'~u~vl~tir~n de racide n-lelF~;que (d(Tp)lST) (e ,a'e 2.2.) dans une nanop~Lcule de PLAso a été étudié, en pl~lce des oligope~ F~ cPtioniques SIliVa.lll~
- LKKLn Hélice a: ~J..1l4t;~ en phase hf~)~nO~- ~e SOus fonne d'un mPl~n~e de pepti-les de poids ~ ire moyen de 34900.
25 - LKLKn Feuillet 13: ~..lh.'t;~ en phase h~mog~n~ Sous forme d'un mPl~nge de peptides de poids mo~ re moyen de 7400.
- PKKLn Pas de ~lL~IClL Le s~nd~;f~
- Kn Pas de st~ucture secondPire ou de sphingosine (lipide me,l,~La.la;Le chargé posiliv~".ent).

21~2~ 18 WO9S/21931 P( l/r~9S/00098 Pour cela, l'acide nucléique (d(Tp) 15T) a été mélangé à l'oligopeptide en solution dans l'eau. En ce qui concerne la sphingosine, elle est solubilisée dans un mélange eau/éthanol 50 % v/v. Les concentrations utili.céPs sont indiquées dans le tableau qui - suit. 100 ~l d'une solution d'acide polylactique (PLAso) soll~hili.~ée dans l'acétQne à
une conce~L.alion de 20 g/l ont été ajoutés au mPl~nge, ainsi que 300 ~1 d'a~tone pure (concen~lation finale en PLAso: 5 g~)- Après hh,,,Ge~ I on au vortex, le mPl~rlge a été versé goutte à goutte dans une soll-tion ~que~e de plu~nic F68 à
2,5 % (p/v) afin de p~cipi~e~ le polymère sous forme d'une s ~l)çnc:on c~lk)~le nanoparticulaire turbide. La turbidité a été app,éc;~ à l'oeil. Le rli~mptre desnanopal ~icules (175 +/- 40 nm) a été mesuré par diffusion quasi éla~iq,le de la lurnière sur un appareil BI 90 (Brookhaven Instrument Co,pol~tion). L'acétone a ens~ite été
)o,ee sous vide pend~nt une heure. La s~ nC on a ensu~e éte filttee sur filtre mmipore AP20 ~ P---~e des pores: 1,5 ~m). pr~alablement mou}ll~ avec la s?~1V~ nde pl~nic F68 à 2,5 %.
15 Le rendernent d'e- eal-s~ tion a été d~le,l.né et est reporté dans le tableau qui suit.
.
Peptide LKKLn LKLKn PKKLn Kn Sphingo.
Structure Hélice a Feuillet ~aucune aucune aucune Concentration du 5 12,5 9,2 1 2,2 peptide (mM) Volume de peptide 11,4 65 48 60 27 dans le mélange ~) Quantité de peptide 57 812 442 60 60 (nmol) Conce"llalion de 71 IlM
d(Tp) 15T
Volume de 28 ~11 d(Tp)15T
Quantité de 2nmol d(Tp) 15T
R ' ¦ 27 l 14,7 2 2 Rendement 4'~,8 l 7,8 l 0,8 0,3 1,3 Ces résultats montrent clairement que les oligopeptides de l'invention perrnettent d'encapsuler les acides nucleiques avecdes rendements nel~e...~ supérieurs à ceux obtenus avec des oligopep~ides de l'art antérieur (polyly~ne) ou ne formant pas de 20 structures secondaires (PKKL).

WO9S121931 2 1 8~ PCI/FR95/00098 Exemple 5: Transfert d'acicle nllcléi~ e dans les cellllles Cet exemple illustre la capacité des composition de l'invention à transferer des acides nucléiques dans les oellules.
5.1. Ce11ules ~tilisée~: Les essais de tlal~ret~ d'acide nurl~;que décr.its dans cet 5 e-.e~..plc ont été elrre~luéc sur une ligl~ée de oellules issue d'un cD.~,no,.~ vésical humain, rle-ci~e T24/EJ acoeccible à l'ATCC. Les cellules ont été cultivées dans un milieu MEM-EAGLE ("m;il;.. n ~csP.nti~l m~in~", Riol~l Tntln~es) supplen~enté en L-glu~ ine ((5 mM), streptoll~rc.ne (50 u~ml), p~nicilline (50 u/ml), en présence de 7 % de sérum de veau foetal clécornrlémenté 30 min à 60C.
5.2. T~a,~fetl des acides nucléiques: Les cellules (1500 / puits) ont été P-~-.C~.. f~es danc des microplaques de 96 puits, en a~n~ Ou en p,~ d'acide nucléique, e~ cap~ ou non dans des nn ~p~l;c,~l~s~ dans un volume total de 100 ~1. Chaque point a été ~ rr~ .~e en ~iple. La conce~ ation en acide nucléique u~lisée a été ajustée par ~liluhon dans de l'eau ou par co~ ,ation par cen~lirugation 1 h à 12000 rpm.15 Dans ce cas, la suspension est centrifugée, le culot pesé puis le volume ajusté.
L'efficacité du ~la..srel~ a été dé~t:.,ninée par mesure de l'inhihition de la pn~liréldtion c~ ire induite.par l'acide n~ pi~lue ~nti~en.~, après 72 ou 96 heures de culture à
37C en présence de 5 % de C02. Pour cela, 2 méthodes ont été l)hli~ées:
- Tout d'abord, l'in~lp~ de llly~id ne tritiée, qui a été dPte~ f e après 20 a(~lit,ion de 2 IlCi de 3H ~ e par puits. Apres 6 heures d'incubation à l'étuve, les plaques ont été lavées au Skatron (Lier, Norvège), l'ADN recueilli sur un filtre, et chaque rondelle du filtre (colle,,l~on~ I à chaque puits de la plaque) placée dans du liquide à sri~ltilI~ffQn puis ~ .e au c~,2,l)teur (LKB Wallac 1211 Miniheta). Les rSs..It~t~ ccllle3p~n~ à la n..,~ e des valeurs obt~- ,P~ dans chacun des 3 puits.
F.nsuite, la plo~ alion ce~ ire a été évaluée par cQrnrt~ge des oellt~lp~ en oellule de ~ Ce7. Pour cela, le sl~rna~nt a été é-limine, les oellules hrl~ ~ (10 min à 37C), puis a~litionn~s de milieu de culture avant d'être c~mptees-Les résultats obtenus sont les suivants:
- AS-Vall2, nu, ~0 ~lM ............................ 42 ~o d'inhihition - AS-Vall2/LKKL/nanoparticule, 100 nM (exprimé en antisens) .50 ~o d'inhihition - nanopalLicule blanche, même clua~ é de polymère.. < 5 ~o dlinhihiti~n wo gs/2lg31 2 i 1~ i 11 8 P~ir~5S100098 - AS-Vall2/LKKL/nanoparticule, 500 nM...... 95 % d'inhibition Ces résultats démontrent clairement l'efficacite des compositionc de l'invention pour le transfert d'acides nucléiques. De plus, ils montrent que l'acide nudéique transféré
collsei ~e ses propriétés fonctionn~ s, dans le cas présent, son activité d'~ ;cPnc~

~,

Claims (20)

REVENDICATIONS
1. Composition comprenant un acide nucléique et un oligopeptide cationique capable de former des structures secondaires.
2. Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'oligopeptide est capable de former des hélices .alpha. ou des feuillets .beta..
3. Composition selon la revendication 2 caractérisée en ce que l'oligopeptide répond à la formule (AoAyAyAo)n ou (AoAyAoAy)n dans laquelle Ao est un acide aminé hydrophobe, Ay est un acide aminé hydrophile, et n est un nombre entier supérieur ou égal à 4.
4. Composition selon la revendication 3 caractérisée en ce que l'acide aminé
hydrophobe est choisi parmi la leucine, la valine, l'isoleucine et la phénylalanine.
5. Composition selon la revendication 3 caractérisée en ce que l'acide aminé
hydrophile est choisi parmi la lysine, l'arginine et l'histidine.
6. Composition selon la revendication 3 caractérisée en ce que l'oligopeptide est choisi parmi (LKKL)n, (LKLK)n, (LRRL)n.
7. Composition selon la revendication 6 caractérisée en ce que n est compris entre 4 et 100, de préférence entre 10 et 50.
8. Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'acide nucléique est un acide désoxyribonucléique.
9. Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'acide nucléique est un acide ribonucléique.
10. Composition selon la revendication 8 ou 9 caractérisée en ce que l'acide nucléique est modifié chimiquement.
11. Composition selon la revendication 8 ou 9 caractérisée en ce que l'acide nucléique est un antisens.
12. Composition selon la revendication 8 caractérisée en ce que l'acide nucléique comporte un gène thérapeutique.
13. Composition selon l'une des revendications 8 à 12 caractérisée en ce que le rapport charges positives de l'oligopeptide / charges négatives de l'acide nucléique est égal ou supérieur à 1.
14. Vecteur de transfert d'acides nucléique comprenant une composition selon l'une des revendications précédentes.
15. Vecteur de transfert selon la revendication 14 caractérisé en ce qu'il s'agit d'une nanoparticule, d'un liposome ou d'une lipoprotéine de faible densité.
16. Procédé d'encapsulation d'acides nucléiques dans des vecteurs de transfert caractérisé en ce que l'on met en contact le vecteur de transfert ou ces composants, l'acide nucléique et un oligopeptide cationique capable de former des structuressecondaires, ou éventuellement un complexe acide nucléique-oligopeptide déjà formé, dans des conditions permettant l'encapsulation de l'acide nucléique dans ledit vecteur de tranfert, puis on récupère le vecteur de transfert formé.
17. Procédé pour le transfert d'un acide nucléique dans une cellule caractérisé
en ce que l'on cultive ladite cellule en présence de l'acide nucléique et d'un oligopeptide cationique capable de former des structures secondaires.
18. Utilisation d'un oligopeptide cationique capable de former des structures secondaires pour le transfert d'acides nucléiques dans les cellules.
19. Utilisation selon la revendication 18 pour le transfert in vitro, ex vivo ouin vivo.
20. Composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique thérapeutique et un oligopeptide cationique capable de former des structures secondaires, éventuellement encapsulés dans un vecteur de transfert.
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