WO2001062805A1 - Polymeres et matrices cationiques bioeliminables a degradation controlee - Google Patents

Polymeres et matrices cationiques bioeliminables a degradation controlee Download PDF

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WO2001062805A1
WO2001062805A1 PCT/FR2001/000499 FR0100499W WO0162805A1 WO 2001062805 A1 WO2001062805 A1 WO 2001062805A1 FR 0100499 W FR0100499 W FR 0100499W WO 0162805 A1 WO0162805 A1 WO 0162805A1
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WO
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cationic
polymer
cationic polymer
matrix
general formula
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PCT/FR2001/000499
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Ignacio De Miguel
Valérie RIEUMAJOU
Roger Kravtzoff
Didier Betbetder
Original Assignee
Biovector Therapeutics Sa
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5161—Polysaccharides, e.g. alginate, chitosan, cellulose derivatives; Cyclodextrin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
    • C08F8/44—Preparation of metal salts or ammonium salts

Definitions

  • the present invention relates to new types of cationic polymers or polymeric matrices, degradable in the organism, and at a controlled degradation rate, usable as such or as vectors for various compounds, in particular molecules with biological activity. It also relates to a process for manufacturing such polymers or matrices.
  • Cationic polymers are extremely useful in the pharmaceutical, cosmetic or food fields. Indeed, the positive charge carried by such polymers allows them to have the following properties: bioadhesion properties (in particular to biological membranes and mucous membranes) and complexation, transport and protection properties of various substances, properties improving immune responses. These properties are observed for all types of cationic polymers, independently of the other functionalities (in particular crosslinking), and / or of their form (micro- or nanoparticles, films, patches, etc.).
  • the use of cationic ligands results in a positive charge of the polymer, which makes it possible to stabilize many active principles. Indeed, many molecules with biological activity carry negative global charges and their association with the polymer matrix is improved by positive charges. Cationic polymers are therefore very interesting for the transport and protection of negatively charged molecules.
  • bioadhesion results in a mucoadhesion property and in an interaction property of these polymers with biological membranes. It is therefore possible to transport an active principle and preferably cause it to penetrate or remain in contact with a mucous membrane or a cell membrane.
  • cationic natural polymers such as chitosan are used to improve the administration of substances mucosally (mainly nasal or vaginal), that is the case, for example peptides, such as insulin (Illum et al. Pharm. Res. (1994) 11, pi 186; Felt et al. Dr g. Dev. Ind. Pharm. (1998) 24, P979).
  • nanoparticles are capable of carrying the opposite charge of drugs, protect and improve their efficiency, for example in the case of antisense oligonucleotides (WO 98/29557).
  • Cationic polymers such as, for example, polyethyleneimine dendrimers have shown their capacity to transport and protect DNA and to improve its cellular penetration, as well as the level of transfection obtained (O. Boussif et al. Proc.Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92, p7297).
  • biodegradation requires that appropriate enzymatic systems are present at the location where the polymer or polymer system to be degraded. Biodegradation is then dependent on factors such as the injection site or product accumulation site. If one seeks a controlled and predictable degradation, the skilled person will prefer systems of known stability, where the degradation is the result of kinetics spontaneous chemical hydrolysis, independent of any other factor and known in advance (Vert. Proceed. fnt 7 Symp. Control Rel Bioact Mater (1999) 26, p228). In the case of the polymers according to the invention, the biological degradation systems can also participate in accelerating the degradation process but whatever the impact of their participation, we can be sure that the system will degrade by itself.
  • the polymers according to the invention have been designed with the fundamental advantage that the degradation rate "in vitro” and "in vivo” can be modulated by the type of graft used.
  • the basic polymer backbone having served as a support for the grafting of the cationic charge, must itself be bioresorbable. biodegradable or bioeliminable.
  • the polymer backbone has free hydroxyl (- OH) functions, which gives it a "polyhydroxylated" character.
  • hydrolyzable, in vivo, or in a physiological medium it is meant that the bonds are degraded when they are subjected to conditions similar to those encountered in vivo in a physiological medium, namely at a pH of between 6.8 and 7 , 7 and at a temperature between 36.7 ° C and 37.4 ° C.
  • the physiological conditions generally relate to a pH of about 7.4 and a temperature of about 37 ° C.
  • physiological conditions can be variable depending on the site and the route of administration. Indeed, if we can consider that the temperature is close to 37 ° C. the pH and the ionic strength are very variable depending on the route of administration.
  • the present invention relates to polyhydroxy polymer onto which are grafted further cationic ligands containing at least one carboxyl function, by means of an ester linkage between said ligand carboxyl function and a hydroxyl group of said polyhydroxylated matrix.
  • This bond is a labile bond which is hydrolyzable in a physiological medium. This ensures bioelimination of the cationic polymer obtained.
  • the method of preparation of such a cationic polymer is also part of the invention.
  • the use of non-toxic reagents for making these polymers allows to obtain also non-toxic degradation products, which is very important in particular for the pharmaceutical industry.
  • the labile bond (matrix - ligands) hydrolyzable in a physiological medium is therefore, preferably, an ester bond between the hydroxyl groups of the monomers constituting the polyhydroxylated polymer matrix and the ligands.
  • the presence of cationic charges on the ligands ensures the lability of the bond, by destabilization of the ester function due to the electron-withdrawing effect of the positive charge.
  • the cationic ligands used are the positive charge by means of quaternary ammonium functions.
  • a particular implementation of the present invention uses the ligands corresponding to formula (1) defined below, in order to carry out the grafting of cationic charges on the polymer matrix.
  • betaine, butyrobetaine and valerobetaine are preferred.
  • carnitine or their derivatives are preferred. These products indeed carry a carboxyl group on one side of the molecule and a quaternary ammonium function on the other side.
  • Betaine and its derivatives are natural compounds, known for their biodegradability and non-toxicity.
  • Betaine or glycine betaine
  • butyrobetaine is also found abundantly in nature, as a product of dehydroxylation of carnitine.
  • Valerobetaine is present in some algae and can be obtained easily synthetically.
  • Y is an aliphatic chain of 1 to 16 carbon atoms, preferably 1 to 12 carbon atoms, more preferably 1 to 8 carbon atoms, even more preferably from 1 to 6 carbon atoms, most preferably from 1 to 4 carbon atoms, saturated or not. branched or not. substituted or not;
  • X " is any counterion (anion), preferably Cl “ , Br “ . I “ or F " .
  • the different members of the betaine family are distinguished by the group Y. The most common are:
  • Glycine betaine Y - CH 2 -
  • the functionalization of a polyhydroxylated polymer with glycine betaine produces a cationic polymer whose cationic charge is stable at acid pH (pH 4-5) but it hydrolyzes spontaneously and this all the more quickly as the pH is higher.
  • the lifespan of this ester under physiological conditions (pH 7.4: 37 ° C) is barely a few hours.
  • More stable polymers can be obtained using synthetic betaines having longer Y chains, branched Y chains or Y chains having intermediate groups capable of modulating the electron-withdrawing effect of the quaternary ammonium function. All the polymers thus obtained are stable at lower pHs (normally pH 4-6) and for the most unstable, storage at low temperature or in the dry state is desirable.
  • the Applicant has simplified the notion of destabilization of the ester function by “electro-pulling effect”, knowing that the reality is probably more complex.
  • the change in the reactivity of the carboxylate in the case described in the present invention is more likely the result of a set of effects including an electron-withdrawing effect, an effect of "field” due to the proximity of cation function and a steric effect mainly due to the type of substituents shown in the amino function.
  • R 2 -N + - Y - COO general formula (2) i R3 or, for its saline form: RI. X " R 2 -N + - Y - COOH i 3 where X " and Y have the same definition as in the formula (1) and Ri, R, R 3 , identical or different are chosen from -H and -CH 3 .
  • polymers or matrices constructed from these polymers for a release of application of the compounds orally.
  • the polymers will be stable in the stomach at acidic pH, and then will start to lose their charge as the intestinal pH rises.
  • the choice of the ligand derivative of formula (1) or (2) which is used for the grafting of cationic ligands on the polymer is made according to the desired use.
  • the degradation rate of these polymers can be more finely modulated by using mixtures of cationic grafts as previously described.
  • the polymers according to the invention may be of any kind, provided they are polyhydroxy, that is to say they have free hydroxyl functions, i.e. accessible for esterification. These polymers can be natural or synthetic, linear or branched. They can be copolymers, or be previously modified or hydrolyzed.
  • polysaccharides or oligosaccharides are used. linear or branched, crosslinked or not. Polyvinyl alcohol can also be used.
  • the polysaccharides are preferably selected from dextran, amylose and amylopectin or a mixture of both, of starch hydrolysates, maltodextrins. cellulose, polymannose, polygalactose or their derivatives.
  • the ligand that is grafted y is not glycine betaine.
  • the degree of functionalization (number of charge grafting) of the polymer may vary widely depending on the intended applications, the invention relating to cationic polymers regardless of load level.
  • the charge rate can be very variable, preferably between 0.1 and 4 mmol of quaternary ammonium functions per gram of polymer.
  • the invention also relates to polymeric matrices or macromolecular constructs which can be obtained by crosslinking or copolymerization of the cationic polymers according to the invention.
  • the polymers obtained according to the invention may be crosslinked naturally or chemically.
  • Those skilled in the art know the methods of crosslinking and may in particular use the epichlorohydrin, the phosphorus oxychloride, trimetaphosphate, bis epoxides. dicarboxylic acids.
  • the initial polyhydroxylated polymers may be crosslinked or copolymerized beforehand, the introduction of the betaine functions taking place in a subsequent step and directly on the polymer matrix obtained.
  • Such a polymer matrix can take various forms, in particular, for example: visible particles, microparticles, nanoparticles, films, patches, etc. whatever the shape which it is desired to give to the polymer matrix according to the invention, it should be noted that the quaternary ammonium functions can be grafted inside the matrix after the shape has been determined.
  • Polymeric matrices can also be prepared according to the invention and subsequently shaping. It is obvious that all the degradation properties of the cationic polymers explained above are also valid for the cationic polymer matrices.
  • the cationic polymers of the invention thus have advantageous properties, in particular: - their power improvement of the immunogenic ability of an antigen to their mucoadhesive or bioadhesive their ability to salt out a controlled manner active, topically, mucosal, parenteral, oral or cellular their capacity to improve the absorption in particular intestinal of certain molecules.
  • an active principle a molecule with biological activity
  • This molecule with biological activity can in particular be chosen from molecules with therapeutic activity, with cosmetic activity or can be a diagnostic agent.
  • the polymers or matrices according to the invention are complexed with a polyanionic active principle, for example: heparin, nucleic acid such as DNA.
  • a polyanionic active principle for example: heparin, nucleic acid such as DNA.
  • nucleic acid such as DNA.
  • RNA or oligonucleotide or their variants (phosphorothioate, peptide nucleic acid (PNA). methylphosphonate .
  • glycosylated peptides containing sialic acid eg most types of "erythropoietin).
  • This complexation can be done by simple mixing, the order in which the components are mixed is irrelevant. Further homogenization steps, freeze drying, concentration, evaporation or ultrafiltration can be added optionally.
  • the ratio of the charge of the polymer to the charge of the active principle is between 50% and 2000%.
  • One of the characteristics of these formulations is to allow controlled release of the polyanion, said release being a function of the polymer or matrix chosen, and depending on the type of graft, the charge of the polymer, the ratio of polymer / charge charge. active ingredient and molecular weight of the polymer.
  • salting out can be carried out in a few hours (case G6-betaine). in a few days (case W200-butyrobetaine), or even in a few weeks (case W200-butyrobetaine at high load), as shown in Example 12.
  • a. optionally, a ligand corresponding to the general formula (2) is synthesized containing a carboxylate function and a quaternary ammonium function, tertiary or secondary amine; b. activating the carboxylate group carried by the cationic ligand; vs. is carried out esterification reaction of the hydroxyl groups of polyhydroxy skeleton. are also part of the invention.
  • the ligand used corresponds to the general formula (1) and contains a carboxylate function and a quaternary ammonium function.
  • Activation of the carboxylate group carried by the cationic ligand is effected preferably by the action of COC1-COC1 or SOCl 2.
  • the invention also relates to the use of the polymers or polymeric matrices regardless of their form in the formulation, transport, vectorization.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition, characterized in that it contains a cationic polymer or polymeric matrix according to the invention in which an active ingredient is incorporated, and a pharmaceutically acceptable carrier for its administration.
  • a pharmaceutical composition characterized in that it contains a cationic polymer or polymeric matrix according to the invention in which an active ingredient is incorporated, and a pharmaceutically acceptable carrier for its administration.
  • the polymers or matrices according to the invention are in particular useful for therapeutic applications and in immunology.
  • the invention also relates to a cosmetic composition. characterized in that it contains a polymer or a cationic polymer matrix according to the invention in which is incorporated an active principle with dermatological and / or cosmetic activity, and cosmetologically acceptable excipients.
  • compositions comprising polymers or cationic polymeric matrices according to the invention are part of the invention.
  • Polymers or polymeric matrices according to the invention can be used for the preparation of medicaments or vaccines, which is an object of the invention.
  • the present invention also relates to polymers or matrices according to the invention or obtained by a method according to the invention, as medicament.
  • the examples which follow are intended to illustrate the invention, by describing certain particular embodiments, and should not be considered as limiting the scope of the invention.
  • Figure 1 hydrolysis of béta ⁇ Amsterdam function in polysaccharides functionalized with glycine betaine under the conditions described in Example 4.
  • FIG. 2 hydrolysis of the betaine function in polysaccharides functionalized with butyrobetaine (diamonds) and valerobetaine (triangles) under the conditions cited in Example 4.
  • Figure 3 Monitoring of total elimination (faecal and urinary) of different polymers functionalized with valerobetaine, butyrobetaine or GTMA. The results are expressed as the cumulative excretion as a function of time.
  • Figure 4 Monitoring of the urinary elimination of different polymers functionalized with valerobetaine, butyrobetaine or GTMA. The results are expressed as the cumulative excretion as a function of time.
  • Figure 5 Monitoring of faecal elimination of different polymers functionalized with valerobetaine, butyrobetaine or GTMA. The results are expressed as the cumulative excretion as a function of time.
  • Figure 6 Kinetics of release of DNA at pH 7.4 and 37 ° C from the complexes formed by the polymer derived by the Glycine betaine.
  • Figure 7 Release kinetics of DNA at pH 7.4 and 37 ° C from the complexes formed by polymers of the Glucidex 6 type derived from Butyrobetaine.
  • Figure 8 Release kinetics of DNA at pH 7.4 and 37 ° C from the complexes formed by Waxylis 200 type polymers derived from Butyrobetaine.
  • a quantity of 40 g (0.22 mol) of bromovaleric acid (Fluka. Saint Quentin Fallavier) is dissolved in a volume of 250 ml of Dioxane (Prolabo, Paris) with magnetic stirring.
  • a volume of 50 ml of liquid Trimethylamine (0.59 mol) is added while maintaining the reaction at 0 ° C for 30 minutes.
  • the reaction is then left for 20 hours at room temperature.
  • the dioxane and excess trimethylamine are removed by evaporation using a chemical vacuum pump.
  • the product obtained is dissolved in ethanol and recrystallized from an ethanol: water mixture (90: 10 v / v).
  • the precipitate obtained is filtered and dried under reduced pressure.
  • Valerobetaine is obtained in hydrobromide form with a recovery yield of 60% and a purity, analyzed by HPLC and by titration of the carboxylate function, greater than 90%. The product is identified by proton and J C NMR and all the characteristic bands of the expected product are found.
  • a mass of 25 grams of glycine betaine (0.163 mol), butyrobetaine (0.14 mol) (Sigma, USA) or valerobetaine synthesized according to Example 1, is added in portions to a ground flask containing a volume of 65 ml of oxalyl chloride (Fluka) (0.76 mole) with magnetic stirring. Stirring is continued for 15 hours then heating for one hour at T 45 ° C.
  • the excess oxalyl chloride is removed under reduced pressure and trapped under vacuum on a guard previously cooled with liquid nitrogen.
  • the recovered powder is washed 3 times with a volume of 200 ml of petroleum ether (SDS, Aucamville, France) and then dried under reduced pressure.
  • the acid chloride of the betaine derivatives is hygroscopic and it is therefore recovered in a glove box under a humidity-controlled atmosphere.
  • the characterization is done by proton NMR and lj C, the spectrum of the three products perfectly corresponds to the expected product.
  • the chlorination yield is determined by comparison between the titration of the carboxylic acid after hydrolysis or after ethanolysis.
  • Betaine acid chloride 0.062 mol or 10.6 g of reagent.
  • Butyrobetaine acid chloride 0.062 mol or 12.34 g.
  • Valerobetaine acid chloride 0.062 mol or 13.21 g.
  • the reaction is kept under stirring at room temperature for about 15 hours.
  • the functionalized polysaccharide (maltodextrin) is then diluted with 500 ml of 0.2 M acetate buffer, pH 5.
  • Dimethylformamide Dimethylformamide.
  • the pyridine, the pyridinium salts, the ungrafted betaine and the acetate buffer are then removed by tangential ultrafiltration on a membrane with a cutoff threshold of 30 Kd (Filtron, France).
  • the functionalized polymer solution is diafiltered against water until complete removal of salts from the secondary reaction.
  • the pH is then checked and brought back to 5 with hydrochloric acid (Prolabo) if necessary.
  • a polymer (maltodextrin) solution functionalized at a concentration of 25 g / l of polymer is obtained.
  • the charge rate of each polymer is determined by chromatography
  • Example 3 The three types of functionalized polymers obtained in Example 3 are dissolved at 10 g / l in Phosphate buffer pH 7.4 and maintained at 37 ° C. The pressure drop is followed by HPLC analysis and expressed as a percentage of hydrolyzed grafts relative to the total contained in the polymer.
  • FIG. 1 represents the rate of hydrolysis of the betaine function in the polysaccharides functionalized by the glycine betaine under the conditions mentioned.
  • FIG. 2 represents the rate of hydrolysis of the betaine function in polysaccharides functionalized with butyrobetaine and valerobetaine under the conditions mentioned.
  • Cationic polymers were obtained from two different polysaccharides: a maltodextrin (Glucidex 2, Roquette Fromme, France) and corn amylopectin (Waxylis 200, Roquette Fringham. France), by applying the same protocol.
  • 50 g of polysaccharide are dispersed in 110 ml of a 2M solution of sodium hydroxide (NaOH, Prolabo, France) in a glass reactor fitted with a mechanical stirring blade.
  • 31 g (0.2 mol) of glycidyl trimethyl ammonium (GTMA, Fluka, Switzerland) are added and the reaction is left at room temperature for 8 hours.
  • GTMA glycidyl trimethyl ammonium
  • Neutralized with acetic acid is brought to a volume of 1.5 liters with the osmosis water and diafiltered against osmosis water. Diafiltration is carried out in a Minissette ultrafiltration system (Pall-Filtron, France) equipped a 30 kD cut-off ultrafiltration membrane. Once the conductivity of the filtrate is less than 20 ⁇ Siemens, the suspension of modified polysaccharide is concentrated and filtered on a 0.45 ⁇ m membrane (Gelman, France).
  • the two suspensions of modified polysaccharide are characterized by their concentration and the quaternary ammonium content by elemental nitrogen analysis.
  • Functionalization rate 1.8 mEq of quaternary ammonium per gram of polymer.
  • Functionalization rate 2 mEq quaternary ammonium per gram of polymer.
  • the quaternary ammonium functions are grafted onto the polysaccharide by a very stable ether bond.
  • EXAMPLE 6 Acute Toxicity of Betaine Polymers Compared to Their Non-Bioeliminable Counterparts Protocol: Cri Mice CD-1 (ICR) BR (Charles RIVER Breeding Center, 76 410 Saint-Aubin-lès-Elbeuf) (50 males and 50 females ) were divided into groups of 10 mice (5 males and 5 females). The polymers obtained in Examples 3 and 5 were administered intravenously at different doses with an unmodified maltodextrin control (neutral polymer): Glucidex 2-Butyro 1.8
  • Glucidex 2-Valéro 1, 6 Neutral polymer (Glucidex 2)
  • Glucidex 2-GTMA 1,8 A control group of 10 mice (5 males and 5 females) received an intravenous administration of the vehicle under the same conditions. After administration, the study focused on: clinical examinations and monitoring of mortality a monitoring of the weight by weighing the animals the day before the test, ie on day-1 and on days +1. 4. +6, +1 1, +14.
  • the maximum non-lethal dose is equal to or greater than 100 mg / kg after intravenous administration in mice. At this dose, no clinical sign could be observed.
  • Example 7 Preparation of a cationic polymer by grafting of the butyrobetaine on a non-polysaccharide polymer backbone (alcohol polvvinylique)
  • This example shows the feasibility of the esterification reaction in an aqueous medium, not only in dimethyl formamide medium. Yields can be significantly improved by studying the conditions of pH, temperature and concentration.
  • 20 g of polyvinyl alcohol (Mw: 22000, Fluka, Switzerland) are placed in a double-jacketed glass reactor connected to a thermostatic group and dispersed with 100 ml of reverse osmosis water then brought to 80 ° C for 2 hours to obtain a viscous solution of polyvinyl alcohol which is then cooled to room temperature.
  • 10 ml of 0.5 M phosphate buffer pH 7.5 are then added and the mixture is kept under mechanical stirring, the mixture is cooled to 4 ° C.
  • the reactor is then equipped with a pH electrode connected to a pH controller containing 2M sodium hydroxide.
  • the setpoint of the pH controller is fixed at pH 7.5.
  • the reaction is left for 30 minutes at 4 ° C. and then diluted with 200 ml of 0.2 M acetate buffer, pH 5.
  • This suspension is pre-homogenized with an Ultra-Turrax model T-25 (IKA, Bioblock) then homogenized at a pressure of 900 bars using a Minilab H-80 homogenizer (Rannie. Denmark) in order to obtain nanoparticles from 50 to 100 nm (Coulter N4SD submicron analyzer. Coultronics, USA).
  • nanoparticles are then purified by ultrafiltration on a 30kD membrane (Minisette ultrafiltration system. Filtron, Pall Gelman
  • the suspension of particles is then purified by micro-filtration on a 0.2 ⁇ m membrane (Spiral-Cap, Pall Gelman Sciences. USA) and the particles are dried by lyophilization.
  • a quantity of 5 g of polysaccharide particles obtained above is dispersed in a volume of 200 ml of dimethylformamide containing 25 ml of pyridine. 5.5 g (27 mmol) of valerobetaine acid chloride (obtained according to Example 2) is added. The reaction is left to stir overnight. The suspension of derived nanoparticles is diluted with 500 ml of 0.2 M acetate buffer, pH 5.5, then washed by ultrafiltration on a 30 kD membrane (Filtron, France) by performing a diafiltration against reverse osmosis water. When the conductivity of the filtrate is less than 30 ⁇ S / cm, the product is recovered after concentration. The pH is controlled and adjusted between 4 and 6 with hydrochloric acid.
  • Potential Z (Malvern 3000 series, 15 mM Phosphate Buffer, pH7): +20 mV
  • Charge rate (HPLC) 2.5 mEq betaine function / g of particles Particles of different sizes can be obtained in the same way using different levels of epichlorohydrin or different grinding pressures.
  • Minilab H-80 (Rannie) to obtain nanoparticles from 50 to 100 nm.
  • the suspension was then diafiltered against 2 liters of a 0.1 M solution of tetramethylammonium chloride and then against the osmosis water (4 liters) and then microfiltered through a membrane of 0.45 microns (SuporCap 0.45 .mu.m. Pall Gelman Sciences ).
  • the suspension of particles thus obtained is then dried by lyophilization.
  • the characteristics of the nanoparticles are: Size (Coulter N4SD): 60 nm
  • An amount of 8.36 g of the particles obtained is dispersed in a volume of 210 ml of dimethylformamide containing 25 ml of pyridine. 5.4 g (or 25.8 mmol) of valerobetaine acid chloride (synthesis example 2) are added. The mixture is left to stir overnight. The suspension of derived nanoparticles is diluted in 500 ml of 0.2 M acetate buffer, pH 5.5.
  • the suspension is then washed by ultrafiltration on a 30 kD membrane (Minisette, Filtron, Pall Gelman ultrafiltration system) against osmosis water and then concentrated before recovery.
  • the pH is controlled and adjusted between 4 and 6 with hydrochloric acid.
  • Betaine function rate (HPLC) 0.9 mEq / g
  • amylopectin (Waxylis 200. Roquette Fromme, Lestrem. I l nce) is dispersed in a volume of 200 ml of dimethylformamide (Flukr Switzerland) containing 25 ml of pyridine (Fluka, Switzerland). Aci chloride is added. .. the butyrobetaine prepared according to Example 2 (62 mmol, 12.34 g)
  • Dimethylformamide, pyridine, pyridinium salts, ungrafted betaine and acetate buffer are then removed by tangential ultrafiltration on a 30 kD cut-off membrane (Filtron, France).
  • the functionalized polymer solution is diafiltered against water until total elimination of salts from the secondary reaction.
  • the pH is then checked and brought back to 5 with hydrochloric acid (Prolabo) if necessary.
  • a polymerized solution (amylopectin) of high functionalized molar weight is obtained, at a concentration of 15 g / l of polymer.
  • the degree of functionalization of the polymer is determined by HPLC of the butyrobetaine graft after alkaline hydrolysis and is estimated at 2.2 mEq / g
  • Example 11 Comparative bioelimination of polymers functionalized with betaines or with GTMA Protocol: the following products are administered intravenously at a dose of 5 mg / kg of covalently carbon 14 labeled rats to Sprague-Dawleys rats (Charles RIVER breeding center 76 410 Saint-Aubin-lès-Elbeuf):
  • Results Figures 3 to 5 summarize the results obtained in terms of urinary and faecal elimination after intravenous administration of the various polymers. These results show the strong elimination, especially in the urine, of polymers functionalized with valerobetaine and butyrobetaine compared to polymers functionalized with GTMA. Indeed, these latter polymers are weakly bio-eliminable and 14 days after administration almost 60% of the product is still present in the carcass of animals.
  • Fecal elimination of polymers can be interpreted as hepatic uptake followed by metabolism in this organ of this type of polymer.
  • the difference in elimination of the two polymers seems to confirm the difference in kinetics of degradation of these.
  • polymers functionalized by valerobetaine more slowly metabolized in the plasma space, a larger fraction is certainly taken up by the liver to be metabolized there.
  • cationic polymers derived from glycine betaine or butyrobetaine are prepared according to Example 3. using two types of polysaccharides, Glucidex 6 (maltodextrin. Roquette Fromme, molar mass approx. 3400 Kd) and Waxylis 200 (Amylopectin . Rocket Brothers, Molar Mass 1-100 Md). The characteristics of each polymer prepared are described in Table 1.
  • a model plasmid having 6600 base pairs is dissolved in 100 ⁇ l of water in an eppendorf tube.
  • the necessary quantity of polymer is added to neutralize half (50%) or twice (200%) the charge of the DNA with the cationic functions.
  • the operation is carried out with stirring (Vortex).
  • the volume of the formulation is then adjusted to 1 ml by adding 100 .mu.l of acetate buffer 200 mM, pH 5.3 and the RO water in qs for 1 ml.
  • Table 2 Samples prepared by DNA complexation (100 ⁇ g) with the various polymers in Table 1.
  • Free DNA rate is determined by electrophoresis on agarose gel 0.7%. The size measurements are carried out on Coulter N4D, Coultronics.
  • Figure 6 shows the release results obtained with polymers of different molecular weights and fillers derived from betaine. We clearly observe a release of DNA with variable kinetics as a function of the ration of polymer / DNA charge and of the molecular weight of the polymer. All the kinetics are nevertheless finished in a few hours, indicating a predominant influence on the rate of hydrolysis of the glycine betaine graft.
  • Figure 7 presents the results obtained with Glucidex type polymers

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Abstract

La présente invention concerne de nouveaux types de polymères et matrices polymériques cationiques, dégradables dans l'organisme, et à vitesse de dégradation contrôlée, utilisables en tant que tels ou comme vecteurs de différents composés, en particulier des molécules à activité biologique. Elle se rapporte également à un procédé de fabrication de tels polymères ou matrices.

Description

POLYMERES ET MATRICES CATIONIQUES BIOELIMINABLES A DEGRADATION CONTROLEE
La présente invention concerne de nouveaux types de polymères ou matrices polymériques cationiques, dégradables dans l'organisme, et à vitesse de dégradation contrôlée, utilisables en tant que tels ou comme vecteurs de différents composés, en particulier des molécules à activité biologique. Elle se rapporte également à un procédé de fabrication de tels polymères ou matrices.
Les polymères cationiques sont extrêmement utiles dans les domaines pharmaceutiques, cosmétiques ou alimentaires. En effet, la charge positive portée par de tels polymères leur permet de présenter les propriétés suivantes : des propriétés de bioadhésion (en particulier aux membranes biologiques et aux muqueuses) et de complexation, des propriétés de transport et de protection de substances diverses, des propriétés d'amélioration des réponses immunitaires. Ces propriétés sont observées pour tous les types de polymères cationiques, indépendamment des autres fonctionnalités (en particulier la réticulation), et/ou de leur forme (micro- ou nano- particules, films, patchs...). L'utilisation de ligands cationiques résulte en une charge positive du polymère, ce qui permet de stabiliser de nombreux principes actifs. En effet, beaucoup de molécules ayant une activité biologique portent des charges globales négatives et leur association avec la matrice polymérique est améliorée par les charges positives. Les polymères cationiques sont donc très intéressants pour le transport et la protection de molécules chargées négativement.
Par ailleurs, la bioadhésion se traduit par une propriété de mucoadhésion et par une propriété d'interaction de ces polymères avec des membranes biologiques. On peut donc transporter un principe actif et l'amener de façon préférentielle à pénétrer ou rester en contact avec une muqueuse ou une membrane cellulaire. Ainsi, des polymères naturels cationiques comme le chitosan sont utilisés pour améliorer l'administration de substances par voie mucosale (principalement nasale ou vaginale), c'est le cas par exemple de peptides comme l'insuline (Illum et al. Pharm. Res. (1994) 11, pi 186 ; Felt et al. Dr g. Dev. Ind. Pharm. (1998) 24, p979). Dans le cas de particules de poly ε caprolactone recouvertes de chitosan ou du polymère cationique poly-L-lysine. la couche cationique mucoadhésive ainsi obtenue permet d'augmenter la pénétration dans la cornée des substances actives transportées par ces systèmes de délivrance oculaire (Int. J. Pharmaceutics (1997) 153, p41). Des particules cationiques à base de polysaccharide fonctionnalisé avec des fonctions ammonium quaternaire (EP 687 173) ont été décrites comme possédant une importante capacité de résidence dans la muqueuse nasale (Kravtzoff et al. Proceed. Int 'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. (1998) 25, p818). Ces mêmes nanoparticules sont capables de transporter des médicaments de charge opposée, de les protéger et d'améliorer leur efficacité, par exemple dans le cas d'oligonucléotides antisens (WO 98/29557). Des polymères cationiques comme par exemple les dendrimères de polyéthylèneimine ont montré leur capacité à transporter et à protéger de l'ADN et à améliorer sa pénétration cellulaire, ainsi que le niveau de transfection obtenu (O. Boussif et al. Proc.Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92, p7297).
Par ailleurs, que ce soit pour le chitosan ou pour les polymères cationiques décrits précédemment, il a été montré que leur adjonction à des antigènes vaccinaux permet d'améliorer et même d'induire des réponses immunitaires tout à fait acceptables quand ils sont administrés par voie nasale (WO 97/20576, WO 98/29099). L'amélioration de réponses immunitaires obtenues par voie injectable a été par ailleurs décrite pour plusieurs polymères polyioniques, anioniques ou cationiques (Paine et al. Vaccine (1998) 16, p92). Cependant, l'effet d'induction de réponses immunitaires par voie mucosale a été principalement décrit pour des polymères cationiques. II semble dans ce cas, que les polymères possédant des fonctions cationiques type ammonium quaternaire soient plus efficaces que les polymères possédant des fonctions aminé primaires (comme le chitosan) où le degré d'ionisation des fonctions aminées est très dépendant du pH.
On connaît des procédés de greffage de ligands cationiques, par exemple ceux décrits dans le brevet européen EP 687 173, qui concernent un greffage de charges positives (ammoniums quaternaires) sur des polysaccharides par réaction avec le glycidyltriméthylammonium (GTMA). On peut aussi citer les méthodes de quaternisation du chitosan (Kotze et al. Pharm Res (1997), 14, pi 197). Toutefois la plupart des procédés actuels de greffage de charges positives à un squelette polymérique ne sont pas totalement satisfaisants pour leur utilisation en pratique, dans la mesure où les liaisons (polymère - ligand ionique) ne sont pas facilement biodégradables. Ainsi, les greffages par l'intermédiaire de liaisons éther ou amide sont stables, et l'élimination d'un polymère ainsi chargé peut s'avérer difficile, en particulier dans le cas d'une utilisation parentérale.
D'autres polymères polysaccharidiques ont aussi été développés, pour des applications alimentaires, en particulier anti-cholestérol (EP 319 645). Dans ce cadre, la propriété thérapeutique recherchée provient d'un effet séquestrant irréversible des sels biliaires et la propriété de biodégradabilité serait plutôt gênante.
Ainsi, il existe un besoin de définir de nouveaux types de polymères, qui soient chargés positivement, mais néanmoins facilement dégradables dans l'organisme et qui donnent naissance à des produits de dégradation non toxiques ou naturels, eux-mêmes biodégradables, bioéliminables ou bioassimilables. La Demanderesse se propose de répondre à cette demande en proposant un nouveau type de polymères cationiques, pour lesquels la liaison (squelette polymérique) - (ligand cationique) est une liaison labile qui peut être hydrolysée in vivo ou dans des conditions physiologiques, la vitesse de dégradation étant modulable en fonction du ligand utilisé. Ces polymères sont facilement éliminés de l'organisme après administration parentérale et leur dégradation peut être modulée entre quelques heures et quelques semaines. La dégradation de ces polymères conduit à des produits non toxiques, complètement bioéliminables ou bioassimilables. Les problèmes liés à la toxicité à long terme ou à l'accumulation du produit dans l'organisme devraient être supprimés.
Pour des applications thérapeutiques, la notion de dégradation est mieux adaptée que la notion de biodégradation. En effet, la biodégradation implique que des systèmes enzymatiques appropriés soient présents à l'endroit où le polymère ou le système polymérique doit être dégradé. La biodégradation est alors dépendante de facteurs comme le site d'injection ou le site d'accumulation du produit. Si l'on recherche une dégradation contrôlée et prévisible, l'homme du métier préférera des systèmes de stabilité connue, où la dégradation est le résultat d'une cinétique d'hydrolyse chimique spontanée, indépendante de tout autre facteur et connue d'avance (Vert. Proceed. fnt 7 Symp. Control Rel Bioact Mater (1999) 26, p228). Dans le cas des polymères selon l'invention, les systèmes de dégradation biologiques peuvent également participer à accélérer le processus de dégradation mais quel que soit l'impact de leur participation, on peut être sûr que le système se dégradera par lui même.
Les polymères selon l'invention ont été conçus avec l'avantage fondamental que la vitesse de dégradation « in vitro » et « in vivo » peut être modulée par le type de greffon utilisé. Afin d'assurer l'élimination de ces polymères catiomques il est entendu que le squelette polymérique de base ayant servi de support au greffage de la charge cationique, doit être lui-même biorésorbable. biodégradable ou bioéliminable. Par ailleurs, et comme cela sera précisé plus loin, le squelette polymérique possède des fonctions hydroxyle (- OH) libres, ce qui lui donne un caractère « polyhydroxylé ». Par « hydrolysable, in vivo, ou en milieu physiologique », on entend que les liaisons sont dégradées lorsqu'on les soumet à des conditions semblables à celles rencontrées in vivo en milieu physiologique, à savoir à un pH compris entre 6,8 et 7,7 et à une température comprise entre 36.7 °C et 37,4 °C. Les conditions physiologiques concernent en général un pH d'environ 7.4 et une température d'environ 37 °C. Toutefois, il est important de noter que les conditions physiologiques peuvent être variables en fonction du site et de la voie d'administration. En effet, si l'on peut considérer que la température est voisine de 37 °C. le pH et la force ionique sont très variables en fonction de la voie d'administration. Ainsi la présente invention concerne des polymères polyhydroxylés sur lesquels sont greffés des ligands cationiques contenant en outre au moins une fonction carboxyle, par l'intermédiaire d'une liaison ester entre ladite fonction carboxyie du ligand et un groupement hydroxyle de ladite matrice polyhydroxylée. Cette liaison est une liaison labile qui est hydrolysable en milieu physiologique. Ceci assure la bioélimination du polymère cationique obtenu.
Le procédé de préparation d'un tel polymère cationique fait également partie de l'invention. L'utilisation de réactifs non toxiques pour la fabrication de ces polymères permet d'obtenir également des produits de dégradation non toxiques, ce qui est un élément très important en particulier pour l'industrie pharmaceutique.
La liaison labile ( matrice - ligands ) hydrolysable en milieu physiologique est donc, de manière préférée, une liaison ester entre les groupements hydroxyles des monomères constituant la matrice polymérique polyhydroxylée et les ligands.
La présence de charges cationiques sur les ligands assure la labilité de la liaison, par déstabilisation de la fonction ester due à l'effet électroattracteur de la charge positive. De manière préférée, les ligands cationiques utilisés portent la charge positive par l'intermédiaire de fonctions ammoniums quaternaires.
Une mise en œuvre particulière de la présente invention utilise les ligands répondant à la formule (1) définie ci-dessous, afin de réaliser le greffage de charges cationiques sur la matrice polymérique. En particulier, on préfère la bétaïne, la butyrobétaïne, la valérobétaïne. la carnitine ou leurs dérivés. Ces produits portent en effet un groupement carboxyle d'un côté de la molécule et une fonction ammonium quaternaire de l'autre côté.
La bétaïne et ses dérivés sont des composés naturels, connus pour leur biodégradabilité et leur non toxicité. La bétaïne (ou glycine bétaïne) est le produit d'oxydation enzymatique de la choline. et la butyrobétaïne se trouve aussi abondamment dans la nature, comme produit de déshydroxylation de la carnitine. La valérobétaïne est présente dans certaines algues et peut être obtenue facilement par voie synthétique.
La formule générale de ligands utilisables dans la présente invention est la suivante : " OOC - Y - N (CH3)3 + formule générale ( 1 ) ou, pour la forme saline :
HOOC - Y - N (CH3)3 + X ' où Y est une chaîne aliphatique de 1 à 16 atomes de carbone, de préférence de 1 à 12 atomes de carbones, de façon plus préférée de 1 à 8 atomes de carbone, de façon encore plus préférée de 1 à 6 atomes de carbone, de façon la plus préférée de 1 à 4 atomes de carbone, saturée ou non. ramifiée ou non. substituée ou non ;
X " est un contre-ion (anion) quelconque, de préférence Cl", Br". I" ou F". Les différents membres de la famille des bétaïnes se distinguent par le groupement Y. Les plus communs sont :
Glycine bétaïne Y= - CH2 -
Butyrobétaïne Y= - (CH2)3 - Valérobétaïne Y= - (CH2)4 -
Carnitine Y= - CH2-CHOH-CH2 -
D'autres bétaïnes naturelles sont connues comme la proline bétaïne par exemple, mais celle-ci est considérée comme un alcaloïde, ce qui peut limiter son utilisation. D'autres, non naturelles, à chaîne linéaire plus longue peuvent être facilement obtenues par quaternarisation de la triméthyl aminé avec des carboxy alkyl bromures ou chlorures, un exemple étant donné par la réaction 1. Réaction 1 HOOC-M-CH2Br + N(CH3)3 - HOOC-M-CH2-N(CH3)3" Br " (dans laquelle M-CH2- est équivalent au Y décrit précédemment excepté dans le cas de la glycine bétaïne où M est inexistant, car Y = -CH2-). Leur activation afin de pouvoir estérifier un groupement hydroxyle présent dans un polymère est aussi aisément réalisée par les techniques d' activation des fonctions carboxylate connues de l'homme de métier (préparation d'halogénures d'acide, d'anhydrides ou d'esters activés), notamment la préparation de chlorures d'acide à l'aide du chlorure d'oxalyle (ou chlorure de thionyle), comme cela est exemplifié par la réaction 2.
Réaction 2 HOOC-R + COC1-COC1 - ClOC-R + HC1 + CO + C02 (où R correspond à l'ensemble -Y-N(CH3) + X " décrit dans la formule 1 ).
Une fois l'halogénure d'acide, l'anhydride ou l'ester activé obtenu, le greffage de ce composé sur un groupement hydroxyle relève de la chimie classique et connue de l'homme du métier dans le cadre des méthodes d'estérification d'alcools, résumée dans la réaction 3.
Réaction 3 (Polymère)-OH + AOC-R -> (Polymère)-OOC-R où R = -Y-N(CH3) + X " défini dans la formule générale (1 ) A = Cl, Br, I ,-O-CO-R, ester activé. Les dérivés de la bétaïne n'avaient pas été utilisés précédemment pour canoniser un polymère par une liaison ester, précisément parce que l'on sait que la liaison ester qui se forme avec le polysaccharide est déstabilisée par l'effet électroattracteur du groupement triméthylammonium de la bétaïne sur la liaison ester, en fonction des conditions de pH et/ou de température.
Ainsi, par exemple, la fonctionnalisation d'un polymère polyhydroxylé avec de la glycine bétaïne produit un polymère cationique dont la charge cationique est stable à pH acide (pH 4-5) mais celui-ci s'hydrolyse spontanément et ceci d'autant plus vite que le pH est plus élevé. La durée de vie de cet ester en conditions physiologiques (pH 7,4 : 37°C) est à peine de quelques heures.
La Demanderesse a montré que le fait d'éloigner la fonction ammonium quaternaire de la liaison ester augmente la stabilité de celle-ci de façon très forte. Ainsi, un polymère polyhydroxylé estérifié avec de la butyrobétaïne a une durée de vie de quelques jours en conditions physiologiques et un polymère dérivé par la valérobétaïne a une durée de vie de quelques semaines.
C'est l'un des intérêts de la présente invention que d'obtenir des polymères ou matrices cationiques pouvant être déstabilisés et s'hydrolyser dans certaines conditions, et dont les caractéristiques de dégradation peuvent être contrôlées en choisissant le type de ligand que l'on greffe pour obtenir un polymère selon l'invention.
Des polymères plus stables peuvent être obtenus en utilisant des bétaïnes synthétiques possédant des chaînes Y plus longues, des chaînes Y ramifiées ou des chaînes Y possédant des groupements intermédiaires susceptibles de moduler l'effet électroattracteur de la fonction ammonium quaternaire. Tous les polymères ainsi obtenus sont stables à des pH plus faibles (normalement pH 4-6) et pour les plus instables la conservation à basse température ou à l'état sec est souhaitable.
La Demanderesse a simplifié la notion de déstabilisation de la fonction ester par « effet électroattracteur », sachant que la réalité est probablement plus complexe. La modification de la réactivité de la fonction carboxylate dans le cas décrit dans la présente invention est plus probablement le résultat d'un ensemble d'effets et notamment d'un effet électroattracteur, d'un effet de « champ » dû à la proximité de la fonction cationique et d'un effet stérique principalement dû au type de substituants présentés dans la fonction aminée.
Ainsi, d'autres aminés d'ordre inférieur (aminés tertiaires, secondaires ou primaires) présentent également un pouvoir électroattracteur qui. bien que moins fort que pour les ammoniums quaternaires, peut être suffisant pour permettre la modulation de la stabilité d'un ester adjacent. Ainsi, les composés pouvant servir à une mise en œuvre de l'invention répondent à une formule générale pouvant être exprimée de la façon suivante :
R I .
R2 -N+ - Y - COO " formule générale (2) i R3 ou, pour sa forme saline : R I . X" R2 -N+ - Y - COOH i 3 où X" et Y ont la même définition que dans la formule (1) et Ri, R , R3, identiques ou différents sont choisis parmi -H et -CH3.
Il est clair que. en fonction de la voie d'administration du polymère, les pH et températures auxquels il va être confronté sont variables, d'où l'intérêt d'avoir une famille de composés permettant de moduler cette dégradation.
On peut envisager par exemple l'utilisation de ces polymères, ou de matrices construites à partir de ces polymères, pour une application de relargage de composés par voie orale. Les polymères seront stables dans l'estomac à pH acide, puis commenceront à perdre leur charge en fonction de la montée du pH intestinal.
On peut donc essayer de cibler une zone de relargage préférentielle.
Ainsi, le choix du dérivé du ligand de formule (1) ou (2) que l'on utilise pour le greffage de ligands cationiques sur le polymère est effectué en fonction de l'utilisation désirée. La vitesse de dégradation de ces polymères peut être modulée de façon plus fine en utilisant des mélanges de greffons cationiques tels que précédemment décrits.
C'est donc un avantage de la présente invention que de permettre une certaine adaptation des qualités requises de dégradabilité de la liaison polymère - ligand cationique en fonction de la longueur de la chaîne utilisée et/ou de la nature de cette chaîne et de substituants éventuels. Cette facilité d'adaptation, sans changer les procédés de synthèse du polymère selon l'invention permet de pouvoir utiliser toutes sortes de principes actifs différents, possédant des propriétés variées, pour des applications et des modes d'administrations divers. Les polymères selon l'invention peuvent être de toute sorte, à condition qu'ils soient polyhydroxylés, c'est-à-dire qu'ils possèdent des fonctions hydroxyle libres, c'est à dire accessibles pour l'estérification. Ces polymères peuvent être naturels ou synthétiques, linéaires ou ramifiés. Ils peuvent être des copolymères, ou être préalablement modifiés ou hydrolyses. De manière préférée, on utilise des polysaccharides ou des oligosaccharides. linéaires ou ramifiés, réticulés ou non. On peut également utiliser l'alcool polyvinylique. Les polysaccharides sont choisis de préférence parmi le dextrane, l'amylose et l'amylopectine ou un mélange des deux, des hydrolysats d'amidon, des maltodextrines. la cellulose, le polymannose, le polygalactose ou leurs dérivés.
De préférence, lorsque le polymère que l'on utilise est l'amidon, le ligand que l'on y greffe n'est pas la glycine bétaïne.
Le degré de fonctionnalisation (nombre de greffage de charges) du polymère peut être très variable en fonction des applications envisagées, l'invention concernant les polymères cationiques quel que soit leur taux de charge. Ainsi, le taux de charge peut être très variable, de préférence entre 0,1 et 4 mmol de fonctions ammonium quaternaire par gramme de polymère.
Dans le cas des polysaccharides type amidon ou maltodextrine, il est connu de l'homme du métier que les fonctions hydroxylées les plus réactives sont en position 2 et 6. Le rapport de greffage entre ces positions peut néanmoins être influencé par les conditions opératoires, par le type de réactif utilisé ou par le mode d'activation ou de catalyse. Dans certains cas, les positions 3 et 4 pourraient aussi être modifiées. Le greffage des bétaïnes dans des positions différentes ne devrait pas néanmoins modifier significativement les propriétés du produit de l'invention. L'invention concerne donc des polymères polyhydroxylés greffés par des ligands ioniques par des liaisons hydrolysables, quelle que soit la position de la modification.
L'invention concerne aussi des matrices polymériques ou constructions macromoléculaires qui peuvent être obtenues par réticulation ou copolymérisation des polymères cationiques selon l'invention.
En effet, les polymères obtenus selon l'invention peuvent être réticulés, naturellement ou chimiquement. L'homme de métier connaît les procédés de réticulation et pourra, en particulier, utiliser l'épichlorhydrine, l'oxychlorure de phosphore, le trimétaphosphate, les bis époxydes. les acides dicarboxyliques.
Dans un autre aspect de l'invention et pour des raisons de compatibilité chimique ou de simplicité du procédé, les polymères polyhydroxylés initiaux pourront être réticulés ou copolymérisés au préalable, l'introduction des fonctions bétaïne intervenant dans une étape ultérieure et directement sur la matrice polymérique obtenue.
Une telle matrice polymérique peut prendre des formes diverses, en particulier, par exemple : particules visibles, microparticules, nanoparticules, films, patchs, etc.... Quelle que soit la forme que l'on désire donner à la matrice polymérique selon l'invention, il est à noter que l'on peut effectuer le greffage des fonctions ammonium quaternaire à l'intérieur de la matrice après que la forme a été déterminée. On peut aussi préparer des matrices polymériques selon l'invention et les modeler ultérieurement. II est évident que toutes les propriétés de dégradation des polymères cationiques explicitées précédemment sont également valables pour les matrices polymériques cationiques.
Les polymères cationiques selon l'invention possèdent donc des propriétés intéressantes, en particulier pour : - leur pouvoir d'amélioration de la capacité immunogène d'un antigène leur pouvoir mucoadhésif ou bioadhésif leur capacité à relarguer un actif de façon contrôlée, au niveau topique, mucosal, parentéral, oral ou cellulaire leur capacité à améliorer l'absorption notamment intestinale de certaines molécules.
Ainsi, on peut incorporer un principe actif (une molécule à activité biologique) dans un polymère ou une matrice selon l'invention, afin de pouvoir améliorer la libération de ladite molécule. Cette molécule à activité biologique peut en particulier être choisie parmi les molécules à activité thérapeutique, à activité cosmétique ou peut être un agent de diagnostic.
Dans un cas particulier, les polymères ou matrices selon l'invention sont complexé(e)s à un principe actif polyanionique, par exemple : héparine, acide nucléique tel que ADN. ARN ou oligonucléotide simple ou double brins, ou leurs variants (phosphorothioate, acide nucléique peptidique (PNA). méthylphosphonate ... ).
Parmi les principes actifs polyanioniques pouvant être aisément complexés par les polymères ou matrices selon l'invention, on peut aussi citer notamment les peptides glycosylés contenant de l'acide sialique (par exemple : la plupart des types d " érythropoiétine) .
Cette complexation peut se faire par simple mélange, l'ordre dans lequel les composants sont mélangés étant sans importance. Des étapes complémentaires d'homogénéisation, de lyophilisation, de concentration, d'évaporation ou d'ultrafiltration peuvent être ajoutées de manière optionnelle. De façon préférée, on le rapport de la charge du polymère sur la charge du principe actif est compris entre 50 % et 2000 %.
Une des caractéristiques de ces formulations est de permettre un relargage contrôlé du polyanion, ledit relargage étant fonction du polymère ou de la matrice choisi(e), et dépendant du type de greffon, de la charge du polymère, du ratio de charge polymère/charge principe actif et de la masse moléculaire du polymère.
En fonction de ces paramètres, le relargage peut être effectué en quelques heures (cas G6-bétaïne). en quelques jours (cas W200-butyrobétaïne), voire en quelques semaines (cas W200-butyrobétaïne à forte charge), ainsi que le montre l'exemple 12.
Les procédés de préparation de polymères selon l'invention, comprenant en particulier les étapes suivantes : a. de façon optionnelle, on synthétise un ligand répondant à la formule générale (2) contenant une fonction carboxylate et une fonction ammonium quaternaire, aminé tertiaire ou secondaire ; b. on effectue l'activation du groupement carboxylate porté par le ligand cationique ; c. on effectue une réaction d'estérification sur les groupements hydroxyles du squelette polyhydroxylé. font également partie de l'invention. On peut obtenir une matrice selon l'invention lorsque l'on ajoute l'étape : d. on réticule ou copolymérise le polymère obtenu en c. afin d'obtenir une matrice polymérique. Pour l'obtention d'une matrice selon l'invention, cette étape peut ne pas s'avérer nécessaire si le squelette polymérique a été réticulé ou copolymérisé préalablement ou bien l'être naturellement.
De préférence, le ligand utilisé répond à la formule générale (1 ) et contient une fonction carboxylate et une fonction ammonium quaternaire.
L'activation du groupement carboxylate porté par le ligand cationique s'effectue de préférence par action de COC1-COC1 ou SOCl2.
L'invention concerne aussi l'utilisation des polymères ou matrices polymériques quelle que soit leur forme pour la formulation, le transport, la vectorisation. la protection, l'amélioration de l'efficacité, l'administration ou le relargage de molécules biologiquement actives à usage pharmaceutique, cosmétique ou alimentaire et ceci quelle que soit la voie d'administration choisie : voie mucosale (nasale, vaginale, rectale, buccale, pulmonaire), voie topique (oculaire, dermique, optique), voie orale et voie parentérale (intra\ eineuse. intramusculaire, intradermique, sous-cutanée, intraoculaire).
L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient un polymère ou une matrice polymérique cationique selon l'invention dans lequel est incorporé un principe actif, et un support pharmaceutiquement acceptable pour son administration. Les polymères ou matrices selon l'invention sont notamment utiles pour des applications thérapeutiques et en immunologie.
L'invention a également pour objet une composition cosmétologique. caractérisée en ce qu'elle contient un polymère ou une matrice polymérique cationique selon l'invention dans lequel est incorporé un principe actif à activité dermatologique et/ou cosmétique, et des excipients cosmétologiquement acceptables.
Les compositions alimentaires comprenant des polymères ou des matrices polymériques cationiques selon l'invention font partie de l'invention
Les polymères ou matrices polymériques selon l'invention, quelle que soit leur forme, peuvent être utilisés pour la préparation de médicaments, ou de vaccins, ce qui est un objet de l'invention.
La présente invention concerne également les polymères ou matrices selon l'invention, ou obtenus par un procédé selon l'invention, à titre de médicament. Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention, en décrivant certains modes de réalisation particuliers, et ne doivent pas être considérés comme limitant le champ de l'invention.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : hydrolyse de la fonction bétaïnée dans les polysaccharides fonctionnalisés par la glycine bétaïne dans les conditions citées dans l'exemple 4.
Figure 2 : hydrolyse de la fonction bétaïnée dans des polysaccharides fonctionnalisés par la butyrobétaïne (losanges) et la valérobétaïne (triangles) dans les conditions citées dans l'exemple 4.
Figure 3 : Suivi de l'élimination totale (fécale et urinaire) de différents polymères fonctionnalisés par la valérobétaïne, la butyrobétaïne ou le GTMA. Les résultats sont exprimés comme l'excrétion cumulée en fonction du temps.
Figure 4 : Suivi de l'élimination urinaire de différents polymères fonctionnalisés par la valérobétaïne, la butyrobétaïne ou le GTMA. Les résultats sont exprimés comme l'excrétion cumulée en fonction du temps.
Figure 5 : Suivi de l'élimination fécale de différents polymères fonctionnalisés par la valérobétaïne, la butyrobétaïne ou le GTMA. Les résultats sont exprimés comme l'excrétion cumulée en fonction du temps. Figure 6 : Cinétiques de relargage de l'ADN à pH 7.4 et 37°C à partir des complexes formés par les polymères dérivés par la Glycine bétaïne.
Figure 7 : Cinétiques de relargage de l'ADN à pH 7,4 et 37°C à partir des complexes formés par les polymères type Glucidex 6 dérivés par la Butyrobétaïne. Figure 8 : Cinétiques de relargage de l'ADN à pH 7,4 et 37°C à partir des complexes formes par les polymères type Waxylis 200 dérivés par la Butyrobétaïne.
EXEMPLES Exemple 1 : Synthèse de la valérobétaïne
Une quantité de 40 g (0.22 mol) d'acide bromovalérique (Fluka. Saint Quentin Fallavier) est solubilisée dans un volume de 250 ml de Dioxane (Prolabo, Paris) sous agitation magnétique. Un volume de 50 ml de Triméthylamine liquide (0.59 mole) est ajouté en maintenant la réaction à 0 °C pendant 30 minutes. La réaction est ensuite laissée 20 heures à température ambiante. Le dioxane et l'excès de triméthyl aminé sont éliminés par évaporation au moyen d'une pompe chimique à vide. Le produit obtenu est dissous dans de l'éthanol et recristallisé dans un mélange éthanol : eau (90 : 10 v/v). Le précipité obtenu est filtré et séché sous pression réduite.
On obtient de la valérobétaïne sous forme bromhydrate avec un rendement de récupération de 60 % et une pureté, analysée par HPLC et par titrage de la fonction carboxylate, supérieure à 90 %. L'identification du produit est faite par RMN du proton et du JC et on retrouve toutes les bandes caractéristiques du produit attendu.
Exemple 2 : Activation de la glycine bétaïne, butyrobétaïne et la valérobétaïne
Une masse de 25 grammes de glycine bétaïne (0.163 mol), butyrobétaïne (0,14 mol) (Sigma, USA) ou de valérobétaïne synthétisée selon l'exemple 1, est ajoutée par portions dans un ballon rodé contenant un volume de 65 ml de chlorure d'oxalyle (Fluka) (0,76 mole) sous agitation magnétique. On maintient sous agitation pendant 15 heures puis on chauffe pendant une heure à T = 45 °C.
L'excès de chlorure d'oxalyle et éliminé sous pression réduite et piégé sous vide sur une garde préalablement refroidie à l'azote liquide. La poudre récupérée est lavé 3 fois avec un volume de 200 ml d'éther de pétrole (SDS, Aucamville, France) puis séchée sous pression réduite. Le chlorure d'acide des dérivés de bétaïne est hygroscopique et il est donc récupéré dans une boîte à gants sous atmosphère à humidité contrôlée . La caractérisation se fait par RMN du proton et du ljC, le spectre des trois produits correspond parfaitement au produit attendu. Le rendement de chloration est déterminé par comparaison entre le titrage de l'acide carboxylique après hydrolyse ou après éthanolyse. La pureté des chlorures d'acide est aussi confirmée par analyse HPLC des bétaïnes correspondantes après hydrolyse. Rendement de chloration de la glycinebétaïne = 92 % Pureté = 76 %.
Rendement de chloration de la butyrobétaïne = 100 % Pureté = 85 %.
Rendement de chloration de la valérobétaïne = 100 % Pureté -= 75 %. Ces résultats sont conformes à la littérature où les rendements de chloration avec du chlorure d'oxalyle sont typiquement quantitatifs. La pureté du produit obtenu est due à la formation de sels d'oxalates mixtes avec les fonctions bétainées et la purification reste difficile. Le produit ainsi obtenu reste cependant parfaitement utilisable pour les réactions d'estérification ultérieures.
Exemple 3 : Préparation d'un polymère cationique par greffage de glycine bétaïne, butyrobétaïne ou valérobétaïne sur un squelette polymérique, polyhydroxylé du type polysaccharide (maltodextrine) Une quantité de 10 g de maltodextrine (hydrolysat d'amidon, PM= 8100,
Glucidex 2. Roquette Frères, Lestrem, France) est solubilisée dans un volume de 200 ml de diméthylformamide (Fluka, Suisse) contenant 25 ml de pyridine (Fluka, Suisse). La quantité de chlorure d'acide des différentes bétaïnes est rajoutée en fonction du taux de charge désiré. Lorsqu'on rajoute une mole de réactif par unité de sucre, on rajoute:
Chlorure d'acide de bétaïne: 0,062 mol soit 10,6 g de réactif.
Chlorure d'acide de butyrobétaïne: 0,062 mol soit 12,34 g.
Chlorure d'acide de valérobétaïne: 0,062 mol soit 13,21 g.
La réaction est maintenue sous agitation à température ambiante pendant environ 15 heures. Le polysaccharide (maltodextrine) fonctionnalisé est ensuite dilué avec 500 ml de tampon acétate 0,2 M pH 5.
La diméthylformamide. la pyridine, les sels de pyridinium, la bétaïne non greffée et le tampon acétate sont ensuite éliminés par ultrafiltration tangentielle sur une membrane de seuil de coupure 30 Kd (Filtron, France). La solution de polymère fonctionnalisé est diafiltrée contre de l'eau jusqu'à élimination totale des sels secondaires issus de la réaction. Le pH est alors contrôlé et ramené à 5 avec de l'acide chlorhydrique (Prolabo) si nécessaire.
On obtient une solution de polymère (maltodextrine) fonctionnalisée à une concentration de 25 g/1 en polymère. Le taux de charge de chaque polymère est déterminé par chromatographie
HPLC après hydrolyse de la fonction greffée. Les rendements de greffage sont tous d'environ 30 %. Glucidex2-Bétaïne 2 Rendement de greffage = 32 % Charge = 2 mEq/g. Glucidex 2-Butyro 1 ,8 Rendement de greffage = 30 % Charge = 1,8 mEq/g. Glucidex 2-Valéro 1 ,6 Rendement de greffage = 25 % Charge = 1,6 mEq/g.
Il est évident que pour un même greffon, différents taux de charge peuvent être obtenus en faisant varier simplement la quantité de réactif utilisé.
Exemple 4 : Dégradation "in vitro" des polymères
Les trois types de polymères fonctionnalisés obtenus dans l'exemple 3 sont solubilisés à 10 g/1 dans du tampon Phosphate pH 7,4 et maintenus à 37 °C. La perte de charge est suivie par analyse HPLC et exprimée sous forme de pourcentage de greffons hydrolyses par rapport au total contenu dans le polymère.
La Figure 1 représente la vitesse d'hydrolyse de la fonction bétaïnée dans les polysaccharides fonctionnalisés par la glycine bétaïne dans les conditions citées.
La Figure 2 représente la vitesse d'hydrolyse de la fonction bétaïnée dans des polysaccharides fonctionnalisés par la butyrobétaïne et la valérobétaïne dans les conditions citées.
Comme on pouvait s'y attendre, on constate sur ces deux graphes que plus la chaîne bétaïne est longue, plus les polymères cationiques obtenus sont stables.
Exemple 5 : Préparation de polymères non-dé radables à base de polysaccharide modifié par le glycidyl triméthyl ammonium
On a obtenu des polymères cationiques à partir de deux polysaccharides différents : une maltodextrine (Glucidex 2, Roquette Frères, France) et de l'amylopectine de mais (Waxylis 200, Roquette Frères. France), par application du même protocole. 50 g de polysaccharide sont dispersés dans 1 10 ml d'une solution 2M d'hydroxyde de sodium (NaOH, Prolabo, France) dans une réacteur en verre muni d'une pale d'agitation mécanique. Une fois la solubilisation complète du polysaccharide obtenue on ajoute 31 g (0,2 mol) de glycidyl triméthyl ammonium (GTMA, Fluka, Suisse) et la réaction est laissée à température ambiante pendant 8 heures.
On neutralise avec de l'acide acétique, on amène à un volume de 1,5 litres avec de l'eau osmosée et on diafiltre contre de l'eau osmosée. La diafiltration est réalisée dans un système d'ultrafiltration Minissette (Pall-Filtron, France) équipé d'une membrane d'ultrafiltration de point de coupure 30 kD. Une fois la conductivité du filtrat inférieure à 20 μSiemens, la suspension de polysaccharide modifié est concentrée et filtrée sur une membrane 0.45 μm (Gelman, France).
Les deux suspensions de polysaccharide modifié sont caractérisées par leur concentration et la teneur en ammonium quaternaire par analyse élémentaire d'azote.
Glucidex 2 - GTMA 1,8
Concentration : 25 g/1
Taux de fonctionnalisation : 1.8 mEq d'ammonium quaternaire par gramme de polymère.
Waxylis 200-GTMA 2
Concentration : 15 g/1
Taux de fonctionnalisation : 2 mEq d'ammonium quaternaire par gramme de polymère. Dans ce cas, les fonctions ammonium quaternaire sont greffées sur le polysaccharide par une liaison éther très stable.
Exemple 6 : Toxicité aiguë des polymères bétaïnes comparés à leurs homologues non bioéliminables Protocole : des souris Cri CD-1(ICR)BR (Centre d'élevage Charles RIVER, 76 410 Saint-Aubin- lès-Elbeuf) (50 mâles et 50 femelles) ont été partagées en groupes de 10 souris (5 mâles et 5 femelles). On a administré par voie intraveineuse à différentes doses les polymères obtenus dans les exemples 3 et 5 avec un témoin de maltodextrine non modifiée (polymère neutre) : Glucidex 2-Butyro 1,8
Glucidex 2-Valéro 1 ,6 Polymère neutre (Glucidex 2) Glucidex 2-GTMA 1,8 Un groupe contrôle de 10 souris (5 mâles et 5 femelles) a reçu une administration intraveineuse du véhicule dans les mêmes conditions. Après administration l'étude a porté sur: des examens cliniques et un suivi de la mortalité un suivi du poids pondéral avec une pesée des animaux la veille de l'essai soit àj-1 ainsi qu'aux jours +1. +4. +6, +1 1 , +14.
Tous les animaux mourant en cours d'étude ont été autopsiés dans les meilleurs délais et leurs principaux organes (foie, rate, rein, estomac, intestin, poumons, cœur) ont été observés macroscopiquement. Tous les animaux survivants à la fin de la période d'observation de 14 jours ont été sacrifiés et autopsiés et les principaux organes (comme cités précédemment) ont été observés macroscopiquement
Résultats : pour le polymère fonctionnalisé par le GTMA (Glucidex 2-GTMA 1,8), la mortalité est de 20 % et 50 % aux doses respectives de 20 et 25 mg/kg. La dose maximale non létale pour ce produit est égale à 18 mg/kg après administration intraveineuse chez la souris. A cette dose, aucun signe clinique n'a pu être observé.
Pour le polymère neutre, la dose maximale non létale est égale ou supérieure à 100 mg/kg après administration intraveineuse chez la souris. A cette dose, aucun signe clinique n'a pu être observé.
Pour le Glucidex 2-Butyro 1 ,8 une mortalité de 40% est observée à la dose de 74,5 mg/kg. Aucune mortalité n'ayant été observée à la dose de 37.25 mg/kg. la dose maximale non létale du Glucidex 2 cationique fonctionnalisé Butyrobétaïne semble être égale à 37.25 mg/kg après administration intraveineuse chez la souris. A cette dose, aucun signe clinique n'a pu être observé.
Pour le produit Glucidex 2-Valéro 1,6 administré à la dose de 30 mg/kg i.v., une mortalité de 50 % a été observée dès le premier jour de l'étude. A la dose de 20 mg/kg, aucune mortalité n'a été observée. Ainsi, pour le Glucidex 2 cationique fonctionnalisé Valérobétaïne la dose maximale non létale est égale à 20 mg/kg après administration intraveineuse chez la souris. A cette dose, aucun signe clinique n'a pu être observé.
Parallèlement le suivi du poids corporel des animaux ne montre aucune modification de la courbe de poids attribuable à l'administration des produits testés.
Les résultats montrent que la toxicité aiguë des polymères cationiques est fortement influencée par la nature du greffon utilisé. Ainsi le polymère greffé par la butyrobétaïne qui est fortement et rapidement bioéliminable présente la plus faible toxicité aiguë chez la souris avec une DL50 d'environ 75 mg/kg. A l'inverse le polymère fonctionnalisé par le GTMA et très faiblement bioéliminable présente la toxicité aiguë la plus sévère avec une DL50 de 25 mg/kg chez la souris.
Exemple 7 : Préparation d'un polymère cationique par greffage de la butyrobétaïne sur un squelette polymérique non polysaccharidique (alcool polvvinylique)
Cet exemple montre la possibilité de réaliser la réaction d'estérification en milieu aqueux, et non pas seulement en milieu diméthyl formamide. Les rendements peuvent être sensiblement améliorés par l'étude des conditions de pH, température et concentration. 20 g d'alcool polyvinylique ( Mw : 22000, Fluka, Suisse) sont placés dans un réacteur en verre à double enveloppe connecté à un groupe thermostatique et dispersés avec 100 ml d'eau osmosée puis portés à 80°C pendant 2 heures pour obtenir une solution visqueuse d'alcool polyvinylique qui est ensuite refroidie à température ambiante. On ajoute alors 10 ml de tampon phosphate 0,5 M pH 7,5 et on maintient le mélange sous agitation mécanique, on refroidit le mélange à 4 °C.
Le réacteur est ensuite équipé d'une électrode pH connectée à un contrôleur de pH contenant de l'hydroxyde de sodium 2M. La consigne du contrôleur de pH est fixée à pH 7,5.
On ajoute alors de façon progressive 10 g de chlorure d'acide de butyrobétaïne (exemple 2). Le pH est maintenu à 7,5 et la température à 4°C pendant la réaction.
A la fin de l'addition du réactif la réaction est laissée 30 minutes à 4 °C puis diluée avec 200 ml de tampon acétate 0,2 M pH 5. On diafiltre contre de l'eau osmosée dans un système d'ultrafiltration Minissette (Pall-Filtron) équipé d'une membrane de point de coupure 10 kD.
On récupère une solution aqueuse d'alcool polyvinylique modifié par des groupements ester de butyrobétaïne à 25 g/1 . Le taux d'estérification mesuré par analyse d'azote élémentaire est de 0,3 mEq/g. Ceci implique un rendement de réaction en milieu aqueux de 15 %. Exemple 8 : Préparation d'une matrice nanoparticulaire réticulée par l'épichlorhydrine et greffée avec de la valérobétaïne
Une quantité de 100 g de polysaccharide (Glucidex 6. Roquette Frères) est dispersée dans 160 ml d'eau. Lorsque la suspension est homogène un volume de 40 ml de soude 10M est ajouté. La solution alcaline de polysaccharide est maintenue sous agitation jusqu'à l'obtention d'une solution translucide. Une quantité de 8,15 g (soit 88,2 mmol) d'épichlorhydrine (Sigma, USA) est alors ajoutée. On laisse pendant une nuit sous agitation douce. On observe une gélification du polysaccharide. Un volume d'environ 2 litres d'eau est ajouté et le pH est ajusté entre 5 et 6 avec de l'acide acétique. Cette suspension est pré-homogénéisée avec un Ultra-Turrax modèle T-25 (IKA, Bioblock) puis homogénéisée à une pression de 900 bars à l'aide d'un homogénéisateur Minilab H-80 (Rannie. Danemark) afin d'obtenir des nanoparticules de 50 à 100 nm (analyseur submicronique Coulter N4SD. Coultronics, USA).
Ces nanoparticules sont ensuite purifiées par ultrafiltration sur une membrane de 30kD (système d'ultrafiltration Minisette. Filtron, Pall Gelman
Sciences. USA). La suspension de particules est ensuite purifiée par micro-filtration sur une membrane 0.2 μm (Spiral-Cap, Pall Gelman Sciences. USA) et les particules sont séchées par lyophilisation.
Une quantité de 5 g de particules polysaccharidiques obtenues précédemment est dispersée dans un volume de 200 ml de diméthylformamide contenant 25 ml de pyridine. Une quantité de 5,5 g (27 mmol) de chlorure d'acide de valérobétaïne (obtenu selon l'exemple 2) est ajoutée. La réaction est laissée sous agitation pendant une nuit. La suspension de nanoparticules dérivées est diluée avec 500 ml de tampon acétate 0,2 M pH 5,5 puis lavée par ultrafiltration sur une membrane de 30 kD (Filtron, France) en réalisant une diafiltration contre de l'eau osmosée. Lorsque la conductivité du filtrat est inférieure à 30 μS/cm, le produit est récupéré après concentration. Le pH est contrôlé et ajusté entre 4 et 6 avec de l'acide chlorhydrique.
On obtient une suspension aqueuse de nanoparticules ayant les caractéristiques suivantes :
Concentration (Poids sec) =26 g/1
Taille des nanoparticules (Coulter N4SD) = 1 10 nm. Potentiel Z (Malvern série 3000, Tampon Phosphate 15 mM, pH7): +20 mV
Taux de charge (HPLC) = 2,5 mEq fonction bétaïne / g de particules Des particules de tailles différentes peuvent être obtenues de la même façon en utilisant des taux d'épichlorhydrine différents ou des pressions de broyage différentes.
Exemple 9 : Préparation d'une matrice réticulée par l'oxychlorure de phosphore et greffée avec de la valérobétaïne
Une quantité de 50 g de maltodextrine PM : 3400 (Glucidex 6. Roquette
Frères, France) est dispersée dans 225 ml d'eau. Lorsque la suspension est homogène, on ajoute 25 ml de soude 10M. Après solubilisation totale, la solution est portée à une température comprise entre 0 et 4°C à l'aide d'un groupe froid
(Neslab RTE300, Newington, USA). L'ajout de l'agent réticulant (oxychlorure de phosphore POCl3, Sigma. USA) se fait à l'aide d'une pompe dosimétrique (pompe
Dosimat DL25. Mettler Toledo, Suisse) à une vitesse de 0,1 ml/min. POCl3 est rajouté dans des proportions de 0,5 mEq/g soit 0,025 mol (3,83 g). Lorsque tout le réactif est ajouté, on maintient encore l'agitation pendant 1 heure. Un volume de
500 ml d'eau est ajouté ainsi qu'un volume de 20 ml d'acide acétique afin d'ajuster le pH entre 4 et 5. Le gel est pré-homogénéisé à l'aide de l'Ultra-Turrax IKA modèle
T-25 puis homogénéisé à une pression de 900 bars à l'aide d'un homogénéisateur
Minilab H-80 (Rannie) afin d'obtenir des nanoparticules de 50 à 100 nm. La suspension est ensuite diafiltrée contre 2 litres d'une solution 0.1 M de chlorure de tetraméthylammonium puis contre de l'eau osmosée (4 litres) puis microfiltrée sur une membrane de 0,45 μm (SuporCap de 0,45 μm. Pall Gelman Sciences). La suspension de particules ainsi obtenue est ensuite séchée par lyophilisation.
Les caractéristiques des nanoparticules sont: Taille (Coulter N4SD): 60 nm
Taux de phosphore (analyse de phosphore total) = 0,4 mEq / g Taux de réticulation (titrage acide-base) = 0.2 mEq/g. Une quantité de 8,36 g des particules obtenues est dispersée dans un volume de 210 ml de diméthylformamide contenant 25 ml de pyridine. 5,4 g (soit 25,8 mmol) de chlorure d'acide de valérobétaïne (synthèse exemple 2) sont ajoutés. On laisse sous agitation pendant une nuit. La suspension de nanoparticules dérivées est diluée dans 500 ml de tampon acétate 0,2 M pH 5,5. La suspension est ensuite lavée par ultrafiltration sur une membrane de 30 kD (système d'ultra filtration Minisette, Filtron, Pall Gelman) contre de l'eau osmosée puis concentrée avant récupération. Le pH est contrôlé et ajusté entre 4 et 6 avec de l'acide chlorhydrique. Les nanoparticules sont purifiées par micro filtration sur une membrane de 0,2 μm (Spiral-Cap 0,2 μm, Pall Gelman Sciences). Concentration (poids sec) = 13 g/1 Taille des nanoparticules (Coulter N4SD) = 120 nm. Taux de fonction bétaïne (HPLC) = 0.9 mEq/g
Exemple 10 : Préparation d'un polymère cationique par greffage de la butyrobétaïne sur un squelette polymérique ramifié à haut poids moléculaire (amylopectine)
Une Quantité de 10 g d' amylopectine (Waxylis 200. Roquette Frères, Lestrem. I l nce) est dispersée dans un volume de 200 ml de diméthylformamide (Flukr Suisse) contenant 25 ml de pyridine (Fluka, Suisse). On ajoute le chlorure d'aci . .. la butyrobétaïne préparé selon l'exemple 2 ( 62 mmol, 12.34 g)
On maintient sous agitation à température ambiante pendant environ 15 heures. Le polysaccharide fonctionnalisé est ensuite dilué avec 500 ml de tampon acétate 0,2 M pH 5,5.
La diméthylformamide, la pyridine, les sels de pyridinium, la bétaïne non greffée et le tampon acétate sont ensuite éliminés par ultrafiltration tangentielle sur une membrane de seuil de coupure 30 kD (Filtron, France). La solution de polymère fonctionnalisé est diafiltrée contre de l'eau jusqu'à la totale élimination des sels secondaires issus de la réaction. Le pH est alors contrôlé et ramené à 5 avec de l'acide chlorhydrique (Prolabo) si nécessaire. On obtient une solution de polymère (amylopectine) de haut poids molaire fonctionnalisé, à une concentration de 15 g/1 en polymère. Le degré de fonctionnalisation du polymère est déterminé par HPLC du greffon butyrobétaïne après hydrolyse alcaline et est estimé à 2.2 mEq/g
Exemple 1 1 : Bioélimination comparée des polymères fonctionnalisés par des bétaïnes ou par du GTMA Protocole : on administre par voie intraveineuse à la dose de 5 mg/kg des produits suivants marqués de façon covalente au carbone 14 à des rats Sprague-Dawleys (Centre d'élevage Charles RIVER 76 410 Saint-Aubin- lès-Elbeuf) :
Glucidex 2-Butyro 1 ,8 Glucidex 2-Valéro 1 ,6
Glucidex 2-GTMA 1 ,8
Waxylis 200-GTMA 2
Waxylis 200 non modifié
Pour chaque animal et de façon individuelle les urines et les fèces sont collectées durant les 14 jours qui suivent l'administration. A la fin de l'étude les animaux sont sacrifiés et différents organes (notamment le foie et la rate) sont collectés. L'ensemble des échantillons, après traitement, est analysé par scintillation liquide. Résultats Les figures 3 à 5 résument les résultats obtenus en terme d'élimination urinaire et fécale après administration intraveineuse des différents polymères. Ces résultats montrent la forte élimination notamment urinaire des polymères fonctionnalisés par la valérobétaïne et la butyrobétaïne par comparaison aux polymères fonctionnalisés par le GTMA. En effet, ces derniers polymères sont faiblement bioéliminables et 14 jours après administration près de 60 % du produit est toujours présent dans la carcasse des animaux.
Il a été possible de vérifier que la forte rétention des produits fonctionnalisés par le GTMA est liée à une forte captation hépato-splénique et à une non métabolisation de ces produits dans ces organes. On peut noter que les deux polymères dégradables montrent une bioélimination équivalente à celle du polysaccharide (Waxylis 200) non modifié. La comparaison des polymères fonctionnalisés par la valérobétaïne ou la butyrobétaïne montre que la vitesse d'élimination des produits semble fortement influencée par la nature du greffon. En effet le polymère butyrobétaïne est plus rapidement éliminé par voie urinaire que son homologue valérobétaïne.
L'élimination fécale des polymères peut s'interpréter comme une captation hépatique suivie d'une métabolisation dans cet organe de ce type de polymère. Dans cette hypothèse la différence d'élimination des deux polymères semble confirmer la différence de cinétique de dégradation de ceux-ci. En effet, pour les polymères fonctionnalisés par la valérobétaïne, plus lentement métabolisés dans l'espace plasmatique, une fraction plus importante est certainement captée par le foie pour y être métabolisée. Ainsi, il est possible de modifier la cinétique de dégradation in vivo de polymères cationiques fonctionnalisés par des greffons bétaïnes en adaptant la nature de la chaîne aliphatique du greffon à la stratégie envisagée.
Exemple 12. Formation de complexes particulaires entre les polymères cationiques betaïnés et le DNA et cinétiques de relargage in vitro
Différents types de polymères cationiques dérivés par la glycine bétaïne ou la butyrobétaïne sont préparés selon l'exemple 3. en utilisant deux types de polysaccharides , le Glucidex 6 (maltodextrin. Roquette Frères, masse molaire approx. 3400 Kd) et du Waxylis 200 (Amylopectine. Roquette Frères, Masse Molaire 1-100 Md). Les caractéristiques de chaque polymère préparé sont décrites dans le Tableau 1.
Figure imgf000025_0001
100 μg d'un plasmide modèle (pPBShAAThFIX) possédant 6600 paires de bases est dissous dans 100 μl d'eau dans un tube eppendorf. On ajoute la quantité nécessaire de polymère pour neutraliser la moitié (50 %) ou deux fois (200 %) la charge du DNA par les fonctions cationiques. L'opération est réalisée sous agitation (Vortex). Le volume de la formulation est ensuite ajusté à 1 ml par addition de 100 μl de tampon acétate 200 mM, pH 5.3 et de l'eau osmosée en q.s.p pour 1 ml.
On observe la formation de complexes particulaires qui sont analysés par dispersion de lumière (Coulter N4D. Coultronics). Le taux complexation du DNA est analysé par électrophorèse sur gel d'agarose 0.7 %. Les caractéristiques de échantillons obtenues sont résumées dans le Tableau 2.
Tableau 2 : Echantillons préparés par complexation du DNA (100 μg) avec les différents polymères du Tableau 1.
Figure imgf000026_0001
Le taux du DNA libre est déterminé par électrophorèse sur gel d'agarose 0,7 % . Les mesures de taille sont réalisées sur Coulter N4D, Coultronics.
Pour les études de relargage, 900μl de formulations sont additionnés de lOOμl de tampon phosphate 1 M pH 7.4 et placées à 37°C. Des échantillons sont prélevés à différents temps et analysés par électrophorèse sur gel d'agarose 0,7 % afin de déterminer la fraction du DNA libéré.
La Figure 6 présente les résultats de relargage obtenus avec les polymères de différentes masses molaires et charges dérivés par la bétaïne. On observe clairement une libération du DNA avec des cinétiques variables en fonction du ration de charge polymère/DNA et de la masse molaire du polymère. Toutes les cinétiques sont néanmoins finies dans quelques heures, indiquant une influence prédominante de la vitesse d'hydrolyse du greffon glycine bétaïne. La Figure 7 présente les résultats obtenus avec les polymères type Glucidex
6 dérivés par la butyrobétaïne et la Figure 8 ceux obtenus avec les polymères type Waxylis 200 dérivés par la butyrobétaïne. Dans ce cas les cinétiques de relargage sont plus longues (jours) indiquant à nouveau un effet prédominant de la vitesse d'hydrolyse du greffon. Dans un degré moindre, les cinétiques dépendent aussi de la charge et masse molaire du polymère ainsi que du ratio de charge entre les polymères et le DNA.

Claims

REVENDICATIONS
1. Polymère cationique caractérisé en ce qu'il consiste en un squelette polymérique polyhydroxylé sur lequel sont greffés des ligands cationiques par des liaisons hydrolysables en milieu physiologique, dont la vitesse de dégradation est contrôlée par la structure du ligand cationique utilisé.
2. Polymère cationique selon la revendication 1. caractérisé en ce que la liaison (squelette polymérique) - (ligand cationique) est une liaison ester sur les groupements hydroxyles dudit squelette polymérique.
3. Polymère cationique selon l'une des revendications 1 ou 2. caractérisé en ce que les ligands cationiques contiennent des ammoniums quaternaires, des aminés tertiaires ou des aminés secondaires.
4. Polymère cationique selon l'une des revendications 1 à 3. caractérisé en ce que les ligands cationiques répondent à la formule générale (2) ou sa forme saline : R,
I
R2 -N+ - Y - COO " formule générale (2)
1 3 où Y est une chaîne aliphatique de 1 à 16 carbones, saturée ou non, ramifiée ou non, substituée ou non ; Ri, R , R3, identiques ou différents sont choisis parmi -H et -CH3.
5. Polymère cationique selon la revendication 4, caractérisé en ce que les ligands cationiques répondent à la formule générale (1) ou sa forme saline :
* OOC - Y - N (CH3)3 + formule générale ( 1 ) où Y est une chaîne aliphatique de 1 à 16 carbones, saturée ou non, ramifiée ou non, substituée ou non.
6. Polymère cationique selon l'une des revendications 1 à 5. caractérisé en ce que la vitesse de dégradation est modulée par l'utilisation de mélanges de greffons cationiques répondant à la formule générale (1) ou (2).
7. Polymère cationique selon l'une des revendications 5 et 6. caractérisé en ce que les ligands cationiques répondant à la formule générale (1 ) sont de la famille des bétaïnes.
8. Polymère cationique selon la revendication 7, caractérisé en ce que les ligands cationiques sont choisis dans le groupe constitués de la glycine bétaïne, la butyrobétaïne, la valérobétaïne, la carnitine ou leurs dérivés.
9. Polymère cationique selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le squelette polymérique polyhydroxylé est constituée de polysaccharides, d'oligosaccharides ou d'alcool polyvinylique.
10. Polymère cationique selon la revendication 9, caractérisé en ce que le polysaccharide est choisi parmi le dextrane, l'amidon, la cellulose, le polygalactose, le polymannose, ou leurs dérivés.
1 1. Matrice polymérique caractérisée en ce qu'elle est obtenue par réticulation ou copolymérisation du polymère cationique selon l'une des revendications 1 à 10.
12. Matrice polymérique cationique caractérisée en ce qu'elle est obtenue par greffage de ligands cationiques de formule générale (2) sur un squelette polymérique polyhydroxylé préalablement réticulé ou copolymérisé.
13. Matrice polymérique cationique caractérisée en ce qu'elle est obtenue par greffage de ligands cationiques de formule générale (1) sur un squelette polymérique polyhydroxylé préalablement réticulé ou copolymérisé.
14. Matrice polymérique cationique selon l'une des revendications 1 1 à 13, caractérisé en ce qu'elle se présente sous la forme d'un film, d'un patch, d'une particule ou d'une nanoparticule.
15. Polymère cationique selon l'une des revendications 1 à 10 ou matrice polymérique selon l'une des revendications 1 1 à 14, caractérisé en ce que l'on y incorpore une molécule à activité biologique.
16. Polymère cationique selon l'une des revendications 1 à 10 ou 15, ou matrice polymérique selon l'une des revendications 1 1 à 15, caractérisé en ce qu'il est utilisé par voie parentérale, mucosale ou topique.
17. Procédé de préparation d'un polymère cationique selon l'une des revendications 1 à 10, 15 ou 16, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a. de façon optionnelle, on synthétise un ligand répondant à la formule générale (2) contenant une fonction carboxylate et une fonction ammonium quaternaire, aminé tertiaire ou secondaire ; b. on effectue l'activation du groupement carboxylate porté par le ligand cationique ; c. on effectue une réaction d'estérification sur les groupements hydroxyles du squelette polyhydroxylé.
18. Procédé de préparation d'une matrice polymérique cationique selon l'une des revendications 1 1 à 16. caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a. de façon optionnelle, on synthétise un ligand répondant à la formule générale (2) contenant une fonction carboxylate et une fonction ammonium quaternaire, aminé tertiaire ou secondaire ; b. on effectue l'activation du groupement carboxylate porté par le ligand cationique ; c. on effectue une réaction d'estérification sur les groupements hydroxyles du squelette polyhydroxylé qui peut avoir été préalablement réticulé ou copolymérisé ; d. si nécessaire, on réticule ou copolymérisé le polymère obtenu en c. afin d'obtenir une matrice polymérique.
19. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient un polymère cationique selon l'une des revendications 1 à 10, 15 ou 16 ou obtenu par un procédé selon la revendication 17, ou une matrice polymérique selon l'une des revendications 1 1 à 16 ou obtenue par un procédé selon la revendication 18, dans lequel est incorporé un principe actif et un support pharmaceutiquement acceptable pour son administration.
20. Composition cosmétologique, caractérisée en ce qu'elle contient un polymère cationique selon l'une des revendications 1 à 10, 15 ou 16 ou obtenu par un procédé selon la revendication 17, ou une matrice polymérique selon l'une des revendications 1 1 à 16 ou obtenue par un procédé selon la revendication 18, dans lequel est incorporé un principe actif à activité dermatologique et/ou cosmétique et des excipients cosmétologiquement acceptables.
21. Composition à usage alimentaire, caractérisée en ce qu'elle contient un polymère cationique selon l'une des revendications 1 à 10, 15 ou 16 ou obtenu par un procédé selon la revendication 17, ou une matrice polymérique selon l'une des revendications 1 1 à 16 ou obtenue par un procédé selon la revendication 18.
22. Utilisation d'un polymère cationique selon l'une des revendications 1 à 10, 15 ou 16 ou obtenu par un procédé selon la revendication 17 ou d'une matrice polymérique cationique selon l'une des revendications 1 1 à 16 ou obtenue par un procédé selon la revendication 18, pour la préparation d'une composition utilisable à titre de médicament ou de vaccin.
23. Utilisation d'un polymère cationique selon l'une des revendications 1 à 10. 15 ou 16 ou obtenu par un procédé selon la revendication 17 ou d'une matrice polymérique cationique selon l'une des revendications 1 1 à 16 ou obtenue par un procédé selon la revendication 18, pour la fabrication d'une composition caractérisée en ce qu'il s'agit d'un complexe (polymère ou matrice) - (principe actif), ledit polymère ou ladite matrice assurant le relargage contrôlé dudit principe actif.
24. Utilisation selon la revendication 23. caractérisée en ce que ledit principe actif est un principe actif polyanionique.
25. Utilisation selon la revendication 24, caractérisée en ce que ledit principe actif est choisi dans le groupe constitué de l'ADN, l'ARN, les oligonucléotides simple ou double brins, leurs variants et un mélange de ces produits.
26. Polymère cationique selon l'une des revendications 1 à 10, 15 ou 16 ou obtenu par un procédé selon la revendication 17 ou matrice polymérique cationique selon l'une des revendications 1 1 à 16 ou obtenue par un procédé selon la revendication 18, à titre de médicament.
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