WO2001051090A2 - Matrices polymeriques amphiphiles et ioniques et derives de telles matrices - Google Patents

Matrices polymeriques amphiphiles et ioniques et derives de telles matrices Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a new type of polymeric matrix characterized in that it carries a positive or negative charge and in which is incorporated a lipid phase of charge opposite to that of the matrix.
  • the invention also relates to their method of manufacture and their use.
  • liposomes generally consisting of a sheet of phospholipids (Liposome: a practical approach, 1990, RRC New (Ed), LRL Press, Oxford University Press).
  • Liposomes can transport polar compounds inside, they can also transport hydrophobic compounds in their phospholipid sheet as well as dissolve "difficult" compounds, thanks to the particularly detergent nature of the lipid sheet. These particles however have the disadvantage of being relatively unstable, difficult to manufacture in a controlled manner and having problems of leakage of the active principle.
  • lipobeads Pan et al, FEBS Letters 1996, 397, p.70-4
  • solid-core liposomes EP 277776 The University of Tennessee Research Corporation
  • BNSM TM EP 687173 Biovector Therapeutics
  • Such matrices can be positively or negatively charged by grafting of suitable ionic charges and the person skilled in the art knows the different manufacturing processes. Those skilled in the art know how to manufacture particles of predetermined size from these matrices, for example by extrusion. These matrices can be used for stabilization and release of polar compounds using the ion exchange mechanisms. But these mechanisms are difficult to control.
  • the Applicant provides an original response to this problem of developing new systems combining hydrophobicity and ionicity properties.
  • the Applicant has highlighted new polymeric matrices which have very interesting ionicity and hydrophobicity properties distributed homogeneously in said matrix. Furthermore, one of the advantages of the matrices according to the invention is that the hydrophobic and / or ionic character of the matrix can be modulated in a very simple manner, without the need to change many parameters.
  • the invention relates to polymeric matrices, characterized in that they comprise a hydrophilic macromolecular matrix, non-liquid carrying a positive or negative ionic charge and in which is incorporated a lipid phase of charge opposite to that of the matrix.
  • the polymer matrices according to the invention have an amphiphilic and ionic character, dispersed homogeneously in the matrix. This character can be adjusted as a function of the quantity and the nature of the lipids incorporated in the hydrophilic polymeric starting matrix.
  • the hydrophilic matrix consists of linear or branched polymer whose ionic charge is naturally or chemically grafted.
  • the polymer can be natural or synthetic, homopolymer or copolymer (block (block), grafted (graft) or random (random)) or a mixture of polymers.
  • Ionic polymers already containing hydrophobic parts can also be used for the implementation of the invention, as long as the insertion of a lipid phase makes it possible to modulate the hydrophobicity of these polymers.
  • the linear or branched polymer is a polyhydroxylated polymer, that is to say that each monomer has at least one free hydroxyl group.
  • the matrix consists in particular of polysaccharides or oligosaccharides, but other polymers can also be used, as the examples demonstrate.
  • a polysaccharide is preferably chosen from dextran, chitosan, starch, amylose or amylopectin or mixtures, cellulose, polygalactose, polymannose and their derivatives.
  • the matrix of the invention can also be composed of natural or synthetic ionic polymers such as alginates or carbopol, known for their property of matrix formation spontaneously in the presence of multivalent ions.
  • the polymer matrix according to the invention comprises a hydrophilic matrix which can be crosslinked naturally or chemically.
  • the polymer matrix can be positively or negatively charged, by grafting of ionic, cationic or anionic groups, with the monomers, preferably sugars, composing the polymer.
  • groups can be chosen from quaternary ammonium or tertiary amine functions, phosphates, sulfates, carboxyethyls, succinates, etc.
  • the processes for grafting charges are well known to those skilled in the art.
  • the lipid phase penetrating the polymers can consist of different types of natural or synthetic lipids, among which: - anionic lipids in general, in particular anionic phospholipids such as phosphatidyl glycerol or phosphatidyl serine (and in particular DPPG (diacyl phosphatidyl glycerol) and DPPS (diacyl phosphatidyl serine)), phosphatidic acids, anionic surfactants such as salts of long chain fatty acids, short or long chain fatty acids, cardiolipins, alkyl sulfates, sulfated glycerides, alkylpolyethoxy ether sulfates, alkylpolyethoxy ether carboxylates, alkyl sulfonates, mono or dialkyl phosphates of cationic compounds such as alkyl or dialkyl ammoniums (in particular diacyl dimethyl ammonium, and acyltrimethylammonium
  • DOTAP racylcarnitine
  • esters of long chain betaines the esters of long chain betaines.
  • the lipids which can be used for the invention are compounds which are insoluble in water, which tend to be in micellar form (detergent) or in lamellar form (phospholipids). Penetration is induced by an energy supply (temperature) allowing the lipids to thin and allowing the ionic interaction to be effective. Once the lipids have penetrated, the drop in temperature allows the trapping of the lipids permanently.
  • the preferred lipids are those of anionic phospholipid type or their cationic analogs, that is to say, the charged groups derived by 2 or more fatty acid chains whose solubility in water is so low that it is considered that they are always in organized form.
  • the lipids incorporated in the hydrophilic polymer are organized in such a way that the hydrophobic zone is homogeneous and is stable in the matrix.
  • the Applicant has shown that the matrices compact more and more as a function of their lipid load. This compaction can only be explained by a hydrophobic interaction between the lipid counterions and not by a charge neutralization phenomenon, since it has been shown that by neutralizing the charge with less lipid counterions (fatty acids with short chain), this compaction is no longer done.
  • amphiphilic matrices simply by using branched polymers of sufficiently large size.
  • the Applicant has shown (Example 12) that by using cationized amylopectin (naturally branched polysaccharide) molecules, of very high molecular weight (up to 100 million Daltons), it is possible to obtain vesicular amphiphilic matrices whose size is about 100 to 250 nm.
  • the incorporation of the lipid phase of opposite charge in this type of polymer causes a spontaneous contraction of the polymer molecules by hydrophobic interaction and the formation of nanometric amphiphilic matrices effective for the transport of the active ingredients.
  • the suspension of very hydrophobic compounds preferably of charge opposite to the matrix (vitamins, trans-retinoic acid, hormones, antidepressants), but which can also be neutral (in particular apolar hormones such as Pestradiol, valerate d estradiol, prostaglandins with central action), - the stabilization of polar compounds of opposite charge to that of the matrix, which are incorporated by ionic interaction, and whose molecule may have an apolar part,
  • the system therefore makes it possible to stabilize active principles sensitive to conventional degradations in an aqueous medium, which is in particular illustrated in example 18 of stabilization of trans-retinoic acid.
  • lipids can be made to penetrate inside the starting matrix after this has been determined. Conversely, it is also possible to prepare the amphiphilic polymeric matrices according to the invention and to model them subsequently. The Applicant has found that the lipid loading capacity of these matrices is linked to their ionic loading capacity.
  • the lipid load rate is limited around 60-80% of load neutralization. From this limit, precipitation phenomena are observed because the particles become too hydrophobic. They can then optionally be stabilized using conventional neutral emulsifiers, whether detergents, surfactants or phospholipids which are nonionic or zwitterionic.
  • these matrices are particularly effective for:
  • mucosal route in particular nasal, vaginal, buccal
  • transport of antigens for vaccine use in particular by mucosal route, in particular by nasal route
  • oligonucleotides DNA, RNA or the like
  • the compounds according to the invention can also be administered by the dermal route, in particular as a "patch".
  • the polymeric matrices according to the invention can be sterilized. They can also be frozen.
  • the invention also relates to a process for the preparation of a polymer matrix, characterized in that: a) A hydrophilic polymer matrix carrying a positive or negative overall charge is prepared. b) The lipid solution of opposite charge to that of the matrix is prepared. c) A mixture of the two solutions is carried out with stirring, so that the lipid phase completely penetrates into the polymer matrix or the nucleus.
  • the lipid phase fully penetrates the polymer matrix or the nucleus (in particular the different proportions and the contact times). It may sometimes be necessary to heat the lipid phase to a sufficient temperature in order to thin it and to facilitate its entry into the polymer phase.
  • the temperature conditions depend on the type of lipids and the polymer matrix used. However, in general, the temperatures useful for implementing the method according to the invention will be in a range from 20 to 95 ° C, preferably from 40 to 80 ° C.
  • the active ingredients can be introduced into the polymer matrices at different stages of manufacture, depending on their charge and their hydrophobicity. In particular, it is advantageous to produce the matrices and to charge them with active principle thereafter, but it is also possible to introduce the active principle during the preparation of the lipid phase and / or of the manufacture of the polymer with stirring. .
  • the amphiphilic and ionic matrices according to the invention can therefore be used for the incorporation of active principles. It is remarkable that the matrices of small sizes (submicron), having incorporated an active principle can undergo sterilizing filtration, in particular sterilizing filtration under 0.2 ⁇ m, without significant loss of material. By significant loss of material is meant a loss of at most 15% of material, more preferably at most 10%, most preferably at most 5% of material.
  • the matrices according to the invention having incorporated an active principle have extremely advantageous properties. Indeed, the Applicant has highlighted the fact that the polymer matrix - active principle complexes allow not only the solubilization of insoluble active principles, but also the protection and stabilization of said active principles.
  • the matrices according to the present invention are also particularly suitable for the stabilization of active principles in suspensions in isotonic medium, in particular for an injectable application.
  • the matrices according to the invention because of their chemical structure, are particularly well suited for oral or mucosal use, but can also be used for the administration of active principles by parenteral or topical route.
  • the matrices according to the invention make it possible to improve the effects linked to these different types of administration (in particular the bioavailability and the stability of the active principles).
  • the present invention is also directed towards a process for modifying the rate of release of an active principle, characterized in that it contains the steps of: a) preparation of matrices according to the invention, with variations in size and / or of lipid phase composition, with possible incorporation of said active principle, b) incorporation of said active principle in the matrices prepared in step a), if it was not incorporated during step a) c ) study of the modification of the rate of release of the active principle as a function of the structure of the matrix.
  • step c) can be carried out in vitro, in particular in dissolution media, or in vivo, in appropriate animal models. Furthermore, it is possible to incorporate the active principle in the matrices directly during the preparation of said matrices or subsequently. This method thus makes it possible to determine the. matrix according to the invention to be chosen for the encapsulation of active ingredients, and the preparation of pharmaceutical or cosmetic compositions having properties for releasing the predetermined active ingredients. This is valid whatever the mode of administration chosen.
  • solubilization of active ingredients in the form of very small matrices should have the important consequence of improving the availability (speed and efficiency of absorption, bioavailability) of insoluble compounds after oral administration. , or mucosal administration.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition, characterized in that it contains a polymer matrix according to the invention in which an active ingredient is incorporated, and a pharmaceutically acceptable carrier for its administration.
  • a pharmaceutical composition characterized in that it contains a polymer matrix according to the invention in which an active ingredient is incorporated, and a pharmaceutically acceptable carrier for its administration.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for its administration.
  • the matrices according to the invention are in particular useful for therapeutic and vaccine applications.
  • the use of matrices according to the invention as medicaments is also an object of the invention.
  • the invention also relates to a cosmetic composition, characterized in that it contains a polymer matrix as described above in which is incorporated an active principle with dermatological and / or cosmetic activity, and cosmetologically acceptable excipients.
  • the invention presents a certain interest in the formulation of lipophilic molecules used as additives in the pharmaceutical or food industry. This is the case with most lipophilic flavors or flavoring agents which are normally essential oils which are difficult to formulate.
  • the invention can be used in these cases to improve and facilitate the formulation of these compounds as well as to stabilize them in the compositions obtained.
  • compositions comprising polymeric matrices according to the invention form part of the invention.
  • the following examples serve to illustrate certain aspects of the invention, and should not be considered as limiting the invention.
  • Figure 1 Fluorescence of the mixture of cationic particles / Liposomes at room temperature. The penetration of lipids (fluorescent) into the matrix is studied by following the protocol of Example 5.
  • Figure 2 Fluorescence of the mixture of cationic particles / Liposomes at 80 ° C. The penetration of lipids (fluorescent) into the matrix is studied by following the protocol of Example 5.
  • Figure 3 Study of the hydration rate of Sephadex A-50 as a function of the rate and type of lipid counterion. The study is carried out according to the protocol of Example 7. The symbols used are: diamond, C16; square, C8; triangle, DPPG.
  • Figure 4 Evolution of the fluorescence polarization of DPH as a function of temperature for amphiphilic matrices loaded with DPPG or palmitate. The study is carried out according to the protocol of Example 7.
  • M.A. Amphiphilic matrix. The symbols used are: diamond, M.A. Cl 6; square: M.A. DPPG.
  • Figure 5 Evolution of the size of the non-crosslinked cationic amphiphilic matrices as a function of the lipid level and of the polymer used. The study is carried out according to the protocol of Example 12. The symbols used are: diamond, cationized amylose; square, cationized amylopectin.
  • Figure 6 Solubilization rate of Amphotericin B by cationic amphiphilic matrices, not crosslinked, in PBS. The study is carried out according to the protocol of Example 13. Symbols, AmB: amphotericin B, "+": cationized.
  • Figure 11 UV stabilization (312 nm) of trans-retinoic acid formulated in cationic amphiphilic matrices.
  • ATRA ethanolic acid solution trans-retinoic at 1 mg / ml untreated.
  • ATRA + UV ATRA solution treated with UN radiation.
  • FORM + UN formulation of trans-retinoic acid treated with UN radiation.
  • a translucent suspension of 2 g / l DPPG liposomes is obtained, having a size around 100 nm, measured by light scattering in a Coulter ron4D type submicronic particle analyzer (Coultronics, USA).
  • the solution is then stored at + 4 ° C.
  • Example 2 Preparation of cationic hydrophilic matrices of several micrometers based on polysaccharide 50 g of polysaccharide (amylopectin, Waxilys 200, Roquette Fromme, France) are dispersed in 100 ml of water. When there are no more lumps, 25 ml of 10 M sodium hydroxide is added. The alkaline polysaccharide solution is kept stirring until a viscous translucent solution is obtained.
  • polysaccharide as amlopectin, Waxilys 200, Roquette Fromme, France
  • the suspension of particles is then centrifuged at 5000 g for 15 minutes (Sigma 3k-20 centrifuge, Bioblock, France) and the pellet is recovered with reverse osmosis water.
  • Example 3 Preparation of submicronic cationic hydrophilic matrices based on polysaccharide.
  • the particles are then purified by ultrafiltration on a 30 kDa membrane (Minissette system, Filtron, USA).
  • the suspension of particles is then purified by micro filtration on a 0.2 ⁇ m membrane (Spiral-Cap 0.2 ⁇ m, Gelman, USA) and stored at 4 ° C.
  • the characteristics of the suspension are:
  • the solution is pre-homogenized with an ultra-turax and then homogenized between 500 and 900 bars to obtain particles less than 100 nm.
  • the solution is purified by ultra-filtration on a membrane having a filtration threshold of 30 Kda then microfiltered through 0.2 ⁇ m.
  • a suspension of particles is obtained having the following characteristics: Size (Coulter N4D): 50 nm (S.D. 20 nm) Total charge (total phosphorus analysis): 2 mmol / g Crosslinking rate (phosphodiester functions deduced by titration):
  • Example 5 Preparation of a cationic amphiphilic matrix of several micrometers with anionic phospholipids
  • FIG. 1 shows a fluorescence preferentially on the surface of the particles indicating that, at ambient temperature, the lipid phase cannot correctly penetrate the polysaccharide network.
  • the interaction between anionic liposomes and cationic particles is obvious but we can observe diffuse fluorescence in the background (excess of liposomes) indicating the saturation of the particle surface
  • Example 6 Preparation of submicron cationic amphiphilic matrices with anionic phospholipids 24 ml of a 17 g / l solution (408 mg of particles) in cationic hydrophilic matrix prepared according to Example 3 are kept stirring at 80 ° C. Using a peristaltic pump, 10.2 ml of an ethanolic solution of
  • DPPG at 16 g / 1 (ethanol: water 88: 12, DPPG 163 mg) are added slowly to the solution of cationic polysaccharide. After adding all of the DPPG, the solution is stirred at 80 ° C for 30 min. The solution is purified by ultra-filtration on a membrane having a filtration threshold of 30 KDa.
  • Example 7 Penetration of different anionic lipids on cationic submicronic matrices. Characterization of systems. Limitation of the type of lipids.
  • Sephadex A-50 is 65 ml / g.
  • the cationic charge rate is 3 mmol / g.
  • the mass of lipids to be used is proportional to the molar mass of the lipid. Table I. Mass ratio of lipids / hydrophilic gel for different lipids and different neutralization rates (for 1 g of Sephadex A-50).
  • the swelling rate is measured for each type of lipid as a function of the load neutralization rate ( Figure 3). It is observed that DPPG and palmitic acid behave in the same way, causing a strong contraction of the gel due to hydrophobic interactions between the fatty acid chains. Octanoic acid, on the other hand, is incapable of contracting the matrix, indicating too high solubility or mobility of fatty acid chains. In this case the lipid is probably in equilibrium between the matrix and the surrounding medium.
  • Four types of matrices were prepared using four different anionic lipids (DPPG, sodium palmitate, sodium octanoate and sodium dodecyl sulfate). The four matrices were prepared at a neutralization rate of 20%. The four lipids were previously added with a lipophilic fluorescent probe (diphenyl hexatriene or DPH, Molecular Probes, Netherlands).
  • the four suspensions of hydrophilic matrices have similar characteristics (size around 100 nm and Potential Z around 15 mV).
  • Table II clearly shows that in the case of DPPG and palmitate the level of fluorescence is similar in water and in PBS, indicating good stability of the lipids inside the matrix.
  • fluorescence in water indicates a loading of the matrix in lipid but this fluorescence disappears completely in an ionic medium, indicating a complete leakage of the lipid.
  • FIG. 4 represents the evolution of the fluorescence of the two types of matrices as a function of the temperature in an aqueous medium.
  • a transition temperature for the DPPG is observed around 45 ° C., indicating that the phospholipids are organized inside the matrix in a lamellar form having the same characteristics of cooperativity as the liposomal forms. Palmitic acid on the other hand does not have a transition temperature, the progressive decrease in fluorescence is explained by the progressive increase in the fluidity of the lipid phase.
  • Example 9 Solubilization and stabilization of Amphotericin B in cationic amphiphilic matrices.
  • Amphotericin B is an extremely insoluble antifungal which has no charge at physiological pH. We can nevertheless consider that this is an example of an insoluble compound with a charge opposite to the matrix because the COOH function can be polarized by its interaction with the matrix.
  • FIG. 7 shows an excellent size stability of the formulations, whether at 4 ° C. or at room temperature for several months.
  • Example 10 Incorporation and stabilization of a highly hydrophobic compound in cationic amphiphilic submicron matrices.
  • Estradiol valerate is an extremely hydrophobic estradiol derivative. 8.9 mg of estradiol valerate are dissolved in 5 ml of an ethanolic solution of DPPG at 16 g / 1 prepared according to example 1.
  • Example 6 According to the method described in Example 6, 2.8 ml of DPPG-estradiol solution (45 mg DPPG, 5 mg of estradiol valerate) are injected into 20 ml of a suspension of cationic hydrophilic matrices prepared according to Example 3 (3.5 g / 1.70 mg).
  • An ethanolic solution DPPG / cholesterol: 70/30 (w / w) at 20 g / 1 is prepared starting from an ethanolic solution of DPPG at 16 g / 1 prepared according to Example 1.
  • This ethanolic solution of DPPG / cholesterol (1 ml, 20 mg) is injected hot into 10 ml of a solution of submicronic cationic vectors prepared according to Example 3 at 3 g / 1 (30 mg) which is maintained at 80 °. vs.
  • the lipid level is 65% w / w (45% DPPG, 20% Cholesterol) compared to the vectors.
  • the suspension is maintained for 30 minutes at 80 ° C. and then allowed to return to ambient temperature.
  • a suspension of submicron cationic amphiphilic matrices is obtained at 5 g / 1 having the following characteristics: Size: 90 nm (SD 30 nm) Cholesterol association rate: 100% Z potential (15 mM phosphate buffer, pH 7): + 15 mN.
  • Example 12 Preparation of cationic submicron amphiphilic matrices from natural non-crosslinked cationized polymers.
  • the natural polymers studied are amylose (polysaccharide of the linear type) and amylopectin (polysaccharide of branched type). Both polymers have very high molecular weights.
  • the two polysaccharides are cationized according to the method described in Example 2 without adding epichlorohydrin. They are treated with GTMA under the same conditions so as to obtain cationized polymers having a charge rate of 1.7 mmol / g in quaternary ammonium functions.
  • non-crosslinked cationic amphiphilic matrices are then prepared according to the same methodology as in Example 7.
  • the size of these matrices is studied as a function of the level of anionic phospholipids (DPPG, FIG. 5).
  • amphiphilic matrices obtained from cationized amylopectin therefore have a size around 200 nm and are stable when they are placed in saline medium (PBS).
  • Example 13 Incorporation of Amphotericin B into non-crosslinked amphiphilic matrices.
  • Example 8 The incorporation is carried out according to the method of Example 8 from non-crosslinked amphiphilic matrices of Example 12.
  • the amphiphilic matrices used were produced at a DPPG rate of 40% w / w.
  • the solubilization rate of Amphotericin B (AmB) is studied as a function of the type of non-crosslinked amphiphilic matrix.
  • the solubilization rate of Amphotericin B in water shows little difference with the conventional amphiphilic matrices already described, but the stability of the PBS association shows strong differences (Figure 6).
  • Example 14 Preparation of submicron anionic amphiphilic matrices loaded with halofantrine.
  • Halofantrine is a known antimalarial, effective against most resistant forms of Plasmodium, but presenting significant problems of intestinal absorption linked to its lack of solubility.
  • An aqueous suspension of anionic submicronic matrices is prepared according to Example 4 at 15 g / l (100 ml, 1.5 g) which is maintained at 70 ° C. 10 ml of an ethanolic solution of dipalmitoyl phosphatidyl choline at 20 g / l (DPPC, 200 mg) and 2 ml of an ethanolic solution of cetyl trimethyl ammonium bromide at 40 g / l (CTAB, 80 mg) are added.
  • DPPC dipalmitoyl phosphatidyl choline
  • CTAB cetyl trimethyl ammonium bromide
  • CTAB 0.53 mg / ml (3.8%)
  • Halofantrine 2 mg / ml (14.4%)
  • Example 15 Preparation of cationic submicron (100 nm) and micron (5-50 ⁇ m) amphiphilic matrices loaded with Cyclosporin A.
  • DPPG dipalmitoyl phosphatidyl glycerol
  • the solution of lipids and cyclosporine is added to the solution of submicronic particles with stirring at 60 ° C. then the formulation is brought to room temperature.
  • the same lipid solution is added to a suspension of cationic particles of 5-50 ⁇ m prepared according to example 2 containing 20 g / 1 of particles (100 ml, 2 g) and which is maintained at 60 ° C.
  • results are of the same type as those presented above, except the size which remains between 5 - 50 ⁇ m and the filterability under 0.2 ⁇ m which is no longer achievable.
  • Example 16 Intestinal passage over a model of open bag in rats. Protocol
  • the various cyclosporine formulations were produced according to Example 15 by replacing palmitic acid with Sodium Dodecyl Sulfate (SDS).
  • SDS Sodium Dodecyl Sulfate
  • cyclosporine was incorporated into micelles of
  • the formulations studied Cyclo-1 and Cyclo-2 correspond to different sizes of nanoparticles, respectively 100 nm and 5-50 ⁇ m. These formulations are aqueous solutions of a cyclosporine / [ 3 H] -cyclosporin mixture at a concentration of 10 mM. By mixing 1 ml of these solutions with 9 ml of TC199 medium (95% O 2 , 5% CO 2 ), 10 ml of a 1 mM cyclosporin solution were obtained.
  • the difference in weight makes it possible to estimate the volume of its content (density of the medium: 1.008 g / ml at 37 ° C.).
  • the empty bags are dissolved in 1M sodium hydroxide at 37 ° C with stirring for 3 hours.
  • the protein assay is carried out on each dissolved bag by spectrophotometry at 750 nm (Perkin Elmer spectrophotometer, Lambda 3) according to the Lowry method (Peterson, 1986) and using bovine serum albumin as standard.
  • volumes of 400 ⁇ l taken from the contents of the bags and 500 ⁇ l taken from the incubation medium are made up to 1 ml with distilled water.
  • Volumes of 800 ⁇ l of tissues dissociated by soda are removed and neutralized with 200 ⁇ l of 5N HC1.
  • the radioactivity is determined in the samples supplemented with 5 ml of scintillant (Ready Safe, Beckman) is carried out on a Beckman LS 1801 counter.
  • Cyclosporine is seen to pass through the intestinal mucosa in the model of the everted rat intestine bag. Cyclosporine formulated using particles of 0.1 ⁇ m size (cyclo-1 formulation) was best absorbed in the contents of the bags. There is a negative effect of particle size on absorption, the formulation made from 5-50 ⁇ m vectors, did not lead to a significant increase in the passage of cyclosporine. The vectors of 0.1 ⁇ m size even showed greater efficiency compared to those of 5-50 ⁇ m at time 75 minutes.
  • particles of size 5-50 ⁇ m caused an increase in absorption, compared to the control, at times 30 and 45 minutes.
  • these particles formed aggregates with the mucus secreted by the intestinal bags and were attached to the intestinal mucosa. This observation points to a significant muco-adhesion of the larger particles.
  • the vectors of the invention promote the passage of cyclosporine in the model of the everted rat intestine bag.
  • tissue concentration of the active ingredient is probably due to a strong mucoadhesion of the particles carrying the cyclosporine.
  • Formulations A Liquid suspension of cyclosporine A in water in combination with ABV type vectors as described in Example 15 (cyclo-2 formulation; 1.2 mg / ml Cyclosporine-A and 9.5 mg / ml ABV ref. KX)
  • Formulations B Liquid suspension of cyclosporin A in water in combination with ABV type vectors described in Example 15 (cyclo 1 formulation; 1.22 mg / ml Cyclo-A and 9.5 mg / ml ABV ref. KX ).
  • FIG. 10 gives the blood pharmacokinetics profile of cycloporin A after oral administration of different formulations, compared to the reference (Neoral®).
  • Tables IV to VI summarize the pharmacokinetic parameters derived from these curves.
  • formulation B 100nm ABV (formulation B) compared to the Neoral® reference.
  • formulation B 100nm ABV (formulation B) compared to the Neoral® reference.
  • the results of formulation B and Neoral® in terms of bioavailability are perfectly equivalent (99% in Cmax and 100% in AUC 0-48H of Neoral®).
  • formulation B has a lower coefficient of variation on Cmax than that of Neoral® (20 vs 39%), which suggests that the absorption obtained with this formulation is less dependent on inter-individual factors.
  • Sandimmun® is less well absorbed than Neoral®
  • Formulation B 100nm liquid is the best absorbed, which is displayed both on the AUC and on the Cmax (Table IV and V)
  • Example 18 Stabilization of trans-retinoic acid by incorporation into cationic amphiphilic matrices of 100 nm.
  • Trans-retinoic acid is a therapeutic molecule used in particular in the treatment of severe acne. It is a molecule practically insoluble in water and having a carboxylate function which makes it a candidate of choice for its incorporation in cationic amphiphilic matrices. When the molecule is in solution, it exhibits high instability in light, air and temperature.
  • a suspension of cationic submicronic amphiphilic matrices, prepared according to Example 6 and diluted to 10 g / 1 is maintained with stirring at 40 ° C.
  • An ethanolic 1 g / l retinoic acid solution is prepared which will be compared with the formulation.

Abstract

La présente invention concerne un nouveau type de matrices polymériques amphiphiles et ioniques comportant une matrice hydrophile macromoléculaire portant une charge ionique positive ou négative et dans laquelle est incorporée une phase lipidique de signe contraire à celui de la matrice. L'invention se rapporte également à leur méthode de fabrication et leur utilisation.

Description

MATRICES POLYMERIQUES AMPHIPHILES ET IONIQUES ET DERIVES DE TELLES MATRICES
La présente invention concerne un nouveau type de matrices polymériques caractérisées en ce qu'elles portent une charge positive ou négative et dans lesquelles est incorporée une phase lipidique de charge opposée à celle de la matrice. L'invention se rapporte également à leur méthode de fabrication et leur utilisation.
La recherche de nouveaux systèmes de délivrance de médicaments est aujourd'hui quelque chose d'indispensable pour le développement de nouveaux produits pharmaceutiques. En effet, la recherche pharmaceutique a produit une énorme quantité de principes actifs extrêmement efficaces, mais parfois difficiles à administrer car ils sont par exemple hydrophobes ou trop insolubles ou présentant des effets secondaires non négligeables. La recherche actuelle s'oriente sur l'amélioration des modes d'administration de ces nouvelles molécules pour produire des formes pharmaceutiques acceptables selon les voies d'administration, pour explorer de nouvelles voies d'administration, pour cibler de façon préférentielle les foyers de la maladie ou pour relarguer les médicaments de façon contrôlée afin de diminuer le nombre d'administrations ou de limiter les effets secondaires indésirables. La recherche actuelle porte donc en particulier sur le développement de nouveaux systèmes de relargage et de stabilisation de principes actifs.
Dans le cadre des systèmes dispersés, on peut citer par exemple les liposomes, constitués en général d'un feuillet de phospholipides (Liposome : a practical approach, 1990, RRC New (Ed), LRL Press, Oxford University Press). L'homme du métier sait maintenant fabriquer des liposomes uni ou multi lamellaires, uni ou multi vésiculaires. Les liposomes peuvent transporter des composés polaires à l'intérieur, ils peuvent aussi transporter des composés hydrophobes dans leur feuillet phospholipidique ainsi que solubiliser des composés « difficiles », grâce au caractère particulièrement détergent du feuillet lipidique. Ces particules possèdent toutefois l'inconvénient d'être relativement instables, difficiles à fabriquer de manière contrôlée et présentant des problèmes de fuite du principe actif. Pour palier aux problèmes des liposomes, d'autres approches ont été proposées dans le but d'augmenter la stabilité mécanique ou bien les propriétés d'incorporation des principes actifs. On trouve ainsi : les lipobeads (Pin et al, FEBS Letters 1996, 397, p.70-4), les liposomes à cœur solide (EP 277776 The University of Tennessee Research Corporation), les BNSM™ (EP 687173 Biovector Therapeutics) où la matrice ionique est à l'intérieur de la structure et permet d'incorporer les actifs par interactions ioniques.
En ce qui concerne les matrices ou systèmes de relargage contrôlé, il existe :
- des hydrogels amphiphiles (WO 97/00275 GelSciences ; Koller et al, STP Pharma 1987, 3, p.115-24): ces gels sont essentiellement utilisés pour des principes actifs hydrophobes ou macromoléculaires. Certains de ces gels ont des propriétés de changement d'état en fonction de la température, qui peuvent être exploités au relargage d'actifs (thermosensibilité).
- Les matrices réticulées ou non, ioniques (Irwing, Drug Development and Industrial Pharmacy, 1987, 13, p.2047-66 ; WO 94/20078 Biovector
Therapeutics). De telles matrices peuvent être chargées positivement ou négativement par greffage de charges ioniques appropriées et l'homme du métier connaît les différents procédés de fabrication. L'homme du métier sait fabriquer des particules de taille prédéterminées à partir de ces matrices, par exemple par extrusion. Ces matrices peuvent être utilisées pour la stabilisation et le relargage de composés polaires en utilisant les mécanismes d'échange d'ions. Mais ces mécanismes sont difficiles à contrôler.
On a ensuite cherché à combiner ionicité et hydrophobie, en particulier pour pouvoir charger des principes actifs hydrophobes et chargés. Dans ce cadre, on a synthétisé des block copolymères avec des parties hydrophobes et hydrophiles chargées (Brevet US Re 35068, MIT ; demande de brevet WO 95/24430 University of Washington, Alcon Lab. Inc.). Ces gels ont été principalement étudiés car ils peuvent avoir des changements d'état en fonction de la température, du pH et de la force ionique. Il est clair que ce mélange d'hydrophobie et d'ionicité est utile pour la solubilisation et la stabilisation de composés amphiphiles ou insolubles. Toutefois, une restriction de ce système est que la distribution hydrophobie et ionicité n'est pas homogène dans l'ensemble du gel et dépend notamment de la taille, de la forme et de l'arrangement des monomères en cours de synthèse. On aura donc toujours des parties apolaires et des parties ioniques distinctes . Par ailleurs les propriétés physico-chimiques de telles matrices sont déterminées par leur synthèse et ne sont pas modulables ultérieurement. Pour obtenir des matrices avec des propriétés d'hydrophobie ou d'ionicité différentes, différentes synthèses sont nécessaires.
La Demanderesse apporte une réponse originale à ce problème de développement de nouveaux systèmes associant des propriétés d'hydrophobie et d'ionicité.
Ainsi, la Demanderesse a mis en évidence de nouvelles matrices polymériques qui possèdent des propriétés d'ionicité et d'hydrophobicité très intéressantes réparties de façon homogène dans ladite matrice. Par ailleurs, un des avantages des matrices selon l'invention est que le caractère hydrophobe et/ou ionique de la matrice peut être modulé de façon très simple, sans qu'il ne soit besoin de changer de nombreux paramètres.
Ainsi, l'invention concerne des matrices polymériques, caractérisées en ce qu'elles comportent une matrice hydrophile macromoléculaire, non liquide portant une charge ionique positive ou négative et dans laquelle est incorporée une phase lipidique de charge opposée à celle de la matrice.
De façon très intéressante, les matrices polymériques selon l'invention présentent un caractère amphiphile et ionique, dispersé de façon homogène dans la matrice. Ce caractère est modulable en fonction de la quantité et de la nature des lipides incorporés dans la matrice polymérique hydrophile de départ.
De préférence, la matrice hydrophile est constituée de polymère linéaire ou ramifié dont la charge ionique est naturellement ou chimiquement greffée. Le polymère peut être naturel ou synthétique, homopolymère ou copolymère (bloc (block), greffé (graft) ou aléatoire (random)) ou un mélange de polymères. Des polymères ioniques contenant déjà des parties hydrophobes (que ce soient des copolymères blocs ou des copolymères à chaînes pendantes) peuvent aussi être utilisés pour la mise en œuvre de l'invention, du moment que l'insertion d'une phase lipidique permet de moduler l'hydrophobie de ces polymères.
De façon préférée, le polymère linéaire ou ramifié est un polymère polyhydroxylé, c'est-à-dire que chaque monomère possède au moins un groupement hydroxyle libre.
Dans un mode préféré de l'invention, la matrice est notamment constituée de polysaccharides ou d'oligosaccharides, mais on peut également utiliser d'autres polymères, comme les exemples le démontrent. Lorsque l'on utilise un polysaccharide, il est choisi de préférence parmi le dextrane, le chitosan, l'amidon, l'amylose ou amylopectine ou mélanges, la cellulose, le polygalactose, le polymannose et leurs dérivés.
La matrice de l'invention peut être aussi composée de polymères ioniques naturels ou synthétiques comme les alginates ou le carbopol, connus pour leur propriété de formation de matrice de façon spontanée en présence d'ions multi valents.
La matrice polymérique selon l'invention comprend une matrice hydrophile qui peut être réticulée naturellement ou chimiquement.
Les modes de réticulation de polysaccharides ou de polymères polyhydroxylés sont connues de l'homme de l'art et impliquent classiquement des réactifs bifonctionnels comme l'épichlorhydrine et les bi-epoxydes (conduisant à des réticulations de type di-éther), les dérivés de l'acide phosphorique comme l'oxychlorure de phosphore ou le trimétaphosphate (conduisant à des réticulations de type diester de phosphate) ou encore les acides dicarboxyliques (conduisant à des réticulations type diesters). Cette description n'est pas limitative et d'autres agents de réticulation dits « classiques » peuvent être utilisés pour l'obtention de matrices hydrophiles réticulées.
La matrice polymérique peut être chargée positivement ou négativement, par greffage de groupements ioniques, cationiques ou anioniques, aux monomères, de préférence des sucres, composant le polymère. Ces groupements peuvent être choisis parmi des fonctions ammoniums quaternaires ou aminés tertiaires, phosphates, sulfates, carboxyéthyles, succinates... Les procédés de greffage de charges sont bien connus de l'homme du métier.
La phase lipidique pénétrant les polymères peut être constituée de différents types de lipides naturels ou synthétiques, parmi lesquels : - les lipides anioniques en général, en particulier les phospholipides anioniques comme le phosphatidyl glycérol ou la phosphatidyl serine (et en particulier le DPPG (diacyl phosphatidyl glycérol) et la DPPS (diacyl phosphatidyl serine)), les acides phosphatidiques, les tensioactifs anioniques comme les sels d'acides gras à longue chaîne, les acides gras à courte ou longue chaîne, les cardiolipines, les alkyl sulfates, les glycérides sulfatés, les alkylpolyethoxy éther sulfates, les alkylpolyethoxy éther carboxylates, les alkyl sulfonates, les phosphates de mono ou dialkyle des composés cationiques comme les alkyl ou dialkyl ammoniums (en particulier les diacyl diméthyl ammonium, et les acyltriméthylammonium), les alkyl pyridiniums, les phospholipides et phosphonolipides cationiques les tensioactifs cationiques, les lipides cationiques, en particulier de dernière génération comme le DOGS, le
DOTAP, racylcarnitine, les esters des bétaïnes à longue chaîne.
Cette liste n'est pas limitative. Des exemples de molécules lipidiques ou tensioactives ioniques peuvent être trouvés dans des ouvrages de galénique générale, par exemple : Puisieux et Seiller, Galenica 5. Agents de surface et émulsions. 1989.
Tech. & Doc. Lavoisier.
Les lipides pouvant être utilisés pour l'invention sont des composés insolubles dans l'eau, ayant tendance à être sous forme micellaire (détergent) ou sous forme lamellaire (phospholipides). La pénétration est induite par un apport d'énergie (température) permettant de fluidifier les lipides et permettant que l'interaction ionique soit effective. Une fois que les lipides ont pénétré, la baisse de température permet le piégeage des lipides de façon permanente.
Tous les lipides chargés ne sont cependant pas adaptés à une mise en œuvre de l'invention. En effet, les lipides chargés trop solubles auront tendance à sortir de la matrice lorsque celle ci est placée dans un milieu ionique par un mécanisme d'échange d'ions.
Les lipides préférés sont ceux de type phospholipides anioniques ou leurs analogues cationiques, c'est à dire, les groupements chargés dérivés par 2 ou plusieurs chaînes d'acides gras dont la solubilité dans l'eau est si basse que l'on considère qu'ils sont toujours sous forme organisée.
En ce qui concerne les molécules tensioactives plus classiques ou formées d'un groupement ionique dérivé par une seule chaîne hydrophobe, il est difficile de dire où se trouve la frontière de solubilité permettant d'obtenir des matrices amphiphiles stables. La Demanderesse a déterminé que les tensioactifs de type sodium dodécyl sulfate sont à la limite de cette solubilité.
Cependant, étant donné que des mélanges complexes de tensioactifs peuvent être envisagés, l'utilisation d'agents tensioactifs plus hydrophiles peut aussi être possible en fonction des propriétés que l'on désire donner à la matrice hydrophile. La Demanderesse a donc montré que des mélanges de lipides de charge opposée à la matrice sont envisageables pour modifier les propriétés de celle-ci et a trouvé que la pénétration de lipides de charge opposée permet d'incorporer aussi des lipides neutres qui n'auraient pas pénétré autrement. La phase lipidique peut donc également contenir de tels lipides. Ainsi des mélanges complexes peuvent être envisagés pour contrôler de façon très fine les propriétés de la matrice. En effet, en particulier lorsque l'on veut augmenter l'hydrophobicité globale de la matrice polymérique selon l'invention, sans toutefois trop modifier la charge, on peut mélanger des lipides chargés et des lipides neutres : cholestérol, phospholipides neutres, vitamines etc.. De façon surprenante, les lipides incorporés dans le polymère hydrophile s'organisent de telle façon que la zone hydrophobe est homogène et est stable dans la matrice.
Des études ont montré que quels que soient la quantité et le type de lipide incorporé, celui-ci se répartit de façon homogène dans la matrice. On a prouvé par exemple, dans le cas des phospholipides anioniques qui forment spontanément des liposomes, que ces phospholipides s'organisent à l'intérieur de la matrice sous une forme inconnue, mais qui présente des caractéristiques de bicouche lipidique et notamment la présence d'une température de transition.
La Demanderesse a montré que les matrices se compactent de plus en plus en fonction de leur charge en lipide. Cette compaction ne peut être expliquée que par une interaction hydrophobe entre les contre-ions lipidiques et non pas par un phénomène de neutralisation de charge, car il a été montré qu'en neutralisant la charge avec des contre-ions moins lipidiques (acides gras à courte chaîne), cette compaction ne se fait plus.
La répartition homogène des lipides chargés dans la matrice et sa compaction montrent que la structure obtenue résulte de la compétition entre interaction ionique (qui aurait tendance à disperser les lipides dans la matrice) et l'interaction hydrophobe qui a tendance à regrouper les lipides. On peut donc certainement parler de matrice ionique et amphiphile.
Une deuxième conséquence importante de cette compaction est que des matrices amphiphiles vésiculaires peuvent être obtenues grâce à cette composante hydrophobe.
En effet, il est possible d'obtenir des matrices amphiphiles simplement en utilisant des polymères ramifiés de taille suffisamment grande. Ainsi, la Demanderesse a montré (exemple 12) qu'en utilisant des molécules d'amylopectine (polysaccharide naturellement ramifié) cationisées, de poids moléculaire très élevé (jusqu'à 100 millions Daltons), on peut obtenir des matrices amphiphiles vésiculaires dont la taille est d'environ 100 à 250 nm. En effet, l'incorporation de la phase lipidique de charge opposée dans ce type de polymère provoque une contraction spontanée des molécules de polymère par interaction hydrophobe et la formation de matrices amphiphiles nanométriques efficaces pour le transport des principes actifs. L'existence d'une telle structure unique permet notamment de résoudre les problèmes posés lors de l'encapsulation de principes actifs possédant des propriétés les rendant peu ou non solubles dans l'eau, ou qui possèdent des caractéristiques amphiphiles. Ainsi, ces propriétés tout à fait particulières (une certaine hydrophobie, tout en gardant des caractéristiques de charge ionique) permettent : - la mise en suspension de composés très insolubles, de préférence ceux qui ont une charge opposée à la matrice (amphotéricine, ketoconazole, antifongiques en général, anticancéreux, etc .),
- la mise en suspension de composés très hydrophobes, de préférence de charge opposée à la matrice (vitamines, acide trans- rétinoïque, hormones, antidépresseurs), mais qui peuvent également être neutres (en particulier les hormones apolaires telles que Pestradiol, le valérate d'estradiol, les prostaglandines à action centrale), - la stabilisation de composés polaires de charge opposée à celle de la matrice, qui sont incorporés par interaction ioniques, et dont la molécule peut posséder une partie apolaire,
- la stabilisation de peptides thérapeutiques (en particulier l'insuline, l'HgH, l'HPTH, des antigènes). La topologie particulière des matrices polymériques selon l'invention
(constitués d'une matrice amphiphile) permet donc d'encapsuler et de stabiliser des principes actifs variés, possédant des propriétés hydrophobe et/ou polaire, de les véhiculer et de les délivrer. La méthode de délivrance / relargage contrôlé et/ou retardé dépendra des caractéristiques d'ionicité et d'hydrophobie de la matrice, de sa taille et/ou de sa forme. On peut ainsi formuler des principes actifs qui étaient instables dans les systèmes précédemment développés, ainsi que les protéger du milieu environnant dans le cas, par exemple d'une administration par voie orale.
Le système permet donc de stabiliser des principes actifs sensibles aux dégradations classiques en milieu aqueux, ce qui est notamment illustré dans l'exemple 18 de stabilisation de l'acide trans-rétinoïque.
Parmi ces molécules, on peut citer, sans que cette liste ne soit limitative :
- les antibiotiques et antiviraux
- les protéines, protéoglycanes, peptides
- les liposaccharides - les antidépresseurs
- les hormones - les antigènes
- les insecticides et fongicides
- les composés agissant sur le système cardiovasculaire
- les composés agissant sur le système nerveux central - les anticancéreux
- les anti-malariques
- les anti-asthmatiques
- les composés présentant une action sur la peau
- les acides nucléiques (ADN, ARN, nucléotides, par exemple) La forme que l'on décidera de donner ultérieurement à une telle matrice polymérique sera définie en fonction de l'application envisagée. Elle peut, en particulier, être choisie dans le groupe comprenant les films, les composants des patches, les particules visibles, microparticules, nanoparticules. De tels dérivés de la matrice polymérique font également partie de l'invention. Quelle que soit la forme que l'on désire donner à la matrice selon l'invention, il est à noter que l'on peux faire pénétrer les lipides à l'intérieur de la matrice de départ après que celle-là a été déterminée. De façon inverse, on peut également préparer les matrices polymériques amphiphiles selon l'invention et les modeler ultérieurement. La Demanderesse a trouvé que la capacité de charge en lipide de ces matrices est liée à leur capacité de charge ionique. Ainsi lorsque l'on veut préparer des nanoparticules dispersées, le taux de charge en lipides est limité autour de 60-80% de neutralisation de la charge. A partir de cette limite on observe des phénomènes de précipitation car les particules deviennent trop hydrophobes. On peut alors optionnellement les stabiliser en utilisant des émulsifiants classiques neutres, que ce soient des détergents, tensioactifs ou phospholipides qui sont non ioniques ou zwitterioniques.
Les différentes possibilités de forme de la matrice permettent d'envisager leur utilisation pour l'administration de molécules par: - voie intraveineuse
- voie intramusculaire (y compris sous forme dépôt) voie transdermique voie sous cutanée voie orale. Ces matrices selon l'invention devraient maintenir les propriétés connues de mucoadhésion conférées par le polymère ionique, et il est même probable que ces propriétés soient augmentées par la partie hydrophobe.
Ainsi, ces matrices sont en particulier efficaces pour :
- le relargage de molécules par voie mucosale (en particulier nasale, vaginale, buccale) - le transport d'antigènes à usage vaccinal (en particulier par voie mucosale, notamment par voie nasale)
- le transport d'oligonucléotides (ADN, ARN ou similaires) par voie mucosale
- la délivrance de peptides en particulier par voie mucosale. On peut également administrer les composés selon l'invention par voie dermique, en particulier en tant que « patch ».
Les matrices polymériques selon l'invention peuvent être stérilisées. Elles peuvent également être congelées.
L'invention concerne également un procédé de préparation d'une matrice polymérique, caractérisé en ce que : a) On prépare une matrice polymérique hydrophile portant une charge globale positive ou négative. b) On prépare la solution de lipides de charge opposée à celle de la matrice. c) On effectue un mélange des deux solutions sous agitation, de telle façon que la phase lipidique pénètre entièrement dans la matrice polymérique ou le noyau.
L'homme du métier pourra optimiser les conditions pour que la phase lipidique pénètre entièrement dans la matrice polymérique ou le noyau (en particulier les différentes proportions et les temps de contact). Il peut parfois être nécessaire de chauffer la phase lipidique à une température suffisante afin de la fluidifier et de faciliter son entrée dans la phase polymérique. Les conditions de températures dépendent du type de lipides et de la matrice polymérique utilisés. Toutefois, d'une manière générale, les températures utiles pour la mise en œuvre du procédé selon l'invention seront comprises dans une gamme allant de 20 à 95°C, de manière préférée de 40 à 80°C.
Les avantages de ces matrices polymériques sont notamment :
- une grande stabilité chimique et thermique, due à la structure polymérique de la matrice solide, et aux interactions stabilisant la phase lipidique à l'intérieur de celle-ci. - la possibilité de moduler et définir la charge globale et le caractère hydrophobe, en faisant varier les polymères, leur taux de dérivation et les lipides choisis pour la préparation, une grande facilité de synthèse et d'industrialisation, avec un nombre d'étapes réduit. - leur capacité à stabiliser des composés hydrophobes et/ou polaires difficiles à intégrer dans des vecteurs classiques.
- la possibilité de modifier la délivrance du principe actif en modulant les charge et hydrophobie globales du vecteur particulaire ainsi que sa taille et sa forme. - une propriété de muco-adhésion permettant l'utilisation et la délivrance du principe actif, notamment par voie orale ou mucosale.
Les principes actifs peuvent être introduits dans les matrices polymériques à différentes étapes de fabrication, en fonction de leur charge et de leur hydrophobicité. En particulier, il est intéressant de produire les matrices et de les charger en principe actif par la suite, mais il est également possible d'introduire le principe actif lors de la préparation de la phase lipidique et/ou de la fabrication du polymère sous agitation.
Les matrices amphiphiles et ioniques selon l'invention peuvent donc être utilisées pour l'incorporation de principes actifs. Il est remarquable que les matrices de petites tailles (submicroniques), ayant incorporé un principe actif peuvent subir une filtration stérilisante, notamment une filtration stérilisante sous 0,2 μm, sans perte significative de matériel. Par perte significative de matériel, on entend une perte d'au plus de 15 % de matériel, de façon plus préférée au plus 10 %, de façon la plus préférée au plus 5 % de matériel. Les matrices selon l'invention ayant incorporé un principe actif possèdent des propriétés extrêmement intéressantes. En effet, la demanderesse a mis en évidence le fait que les complexes matrice polymérique - principe actif permettent, non seulement la solubilisation des principes actifs insolubles, mais aussi la protection et la stabilisation desdits principes actifs. Ceci permet notamment de protéger les principes actifs qui sont normalement sensibles aux réactions d'hydrolyse, d'oxydation et autres réactions de dégradation, qui peuvent être observées in vitro (et ainsi augmenter la stabilité et la durée de vie des compositions pharmaceutique ou cosmétiques selon l'invention), ou in vivo (et augmenter ainsi la durée d'action du principe actif utilisé, et ou permettre de diminuer les doses administrées). Les matrices selon la présente invention sont aussi particulièrement adaptées pour la stabilisation de principes actifs dans des suspensions en milieu isotonique, notamment pour une application injectable.
Les matrices selon l'invention, du fait de leur structure chimique, sont particulièrement bien adaptées à une utilisation orale ou mucosale, mais peuvent également être utilisées pour l'administration de principes actifs par voie parentérale ou topique. On envisage notamment des collyres ophtalmologiques, préparations auriculaires, bains de bouche, préparations vaginales, collutoires, aérosols pulmonaires.
Il est intéressant de noter que les matrices selon l'invention permettent d'améliorer les effets liés à ces différents types d'administration (notamment la biodisponibilité et la stabilité des principes actifs).
Ainsi qu'il a été dit précédemment, le fait de pouvoir moduler la taille des particules et/ou la composition lipidique permet aussi de moduler la vitesse de relargage du principe actif . Ainsi, la présente invention est également dirigée vers un procédé de modification de la vitesse de relargage d'un principe actif, caractérisé en ce qu'il contient les étapes de : a) préparation de matrices selon l'invention, avec des variations de taille et/ou de composition de phase lipidique, avec incorporation éventuelle dudit principe actif, b) incorporation dudit principe actif dans les matrices préparées à l'étape a), s'il n'a pas été incorporé lors de l'étape a) c) étude de la modification de la vitesse de relargage du principe actif en fonction de la structure de la matrice.
L'étude envisagée à l'étape c) peut être effectuée in vitro, notamment dans des milieux de dissolution, ou in vivo, dans des modèles animaux appropriés. Par ailleurs, il est possible d'incorporer le principe actif dans les matrices directement lors de la préparation desdites matrices ou ultérieurement. Ce procédé permet ainsi de déterminer la. matrice selon l'invention à choisir pour Pencapsulation de principes actifs, et la préparation de compositions pharmaceutiques ou cosmétiques ayant des propriétés de libération des principes actifs prédéterminés. Ceci est valable quel que soit le mode d'administration choisi.
Il est à noter que la solubilisation de principes actifs sous la forme de matrices de très petite taille devrait avoir comme conséquence importante l'amélioration de la mise à disposition (vitesse et rendement de l'absorption, biodisponibilité) de composés insolubles après une administration orale, ou une administration mucosale.
Dans le cadre des composés pour lesquels l'insolubilité est le paramètre déterminant, qui mène à une mauvaise absorption, ceci devrait se traduire par une amélioration notable de l'absorption intestinale.
On peut ainsi envisager d'utiliser des particules de très petite taille qui libéreront très rapidement le principe actif sous une forme disponible, pour préparer des formulations à absorption rapide (fast onset). Ceci est notamment recherché dans le cas des analgésiques et du traitement de crises. On peut également envisager l'utilisation de particules plus grandes, libérant le principe actif plus lentement dans le tractus intestinal pour obtenir un effet de relargage prolongé intéressant dans le cas où l'on cherche à éviter les pics plasmatiques tout en maintenant une concentration plasmatique constante pendant le plus long temps possible.
L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient une matrice polymérique selon l'invention dans laquelle est incorporé un principe actif, et un support pharmaceutiquement acceptable pour son administration. L'homme du métier sait choisir les supports acceptables pour une utilisation pharmaceutique. Les matrices selon l'invention sont notamment utiles pour des applications thérapeutiques et vaccinales. L'utilisation de matrices selon l'invention à titre de médicaments est également un objet de l'invention.
L'invention a également pour objet une composition cosmétologique, caractérisée en ce qu'elle contient une matrice polymérique telle que décrite précédemment dans laquelle est incorporé un principe actif à activité dermatologique et/ou cosmétique, et des excipients cosmétologiquement acceptables. Dans un autre aspect, l'invention présente un intérêt certain dans la formulation de molécules lipophiles utilisées comme additifs dans l'industrie pharmaceutique ou alimentaire. C'est le cas de la plupart des arômes ou des agents de saveur lipophiles qui sont normalement des huiles essentielles difficiles à formuler. L'invention peut être utilisée dans ces cas pour améliorer et faciliter la formulation de ces composés ainsi que pour les stabiliser dans les compositions obtenues.
Enfin, les compositions alimentaires comprenant des matrices polymériques selon l'invention font partie de l'invention. Les exemples qui suivent servent à illustrer certains aspects de l'invention, et ne doivent pas être considérés comme limitant ladite invention.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : Fluorescence du mélange de particules cationiques / Liposomes à température ambiante. La pénétration des lipides (fluorescents) dans la matrice est étudiée en suivant le protocole de l'exemple 5. Figure 2 : Fluorescence du mélange de particules cationiques / Liposomes à 80°C. La pénétration des lipides (fluorescents) dans la matrice est étudiée en suivant le protocole de l'exemple 5.
Figure 3 : Etude du taux d'hydratation du Sephadex A-50 en fonction du taux et du type de contre-ion lipidique. L'étude est effectuée en suivant le protocole de l'exemple 7. Les symboles utilisés sont : losange, C16 ; carré, C8 ; triangle, DPPG.
Figure 4 : Evolution de la polarisation de fluorescence du DPH en fonction de la température pour des matrices amphiphiles chargées en DPPG ou en palmitate. L'étude est effectuée suivant le protocole de l'exemple 7. M.A. : Matrice amphiphile. Les symboles utilisés sont : losange, M.A. Cl 6 ; carré : M.A. DPPG.
Figure 5 : Evolution de la taille des matrices amphiphiles cationiques non réticulées en fonction du taux de lipides et du polymère utilisé. L'étude est effectuée suivant le protocole de l'exemple 12. Les symboles utilisés sont : losange, amylose cationisée ; carré, amylopectine cationisée. Figure 6 : Taux de solubilisation de l'Amphotéricine B par les matrices amphiphiles cationiques non réticulées, en PBS. L'étude est effectuée suivant le protocole de l'exemple 13. Symboles, AmB : amphotéricine B, « + » : cationisée.
Figure 7 : Stabilité des formulations submicroniques d' Amphotéricine B à température ambiante exprimée comme le pourcentage d'Amphotéricine filtrable sous 0,2 μm. Symboles, losange = eau ; carré = glucose 5 % ; triangle = PBS.
Figure 8 : Comparaison des 2 formulations et du contrôle en terme d'absorption de la cyclosporine A dans les contenus des sacs. Symboles, losange = contrôle; carré = préparation cyclo-1 ; triangle = préparation cyclo-2.
Figure 9 : Comparaison des 2 formulations et du contrôle en terme d' accumulation tissulaire de la cyclosporine A. Symboles, losange = contrôle; carré = préparation cyclo-1 ; triangle = préparation cyclo-2.
Figure 10 : Pharmacocinétique sanguine de la cyclosporine A obtenue après administration orale des formulations chez le beagle. Symboles, losange = Neoral® ; carré = préparation cyclo-1 ; cercle = préparation cyclo-2. Figure 11 : Stabilisation aux UV (312 nm) de l'acide trans-rétinoique formulé dans des matrices amphiphiles cationiques. ATRA : solution éthanolique d'acide trans-rétinoique à 1 mg/ml non traité. ATRA+UV : solution ATRA traitée par radiation UN. FORM + UN : formulation d'acide trans-rétinoique traitée par radiation UN.
EXEMPLES
Exemple 1 : Préparation de liposomes DPPG
4 g de DPPG (5,58 mmol, Lipoid KG, Allemagne) sont dispersés dans 250 ml d'une solution éthanol : eau (88 :12) contenant 3,4 g d'acétate de choline (21 mmol, Sigma, USA). La solution est chauffée à 60°C jusqu'à la complète dissolution des phospholipides.
12,5 ml de cette solution de DPPG sont injectés dans 87,5 ml d'eau à 80°C sous agitation magnétique, puis on laisse la solution revenir à température ambiante.
On obtient une suspension translucide de liposomes de DPPG à 2 g/1 présentant une taille autour de 100 nm, mesurée par dispersion de lumière dans un analyseur de particules submicroniques type Coulter Ν4D (Coultronics, USA).
La solution est ensuite stockée à + 4°C.
Exemple 2: Préparation de matrices hydrophiles cationiques de plusieurs micromètres à base de polysaccharide 50 g de polysaccharide (amylopectine, Waxilys 200, Roquette Frères, France) sont dispersés dans 100 ml d'eau. Lorsqu'il n'y a plus de grumeaux, 25 ml de soude 10 M sont ajoutés. La solution alcaline de polysaccharide est maintenue sous agitation jusqu'à obtention d'une solution visqueuse translucide.
2,83 g d'épichlorhydrine (ECH, 30 mmol, Sigma, USA) sont alors ajoutés et après une nuit d'agitation douce à température ambiante on observe la gélification du polysaccharide. On ajoute 31,2 g de glycidyl triméthyl ammonium (GTMA, 200 mmol, Fluka, Suisse) et la réaction est maintenue sous agitation pendant 8 heures à température ambiante. A la fin de la réaction, 1 litre d'eau est ajouté et le pH de la solution est amené entre 5 et 7 à l'aide d'acide acétique. Le gel obtenu est lavé en réalisant plusieurs décantations en eau et la suspension est pré-homogénéisée avec un Ultra-Turrax modèle T-25 (IKA, Bioblock, France). La suspension est alors homogénéisée à une pression de 50 bars à l'aide d'un homogénéisateur Minilab H-80 (Rannie, Danemark) afin d'obtenir des fragments de 1 à 50 μm qui sont visibles au microscope optique.
La suspension de particules est alors centrifugée à 5000 g pendant 15 minutes (Centrifugeuse Sigma 3k-20, Bioblock, France) et le culot est récupéré avec de l'eau osmosée.
La suspension de particules est alors séchée par lyophilisation et l'on obtient 20 g de particules de polysaccharide réticulé cationisé présentant les caractéristiques suivantes : Taille (microscopie optique) : 5-50 μm
Charge (Analyse élémentaire d'azote) : 1,75 mmol / g (groupements ammonium quaternaire par gramme de particules).
Exemple 3: Préparation de matrices hydrophiles cationiques submicroniques à base de polysaccharide.
50 g d'une maltodextrine (Glucidex 6, hydrolysat de polysaccharide Mw : 3400, Roquette Frères, France) sont solubilisés dans 80 ml d'eau puis 20 ml de soude 10M sont ajoutés. Dans la solution alcaline de polysaccharide maintenue sous agitation, 3,54 g d'épichlorhydrine (38,3 mmol) sont ajoutés. Après une nuit d'agitation douce à température ambiante, la solution gélifie.
31,2 g de glycidyl triméthyl ammonium (200 mmol) sont ajoutés au gel et la réaction est laissée 8 heures sous agitation. Après la fin de la réaction, 1 litre d'eau est ajouté et le pH de la solution est amené entre 5 et 7 à l'aide d'acide acétique. La suspension est pré-homogénéisée à l'aide d'un Ultra-Turrax T-25. La suspension de particules est alors homogénéisée (Minilab Ff-80) à une pression variant entre 500 et 900 bars pour obtenir des particules ayant une taille inférieure à lOOnm.
Les particules sont ensuite purifiées par ultrafiltration sur une membrane de 30 kDa (système Minissette, Filtron, USA). La suspension de particules est ensuite purifiée par micro filtration sur membrane de 0,2 μm (Spiral-Cap 0,2 μm, Gelman, USA) et stockée à 4°C. Les caractéristiques de la suspension sont :
Taille (Coulter N4D) : 60 nm (S.D= 20 nm)
Charge (Analyse élémentaire) : 2 mmol / g
Potentiel Z (Malvern série 3000, Tampon phosphate 15 mM pH 7) : +
18 mV
Concentration : 17 g/1
Exemple 4: Préparation de matrices hydrophiles anioniques submicroniques à base de polysaccharide
50 g de Glucidex 6 sont solubilisés dans 200 ml d'eau osmosée puis 50 ml de soude 10 M sont ajoutés. Cette solution est réfrigérée à + 4°C et maintenue sous agitation.
23 g d'oxychlorure de phosphore ( 150 mmol, Prolabo, France) sont ajoutés en même temps que 85,2 ml de soude 10M. L'ajout de ces 2 produits est réalisé de façon simultanée et pendant 2 heures. A la fin de l'ajout de réactifs, la réaction est laissée sous agitation pendant 1 heure. Dans ce cas la réticulation et la fonctionnalisation sont réalisées en même temps car l'oxychlorure de phosphore a la propriété de réticuler par des fonctions phosphodiester et de greffer de la charge par une liaison mono ester de phosphate.
On ajoute alors 1 litre d'eau et le pH de la solution est amené entre 5 et 7 avec de l'acide acétique.
La solution est pré-homogénéisée avec un ultra-turax puis homogénéisée entre 500 et 900 bars pour obtenir des particules inférieures à 100 nm. La solution est purifiée par ultra-filtration sur une membrane ayant un seuil de filtration de 30 Kda puis microfiltrée sur 0,2 μm.
On obtient une suspension de particules ayant les caractéristiques suivantes : Taille (Coulter N4D) : 50 nm (S.D. 20 nm) Charge totale (analyse phosphore total) : 2 mmol / g Taux de réticulation (fonctions phosphodiester déduites par titrage) :
0,2 mmol / g Potentiel Z (Tampon phosphate 15 mM, pH 7) : -21 mV Concentration : 20 mg /ml
Exemple 5: Préparation d'une matrice amphiphile cationique de plusieurs micromètres avec des phospholipides anioniques
10 ml d'une suspension à 10 g/1 de matrices hydrophiles cationiques synthétisées selon la méthode de l'exemple 2 sont mélangés avec une solution de liposomes DPPG à 2 g/1 (10 ml) fabriqués selon l'exemple 1. Le mélange est effectué à température ambiante. Afin de suivre la pénétration des lipides dans la matrice cationique, la suspension de DPPG est additionnée au préalable de 50 μg d'une sonde fluorescente lipophile (5-HexaDecanoylAminoEosine). Cette sonde hydrophobe et neutre suit les lipides dans sa distribution et n'est fluorescente qu'en présence de lipides.
Un échantillon est observé au microscope de fluorescence (Nikon Eclipse T- 300) et des photographies sont prises.
La figure 1 montre une fluorescence préférentiellement à la surface des particules indiquant que, à température ambiante, la phase lipidique ne peut pas pénétrer correctement le réseau polysaccharidique. L'interaction entre les liposomes anioniques et les particules cationiques est évidente mais on peut observer de la fluorescence diffuse dans l'arrière plan (excès de liposomes) indiquant la saturation de la surface de particules
Le même échantillon est traité à 80°C et on observe alors (Figure 2) une pénétration de la fluorescence beaucoup plus forte et une disparition de fluorescence dans l'arrière plan. On peut aussi observer que quelle que soit la taille des particules, la fluorescence semble être repartie de façon homogène dans le volume de la particule.
Exemple 6: Préparation de matrices amphiphiles cationiques submicroniques avec des phospholipides anioniques 24 ml d'une solution à 17 g/1 ( 408 mg de particules) en matrice hydrophile cationique préparée suivant l'exemple 3 sont maintenus sous agitation à 80°C. A l'aide d'une pompe péristaltique, 10,2 ml d'une solution éthanolique de
DPPG à 16 g/1 (éthanol : eau 88 :12, DPPG 163 mg) sont ajoutés lentement dans la solution de polysaccharide cationique. Après l'ajout de la totalité du DPPG, la solution est laissée sous agitation à 80°C durant 30 min. La solution est purifiée par ultra-filtration sur une membrane ayant un seuil de filtration de 30 KDa.
Il en résulte une suspension de matrices amphiphiles submicroniques avec un rapport matrice : lipides de 40 % w/w. En tenant compte du taux de charge de la matrice (2 mmol / g) et du poids molaire du DPPG (722 Da), on peut conclure que le taux de neutralisation de la charge cationique par le DPPG est de 26 %. II en résulte 34 ml d'une suspension de particules submicroniques (100-150 nm mesurées au Coulter N4D) à 16,5 g /l. Le potentiel Z de ces matrices amphiphiles reste largement cationique ( + 15 mV mesuré dans du tampon phosphate 15 mM pH 7).
Exemple 7: Pénétration de différents lipides anioniques sur des matrices cationiques submicroniques. Caractérisation des systèmes. Limitation du type de lipides.
Afin de visualiser l'effet de la phase lipidique sur les propriétés physiques de la matrice hydrophile, nous avons étudié la pénétration de différents lipides anioniques sur une matrice hydrophile cationique commerciale, le Sephadex QAE A- 50. Il s'agit de particules de dextran réticulé, fonctionnalisé par des fonction ammonium quaternaire et présentant une forme sphérique et une taille autour de 100 μm, ce qui les rend très utiles pour modéliser.
L'effet de l'association de différents types de lipides (DPPG, acide palmitique et l'acide octanoique) est étudié sur des particules de QAE Sephadex A-50 en mesurant la modification de leur taux de gonflement (hydratation) pour différentes quantités de lipides.
Sur 300 mg de Sephadex à 10 g/1, différentes quantités de lipides sont ajoutées (voir Tableau I) et chauffées 30 min à 80°C. Le taux d'hydratation initial du
Sephadex A-50 est de 65 ml /g. Le taux de charge cationique est de 3 mmol / g. Pour un même taux de neutralisation de charge, la masse de lipides à utiliser est proportionnelle à la masse molaire du lipide. Tableau I. Rapport de masse de lipides / gel hydrophile pour différents lipides et différents taux de neutralisation (pour 1 g de Sephadex A-50).
Figure imgf000022_0001
Le taux de gonflement est mesuré pour chaque type de lipides en fonction du taux de neutralisation de la charge (Figure 3). On observe que le DPPG et l'acide palmitique se comportent de la même façon, provoquant une forte contraction du gel due aux interactions hydrophobes entre les chaînes d'acides gras. L'acide octanoique est par contre incapable de contracter la matrice, indiquant une trop forte solubilité ou mobilité de chaînes acide gras. Dans ce cas le lipide est probablement en équilibre entre la matrice et le milieu environnant.
Pour mieux comprendre ces résultats nous avons travaillé avec des matrices amphiphiles submicroniques préparés selon l'exemple 7. Quatre types de matrices ont été préparées en utilisant quatre lipides anioniques différents (DPPG, palmitate de sodium, octanoate de sodium et dodécyl sulfate de sodium). Les quatre matrices ont été préparées à un taux de neutralisation de 20 %. Les quatre lipides ont été préalablement additionnés d'une sonde fluorescente lipophile (diphenyl hexatriène ou DPH, Molecular Probes, Pays Bas).
Les quatre suspensions de matrices hydrophiles présentent des caractéristiques semblables (taille autour de 100 nm et Potentiel Z autour de 15 mV). Nous avons alors mesuré l'émission de fluorescence (Spectrofluorimètre Perkin- Elmer LS 50B) dans les quatre cas en eau et en milieu salin physiologique (PBS). Le Tableau II montre clairement que dans le cas du DPPG et du palmitate le niveau de fluorescence est similaire en eau et en PBS, indiquant une bonne stabilité des lipides à l'intérieur de la matrice. Pour l'octanoate et dodecyl sulfate, la fluorescence en eau indique un chargement de la matrice en lipide mais cette fluorescence disparaît complètement en milieu ionique, indiquant une fuite complète du lipide.
Tableau IL Etude de l'émission de fluorescence de différentes matrices amphiphiles cationiques en eau ou en PBS en fonction du contre ion lipidique.
Figure imgf000023_0001
On peut conclure de cette étude que des lipides trop solubles ou en tout cas des tensioactifs présentant une solubilité dans l'eau supérieure à celle du sodium dodécyl sulfate ne pourront pas former à eux tous seuls des matrices amphiphiles stables.
Dans les deux cas où la matrice amphiphile semble stable (DPPG et palmitate) nous avons réalisé une étude de polarisation de la fluorescence du DPH en fonction de la température. En effet, le DPH permet de déterminer la température de transition de lipides car sa position dans les phases lipidiques est différente en fonction de l'état de fluidité de la membrane. La figure 4 représente l'évolution de la fluorescence des deux types de matrices en fonction de la température en milieu aqueux. On observe pour le DPPG une température de transition autour de 45 °C , indiquant que les phospholipides se sont organisés à l'intérieur de la matrice sous une forme lamellaire présentant les mêmes caractéristiques de coopérativité que les formes liposomales. L'acide palmitique par contre ne présente pas de température de transition, la diminution progressive de la fluorescence s'explique par l'augmentation progressive de la fluidité de la phase lipidique.
Finalement nous avons réalisé une étude de la taille des particules obtenues en fonction du taux de neutralisation des matrices lipidiques submicroniques chargées en DPPG. Nous avons observé que pour des taux de neutralisation supérieurs à 60 % de la charge, on commence à observer des phénomènes d'agrégation dus à une trop grande hydrophobie des matrices. Ce phénomène à été également observé pour d'autres lipides, et dépend non pas de la charge lipidique mais du taux de neutralisation de la matrice, indiquant que le caractère ionique doit être maintenu pour préparer des matrices amphiphiles stables en suspension.
Exemple 8: Préparation de matrices amphiphiles anioniques de taille submicronique avec des lipides cationiques
10 ml d'une solution de matrices anioniques (3 g/1, 30 mg) préparées selon l'exemple 5 sont placées à 80°C. On additionne progressivement 200 μl d'une solution éthanolique de dioctadécyl diméthyl ammonium (30 g /l, 6 mg, Sigma, USA). Après addition du lipide, la suspension est incubée à 80°C pendant 30 minutes puis laissée refroidir à température ambiante. L'éthanol est ensuite éliminé par ultrafiltration sur membrane de 30 Kda. On obtient une suspension de matrices amphiphiles anioniques à 5 g/1 présentant les caractéristiques suivantes :
Taille : 230 nm (S.D. 90 nm) Charge lipidique 20 % w/w
Potentiel Z (Tampon phosphate 15 mM pH 7): - 14 mV
Exemple 9: Solubilisation et stabilisation de l' Amphotéricine B dans des matrices amphiphiles cationiques.
L' amphotéricine B est un antifongique extrêmement insoluble qui ne possède pas de charge à pH physiologique . On peut néanmoins considérer que c'est un exemple de composé insoluble de charge opposée à la matrice car la fonction COOH peut être polarisée par son interaction avec la matrice.
10 ml d'une solution de vecteurs amphiphiles de l'exemple 6 à 5 g/1 (50 mg) est maintenue sous agitation dans un bain-marie à 50°C. On ajoute 500 μl d'une solution d'Amphotéricine B à 20 g/1 en diméthyl sulfoxyde (DMSO) à la solution de vecteurs amphiphiles. La suspension résultante est laissée sous agitation à 50°C durant 2 heures. On observe la complète dissolution de l'Amphotéricine B. La suspension de particules obtenues est filtrée sur 0,2 μm et le taux d'association de l'Amphotéricine B aux vecteurs amphiphiles est mesuré par spectroscopie (absorption à 405 nm ). Le taux d'association est supérieur à 90% en eau. 1 ml de suspension de particules amphiphiles chargées est ensuite dilué avec
9 ml de tampon PBS et le taux d'association est mesuré de la même façon. Le taux d'association en PBS reste supérieur à 80 %.
La stabilité des formulations d' Amphotéricine B ainsi obtenues a été suivie au cours du temps dans l'eau et dans différents milieux isotoniques comme le glucose 5 % ou le tampon phosphate isotonique (PBS). La figure 7 montre une excellente stabilité de la taille des formulations que ce soit à 4° C ou à température ambiante pendant plusieurs mois.
Exemple 10: Incorporation et stabilisation d'un composé très hydrophobe dans des matrices submicroniques amphiphiles cationiques.
Le valérate d'estradiol est un dérivé de l'estradiol extrêmement hydrophobe. 8,9 mg d'estradiol valérate sont solubilisés dans 5 ml d'une solution éthanolique de DPPG à 16 g/1 préparé suivant l'exemple 1.
Suivant le procédé décrit dans l'exemple 6, on injecte 2,8 ml de solution de DPPG-estradiol (45 mg DPPG, 5 mg d'estradiol valérate) dans 20 ml d'une suspension de matrices hydrophiles cationique préparée selon l'exemple 3 (3,5 g/1, 70 mg).
Après dialyse à 37°C contre de l'eau on obtient une suspension translucide de matrices amphiphiles chargées en estradiol valérate présentant les caractéristiques suivantes :
Taille : 100-150 nm
Potentiel Z (tampon phosphate 15 mM pH 7) == +11 mV Taux d'association en eau (HPLC) : > 90 % Taux d'association en PBS (HPLC) : > 80 % Exemple 11 Incorporation d'un lipide neutre avec le lipide chargé dans la matrice amphiphile.
Une solution éthanolique DPPG / cholestérol : 70/30 (w/w) à 20 g/1 est préparée en partant d'une solution éthanolique de DPPG à 16 g/1 préparée selon l'exemple 1.
Cette solution éthanolique de DPPG / cholestérol (1 ml, 20 mg) est injectée à chaud dans 10 ml d'une solution de vecteurs cationiques submicroniques préparés selon l'exemple 3 à 3 g/1 (30 mg) qui est maintenue à 80°C. Le taux de lipides est de 65% w/w (45 % DPPG, 20% Cholestérol) par rapport aux vecteurs. La suspension est maintenue 30 minutes à 80°C puis on la laisse revenir à température ambiante. On obtient une suspension de matrices amphiphiles cationiques submicroniques à 5 g/1 présentant les caractéristiques suivantes : Taille : 90 nm (SD 30 nm) Taux d'association cholestérol : 100 % Potentiel Z (tampon phosphate 15 mM, pH 7) : + 15 mN.
Exemple 12: Préparation de matrices amphiphiles cationiques submicroniques à partir de polymères naturels cationisés non réticulés.
Dans cet exemple, les polymères naturels étudiés sont l'amylose (polysaccharide de type linéaire) et l'amylopectine (polysaccharide de type ramifié). Les deux polymères présentent des masses molaires très élevées.
Les deux polysaccharides sont cationisés selon la méthode décrite dans l'exemple 2 sans ajouter d'épichlorhydrine. Ils sont traités avec du GTMA dans les mêmes conditions de façon à obtenir des polymères cationisés présentant un taux de charge de 1,7 mmol / g en fonctions ammonium quaternaire.
Les matrices amphiphiles cationiques non réticulées sont alors préparées suivant la même méthodologie que l'exemple 7. La taille de ces matrices est étudiée en fonction du taux de phospholipides anioniques (DPPG, Figure 5).
On observe d'abord une compaction des molécules de polymère cationique, due probablement à l'interaction hydrophobe entre les chaînes d'acides gras. Cette compaction produit spontanément des matrices amphiphiles de taille voisine de 200 nm. Dans la cas de l'amylopectine on observe que ces matrices se forment à partir de 5% de neutralisation ( 6 % DPPG w/w) ) et restent dans la même gamme de tailles jusqu'à 60 % (80 % DPPG w/w) de neutralisation, valeur à partir de laquelle l'agrégation augmente fortement. Dans le cas de l'amylose, l'agrégation est progressive à partir de 5 % de neutralisation. Il semble que des polymères ramifiés forment des matrices amphiphiles mieux structurées, probablement dû à une forme naturellement plus globulaire de la molécule.
Les matrices amphiphiles obtenues à partir de l'amylopectine cationisée présentent donc une taille autour de 200 nm et sont stables lorsqu'elles sont placées en milieu salin (PBS).
Exemple 13: Incorporation de l'Amphotéricine B dans des matrices amphiphiles non réticulées.
L'incorporation est réalisée suivant la méthode de l'exemple 8 à partir de matrices amphiphiles non réticulées de l'exemple 12. Les matrices amphiphiles utilisées ont été réalisées à un taux de DPPG de 40 % w/w.
Le taux de solubilisation de l'Amphotéricine B (AmB) est étudié en fonction du type de matrice amphiphile non réticulée. Le taux de solubilisation de l'Amphotéricine B dans l'eau présente peu de différences avec les matrices amphiphiles classiques déjà décrites mais la stabilité de l'association en PBS montre des fortes différences (Figure 6).
On observe que pour de faibles concentrations en Amphotéricine, les deux types de matrices sont capables de stabiliser l' amphotéricine tout comme les matrices réticulées. Par contre, pour des taux plus élevés, seules les matrices obtenues à partir de l'amylopectine sont capables de maintenir l' amphotéricine en suspension, à un taux légèrement inférieur à celui des matrices réticulées.
Exemple 14 : Préparation de matrices amphiphiles anioniques submicroniques chargées en halofantrine. L'halofantrine est un antipaludique connu, efficace contre la plupart des formes résistantes du Plasmodium, mais présentant des problèmes importants d'absorption intestinale liés à son manque de solubilité.
On prépare une suspension aqueuse de matrices anioniques submicroniques selon l'exemple 4 à 15 g/1 (100 ml, 1,5 g) qui est maintenue à 70°C. On ajoute 10 ml d'une solution éthanolique de dipalmitoyl phosphatidyl choline à 20 g/1 (DPPC, 200 mg) et 2 ml d'une solution éthanolique de Cétyl triméthyl ammonium bromure à 40 g/1 (CTAB, 80 mg).
On ajoute alors 7,5 ml d'une solution éthanolique d'halofantrine à 40 g/1 (300 mg).
Le tout est incubé 15 minutes à 60°C puis ramené à température ambiante. L'éthanol est éliminé par diafiltration contre de l'eau sur un système Amicon 8200 de 200 ml équipé d'une membrane YM-30 de point de coupure 30 Kd. Le volume final est ajusté à 150 ml. On obtient ainsi une suspension de matrices amphiphiles submicroniques chargées en halofantrine et contenant des lipides cationiques et lipides neutres. Particules submicroniques : 10 mg/ml (72 %)
DPPC : 1,33 mg/ml (9,5 %)
CTAB : 0,53 mg/ml (3,8 %) Halofantrine : 2 mg/ml (14,4 %)
Rendement d'incorporation : 100 % (HPLC)
Halofantrine filtrable sous 0,2 μm : > 95 % (HPLC)
Taille : 120 nm (Coulter N4D)
Exemple 15 : Préparation de matrices amphiphiles cationiques submicroniques (100 nm) et microniques (5-50 μm) chargées en Cyclosporine A.
* Formulation Cyclo 1
1 g de dipalmitoyl phosphatidyl glycérol (DPPG) est dispersé avec 4 ml d'une solution de Cyclosporine A en éthanol à 100 g/1 (400 mg). On ajoute 8,5 ml d'une solution de palmitate de sodium à 20 g/1 (170 mg) et 90 ml d'eau sous agitation. La solution est maintenue à 60°C. On prépare une suspension aqueuse de particules cationiques submicroniques préparées selon le procédé décrit dans l'exemple 3 à 20 g/1 ( 2g, 100 ml). Cette solution est maintenue à 60°C.
On ajoute la solution de lipides et cyclosporine à la solution de particules submicroniques sous agitation à 60°C puis la formulation est ramenée à température ambiante.
On obtient ainsi 200 ml d'une suspension de particules amphiphiles submicroniques dont les caractéristiques sont les suivantes :
Particules submicroniques : 10 g/1 (56 %)
DPPG : 5 g/1 (28 %)
Ac. Palmitique : 0,85 g/1 (4,8 %)
Cyclosporine A : 2 g/1 (11,2 %)
Taille : 100 nm ( Coulter N4D)
Rendement incorporation Cyclo A : 100 % ( ΗPLC)
Cyclo A filtrable sous 0,2 μm : > 95 % (HPLC)
* Formulation Cyclo 2
La même solution de lipides est ajoutée sur une suspension de particules cationiques de 5-50 μm préparées selon l'exemple 2 contenant 20 g/1 de particules (100 ml, 2 g) et qui est maintenue à 60°C.
Les résultats sont du même type que ceux présentés précédemment, sauf la taille qui reste entre 5 - 50 μm et la filtrabilité sous 0,2 μm qui n'est plus réalisable.
Exemple 16 : Passage intestinal sur un modèle de sac éverté chez le rat. Protocole
Les différentes formulations de cyclosporine ont été réalisées selon l'exemple 15 en remplaçant l'acide palmitique par du Sodium Dodecyl Sulfate (SDS).
Pour la formulation contrôle, la cyclosporine a été incorporée dans des micelles de
SDS. Les formulations étudiées Cyclo- 1 et Cyclo-2, correspondent à différentes tailles de nanoparticules, respectivement 100 nm et 5-50 μm. Ces formulations sont des solutions aqueuses d'un mélange cyclosporine/[3H]-cyclosporine à une concentration de 10 mM. En mélangeant 1 ml de ces solutions à 9 ml de milieu TC199 (95% O2, 5 % CO2), on a obtenu 10 ml d'une solution de cyclosporine à 1 mM.
Des rats mâles (Sprague-Dawley) d'environ 350 grammes, privés de nourriture pendant 24 heures, sont sacrifiés par étirement cervical. L'intestin est prélevé dans sa totalité et nettoyé dans une solution de NaCl 0,9% à température ambiante. Il est alors immergé dans le milieu TC 199 oxygéné à 37 °C (10 ml TC 199 concentré, 5 ml NaHCO3 à 44 mg/ml, 1 ml glutamine à 1 mg/ml, H2O Q.S. 100 ml). Le pH du milieu après oxygénation est de 7,4. Au moyen d'une tige en verre, l'intestin est éversé et rempli avec du milieu oxygéné. A partir du jéjunum, des petits sacs, de 2 à 3 centimètres, sont réalisés à l'aide de fils de soie. Chacun d'eux est placé dans un erlen-meyer contenant 10 ml de milieu d'incubation à 37 °C sous agitation (60 cycles par minute). Les sacs témoins sont trempés dans le milieu et ressortis immédiatement. A la fin du temps d'incubation désiré, les sacs sont rincés par passage rapide dans 4 bains de NaCl 0.9%. Les sacs sont pesés après séchage sur papier absorbant. Leur contenu est récupéré pour être compté. Le sac vide obtenu est à nouveau essuyé et pesé.
La différence de poids permet d'estimer le volume de son contenu (densité du milieu : 1,008 g/ml à 37 °C). Les sacs vides sont dissous dans la soude 1M à 37°C sous agitation pendant 3 heures.
Le dosage des protéines est réalisé sur chaque sac dissous par spectrophotométrie à 750 nm (spectrophotomètre Perkin Elmer, Lambda 3) suivant la méthode de Lowry (Peterson, 1986) et en utilisant comme standard l'albumine sérique bovine. Pour le comptage de la radioactivité, des volumes de 400 μl prélevés dans le contenu des sacs et de 500 μl prélevés dans le milieu d'incubation sont complétés à 1 ml avec de l'eau distillée. Des volumes de 800 μl de tissus dissociés par la soude sont prélevés et neutralisés par 200 μl de HC1 5N. La détermination de la radioactivité dans les échantillons complétés par 5 ml de scintillant (Ready Safe, Beckman) est réalisée sur un compteur Beckman LS 1801. Résultats
Les résultats de l'absorption dans le contenu des sacs sont donnés sur la figure 8. Les résultats de l'accumulation tissulaire sont donnés sur la figure 9.
On constate un passage de la cyclosporine à travers la muqueuse intestinale dans le modèle du sac d'intestin de rat éversé. La cyclosporine formulée à l'aide des particules de taille 0,1 μm (formulation cyclo- 1) a été la mieux absorbée dans le contenu des sacs. Il existe un effet négatif de la taille des particules sur l'absorption, la formulation réalisée à partir de vecteurs de 5-50μm, n'a pas entraîné d'augmentation significative du passage de la cyclosporine. Les vecteurs de taille 0,1 μm ont même montré une efficacité supérieure par rapport à ceux de 5-50 μm au temps 75 minutes .
En ce qui concerne l'adsorption tissulaire, les particules de taille 5-50 μm ont entraîné une augmentation de l'absorption, par rapport au contrôle, aux temps 30 et 45 minutes. Lors de l'expérimentation, ces particules ont formé des agrégats avec le mucus sécrété par les sacs intestinaux et étaient accolés à la muqueuse intestinale. Cette observation va dans le sens d'une muco-adhésion importante des particules de plus grande taille.
Ces résultats permettent de conclure que :
- les vecteurs de l'invention favorisent le passage de la cyclosporine dans le modèle du sac d'intestin éversé de rat.
- une plus faible taille de ces vecteurs est un facteur positif pour la libération du principe actif à travers les sacs éversés.
- l'augmentation de la concentration tissulaire du principe actif est probablement due à une forte mucoadhésion des particules portant la cyclosporine.
Exemple 17 : Biodisponiblité de la cyclosporine chez le chien beagle Protocole
4 chiens beagle pesant approximativement 10 Kg sont traités en cross-over selon le design présenté dans le tableau ci-dessous: Tableau III : Etude de pharmaco cinétique chez le chien Beagle
Figure imgf000032_0001
A différents temps, après administration orale des formulations décrites ci- dessous, on prélève 3 ml de sang et l'on mesure la concentration sanguine en cyclosporine A par LC-MS en utilisant la cyclosporine U comme étalon interne.
Formulations A: Suspension liquide de cyclosporine A dans l'eau en association avec des vecteurs type ABV tels que décrits à l'exemple 15 (formulation cyclo-2 ; 1,2 mg/ml Cyclosporine-A et 9,5 mg/ml ABV réf. KX )
Formulations B : Suspension liquide de cyclosporine A dans l'eau en association avec des vecteurs type ABV décrit à l'exemple 15 (formulation cyclo 1 ; 1,22 mg/ml Cyclo-A et 9,5 mg/ml ABV réf. KX ).
Les formulations de référence sont les suivantes : Formulation D : Neoral® capsules Formulation E : Sandimmun® capsules. Ces deux produits sont disponibles chez Novartis Pharma, et sont décrits dans le dictionnaire Vidal. Résultats
La figure 10 donne le profil de pharmacocinétique sanguine de la cycloporine A après administration orale de différentes formulations, par comparaison à la référence (Neoral®). Les tableaux IV à VI résument les paramètres pharmacocinétiques dérivés de ces courbes.
L'analyse des résultats montre :
- une bio-équivalence des formulations réalisées à partir de vecteurs type
ABV de lOOnm (formulation B) par comparaison à la référence Neoral®. Ainsi, les résultats de la formulation B et du Neoral® en terme de biodisponibilité sont parfaitement équivalents (99% en Cmax et 100% en AUC 0-48H du Neoral®). De plus la formulation B présente un coefficient de variation sur le Cmax inférieur à celui du Neoral® (20 vs 39%), ce qui laisse penser que l'absorption obtenue avec cette formulation est moins dépendante des facteurs inter-individuels. - de façon attendue le Sandimmun® est moins bien absorbé que le Neoral®
(70% en Cmax et 66% en AUC 0-48H). La formulation B étant dans ce cas mieux absorbé que celui-ci (tableau V et IV).
- un effet négatif de l'augmentation de la taille des particules (formulation B versus formulation A). La formulation B (lOOnm liquide) est la mieux absorbée ce qui est visualisé tant sur les AUC que sur le Cmax (tableau IV et V)
- cette même formulation présente une adsorption précoce par comparaison au Neoral® (formulation D) et au Sandimmun® (formulation E) (tableau VI). Ainsi les résultats obtenus permettent de démontrer l'action des formulations réalisées à partir de vecteurs type ABV sur la biodisponibilité d'un principe actif relativement insoluble dans l'eau (la cyclosporine A) et laisse penser que ces formulations pourraient permettre d'agir sur la vitesse de passage du principe actif dans la circulation sanguine. Tableaux IV à VI : Paramètres pharmaco cinétiques des différentes formulations testées après administration orale chez le chez beagle
Figure imgf000033_0001
Tableau IV
Figure imgf000034_0001
Tableau V
Figure imgf000034_0002
Tableau VI
Exemple 18 : Stabilisation de l'acide trans-rétinoique par incorporation dans des matrices amphiphiles cationiques de 100 nm.
L'acide trans-rétinoïque est une molécule thérapeutique utilisée notamment dans le traitement des acnés sévères. Il s'agit d'une molécule pratiquement insoluble dans l'eau et possédant une fonction carboxylate ce qui en fait un candidat de choix pour son incorporation dans les matrices amphiphiles cationiques. Lorsque la molécule est en solution, elle présente une forte instabilité à la lumière, l'air et la température.
Une suspension de matrices amphiphiles cationiques submicroniques, préparées selon l'exemple 6 et diluées à 10 g/1 est maintenue sous agitation à 40°C
(50 ml, 500 mg de matrices). On ajoute alors 1 ml d'une solution éthanolique d'acide trans-rétinoique à 50 g/1 (50 mg, 10 % w/w par rapport aux particules). On obtient ainsi une suspension de matrices amphiphiles cationiques chargées à 10 % w/w en acide trans-rétinoique. La taille des particules mesurée par dispersion de lumière (Coulter N4D, Coultronics Inc.) est de 120 nm.
On prépare une solution éthanolique d'acide rétinoique à 1 g/1 qui sera comparée à la formulation.
10 ml de la solution éthanolique sont placés dans un tube à essai et laissés à la lumière et température ambiante (ATRA).
10 ml de la solution éthanolique (ATRA + UV) et 10 ml de la suspension de vecteurs amphiphiles chargés (FORM + UV) sont placés sur une table d'émission UV à 312 nm ( Stratagene Eagle-Eye) pendant 60 minutes, afin d'accélérer la dégradation de l'acide trans-rétinoique.
Les résultats sont présentés dans la Figure 11, dans laquelle la dégradation de l'acide trans-rétinoique est suivie par la diminution de l'absorption à 340 nm. On observe une dégradation très rapide de l'acide trans-rétinoique en solution et une claire stabilisation de la molécule lorsqu'elle est formulée dans les matrices amphiphiles.

Claims

REVENDICATIONS
1) Matrice polymérique caractérisée en ce qu'elle comporte une matrice hydrophile macromoléculaire portant une charge ionique positive ou négative et dans laquelle est incorporée une phase lipidique de signe contraire à celui de la matrice.
2) Matrice polymérique selon la revendication 1, caractérisée en ce que la matrice hydrophile est constituée de polymère linéaire ou ramifié dont la charge ionique est naturellement ou chimiquement greffée. 3) Matrice polymérique selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la matrice hydrophile est constituée de polymère polyhydroxylé linéaire ou ramifié dont la charge ionique est naturellement ou chimiquement greffée.
4) Matrice polymérique selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la matrice hydrophile est constituée de polysaccharides ou oligosaccharides portant des fonctions ioniques naturellement ou chimiquement greffées.
5) Matrice polymérique selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la matrice hydrophile est naturellement ou chimiquement réticulée.
6) Matrice polymérique selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la charge est obtenue par greffage d'une charge ionique, portée par un groupement phosphate ou un groupement ammonium quaternaire.
7) Matrice polymérique selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que les lipides chargés sont choisis parmi les phospholipides, les acides gras, les tensioactifs anioniques ou cationiques, les lipides anioniques ou cationiques.
8) Matrice polymérique selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que le lipide anionique est choisi dans le groupe constitué des diacyl phosphatidyl glycérol, diacyl phosphatidyl serine, cardiolipine, acides gras.
9) Matrice polymérique selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que le lipide cationique est choisi dans le groupe constitué des diacyl diméthyl ammonium, acyltriméthylammonium, DOGS, DOTAP, phospholipides ou phosponolipides cationiques, acylcarnitine, esters de bétaïne à longue chaîne. 10) Matrice polymérique selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que la phase lipidique contient également des lipides neutres.
11) Matrice polymérique selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu'elle se présente sous la forme d'un film. 12) Matrice polymérique selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu'elle se présente sous la forme d'un « patch ».
13) Matrice polymérique selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu'elle se présente sous la forme d'une particule.
14) Matrice polymérique selon la revendication 13, caractérisée en ce que la particule est une microparticule ou une nanoparticule.
15) Matrice polymérique selon la revendication 14, caractérisée en ce que la particule est maintenue en suspension par addition de tensioactifs ou phospholipides non ioniques ou zwitterioniques.
16) Matrice polymérique selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisée en ce que, dans la matrice et/ou dans la phase lipidique, se trouve incorporé un principe actif.
17) Procédé de préparation d'un matrice polymérique selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que : a) On prépare une matrice polymérique hydrophile portant une charge globale positive ou négative. b) On prépare une solution de lipides de charge opposée à celle de la matrice. c) On effectue un mélange des deux solutions sous agitation, à une température suffisante pour fluidifier la phase lipidique, afin de la faire pénétrer dans la matrice.
18) Procédé de préparation selon la revendication 17, caractérisé en ce que le mélange de l'étape c) s'effectue à une température comprise entre 40 et 80 °C.
19) Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient une matrice polymérique selon l'une des revendications 1 à 16, ou obtenue par un procédé selon la revendication 17 ou 18, dans laquelle est incorporé un principe actif et un support pharmaceutiquement acceptable pour son administration. 20) Composition cosmétologique, caractérisée en ce qu'elle contient une matrice polymérique selon l'une des revendications 1 à 16, ou obtenue par un procédé selon la revendication 17 ou 18, dans laquelle est incorporé un principe actif à activité dermatologique et/ou cosmétique et des excipients cosmétologiquement acceptables.
21) Composition à usage alimentaire, caractérisée en ce qu'elle contient une matrice polymérique selon l'une des revendications 1 à 16, ou obtenue par un procédé selon la revendication 17 ou 18.
22) Matrice polymérique selon l'une des revendications 1 à 16, ou obtenue par un procédé selon la revendication 17 ou 18 à titre de médicament.
23) Utilisation d'une matrice polymérique selon l'une des revendications 1 à 16, ou obtenue par un procédé selon la revendication 17 ou 18, pour la préparation d'un complexe matrice polymérique - principe actif destiné à être administré par voie orale. 24) Utilisation d'une matrice polymérique selon l'une des revendications 1 à 16, ou obtenue par un procédé selon la revendication 17 ou 18, pour la préparation d'un complexe matrice polymérique - principe actif destiné à être administré par voie mucosale, parentérale ou topique.
25) Utilisation selon la revendication 24, caractérisée en ce que ledit complexe se présente sous une forme choisie dans le groupe constitué des collyres ophtalmologiques, préparations auriculaires, bains de bouche, préparations vaginales, collutoires, et aérosols pulmonaires.
26) Utilisation d'une matrice polymérique selon l'une des revendications 1 à 16, ou obtenue par un procédé selon la revendication 17 ou 18, pour la préparation d'un complexe matrice polymérique - principe actif, permettant la protection et/ou stabilisation dudit principe actif sensible aux réactions d'hydrolyse, oxydation et autres réactions de dégradation.
27) Utilisation d'une matrice selon la revendication 16, pour la préparation d'un complexe matrice polymérique - principe actif, caractérisé en ce que ledit principe actif est un antigène, ledit complexe étant administré par injection ou par voie mucosale. 28) Procédé de modification de la vitesse de relargage d'un principe actif, caractérisé en ce qu'il contient les étapes de : a) préparation de matrices selon la revendication 16, avec des variations de taille et/ou de composition de phase lipidique, avec incorporation éventuelle dudit principe actif, b) incorporation dudit principe actif dans les matrices préparées à l'étape a), s'il n'a pas été incorporé lors de l'étape a) c) étude de la modification de la vitesse de relargage du principe actif en fonction de la structure de la matrice. 29) Utilisation d'une matrice polymérique selon l'une des revendications 1 à 16, ou obtenue par un procédé selon la revendication 17 ou 18, pour la préparation d'un complexe matrice polymérique - principe actif destiné à améliorer la biodisponibilité dudit principe actif par rapport au principe actif non formulé, quelle que soit la voie d'administration. 30) Utilisation d'une matrice polymérique selon l'une des revendications 1 à 16, ou obtenue par un procédé selon la revendication 17 ou 18, pour la préparation d'un complexe matrice polymérique - principe actif destiné à être administré par voie orale ou mucosale et à améliorer l'absorption dudit principe actif.
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