FR2757768A1 - Vecteur particulaire homeocharge et composition pharmaceutique ou cosmetique le contenant - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un vecteur particulaire comprenant: - un noyau hydrophile non liquide, - un feuillet amphiphile Caractérisé en ce que le noyau porte une charge globale cationique, anionique ou neutre et en ce que le feuillet amphiphile porte une charge globale de même polarité que celle portée par le noyau. Elle concerne également une composition pharmaceutique, cosmétique ou un additif alimentaire contenant un tel vecteur.
Description
La présente invention se rapporte à des particules complexes, utiles pour le transport et le ciblage de principes actifs, qui sont compatibles avec les fonctions biologiques de l'organisme et des cellules.
Des vecteurs particulaires ont été décrits dans EP 344 040 ; ces vecteurs comprennent un noyau hydrophile, entouré d'une première couche lipidique, puis d'une seconde couche, plus externe, de composes amphiphiles liés à la première couche lipidique par des interactions hydrophobes.
la a demande WO 94/20078 a été déposée pour une autre génération de vecteurs particulaires, ou "BVSM-L", constitués d'un noyau hydrophile et d'une couche externe composée au moins en partie de composés amphiphiles, directement associée au noyau par des liaisons ioniques ou des interactions hydrophobes. Le noyau de ces vecteurs peut être greffé par des ligands ioniques, acides ou basiques, lui conférant une charge qui peut être mise à profit pour le changement de certains actifs.
la a demande WO 94/20078 a été déposée pour une autre génération de vecteurs particulaires, ou "BVSM-L", constitués d'un noyau hydrophile et d'une couche externe composée au moins en partie de composés amphiphiles, directement associée au noyau par des liaisons ioniques ou des interactions hydrophobes. Le noyau de ces vecteurs peut être greffé par des ligands ioniques, acides ou basiques, lui conférant une charge qui peut être mise à profit pour le changement de certains actifs.
De manière inattendue, la Demanderesse a maintenant trouvé que des vecteurs particulaires, dans lesquels à la fois le noyau et le feuillet externe portent une charge ionique peuvent être obtenus de façon stable.
De plus, un noyau globalement neutre peut être associé à un feuillet externe non chargé.
En effet, contrairement aux observations et aux connaissances généralement admiscs dans l'état de la technique, des charges de même signe peuvent être présentes sur les différents composants du vecteur.
C'est pourquoi la présente invention a pour objet un vecteur particulaire comprenant - un noyau hydrophile non liquide - un feuillet amphiphile caractérisé en ce que le noyau porte une @ charge globale cationique, anionique ou neutre et en ce que le feuillet amphiphile porte une charge globale de même polarité que celle portée par le noyau
L)e tels vecteurs, qui associent une structure interne chargée hdrophile, avec une structure externe de charge semblable ct dc caractère amphiphile, seront appelés dans ce qui suit "homéobiovecteurs" ou "biovecteurs homéocharges'.
L)e tels vecteurs, qui associent une structure interne chargée hdrophile, avec une structure externe de charge semblable ct dc caractère amphiphile, seront appelés dans ce qui suit "homéobiovecteurs" ou "biovecteurs homéocharges'.
La couche de composés amphiphiles se trouve dans une situation externe par rapport au noyau de l'homéobiovecteur ; elle peut être discontinue ou continue, et/ou présenter des interdigitations avec les constituants du noyau.
Alors que l'on pourrait s'attendrc à ce que les répulsions électrostatiques entre le feuillet amphiphile et le noyau s'opposent à ce type d'association, les homéo-biovecteurs se caractérisent par une remarquable stabilité de l'association supra-moléculaire dans le temps.
Ils présentent en outre une organisation spécifique de la membrane amphiphile, avec une augmentation de l'entassement moléculaire des lipides et un fort degré de coopérativité. Cette organisation est modulée par la charge ionique du noyau hydrophile.
Elle peut notamment être objectivée par la mesure des températures de transition de phase.
Les homéo-biovecteurs, cationiques ou anioniques, pourront servir au transport de molécules d'intérêt. Selon un des aspects préférés de l'invention, ces vecteurs contiendront au moins un principe actif, associé au noyau et/ou au feuillet amphiphile.
La composition du noyau et/ou du feuillet amphiphile seront adaptés par l'homme du métier selon le type de molécule devant lui être associé et l'application envisagée.
Dans l'un des modes de réalisation de l'invention, le vecteur particulaire comportera au moins - un noyau hydrophile non liquide portant une charge cationique ou
anionique - un feuillet amphiphile portant une charge cationique ou anionique, de
même polarité que celle portée par le noyau.
anionique - un feuillet amphiphile portant une charge cationique ou anionique, de
même polarité que celle portée par le noyau.
Dans un autre mode de réalisation également compris dans I'invention, le vecteur comporte - un noyau hydrophile non liquide, neutre électriquement - un feuillet amphiphile globalement neutre, comprenant des
phospholipides zwittéri()niques.
phospholipides zwittéri()niques.
En particulier, le feuillet amphiphile pourra être constitué d'un ou plusieurs composants, en vue de créer un environnement physicochimique adapté au principe actif et à la fonction recherchée.
De préférence, au moins un constituant du feuillet amphiphile est choisi dans le groupe constitué par les phospholipides anioniques, cationiques ou zwittérioniques, naturels ou synthétiques, les céramides, les acides gras, les stéroïdes, les lipides, les glycolipides, les lipoprotéines et les tensioactifs, portant une charge de même polarité que celle du noyau.
Parmi les constituants particulièrement adaptés à la préparation des homéobiovecteurs, on peut citer la phosphatidylcholine, la phosphatidyléthanolamine, la phosphatidylserine, le phosphatidylglycérol, le phosphatidylinositol, le cholestérol, et leurs dérivés. Ces constituants peuvent être seuls ou en mélange, éventuellement associés à d'autres constituants non chargés.
Selon l'un des aspects de l'invention, au moins un constituant du feuillet amphiphile est choisi parmi la dipalmitoyl phosphatidylcholine, le dimyristoyl phosphatidylglycérol, le dipalmitoyl phosphatidylglycérol, le distéaroyl phosphatidylglycérol, le dioleoyl phosphatidylglycérol, le dimyristoyl acide phosphatidique, le dipalmitoyl acide phosphatidique, le dipalmitoyl phosphatidylsérine et la stéarylamine.
La proportion de constituants du feuillet amphiphile portant une charge de même polarité que celle du noyau-est dans tous les cas supérieure à 0%, en particulier supérieure à 0,001%, et inférieure ou égale à 100%. Elle peut notamment être comprise entre environ 5% et 30% de ces constituants, en fonction de la charge portée par le noyau hydrophile.
Ce noyau est de préférence essentiellement constitué de composés choisis parmi les oligomères et les polymères hydrophiles, naturellement ou chimiquement réticulés.
Plus particulièrement, le noyau est constitué de dérivés saccharidiques, de différents poids moléculaires, en particulier de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, portant une charge cationique ou an ionique.
On peut ainsi utiliser l'amidon, le dextrane ou la cellulose et leurs dérivés substitués, de même que leurs produits d'hydrolyse comme notamment les dextrines et les maltodextrines. Les sels et les esters de ces polymères ou oligomères (qui comportent naturellement des fonctions hydroxy) seront également appropriés à la mise en oeuvre de l'invention.
La réticulation pourra être obtenue par différentes techniques connues de l'homme du métier. Des méthodes de préparation de noyaux po uvant entrer dans la composition des homéo-biovecteurs sont notamment décrites dans WO 94/20078 et WO 92/21329.
Avantageusement, des ligands ioniques, acides ou basiques sont fixés sur le noyau.
La fixation des ligands ioniques sur le noyau sera effectuée après cette étape de réticulation ou en même temps, dans certains modes de réalisation. Cette seconde possibilité est notamment applicable pour des noyaux "acides", en particulier par la mise en oeuvre d'un réactif assurant simultanément la réticulation et le greffage des ligands ; à cet égard, un réactif comme l'oxychlorure de phosphore, utilisé à basse température (de l'ordre de 0 à 10 C, de préférence aux environs de 4 C), est particulièrement adapté.
De manière générale, tout composé susceptible d'attaque nucléophile par les hydroxyles de l'oligo ou du polysaccharide peut être greffé sur la matrice ; on peut ainsi citer les époxydes, chlorures d'acide, anhydrides, halogénures d'alkyle, isothiocyanates, chlorotriazines, etc.
De préférence, les ligands ioniques portent au moins une fonction choisie dans le groupe comprenant : phosphates, sulfates, acides carboxyliques, ammonium quaternaire, amines primaires, amines secondaires. Les réactifs peuvent par exemple être choisis parmi l'acide succinique, L'acide phosphorique, L'acide citrique, la glycine, I'alanine,
L'acide glutamique, l'acide aspartique ou leurs dérivés, la choline,
I'hydroxycholine, le 2-(diméthylamino)éthanol, la 2 (diméthylamino)éthylamine et le chlorure de glycydyltriméthylammonium.
L'acide glutamique, l'acide aspartique ou leurs dérivés, la choline,
I'hydroxycholine, le 2-(diméthylamino)éthanol, la 2 (diméthylamino)éthylamine et le chlorure de glycydyltriméthylammonium.
La concentration initiale en polysaccharides est de préférence comprise entre 100 et 500 g/l, selon les rendements dc greffage et de réticulation souhaités, et en fonction du type de gel recherché (durcté, homogénéité, taille de maille).
En tout état de cause, I'étape de fonctionnalisation du noyau sera avantageusement effectuée avant le broyage et l'homogénéisation du gel pour obtenir des particules de taille et de dureté contrôlée, dans lesquelles les charges sont réparties de façon homogène et régulière.
Cette homogénéisation peut être effectuée par haute pression (700 à 1200 bars), et suivie d'une ou plusieurs filtrations.
De préférence, le noyau hydrophile est directement associé au feuillet amphiphile, par des interactions pouvant notamment être du type liaisons hydrogène.
Les homéo-biovecteurs sont préparés par mélange des noyaux dispersés dans un solvant aqueux avec le ou les contituants du feuillet. Ia synthèse peut notamment être effectué sous agitation, à une température supérieure à la température de transition de phase gel-liquide des constituants amphiphiles, ou par homogénéisation sous pression à une température supérieure à la température de transition de phase gelliquide des constituants amphiphiles, ou toute autre méthode appropriée.
Après élimination des solvants organiques résiduels, les homéobiovecteurs sont stérilisés notamment par filtration et stockés en conditions stériles.
Le diamètre moyen des homéo-biovecteurs peut varier de 10 nm à 100 m.
Dans un des modes de réalisation de l'invention, convenant particulièrement à des applications pharmaceutiques, ce diamètre est compris entre 10 nm et 5 m, en particulier d'environ 15 nm à 80 nm.
Différents types de molécules pourront être associées à l'homéobiovecteur, et notamment des principes actifs portant une charge globale anionique, cationique ou zwittérionique.
Ces molécules pourront notamment être choisies parmi les peptides, les protéines, les lipoprotéines, les r)rotéogl! canes, les li popolysaccharidcs, les acides gras, les triglycérides, les phospholipides, les glycolipides, les stériles, les oligosaccharides, les séquences nucléotidiques, les séquences nucléosidiques, les acides nucléiques, les vitamines et les porphyrines.
Ils pourront être utiles dans différents domaines, et les homéobiovecteurs peuvent, dans différents modes de réalisation de l'invention, être associés à au moins un principe actif choisi dans le groupe suivant les antibiotiques, les antiseptiques, les analgésiques, les anesthésiants, les antiinflammatoires, les antiviraux, les anticancéreux, les immunomodulateurs et les médiateurs cellulaires, les antihistaminiques, les antimuscariniques, les agents anti-anémiants, les agents hémostatiques, les anti-diabétiques, les agents cardio-vasculaires, les antidépresseurs, les anti-épileptiques, les anxiolytiques, les hypnotiques, les sédatifs, les antipsychotiques, les agents anorexigènes, les vaccins, les hormones naturelles ou synthétiques et leurs dérivés, les insecticides, les fongicides, les antimalariques, les antiasthmatiques, les anticorps, les antigènes et leurs fragments, les agents de diagnostic, les agents de diagnostic RNIN, et les marqueurs radioactifs.
Parmi les médiateurs cellulaires, on peut citer les cytokines, choisies dans le groupe comprenant: les interleukines, les interférons, les
TNF, le G-CSF, le M-CSF, le GM-CSF et le MIF.
TNF, le G-CSF, le M-CSF, le GM-CSF et le MIF.
La structure et la charge de l'homéo-biotecteur pourront être adaptées selon la nature de principe actif, dont l'efficacité sera améliorée notamment par un potentiel de surface membranaire accentué, du fait de la présence du noyau sous-jacent de charge semblable.
De tels vecteurs sont particulièrement avantageux puisqu'ils permettent d'associer les caractéristiques de ciblage assurées en particulier par le noyau hydrophile et les interactions cellulaires spécifiques d'une membrane amphiphile, notamment phospholipidique.
En outre, la structure membranaire lipidique est stabilisée par la présence du noyau. Les forces de répulsion entre les homéo-biovecteurs limitent les interactions interparticulaires et augmentent donc leur durée de xie.
Enfin, selon la nature physicochimique dc la molécule transportée, elle pourra etre associée à l'une et/ou l'autre des structures de l'homéobiovecteur.
Par exemple, dans le cas d'association de molécules d'intérêt telles que des protéines, des systèmes membranaires modèles décrits dans la littérature (monocouches phospholipidiques, liposomes) montrent que les interactions entre la membrane et les protéines peuvent être favorisées si la membrane est chargée avec un potentiel de surface important et possède un fort entassement moléculaire.
En particulier, les homéo-biovecteurs anioniques peuvent être associés à des drogues cationiques à la fois au niveau du noyau et de la membrane (TNF, IL2). Il a été largement décrit dans la littérature qu'une membrane anionique favorise l'association, la stabilité et la pénétration cellulaire de protéines membranaires (cytochrome c, hémagglutinine). La charge anionique des noyaux joue un rôle important dans les interactions avec les membranes cellulaires.
La combinaison de ces deux facteurs (noyau anionique associé à la membrane anionique), dans le cadre d'une application thérapeutique, devrait conférer une synergie d'action pour une délivrance favorable de la drogue. Cet effet ne serait pas observable en utilisant chaque système (noyau an ionique ou liposomes anioniques) pris isolément.
Schönhoff et al. (I'rogr. Colloid Polymer. Sci., 1992, 89, 243-248) a montré que l'incorporation de protéines membranaires dans la membrane lipidique est optimisée avec une membrane anionique qui possède un fort entassement moléculaire.
De nombreuses publications se reportant à l'interaction des
Cytochromes (Cyt.) avec des membranes modèles ont montré que: - la liaison du Cyt.c à une monocouche dépend dc la densité de charge du
film lipidique. La pénétration dans la membrane est favorisée par la
présence des charges surfaciques.
Cytochromes (Cyt.) avec des membranes modèles ont montré que: - la liaison du Cyt.c à une monocouche dépend dc la densité de charge du
film lipidique. La pénétration dans la membrane est favorisée par la
présence des charges surfaciques.
- dans le cas des membranes constituées de mélanges phospholipidiques,
la Cyt.c oxydase discrimine les différents constituallts membranaires en
fonction de leur têtue polaire (avec une préférence pour les charges
anioniques) et en fonction de l'état de phase de la membrane
(préférence pour une membrane à fort entassement moléculaire) (de
Cuyper, Eur. J. Biochem., 1980, 104,397-405).
la Cyt.c oxydase discrimine les différents constituallts membranaires en
fonction de leur têtue polaire (avec une préférence pour les charges
anioniques) et en fonction de l'état de phase de la membrane
(préférence pour une membrane à fort entassement moléculaire) (de
Cuyper, Eur. J. Biochem., 1980, 104,397-405).
- les interactions entre la membrane et le Cyt.bS sont renforcées en
présence de lipides anioniques (interactions électrostatiques). Ces
interactions ont pour effet de favoriser l'insertion membranaire
(protection contre la dénaturation) (Dufourcq-Faucon, FEBS Letters,
1975, 57(1) 112-116). La présence de lipides saturés (membrane à fort
entassement moléculaire) est recommandée (Dufourcq-Bernon,
Biochem. Biophys. Acta, 197G, 433, 252-263). Dans ces systèmes
reconstitués, il apparaît que les lipides à tête polaire anionique sont
nécessaires pour faciliter l'association et permettre une bonne
orientation des groupements hémiques (Chester, Biophys. J. 1992, 61, 12241243).
présence de lipides anioniques (interactions électrostatiques). Ces
interactions ont pour effet de favoriser l'insertion membranaire
(protection contre la dénaturation) (Dufourcq-Faucon, FEBS Letters,
1975, 57(1) 112-116). La présence de lipides saturés (membrane à fort
entassement moléculaire) est recommandée (Dufourcq-Bernon,
Biochem. Biophys. Acta, 197G, 433, 252-263). Dans ces systèmes
reconstitués, il apparaît que les lipides à tête polaire anionique sont
nécessaires pour faciliter l'association et permettre une bonne
orientation des groupements hémiques (Chester, Biophys. J. 1992, 61, 12241243).
Dans le cas de la somatostatine c) clique, la présence de charges anioniques dans la membrane a pour effet de favoriser l'association et l'insertion du peptide. Cette insertion s'accompagne d'une réorganisation des tetes polaires avoisinantes (Beschiaschvili Biochem. Biophys. Acta, 1991,1061,78-84).
Le mélange lipidique de phosphatidylcholine et de phosphatidylglycérol (DPPC/DPPG) aboutit à une membrane anionique qui participe à la stabilisation et l'orientation de protéines surfactantes du poumon insérées dans les membranes des systèmes reconstitués (Shiffer,
Biochemistry 1993, 32, 590-597).
Biochemistry 1993, 32, 590-597).
Une toxine bactérienne comme la colicine A s'associe puis s'insère dans une membrane anionique. De plus, un potentiel de membrane permet une disposition correcte de la protéine qui constitue alors un canal transmembranaire actif (Massotte, Biochemistry (1993, 32, 13787-13794) (Stroud, Curr. Opinion Struct. Biol. 1995, 5, 511-520), (Géli, Subcellular
Biochem. 1994, 22, 21-69).
Biochem. 1994, 22, 21-69).
En prenant l'exemple du transporteur membranaire d'ADP/ATP, il est montré que le potentiel de surface généré par les lipides anioniques est un paramètre prédominant pour moduler les paramètres d'affinité de protéines membranaires ct pour restaurer leur activité biologique dans un système reconstitué (Kramer. Methods in Enzymology, 1989, 171, 387-384).
L'antibiotique Adriamycine pénètre dans la bicouche lipidique grâce aux interactions entre les têtes polaires des phospholipides (groupement phosphate) et le groupement aminoglycosylé du peptide.
Cette pénétration membranaire dépend fortement du packing moléculaire (Dupou (Eur. J. Biochem. 1989, 181, 695-702).
Il a été montré que les phospholipides anioniques déterminent, dans divers cas, les interactions de protéines avec les membranes. Ces interactions aboutissent à des insertions protéiques ou des translocations.
Les systèmes reconstitués de type protéolîposomes dépendent généralement de la présence de phospholipides spécifiques au sein de la membrane (apport de charges au niveau des têtes polaires, cohésion et compaction moléculaires).
Dans le cas des homéo-biovecteurs cationiques, on peut associer au noyau et/ou au feuillet amphiphile des drogues ou des prodrogues anioniques tels des acides nucléiques (DNA, RNA, oligonucléotides), des lipides, des protéines.
En effet les liposomes cationiques ont été utilisés pour ce type de molécule, notamment en thérapie génique. En particulier, ils permettent une délivrance cytoplasmique de l'ADN.
Toutefois ces travaux montrent un certain nombre de limitations.
L'expression du gène est le plus souvent faible et transitoire. En outre, le complexe ADN/liposomes est trop facilement dégradé et éliminé par l'organisme. Dans certains cas, la co-injection d'activateurs du promoteur du gène est nécessaire afin d'obtenir la production de la protéine. Enfin, en ce qui concerne les protéoliposomes fusogènes, les résultats sont peu reproductibles.
Dans le cadre de la présente invention, il a été montré que le type d'association présente dans les homéo-bioecteurs rigidifie et stabilise une membrane phospholipidique. Ce type de stabilisation pourrait avoir un role important in vivo. l.n effet, les membranes cationiqucs interagissent portement avec leur environnement pour favoriser ( I ) la bioadhésion sur la surface cellulaire et (2) la délivrance ! toplamiquc avec le principe actif associé.
Les homéo-biovecteurs cationiques sont des structures supramoléculaires qui se différencient des structures liposomales, protéoliposomales fusogènes, des vecteurs viraux ou des complexes solubles de DNA (Legendre-Skoza, Proc. Natl. Sci. USA, 1993, 90, 893-397), (Felgner-Rhodes, Nature, 1991, 349, 351-382) : ces homéo-biovecteurs permettront d'associer les molécules (oligonucléotides, ADN, ARN) aussi bien en surface (au niveau membranaire) qu'en profondeur (au niveau du noyau polysaccharidique cationique) où ils seront stabilisés et protégés des dégradations enzymatiques.
La présence de protéines fusogènes à la surface des homéobiovecteurs cationiques peut être envisagée : elles agiront en synergie avec les effets de charge pour délivrer les molécules actives dans le c > toplasme des cellules.
Compte tenu de résultats de non-immunogénicité et de biodistribution obtenus in vivo avec les biovecteurs cationiques, le temps de résidence intra-tissulaire des homéo-biovecteurs est suffisamment long pour envisager localement une délivrance de matériel génétique exogène dans le cadre d'une thérapie génique (exemple : pallier les déficits hormonaux en injectant dans le tissu déficitaire des complexes 'homéobiovecteurs/DNA producteur de la protéine hormonale").
L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient un vecteur particulaire comme décrit ci-dessus.
Selon un autre aspect, I'invention a pour objet une composition cosmétique, caractérisée en ce qu'elle contient un v secteur particulaire comme décrit précédemment et des excipients cosmétologiquement acceptables.
Les homéo-biovecteurs ont également des applications comme additif alimentaire, ou dans le domaine du traitement des eaux.
I,'invcntion sera illustré par les exemples qui suivent.
Dans ces exemples On se référera aux figures suivantes.
Figure 1 : Séparation des noyaux polysaccharidiques (NPS), des
liposomes ct des biovecteurs sur des gradients de densité
saccharose (0%-35%). (A) : séparation des Nl > S marqués à la
fluorescéine (O) et des liposomes marqués au DPH (0). (B)
séparation des biovecteurs dont le NPS est marqué à la
fluorescéine () et à la membrane au DPII (+).
liposomes ct des biovecteurs sur des gradients de densité
saccharose (0%-35%). (A) : séparation des Nl > S marqués à la
fluorescéine (O) et des liposomes marqués au DPH (0). (B)
séparation des biovecteurs dont le NPS est marqué à la
fluorescéine () et à la membrane au DPII (+).
Figure 2 : Transition de phase des lipides organisés sous forme de
liposomes ou d'homéo-biovecteurs. Profils obtenus en
mesurant la polarisation de fluorescence p du DPH en
fonction de la température pour 1 ml d'échantillon
conditionné en eau.
liposomes ou d'homéo-biovecteurs. Profils obtenus en
mesurant la polarisation de fluorescence p du DPH en
fonction de la température pour 1 ml d'échantillon
conditionné en eau.
(A) : liposomes DPPC et homéo-biovecteurs neutres. (B)
liposomes DPPC/DPPG et homéo-biovecteurs anioniques. (C)
liposomes DPPC/Stéarylamine et homéo-biovecteurs
cationiques.
liposomes DPPC/DPPG et homéo-biovecteurs anioniques. (C)
liposomes DPPC/Stéarylamine et homéo-biovecteurs
cationiques.
Figure 3 : Influencc des ions cobalts sur la fluorescence de la sonde
NBD-PC insérée dans la membrane liposomale (0) et dans la
membrane des biovecteurs (#). La concentration lipidique est
de 27,2 M et la température est de 20 C.
NBD-PC insérée dans la membrane liposomale (0) et dans la
membrane des biovecteurs (#). La concentration lipidique est
de 27,2 M et la température est de 20 C.
Exemple 1: Préparation des homéo-biovecteurs anioniques
La préparation des homéo-biovecteurs anioniques se déroule en deux étapes principales: (1) la synthèse des noyaux polysaccharidiques anioniques, (2) I'association de lipides aux NPS anioniques.
La préparation des homéo-biovecteurs anioniques se déroule en deux étapes principales: (1) la synthèse des noyaux polysaccharidiques anioniques, (2) I'association de lipides aux NPS anioniques.
1. Synthèse des Nl > S anioniques
500 g de maltodextrine Glucidex (ROQUETTE, Lestrem, France) sont introduits dans un réacteur dc 10 litres (TRIMIX) avec 2 litres d'eau déminéralisée. Après solubilisation à 40 C, 5()0 ml d'hydroxyde de sodium (NaOH) à 101s1 sont ajoutés sous agitation mécanique.
500 g de maltodextrine Glucidex (ROQUETTE, Lestrem, France) sont introduits dans un réacteur dc 10 litres (TRIMIX) avec 2 litres d'eau déminéralisée. Après solubilisation à 40 C, 5()0 ml d'hydroxyde de sodium (NaOH) à 101s1 sont ajoutés sous agitation mécanique.
Quand la température de la solution est stabilisée à 4 C, 1700 ml de
NaOH 10M et 283,3 ml d'oxychlorure de phosphore (POCl3) sont introduits sous débits contrôlés. La réaction de réticulation se déroule sous agitation mécanique durant 20 heures. En fin d'addition des réactifs, le mélange réactionnel est agité pendant 15 minutes. Un volume de 5 litres d'eau déminéralisée est alors ajouté. Le pH est ramené à 7,0 par neutralisation avec de l'acide acétique glacial.
NaOH 10M et 283,3 ml d'oxychlorure de phosphore (POCl3) sont introduits sous débits contrôlés. La réaction de réticulation se déroule sous agitation mécanique durant 20 heures. En fin d'addition des réactifs, le mélange réactionnel est agité pendant 15 minutes. Un volume de 5 litres d'eau déminéralisée est alors ajouté. Le pH est ramené à 7,0 par neutralisation avec de l'acide acétique glacial.
L'hydrogel obtenu est broyé par l'intermédiaire d'un homogénéisateur à haute pression (RANNIE Lab). La pression exercée est de 500 bars A l'issue de cette étape, les matrices dispersées ont un diamètre moyen de 60 nm.
La purification s'opère par des étapes successives de (1) micro filtration 0,45 m pour éliminer les particules de taille trop importante, (2) diafiltration à volume constant pour éliminer les petites molécules (sels, fragments polysaccharidiques).
Enfin, les NPS anioniques sont concentrés, récupérés, dans des flacons stériles et conservés à -20 C.
2. Synthèse des homéo-biovecteurs anioniques
Les noyaux polysaccharidiques anioniques décongelés sont dilués avec de l'eau osmosée dans un réceptacle en verre dans la proportion de
Img/lml (exemple : 250 mg NPS / 250 ml). Ia dispersion est soumise à agitation magnétique (5-10 minutes) puis homogénéisée (RANNIE htinilab) à 400 bars durant 3 minutes. La dispersion de NPS est placée dans un bainmarie à 80 C.
Les noyaux polysaccharidiques anioniques décongelés sont dilués avec de l'eau osmosée dans un réceptacle en verre dans la proportion de
Img/lml (exemple : 250 mg NPS / 250 ml). Ia dispersion est soumise à agitation magnétique (5-10 minutes) puis homogénéisée (RANNIE htinilab) à 400 bars durant 3 minutes. La dispersion de NPS est placée dans un bainmarie à 80 C.
Les lipides (exemple : mélange de DPPC avec DPPG), sous forme de poudre, sont pesés de telle sorte que la masse totale représente, par exemple, 30% (p/p) dc la masse des NPS (75 mg de lipides pour 250 mg de N15). Les lipides constitutirs de la membrane sont mélangés et solubilisés avec 2 ml d'éthanol 95% (v/v). Si les lipides chargés représentent, par exemple, 5% (p/p) des lipides totaux,...
L'homogénéisateur, est amené à une température de 60 C minimum par circulation d'eau en circuit fermé. Concomitamment, les NPS dispersés à 80 C sont soumis à agitation magnétique et la solution éthanolique de lipides est injectée dans la dispersion de NPS.
La dispersion "NPS/lipides" à 80 C est alors introduite dans l'homogénéisateur et est homogénéisée à 450 bars pendant 25 minutes en circuit fermé à 60 C minimum. A l'issue de cette étape, la préparation est introduite dans un ballon en verre puis soumise à basse pression à 60 C pour éliminer l'éthanol resté en solution.
Les homéo-biovecteurs anioniques ainsi obtenus sont alors entreposés dans des conditions stériles après filtration sur 0,2 cim.
Exemple 2: Préparation des homéo-biovecteurs cationiques
La préparation des homéo-biovecteurs cationiques se déroule en deux étapes principales : (1) la synthèse des noyaux polysaccharidiques (NPS) cationiques, (2) I'association de lipides cationiques aux NPS cationiques.
La préparation des homéo-biovecteurs cationiques se déroule en deux étapes principales : (1) la synthèse des noyaux polysaccharidiques (NPS) cationiques, (2) I'association de lipides cationiques aux NPS cationiques.
1. Synthèse des NPS cationiques
500 g de maltodextrines Glucides (ROQUETTE) sont solubilisés avec 0,880 litres d'eau dans un réacteur thermostaté à 20 C sous agitation. Puis, on introduit environ 7 g de NaBI-4 et on laisse 1 heure sous agitation.
500 g de maltodextrines Glucides (ROQUETTE) sont solubilisés avec 0,880 litres d'eau dans un réacteur thermostaté à 20 C sous agitation. Puis, on introduit environ 7 g de NaBI-4 et on laisse 1 heure sous agitation.
200 ml de NaOH 10 l sont rajoutés puis 30,25 ml d'épichlorydrine (Fluka). Après 12 heures de réaction, 382,3 g de chlorure dc glycidyltriméthylammonium (Fluka) sont introduits et Ic mélange est maintenu sous agitation durant 10 heures).
Le gel est dilué avec X litres d'eau déminéralisée et neutralisé à l'acide acétique glacial.
I.'hxdrogel obtenu est broyé par l'intermédiaire d'un homogénéisateur à haute pression (RANN@@ lab). la pression exercée est de -100 bars. A l'issue de cette étapes les matrices dispersées ont un diamètre moyen dc 60 nm.
La purification s'opère par des étapes successives de (1) microfiltration 0,45 m pour éliminer les particules de taille trop importante, (2) diafiltration à volume constant pour éliminer les petites molécules (seuls, fragments polysaccharidiques).
Enfin, les NPS cationiques sont concentrés, récupérés dans des flacons stériles et conservés à -20 C.
2. Synthèse des homéo-biovecteurs cationiques
Les noyaux polysaccharidiques cationiques décongelés sont dilués avec de l'eau osmosée dans un réceptacle en verre dans la proportion de 1 mg de NPS/1 ml d'eau. La dispersion est placée dans un premier temps sous agition magnétique (5-10 minutes) puis homogénéisée (RANNIE Minilab) à 400 bars durant 3 minutes. La dispsersion de NPS est placée dans un bainmarie à 80 C.
Les noyaux polysaccharidiques cationiques décongelés sont dilués avec de l'eau osmosée dans un réceptacle en verre dans la proportion de 1 mg de NPS/1 ml d'eau. La dispersion est placée dans un premier temps sous agition magnétique (5-10 minutes) puis homogénéisée (RANNIE Minilab) à 400 bars durant 3 minutes. La dispsersion de NPS est placée dans un bainmarie à 80 C.
Les lipides (exemple : mélange de DPPC avec stéarylamine), sous forme de poudre, sont pesés de telle sorte que la masse totale représente, par exemple 30% (p/p) de la masse des NPS (75 mg de lipides pour 250 mg de NPS). Les lipides constitutifs de la membrane sont mélangés et solubilisés avec 2 ml d'éthanol 95% (v/v). Si les lipides chargés représentent, par exemple, 5% (p/p) des lipides totaux.
L'homogénéisateur, est amené à une température de 60 C minimum par circulation d'eau en circuit fermé.
Concomitamment, les NPS dispersés à 80 C sont soumis à agitation magnétique et la solution éthanolique de lipide est injectée dans la dispersion de NPS.
L'eau de chauffage de circuit de l'homogénéisateur est évacuée et remplacée par la dispersion "NPS/lipides" à 80" C. Cette nouvelle dispersion est homogénéisée à 450 bars pendant 25 minutes en circuit fermé à 60 C minimum. A l'issue de cette étape, la préparation est introduite dans U17 ballon en verrc puis soumise à basse pression à 60 C pour éliminer l'éthanol resté en solution.
Les homéo-biovecteurs cationiques ainsi obtenus sont alors entreposés dans des conditions stériles après filtration sur 0,2 llm.
Exemple 3 : Préparation des homéo-biovecteurs neutres
La préparation des homéo-biovecteurs neutres se déroule en deux étapes principales : (1) la synthèse des noyaux polysaccharidiques (NPS) neutres, (2) I'association dc lipides zwittérioniques aux Nl > S neutres.
La préparation des homéo-biovecteurs neutres se déroule en deux étapes principales : (1) la synthèse des noyaux polysaccharidiques (NPS) neutres, (2) I'association dc lipides zwittérioniques aux Nl > S neutres.
1. Synthèse des NPS neutres
500 g de maltodextrines Glucidex (ROQUETTE) sont solubilisés avec 0,880 litres d'eau dans un réacteur thermostaté à 20 C sous agitation.
500 g de maltodextrines Glucidex (ROQUETTE) sont solubilisés avec 0,880 litres d'eau dans un réacteur thermostaté à 20 C sous agitation.
Introduire environ 7 g de NaBîl4 et laisser 1 heure sous agitation. 220 ml de NaOll 10 M sont rajoutés puis 30,25 ml d'épichlorydrine (Fluka). Après 12 heures de réaction, diluer le gel avec 8 litres d'eau déminéralisée et neutraliser par ajout d'acide acétique glacial.
L'hydrogel obtenu est broyé par l'intermédiaire d'un homogénéisateur à haute pression (RANNIE lab). la pression exercée est de 400 bars. A l'issue de cette étape, les matrices dispersées ont un diamètre moyen de 60 nm.
La purification s'opère par des étapes successives de (1) microfiltration 0,45 m pour éliminer les particules de taille trop importante, (2) diafiltration à volume constant pour éliminer les petites molécules (seuls, fragments polysaccharidiques).
Enfin, les NPS sont concentrés, récupérés dans des flacons stériles et conservés à -20 C.
2. Synthèse des homéo-biovecteurs neutres
Les noyaux polysaccharidiques neutres décongelés sont dilués avec de l'eau osmosée dans un réceptacle en vcrrc (250 mg NPS / 250 ml). La dispersion est placée dans un premier temps sous agitation magnétique (510 minutes) puis homogénéisée (RANNIE blinilab) à 400 bars durant 3 minutes. La dispsersion dc NPS est placée dans un bain-marie à 80 C.
Les noyaux polysaccharidiques neutres décongelés sont dilués avec de l'eau osmosée dans un réceptacle en vcrrc (250 mg NPS / 250 ml). La dispersion est placée dans un premier temps sous agitation magnétique (510 minutes) puis homogénéisée (RANNIE blinilab) à 400 bars durant 3 minutes. La dispsersion dc NPS est placée dans un bain-marie à 80 C.
Les lipides (exemple : DPPC), sous forme de poudre, sont pesés de telle sorte que la masse totale représente, par exemple, 30% (p/p) de la masse des NPS. Les lipides constitutifs de la membrane sont solubilisés avec 2 ml d'éthanol 95% (p/p).
L'homogénéisateur est amené à une température de 60 C minimum par circulation d'eau en circuit fermé.
Les NPS dispersés à 80 C sont soumis à agitation magnétique et la solution éthanolique de lipide est injectée dans la dispersion de NPS.
L'eau de chauffage dc circuit de l > homogénéisateur est remplacée par la dispersion "NPS/lipides" à 80 C. Cette nouvelle dispersion est homogénéisée à 450 bars pendant 25 minutes en circuit fermé à 60 C minimum. A l'issue de cette étape, la préparation est introduite dans un ballon en verre puis soumise à basse pression à 60 C pour éliminer l'éthanol resté en solution.
Les homéo-biovecteurs neutres ainsi obtenus sont alors entreposés dans des conditions stériles après filtration sur 0,2 m.
Exemple 4: Caractérisation des vecteurs particulaircs
Les homéo-biovecteurs ont été caractérisés par
- I'association des noyaux polysaccharidiques (NPS) avec les molécules de lipide
- l'organisation des lipides (associés aux NPS) entre eux
- la couche lipidique entourant les NPS.
Les homéo-biovecteurs ont été caractérisés par
- I'association des noyaux polysaccharidiques (NPS) avec les molécules de lipide
- l'organisation des lipides (associés aux NPS) entre eux
- la couche lipidique entourant les NPS.
Cet édifice supramoléculaire possède des propriétés remarquables de stabilité dans le temps.
1. Matériel et Méthodes
Les vecteurs particulaires anioniques et cationiques sont préparés selon la technique décrite dans les exemples 1 et 2.
Les vecteurs particulaires anioniques et cationiques sont préparés selon la technique décrite dans les exemples 1 et 2.
Les liposomes ont été préparés par injection d'une solution éthanolique de lipides dans de l'eau comme décrit dans Batzri et al (Biochem. Biophys. Acta, 1973, 298 > 1015-1019) et Kremer ct al (Biochemistry, 1977, 16, 3932-3935). 'rous les échantillons préparés sont stockés dans des tubes stériles après filtration stérilisante sur 0,2 llm.
1.1. Détcrmination de la taille des nanoparticules
Le diamètre moyen des noyaux polysaccharidiques, des liposomes et des vecteurs particulaires est déterminé par un analyseur de nanoparticules Coulter N4MD (Coultronics, margency, France). Les mesures ont été effectuées en triple, à une température de 25 C, après dilution de l'échantillon dans du PBS 50 mM.
Le diamètre moyen des noyaux polysaccharidiques, des liposomes et des vecteurs particulaires est déterminé par un analyseur de nanoparticules Coulter N4MD (Coultronics, margency, France). Les mesures ont été effectuées en triple, à une température de 25 C, après dilution de l'échantillon dans du PBS 50 mM.
1.2. Marquage fluorescent des biovectcurs
Le marquage du noyau polysaccharidique par la fluorescéine a été effectué par addition de 10 mg d'une solution aqueuse de DTAF (5([4,6 dichlorotriazine-2#L]amino)fluorescence 2 mg/ml) à 100 mg de particules polysaccharidiques à pH 10, sous agitation magnétique. Après 2 heures à température ambiante, le mélange réactionnel est lavé par ultrafiltration, d'abord avec NaCI 1 M puis de l'eau déminéralisé jusqu'à ce qu'on ne puisse plus détecter de fluorescéine dans l'ultrafiltrat. Les noyaux polysaccharidiques marqués à la fluorescéine (1 mg/ml) sont ensuite stockés dans des tubes stériles après filtration stérilisante sur 0,2 iim.
Le marquage du noyau polysaccharidique par la fluorescéine a été effectué par addition de 10 mg d'une solution aqueuse de DTAF (5([4,6 dichlorotriazine-2#L]amino)fluorescence 2 mg/ml) à 100 mg de particules polysaccharidiques à pH 10, sous agitation magnétique. Après 2 heures à température ambiante, le mélange réactionnel est lavé par ultrafiltration, d'abord avec NaCI 1 M puis de l'eau déminéralisé jusqu'à ce qu'on ne puisse plus détecter de fluorescéine dans l'ultrafiltrat. Les noyaux polysaccharidiques marqués à la fluorescéine (1 mg/ml) sont ensuite stockés dans des tubes stériles après filtration stérilisante sur 0,2 iim.
Le marquage des couches de phospholipides avec DPH (1,6-diphényl1,3,5-hexatriène) est effectué en ajoutant la sonde (10-3 M dans du tétrahydrofurane) à des suspensions aqueuses d'homéo biovecteurs ou de liposomes. La température est maintenue à 60 C pendant 30 minutes. Le rapport final en DPH aux phospholipides est de 0,5%.
Pour le double marquage des homéo-biovecteurs par la fluorescéine et le DPH, des homéo-biovecteurs ont d'abord été préparés avec des noyaux polysaccharidiques marqués à la fluorescéine puis la couche lipidique externe a été marquée au DPH comme décrit ci-dessus.
Toutes les préparations fluorescentes ont été conservées dans I 'obscurité.
1.3. Spectroscopie de fluorescence
L'excitation de fluorescence et le spectre d'émission ont été enregistrés avec un spectrofluorimètre SLM-Aminco, Modèlc 500. Dans ces expériences, de même que dans l'expérience de polarisation dc fluorescence décrite plus bas, I'absorbance des suspensions d'homéobiovecteurs et de liposome n'était jamais supérieure à 0,1. Pour le spectre d'émission de fluorescence, la longeur d'onde était de 360 nm pour DPH et 490 nm pour la fluorescéine. Pour le spectre d'excitation, la longueur d'onde d'émission était dc 426 nm pour DPH et 522 nm pour la fluorescéine.
L'excitation de fluorescence et le spectre d'émission ont été enregistrés avec un spectrofluorimètre SLM-Aminco, Modèlc 500. Dans ces expériences, de même que dans l'expérience de polarisation dc fluorescence décrite plus bas, I'absorbance des suspensions d'homéobiovecteurs et de liposome n'était jamais supérieure à 0,1. Pour le spectre d'émission de fluorescence, la longeur d'onde était de 360 nm pour DPH et 490 nm pour la fluorescéine. Pour le spectre d'excitation, la longueur d'onde d'émission était dc 426 nm pour DPH et 522 nm pour la fluorescéine.
1.4. Polarisation de fluorescence
Les expériences ont été effectuées sur un appareil automatique formaté relié à un microordinateur.
Les expériences ont été effectuées sur un appareil automatique formaté relié à un microordinateur.
1.5. Expériences d'extinction de fluorescence
Les homéo-biovecteurs ou les liposomes ont été préparés avec du
DPPC (1 (1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine) additionné de NBD
PC (1 -acyl-2- [1 2-[(7-nîtro-2- 1 > 3-benzoxadiazole-4-yl)amino]dodécanoyle]- sn-glycéro-3-phosphocholine, (2 mol %), et dispersés dans NaCI 1,5 M. Des aliquots de suspension d'homéo-biovecteur ou de liposome ont été mis dans une cuve en quartz (concentration phospholipide : 27,2 FM) et la fluorescence a été mesurée pour donner la valeur F0 Puis un volume donné de solution d'extinction CoCI2 (0,3 NI dans l'eau) est ajouté afin d'obtenir la concentration souhaitée. Les réactifs sont mélangés pendant 15 secondes et la fluorescence est mesurée immédiatement pour donner la valeur F1. L'efficacité d'extinction est calculée comme (l-FI/Fo)x100. Les longueurs d'onde d'excitation et d'émission étaient respectivement de 474 nm et de 535 nm, et la température de 20 C.
Les homéo-biovecteurs ou les liposomes ont été préparés avec du
DPPC (1 (1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine) additionné de NBD
PC (1 -acyl-2- [1 2-[(7-nîtro-2- 1 > 3-benzoxadiazole-4-yl)amino]dodécanoyle]- sn-glycéro-3-phosphocholine, (2 mol %), et dispersés dans NaCI 1,5 M. Des aliquots de suspension d'homéo-biovecteur ou de liposome ont été mis dans une cuve en quartz (concentration phospholipide : 27,2 FM) et la fluorescence a été mesurée pour donner la valeur F0 Puis un volume donné de solution d'extinction CoCI2 (0,3 NI dans l'eau) est ajouté afin d'obtenir la concentration souhaitée. Les réactifs sont mélangés pendant 15 secondes et la fluorescence est mesurée immédiatement pour donner la valeur F1. L'efficacité d'extinction est calculée comme (l-FI/Fo)x100. Les longueurs d'onde d'excitation et d'émission étaient respectivement de 474 nm et de 535 nm, et la température de 20 C.
1.6. Séparation isopycnique sur gradients dc saccharose
Les gradients de saccharose ont été préparés en faisant fondre 9 ml de solution de saccharose à 2096 (p/p) à température ambiante. 1 ml de l'échantillon est déposé en haut du tube et on effectue une centrifugation 4 heures à 250 000 g, 8 C. Après centrifugation des fractions de 0,5 ml sont récoltées du haut au fond du tube avec une pipette et analysées en spectroscopie de fluorescence.
Les gradients de saccharose ont été préparés en faisant fondre 9 ml de solution de saccharose à 2096 (p/p) à température ambiante. 1 ml de l'échantillon est déposé en haut du tube et on effectue une centrifugation 4 heures à 250 000 g, 8 C. Après centrifugation des fractions de 0,5 ml sont récoltées du haut au fond du tube avec une pipette et analysées en spectroscopie de fluorescence.
2. Résultats 2.1. Association des noyaux polysaccharidiqucs (NPS) avec les
phospholipides
Comme le montre la figure 1A, les NPS dépourvus de lipide ( lmg/ml) sédimentent sur une large zonc du gradient de densité (de 2 à 20%, saccharose, avec une apogée à 7%) indiquant une hétérogénéité de densité de ces NPS. Les liposomes (0,2mg/ml) sont plus denses et plus homogènes que les NPS (position isopycnique étroite entre 18% et 20% saccharose).
phospholipides
Comme le montre la figure 1A, les NPS dépourvus de lipide ( lmg/ml) sédimentent sur une large zonc du gradient de densité (de 2 à 20%, saccharose, avec une apogée à 7%) indiquant une hétérogénéité de densité de ces NPS. Les liposomes (0,2mg/ml) sont plus denses et plus homogènes que les NPS (position isopycnique étroite entre 18% et 20% saccharose).
Quant aux biovecteurs (figure 1B), marqués à la fois avec la fluorescéine au niveau du Nl)S et avec du DPll au niveau de la membrane, ils se positionnent entre 14 et 19% saccharose (apogée à 17%). Les deux fluorophores se retrouvant dans les mêmes fractions, l'association des NPS avec les lipides est ainsi mise en évidence. Elle entraîne une augmentation de la densité et de l'homogénéité des NI'S constitutifs.
Des contrôles montrent que la synthèse des Biovecteuns aboutit à un produit pur. En effet, la présence de NPS libres et de liposomes libres n'est pas détectée dans une préparation de biovecteurs. De plus, le mode opératoire appliqué pour synthétiser les biovecteurs permet de faire varier le rapport pondéral lipides/NPS de 20 à l()0% sans provoquer la formation de liposomes.
2.2. Détermination de la taille des homéo-biovecteurs
Les mesures réalisées anec les NPS témoins, les liposomes témoins et les homéo-biovecteuns sont rapportées dans le tableau 1.
Les mesures réalisées anec les NPS témoins, les liposomes témoins et les homéo-biovecteuns sont rapportées dans le tableau 1.
Il apparaît que la taille des homéo-biovecteurs neutres, cationiques et an ioniques dépend de la taille de leur Nl'S constitutif (exemple : pour un
NPS cationique d'environ 80 nm, l'homéo-biovecteur cationique résultant mesure environ 80 nm de diamètre). Par contre, la taille des liposomes témoins est inférieure. Les phospholipides des liposomes s'organisent entre eux de manière à ce que la structure soit thermodynamiquement stable. Le noyau de NPS des homéo-biovecteurs favorise une meilleure stabilité du système lipidique.
NPS cationique d'environ 80 nm, l'homéo-biovecteur cationique résultant mesure environ 80 nm de diamètre). Par contre, la taille des liposomes témoins est inférieure. Les phospholipides des liposomes s'organisent entre eux de manière à ce que la structure soit thermodynamiquement stable. Le noyau de NPS des homéo-biovecteurs favorise une meilleure stabilité du système lipidique.
Tableau 1 : Mesurc dc la taille des nanoparticules (noyaux polysaccharidiques (NPS), liposomes ct homéo-biovecteurs) par dispersion dc lumière LASER.
[noyau] = 1 mg/ml; [lipides] = 0,2 mg/ml le rapport pondérai des mélanges lipidiques DPPC/DPPG ou DPPC/SA est de 95/5. Mesures réalisées en PBS 50 mM.
Echantillon Diamètre moyen + écart type (nm)
NPS neutres 42,3#26
Liposomes zwittérioniques (DPPC) 394 + 13
Homéo-biovecteurs neutres 32,9#09
NPS cationiques 74,7#29
Liposomes cationiques (DPPC/SA) 22,3 + 11
Homéo-biovecteurs cationiques 78,5#42 NPS anioniques 3A,G + liposomes anioniques (DPPC/DPPG) 18,5#09
Homéo-biovecteurs anioniques 45,4#26 (DPPC = dipamitoyl-phosphatidylcholine ; DPPG = dipamitoylphosphatidylglycérol ; SA = stéarylamine)
Ces mesures de taille font apparaître une seule population homogène, en corrélation avec les études sur gradient de densité montrant le haut degré de pureté des préparations d'homéo-biovccteurs
Les lipides seuls donnent des suspensions liposomales relativement monodispersées avec une taille moyenne dépendant de la composition de 40 nm et de 20 nm pour le mélange DPPC et DPPC/DPPG respectivement.
NPS neutres 42,3#26
Liposomes zwittérioniques (DPPC) 394 + 13
Homéo-biovecteurs neutres 32,9#09
NPS cationiques 74,7#29
Liposomes cationiques (DPPC/SA) 22,3 + 11
Homéo-biovecteurs cationiques 78,5#42 NPS anioniques 3A,G + liposomes anioniques (DPPC/DPPG) 18,5#09
Homéo-biovecteurs anioniques 45,4#26 (DPPC = dipamitoyl-phosphatidylcholine ; DPPG = dipamitoylphosphatidylglycérol ; SA = stéarylamine)
Ces mesures de taille font apparaître une seule population homogène, en corrélation avec les études sur gradient de densité montrant le haut degré de pureté des préparations d'homéo-biovccteurs
Les lipides seuls donnent des suspensions liposomales relativement monodispersées avec une taille moyenne dépendant de la composition de 40 nm et de 20 nm pour le mélange DPPC et DPPC/DPPG respectivement.
2.3. Influence du noyau polysaccharidiquc sur l'organisation
lipidique
Ayant démontré que les lipides sont associés aux NPS, il s'agit de montrer que ces molécules amphiphiles sont organisées entre elles pour former la membrane constitutive des homéo-biovecteurs. Le comportement de phase des lipides permet d'étudier cette organisation.
lipidique
Ayant démontré que les lipides sont associés aux NPS, il s'agit de montrer que ces molécules amphiphiles sont organisées entre elles pour former la membrane constitutive des homéo-biovecteurs. Le comportement de phase des lipides permet d'étudier cette organisation.
Le comportement de phase de la couronne lipidique organisée autour des NPS est étudié en visualisant la transition de phase gel-liquide des lipides en fonction de la température par la mesure de la dépolarisation de fluorescence de la sonde DPH insérée au sein de la zone hydrophobe membranaire. Les profils obtenus (figure 2) pour les homéo-biovecteurs et les liposomes témoins de même composition lipidique permettent de relever la température de transition de phase gel-liquide (Tm) (tableau 2). l.es résultats obtenus permettent de connaître l'influence du NPS et de la composition saline de la phase aqueuse sur l'organisation lipidique.
Les transitions de phase gel-liquide des lipides organisés sous forme d'homéo-biovecteurs sont très bien définies. Cette observation s'explique par un fort degré de coopérativité intermoléculaire et donc par un degré d'organisation de la membrane des homéo-biovecteurs tout à fait comparable aux membranes liposomales.
Les homéo-biovecteurs neutres et les liposomes témoins sont analysés sur la figure 2A, qui montre un profil caractéristique de la transition de phase du DPlC organisée sous forme de liposome permettant de relever une v saleur 'm dc 4()' C. l.es homéo-biovecteurs neutres possèdent une membrane dont la transition de phase est aussi nette que celle des liposomes mais présentant un décalage @ ers les plus hautes températures.
Les homéo-biovecteurs anioniques (figurc 2B) ont une transition de phase très marquée et décalée vers des températures plus importantes par rapport aux lîposomes témoins.
Les homéo-biovecteurs cationiques (figure 2C) offrent des caractéristiques similaires : L'effet du NPS cationique sur la membrane cationique associée est tel que la transition de phase des lipides est décaléc vers les températures supérieures par rapport aux liposomes témoins.
Les homéo-biovecteurs montrent donc une transition de phase supérieure à celle des liposomes témoins. A titre de comparaison, les biovecteurs light constitués d'un NPS cationique et d'une membrane anionique ont une transition de phase inférieure à celle des liposomes témoins (écart de température de -1 C). Dans ce cas, le noyau NPS a un effet sur sa membrane qui est l'inverse de celui du homéo-biovecteur.
Tableau 2 Températurcs dc transition dc phase gel-liquide (Tm) des membranes lipidiques organisées sous la forme de liposomes ou d'homéo-biovecteurs.
[noyau] = 1 mg/ml; [lipides] = 0,2 mg/ml; le rapport pondéral des mélanges lipidiques DPPC/DPPG ou DPPC/SA est de 95/5. Mesures réalisées avec 1 ml de nanoparticules dispersées dans l'eau ou dans le PBS.
Tm ( C)
Echantillons Eau PBS
Liposomes zwittérioniques DPPC 40,0 + 0,2 39,2 + 0,3
Homéo-biovecteurs neutres 40,8 + 0,2 39,8 + 0,1
Liposomes cationiques DPPC/SA 43,4 + 0,1 42,8 + 0,1 lloméo-biovecteurs cationiques 44,9#0,2 43,4 + 0 1
Liposomes anioniques DPPC/DPPG 41,4#0,1 38,3#0,2 homéo-biovecteurs anioniques 44,8#0,1 39,1#0,2 (DPPC = dipamitoyl-phosphatidylcholine , DPPG = dipamitoylphosphatidylglycérol ; SA = stéarylamine)
Le relevé des températures Tm (tableau 2) de chaque système permet de caractériser le décalage de transition de phase.
Echantillons Eau PBS
Liposomes zwittérioniques DPPC 40,0 + 0,2 39,2 + 0,3
Homéo-biovecteurs neutres 40,8 + 0,2 39,8 + 0,1
Liposomes cationiques DPPC/SA 43,4 + 0,1 42,8 + 0,1 lloméo-biovecteurs cationiques 44,9#0,2 43,4 + 0 1
Liposomes anioniques DPPC/DPPG 41,4#0,1 38,3#0,2 homéo-biovecteurs anioniques 44,8#0,1 39,1#0,2 (DPPC = dipamitoyl-phosphatidylcholine , DPPG = dipamitoylphosphatidylglycérol ; SA = stéarylamine)
Le relevé des températures Tm (tableau 2) de chaque système permet de caractériser le décalage de transition de phase.
Ces températures Tm, pour des échantillons dispersés dans l'eau ou en présence d'une force ionique (PBS 50 mltl), montrent que les membranes associées aux NI > S de charge ionique semblable ont une organisation lipidique telle que l'entassement moléculaire est plus important (Tm des homéo-biovecteurs supérieure à la température des liposomes témoins), quelque soit le type d'homéo-biovecteur.
L'addition de sels dans les dispersions d'homéo-biovecteurs a pour effet de diminuer l'effet du NPS sur l'organisation des lipides entre eux.
Cette observation permet de conclure que le Nl > S a une influence sur l'entassement moléculaire des lipides par l'intermédiaire d'interactions électrostatiques et de type hydrogène avec les têtes polaires des phospholipides.
Ainsi quelque soit le type d'homéo-biovecteur envisagé, cette structure supramoléculaire favorise une meilleure organisation membranaire que celle des liposomes entraînant une augmentation du packing moléculaire des lipides entre eux.
2.4. Nombre dc bicouchcs lipidiques cntourant Ic noyau
polysaccharidique
Les lipides associés au NPS sont organisés entre eux pour former une membrane. II s'agit de caractériser la structure de cette membrane.
polysaccharidique
Les lipides associés au NPS sont organisés entre eux pour former une membrane. II s'agit de caractériser la structure de cette membrane.
Des expériences d'extinction de fluorescence ont été menées en utilisant une sonde NBD-PC, pour laquelle on a montré que le groupe NBD est localisé dans la région glycérophosphate dc la bicouche lipidique. Les ions cobalts ont été utilisés comme extincteurs de fluorescence. Les biovecteurs ont été préparés cn présence de NaCI 1,) hI, pour éviter des modifications trop importantes de concentration en ions après addition de l'extincteur dans la phase aqueuse. Les courbes de fluorescence obtenues respectivement pour les Iipos(mes DPPC et les biovecteurs anioniques
DPPC sont montrées sur la figure 3. Les modifications de la courbe sont détectées aux alentours de 50F55% d'extinction. Le fait que les sondes moléculaires localisées dans la couche lipidique externe soient les premières affectées, suggère que les homéo-biovecteurs aussi bien que les liposomes DPPC sont composés d'une bicouche lipidique unique. En conséquence, pour un calcul sur la base d'une épaisseur de la bicouche de 5,5 nm et d'une surface moléculaire de 0,47 nm2 dans la phase gel, indique que pour des vésicules unilamellaires de 40 nm et 80 nm de diamètre, environ 65% et 55% des molécules lipidiques respectivement sont présentes dans la couche externe.
DPPC sont montrées sur la figure 3. Les modifications de la courbe sont détectées aux alentours de 50F55% d'extinction. Le fait que les sondes moléculaires localisées dans la couche lipidique externe soient les premières affectées, suggère que les homéo-biovecteurs aussi bien que les liposomes DPPC sont composés d'une bicouche lipidique unique. En conséquence, pour un calcul sur la base d'une épaisseur de la bicouche de 5,5 nm et d'une surface moléculaire de 0,47 nm2 dans la phase gel, indique que pour des vésicules unilamellaires de 40 nm et 80 nm de diamètre, environ 65% et 55% des molécules lipidiques respectivement sont présentes dans la couche externe.
2.5. Stabilité dans le temps des homéo-biovecteurs
La structure particulière des homéo-biovecteurs (nanoparticules constituées d'une membrane lipidique organisée en une bicouche et supportée par un NPS sous-jacent de charge semblable est-elle stable dans le temps ?
La stabilité de la taille nanoparticulaire est suivie à des intervalles de temps réguliers pour des préparations conservées stérilement à 4 C.
La structure particulière des homéo-biovecteurs (nanoparticules constituées d'une membrane lipidique organisée en une bicouche et supportée par un NPS sous-jacent de charge semblable est-elle stable dans le temps ?
La stabilité de la taille nanoparticulaire est suivie à des intervalles de temps réguliers pour des préparations conservées stérilement à 4 C.
Les mesures sont rapportées dans le tableau 3.
Aucun changement de taille significatif des homéo-biovecteurs anioniques et des homéo-biovecteurs cationiques n'est détecté pendant plus de 9 mois.
Ces structures possèdent une remarquable stabilité dans le temps.
Tableau 3 : Stabilité dans le temps de la taille des nanoparticules (liposomes et homéo-biovecteurs) à 4 C.
[noyau] = I mg/ml ; [lipides] = 0,2 mg/ml ; le rapport pondéral des mélanges lipidiques DPPC/DPPG ou DPPC/SA est de 95/5.
Mesure réalisée en PBS 50 mM.
Diamètre moyen + écart type (nm)
Echantillon 24 h 1 mois 3 mois 6 mois 9 mois 12 mois
Liposomes cationiques (DPPC/SA) 22,3#11 28,3#08 25,0#09 Aggr. Aggr. Aggr.
Echantillon 24 h 1 mois 3 mois 6 mois 9 mois 12 mois
Liposomes cationiques (DPPC/SA) 22,3#11 28,3#08 25,0#09 Aggr. Aggr. Aggr.
Homéo-biovecteurs cationiques 78,5#42 76,2#11 82,1#15 77,0#25 77,2#67 Aggr.
Liposomes anioniques (DPPC/DPPG 18,5#09 22,3#0,9 Aggr. Aggr. Aggr. Aggr.
Homéo-biovecteurs anioniques 45,4#26 52,3#11 48,2#0,8 55,0#22 42,1#15 49,2#12 (DPPC = dipamitoyl-phosphatidylcholine ; DPPG = dipamitoyl-phosphatidylglycérol ; SA = stéarylamine) (Aggr. = aggrégation).
Claims (22)
1. Vecteur particulaire comprenant - un noyau hydrophile non liquide - un feuillet amphiphile caractérisé en ce que le noyau porte une charge globale cationique, anionique ou neutre et en ce que le feuillet amphiphile porte une charge globale de même polarité que celle portée par le noyau.
2. Vecteur particulaire selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient en outre au moins un principe actif, associé au noyau et/ou au feuillet amphiphile.
3 .Vecteur particulaire selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comporte au moins - un noyau hydrophile non liquide portant une charge cationique ou
anionique, de même polarité que celle portée par le noyau.
4. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comporte: - un noyau hydrophile non liquide, neutre électriquement - un feuillet amphiphile globalement neutre, comprenant des
phospholipides zwittérioniques.
5. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'au moins un constituant du feuillet amphiphile est choisi dans le groupe constitué par les phospholipides anioniques, cationiques ou zwittérioniques, naturels ou svnthétiques, les céramides, les acides gras, les stéroldes, les lipides, les gl!colipides, les lipoprotéines et les tensioactifs, portant une charge de même polarité que celle du noyau.
6. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la proportion de constituants du feuillet amphiphile portant une charge de méme polarité que celle du noyau est supérieure à 0% et inférieure ou égale à 100%.
7. Vecteur particulairc selon l'une des revenciications 1 à 6, caractérisé en ce que le noyau est constitué de composés choisis parmi les oligomères et les polymères hxdrophiles, naturellement ou chimiquement réticulés.
8. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le noyau est constitué de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, portant une charge cationique ou anionique.
9. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le noyau comprend des constituants choisis parmi: le dextrane, l'amidon, la cellulose, leurs dérivés substitués, leurs produits d'hydrolyse, les sels et les esters de ces composés.
10. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 7 à 9, caractérisé en cc que des ligands ioniques, acides ou basiques sont fixés sur le noyau.
11. Vecteur particulaire selon la revendication 10, caractérisé en ce que les ligands ioniques portent au moins une fonction choisie dans le groupe comprenant: phosphates, sulfates, acides carboxyliques, ammonium quaternaire, amines primaires, amines secondaires.
12. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'au moins un constituant du feuillet amphiphile est choisi parmi la phosphatidylcholine, la phosphátidyléthanolaminc, la phosphatidylserine, le phosphatidylglycérol, le cholestérol, et leurs dérivés.
13. Vecteur selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'au moins un constituant du feuillet amphiphile est choisi parmi le dipalmitoyl phosphatidylcholine, le dimyristoyl phosphatidylglycérol, le dipalmitoyl phosphatidylglycéro1, le distéaroyl phosphatidylglycérol, le dioleoyl phosphatidylglycérol, Ic dimyristoyl acide phosphatidique, le dipalmitoyl acide phosphatidique, le dipalmitoyl phosphatidylsérine et la stéarylamine.
14. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que le feuillet amphiphile comprend au moins deux composés lipidiques différents.
15. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que le feuillet amphiphile est directement associé au noyau.
16. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que son diamètre moyen est compris entre environ 10 nm et 100 zm.
17. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 2 à 16, caractérisé en ce que le principe actif porte également une charge globale, ou est lipophile
18. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 2 à 17, caractérisé en ce qu'au moins un principe actif est choisi parmi les peptides, les protéines, les lipoprotéines, les protéoglycanes, les lipopolysaccharides, les acides gras, les triglycérides, les phospholipides, les glycolipides, les stéroïdes, les oligosaccharides, les séquences nucléotidiques, les séquences nucléosidiques, les acides nucléïques, les vitamines et les porphyrines.
19. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 2 à 18, caractérisé en ce qu'au moins un principe actif est choisi dans le groupe suivant : les antibiotiques, les antiseptiques, les analgésiques, les anesthésiants, les antiinflammatoires, les antiviraux, les anticancéreux, les immunomodulateurs et les médiateurs cellulaires, les antihistaminiques, les antimuscariniques, les agents anti-anémiants, les agents hémostatiques, les anti-diabétiques, les agents cardio-vasculaires, les anti-dépresseurs, les anti-épileptiques, les anxiolytiques, les hypnotiques, les sédatifs, les antipsychotiques, les agents anorexigènes, les vaccins, les hormones naturelles ou synthétiques et leurs dérivés, les insecticides, les fongicides, les antimalariques, les antiasthmatiques, les anticorps, les antigènes et leurs fragments, les agents de diagnostic, les agents de diagnostic RNIN, et les marqueurs radioactifs .
20. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient un vecteur particulaire selon l'une des revelldications 1 à 19.
21. Composition cosmétique, caractérisée en ce qu'elle contient un vecteur particulaire selon l'une des revendications 1 à 19 ct des excipients cosmétologiquement acceptables.
22. Additif alimentaire caractérisé en ce qu'il comprend un vecteur particulaire selon l'une des revendications I à 19.
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