EP0946153A1 - Vecteur particulaire homeocharge et composition pharmaceutique ou cosmetique le contenant - Google Patents

Vecteur particulaire homeocharge et composition pharmaceutique ou cosmetique le contenant

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EP0946153A1
EP0946153A1 EP97952990A EP97952990A EP0946153A1 EP 0946153 A1 EP0946153 A1 EP 0946153A1 EP 97952990 A EP97952990 A EP 97952990A EP 97952990 A EP97952990 A EP 97952990A EP 0946153 A1 EP0946153 A1 EP 0946153A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
vector according
particulate vector
biovectors
cationic
core
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP97952990A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Didier Betbeder
Michel Major
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biovector Therapeutics SA
Original Assignee
Biovector Therapeutics SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biovector Therapeutics SA filed Critical Biovector Therapeutics SA
Publication of EP0946153A1 publication Critical patent/EP0946153A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5161—Polysaccharides, e.g. alginate, chitosan, cellulose derivatives; Cyclodextrin

Definitions

  • the present invention relates to complex particles, useful for the transport and targeting of active principles, which are compatible with the biological functions of the organism and of the cells.
  • Particulate vectors have been described in EP 344 040; these vectors comprise a hydrophilic nucleus, surrounded by a first lipid layer, then by a second, more external layer, of amphiphilic compounds linked to the first lipid layer by hydrophobic interactions.
  • BVSM-L particulate vectors
  • the nucleus of these vectors can be grafted with ionic, acidic or basic ligands, giving it a charge which can be used to change certain active ingredients.
  • ionic, acidic or basic ligands giving it a charge which can be used to change certain active ingredients.
  • a generally neutral core can be associated with an unloaded external sheet.
  • the present invention relates to a particulate vector comprising: a non-liquid hydrophilic core an amphiphilic sheet characterized in that the core carries an overall cationic, anionic or neutral charge and in that the amphiphilic sheet carries an overall charge of the same polarity as that carried by the core.
  • Such vectors which associate an internal hydrophilic charged structure, with an external structure of similar charge and of amphiphilic character, will be called in the following “homeo-biovectors” or “homeocharged biovectors”.
  • the layer of amphiphilic compounds is in an external situation with respect to the nucleus of the biomeector; it can be discontinuous or continuous, and / or present interdigitations with the constituents of the nucleus.
  • amphiphilic membranes also have a specific organization of the amphiphilic membrane, with an increase in the molecular packing of lipids and a high degree of cooperativity. This organization is modulated by the ionic charge of the hydrophilic nucleus. It can in particular be objectified by measuring the phase transition temperatures.
  • Homeo-biovectors cationic or anionic, can be used to transport molecules of interest.
  • these vectors will contain at least one active principle, associated with the nucleus and / or the amphiphilic sheet.
  • composition of the core and / or of the amphiphilic sheet will be adapted by a person skilled in the art according to the type of molecule to be associated with it and the application envisaged.
  • the particulate vector will comprise at least: a non-liquid hydrophilic nucleus carrying a cationic or anionic charge an amphiphilic sheet carrying a cationic or anionic charge, of the same polarity as that carried by the nucleus.
  • the vector comprises: a non-liquid hydrophilic core, electrically neutral an overall neutral amphiphilic sheet, comprising zwitterionic phospholipids.
  • the amphiphilic sheet may consist of one or more components, with a view to creating a physico-chemical environment adapted to the active principle and to the desired function.
  • At least one constituent of the amphiphilic sheet is chosen from the group consisting of anionic, cationic or zwitterionic phospholipids, natural or synthetic, ceramides, fatty acids, steroids, lipids, glycolipids, lipoproteins and surfactants , carrying a charge of the same polarity as that of the core.
  • constituents particularly suitable for the preparation of homeobiovectors mention may be made of phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol, cholesterol, and their derivatives. These constituents can be alone or as a mixture, possibly associated with other uncharged constituents.
  • At least one constituent of the amphiphilic sheet is chosen from dipalmitoyl phosphatidylcholine, dimyristoyl phosphatidylglycerol, dipalmitoyl phosphatidylglycerol, distearoyl phosphatidylglycerol, dioleoyl phosphatidylglycerol, dioleyloxypropyl trimethylphosphyltrim dipalmitoyl phosphatidic acid, dipalmitoyl phosphatidylserine and stearylamine.
  • the proportion of constituents of the amphiphilic sheet carrying a charge of the same polarity as that of the core is in all cases greater than 0%, in particular greater than 0.001%, and less than or equal to 100%. It can in particular be between approximately 5% and 30% of these constituents, depending on the charge carried by the hydrophilic core.
  • This core preferably consists essentially of compounds chosen from oligomers and hydrophilic polymers, naturally or chemically crosslinked. More particularly, the nucleus consists of saccharide derivatives, of different molecular weights, in particular of polysaccharides or oligosaccharides naturally or chemically crosslinked, carrying a cationic or anionic charge.
  • starch dextran or cellulose and their substituted derivatives, as well as their hydrolysis products such as in particular dextrins and maltodextrins.
  • the salts and esters of these polymers or oligomers (which naturally contain hydroxy functions) will also be suitable for carrying out the invention.
  • Crosslinking can be obtained by different techniques known to those skilled in the art. Methods for preparing nuclei which can enter into the composition of homeobiovectors are described in particular in WO 94/20078 and WO 92/21329.
  • ionic, acidic or basic ligands are attached to the nucleus.
  • the binding of the ionic ligands to the nucleus will be carried out after this crosslinking step or at the same time, in certain embodiments.
  • This second possibility is particularly applicable for "acid" nuclei, in particular by - use of a reagent simultaneously ensuring crosslinking and grafting ligands; in this regard, a reagent such as phosphorus oxychloride, used at low temperature (of the order of 0 ° to 10 ° C, preferably around 4 ° C), is particularly suitable.
  • any compound capable of nucleophilic attack by the hydroxyls of the oligo or of the polysaccharide can be grafted onto the matrix; mention may thus be made of epoxides, acid chlorides, anhydrides, alkyl halides, isothiocyanates, chlorotriazines, etc.
  • the ionic ligands carry at least one function chosen from the group comprising: phosphates, sulfates, carboxylic acids, quaternary ammonium, primary amines, secondary amines.
  • the reagents can for example be chosen from succinic acid, phosphoric acid, citric acid, glycine, alanine, glutamic acid, aspartic acid or their derivatives, choline, 3-hydroxycholine, 2 - (dimethylamino) ethanol, 2- (dimethylamino) ethylamine and glycydyltrimethylammonium chloride.
  • the initial concentration of polysaccharides is preferably between 100 and 500 g / l, depending on the grafting and crosslinking yields desired, and depending on the type of gel sought (hardness, homogeneity, mesh size).
  • the functionalization step of the core will advantageously be carried out before grinding and homogenizing the gel to obtain particles of controlled size and hardness, in which the charges are distributed in a homogeneous and regular manner.
  • This homogenization can be carried out by high pressure (700 to 1,200 bars), and followed by one or more filtrations.
  • the hydrophilic nucleus is directly associated with the amphiphilic sheet, by interactions which can in particular be of the hydrogen bond type.
  • the homeo-biovectors are prepared by mixing the nuclei dispersed in an aqueous solvent with the constituent (s) of the sheet. The synthesis can in particular be carried out with stirring, at a temperature higher than the gel-liquid phase transition temperature of the amphiphilic constituents, or by pressure homogenization at a temperature higher than the gel-liquid phase transition temperature of the amphiphilic constituents, or any other suitable method.
  • the homeo-biovectors are sterilized in particular by filtration and stored under sterile conditions.
  • the average diameter of homeo-biovectors can vary from 10 nm to 100 ⁇ m.
  • this diameter is between 10 nm and 5 ⁇ m, in particular approximately 15 nm to 80 nm.
  • RNA molecules could be associated with the Tiomeo-biovector, and in particular active principles carrying a global charge: anionic, cationic or zwitterionic.
  • These molecules may in particular be chosen from peptides, proteins, lipoproteins, proteoglycans, lipopolysaccharides, fatty acids, triglycerides, phospholipids, glycolipids, steroids, oligosaccharides, nucleotide sequences, nucleoside sequences, nucleic acids, vitamins and porphyrins.
  • homeo-biovectors can, in different embodiments of the invention, be associated with at least one active principle chosen from the following group: antibiotics, antiseptics, analgesics, anesthetics , anti-inflammatory drugs, antivirals, anticancer drugs, immunomodulators and cellular mediators, antihistamines, antimuscarinics, anti-anemic agents, hemostatic agents, anti-diabetics, cardiovascular agents, anti-depressants, anti-epileptics, anxiolytics, hypnotics, sedatives, antipsychotics, appetite suppressants, vaccines, natural or synthetic hormones and their derivatives, insecticides, fungicides, antimalarials, asthma medications, antibodies, antigens and their fragments, diagnostic agents, NMR diagnostic agents, and markers radioactive.
  • cytokines chosen from the group comprising: interleukins, interferons, TNF, G-CSF,
  • the structure and the charge of the iomeo-biovector may be adapted according to the nature of the active principle, the effectiveness of which will be improved in particular by an accentuated membrane surface potential, due to the presence of the underlying nucleus of similar charge.
  • Such vectors are particularly advantageous since they make it possible to associate the targeting characteristics provided in particular by the hydrophilic nucleus and the specific cellular interactions of an amphiphilic membrane, in particular phospholipid.
  • the lipid membrane structure is stabilized by the presence of the nucleus. The repulsive forces between homeo-biovectors limit interparticle interactions and therefore increase their lifespan.
  • model membrane systems described in the literature show that the interactions between the membrane and the proteins can be favored if the membrane is loaded with a large surface potential and has a strong molecular packing.
  • anionic homeo-biovectors can be associated with cationic drugs both at the nucleus and at the membrane (TNF, IL2). It has been widely described in the literature that an anionic membrane promotes the association, stability and cellular penetration of membrane proteins (cytochrome c, hemagglutinin). The anionic charge of the nuclei plays an important role in interactions with cell membranes.
  • anion nucleus associated with the anionic membrane within the framework of a therapeutic application, should confer a synergy of action for a favorable delivery of the drug. This effect would not be observable when using each system (anion nucleus or anionic liposomes) taken in isolation.
  • Cyt.c oxidase discriminates the various membrane constituents according to their polar head (with a preference for anionic charges) and according to the phase state of the membrane (preference for a membrane with high molecular packing) (de Cuyper, Eur. J. Biochem., 1980, 104, 397-405). the interactions between the membrane and Cyt.b5 are reinforced in the presence of anionic lipids (electrostatic interactions).
  • DPPC / DPPG phosphatidylcholine and phosphatidylglycerol
  • a membrane potential allows a correct arrangement of the protein which then constitutes an active transmembrane channel (Massotte, Biochemistry (1993, 32, 13787-13794) (Stroud, Curr. Opinion Struct. Biol. 1995, 5, 51 1 -520), (Géli, Subcellular Biochem. 1994, 22, 21-69).
  • the antibiotic Adriamycin enters the lipid bilayer thanks to the interactions between the polar heads of the phospholipids (phosphate group) and the aminoglycosyl group of the peptide.
  • Anionic phospholipids have been shown to determine, in various cases, the interactions of proteins with membranes. These interactions result in protein insertions or translocations.
  • Reconstituted systems of proteoliposome type generally depend on the presence of specific phospholipids within the membrane (contribution of charges at the level of the polar heads, molecular cohesion and compaction).
  • cationic homeo-biovectors it is possible to associate with the nucleus and / or the amphiphilic sheet drugs or anionic prodrugs such as nucleic arides (DNA, RNA, oligonucleotides), lipids, proteins.
  • nucleic arides DNA, RNA, oligonucleotides
  • lipids proteins.
  • cationic liposomes have been used for this type of molecule, in particular in gene therapy. In particular, they allow cytoplasmic delivery of DNA.
  • the gene expression is most often weak and transient.
  • the DNA / liposome complex is too easily degraded and eliminated by the body.
  • the co-injection of promoters of the gene promoter is necessary in order to obtain the production of the protein.
  • fusogenic proteoliposomes the results are not very reproducible.
  • the type of association present in homeo-biovectors stiffens and stabilizes a phospholipid membrane. This type of stabilization could have an important role in vivo.
  • cationic membranes interact strongly with their environment to promote (1) bioadhesion on the cell surface and (2) cytoplasmic delivery with the associated active ingredient.
  • Cationic homeo-biovectors are supramolecular structures which differ from liposomal structures, fusogenic proteoliposomal structures, viral vectors or soluble DNA complexes (Legendre-Skoza, Proc. Natl. Sri. USA, 1993, 90, 893-397), (Felgner-Rhodes, Nature, 1991, 349, 351-382): these homeobiovectors will make it possible to associate molecules (oligonucleotides, DNA, RNA) both on the surface (at the membrane level) and at depth (at the level of the polysaccharide nucleus cationic) where they will be stabilized and protected from enzymatic degradation.
  • fusogenic proteins on the surface of cationic homeobiovectors can be envisaged: they will act in synergy with the charge effects to deliver the active molecules in the cytoplasm of cells.
  • the intra-tissue residence time of homeo-biovectors is long enough to locally consider the delivery of exogenous genetic material as part of gene therapy. (example: compensate for hormonal deficits by injecting into the deficient tissue complexes "homeo-biovectors / DNA producing the hormonal protein").
  • the subject of the invention is also a pharmaceutical composition, characterized in that it contains a particulate vector as described above.
  • the subject of the invention is a cosmetic composition, characterized in that it contains a particulate vector as described above and cosmetologically acceptable excipients.
  • Homeo-biovectors also have applications as a food additive, or in the field of water treatment.
  • the invention will be illustrated by the following examples.
  • Figure 1 Separation of polysaccharide nuclei (NPS), liposomes and biovectors on sucrose density gradients (0% -35%).
  • A separation of NPS labeled with fluorescein (O) and liposomes labeled with DPH (0).
  • B separation of the biovectors whose NPS is labeled with fluorescein (•) and the membrane with DPH ( ⁇ ).
  • Figure 2 Phase transition of lipids organized in the form of liposomes or iomeo-biovectors. Profiles obtained by measuring the fluorescence polarization p of DPH as a function of temperature for 1 ml of sample conditioned in water.
  • Figure 3 Influence of cobalt ions on the fluorescence of the NBD-PC probe inserted in the liposomal membrane (0) and in the biovector membrane (•). The lipid concentration is 27.2 ⁇ M and the temperature is 20 ° C.
  • Example 1 Preparation of anionic homeo-biovectors The preparation of anionic homeo-biovectors takes place in two main stages: (1) the synthesis of anionic polysaccharide nuclei, (2) the association of lipids with anionic NPS.
  • the purification is carried out by successive stages of (1) 0.45 ⁇ m microfiltration to eliminate particles of too large a size, (2) diai fi ltration at constant volume to eliminate small molecules (salts, polysaccharide fragments).
  • anionic NPS are concentrated, recovered, in sterile bottles and stored at -20 ° C.
  • the thawed anionic polysaccharide nuclei are diluted with osmosis water in a glass receptacle in the proportion of lmg / lml (example: 250 mg NPS / 250 ml).
  • the dispersion is subjected to magnetic stirring (5-10 minutes) then homogenized (RANNIE Minilab) at 400 bars for 3 minutes.
  • the dispersion of NPS is placed in a water bath at 80 ° C.
  • the lipids (example: mixture of DPPC with DPPG), in powder form, are weighed so that the total mass represents, for example, 30% (w / w) of the mass of the NPS (75 mg of lipids per 250 mg of NPS).
  • the constituent lipids of the membrane are mixed and solubilized with 2 ml of 95% ethanol (v / v). If the loaded lipids represent, for example, 5% (w / w) of the total lipids, weigh 3.75 mg of anionic lipid and 71.25 mg of DPPC.
  • the homogenizer is brought to a temperature of 60 ° C minimum by circulating water in a closed circuit. Concomitantly, the NPS dispersed at 80 ° C. are subjected to magnetic stirring and the ethanolic solution of lipids is injected into the dispersion of NPS.
  • the "NPS / lipids" dispersion at 80 ° C. is then introduced into the homogenizer and is homogenized at 450 bars for 25 minutes in a closed circuit at minimum 60 ° C.
  • the preparation is introduced into a glass flask and then subjected to low pressure at 60 ° C to remove the ethanol remaining in solution.
  • the anionic homeo-biovectors thus obtained are then stored under sterile conditions after filtration through 0.2 ⁇ m.
  • cationic homeo-biovectors takes place in two main stages: (1) synthesis of cationic polysaccharide nuclei (NPS), (2) association of cationic lipids with cationic NPS.
  • NPS cationic polysaccharide nuclei
  • ROQUETTE Glucidex maltodextrins
  • Lliydrogel obtained is ground using a high pressure homogenizer (RANNIE Lab).
  • the pressure exerted is 400 bars.
  • the dispersed matrices have an average diameter of 60 nm.
  • the purification is carried out by successive stages of (1) 0.45 ⁇ m microfiltration to eliminate particles of too large a size, (2) diafiltration at constant volume to eliminate small molecules (salts, polysaccharide fragments).
  • the cationic NPS are concentrated, collected in sterile bottles and stored at -20 ° C.
  • the lipids (example: mixture of DPPC with stearylamine), in the form of powder, are weighed so that the total mass represents, for example 30% (w / w) of the mass of the NPS (75 mg of lipids for 250 mg from NPS).
  • the constituent lipids of the membrane are mixed and solubilized with 2 ml of 95% ethanol (v / v). If the loaded lipids represent, for example, 5% (w / w) of the total lipids, weigh 3.75 mg of cationic lipid and 71.25 mg of DPPC.
  • the homogenizer is brought to a temperature of 60 ° C minimum by circulating water in a closed circuit. Concomitantly, the NPS dispersed at 80 ° C. are subjected to magnetic stirring and the ethanolic lipid solution is injected into the NPS dispersion.
  • the heating water in the homogenizer circuit is removed and replaced by the "NPS / lipids" dispersion at 80 ° C.
  • This new dispersion is homogenized at 450 bars for 25 minutes in a closed circuit at minimum 60 ° C.
  • the preparation is introduced into a glass flask and then subjected to low pressure at 60 ° C to remove the ethanol remaining in solution.
  • the cationic homeo-biovectors thus obtained are then stored under sterile conditions after filtration through 0.2 ⁇ m.
  • NPS neutral polysaccharide nuclei
  • ROQUETTE Glucidex maltodextrins
  • the hydrogel obtained is ground using a high pressure homogenizer (RANNIE Lab).
  • the pressure exerted is 400 bars.
  • the dispersed matrices have an average diameter of 60 nm.
  • the purification is carried out by successive stages of (1) 0.45 ⁇ m microfiltration to remove excessively large particles. important, (2) diafiltration at constant volume to remove small molecules (salts, polysaccharide fragments).
  • NPS are concentrated, collected in sterile bottles and stored at -20 ° C.
  • the thawed neutral polysaccharide cores are diluted with osmosis water in a glass receptacle (250 mg NPS / 250 ml).
  • the dispersion is first placed under magnetic stirring (5-10 minutes) and then homogenized (RANNIE Minilab) at 400 bars for 3 minutes.
  • the dispersion of NPS is placed in a water bath at 80 ° C.
  • the lipids (example: DPPC), in powder form, are weighed so that the total mass represents, for example, 30% (w / w) of the mass of the NPS.
  • the constituent lipids of the membrane are dissolved with 2 ml of 95% ethanol (w / w).
  • the homogenizer is brought to a temperature of at least 60 ° C by circulating water in a closed circuit.
  • the NPS dispersed at 80 ° C. are subjected to magnetic stirring and the ethanolic lipid solution is injected into the NPS dispersion.
  • the homogenizer circuit heating water is replaced by the "NPS / lipids" dispersion at 80 ° C.
  • This new dispersion is homogenized at 450 bars for 25 minutes in a closed circuit at 60 ° C minimum.
  • the preparation is introduced into a glass flask and then subjected to low pressure at 60 ° C to remove the ethanol remaining in solution.
  • the neutral homeo-biovectors thus obtained are then stored under sterile conditions after filtration through 0.2 ⁇ m.
  • NPS polysaccharide nuclei
  • anionic and cationic particulate vectors are prepared according to the technique described in Examples 1 and 2.
  • the liposomes were prepared by injection of an ethanolic solution of lipids in water as described in Batzri et al (Biochem. Biophys. Acta, 1973, 298, 1015-1019) and Kremer et al (Biochemistry, 1977, 16 , 3932-3935). All the samples prepared are stored in sterile tubes after sterilizing filtration through 0.2 ⁇ m.
  • the average diameter of the polysaccharide nuclei, the liposomes and the particle vectors is determined by a Coulter N4MD nanoparticle analyzer (Coultronics, Margency, France). The measurements were carried out in triplicate, at a temperature of 25 ° C., after dilution of the sample in 50 mM PBS.
  • the labeling of the polysaccharide nucleus with fluorescein was carried out by addition of 10 mg of an aqueous solution of DTAF (5 ([4,6- dichlorotriazine-2 ⁇ L] amino) fluorescence 2 mg / ml) to 100 mg of polysaccharide particles to pH 10, with magnetic stirring. After 2 hours at room temperature, the reaction mixture is washed by ultrafiltration, first with 1 M NaCl and then demineralized water until no fluorescein can be detected in the ultrafiltrate. The fluorescein-labeled polysaccharide nuclei (1 mg / ml) are then stored in sterile tubes after sterilizing filtration over 0.2 ⁇ m.
  • DTAF [4,6- dichlorotriazine-2 ⁇ L] amino fluorescence 2 mg / ml
  • the labeling of the phospholipid layers with DPH (1, 6-diphenyl-1,3,5-hexatriene) is carried out by adding the probe (10 3 M in tetrahydrofuran) to aqueous suspensions of homeo-vectors or liposomes. The temperature is maintained at 60 ° C for 30 minutes. The final ratio of DPH to phospholipids is _ 0.5%.
  • homeo-biovectors were first prepared with polysaccharide nuclei labeled with fluorescein and then the external lipid layer was labeled with DPH as described above. All fluorescent preparations were stored in the dark.
  • the fluorescence excitation and the emission spectrum were recorded with an SLM-Aminco spectrofluorimeter, Model 500.
  • the absorbance of the suspensions homeo-biovector and liposome was never greater than 0.1.
  • the wavelength was 360 nm for DPH and 490 nm for fluorescein.
  • the emission wavelength was 426 nm for DPH and 522 nm for fluorescein.
  • the homeo-biovectors or the liposomes were prepared with DPPC (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) supplemented with NBD-PC (l-acyl-2- [12 - [(7-nitro-2 - 1,3-benzoxadiazole-4-yl) amino] dodecanoyl] -sn-glycero-3-phosphocholine, (2 mol%), and dispersed in 1.5 M NaCl. Aliquots of thiomeo-biovector or liposome suspension have was put in a quartz tank (phospholipid concentration: 27.2 ⁇ M) and the fluorescence was measured to give the value Fo.
  • quenching solution C0CI2 0.3 M in water
  • the reagents are mixed for 15 seconds and the fluorescence is measured immediately to give the value Fi.
  • the quenching efficiency is calculated as (l-F ⁇ / Fo) xlOO. excitation and emission were 474 nm and 535 nm respectively, and the temperature 20 ° C.
  • sucrose gradients were prepared by melting 9 ml of 20% (w / w) sucrose solution at room temperature. 1 ml of the sample is placed at the top of the tube and centrifugation is carried out for 4 hours at 250,000 g, 8 ° C. After centrifugation, 0.5 ml fractions are collected from the top to the bottom of the tube with a pipette and analyzed in fluorescence spectroscopy.
  • NPS polysaccharide nuclei
  • Controls show that the synthesis of Biovectors results in a pure product. Indeed, the presence of free NPS and free liposomes is not detected in a preparation of biovectors.
  • the procedure applied to synthesize the biovectors makes it possible to vary the lipid / NPS weight ratio from 20 to 100% without causing the formation of liposomes.
  • the size of the neutral, cationic and anionic homeo-biovectors depends on the size of their constitutive NPS (example: for a cationic NPS of approximately 80 nm, the resulting cationic iomeo-biovector measures approximately 80 nm in diameter).
  • the size of the control liposomes is smaller.
  • the phospholipids of the liposomes organize themselves so that the structure is thermodynamically stable.
  • the NPS core of homeo-biovectors promotes better stability of the lipid system.
  • Table 1 Measurement of the size of nanoparticles (polysaccharide nuclei (NPS), liposomes and homeo-biovectors) by LASER light scattering.
  • DPPC dipamitoyl-phosphatidylcholine
  • DPPG dipamitoyl- phosphatidylglycerol
  • SA stearylamine
  • lipids are associated with NPS
  • the aim is to show that these amphiphilic molecules are organized together to form the constitutive membrane of homeo-biovectors.
  • the phase behavior of the lipids makes it possible to study this organization.
  • the phase behavior of the lipid crown organized around the NPS is studied by visualizing the gel-liquid phase transition of lipids as a function of temperature by measuring the fluorescence depolarization of the DPH probe inserted within the hydrophobic membrane zone. .
  • the profiles obtained (FIG. 2) for the homeo-biovectors and the control liposomes of the same lipid composition make it possible to raise the transition temperature of the gel-liquid phase (Tm) (Table 2).
  • the results obtained make it possible to know the influence of the NPS and of the saline composition of the aqueous phase on the lipid organization.
  • the gel-liquid phase transitions of lipids organized in the form of homeo-biovectors are very well defined. This observation is explained by a high degree of intermolecular cooperativity and therefore by a degree of organization of the membrane of homeo-biovectors quite comparable to liposomal membranes.
  • the neutral homeo-biovectors and the control liposomes are analyzed in FIG. 2A, which shows a characteristic profile of the phase transition of the DPPC organized in the form of a liposome making it possible to note a Tm value of 40 ° C.
  • the neutral homeo-biovectors have a membrane whose phase transition is as clear as that of the liposomes but exhibiting a shift towards the highest temperatures.
  • the anionic homeo-biovectors (FIG. 2B) have a very marked and shifted phase transition towards higher temperatures compared to the control liposomes.
  • the cationic homeo-biovectors offer similar characteristics: the effect of cationic NPS on the associated cationic membrane is such that the phase transition of the lipids is shifted towards higher temperatures compared to the control liposomes.
  • the light biovectors constituted by a cationic NPS and an anionic membrane have a lower phase transition than that of the control liposomes (temperature difference of -1 ° C).
  • the NPS nucleus has an effect on its membrane which is the opposite of that of the homeo-biovector.
  • Table 2 Temperatures of gel-liquid phase transition (Tm) of lipid membranes organized in the form of liposomes or homeo-biovectors.
  • DPPC dipamitoyl-phosphatidylcholine
  • DPPG dipamitoyl- phosphatidylglycerol
  • SA stearylamine
  • the temperature reading Tm (table 2) of each system makes it possible to characterize the phase transition offset.
  • this supramolecular structure promotes better membrane organization than that of the liposomes resulting in an increase in the molecular packing of the lipids between them.
  • the lipids associated with the NPS are organized together to form a membrane. It is a question of characterizing the structure of this membrane. Fluorescence quenching experiments were carried out using an NBD-PC probe, for which it has been shown that the NBD group is localized in the glycerophosphate region of the lipid bilayer. Cobalt ions have been used as fluorescence extinguishers.
  • the biovectors were prepared in the presence of 1.5 M NaCl, in order to avoid excessive changes in ion concentration after addition of the extinguisher in the aqueous phase. The fluorescence curves obtained respectively for the DPPC liposomes and the DPPC anionic biovectors are shown in FIG. 3.
  • Table 3 Stability over time of the size of nanoparticles (liposomes and homeo-biovectors) at 4 ° C.
  • Cationic liposomes (DPPC / SA) 22.3 + 1 1 28.3 + 08 25.0 + 09 Aggr. Aggr. Aggr. Cationic homeo-biovectors 78.5 ⁇ 42 76.2 + 1 1 82, 1 + 15 77.0 + 25 77.2 + 67 Aggr.
  • Anionic liposomes (DPPC / DPPG) 18.5 + 09 22.3 + 0.9 Aggr. Aggr. Aggr. Aggr. Anionic homeo-biovectors 45.4 + 26 52.3 + 1 1 48.2 + 0.8 55.0 + 22 42, 1 + 15 49.2 + 12
  • DPPC dipamitoyl-phosphatidylcholine
  • DPPG dipamitoyl-phosphatidylglycerol
  • SA stearylamine
  • Cationic homeobiovectors prepared as in Example 2 are used, but here the constituent lipids of the membrane are a mixture of DPPC (dipalmitoyl phosphatidylcholine), DOTAP (dioleyloxypropyl trimethylammonium) and cholesterol according to a weight ratio of 35/35/30, the positively charged lipid being DOTAP.
  • the lipids have a total mass representing 30% by weight of the mass of the NPS.
  • the cationic nucleus has an overall charge of 0.8 mEq / g dry NPS and an average diameter of 1 10 nm.
  • the complete cationic homeobiovector obtained has an average diameter of 130 nm.
  • the DNA used is 6.7 kb plasmid DNA (plasmid 1633). It is packaged in PBS and stored at 4 ° C.
  • a volume of DNA solution is mixed, the concentration of which is calculated as a function of the DNA / NPS ratio which it is desired to obtain (1.1 to 5.5% for example) and a volume of dispersion. of homeobiovector at 1.8 mg / ml in PBS.
  • a volume of cationic homeobiovector at 1.8 mg / ml will be mixed with a volume of DNA at 100 ⁇ g / ml in PBS. The mixture is maintained for 1 hour with magnetic stirring and stored at 4 ° C.
  • the size of the resulting nanoparticles makes it possible to verify that there is no aggregation (the technique used is light scattering).
  • the formulation mode allows a homogeneous nanoparticulate dispersion.
  • the rate of association of DNA on homeocharged biovectors (determined by isopycnic separation on a sucrose density gradient and electrophoresis on 1% agarose gel) is greater than 95%.
  • - homeobiovectors favor a spontaneous association with DNA by electrostatic interactions without any external energy supply.

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Abstract

La présente invention concerne un vecteur particulaire comprenant: un noyau hydrophile non liquide; un feuillet amphiphile caractérisé en ce que le noyau porte une charge globale cationique, anionique ou neutre et en ce que le feuillet amphiphile porte une charge globale de même polarité que celle portée par le noyau. Elle concerne également une composition pharmaceutique, cosmétique ou un additif alimentaire contenant un tel vecteur.

Description

VECTEUR PARTICULAIRE HOMEOCHARGE ET COMPOSITION PHARMACEUTIQUE OU COSMETIQUE LE CONTENANT
La présente invention se rapporte à des particules complexes, utiles pour le transport et le ciblage de principes actifs, qui sont compatibles avec les fonctions biologiques de l'organisme et des cellules.
Des vecteurs particulaires ont été décrits dans EP 344 040 ; ces vecteurs comprennent un noyau hydrophile, entouré d'une première couche lipidique, puis d'une seconde couche, plus externe, de composés amphiphiles liés à la première couche lipidique par des interactions hydrophobes.
La demande WO 94/20078 a été déposée pour une autre génération de vecteurs particulaires, ou "BVSM-L", constitués d'un noyau hydrophile et d'une couche externe composée au moins en partie de composés amphiphiles, directement associée au noyau par des liaisons ioniques ou des interactions hydrophobes. Le noyau de ces vecteurs peut être greffé par des ligands ioniques, acides ou basiques, lui conférant une charge qui peut être mise à profit pour le changement de certains actifs. De manière inattendue, la Demanderesse a maintenant trouvé que des vecteurs particulaires, dans lesquels à la fois le noyau et le feuillet externe portent une charge ionique peuvent être obtenus de façon stable.
De plus, un noyau globalement neutre peut être associé à un feuillet externe non chargé.
En effet, contrairement aux observations et aux connaissances généralement admises dans l'état de la technique, des charges de même signe peuvent être présentes sur les différents composants du vecteur.
C'est pourquoi la présente invention a pour objet un vecteur particulaire comprenant : un noyau hydrophile non liquide un feuillet amphiphile caractérisé en ce que le noyau porte une charge globale cationique, anionique ou neutre et en ce que le feuillet amphiphile porte une charge globale de même polarité que celle portée par le noyau.
De tels vecteurs, qui associent une structure interne chargée hydrophile, avec une structure externe de charge semblable et de caractère amphiphile, seront appelés dans ce qui suit "homéo- biovecteurs" ou "biovecteurs homéochargés".
La couche de composés amphiphiles se trouve dans une situation externe par rapport au noyau de ltioméobiovecteur ; elle peut être discontinue ou continue, et/ou présenter des interdigitations avec les constituants du noyau.
Alors que l'on pourrait s'attendre à ce que les répulsions électrostatiques entre le feuillet amphiphile et le noyau s'opposent à ce type d'association, les homéo-biovecteurs se caractérisent par une remarquable stabilité de l'association supra-moléculaire dans le temps.
Ils présentent en outre une organisation spécifique de la membrane amphiphile, avec une augmentation de l'entassement moléculaire des lipides et un fort degré de coopérativité. Cette organisation est modulée par la charge ionique du noyau hydrophile. Elle peut notamment être objectivée par la mesure des températures de transition de phase.
Les homéo-biovecteurs, cationiques ou anioniques, pourront servir au transport de molécules d'intérêt. Selon un des aspects préférés de l'invention, ces vecteurs contiendront au moins un principe actif, associé au noyau et/ou au feuillet amphiphile.
La composition du noyau et/ou du feuillet amphiphile seront adaptés par l'homme du métier selon le type de molécule devant lui être associé et l'application envisagée.
Dans l'un des modes de réalisation de l'invention, le vecteur particulaire comportera au moins : un noyau hydrophile non liquide portant une charge cationique ou anionique un feuillet amphiphile portant une charge cationique ou anionique, de même polarité que celle portée par le noyau. Dans un autre mode de réalisation également compris dans l'invention, le vecteur comporte : un noyau hydrophile non liquide, neutre électriquement un feuillet amphiphile globalement neutre, comprenant des phospholipides zwittérioniques. En particulier, le feuillet amphiphile pourra être constitué d'un ou plusieurs composants, en vue de créer un environnement physico-chimique adapté au principe actif et à la fonction recherchée.
De préférence, au moins un constituant du feuillet amphiphile est choisi dans le groupe constitué par les phospholipides anioniques, cationiques ou zwittérioniques, naturels ou synthétiques, les céramides, les acides gras, les stéroïdes, les lipides, les glycolipides, les lipoprotéines et les tensioactifs, portant une charge de même polarité que celle du noyau.
Parmi les constituants particulièrement adaptés à la préparation des homéobiovecteurs, on peut citer la phosphatidylcholine, la phosphatidyléthanolamine, la phosphatidylserine, le phosphatidylglycérol, le phosphatidylinositol, le cholestérol, et leurs dérivés. Ces constituants peuvent être seuls ou en mélange, éventuellement associés à d'autres constituants non chargés. Selon l'un des aspects de l'invention, au moins un constituant du feuillet amphiphile est choisi parmi la dipalmitoyl phosphatidylcholine, le dimyristoyl phosphatidylglycérol, le dipalmitoyl phosphatidylglycérol, le distéaroyl phosphatidylglycérol, le dioleoyl phosphatidylglycérol, le dioleyloxypropyl trimethylammonium, le dimyristoyl acide phosphatidique, le dipalmitoyl acide phosphatidique, le dipalmitoyl phosphatidylserine et la stéarylamine. La proportion de constituants du feuillet amphiphile portant une charge de même polarité que celle du noyau est dans tous les cas supérieure à 0%, en particulier supérieure à 0,001%, et inférieure ou égale à 100%. Elle peut notamment être comprise entre environ 5% et 30% de ces constituants, en fonction de la charge portée par le noyau hydrophile.
Ce noyau est de préférence essentiellement constitué de composés choisis parmi les oligomères et les polymères hydrophiles, naturellement ou chimiquement réticulés. Plus particulièrement, le noyau est constitué de dérivés saccharidiques, de différents poids moléculaires, en particulier de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, portant une charge cationique ou anionique.
On peut ainsi utiliser l'amidon, le dextrane ou la cellulose et leurs dérivés substitués, de même que leurs produits d'hydrolyse comme notamment les dextrines et les maltodextrines. Les sels et les esters de ces polymères ou oligomères (qui comportent naturellement des fonctions hydroxy) seront également appropriés à la mise en oeuvre de l'invention. La réticulation pourra être obtenue par différentes techniques connues de l'homme du métier. Des méthodes de préparation de noyaux pouvant entrer dans la composition des homéobiovecteurs sont notamment décrites dans WO 94/20078 et WO 92/21329. Avantageusement, des ligands ioniques, acides ou basiques sont fixés sur le noyau.
La fixation des ligands ioniques sur le noyau sera effectuée après cette étape de réticulation ou en même temps, dans certains modes de réalisation. Cette seconde possibilité est notamment applicable pour des noyaux "acides", en particulier par -.a mise en oeuvre d'un réactif assurant simultanément la réticulation et le greffage des ligands ; à cet égard, un réactif comme l'oxychlorure de phosphore, utilisé à basse température (de l'ordre de 0° à 10° C, de préférence aux environs de 4° C), est particulièrement adapté.
De manière générale, tout composé susceptible d'attaque nucléophile par les hydroxyles de l'oligo ou du polysaccharide peut être greffé sur la matrice ; on peut ainsi citer les époxydes, chlorures d'acide, anhydrides, halogénures d'alkyle, isothiocyanates, chlorotriazines, etc.
De préférence, les ligands ioniques portent au moins une fonction choisie dans le groupe comprenant : phosphates, sulfates, acides carboxyliques, ammonium quaternaire, aminés primaires, aminés secondaires. Les réactifs peuvent par exemple être choisis parmi l'acide succinique, l'acide phosphorique, l'acide citrique, la glycine, l'alanine, l'acide glutamique, l'acide aspartique ou leurs dérivés, la choline, lTiydroxycholine, le 2-(diméthylamino)éthanol, la 2- (diméthylamino)éthylamine et le chlorure de glycydyltriméthylammonium.
La concentration initiale en polysaccharides est de préférence comprise entre 100 et 500 g/1, selon les rendements de greffage et de réticulation souhaités, et en fonction du type de gel recherché (dureté, homogénéité, taille de maille).
En tout état de cause, l'étape de fonctionnalisation du noyau sera avantageusement effectuée avant le broyage et l'homogénéisation du gel pour obtenir des particules de taille et de dureté contrôlée, dans lesquelles les charges sont réparties de façon homogène et régulière.
Cette homogénéisation peut être effectuée par haute pression (700 à 1200 bars), et suivie d'une ou plusieurs filtrations.
De préférence, le noyau hydrophile est directement associé au feuillet amphiphile, par des interactions pouvant notamment être du type liaisons hydrogène. Les homéo-biovecteurs sont préparés par mélange des noyaux dispersés dans un solvant aqueux avec le ou les contituants du feuillet. La synthèse peut notamment être effectuée sous agitation, à une température supérieure à la température de transition de phase gel-liquide des constituants amphiphiles, ou par homogénéisation sous pression à une température supérieure à la température de transition de phase gel-liquide des constituants amphiphiles, ou toute autre méthode appropriée.
Après élimination des solvants organiques résiduels, les homéo-biovecteurs sont stérilisés notamment par filtration et stockés en conditions stériles.
Le diamètre moyen des homéo-biovecteurs peut varier de 10 nm à 100 μm.
Dans un des modes de réalisation de l'invention, convenant particulièrement à des applications pharmaceutiques, ce diamètre est compris entre 10 nm et 5 μm, en particulier d'environ 15 nm à 80 nm.
Différents types de molécules pourront être associées à lTioméo-biovecteur, et notamment des principes actifs portant une charge globale : anionique, cationique ou zwittérionique. Ces molécules pourront notamment être choisies parmi les peptides, les protéines, les lipoprotéines, les protéoglycanes, les lipopolysaccharides, les acides gras, les triglycérides, les phospholipides, les glycolipides, les stéroïdes, les oligosaccharides, les séquences nucléotidiques, les séquences nucléosidiques, les acides nucléiques, les vitamines et les porphyrines.
Ils pourront être utiles dans différents domaines, et les homéo-biovecteurs peuvent, dans différents modes de réalisation de l'invention, être associés à au moins un principe actif choisi dans le groupe suivant : les antibiotiques, les antiseptiques, les analgésiques, les anesthésiants, les antiinflammatoires, les antiviraux, les anticancéreux, les immunomodulateurs et les médiateurs cellulaires, les antihistaminiques, les antimuscariniques, les agents anti- anémiants, les agents hémostatiques, les anti-diabétiques, les agents cardio-vasculaires, les anti-dépresseurs, les anti-épileptiques, les anxiolytiques, les hypnotiques, les sédatifs, les antipsychotiques, les agents anorexigènes, les vaccins, les hormones naturelles ou synthétiques et leurs dérivés, les insecticides, les fongicides, les antimalariques, les antiasthmatiques, les anticorps, les antigènes et leurs fragments, les agents de diagnostic, les agents de diagnostic RMN, et les marqueurs radioactifs . Parmi les médiateurs cellulaires, on peut citer les cytokines, choisies dans le groupe comprenant : les interleukines, les interférons, les TNF, le G-CSF, le M-CSF, le GM-CSF et le MIF.
La structure et la charge de lTioméo-biovecteur pourront être adaptées selon la nature de principe actif, dont l'efficacité sera améliorée notamment par un potentiel de surface membranaire accentué, du fait de la présence du noyau sous-jacent de charge semblable.
De tels vecteurs sont particulièrement avantageux puisqu'ils permettent d'associer les caractéristiques de ciblage assurées en particulier par le noyau hydrophile et les interactions cellulaires spécifiques d'une membrane amphiphile, notamment phospholipidique. En outre, la structure membranaire lipidique est stabilisée par la présence du noyau. Les forces de répulsion entre les homéo-biovecteurs limitent les interactions interparticulaires et augmentent donc leur durée de vie.
Enfin, selon la nature physicochimique de la molécule transportée, elle pourra être associée à l'une et/ ou l'autre des structures de lTioméo-biovecteur.
Par exemple, dans le cas d'association de molécules d'intérêt telles que des protéines, des systèmes membranaires modèles décrits dans la littérature (monocouches phospholipidiques, liposomes) montrent que les interactions entre la membrane et les protéines peuvent être favorisées si la membrane est chargée avec un potentiel de surface important et possède un fort entassement moléculaire.
En particulier, les homéo-biovecteurs anioniques peuvent être associés à des drogues cationiques à la fois au niveau du noyau et de la membrane (TNF, IL2). Il a été largement décrit dans la littérature qu'une membrane anionique favorise l'association, la stabilité et la pénétration cellulaire de protéines membranaires (cytochrome c, hémagglutinine). La charge anionique des noyaux joue un rôle important dans les interactions avec les membranes cellulaires.
La combinaison de ces deux facteurs (noyau anionique associé à la membrane anionique), dans le cadre d'une application thérapeutique, devrait conférer une synergie d'action pour une délivrance favorable de la drogue. Cet effet ne serait pas observable en utilisant chaque système (noyau anionique ou liposomes anioniques) pris isolément.
Schônhoff et al. (Progr. Colloid Polymer. Sri., 1992, 89, 243- 248) a montré que l'incorporation de protéines membranaires dans la membrane lipidique est optimisée avec une membrane anionique qui possède un fort entassement moléculaire.
De nombreuses publications se reportant à l'interaction des Cytochromes (Cyt.) avec des membranes modèles ont montré que : la liaison du Cyt.c à une monocouche dépend de la densité de charge du film lipidique. La pénétration dans la membrane est favorisée par la présence des charges surfaciques. dans le cas des membranes constituées de mélanges phospholipidiques, la Cyt.c oxydase discrimine les différents constituants membranaires en fonction de leur tête polaire (avec une préférence pour les charges anioniques) et en fonction de l'état de phase de la membrane (préférence pour une membrane à fort entassement moléculaire) (de Cuyper, Eur. J. Biochem., 1980, 104, 397-405). les interactions entre la membrane et le Cyt.b5 sont renforcées en présence de lipides anioniques (interactions électrostatiques). Ces interactions ont pour effet de favoriser l'insertion membranaire (protection contre la dénaturation) (Dufourcq-Faucon, FEBS Letters, 1975, 57( 1) 1 12- 1 16). La présence de lipides saturés (membrane à fort entassement moléculaire) est recommandée (Dufourcq-Bernon, Biochem. Biophys. Acta, 1976, 433, 252-263). Dans ces systèmes reconstitués, il apparaît que les lipides à tête polaire anionique sont nécessaires pour faciliter l'association et permettre une bonne orientation des groupements hémiques (Chester, Biophys. J. 1992, 61, 1224- 1243).
Dans le cas de la somatostatine cyclique, la présence de charges anioniques dans la membrane a pour effet de favoriser l'association et l'insertion du peptide. Cette insertion s'accompagne d'une réorganisation des têtes polaires avoisinantes (Beschiaschvili Biochem. Biophys. Acta, 1991 , 1061 , 78-84).
Le mélange lipidique de phosphatidylcholine et de phosphatidylglycérol (DPPC/DPPG) aboutit à une membrane anionique qui participe à la stabilisation et l'orientation de protéines surfactantes du poumon insérées dans les membranes des systèmes reconstitués (Shiffer, Biochemistry 1993, 32, 590-597).
Une toxine bactérienne comme la colicine A s'associe puis s'insère dans une membrane anionique. De plus, un potentiel de membrane permet une disposition correcte de la protéine qui constitue alors un canal transmembranaire actif (Massotte, Biochemistry ( 1993, 32, 13787- 13794) (Stroud, Curr. Opinion Struct. Biol. 1995, 5, 51 1-520), (Géli, Subcellular Biochem. 1994, 22, 21-69).
En prenant l'exemple du transporteur membranaire d'ADP/ATP, il est montré que le potentiel de surface généré par les lipides anioniques est un paramètre prédominant pour moduler les paramètres d'affinité de protéines membranaires et pour restaurer leur activité biologique dans un système reconstitué (Krâmer, Methods in Enzymology, 1989,
171 , 387-384).
L'antibiotique Adriamycine pénètre dans la bicouche lipidique grâce aux interactions entre les têtes polaires des phospholipides (groupement phosphate) et le groupement aminoglycosylé du peptide.
Cette pénétration membranaire dépend fortement du packing moléculaire (Dupou (Eur. J. Biochem. 1989, 181, 695-702).
Il a été montré que les phospholipides anioniques déterminent, dans divers cas, les interactions de protéines avec les membranes. Ces interactions aboutissent à des insertions protéiques ou des translocations.
Les systèmes reconstitués de type protéoliposomes dépendent généralement de la présence de phospholipides spécifiques au sein de la membrane (apport de charges au niveau des têtes polaires, cohésion et compaction moléculaires).
Dans le cas des homéo-biovecteurs cationiques, on peut associer au noyau et/ ou au feuillet amphiphile des drogues ou des prodrogues anioniques tels des arides nucléiques (DNA, RNA, oligonucléotides), des lipides, des protéines. En effet les liposomes cationiques ont été utilisés pour ce type de molécule, notamment en thérapie génique. En particulier, ils permettent une délivrance cytoplasmique de l'ADN.
Toutefois ces travaux montrent un certain nombre de limitations.
L'expression du gène est le plus souvent faible et transitoire. En outre, le complexe ADN/liposomes est trop facilement dégradé et éliminé par l'organisme. Dans certains cas, la co-injection d'activateurs du promoteur du gène est nécessaire afin d'obtenir la production de la protéine. Enfin, en ce qui concerne les protéoliposomes fusogènes, les résultats sont peu reproductibles. Dans le cadre de la présente invention, il a été montré que le type d'association présente dans les homéo-biovecteurs rigidifie et stabilise une membrane phospholipidique. Ce type de stabilisation pourrait avoir un rôle important in vivo. En effet, les membranes cationiques interagissent fortement avec leur environnement pour favoriser (1) la bioadhésion sur la surface cellulaire et (2) la délivrance cytoplasmique avec le principe actif associé.
Les homéo-biovecteurs cationiques sont des structures supramoléculaires qui se différencient des structures liposomales, protéoliposomales fusogènes, des vecteurs viraux ou des complexes solubles de DNA (Legendre-Skoza, Proc. Natl. Sri. USA, 1993, 90, 893- 397), (Felgner-Rhodes, Nature, 1991, 349, 351-382) : ces homéobiovecteurs permettront d'associer les molécules (oligonucléotides, ADN, ARN) aussi bien en surface (au niveau membranaire) qu'en profondeur (au niveau du noyau polysaccharidique cationique) où ils seront stabilisés et protégés des dégradations enzymatiques. La présence de protéines fusogènes à la surface des homéobiovecteurs cationiques peut être envisagée : elles agiront en synergie avec les effets de charge pour délivrer les molécules actives dans le cytoplasme des cellules.
Compte tenu de résultats de non-immunogénicité et de biodistribution obtenus in vivo avec les biovecteurs cationiques, le temps de résidence intra-tissulaire des homéo-biovecteurs est suffisamment long pour envisager localement une délivrance de matériel génétique exogène dans le cadre d'une thérapie génique (exemple : pallier les déficits hormonaux en injectant dans le tissu déficitaire des complexes 'homéo-biovecteurs/ DNA producteur de la protéine hormonale").
L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient un vecteur particulaire comme décrit ci-dessus. Selon un autre aspect, l'invention a pour objet une composition cosmétique, caractérisée en ce qu'elle contient un vecteur particulaire comme décrit précédemment et des excipients cosmétologiquement acceptables.
Les homéo-biovecteurs ont également des applications comme additif alimentaire, ou dans le domaine du traitement des eaux. L'invention sera illustrée par les exemples qui suivent.
Dans ces exemples on se référera aux figures suivantes. Figure 1 : Séparation des noyaux polysaccharidiques (NPS), des liposomes et des biovecteurs sur des gradients de densité saccharose (0%-35%). (A) : séparation des NPS marqués à la fluorescéine (O) et des liposomes marqués au DPH (0). (B) : séparation des biovecteurs dont le NPS est marqué à la fluorescéine (•) et la membrane au DPH (^). Figure 2 : Transition de phase des lipides organisés sous forme de liposomes ou dTioméo-biovecteurs. Profils obtenus en mesurant la polarisation de fluorescence p du DPH en fonction de la température pour 1 ml d'échantillon conditionné en eau.
(A) : liposomes DPPC et homéo-biovecteurs neutres. (B) : liposomes DPPC/DPPG et homéo-biovecteurs anioniques. (C) : liposomes DPPC/Stéarylamine et homéo-biovecteurs cationiques. Figure 3 : Influence des ions cobalt sur la fluorescence de la sonde NBD-PC insérée dans la membrane liposomale (0) et dans la membrane des biovecteurs (•). La concentration lipidique est de 27,2 μM et la température est de 20° C.
Exemple 1 : Préparation des homéo-biovecteurs anioniques La préparation des homéo-biovecteurs anioniques se déroule en deux étapes principales : ( 1) la synthèse des noyaux polysaccharidiques anioniques, (2) l'association de lipides aux NPS anioniques.
1. Synthèse des NPS anioniques 500 g de maltodextrine Glucidex (ROQUETTE, Lestrem, France) sont introduits dans un réacteur de 10 litres (TRIMIX) avec 2 litres d'eau déminéralisée. Après solubilisation à 4° C, 500 ml dliydroxyde de sodium (NaOH) à 10M sont ajoutés sous agitation mécanique.
Quand la température de la solution est stabilisée à 4° C, 1700 ml de NaOH 10M et 283,3 ml d'oxychlorure de phosphore (P0C13) sont introduits sous débits contrôlés. La réaction de réticulation se déroule sous agitation mécanique durant 20 heures. En fin d'addition des réactifs, le mélange réactionnel est agité pendant 15 minutes. Un volume de 5 litres d'eau déminéralisée est alors ajouté. Le pH est ramené à 7,0 par neutralisation avec de l'acide acétique glacial. L iydrogel obtenu est broyé par l'intermédiaire d'un homogénéisateur à haute pression (RANNIE Lab). La pression exercée est de 500 bars. A l'issue de cette étape, les matrices dispersées ont un diamètre moyen de 60 nm.
La purification s'opère par des étapes successives de ( 1) microfiltration 0,45 μm pour éliminer les particules de taille trop importante, (2) diaiîltration à volume constant pour éliminer les petites molécules (sels, fragments polysaccharidiques).
Enfin, les NPS anioniques sont concentrés, récupérés, dans des flacons stériles et conservés à -20° C.
2. Synthèse des homéo-biovecteurs anioniques
Les noyaux polysaccharidiques anioniques décongelés sont dilués avec de l'eau osmosée dans un réceptacle en verre dans la proportion de lmg/ lml (exemple : 250 mg NPS / 250 ml). La dispersion est soumise à agitation magnétique (5- 10 minutes) puis homogénéisée (RANNIE Minilab) à 400 bars durant 3 minutes. La dispersion de NPS est placée dans un bain-marie à 80° C.
Les lipides (exemple : mélange de DPPC avec DPPG), sous forme de poudre, sont pesés de telle sorte que la masse totale représente, par exemple, 30% (p/p) de la masse des NPS (75 mg de lipides pour 250 mg de NPS). Les lipides constitutifs de la membrane sont mélangés et solubilisés avec 2 ml d'éthanol 95% (v/v). Si les lipides chargés représentent, par exemple, 5% (p/p) des lipides totaux, il faut peser 3,75 mg de lipide anionique et 71,25 mg de DPPC.
L'homogénéisateur, est amené à une température de 60° C minimum par circulation d'eau en circuit fermé. Concomitamment, les NPS dispersés à 80° C sont soumis à agitation magnétique et la solution éthanolique de lipides est injectée dans la dispersion de NPS.
La dispersion "NPS/lipides" à 80° C est alors introduite dans l'homogénéisateur et est homogénéisée à 450 bars pendant 25 minutes en circuit fermé à 60° C minimum. A l'issue de cette étape, la préparation est introduite dans un ballon en verre puis soumise à basse pression à 60° C pour éliminer l'éthanol resté en solution.
Les homéo-biovecteurs anioniques ainsi obtenus sont alors entreposés dans des conditions stériles après filtration sur 0,2 μm.
Exemple 2: Préparation des homéo-biovecteurs cationiques
La préparation des homéo-biovecteurs cationiques se déroule en deux étapes principales : ( 1) la synthèse des noyaux polysaccharidiques (NPS) cationiques, (2) l'association de lipides cationiques aux NPS cationiques.
1. Synthèse des NPS cationiques
500 g de maltodextrines Glucidex (ROQUETTE) sont solubilisés avec 0,880 litres d'eau dans un réacteur thermostaté à 20° C sous agitation. Puis, on introduit environ 7 g de NaBH^ et on laisse 1 heure sous agitation.
200 ml de NaOH 10 M sont rajoutés puis 30,25 ml d'épichlorydrine (Fluka). Après 12 heures de réaction, 382,3 g de chlorure de glycidyltriméthylammonium (Fluka) sont introduits et le mélange est maintenu sous agitation durant 10 heures. Le gel est dilué avec 8 litres d'eau déminéralisée et neutralisé à l'acide acétique glacial.
Lliydrogel obtenu est broyé par l'intermédiaire d'un homogénéisateur à haute pression (RANNIE Lab). La pression exercée est de 400 bars. A l'issue de cette étape, les matrices dispersées ont un diamètre moyen de 60 nm.
La purification s'opère par des étapes successives de ( 1) microfiltration 0,45 μm pour éliminer les particules de taille trop importante, (2) diafiltration à volume constant pour éliminer les petites molécules (sels, fragments polysaccharidiques).
Enfin, les NPS cationiques sont concentrés, récupérés dans des flacons stériles et conservés à -20° C.
2. Synthèse des homéo-biovecteurs cationiques Les noyaux polysaccharidiques cationiques décongelés sont dilués avec de l'eau osmosée dans un réceptacle en verre dans la proportion de 1 mg de NPS/ 1 ml d'eau. La dispersion est placée dans un premier temps sous agition magnétique (5- 10 minutes) puis homogénéisée (RANNIE Minilab) à 400 bars durant 3 minutes. La dispersion de NPS est placée dans un bain-marie à 80° C.
Les lipides (exemple : mélange de DPPC avec stéarylamine), sous forme de poudre, sont pesés de telle sorte que la masse totale représente, par exemple 30% (p/p) de la masse des NPS (75 mg de lipides pour 250 mg de NPS). Les lipides constitutifs de la membrane sont mélangés et solubilisés avec 2 ml d'éthanol 95% (v/v). Si les lipides chargés représentent, par exemple, 5% (p/p) des lipides totaux, il faut peser 3,75 mg de lipide cationique et 71,25 mg de DPPC.
L'homogénéisateur, est amené à une température de 60° C minimum par circulation d'eau en circuit fermé. Concomitamment, les NPS dispersés à 80° C sont soumis à agitation magnétique et la solution éthanolique de lipide est injectée dans la dispersion de NPS.
L'eau de chauffage de circuit de l'homogénéisateur est évacuée et remplacée par la dispersion "NPS/lipides" à 80° C. Cette nouvelle dispersion est homogénéisée à 450 bars pendant 25 minutes en circuit fermé à 60° C minimum. A l'issue de cette étape, la préparation est introduite dans un ballon en verre puis soumise à basse pression à 60° C pour éliminer l'éthanol resté en solution. Les homéo-biovecteurs cationiques ainsi obtenus sont alors entreposés dans des conditions stériles après filtration sur 0,2 μm.
Exemple 3 : Préparation des homéo-biovecteurs neutres
La préparation des homéo-biovecteurs neutres se déroule en deux étapes principales : (1) la synthèse des noyaux polysaccharidiques (NPS) neutres, (2) l'association de lipides zwittérioniques aux NPS neutres.
1. Synthèse des NPS neutres
500 g de maltodextrines Glucidex (ROQUETTE) sont solubilisés avec 0,880 litres d'eau dans un réacteur thermostaté à 20° C sous agitation. Introduire environ 7 g de NaBH4 et laisser 1 heure sous agitation. 220 ml de NaOH 10 M sont rajoutés puis 30,25 ml d'épichlorydrine (Fluka). Après 12 heures de réaction, diluer le gel avec 8 litres d'eau déminéralisée et neutraliser par ajout d'acide acétique glacial.
LTiydrogel obtenu est broyé par l'intermédiaire d'un homogénéisateur à haute pression (RANNIE Lab). La pression exercée est de 400 bars. A l'issue de cette étape, les matrices dispersées ont un diamètre moyen de 60 nm. La purification s'opère par des étapes successi es de ( 1) microfiltration 0,45 μm pour éliminer les particules de taille trop importante, (2) diafiltration à volume constant pour éliminer les petites molécules (sels, fragments polysaccharidiques).
Enfin, les NPS sont concentrés, récupérés dans des flacons stériles et conservés à -20° C.
2. Synthèse des homéo-biovecteurs neutres
Les noyaux polysaccharidiques neutres décongelés sont dilués avec de l'eau osmosée dans un réceptacle en verre (250 mg NPS / 250 ml). La dispersion est placée dans un premier temps sous agitation magnétique (5- 10 minutes) puis homogénéisée (RANNIE Minilab) à 400 bars durant 3 minutes. La dispsersion de NPS est placée dans un bain- marie à 80° C.
Les lipides (exemple : DPPC), sous forme de poudre, sont pesés de telle sorte que la masse totale représente, par exemple, 30% (p/p) de la masse des NPS. Les lipides constitutifs de la membrane sont solubilisés avec 2 ml d'éthanol 95% (p/p).
L'homogénéisateur est amené à une température de 60° C minimum par circulation d'eau en circuit fermé.
Les NPS dispersés à 80° C sont soumis à agitation magnétique et la solution éthanolique de lipide est injectée dans la dispersion de NPS.
L'eau de chauffage de circuit de l'homogénéisateur est remplacée par la dispersion "NPS/lipides" à 80° C. Cette nouvelle dispersion est homogénéisée à 450 bars pendant 25 minutes en circuit fermé à 60° C minimum. A l'issue de cette étape, la préparation est introduite dans un ballon en verre puis soumise à basse pression à 60° C pour éliminer l'éthanol resté en solution.
Les homéo-biovecteurs neutres ainsi obtenus sont alors entreposés dans des conditions stériles après filtration sur 0,2 μm.
Exemple 4: Caractérisation des vecteurs particulaires
Les homéo-biovecteurs ont été caractérisés par : - l'association des noyaux polysaccharidiques (NPS) avec les molécules de lipide
- l'organisation des lipides (associés aux NPS) entre eux
- la couche lipidique entourant les NPS. Cet édifice supramoléculaire possède des propriétés remarquables de stabilité dans le temps.
1. Matériel et Méthodes
Les vecteurs particulaires anioniques et cationiques sont préparés selon la technique décrite dans les exemples 1 et 2.
Les liposomes ont été préparés par injection d'une solution éthanolique de lipides dans de l'eau comme décrit dans Batzri et al (Biochem. Biophys. Acta, 1973, 298, 1015- 1019) et Kremer et al (Biochemistry, 1977, 16, 3932-3935). Tous les échantillons préparés sont stockés dans des tubes stériles après filtration stérilisante sur 0,2 μm.
1.1. Détermination de la taille des nanoparticules
Le diamètre moyen des noyaux polysaccharidiques, des liposomes et des vecteurs particulaires est déterminé par un analyseur de nanoparticules Coulter N4MD (Coultronics, Margency, France). Les mesures ont été effectuées en triple, à une température de 25° C, après dilution de l'échantillon dans du PBS 50 mM.
1.2. Marquage fluorescent des biovecteurs
Le marquage du noyau polysaccharidique par la fluorescéine a été effectué par addition de 10 mg d'une solution aqueuse de DTAF (5([4,6- dichlorotriazine-2λL]amino)fluorescence 2 mg/ml) à 100 mg de particules polysaccharidiques à pH 10, sous agitation magnétique. Après 2 heures à température ambiante, le mélange réactionnel est lavé par ultrafiltration, d'abord avec NaCl 1 M puis de l'eau déminéralisée jusqu'à ce qu'on ne puisse plus détecter de fluorescéine dans l'ultrafiltrat. Les noyaux polysaccharidiques marqués à la fluorescéine ( 1 mg/ml) sont ensuite stockés dans des tubes stériles après filtration stérilisante sur 0,2 μm. Le marquage des couches de phospholipides avec DPH ( 1 ,6- diphényl- l,3,5-hexatriène) est effectué en ajoutant la sonde ( 10 3 M dans du tétrahydrofurane) à des suspensions aqueuses d'homéo biovecteurs ou de liposomes. La température est maintenue à 60° C pendant 30 minutes. Le rapport final en DPH aux phospholipides est de _ 0,5%.
Pour le double marquage des homéo-biovecteurs par la fluorescéine et le DPH, des homéo-biovecteurs ont d'abord été préparés avec des noyaux polysaccharidiques marqués à la fluorescéine puis la couche lipidique externe a été marquée au DPH comme décrit ci-dessus. Toutes les préparations fluorescentes ont été conservées dans l'obscurité.
1.3. Spectroscopie de fluorescence
L'excitation de fluorescence et le spectre d'émission ont été enregistrés avec un spectrofluorimètre SLM-Aminco, Modèle 500. Dans ces expériences, de même que dans l'expérience de polarisation de fluorescence décrite plus bas, l'absorbance des suspensions d'homéo- biovecteurs et de liposome n'était jamais supérieure à 0, 1. Pour le spectre d'émission de fluorescence, la longeur d'onde était de 360 nm pour DPH et 490 nm pour la fluorescéine. Pour le spectre d'excitation, la longueur d'onde d'émission était de 426 nm pour DPH et 522 nm pour la fluorescéine.
1.4. Polarisation de fluorescence Les expériences ont été effectuées sur un appareil automatique formaté relié à un microordinateur. 1.5. Expériences d'extinction de fluorescence
Les homéo-biovecteurs ou les liposomes ont été préparés avec du DPPC ( l,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine) additionné de NBD-PC ( l-acyl-2- [ 12-[(7-nitro-2- l ,3-benzoxadiazole-4- yl)amino]dodécanoyle]-sn-glycéro-3-phosphocholine, (2 mol %), et dispersés dans NaCl 1,5 M. Des aliquots de suspension dTioméo- biovecteur ou de liposome ont été mis dans une cuve en quartz (concentration phospholipide : 27,2 μM) et la fluorescence a été mesurée pour donner la valeur Fo. Puis un volume donné de solution d'extinction C0CI2 (0,3 M dans l'eau) est ajouté afin d'obtenir la concentration souhaitée. Les réactifs sont mélangés pendant 15 secondes et la fluorescence est mesurée immédiatement pour donner la valeur Fi. L'efficacité d'extinction est calculée comme ( l-Fι/Fo)xlOO. Les longueurs d'onde d'excitation et d'émission étaient respectivement de 474 nm et de 535 nm, et la température de 20° C.
1.6. Séparation isopycnique sur gradients de saccharose
Les gradients de saccharose ont été préparés en faisant fondre 9 ml de solution de saccharose à 20% (p/p) à température ambiante. 1 ml de l'échantillon est déposé en haut du tube et on effectue une centrifugation 4 heures à 250 000 g, 8° C. Après centrifugation des fractions de 0,5 ml sont récoltées du haut au fond du tube avec une pipette et analysées en spectroscopie de fluorescence.
2. Résultats
2.1. Association des noyaux polysaccharidiques (NPS) avec les phospholipides Comme le montre la figure 1A, les NPS dépourvu s de lipide
( Img/ml) sédimentent sur une large zone du gradient de densité (de 2 à 20%, saccharose, avec une apogée à 7%) indiquant une hétérogénéité de densité de ces NPS. Les liposomes (0,2mg/ml) sont plus denses et plus homogènes que les NPS (position isopycnique étroite entre 18% et 20%o saccharose). Quant aux biovecteurs (figure 1B), marqués à la fois avec la fluorescéine au niveau du NPS et avec du DPH au niveau de la membrane, ils se positionnent entre 14 et 19% saccharose (apogée à 17%). Les deux fluorophores se retrouvant dans les mêmes fractions, l'association des NPS avec les lipides est ainsi mise en évidence. Elle entraîne une augmentation de la densité et de l'homogénéité des NPS constitutifs.
Des contrôles montrent que la synthèse des Biovecteurs aboutit à un produit pur. En effet, la présence de NPS libres et de liposomes libres n'est pas détectée dans une préparation de biovecteurs. De plus, le mode opératoire appliqué pour synthétiser les biovecteurs permet de faire varier le rapport pondéral lipides/ NPS de 20 à 100% sans provoquer la formation de liposomes.
2.2. Détermination de la taille des homéo-biovecteurs Les mesures réalisées avec les NPS témoins, les liposomes témoins et les homéo-biovecteurs sont rapportées dans le tableau 1.
Il apparaît que la taille des homéo-biovecteurs neutres, cationiques et anioniques dépend de la taille de leur NPS constitutif (exemple : pour un NPS cationique d'environ 80 nm, lTioméo-biovecteur cationique résultant mesure environ 80 nm de diamètre). Par contre, la taille des liposomes témoins est inférieure. Les phospholipides des liposomes s'organisent entre eux de manière à ce que la structure soit thermodynamiquement stable. Le noyau de NPS des homéo-biovecteurs favorise une meilleure stabilité du système lipidique. Tableau 1 : Mesure de la taille des nanoparticules (noyaux polysaccharidiques (NPS), liposomes et homéo-biovecteurs) par dispersion de lumière LASER.
[noyau] = 1 mg/ml ; [lipides] = 0,2 mg/ml ; le rapport pondéral des mélanges lipidiques DPPC/DPPG ou DPPC/SA est de 95/5. Mesures réalisées en PBS 50 mM.
Echantillon Diamètre moyen + écart type (nm)
NPS neutres 42,3 ± 26
Liposomes zwittérioniques (DPPC) 39,4 + 13
Homéo-biovecteurs neutres 32,9 + 09
NPS cationiques 74,7 + 29
Liposomes cationiques (DPPC/SA) 22,3 ± 1 1
Homéo-biovecteurs cationiques 78,5 + 42
NPS anioniques 34,6 + 13
Liposomes anioniques (DPPC/DPPG) 18,5 + 09
Homéo-biovecteurs anioniques 45,4 + 26
(DPPC = dipamitoyl-phosphatidylcholine ; DPPG = dipamitoyl- phosphatidylglycérol ; SA = stéarylamine)
Ces mesures de taille font apparaître une seule population homogène, en corrélation avec les études sur gradient de densité montrant le haut degré de pureté des préparations d 'homéo-biovecteurs Les lipides seuls donnent des suspensions liposomales relativement monodispersées avec une taille moyenne dépendant de la composition de 40 nm et de 20 nm pour le mélange DPPC et DPPC/DPPG respectivement.
2.3. Influence du noyau polysaccharidique sur l'organisation lipidique
Ayant démontré que les lipides sont associés aux NPS, il s'agit de montrer que ces molécules amphiphiles sont organisées entre elles pour former la membrane constitutive des homéo-biovecteurs. Le comportement de phase des lipides permet d'étudier cette organisation. Le comportement de phase de la couronne lipidique organisée autour des NPS est étudié en visualisant la transition de phase gel- liquide des lipides en fonction de la température par la mesure de la dépolarisation de fluorescence de la sonde DPH insérée au sein de la zone hydrophobe membranaire. Les profils obtenus (figure 2) pour les homéo-biovecteurs et les liposomes témoins de même composition lipidique permettent de relever la température de transition de phase gel-liquide (Tm) (tableau 2). Les résultats obtenus permettent de connaître l'influence du NPS et de la composition saline de la phase aqueuse sur l'organisation lipidique. Les transitions de phase gel-liquide des lipides organisés sous forme d'homéo-biovecteurs sont très bien définies. Cette observation s'explique par un fort degré de coopérativité intermoléculaire et donc par un degré d'organisation de la membrane des homéo-biovecteurs tout à fait comparable aux membranes liposomales. Les homéo-biovecteurs neutres et les liposomes témoins sont analysés sur la figure 2A, qui montre un profil caractéristique de la transition de phase du DPPC organisée sous forme de liposome permettant de relever une valeur Tm de 40° C. Les homéo-biovecteurs neutres possèdent une membrane dont la transition de phase est aussi nette que celle des liposomes mais présentant un décalage vers les plus hautes températures. Les homéo-biovecteurs anioniques (figure 2B) ont une transition de phase très marquée et décalée vers des températures plus importantes par rapport aux liposomes témoins.
Les homéo-biovecteurs cationiques (figure 2C) offrent des caractéristiques similaires : l'effet du NPS cationique sur la membrane cationique associée est tel que la transition de phase des lipides est décalée vers les températures supérieures par rapport aux liposomes témoins.
Les homéo-biovecteurs montrent donc une transition de phase supérieure à celle des liposomes témoins. A titre de comparaison, les biovecteurs light constitués d'un NPS cationique et d'une membrane anionique ont une transition de phase inférieure à celle des liposomes témoins (écart de température de -1°C). Dans ce cas, le noyau NPS a un effet sur sa membrane qui est l'inverse de celui du homéo-biovecteur.
Tableau 2 : Températures de transition de phase gel-liquide (Tm) des membranes lipidiques organisées sous la forme de liposomes ou d'homéo-biovecteurs.
[noyau] = 1 mg/ml ; [lipides] = 0,2 mg/ml ; le rapport pondéral des mélanges lipidiques DPPC/DPPG ou DPPC/SA est de 95/5. Mesures réalisées avec 1 ml de nanoparticules dispersées dans l'eau ou dans le PBS.
Tm (° C)
Echantillons Eau PBS
Liposomes zwittérioniques DPPC 40,0 ± 0,2 39,2 + 0,3 Homéo-biovecteurs neutres 40,8 + 0,2 39,8 + 0, 1
Liposomes cationiques DPPC/SA 43,4 + 0, 1 42,8 + 0, 1
Homéo-biovecteurs cationiques 44,9 + 0,2 43,4 + 0, 1
Liposomes anioniques DPPC/DPPG 41, 1 + 0, 1 38,3 + 0,2 homéo-biovecteurs anioniques 44,8 + 0, 1 39, 1 + 0,2
(DPPC = dipamitoyl-phosphatidylcholine ; DPPG = dipamitoyl- phosphatidylglycérol ; SA = stéarylamine)
Le relevé des températures Tm (tableau 2) de chaque système permet de caractériser le décalage de transition de phase.
Ces températures Tm, pour des échantillons dispersés dans l'eau ou en présence d'une force ionique (PBS 50 mM), montrent que les membranes associées aux NPS de charge ionique semblable ont une organisation lipidique telle que l'entassement moléculaire est plus important (Tm des homéo-biovecteurs supérieure à la température des liposomes témoins), quelque soit le type dl oméo-biovecteur.
L'addition de sels dans les dispersions d'homéo-biovecteurs a pour effet de diminuer l'effet du NPS sur l'organisation des lipides entre eux. Cette observation permet de conclure que le NPS a une influence sur l'entassement moléculaire des lipides par l'intermédiaire d'interactions électrostatiques et de type hydrogène avec les têtes polaires des phospholipides.
Ainsi quelque soit le type drioméo-biovecteur envisagé, cette structure supramoléculaire favorise une meilleure organisation membranaire que celle des liposomes entraînant une augmentation du packing moléculaire des lipides entre eux.
2.4. Nombre de bicouches lipidiques entourant le noyau polysaccharidique
Les lipides associés au NPS sont organisés entre eux pour former une membrane. Il s'agit de caractériser la structure de cette membrane. Des expériences d'extinction de fluorescence ont été menées en utilisant une sonde NBD-PC, pour laquelle on a montré que le groupe NBD est localisé dans la région glycérophosphate de la bicouche lipidique. Les ions cobalt ont été utilisés comme extincteurs de fluorescence. Les biovecteurs ont été préparés en présence de NaCl 1,5 M, pour éviter des modifications trop importantes de concentration en ions après addition de l'extincteur dans la phase aqueuse. Les courbes de fluorescence obtenues respectivement pour les liposomes DPPC et les biovecteurs anioniques DPPC sont montrées sur la figure 3. Les modifications de la courbe sont détectées aux alentours de 50%-55% d'extinction. Le fait que les sondes moléculaires localisées dans la couche lipidique externe soient les premières affectées, suggère que les homéo-biovecteurs aussi bien que les liposomes DPPC sont composés d'une bicouche lipidique unique. En conséquence, pour un calcul sur la base d'une épaisseur de la bicouche de 5,5 nm et d'une surface moléculaire de 0,47 nm2 dans la phase gel, indique que pour des vésicules unilamellaires de 40 nm et 80 nm de diamètre, environ 65% et 55% des molécules lipidiques respectivement sont présentes dans la couche externe.
2.5. Stabilité dans le temps des homéo-biovecteurs
La structure particulière des homéo-biovecteurs (nanoparticules constituées d'une membrane lipidique organisée en une bicouche et supportée par un NPS sous-jacent de charge semblable est-elle stable dans le temps ?
La stabilité de la taille nanoparticulaire est suivie à des intervalles de temps réguliers pour des préparations conservées stérilement à 4° C. Les mesures sont rapportées dans le tableau 3. Aucun changement de taille significatif des homéo-biovecteurs anioniques et des homéo-biovecteurs cationiques n'est détecté pendant plus de 9 mois.
Ces structures possèdent une remarquable stabilité dans le temps.
Tableau 3 : Stabilité dans le temps de la taille des nanoparticules (liposomes et homéo-biovecteurs) à 4° C.
[noyau] = 1 mg/ml ; [lipides] = 0,2 mg/ml ; le rapport pondéral des mélanges lipidiques DPPC/DPPG ou DPPC/SA est de 95/5.
Mesure réalisée en PBS 50 mM.
Diamètre moyen + écart type (nm)
Echantillon 24 h 1 mois 3 mois 6 mois 9 mois 12 mois
Liposomes cationiques (DPPC/SA) 22,3 + 1 1 28,3 + 08 25,0 + 09 Aggr. Aggr. Aggr. Homéo-biovecteurs cationiques 78,5 ± 42 76,2 + 1 1 82, 1 + 15 77,0 + 25 77,2 + 67 Aggr.
Liposomes anioniques (DPPC/DPPG) 18,5 + 09 22,3 + 0,9 Aggr. Aggr. Aggr. Aggr. Homéo-biovecteurs anioniques 45,4 + 26 52,3 + 1 1 48,2 + 0,8 55,0 + 22 42, 1 + 15 49,2 + 12
(DPPC = dipamitoyl-phosphatidylcholine ; DPPG = dipamitoyl-phosphatidylglycérol ; SA = stéarylamine) (Aggr. = aggrégation).
EXEMPLE 5: Association d'homéobiovecteur cationique avec de l'ADN
1. Préparation des homéobiovecteurs cationiques: On utilise des homéobiovecteurs cationiques préparés comme dans l'exemple 2, mais ici les lipides constitutifs de la membrane sont un mélange de DPPC (dipalmitoyl phosphatidylcholine), DOTAP (dioleyloxypropyl trimethylammonium) et cholestérol selon un rapport pondéral de 35/35/30, le lipide chargé positivement étant le DOTAP. Les lipides ont une masse totale représentant 30% en poids de la masse des NPS. Le noyau cationique a une charge globale de 0,8 mEq/g NPS sec et un diamètre moyen de 1 10 nm.
L'homéobiovecteur cationique complet obtenu a un diamètre moyen de 130 nm.
2. Préparation de l'ADN
L'ADN utilisé est de l'ADN plasmidique de 6,7 kb (plasmide 1633). Il est conditionné en PBS et stocké à 4°C.
3. Préparation de l'association biovecteur/ADN
Dans un tube à essai, on mélange un volume de solution d'ADN dont la concentration est calculée en fonction du rapport ADN/NPS que l'on veut obtenir ( 1 , 1 à 5,5 % par exemple) et un volume de dispersion d'homéobiovecteur à 1,8 mg/ml en PBS. Par exemple, pour obtenir un rapport ADN/NPS égal à 5,5%, on mélangera un volume d'homéobiovecteur cationique à 1 ,8 mg/ml avec un volume d'ADN à lOOμg/ml en PBS. On maintient le mélange 1 heure sous agitation magnétique et l'on entrepose à 4°C.
4. Caractérisation des formulations biovecteur homéochargé/ADN
Les paramètres mesurés pour caractériser les préparations biovecteurs/ADN sont résumés dans le tableau 4 ci-après. TABLEAU 4
(dppc = dipamitoyl-phosphatidylcholine ; dotap = dioleyloxypropyl trimethylammonium)
Caractéristiques physicochimiques des homéobiovecteurs et des préparations homéobiovecteur/ADN
5. Résultats
- la taille des nanoparticules résultantes permet de vérifier qu'il n'y a pas d'agrégation (la technique utilisée est le light scattering). Le mode de formulation permet une dispersion homogène nanoparticulaire.
- le taux d'association de l'ADN sur les biovecteurs homéochargés (déterminé par séparation isopycnique sur gradient de densité saccharose et électrophorèse sur gel d'agarose 1%) est supérieur à 95 %. - les homéobiovecteurs favorisent une association spontanée avec l'ADN par interactions électrostatiques sans apport d'énergie extérieure.
Il est remarquable de constater que les formulations "biovecteur homéochargé/ADN" soumise à un champ électrique durant l'électrophorèse sur gel d'agarose conservent leur ADN associé. En effet aucun ADN libre n'est détectable à l'issue de l'électrophorèse. Les interactions entre ADN et homéobiovecteurs cationiques sont très stables. Par ailleurs, on a testé la conservation de la structure de l'ADN après formulation: l'ADN associé aux biovecteurs est libéré par compétition ionique. On l'analyse par électrophorèse sur gel d'agarose 1%, on constate que l'ADN a bien conservé sa structure plasmidique. Le procédé de formulation utilisé permet donc le maintien de l'intégrité structurale de l'ADN. LEGENDE DES FIGURES
Figure 2
LIPOSOMES 7WITTÉRI0NI0LΕS O HOMÉO-BIOVECTEURS NEUTRES α
LIPOSOMES ANIONIQUES * HOMÉO-BIOVECTEURS ANTONIOUESΘ
LIPOSOMES CATIONIQUES o HOMÉO-BIOVECTEURS CATIONIQUES a

Claims

REVENDICATIONS
1. Vecteur particulaire comprenant : - un noyau hydrophile non liquide un feuillet amphiphile caractérisé en ce que le noyau porte une charge globale cationique, anionique ou neutre et en ce que le feuillet amphiphile porte une charge globale de même polarité que celle portée par le noyau.
2. Vecteur particulaire selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il contient en outre au moins un principe actif, associé au noyau et/ou au feuillet amphiphile.
3 .Vecteur particulaire selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comporte au moins : - un noyau hydrophile non liquide portant une charge cationique ou anionique, de même polarité que celle portée par le noyau.
4. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comporte : un noyau hydrophile non liquide, neutre électriquement - un feuillet amphiphile globalement neutre, comprenant des phospholipides zwittérioniques.
5. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'au moins un constituant du feuillet amphiphile est choisi dans le groupe constitué par les phospholipides anioniques, cationiques ou zwittérioniques, naturels ou synthétiques, les céramides, les acides gras, les stéroïdes, les lipides, les glycolipides, les lipoprotéines et les tensioactifs, portant une charge de même polarité que celle du noyau.
6. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la proportion de constituants du feuillet amphiphile portant une charge de même polarité que celle du noyau est supérieure à 0% et inférieure ou égale à 100%).
7. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le noyau est constitué de composés choisis parmi les oligomères et les polymères hydrophiles, naturellement ou chimiquement réticulés.
8. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le noyau est constitué de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, portant une charge cationique ou anionique.
9. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le noyau comprend des constituants choisis parmi : le dextrane, l'amidon, la cellulose, leurs dérivés substitués, leurs produits d'hydrolyse, les sels et les esters de ces composés.
10. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que des ligands ioniques, acides ou basiques sont fixés sur le noyau.
1 1. Vecteur particulaire selon la revendication 10, caractérisé en ce que les ligands ioniques portent au moins une fonction choisie dans le groupe comprenant : phosphates, sulfates, acides carboxyliques, ammonium quaternaire, aminés primaires, aminés secondaires.
12. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 1 à 1 1 , caractérisé en ce qu'au moins un constituant du feuillet amphiphile est choisi parmi la phosphatidylcholine, la phosphatidyléthanolamine, la phosphatidylserine, le phosphatidylglycérol, le cholestérol, et leurs dérivés.
13. Vecteur selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'au moins un constituant du feuillet amphiphile est choisi parmi le dipalmitoyl phosphatidylcholine, le dimyristoyl phosphatidylglycérol, le dipalmitoyl phosphatidylglycérol, le distéaroyl phosphatidylglycérol, le dioleoyl phosphatidylglycérol, le dioleyloxypropyl trimethylammonium, le dimyristoyl acide phosphatidique, le dipalmitoyl acide phosphatidique, le dipalmitoyl phosphatidylserine et la stéarylamine.
14. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que le feuillet amphiphile comprend au moins deux composés lipidiques différents.
15. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que le feuillet amphiphile est directement associé au noyau.
16. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que son diamètre moyen est compris entre environ 10 nm et 100 μm.
17. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 2 à 16, caractérisé en ce que le principe actif porte également une charge globale, ou est lipophile
18. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 2 à 17, caractérisé en ce qu'au moins un principe actif est choisi parmi les peptides, les protéines, les lipoprotéines, les protéoglycanes, les lipopolysaccharides, les acides gras, les triglycérides, les phospholipides, les glycolipides, les stéroïdes, les oligosaccharides, les séquences nucléotidiques, les séquences nucléosidiques, les acides nucléiques, les vitamines et les porphyrines.
19. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 2 à 18, caractérisé en ce qu'au moins un principe actif est choisi dans le groupe suivant : les antibiotiques, les antiseptiques, les analgésiques, les anesthésiants, les antiinflammatoires, les antiviraux, les anticancéreux, les immunomodulateurs et les médiateurs cellulaires, les antihistaminiques, les antimuscariniques, les agents anti-anémiants, les agents hémostatiques, les anti-diabétiques, les agents cardio- vasculaires, les anti-dépresseurs, les anti-épileptiques, les anxiolytiques, les hypnotiques, les sédatifs, les antipsychotiques, les agents anorexigènes, les vaccins, les hormones naturelles ou synthétiques et leurs dérivés, les insecticides, les fongicides, les antimalariques, les antiasthmatiques, les anticorps, les antigènes et leurs fragments, les agents de diagnostic, les agents de diagnostic RMN, et les marqueurs radioactifs .
20. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient un vecteur particulaire selon l'une des revendications 1 à 19.
21. Composition cosmétique, caractérisée en ce qu'elle contient un vecteur particulaire selon l'une des revendications 1 à 19 et des excipients cosmétologiquement acceptables.
22. Additif alimentaire caractérisé en ce qu'il comprend un vecteur particulaire selon l'une des revendications 1 à 19.
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