WO2005030170A2 - Rupture controlee de liposomes furtifs - Google Patents

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WO2005030170A2
WO2005030170A2 PCT/FR2004/002435 FR2004002435W WO2005030170A2 WO 2005030170 A2 WO2005030170 A2 WO 2005030170A2 FR 2004002435 W FR2004002435 W FR 2004002435W WO 2005030170 A2 WO2005030170 A2 WO 2005030170A2
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Carlos Marques
André SCHRÖDER
Nathalie Fa
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Universite Louis Pasteur
Centre National De La Recherche Scientifique Cnrs
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers

Definitions

  • the invention relates to a method which allows the rupture of the membrane of a biocompatible liposome, often called a stealth liposome, to be triggered in a controlled manner, thereby releasing the content of the liposome in its environment.
  • the trigger is a bio-compatible molecule.
  • the triggering agent is ⁇ -cyclodextrin.
  • the invention relates in particular to the use of this "in vivo" process, in the therapeutic, diagnostic, experimental, cosmetic and agro-food fields.
  • Liposomes are self-assembled capsules, in a bilayer or in a stack of bilayers, of amphiphilic molecules. These molecules can be natural molecules, for example phospholipids, or chemically synthesized molecules. In living organisms, the phospholipid bilayers constitute the cell walls, and are also present in the cell (Golgi apparatus, vesicles used for intra-cellular transport for example). These membranes integrate many specific molecules with multiple functions: communication between the media arranged on either side of the membrane, recognition, adhesion, etc. Industrial applications are increasingly using capsules of lipid bilayers, called liposomes or vesicles, for example in cosmetics or in pharmacies.
  • liposomes In these fields, current research aims to optimize the functionality of liposomes as a vector for active substances in the body. Thus, these liposomes must be not only bio-compatible, but also stealthy, that is to say that they must be able to circulate in the host organism without being destroyed by the immune defenses. Making a liposome stealth requires modifying its surface properties, usually by incorporating specific molecules into the membrane. These molecules can be natural amphiphilic molecules, chemically modified phospholipids, or even copolymers. For example, by incorporating gangliosides into the liposome membrane, T.
  • the chemical entity which comprises this polymer chain can be either a copolymer, for example diblock or triblock, the hydrophobic part of which is inserted at the heart of the membrane (Kostarelos et al. 1999), or a phospholipid chemically modified by grafting de0 this hydrophilic polymer chain.
  • the liposomes incorporating a fraction of phospholipid modified by grafting a PEG chain (PEG-lipid) represent the stealth liposomes most widely used to date in the field of therapeutic applications. There are numerous clinical studies in the literature concerning the use of liposomes as vectors allowing a slow release of the active ingredients which they contain (Allen & Chonn, 1987; Hong et al, 1999).
  • the liposome When the liposome reaches the target area (the tumor), the membrane transits from the gel state in the liquid state, and the liposome releases part of its content. These liposomes have been tested “in vitro” as well as “in vivo”. Also, it has been proposed to use the ultrasonic waves emitted by an ultrasound device, in order to destroy liposomes previously located in a target area (Bednarski et al, 1997). The direct destruction of liposomes by ultrasound can however be harmful for healthy tissue, because of the high energy required.
  • the inventors have developed a new approach for the controlled release of an active agent or for the controlled rupture of liposomes in vivo based on the administration of a biocompatible compound.
  • the inventors have discovered that, when these liposomes are placed in the presence of a known biocompatible molecule, ⁇ -cyclodextrin, the rupture of the membrane and therefore the release of the contents of the capsule are activated in a rapid and controllable manner.
  • the invention relates to a method for the controlled release of an active agent in a mammal, comprising the administration to said mammal of a liposome containing said active agent, the liposome being decorated with hydrophilic polymer chains and the method further comprising administering to said mammal a biocompatible compound complexing with said polymer and modifying the conformation and / or the structure thereof, the administration of said compound inducing destabilization of the liposome in vivo and release of the active agent in the mammal.
  • decorated with hydrophilic polymer chains is meant that the liposome exposes hydrophilic polymer chains on its surface.
  • the hydrophilic polymer chains can be inserted into the heart of the membrane via a hydrophobic part or by grafting onto a lipid.
  • the liposome is decorated with hydrophilic polymer chains by incorporating into its composition at least one lipid modified by grafting a hydrophilic polymer chain, more particularly a poly (ethylene glycol) (PEG) chain. -lipid).
  • the invention relates to a method of destroying a liposome in vivo comprising the administration of a liposome being decorated with chains of hydrophilic polymer, and the administration of a biocompatible compound complexing with said polymer and modifying the conformation and or the structure thereof, the administration of said compound inducing destruction of the liposome in vivo.
  • the liposome is decorated with hydrophilic polymer chains by incorporating into its composition at least one lipid modified by grafting a hydrophilic polymer chain, more particularly a poly (ethylene glycol) (PEG) chain. -lipid).
  • the invention relates to a kit, product or composition comprising the following two products for a simultaneous, separate or spaced use (or administration) over time: a liposome containing an active agent, the liposome being decorated with polymer chains hydrophilic; and a biocompatible compound complexing with said polymer and modifying the conformation and / or the structure thereof, said compound inducing destabilization of the liposome in vivo and release of the active agent.
  • the liposome is decorated with hydrophilic polymer chains by incorporating into its composition at least one lipid modified by grafting a hydrophilic polymer chain, more particularly a poly (ethylene glycol) chain (PEG-lipid).
  • a hydrophilic polymer chain more particularly a poly (ethylene glycol) chain (PEG-lipid).
  • the separate administration of the two products can be simultaneous or consecutive (sequential).
  • administration of the liposome precedes administration of the biocompatible compound. Repeated administrations can also be carried out.
  • the invention also relates to the use of a biocompatible compound complexing with the hydrophilic polymer part of a lipid modified by grafting of said polymer, and modifying the conformation and / or the structure thereof for the controlled release of a active agent contained in a liposome comprising in its composition this modified lipid.
  • the invention further relates to the use of a biocompatible compound complexing with the hydrophilic polymer part of a lipid modified by grafting of said polymer, and modifying the conformation and / or the structure thereof for the destruction of a liposome comprising in its composition this modified lipid.
  • the invention finally relates to the use of a liposome containing an active agent, the liposome comprising in its composition a lipid modified by grafting a hydrophilic polymer and a biocompatible compound complexing with said polymer and modifying the conformation and / or the structure thereof, said compound inducing destabilization of the liposome in vivo and a controlled release of the active agent for the preparation of a medicament.
  • the methods, uses or products according to the present invention can be used in the therapeutic, diagnostic, experimental, cosmetic and agro-food fields.
  • Figure 1 a) section of a phospholipid liposome. b) two-dimensional section of the membrane of a stealth liposome comprising a fraction of liposome modified by grafting a hydrophilic polymer chain, c) two-dimensional section of the membrane of a stealth liposome comprising a fraction of diblock copolymers and triblocks, of respective structures [hydrophobic-hydrophilic] and [hydrophilic-hydrophobic-hydrophilic].
  • Figure 2 Reproduction of a photograph under an optical microscope of a giant vesicle of DOPC.
  • Figure 4 Evolution of the size of a giant vesicle comprising PEG-lipids, in the presence of ⁇ -cyclodextrin over time.
  • Figure 5 Rate of disappearance of the vesicles over time as a function of the concentration of ⁇ -cyclodextrin:: 5 mM; : 7 mM; •: 8 mM; : 9 mM.
  • Figure 6 Asymmetric complexation of the polymer chains anchored on the membrane by the cyclodextrin molecules: a) stealth liposome membrane in the absence of cyclodextrin, b) this same membrane exposed to cyclodextrin.
  • Figure 7 Asymmetry of the pressure forces due to the polymer on either side of the membrane: a) the fluctuations of the polymer generate a pressure force on the membrane; b) when the POE chain is complexed by cyclodextrin, it straightens and exerts less pressure, which causes a local curvature of the membrane.
  • Figure 8 Illustration of the results of a UV-visible spectroscopy experiment representing the transmission of the sample at the wavelength of calcein (relative to the baseline) as a function of the time elapsed since the introduction of the ⁇ -cyclodextrin (concentration 10 mM).
  • the present invention relates to a new mode of rupture of so-called "stealth” liposomes, capable of being used as vectors of active molecules in the organism.
  • a liposome is a capsule made up of a self-assembled membrane of amphiphilic molecules. In the case of biocompatible liposomes, this membrane is most often composed of phospholipids, directly extracted from biological cells, or else synthesized by chemical means, identical to natural phospholipids.
  • So-called "stealth” liposomes have the particularity that they can circulate in the body for a relatively long time, without being eliminated by the immune defenses. In a preferred embodiment of the present invention, this property is due to the presence on the surface of a hydrophilic polymer chain.
  • hydrophilic polymer chain is due to the presence in the membrane of phospholipids modified by chemical grafting of a hydrophilic polymer chain.
  • This polymer is generally grafted on the polar head of an amphipatic lipid.
  • This hydrophilic polymer is preferably a polyalkylether.
  • said polymer is a polyethylene glycol, a parent homopolymer such as polymethylethylene glycol, polyhydroxypropylene glycol, polypropylene glycol, polymethylpropylene glycol, and polyhydroxypropyleneoxide, or a heteropolymer of small alkoxy monomers such as polyethylene / polypropylene glycol.
  • This polymer preferably has a molecular weight of between 120 and 20,000 daltons.
  • the polymer is a polyethylene glycol PEG, more particularly polyethylene glycol from 1000 to 5000 daltons, and the molar fraction of modified phospholipid (PEG-lipid) is between 0.1% and 10%.
  • the polymer can also be selected from the following group: polyvinylpyrrolidone, polyvinylmethylether, polyhydroxypropylmethacrylate, polyhydroxypropylmethacrylamide, polyhydroxyethylacrylate, polymethacrylamide, polydimethylacrylamide, polymethyloxazoline, polyethyloxazoline, polyhydroxyethylazin, polyhydroxyethylazin
  • the polymer is grafted onto one of the amphipatic lipids included in the liposome, among which there are for example phospholipids such as phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidic acid (PA), phosphatidylinositol (PI), and sphingomyelin, but the polymer can also, in another configuration, be one of the components of a block co-polymer, which inserts into the membrane thanks to the affinity of at least one of its blocks with the hydrophobic part of the membrane.
  • phospholipids such as
  • liposome This type of liposome is marketed by various companies, or has been the subject of patent applications.
  • ALZA Corporation's markets liposomes stabilized by PEG chains, and containing various anticancer agents, under the name of "STEALTH® liposomal technology".
  • Doxil® and Caelyx® are registered names, referring to stealth liposomes incorporating a specific drug.
  • the liposomes considered in the present invention may also have the capacity to target particular tissues, more particularly pathological tissues due to their lipid composition and / or the presence of elements targeting introduced into their structure. For example, they can contain molecules that bind to a ligand present on the surface of cells. A diagram of these liposomes is given in Figure lb and the.
  • the modification of conformation and / or structure of the polymer by said compound results in a difference or an asymmetry between the inside and the outside of the liposome which destabilizes the lipid wall.
  • said compound can cause a stiffening of the polymer, the latter unfolding.
  • the compound is preferably a cyclodextrin, or any derivative of a cyclodextrin.
  • the cyclodextrin can be ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, and ⁇ -cyclodextrin.
  • cyclodextrin derivatives There are many cyclodextrin derivatives; they are obtained from various chemical reactions between a cyclodextrin and another compound, for example “Trypsin-cyclodextrin” (Villalonga et al., 2003), or alternatively hydroxypropyl- ⁇ beta> -cyclodextrin (Imaili et al., 2003) .
  • Polymers bearing a large number of cyclodextrins grafted in lateral configuration (in a comb) have even been synthesized, for example a poly ( ⁇ -lysine) - ⁇ -cyclodextrin chain (Huh 2002).
  • any cyclodextrin derivative and any complex molecule integrating a cyclodextrin may be suitable in the present invention, if it is biocompatible.
  • the compound is ⁇ -cyclodextrin.
  • said compound can remove the polymer from the modified lipid.
  • said compound can aggregate with the water-soluble polymer chains which decorate the liposome, thus greatly modifying their spatial conformation and therefore inducing the destabilization of the liposome. Such aggregates of polymers are for example obtained when two polymers charged with opposite net charges are brought into contact.
  • polymer chains can also aggregate if there are hydrogen interactions between them; thus it has been shown that a PEO chain aggregates with various polypeptides, for example poly (Glu, Tyr) (1: 1) (Lu et al., 2002), as well as with proteins: with the pepsin (Xia et al., 1993) and with albumin (Azegami et al., 1999) for example.
  • the hydrophilic polymer is polyethylene glycol and the biocompatible compound is ⁇ -cyclodextrin.
  • the compound must be biocompatible. That is to say, it should not cause any significant side or unwanted effects when administered.
  • Cyclodextrins were first isolated in 1891, but it was not until 1904 that their cyclic structure was identified. They are the result of the degradation of starch by an enzyme, glycosyl transferase, produced by a bacterium (Bacillus macerates). In this process, the breakdown of the starch molecule is followed by intramolecular cyclization. Cyclodextrins are therefore oligosaccharides consisting of 6, 7 or 8 glucose molecules assembled in a cycle called respectively ⁇ , ⁇ , and ⁇ .
  • Each cycle is in "chair” conformation, which gives the whole molecule a truncated cone shape where the primary hydroxyl groups form the narrow base, and the secondary hydroxyl groups form the broad base.
  • This cone shape allows the cyclodextrin to associate with a non-polar molecule or molecular group: the molecule or molecular group is placed in the cavity of the cyclodextrin.
  • the hydroxyl groups at the ends of the molecule make it water-soluble.
  • the internal and external faces of the cone are made up of CH groups, which makes the interior of the cone less polar.
  • the cyclodextrins are stable in basic medium, but placed in an acidic medium, they are degraded and give glucose. Cyclodextrins are not toxic below a certain concentration.
  • ⁇ -cyclodextrins have the lowest toxicity threshold (5mM), and ⁇ -cyclodextrins the highest threshold (30mM).
  • the cyclodextrins can modify certain properties of the molecules which they complex by an increase in their solubility, their stabilization, or a reduction in their volatility ...
  • cyclodextrins molecules very interesting in the food and pharmaceutical industry where they are used to stabilize additives such as colors, flavors, odors, flavor enhancers, etc.
  • the three-dimensional form of cyclodextrins allows them to combine, forming complex but thermodynamically stable structures.
  • cyclodextrin In the case of rotaxanes, cyclodextrin is free to rotate around the molecule which crosses it: there is no covalent bond.
  • catenans two cyclic molecules are linked together by weak interactions. The inclusion of molecules in the cyclodextrin cavity depends mainly on their hydrophobic interactions.
  • the hydrophilic polymer is polyethylene glycol and the biocompatible compound is ⁇ -cyclodextrin.
  • the active agent contained in the liposomes can be any compound suitable for transport in liposomes.
  • the active agent can be, in a non-exhaustive manner, a peptide or a protein, such as a hormone, an enzyme, an enzyme inhibitor, a lipoprotein; a nucleic acid such as an RNAi, an antisense oligonucleotide, a messenger RNA, a cDNA; a carbohydrate or a lipid; a chemical compound, such as a drug.
  • the active agent has a therapeutic effect, but can also provide an odor, a flavor, or any other useful supplement in the food industry.
  • the liposome and the compound can be administered by any suitable means well known to those skilled in the art.
  • the compounds are administered parenterally such as subcutaneously, intravenously, or intramuscularly.
  • this compound will preferably be administered in the following quantity range: 0.1 mM to 10 mM.
  • ⁇ -cyclodextrin will preferably be administered in the following quantity range: O.lmM to 5mM.
  • the ⁇ -cyclodextrin will preferably be administered in the following quantity range: O.lmM to 30mM.
  • the maximum concentration of cyclodextrin corresponds to its toxicity threshold.
  • the maximum injectable concentration varies as a function of the compound, and remains given by the toxicity threshold of the molecule, the minimum concentration being O.lmM.
  • the rupture of the liposomes and, consequently, the release of the active agent can be controlled by the amount of compound complexing with said polymer. The greater the amount of compound, the faster the release of the agent contained in the liposomes.
  • the stealth liposomes are made from di-octadecyl-phosphatidil-choline (DOPC) and DOPE (di-octadecyl-phosphatidil-ethanolamine) modified by grafting of PEG molecules (supplier: AVANTI).
  • DOPC di-octadecyl-phosphatidil-choline
  • DOPE di-octadecyl-phosphatidil-ethanolamine
  • PEG molecules supplier: AVANTI
  • the liposomes are dispersed in an aqueous glucose solution where they have a stability of the order of several tens of hours.
  • An iso-osmotic solution of ⁇ -cyclodextrin, a known biocompatible molecule is then added to this solution.
  • a destabilization of the liposomes is then observed, which results in a release of the content of the liposome in the solution.
  • Liposomes were produced by the known technique of electroforming (Angelova & Dimitrov, 1986). Vesicles containing molar fractions of 99.5% DOPC and 0.5% modified DOPE (PEG-lipid) were made in 0.05M sucrose solution. They were then transferred to the observation cell which contained 0.0502M of Glucose. The difference in density between Glucose and Sucrose causes the vesicles to settle, allowing easy observation under the microscope. The above molar concentrations are iso-osmotic, which does not cause any change in the volume of the vesicle over time. A certain amount of iso-osmotic solution is then added to the previous solution, containing ⁇ -cyclodextrin and Glucose.
  • the inventors produced multi-lamellar liposomes with a diameter of less than 1 micrometer containing molar fractions of 99.0% of DOPC and 1.0% of modified DOPE (PEG-lipid). These vesicles are obtained by simple hydration of a phospholipid film deposited on a glass surface. Their observation under an optical microscope being impossible, another measurement protocol was chosen. The vesicles were made so as to encapsulate a dye, calcein, at a concentration of 1%. The inventors have verified that these vesicles do not release their contents under normal conditions of storage in a glucose solution.
  • a stock solution containing 1 mg / ml of vesicles, was divided into 4 daughter solutions of 0.25mg / ml concentration. To each of these solutions was added 1 ml of iso-osmotic solution containing Glucose and ⁇ -cyclodextrin, as before. After a time t, different for each of these solutions, each solution was centrifuged and the supernatant extracted, then filtered, with a 200nm filter, not allowing the passage of any vesicle. This supernatant was then analyzed by UV-visible spectroscopy technique, in order to determine the amount of calcein contained in this supernatant.
  • the quantity of calcein measured represents the rate of calcein released by the vesicles.
  • Figure 8 reports this rate, as a function of the time elapsed since the addition of ⁇ -cyclodextrin in the solution. It is found that the amount of calcein released by the vesicles increases over time.
  • the modulus of curvature of these vesicles was measured.
  • the value obtained, 35 keT, is very different from that corresponding to vesicles of pure DOPC (22 k B T).
  • About 100 ⁇ l of the solution containing the giant vesicles were transferred to a small observation cell consisting of a slide and a microscope slide separated by a silicone spacer. This cell was previously filled with a mixed solution of glucose and ⁇ -cyclodextrin. This solution is iso-osmolar to the sucrose solution which contains the vesicles.
  • Such complexation would modify the flexibility of the polymer chain, which would induce a local modification of the elasticity and of the curvature of the lipid membrane.
  • the inventors repeated this experiment by varying the concentration of the ⁇ -cyclodextrin solution from 5 to 10 mM, while keeping the level of DOPE-PEG in the vesicles constant at 0.5%. For each experiment, they measured the temporal evolution of the size of numerous vesicles. In general, the reduction in the diameter of a vesicle is linear over time, although we have also observed changes in level: the size of the vesicle remains constant for a few minutes, then suddenly decreases by several microns, And so on.
  • the polymer chains are therefore diluted on the surface of the membrane, and are found in the "mushroom" regime.
  • the polymer is anchored on the surface of the membrane, and the polymer chain has the shape of a ball.
  • the polymer has been shown to exert a pressing force on the membrane to which it is attached.
  • the polymer exerts a pressure which depends on its radius of gyration and the distance to the anchoring point (cf. Figure 7.a).
  • the pressures exerted on both sides offset each other since the polymers are equally distributed on each monolayer. This situation is completely different when the cyclodextrin is in the vicinity of the membrane.
  • Cyclodextrin molecules easily complex POE chains by threading around the monomers. This configuration, adopted by the cyclodextrins gives the complex a form of tube crossed in its middle by the polymer chain. The cyclodextrin molecules thus force the polymer chain to straighten out and adopt a "hedgehog" configuration (cf. FIG. 6). In this case, the pressure exerted by the polymer on the membrane is greatly reduced. There is then an imbalance between the forces exerted by the polymers of the internal monolayer which are always in "mushroom” regime and those exerted by the complexed polymers of the external layer.
  • the inventors therefore carried out the same experiment with multilamellar vesicles anchoring polymer chains, and encapsulating a detectable substance.
  • the objective is on the one hand to check if there is also destruction of the membrane in the case of multilayers, and on the other hand, if the encapsulated dye is released into the surrounding medium as the complexation progresses polymer chains by cyclodextrin molecules. This is presented in the next paragraph. Effect of ⁇ -cyclodextrin on MLVs
  • the principle of these experiments was to study the release of a dye, calcein, encapsulated in MLVs of DOPC decorated with PEO chains and placed in the presence of ⁇ -cyclodextrin.
  • UV-visibia spectroscopy was used to monitor over time the amount of calcein released into the medium.
  • Calcein is a yellow dye with a molar mass of 622 g / mol.
  • MLVs were obtained by hydrating a lipid film made up of a mixture of DOPC and DOPE-PEG, where the latter represents 1% of the total lipid mass. The lipid film was hydrated with a 0.1M solution of sucrose and calcein (1%). Thus, the dye is encapsulated in the MLV during their formation. The volume of the hydrating solution added was such that the final concentration of the MLVs was approximately 1 mg / ml.
  • the procedure then used to prepare the MLV suspensions in the glucose + ⁇ -cyclodextrin mixture is as follows.
  • the stock solution containing the MLVs was divided into several daughter solutions. For each of them, the solution in which the MLV is bathed has been replaced by a colorless glucose solution. This operation was carried out by centrifuging for 5 min each daughter solution, and gradually replacing the supernatant solution with the glucose solution. At the end of the operation, the MLVs which contain calcein are bathed in a colorless solution of glucose. A final centrifugation made it possible to concentrate the MLVs in the bottom of the tube and to remove a large part of the glucose solution.
  • association constants between psoralen derivatives and modifîed ⁇ beta> - cyclodextrin Effect of sucrose as a co-enhancer association agent, Journal-of- liquid-chromatography-and-related-technologies, 2003; 26 (6): 871-882.
  • Lu C Pelton R., Valliant J., Bothwell S., Stephenson K., Collo ⁇ dal Flocculation with Poly (ethyleneoxide) / Polypeptide Complexes, Langmuir, 2002, 20 18: 4536-4538.
  • Huh KM Tomita H., Lee WK, Ooya T., Yui N., Synthesis of a- Cyclodextrin-Conjugated PoIy (e-lysine) s and Their Inclusion Complexation Behavior, Macromol Rapid Commun., 2002, 23 (3): 179-182.

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Abstract

L'invention concerne un procédé qui permet de déclencher de façon contrôlée la rupture de la membrane d'un liposome bio-compatible, souvent appelé liposome furtif, ce qui a pour effet de libérer le contenu du liposome dans son environnement. L'agent déclencheur est une molécule bio-compatible. De préférence, l'agent déclencheur est la alpha-cyclodextrine. L'invention concerne notamment l'utilisation de ce procédé << in-vivo >>, dans les domaines thérapeutique, diagnostique, expérimental, cosmétique et agro-alimentaire.

Description

Rupture contrôlée de liposomes furtifs
L'invention concerne un procédé qui permet de déclencher de façon contrôlée la rupture de la membrane d'un liposome bio-compatible, souvent appelé liposome furtif, ce qui a pour effet de libérer le contenu du liposome dans son environnement. L'agent déclencheur est une molécule bio-compatible. De préférence, l'agent déclencheur est la α-cyclodextrine. L'invention concerne notamment l'utilisation de ce procédé « in- vivo », dans les domaines thérapeutique, diagnostique, expérimental, cosmétique et agro-alimentaire.
ARRIERE PLAN TECHNOLOGIQUE Les liposomes sont des capsules auto-assemblées, en bicouche ou en empilement de bicouches, de molécules amphiphiles. Ces molécules peuvent être des molécules naturelles, par exemple des phospholipides, ou des molécules synthétisées par voie chimique. Dans le vivant, les bicouches de phospholipides constituent les parois cellulaires, et sont également présentes dans la cellule (appareil de Golgi, vésicules servant au transport intra-cellulaire par exemple). Ces membranes intègrent de nombreuses molécules spécifiques aux fonctions multiples : communication entre les milieux disposés de part et d'autre de la membrane, reconnaissance, adhésion, etc.. Des applications industrielles utilisent de façon croissante les capsules de bicouches de lipides, nommées liposomes ou vésicules, par exemple en cosmétique ou en pharmacie. Dans ces domaines, la recherche actuelle vise à optimiser la fonctionnalité des liposomes en tant que vecteur de substances actives dans l'organisme. Ainsi, ces liposomes se doivent d'être non seulement bio-compatibles, mais également furtifs, c'est à dire qu'ils doivent pouvoir circuler dans l'organisme hôte sans être détruits par les défenses immunitaires. Rendre un liposome furtif nécessite de modifier ses propriétés de surface, en général en incorporant des molécules spécifiques dans la membrane. Ces molécules peuvent être des molécules amphiphiles naturelles, des phospholipides modifiés chimiquement, ou bien encore des copolymères. Par exemple, en incorporant des gangliosides dans la membrane de liposomes, T. M Allen a montré que les fonctions d'acide sialique portées par ces gangliosides confèrent une certaine furtivité aux liposomes ainsi modifiés (Allen & Chonn, 1987). Une autre façon de rendre les liposomes furtifs consiste à décorer la membrane avec des chaînes de polymère hydrosoluble. Ce polymère est souvent du poly(éthylene glycol) (PEG) (Allen et al, 5 1991 ; US 5,013,556 ; Silvander, 2002 ; Nicholas et al, 2000), mais peut également appartenir à diverses familles de polymères hydrophiles (US 5,395,619). L'entité chimique qui comprend cette chaîne polymère peut être soit un copolymère, par exemple dibloc ou tribloc, dont la partie hydrophobe s'insère au cœur de la membrane (Kostarelos et al. 1999), soit un phospholipide modifié chimiquement, par le greffage de0 cette chaîne polymère hydrophile. Les liposomes incorporant une fraction de phospholipide modifié par greffage d'une chaîne PEG (PEG-lipide) représentent les liposomes furtifs les plus largement utilisés à ce jour dans le domaine des applications thérapeutiques. On trouve dans la littérature de nombreuses études cliniques concernant5 l'utilisation de liposomes comme vecteurs permettant une libération lente des principes actifs qu'ils contiennent (Allen & Chonn, 1987 ; Hong et al, 1999). On parle alors de demi-vie du liposome, c'est à dire d'une durée de vie moyenne, telle qu'elle est mesurée à partir de l'observation du comportement d'un grand nombre d'entrés eux ; cette demi- vie peut atteindre plusieurs dizaines d'heures.0 En revanche, un problème actuel est la maîtrise du déclenchement de la libération du contenu du liposome par une action extérieure, qui permettrait par exemple de libérer rapidement les molécules actives injectées. Différentes études se sont orientées en ce sens. Ainsi, des liposomes sensibles à la température ont été réalisés ; il s'agit de5 mettre à profit le mécanisme prouvé de l'augmentation de la perméabilité d'une membrane au voisinage de sa température de transition sol-gel des chaînes grasses du phospholipide (voir les références citées dans Needham et al, 2000 ; et Needham & Dcwhirst, 2001). Dans ces références, les auteurs montrent comment optimiser les propriétés de ces liposomes en jouant sur la composition de la membrane. Ainsi, pour le0 traitement in- vivo de certaines tumeurs, la membrane est telle que la transition de phase gel-liquide se situe entre 37°C (la température du corps) et 41°C (la température de la tumeur). Lorsque le liposome atteint la zone cible (la tumeur), la membrane transite de l'état gel à l'état liquide, et le liposome relargue une partie de son contenu. Ces liposomes ont été testés « in- vitro » ainsi que « in- vivo ». Egalement, il a été proposé d'utiliser les ondes ultrasonores émises par un dispositif de type échographe, afin de détruire des liposomes préalablement localisés dans une zone cible (Bednarski et al, 1997). La destruction directe de liposomes par ultrasons peut cependant s'avérer nocive pour les tissus sains, à cause de la forte énergie requise. Des améliorations ont donc été proposées, avec l'association dans le sang des liposomes et de micro-bulles de gaz stabilisées par divers tensio-actifs ; dans ce cas, une énergie ultrasonore réduite suffit à provoquer l'explosion des micro-bulles, et celles-ci provoquent à leur tour la rupture des liposomes (US 6,258,378). Une technique utilisant l'énergie lumineuse d'un laser pour la destruction des liposomes a également été répertoriée (US 4,891,043). Il s'agit d'utiliser des vésicules absorbant la lumière dans une gamme de longueurs d'ondes donnée, et sensibles à la température. Ainsi, en envoyant l'énergie lumineuse au travers des tissus, les liposomes chauffent et relarguent leur contenu. Cette technique est d'autant plus applicable que les tissus sont transparents (oeil) ou peu épais. Enfin l'utilisation de vésicules sensibles au pH a été étudiée (Drummond et al, 2000). Une justification est le fait que l'environnement proche d'une tumeur est d'un pH plus acide (pH 6.5, à comparer avec pH=7 dans le reste du corps).
Il reste néanmoins des problèmes importants en ce qui concerne le largage rapide et contrôlé du contenu du liposome en environnement « in vivo ».
RESUME DE L'INVENTION Les inventeurs ont mis au point une nouvelle approche de libération contrôlée d'un agent actif ou de rupture contrôlée de liposomes in vivo basée sur l'administration d'un composé biocompatible. En effet, les inventeurs ont découvert que, lorsque ces liposomes sont mis en présence d'une molécule biocompatible connue, la α- cyclodextrine, la rupture membranaire et donc la libération du contenu de la capsule sont activés de façon rapide et contrôlable. L'invention concerne une méthode de libération contrôlée d'un agent actif chez un mammifère, comprenant l' administration audit mammifère d'un liposome contenant ledit agent actif, le liposome étant décoré par des chaînes de polymère hydrophile et la méthode comprenant en outre l' administration audit mammifère d'un composé biocompatible se complexant audit polymère et modifiant la conformation et/ou la structure de celui-ci, l' administration dudit composé induisant une déstabilisation du liposome in vivo et une libération de l'agent actif chez le mammifère. Par « décoré par des chaînes de polymère hydrophile » est entendu que le liposome expose à sa surface des chaînes de polymère hydrophile. Les chaîne de polymère hydrophile peuvent s'insérer au cœur de la membrane par l'intermédiaire d'un partie hydrophobe ou par greffage sur un lipide. De préférence, le liposome est décoré par des chaînes de polymère hydrophile par l'incorporation dans sa composition d'au moins un lipide modifié par greffage d'une chaîne polymère hydrophile, plus particulièrement d'une chaîne de poly(éthylène glycol) (PEG-lipide). L'invention concerne une méthode de destruction d'un liposome in vivo comprenant l'administration d'un liposome étant décoré par des chaînes de polymère hydrophile, et l'administration d'un composé biocompatible se complexant audit polymère et modifiant la conformation et ou la structure de celui-ci, l'administration dudit composé induisant une destruction du liposome in vivo. De préférence, le liposome est décoré par des chaînes de polymère hydrophile par l'incorporation dans sa composition d'au moins un lipide modifié par greffage d'une chaîne polymère hydrophile, plus particulièrement d'une chaîne de poly(éthylène glycol) (PEG-lipide). L'invention concerne un kit, produit ou composition comprenant les deux produits suivants en vue d'une utilisation (ou administration) simultanée, séparée ou espacée dans le temps : un liposome contenant un agent actif, le liposome étant décoré par des chaînes de polymère hydrophile; et un composé biocompatible se complexant audit polymère et modifiant la conformation et/ou la structure de celui-ci, ledit composé induisant une déstabilisation du liposome in vivo et une libération de l'agent actif. De préférence, le liposome est décoré par des chaînes de polymère hydrophile par l'incorporation dans sa composition d'au moins un lipide modifié par greffage d'une chaîne polymère hydrophile, plus particulièrement d'une chaîne de poly(éthylène glycol) (PEG-lipide). L'administration séparée des deux produits peut être simultanée ou consécutive (séquentielle). De préférence, l'administration du liposome précède l'administration du composé biocompatible. Des administrations répétées peuvent être également réalisées. L'invention concerne également l'utilisation d'un composé biocompatible se complexant à la partie polymère hydrophile d'un lipide modifié par greffage dudit polymère, et modifiant la conformation et/ou la structure de celui-ci pour la libération contrôlée d'un agent actif contenu dans un liposome comprenant dans sa composition ce lipide modifié. L'invention concerne en outre l'utilisation d'un composé biocompatible se complexant à la partie polymère hydrophile d'un lipide modifié par greffage dudit polymère, et modifiant la conformation et/ou la structure de celui-ci pour la destruction d'un liposome comprenant dans sa composition ce lipide modifié. L'invention concerne enfin l'utilisation d'un liposome contenant un agent actif, le liposome comprenant dans sa composition un lipide modifié par greffage d'un polymère hydrophile et d'un composé biocompatible se complexant audit polymère et modifiant la conformation et/ou la structure de celui-ci, ledit composé induisant une déstabilisation du liposome in vivo et une libération contrôlée de l'agent actif pour la préparation d'un médicament. Les méthodes, utilisations ou produits selon la présente invention peuvent être utilisés dans les domaines thérapeutique, diagnostique, expérimental, cosmétique et agro-alimentaire.
LEGENDE DES FIGURES Figure 1 : a) coupe d'un liposome de phospholipides. b) coupe à deux dimensions de la membrane d'un liposome furtif comprenant une fraction de liposome modifié par greffage d'une chaîne de polymère hydrophile, c) coupe à deux dimensions de la membrane d'un liposome furtif comprenant une fraction de copolymères diblocs et triblocs, de structures respectives [hydrophobe-hydrophile] et [hydrophile-hydrophobe- hydrophile]. Figure 2 : Reproduction d'une photographie au microscope optique d'une vésicule géante de DOPC. Figure 3 : Evolution d'une vésicule géante stabilisée par un PEG-lipide, en présence de α-cyclodextrine dans la solution. L'échelle est la même pour toutes les images, a) t=0 min ; b) t=3 min ; c) t=6,3 min ; d) t=12 min ; e) t=22 min ; f) t=32 min ; g) t=42 min ; h) t=51 min. Figure 4 : Evolution de la taille d'une vésicule géante comprenant des PEG- lipides, en présence de α-cyclodextrine au cours du temps. Figure 5 : Vitesse de disparition des vésicules au cours du temps en fonction de la concentration en α-cyclodëxtrine : : 5 mM; : 7 mM ;• : 8 mM ; : 9 mM. Figure 6 : Complexation asymétrique des chaînes polymères ancrées sur la membrane par les molécules de cyclodextrine : a) membrane de liposome furtif en l'absence de cyclodextrine, b) cette même membrane exposée à la cyclodextrine. Figure 7 : Asymétrie des forces de pression dues au polymère de part et d'autre de la membrane : a) les fluctuations du polymère engendrent une force de pression sur la membrane; b) lorsque la chaîne de POE est complexée par la cyclodextrine, elle se redresse et exerce une pression moindre, ce qui entraîne une courbure locale de la membrane. Figure 8 : Illustration des résultats d'une expérience de spectroscopie UV-visible représentant la transmission de l'échantillon à la longueur d'onde de la calcéine (relativement à la ligne de base) en fonction du temps écoulé depuis l'introduction de la α-cyclodextrine (concentration 10 mM).
DESCRIPTION DETAILLEE La présente invention est relative à un nouveau mode de rupture des liposomes dits « furtifs », susceptibles d'être utilisés comme vecteurs de molécules actives dans l'organisme. Un liposome est une capsule constituée d'une membrane auto-assemblée de molécules amphiphiles. Dans le cas de liposomes biocompatibles, cette membrane est composée le plus souvent de phospholipides, directement extraits de cellules biologiques, ou bien synthétisés par voie chimique, à l'identique de phospholipides naturels. Les liposomes dits « furtifs » ont cette particularité qu'ils peuvent circuler dans l'organisme pendant un temps relativement long, sans être éliminés par les défenses immunitaires. Dans un mode préféré de réalisation de la présente invention, cette propriété est due à la présence à la surface d'un chaîne de polymère hydrophile. Le plus souvent, la présence à la surface d'un chaîne de polymère hydrophile est due à la présence dans la membrane de phospholipides modifiés par greffage chimique d'une chaîne polymère hydrophile. Ce polymère est généralement greffé sur la tête polaire d'un lipide amphipatique. Ce polymère hydrophile est de préférence un polyalkyléther. De préférence, ledit polymère est un polyéthylèneglycol, un homopolymère parent tel que le polyméthyléthylèneglycol, polyhydroxypropylèneglycol, polypropylèneglycol, polyméthylpropylèneglycol, et polyhydroxypropylèneoxide, ou un hétéropolymère de petits monomères alkoxy tel que le polyéthylène/polypropylèneglycol. Ce polymère a de préférence un poids moléculaire compris entre 120 et 20000 daltons. Dans un mode de réalisation préféré, le polymère est un polyéthylèneglycol PEG, plus particulièrement polyéthylèneglycol de 1000 à 5000 daltons, et la fraction molaire de phospholipide modifié (PEG-lipide) est comprise entre 0.1% et 10%. Le polymère peut également être sélectionné parmi le groupe suivant : polyvinylpyrrolidone, polyvinylmethylether, polyhydroxypropylméthacrylate, polyhydroxypropylméthacrylamide, polyhydroxyéthylacrylate, polyméthacrylamide, polydiméthylacrylamide, polyméthyloxazoline, polyéthyloxazoline, polyhydroxyéthyloxazoline, polyhydroxypropyloxazoline, et polyaspartamide. Dans une première configuration, le polymère est greffé sur l'un des lipides amphipatiques compris dans le liposome, parmi lesquels on trouve par exemple des phospholipides comme la phosphatidylcholine (PC), la phosphatidyléthanolamine (PE), l'acide phosphatidique (PA), le phosphatidylinositol (PI), et la sphingomyéline, mais le polymère peut également, dans une autre configuration, être une des composantes d'un co-polymère à blocs, qui s'insère dans la membrane grâce à l'affinité d'au moins un de ses blocs avec la partie hydrophobe de la membrane. Ce type de liposome est commercialisé par diverses entreprises, ou a fait l'objet de dépôts de brevets. Par exemple, ALZA Corporation's commercialise des liposomes stabilisés par des chaînes de PEG, et contenant divers agents anticancer, sous le nom de « STEALTH® liposomal technology ». De même, Doxil® et Caelyx® sont des noms déposés, se rapportant à des liposomes furtifs incorporant une drogue spécifique. Les liposomes considérés dans la présente invention peuvent présenter en outre la capacité de cibler des tissus particuliers, plus particulièrement des tissus pathologiques en raison de leur composition lipidique et/ou de la présence d'éléments de ciblage introduits dans leur structure. Par exemple, ils peuvent contenir des molécules se liant à un ligand présent en surface des cellules. Un schéma de ces liposomes est donné Figure lb et le. Le mode de préparation de ces vésicules est parfaitement connu de l'homme du métier (Allen et al, 1991 ; Angelova & Dimitrov, 1986 ; US 5,013,556 ; US 5.395,619). Ces liposomes, très stables dans le temps, peuvent subsister plusieurs jours en solution stérile, ainsi que
« in- vivo » dans le système sanguin. Les inventeurs ont identifié un nouveau moyen de rompre les liposomes souvent appelés liposomes furtifs, qui sont décorés par des chaînes de polymère hydrophile suite à la modification de la composition de leur membrane, soit par ajout d'un lipide modifié par greffage d'un polymère hydrophile, soit par ajout d'un copolymère dont une partie est une chaîne hydrophile, à l'aide d'un composé biocompatible se complexant audit polymère et modifiant la conformation et/ou la structure de celui-ci. La modification de conformation et/ou structure du polymère entraîne la rupture des liposomes et la libération de leur contenu. Plus particulièrement, la modification de conformation et/ou structure du polymère par ledit composé entraîne une différence ou une dissymétrie entre l'intérieur et l'extérieur du liposome qui déstabilise la paroi lipidique. Par exemple, ledit composé peut provoquer une rigidification du polymère, celui-ci se dépliant. Dans ce cas, le composé est de préférence une cyclodextrine, ou tout dérivé d'une cyclodextrine. La cyclodextrine peut être la α-cyclodextrine, la β-cyclodextrine, et la γ- cyclodextrine. Les dérivés de la cyclodextrine sont nombreux ; ils sont obtenus à partir de réactions chimiques diverses entre une cyclodextrine et un autre composé, par exemple « Trypsin-cyclodextrin » (Villalonga et al., 2003), ou encore hydroxypropyl- <beta>-cyclodextrin (Imaili et al., 2003). Des polymères portant un grand nombre de cyclodextrine greffées en configuration latérale (en peigne) ont même été synthétisés, par exemple une chaîne de poly(ε-lysine)-α-cyclodextrine (Huh 2002). Tout dérivé d'une cyclodextrine et toute molécule complexe intégrant une cyclodextrine peut convenir dans la présente invention, s'il est biocompatible. Dans un mode de réalisation préféré, le composé est la α-cyclodextrine. Dans un autre exemple, ledit composé peut arracher le polymère du lipide modifié. Dans un autre exemple, ledit composé peut s'agréger avec les chaînes de polymère hydrosoluble qui décorent le liposome, modifiant ainsi fortement leur conformation spatiale et donc induisant la déstabilisation du liposome. De tels agrégats de polymères sont par exemple obtenus lorsque l'on met en présence deux polymères chargés de charge nette opposée. Deux chaînes polymères peuvent également s'agréger s'il existe des interactions hydrogène entre elles ; ainsi il a été montré qu'une chaîne de PEO s'agrège avec divers polypeptides, par exemple du poly(Glu, Tyr) (1 :1) (Lu et al., 2002), ainsi qu'avec des protéines : avec la pepsine (Xia et al., 1993) et avec la l'albumine (Azegami et al., 1999) par exemple. Dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, le polymère hydrophile est le polyéthylèneglycol et le composé biocompatible est la α- cyclodextrine. Outre les propriétés du composé de modification de conformation et/ou structure du polymère, le composé doit être biocompatible. C'est-à-dire qu'il ne doit pas provoquer d'effets secondaires ou indésirables importants lors de son administration. Cela dépend donc de sa toxicité à la concentration utilisée pour rompre les liposomes. De préférence, ce composé est hydrosoluble. En effet, cette hydrosolubilité permet de faciliter son administration. Les cyclodextrines ont été isolées pour la première fois en 1891, mais ce n'est qu'en 1904 que leur structure cyclique fut identifiée. Elles sont le résultat de la dégradation de l'amidon par une enzyme, la glycosyl transférase, produite par une bactérie (Bacillus macérons). Dans ce processus, la rupture de la molécule d'amidon est suivie d'une cyclisation intramoléculaire. Les cyclodextrines sont donc des oligosaccharides constitués de 6, 7 ou 8 molécules de glucose assemblées en cycle appelés respectivement α, β, et γ. Chaque cycle est en conformation "chaise", ce qui donne à l'ensemble de la molécule une forme de cône tronqué où les groupements hydroxyles primaires forment la base étroite, et les groupements hydroxyles secondaires forment la base large. Cette forme de cône permet à la cyclodextrine de s'associer avec une molécule ou un groupe moléculaire non polaire : la molécule ou le groupe moléculaire se place dans la cavité de la cyclodextrine. Les groupements hydroxyles des extrémités de la molécule la rendent hydrosoluble. Les faces interne et externe du cône sont constituées de groupes C-H, ce qui rend l'intérieur du cône peu polaire. Les cyclodextrines sont stables en milieu basique, mais placées dans un milieu acide, elles sont dégradées et donnent du glucose. Les cyclodextrines ne sont pas toxiques en-dessous d'une certaine concentration.
A faible concentration, elles protègent les globules rouges de l'hémolyse provoquée par un choc osmotique ou une élévation de température, mais également contre l'action hémolytique de diverses molécules (Weisz et al. 1993). Elle peuvent cependant engendrer une hémolyse si elles sont en trop grande concentration (Uekama 1981) : les β-cyclodextrines présentent le seuil de toxicité le plus bas (5mM), et les γ- cyclodextrines le seuil le plus élevé (30mM). Les cyclodextrines peuvent modifier certaines propriétés des molécules qu'elles complexent par une augmentation de leur solubilité, de leur stabilisation, ou une réduction de leur volatilité... Ces propriétés font des cyclodextrines des molécules très intéressantes dans l'industrie alimentaire et pharmaceutique où elles sont utilisées pour stabiliser des additifs comme les colorants, les arômes, les odeurs, les exhausteurs de goût... La forme tridimentionelle des cyclodextrines leur permet de s'associer en formant des structures complexes mais thermodynamiquement stables. Dans le cas des rotaxanes, la cyclodextrine est libre de tourner autour de la molécule qui la traverse : il n'y a pas de liaison covalente. Dans le cas des caténanes, deux molécules cycliques sont liées ensemble par des interactions faibles. L'inclusion des molécules dans la cavité de la cyclodextrine dépend surtout de leurs interactions hydrophobes. Certains polymères solubles dans l'eau mais contenant des parties hydrophobes permettent cette association et favorisent la formation d'une chaîne de molécules de cyclodextrines "enfilée" autour de la chaîne. Dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, le polymère hydrophile est le polyéthylèneglycol et le composé biocompatible est la α- cyclodextrine. L'agent actif contenu dans les liposomes peut être tout composé adapté au transport dans des liposomes. L'agent actif peut être, de manière non exhaustive, un peptide ou une protéine, comme une hormone, une enzyme, un inhibiteur d'enzyme, une lipoprotéine ; un acide nucléique comme un RNAi, un oligonucléotide antisens, un ARN messager, un ADNc ; un carbohydrate ou un lipide ; un composé chimique, comme un médicament. De préférence, l'agent actif a un effet thérapeutique, mais peut aussi apporter une odeur, une saveur, ou tout autre complément utile dans l'industrie agro-alimentaire. Dans les applications thérapeutiques, le liposome et le composé peuvent être administrés par tout moyen approprié bien connu par l'homme du métier. De préférence, ils sont administrés par voie parentérale telle que sous-cutanée, intraveineuse, ou intramusculaire. Lorsque le composé est la α-cyclodextrine, ce composé sera administré de préférence dans la gamme de quantité suivante : 0.1 mM à lOmM. De même, la β- cyclodextrine sera administré de préférence dans la gamme de quantité suivante : O.lmM à 5mM. La γ- cyclodextrine sera administré de préférence dans la gamme de quantité suivante : O.lmM à 30mM. Dans chacun des cas précédents, la concentration maximale de cyclodextrine correspond à son seuil de toxicité. De même, lorsque le composé est une cyclodextrine modifiée, la concentration maximale injectable varie en fonction du composé, et reste donnée par le seuil de toxicité de la molécule, la concentration minimale étant de O.lmM. La rupture des liposomes et, par conséquent la libération de l'agent actif, peut être contrôlée par la quantité de composé se complexant audit polymère. Plus la quantité de composé sera importante, et plus le relargage de l'agent contenu dans les liposomes sera rapide. Les expériences initiales ont été réalisées en environnement « in- vitro ». Les liposomes furtifs sont réalisés à partir de di-octadécyl-phosphatidil-choline (DOPC) et de DOPE (di-octadécyl-phosphatidil-éthanolamine) modifié par greffage de molécules PEG (fournisseur : AVANTI). Les liposomes sont dispersés dans une solution aqueuse de glucose où ils présentent une stabilité de l'ordre de plusieurs dizaines d'heures. On ajoute ensuite à cette solution une solution iso-osmotique de α-cyclodextrine, une molécule bio-compatible connue. On observe alors une déstabilisation des liposomes, qui se traduit par un largage du contenu du liposome dans la solution. Ce processus est relativement rapide, de l'ordre de quelques dizaines de minutes pour une concentration globale en α-cyclodextrine de l'ordre de 5 mM. Le temps caractéristique diminue avec la concentration en α-cyclodextrine : il est diminué d'un facteur 2 lorsque l'on passe de 5mM à lOmM de α-cyclodextrine dans la solution. Ainsi, la concentration de α- cyclodextrine est un paramètre régulateur du largage du contenu des liposomes. Cette expérience a été réalisée et vérifiée dans deux conditions expérimentales différentes : 1) D'une part, les inventeurs ont réalisé des liposomes uni-lamellaires géants de diamètre de 20 à 40 micromètres (Figure 2.). Ces liposomes ont été fabriqués par la technique connue d' électroformation (Angelova & Dimitrov, 1986). Des vésicules contenant des fractions molaires de 99.5% de DOPC et 0.5% de DOPE modifié (PEG-lipide) ont été réalisées en solution de sucrose 0.05M. Elles ont ensuite été transférées dans la cellule d'observation qui contenait 0.0502M de Glucose. La différence de densité entre le Glucose et le Sucrose fait sédimenter les vésicules, autorisant une observation aisée au microscope. Les concentrations molaires ci-dessus sont iso-osmotiques, ce qui n'entraîne aucune variation de volume de la vésicule au cours du temps. On ajoute alors une certaine quantité de solution iso-osmotique à la solution précédente, contenant de la α-cyclodextrine et du Glucose. L'observation au microscope permet de voir l'effet de l'addition de α-cyclodextrine : la taille de certaines vésicules diminue, parfois lentement, parfois jusqu'à disparition complète de la vésicule (Figure 3). Le fait que la répartition de la α-cyclodextrine dans la solution n'est pas homogène permet d'expliquer la diversité des comportements observés. En modifiant la concentration de α-cyclodextrine ajoutée, on observe qualitativement deux phénomènes : i) la fraction de vésicules qui subit une diminution de taille augmente avec la concentration en α-cyclodextrine ; et ii) le taux moyen de diminution de la taille augmente avec la quantité de α-cyclodextrine. 2) D'autre part, les inventeurs ont réalisé des liposomes multi-lamellaires de diamètre inférieur à 1 micromètre contenant des fractions molaires de 99.0% de DOPC et 1.0% de DOPE modifié (PEG-lipide). Ces vésicules sont obtenues par simple hydratation d'un film de phospholipide déposé sur une surface de verre. Leur observation au microscope optique étant impossible, un autre protocole de mesure a été choisi. Les vésicules ont été réalisées de façon à encapsuler un colorant, la calcéïne, à une concentration de 1%. Les inventeurs ont vérifié que ces vésicules ne larguaient pas leur contenu dans les conditions normales de stockage en solution de Glucose. Une solution mère, contenant lmg/ml de vésicules a été divisée en 4 solutions filles de concentration 0.25mg/ml. A chacune de ces solutions ont été ajoutés 1 ml de solution iso-osmotique contenant du Glucose et de la α-cyclodextrine, comme précédemment. Après un temps t, différent pour chacune de ces solutions, chaque solution a été centrifugée et le surnageant extrait, puis filtré, avec un filtre 200nm, ne permettant le passage d'aucune vésicule. Ce surnageant a ensuite été analysé par technique de spectroscopie UV-visible, afin de déterminer la quantité de calcéïne contenue dans ce surnageant. Aucune vésicule n'étant présente dans cette solution, la quantité de calcéine mesurée représente la taux de calcéïne relarguée par les vésicules. La Figure 8 reporte ce taux, en fonction du temps écoulé depuis l'addition de α-cyclodextrine dans la solution. On constate que la quantité de calcéïne relarguée par les vésicules augmente avec le temps. Les inventeurs ont vérifié pour chaque type de vésicules (petites multi- lamellaires et grandes uni-lamellaires) que l'ajout de α-cyclodextrine dans une solution de vésicules non modifiées, c'est à dire ne comportant pas de molécules PEG à la surface de la membrane, ne modifie en rien la structure des vésicules, et en particulier dans le cas des petites vésicules, n'occasionne aucun relargage du contenu (Figure 8). Enfin, la α-cyclodextrine étant bio-compatible, les expériences « in vitro » peuvent être reproduites en environnement « in- vivo ». Toutes les références faites dans la description de l'invention sont incorporées intégralement à cette dernière.
EXEMPLES Association entre la α-cyclodextrine et les PEG greffés sur des GUV Les vésicules décorées de polymères ont été préparées à partir d'un mélange de deux solutions de phospholipide : le DOPC et le DOPE-PEG. La formule chimique du DOPE-PEG est représentée ci-dessous. Sa partie hydrophobe est constituée de deux chaînes en Cl 8, et sa partie hydrophile est une chaîne de 44 monomères PEO (polyoxyethylène) portée par le groupement glycérol. Les proportions utilisées lors du mélange ont été telles que le DOPE-PEG représente 0.5 % de la masse totale de lipide en solution. Cette solution a permis de produire rapidement des vésicules géantes par électroformation. O
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Formule chimique du DOPE-PEG.
Pour vérifier que les molécules de DOPE-PEG ont bien été incorporées à la bicouche de DOPC, on a mesuré le module de courbure de ces vésicules. La valeur obtenue, 35 keT, est bien différente de celle correspondant aux vésicules de DOPC pur (22 kBT). Environ 100 μl de la solution contenant les vésicules géantes ont été transférés dans une petite cellule d'observation constituée d'une lame et d'une lamelle de microscope séparées par un espaceur en silicone. Cette cellule a été préalablement remplie d'une solution mixte de glucose et de α-cyclodextrine. Cette solution est iso- osmolaire à la solution de sucrose qui contient les vésicules. Différentes expériences ont été réalisées, en variant la concentration de α-cyclodextrine dans la cellule, entre 5 mM et 10 mM. Dans tous les cas l'observation au microscope d'une vésicule géante a révélé que son diamètre diminue au cours du temps. Les inventeurs ont bien sûr vérifié au préalable que des vésicules de DOPC pur ne sont pas affectées par la présence de α- cyclodextrine. Des images d'une même vésicule prises différents instants après le transfert des vésicules dans la cellule contenant la α-cyclodextrine sont présentées sur la figure 3. La diminution progressive du diamètre de la membrane est caractéristique du largage du contenu de la vésicule dans son environnement. Par ailleurs, l'image de la membrane évolue également avec le temps. Au début la membrane est très contrastée, apparaissant sous la forme de deux traits, noir et blanc ; ce contraste est dû à la différence d'indice optique des milieux extérieurs et intérieurs de la membrane. Au bout de quelques minutes, ce contraste disparaît, ce qui s'explique par un mélange des solution interne et externe. Cela signifie que des pores se sont créés dans la membrane, permettant une circulation des solutions à travers la membrane. La Figure 4 montre que la diminution du diamètre de la vésicule est constante avec le temps. Ces observations peuvent être interprétées comme une dislocation de la bicouche lipidique due à la présence de cyclodextrine. Les cyclodextrines peuvent former des assemblages complexes avec les chaînes de polymère comme les POE. Une telle complexation modifierait la flexibilité de la chaîne polymère, ce qui induirait une modification locale de l'élasticité et de la courbure de la membrane lipidique. Les inventeurs ont répété cette expérience en variant la concentration de la solution de α-cyclodextrine de 5 à 10 mM, tout en maintenant constant à 0.5 % le taux de DOPE-PEG dans les vésicules. Pour chaque expérience, ils ont mesuré l'évolution temporelle de la taille de nombreuses vésicules. D'une manière générale la diminution du diamètre d'une vésicule est linéaire avec le temps, bien que l'on ait également observé des évolutions en palier : la taille de la vésicule reste constante pendant quelques minutes, puis diminue subitement de plusieurs microns, et ainsi de suite. Dans tous les cas observés, les vésicules finissent par disparaître totalement, et on n'observe plus que de petits débris de membranes en suspension dans la solution. Les résultats de ces expériences sont illustrés sur la figure 5 où chaque point représente pour une vésicule la vitesse moyenne de décroissance de son diamètre, c'est-à-dire la pente des droites diamètre = f(t), telles que celle de la figure 4. Ce résultat montre que la vitesse de disparition de la vésicule augmente très légèrement avec la concentration de α- cyclodextrine dans la gamme de concentrations utilisée. La concentration en DOPE-PEG dans la membrane est de 0.5 % en masse, ce qui correspond à un taux de couverture d'une molécule de DOPE-PEG pour 700 molécules de DOPC. Les chaînes polymère sont donc diluées sur la surface de la membrane, et se trouvent dans le régime "champignon". Dans ce régime, le polymère est ancré sur la surface de la membrane, et la chaîne polymère a la forme d'une pelote. Il a été montré que le polymère exerce une force de pression sur la membrane à laquelle il est fixé. A chaque point de contact avec la surface, le polymère exerce une pression qui dépend de son rayon de giration et de la distance au point d'ancrage (cf. figure 7.a). Dans une bicouche décorée, les pressions exercées de part et d'autre se compensent puisque les polymères sont également répartis sur chaque monocouche. Cette situation est totalement différente lorsque la cyclodextrine se trouve au voisinage de la membrane. Les molécules de cyclodextrine complexent facilement les chaînes POE en s'enfilant autour des monomères. Cette configuration, adoptée par les cyclodextrines donne au complexe une forme de tube traversé en son milieu par la chaîne polymère. Les molécules de cyclodextrine forcent ainsi la chaîne polymère à se redresser et à adopter une configuration "en hérisson" (cf. figure 6). Dans ce cas, la pression exercée par le polymère sur la membrane est fortement réduite. Il y a alors un déséquilibre entre les forces exercées par les polymères de la monocouche interne qui se trouvent toujours en régime "champignon" et celles exercées par les polymères complexés de la couche externe. Or, il a été montré qu'un ancrage asymétrique de macromolécules sur des vésicules sphériques ou allongées engendre des modifications spectaculaires de la forme de ces vésicules : on a observé notamment des bourgeonnements, l'apparition de perles, ou la torsion de la membrane. Il est plausible qu'un phénomène similaire soit en jeu dans le cas présent. En effet, les inventeurs ont observé une diminution continue de la taille de la vésicule jusqu'à sa disparition. La Figure 6.f montre que des petits amas de phospholipides apparaissent au bout de 30 minutes environ à la surface de la vésicule, initialement uniforme, et sur la dernière image, il n'y a plus qu'un amas informe de phospholipide. Il est donc possible qu'au fur et à mesure que les chaînes polymère sont complexées, la membrane de la vésicule se courbe localement jusqu'à former une petite vésicule (cf. figure 7.b). Ce phénomène se répétant sur toute la surface de la vésicule, il ne reste enfin que ce petit amas de phospholipide observé. Cette analyse semble expliquer les résultats observés. Concrètement, une telle destruction de la membrane pourrait être utilisée dans le domaine de la libération contrôlée. Ce phénomène est reproductible, facilement observable, utilise des produits biocompatibles et peu coûteux. Dans le domaine de l'encapsulation, les liposomes utilisés sont le plus souvent des vésicules multilamellaires de petite taille, plus facile à produire. Les inventeurs ont donc réalisé la même expérience avec des vésicules multilamellaires ancrant des chaînes polymère, et encapsulant une substance détectable. L'objectif est d'une part de vérifier s'il y a aussi destruction de la membrane dans le cas de multicouches, et d'autre part, si le colorant encapsulé est libéré dans le milieu environnant au fur et à mesure de la complexation des chaînes polymère par les molécules de cyclodextrine. C'est ce qui est présenté dans le paragraphe suivant. Effet de la α-cyclodextrine sur des MLV Le principe de ces expériences était d'étudier la libération d'un colorant, la calcéine, encapsulé dans des MLV de DOPC décorées de chaînes PEO et mises en présence de α-cyclodextrine. Comme il est impossible d'observer ce phénomène au microscope, la spectroscopie UV-visibie a été utilisée pour suivre au cours du temps la quantité de calcéine libérée dans le milieu. La calcéine est un colorant jaune de masse molaire 622 g/mol. Les MLV ont été obtenues en hydratant un film lipidique constitué d'un mélange de DOPC et de DOPE-PEG, où ce dernier représente 1 % de la masse totale de lipide. Le film lipidique a été hydraté avec une solution 0.1M de sucrose et de calcéine (1 %). Ainsi, le colorant se trouve encapsulé dans les MLV lors de leur formation. Le volume de la solution hydratante ajoutée a été telle que la concentration finale des MLV soit d'environ lmg/ml. La procédure utilisée ensuite pour préparer les suspensions de MLV dans le mélange glucose +α-cyclodextrine est la suivante. La solution-mère contenant les MLV a été divisée en plusieurs solutions-filles. Pour chacune d'entre elles, on a remplacé la solution dans laquelle baigne les MLV par une solution de glucose, incolore. Cette opération a été réalisée en centrifugeant pendant 5 mn chaque solution-fille, et en remplaçant peu à peu la solution surnageante par la solution de glucose. A la fin de l'opération, les MLV qui contiennent la calcéine baignent dans une solution incolore de glucose. Une dernière centrifugation a permis de concentrer les MLV dans le fond du tube et de retirer une grande partie de la solution de glucose. A chaque solution-fille, on a ajouté au temps t0 1ml d'une solution 0.1M d'un mélange de glucose et de α- cyclodextrine (10 mM). Au bout d'un temps t variant de 5 à 60 mn, la solution a été filtrée avec une membrane dont les pores ont un diamètre de 200 nm (filtres nylon Roth). Le filtrat, qui ne contient pas de vésicules, a été analysée par spectroscopie UV- visible afin de mesurer la quantité de colorant libérée dans la solution. A partir des spectres obtenus, on a reporté sur la figure 8 l'évolution du maximum d'absorbance, mesuré à 480 nm avec la durée de l'action de la cyclodextrine sur les MLV. Cette figure montre que la libération du colorant est régulière au cours du temps. Au bout de 45 mn et de 60 mn, les quantités de calcéine dans le filtrat sont presque identiques, ce qui signifie que toutes les MLV ont été détruites en 45 mn. Ce processus semble aussi rapide pour les GUV que pour les MLV. Ces résultats confirment que l'utilisation conjuguée de la cyclodextrine et des chaînes POE greffées sur des liposomes permet l'ouverture rapide des liposomes.
REFERENCE Allen T. M., Chonn A., Large unilamellar liposomes with Io uptake into the reticuloendothelial System, FEBSLett. (1987), 223:42-46. Allen T.M., Hansen C, Martin F.J., Redemann C, Yau-Young A.F., Liposomes containing synthetic lipid derivatives of poly(ethylene glycol) show prolonged circulation haif-Iives in vivo, Biochimica and Biophysica Acta (1991), 1066, 29-36. Angelova M. I. and Dimitrov D. S., Faraday Discuss. Chem. Soc. (1986), 81, 303. Bednarski M. D., Lee J. W., Callstrom M. R., and Li K. C, In vivo target- specific delivery of macromolecular agents with MR guided focused ultrasound, Radiology (1997), 204: 263-268. Kostarelos K., Kipps M., Tadros T.F., Luckham P.F., Molecular structure and conformation in phospholipid vesicles sterically stabilized by (tri)-block copolymers investigated by multi-nuclear magnetic résonance techniques, Colloids and Surfaces A. (1998), 136 (1-2) : 1-9.. Drummond D.C., Zignani M., Leroux J.C., Current status of pH-sensitive liposomes in drug delivery, Prog. Lip. Res. (2000), 39: 409-460. Drummond D.C., Meyer O., Hong K., Kirpotin D.B., Papahadjopoulos D., Optimizing Liposomes for Delivery of Chemotherapeutic Agents to Solid Tumors, Pharm. Rev. (1999), 51(4): 691-743. Needham D., Anyarambhatla G., Kong G., Dewhirst M.W., A new Temperature-sensitive Liposome for Use with Mild Hyperthermia : Characterization and Testing in a Human Tumor Xenograft Model , Cancer Res. (2000), 60: 1197-1201. Needham D., Dewhirst M.W., The development and testing of a new temperature-sensitive drug delivery system for the treatment of solid tumors , Adv. Drug Delivery Rev. (2001), 53: 285-305. Nicholas A. R., Scott M. J., Kennedy N. L, Jones M. N., Effect of grafted 5 polyethylene glycol (PEG) on the size, encapsulation efficiency and permeability of vesicles, Biochimica and Biophysica Acta (2000), 1463:167-178. Silvander M., Steric stabilisation of liposomes - a review, Progr. Colloid Polym. Sci. (2002), 120:35-40. Villalonga R., Fernandez M.; Fragoso A.; Cao R.; Di-Pierro P.; Mariniello L. 10 Porta R., Transglutaminase-catalyzed synthesis of trypsin-cyclodextrin conjugates Kinetics and stability properties, Biotechnology-and-bioengineering, 2003; 81 (6) 732-737. Ismaili L; André C, Nicos L.; Mozer J.L., Millet J.; Refouvelet B.; Makki S.; Robert J.F., Xicluna A.; Guillaume Y.C., Chromatographic détermination of the
15 association constants between psoralen derivatives and modifîed <beta>- cyclodextrin: Effect of sucrose as a co-enhancer association agent, Journal-of- liquid-chromatography-and-related-technologies, 2003; 26 (6) : 871-882. Lu C, Pelton R., Valliant J., Bothwell S., Stephenson K., Colloïdal Flocculation with Poly(ethyleneoxyde)/Polypeptide Complexes, Langmuir, 2002, 20 18 : 4536-4538. Huh K.M., Tomita H., Lee W.K., Ooya T., Yui N., Synthesis of a- Cyclodextrin-Conjugated PoIy(e-lysine)s and Their Inclusion Complexation Behavior, Macromol Rapid Commun., 2002, 23(3): 179-182. Azegami S., suboi A., Izumi T., Hirata M., Dubin P.L., Wang B., Kokufuta E., 25 Formation of an Intrapolymer Complex from Human Sérum Albumin and Poly(ethylene glycol), Langmuir, 1999, 15 : 940-947. Xia J., Dubin P.L., Kokufuta E., Dynamic and Electrophoretic Light Scattering of a Water-Soluble Complex Formed between Pepsin and Poly(ethylene glycol), Macromolecules, 1993, 26: 6688-6690. 30 Uekama K., Pharmaceutical Applications of Cyclodextrin Complexations, Yakugaku Zasshi, 1981, 101(10) : 857-873. Weisz P.B., Kumar K., Macarek E.J., Protection of erythrocytes against hemolytic agents by cyclodextrin polysulfate, Biochemical-pharmacology, 1993; 45 (5) : 1011-1016.

Claims

REVENDICATIONS
1- Méthode de libération contrôlée d'un agent actif chez un mammifère, comprenant l'administration audit mammifère d'un liposome contenant ledit agent actif, le liposome étant composé pour partie d'un lipide modifié par greffage d'un polymère hydrophile, et la méthode comprenant en outre radministration audit mammifère d'un composé biocompatible se complexant audit polymère et modifiant la conformation et/ou la structure de celui-ci, l'administration dudit composé induisant une déstabilisation du liposome in vivo et une libération contrôlée de l'agent actif chez le mammifère.
2- Méthode de destruction d'un liposome in vivo comprenant l'administration d'un liposome étant composé pour partie d'un lipide modifié par greffage d'un polymère hydrophile, et l'administration d'un composé biocompatible se complexant audit polymère et modifiant la conformation et/ou la structure de celui-ci, administration dudit composé induisant une destruction du liposome in vivo.
3- Utilisation d'un composé biocompatible se complexant au polymère hydrophile et modifiant la conformation et/ou la structure de celui-ci pour la libération contrôlée d'un agent actif contenu dans un liposome composé pour partie d'un lipide modifié par greffage dudit polymère.
4- Utilisation d'un composé biocompatible se complexant au polymère hydrophile et modifiant la conformation et/ou la structure de celui-ci pour la destruction d'un liposome composé pour partie d'un lipide modifié par greffage dudit polymère.
5- Méthode selon la revendication 1 ou 2 ou utilisation selon la revendication 3 ou 4, dans laquelle le polymère hydrophile est sélectionné parmi le groupe constitué de polyéthylèneglycol, homopolymère parent tel que le polyméthyléthylèneglycol, polyhydroxypropylèneglycol, polypropylèneglycol, polyméthylpropylèneglycol, et polyhydroxypropyleneoxide, ou un hétéropolymère de petits monomères alkoxy tel que le polyéthylène/polypropylèneglycol.
6- Méthode ou utilisation selon la revendication 5, dans laquelle le polymère hydrophile est un polyéthylèneglycol.
7- Méthode selon la revendication 1 ou 2 ou utilisation selon la revendication 3 ou 4, dans laquelle ledit composé est une entité chimique obtenue par modification d'une cyclodextrine (dérivé d'une cyclodextrine).
8- Méthode selon la revendication 1 ou 2 ou utilisation selon la revendication 3 ou 4, dans laquelle ledit composé est une cyclodextrine.
9- Méthode ou utilisation selon la revendication 7, dans laquelle ledit composé est la α-cyclodextrine.
10- Méthode selon la revendication 1 ou utilisation selon la revendication 3, dans laquelle ledit agent actif est une molécule thérapeutique. 11- Méthode selon la revendication 1 ou utilisation selon la revendication 3, dans laquelle ledit agent actif est une molécule d'utilité alimentaire (saveur , odeur, traitement de plantes...).
12- Produit comprenant les deux produits suivants, en vue d'une utilisation simultanée, séparée ou espacée dans le temps : - un liposome contenant un agent actif, le liposome étant composé pour partie d'un lipide modifié par greffage d'un polymère hydrophile; et - un composé biocompatible se complexant audit polymère et modifiant la conformation et/ou la structure de celui-ci, ledit composé induisant une déstabilisation du liposome in vivo et une libération contrôlée de l'agent actif.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6339069B1 (en) * 1996-10-15 2002-01-15 Elan Pharmaceuticalstechnologies, Inc. Peptide-lipid conjugates, liposomes and lipsomal drug delivery

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JORGENSEN K ET AL: "Interaction of a lipid-membrane destabilizing enzyme with PEG-liposomes" BIOSIS, 10 juin 1999 (1999-06-10), XP002182182 *
KIRPOTIN D ET AL: "Liposomes with detachable polymer coating: Destabilization and fusion of dioleoylphosphatidylethanolamine vesicles triggered by cleavage of surface-grafted poly(ethylene glycol)" FEBS LETTERS 1996 NETHERLANDS, vol. 388, no. 2-3, 1996, pages 115-118, XP002325070 ISSN: 0014-5793 *
WRIGHT S ET AL: "ANTIBODY-DIRECTED LIPOSOMES AS DRUG-DELIVERY VEHICLES" ADVANCED DRUG DELIVERY REVIEWS, AMSTERDAM, NL, vol. 3, janvier 1989 (1989-01), pages 343-389, XP000283234 ISSN: 0169-409X *

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