WO2002028374A1 - Suspension colloidale de particules submicroniques de vectorisation de principes actifs hydrophiles (insuline) et leur mode de preparation - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne une suspension de particules de vectorisation (PV) de principes actifs (PA) hydrophiles (insuline). Ces PV sont à base d'un copolymère dibloc PolyEthylèneGlycol/polyaminoacides neutres hydrophobes polyAANO. Ces particules de PEG/polyAANO sont associés à un PA hydrophile (insuline). L'invention vise, également, un solide pulvérulent à partir duquel sont issues les PV ainsi que la préparation de ce solide et de cette suspension de PV à base de PEG/polyAANO-insuline. Cette préparation consiste à copolymériser les N-CarboxyAnhydrides d'AANO, en présence de N-méthylpyrrolidone, de méthanol et de PEG fonctionnalisé amine. On obtient du PEG/polyAANO, que l'on associe avec l'insuline. On précipite à l'aide d'eau de façon à obtenir les PV. Eventuellement, on neutralise, on dialyse, on concentre et on élimine l'eau. On produit ainsi un solide pulvérulent ou des PV en suspension chargé en insuline et on prépare des spécialités pharmaceutiques.
Description
SUSPENSION COLLOÏDALE DE PARTICULES SUBMICRONIQUES DE VECTORISATION DE PRINCIPES ACTIFS HYDROPHILES (INSULINE) ET LEUR
MODE DE PREPARATION Le domaine de la présente invention est celui des Particules de Vectorisation (PV) , utiles pour l'administration de principes actifs (PA) . Ces derniers sont, de préférence, des médicaments ou des nutriments pour l'administration à un organisme animal ou humain par voie orale ou nasale, vaginale, oculaire, sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale, intracérébrale, parentérale, etc.. En termes de nature chimique, les PA plus particulièrement concernés par l'invention sont hydrophiles, par exemple, des protéines, des glycoprotéines, des peptides, des polysaccharides, des lipopolysaccharides, ou des polynucléotides .
La présente invention concerne, plus précisément, des suspensions colloïdales de Particules de Vectorisation, avantageusement de type submicronique, à base de blocs de polyaminoacides hydrophobes et polymères hydrophiles du type polyalkylène-glycol (PAG) , de préférence polyéthylène-glycol (PEG) .
La présente invention vise aussi bien des particules nues (insuline) en tant que telles, que des systèmes de vecteurs de PA hydrophiles, constitués par des particules chargées par le (ou les) PA.
La présente invention a également trait à des solides pulvérulents comprenant ces PV.
L'invention concerne, également, des procédés de préparation desdites suspensions colloïdales de particules, chargées en PA hydrophile (insuline) .
L' encapsulation de PA dans les PV a notamment, pour but de modifier leur durée d'action et/ou de les acheminer au lieu du traitement et/ou augmenter la biodisponibilité desdits PA. De nombreuses techniques d' encapsulation ont déjà été proposées. De telles techniques visent, d'une part, à permettre le transport du PA jusqu'à son site d'action thérapeutique, tout en le protégeant contre les agressions de l'organisme (hydrolyse, digestion enzymatique, etc.) et, d'autre part, à contrôler la libération du
PA sur son site d'action, afin de maintenir la quantité disponible pour l'organisme au niveau désiré. Les PA concernés par ces avatars de transport et de séjour dans l'organisme sont, par exemple, des protéines mais peuvent être, également, des produits tout autres, des molécules organiques d'origine synthétique ou naturelle. La revue de M.J. HUMPHREY (Delivery system for peptide Drugs, éditée par S. DAVIS et L. ILLUM, Plénum Press, N.Y. 1986), fait état de la problématique concernant l'amélioration de la biodisponibilité des PA et l'intérêt des systèmes de vectorisation et de libération contrôlée.
Parmi tous les matériaux envisageables pour former des PV, les polymères sont de plus en plus utilisés, du fait de leurs propriétés intrinsèques. S'agissant du cahier des charges que l'on souhaite obtenir pour les PV, il est particulièrement exigeant et comprend, notamment, les spécifications suivantes.
1 La première spécification recherchée pour les PV serait que le polymère, constituant les PV soit biocompatible, éliminable (par excrétion) et/ou biodégradable et, encore mieux, qu'il soit métabolisé en produits non toxiques pour l'organisme. En outre, il conviendrait que la biodégradation dans l'organisme soit d'une durée suffisamment courte.
2 Les PV auraient avantage à pouvoir former, sans l'aide de solvant organique et/ou de tensioactif, une suspension aqueuse stable.
3 II serait également souhaitable que les PV aient une taille suffisamment faible pour pouvoir subir, en suspension dans un liquide, une filtration stérilisante par un filtre dont le diamètre des pores est inférieur ou égal à 0,2 μm.
4 II est souhaitable que les PV et les systèmes PV-PA puissent être obtenus par un procédé non dénaturant pour le PA.
5 Les PV devraient, avantageusement, permettre de contrôler la vitesse de libération du PA.
6 Une autre spécification importante serait que les systèmes PV-PA puissent constituer d'excellents médicaments injectables. Cette aptitude améliorée de
l'administration par injection -e.g. intraveineuse ou intramusculaire- « injectabilité » se caractérise par : (i) un volume injecté réduit (pour une dose thérapeutique donnée) , (ii) une viscosité faible.
Ces deux propriétés sont satisfaites lorsque la dose thérapeutique de PA est associée à une quantité minimale de PV. En d'autres termes, les PV doivent avoir un fort taux de chargement en PA. 7 Le coût propre aux PV dans une préparation injectable doit être réduit et là encore il convient que les PV aient un fort taux de chargement en PA. En définitive, la faible taille et un fort taux de chargement sont des spécifications majeures recherchées pour les PV. 8 II est également avantageux que le polymère, constitutif des PV, n'induise pas de réponse immunitaire.
9 Pour la famille de PA hydrophiles, en particulier les protéines et plus particulièrement encore l'insuline, il conviendrait d'avoir des PV qui soient adaptés à cette famille de PA en termes de facilité d'association et de libération et en termes de caractère non dénaturant.
Les propositions techniques antérieures, décrites infra, ont tenté de satisfaire l'ensemble de ces spécifications. A titre d'illustration, on citera les propositions antérieures (a) à (j) :
(a) Le brevet US-A-5 286 495 concerne un procédé d' encapsulation par vaporisation de protéines en phase aqueuse, à l'aide de matériaux ayant des charges opposées, à savoir : l'alginate
(chargé négativement) et la polylysine (chargée positivement) . Ce procédé de fabrication permet de produire des particules de taille supérieure à 35 μm .
(b) Par ailleurs, les techniques d'émulsion sont couramment utilisées pour préparer des microparticules chargées de PA. Par exemple, les demandes de brevets WO 91/06286, WO 91/06287 et WO 89/08449 divulguent de telles techniques d'émulsion dans lesquelles on a recours à des solvants organiques pour solubiliser des polymères, par exemple de type polylactique . Mais il s'est avéré que les solvants peuvent être
dénaturants, notamment pour les PA peptidiques ou polypeptidiques . (c) On connaît, également, des PV biocompatibles appelées protéinoïdes, décrites dès 1970 par X. FOX et K. DOSE dans « Molecular Evolution and the origin of Life », Ed. Marcel DEKKER Inc (1977) . Ainsi, la demande de brevet WO 88/01213 propose un système à base d'un mélange de polypeptides synthétiques, dont la solubilité dépend du pH. Pour obtenir les microparticules matricielles selon cette invention, ils solubilisent le mélange de polypeptides, puis avec un changement de pH, ils provoquent la précipitation de particules protéinoïdes. Lorsque la précipitation s'effectue en présence d'un PA, celui-ci est encapsulé dans la particule. (d) On mentionnera également, pour mémoire, le brevet US 4 351 337 qui relève d'un domaine différent de celui de la vectorisation de PA propre à l'invention. Ce brevet divulgue des implants massiques fixés et localisés à des endroits bien précis de l'organisme. Ces implants sont des tubes ou des capsules creuses de taille microscopiques (160 μm et de longueur égale à 2 000 μm) , constitués de copolymères de copoly (aminoacides) -e.g. poly (acide glutamique-leucine) ou poly (benzylglutamate-leucine) - obtenus par copolymérisation de monomères de N-carboxyanhydrides d' aminoacides (NCA) . L'inclusion d'un PA s'opère par une technique d' évaporation de solvant d'un mélange de polymère et de PA. Le brevet US 4 450 150 appartient à la même famille que le brevet US 4 351 337 étudié ci-dessus et a essentiellement le même objet. Les PAA constitutifs sont des poly (acide glutamique- éthylglutamate) .
(e) La demande de brevet PCT/FR WO 97/02810 divulgue une composition pour la libération contrôlée de principes actifs, comprenant une pluralité de particules lamellaires d'un polymère biodégradable, au moins en partie cristallin (polymère d'acide lactique) et d'un PA absorbé sur lesdites particules. Dans ce cas, la libération du principe actif s'opère par désorption.
(f) La publication « CHEMISTRY LETTERS 1995, 707, AKIYOSHI ET AL » concerne la stabilisation d' insuline par complexation supramoléculaire avec des polysaccharides hydrophobisés par greffage de cholestérol. (g) L'article paru dans « MACROMOLECULES 1997, 30, 4013-4017 » décrit des copolymères composés d'un bloc polypeptide à base de L-phénylalanine, de (-benzyl-L-glutamate ou de O- (tétra-O- acétyl-D-glucopyranosyl) -L-sérine, et un bloc synthétique, tels que la poly (2-méthyl-2-oxazoline) ou la poly (2-phényl-2- oxazoline) . Des polymères s'agrègent en milieu aqueux pour former des particules de 400 nm, capables de s'associer avec une enzyme, la lipase. La terme associée signifie ici que la protéine s'adsorbe sur la particule par un phénomène physique
(pas de liaison covalente) . (h) La demande PCT WO 96/29991 a pour objet des particules de polyaminoacides utiles pour la vectorisation de PA dont notamment des PA hydrophiles tels que l'insuline. Ces particules ont une taille comprise entre 10 et 500 nm. Les particules selon le WO 96/29991 se forment spontanément par mise en contact de PAA avec une solution aqueuse. Les PAA comprennent des monomères aminoacides neutres et hydrophobes AAO et des monomères ionisables et hydrophiles AAI . Ces particules peuvent être chargées en insuline, au mieux à hauteur de 6,5 % en poids sec d'insuline par rapport à la masse de PAA. Ta est mesuré selon un mode opératoire Ma décrit plus loin.
(i) L'EP 0 583 955 divulgue des micelles polymère capables de piéger physiquement des PA hydrophobes. Ces micelles sont constitués par des copolymères bloc : PEG/polyAANO (AANO = Amino-Acide Neutre hydrophObe) .
L'AANO peut être : Leu, Val, Phe, Bz-O-Glu, Bz-O-Asp, ce dernier étant préféré. Les principes actifs PA hydrophobes piégés dans ces micelles PEG/polyAANO sont e.g. : adriamycine, indométhacine, daunomycine, methotrexate, mitomycine. Dans cette demande de brevet, seuls sont exemplifiés les micelles à base de PEG/polyGlu-O-Bz . Or, il est à noter que ces esters Glu-O-Bz ne sont pas stables à l'hydrolyse en milieu aqueux. En outre, il n'est nullement question dans ce
document de particules constituées par un copolymère bloc PEG/polyAANO, dont le coeur est formé par le polyamino acide neutre hydrophobe et comprenant une chevelure externe hydrophile à base de PEG, ces particules étant aptes à s'associer avec des PA hydrophiles et à les libérer in vivo, (j) On connaît également des nanoparticules de vectorisation sur lesquelles sont greffées des chaînes de PEG. Il s'agit par exemple de nanoparticules de polylactides ou de liposomes. Ce revêtement de chaînes de PEG est un moyen efficace connu de l'homme de l'art pour éviter l'adsorption de protéines (hydrophiles) sur ces nanoparticules recouvertes de PEG. De telles nanoparticules ou liposomes sont qualifiés de "furtifs". La prévention de l'adsorption de protéines sur une surface par greffage de PEG, est décrite dans un très grand nombre d'articles par exemple : L. Illum et al. J. Pharm.
Sci. 7_2, 1086, (1983) . La description de liposomes "furtifs"
("stealth liposomes") peut être trouvée dans : [DD Lasic, FJ
Martin "Stealth Liposomes" CRC Press (BocaRaton, FL) 1995; MC
Woodle, DD Lasic "Sterically Stabilized Liposomes" Biochim Biophys Acta 1992, 1113, 171-199; MC Woodle "Controlling Liposome Blood Clearance by surface grafted polymers" Advanced Drug Delivery Reviews 1998, 32, 139-152] . On trouvera également une synthèse de ces questions dans : ["Polyethylène-glycol coated biodégradable nanospheres R.Gref et al in "microparticulated for the delivery of proteins and vaccines" S. Cohen et al Ed. Marcel Dekker 1996"] . Comme le chargement en principe actif de ces nanoparticules furtives est empêché, ces auteurs préconisent une encapsulation à cœur des principes actifs par un procédé en voie solvant organique. Or, ce type de procédé est contraire aux spécifications 2 & 4 du cahier des charges ci-dessus défini.
Il ressort donc de ce qui précède que les propositions techniques antérieures sus décrites, et notamment la proposition (i) , satisfont incomplètement aux spécifications du cahier des charges indiqué supra, et, en particulier pour ce qui concerne l'association des particules à des principes actifs hydrophiles (protéines telles que l'insuline) ainsi que l'aptitude de ces
particules chargées en PA hydrophiles à libérer ces derniers in vivo sans qu'ils n'aient été altérés par la vectorisation.
Dans cet état de fait, l'un des objectifs essentiels est de pouvoir fournir de nouvelles PV qui forment spontanément, et sans l'aide de tensioactifs ou de solvants organiques, des suspensions aqueuses stables de PV et adaptées à la vectorisation de PA hydrophiles (notamment des protéines telles que l'insuline). Il s'agit d'obtenir des suspensions de particules chargées en principe actif hydrophile, de préférence en protéines telles que 1 ' insuline.
Un autre objectif essentiel de la présente invention est de fournir de nouvelles PV en suspension aqueuse colloïdale stable (notamment à l 'hydrolyse) ou sous forme pulvérulente et à base de pol (aminoacides) (PAA) , ces nouvelles PV se devant de satisfaire au mieux aux spécifications 1 à 9 du cahier des charges susvisé.
Un autre objectif essentiel de l'invention est de perfectionner les particules divulguées dans la demande EP 0 583 955. Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir une suspension nouvelle de PV dont on maîtrise parfaitement les caractéristiques, notamment en termes du taux de chargement en PA et en termes de contrôle de cinétique de libération du PA.
Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir des suspensions médicamenteuses hydrophiles injectables. Les spécifications, requises pour de telles suspensions, sont un faible volume d'injection et une faible viscosité. Il importe que la masse de particules colloïdales par dose d'injection soit le plus faible possible et ce sans limiter la quantité du principe actif PA transporté par ces particules, afin de ne pas nuire à l'efficacité thérapeutique.
Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir une suspension colloïdale aqueuse ou un solide pulvérulent comprenant des particules de vectorisation de principes actifs satisfaisant aux spécifications visées ci-dessus et qui constitue une forme galénique appropriée et convenable pour une administration, par exemple orale, à l'homme ou l'animal.
Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir une suspension colloïdale comprenant des particules de vectorisation de principes actifs filtrables sur des filtres de 0,2 μm à des fins de stérilisation. Un autre objectif essentiel de l'invention est de proposer un procédé de préparation de particules (sèches ou en suspension dans un liquide) de PAA utiles, notamment, comme vecteurs de principes actifs hydrophiles (notamment protéines telles que l'insuline), ledit procédé se devant d'être, plus simple à mettre en œuvre, non dénaturant pour les principes actifs et devant en outre toujours permettre une maîtrise fine de la granulométrie moyenne des particules obtenues.
Un autre objectif essentiel de l'invention est l'utilisation des susdites particules en suspension aqueuse ou sous forme solide pour la préparation de médicaments (e.g. vaccins), en particulier pour administration notamment orale, nasale, vaginale, oculaire, sous-cutanée, intraveineuse, intra-musculaire, intradermique, intra-péritonéale, intracérébrale ou parentérale, les principes actifs hydrophiles de ces médicaments pouvant être, notamment, des protéines, des glycoprotéines, des peptides, des polysaccharides, des lipopolysaccharides, des oligonucléotides et- des polynucléotides .
Un autre objectif de la présente invention est de fournir un médicament, du type système à libération prolongée de principes actifs, qui soit aisé et économique à produire et qui soit, en outre, biocompatible et apte à assurer un très haut niveau de biodisponibilité du PA.
Les objectifs relatifs aux produits (parmi d'autres) sont atteints par la présente invention qui concerne, tout d'abord, une suspension colloïdale de particules submicroniques susceptibles d'être utilisées, notamment pour la vectorisation de principe (s) actif (s) (PA) , ces particules étant des arrangements supramoléculaires individualisés : • à base d'un copolymère amphiphile comprenant : ^ au moins un bloc de polyaminoacide (s) (PAA) linéaire (s), hydrophobe (s) à enchaînements α- peptidiques, les aminoacides hydrophobes AAO
constitutifs de ce bloc PAA étant identiques ou différents entre eux ; et au moins un bloc de polymère (s) hydrophile (s) du type polyalkylèneglycol (PAG) , de préférence polyéthylène-glycol (PEG) ;
• aptes à s'associer en suspension colloïdale à l'état non dissous, au moins un PA et à libérer celui-ci, notamment in vivo, de manière prolongée et/ou retardée ; caractérisée en ce que les particules qu'elle contient sont associées et/ou peuvent être associées avec au moins un PA sélectionné parmi les PA hydrophiles, de préférence parmi les protéines, ce PA étant plus préférentiellement encore constitué par de l'insuline.
L'un des fondements inventifs de ces nouvelles particules de vectorisation PV, en suspension aqueuse colloïdale stable ou à l'état de solide pulvérulent, tient à la sélection originale d'un copolymère bloc polymère hydrophile/ 'poly -aminoacide hydrophobe permettant d'obtenir des particules de taille submicronique, qui forment une suspension colloïdale aqueuse stable en l'absence de tensioactifs ou de solvants et qui soient adaptés à des PA hydrophiles .
Il est particulièrement surprenant et inattendu que les particules à base de copolymère bloc polymère hydrophile polyalkylèneglycol/polyaminoacide hydrophobe connues pour piéger des principes actifs hydrophobes (EP 0 583 955) , puissent s'associer et libérer in vivo des PA hydrophiles, en particulier des protéines telles que l'insuline.
En outre, l'homme du métier connaissant l'utilisation d'une couche extérieure de PEG pour prévenir l'adsorption des protéines hydrophiles, aurait tout naturellement écarté cette solution pour la conception de nanoparticules devant au contraire adsorber une grande quantité de protéines hydrophiles. Contre toute attente, il n'en est rien dans le cadre de l'invention.
La structure des copolymères bloc PAG/Poly AAO et la nature des acides aminés AAO, sont choisies de telle façon que :
• les chaînes de polymères se structurent spontanément sous forme de particules (PV) de petite taille,
• les particules forment une suspension colloïdale stable dans l'eau et en milieu physiologique,
• les PV s'associent avec des protéines ou autres PA hydrophiles en milieu aqueux, par un mécanisme spontané et non dénaturant pour la protéine,
• les PV libèrent les PA hydrophiles en milieu physiologique et, plus précisément, in vivo ; la cinétique de libération est fonction de la nature du copolymère PAG/Poly AAO précurseur des PV. Ainsi, en jouant sur la structure particulière du copolymère, on peut contrôler les phénomènes d'association et de libération du PA sur le plan cinétique et quantitatif.
De préférence, le PAG correspond à du Polyéthylène-Glycol (PEG) ou à du polypropylène-glycol (PPG) , le PEG étant particulièrement préféré.
Suivant une autre caractéristique de l'invention, le PAG -de préférence le PEG- possède une masse molaire en poids comprise entre 500 et 50000 D, de préférence entre 1000 et 10000 D, et plus préférentiellement encore entre 1000 et 5000 D. Avantageusement, la suspension selon l'invention est caractérisée par un taux de chargement Ta des particules de vectorisation avec l'insuline, exprimé en % de masse d'insuline associée par rapport à la masse et mesuré selon un mode opératoire Ma, Ta étant tel que : 7 < Ta de préférence, 8 < Ta < 50 et, plus préférentiellement encore, 10 < Ta < 30.
Mode opératoire Ma : (a) Préparation d'une solution aqueuse d'insuline : De l'insuline recombinante humaine lyophilisée (Sigma n° 10259) est versée dans une solution HCl 0,1 N durant 5 min à 25°C. Cette solution est ensuite versée dans une solution de tampon phosphate qui est finalement neutralisée par ajout de NaOH de 0,1 N. La solution est laissée ensuite au repos 30 min à température ambiante, puis filtrée sur membrane
® "acrodisc " 0,8-0,2 μm. La masse d'insuline est calculée en
fonction du volume souhaité de solution, afin d'obtenir une concentration de 60 UT/ml. (b) Dispersion des particules de vectorisation en PAA à associer dans la solution d' insuline : Les PV lyophilisées sont ajoutées à la solution d'insuline, à raison de 10 g PV/ l de solution. Ce mélange est agité au vortex à deux ou trois reprises, puis placé dans un agitateur à basculement à température ambiante pendant 18 heures. La suspension colloïdale est ensuite conservée à 4°C. (c) Séparation de l'insuline libre de l'insuline associée et dosage de l'insuline libre : La solution, contenant l'insuline et les PV, est centrifugée 1 heure sous 60 000 g à 20°C. Le surnageant est disposé dans des tubes munis d'une membrane d'ultrafiltration (seuil de coupure 100 OOODa) et centrifugé sous 3 000 g 2 heures à 20°C. L'insuline dans le filtrat est dosée par CLHP.
Pour définir un peu plus les copolymères constitutifs des particules, on peut indiquer qu'ils sont du type séquentiel alterné (blocs) .
Ainsi, selon une forme préférée de réalisation de la suspension de PV selon l'invention : les AAO sont des acides aminés neutres hydrophobes AANO, le rapport PAG/AANO est > 1, - et la longueur absolue du bloc PEG est > 2 monomères, de préférence > 10 monomères, et plus préférentiellement > 20 monomères. Avantageusement, le ou les blocs PAA à base d'AANO en comprennent au moins 5, de préférence au moins 10, et plus préférentiellement encore au moins entre 10 et 50.
De manière plus préférée encore, les particules sont des "diblocs" de PEG/AANO.
Ces aminoacides neutres hydrophiles (AANO) sont en pratique sont choisis dans le groupe comprenant: • des acides aminés neutres naturels : Leu, Ile, Val, Ala, Pro, Phe, leurs mélanges, • des acides aminés neutres, rares ou synthétiques : norleucine, norvaline,
• des dérivés des acides aminés polaires : Glutamate de méthyl, glutamate de éthyle, aspartate de benzyle, N- acétyllysine.
Suivant une caractéristique préférée de l'invention, les PAA blocs constitutifs des particules ont des degrés de polymérisation
DP compris entre 30 et 600, de préférence entre 50 et 200 et, plus préférentiellement encore, entre 60 et 150.
La présente invention vise, non seulement des suspensions de particules nues, telles que définies ci-dessus, mais également des particules comprenant au moins un principe actif PA De préférence, la suspension selon l'invention est aqueuse et stable. Ces particules, chargées ou non en PA, sont, avantageusement, sous forme dispersée dans un liquide (suspension) , de préférence aqueux, mais peuvent également être à l'état de solide pulvérulent, obtenu à partir de la suspension de PV telle que définie ci-dessus.
D'où il s'ensuit que l'invention concerne, outre une suspension colloïdale (de préférence aqueuse) de PV, un solide pulvérulent comprenant des PV et obtenu à partir de la suspension selon l'invention.
Un autre objet essentiel de l'invention se rapporte à la préparation des particules sélectionnées (telles que décrites ci- avant) , aussi bien sous forme de suspension colloïdale que sous forme de solide pulvérulent. Le procédé de préparation considéré consiste, essentiellement, à synthétiser des copolymères PAG/polyAAO précurseur et à les transformer en particules structurées .
Plus précisément, il s'agit, tout d'abord, d'un procédé de préparation du solide pulvérulent susvisé et formé par de particules structurées submicroniques susceptibles d'être utilisées, notamment pour la vectorisation de principe (s) actif (s), ces particules étant des arrangements supramoléculaires discrets :
• à base d'un copolymère amphiphile comprenant : au moins un bloc de polyaminoacide (s) (PAA) linéaire (s), hydrophobe (s) à enchaînements α- peptidiques, les aminoacides hydrophobes AAO
constitutifs de ce bloc PAA étant identiques ou différents entre eux ; et au moins un bloc de polymère (s) hydrophile (s) du type polyalkylèneglycol (PAG) , de préférence polyéthylène-glycol (PEG) ;
• aptes à s'associer en suspension colloïdale à l'état non dissous, au moins un PA et à libérer celui-ci, notamment in vivo, de manière prolongée et/ou retardé.
Ce procédé est caractérisé en ce que :
1) on fait réagir au moins un segment PAG avec au moins un segment PAA comprenant chacun au moins un monomère alkylène-glycol ou aminoacide respectivement et au moins une fonction réactive permettant de former une ou des liaisons PAA-PAG (de préférence amide) , de façon à obtenir un copolymère bloc PAG-polyAAO ;
2) on précipite -de préférence dans l'eau-, le copolymère bloc PAG-polyAAO obtenu à 1 ' étape 1 , ce qui conduit à la formation spontanée de particules de vectorisation de PA ;
3) on associe au moins un principe actif PA hydrophile avec les particules ;
4) éventuellement on dialyse le milieu réactionnel pour purifier la suspension aqueuse de particules structurées ;
5) éventuellement on concentre cette suspension de 1 ' étape 4 ;
6) on élimine le milieu liquide pour recueillir le solide pulvérulent comprenant les particules.
Les fonctions des segments PAG et PAA de l'étape 1 peuvent être des fonctions aminé ou acide carboxylique. On peut envisager de réaliser la polymérisation conduisant au bloc PAG et/ouPAA avant, pendant ou après la formation de la liaison PAG-PAA. Toutes ces variantes sont à la portée de l'homme de l'art. De préférence, dans l'étape 1 :
1.1) on réalise une copolymérisation de monomères formés par des anhydrides de N-CarboxyAminoacides (NCA) d1 aminoacides hydrophobes AAO en présence :
- d'au moins un solvant polaire non aromatique, de préférence choisi dans le groupe comprenant : la N-
MéthylPyrrolidone (NMP) , le DiMéthylFormamide (DMF) , le DiMéthylsuifOxyde (DMSO) , le DiMéthylAcétamide
(DMAc) , la pyrrolidone ; la NMP étant plus particulièrement préférée ; - et éventuellement d'au moins un co-solvant sélectionné parmi les solvants aprotiques (de préférence le dioxanne-1,4) et/ou les solvants protiques
(de préférence la pyrrolidone) et/ou l'eau et/ou les alcools, le methanol étant particulièrement préféré ; 1.2) on met en œuvre ou on prépare par polymérisation de monomères alkylène-glycol (de préférence ethylène ou propylène-glycol) au moins un bloc polymère PAG de poly-alkylène-glycol (de préférence de PEG ou PPG) ; ce bloc PAG étant fonctionnalisé (avantageusement à au moins l'une de ses extrémités) par au moins un groupement réactif nucléophile, de préférence choisi dans le groupe comprenant les aminés (en particulier les aminés primaires ou secondaires) , les alcools ou les thiols; 1.3) on ajoute le PAG fonctionnalisé de l'étape 2 au milieu de polymérisation du bloc de poly-AAO, avant, pendant ou après la polymérisation.
L'étape 1.1 du procédé s'inspire des techniques connues de polymérisation d'anhydrides de N-carboxy- (α-aminoacides (NCA), décrites, par exemple, dans l'article « Biopolymers, 15, 1869
(1976) » et dans l'ouvrage de H.R. KRICHELDORF « α-Aminoacid-N- carboxy Anhydride and Related Heterocycles » Springer Verlag
(1987) .
Suivant une variante, à l'issue de l'étape 1.1, on précipite -de préférence dans l'eau- le copolymère poly(AOO) (pAAI) obtenu et on recueille ce précipité. Cette variante correspond à un mode discontinu de préparation de particules, dans lequel on isole le copolymère poly (AAO) (pAAI) sous forme de précipité formant un
produit intermédiaire stable. Ce précipité peut être, par exemple, filtré, lavé et séché.
De manière plus préférée encore, les NCA-pAAI sont des NCA d'acide glutamique ou aspartique O-alkylê, par exemple des NCA- Glu-O-Me, NCA-Glu-O-Et ou NCA-Glu-O-Bz (Me = méthyle - Et = éthyle) .
De préférence, le ou les bloc (s) PAG fonctionnalisé (s) est (sont) introduit (s) avant et/ou au début de la polymérisation, qui se déroule de préférence à une température comprise entre 20 et 120°C à pression atmosphérique normale.
Avantageusement, les PAG de l'étape 1.2 sont des produits commerciaux disponibles (PEG e.g.), ou bien encore sont obtenus de manière connue en soi par polymérisation d'oxyde d'éthylène
D'autres paramètres, comme la concentration en polymère, la température du mélange réactionnel, le mode d'ajout du polymère hydrophile, l'emploi de pression réduite, la durée de la réaction, etc.. sont ajustés selon les effets désirés et bien connus de
1 ' homme de 1 ' art .
Pour effectuer l'association (étape 3) d'un ou plusieurs PA aux particules, il est possible de mettre en œuvre plusieurs méthodes conformément à l'invention. Des exemples, non limitatifs, de ces méthodes sont énumérés ci-après.
Selon une première méthode, on effectue l'association de PA aux particules par mise en présence d'une phase liquide (aqueuse ou non) contenant le PA avec la suspension colloïdale de particules .
Selon une deuxième méthode, on effectue l'association du PA aux particules par mise en présence d'un PA à l'état solide avec la suspension colloïdale de particules. Le PA solide peut être, par exemple, sous forme de lyophilisât, de précipité, de poudre ou autre .
Selon une troisième méthode, on met en présence le solide pulvérulent (PAA) , tel que décrit supra en tant que produit et par ses caractéristiques d'obtention, avec une phase liquide (aqueuse ou non) contenant le PA.
Selon une quatrième méthode, on met en présence le solide pulvérulent, tel que décrit supra en tant que produit et par ses caractéristiques d'obtention, avec le PA sous forme solide. On
disperse ensuite ce mélange de solides, dans une phase liquide, de préférence une solution aqueuse.
Dans toutes ces méthodes, le PA utilisé peut être sous forme pure ou préformulée. Conformément à l'étape facultative 5, on élimine les impuretés (sels) ainsi que le solvant, par tout traitement de séparation physique approprié, par exemple par diafiltration (dialyse) (étape 4) , filtration, modification pH, chromâtographie... Cela conduit à une suspension aqueuse de particules structurées qui peut être concentrée, par exemple par distillation ou tout autre moyen physique convenable : ultrafiltration, centrifugation.
Pour concentrer (étape 6) ou pour séparer (étape 7) les particules de leur milieu liquide de suspension, on élimine, éventuellement, la phase aqueuse, par exemple par distillation par séchage (e.g. à l'étuve), par lyophilisation ou tout autre moyen physique convenable : ultrafiltration, centrifugation. On récupère, à l'issue de cette étape 7, un solide pulvérulent, de couleur blanche . II est à noter que la mise en œuvre des étapes 1, 2, 3, 4 et éventuellement 5 du procédé ci-dessus correspondant à une préparation d'une suspension colloïdale de particules submicroniques et à fort taux de chargement avec les PA hydrophiles . Lors de cette préparation de suspension colloïdale, les copolymères amphiphiles PAG-poly (AAO) de l'étape 1 sont placés dans un milieu aqueux dans lequel au moins une partie des PAG est soluble et au moins une partie des AANO est insoluble. Les copolymères PAG/polyAANO existent sous forme de nanoparticules dans ce milieu aqueux.
Une alternative pour préparer la suspension de PV selon l'invention consiste à mettre en présence le solide pulvérulent, tel que décrit ci-dessus en tant que produit et par son procédé d'obtention, avec un milieu aqueux, non solvant des AANO. Compte tenu de la taille nanométrique des particules, la suspension peut être filtrée sur des filtres de stérilisation, ce qui permet d'obtenir, aisément et à moindre coût, des liquides médicamenteux injectables stériles. Le fait de pouvoir, grâce à
l'invention, contrôler la taille des particules et atteindre des valeurs de Dh entre 25 et 100 nm, est un atout important.
La présente invention vise, également, de nouveaux produits intermédiaires du procédé décrit ci-dessus, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par des copolymères PAG-polyAAO précurseurs de particules.
Selon un autre de ses aspects, l'invention concerne une suspension et/ou un solide pulvérulent, tels que définis ci-dessus et/ou tels qu'obtenus par le procédé présenté supra, cette suspension et ce solide comprenant au moins un principe actif hydrophile, choisi, de préférence, parmi :
• les vaccins ;
• les protéines et/ou les peptides, parmi lesquels les plus préférentiellement retenus sont : les hémoglobines, les cytochromes, les albumines, les interférons, les antigènes, les anticorps, l' érythropoïétine, l'insuline, les hormones de croissance, les facteurs VIII et IX, les interleukines ou leurs mélanges, les facteurs stimulants de l'hématopoïèse ;
• les polysaccharides, l'héparine étant plus particulièrement sélectionnée ;
• les acides nucléiques et, préférablement, les oligonucléotides d'ARN et/ou d'ADN ; • des molécules non peptido-protéiques appartenant à diverses classes de chimiothérapie anticancéreuses et, en particulier, les anthracyclines et les taxoïdes , -
• et leurs mélanges .
Enfin, l'invention concerne une spécialité pharmaceutique, nutritionnelle, phytosanitaire ou cosmétique, caractérisée en ce qu'elle comporte une suspension et/ou du solide pulvérulent chargé (s) en PA hydrophile et tels que définis ci-dessus.
Selon un autre de ses objets, l'invention vise, également, l'utilisation de ces PV (en suspension ou sous forme solide) chargées en PA, pour la fabrication de médicaments du type systèmes à libération contrôlée de PA.
Il peut s'agir, par exemple de ceux administrables, de préférence par voie orale, nasale, vaginale, oculaire, sous- cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale, intracérébrale ou parentérale. Les applications cosmétiques envisageables sont, par exemple, les compositions comprenant un PA associé aux PV selon l'invention et applicables par voie transdermique.
Les exemples qui suivent et qui concernent le PA hydrophile formé par l'insuline permettront de mieux comprendre l'invention dans ses différents aspects produit/procédé/application. Ces exemples illustrent la préparation de particules de polyaminoacides chargés ou non en insuline, de même qu'ils présentent les caractéristiques de structure et les propriétés de ces particules.
LEGENDES DES FIGURES
Fig 1 - Evolution de la glycémie G : [..—o..—] (moyenne en % basai) et de 1 ' insulinémie moyenne I (en mUl/1) : [—•—] après injection d'une formulation de PV chargée en insuline à raison de 0,5 Ul/kg, en fonction du temps T (en heures) .
EXEMPLES
Exemple 1 - Préparation du polymêre-poly (leucine) -bloc-polyéthylèneglycol
Les techniques utilisées, pour la polymérisation des NCA en polymères de structures en blocs ou statistiques sont connues de l'homme de l'art et sont détaillées dans l'ouvrage de H. R. KRICHELDORF "α-aminoacides-N-Carboxy Anhydrides and Related Heterocycles", Springer Verlag (1987). La synthèse suivante précise la synthèse de l'un d'entre eux.
Synthèse de la poly (Ala) 40- PEG: 10 g de NCA-Leu sont solubilisés dans 150 ml de NMP à 60°C. 5 ml d'une solution de 2 g de aminoethyl-PEG (Mw = 5000 D) dans 50 ml de NMP sont ajoutés au monomère en une fois. Après 2 h, on verse le milieu réactionnel
dans 11 d'eau. Le précipitât formé est filtré, lavé et séché.
Rendement > 95%.
Exemple 2 -
Préparation du polymère-poly (phénylalanine) -bloc- polyéthylêneglycol
Synthèse de la poly (Leu) 40- PEG: 10 g de NCA-Phe sont solubilisés dans 150 ml de NMP à 60°C. 5 ml d'une solution de 2 g de aminoethyl-PEG (Mw = 5000 D) dans 50 ml de N-méthylpyrrolidone (NMP) sont ajoutés au monomère en une fois. Après 2 h, on vers le milieu réactionnel dans 11 d'eau. Le précipitât formé est filtré, lavé et séché. Rendement > 95%.
Exemple 3 - Mise en évidence des nanoparticules par Diffusion de la Lumière (DDL) et par Microscopie Electronique à Transmission (TEM)
10 mg de particules du polymère 1 sont suspendus dans 10 ml d'eau ou une solution aqueuse de sel. Cette solution est ensuite introduite dans un granulomètre Coulter (ou diffractomètre laser) . Les résultats de l'analyse de la granulométrie des différents produits testés sont présentés dans le tableau 1 suivant .
Exemple 4 -
Test d'association des nanoparticules avec une protéine
(1' insuline)
A partir d'une solution tampon phosphate isotonique de pH 7,4, on prépare une solution d'insuline humaine titrée à 1,4 mg/ l correspondant à 40 Ul/ml. Dans 1 ml de cette solution d'insuline, on disperse 10 mg du PV préparé dans l'exemple 1. Après 15 heures d'incubation à température ambiante, l'insuline associée aux PV et
l'insuline libre sont séparées par centrifugation (60 000 g, 1 heure) et ultrafiltration (seuil de filtration 300 000 D) . L'insuline libre récupérée dans le filtrat est dosée par CLHP ou par ELISA et l'on en déduit par différence la quantité d'insuline associée. La quantité d'insuline associée au PV est supérieure à 0,77 mg, ce qui représente plus de 55 % du total de l'insuline engagée .
Le tableau suivant rassemble les résultats des mesures de taux d'association effectuées sur différents PV. Le taux d'association exprime le pourcentage d' insuline associée par rapport à l'insuline engagée dans une préparation titrée à 1.4 mg/ml d'insuline et 10 mg/ml de PV. Cette valeur est transformée en un taux de chargement qui exprime une formulation à 100% de fixation de la protéine, en mg d'insuline par 100 mg de PV.
Tableau 2 - Mesures du taux d'association avec l'insuline pour un mélange 0.14 mg INSULINE/mg PV
Exemple 5 -
Pharmacocinétique et pharmacodynamie des PV-chargés avec l'insuline chez le chien sain à jeun
Le protocole de cet exemple est le suivant : La préparation de l'exemple 4 a été injectée à des chiens, rendus diabétiques par pancréatectomie totale, et à jeun de la veille au soir. L'administration à 11 heures du matin par voie sous cutanée thoracique de la préparation a été faite à la posologie de 0,5 Ul/kg d'insuline par Kg de poids vif de l'animal. Le volume administré est compris entre 0,18 et 0,24 ml. Au temps -4, -2, 0, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 et 48 heures, 1 ml de sang sont prélevés par ponction jugulaire sous vide sur tube héparinate de sodium. 30 μl de sang total sont utilisés extemporanément pour mesure de la glycémie. Le tube est ensuite
centrifugé, décanté et le plasma stocké à -20°C pour dosage de l'insuline. Les résultats présentés dans la figure 1 ci-après montrent un relarguage de l'insuline jusqu'à 12 heures (trait plein) et un effet hypoglycémiant important qui se prolonge jusqu'à 20 heures (trait discontinu) après l'injection.
Tableau 3 - Mesures du temps d'action de l'insuline (effet hypoglycémiant) en présence de PV selon l'invention
Cet exemple démontre la non denaturation de l'insuline en présence de PV selon l'invention.
Il met également en évidence l'augmentation de la durée d'action de l'insuline par rapport à l'insuline non formulée, et donc, l'utilité des PV comme système à libération contrôlée de 1 ' insuline.
Claims
1.2) on met en œuvre ou on prépare par polymérisation de monomères alkylène-glycol (de préférence ethylëne ou propylène-glycol) au moins un bloc polymère PAG de poly-alkylène-glycol (de préférence de PEG ou PPG) ; ce bloc PAG étant fonctionnalisé (avantageusement à au moins l'une de ses extrémités ) par au moins un groupement réactif nucléophile, de préférence choisi dans le groupe comprenant les aminés (en particulier les aminés primaires ou secondaires) , les alcools ou les thiols ;
1.3) on ajoute le PAG fonctionnalisé de l'étape 2 au milieu de polymérisation du bloc de poly-AAO, avant, pendant ou après la polymérisation.
12- Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que, le ou les bloc (s) PAG fonctionnalisé (s) est (sont) introduit (s) avant et/ou au début de la polymérisation, qui se déroule de préférence à une température comprise entre 20 et 120°C à pression atmosphérique normale.
13- Procédé de préparation de la suspension selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'on met en présence d'un milieu aqueux non solvant des AAO, le solide pulvérulent selon la revendication 9 et/ou le solide pulvérulent obtenu par le procédé selon la revendication 10.
14- Procédé de préparation de la suspension selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes 1,2,3,4 et éventuellement 5 du procédé selon la revendication 10.
15- Procédé de préparation de la suspension selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'on effectue l'association du PA hydrophile aux particules, par mise en présence d'une phase liquide contenant ledit PA hydrophile avec la suspension colloïdale de particules.
16- Procédé de préparation de la suspension selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'on effectue l'association du PA hydrophile aux particules par mise en présence dudit PA à l'état solide avec la suspension colloïdale de particules .
17- Procédé de préparation de la suspension selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'on met en présence le solide pulvérulent selon la revendication 9 et/ou le solide pulvérulent obtenu par le procédé selon la revendication 10, avec une phase liquide contenant le PA hydrophile.
18- Procédé de préparation de la suspension selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'on met en présence le solide pulvérulent selon la revendication 9 et/ou le solide pulvérulent obtenu par le procédé selon la revendication 10, avec le PA hydrophile sous forme solide et en ce que l'on disperse ce mélange de solides dans une phase liquide, de préférence une solution aqueuse.
19- Produits intermédiaires du procédé selon la revendication 10 ou 11, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par des copolymères PAG-polyAAO, de préférence PEG-polyAANO, précurseurs de particules.
20- Suspension selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 et/ou obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 18 et/ou solide pulvérulent selon la revendication 9 comprenant un moins un principe actif hydrophile choisi, de préférence, parmi : o les vaccins ; o les protéines et/ou les peptides, parmi lesquels les plus préférentiellement retenus sont : les hémoglobines, les cytochromes, les albumines, les interférons, les antigènes, les anticorps, l'érythropoïétine, l'insuline, les hormones de
croissance, les facteurs VIII et IX, les interleukines ou leurs mélanges, les facteurs stimulants de l'hématopoïèse ; o les polysaccharides, l'héparine étant plus particulièrement sélectionnée ; o les acides nucléiques et, préférablement, les oligonucléotides d'ARN et/ou d'ADN ; o des molécules non peptido-protéiques appartenant à diverses classes de chimiothérapie anti- cancéreuses et, en particulier, les anthracyclines et les taxoïdes ; o et leurs mélanges .
21- Spécialité pharmaceutique, nutritionnelle, phytosanitaire ou cosmétique, caractérisée en ce qu'elle comporte une suspension selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 et/ou obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 18 et/ou du solide pulvérulent selon la revendication 9.
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