WO2002028374A1 - Suspension colloidale de particules submicroniques de vectorisation de principes actifs hydrophiles (insuline) et leur mode de preparation - Google Patents

Suspension colloidale de particules submicroniques de vectorisation de principes actifs hydrophiles (insuline) et leur mode de preparation Download PDF

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WO2002028374A1
WO2002028374A1 PCT/FR2001/003028 FR0103028W WO0228374A1 WO 2002028374 A1 WO2002028374 A1 WO 2002028374A1 FR 0103028 W FR0103028 W FR 0103028W WO 0228374 A1 WO0228374 A1 WO 0228374A1
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suspension
insulin
pag
hydrophilic
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PCT/FR2001/003028
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Nathan Bryson
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Flamel Technologies
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    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics

Definitions

  • the field of the present invention is that of Vectorization Particles (PV), useful for the administration of active principles (PA).
  • PV Vectorization Particles
  • PA active principles
  • the latter are preferably drugs or nutrients for administration to an animal or human body by the oral or nasal, vaginal, ocular, subcutaneous, intravenous, intramuscular, intradermal, intraperitoneal, intracerebral, parenteral, etc. routes.
  • the APs more particularly concerned with the invention are hydrophilic, for example, proteins, glycoproteins, peptides, polysaccharides, lipopolysaccharides, or polynucleotides.
  • the present invention relates, more specifically, to colloidal suspensions of Vectorization Particles, advantageously of the submicron type, based on blocks of hydrophobic polyamino acids and hydrophilic polymers of the polyalkylene glycol (PAG) type, preferably polyethylene glycol (PEG).
  • PAG polyalkylene glycol
  • PEG polyethylene glycol
  • the present invention is aimed both at naked particles (insulin) as such, as well as hydrophilic AP vector systems, constituted by particles loaded with the PA (s).
  • the present invention also relates to pulverulent solids comprising these PV.
  • the invention also relates to methods for preparing said colloidal suspensions of particles loaded with hydrophilic PA (insulin).
  • the purpose of encapsulating PA in PV is in particular to modify their duration of action and / or to route it to the place of treatment and / or to increase the bioavailability of said PA.
  • Many encapsulation techniques have already been proposed. On the one hand, such techniques aim to allow the transport of PA to its site of therapeutic action, while protecting it against attacks by the organism (hydrolysis, enzymatic digestion, etc.) and, on the other hand, to control the release of the PA on its site of action, in order to maintain the quantity available for the organism at the desired level.
  • the AP concerned by these avatars of transport and stay in the organism are, for example, proteins but can be, also, quite different products, organic molecules of synthetic or natural origin.
  • the first specification sought for PV would be that the polymer constituting PV is biocompatible, eliminable (by excretion) and / or biodegradable and, even better, that it is metabolized into non-toxic products for the organism.
  • biodegradation in the body should be of a sufficiently short duration.
  • 2 PV would have the advantage of being able to form, without the aid of organic solvent and / or surfactant, a stable aqueous suspension.
  • the PVs it would also be desirable for the PVs to be of sufficiently small size to be able to undergo, in suspension in a liquid, sterilizing filtration by a filter whose pore diameter is less than or equal to 0.2 ⁇ m.
  • PV and PV-PA systems can be obtained by a non-denaturing process for PA.
  • PV-PA systems can be excellent injectable drugs.
  • This improved ability to administration by injection - intravenous or intramuscular eg - "injectability" is characterized by: (i) a reduced injected volume (for a given therapeutic dose), (ii) low viscosity.
  • PV must have a high PA loading rate. 7
  • the specific cost of PV in an injectable preparation must be reduced and here again, PV must have a high PA loading rate.
  • the small size and a high loading rate are major specifications sought for PV. 8 It is also advantageous for the polymer constituting the PVs not to induce an immune response.
  • PVs which are adapted to this family of PAs in terms of ease of association and release and in terms of character. non denaturing.
  • US-A-5,286,495 relates to a process of encapsulation by vaporization of proteins in aqueous phase, using materials having opposite charges, namely: alginate
  • patent application WO 88/01213 proposes a system based on a mixture of synthetic polypeptides, the solubility of which depends on the pH.
  • they dissolve the mixture of polypeptides, then with a change in pH, they cause the precipitation of proteinoid particles. When the precipitation takes place in the presence of an AP, this is encapsulated in the particle.
  • AP proteinoid particles
  • These implants are hollow tubes or capsules of microscopic size (160 ⁇ m and length equal to 2000 ⁇ m), made up of copolymers of copoly (amino acids) -eg poly (glutamic acid-leucine) or poly (benzylglutamate-leucine) - obtained by copolymerization of monomers of N-carboxyanhydrides of amino acids (NCA).
  • the inclusion of a PA is carried out by a technique of evaporation of solvent from a mixture of polymer and PA.
  • the US patent 4,450,150 belongs to the same family as the US patent 4,351,337 studied above and has essentially the same subject.
  • the constituent PAAs are poly (glutamic acid-ethyl glutamate).
  • PCT / FR patent application WO 97/02810 discloses a composition for the controlled release of active principles, comprising a plurality of lamellar particles of a biodegradable polymer, at least partly crystalline (lactic acid polymer) and of a PA absorbed on said particles. In this case, the release of the active ingredient takes place by desorption.
  • the publication "CHEMISTRY LETTERS 1995, 707, AKIYOSHI ET AL” concerns the stabilization of insulin by supramolecular complexation with hydrophobized polysaccharides by grafting of cholesterol.
  • PCT application WO 96/29991 relates to polyamino acid particles useful for vectorization of PA including in particular hydrophilic PA such as insulin. These particles have a size between 10 and 500 nm.
  • the particles according to WO 96/29991 are formed spontaneously by bringing PAA into contact with an aqueous solution.
  • PAAs include neutral and hydrophobic AAO amino acid monomers and ionizable and hydrophilic AAI monomers. These particles can be loaded with insulin, at most up to 6.5% by dry weight of insulin relative to the mass of PAA. Ta is measured according to a procedure Ma described below.
  • the AANO can be: Leu, Val, Phe, Bz-O-Glu, Bz-O-Asp, the latter being preferred.
  • the hydrophobic active ingredients PA trapped in these PEG / polyAANO micelles are eg: adriamycin, indomethacin, daunomycin, methotrexate, mitomycin.
  • adriamycin indomethacin
  • daunomycin daunomycin
  • methotrexate mitomycin
  • one of the essential objectives is to be able to supply new PVs which spontaneously form, and without the aid of surfactants or organic solvents, stable aqueous suspensions of PV and suitable for the vectorization of hydrophilic PAs (including proteins such as insulin). It is a question of obtaining suspensions of particles loaded with hydrophilic active principle, preferably in proteins such as insulin.
  • Another essential objective of the present invention is to provide new PVs in a stable colloidal aqueous suspension (especially on hydrolysis) or in powder form and based on pol (amino acids) (PAA), these new PVs having to satisfy the better to specifications 1 to 9 of the above mentioned specifications.
  • PAA amino acids
  • Another essential objective of the invention is to improve the particles disclosed in application EP 0 583 955.
  • Another essential objective of the invention is to provide a new suspension of PV whose characteristics are perfectly mastered, in particular in terms of the rate PA loading and in terms of controlling PA release kinetics.
  • Another essential objective of the invention is to provide injectable hydrophilic drug suspensions.
  • the specifications required for such suspensions are a low injection volume and a low viscosity. It is important that the mass of colloidal particles per injection dose is as low as possible and this without limiting the amount of the active ingredient PA transported by these particles, so as not to harm therapeutic efficacy.
  • Another essential objective of the invention is to provide an aqueous colloidal suspension or a pulverulent solid comprising vectoring particles of active principles satisfying the specifications referred to above and which constitutes an appropriate dosage form suitable for administration, for example oral , to humans or animals.
  • Another essential objective of the invention is to provide a colloidal suspension comprising vectoring particles of active principles which can be filtered on 0.2 ⁇ m filters for sterilization purposes.
  • Another essential objective of the invention is to provide a process for the preparation of particles (dry or in suspension in a liquid) of PAA useful, in particular, as vectors for hydrophilic active principles (in particular proteins such as insulin), said process should be, simpler to implement, non-denaturing for the active ingredients and should also always allow fine control of the average particle size of the particles obtained.
  • Another essential objective of the invention is the use of the above particles in aqueous suspension or in solid form for the preparation of medicaments (eg vaccines), in particular for administration in particular oral, nasal, vaginal, ocular, subcutaneous, intravenous , intramuscular, intradermal, intraperitoneal, intracerebral or parenteral,
  • medicaments eg vaccines
  • the hydrophilic active principles of these drugs can be, in particular, proteins, glycoproteins, peptides, polysaccharides, lipopolysaccharides, oligonucleotides and- polynucleotides.
  • Another objective of the present invention is to provide a medicament, of the system of sustained release system of active principles, which is easy and economical to produce and which is, moreover, biocompatible and capable of ensuring a very high level of bioavailability of the AP. .
  • the present invention which relates, first of all, to a colloidal suspension of submicronic particles capable of being used, in particular for the vectorization of active principle (s) (PA), these particles being individualized supramolecular arrangements: • based on an amphiphilic copolymer comprising: ⁇ at least one block of linear polyamino acid (PAA), hydrophobic (s) with ⁇ -peptide sequences, hydrophobic amino acids AAO constituting this PAA block being identical or different from each other; and at least one block of hydrophilic polymer (s) of the polyalkylene glycol (PAG) type, preferably polyethylene glycol (PEG);
  • PAA polyamino acid
  • PAG polyalkylene glycol
  • PEG polyethylene glycol
  • One of the inventive foundations of these new PV vectoring particles, in stable colloidal aqueous suspension or in the form of a pulverulent solid, is due to the original selection of a hydrophilic polymer / poly-amino acid hydrophobic block copolymer making it possible to obtain particles of submicron size, which form a stable aqueous colloidal suspension in the absence of surfactants or solvents and which are suitable for hydrophilic APs.
  • the particles based on hydrophilic polymer block polymer polyalkylene glycol / hydrophobic polyamino acid known to trap hydrophobic active principles can associate and release in vivo hydrophilic PA, in particular proteins such as insulin.
  • PVs associate with proteins or other hydrophilic PAs in an aqueous medium, by a spontaneous and non-denaturing mechanism for the protein
  • PVs release hydrophilic PAs in a physiological medium and, more precisely, in vivo; the release kinetics are a function of the nature of the PAG / Poly AAO copolymer precursor of PV.
  • the particular structure of the copolymer it is possible to control the phenomena of association and of release of the AP on the kinetic and quantitative plan.
  • the PAG corresponds to Polyethylene Glycol (PEG) or to Polypropylene Glycol (PPG), PEG being particularly preferred.
  • PEG Polyethylene Glycol
  • PPG Polypropylene Glycol
  • the PAG - preferably the PEG - has a molar mass by weight of between 500 and 50,000 D, preferably between 1,000 and 10,000 D, and more preferably still between 1,000 and 5,000 D.
  • the suspension according to the invention is characterized by a loading rate Ta of the particles of vectorization with insulin, expressed in% of mass of insulin associated with respect to the mass and measured according to a procedure Ma, Ta being such that: 7 ⁇ Ta preferably, 8 ⁇ Ta ⁇ 50 and, more preferably still, 10 ⁇ Ta ⁇ 30.
  • Procedure Ma (a) Preparation of an aqueous insulin solution: Lyophilized human recombinant insulin (Sigma No. 10259) is poured into 0.1 N HCl solution for 5 min at 25 ° C. This solution is then poured into a phosphate buffer solution which is finally neutralized by adding 0.1 N NaOH. The solution is then left to stand for 30 min at room temperature, then filtered through a membrane.
  • AAOs are hydrophobic neutral amino acids AANO, the PAG / AANO ratio is> 1, - and the absolute length of the PEG block is> 2 monomers, preferably> 10 monomers, and more preferably> 20 monomers.
  • the PAA block (s) based on AANO comprise at least 5, preferably at least 10, and more preferably still at least between 10 and 50.
  • the particles are "diblocks" of PEG / AANO.
  • hydrophilic neutral amino acids are in practice chosen from the group comprising: • natural neutral amino acids: Leu, Ile, Val, Ala, Pro, Phe, their mixtures, • neutral, rare or synthetic amino acids: norleucine , norvaline, • derivatives of polar amino acids: methyl glutamate, ethyl glutamate, benzyl aspartate, N-acetyllysine.
  • the PAA blocks constituting the particles have degrees of polymerization
  • DP between 30 and 600, preferably between 50 and 200 and, more preferably still, between 60 and 150.
  • the present invention relates not only to suspensions of bare particles, as defined above, but also to particles comprising at least one active principle PA.
  • the suspension according to the invention is aqueous and stable.
  • These particles, loaded or not with PA, are advantageously in the form dispersed in a liquid (suspension), preferably aqueous, but can also be in the form of a pulverulent solid, obtained from the PV suspension as defined above.
  • the invention relates, in addition to a colloidal (preferably aqueous) suspension of PV, a pulverulent solid comprising PV and obtained from the suspension according to the invention.
  • Another essential object of the invention relates to the preparation of the selected particles (as described above), both in the form of a colloidal suspension and in the form of a pulverulent solid.
  • the preparation process under consideration essentially consists in synthesizing precursor PAG / polyAAO copolymers and in transforming them into structured particles.
  • an amphiphilic copolymer comprising: at least one block of linear polyamino acid (s) (PAA), hydrophobic (s) with ⁇ -peptide sequences, the hydrophobic amino acids AAO constituting this PAA block being identical or different from each other; and at least one block of hydrophilic polymer (s) of the polyalkylene glycol (PAG) type, preferably polyethylene glycol (PEG);
  • PAA linear polyamino acid
  • PAG polyalkylene glycol
  • PEG polyethylene glycol
  • At least one hydrophilic active ingredient PA is associated with the particles
  • step 1 The functions of the PAG and PAA segments of step 1 can be amine or carboxylic acid functions. It is possible to envisage carrying out the polymerization leading to the PAG and / or PAA block before, during or after the formation of the PAG-PAA bond. All these variants are within the reach of those skilled in the art.
  • step 1 1.1) a copolymerization of monomers formed by anhydrides of N-CarboxyAminoacids (NCA) of 1 hydrophobic AAO amino acids is carried out in the presence of:
  • NCA N-CarboxyAminoacids
  • N-aromatic polar solvent preferably chosen from the group comprising:
  • MethylPyrrolidone NMP
  • DiMethylFormamide DMF
  • DiMethylsuifOxide DMSO
  • aprotic solvent preferably 1,4-dioxane
  • protic solvents preferably 1,4-dioxane
  • At least one PAG polymer block of poly-alkylene glycol (preferably PEG or PPG) is used or prepared by polymerization of alkylene glycol monomers (preferably ethylene or propylene glycol); this PAG block being functionalized (advantageously at at least one of its ends) by at least one reactive nucleophilic group, preferably chosen from the group comprising amines (in particular primary or secondary amines), alcohols or thiols; 1.3) the functionalized PAG from step 2 is added to the polymerization medium of the poly-AAO block, before, during or after the polymerization.
  • Step 1.1 of the process is inspired by the known techniques for the polymerization of N-carboxy- ( ⁇ -amino acids (NCA) anhydrides, described, for example, in the article "Biopolymers, 15, 1869
  • the poly (AOO) (pAAI) copolymer obtained is precipitated - preferably in water - and this precipitate is collected.
  • This variant corresponds to a discontinuous mode of preparation of particles, in which the poly (AAO) (pAAI) copolymer is isolated in the form of a precipitate forming a stable intermediate product. This precipitate can be, for example, filtered, washed and dried.
  • the functionalized PAG block (s) is (are) introduced before and / or at the start of the polymerization, which preferably takes place at a temperature between 20 and 120 ° C. at pressure normal atmospheric.
  • the PAGs of step 1.2 are available commercial products (e.g. PEG), or else are obtained in a manner known per se by polymerization of ethylene oxide
  • step 3 To carry out the association (step 3) of one or more APs with the particles, it is possible to implement several methods in accordance with the invention. Non-limiting examples of these methods are listed below.
  • the association of PA with the particles is carried out by bringing a liquid phase (aqueous or not) containing the PA into contact with the colloidal suspension of particles.
  • the association of the PA with the particles is carried out by bringing a PA in the solid state into contact with the colloidal suspension of particles.
  • the solid AP can be, for example, in the form of lyophilisate, precipitate, powder or the like.
  • the pulverulent solid (PAA) is brought into contact, as described above as a product and by its production characteristics, with a liquid phase (aqueous or not) containing the PA.
  • the pulverulent solid is brought into contact, as described above as a product and by its production characteristics, with the PA in solid form.
  • the PA used can be in pure or preformulated form.
  • the impurities (salts) and the solvent are eliminated, by any appropriate physical separation treatment, for example by diafiltration (dialysis) (step 4), filtration, pH modification, chromatography, etc. leads to an aqueous suspension of structured particles which can be concentrated, for example by distillation or any other suitable physical means: ultrafiltration, centrifugation.
  • step 6 To concentrate (step 6) or to separate (step 7) the particles from their liquid suspension medium, the aqueous phase is possibly eliminated, for example by distillation by drying (eg in an oven), by lyophilization or any other suitable physical means: ultrafiltration, centrifugation. Is recovered, at the end of this step 7, a powdery solid, white in color.
  • steps 1, 2, 3, 4 and possibly 5 of the above method corresponding to a preparation of a colloidal suspension of submicronic particles and with a high loading rate with hydrophilic PAs.
  • the amphiphilic PAG-poly (AAO) copolymers of step 1 are placed in an aqueous medium in which at least part of the PAG is soluble and at least part of the AANO is insoluble.
  • PAG / polyAANO copolymers exist in the form of nanoparticles in this aqueous medium.
  • An alternative for preparing the PV suspension according to the invention consists in bringing the pulverulent solid, as described above, into contact as a product and by its process for obtaining, with an aqueous, non-solvent medium, the AANOs.
  • the suspension can be filtered through sterilization filters, which makes it possible to obtain sterile injectable medicated liquids easily and at low cost.
  • the present invention also relates to new intermediate products of the process described above, characterized in that they consist of PAG-polyAAO copolymers which are precursors of particles.
  • the invention relates to a suspension and / or a pulverulent solid, as defined above and / or as obtained by the process presented above, this suspension and this solid comprising at least one active principle hydrophilic, preferably chosen from:
  • proteins and / or peptides among which the most preferably retained are: hemoglobins, cytochromes, albumin, interferons, antigens, antibodies, erythropoietin, insulin, growth hormones, factors VIII and IX, interleukins or their mixtures, stimulating factors of hematopoiesis;
  • nucleic acids and, preferably, RNA and / or DNA oligonucleotides; • non-peptido-protein molecules belonging to various classes of anticancer chemotherapy and, in particular, anthracyclines and taxoids, -
  • the invention relates to a pharmaceutical, nutritional, phytosanitary or cosmetic specialty, characterized in that it comprises a suspension and / or pulverulent solid loaded with hydrophilic PA and as defined above.
  • the invention also relates to the use of these PVs (in suspension or in solid form) loaded with PA, for the manufacture of medicaments of the PA release type systems. It can be, for example, those which can be administered, preferably by the oral, nasal, vaginal, ocular, subcutaneous, intravenous, intramuscular, intradermal, intraperitoneal, intracerebral or parenteral route. Possible cosmetic applications are, for example, the compositions comprising a PA associated with the PVs according to the invention and applicable transdermally.
  • Fig 1 - Evolution of glycemia G [..— o ..—] (average in% basal) and 1 insulinemia average I (in mUl / 1): [- • -] after injection of a formulation of PV loaded with insulin at the rate of 0.5 IU / kg, as a function of time T (in hours).
  • a solution of human insulin titrated at 1.4 mg / l is prepared corresponding to 40 IU / ml.
  • 10 mg of the PV prepared in Example 1 are dispersed.
  • the insulin associated with the PV and the free insulin are separated by centrifugation (60,000 g, 1 hour) and ultrafiltration (filtration threshold 300,000 D).
  • the free insulin recovered in the filtrate is measured by HPLC or by ELISA and the amount of associated insulin is deduced therefrom by difference.
  • the amount of insulin associated with PV is greater than 0.77 mg, which represents more than 55% of the total insulin used.
  • the association rate expresses the percentage of associated insulin relative to the insulin used in a preparation titrated to 1.4 mg / ml of insulin and 10 mg / ml of PV. This value is transformed into a loading rate which expresses a formulation with 100% protein fixation, in mg of insulin per 100 mg of PV.
  • the protocol of this example is as follows: The preparation of Example 4 was injected into dogs, made diabetic by total pancreatectomy, and on an empty stomach from the previous evening. The administration at 11 am by thoracic subcutaneous route of the preparation was made at the dosage of 0.5 IU / kg of insulin per kg of live weight of the animal. The volume administered is between 0.18 and 0.24 ml. At time -4, -2, 0, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 and 48 hours, 1 ml of blood are taken by jugular puncture under vacuum on a sodium heparinate tube. 30 ⁇ l of whole blood is used extemporaneously for blood sugar measurement.
  • the tube is then centrifuged, decanted and the plasma stored at -20 ° C for insulin determination.
  • the results presented in FIG. 1 below show a release of insulin up to 12 hours (solid line) and a significant hypoglycaemic effect which extends up to 20 hours (broken line) after the injection.
  • This example demonstrates the non-denaturation of insulin in the presence of PV according to the invention.

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Abstract

L'invention concerne une suspension de particules de vectorisation (PV) de principes actifs (PA) hydrophiles (insuline). Ces PV sont à base d'un copolymère dibloc PolyEthylèneGlycol/polyaminoacides neutres hydrophobes polyAANO. Ces particules de PEG/polyAANO sont associés à un PA hydrophile (insuline). L'invention vise, également, un solide pulvérulent à partir duquel sont issues les PV ainsi que la préparation de ce solide et de cette suspension de PV à base de PEG/polyAANO-insuline. Cette préparation consiste à copolymériser les N-CarboxyAnhydrides d'AANO, en présence de N-méthylpyrrolidone, de méthanol et de PEG fonctionnalisé amine. On obtient du PEG/polyAANO, que l'on associe avec l'insuline. On précipite à l'aide d'eau de façon à obtenir les PV. Eventuellement, on neutralise, on dialyse, on concentre et on élimine l'eau. On produit ainsi un solide pulvérulent ou des PV en suspension chargé en insuline et on prépare des spécialités pharmaceutiques.

Description

SUSPENSION COLLOÏDALE DE PARTICULES SUBMICRONIQUES DE VECTORISATION DE PRINCIPES ACTIFS HYDROPHILES (INSULINE) ET LEUR
MODE DE PREPARATION Le domaine de la présente invention est celui des Particules de Vectorisation (PV) , utiles pour l'administration de principes actifs (PA) . Ces derniers sont, de préférence, des médicaments ou des nutriments pour l'administration à un organisme animal ou humain par voie orale ou nasale, vaginale, oculaire, sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale, intracérébrale, parentérale, etc.. En termes de nature chimique, les PA plus particulièrement concernés par l'invention sont hydrophiles, par exemple, des protéines, des glycoprotéines, des peptides, des polysaccharides, des lipopolysaccharides, ou des polynucléotides .
La présente invention concerne, plus précisément, des suspensions colloïdales de Particules de Vectorisation, avantageusement de type submicronique, à base de blocs de polyaminoacides hydrophobes et polymères hydrophiles du type polyalkylène-glycol (PAG) , de préférence polyéthylène-glycol (PEG) .
La présente invention vise aussi bien des particules nues (insuline) en tant que telles, que des systèmes de vecteurs de PA hydrophiles, constitués par des particules chargées par le (ou les) PA.
La présente invention a également trait à des solides pulvérulents comprenant ces PV.
L'invention concerne, également, des procédés de préparation desdites suspensions colloïdales de particules, chargées en PA hydrophile (insuline) .
L' encapsulation de PA dans les PV a notamment, pour but de modifier leur durée d'action et/ou de les acheminer au lieu du traitement et/ou augmenter la biodisponibilité desdits PA. De nombreuses techniques d' encapsulation ont déjà été proposées. De telles techniques visent, d'une part, à permettre le transport du PA jusqu'à son site d'action thérapeutique, tout en le protégeant contre les agressions de l'organisme (hydrolyse, digestion enzymatique, etc.) et, d'autre part, à contrôler la libération du PA sur son site d'action, afin de maintenir la quantité disponible pour l'organisme au niveau désiré. Les PA concernés par ces avatars de transport et de séjour dans l'organisme sont, par exemple, des protéines mais peuvent être, également, des produits tout autres, des molécules organiques d'origine synthétique ou naturelle. La revue de M.J. HUMPHREY (Delivery system for peptide Drugs, éditée par S. DAVIS et L. ILLUM, Plénum Press, N.Y. 1986), fait état de la problématique concernant l'amélioration de la biodisponibilité des PA et l'intérêt des systèmes de vectorisation et de libération contrôlée.
Parmi tous les matériaux envisageables pour former des PV, les polymères sont de plus en plus utilisés, du fait de leurs propriétés intrinsèques. S'agissant du cahier des charges que l'on souhaite obtenir pour les PV, il est particulièrement exigeant et comprend, notamment, les spécifications suivantes.
1 La première spécification recherchée pour les PV serait que le polymère, constituant les PV soit biocompatible, éliminable (par excrétion) et/ou biodégradable et, encore mieux, qu'il soit métabolisé en produits non toxiques pour l'organisme. En outre, il conviendrait que la biodégradation dans l'organisme soit d'une durée suffisamment courte.
2 Les PV auraient avantage à pouvoir former, sans l'aide de solvant organique et/ou de tensioactif, une suspension aqueuse stable.
3 II serait également souhaitable que les PV aient une taille suffisamment faible pour pouvoir subir, en suspension dans un liquide, une filtration stérilisante par un filtre dont le diamètre des pores est inférieur ou égal à 0,2 μm.
4 II est souhaitable que les PV et les systèmes PV-PA puissent être obtenus par un procédé non dénaturant pour le PA.
5 Les PV devraient, avantageusement, permettre de contrôler la vitesse de libération du PA.
6 Une autre spécification importante serait que les systèmes PV-PA puissent constituer d'excellents médicaments injectables. Cette aptitude améliorée de l'administration par injection -e.g. intraveineuse ou intramusculaire- « injectabilité » se caractérise par : (i) un volume injecté réduit (pour une dose thérapeutique donnée) , (ii) une viscosité faible.
Ces deux propriétés sont satisfaites lorsque la dose thérapeutique de PA est associée à une quantité minimale de PV. En d'autres termes, les PV doivent avoir un fort taux de chargement en PA. 7 Le coût propre aux PV dans une préparation injectable doit être réduit et là encore il convient que les PV aient un fort taux de chargement en PA. En définitive, la faible taille et un fort taux de chargement sont des spécifications majeures recherchées pour les PV. 8 II est également avantageux que le polymère, constitutif des PV, n'induise pas de réponse immunitaire.
9 Pour la famille de PA hydrophiles, en particulier les protéines et plus particulièrement encore l'insuline, il conviendrait d'avoir des PV qui soient adaptés à cette famille de PA en termes de facilité d'association et de libération et en termes de caractère non dénaturant.
Les propositions techniques antérieures, décrites infra, ont tenté de satisfaire l'ensemble de ces spécifications. A titre d'illustration, on citera les propositions antérieures (a) à (j) :
(a) Le brevet US-A-5 286 495 concerne un procédé d' encapsulation par vaporisation de protéines en phase aqueuse, à l'aide de matériaux ayant des charges opposées, à savoir : l'alginate
(chargé négativement) et la polylysine (chargée positivement) . Ce procédé de fabrication permet de produire des particules de taille supérieure à 35 μm .
(b) Par ailleurs, les techniques d'émulsion sont couramment utilisées pour préparer des microparticules chargées de PA. Par exemple, les demandes de brevets WO 91/06286, WO 91/06287 et WO 89/08449 divulguent de telles techniques d'émulsion dans lesquelles on a recours à des solvants organiques pour solubiliser des polymères, par exemple de type polylactique . Mais il s'est avéré que les solvants peuvent être dénaturants, notamment pour les PA peptidiques ou polypeptidiques . (c) On connaît, également, des PV biocompatibles appelées protéinoïdes, décrites dès 1970 par X. FOX et K. DOSE dans « Molecular Evolution and the origin of Life », Ed. Marcel DEKKER Inc (1977) . Ainsi, la demande de brevet WO 88/01213 propose un système à base d'un mélange de polypeptides synthétiques, dont la solubilité dépend du pH. Pour obtenir les microparticules matricielles selon cette invention, ils solubilisent le mélange de polypeptides, puis avec un changement de pH, ils provoquent la précipitation de particules protéinoïdes. Lorsque la précipitation s'effectue en présence d'un PA, celui-ci est encapsulé dans la particule. (d) On mentionnera également, pour mémoire, le brevet US 4 351 337 qui relève d'un domaine différent de celui de la vectorisation de PA propre à l'invention. Ce brevet divulgue des implants massiques fixés et localisés à des endroits bien précis de l'organisme. Ces implants sont des tubes ou des capsules creuses de taille microscopiques (160 μm et de longueur égale à 2 000 μm) , constitués de copolymères de copoly (aminoacides) -e.g. poly (acide glutamique-leucine) ou poly (benzylglutamate-leucine) - obtenus par copolymérisation de monomères de N-carboxyanhydrides d' aminoacides (NCA) . L'inclusion d'un PA s'opère par une technique d' évaporation de solvant d'un mélange de polymère et de PA. Le brevet US 4 450 150 appartient à la même famille que le brevet US 4 351 337 étudié ci-dessus et a essentiellement le même objet. Les PAA constitutifs sont des poly (acide glutamique- éthylglutamate) .
(e) La demande de brevet PCT/FR WO 97/02810 divulgue une composition pour la libération contrôlée de principes actifs, comprenant une pluralité de particules lamellaires d'un polymère biodégradable, au moins en partie cristallin (polymère d'acide lactique) et d'un PA absorbé sur lesdites particules. Dans ce cas, la libération du principe actif s'opère par désorption. (f) La publication « CHEMISTRY LETTERS 1995, 707, AKIYOSHI ET AL » concerne la stabilisation d' insuline par complexation supramoléculaire avec des polysaccharides hydrophobisés par greffage de cholestérol. (g) L'article paru dans « MACROMOLECULES 1997, 30, 4013-4017 » décrit des copolymères composés d'un bloc polypeptide à base de L-phénylalanine, de (-benzyl-L-glutamate ou de O- (tétra-O- acétyl-D-glucopyranosyl) -L-sérine, et un bloc synthétique, tels que la poly (2-méthyl-2-oxazoline) ou la poly (2-phényl-2- oxazoline) . Des polymères s'agrègent en milieu aqueux pour former des particules de 400 nm, capables de s'associer avec une enzyme, la lipase. La terme associée signifie ici que la protéine s'adsorbe sur la particule par un phénomène physique
(pas de liaison covalente) . (h) La demande PCT WO 96/29991 a pour objet des particules de polyaminoacides utiles pour la vectorisation de PA dont notamment des PA hydrophiles tels que l'insuline. Ces particules ont une taille comprise entre 10 et 500 nm. Les particules selon le WO 96/29991 se forment spontanément par mise en contact de PAA avec une solution aqueuse. Les PAA comprennent des monomères aminoacides neutres et hydrophobes AAO et des monomères ionisables et hydrophiles AAI . Ces particules peuvent être chargées en insuline, au mieux à hauteur de 6,5 % en poids sec d'insuline par rapport à la masse de PAA. Ta est mesuré selon un mode opératoire Ma décrit plus loin.
(i) L'EP 0 583 955 divulgue des micelles polymère capables de piéger physiquement des PA hydrophobes. Ces micelles sont constitués par des copolymères bloc : PEG/polyAANO (AANO = Amino-Acide Neutre hydrophObe) .
L'AANO peut être : Leu, Val, Phe, Bz-O-Glu, Bz-O-Asp, ce dernier étant préféré. Les principes actifs PA hydrophobes piégés dans ces micelles PEG/polyAANO sont e.g. : adriamycine, indométhacine, daunomycine, methotrexate, mitomycine. Dans cette demande de brevet, seuls sont exemplifiés les micelles à base de PEG/polyGlu-O-Bz . Or, il est à noter que ces esters Glu-O-Bz ne sont pas stables à l'hydrolyse en milieu aqueux. En outre, il n'est nullement question dans ce document de particules constituées par un copolymère bloc PEG/polyAANO, dont le coeur est formé par le polyamino acide neutre hydrophobe et comprenant une chevelure externe hydrophile à base de PEG, ces particules étant aptes à s'associer avec des PA hydrophiles et à les libérer in vivo, (j) On connaît également des nanoparticules de vectorisation sur lesquelles sont greffées des chaînes de PEG. Il s'agit par exemple de nanoparticules de polylactides ou de liposomes. Ce revêtement de chaînes de PEG est un moyen efficace connu de l'homme de l'art pour éviter l'adsorption de protéines (hydrophiles) sur ces nanoparticules recouvertes de PEG. De telles nanoparticules ou liposomes sont qualifiés de "furtifs". La prévention de l'adsorption de protéines sur une surface par greffage de PEG, est décrite dans un très grand nombre d'articles par exemple : L. Illum et al. J. Pharm.
Sci. 7_2, 1086, (1983) . La description de liposomes "furtifs"
("stealth liposomes") peut être trouvée dans : [DD Lasic, FJ
Martin "Stealth Liposomes" CRC Press (BocaRaton, FL) 1995; MC
Woodle, DD Lasic "Sterically Stabilized Liposomes" Biochim Biophys Acta 1992, 1113, 171-199; MC Woodle "Controlling Liposome Blood Clearance by surface grafted polymers" Advanced Drug Delivery Reviews 1998, 32, 139-152] . On trouvera également une synthèse de ces questions dans : ["Polyethylène-glycol coated biodégradable nanospheres R.Gref et al in "microparticulated for the delivery of proteins and vaccines" S. Cohen et al Ed. Marcel Dekker 1996"] . Comme le chargement en principe actif de ces nanoparticules furtives est empêché, ces auteurs préconisent une encapsulation à cœur des principes actifs par un procédé en voie solvant organique. Or, ce type de procédé est contraire aux spécifications 2 & 4 du cahier des charges ci-dessus défini.
Il ressort donc de ce qui précède que les propositions techniques antérieures sus décrites, et notamment la proposition (i) , satisfont incomplètement aux spécifications du cahier des charges indiqué supra, et, en particulier pour ce qui concerne l'association des particules à des principes actifs hydrophiles (protéines telles que l'insuline) ainsi que l'aptitude de ces particules chargées en PA hydrophiles à libérer ces derniers in vivo sans qu'ils n'aient été altérés par la vectorisation.
Dans cet état de fait, l'un des objectifs essentiels est de pouvoir fournir de nouvelles PV qui forment spontanément, et sans l'aide de tensioactifs ou de solvants organiques, des suspensions aqueuses stables de PV et adaptées à la vectorisation de PA hydrophiles (notamment des protéines telles que l'insuline). Il s'agit d'obtenir des suspensions de particules chargées en principe actif hydrophile, de préférence en protéines telles que 1 ' insuline.
Un autre objectif essentiel de la présente invention est de fournir de nouvelles PV en suspension aqueuse colloïdale stable (notamment à l 'hydrolyse) ou sous forme pulvérulente et à base de pol (aminoacides) (PAA) , ces nouvelles PV se devant de satisfaire au mieux aux spécifications 1 à 9 du cahier des charges susvisé.
Un autre objectif essentiel de l'invention est de perfectionner les particules divulguées dans la demande EP 0 583 955. Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir une suspension nouvelle de PV dont on maîtrise parfaitement les caractéristiques, notamment en termes du taux de chargement en PA et en termes de contrôle de cinétique de libération du PA.
Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir des suspensions médicamenteuses hydrophiles injectables. Les spécifications, requises pour de telles suspensions, sont un faible volume d'injection et une faible viscosité. Il importe que la masse de particules colloïdales par dose d'injection soit le plus faible possible et ce sans limiter la quantité du principe actif PA transporté par ces particules, afin de ne pas nuire à l'efficacité thérapeutique.
Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir une suspension colloïdale aqueuse ou un solide pulvérulent comprenant des particules de vectorisation de principes actifs satisfaisant aux spécifications visées ci-dessus et qui constitue une forme galénique appropriée et convenable pour une administration, par exemple orale, à l'homme ou l'animal. Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir une suspension colloïdale comprenant des particules de vectorisation de principes actifs filtrables sur des filtres de 0,2 μm à des fins de stérilisation. Un autre objectif essentiel de l'invention est de proposer un procédé de préparation de particules (sèches ou en suspension dans un liquide) de PAA utiles, notamment, comme vecteurs de principes actifs hydrophiles (notamment protéines telles que l'insuline), ledit procédé se devant d'être, plus simple à mettre en œuvre, non dénaturant pour les principes actifs et devant en outre toujours permettre une maîtrise fine de la granulométrie moyenne des particules obtenues.
Un autre objectif essentiel de l'invention est l'utilisation des susdites particules en suspension aqueuse ou sous forme solide pour la préparation de médicaments (e.g. vaccins), en particulier pour administration notamment orale, nasale, vaginale, oculaire, sous-cutanée, intraveineuse, intra-musculaire, intradermique, intra-péritonéale, intracérébrale ou parentérale, les principes actifs hydrophiles de ces médicaments pouvant être, notamment, des protéines, des glycoprotéines, des peptides, des polysaccharides, des lipopolysaccharides, des oligonucléotides et- des polynucléotides .
Un autre objectif de la présente invention est de fournir un médicament, du type système à libération prolongée de principes actifs, qui soit aisé et économique à produire et qui soit, en outre, biocompatible et apte à assurer un très haut niveau de biodisponibilité du PA.
Les objectifs relatifs aux produits (parmi d'autres) sont atteints par la présente invention qui concerne, tout d'abord, une suspension colloïdale de particules submicroniques susceptibles d'être utilisées, notamment pour la vectorisation de principe (s) actif (s) (PA) , ces particules étant des arrangements supramoléculaires individualisés : • à base d'un copolymère amphiphile comprenant : ^ au moins un bloc de polyaminoacide (s) (PAA) linéaire (s), hydrophobe (s) à enchaînements α- peptidiques, les aminoacides hydrophobes AAO constitutifs de ce bloc PAA étant identiques ou différents entre eux ; et au moins un bloc de polymère (s) hydrophile (s) du type polyalkylèneglycol (PAG) , de préférence polyéthylène-glycol (PEG) ;
• aptes à s'associer en suspension colloïdale à l'état non dissous, au moins un PA et à libérer celui-ci, notamment in vivo, de manière prolongée et/ou retardée ; caractérisée en ce que les particules qu'elle contient sont associées et/ou peuvent être associées avec au moins un PA sélectionné parmi les PA hydrophiles, de préférence parmi les protéines, ce PA étant plus préférentiellement encore constitué par de l'insuline.
L'un des fondements inventifs de ces nouvelles particules de vectorisation PV, en suspension aqueuse colloïdale stable ou à l'état de solide pulvérulent, tient à la sélection originale d'un copolymère bloc polymère hydrophile/ 'poly -aminoacide hydrophobe permettant d'obtenir des particules de taille submicronique, qui forment une suspension colloïdale aqueuse stable en l'absence de tensioactifs ou de solvants et qui soient adaptés à des PA hydrophiles .
Il est particulièrement surprenant et inattendu que les particules à base de copolymère bloc polymère hydrophile polyalkylèneglycol/polyaminoacide hydrophobe connues pour piéger des principes actifs hydrophobes (EP 0 583 955) , puissent s'associer et libérer in vivo des PA hydrophiles, en particulier des protéines telles que l'insuline.
En outre, l'homme du métier connaissant l'utilisation d'une couche extérieure de PEG pour prévenir l'adsorption des protéines hydrophiles, aurait tout naturellement écarté cette solution pour la conception de nanoparticules devant au contraire adsorber une grande quantité de protéines hydrophiles. Contre toute attente, il n'en est rien dans le cadre de l'invention.
La structure des copolymères bloc PAG/Poly AAO et la nature des acides aminés AAO, sont choisies de telle façon que :
• les chaînes de polymères se structurent spontanément sous forme de particules (PV) de petite taille, • les particules forment une suspension colloïdale stable dans l'eau et en milieu physiologique,
• les PV s'associent avec des protéines ou autres PA hydrophiles en milieu aqueux, par un mécanisme spontané et non dénaturant pour la protéine,
• les PV libèrent les PA hydrophiles en milieu physiologique et, plus précisément, in vivo ; la cinétique de libération est fonction de la nature du copolymère PAG/Poly AAO précurseur des PV. Ainsi, en jouant sur la structure particulière du copolymère, on peut contrôler les phénomènes d'association et de libération du PA sur le plan cinétique et quantitatif.
De préférence, le PAG correspond à du Polyéthylène-Glycol (PEG) ou à du polypropylène-glycol (PPG) , le PEG étant particulièrement préféré.
Suivant une autre caractéristique de l'invention, le PAG -de préférence le PEG- possède une masse molaire en poids comprise entre 500 et 50000 D, de préférence entre 1000 et 10000 D, et plus préférentiellement encore entre 1000 et 5000 D. Avantageusement, la suspension selon l'invention est caractérisée par un taux de chargement Ta des particules de vectorisation avec l'insuline, exprimé en % de masse d'insuline associée par rapport à la masse et mesuré selon un mode opératoire Ma, Ta étant tel que : 7 < Ta de préférence, 8 < Ta < 50 et, plus préférentiellement encore, 10 < Ta < 30.
Mode opératoire Ma : (a) Préparation d'une solution aqueuse d'insuline : De l'insuline recombinante humaine lyophilisée (Sigma n° 10259) est versée dans une solution HCl 0,1 N durant 5 min à 25°C. Cette solution est ensuite versée dans une solution de tampon phosphate qui est finalement neutralisée par ajout de NaOH de 0,1 N. La solution est laissée ensuite au repos 30 min à température ambiante, puis filtrée sur membrane
® "acrodisc " 0,8-0,2 μm. La masse d'insuline est calculée en fonction du volume souhaité de solution, afin d'obtenir une concentration de 60 UT/ml. (b) Dispersion des particules de vectorisation en PAA à associer dans la solution d' insuline : Les PV lyophilisées sont ajoutées à la solution d'insuline, à raison de 10 g PV/ l de solution. Ce mélange est agité au vortex à deux ou trois reprises, puis placé dans un agitateur à basculement à température ambiante pendant 18 heures. La suspension colloïdale est ensuite conservée à 4°C. (c) Séparation de l'insuline libre de l'insuline associée et dosage de l'insuline libre : La solution, contenant l'insuline et les PV, est centrifugée 1 heure sous 60 000 g à 20°C. Le surnageant est disposé dans des tubes munis d'une membrane d'ultrafiltration (seuil de coupure 100 OOODa) et centrifugé sous 3 000 g 2 heures à 20°C. L'insuline dans le filtrat est dosée par CLHP.
Pour définir un peu plus les copolymères constitutifs des particules, on peut indiquer qu'ils sont du type séquentiel alterné (blocs) .
Ainsi, selon une forme préférée de réalisation de la suspension de PV selon l'invention : les AAO sont des acides aminés neutres hydrophobes AANO, le rapport PAG/AANO est > 1, - et la longueur absolue du bloc PEG est > 2 monomères, de préférence > 10 monomères, et plus préférentiellement > 20 monomères. Avantageusement, le ou les blocs PAA à base d'AANO en comprennent au moins 5, de préférence au moins 10, et plus préférentiellement encore au moins entre 10 et 50.
De manière plus préférée encore, les particules sont des "diblocs" de PEG/AANO.
Ces aminoacides neutres hydrophiles (AANO) sont en pratique sont choisis dans le groupe comprenant: • des acides aminés neutres naturels : Leu, Ile, Val, Ala, Pro, Phe, leurs mélanges, • des acides aminés neutres, rares ou synthétiques : norleucine, norvaline, • des dérivés des acides aminés polaires : Glutamate de méthyl, glutamate de éthyle, aspartate de benzyle, N- acétyllysine.
Suivant une caractéristique préférée de l'invention, les PAA blocs constitutifs des particules ont des degrés de polymérisation
DP compris entre 30 et 600, de préférence entre 50 et 200 et, plus préférentiellement encore, entre 60 et 150.
La présente invention vise, non seulement des suspensions de particules nues, telles que définies ci-dessus, mais également des particules comprenant au moins un principe actif PA De préférence, la suspension selon l'invention est aqueuse et stable. Ces particules, chargées ou non en PA, sont, avantageusement, sous forme dispersée dans un liquide (suspension) , de préférence aqueux, mais peuvent également être à l'état de solide pulvérulent, obtenu à partir de la suspension de PV telle que définie ci-dessus.
D'où il s'ensuit que l'invention concerne, outre une suspension colloïdale (de préférence aqueuse) de PV, un solide pulvérulent comprenant des PV et obtenu à partir de la suspension selon l'invention.
Un autre objet essentiel de l'invention se rapporte à la préparation des particules sélectionnées (telles que décrites ci- avant) , aussi bien sous forme de suspension colloïdale que sous forme de solide pulvérulent. Le procédé de préparation considéré consiste, essentiellement, à synthétiser des copolymères PAG/polyAAO précurseur et à les transformer en particules structurées .
Plus précisément, il s'agit, tout d'abord, d'un procédé de préparation du solide pulvérulent susvisé et formé par de particules structurées submicroniques susceptibles d'être utilisées, notamment pour la vectorisation de principe (s) actif (s), ces particules étant des arrangements supramoléculaires discrets :
• à base d'un copolymère amphiphile comprenant : au moins un bloc de polyaminoacide (s) (PAA) linéaire (s), hydrophobe (s) à enchaînements α- peptidiques, les aminoacides hydrophobes AAO constitutifs de ce bloc PAA étant identiques ou différents entre eux ; et au moins un bloc de polymère (s) hydrophile (s) du type polyalkylèneglycol (PAG) , de préférence polyéthylène-glycol (PEG) ;
• aptes à s'associer en suspension colloïdale à l'état non dissous, au moins un PA et à libérer celui-ci, notamment in vivo, de manière prolongée et/ou retardé.
Ce procédé est caractérisé en ce que :
1) on fait réagir au moins un segment PAG avec au moins un segment PAA comprenant chacun au moins un monomère alkylène-glycol ou aminoacide respectivement et au moins une fonction réactive permettant de former une ou des liaisons PAA-PAG (de préférence amide) , de façon à obtenir un copolymère bloc PAG-polyAAO ;
2) on précipite -de préférence dans l'eau-, le copolymère bloc PAG-polyAAO obtenu à 1 ' étape 1 , ce qui conduit à la formation spontanée de particules de vectorisation de PA ;
3) on associe au moins un principe actif PA hydrophile avec les particules ;
4) éventuellement on dialyse le milieu réactionnel pour purifier la suspension aqueuse de particules structurées ;
5) éventuellement on concentre cette suspension de 1 ' étape 4 ;
6) on élimine le milieu liquide pour recueillir le solide pulvérulent comprenant les particules.
Les fonctions des segments PAG et PAA de l'étape 1 peuvent être des fonctions aminé ou acide carboxylique. On peut envisager de réaliser la polymérisation conduisant au bloc PAG et/ouPAA avant, pendant ou après la formation de la liaison PAG-PAA. Toutes ces variantes sont à la portée de l'homme de l'art. De préférence, dans l'étape 1 : 1.1) on réalise une copolymérisation de monomères formés par des anhydrides de N-CarboxyAminoacides (NCA) d1 aminoacides hydrophobes AAO en présence :
- d'au moins un solvant polaire non aromatique, de préférence choisi dans le groupe comprenant : la N-
MéthylPyrrolidone (NMP) , le DiMéthylFormamide (DMF) , le DiMéthylsuifOxyde (DMSO) , le DiMéthylAcétamide
(DMAc) , la pyrrolidone ; la NMP étant plus particulièrement préférée ; - et éventuellement d'au moins un co-solvant sélectionné parmi les solvants aprotiques (de préférence le dioxanne-1,4) et/ou les solvants protiques
(de préférence la pyrrolidone) et/ou l'eau et/ou les alcools, le methanol étant particulièrement préféré ; 1.2) on met en œuvre ou on prépare par polymérisation de monomères alkylène-glycol (de préférence ethylène ou propylène-glycol) au moins un bloc polymère PAG de poly-alkylène-glycol (de préférence de PEG ou PPG) ; ce bloc PAG étant fonctionnalisé (avantageusement à au moins l'une de ses extrémités) par au moins un groupement réactif nucléophile, de préférence choisi dans le groupe comprenant les aminés (en particulier les aminés primaires ou secondaires) , les alcools ou les thiols; 1.3) on ajoute le PAG fonctionnalisé de l'étape 2 au milieu de polymérisation du bloc de poly-AAO, avant, pendant ou après la polymérisation.
L'étape 1.1 du procédé s'inspire des techniques connues de polymérisation d'anhydrides de N-carboxy- (α-aminoacides (NCA), décrites, par exemple, dans l'article « Biopolymers, 15, 1869
(1976) » et dans l'ouvrage de H.R. KRICHELDORF « α-Aminoacid-N- carboxy Anhydride and Related Heterocycles » Springer Verlag
(1987) .
Suivant une variante, à l'issue de l'étape 1.1, on précipite -de préférence dans l'eau- le copolymère poly(AOO) (pAAI) obtenu et on recueille ce précipité. Cette variante correspond à un mode discontinu de préparation de particules, dans lequel on isole le copolymère poly (AAO) (pAAI) sous forme de précipité formant un produit intermédiaire stable. Ce précipité peut être, par exemple, filtré, lavé et séché.
De manière plus préférée encore, les NCA-pAAI sont des NCA d'acide glutamique ou aspartique O-alkylê, par exemple des NCA- Glu-O-Me, NCA-Glu-O-Et ou NCA-Glu-O-Bz (Me = méthyle - Et = éthyle) .
De préférence, le ou les bloc (s) PAG fonctionnalisé (s) est (sont) introduit (s) avant et/ou au début de la polymérisation, qui se déroule de préférence à une température comprise entre 20 et 120°C à pression atmosphérique normale.
Avantageusement, les PAG de l'étape 1.2 sont des produits commerciaux disponibles (PEG e.g.), ou bien encore sont obtenus de manière connue en soi par polymérisation d'oxyde d'éthylène
D'autres paramètres, comme la concentration en polymère, la température du mélange réactionnel, le mode d'ajout du polymère hydrophile, l'emploi de pression réduite, la durée de la réaction, etc.. sont ajustés selon les effets désirés et bien connus de
1 ' homme de 1 ' art .
Pour effectuer l'association (étape 3) d'un ou plusieurs PA aux particules, il est possible de mettre en œuvre plusieurs méthodes conformément à l'invention. Des exemples, non limitatifs, de ces méthodes sont énumérés ci-après.
Selon une première méthode, on effectue l'association de PA aux particules par mise en présence d'une phase liquide (aqueuse ou non) contenant le PA avec la suspension colloïdale de particules .
Selon une deuxième méthode, on effectue l'association du PA aux particules par mise en présence d'un PA à l'état solide avec la suspension colloïdale de particules. Le PA solide peut être, par exemple, sous forme de lyophilisât, de précipité, de poudre ou autre .
Selon une troisième méthode, on met en présence le solide pulvérulent (PAA) , tel que décrit supra en tant que produit et par ses caractéristiques d'obtention, avec une phase liquide (aqueuse ou non) contenant le PA.
Selon une quatrième méthode, on met en présence le solide pulvérulent, tel que décrit supra en tant que produit et par ses caractéristiques d'obtention, avec le PA sous forme solide. On disperse ensuite ce mélange de solides, dans une phase liquide, de préférence une solution aqueuse.
Dans toutes ces méthodes, le PA utilisé peut être sous forme pure ou préformulée. Conformément à l'étape facultative 5, on élimine les impuretés (sels) ainsi que le solvant, par tout traitement de séparation physique approprié, par exemple par diafiltration (dialyse) (étape 4) , filtration, modification pH, chromâtographie... Cela conduit à une suspension aqueuse de particules structurées qui peut être concentrée, par exemple par distillation ou tout autre moyen physique convenable : ultrafiltration, centrifugation.
Pour concentrer (étape 6) ou pour séparer (étape 7) les particules de leur milieu liquide de suspension, on élimine, éventuellement, la phase aqueuse, par exemple par distillation par séchage (e.g. à l'étuve), par lyophilisation ou tout autre moyen physique convenable : ultrafiltration, centrifugation. On récupère, à l'issue de cette étape 7, un solide pulvérulent, de couleur blanche . II est à noter que la mise en œuvre des étapes 1, 2, 3, 4 et éventuellement 5 du procédé ci-dessus correspondant à une préparation d'une suspension colloïdale de particules submicroniques et à fort taux de chargement avec les PA hydrophiles . Lors de cette préparation de suspension colloïdale, les copolymères amphiphiles PAG-poly (AAO) de l'étape 1 sont placés dans un milieu aqueux dans lequel au moins une partie des PAG est soluble et au moins une partie des AANO est insoluble. Les copolymères PAG/polyAANO existent sous forme de nanoparticules dans ce milieu aqueux.
Une alternative pour préparer la suspension de PV selon l'invention consiste à mettre en présence le solide pulvérulent, tel que décrit ci-dessus en tant que produit et par son procédé d'obtention, avec un milieu aqueux, non solvant des AANO. Compte tenu de la taille nanométrique des particules, la suspension peut être filtrée sur des filtres de stérilisation, ce qui permet d'obtenir, aisément et à moindre coût, des liquides médicamenteux injectables stériles. Le fait de pouvoir, grâce à l'invention, contrôler la taille des particules et atteindre des valeurs de Dh entre 25 et 100 nm, est un atout important.
La présente invention vise, également, de nouveaux produits intermédiaires du procédé décrit ci-dessus, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par des copolymères PAG-polyAAO précurseurs de particules.
Selon un autre de ses aspects, l'invention concerne une suspension et/ou un solide pulvérulent, tels que définis ci-dessus et/ou tels qu'obtenus par le procédé présenté supra, cette suspension et ce solide comprenant au moins un principe actif hydrophile, choisi, de préférence, parmi :
• les vaccins ;
• les protéines et/ou les peptides, parmi lesquels les plus préférentiellement retenus sont : les hémoglobines, les cytochromes, les albumines, les interférons, les antigènes, les anticorps, l' érythropoïétine, l'insuline, les hormones de croissance, les facteurs VIII et IX, les interleukines ou leurs mélanges, les facteurs stimulants de l'hématopoïèse ;
• les polysaccharides, l'héparine étant plus particulièrement sélectionnée ;
• les acides nucléiques et, préférablement, les oligonucléotides d'ARN et/ou d'ADN ; • des molécules non peptido-protéiques appartenant à diverses classes de chimiothérapie anticancéreuses et, en particulier, les anthracyclines et les taxoïdes , -
• et leurs mélanges .
Enfin, l'invention concerne une spécialité pharmaceutique, nutritionnelle, phytosanitaire ou cosmétique, caractérisée en ce qu'elle comporte une suspension et/ou du solide pulvérulent chargé (s) en PA hydrophile et tels que définis ci-dessus.
Selon un autre de ses objets, l'invention vise, également, l'utilisation de ces PV (en suspension ou sous forme solide) chargées en PA, pour la fabrication de médicaments du type systèmes à libération contrôlée de PA. Il peut s'agir, par exemple de ceux administrables, de préférence par voie orale, nasale, vaginale, oculaire, sous- cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale, intracérébrale ou parentérale. Les applications cosmétiques envisageables sont, par exemple, les compositions comprenant un PA associé aux PV selon l'invention et applicables par voie transdermique.
Les exemples qui suivent et qui concernent le PA hydrophile formé par l'insuline permettront de mieux comprendre l'invention dans ses différents aspects produit/procédé/application. Ces exemples illustrent la préparation de particules de polyaminoacides chargés ou non en insuline, de même qu'ils présentent les caractéristiques de structure et les propriétés de ces particules.
LEGENDES DES FIGURES
Fig 1 - Evolution de la glycémie G : [..—o..—] (moyenne en % basai) et de 1 ' insulinémie moyenne I (en mUl/1) : [—•—] après injection d'une formulation de PV chargée en insuline à raison de 0,5 Ul/kg, en fonction du temps T (en heures) .
EXEMPLES
Exemple 1 - Préparation du polymêre-poly (leucine) -bloc-polyéthylèneglycol
Les techniques utilisées, pour la polymérisation des NCA en polymères de structures en blocs ou statistiques sont connues de l'homme de l'art et sont détaillées dans l'ouvrage de H. R. KRICHELDORF "α-aminoacides-N-Carboxy Anhydrides and Related Heterocycles", Springer Verlag (1987). La synthèse suivante précise la synthèse de l'un d'entre eux.
Synthèse de la poly (Ala) 40- PEG: 10 g de NCA-Leu sont solubilisés dans 150 ml de NMP à 60°C. 5 ml d'une solution de 2 g de aminoethyl-PEG (Mw = 5000 D) dans 50 ml de NMP sont ajoutés au monomère en une fois. Après 2 h, on verse le milieu réactionnel dans 11 d'eau. Le précipitât formé est filtré, lavé et séché.
Rendement > 95%.
Exemple 2 -
Préparation du polymère-poly (phénylalanine) -bloc- polyéthylêneglycol
Synthèse de la poly (Leu) 40- PEG: 10 g de NCA-Phe sont solubilisés dans 150 ml de NMP à 60°C. 5 ml d'une solution de 2 g de aminoethyl-PEG (Mw = 5000 D) dans 50 ml de N-méthylpyrrolidone (NMP) sont ajoutés au monomère en une fois. Après 2 h, on vers le milieu réactionnel dans 11 d'eau. Le précipitât formé est filtré, lavé et séché. Rendement > 95%.
Exemple 3 - Mise en évidence des nanoparticules par Diffusion de la Lumière (DDL) et par Microscopie Electronique à Transmission (TEM)
10 mg de particules du polymère 1 sont suspendus dans 10 ml d'eau ou une solution aqueuse de sel. Cette solution est ensuite introduite dans un granulomètre Coulter (ou diffractomètre laser) . Les résultats de l'analyse de la granulométrie des différents produits testés sont présentés dans le tableau 1 suivant .
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000020_0002
Exemple 4 -
Test d'association des nanoparticules avec une protéine
(1' insuline)
A partir d'une solution tampon phosphate isotonique de pH 7,4, on prépare une solution d'insuline humaine titrée à 1,4 mg/ l correspondant à 40 Ul/ml. Dans 1 ml de cette solution d'insuline, on disperse 10 mg du PV préparé dans l'exemple 1. Après 15 heures d'incubation à température ambiante, l'insuline associée aux PV et l'insuline libre sont séparées par centrifugation (60 000 g, 1 heure) et ultrafiltration (seuil de filtration 300 000 D) . L'insuline libre récupérée dans le filtrat est dosée par CLHP ou par ELISA et l'on en déduit par différence la quantité d'insuline associée. La quantité d'insuline associée au PV est supérieure à 0,77 mg, ce qui représente plus de 55 % du total de l'insuline engagée .
Le tableau suivant rassemble les résultats des mesures de taux d'association effectuées sur différents PV. Le taux d'association exprime le pourcentage d' insuline associée par rapport à l'insuline engagée dans une préparation titrée à 1.4 mg/ml d'insuline et 10 mg/ml de PV. Cette valeur est transformée en un taux de chargement qui exprime une formulation à 100% de fixation de la protéine, en mg d'insuline par 100 mg de PV.
Tableau 2 - Mesures du taux d'association avec l'insuline pour un mélange 0.14 mg INSULINE/mg PV
Figure imgf000021_0001
Exemple 5 -
Pharmacocinétique et pharmacodynamie des PV-chargés avec l'insuline chez le chien sain à jeun
Le protocole de cet exemple est le suivant : La préparation de l'exemple 4 a été injectée à des chiens, rendus diabétiques par pancréatectomie totale, et à jeun de la veille au soir. L'administration à 11 heures du matin par voie sous cutanée thoracique de la préparation a été faite à la posologie de 0,5 Ul/kg d'insuline par Kg de poids vif de l'animal. Le volume administré est compris entre 0,18 et 0,24 ml. Au temps -4, -2, 0, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 et 48 heures, 1 ml de sang sont prélevés par ponction jugulaire sous vide sur tube héparinate de sodium. 30 μl de sang total sont utilisés extemporanément pour mesure de la glycémie. Le tube est ensuite centrifugé, décanté et le plasma stocké à -20°C pour dosage de l'insuline. Les résultats présentés dans la figure 1 ci-après montrent un relarguage de l'insuline jusqu'à 12 heures (trait plein) et un effet hypoglycémiant important qui se prolonge jusqu'à 20 heures (trait discontinu) après l'injection.
Tableau 3 - Mesures du temps d'action de l'insuline (effet hypoglycémiant) en présence de PV selon l'invention
Figure imgf000022_0001
Cet exemple démontre la non denaturation de l'insuline en présence de PV selon l'invention.
Il met également en évidence l'augmentation de la durée d'action de l'insuline par rapport à l'insuline non formulée, et donc, l'utilité des PV comme système à libération contrôlée de 1 ' insuline.

Claims

REVENDICATIONS1- Suspension colloïdale de particules submicroniques susceptibles d'être utilisées, notamment pour la vectorisation de principe (s) actif (s) (PA) , ces particules étant des arrangements supramoléculaires individualisés :• à base d'un copolymère amphiphile comprenant :•X au moins un bloc de polyaminoacide (s) (PAA) linéaire (s), hydrophobe (s) à enchaînements α-peptidiques, les aminoacides hydrophobes AAO constitutifs de ce bloc PAA étant identiques ou différents entre eux ;•S et au moins un bloc de polymère (s) hydrophile (s) du type polyalkylèneglycol (PAG) , de préférence polyéthylène-glycol (PEG) ;• aptes à s'associer en suspension colloïdale à l'état non dissous, avec au moins un PA et à libérer celui-ci, notamment in vivo, de manière prolongée et/ou retardée ; caractérisée en ce que les particules qu'elle contient sont associées et/ou peuvent être associées avec au moins un PA sélectionné parmi les PA hydrophiles, de préférence parmi les protéines, ce PA étant plus préférentiellement encore constitué par de l'insuline.2- Suspension selon la revendication 1, caractérisée par un taux de chargement Ta des particules de vectorisation avec l'insuline, exprimé en % de masse d'insuline associée par rapport à la masse et mesuré selon un mode opératoire Ma, Ta étant tel que :7 < Ta de préférence, 8 < Ta < 50 et, plus préférentiellement encore, 10 ≤Ta <30.3- Suspension selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le PAG -de préférence le PEG- possède une masse molaire en poids comprise entre 500 et 50000 D, de préférence entre 1000 et 10000 D, et plus préférentiellement encore entre 1000 et 5000 D. 4- Suspension selon l'une quelconque des revendications 1 à3, caractérisée :- en ce que les AAO sont des acides aminés neutres hydrophobes AANO, - en ce que le rapport PAG/AANO est > 1,- et en ce que la longueur absolue du bloc PEG est > 2 monomères, de préférence > 10 monomères, et plus préférentiellement > 20 monomères.5- Suspension selon l'une quelconque des revendications 1 à4, caractérisée en ce que le ou les blocs PAA à base d'AANO en comprennent au moins 5, de préférence au moins 10, et plus préférentiellement encore au moins entre 10 et 50.6- Suspension selon l'une quelconque des revendications 1 à5, caractérisée en ce que les particules sont des « diblocs » PEG/AANO .7- Suspension selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que les AANO sont choisis dans le groupe comprenant :• des acides aminés neutres naturels : Leu, Ile, Val, Ala, Pro, Phe, leurs mélanges ;• des acides aminés neutres, rares ou synthétiques : norleucine, norvaline ;• des dérivés des acides aminés polaires: Glutamate de méthyl, glutamate de éthyle, aspartate de benzyle, N-acétyllysine.8- Suspension selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle est aqueuse et stable.9- Solide pulvérulent, caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir de la suspension selon l'une quelconque des revendications 1 à 8. 10- Procédé de préparation du solide pulvérulent selon la revendication 9, caractérisée en ce que :1) on fait réagir au moins un segment PAG avec au moins un segment PAA comprenant chacun au moins un monomère alkylène-glycol ou aminoacide respectivement et au moins une fonction réactive permettant de former une ou des liaisons PAA-PAG (de préférence amide) , de façon à obtenir un copolymère bloc PAG-polyAAO ;2) on précipite - de préférence dans l'eau -, le copolymère bloc PAG-polyAAO obtenu à l'étape 1, ce qui conduit à la formation spontanée de particules de vectorisation de PA ;3) on associe au moins un principe actif PA hydrophile avec les particules ; 4) éventuellement on dialyse le milieu reactionnel pour purifier la suspension aqueuse de particules structurées ; 5) éventuellement on concentre cette suspension de1 ' étape 4 ; 6) on élimine le milieu liquide pour recueillir le solide pulvérulent comprenant les particules .11- Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que dans 1 ' étape 1 : 1.1) on réalise une copolymérisation de monomères formés par des anhydrides de N-CarboxyAminoacides (NCA) d' amino-acides hydrophobes AAO en présence : d'au moins un solvant polaire non aromatique, de préférence choisi dans le groupe comprenant : la N-MéthylPyrrolidone (NMP) , leDiMéthylFormamide (DMF) , le DiMéthylsulfOxyde (DMSO) , le DiMéthylAcétamide (DMAc) , la pyrrolidone ; la NMP étant plus particulièrement préférée ; - et éventuellement d'au moins un co-solvant sélectionné parmi les solvants aprotiques (de préférence le dioxanne-1,4) et/ou les solvants protiques (de préférence la pyrrolidone) et/ou l'eau et/ou les alcools, le methanol étant particulièrement préféré ;
1.2) on met en œuvre ou on prépare par polymérisation de monomères alkylène-glycol (de préférence ethylëne ou propylène-glycol) au moins un bloc polymère PAG de poly-alkylène-glycol (de préférence de PEG ou PPG) ; ce bloc PAG étant fonctionnalisé (avantageusement à au moins l'une de ses extrémités ) par au moins un groupement réactif nucléophile, de préférence choisi dans le groupe comprenant les aminés (en particulier les aminés primaires ou secondaires) , les alcools ou les thiols ;
1.3) on ajoute le PAG fonctionnalisé de l'étape 2 au milieu de polymérisation du bloc de poly-AAO, avant, pendant ou après la polymérisation.
12- Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que, le ou les bloc (s) PAG fonctionnalisé (s) est (sont) introduit (s) avant et/ou au début de la polymérisation, qui se déroule de préférence à une température comprise entre 20 et 120°C à pression atmosphérique normale.
13- Procédé de préparation de la suspension selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'on met en présence d'un milieu aqueux non solvant des AAO, le solide pulvérulent selon la revendication 9 et/ou le solide pulvérulent obtenu par le procédé selon la revendication 10.
14- Procédé de préparation de la suspension selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes 1,2,3,4 et éventuellement 5 du procédé selon la revendication 10.
15- Procédé de préparation de la suspension selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'on effectue l'association du PA hydrophile aux particules, par mise en présence d'une phase liquide contenant ledit PA hydrophile avec la suspension colloïdale de particules. 16- Procédé de préparation de la suspension selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'on effectue l'association du PA hydrophile aux particules par mise en présence dudit PA à l'état solide avec la suspension colloïdale de particules .
17- Procédé de préparation de la suspension selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'on met en présence le solide pulvérulent selon la revendication 9 et/ou le solide pulvérulent obtenu par le procédé selon la revendication 10, avec une phase liquide contenant le PA hydrophile.
18- Procédé de préparation de la suspension selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'on met en présence le solide pulvérulent selon la revendication 9 et/ou le solide pulvérulent obtenu par le procédé selon la revendication 10, avec le PA hydrophile sous forme solide et en ce que l'on disperse ce mélange de solides dans une phase liquide, de préférence une solution aqueuse.
19- Produits intermédiaires du procédé selon la revendication 10 ou 11, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par des copolymères PAG-polyAAO, de préférence PEG-polyAANO, précurseurs de particules.
20- Suspension selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 et/ou obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 18 et/ou solide pulvérulent selon la revendication 9 comprenant un moins un principe actif hydrophile choisi, de préférence, parmi : o les vaccins ; o les protéines et/ou les peptides, parmi lesquels les plus préférentiellement retenus sont : les hémoglobines, les cytochromes, les albumines, les interférons, les antigènes, les anticorps, l'érythropoïétine, l'insuline, les hormones de croissance, les facteurs VIII et IX, les interleukines ou leurs mélanges, les facteurs stimulants de l'hématopoïèse ; o les polysaccharides, l'héparine étant plus particulièrement sélectionnée ; o les acides nucléiques et, préférablement, les oligonucléotides d'ARN et/ou d'ADN ; o des molécules non peptido-protéiques appartenant à diverses classes de chimiothérapie anti- cancéreuses et, en particulier, les anthracyclines et les taxoïdes ; o et leurs mélanges .
21- Spécialité pharmaceutique, nutritionnelle, phytosanitaire ou cosmétique, caractérisée en ce qu'elle comporte une suspension selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 et/ou obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 18 et/ou du solide pulvérulent selon la revendication 9.
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