MXPA03002977A - Suspension coloidal de particulas submicronicas de vectorizacion de principios activos hidrofilicos (insulina) y su modo de preparacion. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a una suspension de particulas de vectorizacion (PV) de principios activos (PA) hidrofilicos (insulina). Dichas PV se basan en un copolimero de doble bloque de Glicol de PoliEtileno/poliaminoacidos neutros hidrofobicos poliAANO. Dichas particulas de PEG/poliAANO se asocian con un PA hidrofilico (insulina). La invencion tambien se refiere, a un solido pulverulento del cual se derivan las PV y la preparacion de dicho solido y dicha suspension de PV a base de PEG/poliAANO e insulina. Dicha preparacion consiste en copolimerizar N-CarboxiAnhidridos de AANO, en presencia de N-metilpirrolidona, metanol, y PEG funcionalizado por amina. Se obtiene PEG/poliAANO, que se asocia con insulina. Se precipita con la ayuda de agua para obtener las PV. Eventualmente, se neutraliza, dializa, concentra y elimina el agua, Se produce asi un solido pulverulento o PV en suspension cargada en insulina y se preparan especialidades farmaceuticas.

Description

SUSPENSIÓN COLOIDAL DE PARTÍCULAS SUBMICRÓNICAS DE VECTORIZACION DE PRINCIPIOS ACTIVOS HIDROFÍLICOS (INSULINA) Y SU MODO DE PREPARACIÓN El dominio de la presente invención es aquel de las Partículas de Vectorización (PV), útiles para la administración de principios activos (PA). Estos últimos son, de preferencia, los medicamentos o nutrientes para su administración a un organismo animal o humano por vía oral o nasal, vaginal, ocular, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intracerebral, parenteral, etc. En términos de naturaleza química, los PA a los que se refiere más particularmente la invención son hidrofílicos, por ejemplo, proteínas, glucoproteínas, péptidos, polisacáridos, lipopolisacáridos o polinucleótidos. La presente invención se refiere, de manera más precisa, a las suspensiones coloidales de Partículas de Vectorización, ventajosamente de tipo submicrónico, a base de bloques de poliaminoácidos hidrofóbicos y polímeros hidrofílicos de tipo polialquilenglicol (PAG), de preferencia glicol de polietileno (PEG). La presente invención comprende también las partículas matizados (insulina) como tales, los sistemas de vectores de PA hidrofílicos, constituidos por las partículas cargadas por el (los) PA. La invención se refiere, igualmente, a los métodos de preparación de dichas suspensiones coloidales de partículas, cargadas en PA hidrofílico (insulina). La encapsulación de PA en las PV tiene, notablemente, por objeto modificar su duración de acción y/o encaminarlas al lugar de tratamiento y/o aumentar la biodisponibilidad de dichos PA. Numerosas técnicas de encapsulación ya se han propuesto. Tales técnicas incluyen, por una parte, permitir el transporte de PA hasta su sitio de acción terapéutica, protegiéndose contra las agresiones del organismo (hidrólisis, digestión enzimática, etc.) y, por otra parte, controlar la liberación de PA sobre su sitio de acción, a fin de mantener la cantidad disponible para el organismo al nivel deseado. Los PA referidos por estas transformaciones de transporte y de estancia en el organismo son, por ejemplo, las proteínas pero también pueden ser, igualmente, diferentes productos, moléculas orgánicas de origen sintético o natural. La revista de M. J. HUMPHREY (Delivery system for peptide Drugs, editada por S. DAVIS y L. ILLUM, Plenum Press, N .Y. 1986), expone la problemática que concierne a la mejora de la biodisponibilidad de PA y el interés de los sistemas de vectorización y de liberación controlada. Entre todos los materiales considerados para formar las PV, los polímeros se utilizan cada vez más, debido a sus propiedades intrínsecas. Se tratan de un cuaderno de cargas que se desean obtener para las PV, es particularmente exigente y comprende notablemente, las siguientes especificaciones. 1 . La primer especificación buscada para las PV será que el polímero, que constituye las PV sea biocompatible, eliminable (por excreción) y/o biodegradable y, aún mejor, que se metabolice en productos no tóxicos para el organismo. Además, convendrá que la biodegradación en el organismo sea de una duración suficientemente corta. Las PV tendrán la ventaja de poder formar, sin la ayuda de un solvente orgánico y/o agente tensoactivo, una suspensión acuosa, estable. Será igualmente deseable que las PV tengan un tamaño suficientemente corto para poder subir, en suspensión en un líquido, una filtración estéril por un filtro cuyo diámetro de los poros es inferior o igual a 0.2 µp\. Es deseable que las PV y los sistemas PV-PA puedan obtenerse por un método no desnaturalizante para PA. Las PV deberán, ventajosamente, permitir controlar la velocidad de liberación de PA. Otra especificación importante será que los sistemas PV-PA podrán constituir excelentes medicamentos inyectables. Esta aptitud mejorada de la administración por inyección, por ejemplo, intravenosa o intramuscular, «inyectabilidad» se caracteriza por: (i) un volumen inyectado reducido (para una dosis terapéutica proporcionada), (ii) una viscosidad débil. Estas dos propiedades son satisfactorias cuando la dosis terapéutica de PA se asocia con una cantidad mínima de PV. En otros términos, PV deben tener una fuerte proporción de cargamento en PA. 7. El costo propio de las PV en una preparación inyectable debe reducirse y aún conveniente que las PV tengan una fuerte proporción de carga en PA. En definitiva, el tamaño corto y una fuerte proporción de carga son las principales especificaciones buscadas para las PV. 8. Igualmente es ventajoso que el polímero , constitutivo de PV, no ind uzca la respuesta inmunitaria. 9. Para la familia de PA hidrofílicos, en particular las proteínas y más particularmente aún la insulina, convendrá tener PV que se adapten a esta familia de PA en términos de facilidad de asociación y de liberación y en términos de carácter no desnaturalizante. Las proposiciones técnicas anteriores, descritas infra, intentan satisfacer el conjunto de estas especificaciones. A manera de ilustración , se citarán las proposiciones anteriores (a) a (j) : (a) La Patente de E. U . 5 286 495 se refiere a un método de encapsulación por vaporización de proteínas en fase acuosa, con la ayuda de materiales que tienen cargas opuestas, es decir: alginato (cargado negativamente) y polilisina (cargada positivamente). Este método de fabricación permite producir partículas de tamaño superior a 35 µt?. (b) Por otra parte, las técnicas de emulsión se utilizan actualmente para preparar micropartículas cargadas de PA. Por ejemplo , las solicitudes de Patente WO 91 /06286, WO 91 /06287 y WO 89/08449 divulgan tales técnicas de em ulsión en las cuales se recurre a los solventes orgánicos para soiubilizar los polímeros, por ejemplo, de tipo poliláctico. Pero se comprueba que los solventes pueden desnatural izarse, notablemente para los PA peptídicos o polipeptídicos Se conocen, ig ualmente, las PV biocompatibles llamadas protenoides, descritas en 1 970 por X. FOX y K. DOSE en «Molecular Evolution and the Origin of Life» , Ed . Marcel D EKKER I nc (1 977) . Así, la solicitud de Patente WO 88/01213 propone un sistema a base de una mezcla de polipéptidos sintéticos, de los cuales la solubilidad depende del pH . Para obtener las micropartículas de las matrices según esta i nvención , solubilizan la mezcla de polipéptidos, después con un cambio de pH , provocan la precipitación de partícu las proteinoides. Cuando la preparación se efectúa en presencia de un PA, este se encapsula en la partícula. Se mencionará igualmente, para memoria, la Patente de E. U . 4 351 337 que revela un domin io diferente de aquel de la vectorización de PA propio de la invención. Esta Patente divulga los implantes másicos fijos y localizados en los sitios bien precisos del organismo. Estos implantes son tubos o cápsulas ah uecadas de tamaño microscópico (160 µ?? y longitud igual a 2 000 µp\) , constituidos de copolímeros de copoli(aminoácidos), por ejemplo, poli(ácido glutámico-leucina) o poli(bencilglutamato-leucina), obtenidos por copolimerización de monómeros de N-carboxianhídridos de aminoácidos (NCA). La inclusión de un PA se opera por una técnica de evaporación de solvente de una mezcla de polímero y de PA. La Patente de E.U. 4 450 150 que pertenece a la misma familia que la Patente de E. U. 4 351 337 estudiada anteriormente y tiene esencialmente el mismo objeto. Los PAA constitutivos son poli(ácido glutámico-etilglutamato) La Solicitud de Patente PCT/FR WO 97/02810 divulga una composición para la liberación controlada de principios activos, que comprende una pluralidad de partículas lamelares de un polímero biodegradable, al menos en parte cristalino (polímero de ácido láctico) y de un PA absorbido sobre dichas partículas. En este caso, la liberación de principio activo se opera por desorción. La publicación «CHEMISTRY LETTERS 1995, 707, AKIYOSH I ET AL» se refiere a la estabilización de insulina por complejación supramolecular con los polisacáridos hidrofóbicos por injerto de colesterol. El artículo que aparece en «MACRO OLECULES 1997, 30, 4013-4017» describe los copolímeros compuestos de un bloque de pollpéptido en base a L-fenilalanina, de (-bencil-L-glutamato o de 0-(tetra-0-acetil-D-glucopiranosil)-L-serina, y un bloque sintético, tal como poli(2-metil-2-oxazolina) o poli(2-fenil-2-oxazolina). Los polímeros se agregan en medio acuoso para formar partículas de 400 nm, capaces de asociarse con una enzima, la lipasa. El término asociado significa aquí que la proteína se absorbe sobre la partícula por un fenómeno físico (no por enlace covalente). La Patente PCT WO 96/29991 tiene por objeto las partículas de poliaminoácidos útiles para la vectorizacion de PA, notablemente PA hidrofílicos tal como insulina. Estas partículas tienen un tamaño comprendido entre 10 y 500 nm. Las partículas según la WO 96/29991 se forman espontáneamente al poner en contacto PAA con una solución acuosa. PAA comprenden monómeros aminoácidos neutros y AAO hidrofóbicos y monómeros ionizables e AAI hidrofílicos. Estas partículas pueden cargarse en insulina, lo mejor posible a una elevación de 6.5% en peso seco de insulina con respecto a la masa de PAA. Ta se mide según un modo operativo Ma descrito más lejos. EP 0 583 955 divulga micelas de polímero capaces de colocarse físicamente en PA hidrofóbicos. Estas micelas se constituyen por los copolímeros de bloque: PEG/poliAANO (AANO=Aminoácido Neutro hidrofóbico). AANO puede ser: Leu, Val, Phe, Bz-O-Glu, Bz-O-Asp, este último siendo preferido. Los principios activos PA hidrofóbicos colocados las micelas de PEG/poliAANO son, por ejemplo, adriamicina, indometacina, daunomicina, metotrexato, mitomicina. En esta solicitud de patente, solo se ejemplifican las micelas a base de PEG/poliGlu-0-Bz. O, se observa que estos ésteres Glu-O-Bz no son estables en la hidrólisis en medio acuoso. Además, no existe cuestión en este documento de partículas constituidas por un copolímero de bloque PEG/poliAANO, del cual el núcleo se forma por el poliaminoácido neutro hidrofóbico y que comprende un cola externa hidrofílica a base de PEG, estas partículas siendo aptas para asociarse con los PA hidrofílicos y a su liberación in vivo. Se conocen igualmente las nanopartículas de vectorización sobre las cuales son injertadas de cadenas de PEG. Se trata, por ejemplo, de nanopartículas de poliláctidos o liposomas. Este revestimiento de cadenas de PEG es un medio eficaz conocido por el experto en la materia para evitar la absorción de proteínas (hidrofílicas) sobre estas nanopartículas recubiertas de PEG. Tales nanopartículas o liposomas se califican de "furtitivos". La prevención de absorción de las proteínas sobre una superficie por injerto de PEG, se describe en un gran número de artículos, por ejemplo: L. Illum et al., J. Pharm. Sci. 72, 1086, (1983). La descripción de liposomas "furtitivos" ("liposomas stealth") puede encontrarse en: [DD Lasic, FJ Martin "Stealth Liposomes" CRC Press (BocaRaton, FL) 1995; MC Woodle, DD Lasic "Sterically Stabilized Liposomes" Biochim Biophys Acta 1992, 1 1 13, 171-199; MC Woodle "Controlling Liposome Blood Clearance by surface grafted polymers" Advanced Drug Delivery Reviews 1998, 32, 139-152]. Igualmente se encuentra una síntesis de estas cuestiones en: ["Polyethyléne-glycol coated biodegradable nanospheres R. Gref et al m. "micropartículated for the delivery of proteins and vaccines" S. Cohén et al., Ed. Marcel Dekker 1996"]. Como la carga en principio activo de estas nanopartículas furtivas se impide, preconocen una encapsulacion en el centro de los principios activos por un método en vía de solvente orgánico. O, este tipo de método se contrario a las especificaciones 2 & 4 del cuaderno de cargas anteriormente definido. De este procedimiento se resalta que las proposiciones técnicas anteriores descritas, y notablemente la proposición (i), satisfacen de manera incompleta las especificaciones del cuaderno de cargas indicadas supra, y, en particular en lo que respecta a la asociación de partículas a los principios activos hidrofílicos (proteínas tal como la insulina) así como la aptitud de estas partículas cargadas en PA hidrofílicos han liberado estas últimas in vivo sin que se hayan alterado por la vectorización. En este caso, uno de los objetivos esenciales es poder suministrar nuevas PV que se forman espontáneamente, y sin la ayuda de agentes tensoactivos o de solventes orgánicos, suspensiones acuosas estables de PV y adaptadas a la vectorización de PA hidrofílicos (notablemente las proteínas tal como la insulina). Se trata de obtener las suspensiones de partículas cargadas en principio activo hidrofílico, de preferencia en proteínas tales como la insulina. Otro objetivo esencial de la presente invención es suministrar nuevas PV en suspensión acuosa coloidal estable (notablemente a la hidrólisis) o bajo la forma pulverulenta y a base de poli(aminoácidos) (PAA), estas nuevas PV deben satisfacer lo mejor posible las especificaciones 1 a 9 del cuaderno de cargas intentado. Otro objetivo esencial de la invención es perfeccionar las partículas divulgadas en la patente EP 0 583 955. Otro objetivo esencial de la invención es suministrar una suspensión nueva de PV de la cual se dominan perfectamente las características, notablemente en términos de proporción de carga en PA y en términos de control de cinética de liberación de PA. Otro objetivo esencial de la invención es suministrar suspensiones médicas hidrofílicas inyectables. Las especificaciones, requeridas para tales suspensiones, son de un volumen débil de inyección y una viscosidad débil . Importa q ue la masa de partículas coloidales por dosis de inyección sea la más débil posible y sin limitar la cantidad de principio activo PA transportado por estas partículas, a fin de no perjudicar la eficacia terapéutica . Otro objetivo esencial de la invención es suministrar una suspensión coloidal acuosa o un sólido pulverulento que comprende las partícu las de vectorización de principios activos que satisfacen las especificaciones intentadas anteriormente y que constituyen una forma galénica apropiada y conveniente para una administración , por ejemplo, oral, al hombre o animal. Otro objetivo esencial de la invención es suministrar u na suspensión coloidal que comprende partículas de vectorización de principios activos filtrabies sobre los filtros de 0.2 ¿im para los fines de esterilización. Otro objetivo esencial de la invención es proponer un método de preparación de partículas (secas o en suspensión en un líquido) de PAA útiles, notablemente, como vectores de principios activos hidrofílicos (notablemente proteínas tales como la insulina) , dicho método deberá ser, más simple de emplear, no desnaturalizante para los principios activos y por otro lado , siempre debe permitir un dominio fino de la gran ulometría promedio de las partículas obtenidas. Otro objetivo esencial de la invención es el uso de dichas partículas en suspensión acuosa o bajo forma sólida para la preparación de medicamentos (por ejemplo, vacunas), en particular para su administración notablemente oral, nasal, vaginal, ocular, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intracerebral o parenteral, los principios activos hidrofílicos de estos medicamentos pueden ser, notablemente, las proteínas, glucoproteínas, péptidos, polisacáridos, lipopolisacáridos, oligonucleótidos y polinucleótidos. Otro objetivo de la presente invención es suministrar un medicamento, de tipo sistema de liberación prolongada de principios activos, que sea fácil y económico de producir y que sea, por otro lado, biocompatible y apto para asegurar un muy alto nivel de biodisponibilidad de PA. Los objetivos relativos a los productos (entre otros) se logran por la presente invención que se refiere, a una suspensión coloidal de partículas submicrónicas susceptibles de utilizarse, notablemente para la vectorización de principio(s) activo(s) (PA), estas partículas siendo de arreglos supramoleculares individuales: • a base de un copolímero anfifílico que comprende: V al menos un bloque de poliaminoácido(s) (PAA) lineal(es), hidrofóbico(s) a encadenamientos a- peptídicos, aminoácidos idrofóbicos AAO constitutivos de este bloque PPA siendo idénticos o diferentes entre ellos; y al menos un bloque de polímero(s) hidrofílico(s) de tipo polialquilenglicol (PAG), de preferencia glicol de polietileno (PEG). • aptos para asociar en suspensión coloidal al estado no disuelto, al menos un PA y para liberar este, notablemente in vivo, de manera prolongada y/o retardada; caracterizadas porque las partículas que la contienen se asocian y/o pueden asociarse con al menos un PA seleccionado entre los PA hidrofílicos, de preferencia entre las proteínas, PA más preferencialmente todavía constituido por la insulina. Uno de los fundamentos inventivos de estas nuevas partículas de vectorización PV, en suspensión acuosa coloidal estable o en el estado de sólido pulverulento, tiende a la selección original de un copolímero de bloque polímero hidrofílico/poliaminoácido hidrofobico que permite obtener las partículas de tamaño submicrónico, que forman una suspensión coloidal acuosa estable en ausencia de agentes tensoactivos o solventes y que se adaptan a los PA hidrofílicos. Es particularmente sorprendente e inadvertido que las partículas a base de copolímero de bloque polímero hidrofílico de polialquiienglicol/poliaminoácido hidrofobico conocidos por colocar los principios activos hidrofóbicos (EP 0 583 955), pueden asociarse y liberarse in vivo de PA hidrofílicos, en particular proteínas tal como ia insulina. Además, el experto en la materia que conoce el uso de una capa exterior de PEG para prevenir la absorción de proteínas hidrofílicas, separará naturalmente esta solución para la concepción de nanopartículas que deben por el contrario absorber una gran cantidad de proteínas hidrofílicas. Contra todo intento, no tiene nada en el alcance de la invención. La estructura de copolímeros de bloque PAG/Pol¡ AAO y la naturaleza de aminoácidos AAO, se eligen de manera que: • las cadenas de polímeros se estructuran espontáneamente bajo forma de partículas (PV) de tamaño pequeño, • las partículas forman una suspensión coloidal estable en el agua y en medio fisiológico, • PV se asocian con proteínas u otros PA hidrofílicos en medio acuoso, por un mecanismo espontáneo y no desnaturalizante para la proteína. • PV que liberan PA hidrofílicos en medio fisiológico y, más precisamente, in vivo, la cinética de liberación es función de la naturaleza de copolímero PAG/Poli AAO precursor de PV. Así, al funcionar sobre la estructura particular de copolímero, se pueden controlar los fenómenos de asociación y de liberación de PA sobre el plano cinético y cuantitativo. De preferencia, PAG corresponde a glicol de polietileno (PEG) o a glicol de polietileno (PPG), PEG siendo particularmente preferido. Siguiendo otra característica de la invención, PAG, de preferencia PEG, posee una masa molar en peso comprendida entre 500 y 50000 D, de preferencia entre 1000 y 10000 D, y más preferencialmente todavía entre 1000 y 5000 D. Ventajosamente, la suspensión según la invención se caracteriza por una proporción de carga Ta de partículas de vectorización con la insulina, expresada en % de masa de insulina asociada con respecto a la masa y medida según un modo operativo Ma, Ta siendo tal como: 7 < Ta de preferencia, 8 < Ta < 50 y, más preferentemente todavía , 10 < Ta < 30. Modo operativo Ma: (a) Preparación de una solución acuosa de insulina: La insulina recombinante humana liofilizada (Sigma n° 10259) se vierte en una solución de HCI 1 N durante 5 minutos a 25°C. Esta solución enseguida se vierte en una sol ución de tapón de fosfato que se neutraliza finalmente por la adición de NaOH de 0.1 N . La solución se deja enseguida en reposo 30 min a temperatura ambiente, después se filtra sobre la membrana "acrodisc"® 0.8-0.2 µt? . La masa de insulina se calcula en función del volumen deseado de solución , a fin de obtener una concentración de U l/ml . (b) Dispersión de partículas de vectorización en PAA para asociarse en la solución de insulina: Las PV liofilizadas se agregan a la solución de insulina, en razón de 10 mg PV/ml de solución. Esta mezcla se agita en vértice de dos a tres veces, después se coloca en un agitador en vaivén a temperatura ambiente durante 18 horas. La suspensión coloidal se conserva enseguida a 4°C. (c) Separación de insulina libre de la insulina asociada y dosificación de insulina libre: La solución , que contiene insulina y PV, se centrifuga 1 hora bajo 60 000 g a 20°C. El sobrenadante se coloca en tubos suministrados con una membrana de ultrafiltración (umbral de corte 100 OOODa) y se centrifuga bajo 3 000 g 2 horas a 20°C. La insulina en el filtrado se dosifica por CLH P. Para definir un poco más los copolímeros constitutivos de partículas, se puede indicar que son de tipo secuencial alterno (bloques). Así, según una forma preferida de realización de la suspensión de PV según la invención: - AAO son aminoácidos neutros hidrofóbicos AANO, - la relación PAG/AANO es >1 , - y la longitud absoluta del bloque PEG es > 2 monómeros, de preferencia > 10 monómeros, y más preferentemente > 20 monómeros. Ventajosamente, el o los bloques PAA a base de AANO comprenden al menos 5, de preferencia al menos 10, y más preferentemente todavía al menos entre 10 y 50. De manera aún más preferida, las partículas son "dibloques" de PEG/AANO. Estos aminoácidos neutros hidrofílicos (AANO) en la práctica, se eligen del grupo que comprende: • aminoácidos neutros naturales: Leu, lie, Val, Ala, Pro, Phe, sus mezclas, • aminoácidos neutros, raros o sintéticos: norleucina, norvalina • derivados de aminoácidos polares: glutamato de metilo, glutamato de etilo, aspartato de bencilo, N-acetillisina. Siguiendo una característica preferida de la invención, PAA de bloques constitutivos de partículas tienen grados de polimerización DP comprendidos entre 30 y 600, de preferencia entre 50 y 200 y, más preferentemente todavía, entre 60 y 150. La presente invención propone, no solamente las suspensiones de partículas matizadas, tales como aquellas definidas anteriormente, sino que igualmente las partículas que comprenden al menos un principio activo PA. De preferencia, la suspensión según la invención es acuosa y estable. Estas partículas, cargadas o no en PA, se encuentran, ventajosamente bajo forma dispersa en un líquido (suspensión), de preferencia acuoso, pero pueden igualmente encontrarse en el estado de sólido pulverulento, obtenido a partir de la suspensión de PV tal como se define anteriormente. También la invención se refiere además a una suspensión coloidal (de preferencia acuosa) de PV, un sólido pulverulento que comprende PV y obtenido de la suspensión según la invención. Otro objeto esencial de la invención se refiere a la preparación de partículas seleccionadas (tales como las descritas a continuación), también bajo forma de suspensión coloidal que bajo forma de sólido pulverulento, para sintetizar los copolímeros PAG/poliAAO precursores y transformar partículas estructuradas. Más precisamente, se trata, de un método de preparación de sólido pulverulento intentado y formado por las partículas estructuradas submicrónicas susceptibles de utilizarse, notablemente para la vectorización de principio(s) activo(s), estas partículas siendo arreglos supramoleculares discretos: • a base de un copolímero anfifílico que comprende: S al menos un bloque de poliaminoácido(s) (PAA) lineal(es), hidrofóbico(s) a encadenamientos - peptídicos, aminoácidos hidrofóbicos AAO constitutivos de este bloque PPA siendo idénticos o diferentes entre ellos; y al menos un bloque de polímero(s) hidrofílico(s) de tipo polialquilenglicol (PAG), de preferencia glicol de polietileno (PEG). · aptos para asociar en suspensión coloidal al estado no disuelto, al menos un PA y para liberar este, notablemente in vivo, de manera prolongada y/o retardada; Este método se caracteriza porque: 1 ) se hace reaccionar al menos un segmento PAG con al menos un segmento PAA que comprende cada uno al menos un monómero de glicol de alquileno o aminoácido respectivamente y al menos una función reactiva que permite formar uno o los enlaces PAA-PAG (de preferencia amida), para obtener un copolímero de bloque PAG-poliAAO; 2) se precipita, de preferencia en agua, el copolímero de bloque PAG-poliAAO obtenido en la etapa 1 , lo que conduce a la formación espontánea de partículas de vectorización de PA; 3) se asocia al menos un principio activo PA hidrofílico con las partículas; 4) eventualmente se dializa el medio reaccional para purificar la suspensión acuosa de partículas estructuradas; ) eventualmente se concentra esta suspensión de la etapa 4, 6) se elimina el medio líquido para recolectar el sólido pulverulento que comprende las partículas. Las funciones de los segmentos PAG y PAA de la etapa 1 pueden ser funciones de amina o ácido carboxílico. Se puede intentar realizar la polimerización que conduce al bloque PAG y/o PAA antes, durante o después de la formación del enlace PAG-PAA. Todas estas variantes están al alcance del experto en la materia. De preferencia, en la etapa 1 : 1.1) se realiza una copolimerización de monómeros formados por anhídridos de N-CarboxiAminoácidos (NCA) de aminoácidos hidrofóbicos AAO en presencia: - de al menos un solvente polar no aromático de preferencia elegido en el grupo que comprende: N-MetilPirrolidona (N P), DiMetilFormamida (DMF), DiMetilsulfÓxido (DMSO), DiMetilAcetamida (DMAc), pirrolidona, NMP siendo más particularmente preferida; - y eventualmente de al menos un co-solvente seleccionado entre los solventes apróticos (de preferencia el dioxano-1 ,4) y/o los solventes próticos (de preferencia la pirrolidona) y/o el agua y/o los alcoholes, metanol siendo particularmente preferido; 1 .2) se emplea o se prepara por polimerización monómeros de glicol de alquileno (de preferencia etileno o glicol de propileno) al menos un bloque de polímero PAG de glicol de polialquileno (de preferencia de PEG o PPG); este bloque PAG funcionalizándose (ventajosamente a al menos una de sus extremidades) por al menos un grupo reactivo nucleofílico, de preferencia elegido en el grupo que comprende las aminas (en particular las aminas primarias o secundarias), los alcoholes o tioles; 1.3) se agrega PAG funcionalizado de la etapa 2 en medio de polimerización de bloque de poli-AAO, antes, durante y después de la polimerización. La etapa 1.1 de procedimiento se inspira en las técnicas conocidas de polimerización de anhídridos de N-carboxi-(a-aminoácidos (NCA), descritos, por ejemplo, en el artículo «Biopolymers, 15, 1869 (1976) » y en la obra de H. R. KRICHELDORF «cc-Aminoacido-N-carboxy Anhidride and Related Heterocycles» Springer Verlag (1987). Siguiendo una variante, en el campo de la etapa 1.1 , se precipita, de preferencia en agua, el copolímero poli(AOO) (pAAl) obtenido y se recolecta este precipitado. Esta variante corresponde a un modo discontinuo de preparación de partículas, en el cual se aisla el copolímero poli(AAO) (pAAl) bajo forma de precipitado que forma un producto intermedio estable. Este precipitado puede, por ejemplo, filtrarse, lavarse y secarse.

De manera aún más preferida, NCA-pAAl son NCA de ácido glutámico o aspártico O-alquilado, por ejemplo, NCA-Glu-O- e, NCA-Glu-O-Et o NCA-Glu-O-Bz (Me = metilo, Et = etilo). De preferencia, el o los bloques PAG funcionalizado(s) se introduce(n) antes y/o al comienzo de la polimerización, que se desarrolla de preferencia a una temperatura comprendida entre 20 y 120°C a presión atmosférica normal. Ventajosamente, PAG de la etapa 1.2 son los productos comerciales disponibles (PEG, por ejemplo) o aún bien se obtienen de manera conocida por polimerización de óxido de etileno. Otros parámetros, como la concentración en polímero, la temperatura de mezcla reaccional, el modo de agregar el polímero hidrofílico, el empleo de presión reducida, la duración de la reacción, etc. , se ajustan según los efectos deseados y bien conocidos por el experto en la materia. Para efectuar la asociación (etapa 3) de uno o varios PA a las partículas, es posible emplear varios procedimientos conforme a la invención. Los ejemplos, no limitativos, de estos métodos se enumeran a continuación. Según un primer método, se efectúa la asociación de PA a las partículas al poner en presencia de una fase líquida (acuosa o no) que contiene PA con la suspensión coloidal de partículas. Según un segundo método, se efectúa la asociación de PA a las partículas al poner en presencia de un PA en el estado sólido con la suspensión coloidal de partículas. PA sólido puede encontrase, por ejemplo, bajo forma de liofilisato, precipitado, polvo u otro. Según un tercer método, se pone en presencia el sólido pulverulento (PAA), tal como se describe en cuanto al producto y por sus características de obtención, con una fase líquida (acuosa o no) que contiene PA. Según un cuarto método, se pone en presencia el sólido pulverulento, tal como se describe en cuanto al producto y por sus características de obtención, con PA bajo forma sólida. Se dispersa enseguida esta mezcla de sólidos, en una fase líquida, de preferencia una solución acuosa. En todos estos métodos, PA utilizados pueden encontrarse bajo forma pura o preformulada. Conforme a la etapa facultativa 5, se eliminan las impurezas (sales) así como el solvente, por todo tratamiento de separación física apropiada, por ejemplo, por diafiltración (diálisis) (etapa 4), filtración, modificación de pH, cromatografía. Se conduce a una suspensión acuosa de partículas estructuras que pueden concentrarse, por ejemplo, por destilación o todo otro medio físico conveniente: ultrafiltración, centrifugación. Para concentrar (etapa 6) o para separar (etapa 7) las partículas de su medio líquido de suspensión, se elimina, eventualmente, la fase acuosas, por ejemplo, por destilación por secado (por ejemplo, en la estufa), por liofilización o todo otro medio físico conveniente: ultrafiltración, centrifugación. Se recupera, en el campo de la etapa 7, un sólido pulverulento, de color blanco.

Se observa que el empleo de las etapas 1 , 2, 3, 4 y eventualmente 5 del método anterior corresponde a una preparación de una suspensión coloidal de partículas submicrónicas y a una fuerte proporción de carga con los PA hidrofílicos. Cuando esta preparación de suspensión coloidal, los copolímero anfifílicos PAG-poli(AAO) de la etapa 1 se colocan en un medio acuoso en el cual al menos una parte de PAG es soluble y al menos una parte de AANO es insoluble. Los copolímeros PAG/poliAANO existen bajo forma de nanopartículas en este medio acuoso. Una alternativa para preparar la suspensión de PV según la invención consiste en poner en presencia el sólido pulverulento, tal como se describe anteriormente como en producto y por su método de obtención, con un medio acuoso, no solvente de AANO. Tomando en cuenta el tamaño nanométrico de las partículas, la suspensión puede filtrase sobre los filtros de esterilización, lo que permite obtener, fácilmente y a menos costo, líquidos médicos inyectables, estériles. El hecho de poder, gracias a la invención, controlar el tamaño de las partículas y lograr los valores de Dh entre 25 y 100 nm, es un triunfo importante. La presente invención intenta, igualmente, nuevos productos intermedios del método descrito anteriormente, caracterizados porque se constituyen por los copolímeros PAG-poliAAG precursores de partículas. Según otro de sus aspectos, la invención se refiere a una suspensión y/o un sólido pulverulento, tal como se define anteriormente, y/o tal como se obtienen por el método presente arriba, esta suspensión y este sólido comprendiendo al menos un principio activo hidrofílico, elegido, de preferencia, entre: • las vacunas; • las proteínas y/o los péptidos, entre los cuales los más preferentemente retenidos son: hemoglobinas, citocromas, albúminas, interferones, antígenos, anticuerpos, eritropoyetina, insulina, hormonas de crecimiento, factores VIII y IX, interleucinas o sus mezclas, factores estimulantes de hemotopoyesis; • los polisacáridos, heparina seleccionándose más particularmente; • los ácidos nucleicos y, preferentemente, los oligonucleótidos de ARN y/o ADN; • moléculas no peptidoprotéicas que pertenecen a diversas clases de quimioterapias anticancerosas y, en particular, antraciclinas y taxoides; • y sus mezclas. En fin, la invención se refiere a una especialidad farmacéutica, nutricional, fitosanitaria o cosmética, caracterizada porque comprende una suspensión y/o sólido pulverulento cargado en PA hidrofílico y tales como se definen anteriormente. Según otro de sus objetos, la invención intenta, igualmente, el uso de estas PV (en suspensión o bajo forma sólida) cargadas en PA, para la fabricación de medicamentos de tipo sistemas de liberación controlada de PA.

Se puede tratar, por ejemplo, de aquellos administrables, de preferencia por vía oral, nasal, vaginal, ocular, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intracerebral o parenteral. Las aplicaciones cosméticas considerables son, por ejemplo, las composiciones que comprenden un PA asociado a PV según la invención y aplicables por vía transdérmica. Los siguientes ejemplos y que conciernen a PA hidrofílico formado por la insulina permitirán comprender mejor la invención en sus diferentes aspectos de producto/procedimiento/aplicación. Estos ejemplos ilustran la preparación de partículas de poliaminoácidos cargados o no en insulina, como también presenta las características de estructura y las propiedades estas partículas.

LEYENDA DE LAS FIGURAS Figura 1 - Evolución de glicemia G : [.. — o... — J promedio en % basa) y de la insulinemia promedio I (en mUI/1) : [ — · — ] después de la inyección de una formulación de PV cargada en insulina en razón de 0.5 U l/kg, en función de tiempos T (en horas).

EJEMPLOS Ejemplo 1 - Preparación de polímero-poli(leucina)-bloque-polietilenglicol Las técnicas utilizadas, para la polimerización de NCA en polímeros de estructuras en bloques o estáticas se conocen por el hombre experto en la materia y se detallan en la obra de H. R. KRICHELDORF "a- aminoacides-N-Carboxy Anhydrides and Related Heterocycles", Springer Verlag (1987). La siguiente síntesis precisa la síntesis de uno de entre ellos. Síntesis de poli(Ala)40-PEG: 10 g de NCA-Leu se solubilizan en 150 mi de NMP a 60°C. 5 mi de una solución de 2 g de aminoetil-PEG (Mw = 5000 D) en 50 mi de NMP se agregan al monómero una vez. Después de 2 h, se vierte el medio reaccional en 1 1 de agua. El precipitado formado se filtra, lava y seca. Rendimiento > 95%. Ejemplo 2 - Preparación del polímero-poli(fenilalanina)-bloque-polietilenglicol Síntesis de poli(Leu)40-PEG: 10 g de NCA-Leu se solubilizan en 150 mi de N MP a 60°C. 5 mi de una solución de 2 g de aminoetil-PEG (Mw = 5000 D) en 50 mi de N-metilpirrolidona (NMP) se agregan al monómero una vez. Después de 2 h, se vierte el medio reaccional en 1 1 de agua. El precipitado formado se filtra, lava y seca. Rendimiento > 95%. Ejemplo 3- Puesta en evidencia de nanopartículas por Difusión de la Luz (DDL) y por Microscopía Electrónica en Transmisión (TEM). 10 mg de partículas de polímero 1 se suspenden en 10 mi de agua o una solución acuosa de sal. Esta solución se introduce enseguida en un granuiómetro Coulter (o difractrómetro láser). Los resultados del análisis de la granulometría de diferentes productos probados se presentan en la siguiente tabla 1.

Tabla 1 - Mediciones del tamaño de PV Ejemplo 4 - Prueba de asociación de nanopartículas con una proteína (la insulina) A partir de una solución de tapón de fosfato isotónico de pH 7.4, se prepara una solución de insulina humana concentrada a 1.4 mg/ml que corresponde a 40 Ul/ml. En 1 mi de esta solución de insulina, se dispersan 10 mg de PV preparados en el ejemplo 1 . Después de 15 horas de incubación a temperatura ambiente, la insulina asociada a PV y la insulina libre se separan por centrifugación (60 000 g, 1 hora) y ultrafiltración (umbral de filtración 300 000 D). La insulina libre recuperada en el filtrado se dosifica por CLHP o por ELISA y se deduce por diferencia la cantidad de insulina asociada. La cantidad de insulina asociada a PV es superior a 0.77 mg, que representa más de 55% de total de insulina medida. La siguiente tabla muestra los resultados de las medidas de la relación de asociación efectuadas sobre diferentes PV. La relación de asociación expresa el porcentaje de insulina asociada con respecto a la insulina medida en una preparación concentrada a 1 .4 mg/ml de insulina y 10 mg/ml de PV. Este valor se transforma en una relación de carga que expresa una formulación al 100% de fijación de la proteína, en mg de insulina por 100 mg de PV.

Tabla 2 - Mediciones de la relación de asociación con la insulina para una mezcla de 0.14 mg de INSULINA/mg PV Ejemplo 5 - Farmacocinética y farmacodinámica de PV cargadas con la insulina al perro sano en ayunas El procedimiento de este ejemplo es el siguiente: La preparación del ejemplo 4 se ha inyectado en los perros, diabéticos por pancreatectomia total, y en ayunas la noche anterior. La administración a las 1 1 horas de la mañana por vía subcutánea torácica de la preparación se ha hecho a la posología de 0.5 Ul/kg de insulina por Kg de peso vivo del animal. El volumen administrado se comprende entre 0.18 y 0.24 mi. En los tiempos -4, -2, 0, 1 , 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 y 48 horas, 1 mi de sangre se pretoma por punción yugular al vacío sobre el tubo de heparinato de sodio. 30 µ? de sangre total se utilizan extemporáneamente para medir la glicemia. El tubo se centrifuga enseguida, decanta y el plasma se almacena a -20°C para dosificación de la insulina. Los resultados presentes en la figura 1 anterior muestran un regulado de la insulina hasta 12 horas (tratado pleno) y un efecto hipoglicemiante importante que se prolonga hasta 20 horas (tratado discontinuo) después de la inyección.

Tabla 3 - Mediciones del tiempo de acción de insulina (efecto hipoglicemiante) en presencia de PV según la invención Este ejemplo demuestra la no desnaturalización de la insulina en presencia de PV según la invención. Igualmente pone en evidencia el aumento de la duración de acción de la insulina con respecto a la insulina no formulada, y por lo tanto, la utilidad de PV como sistema de liberación controlada de insulina.

Claims (20)

1. REIVINDICACIONES 1. Suspensión coloidal de partículas submicrónicas susceptibles de utilizarse, notablemente para la vectorización de principio(s) activo(s) (PA), estas partículas siendo de arreglos supramoleculares individuales: • a base de un copolímero anfifílico que comprende: ·/ al menos un bloque de poliaminoácido(s) (PAA) lineal(es), hidrofóbico(s) a encadenamientos cc- peptídicos, aminoácidos hidrofóbicos AAO constitutivos de este bloque PPA siendo idénticos o diferentes entre ellos; y al menos un bloque de polímero(s) hidrofílico(s) de tipo polialquilenglicol (PAG), de preferencia glicol de polietileno (PEG). • aptos para asociarse en suspensión coloidal al estado no disuelto, con al menos un PA y para liberar este, notablemente ín vivo, de manera prolongada y/o retardada; caracterizada porque las partículas que la contienen se asocian y/o pueden asociarse con al menos un PA seleccionado entre los PA hidrofílicos, de preferencia entre las proteínas, PA más preferencialmente todavía constituido por la insulina.
2. 2. La suspensión según la reivindicación 1 , caracterizada por una relación de carga Ta de partículas de vectorización con la insulina, expresada en % de masa de insulina asociada con respecto a la masa y medida según un modo operativo Ma, Ta siendo tal como: 7 < Ta de preferencia, 8 < Ta < 50 y, más preferentemente todavía, 10 < Ta < 30.
3. 3. La suspensión según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque PAG, de preferencia PEG, posee una masa molar en peso comprendida entre 500 y 50000 D, de preferencia entre 1000 y 10000 D, y más preferentemente todavía entre 1000 y 5000 D.
4. 4. La suspensión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada: - porque AAO son aminoácidos neutros hidrofóbicos AANO, - porque la relación PAG/AANO es >1 , - porque la longitud absoluta del bloque PEG es > 2 monómeros, de preferencia > 10 monómeros, y más preferentemente > 20 monómeros.
5. 5. La suspensión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el o los bloques PAA a base de AANO comprenden al menos 5, de preferencia al menos 10, y más preferentemente todavía al menos entre 10 y 50.
6. 6. La suspensión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque las partículas son "dibloques" de PEG/AANO.
7. 7. La suspensión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque AANO se eligen entre los grupos que comprenden: • aminoácidos neutros naturales: Leu, lie, Val, Ala, Pro, Phe, sus mezclas, • aminoácidos neutros, raros o sintéticos: norleucina, norvalina • derivados de aminoácidos polares: glutamato de metilo, glutamato de etilo, aspartato de bencilo, N-acetillisina. 8. La suspensión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque es acuosa y estable. 9. Sólido pulverulento, caracterizado porque se obtiene a partir de la suspensión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
8. 8. 10. Método de preparación de sólido pulverulento según la reivindicación 9, caracterizado porque: 1 ) se hace reaccionar al menos un segmento PAG con al menos un segmento PAA que comprende cada uno al menos un monómero de glicol de alquileno o aminoácido respectivamente y al menos una función reactiva que permite formar uno o los enlaces PAA-PAG (de preferencia amida), para obtener un copolímero de bloque PAG-poliAAO; 2) se precipita, de preferencia en agua, el copolímero de bloque PAG-poliAAO obtenido en la etapa 1 , lo que conduce a la formación espontánea de partículas de vectorización de PA; 3) se asocia al menos un principio activo PA hidrofílico con las partículas; 4) eventualmente se dializa el medio reaccional para purificar la suspensión acuosa de partículas estructuradas; 5) eventualmente se concentra esta suspensión de la etapa 4, 6) se elimina el medio líquido para recolectar el sólido pulverulento que comprende las partículas. 1 1 . Método según la reivindicación 10, caracterizado porque en la etapa 1 : 1.1 ) se realiza una copolimerización de monómeros formados por anhídridos de N-CarboxíAminoácidos (NCA) de aminoácidos hidrofóbicos AAO en presencia: - de al menos un solvente polar no aromático de preferencia elegido en el grupo que comprende: N-MetilPirrolidona (NMP), DiMetilFormamida (DMF), DiMetilsulfÓxido (DMSO), DiMetilAcetamida (DMAc), pirrolidona, NMP siendo más particularmente preferida; - y eventualmente de al menos un co-solvente seleccionado entre los solventes apróticos (de preferencia el dioxano-1 ,4) y/o los solventes próticos (de preferencia la pirrolidona) y/o el agua y/o los alcoholes, metanol siendo particularmente preferido; 1 .2) se emplea o se prepara por polimerización monómeros de glicol de alquileno (de preferencia etileno o glicol de propileno) al menos un bloque de polímero PAG de glicol de polialquileno (de preferencia de PEG o PPG); este bloque PAG funcionalizándose (ventajosamente a al menos una de sus extremidades) por al menos un grupo reacíivo nucleofílico, de preferencia elegido en el grupo que comprende las aminas (en particular las aminas primarias o secundarias), los alcoholes o tioles; 1.3) se agrega PAG funcionalizado de la etapa 2 en medio de polimerización de bloque de poli-AAO, antes, durante y después de la polimerización. 12. Método según la reivindicación 1 1 , caracterizado porque el o los bloques PAG funcionallzado(s) se introduce(n) antes y/o al comienzo de la polimerización, que se desarrolla de preferencia a una temperatura comprendida entre 20 y 120°C a presión atmosférica normal. 13. Método de preparación de la suspensión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque se pone en presencia de un medio acuoso no solvente de AAO, el sólido pulverulento según la reivindicación 9 y/o el sólido pulverulento obtenido por el método según la reivindicación 10. 14. Método de preparación de la suspensión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque comprende las etapas 1 , 2, 3, 4 y eventualmente 5 del método según la reivindicación 10. 15. Método de preparación de la suspensión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque se efectúa la asociación de PA hidrofílico a las partículas, al poner en presencia de una fase líquida que contiene dicho PA hidrofílico con la suspensión coloidal de partículas. 16. Método de preparación de la suspensión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque se efectúa la asociación de PA hidrofílico a las partículas al poner en presencia dicho PA en el estado sólido con la suspensión coloidal de partículas. 17. Método de preparación de la suspensión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque se pone en presencia el sólido pulverulento según la reivindicación 9 y/o el sólido pulverulento obtenido por el método según la reivindicación 10, con una fase líquida que contiene el PA hidrofílico. 18. Método de preparación de la ' suspensión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque se pone en presencia el sólido pulverulento según la reivindicación 9 y/o el sólido pulverulento obtenido por el método según la reivindicación 10, con PA hidrofílico bajo forma sólida y porque se dispersa esta mezcla de sólidos en una fase líquida, de preferencia una solución acuosa. 19. Productos intermedios del método de preparación según la reivindicación 10 u 1 1 , caracterizado porque se constituyen por los copolímeros PAG-poliAAO, de preferencia PEG-poliAANO, precursores de partículas. 20. Suspensión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y/u obtenida por el método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 18 y/o sólido pulverulento según la reivindicación 9 que comprende al menos un principio activo hidrofílico elegido, de preferencia, entre: • las vacunas; • las proteínas y/o los péptidos, entre los cuales los más preferentemente retenidos son: hemoglobinas, citocromas, albúminas, interferones, antígenos, anticuerpos, eritropoyetina, insulina, hormonas de crecimiento, factores VI II y IX, interleucinas o sus mezclas, factores estimulantes de hemotopoyesis; • los polisacáridos, heparina seleccionándose más particularmente; • los ácidos nucleicos y, preferentemente, los oligonucleótidos de ARN y/o ADN; • moléculas no peptidoprotéicas que pertenecen a diversas clases de quimioterapias anticancerosas y, en particular, antraciclinas y taxoides; • y sus mezclas. 21 . Especialidad farmacéutica, nutricional, fitosanitaria o cosmética, caracterizada porque comprende una suspensión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y/u obtenida por el método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 18 y/o sólido pulverulento según la reivindicación
9. 9.