BRPI0919868B1

BRPI0919868B1 - processo para a preparação de um derivado de clorina ou de bacterioclorina

Info

Publication number: BRPI0919868B1
Application number: BRPI0919868-7A
Authority: BR
Inventors: Luís Guilherme Da Silva Arnaut Moreira; Maria Miguéns Pereira; Sebastião José Formosinho Sanches Simões; Sérgio Paulo Magalhães Simões; Krystyna Urbanska; Grazynia Stochel
Original assignee: Bluepharma-Industria Farmacêutica, S.A; Universidade De Coimbra
Priority date: 2008-10-24
Filing date: 2009-10-22
Publication date: 2020-10-27
Also published as: AU2009307106A1; ZA201102760B; US9670217B2; WO2010047611A9; ES2450136T3; CN102227432A; EP2346874B1; CA2741429A1; RU2011114878A; GB0819594D0; PL2346874T3; DK2346874T3; JP2012506425A; BRPI0919868B8; AU2009307106B2; WO2010047611A1; US20110250143A1; JP5567024B2; RU2513483C2; CA2741429C

Abstract

PROCESSO A invenção indica os métodos de preparação, as propriedades, as composições farmacêuticas e os métodos de terapia utilizando clorinas e bacterioclorinas sulfonadas concebidas para a utilização em terapia foto dinâmica (PDT) de tecidos hiperproliferativos, tais como tumores, vasos sanguíneos hiperproliferativos e outros distúrbios ou anormalidades sensíveis à PDT. De maneira especial, descreve-se a síntese econômica em larga escala de clorinas e bacterioclorinas. As suas propriedades foram moldadas para atingirem as de fotossensibilizadores ideais em PDT. Numa outra parte da patente, indicam-se as composições farmacêuticas e os métodos terapêuticos para administração sistêmica. Ainda numa outra parte, indicam-se também as composições farmacêuticas e os métodos terapêuticos para administração tópica. Para além disso, indica-se um método de marcação e obtenção de imagem de um tecido alvo por fluorescência e ressonância magnética.

Description

OBJETO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se aos métodos de preparação, às propriedades, à composição farmacêutica e à utilização em terapia de clorinas e bacterioclorinas sulfonadas concebidas para a terapia fotodinâmica (PDT) de tecidos hiperproliferativos, tais como tumores, vasos sanguíneos hiperproliferativos e outros distúrbios ou anomalias que reajam à PDT. Em particular, a presente invenção refere-se a um método novo para a síntese química em grande escala de clorinas e bacterioclorinas estáveis, que se caracteriza pela ausência de solventes e pela ausência de bases. Numa parte deste documento, indicam-se as composições farmacêuticas e os métodos para a sua utilização em terapia por administração sistêmica. Numa outra parte, indicam-se as composições farmacêuticas e os métodos para a sua aplicação em terapia por administração tópica. Indicam-se também métodos para a detecção de tecidos hiperproliferativos, como tumores, utilizando métodos fotodinâmicos ou MRI (processos imagiológicos por ressonância magnética).

I. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO I.A. Estado da arte

Vários compostos macrocíclicos tetrapirrólicos, tais como as purpurinas, clorinas, bacterioclorinas, ftalocianinas e benzoclorinas, podem acumular-se preferencialmente em tecidos hiperproliferativos quando injetados num organismo e absorverem luz, originando um estado excitado em resposta à luz. Estes compostos macrocíclicos passam então a exibir um efeito citotóxico sobre as células ou outros tecidos onde se encontram ao serem irradiados com o comprimento de onda apropriado. Para além disso, estes compostos emitem energia a partir do tecido, fenômeno que se pode utilizar para detectar a sua localização.

Em PDT, injeta-se no paciente um fotossensibilizador (geralmente na concentração de 0,1 e 10 mg/kg de peso corporal), que apresente alguma seletividade para causar danos fotoquímicos ao tecido tumoral e, após um tempo determinado, irradia-se a zona do tumor com luz visível ou da gama infravermelha próxima (cerca de 50 a 200 J/cm2) . O fotossensibilizador absorve luz e fluoresce, ou reage com moléculas presentes nos tecidos por meio de reações de transferência de elétrons ou hidrogênio (processos Tipo I), ou transfere a sua energia para o oxigênio molecular no estado fundamental dando origem ao oxigênio singleto O2 (^■Δg) que ataca os tecidos (processo Tipo II) . 0 principal contribuinte para o processo Tipo I é o íon superóxido (O2‘ ) , formado por transferência de elétron proveniente do sensibilizador excitado eletronicamente. Há evidências a favor do processo de foto-oxigenação Tipo II em relação ao processo Tipo I em células [1,2], mas há relatos de aumento da resposta em PDT quando o íon superóxido também é gerado [3]. Para a detecção, determina-se a fluorescência por meio de exposição à luz de comprimento de onda desejado, necessitando-se de energias mais baixas do que aquelas utilizadas no tratamento. O tratamento eficaz requer geralmente a formação de quantidades elevadas de oxigênio singleto no tecido, que pode ter um efeito sinérgico com a formação simultânea do íon superóxido ou de outras espécies reativas de oxigênio.

As propriedades dos sensibilizadores ideais para aplicação em PDT incluem: (i) síntese simples, eficiente e econômica; (ii) estabilidade, pureza e longa duração na armazenagem; (iii) solubilidade em veículos ou solventes biocompatíveis; (iv) elevado coeficiente de absorção na "janela fototerapêutica" (600-900 nm) ; (v) sensibilização do oxigênio molecular singleto e/ou geração do íon superóxido com elevado rendimento quântico; (vi) toxicidade reduzida ou inexistente na ausência de luz; (vii) acumulação seletiva e retenção prolongada nos tecidos tumorais; (viii) baixa fotossensibilização da pele aquando da administração sistêmica; (ix) fotobranqueamento controlado; (x) fácil metabolismo ou excreção após o tratamento. O sensibilizador é apenas o precursor da espécie citotóxica, que inclui principalmente o oxigênio singleto e outras espécies de oxigênio reativas, tais como o íon superóxido. O precursor imediato do oxigênio singleto e, frequentemente, do íon superóxido, é o estado tripleto do sensibilizador. Assim, para se obter um elevado rendimento quântico de oxigênio singleto, o estado tripleto do sensibilizador tem de apresentar, pelo menos, três propriedades: (i) rendimento quântico próximo da unidade, (ii) energia eletrônica pelo menos 20 kJ/mol superior à do oxigênio singleto (94 kJ/mol) e (iii) longo tempo de vida (centenas de microssegundos). Pode-se aumentar a acumulação e a retenção nos tecidos tumorais utilizando-se vetores específicos, mas a hidrofilicidade/lipofilicidade é uma propriedade intrínseca relevante do sensibilizador para tais fins e a capacidade em adequar tais propriedades para atingir os alvos desejados é uma propriedade muito apreciada.

0 limite inferior da janela fototerapêutica é determinada pela presença de proteínas que contêm o grupo heme, responsável pela maior parte da absorção da luz na gama do espectro visível nos tecidos. A penetração da luz nos tecidos diminui rapidamente abaixo de 550 nm. Entretanto, existe aumento significativo na penetração a 550 a 630 nm, que duplica novamente até 700 nm. A isso, segue-se um aumento de 10% na penetração tecidual à medida que o comprimento de onda se desloca para 800 nm. 0 limite superior da janela fototerapêutica é determinado pela absorção da radiação infravermelha pela água e pelas exigências energéticas para a transferência eficiente de energia para o oxigênio. De fato, a transferência de energia tripleto controlada por difusão a partir do sensibilizador para o oxigênio molecular requer que a energia tripleto do sensibilizador seja de, pelo menos, 115 kJ/mol. Adicionalmente, a desdobramento da energia singleto-tripleto em compostos macrocíclicos tetrapirrólicos é de aprox. 4 0 kJ/mol [4] , o que requer que o sensibilizador possua uma energia singleto superior a 150 kJ/mol. Considerando-se que o deslocamento de Stokes de tais sensibilizadores é geralmente pequeno, eles deveriam absorver luz logo abaixo de 800 nm. Conclui-se que um sensibilizador ideal deva absorver intensamente luz de comprimentos de onda próximos de 750 nm. A forte absorção neste comprimento de onda torna as bacterioclorinas candidatas ideais como sensibilizadores em PDT. Nas aplicações em que a penetração da luz não é tão crítica, as clorinas também são possíveis candidatas à utilização em PDT.

A Photofrin®, um derivado da hematoporfirina [5], é o fotossensibilizador mais utilizado e foi aprovado para o tratamento de diversos tumores sólidos [6] . O derivado da hematoporfirina (HpD) prepara-se misturando a hematoporfirina com ácido acético glacial e ácido sulfúrico, após hidrólise e precipitação sob condições ácidas. Este método foi descrito parcialmente por Lipson et al. [7] . 0 HpD produzido desta maneira consiste de uma mistura complexa de porfirinas. Quando o HpD é separado nas suas duas frações principais por filtração em gel usando Sephadex LH-20, a porção de elevado peso molecular, denominada Photofrm , e um agente mais eficaz em PDT [8] . A dose de Photofrin® recomendada para humanos é de 1-2 mg/kg de peso corporal. Os principais componentes da Photofrin® são dímeros e oligômeros de elevado peso molecular, unidos por ligações do tipo éter, éster e, possivelmente, carbono-carbono [9].

A Photofrm possui algumas características desejáveis, incluindo-se boa eficácia, solubilidade em água, rendimento razoável de oxigênio singleto e facilidade de fabrico. No entanto, a Photofrin® também apresenta desvantagens: (i) ela é constituída por uma mistura complexa de dímeros de porfirina e oligômeros de elevado peso molecular, unidos por ligações tipo éter, éster e/ou carbono-carbono; (ii) apresenta fototoxicidade na pele dos pacientes durante quatro a seis semanas após a administração; (iii) devido à sua absorção relativamente fraca na gama do vermelho (63 0 nm) e à falta de penetração da luz através dos tecidos, a utilização atual da Photofrin® em clínica no âmbito da PDT limita-se à destruição de tecido cancerígeno situado a menos de 4 mm da fonte de luz utilizada em terapia. Há assim necessidade de sensibilizadores mais eficazes, puros do ponto de vista químico, menos fototóxicos, que apresentem melhor localização e que absorvam luz de maneira mais intensa no infravermelho.

Sabe-se que a redução química de um dos anéis tetrapirrólicos, o que corresponde à transformação da porfirina em clorina, causa o deslocamento da banda de absorção de maior comprimento de onda para o vermelho, concomitantemente com o aumento do seu coeficiente de absorção. Tais propriedades foram exploradas na segunda geração de fotossensibilizadores para a PDT e a 5,10,15,20- tetrakis(3-hidroxifenil)clorina (m-THPC), comercializada como Foscan®, mostrou ser um dos mais potentes desta segunda geração de fotossensibilizadores [10] . A redução posterior do anel pirrólico oposto, o que corresponde à transformação da clorina em bacterioclorina, causa deslocamento da banda de absorção para o infravermelho e aumento adicional do seu coeficiente de absorção. No entanto, até recentemente, acreditava-se que as bacterioclorinas fossem compostos muito instáveis [10] e os esforços de investigação em sensibilizadores para PDT concentraram-se nas clorinas [11] . Posteriormente, demonstrou-se que bacterioclorinas estáveis podem realmente ser sintetizadas [12] . Este fato não foi totalmente valorizado na literatura científica, que afirmou ainda ser a síntese de bacterioclorinas estáveis por este método limitada à preparação de bacterioclorinas com funcionalidades inertes [13] . Entretanto, descreveu-se a síntese de bacterioclorinas com outras funcionalidades (ver PCT7EP2005/012212, WO/2006/053707).

0 interesse óbvio na utilização das bacterioclorinas como sensibilizadores em PDT e os relatos de que algumas bacterioclorinas de ocorrência natural eram fotossensibilizadores eficazes tanto in vitro como in vivo [14,15] motivaram várias tentativas para sintetizar as bacterioclorinas. As bacterioclorinas sintéticas foram preparadas por derivação das porfirinas correspondentes via di-hidroxilação vicinal com tetróxido de ósmio [16], ciclização intramolecular [17], reações de Diels-Alder usando porfirinas como dienófilos [18] ou reações de Diels- Alder com vinilporfirinas nas quais a porfirina é o dieno [19], via cicloadições 1,3-dipolar [20] e também por autocondensação de derivados desidrodipirrino-acetal [21] . Adicionalmente, existe um método clássico desenvolvido há muitas décadas por Whitlock para a preparação de bacterioclorinas por redução das posições pirrólicas 7,8- 17,18 da porfirina usando diimida [22]. Este foi o método utilizado por Bonnet para sintetizar o Foscan® e a 5,10,15,20-tetrakis(3-hidrofenil)bacterioclorina [23] . Entretanto, as investigações intensivas visando a síntese de derivados da bacterioclorina levaram a muitas patentes fundamentadas nos métodos supracitados (ver, por exemplo, US2007/7,166,719; US2003/6,624,187; US2003/6,569,846; US2002/6,376,483; US1999/5,864,035; US1998/5,831,088; WO90/12573; W094/00118; W095/32206; WO96/13504; WO97/32885; US2006/194,960).

Algumas das novas bacterioclorinas sintetizadas possuem toxicidade insignificante na ausência de luz e elevada seletividade pelo tumor, são parcialmente hidrossolúveis e possuem bandas de absorção acentuadas na 5 gama de 700 nm a 800 nm. Porém, permanecem algumas desvantagens, nomeadamente: (i) síntese complicada e dispendiosa que envolve etapas de purificação trabalhosas; (ii) hidrossolubilidade limitada que, no caso de aplicação sistêmica, exige a dissolução em solventes orgânicos, o que ZZLO representa um fardo químico adicional para o organismo, ou requer a ligação a um veículo, aumentando as despesas do tratamento; (iii) instabilidade química, especialmente na presença de luz; (iv) rendimentos quânticos de oxigênio singleto baixos ou desconhecidos. Um representante 15 interessante dessa terceira geração de fotossensibilizadores é um complexo paládio- bacteriofeoforbídeo, denominado atualmente de Tookad® e aprovado para estudos clínicos de fase III. O Tookad® é derivado da bacterioclorofila e, como a maioria das 20 bacterioclorinas de ocorrência natural, é muito sensível ao oxigênio, que causa a sua rápida oxidação em clorina, que possui um pico de absorção máximo em 660 nm ou abaixo deste valor. Para além disso, se for usado um laser para excitar a bacterioclorina in vivo, a oxidação poderá formar um novo 25 cromóforo que absorve fora da janela do laser, reduzindo a eficiência fotossensibilizadora. A degradação fotoquímica dessa família de compostos foi medida com iluminação a 778 nm (13 mW) em TX-100/PBS, revelando-se que 90% do composto se perde de modo irreversível em 5 min (4 J) , com 30 aparecimento simultâneo da banda de clorina a 660 nm [3].

A PDT também foi testada extensamente no tratamento de doenças cutâneas, nomeadamente ceratoses actínicas, carcinoma de células escamosas, doença de Bowen (carcinoma de células escamosas intra-epiteliais) e carcinoma de 5 células basais, mas existem poucas informações acerca do efeito sobre melanomas malignos [24]. A alta pigmentação de tecidos com melanoma limita a eficácia da PDT quando se utiliza a luz visível, porque a melanina atenua a penetração da luz de comprimentos de onda inferiores a 700 Z2L0 nm nos tecidos. Existem também relatos da utilização tópica da PDT em doenças não-tumorais, tais como a psoríase. Estudos mais antigos empregaram o derivado da hematoporf irina [25] e o sal tetrassódico do meso- tetrafenilporfino sulfonato [26] em formulações líquidas 15 com intensificadores de penetração através da pele. No entanto, geralmente quando se aplicam topicamente HpD ou outras porfirinas numa formulação (líquida, em gel, creme, emulsão, etc.) com um veículo destinado a aumentar a sua difusão através do tecido, as porfirinas tendem a ficar 20 retidas à medida que o intensificador de permeabilidade se dilui nos fluidos normais do tecido. Nestes casos, as porfirinas não se podem mais difundir através do tecido (ou até permanecem em solução). Como consequência, a aplicação tópica das porfirinas está associada frequentemente à perda 25 da especificidade por tecidos malignos, e os tecidos normais nas proximidades do sítio de aplicação podem desenvolver fotossensibilização permanente como resultado da concentração localizada da porfirina.

Para superar esses problemas, sugeriu-se que, em vez 30 de aplicar topicamente uma porfirina, seria vantajoso utilizar um agente que não fosse ele próprio um fotossensibilizador, mas que induzisse a síntese de porfirinas endógenas in vivo, nomeadamente da protoporfirina-IX (PplX) [27]. Sabe-se que o ácido 5-amino- 4-oxopentanóico, também conhecido como ácido 5- aminolevulínico (ou ALA), é um precursor biológico da protoporfirina-IX. Um excesso do ALA causa a acumulação biológica da PplX, que é o verdadeiro agente fotossensibilizante. Assim, aplicando-se topicamente o ALA em tumores cutâneos e, após algumas horas, expondo-se estes tumores à luz, pode obter-se um efeito fototerapêutico benéfico (ver, por exemplo, WO91/01727). Considerando-se que o ALA penetra mais facilmente nos basilomas e nos carcinomas de células escamosas do que na pele saudável, e uma vez que a biossíntese da PplX é mais eficiente nos tumores cutâneos, descobriu-se que a aplicação tópica do ALA aumenta a produção seletiva da PplX em tumores. Este fato constitui a base de diversas formulações dermatológicas do ALA, ou de alguns dos seus derivados, que foram aprovadas e estão a ser utilizadas em clínica, especialmente o Levulan® e o Metvix®.

No entanto, embora a utilização do ALA represente um avanço significativo das técnicas modernas, a terapia fotodinâmica com o ALA não é totalmente satisfatória. Os pacientes costumam relatar sentirem dores na PDT com o ALA [28] . 0 ALA é um profármaco e a eficiência na produção do princípio ativo varia de acordo com a biossíntese no paciente. Apenas uma quantidade muito pequena de PplX pode ser biossintetizada pelas células. Ele costuma ser instável nas formulações farmacêuticas. Ele não é capaz de penetrar em todos os tumores e outros tecidos com eficácia suficiente, o que impede o tratamento de uma série de tumores ou outras doenças. O seu melhor comprimento de onda fotoativador é de aprox. 635 nm, tendo sido demonstrado que somente 1 a 10% da luz vermelha (600-700 nm) incidente pode atravessar uma camada de tecido humano de 1 cm de espessura. Portanto, existe ainda uma necessidade de agentes terapêuticos fotodinâmicos para aplicações tópicas.

I.B. Resumo da invenção

Num primeiro aspecto, a presente invenção indica um processo de preparação de um derivado da clorina ou de bacterioclorina que possui a seguinte fórmula:

Fórmula (I) na qual: representa uma ligação carbono-carbono simples ou dupla; X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8 são, cada um, halogênios (F, Cl, Br) e átomos de hidrogênio selecionados independentemente, contanto que simultaneamente X2, X4, X6 e X8 ou que simultaneamente X1, X3, X5 e X7 sejam halogênios, ou que todos os X sejam halogênios; Ri, R2, R3, R4, Rs, Re, R7, Rs são selecionados independentemente entre H, -OH e -SO2R, em Ç[ue cada R é selecionado independentemente entre -Cl, -OH, -aminoácido, 5 -0Rn, -NHRn e -NR2n , nos quais Rn é um alquilo com 1 a 12 átomos de carbono; Y é um flúor ou hidrogênio; incluindo o seguinte passo: (i) A redução no estado sólido da porfirina ZZLO substituída correspondente em derivado clorina ou de bacterioclorina usando hidrazidas, na ausência de solventes e, opcionalmente, na ausência de bases; na qual a porfirina substituída correspondente tem a fórmula:

Fórmula (II) .

Portanto, o composto de fórmula (I) pode ser um derivado de clorina com a seguinte fórmula:

Fórmula (V).

De maneira alternativa, o composto de fórmula (I) pode ser um derivado de bacterioclorina com a seguinte fórmula:

Fórmula (VI).

Conforme apropriado, X2, X4, X6, X8 são, cada um, selecionados independentemente dos halogênios (F, Cl, Br).

Conforme apropriado, Rs» Re, R?, Re são H.

Conforme apropriado, Y é H.

Conforme apropriado, Ri, R2, R3, R4 são -SO2R, em que cada R é selecionado independentemente entre -Cl, -OH, - aminoácido, -ORn, -NHRn e -NR2n , em que Rn é um radical alquilo com 1 a 12 átomos de carbono.

Num outro aspecto, X2, X4, X6, X8são, cada um, selecionados independentemente dos halogênios (F, Cl, Br); R5, Re, R7/ Ra são H; Y é H; e Ri, R2, R3, R4/ são -SO2R, em que cada R é selecionado independentemente entre -Cl, -OH, -aminoácido, -ORn, -NHRn e -NR2n , nos quais Rn é um radical alquilo com 1 a 12 átomos de carbono.

Num outro aspecto, a presente invenção indica um processo de preparação de um derivado de clorina ou de bacterioclorina com a seguinte fórmula:

na qual: representa uma ligação carbono-carbono simples ou dupla; X2 são selecionados a partir de halogênios (F, Cl, Br) , X1 são selecionados entre hidrogênio ou halogênios (F, Cl, Br); e R' são -SO2R, em que cada R é selecionado independentemente entre -Cl, -OH, -aminoácido, -ORn, -NHRn e -NR2n , nos quais Rn é um radical alquilo com 1 a 12 átomos de carbono, incluindo o seguinte passo: (i) A redução no estado sólido da porfirina substituída correspondente em derivado de clorina ou de bacterioclorina usando hidrazidas na ausência de solventes e, opcionalmente, na ausência de bases; em que a porfirina substituída correspondente tem a fórmula:

Fórmula (IV).

Portanto, o composto de fórmula (III) pode ser um derivado de clorina com a fórmula:

Fórmula (VII).

Como alternativa, o composto de fórmula (III) pode ser um derivado de bacterioclorina com a fórmula:

Fórmula (VIII).

Num outro aspecto, R' é -SO2R, em que R é -Cl para a porfirina substituída correspondente de fórmula (IV); e o processo inclui ainda o passo para: (ii) ligação do derivado de clorina ou de bacterioclorina com uma amina H-NHRn ou H-NR2n; um aminoácido ou um álcool H-ORn, nos quais Rn é um radical alquilo com 1 a 12 átomos de carbono; para originar um derivado de clorina ou de bacterioclorina no qual R' é -SO2R, em que R é um - aminoácido, -0Rn, -NHRn ou -NR2n, nos quais Rn é um radical alquilo com 1 a 12 átomos de carbono.

Num outro aspecto, a presente invenção indica uma composição farmacêutica contendo: (a) um derivado de clorina ou de bacterioclorina com a fórmula:

Fórmula (III) ou uma composição dela derivada aceitável do ponto de vista farmacêutico, na qual: representa uma ligação carbono-carbono simples ou dupla; X2 são selecionados a partir de halogênios (F, Cl, Br) , X1 são selecionados entre hidrogênio ou halogênios (F, Cl, Br), e R' são -SO2R; R são, cada um, selecionados independentemente como - Cl, -OH, -aminoácido, -ORn, -NHRn e -NR2n , nos quais Rn é um radical alquilo com 1 a 12 átomos de carbono, na qual o derivado de clorina ou de bacterioclorina é eficaz no tratamento por terapia fotodinâmica para melhorar os sintomas de um distúrbio hiperproliferativo; e (b) um intensificador de penetração de superfície.

Para além disso, a presente invenção indica a utilização de um derivado de clorina ou de bacterioclorina, ou de uma composição dela derivada aceitável do ponto de vista farmacêutico, na detecção de tecido hiperproliferativo; na qual o derivado de clorina ou de bacterioclorina tem a fórmula:

Fórmula (III) Na qual: representa uma ligação carbono-carbono simples ou dupla; X2 são selecionados a partir de halogênios (F, Cl, Br) , X1 são selecionados entre hidrogênio ou halogênios (F, Cl, Br), e R' são -SO2R; R são, cada um, selecionados independentemente como - Cl, -OH, -aminoácido, -0Rn, -NHRn e -NR2n , nos quais Rn são radicais alquilo com 1 a 12 átomos de carbono,

Para além disso, a presente invenção indica um método para a detecção da presença de um tecido hiperproliferativo num paciente e inclui: (i) a administração ao paciente de uma quantidade suficiente para diagnóstico de um derivado de clorina ou de bacterioclorina e com a seguinte fórmula:

Na qual: representa uma ligação carbono-carbono simples ou dupla; X2 são selecionados a partir de halogênios (F, Cl, Br) , X1 são selecionados entre hidrogênio ou halogênios (F, Cl, Br), e R'são -SO2R; R são, cada um, selecionados independentemente como - Cl, -OH, -aminoácido, -0Rn, -NHRn e -NR2n , nos quais Rn são radicais alquilo com 1 a 12 átomos de carbono, ou uma composição dela derivada aceitável do ponto de vista farmacêutico que se associe preferencialmente com o alvo, (ii) a espera do tempo suficiente para o derivado de clorina ou de bacterioclorina se ligar ao alvo e para ZZLO qualquer derivado de clorina ou de bacterioclorina que não se ligue preferencialmente ao tecido alvo ser eliminado do tecido não almejado, e (iii) a visualização do composto no paciente.

A visualização pode realizar-se gerando uma imagem por 15 ressonância magnética (MRI) de, pelo menos, parte do corpo do paciente.

De maneira alternativa, a visualização pode executar- se expondo o composto à luz de energia suficiente para causar a sua fluorescência.

Para além disso, a presente invenção indica uma composição aceitável do ponto de vista farmacêutico para utilização no tratamento de um cancro de pele ou de distúrbios cutâneos, entre eles, as ceratoses actínicas, o carcinoma de células escamosas, a doença de Bowen, o carcinoma de células basais, a psoríase e as acnes vulgaris e rosacea; na qual a composição inclui: (i) um derivado de clorina ou de bacterioclorina com a fórmula:

Fórmula (III) Na qual: representa uma ligação carbono-carbono simples ou dupla; X2 são selecionados a partir de halogênios (F, Cl, Br) , X1 são selecionados entre hidrogênio ou halogênios (F, Cl, Br), e R' são -SO2R; R são, cada um, selecionados independentemente como - Cl, -OH, -aminoácido, -ORn, -NHRn e -NR2n , nos quais Rn são radicais alquilo com 1 a 12 átomos de carbono; e (ii) um veículo aceitável do ponto de vista farmacêutico para transporte transdérmico ou intradérmico de tal composto, no qual o veículo inclui um intensificador de penetração de superfície que permeabiliza temporariamente a pele e facilita a penetração do composto através das diversas camadas da pele; no qual (a) administra-se a composição a um paciente; (b) espera-se o tempo suficiente para o derivado de clorina ou de bacterioclorina se acumular preferencialmente nas proximidades do alvo do tratamento dermatológico; e (c) irradia-se o alvo para obter a resposta desejada sobre o cancro de pele ou o distúrbio cutâneo.

Processo de preparação dos derivados

Pertinentemente, a hidrazina é a p-tolueno sulfonil hidrazida, a 4-clorobenzeno sulfônico hidrazida, a 4,4'-oxi bis(benzeno sulfonil) hidrazida, a benzeno sulfonil hidrazida, a 4-metoxibenzeno sulfonil hidrazida ou a hidrazida benzóica.

As reações no estado sólido requerem a utilização de temperaturas acima do ponto de fusão de um dos reagentes, de maneira que o(s) outro(s) reagente(s) se encontre (m) parcialmente dissolvido(s) ou disperso(s) no reagente fundido. No caso de reações no estado sólido entre hidrazidas e derivados de porfirina, a reação no estado sólido pertinentemente efetuada acima do ponto de fusão da hidrazida.

Pertinentemente, o passo de redução executa-se à temperatura de, pelo menos, 70 °C. Pertinentemente, o passo de redução executa-se à temperatura de, pelo menos, 100 °C. Num outro aspecto, o passo de redução realiza-se a temperaturas entre 70 e 200 °C. Pertinentemente, o passo de redução realiza-se durante, pelo menos, 5 minutos.

Pertinentemente, o passo de redução executa-se sob vácuo ou atmosfera inerte.

Composições farmacêuticas

Pertinentemente, a composição farmacêutica contém, pelo menos, 0,01% em peso do derivado de clorina ou de bacterioclorina, ou de um sal dele derivado aceitável do ponto de vista farmacêutico, com base no peso total da composição. Pertinentemente, a composição farmacêutica contém entre 0,01% e 30% em peso do derivado de clorina ou de bacterioclorina, ou de um sal dele derivado aceitável do ponto de vista farmacêutico, com base no peso total da composição. Pertinentemente, a composição farmacêutica apropriada contém entre 0,01% e 10% em peso do derivado de clorina ou de bacterioclorina, ou de um sal dele derivado aceitável do ponto de vista farmacêutico, com base no peso total da composição. Pertinentemente, a composição farmacêutica apropriada contém entre 0,1% e 1% em peso do derivado de clorina ou de bacterioclorina, ou de um sal dele derivado aceitável do ponto de vista farmacêutico, com base no peso total da composição.

Quando um intensificador de penetração de superfície se encontra presente numa composição farmacêutica, pertinentemente a composição contém entre 0,05 e 10% em peso do intensificador de penetração de superfície, com base no peso total da composição. Pertinentemente, a composição contém entre 0,1 e 10% em peso do intensificador de penetração de superfície. Pertinentemente, este intensificador de penetração de superfície pode selecionar- se de entre o dimetilsulfóxido e outros dialquilsulfóxidos, N-metilformamida, dimetilformamida, dimetilacetamida, glicóis, vários derivados da pirrolidona e várias azacicloalcan-2-onas substituídas na posição 1.

Pertinentemente, os glicóis podem ser selecionados de entre o polietilenoglicol, o polietilenoglicol 425, o trimetilenoglicol e o propilenoglicol monolaureato.

Pertinentemente, os derivados da pirrolidona podem ser selecionados de entre a N-dodecil pirrolidina-3,5-diona, N- dodecil pirrolidina-2-tiona, N-dodecil-2-pirrolidona, N-(2- hidroxietil)-2-pirrolidona, N-ciclohexil-2-pirrolidona, 1- butil-3-dodecil-2-pirrolidona, 1,5-dimetil-2-pirrolidona, l-etil-2-pirrolidona, l-hexil-4-metiloxicarbonil-2- pirrolidona, l-hexil-2-pirrolidona, 1-(2-hidroxietil) pirrolidinona, 3-hidroxi-N-metil-2-pirrolidinona, 1-lauril- 4-metiloxicarbonil-2-pirrolidona e N-metil-2-pirrolidona.

Pertinentemente, as azacicloalcan-2-onas substituídas na posição 1, inclusive a l-dodecilazacicloheptan-2-ona, denominada a seguir como Azone®, são apresentadas nas patentes norte-americanas US. Pat. n.° 4.562.075, 4.405.616, 4.326.893 e 3.989.816.

Detecção de tecido hiperproliferativo

Quando os derivados de clorina e de bacterioclorina, ou os seus sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, são utilizados para a detecção de tecidos hiperproliferativos, o tecido hiperproliferativo pode ser um tecido endotelial vascular, tecido neovascularizado, tecido neovascularizado localizado no olho, parede vascular anormal de um tumor, tumor sólido, tumor da cabeça, tumor do pescoço, tumor num olho, tumor do trato gastrointestinal, tumor de fígado, tumor da mama, tumor da próstata, tumor do pulmão, tumor não sólido, células malignas de um tecido hematopoiético e tecido linfático, lesões no sistema vascular, uma doença da medula óssea, e células doentes nas quais a doença seja de origem auto- imune ou inflamatória.

Tratamento de doenças hiperproliferativas

Num outro aspecto, a presente invenção indica a utilização de um derivado de clorina ou de bacterioclorina, ou de um sal dele derivado aceitável do ponto de vista farmacêutico, conforme com o descrito, no fabrico de um medicamento para utilização no tratamento de doenças hiperproliferativas.

Quando os derivados de clorina ou de bacterioclorina, ou sais dele derivados aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, são utilizados no tratamento de doenças hiperproliferativas, pertinentemente as doenças hiperproliferativas podem ser cancros ou carcinomas, mielomas, psoríase e degeneração macular. Os exemplos pertinentes incluem cancro gástrico, cancro entérico, cancro pulmonar, cancro da mama, cancro uterino, cancro do esôfago, cancro dos ovários, cancro pancreático, cancro da faringe, sarcomas, cancro hepático, cancro da bexiga urinária, cancro do maxilar superior, cancro do dueto biliar, cancro da cabeça e do pescoço, cancro da língua, tumor cerebral, cancro da pele, tumor maligno da tiróide, cancro da próstata, cancro coloretal, cancro da glândula parótida, doença de Hodgkin, mieloma múltiplo, cancro renal, leucemia e linfocitoma maligno.

Tais tratamentos incluem pertinentemente a irradiação do derivado de clorina ou de bacterioclorina, ou do seu derivado de composição aceitável do ponto de vista farmacêutico, com luz de comprimento de onda correspondente às bandas de absorção do derivado de clorina ou de bacterioclorina. O comprimento de onda apropriado da luz é de 600 a 800 nm. Pertinentemente, quando são usadas clorinas, a luz deve ter um comprimento de onda entre 630 e 690 nm. Pertinentemente, quando são usadas bacterioclorinas, a luz deve ter um comprimento de onda entre 720 e 780 nm.

Pertinentemente, a dose de luz apropriada é de 1 a 250 J/cm2. Nalguns casos, a dose de luz pertinente é menor que 50 J/cm2, menor que 20 J/cm2 ou menor que 10 J/cm2.

Pertinentemente, a dose apropriada do derivado de 5 clorina ou de bacterioclorina, ou dos seus sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, é de 0,01 mg a 200 mg por quilograma de peso corporal por dia. Pertinentemente, a dose apropriada é de 0,01 mg a 100 mg por quilograma de peso corporal por dia.

A presente invenção foi executada com o conhecimento do estado da arte acima descrito. A síntese descrita na patente WO 2006/053707 (PCT/EP2005/012212) inclui apenas três passos semiquantitativos: (i) funcionalização de tetrakis-fenilporfirinas halogenadas via clorossulfonação 15 do anel fenílico; (ii) síntese de compostos anfifílicos via reação do grupo clorossulfônico com agentes nucleófilos, água, nomeadamente aminas e alcoóis; iii) redução do composto macrocíclico tetrapirrólico com derivados de hidrazida na presença de bases não-nucleófilas inorgânicas 20 ou orgânicas. Porém, conforme indicado na Figura 2 da patente WO 2006/053707, na síntese de bacterioclorinas sulfonadas e halogenadas por este método observa-se contaminação pela clorina análoga, e a purificação requer uma separação trabalhosa. O objetivo da presente invenção é 25 descrever uma síntese econômica, amiga do ambiente e em grande escala de tetrakis-fenilclorinas e tetrakis- fenilbacterioclorinas puras, estáveis e funcionalizadas com grupos sacadores de elétrons nas posições orto dos anéis fenílicos. A presente invenção também tem como objetivo 30 apresentar as propriedades químicas e terapêuticas das referidas clorinas e bacterioclorinas, os métodos terapêuticos e composições farmacêuticas com tais moléculas, bem com a evidência da sua eficácia em PDT.

As bacterioclorinas têm características distintas que as tornam os fotossensibilizadores preferidos em PDT: 1) Os átomos de halogênio presentes nas posições orto dos grupos fenil exercem três funções. Primeiro, eles produzem um "efeito de átomo pesado" controlado, que aumenta o rendimento do estado tripleto do sensibilizador, sem afetar o tempo de vida do tripleto e a sua capacidade de transferir eficientemente a energia eletrônica para o oxigênio molecular [29]. Segundo, eles estabilizam o estado reduzido dos compostos macrocíclicos tetrapirrólicos, tanto por efeitos eletrônicos como estéreos. Terceiro, eles aumentam a constante de velocidade de transferência de energia para o oxigênio molecular através de interações de transferência de carga, o que conduz a rendimentos elevados de oxigênio singleto, íons superóxido e outras espécies reativas de oxigênio. 2) O grupo sulfonila presente nas posições meta dos grupos fenil exerce duas funções. Primeiro, ele permite alterar da maneira desejada a hidrofilicidade/lipofilicidade dos sensibilizadores, pois os sensibilizadores muito hidrofóbicos parecem ser menos fototóxicos, provavelmente devido à baixa solubilidade e à dificuldade em deixarem a membrana plasmática e se localizarem noutros compartimentos intracelulares, enquanto que corantes muito hidrofílicos podem localizar-se predominantemente no estroma tumoral e apresentar eficácia reduzida em PDT [30]. Segundo, o grupo sulfonila, nomeadamente ligado a substituintes volumosos ou longos, promove proteção estérea adicional contra a oxidação do anel bacterioclorina dos corantes. 3) A presença simultânea de átomos de halogênio nas posições orto e do grupo sulfonila nas posições meta dos grupos fenil exerce uma função adicional. Modelagem molecular e dados experimentais indicam que, quando existe rotação restrita da ligação simples na posição meso nas 5,10,15,20-tetrafenilporfirinas com anéis fenílicos assimétricos, se observam isômeros geométricos (conhecidos como atropisômeros) devido à posição diferente dos substituintes em orto e/ou meta em relação ao plano da porfirina [31]. Os atropisômeros têm polaridades significativamente diferentes e coeficientes de absorção da banda de absorção no maior comprimento de onda que podem divergir em quase uma ordem de grandeza. Particularmente, o isômero α4, com os quatro substituintes sulfamoil no mesmo lado do plano da porfirina, possui o maior coeficiente de absorção e é o atropisômero mais anfifílico.

O emprego generalizado de clorinas e bacterioclorinas sulfonadas em PDT requer uma síntese econômica e amiga do ambiente que possa ser realizada em escala industrial. Um dos principais objetivos da presente invenção é descrever um novo método de preparação de tais compostos, baseado unicamente na porfirina precursora e numa hidrazida, em que esta se adiciona no estado sólido e se aquece acima da temperatura de fusão num reator vedado e na ausência de oxigênio e de base, obtendo-se o produto desejado após um tempo determinado.

A presente invenção também tem apresentar métodos de PDT por meio da administração tópica duma determinada clorina ou bacterioclorina sulfonada, num veículo apropriado. Os veículos para administração tópica de fotossensibilizadores podem ser de várias formas, nomeadamente soluções líquidas, geles, cremes, emulsões, unguentos, etc. Tipicamente, a formulação de tais veículos inclui pelo menos um intensificador de penetração de superfície. Contrariamente às convenções neste campo do conhecimento, que afirmam que as drogas de pesos moleculares acima de 500 Dalton não atravessam bem a pele [32] , indicamos formulações para o transporte intradérmico eficiente das citadas clorinas ou bacterioclorinas sulfonadas para doenças cutâneas, nas quais as referidas moléculas possuem pesos moleculares acima de 1 kD.

Esta invenção refere-se a compostos para tratamento e detecção de tecidos hiperproliferativos, tais como tumores, por meio de métodos fotodinâmicos. Os compostos da presente invenção também são úteis no tratamento de distúrbios dermatológicos, tais como psoríase e acnes vulgaris e rosacea; distúrbios ginecológicos, como o sangramento uterino disfuncional; distúrbios urológicos, como o vírus do condiloma; distúrbios cardiovasculares, como a restenose e as placas ateroscleróticas; destruição fotodinâmica de bactérias ou vírus; remoção de pêlos e cosméticos; inibição da resposta imunológica após o transplante de órgãos ou tecidos.

Finalmente, a presente invenção também tem como objetivo estabelecer métodos para o diagnóstico de tecidos hiperproliferativos utilizando clorinas ou bacterioclorinas sulfonadas e halogenadas. Contanto que estes compostos se acumulem em tais tecidos, a propriedade adicional requerida para fins diagnósticos consiste na detecção inequívoca de quantidades muito pequenas destes compostos. Estes compostos têm bandas de absorção muito distintas nas gamas do vermelho e do infravermelho, para as quais os tecidos são mais transparentes. A excitação seletiva destes compostos causa fluorescência característica em comprimentos de onda nos quais as moléculas biológicas não emitem. A detecção da fluorescência pode fazer-se com equipamentos de alta sensibilidade, e quantidades subnanomolares de clorinas ou bacterioclorinas sulfonadas e halogenadas podem ser medidas em meios biológicos. A fonte de irradiação para fotodiagnóstico e fototerapia não é restrita, mas um feixe de laser é preferido pelo facto de se poder aplicar seletivamente intensos raios de luz na gama de comprimentos de onda desejada. É necessário que os raios de luz tenham intensidade suficiente para que os compostos emitam fluorescência apropriada ao diagnóstico e, para terapia, que causem a morte celular. Adicionalmente, aquando da utilização de clorinas ou bacterioclorinas sulfonadas e fluoradas, pode detectar-se a acumulação destes compostos em pequenas zonas do corpo e acompanhar os respectivos metabólitos formados durante a sua eliminação pelo corpo por meio de ressonância magnética (MRI) do flúor.

II. DESCRIÇÃO PORMENORIZADA II. A. Definições

No âmbito desta patente, "distúrbios hiperproliferativos" dizem respeito a distúrbios cuja patologia comum envolve a proliferação celular excessiva causada pelo crescimento celular desregulado ou anormal e inclui a angiogénese descontrolada. Os exemplos de distúrbios hiperproliferativos incluem, mas não se limitam a, cancros e carcinomas, mielomas, psoríase e degeneração macular.

No âmbito desta patente, "tecido hiperproliferativo" diz respeito ao tecido que cresce de maneira descontrolada, e inclui tumores e crescimento descontrolado de vasos, tais como o crescimento de vasos sanguíneos observado em degeneração macular relacionada à idade.

No âmbito desta patente, "tumor" denota um neoplasma e inclui tanto os tumores benignos como malignos. Este termo inclui especialmente os tumores malignos que podem ser sólidos ou não-sólidos (como a leucemia). Exemplos de tumores são o cancro gástrico, o cancro entérico, o cancro pulmonar, o cancro da mama, o cancro uterino, o cancro do esófago, o cancro dos ovários, o cancro pancreático, o cancro da faringe, os sarcomas, o cancro hepático, o cancro da bexiga urinária, o cancro do maxilar superior, o cancro do dueto biliar, o cancro da cabeça e do pescoço, o cancro da língua, o tumor cerebral, o cancro da pele, o tumor maligno da tiróide, o cancro da próstata, o cancro coloretal, o cancro da glândula parótida, a doença de Hodgkin, o mieloma múltiplo, o cancro renal, a leucemia e o linfocitoma maligno.

No âmbito desta patente, "agente infeccioso" refere-se a micróbios ou parasitas invasores. No contexto aqui usado, "micróbio" refere-se a vírus, bactérias, rickettsias, micoplasmas, protozoários, fungos e microrganismos semelhantes, e "parasita" refere-se a invertebrados multicelulares geralmente microscópicos ou muito pequenos, ou aos seus ovos ou às suas formas jovens, que são susceptíveis à eliminação pela indução de anticorpos ou destruição por lise ou fagocitose.

No âmbito desta patente, um "agente farmacêutico" ou "fármaco" refere-se a um composto ou composição química capaz de induzir um efeito terapêutico ou profilático desejado quando administrado da maneira apropriada a um paciente. O conceito inclui, mas não se limita a, fotossensibilizadores que absorvem a luz e a utilizam para atuarem como um fármaco ou para ativar outros compostos químicos que, posteriormente, funcionem como fármacos.

No âmbito desta patente, "composição derivada aceitável do ponto de vista farmacêutico" refere-se a composições nas quais os fotossensibilizadores estão ligados a grupos biologicamente ativos, ou seja, a qualquer grupo que promova seletivamente a ligação, a acumulação ou a eliminação num determinado ambiente biológico. Exemplos clássicos incluem os substituintes derivados de açúcares, derivados de aminoácidos, oligonucleotídeos ou ligantes específicos para receptores (hormonas esteróides, fatores de crescimento, neurotransmissores e anticorpos). Inclui-se também os sais dos fotossensibilizadores.

No âmbito desta patente, "veículo aceitável do ponto de vista farmacêutico" inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, excipientes para formulação de comprimidos, pílulas, cápsulas, cremes, soluções, suspensões ou emulsões. As técnicas envolvidas na formulação dessas composições farmacêuticas são bem conhecidas.

No âmbito desta patente, "intensificador de penetração de superfície"refere-se a um composto ou a uma composição química capaz de aumentar ou acelerar o transporte da fármaco através duma barreira, tal como a pele e outros tecidos, e inclui o dimetilsulfóxido e outros dialquilsulfóxidos, a dimetilformamida, a dimetilacetamida, os glicóis, vários derivados da pirrolidona, o Azone®, ou quaisquer dos outros agentes que facilitam a penetração na pele descritos na literatura, ou as suas misturas.

No âmbito desta patente, "irradiação" significa expor um paciente a todas as frequências do espectro eletromagnético. De preferência, seleciona-se o comprimento de onda para irradiação igual ao(s) comprimento(s) de onda no qual a fármaco absorve a luz.

No âmbito desta patente, "Luzitina"refere-se a qualquer tetrakis-fenilclorina ou tetrakis- fenilbacterioclorina sulfonada que possua grupos sacadores de elétrons nas posições orto dos grupos fenil, e os seguintes acrónimos referem-se a compostos químicos específicos que servem apenas para exemplificar, sem limitar, esta extensa gama de moléculas:

Luzitina-Cl-c é a 5,10,15,20-tetrakis(2-cloro-5- sulfonilfenil)clorina, - Luzitina-FMet-c é a 5,10,15,20-tetrakis(2-fluoro-5- N-metilsulfamoilfenil)clorina, Luzitina-F é a 5,10,15,20-tetrakis(2-fluoro-5- sulfonilfenil)bacterioclorina, Luzitina-Cl é a 5,10,15,20-tetrakis(2-cloro-5- sulfonilfenil)bacterioclorina, - Luzitina-Cl2 é a 5,10,15,20-tetrakis(2,6-dicloro-3- sulfonilfenil)bacterioclorina, - Luzitina-FMet é a 5,10,15,20-tetrakis(2-fluoro-5-N- metilsulfamoilfenil)bacterioclorina, - Luzitina-F2Met é a 5,10,15,20-tetrakis(2,6-fluoro-3- N-metilsulfamoilfenil)bacterioclorina, - Luzitina-Cl2Et é a 5,10,15,20-tetrakis(2,6-dicloro- 3-N-etilsulfamoilfenil)bacterioclorina, - Luzitina-Cl2Hep é a 5,10,15,20-tetrakis(2,6-dicloro- 3-N-heptilsulfamoilfenil)bacterioclorina, - Luzitina-FMet2 é a 5,10,15,20-tetrakis(2-fluoro-5- N,N-dimetisulfamoilfenil)bacterioclorina, Usam-se aqui também os seguintes acrónimos: - Cl2PhB, que se refere à 5,10,15,20-tetrakis(2,6- diclorofenil)bacterioclorina - BMPO, que se refere ao 5-terc-butoxicarbonil-5- metil-l-pirrolino-N-óxido - DMPO, que se refere ao 5-dimetil-l-pirrolino-N-óxido - DMSO, que se refere ao dimetilsulfóxido

II. B. Compostos precursores

Sintetizaram-se as 5,10,15,20-tetrakis(halogéneo- fenil)porfirinas e as 5,10,15,20-tetrakis(2- cianofenil)porfirinas, as 5,10,15,20-tetrakis(2- trifluorometilfenil)porfirinas, as 5,10,15,20-tetrakis(2- nitrofenil)porfirinas e as 5,10,15,20-tetrakis(2- carboximetilfenil)porfirinas pelo método do nitrobenzene [33] , misturando-se o pirrol com os fenilaldeídos halogenados desejados numa mistura de ácido acético/nitrobenzeno a 120 °C. Após arrefecimento, a porfirina na sua forma pura cristaliza-se diretamente a partir do meio de reação. Todos os dados de caracterização (obtidos por RMN, FAB e micro-análise) concordam plenamente com as porfirinas descritas anteriormente.

A clorossulfonação das porfirinas citadas executou-se segundo um método anteriormente desenvolvido [34,35]. A porfirina necessária (200 mg) e o ácido clorossulfônico (10 mL, 150 mmol) foram agitados a temperaturas entre 50 e 250 °C durante 1 a 3 h. Após este período, adicionou-se diclorometano (200 mL) à solução. Executou-se a extração contínua com água, sob agitação, até à neutralização. De seguida, lavou-se a solução de diclorometano com bicarbonato de sódio e secou-se com Na2SO4 anidro. Após purificação por cromatografia de coluna em sílica gel usando diclorometano como eluente e subsequente evaporação do solvente, obtiveram-se as porfirinas clorossulfonadas desejadas na forma de cristais de cor púrpura.

A hidrólise das porfirinas clorossulfonadas supracitadas foi feita suspendendo-se 100 mg do composto desejado em água destilada (120 mL) e refluxando-se a mistura durante 12 h. As soluções resultantes foram concentradas em evaporador rotativo e o sólido obtido foi secado a 120 °C. Os derivados ácido sulfônico da porfirina foram obtidos com rendimento quantitativo. A caracterização dos mesmos por RMN, FAB e micro-análise corresponde bem aos dados da literatura [34,35].

II. C. Equipamentos

Os espectros de absorção foram registrados num espectrofotômetro Shimadzu UV-2100 ou num bioespectrofotômetro Carry 50 (Varian, Mulgrave, EUA) . Os espectros de fluorescência foram medidos com um espectrofotômetro Spex Fluorolog 3, com correcção da dependência do sistema relativamente ao comprimento de onda (fotomultiplicador RCA C31034), ou com um espectrofluorímetro PerkinElmer LS 50. Os espectros de absorção de transientes foram medidos com um espectrômetro cinético de fotólise por relâmpago de laser modelo Applied Photophysics LKS 60 com resolução de nanossegundos, utilizando para excitação a terceira harmônica de um laser Nd/YAG da Spectra-Physics Quanta Ray GCR 130-01, um fotomultiplicador Hamamatsu 1P28 e um osciloscópio Hewlett- Packard Infinium (1 GS/s). As medições utilizando fotólise por relâmpago foram executadas na presença de ar e em soluções saturadas de argônio. Para os ensaios de calorimetria fotoacústica utilizaram-se o mesmo laser Nd/YAG, uma célula fotoacústica frontal de fabrico próprio com um transdutor Panametrics de 2,25 MHz (modelo 5676) e um osciloscópio Tektronix DSA 601 [36]. A fosforescência do oxigênio singleto à temperatura ambiente foi medida a 1270 nm com um fotomultiplicador Hamamatsu R5509-42, arrefecido até 193 K numa câmara para nitrogênio líquido (Products for Research modelo PC176TSCE005), após a excitação por laser a 355 nm de soluções arejadas utilizando uma adaptação do espectrômetro da Applied Photophysics [37] . A emissão do oxigênio singleto a 1270 nm também foi monitorizada com um detector de germânio arrefecido com nitrogênio líquido (North Coast) acoplado a um osciloscópio Tektronix (TDS 520B) , após excitação da amostra com pulsos laser de 5 ns usando a terceira harmônica (355 nm) gerada por um laser Nd:YAG Q-switched (Continuum Surelite II).

As análises elementares foram executadas com um analisador elementar Fisons Instruments EA 1108 CHNS-O.Os pontos de fusão foram medidos num aparelho medidor de pontos de fusão em capilar Electrothermal. Os espectros de 1H-RMN, 19F-RMN e 13C-RMN foram registrados num espectrômetro de RMN Brucker-Amx de 300 MHz. As atribuições dos sinais do 1H foram feitas experimentalmente com COSY 2D e NOESY, e as atribuições dos sinais de 13C foram feitas experimentalmente com HSQC 2D e HMBC. Os dados MALDI-TOFMS foram obtidos usando um Applied Biosystems Voyager DE-STR (Framingham, MA, EUA) equipado com um laser de nitrogênio (À, = 337 nm) .

Os espectros da ressonância paramagnética eletrônica (RPE) das espécies com, pelo menos, um elétron desirmanado foram obtidos usando um espectrômetro Bruker ESP 300 (IBM Instruments Inc.). Os ajustes típicos deste equipamento foram os seguintes: potência das microondas 10 mW, amplitude modulada 0,8 G, alcance de varrimento 60,0 G. Os espectros da RPE foram registrados sob irradiação in situ com um laser de díodo da Hamamatsu. Os seguintes ajustes foram utilizados para registrar os espectros: alta potência (4 mW) , baixa amplitude modulada (0,2 G) e alcance de varrimento estreito (60 G) , registrando-se 20 varrimentos para cada espectro.

As irradiações em experiências in vitroforam executadas com uma lâmpada de halogênio ou fonte de laser. No primeiro caso, uma lâmpada de halogênio de 500 W foi colocada a 50 cm da placa irradiada a fim de assegurar uma irradiação homogênea. Um filtro de água arrefecido (d = 35 mm) e um filtro de corte de 60 0 nm foram postos entre a lâmpada e as amostras. A fluência da luz que chegava às amostras foi de 3 mW/cm2. O espectro de emissão da lâmpada de halogênio foi registrado utilizando um espectroradiômetro IL2000 (Spectrocube), Figura 1. No segundo caso foram utilizados três lasers de díodos da Lynx, de cavidade externa TEC 500, accionados por controladores de laser PilotPC 500 (Sacher Lasertechnik, Marburgo, Alemanha). As energias dos lasers eram estáveis a 40 mW para o laser de 748 nm, a 10 mW para o laser de 649 nm e a 10 mW para o laser de 633 nm. As energias dos lasers foram medidas regularmente com um Coherent LaserCheck. Nalgumas experiências in vitro a luz do laser foi focada numa fibra óptica por um colimador instalado numa microbancada óptica, e assim distribuída pelas células. Este sistema reduziu a potência da luz laser de 748 nm para 3 0 mW.

Para a irradiação das bacterioclorinas nas experiências de fotobranqueamento utilizou-se o laser de díodo Lynx de 748 nm. Para os estudos com animais, utilizou-se um laser de díodo Hamamatsu fabricado sob encomenda, tipo LA0873, S/N M070301, com 140 mW a 748 nm. Este laser de díodo tem por controlador um ThorLabs 500 mA ACC/APC Laser Diode Controller e sistemas electrónicos instalados no nosso laboratório. As energias deste laser e de outros lasers de alta energia empregues neste trabalho foram verificadas regularmente com um medidor de energias de laser Ophir modelo AN/2E.

A absorção celular do fotossensibilizador em função do tempo e a viabilidade das células foram confirmadas por microscopia de fluorescência usando um microscópio Nikon ECLIPSE TS-100F.

A fluorescência das amostras de pele foi analisada com um microscópio de fluorescência Olympus, modelo BX51M, usando um espelho de fluorescência U-MSWG2 (filtro de excitação de 480-550, filtro de emissão de 590, filtro dicromático de 570 nm) . A microscopia confocal foi feita com um microscópio invertido (DMI6000) Leica TCS SP5 (Leica Mycrosystems CMS GmbH, Mannheim, Alemanha) com objectiva apocromática de 63' de imersão em água (abertura óptica numérica 1.2) . Antes de passar ao modo confocal, a suspensão de GUV (vesículas unilamelares gigantes) foi observada diretamente usando uma lâmpada de sódio como fonte de luz e um filtro para selecionar a fluorescência da Rhod-DOPE para avaliar o rendimento da formação de Gols. A fonte de excitação usada na microscopia de fluorescência confocal foi a linha de 514 nm proveniente do laser de Ar+ ou a linha de 74 5 nm de um laser de Ti:Sa. A emissão foi coletada no intervalo de 550 a 800 nm aproveitando a vantagem da fibra acústico-óptica sintonizável e do separador de feixe do sistema Leica TCS SPC5. A quantidade de luz perdida é mínima em concordância com o "desvio inteligente" que se manteve sempre abaixo de 0,5% (geralmente entre -0,1% e 0,1%) e às contagens desprezáveis de fótons fora das estruturas lipídicas. As secções confocais de espessura menor do que 0,5 mm foram obtidas usando o passo do motor galvanométrico. As projeções tridimensionais foram obtidas usando a software Leica Application Suite - Advanced Fluorescence.

II. D. Métodos II.D.1. Coeficientes de partição

Os coeficientes de partição (CP) n-octanol:água foram medidos usando uma pequena modificação do método de agitação em frasco descrito na literatura [35] por alguns dos autores desta patente. A modificação incluiu a excitação da banda de absorção a aprox. 500 nm e a detecção da fluorescência na região vermelha/IV do espectro.

II.D.2. Fotoquímica e fotofísica

As experiências de fotobranqueamento foram executadas em soluções de tampão PBS, PBS:metanol (50:50) e metanol. As soluções foram irradiadas com o laser de díodo Lynx numa célula com caminho óptico de 1 cm. A absorção inicial das soluções era ao redor de 0,8. 0 mecanismo de fotobranqueamento foi avaliado com a irradiação do sensibilizador usando o laser de díodo Hamamatsu a 80 mW. 0 sensibilizador foi irradiado em PBS e na presença de ácido ascórbico ou azida.

Os rendimentos quânticos de fluorescência (OF) foram determinados em etanol tomando como referência o rendimento quântico de fluorescência do Cl2PhB em tolueno [4] . As absorvâncias das soluções da referência e da amostra foram ajustadas a cerca de 0,2 no comprimento de onda de excitação de 515,5 nm, diluindo-se 10 vezes as soluções antes da detecção da fluorescência. O rendimento quântico de fluorescência foi obtido a partir da razão entre as bandas de fluorescência da amostra e da referência multiplicada pelo rendimento quântico de fluorescência da referência, 0,012 segundo descrito na literatura [12], após corrigir a diferença dos índices de refração do etanol e do tolueno.

Os espectros de absorção do tripleto-tripleto e os tempos de vida do estado triplet© dos fotossensibilizadores (TT) foram medidos com o equipamento de medição de espectros de absorção de transientes descrito acima, com excitação a 355 nm, nas quais as soluções têm absorvâncias entre 0,25 e 0,30.

A calorimetria fotoacústica de resolução temporal (PAC) foi feita com o equipamento descrito anteriormente usando um procedimento descrito por alguns dos autores desta patente [4]. Todas as medições foram feitas em etanol usando o composto manganésio 5,10,15,20-tetrafenilporfirina como referência fotoacústica.

Os rendimentos quânticos de oxigênio singleto em etanol foram obtidos por meio do procedimento descrito por alguns dos autores desta patente [37] usando a fenalenona como referência. A literatura indica que o rendimento quântico de oxigênio singleto obtido com a fenalenona em etanol é de 0^=0,95 [38] .

II.D.3.Ressonância Paramagnêtica Eletrônica (RPE)

As espécies reativas de oxigênio produzidas por irradiação de fotossensibilizadores em PBS, nomeadamente o íon superóxido e o radical hidroxila, formam aductos com vários capturadores de spin. Estes aductos podem ser identificados por RPE. O tampão PBS empregue nessas medições foi tratado previamente com resina quelante Chelex 100 para remoção de quaisquer íons metálicos contaminantes que poderiam catalisar a decomposição de peróxidos. Dois capturadores de spin foram utilizados: BMPO e DMPO. O DMPO foi purificado inicialmente com carvão ativado/benzeno e, de seguida, uma concentração de partida foi determinada por espectrofotometria usando o coeficiente de extinção £226=7200 M’1 cm’1. As medições da RPE foram realizadas à temperatura ambiente usando o espectrômetro Bruker descrito acima, com irradiação in situ e laser de díodo Hamamatsu.

II.D.4. Testes de permeabilidade cutânea

O melhor modelo animal para ensaio de permeabilidade cutânea é o Porco Miniatura devido às semelhanças entre as características da pele do Porco Miniatura e a pele humana [39]. Diferentes formulações de cremes, unguentos, geles e soluções líquidas foram empregues para aumentar a penetração do fotossensibilizador em amostras de pele de Porcos Miniatura. As formulações continham os fotossensibilizadores em quantidades a variar de 0,1 a 10%, intensificadores de permeabilidade, tais como o Azone® e o DMSO, assim como vários excipientes. Testes ex vivo empregaram a pele cortada do dorso de Porcos Miniatura. Testes in vivo foram efetuados no dorso de Porcos Miniatura. Em cada teste, a formulação foi aplicada numa área de aprox. 1 cm2 de pele durante o tempo desejado, e coberta em seguida. Decorrido o tempo, a formulação foi removida com uma espátula e limpada com mecha de algodão de uso médico embebido em etanol, até não mais se observarem resíduos do sensibilizador na mecha de algodão. Nos testes in vivo as amostras de pele foram removidas por cirurgia e os animais foram sacrificados em seguida.

0 primeiro passo para fixação do tecido de amostras de pele foi a imersão em paraformaldeído (4% em solução aquosa) durante pelo menos 24 h. De seguida, as amostras foram transferidas a uma solução de sacarose 25% durante pelo menos 48 h. Após este tratamento, as amostras de pele tornam-se mais densas do que a solução de sacarose. Uma alíquota foi extraída por punção biópsia, congelada em gelo seco e, de seguida, montada em suporte com Tissue-Tek O.C.T. Compound (Sakura Finetek Europe B.V., Zoeterwoude, Países Baixos) e cortada em fatias de espessura controlada, selecionada entre 25 e 100 mm, num crióstato. As fatias de pele foram transferidas para lâminas de microscópio e mantidas sob refrigeração até serem analisadas por microscopia de fluorescência e microscopia confocal. Como alternativa, em vez de utilizar o paraformaldeído como fixador, as amostras de pele foram congeladas diretamente em gelo seco.

II. D. 5. Ensaios In vitro

Os fármacos descritos nesta patente foram avaliadas em estudos in vitro.Num conjunto de ensaios in vitro empregou-se irradiação com uma lâmpada de halogênio guarnecida com vários filtros. No outro conjunto empregou- se irradiação de laser de díodo para iluminar cada uma das culturas celulares.

II.D.S.i) Ensaios in vitro com irradiação proveniente de lâmpada de halogênio

As linhagens celulares empregues nos ensaios de irradiação com lâmpada de halogênio eram de células MCF7 (carcinoma humano de mama), SKMEL 188 (melanoma humano) e S91/I3 (melanoma de ratinho). Elas foram utilizadas tanto nas experiências referentes à toxicidade como à fototoxicidade. As células MCF7 foram cultivadas em meios suplementados com 10% de soro fetal bovino (FBS), 25 UI/ml de penicilina e 25 gg/ml de estreptomicina. As células de melanoma humano SKMEL-188 foram cultivadas em meio FIO suplementado com 10 % de soro fetal bovino (FCS), 100 UI/ml de penicilina e 100 gg/ml de estreptomicina. A sublinhagem 13 de células de melanoma Cloudman S91 foi cultivada em meio RPMI 1640 suplementado com 100 UI/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina e 5% de soro fetal bovino (FCS) (Gibco BRL). Todas as linhagens de células foram cultivadas em monocamadas em placas de Petri de 60 mm de diâmetro, e incubadas a 37 °C em atmosfera úmida com 5% de CO2.

Citotoxicida.de. A viabilidade e a eficiência metabólica das células foram determinadas pela absorção e redução do brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difenil tetrazólio (MTT) em corante formazano insolúvel por enzimas microssomais da célula. As linhagens celulares foram cultivadas em meio RPMI com 10% de soro fetal bovino, penicilina e estreptomicina. As células foram mantidas em 5% de CO2, 95% de ar e 100% de umidade. Para determinar a citotoxicidade, estas células foram transferidas em placas com 96 poços à densidade de 1 x 104 células por poço em meios completos. Após 24 h, as células foram incubadas com fotossensibilizadores em diferentes concentrações (0,25 até 50 pM) durante 18 horas a 37 °C. De seguida, as células foram lavadas duas vezes com PBS e incubadas em meio de crescimento a 37°C durante 24 h. Após este período, o meio foi substituído por 100 pl de meio fresco e 20 pl de MTT, e as células foram incubadas com MTT na concentração final de 0,5 mg/ml durante 3 h. A seguir, o meio de cultura foi substituído por solução de DMSO:metanol (1:1) para dissolver os cristais azuis de formazano. A placa de cultura de 96 poços foi agitada durante 0,5 min à temperatura ambiente e a leitura da densidade óptica a 560 nm foi feita imediatamente usando um leitor de ELISA (GENios Plus; Tecan Trading AG, Suíça). A sobrevivência celular foi expressa pela alteração da absorção do sal de formazano e a taxa de sobrevivência foi indicada como a razão percentual entre o número de células viáveis tratadas e o número de células viáveis não tratadas. O número de células foi determinado por regressão linear a partir de uma curva de calibração.

Absorção celular dependente do tempo. As células SKMEL 188, S91 e MCF7 foram semeadas em placas de 96 poços com IxlO4 células por poço e expostas à concentração de 20 pM dos fotossensibilizadores clorina ou bacterioclorina em PBS durante vários intervalos de tempo, de 10 min até 180 min, a fim de testar a acumulação do fármaco em função do tempo. No fim do intervalo de incubação, as células foram lavadas três vezes com PBS e ressuspendidas em 100 pL de PBS com 0,25% de Triton X-100. A retenção dos fotossensibilizadores nas células foi detectada por medição da fluorescência dos fotossensibilizadores acumulados usando um leitor de ELISA. Adicionalmente, a absorção do fotossensibilizador e a viabilidade das células foram confirmados por microscopia de fluorescência. Nestas experiências as células SKMEL 188, S91 e MCF7 foram incubadas durante 2 horas com 20 pM do fotossensibilizador, lavadas três vezes com PBS, ressuspendidas em PBS e examinadas com microscopia de fluorescência.

Fotossensibilização celular. As células SKMEL 188, S91 e MCF7 foram preparadas conforme descrito acima. Com base nos ensaios de citotoxicidade, selecionou-se a concentração de 5 pM do fotossensibilizador para os ensaios de fotossensibilização. As células foram incubadas por 12 h a 37 °C e, de seguida, irradiadas à taxa de fluência de 0,53 mW/cm2 e em doses entre 0,1 e 0,64 J/cm2. Note-se que o fotossensibilizador utiliza apenas cerca de 1/5 da taxa de fluência disponível da lâmpada de halogênio filtrada. O teste com MTT foi realizado 24 h após a irradiação. Os valores foram obtidos de três experiências independentes e expressos como percentagem de sobrevivência celular com referência às células controlo que foram tratadas da mesma maneira, porém não incubadas com o fotossensibilizador, nem iluminadas.

II.D.S.ii) Ensaios in vitro com irradiação laser

As linhagens celulares empregues nos ensaios com irradiação laser foram a HT-29 (carcinoma humano de cólon), PC-3 (carcinoma humano de próstata), SW2 (cancro humano pulmonar de pequenas células), A-549 (cancro humano pulmonar de não-pequenas células), S91/I3 (melanoma de ratinho) e CT26 (carcinoma de cólon de ratinho) . Estas linhagens foram utilizadas tanto para as experiências referentes à citotoxicidade como à fototoxicidade. As células PC-3, SW2 e S91/I3 foram cultivadas em meio RPMI- 1640 (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha) e as células HT- 29, A-549 e CT26 foram cultivadas em meio Dulbecco Eagle modificado (DMEM) (Cambrex Bioscience, Verviers, Bélgica). Os dois meios de cultura foram suplementados com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS) (Cambrex Bioscience, Verviers, Bélgica), 100 UI/ml de penicilina e 100 gg/ml de estreptomicina (Cambrex Bioscience, Verviers, Bélgica). O meio DMEM utilizado para as células CT26 também foi suplementado com HEPES 10 mM. As linhagens celulares foram mantidas em frascos de cultura de 75 cm2 (Orange Scientific, Braine-1'Alleud, Bélgica) a 37 °C, em atmosfera umedecida e com 5% de CO2. Para os estudos in vitro, as células com 85-90% de confluência foram desprendidas da superfície do frasco de cultura com solução de tripsina- Versene-EDTA (Cambrex Bioscience, Verviers, Bélgica) , contadas e semeadas em placas de 96 poços de fundo plano nas densidades desejadas.

Ensaio de viabilidade celular. No fim das experiências a viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de redução da resazurina [40] . De maneira resumida, uma solução stock (0,1 mg/ml em solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4) de resazurina (Sigma-Aldrich, Steinhelm, Alemanha) foi diluída 10% em meio de cultura sem FBS ou antibióticos, e 200 pl foram adicionados às células em cada poço. As placas foram incubadas durante 3-4 h a 37 °C. Os valores de absorvância para cada poço foram medidos a 540 nm e 630 nm por um leitor de microplacas Multiskan Ex (Thermo Electron Corporation, Vartaa, Finlândia).

Citotoxicidade. As células foram semeadas em placas de 96 poços de fundo plano (Orange Scientific, Braine- 1'Alleud, Bélgica) com 100 pl de meio de cultura e deixadas a aderir durante uma noite. O fotossensibilizador foi adicionado às células (diluído em 100 pl de meio de cultura) em concentrações finais entre 0,01 e 1 mM. Cada concentração foi testada quatro vezes. Os períodos de incubação no escuro a 37 °C foram duas vezes maiores do que o tempo de duplicação das células da linhagem testada. Após a incubação, avaliou-se a viabilidade celular. Em experiências controlo paralelas, as células foram incubadas sem o fármaco. A citotoxicidade foi quantificada expressando a morte celular relativamente às células não tratadas (% de células controlo). Os resultados foram indicados em gráfico na forma de curvas de dose-resposta (% de morte celular em função da concentração do fármaco), que permitem a determinação da concentração que inibe 50% do crescimento celular (IC50) .

Fotossensibilização celular. As células foram semeadas em placas de 96 poços DB Falcon black de fundo plano transparente (DB Biosciences - Labware, NJ, EUA) em 100 pl de meio de cultura e deixadas a aderir durante uma noite. 0 fármaco foi adicionada às células (diluída em 100 pl de meio de cultura) nas concentrações desejadas. As células foram incubadas com o fármaco no escuro a 37 °C durante um tempo determinado. Este tempo de incubação é geralmente denominado de intervalo de fármaco-luz. Após a incubação, as células foram lavadas uma vez com 200 p.1 de PBS para remoção do fármaco não internalizado e 100 pl de meio de cultura fresco foram adicionados. As células foram irradiadas (cada poço separadamente) com a luz de 748 nm do laser de díodo Lynx acima descrito, à potência de 100,7 mW/cm2. O tempo de irradiação foi escolhido para se obter a dose de luz desejada. Duas condições de controlo paralelas foram testadas: as células foram incubadas no escuro com a dose mais alta de fármaco e não foram irradiadas, e as células foram irradiadas com a dose mais alta de luz sem o fármaco. Após a irradiação, 100 |il de meio de cultura fresco foram adicionados. A viabilidade celular foi avaliada aproximadamente 24 h após a irradiação.

II.D.6. Experiências in vivo

Os ratinhos utilizados no presente estudo provieram de duas fontes. Para os estudos de toxicidade no escuro, biodistribuição e farmacocinética empregaram-se ratinhos DBA/2 com peso entre 20-30 g provenientes do biotério da Faculdade de Bioquímica, Biofísica e Biotecnologia da Universidade Jagiellonian em Cracóvia. Os ratinhos foram mantidos sob dieta padrão de laboratório e podiam aceder à água para beber em qualquer momento. A utilização destes animais para fins experimentais foi aprovada pelo Comité de Ética em Experimentação Animal da Universidade Jagiellonian (Resolução n.° 384/99). Esses ratinhos também foram utilizados nos testes em PDT.

Os outros ratinhos eram Balb/C pesando entre 20-25 g e provenientes do biotério dos Laboratórios Charles River (Barcelona). Os ratinhos foram mantidos sob dieta padrão de laboratório e podiam aceder à água para beber em qualquer momento. A utilização destes animais para fins experimentais foi aprovado pelo Conselho do Centro de Neurociências e Biologia Celular (Coimbra).

Os quatro Porcos Miniatura utilizados no presente estudo foram obtidos do IMIDRA (Instituto Madrileno de Investigación y Desarrollo Rural, Agrário y Alimentario) - Aranjuez (Madrid). Eles eram todos fêmeas de 6-8 meses de idade, brancos com manchas castanhas e pesavam, em média, 56,8 kg (66,2, 57,1, 43,5 e 60,6 kg) . Foram recebidos na Estação Zootécnica Nacional, Vale de Santarém, onde foram acomodados em caixas separadas de 1,5 m2, alimentados com dieta padrão para porcos e água ad libidum por um período de aclimatação de três semanas. 0 estudo foi realizado de acordo com os regulamentos éticos portugueses sob licença concedida pela Direção de Serviços de Saúde e Proteção Animal, ref. 0420/000/000/2007. O acesso à alimentação foi suspendido 24 h antes do tratamento. O dorso dos animais foi depilado 24 h antes da aplicação das formulações. A administração tópica dos fotossensibilizadores foi feita sob anestesia. A medicação preliminar empregue 30 min antes das aplicações foi a seguinte: Azaperona (Stresnil® Veterinária ESTEVE - Espanha), injeção intramuscular de 2 mg/kg + sulfato de atropina, 50 mg SC. A indução foi feita com cetamina (Clorketam® - Vétoquinol, França), 20 mg/kg, injeção intramuscular. A anestesia foi mantida com intubação endotraqueal usando ventilação espontânea com 2-3 1/min de oxigênio + 3% de isoflurano (Isoflo® - Veterinária ESTEVE, Espanha). As amostras foram recolhidas de 3 Porcos Miniatura sob anestesia conforme descrito acima. As amostras de pele de dimensão 20x20x10 (comprimento, largura, espessura) foram obtidas por excisão cirúrgica. Após a recolha das amostras de pele, os animais foram sacrificados aplicando-se dose excessiva de tiopental sódico (25 mg/kg) + 20 ml de cloreto de potássio 7,5%. O quarto porco miniatura foi mantido vivo e observado durante mais 3 semanas, e alimentado com uma dieta padrão para porcos e água ad libidum. Após 3 semanas, a administração tópica dos fotossensibilizadores foi executada novamente sob anestesia. Aplicou-se choque elétrico para tornar o animal inconsciente, que foi sacrificado cortando-se a sua veia jugular.

II. E. Propriedades dos compostos II.E.l. Propriedades físicas

Conforme mencionado nos Fundamentos da invenção, as propriedades físicas e químicas mais importantes dos fármacos relevantes para a PDT são a forte absorção na gama de 600-800 nm, a elevada eficiência de geração de oxigênio singleto, a estabilidade química, o fotobranqueamento controlado e os coeficientes de partição octanol:água entre -2 e 5. Estas propriedades correspondem à absorvância de luz desejada na janela fototerapêutica e à geração eficaz de espécies citotóxicas induzida pela luz, e reduzem os efeitos secundários, tais como a fotossensibilidade prolongada da pele, além de facilitar a administração sistêmica ou transdérmica.

As absorvâncias dos compostos foram medidas em várias concentrações, de 1 a 20 pM, e em todos os casos observou- se o cumprimento da lei de Beer-Lambert. Adicionalmente, o comprimento de onda da absorção máxima (Ânáx) no infravermelho não variou na gama de concentração estudada. Isso indica haver pouca agregação entre as moléculas, que se encontram principalmente na forma de monômeros nessas concentrações nos solventes estudados. A Tabela 1 mostra os coeficientes de absorção molar (^tóx) típicos no vermelho e infravermelho e os valores máximos de comprimento de onda. Esta tabela também indica os rendimentos quânticos de fluorescência (<t>P) representativos para as Luzitinas. Os rendimentos quânticos de fluorescência destas moléculas diminuem na presença de substituintes como o cloro, uma característica específica determinante do efeito de átomo pesado esperada para tais moléculas.

Os espectros de absorção tripleto-tripleto das Luzitinas medidos neste trabalho estão de acordo com aqueles indicados na literatura para as clorinas e bacterioclorinas. Todos os decaimentos do tripleto foram nitidamente mono-exponenciais. Em soluções desarejadas obtidas por fluxo de N2 durante, pelo menos, 3 0 min, os tempos de vida do tripleto (TT)são da ordem de milissegundos, o que demonstra a fotoquímica ineficiente na ausência de oxigênio. Os valores representativos estão indicados na Tabela 1. Em etanol saturado de ar os tempos de vida do tripleto diminuíram para 200-300 nanossegundos, valor significativamente mais curto do que os tempos de vida das correspondentes porfirinas. Tais valores são consistentes com a transferência de energia limitada por difusão a partir do estado tripleto do sensibilizador para o oxigênio molecular através de uma interação de transferência de carga.

Todas as emissões de oxigênio singleto medidas em soluções de etanol arejadas são bem descritas por decaimentos mono-exponenciais, com tempos de vida típicos para o oxigênio singleto (TΔ) . Os valores <I>Δna Tabela 1 foram obtidos pelos métodos acima descritos e são representativos para esses fotossensibilizadores. Tabela 1. Rendimentos quânticos de fluorescência, tempos de vida do tripleto, rendimentos quânticos do oxigênio singleto e tempos de vida do oxigênio singleto para fotossensibilizadores representativos em soluções de etanol saturadas de ar.

[41] . b> As unidades HpD monoméricas apresentam OΔ=0,64 em metanol, mas na água elas estão presentes principalmente na forma de dímeros com ®Δ=0,ll [42]. c) Em solução aquosa. d) Corrigido para o teor de clorina. d) [43] . e> Em metanol, mas cai à metade deste valor em 65% de água em metanol [44] . f) Em metanol [45] .

Tipicamente, a soma dos rendimentos quânticos de fluorescência e de oxigênio singleto das Luzitinas é de 0,6-0,8, e 20 a 40% da luz absorvida é utilizada para 10 outros processos. Estes processos foram investigados por calorimetria fotoacústica de resolução temporal (PAC) e ressonância paramagnética eletrônica (RPE). A PAC mede a quantidade de energia libertada em processos não radiativos (conversão interna, cruzamento intersistemas, reações 15 químicas) no decaimento dos estados excitados eletronicamente. A RPE mede a quantidade de espécies com elétrons desirmanados (radicais livres) presentes na amostra e foi utilizada aqui com irradiação laser direta para medir a geração do íon superóxido, do radical hidroxila e de outras espécies reativas de oxigênio (ROS) induzida pela luz. A libertação de energia medida por PAC é consistente com a formação dos estados tripleto da bacterioclorina com rendimentos quânticos próximos da unidade e energia tripleto de 105-125 kJ/mol, o que concorda com os dados da literatura acerca de bacterioclorinas halogenadas [12] . Os espectros da RPE, obtidos durante a irradiação das Luzitinas em PBS e na presença de DMPO e BMPO, revelaram a existência do íon superóxido e do radical hidroxila. Juntos, os dados da RPE e da PAC mostram inequivocamente que a irradiação desses fotossensibilizadores a 748 nm leva à formação do íon superóxido e, de seguida, do radical hidroxila, o que contribui para a fototoxicidade das Luzitinas. Assim, a fototoxicidade dos sensibilizadores é maior do que aquela prevista a partir dos seus rendimentos quânticos de oxigênio singleto, que já são 5 vezes maiores do que aqueles da Photofrin®.

A estabilidade química dos compostos foi estudada expondo-os à luz, ao ar e a alterações de pH. A degradação mais significativa ocorre no caso de soluções arejadas irradiadas com luz de comprimento de onda apropriado. Em tais circunstâncias, o fotobranqueamento dos compostos segue uma lei cinética de primeira ordem e é proporcional à energia da luz laser incidente. De maneira geral, observou- se também que a velocidade de fotobranqueamento aumenta segundo o teor de água da solução. Bonnett relatou a fotoconversão do Foscan® (m-THPC) e da bacterioclorina analoga (m-THPB) etn PBS:metanol (50:50) [46] . Scherz relatou a fotoconversão do Tookad® em acetona e Triton- X-.PBS [3] . Para comparar a fotoestabilidade das Luzitinas 5 com a fotoestabilidade do Foscan® e do Tookad®, indicamos na Tabela 2 os tempos de meia-vida (fci/2) de fármacos representativos dos aqui descritos, juntamente com os do Foscan® e do Tookad® normalizados para uma potência de laser de 100 mW. Tabela 2. Tempos de meia-vida de bacterioclorinas irradiadas com laser de 100 mW a 748 nm e os seus respectivos coeficientes de partição n-octanol:água (Kbw) •

Distinguimos o fotobranqueamento das nossas bacterioclorinas da fotoconversão do m-THPB ou do Tookad®. Esta diferença baseia-se no fato de que, após irradiação prolongada com laser, a maioria das nossas bacterioclorinas são transformadas em produtos sem absorção detectável no visível e o processo pode ser descrito apropriadamente como fotobranqueamento. Por outro lado, a irradiação do m-THPB ou do Tookad® com laser produz grandes quantidades das clorinas correspondentes que não absorvem a mesma luz laser, o que é descrito de maneira mais apropriada como fotoconversão num outro corante. 0 fotobranqueamento das nossas bacterioclorinas é vantajoso porque causa menor fotossensibilidade da pele, o que não se observa na fotoconversão num outro corante.

II.E.l. Propriedades biológicas

A Photofrin® fornece padrões de referência importantes para a toxicidade no escuro e a para eficácia da PDT in vitro. A toxicidade da Photofrin® no escuro da linhagem de células H1299 de cancro pulmonar de não- pequenas células foi avaliada em várias concentrações de Photofrin® e a viabilidade celular diminuiu 50% para ICescuro5o=θ z 0 pg/ml [47]. Um estudo semelhante sobre a toxicidade da Photofrin® no escuro em células Colo-26, uma linhagem de células de carcinoma de cólon de ratinho, indicou ICescuro5o=20 pg/ml (30 pM, assumindo-se um monômero) [48] . A linhagem celular de adenocarcinoma humano (HT29) tem sido uma das linhagens celulares mais estudadas em PDT. Os estudos referentes ao efeito da concentração de Photofrin® nas células da linhagem HT29 indicaram que a dose letal que mata 50% das células, com uma dose de 5 J/cm2 de luz de halogênio filtrada, é de IC50=7,5 pg/ml. Para 90% de morte celular, esta concentração aumenta para IC9O=4O pg/ml [49] . Para a mesma linhagem celular, o Foscan® é muito mais tóxico, com IC50=0,8 pg/ml, quando um laser de corantes a 650 nm é utilizado para fornecer 10 J/cm2; contudo, para esta dose de luz, IC90>10 pg/ml e alcança os limites da sua toxicidade no escuro, ICescUro5o=13 pg/ml [50]. Ao contrário da Photofrin®, a composição molecular do Foscan® é conhecida e é mais conveniente expressar os seus ICs em unidades molares. Nestas unidades, a citotoxicidade do Foscan® é de ICescUro5o=19 pM e a toxicidade para uma dose de luz de 10 J/cm2 é de IC50=l,2 pM. Por último, é interessante mencionar que o Tookad® causa uma taxa de morte de 50% em células HT29 na dose de 4 8 pM sob irradiação de 25 J/cm2 (patente US2003/6,569,846) . Embora os valores IC50 e IC90 dependam dos modos de administração, dos tempos de incubação, das fluências da luz e de outros pormenores das experiências, os valores supracitados indicam os melhores resultados neste campo.

A Tabela 3 compara a toxicidade da Photofrin® e do Foscan® no escuro em relação à toxicidade no escuro das Luzitinas. Aplicando-se os métodos acima descritos e de acordo com os pormenores nos exemplos que se seguem, as doses de luz necessárias para matar 50% e 90% das diversas linhagens de células sob luz de halogênio filtrada na presença de uma clorina halogenada e sulfonada estão indicadas na Tabela 4, e os valores correspondentes para uma bacterioclorina halogenada e sulfonada estão indicados na Tabela 5. A Tabela 6 indica a fototoxicidade em função da concentração de várias Luzitinas necessária para matar 90% das células com luz laser de 6 J/cm2. Tabela 3. Toxicidade de fotossensibilizadores no escuro para linhagens celulares de cancro humano e de ratinho.

a) As células foram incubadas durante o dobro de tempo necessário à duplicação da população celular em meio de cultura completo, no escuro e na presença de concentrações diferentes do fotossensibilizador. Tabela 4. Doses de luz em J/cm2 necessárias para matar 50% e 90% das células nas linhagens de células indicadas, para [Luzitina-Cl-c]=20 pM («20 pg/ml) sob irradiação de lâmpada de halogênio filtrada.

Tabela 5. Doses de luz em J/cm2 necessárias para matar 50% e 90% das células nas linhagens de células indicadas, para [Luzitina-Cl]=20 pM («20 pg/ml) sob irradiação de lâmpada de halogênio filtrada.

Tabela 6. Concentrações do sensibilizador em pM necessárias para matar 90% das células de linhagens de células de carcinoma humano de próstata (PC-3), adenocarcinoma humano (HT-29), carcinoma humano pulmonar não de células pequenas (A-549), melanoma de ratinho (S91I3) e carcinoma de cólon de ratinho (CT26) sob irradiação com laser de díodo de 6 J/cm2 a 28,5 mW.

As Tabelas 4-6 mostram a baixa toxicidade das Luzitinas no escuro e a sua fototoxicidade extremamente alta. A Tabela 6 mostra que as concentrações de Luzitina necessárias para matar 90% das células de várias linhagens são até 100 vezes menores do que aquelas requeridas pela Photofrin® e até 20 vezes menores do que aquelas requeridas pelo Foscan®. Com doses de laser de 6 J/cm2 (60 segundos de irradiação nas nossas condições experimentais) foi possível matar 100% das células de todas as linhagens celulares estudadas com concentrações de Luzitina que apresentam citotoxicidade desprezável no escuro.

II. F. Metódos de utilização dos compostos e composições

As Luzitinas podem administrar-se por meio de formulações para aplicação tópica, oral, intravenosa, subcutânea, intraperitoneal, retal, sublingual, nasal, ocular, auricular ou por inalação, de acordo com a situação clínica. A formulação farmacêutica é adaptada à via de administração selecionada. As formulações contêm, para além das Luzitinas (isoladas ou combinadas entre si), um veículo aceitável do ponto de vista farmacêutico. Antes do preparo da formulação, podem obter-se derivados de Luzitinas nas suas correspondentes formas de sais, ésteres, éteres ou ésteres enólicos, acetais, cetais, orto-ésteres, hemiacetais, hemicetais, ácidos, bases, solvatos, hidratos ou profármacos.

Após a administração tópica ou sistêmica, ou ambas, a zona tratada é exposta à luz de comprimento de ondà apropriado, de preferência entre 630 e 690 nm para clorinas ou entre 720 e 780 nm para bacterioclorinas, de preferência utilizando-se um laser. Os métodos de irradiação de várias zonas do corpo são bem conhecidos na prática. O intervalo de fármaco-luz pode variar de alguns minutos a vários dias, dependendo do modo de administração. A dose de luz depende da via de administração, da fonte de luz e do objetivo da terapia. No caso de irradiação por laser contínuo, a dose de luz deve ser de 10 a 250 Joules/cm2, com a potência do laser entre 20 e 200 mW/cm2. Pode utilizar-se também irradiação por laser pulsado com energias entre 0,001 e 10 mJ/cm2 por pulso. A dose de luz pode aplicar-se numa única ou em várias sessões. Para fins de diagnóstico, pode reduzir-se a dose de luz. Quando se empregam fontes de luz de banda larga na irradiação, as doses de luz são aumentadas para manter a energia da fonte de luz, nas regiões do espectro onde as Luzitinas absorvem, no nível determinado para a irradiação com laser.

As Luzitinas podem administrar-se uma única vez ou podem dividir-se em várias doses mais pequenas a serem administradas em intervalos de tempo. As Luzitinas podem administrar-se junto com outros medicamentos para obtenção de efeitos sinérgicos. As doses de luz administradas após o intervalo de fármaco-luz são aquelas da gama de variação acima indicada para uma única dose. O tratamento pode repetir-se diversas vezes em vários intervalos. Subentende- se que a dose exata e a duração do tratamento dependem da doença a ser tratada e podem determinar-se empiricamente por meio de protocolos conhecidos na prática.

II.F.1. Administração sistêmica (oral, injetável, aerossóis e retal)

Um fato limitativo comum associado à administração oral é a degradação putativa da droga nas condições ácidas do estômago. Como mostra o exemplo abaixo, as Luzitinas são relativamente estáveis em pH 1 durante 3 horas. As alterações do espectro observados em valores baixos de pH devem-se à protonação do anel pirrólico, mas são reversíveis quando a acidez é neutralizada. Outra dificuldade encontrada com frequência na administração oral refere-se à biodisponibilidade. Pode obter-se Luzitinas que se aproximam da regra de cinco de Lipinsky [51] para absorção intestinal. As Luzitinas podem ter log KQW<5, quatro doadores para formação de ligações de hidrogênio, doze aceitadores de ligações de hidrogênio e peso molecular de 1 kD. Apenas este último parâmetro excede de maneira significativa os limites da regra supracitada.

Levando-se em conta as propriedades físico-químicas das Luzitinas, podem considerar-se as formas de dosagem sólidas, semi-sólidas e líquidas. Neste contexto, devem levar-se em conta os adjuvantes farmacêuticos mais modernos para as várias formas de dosagem farmacêutica e modos de administração.

O intervalo de fármaco-luz preferido na administração sistêmica pode variar de alguns minutos a 3 dias, dependendo do modo de administração. As composições farmacêuticas devem fornecer uma dose de 0,01 mg a 100 mg de Luzitina (ou de combinação de Luzitinas) por quilograma de peso corporal e por dia. A melhor dose diária das Luzitinas é de 0,1 a 10 mg por quilograma de peso corporal.

II. F. 2. Administração tópica

A administração tópica pode ser feita com formulações apropriadas contendo um ou vários intensificadores de penetração de superfície e outros excipientes na forma de líquido, gel, hidrogel, creme, unguento, sprays ou qualquer outra formulação dermatológica aceitável. Conforme mencionado nos Fundamentos da invenção, a penetração cutânea conseguida para a Photofrin® ou para outros fotossensibilizadores de alto peso molecular não é suficiente para a PDT eficaz dos distúrbios de pele. As Luzitinas também não cumprem a maioria dos critérios para a boa passagem através da pele [32] . No entanto, a nossa capacidade de modular a anfifilicidade, a capacidade de ligações de hidrogênio desses compostos e, até certo ponto, o seu peso molecular, simplificam a tarefa de encontrar formulações que promovam a sua difusão passiva para a derme. Para uma formulação em gel indicada no exemplo 21 foi demonstrada uma transferência rápida e eficaz para a derme.

O intervalo de fármaco-luz preferido na administração tópica situa-se entre 15 min e 3 h. A formulação deve conter 0,01 a 10% de Luzitina. De preferência, a percentagem do sensibilizador na formulação é de 0,1 a 1%.

A administração tópica também se considera para os olhos. As aplicações destinadas ao uso oftalmológico podem ser formuladas como soluções isotônicas 0,01% - 10%, pH 5- 7, com os sais apropriados.

Esta invenção será agora descrita em mais pormenores nos exemplos não limitativos a seguir, com referência às seguintes Figuras:

Figura 1. Densidade espectral da lâmpada de halogênio de 500 W com um filtro de corte de 600 nm e espectro de absorção do infravermelho de uma clorina (linha pontilhada) e de uma bacterioclorina (linha tracejada).

Figura 2. Espectro de absorção da Luzitina-FMet-c obtido a partir da redução da porfirina correspondente por meio de síntese caracterizada pela ausência total de solventes orgânicos e de bases.

Figura 3. Espectro de absorção da Luzitina-Cl2Et obtido a partir da redução da porfirina correspondente por meio de síntese caracterizada pela ausência total de solventes orgânicos e de bases.

Figura 4. Espectro de absorção da fração mais polar (βαs+αj de atropoisômeros da Luzitina-Cl2Et indicando o aumento da absorvância no infravermelho, estimado em £máx=150.000 M'1 cm-1 a 748 nm.

Figura 5. Espectro de absorção da Luzitina-Cl2 em solução aquosa neutra (linha a cheio), após 2 horas em pH 1 (linha pontilhada) e após neutralização (linha tracejada). Os espectros foram corrigidos para o efeito de diluição causado pela adição de gotas de HC1 e NaOH à solução aquosa.

Figura 6. Espectros de absorção da Luzitina-FMet em PBS:metanol (3:2) antes (à esquerda) e após (à direita) 65 min de irradiação com o laser de díodo Lynx a 74 8 nm e à potência de 28,8 mW (110 J), que mostra o fotobranqueamento controlado.

Figura 7. Intensidade de fosforescência do oxigênio singleto obtida a 127 0 nm após a excitação a 355 nm da Luzitina-Cl2Hep ou da fenalenona em etanol saturado de ar. A inclinação da reta obtida a partir da relação intensidade de fosforescência versus intensidade do laser foi empregue para determinar o rendimento quântico do oxigênio singleto do sensibilizador.

Figura 8. Espectros da RPE obtidos na presença de 80 pM de Luzitina-Cl sob irradiação. À esquerda: com BMPO 4 0 mM em PBS, o espectro corresponde àquele do aducto de spin de BMPO com o radical hidroxila. À direita: com DMPO 40 mM em DMSO, o espectro corresponde àquele do aducto de spin de DMPO com o íon superóxido.

Figura 9. Fração de células S91 (percentagem) sobreviventes sob várias doses de luz na presença de [Luzitina-Cl-c]= 20 pM. O fotossensibilizador não internalizado não foi removido antes da irradiação. Inserto: Citotoxicidade da Luzitina-Cl-c no escuro para as células da linhagem S91 em diferentes concentrações do sensibilizador.

Figura 10. Fração de células MCF7 sobreviventes (percentagem) sob várias doses de luz na presença de [Luzitina-Cl] = 5 pM após 12 h de incubação. O fotossensibilizador não internalizado foi removido antes da irradiação. Inserto: Citotoxicidade da Luzitina-Cl no escuro para as células da linhagem MCF em diferentes concentrações do sensibilizador. A potência efetiva da luz é de 0,53 mW/cm2.

Figura 11. Efeito fototóxico da Luzitina-Cl2 sobre a linhagem celular PC-3 de cancro de próstata após um intervalo de fármaco-luz de 24 horas. As células em meio de cultura foram irradiadas com laser a 748 nm durante 30 ou 60 segundos, o que corresponde a doses de luz de 3 e 6 J/cm2, respectivamente.

Figura 12. Percentagem de sobrevivência celular relativa ao controlo para várias concentrações de Luzitina- Cl2Et em linhagens de células de carcinoma de cólon de ratinho após um intervalo de fármaco-luz de 18 horas. O fotossensibilizador não internalizado foi removido antes da irradiação. As células em meio de cultura foram irradiadas com laser a 748 nm durante 60 segundos, o que corresponde a doses de luz de 6 J/cm2.

Figura 13. Percentagem de sobrevivência celular relativa ao controlo para várias concentrações de Luzitina- FMet em linhagens de células de adenocarcinoma humano após incubação por 18 horas. O fotossensibilizador não internalizado foi removido antes da irradiação. As células em meio de cultura foram irradiadas com laser a 74 8 nm durante 60 segundos, o que corresponde a doses de luz de 6 J/cm2.

Figura 14. Percentagem de sobrevivência celular relativa ao controlo para várias concentrações de Luzitina- F2Met em linhagens de células de cancro humano pulmonar de não-pequenas células após incubação por 18 horas. O fotossensibilizador não internalizado foi removido antes da irradiação. As células em meio de cultura foram irradiadas com laser a 748 nm durante 60 segundos, o que corresponde a doses de luz de 6 J/cm2.

Figura 15. Fluorescência da Luzitina-Cl2Et em concentrações de 3,26 nM (linha a cheio) e 0,26 nM (linha tracejada) em soro humano utilizadas para determinar o seu limite de detecção. Indicam-se também a linha de base (linha tracejada e pontilhada) e a curva de Gauss (linha pontilhada) utilizadas para simular a concentração mais baixa para a determinação mais exata da fluorescência de baixa intensidade.

Figura 16. Fluorescência da Luzitina-Cl-c dividida pelo peso do fígado, sangue e cérebro, respectivamente em ordem de intensidade, após administração intraperitoneal de 10 mg/kg em ratinhos DBA/2.

Figura 17. Farmacocinética e biodistribuição da Luzitina-Cl após administração intraperitoneal de 10 mg/kg em ratinhos DBA/2. A intensidade de fluorescência nos vários tecidos (sangue, tumor, coração, pulmões, baço, fígado, rins, intestino, músculo e pele) foi normalizada para os seus respectivos pesos.

Figura 18. Fluorescência da Luzitina-Cl2Et dividida pelo peso do tumor e do sangue, respectivamente em ordem de intensidade, após administração intraperitoneal de 10 mg/kg em ratinhos DBA/2.

Figura 19. Volume dos tumores em ratinhos Balb/C com tumores CT26 implantados e tratados com Luzitina-FMet. A linha espessa representa a média dos tamanhos do tumor em quatro animais controlo, nos quais a Luzitina-FMet foi administrada, mas não irradiada. As linhas finas representam cada um dos animais tratados com Luzitina-FMet e laser de 132 J/cm2 a 748 nm.

Figura 20. Tamanho dos tumores S91 implantados em ratinhos DBA/2 tratados com Luzitina-Cl2Et. Empregaram-se duas doses de laser a 748 nm.

Figura 21. Fluorescência confocal da Luzitina-FMet 3 h após aplicação tópica no dorso de um Porco Miniatura. Excitação multifóton a 744 nm; eliminação completa do ruído; imagens de fluorescência no plano geradas por 6 imagens; detector 8 00 V @; abertura = 3 79 pm. O fotossensibilizador difundiu-se através de 50 microns da camada córnea (stratum corneum) e da epiderme.

Figura 22. Espectros de absorção da Luzitina-FMet 3 h após aplicação tópica no dorso de um Porco Miniatura obtidos por espectroscopia confocal. As diversas linhas correspondem a medições em diferentes partes da amostra.

EXEMPLOS EXEMPLO 1. PROCESSO DE SÍNTESE EM ESTADO SÓLIDO PARA OBTENÇÃO DE BACTERIOCLORINAS COM SUBSTITUINTES SACADORES DE ELETRONS

Este exemplo ilustra a vasta gama de bacterioclorinas que se podem sintetizar por um método caracterizado pela ausência de solvente e de base, ou seja, no qual somente uma porfirina e uma hidrazida (ambas em estado sólido) são empregues como materiais de partida.

Numa preparação, misturamos 60 mg (6,8 x 10’5 mol) de 5,10,15,20-tetrakis(2-trifluorometilfenil)porfirina com 500 mg (2,7 x 10'3 mol) de p-tolueno sulfonilhidrazida, ambas na forma de pó muito fino. Elas foram adicionadas num reator que foi evacuado de ar, vedado sob N2 e aquecido a uma temperatura acima de 100 °C durante vários minutos. Após arrefecimento (à temperatura ambiente), o sólido foi removido e várias porções de 250 mg (1,4 x 10’3 mol) de p- tolueno sulfonilhidrazida foram acrescentadas até ao desaparecimento completo da banda de Soret da porfirina. A bacterioclorina foi extraída com uma pequena quantidade de solvente orgânico. O excesso de hidrazida foi removido por filtração rápida em sílica gel (coluna de 8 cm de altura e diâmetro interno de 2,5 cm) usando diclorometano/n-hexano como eluente. Após evaporação do solvente e recristalização em éter dietílico/pentano, obteve-se 90% de CF3PhB com menos de 5% de clorina contaminante.

Os deslocamentos químicos da RMN do produto isolado são os seguintes:

RMN XH: (400,13 MHz, CDC13) δ, ppm: 7,47-7,45 (m, 4H) ; 7,26- 7,20 (m, 8H) ; 7,15-7,12 (m, 4H) ; 2,42 (s, 4H) ; 2,37 (S, 4H); -1,27 (S, 2H).

EXEMPLO 2. PROCESSO DE SÍNTESE EM ESTADO SÓLIDO PARA OBTENÇÃO DE CLORINAS HALOGENADAS

Para a preparação de 5,10,15,20-tetrakis(2- fluorofenil-5-N-metilsulfamoilfenil) clorina, Luzitina- FMet-c, misturamos 50 mg (4,72xl0-5 mol) de 5,10,15,20- tetrakis (2-fluorofenil-5-N-metilssulfamoilfenil)porfirina com 18 mg (9,44xl0‘5 mol) de p-tolueno sulfonilhidrazida. O reator foi evacuado de ar, vedado sob N2 e aquecido a uma temperatura acima de 100 °C durante vários minutos. Após arrefecimento (à temperatura ambiente), o sólido foi removido com uma pequena quantidade de solvente orgânico e o excesso de hidrazida foi removido por filtração rápida em sílica gel usando acetato de etilo/hexano como eluente. Obteve-se uma mistura de clorina contaminada com aproximadamente 10% de bacterioclorina. A mistura de clorina e bacterioclorina foi dissolvida em diclorometano e oxidada à clorina correspondente por aquecimento a 50 °C na presença de ar.

Após recristalização em éter dietílico/pentano obteve- se 90% de Luzitina-FMet-c com menos de 1% de contaminação por bacterioclorina. A Figura 2 indica o espectro de absorção do produto final.

EXEMPLO 3. PROCESSO DE SÍNTESE EM ESTADO SÓLIDO PARA OBTENÇÃO DE BACTERIOCLORINAS HALOGENADAS

Este exemplo descreve um método claro, simples, econômico e amigo do ambiente para sintetizar bacterioclorinas anfifílicas halogenadas sem utilizar solventes e num único reator.

A porfirina apropriada (em estado sólido) e a p- tolueno sulfonilhidrazida (em estado sólido) são bem pulverizadas e misturadas completamente. De seguida, elas são introduzidas num reator e evacuadas em alto vácuo. O reator é vedado e mantido sob alto vácuo ou lavado repetidamente com um gás inerte. Por fim, o reator é aquecido (70-200 °C) durante 1-340 min, enquanto vedado. Após o fim da reação e do arrefecimento do reator à temperatura ambiente, a bacterioclorina correspondente é obtida com rendimento de 90%. Após uma rápida filtração em coluna de sílica gel, obtém-se uma bacterioclorina com menos de 5% da clorina contaminante correspondente.

Para a preparação de 5,10,15,20-tetrakis(2,6-dicloro- 3-N-etilsulfamoilfenil) bacterioclorina, Luzitina-Cl2Et, com este método, misturou-se 50 mg (3,8 x 10'5 mol) de 5,10,15,20-tetrakis(2,6-dicloro-3-sulfoetilfenil)porfirina com 188 mg (10'3 mol) de p-tolueno sulfonilhidrazida, evacuou-se o reator com uma bomba Edwards, vedou-se e aqueceu-se o reator à temperatura acima de 70 °C por vários minutos. Após arrefecimento (à temperatura ambiente), removeu-se o sólido com uma pequena quantidade de éter dietílico e removeu-se o excesso de hidrazida por filtração rápida em sílica gel (coluna de 4 cm de altura e diâmetro interno de 2,5 cm) usando acetato de etilo/éter dietílico como eluente. Após a evaporação do solvente, o sólido resultante é recristalizado em éter dietílico/pentano, obtendo-se um rendimento de 90% em Luzitina-Cl2Et. O espectro de absorção na Figura 3 revela a existência de menos de 5% da clorina correspondente. 0 coeficiente de absorção molar desta e de outras bacterioclorinas estão indicados na Tabela 1, corrigidos para a quantidade de clorina por vezes presente nas amostras. A comparação entre os espectros da Figura 3 abaixo com aqueles da Figura 2 na patente PCT/EP2005/012212, também da Universidade de Coimbra, revela a redução de, pelo menos, 10 vezes de clorina como impureza por meio deste novo método de síntese, que também é mais econômico, menos trabalhoso e não prejudica o ambiente. A RMN e a MS do produto isolado indicaram os seguintes valores:

RMN 1H: (300 MHz, CDC13) δ, ppm: 8,42 (d, J = 8,55 Hz , 4H, p-H); 7,88 (d, J = 8,55 Hz, 4H, m-H); 7,84- 7,82 (m, 4H, β-H) ; 5,01(m, 4H, N-H) ; 3,91(s, 8H, β-H) ; 3,22 (m, 8H, CH2 ); 1,24 (t, 12H, J = 6,73 Hz, CH3 ); -1,29 (s, 2H, NH). MS: (MALDI-TOF), m/z: 1322,0 [M]+.

EXEMPLO 4. ATROPOISÔMEROS DE BACTERIOCLORINAS HALOGENADAS

Este exemplo indica a existência de atropoisômeros estáveis de bacterioclorinas halogenadas e sulfonadas e a possibilidade de separá-los facilmente. Também se indica que os atropoisômeros mais polares têm maiores coeficientes de extinção no infravermelho.

Usando o procedimento descrito no exemplo 3, porém com uma coluna maior (8 cm de altura; 2,5 cm de diâmetro interno) e com acetato de etilo/n-hexano (1:1) como primeiro eluente e acetato de etilo/n-hexano (3:1) como último eluente, observamos a separação da 5,10,15,20- tetrakis (2,6-dicloro-3-N- etilsulfamoilfenil)bacterioclorina, a Luzitina-Cl2Et, em duas frações. Cada fração apresentou duas manchas em TLC, que foram identificadas como uma mistura dos atropoisômeros menos polares αβαβ+α2β2 ou dos mais polares βαs+oM. A Figura 4 indica o espectro de absorção da mistura dos atropoisômeros de polaridade mais elevada. Esta fração apresenta um aumento de 50% do coeficiente de extinção ε na banda de 750 nm, que atinge 150.000 M'1 cm'1.

EXEMPLO 5. ESTABILIDADE DE BACTERIOCLORINAS HALOGENADAS E SULFONADAS EM FUNÇÃO DO pH

Este exemplo demonstra a estabilidade das bacterioclorinas halogenadas e sulfonadas em pH 1 a 37 °C, ou seja, no grau de acidez do estômago.

A Luzitina-Cl2 foi dissolvida em solução aquosa neutra e equilibrada a 37 °C até se obter o espectro de absorção indicado na Figura 5. Adicionaram-se gotas de HC1 em solução aquosa para diminuir o pH até 1 e, 2 horas mais tarde, registrou-se o espectro de absorção da Luzitina-Cl2 em pH 1. De seguida, adicionou-se NaOH em solução aquosa para neutralizar a solução e, após 3 horas, registrou-se novamente o espectro de absorção. A Figura 5 indica os espectros de absorção corrigidos para a diluição ocorrida pela adição de HC1 e NaOH em solução aquosa. As alterações espectrais observadas em pH baixo devem-se à protonação do anel pirrólico, mas são reversíveis aquando da neutralização da acidez. Nestas condições, recupera-se quase a metade da Luzitina-Cl2, e a outra metade transforma-se na clorina correspondente.

EXEMPLO 6. ESTABILIDADE DE BACTERIOCLORINAS HALOGENADAS E SULFONADAS NA PRESENÇA DE LUZ

Este exemplo demonstra a grande estabilidade das bacterioclorinas halogenadas e sulfonadas quando irradiadas por luz infravermelha, o que resolve os problemas de instabilidade próprios de outras bacterioclorinas de origem sintética, como no caso da 5,10,15,20-tetrakis(3- hidroxifenil)bacterioclorina, ou derivadas de produtos naturais, como no caso do Tookad®.

A Luzitina-FMet foi dissolvida em PBS:metanol (2:3), transferida a uma célula de quartzo de 1 cm e o seu espectro de absorção foi registrado (Figura 6). De seguida, a célula de quartzo foi colocada no feixe do laser de díodo Lynx de 748 nm inicialmente desfocado a fim de se obter um feixe de diâmetro coincidente com o da janela da célula de quartzo. A potência do laser medida sob tais condições foi de 28,8 mW. A cada 5 minutos, a irradiação foi interrompida e um novo espectro de absorção foi registrado. Este procedimento foi executado durante 65 minutos. 0 fotobranqueamento segue a cinética de uma reação de primeira ordem no intervalo de tempo da experiência. A Figura 6 indica também o espectro de absorção após a irradiação. Â medida que o pico de absorvância da bacterioclorina a 743 nm diminui de 1,128 para 0,337, a absorção da clorina aumenta apenas de 0,114 para 0,151. Considerando-se os coeficientes de absorção molar destes compostos nestes comprimentos de onda, torna-se claro que, enquanto 70% da bacterioclorina é destruída durante a irradiação, apenas uma pequena percentagem de clorina é formada. Os produtos restantes não apresentam espectros bem resolvidos na gama do visível/IV e o processo de fotodegradação dominante pode descrever-se como fotobranqueamento.

A meia-vida do fotobranqueamento foi medida a diferentes intensidades de laser e mostrou ser proporcional à potência do laser. As meias-vidas de outras bacterioclorinas normalizadas para irradiação laser de 100 mW a 748 nm estão indicadas na Tabela 1, junto com os dados da literatura referentes à fotodegradação do Foscan® e do Tookad® normalizada para a mesma intensidade de luz. Observou-se também que a meia-vida da Luzitina-Cl aumenta 30 vezes quando a solução do fotossensibilizador em PBS está saturada com argônio, que reduz a concentração de oxigênio na solução. Isto indica a participação de ROS no fotobranqueamento.

EXEMPLO 7. GERAÇÃO EFICIENTE DE OXIGÉNIO SINGULETO PELA LUZ

Este exemplo descreve a geração eficiente de oxigênio singleto na presença de Luzitinas, luz de comprimento de onda apropriado e oxigênio molecular dissolvido na solução.

Uma solução de Luzitina-Cl2Hep em etanol saturada de ar com absorvância aproximada de 0,2 a 355 nm foi excitada numa célula de quartzo de 1 cm com um laser Nd:YAG pulsado e a emissão do oxigênio singleto foi acompanhada a 1270 nm usando o equipamento e os métodos anteriormente descritos. A intensidade de fluorescência do oxigênio singleto foi estudada em função da intensidade do laser. Um estudo semelhante foi efetuado com fenalenona em etanol numa concentração correspondente à absorvância da Luzitina- Cl2Hep a 355 nm. A Figura 7 indica a dependência da intensidade de fosforescência do oxigênio singleto medida a 1270 nm em função da energia do laser, após a excitação da Luzitina-Cl2Hep ou da fenalenona a 355 nm em etanol saturado de ar. Utilizaram-se energias diferentes do laser e, a partir da inclinação da curva de dependência da emissão do oxigênio singleto em função da energia do laser e do valor de OΔ=0,95 para a fenalenona em etanol, obtivemos <I>Δ=0,78 para a Luzitina-Cl2Hep. A Tabela 1 mostra os valores para outras bacterioclorinas.

A fotoestabilidade dessas bacterioclorinas, associada à sua eficiência quântica de quase 70% na produção de oxigênio singleto, implica que uma determinada molécula de bacterioclorina, sob irradiação contínua, produzirá localmente uma quantidade muito grande de moléculas de oxigênio eletronicamente excitadas antes de sofrer fotobranqueamento. Quase 30% da energia absorvida pelo sensibilizador é perdida em outros processos, alguns dos quais são identificados no exemplo seguinte.

EXEMPLO 8. FOTOGERAÇÃO DE ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO (ROS)

Este exemplo descreve a geração de espécies reativas de oxigênio, nomeadamente o íon superóxido e o radical hidroxila utilizando Luzitina-Cl como sensibilizador.

A fim de determinar a fotogeração do íon superóxido e do radical hidroxila pela Luzitina-Cl, mediram-se os espectros da RPE na presença de 30-80 pM de Luzitina-Cl e 40 mM de BMPO nas seguintes condições: a) Solução aquosa saturada de ar no escuro. b) Solução aquosa saturada de nitrogênio e irradiada com o laser de díodo Hamamatsu durante 8 minutos. c) Solução aquosa saturada de ar e irradiada com o laser de díodo Hamamatsu durante 4 minutos. d) Solução aquosa saturada de ar e irradiada com o laser de díodo Hamamatsu durante 8 minutos. e) Solução aquosa saturada de ar e irradiada com o laser de díodo Hamamatsu durante 16 minutos. f) Solução aquosa saturada de ar e irradiada com o laser de díodo Hamamatsu durante 16 minutos, na presença de superóxido dismutase (50 pg/ml). g) Solução aquosa saturada de ar e irradiada com o laser de díodo Hamamatsu durante 16 minutos, na presença de catalase (30 pg/ml).

Nas condições experimentais (a) e (b) não se detectou o aducto ROS-BMPO. No entanto, nas condições experimentais (c), (d) e (e) detectou-se o aducto de BMPO formado entre o BMPO e o radical hidroxila (Figura 8) . A luz é necessária para formação deste aducto. A condição experimental (f) não apresenta sinais, o que significa que a superóxido dismutase, enzima que catalisa a dismutação do íon superóxido, inibe a formação do aducto BMPO-radical hidroxila. Para além disso, a condição experimental (g) também não apresenta sinais e prova que a catalase, enzima que degrada o peróxido de hidrogênio em água e oxigênio molecular, também inibe a formação do aducto BMPO-radical hidroxila. Estes resultados indicam que os radicais hidroxila não são formados diretamente a partir do fotossensibilizador e do oxigênio molecular, mas sim como produtos secundários. A inibição observada na presença de superóxido dismutase evidencia claramente ter havido formação de íon superóxido. A inibição observada na presença de catalase sugere que o peróxido de hidrogênio também seja um precursor do radical hidroxila.

Experiências similares foram efetuadas com DMPO em DMSO. Detectamos o aducto DMPO-superóxido na presença de ar e luz (Figura 8) . Entretanto, na ausência de ar ou luz, ou na presença de superóxido dismutase, este aducto não foi observado.

Juntos, esses dados indicam a formação do íon superóxido, seguido da formação de peróxido de hidrogênio e, posteriormente, do radical hidroxila, que são espécies reativas de oxigênio muito bem caracterizadas quanto à capacidade de causar danos a células. Estas ROS completam a eficácia de formação de oxigênio singleto de aprox. 70% dessas bacterioclorinas e mostram que os 30% restantes da energia absorvida pelo sensibilizador não são perdidos, mas utilizados na formação de outras espécies citotóxicas para além do oxigênio singleto.

EXEMPLO 9. FOTOTOXICIDADE DA Luzitina-Cl-c IN VITRO EM LINHAGENS CELULARES DE MELANOMA DE RATINHO SOB IRRADIAÇÃO COM LÂMPADA NORMAL

Este exemplo mostra que as Luzitinas são muito tóxicas para as células de melanoma de ratinho irradiadas com uma lâmpada de halogênio filtrada, em concentrações nas quais a sua toxicidade no escuro é insignificante.

A citotoxicidade no escuro e a atividade fotossensibilizante da Luzitina-Cl-c na linhagem celular S91 (melanoma de ratinho) foram medidas de acordo com os materiais e os métodos descritos anteriormente, exceto pelo fato de, após a incubação, as células não terem sido lavadas para remoção do fotossensibilizador não internalizado antes da irradiação. O inserto na Figura 9 indica a citotoxicidade no escuro em diferentes concentrações de Luzitina-Cl-c e tempo de incubação de 120 minutos. A Figura 9 indica a fração de células S91 que sobrevivem em diferentes doses de luz quando as células são irradiadas na presença de [Luzitina-Cl-c]=20 pM. As doses de luz necessárias para matar 90% (LD90) ou 50% (LD50) das células em cultura estão indicadas na Tabela 3.

EXEMPLO 10. FOTOTOXICIDADE DA Luzitina-Cl IN VITRO EM CARCINOMA HUMANO DE MAMA SOB IRRADIAÇÃO COM LÂMPADA NORMAL

Este exemplo mostra que as Luzitinas são muito tóxicas para as células de carcinoma humano de mama quando irradiadas com uma lâmpada de halogênio filtrada, em concentrações nas quais a sua toxicidade no escuro é insignificante.

A citotoxicidade no escuro e a atividade fotossensibilizante da Luzitina-Cl na linhagem celular MCF7 (carcinoma humano de mama) foram medidas de acordo com os materiais e métodos descritos anteriormente. O inserto na Figura 10 indica a citotoxicidade no escuro em diferentes concentrações de Luzitina-Cl e tempo de incubação de 12 horas. A Figura 10 indica a fração de células MCF7 que sobrevive na presença de [Luzitina-Cl]=5 pM e várias doses de luz. Nitidamente, a concentração de 5 pM de Luzitina-Cl causou 100% de morte nas células expostas à lâmpada de halogênio filtrada de dose 0,6 J/cm2. As doses de luz necessárias para matar 90% (LD90) ou 50% (LD50) das células em cultura estão indicadas na Tabela 4.

EXEMPLO 11. FOTOTOXICIDADE DA Luzitina-Cl2IN VITRO EM CARCINOMA HUMANO DE PRÓSTATA IRRADIADO COM LASER

Este exemplo mostra que as Luzitinas são muito tóxicas para as células de carcinoma humano de próstata quando irradiadas com laser, em concentrações nas quais a sua toxicidade no escuro é insignificante.

A citotoxicidade da Luzitina-Cl2 no escuro para a linhagem de células PC-3 (carcinoma humano de próstata) foi medida de acordo com os materiais e métodos descritos anteriormente. Segundo estas experiências, 0,05 mM é a maior concentração de Luzitina-Cl2 que causa relativamente poucos efeitos na viabilidade das linhagens celulares no teste no escuro. Esta será a concentração de referência nos estudos de fototoxicidade seguintes.

A atividade fotossensibilizante da Luzitina-Cl2 em linhagens de células PC-3 foi medida de acordo com os materiais e métodos descritos anteriormente. A fração de células que sobrevivem com doses de luz de 3 e 6 J/cm2 e tempo de incubação de 24 horas está indicada na Figura 11 para várias concentrações deste fotossensibilizador. De acordo com a Figura 11, a [Luzitina-Cl2] =20 pM causa 100% de morte nas células expostas à dose de luz laser de 6 J/ cm2.

EXEMPLO 12. FOTOTOXICIDADE DA Luzitina-Cl2Et IN VITRO EM LINHAGENS CELULARES DE CARCINOMA DE CÓLON DE RATINHO IRRADIADAS COM LASER

Este exemplo mostra que as Luzitinas são muito tóxicas para as células de carcinoma de cólon de ratinho quando irradiadas com laser, em concentrações nas quais a sua toxicidade no escuro é insignificante.

A citotoxicidade da Luzitina-Cl2Et no escuro para as linhagens de células CT26 (carcinoma de cólon de ratinho) não pôde ser medida em termos de IC50 porque o composto precipita no meio de cultura antes de atingir este nível de citotoxicidade. A concentração de 50 pM é a concentração mais alta de Luzitina-Cl2Et que causa relativamente poucos efeitos na viabilidade desta linhagem de células no escuro.

A atividade fotossensibilizante da Luzitina-Cl2Et em linhagens de células CT26 foi medida de acordo com os materiais e métodos descritos anteriormente. A fração de células que sobrevive com doses de luz de 6 J/cm2 e tempo de incubação de 18 horas está indicada na Figura 12 para várias concentrações deste fotossensibilizador. Esta figura indica que a Luzitina-Cl2Et em concentração de 5 pM causa 90% de morte nas células expostas à dose de luz laser de 6 J/cm2, LD90=5 pM. De acordo com a Figura 12, a [Luzitina- Cl2]=10 pM causa 100% de morte nas células expostas à dose de luz laser de 6 J/cm2. A Tabela 6 indica as concentrações de Luzitina-Cl2Et necessárias para alcançar a LD90 em várias outras linhagens celulares com irradiação de laser de díodo de 6 J/cm2a 28,5 mW.

EXEMPLO 13. FOTOTOXICIDADE DA Luzitina-FMet IN VITRO EM CÉLULAS DE CARCINOMA HUMANO DE CÓLON IRRADIADAS COM LASER

Este exemplo mostra que as Luzitinas são muito tóxicas para as células de carcinoma humano de cólon irradiadas com laser, em concentrações nas quais a sua toxicidade no escuro é insignificante.

A citotoxicidade da Luzitina-FMet no escuro para as linhagens de células HT-29 (adenocarcinoma humano de cólon) não pôde ser medida em termos de IC50 porque o composto precipita no meio de cultura antes de atingir este nível de citotoxicidade. A concentração de 50 pM é a concentração mais alta de Luzitina-FMet que causa relativamente poucos efeitos na viabilidade das linhagens de células testadas no escuro.

A atividade fotossensibilizante da Luzitina-FMet em linhagens de células HT-29 foi medida de acordo com os materiais e métodos descritos anteriormente. A fração de células que sobrevive com doses de luz de 6 J/cm2 e tempo de incubação de 18 horas está indicada na Figura 13 para várias concentrações deste fotossensibilizador. Esta figura indica que a Luzitina-FMet em concentração de 0,5 pM causa 90% de morte nas células expostas à dose de luz laser de 6 J/cm2, LD90=l pM. De acordo com a Figura 13, [Luzitina- FMet] =1 pM causa 100% de morte nas células expostas à dose de luz laser de 6 J/cm2. A Tabela 6 indica as concentrações de Luzitina-FMet necessárias para alcançar a LD90 em várias outras linhagens celulares com irradiação de laser de díodo de 6 J/cm2 a 28,5 mW.

EXEMPLO 14. FOTOTOXICIDADE DA Luzitina-F2Met IN VITRO EM CARCINOMA HUMANO PULMONAR DE NÃO-PEQUENAS CÉLULAS IRRADIADAS COM LASER

Este exemplo mostra que as Luzitinas são muito tóxicas para as células de carcinoma humano pulmonar de não- pequenas células quando irradiado com laser, em concentrações nas quais a sua toxicidade no escuro é insignificante.

A citotoxicidade da Luzitina-F2Met no escuro para as linhagens de células A-549 (cancro de pulmão de não- pequenas células) não pôde ser medida em termos de IC50 porque o composto precipita no meio de cultura antes de atingir este nível de citotoxicidade. A concentração de 50 mM é a concentração mais alta de Luzitina-F2Met que causa relativamente poucos efeitos na viabilidade das linhagens de células testadas no escuro.

A fração de células que sobrevive com doses de luz de 6 J/cm2 e tempo de incubação de 18 horas está indicada na Figura 14 para várias concentrações deste fotossensibilizador. Esta figura indica que a Luzitina- F2Met em concentração de 0,5 pM causa 90% de morte nas células expostas à dose de luz laser de 6 J/cm2, LD90=0,5 pM. De acordo com a Figura 14, [Luzitina-F2Met] =0,5 pM causa 100% de morte nas células expostas à dose de luz laser de 6 J/cm2. A Tabela 6 indica as concentrações de Luzitina-F2Met necessárias para alcançar a LD90 em várias outras linhagens celulares com irradiação de laser de díodo de 6 J/cm2 a 28,5 mW.

EXEMPLO 15. LIMITE DE DETECÇÃO DE FLUORESCÊNCIA

Este exemplo indica a extrema sensibilidade e seletividade de detecção das Luzitinas em amostras biológicas.

Soluções de diferentes concentrações foram preparadas diluindo-se em soro humano uma solução stock 1% de Luzitina-Cl2Et em etanol. As concentrações variaram de 0,2 nM a 10 nM. As amostras foram excitadas a 514 nm no espectrofluorímetro descrito acima usando fendas de 4:5:3: para excitação e emissão. A emissão foi captada na gama do infravermelho conforme indicado na Figura 15.

O limite de detecção foi determinado por meio da equação L.D. = 1 b na qual Sy/X é o desvio padrão da curva de calibragem e b a sua inclinação. Obteve-se o limite de detecção de 0,17 nM (ou 0,2 ng/g).

EXEMPLO 16. TOXICIDADE IN VIVO NO ESCURO

Este exemplo indica que as Luzitinas não são tóxicas para ratinhos em concentrações muito mais altas do que aquelas aprovadas para PDT com fotossensibilizadores disponíveis no comércio.

Os ratinhos foram divididos nos seguintes grupos experimentais: a) 10 animais receberam 2 mg/kg de Luzitina-Cl b) 10 animais receberam 5 mg/kg Luzitina-Cl c) 10 animais receberam 10 mg/kg Luzitina-Cl d) 10 animais receberam 15 mg/kg Luzitina-Cl e) 10 animais receberam 20 mg/kg Luzitina-Cl f) 10 animais não foram tratados e formaram o grupo controlo.

As soluções de Luzitina-Cl (0,5 ml) foram injetadas por via subcutânea e os animais foram observados cuidadosamente durante 30 dias. Nos primeiros 6 dias após a injeção os animais do grupo (e) apresentaram sensibilidade à luz e alguns animais do grupo (d) também apresentaram uma pequena sensibilidade. A sensibilidade nestes animais manifestou-se na forma de aversão à fonte de luz apontada diretamente a eles. Os animais foram pesados regularmente, mas não se observou alteração significativa de peso em nenhum dos animais. Após 30 dias, os animais foram anestesiados com Morbital (Biowet, Polónia), os seus órgãos e amostras de tecidos foram retirados e a morfologia do sangue, assim como a histologia dos órgãos selecionados, foi analisada. Nenhuma alteração foi observada no sangue, nem nos órgãos.

As doses empregadas nestes ensaios de toxicidade no escuro foram 10 vezes maiores do que aquelas recomendadas para uso no caso da Photofrin® e 100 vezes maiores do que as doses empregues com o Foscan®. Mesmo assim, o limite de toxicidade no escuro mensurável em ratos não foi alcançado. Isto evidencia de que se podem empregar doses mais altas de Luzitinas em PDT do que as doses de Photofrin® ou Foscan®.

EXEMPLO 17. BIODISTRIBUIÇÃO DA CLORINA APÓS ADMINISTRAÇÃO IP

Este exemplo indica que as Luzitinas podem atravessar a barreira hematoencefálica duas horas após a administração intraperitonial.

A Luzitina-Cl-c foi administrada na dose de 10 mg/kg em ratos DBA/2 por meio de injeção intraperitonial. A distribuição da clorina nos tecidos foi analisada 2 h após a administração. Os animais foram anestesiados com Morbital (Biowet, Polónia) e alguns dos seus órgãos, incluindo-se o cérebro, foram excisados, pesados e, de seguida, armazenados a -30 °C até à execução de análises posteriores. O teor de pigmentos nas amostras de tecido foi analisado por espectrometria de fluorescência. Para extrair os pigmentos, as amostras de tecido foram homogeneizadas durante 1 min em 7 ml de acetona aquosa a 90%, gelada, usando um homogeneizador de tecidos MPW-120 (Medicai Instruments, Polónia) à velocidade de 10.000 rpm. O material homogeneizado foi centrifugado a 2.000 g durante 10 min a 4 °C, o sobrenadante foi coletado e o pellet foi extraído novamente com acetona aquosa 90% para garantir a recuperação total do pigmento. Os extratos foram reunidos e o seu teor em pigmentos analisado. As amostras foram excitadas a 413 nm e os espectros de fluorescência foram registrados na gama entre 600 e 800 nm. A Figura 16 indica a intensidade de fluorescência proveniente do cérebro, do sangue e do fígado, normalizada para os seus respectivos pesos.

A distribuição do sensibilizador entre o sangue e o cérebro foi de 4:1 duas horas após a administração intraperitonial em ratos DBA/2. Esta é a prova do princípio de que as Luzitinas apropriadas podem atravessar a barreira hematoencefálica em quantidades significativas para se tornarem um fotossensibilizador no cérebro. O exemplo seguinte demonstra que esta classe de sensibilizadores tende a acumular-se em tumores, o que aumenta o número de fotossensibilizadores disponíveis para o tratamento de tumores do cérebro.

EXEMPLO 18. FARMACOCINÉTICA DA BACTERIOCLORINA APÓS ADMINISTRAÇÃO INTRAPERITONIAL

Este exemplo mostra que as Luzitinas, após administração intraperitonial, se acumulam primeiramente nos tumores e, de seguida, são eliminadas a taxas mais baixas.

O modelo tumoral utilizado foi o de células de melanoma Cloudman S91 cultivadas em monocamada em meio RPMI com 5% de soro fetal bovino suplementado com antibióticos. As células foram cultivadas a 37 °C em atmosfera umedecida e com 5% de CO2. As células de melanoma (~lxl06) foram suspendidas em 0,1 ml de solução salina tamponada por fosfato (PBS) e implantadas subcutaneamente no lado direito do dorso do animal. O tumor pode visualizar-se após dez dias da implantação. Os animais foram tratados três semanas após a injeção.

A Luzitina-Cl foi administrada na dose de 10 mg/kg em ratinhos DBA/2 por meio de injeção intraperitoneal. A distribuição da bacterioclorina nos tecidos foi analisada nos seguintes intervalos: 2 h, 6 h, 12 h, 24 h e 48 h após a administração intraperitoneal. Os animais foram anestesiados com cetamina e xilazina, os seus órgãos e amostras de tecido foram excisados, pesados e armazenados a -30 °C até à execução de análises posteriores. O teor de pigmentos nas amostras de tecido foi analisado por espectrometria de fluorescência. Para extrair os pigmentos, as amostras de tecido foram homogeneizadas durante 1 min em 7 ml de solução etanol/DMSO (75:25), gelada, usando um homogeneizador de tecidos MPW-120 (Medicai Instruments, Polónia) à velocidade de 10.000 rpm. O material homogeneizado foi centrifugado a 2.000 g durante 10 min a 4 °C, o sobrenadante foi coletado e o pellet foi extraído novamente com a solução etanol:DMSO para garantir a recuperação total do pigmento. Os extratos foram reunidos e o seu teor em pigmentos analisado. As amostras foram excitadas a 517 nm e os espectros de fluorescência foram registrados na gama entre 600 e 850 nm. A Figura 17 indica a intensidade de fluorescência proveniente do tumor e de vários órgãos normalizada para os seus respectivos pesos.

Existe acumulação significativa deste fotossensibilizador no tumor um dia após a administração intraperitoneal, quando ele alcança uma concentração 3 vezes maior do que aquela em músculo. Adicionalmente, a acumulação na pele é insignificante, o que explica a ausência de fotossensibilidade dos ratinhos nos estudos de toxicidade no escuro. Por último, o fotossensibilizador foi eliminado da maioria dos órgãos em 24 h. Tais farmacocinéticas são muito favoráveis para a seleção da janela temporal do tratamento com PDT, na qual os efeitos secundários são reduzidos e a eficácia do tratamento é levada ao máximo.

Estudos similares foram realizados com outras Luzitinas e a Luzitina-Cl2Et apresentou seletividade muito forte para o tumor comparada àquela para o músculo (Figura 18) .

EXEMPLO 19. PDT DE CARCINOMA DE CÓLON EM RATINHOS Balb/C USANDO Luzitina-FMet

Este exemplo indica que as Luzitinas promovem regressão/necrose do tumor quando expostas à luz de comprimento de onda apropriado.

O modelo tumoral foi o carcinoma de cólon de ratinho CT26 cultivado em monocamada em meio RPMI com 5% de soro fetal bovino e suplementado com antibióticos. As células foram cultivadas a 37 °C em atmosfera umedecida e com 5% de C02. As células de carcinoma (~lxl06) foram suspendidas em 0,1 ml de solução salina tamponada por fosfato (PBS) e implantadas subcutaneamente no lado direito do dorso dos ratinhos Balb/C. O tumor cresceu e alcançou 5 mm de diâmetro aproximadamente uma semana após a implantação. Nenhuma necrose espontânea foi observada. 0 tratamento foi iniciado quando o tumor atingiu 5 mm de diâmetro em cada um dos animais. No dia em que os tumores alcançaram o tamanho para o tratamento, injetou-se nos ratinhos uma dose de 10 mg/kg de Luzitina-FMet em PEG400 por via intraperitonial. 24 h após a injeção, quatro ratos foram anestesiados com cetamina e xilazina, e tratados com o laser de díodo Hamamatsu de 74 8 nm descrito anteriormente em taxa de fluência de 100 mW/cm2 durante 22 minutos (fluência total de 132 J/cm2) . Outros quatro ratos não foram tratados e serviram de controlo. Os ratos foram controlados diariamente, duas medições ortogonais L e W (perpendicular a L) foram feitas nos tumores, e os seus respectivos volumes foram calculados por meio da fórmula V=LxW2/2 e registrados.

A Figura 19 mostra o volume relativo do tumor medido em dias diferentes após terem sido irradiados com laser. Os tamanhos dos tumores nos animais tratados são menores do que os tamanhos médios dos tumores dos animais controlo e, num dos casos, o tumor desapareceu completamente.

EXEMPLO 20. PDT DE CÉLULAS DE MELANOMA EM RATINHOS DBA/2 USANDO Luzitina-Cl2Et

O modelo tumoral foi o de células de melanoma Cloudman S91 cultivadas em monocamada em meio RPMI com 5% de soro fetal bovino e suplementado com antibióticos. As células foram cultivadas a 37 °C em atmosfera umedecida e com 5% de CO2. As células de melanoma (~lxl06) foram suspendidas em 0,1 ml de solução salina tamponada por fosfato (PBS) e implantadas subcutaneamente no lado direito do dorso dos ratinhos DBA/2. O tumor cresceu e alcançou 5 mm de diâmetro aproximadamente uma semana após a implantação. Nenhuma necrose espontânea foi observada. O tratamento foi iniciado quando o tumor atingiu 5 mm de diâmetro em cada um dos animais. No dia em que os tumores alcançaram o tamanho para o tratamento, injetou-se nos ratos uma dose de 10 mg/kg de Luzitina-Cl2Et em PEG400 por via intraperitonial. 24 h após a injeção, os ratinhos foram anestesiados com cetamina e xilazina, imobilizados num suporte plástico e, de seguida, tratados com diferentes doses de luz com o laser de díodo Hamamatsu de 748 nm descrito anteriormente. Alguns minutos após a irradiação, a zona do tumor apresentou sinais evidentes de necrose, que se alargaram para toda a zona irradiada após algumas horas. Os ratos foram controlados diariamente e o tamanho dos tumores foi medido e registrado. A Figura 20 indica o tamanho do tumor medido em dias diferentes após terem sido irradiados com laser. Observa-se nitidamente que uma única sessão de tratamento promoveu uma regressão durável do tumor.

EXEMPLO 21. FORMULAÇÕES PARA ADMINISTRAÇÃO TÓPICA

Este exemplo indica que as Luzitinas podem difundir-se rapidamente através da pele quando aplicadas com uma formulação transdérmica apropriada. Quatro Porcos Miniatura foram empregues para testar a difusão através da pele do fotossensibilizador Luzitina-FMet e avaliar os possíveis efeitos secundários das formulações para administração tópica.

Primeiro, dissolveu-se o fotossensibilizador em etanol absoluto (5 mg em 0,556 ml). De seguida, adicionaram-se 1,737 ml de propilenoglicol e, por último, 0,22 ml de Azone® e 0,3 ml de água. A mistura foi agitada vigorosamente em misturador vortex e mantida em banho de ultra-sons para facilitar a solubilização e, de seguida, adicionada ao gel de base composto de água (76,65%), 96% de etanol (15%), glicerina (6%), trietanolamina (1,35%) e carbopol 940 (1%). A formulação foi misturada cuidadosamente para se conseguir uma boa homogeneização. Nesta formulação, a concentração final do fotossensibilizador é de 0,1% e a de Azone® é de 4%.

O tratamento dos animais foi descrito acima. As formulações foram aplicadas com a mão, protegidas com luvas cirúrgicas, em zonas determinadas previamente e enquanto os animais estavam calmos sob o efeito do anestésico. Cada aplicação abrangeu uma zona circular de aprox. 3 cm de diâmetro com alguns milímetros de espessura do gel. A aplicação foi coberta com um penso oclusivo. Em alguns animais, repetiu-se o mesmo procedimento 3 horas mais tarde numa outra zona do dorso. Num dos animais, as formulações foram removidas 6 h após a aplicação, o dorso do animal foi limpo e ele foi mantido vivo durante 10 dias para avaliação subsequente. As amostras de pele foram recolhidas conforme descrito anteriormente. Cada amostra era aproximadamente retangular, com lados de 2 cm e espessura de 1 cm. Nenhum dos animais, particularmente o animal mantido vivo, mostrou evidências de efeitos secundários causados pela formulação com ou sem quaisquer dos sensibilizadores.

Após o procedimento de fixação, cada uma das amostras foi cortada em fatias para avaliação por microscopia de fluorescência e microscopia confocal. Um exemplo representativo das imagens obtidas das amostras está indicada na Figura 21. As imagens revelam que, no intervalo de 3 h da aplicação do gel, a Luzitina-FMet se difundiu através de toda a epiderme. A fluorescência da Luzitina- FMet também foi confirmada pelo seu espectro de absorção mostrado na Figura 22. Assim, pode obter-se uma composição para aplicação tópica de Luzitinas que se difunde através do stratum corneum e da epiderme em algumas horas, o que é muito conveniente para PDT de distúrbios cutâneos. (1) K. Berg, in H. Hõnigsmann, G. Jori, A.R. Young (Eds.), The Fundamental Bases of Phototherapy. OEMF spa, Milano, 1996, p. 181-207. (2) R.V. Bensasson, E.J. Land, T.G. Truscott: Excited States and Free Radicals in Biology and Medicine, Oxford Univ. Press, Oxford, 1993. (3) Y. Vakrat-Haglili, L. Weiner, V. Brumfeld, A. Brandis, Y. Salomon, B. McIlroy, B.C. Wilson, A. Pawlak, M. Rozanowska, T. Sarna, A. Scherz, J. Am. Chem. Soc. 127 (2005) 6487. (4) M. Pineiro, A.L. Carvalho, M.M. Pereira, A.M.d.A.R. Gonsalves, L.G. Arnaut, S.J. Formosinho, Chem. Eur. J. 4 (1998) 2299. (5) T.J. Dougherty, D.G. Boyle, K.R. Weishaupt: Photodynamic Therapy--Clinical and Drug Advances, Porphyrin Photosensitization, Plenum Press, New York, 1983. (6) T.J. Dougherty, C.J. Gomer, B.W. Henderson, G. Jori, D. Kessel, M. Korbelik, J. Moan, Q. Peng, J. Natl. Cancer Inst. 90 (1998) 889. (7) R.L. Lipson, E.J. Baldes, A.M. Olsen, J. Natl. Cancer Inst. 26 (1961) 1. (8) T.J. Dougherty, D.G. Boyle, K.R. Weishaupt, B. Henderson, W. Potter, D.A. Bellnier, K.E. Wityk, Adv. Exp. Biol. Med. 160 (1983) 3. (9) R.K. Pandey, M.M. Siegel, R. Tsao, J.M. McReynolds, T.J. Dougherty, Biomed. And Environ. Mass Spectrometry 19 (1990) 405. (10) R. Bonnett, G. Martinez, Tetrahedron 57 (2001) 9513 . (11) E.D. Sternberg, D. Dolphin, C. 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Claims

1. Processo para a preparação de um derivado de clorina ou de bacterioclorina com a seguinte fórmula:

Fórmula (I) na qual: representa uma ligação carbono-carbono simples ou dupla; X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, x8 são, cada um, halogênios (F, Cl'Br) e átomos de hidrogênio selecionados independentemente, contanto que simultaneamente X2, X4, Xse X8 ou que todos de X1, X3, x5 e X7 sejam halogênios, ou que todos os X sejam halogênios; Ri, R2, R3, R4, R5, Rs, R7, Rg são selecionados independentemente entre H, -OH e -SO2R, onde R é selecionado independentemente entre -Cl, -OH, -aminoácido, -0Rn, -NHRn e -NR211, nos quais Rn é um alquil com 1 a 12 átomos de carbono; Y é um flúor ou hidrogênio; caracterizadopor compreender a seguinte etapa: (i) a redução no estado sólido da porfirina substituída correspondente em derivado de clorina ou derivado de bacterioclorina usando hidrazidas na ausência de solventes e, opcionalmente, na ausência de bases; na qual a porfirina substituída correspondente tem a fórmula:

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de um derivado de clorina ou de bacterioclorina com a seguinte fórmula:

na qual: representa uma ligação carbono-carbono simples ou dupla; X2 são selecionados a partir de halogênios (F, Cl, Br), X1 são selecionados entre hidrogênio ou halogênios (F, Cl, Br) , e R' são -SO2R; R são, cada um, selecionados independentemente entre - Cl, -OH, -aminoácido, -0Rn, -NHRn e -NR211, nos quais Rn é um alquil com 1 a 12 átomos de carbono; caracterizadopor compreender a seguinte etapa: (i) a redução no estado sólido da porfirina substituída correspondente em derivado de clorina ou derivado de bacterioclorina usando hidrazidas na ausência de solventes e, opcionalmente, na ausência de bases; em que a porfirina substituída correspondente tem a fórmula: