WO2022100750A1

WO2022100750A1 - 可用于光动力治疗或诊断的制剂

Info

Publication number: WO2022100750A1
Application number: PCT/CN2021/130873
Authority: WO
Inventors: 柳欣
Original assignee: 北京厚燊维康科技有限责任公司
Priority date: 2020-11-16
Filing date: 2021-11-16
Publication date: 2022-05-19
Also published as: CN114504551A; CN114504551B

Abstract

属于医药技术领域，涉及可用于光动力治疗或诊断的制剂。特别地，涉及一种制剂，所述制剂以式(I)所示的化合物、其药学上可接受的盐或酯、前药、立体异构体、水合物、溶剂合物、晶型、同位素标记物、它们的代谢物形式、或它们的任意组合或混合物作为活性成分；所述制剂为液体制剂。所述制剂可用于对疾病进行光动力治疗或光动力诊断，或用于通过光动力治疗对皮肤进行美容。

Description

可用于光动力治疗或诊断的制剂

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及包含二酮类化合物的制剂及其在光动力治疗或诊断中的用途。

背景技术

光动力治疗(Photodynamic Therapy)是一种光化学疗法，其基于光敏剂敏化诱导氧气产生以单线态氧为代表的活性氧物种(ROS)，可以对肿瘤细胞或病原微生物等产生杀伤作用，以达到治疗疾病的目的。光动力治疗是一种新型疗法，目前已经应用在了包括：肿瘤、尖锐湿疣、痤疮及鲜红斑痣的部分临床治疗当中。其中，对比肿瘤治疗的传统疗法，光动力治疗具有：操作方便、选择性高以及副作用小的显著优势。此外，光动力治疗还可用于皮肤美容。光动力诊断是指在光的作用下，利用对病变组织有亲和作用的光敏剂的特征光谱来诊断疾病。光动力诊断已经被应用于肿瘤、尖锐湿疣、痤疮及鲜红斑痣的诊断中。

光动力治疗或诊断的基本要素是氧、光敏剂和光。其中光敏剂是光动力治疗或诊断的关键，理想的光敏剂需要满足无毒、廉价易得、光化学性质良好、代谢速度快等要求。目前在临床研究中应用最广泛的是基于卟啉和/或酞菁结构的光敏剂。然而，由于这类光敏剂大π共轭环系的存在，其分子间具有很强的π-π堆积作用，导致卟啉和/或酞菁类分子很容易发生聚集而使得其光化学效率降低，大大限制了其在临床上的应用。因此，寻求具有良好光化学性质的新型光敏剂分子将有助于推动光动力治疗或诊断在临床中的应用，不仅具有重要的研究意义，也具有潜在的应用价值。

发明内容

本申请的发明人通过深入研究，创造性地发现了，某些二酮类化合物受光照激发后，可诱导氧气产生单线态氧和/或过氧自由基等活性氧物种，从而表现出显著抗肿瘤、抗微生物活性以及增强免疫作用，可用于疾病的光动力治疗或光动力诊断，还可用于利用光动力治疗对皮肤进行美容。

影响药物被皮肤吸收的主要因素包括药物在皮肤内外分配，药物的饱和程度，皮肤角质层的软化，药物移动，皮肤润湿程度等。本发明选择特定的药物辅料，与二酮类化合物组成药物制剂，以提高药物的表皮暴露量，促进药物被皮肤吸收，达到更好的治疗、诊断或美容效果，由此提供了下述发明。

在一个方面，本申请提供了一种制剂，所述制剂以式(I)所示的化合物、其药学上可接受的盐或酯、前药、立体异构体、水合物、溶剂合物、晶型、同位素标记物、它们的代谢物形式、或它们的任意组合或混合物作为活性成分；所述制剂为液体制剂；

其中，R ¹和R ²各自独立地选自C ₁-C ₆直链或支链烷基，卤代C ₁-C ₆直链或支链烷基，羟基，以及任选地被一个或多个(例如2个、3个、4个或5个)相同或不同的取代基取代的下列基团：C ₆-C ₁₄芳基、5-6元杂芳基、5-6元杂环基、3-6元环烷基，所述取代基各自独立地选自：羟基、羧基、磺酸基、卤素(例如氟、氯、溴或碘)原子、氨基、巯基、硝基、-C(O)O-(C ₁-C ₄直链或支链烷基)、-S(O) ₂O-(C ₁-C ₄直链或支链烷基)、-O-(C ₁-C ₄直链或支链烷基)；

所述制剂还包含以下成分中的一种或多种：水、具有2～3个碳原子的一元或多元醇(例如丙二醇、乙醇或异丙醇)、二乙二醇单乙基醚(Transcutol)。在一些实施方案中，所述制剂中的活性成分的重量百分比为0.01％-99.9％(例如0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-1％、1％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％、90％-99.5％、99.5％-99.9％)。

在一些实施方案中，所述制剂包含水，其重量百分比为0.01％-99.9％(例如0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-1％、1％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％、90％-99.5％、99.5％-99.9％)。

在一些实施方案中，所述制剂包含具有2～3个碳原子的一元或多元醇(例如丙二醇、乙醇或异丙醇)，其重量百分比为0.01％-99.9％(例如0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-1％、1％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％、90％-99.5％、99.5％-99.9％)。

在一些实施方案中，所述制剂包含二乙二醇单乙基醚(Transcutol)，其重量百分比为0.01％-99.9％(例如0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-1％、1％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％、90％-99.5％、99.5％-99.9％)。

在一些实施方案中，所述制剂中包含活性成分和水，其中，所述活性成分的重量百分比为3％-10％、10％-20％或20％-25％，水的重量百分比为75％-97％(例如75％-80％、80％-90％或90％-97％)。

在一些实施方案中，所述制剂包含活性成分和具有2～3个碳原子的一元或多元醇(例如丙二醇、乙醇或异丙醇)，其中，所述活性成分的重量百分比为20％-50％(例如 20％-30％、30％-40％或40％-50％)，所述具有2～3个碳原子的一元或多元醇(例如丙二醇、乙醇或异丙醇)的重量百分比为50％-80％(例如50％-60％、60％-70％或70％-80％)。

在一些实施方案中，所述制剂包含活性成分、水和具有2～3个碳原子的一元或多元醇(例如丙二醇、乙醇或异丙醇)，其中，所述活性成分的重量百分比为10％-20％，水的重量百分比为40％-71％(例如40％-50％、50％-60％、60％-70％或70％-71％)，所述具有2～3个碳原子的一元或多元醇(例如丙二醇、乙醇或异丙醇)的重量百分比为9％-40％(例如9％-10％、10％-20％、20％-30％或30％-40％)。

在一些实施方案中，所述制剂包含活性成分和二乙二醇单乙基醚(Transcutol)，任选地还包含水或具有2～3个碳原子的一元或多元醇(例如丙二醇、乙醇或异丙醇)，其中，活性成分和二乙二醇单乙基醚(Transcutol)的重量百分比各自独立地为20％-40％(例如20％-30％或30％-40％)。

在一些实施方案中，所述制剂还包含一种或多种其他药学上可接受的辅料(例如载体、稳定剂或增溶剂)。

在某些实施方案中，所述式(I)所示的化合物、其药学上可接受的盐或酯、前药、立体异构体、水合物、溶剂合物、晶型、同位素标记物、它们的代谢物形式、或它们的任意组合或混合物是所述制剂中的唯一活性成分。

在某些实施方案中，所述C ₁-C ₆直链或支链烷基为C ₁-C ₄直链或支链烷基。

在某些实施方案中，所述C ₁-C ₄直链或支链烷基选自：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基。

在某些实施方案中，所述C ₆-C ₁₄芳基为苯基或萘基。

在某些实施方案中，所述卤代C ₁-C ₆直链或支链烷基为氟代、氯代、溴代或碘代的C ₁-C ₆直链或支链烷基。在某些实施方案中，所述卤代C ₁-C ₆直链或支链烷基为卤代C ₁-C ₄直链或支链烷基，例如氟代甲基、溴代甲基、氯代甲基、氟代乙基、溴代乙基或氯代乙基。

本文中的“卤代”包括被一个或多个(例如2个、3个、4个或5个)卤素原子(例如氟、氯、溴或碘)取代。

在某些实施方案中，所述氟代甲基选自-CH ₂F、-CHF ₂、-CF ₃。在某些实施方案中，所述溴代甲基选自-CH ₂Br、-CHBr ₂、-CBr ₃。

在某些实施方案中，所述氯代甲基选自-CH ₂Cl、-CHCl ₂、-CCl ₃。

在某些实施方案中，所述氟代乙基选自一氟代乙基、二氟代乙基、三氟代乙基、四氟代乙基或全氟乙基。

在某些实施方案中，所述溴代乙基选自一溴代乙基、二溴代乙基、三溴代乙基、四溴代乙基或全溴乙基。

在某些实施方案中，所述氯代乙基选自一氯代乙基、二氯代乙基、三氯代乙基、四氯代乙基或全氯乙基。

在某些实施方案中，所述5-6元杂芳基含有1-3个选自氮、氧或硫的环原子。在某些实施方案中，所述5-6元杂芳基选自：呋喃基、噻吩基、吡咯基、恶唑基、异恶唑基、咪唑基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基。

在某些实施方案中，所述5-6元杂环基含有1-3个选自氮、氧或硫的环原子。在某些实施方案中，所述5-6元杂环基选自：氮杂环丙烷基、二氮杂环丙烷基、氮杂环丁烷基、二氧杂环己烷基、二氧杂环戊烷基、四氢呋喃基、吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、四氢噻吩基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、六氢嘧啶基、六氢哒嗪基。当所述杂芳基或杂环基含有多个杂原子时，所述多个杂原子可以相同或不同。

在某些实施方案中，R ¹选自C ₁-C ₄直链或支链烷基(例如甲基、乙基)、C ₆-C ₁₄芳基(例如苯基)。

在某些实施方案中，R ²选自C ₁-C ₄直链或支链烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基)、卤代C ₁-C ₄直链或支链烷基(例如溴代甲基、溴代乙基)、羟基。

在某些实施方案中，R ¹为C ₁-C ₄直链或支链烷基(例如甲基、乙基)，R ²为C ₁-C ₄直链或支链烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基)。

在某些实施方案中，R ¹选自C ₁-C ₄直链或支链烷基(例如甲基、乙基)、苯基，R ²为羟基。

在某些实施方案中，R ¹为C ₁-C ₄直链或支链烷基(例如甲基、乙基)，R ²为卤代C ₁-C ₄直链或支链烷基(例如溴代甲基)。

在某些实施方案中，R ¹和R ²为苯基，所述苯基任选地被一个或多个相同或不同的取代基取代。

在某些实施方案中，R ¹和R ²各自独立地为5-6元含氮杂芳基，所述5-6元含氮杂芳基任选地被一个或多个相同或不同的取代基取代。

本文中的“任选地被……取代”表示可以被取代，也可以不被取代。

在某些实施方案中，R ¹和R ²为相同的基团。

在某些实施方案中，R ¹和R ²为不同的基团。

在某些实施方案中，所述化合物选自：

在某些实施方案中，所述化合物为丁二酮，其结构式为

在某些实施方案中，所述液体制剂被用于光动力治疗或光动力诊断。

在一个方面，本申请提供了组合物在制备药物中的用途，所述组合物包含式(I)所示的化合物、其药学上可接受的盐或酯、前药、立体异构体、水合物、溶剂合物、晶型、同位素标记物、它们的代谢物形式、或它们的任意组合或混合物，所述组合物为液体制剂，所述药物用于疾病的光动力治疗或光动力诊断，或用于通过光动力治疗对皮肤进行美容。

在本发明的某些实施方案中，所述光动力治疗通过包括以下步骤的方法进行：

步骤I：将所述液体制剂给受试者施用；以及

步骤II：以光对受试者进行照射。

在某些实施方案中，步骤I中，通过涂抹、贴敷或微针所述液体制剂给受试者施用。

步骤II中，可以使用具有单一波长的光，也可以使用混合光。

在某些实施方案中，步骤II中，所述光的至少部分波长在10nm-1mm的范围内，例如在10nm-380nm、380-780nm、780nm-3μm、3μm-30μm和30μm-1mm的一个或多个范围内。在某些实施方案中，所述光的至少部分波长在400nm-480nm(例如410nm、420nm、430nm、440nm、450nm、460nm、470nm)的范围内。在某些实施方案中，所述光的至少部分波长在450nm-480nm的范围内。

在某些实施方案中，步骤II中，照射的时间为1s-12h，例如1s-10s、10s-100s、100s-200s、200s-500s或500s-900s，例如1min-10min、10min-30min或30min-60min，例如1h-2h、2h-5h或5h-12h。

在某些实施方案中，步骤II中，以1-2000mW/cm ²(例如1-15mW/cm ²、15mW/cm ²-50mW/cm ²、50mW/cm ²-100mW/cm ²、100mW/cm ²-200mW/cm ²、200mW/cm ²-300mW/cm ²、300mW/cm ²-500mW/cm ²、500mW/cm ²-1000mW/cm ²、1000mW/cm ²-1500mW/cm ²或1500mW/cm ²-2000mW/cm ²)的光照强度进行照射。

在某些实施方案中，步骤II包括：以光对受试者体内或体表所希望进行治疗的位点(例如发生病变的部位)进行照射，或者以光对受试者全身进行照射。

在另一方面，本申请提供了一种诊断或治疗受试者中的疾病的方法，所述方法包括使用上述任一项的液体制剂作为光敏剂的步骤。

在某些实施方案中，所述方法包括如上任一项定义的步骤I和步骤II。

在另一方面，本申请提供了一种对受试者进行皮肤美容的方法，所述方法包括使用上述任一项定义的液体制剂作为光敏剂的步骤。在某些实施方案中，所述皮肤美容不以治疗为目的。

在某些实施方案中，所述方法包括以下步骤：

步骤I’：将上述任一项的液体制剂施用到受试者的皮肤上；以及

步骤II’：以光对所述皮肤进行照射。步骤II’中，可以使用具有单一波长的光，也可以使用混合光。

在某些实施方案中，步骤II’中，所述光的至少部分波长在10nm-1mm的范围内，例如在10nm-380nm、380-780nm、780nm-3μm、3μm-30μm和30μm-1mm的一个或多个范围内。在某些实施方案中，所述光的至少部分波长在400nm-480nm的范围内。在某些实施方案中，所述光的至少部分波长在450nm-480nm的范围内。

在某些实施方案中，步骤II’中，照射的时间为1s-12h，例如1s-10s、10s-100s、100s-200s、200s-500s或500s-900s，例如1min-10min、10min-30min或30min-60min，例如1h-2h、2h-5h或5h-12h。

在某些实施方案中，步骤II’中，以1-2000mW/cm ²(例如1-15mW/cm ²、15mW/cm ²-50mW/cm ²、50mW/cm ²-100mW/cm ²、100mW/cm ²-200mW/cm ²、200mW/cm ²-300mW/cm ²、300mW/cm ²-500mW/cm ²、500mW/cm ²-1000mW/cm ²、1000mW/cm ²-1500mW/cm ²或1500mW/cm ²-2000mW/cm ²)的光照强度进行照射。

进一步地，本发明的皮肤美容的方法还可以与其他皮肤美容的方法联合使用，例如，可与使用红蓝光治疗仪的皮肤美容方法(例如光子嫩肤)联合使用，在改善与微生物感染相关的皮肤症状(例如痤疮)的同时，又可以修复真皮组织。

在另一方面，本申请提供了上述任一项的液体制剂与光联合用于治疗或诊断受试者中的疾病的用途。

所述光可以是具有单一波长的光，也可以是混合光。

在某些实施方案中，所述光的至少部分波长在10nm-1mm的范围内，例如在10nm-380nm、380-780nm、780nm-3μm、3μm-30μm和30μm-1mm的一个或多个范围内。在某些实施方案中，所述光的至少部分波长在400nm-480nm(例如410nm、420nm、430nm、440nm、450nm、460nm、470nm)的范围内。在某些实施方案中，所述光的至少部分波长在450nm-480nm的范围内。

在某些实施方案中，所述治疗通过包括如上任一项定义的步骤I和步骤II的方法进行。

在另一方面，本申请提供了上述任一项的液体制剂与光联合用于皮肤美容的用途。在某些实施方案中，所述皮肤美容不以治疗为目的。

所述光可以是具有单一波长的光，也可以是混合光。

在某些实施方案中，所述光的至少部分波长在10nm-1mm的范围内，例如在 10nm-380nm、380-780nm、780nm-3μm、3μm-30μm和30μm-1mm的一个或多个范围内。在某些实施方案中，所述光的至少部分波长在400nm-480nm(例如410nm、420nm、430nm、440nm、450nm、460nm、470nm)的范围内。在某些实施方案中，所述光的至少部分波长在450nm-480nm的范围内。

在某些实施方案中，所述皮肤美容通过包括如上任一项定义的步骤I’和步骤II’的方法进行。

本发明所涉及的液体制剂可以被用于在受试者中治疗或诊断选自下列的疾病：

(i)肿瘤及并发疾病；

(ii)微生物或寄生虫感染相关疾病；

(iii)免疫相关疾病；

在某些实施方案中，所述肿瘤及并发疾病选自乳腺癌、黑色素瘤、脑膜瘤、软组织肉瘤、唾液腺肿瘤、阴茎癌、舌癌、上颌窦癌、甲状腺癌、恶性淋巴瘤、睾丸肿瘤、鼻咽癌、喉癌、口腔癌、宫颈癌、外阴癌、皮肤癌、卡波西肉瘤、非黑色素瘤皮肤癌(包括鳞状细胞癌和基底细胞癌)、血管瘤及这些疾病的继发性并发症(例如，疼痛、感染、心包积液、胸腔积液)。

在某些实施方案中，所述微生物选自：

细菌(例如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌、炭疽杆菌、淋病奈瑟菌、痤疮丙酸杆菌以及丙沙门杆菌)，

病毒(例如腮腺炎病毒、风疹病毒、人乳头状病毒、水痘带状疱疹病毒)，

真菌(例如白色念珠菌、红色毛癣菌、絮状表皮癣菌)，

支原体(例如溶脲脲原体、人型支原体、生殖器支原体)，

衣原体(例如沙眼衣原体)，

立克次氏体(例如普氏立克次氏体、莫氏立克次氏体、立克次氏立克次氏体)，

放线菌(例如以色列放线菌)，

螺旋体(例如梅毒螺旋体)。

在某些实施方案中，所述寄生虫选自：阴道毛滴虫、阿米巴虫、杜氏利什曼原虫、丝虫、疥螨、毛囊螨、虱子、跳蚤。

在某些实施方案中，所述微生物或寄生虫感染相关疾病选自：由大肠杆菌引起的肠道外感染、细菌性和阿米巴性痢疾、淋病、梅毒、炭疽、黑热病、丝虫病、流行性腮腺炎、风疹、非淋菌性尿道炎、支原体宫颈炎、沙眼、流行性斑疹伤寒、地方性斑疹伤寒、落矶山斑疹伤寒、立克次氏痘、恙虫病、癣病(例如花斑癣、掌黑癣、毛结节菌病、足癣、手癣、体癣、股癣、甲癣、头癣)、孢子丝菌病、着色芽生菌、念珠菌病、曲霉病、隐球菌病、接合菌病、马内菲青霉病、尖锐湿疣、带状疱疹、痤疮。

在某些实施方案中，所述免疫相关疾病选自：

继发性免疫缺陷：例如感染(例如风疹、球孢子菌感染)

自身免疫疾病：例如系统性红斑狼疮、硬皮病、皮肤病。

进一步地，本发明所涉及的液体制剂可以被用于治疗或诊断受试者的癌前病变或皮肤疾病，或用于皮肤美容。

在某些实施方案中，所述癌前病变选自乳头状病毒感染导致的宫颈癌癌前病变以及以下癌症的癌前病变：乳腺癌、黑色素瘤、脑膜瘤、软组织肉瘤、唾液腺肿瘤、阴茎癌、舌癌、上颌窦癌、甲状腺癌、恶性淋巴瘤、睾丸肿瘤、鼻咽癌、喉癌、口腔癌、宫颈癌、外阴癌、皮肤癌、卡波西肉瘤、非黑色素瘤皮肤癌(包括鳞状细胞癌和基底细胞癌)。

在某些实施方案中，所述皮肤疾病选自尖锐湿疣、与微生物感染相关的痤疮、鲜红斑痣、日光性角化病、皮肤癌、皮肤癌前期病变、皮肤良性增生性疾病。

在某些实施方案中，所述皮肤美容选自：去除色素性皮损(例如黄褐斑、雀斑等)、去除角质、改善与微生物感染相关的痤疮。

在另一方面，本申请还涉及一种抑制肿瘤细胞、微生物或寄生虫的活性的方法，所述方法包括：

步骤i：将如上任一项所定义的液体制剂施加到所述肿瘤细胞、微生物或寄生虫上；以及

步骤ii：以光对所述肿瘤细胞、微生物或寄生虫进行照射。

所述方法可以在受试者体内或体外进行，并且可以用于治疗目的或非治疗目的。在某些实施方案中，所述方法用于非治疗目的，并且在体外进行。例如，所述方法可用于抑制人体或动物体体表(不包括伤口和感染部位)或物体表面的微生物或寄生虫的活性；或者，所述方法用于以研究为目的开展的体外实验中。

在某些实施方案中，所述肿瘤细胞选自：乳腺癌细胞、黑色素瘤细胞、脑膜瘤细胞、软组织肉瘤细胞、唾液腺肿瘤细胞、阴茎癌细胞、舌癌细胞、上颌窦癌细胞、甲状腺癌细胞、恶性淋巴瘤细胞、睾丸肿瘤细胞、鼻咽癌细胞、喉癌细胞、口腔癌细胞、宫颈癌细胞、外阴癌细胞、皮肤癌细胞、卡波西肉瘤细胞、非黑色素瘤皮肤癌(包括鳞状细胞癌和基底细胞癌)细胞、血管瘤细胞。

在某些实施方案中，所述微生物选自：

真菌(例如白色念珠菌、红色毛癣菌、絮状表皮癣菌)，

支原体(例如溶脲脲原体、人型支原体、生殖器支原体)，

衣原体(例如沙眼衣原体)，

放线菌(例如以色列放线菌)，

螺旋体(例如梅毒螺旋体)。

本申请中，所述受试者优选哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物，例如，人。

术语定义

本发明中，术语“光动力治疗”是指一种光化学疗法，其基于光敏剂敏化诱导氧气产生以单线态氧为代表的活性氧物种(ROS)，可以对肿瘤细胞或病原微生物等产生杀伤作用，以达到治疗疾病的目的，还可用于皮肤美容，例如除皱、消除皮肤松弛、去除色素性皮损、去除皮肤增生物、去除角质等。

本发明中，术语“光动力诊断”是指一种光化学诊断方法，其通过在光的作用下，利用对肿瘤或其他病变组织有亲和作用的光敏剂的特征光谱来诊断疾病。

本发明中，术语“单一波长光”是指光谱强度分布的峰的半值宽度为10nm以下的光。

本发明中，术语“混合光”是指由多个具有单一波长的光混合得到的光。

本发明中，术语“光敏剂”是指这样的化学物质，其能够吸收特定波长的光的能量，并将能量传递给其它分子，从而产生活性氧等可以对细胞或微生物等产生杀伤作用的物质。

本发明中，术语“微生物”包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物、显微藻类等难以用肉眼观察的微小生物。引起人或动物致病的微生物叫病源微生物，通常包括真菌、放线菌、螺旋体、细菌、立克次体、衣原体、病毒、支原体。

发明的有益效果

本发明中所采用的制剂包含有机小分子二酮类光敏剂，分子间聚集效应弱，毒性低，水溶性好，在水相中仍能保持良好的光化学性质，并且廉价易得。本发明所采用的制剂能够在光激发下实现下述的至少一种技术效果：

(1)抑制肿瘤细胞活性；

(2)抑制细菌等微生物的活性；

(3)增强免疫；

(4)具备良好的生物利用度；

(5)具备良好的安全性；

本发明能够用于治疗肿瘤，或由微生物或寄生虫感染引起的疾病，并能用于增强免疫，还可用于皮肤美容，具有重要的临床价值。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是，本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1显示了实验例3中，BALB/C小鼠治疗2周中，小鼠肿瘤组织的体积变化。如图所示，从给药14天后，高浓度治疗组与对照组存在极显著性差异(p<0.001)，低浓度治疗组与对照组存在极显著性差异(p<0.001)。肿瘤大小得到控制并有减小的情况出现，高浓度治疗组效果更加突出。此实验表明二酮类化合物对肿瘤存在抑制作用。

图2显示了实验例3中，BALB/C小鼠治疗2周后，小鼠肿瘤组织的重量变化。如图所示，二酮类化合物从给药14天后，高浓度治疗组与对照组存在极显著性差异(p<0.001)，低浓度治疗组与对照组存在极显著性差异(p<0.001)。治疗组肿瘤的重量比出现明显的生长抑制情况，高浓度治疗组具有更好的肿瘤抑制效果。此实验表明二酮类化合物对肿瘤存在抑制作用。

图3显示了实验例3中，BALB/C小鼠治疗2周后，小鼠肿瘤组织中B细胞数量。如图所示，二酮类化合物从给药14天后，高浓度治疗组与对照组存在极显著性差异(p<0.001)，低浓度治疗组与对照组存在极显著性差异(p<0.01)。治疗组肿瘤组织中B细胞数量显著增加，高浓度治疗组具有更好的增强免疫作用。

图4显示了实验例3中，BALB/C小鼠治疗2周后血液中天冬氨酸转氨酶的含量。

图5显示了实验例3中，BALB/C小鼠治疗2周后血液中尿素氮的含量。

图6显示了实验例3中，BALB/C小鼠治疗2周后血液中肌酸激酶的含量。

图7显示了实验例4中，BALB/C小鼠治疗2周中的体重变化。

图8显示了实验例4中，BALB/C小鼠治疗2周后血液中天冬氨酸转氨酶的含量。

图9显示了实验例4中，BALB/C小鼠治疗2周后血液中尿素氮的含量。

图10显示了实验例4中，BALB/C小鼠治疗2周后血液中肌酸激酶的含量。

图11显示了实验例5中，不同浓度实验光敏剂组，在避光与光照给药条件下，对Hela人宫颈癌细胞的毒性。给药浓度为6×10 ^-3mol/L、3×10 ^-6mol/L、6×10 ^-7mol/L、6×10 ^-9mol/L、3×10 ^-9mol/L、6×10 ^-10mol/L。如图所示，在避光给药条件下，对Hela的细胞毒性较小，表明二酮类化合物具有良好的安全性。在光照给药条件下，对Hela的细胞毒性较大，与避光给药条件下的细胞毒性存在显著差异，表明二酮类化合物在光照条件下具有显著的肿瘤细胞抑制活性。

图12显示了实验例5中，实验光敏剂组分别在避光、蓝光光照给药条件下，对照药物5-α氨基酮戊酸(ALA)组分别在避光、红光光照给药条件下，对Hacat人生化角质形成细胞的毒性。给药浓度为6×10 ^-3mol/L、6×10 ^-4mol/L、6×10 ^-5mol/L、6×10 ^-6mol/L、6×10 ^-7mol/L、6×10 ^-8mol/L、6×10 ^-9mol/L。如图所示，ALA在光照条件下，对于正常细胞的毒性较大。二酮类化合物在光照条件下，对于正常细胞的毒性与ALA在光照条件下，对于正常细胞的毒性存在显著差异。表明二酮类化合物在光照条件下对正常细胞毒性小，选择性高。

图13显示了实验光敏剂组，在施用后即刻，受光激发后可在小鼠皮肤产生较强荧光。并且在施用后4小时，小鼠皮肤荧光已明显下降。在施用后8小时，小鼠皮肤荧光已趋近于0。上述结果表明，本发明所选取的二酮类化合物可在皮肤进行光动力治疗或诊断。同时代谢迅速，不在体内外长时间滞留，具有良好的安全性。

图14为本申请实验例使用的Franz池的装置示意图。

图15显示了实验例9中，10％丁二酮水溶液涂抹或贴敷巴马小型猪的表皮暴露量。

图16显示了实验例11中，丁二酮纯品涂抹或水溶液贴敷巴马小型猪的表皮药物的暴露量。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

生物活性实验

以下实验例中体外实验所涉及的细胞、试剂、仪器如下所述：

药物：

化合物BJMU-201至BJMU-214，均由百灵威、偶合或伊诺凯等公司购买获得

细胞：

人结肠癌细胞SW480、人宫颈癌细胞Hela、人黑色素瘤细胞B16，均来源于ATCC细胞库。

培养液：

RPMI 1640培养基和胎牛血清；DMEM(含2mL-谷氨酰胺和Earle’s BSS，1.5g/L NaHCO ₃，0.1mM非必需氨基酸，1.0mM丙酮酸钠)和胎牛血清。

细胞培养：

维持37℃、5％CO ₂和饱和湿度环境，培养至80％汇合后，0.25％胰蛋白酶-EDTA消化处理。

涉及的主要试剂、仪器：

DMEM高糖培养基、1640培养基、胰蛋白酶(Gibco，Maryland，美国)；胎牛血清(FBS)(PAN，德国)；低温冷冻高速离心机(北京大龙，中国)；水平摇床(ZD-9550，Kylin Bell Lab Instruments，江苏)；超净工作台(苏净安泰，苏州)；FlexStation 3多功能酶标仪(Molecular Devices)。

实验例1.化合物对肿瘤细胞毒性的评价

本实验例通过MTT法检测化合物对肿瘤细胞的毒性，具体步骤如下：

(1)收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μL，铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔(边缘孔用无菌PBS填充)。

(2)5％CO ₂，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度的药物。一般5-7个梯度，每孔100μL，设3-5个复孔。

(3)将细胞随机分成光照给药、避光给药组，5％CO ₂，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

(4)以450nm-480nm波长的激光(光照强度110mW/cm ²)对细胞进行照射，光照时间为900秒，最终光剂量约为100J/cm ²，光照处理后，PBS清洗。

(5)每孔加入20μL MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

(6)终止培养，小心吸去孔内培养液。

(7)每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

(8)同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。

表1-1和表1-2显示了所检测的14个化合物(BJMU-201至BJMU-214)在光照给药条件下，对三种肿瘤细胞的毒性。结果显示，本发明所选取的二酮类化合物在光照给药条件下，对SW480人结肠癌细胞、Hela人宫颈癌细胞和B16人黑色素瘤细胞中存在较高细胞毒性。上述结果表明，本申请的化合物具有显著的肿瘤细胞抑制活性。

表1-1：二酮类化合物在光照给药条件下，对不同肿瘤细胞的细胞毒性

表1-2：二酮类化合物在光照给药条件下，对不同肿瘤细胞的细胞毒性

表2显示了所检测的14个化合物(BJMU-201至BJMU-214)在避光给药条件下，对三种肿瘤细胞的毒性。结果显示，本发明所选取的二酮类化合物在避光给药条件下，对SW480人结肠癌细胞、Hela人宫颈癌细胞和B16人黑色素瘤细胞中存在较低细胞毒性。上述结果表明，本申请的化合物具有良好的安全性。

表2：二酮类化合物在避光给药条件下，对不同肿瘤细胞的细胞毒性

实验例2.化合物对细菌的抑制作用评价

将单个大肠杆菌菌落从固体Luria Bertani(LB)琼脂平板上转移到5ml液体LB培养基中，在37℃下培养12小时。通过离心(7000转/分，1分钟)和PBS缓冲液三次洗涤来收集细菌。弃上清液，剩下的大肠杆菌重新悬浮在PBS缓冲液中。将细菌悬液的光密度(OD600)调整为1.0。然后用PBS缓冲液稀释悬浮液(5倍)。用稀释后的大肠杆菌细胞悬液与浓度为60mM的光敏剂(二酮类化合物)溶液，在37℃黑暗中孵育15分钟，然后在15mW/cm ²激光灯下光照200s(波长450nm-480nm，最终光剂量约为3J cm ^-2)，用PBS缓冲液对光照后的细菌悬浮液进行连续稀释(10 ⁴倍)。将稀释的细菌大肠杆菌的100μL分散在固体LB琼脂平板上，37℃孵育12-16小时，并计数形成的菌落。同时设置避光给药组、避光不给药组，通过将光照给药组、避光给药组杀死的菌落形成单位(cfu)的数量除以避光不给药组杀死的菌落形成单位(cfu)的数量来确定抑制率。

结果如表3所示。二酮类化合物在光照药条件下，对大肠杆菌的生长存在明显抑制作用。结果表明，本申请的化合物具有显著的细菌抑制活性。二酮类化合物在避光药条件下，对大肠杆菌的生长存在较轻抑制作用。结果表明，本申请的化合物具有良好的安全性。

表3：二酮类化合物在光照和避光给药条件下，对大肠杆菌的抑制率

实验例3.化合物对肿瘤的抑制作用评价(动物实验)

1.以BJMU-204作为光敏剂，应用BALB/C小鼠进行光动力治疗肿瘤作用实验。

造模方式：BALB/C小鼠共分为5组，每组11-12只。复苏、传代培养4T1(小鼠乳腺癌细胞)至细胞状态较好，用于肿瘤成瘤接种。BALB/C小鼠进行局部脱毛消毒，进行肿瘤细胞小鼠乳腺脂肪垫原位注射。7-10天成瘤。

给药时间：从小鼠成瘤后开始给予药物干预，隔天、瘤内注射给药进行光动力治疗(波长450nm-480nm激光，光照强度200mW/cm ²)。

给药方式：见下表，将光敏剂溶于生理盐水，对第1-3组小鼠进行瘤内注射，光治疗组在注射之后马上进行光照治疗。

2.各实验组小鼠，取血分离血清，剖检，取肿瘤称湿重；取肿瘤织固定，做病理学检查，采用H.E.染色，光学显微镜下观察小鼠肿瘤变化；血常规指标检测：白细胞数WBC、红细胞数RBC、淋巴细胞数LY、血小板PLT等多项血液常规指标；血液生化指标的检测：常规血液生化指标，于北医三院检验科进行检测分析。

3.取各实验组小鼠肿瘤，剪取约1cm*1cm*0.5cm大小的肿瘤组织置于10ml EP管中。加入5ml胰酶进行消化，30min后，停止消化，将消化液以及肿瘤组织过单细胞筛，得到肿瘤组织单细胞悬液，加入(流式细胞仪用)B220抗体，PI染液进行染色，30min后结束染色，吸去染液，PBS溶液重悬后，流式细胞仪检测。

图1显示了BALB/C小鼠治疗2周中，小鼠肿瘤组织的体积变化。如图所示，从给药14天后，高浓度治疗组与对照组存在极显著性差异(p<0.001)，低浓度治疗组与对照组存在极显著性差异(p<0.001)。肿瘤大小得到控制并有减小的情况出现，高浓度治疗组效果更加突出。此实验表明二酮类化合物对肿瘤存在抑制作用。

图2显示了BALB/C小鼠治疗2周后，小鼠肿瘤组织的重量变化。如图所示，二酮类化合物从给药14天后，高浓度治疗组与对照组存在极显著性差异(p<0.001)，低浓度治疗组与对照组存在极显著性差异(p<0.001)。治疗组肿瘤的重量比出现明显的生长抑制情况，高浓度治疗组具有更好的肿瘤抑制效果。此实验表明二酮类化合物对肿瘤存在抑制作用。

图3显示了BALB/C小鼠治疗2周后，小鼠肿瘤组织中B细胞数量。如图所示，二酮类化合物从给药14天后，高浓度治疗组与对照组存在极显著性差异(p<0.001)，低浓度治疗组与对照组存在极显著性差异(p<0.01)。治疗组肿瘤组织中B细胞数量显著增加，高浓度治疗组具有更好的增强免疫作用。

表4显示了BALB/C小鼠治疗2周后，小鼠血常规测试结果。小鼠血液中血小板、白细胞数量降低，并且治疗组与对照组存在极显著差异(p<0.001)。治疗组中血小板、白细胞数量降低，说明治疗组中免疫功能有所增强。此实验表明二酮类化合物参与的光动力治疗能够增强免疫作用。

图4-图6显示了BALB/C小鼠治疗2周后的血生化数据。其中，图4、图5、图6分别对应于天冬氨酸转氨酶、尿素氮、肌酸激酶的含量。

表4中BALB/C小鼠血常规(除白细胞、血小板)数据，以及图4-图6中的血生化数据表明，二酮类化合物在高浓度或低浓度治疗剂量下连续治疗14天不会产生肝肾及血液毒性。

实验例4.化合物对健康小鼠光毒性评价(动物实验)

1.以BJMU-204作为光敏剂，应用BALB/C小鼠进行光毒性评价实验。

BALB/C小鼠共分为2组，每组9只。适应性饲养2天。对照组正常饲养，实验组隔天、皮下注射给药进行光动力治疗(波长450nm-480nm激光，光照强度200mW/cm ²)。

给药方式：见下表，将光敏剂溶于生理盐水，对实验组小鼠进行皮下注射，之后马上进行光照治疗。

序号	给药方式
实验组	高浓度(3％)皮下注射给药+光照10min
对照组	正常饲养

2.实验组、对照组小鼠隔天称取体重。实验结束时，取血分离血清，剖检，血常规指标检测：白细胞数WBC、红细胞数RBC、淋巴细胞数LY、血小板PLT等多项血液常规指标；血液生化指标的检测：常规血液生化指标，于北医三院检验科进行检测分析。

表5显示了BALB/C小鼠的血常规数据。

表5：BALB/C小鼠治疗2周后，12h小鼠血常规结果

图7显示了BALB/C小鼠治疗2周中，小鼠的体重变化。如图所示，从给药14天后，对照组与实验组小鼠体重不存在显著性差异(p<0.05)，并且治疗期间，实验组小鼠体重无大幅变化，此实验表明二酮类化合物对正常小鼠存在的光毒性很小。

图8-图10显示了BALB/C小鼠治疗2周后的血生化数据。其中，图8、图9、图10分别对应于天冬氨酸转氨酶、尿素氮、肌酸激酶的含量。

表5中BALB/C小鼠血常规数据，以及图8-图10中的血生化数据表明，二酮类化合物对健康小鼠在高浓度治疗剂量下连续施用14天不会产生肝肾及血液毒性。

实验例5.化合物细胞毒性评价

本实验例通过MTT法检测化合物BJMU-204对细胞的毒性，具体步骤如下：

(3)将细胞随机分成光照给药、避光给药组，5％CO ₂，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。实验光敏剂-光照组孵育15分钟后进行光照，对照5-α氨基酮戊酸(ALA)-光照组孵育3小时后进行光照(对照药物ALA需孵育3小时才可产生卟啉类物质，用于光的吸收)。实验光敏剂-避光组孵育15分钟，对照ALA-避光组孵育3小时后，直接加入MTT溶液。

(4)实验光敏剂光照组，以450nm-480nm波长的激光(光照强度110mW/cm ²)对细胞进行照射，光照时间为900秒，最终光剂量约为100J/cm ²，光照处理后，PBS清洗。

对照ALA光照组，以630nm-650nm波长的激光(光照强度110mW/cm ²)对细胞进行照射，光照时间为900秒，最终光剂量约为100J/cm ²，光照处理后，PBS清洗。

(6)终止培养，小心吸去孔内培养液。

图11显示了实验光敏剂组，在避光与光照给药条件下，对Hela人宫颈癌细胞的毒性。给药浓度为6×10 ^-3mol/L、3×10 ^-6mol/L、6×10 ^-7mol/L、6×10 ^-9mol/L、3×10 ^-9mol/L、6×10 ^-10mol/L。结果显示，本发明所选取的二酮类化合物在避光给药条件下，对Hela人宫颈癌细胞存在较低细胞毒性。上述结果表明，本申请的化合物具有良好的安全性。结果显示，本发明所选取的二酮类化合物在蓝光光照给药条件下，对Hela人宫颈癌细胞中存在较高细胞毒性。上述结果表明，本申请的化合物在光照条件下具有显著的肿瘤细胞抑制活性。

图12显示了实验光敏剂组分别在避光、蓝光光照给药条件下，对照药物ALA组分别在避光、红光光照给药条件下，对Hacat人生化角质形成细胞的毒性。给药浓度为6×10 ^-3mol/L、6×10 ^-4mol/L、6×10 ^-5mol/L、6×10 ^-6mol/L、6×10 ^-7mol/L、6×10 ^-8mol/L、6×10 ^-9mol/L。结果显示，本发明所选取的二酮类化合物在避光与蓝光光照给药条件下，对Hacat人生化角质形成细胞存在较低细胞毒性。对照药物5-α氨基酮戊酸(ALA)在红光光照条件下，对Hacat人生化角质形成细胞存在较高细胞毒性。本发明所选取的二酮类化合物在光照条件下，对于正常细胞的毒性与ALA在光照条件下，对于正常细胞的毒性存在显著差异。上述结果表明，本申请的化合物在光照条件下对正常细胞毒性小，选择性高。

实验例6.化合物小鼠皮肤荧光评价

本实验例通过评价化合物BJMU-204作为光敏剂用于皮肤施用的潜能。具体步骤如下：

将BALB/C小鼠进行脱毛，彻底清洁皮肤后，避光4小时以上。使用IVIS SPECTRUM小动物活体成像仪，对小鼠背部进行拍照，在480nm和520nm波长下和2s照射时间进行激发。对未施用光敏剂的小鼠进行拍照，作为对照。对小鼠后背直径为10mm皮肤施用100μL 30％浓度化合物的小鼠进行拍照记录荧光强度，随后施用2小时、4小时、8小时、12小时分别进行拍照。每个图像使用Living Image 4.3.1进行处理，测量皮肤上直径10mm的圆形视野内的平均荧光。对于环境光、小鼠皮肤背景荧光，使用无施用化合物小鼠背部荧光值进行校正。

图13显示了实验光敏剂组，在施用后即刻，受光激发后可在小鼠皮肤产生较强荧光。结果显示，本发明所选取的二酮类化合物可在皮肤进行光动力治疗或诊断。二酮类化合物受光激发后能够迅速产生荧光，无需进行长时间等待。并且在施用后4小时，小鼠皮肤荧光已明显下降。在施用后8小时，小鼠皮肤荧光已趋近于0。上述结果表明，本申请的化合物代谢迅速，不在体内外长时间滞留，具有良好的安全性。

以上实验表明，本发明选取的二酮类化合物在细胞上表现出了光照下显著杀伤肿瘤细胞的活性，在细菌上表现出了光照下显著抑制细菌生长的活性，在避光条件下，无以上两种活性且化合物毒性低。本发明选取的二酮类化合物在小鼠体内也可以显著抑制肿瘤细胞活性，并能够显著增强免疫活性。综上所述，本发明选取的二酮类化合物可以用于光动力治疗达到治疗癌症、微生物感染以及相关并发症的目的，也可以用于治疗免疫相关疾病。

实施例制剂配制

按照以下配方将各组分混合，配制液体制剂。

表6

处方成分	w/w
丁二酮	40％
丙二醇	10％
水	20％
乙醇	30％

处方成分	w/w
丁二酮	20％
水	80％

处方成分	w/w
丁二酮	30％
丙二醇	20％
水	50％

实验例7丁二酮纯品和20％丁二酮水溶液的保存稳定性

对20％丁二酮水溶液的保存稳定性进行测试，结果见表7。

表7：20％丁二酮水溶液的保存稳定性

备注：RRT为相对保留时间，结果为GC检测结果，充氮作用为去除体系中的氧气。

从上表可以看出，20％丁二酮水溶液的稳定性较好，可以在5℃左右的条件下稳定存在至少三个月。此外，对充氮和不充氮的数据进行比较，可以看出，氧气对20％丁二酮水溶液的保存稳定性影响不大。

对丁二酮纯品的保存稳定性进行测试，结果见表8和表9。

表8：丁二酮纯品的保存稳定性(长期：5℃±3℃)

表9：丁二酮纯品的保存稳定性(加速：25℃±3℃60％RH±5％)

从上表可以看出，丁二酮纯品的稳定性比较好，可以在避光条件下长期储存。

实验例8Franz池检测药物活性成分单位时间下皮内累积量

1.实验原理和装置

将人或动物的皮肤固定于扩散池与接收池之间，测定不同时间由扩散池穿透到接收池溶液中的药量，求出药物对皮肤的渗透率。一般采用垂直型的Franz扩散池，其上部为扩散池，直接与空气接触，下部为接收池，两池之间为皮肤。另有一种水平封闭性Valia-Chien扩散池，皮肤夹在两玻璃池之间，一侧为扩散池，另一侧为接收池。使用上述方法检测15min内固定在中间的皮肤中药物的累积量。

Franz池的装置示意图见图14。

2.试剂来源

名称	批号	来源
丁二酮	LP20V62	北京百灵威
无水乙醇	2012123201	安徽安特
Transcutol HP	178161	嘉法师
卡波姆934	22119020	COREL
乙基纤维素	D184GA7021	DOW
聚丙烯瓶	S191203	西安方正

3.制剂配制

(1)包含丁二酮和醇类的制剂：依次定量称取丁二酮、无水乙醇(或丙二醇)，搅拌溶解，装瓶。

(2)包含丁二酮、水和醇类的制剂：依次定量称取丁二酮、无水乙醇(或丙二醇)、纯水，搅拌溶解，装瓶。

(3)包含丁二酮和Transcutol HP的制剂：依次定量称取丁二酮、Transcutol HP，搅拌溶解，装瓶。

(4)包含丁二酮、水和Transcutol HP的制剂：依次定量称取丁二酮、Transcutol HP、纯水，搅拌溶解，装瓶。

(5)包含丁二酮、卡波姆934和Transcutol HP的制剂(对比例)：先定量称取卡波姆934加入到事先称好的纯水中，搅拌溶解，再称取丁二酮、Transcutol HP加入，搅拌均匀，装瓶。

(6)包含丁二酮、无水乙醇和Transcutol HP的制剂：依次定量称取丁二酮、Transcutol HP、无水乙醇，搅拌溶解，装瓶。

(7)包含丁二酮、无水乙醇、乙基纤维素和Transcutol HP的制剂(对比例)：先定量称取乙基纤维素加入到事先称好的无水乙醇中，搅拌溶解，再称取丁二酮、Transcutol HP加入，搅拌均匀，装瓶。

3.实验结果：如表10所示，水在制剂中不仅可以起到溶剂作用，还可以促进丁二酮对皮肤的渗透。相比之下，卡波姆934和乙基纤维素对丁二酮的促渗作用不佳。

表10：丁二酮的皮内累积量

实验例9不同给药方式对小型猪表皮、真皮、皮下组织、皮下肌肉药物滞留量的影响。

1.试验概述

本试验分别将2只巴马小型猪颈背部皮肤分为6块区域，左右各3块区域，每块区域体表面积为36cm ²。右侧区域按1、2、3次的给药频率经皮涂抹10％丁二酮水溶液，涂抹体积为0.1mL/cm ²，左侧区域用纱布蘸取丁二酮溶液贴敷1、5、15min，给药体积为0.1mL/cm ²。给药结束即刻采集全血样品和表皮、真皮、皮下组织、皮下肌肉4层皮肤组织，测定组织匀浆中丁二酮的浓度。

2.实验设计

试验分组

备注：动物编号的首位数字代表组别(1代表丁二酮溶液组)。第二位字母代表性别(M为雄性，F为雌性)，第三、四、五位数值代表动物序列号。

剂量设计

备注：L、R分别代表巴马小型猪的左右侧。

3.给药方式注解

涂抹给药：准确量取所需给药制剂后(根据面积计算)，将药物滴取到小型猪皮肤表面，用棉签均匀涂抹待给药区域，其中3次和5次涂抹给药方式将总给药量均分成3份或者5 份给药，每次涂抹约30s，每次间隔约为10s；在给药过程中注意避光。

贴敷给药：准确量取所需给药制剂后(根据面积计算)，将一定面积棉片(或纱布)蘸取所有药物制剂(保证棉片或纱布的用量可刚好饱和吸收所有制剂，可用增加层数的方法增加棉片或纱布的用量)，贴敷到动物皮肤表面；在给药过程中注意避光。

4.样品采集与处理

皮肤组织样品采样时间：最后一次给药结束即刻(0～2min)

采样动物：上述各组待采样的所有存活猪，按表1进行采样；

动物处死方法：以戊巴比妥钠麻醉(耳缘静脉30mg/kg)，腹主动脉放血安乐死。

皮肤组织样品采集：采集给药区域的表皮、真皮、皮下组织和皮下肌肉共计4层。最后一次给药结束后立即用纸巾或抹布将涂抹给药部位的药物拭去，以肥皂水清洗，再用清水冲洗3遍。先用手术刀将给药区域皮肤(以标记笔标记处)从表皮层至肌肉层整体取下，皮下组织用剪刀或刀片剪取适量；剥离皮下组织用剪刀或刀片剪取适量皮下肌肉，剩余皮肤再用电动取皮刀在给药区域中间相同位置分别取表皮(厚0.05mm)和真皮(厚0.75mm)；

处理：各皮肤层分离后立即装入EP管并置于液氮中暂存，随后于-66℃以下保存；

样品检测：以气相色谱法测定各血浆和组织匀浆液中丁二酮的浓度，由四川省食品药品检验检测院进行样品检测。

皮肤组织浓度(ng/g)＝皮肤组织匀浆浓度(ng/mL)×稀释倍数÷1g/mL(皮肤组织密度按1g/mL计)(匀浆时表皮、真皮的稀释倍数为10，皮下组织、皮下肌肉的稀释倍数为5)。

根据丁二酮的相对分子质量对上式得到的皮肤组织浓度进行换算，得到以mM/L为单位的浓度。

5.结果：如表11和图15所示，丁二酮在表皮以外的组织中的浓度很低，进入真皮、皮下肌肉和皮下组织中的量很少。

表11：巴马小型猪经皮涂抹/贴敷丁二酮溶液后各组织中丁二酮的浓度(Mean,单位：mM/L)

注：“/”表示在检测限以下，无运算结果。

实验例10丁二酮在皮肤中的代谢数据。

1.试验概述

将14只巴马小型猪随机分为丁二酮溶液即刻组、5、25分钟、1、4、16、64小时组，每组2只(雌雄各半)，巴马小型猪按2％的体表面积经皮贴敷规格为10％的丁二酮溶液，给药体积为0.06mL/cm ²。于给药前及给药结束即刻(0～1min)、给药后5、25分钟、1、4、16、64小时采集全血样品，并于给药结束即刻(0～1min)、给药后5、25分钟、1、4、16、64小时采集表皮、真皮、皮下组织、皮下肌肉4层皮肤组织。

2.实验设计

试验分组

备注：动物编号的首位数字代表组别(1、2、3、4、5、6、7代表丁二酮溶液即刻组、5、25分钟、1、4、16、64小时组)。第二位字母代表性别(M为雄性，F为雌性)，第三、四、五位数值代表动物序列号。

剂量设计

备注：“*”表示丁二酮含量。

3.给药方式注解

贴敷给药：同实验例9。

4.样品采集与处理

血浆样本采集：

给药前及给药结束即刻(0～1min)、给药后5分钟(±2分钟)、25分钟(±2分钟)、1小时(±5分钟)、4小时(±5分钟)、16小时(±10分钟)、64小时(±30分钟)。

丁二酮溶液即刻组：给药结束即刻(0～1min)；

丁二酮溶液5分钟组：给药后5分钟(±2分钟)；

丁二酮溶液25分钟组：给药后25分钟(±2分钟)；

丁二酮溶液1小时组：给药后1小时(±5分钟)；

丁二酮溶液4小时组：给药后4小时(±5分钟)；

丁二酮溶液16小时组：给药后16小时(±10分钟)；

丁二酮溶液64小时组：给药后64小时(±30分钟)。

动物处死方法、样品采集、处理、样品检测、皮肤组织浓度计算公式：同实验例9。

5.结果：从表12和表13可以看出，丁二酮在血液、真皮、皮下组织、和皮下肌肉中的浓度很小，并且64小时之后在血液和组织中基本代谢完全。

表12：巴马小型猪单次经皮贴敷丁二酮溶液后不同时间点血浆中丁二酮浓度(mM/L)

备注：BLQ表示低于定量下限；“-”表示未采集样本。

表13：巴马小型猪单次经皮贴敷丁二酮溶液后不同时间点皮肤组织中丁二酮浓度(mM/L)

实验例11丁二酮及其不同浓度的水溶液的表皮分层暴露量

1.试验概述

本试验将14只巴马小型猪随机分为丁二酮组、3％丁二酮溶液组、10％丁二酮溶液组、25％丁二酮溶液组，其中丁二酮组共2只(雌雄各半)，其余组别每组2只(雌雄各半)。丁二酮组巴马小型猪颈背部皮肤分为2块区域，左右各1块区域(左侧区域分别为L1，右侧区域分别为R1)，每块区域体表面积为36cm ²，每块区域按0.1mL/cm ²的涂抹体积经皮涂抹丁二酮(99.6988％)，涂抹时间为30s，于给药结束即刻(0～1min)采集L1/R1的表皮。3％丁二酮溶液组、10％丁二酮溶液组、25％丁二酮溶液组巴马小型猪按5％的体表面积分别经皮贴敷15min规格为3.0％、10％、25％的丁二酮溶液，给药体积均为0.06mL/cm ²。并于给药结束即刻(0～1min)采集表皮、真皮、皮下组织共3层皮肤组织。

2.实验设计

分组情况

备注：动物编号的首位数字代表组别(1、2、3、4代表丁二酮组、3％丁二酮溶液组、10％丁二酮溶液组、25％丁二酮溶液组，分别以绿、蓝、红、黄色标签标识)。丁二酮组每只巴马小型猪分2个区域给药，L1对应左侧给药结束即刻、R1对应右侧给药结束即刻。第二位字母代表性别(M为雄性，F为雌性)，第三、四、五位数值代表动物序列号。

剂量设计

备注：“*”表示丁二酮含量；“#”表示给药面积为5％体表面积。

3.给药方式注解

同实验例9。

4.样品采集与处理

采样动物：上述各组待采样的所有存活猪；

5.实验结果：如表14和图16所示，巴马小型猪单次经皮贴敷不同规格丁二酮溶液，在体表皮的药物暴露量随丁二酮浓度的增加而升高。

表14：巴马小型猪单次经皮贴敷不同规格丁二酮溶液或涂抹丁二酮后皮肤组织中丁二酮浓度(mM/L)

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims

一种制剂，所述制剂以式(I)所示的化合物、其药学上可接受的盐或酯、前药、立体异构体、水合物、溶剂合物、晶型、同位素标记物、它们的代谢物形式、或它们的任意组合或混合物作为活性成分；所述制剂为液体制剂；

其中，R ¹和R ²各自独立地选自C ₁-C ₆直链或支链烷基、卤代C ₁-C ₆直链或支链烷基、羟基，以及任选地被一个或多个(例如2个、3个、4个或5个)相同或不同的取代基取代的下列基团：C ₆-C ₁₄芳基、5-6元杂芳基、5-6元杂环基、3-6元环烷基，所述取代基各自独立地选自：羟基、羧基、磺酸基、卤素(例如氟、氯、溴或碘)原子、氨基、巯基、硝基、-C(O)O-(C ₁-C ₄直链或支链烷基)、-S(O) ₂O-(C ₁-C ₄直链或支链烷基)、-O-(C ₁-C ₄直链或支链烷基)；

所述制剂还包含以下成分中的一种或多种：水、具有2～3个碳原子的一元或多元醇(例如丙二醇、乙醇或异丙醇)、二乙二醇单乙基醚(Transcutol)；

优选地，所述C ₁-C ₆直链或支链烷基为C ₁-C ₄直链或支链烷基；

优选地，所述C ₁-C ₄直链或支链烷基选自：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基；

优选地，所述C ₆-C ₁₄芳基为苯基或萘基；

优选地，所述卤代C ₁-C ₆直链或支链烷基为氟代、氯代、溴代或碘代的C ₁-C ₆直链或支链烷基；

优选地，所述5-6元杂芳基含有1-3个选自氮、氧或硫的环原子；

优选地，所述5-6元杂环基含有1-3个选自氮、氧或硫的环原子。
权利要求1的制剂，其中，R ¹选自C ₁-C ₄直链或支链烷基(例如甲基、乙基)、C ₆-C ₁₄芳基(例如苯基)，和/或

R ²选自C ₁-C ₄直链或支链烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基)、卤代C ₁-C ₄直链或支链烷基(例如溴代甲基、溴代乙基)、羟基。
权利要求1或2的制剂，所述化合物具有以下特征中的一个：

(1)R ¹为C ₁-C ₄直链或支链烷基，R ²为C ₁-C ₄直链或支链烷基；

(2)R ¹选自C ₁-C ₄直链或支链烷基、苯基，R ²为羟基；

(3)R ¹为C ₁-C ₄直链或支链烷基，R ²为卤代C ₁-C ₄直链或支链烷基；

(4)R ¹和R ²为苯基，所述苯基任选地被一个或多个相同或不同的取代基取代；

(5)R ¹和R ²各自独立地为5-6元含氮杂芳基，所述5-6元含氮杂芳基任选地被一个或多个相同或不同的取代基取代。
权利要求1-3任一项的制剂，所述化合物选自：
组合物在制备药物中的用途，所述组合物包含如权利要求1-4任一项定义的化合物、其药学上可接受的盐或酯、前药、立体异构体、水合物、溶剂合物、晶型、同位素标记物、它们的代谢物形式、或它们的任意组合或混合物，所述组合物为液体制剂，所述药物用于疾病的光动力治疗或光动力诊断，或用于通过光动力治疗对皮肤进行美容。
权利要求5的用途，所述光动力治疗通过包括以下步骤的方法进行：

步骤I：将权利要求1-4任一项定义的制剂给受试者施用；以及

步骤II：以光对所述受试者进行照射；

优选地，所述方法具有以下特征中的一个或多个：

(1)步骤II中的光是具有单一波长的光，或者是混合光；

(2)步骤II中，所述光的至少部分波长在10nm-1mm的范围内；

(3)步骤II中，照射的时间为1s-12h；

(4)步骤II中，以1-2000mW/cm ²的光照强度进行照射。
权利要求5或6的用途，所述疾病选自：

(i)肿瘤及并发疾病；

(ii)微生物或寄生虫感染相关疾病；

(iii)免疫相关疾病；

优选地，所述肿瘤及并发疾病选自乳腺癌、黑色素瘤、脑膜瘤、软组织肉瘤、唾液腺肿瘤、阴茎癌、舌癌、上颌窦癌、甲状腺癌、恶性淋巴瘤、睾丸肿瘤、鼻咽癌、喉癌、口腔癌、宫颈癌、外阴癌、皮肤癌、卡波西肉瘤、非黑色素瘤皮肤癌(包括鳞状细胞癌和基底细胞癌)、血管瘤及这些疾病的继发性并发症(例如，疼痛、感染、心包积液、胸腔积液)；

优选地，所述微生物选自：

细菌(例如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌、炭疽杆菌、淋病奈瑟菌、痤疮丙酸杆菌以及丙沙门杆菌)，

病毒(例如腮腺炎病毒、风疹病毒、人乳头状病毒、水痘带状疱疹病毒)，

真菌(例如白色念珠菌、红色毛癣菌、絮状表皮癣菌)，

支原体(例如溶脲脲原体、人型支原体、生殖器支原体)，

衣原体(例如沙眼衣原体)，

立克次氏体(例如普氏立克次氏体、莫氏立克次氏体、立克次氏立克次氏体)，

放线菌(例如以色列放线菌)，

螺旋体(例如梅毒螺旋体)；

优选地，所述寄生虫选自：阴道毛滴虫、阿米巴虫、杜氏利什曼原虫、丝虫、疥螨、毛囊螨、虱子、跳蚤；

优选地，所述微生物或寄生虫感染相关疾病选自：由大肠杆菌引起的肠道外感染、细菌性和阿米巴性痢疾、淋病、梅毒、炭疽、黑热病、丝虫病、流行性腮腺炎、风疹、非淋菌性尿道炎、支原体宫颈炎、沙眼、流行性斑疹伤寒、地方性斑疹伤寒、落矶山斑疹伤寒、立克次氏痘、恙虫病、癣病(例如花斑癣、掌黑癣、毛结节菌病、足癣、手癣、体癣、股癣、甲癣、头癣)、孢子丝菌病、着色芽生菌、念珠菌病、曲霉病、隐球菌病、接合菌病、马内菲青霉病、尖锐湿疣、带状疱疹、痤疮；

优选地，所述免疫相关疾病选自：

继发性免疫缺陷：例如感染(例如风疹、球孢子菌感染)

自身免疫疾病：例如系统性红斑狼疮、硬皮病、皮肤病。
权利要求5-7任一项的用途，所述疾病为癌前病变与皮肤疾病；

优选地，所述癌前病变选自乳头状病毒感染导致的宫颈癌癌前病变以及以下癌症的癌前病变：乳腺癌、黑色素瘤、脑膜瘤、软组织肉瘤、唾液腺肿瘤、阴茎癌、舌癌、上颌窦癌、甲状腺癌、恶性淋巴瘤、睾丸肿瘤、鼻咽癌、喉癌、口腔癌、宫颈癌、外阴癌、皮肤癌、卡波西肉瘤、非黑色素瘤皮肤癌(包括鳞状细胞癌和基底细胞癌)；

优选地，所述皮肤疾病选自尖锐湿疣、与微生物感染相关的痤疮、鲜红斑痣、日光性角化病、皮肤癌、皮肤癌前期病变、皮肤良性增生性疾病。
一种对受试者进行皮肤美容的方法，所述方法包括使用权利要求1-4任一项定义的制剂作为光敏剂的步骤；所述皮肤美容不以治疗为目的；

优选地，所述皮肤美容选自：去除色素性皮损(例如黄褐斑、雀斑等)、去除角质、改善与微生物感染相关的痤疮；

优选地，所述皮肤美容的方法与其他皮肤美容的方法(例如使用红蓝光治疗仪的皮肤美容方法，例如光子嫩肤)联合使用。
权利要求1-4任一项定义的制剂与光联合用于皮肤美容的用途，所述皮肤美容不以治疗为目的。
一种抑制肿瘤细胞、微生物或寄生虫的活性的方法，所述方法用于非治疗目的，并且在体外进行，所述方法包括：

步骤i：将权利要求1-4任一项定义的制剂施加到所述肿瘤细胞、微生物或寄生虫上；以及

步骤ii：以光对所述肿瘤细胞、微生物或寄生虫进行照射。
权利要求11的方法，其具有以下特征中的一个或多个：

(1)步骤ii中的光是具有单一波长的光，或者是混合光；

(2)步骤ii中，所述光的至少部分波长在10nm-1mm的范围内；

(3)步骤ii中，照射的时间为1s-12h；

(4)步骤ii中，以1-2000mW/cm ²的光照强度进行照射。
权利要求11或12的方法，其中，

所述肿瘤细胞选自：乳腺癌细胞、黑色素瘤细胞、脑膜瘤细胞、软组织肉瘤细胞、唾液腺肿瘤细胞、阴茎癌细胞、舌癌细胞、上颌窦癌细胞、甲状腺癌细胞、恶性淋巴瘤细胞、睾丸肿瘤细胞、鼻咽癌细胞、喉癌细胞、口腔癌细胞、宫颈癌细胞、外阴癌细胞、皮肤癌细胞、卡波西肉瘤细胞、非黑色素瘤皮肤癌(包括鳞状细胞癌和基底细胞癌)细胞、血管瘤细胞；

所述微生物选自：

细菌(例如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌、炭疽杆菌、淋病奈瑟菌、痤疮丙酸杆菌以及丙沙门杆菌)，

病毒(例如腮腺炎病毒、风疹病毒、人乳头状病毒、水痘带状疱疹病毒)，

真菌(例如白色念珠菌、红色毛癣菌、絮状表皮癣菌)，

支原体(例如溶脲脲原体、人型支原体、生殖器支原体)，

衣原体(例如沙眼衣原体)，

立克次氏体(例如普氏立克次氏体、莫氏立克次氏体、立克次氏立克次氏体)，

放线菌(例如以色列放线菌)，

螺旋体(例如梅毒螺旋体)。

在某些实施方案中，所述寄生虫选自：阴道毛滴虫、阿米巴虫、杜氏利什曼原虫、丝虫、疥螨、毛囊螨、虱子、跳蚤。