BR112017020052B1 - Atropisômeros de tetrafenilbacterioclorinas halogenados e clorinas e seu uso em terapia fotodinâmica - Google Patents

Abstract

ATROPISÔMEROS DE TETRAFENILBACTERIOCLORINAS HALOGENADOS E CLORINAS E SEU USO EM TERAPIA FOTODINÂMICA. Esta invenção se refere a atropisômeros de derivados de tetrafenilporfirina reduzidos com átomos de halogênio (F, Cl, Br) nas posições orto dos grupos fenila, particularmente tetrafenilclorinas halogenados e tetrafenilbacterioclorinas halogenados, que podem ser utilizados na terapia fotodinâmica. De acordo com as fórmulas da invenção, os substituintes orto-fenila X1, X2 , X3, X4 , X5, X6, X7 e X8 podem ser idênticos ou diferentes e representam átomos de halogénio ou átomos de hidrogênio, desde que pelo menos todos os X2, X4, Xh e X11 sejam halogênios, e os substituintes meta-fenila R1, R2, R3 e R4 são independentemente escolhidos dentre -OH, -OR ou -SO-.R", onde R" são independentemente escolhidos dentre -Cl, -OH, - aminoácido, -OR, -NHR ou -NR2, onde R são alquila com 1 a 12 átomos de carbono ou R representa cicloalquila com 2 a 12 átomos de carbono. Os atropisêmeros desta invenção têm a maioria dos substituintes R1, R2 R3 e R4 no mesmo lado do plano definido pelo macrociclo. invenção também se refere a uma composição farmacêutica anticancerígena e/ou antimicrobiana e/ou antiviral onde os atropisômeros a4 e a'(3 são os principais ingredientes ativos, de modo que a mistura de (...).

Description

CAMPO TÉCNICO

[001] O presente pedido se refere a uma composição farmacêutica enriquecida com atropisômeros de tetrafenilbacterioclorinas halogenados e clorinas, o seu processo de preparação e utilização na terapia fotodinâmica.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] As sulfonamida tetrafenilclorinas e tetrafenilbacterioclorinas com átomos de halogênio nas posições orto dos grupos fenila apresentaram propriedades particularmente úteis para a terapia fotodinâmica (PDT) (1 a 4). PDT é um tratamento médico que combina o uso de um medicamento fotossensibilizante, luz do comprimento de onda absorvido por esse medicamento e oxigênio molecular para gerar espécies de oxigênio reativo (ROS) no tecido alvo. O efeito terapêutico é mediado pelo estresse oxidativo produzido localmente pelas ROS. Tetrafenilporfirinas, tetrafenilclorinas e derivados de tetrafenilbacterioclorinas são frequentemente utilizados como fotossensibilizadores de PDT (5). Essas moléculas possuem ligações simples de fenil-macrociclo com rotações impedidas. Quando os grupos fenila contêm átomos de halogênio nas posições orto, a rotação em torno da ligação simples entre o grupo fenila e o macrociclo pode ser impedida ou muito reduzida. Embora o impedimento estérico da rotação da ligação simples de fenil-macrociclo possa, em princípio, ser superado a altas temperaturas, a meia-vida desta rotação em tetrafenilporfirinas halogenadas,tetrafenilclorinas e tetrafenilbacterioclorinas pode ser suficientemente longa à temperatura ambiente e à temperatura corporal para permitir a separação e o uso independente de estereoisômeros possivelmente existentes nesta classe de moléculas. Os estereoisômeros são mais frequentemente observados como resultado de átomos quirais. Os enantiômeros ou diastereômeros resultantes da presença de átomos quirais são conhecidos pela origem de fármacos com interações muito diferenciadas com alvos biológicos. As tetrafenilbacterioclorinas halogenadas, as tetrafenilclorinas e as tetrafenilbacterioclorinas não possuem átomos quirais no macrociclo ou nos grupos fenila, mas possuem estereoisômeros separáveis porque a ligação simples de fenil-macrociclo impedida pode gerar uma distribuição espacial diferente de substituintes volumosos. Este será o caso de tais moléculas quando contiverem substituintes não simétricos nas posições orto e/ou meta e a barreira para a rotação da ligação simples fenil- macrociclo é alta. Os estereoisômeros resultantes da rotação axial lenta são chamados de atropisômeros (6). Atropisômeros de tetrafenilporfirinas halogenadas quando os substituintes nas duas posições meta dos grupos fenila são diferentes (7 a 9). Os compostos da invenção apresentam a primeira evidência de que os atropisômeros de tetrafenilclorinas orto-halogenadas e de tetrafenilbacterioclorinas orto-halogenadas são separáveis e que os atropisômeros possuem efeito terapêutico diferencial como fotossensibilizadores para PDT.

[003] Pode ser surpreendente que os atropisômeros que diferem apenas pela conformação em torno de uma única ligação podem gerar tensões oxidativas com resultados terapêuticos dramaticamente diferentes. Inesperadamente, os inventores da presente invenção constataram que o enriquecimento de uma mistura de atropisômeros nos atropisômeros com grupos mais volumosos no mesmo lado do plano definido pelo macrociclo pode curar camundongos com tumores implantados subcutaneamente em condições em que a mistura enriquecida em atropisômeros com o mesmo número de grupos volumosos em ambos os lados do plano de macrociclos não cura nenhum animal. A maior eficácia de PDT de uma composição de atropisômero enriquecida em atropisômeros com a maioria dos meta-substituintes do grupo fenila ligado ao macrociclo no mesmo lado do plano definido pelo macrociclo, não poderia ser antecipada pela pessoa versada na técnica. De fato, estudos anteriores de fototoxicidade com tetrafenilporfirinas pareciam indicar exatamente o oposto, ou seja, sugeriu-se que os quatro atropisômeros isoláveis das tetrafenilporfirinas de "cerca de estacas" não tinham diferenças na capacidade de fotossensibilização (10). Além disso, os dois regioisômeros do anel monoácido do derivado de benzoporfirina A, conhecido como verteporfina e utilizados na prática clínica como fotossensibilizador na PDT da degeneração macular relacionada à idade, são igualmente fotossensibilizadores potentes de células tumorais in vitro e in vivo (11). Além disso, os dois regioisômeros de verteporfina consistem cada um em uma mistura racêmica de dois enantiômeros e todos os enantiômeros têm atividade farmacológica similar (12). Com base em todos os dados disponíveis, a pessoa versada na técnica é levada a acreditar que os atropisômeros de qualquer fotossensibilizador dado interagem com a luz e com o oxigênio de maneiras muito semelhantes e concluem que a eficácia da PDT dos atropisômeros deve ser muito semelhante. A presente invenção descreve, pela primeira vez, composições farmacêuticas terapeuticamente benéficas de atropisômeros de tetrafenilclorina halogenada ou derivados de tetrafenilbacterioclorinas halogenadas para utilização em PDT que são enriquecidos no atropisômero com todos os substituintes meta do grupo fenila ligados ao macrociclo no mesmo lado do plano definido pelo macrociclo (atropisômero α4), de modo que a quantidade relativa do atropisômero α4 na composição farmacêutica seja superior a 20%. Contra todas as expectativas, demonstra-se que a eficácia de PDT in vitro do atropisômero α4 preferido pode ser de ordens de magnitude maiores que a eficácia de PDT in vitro do atropisômero ativo menos ativo αβαβ onde os substituintes volumosos nas posições meta de anéis de fenila adjacentes estão em lados opostos do plano definido pelo macrociclo.

[004] A Figura 1 ilustra os vários estereoisômeros existentes em tetrafenilbacterioclorinas halogenadas de sulfonamida com halogênios nas posições orto dos anéis fenila e grupos sulfonamida em uma das posições meta. A orientação tridimensional dos átomos dos estereoisômeros ilustrados na Figura 1 é diferente e pode ser interconvertida pela rotação de ligações simples de fenil- macrociclo. Essa interconversão é muito lenta à temperatura ambiente, ou à temperatura corporal, devido à presença de átomos de halogênio (F, Cl, Br) nas posições orto dos anéis de fenila, o que permite a separação e o uso individual de cada um dos atropisômeros. As linhas em negrito nas estruturas moleculares da Figura 1 indicam que os átomos em negrito e os grupos anexados a eles são estericamente restritos de modo a existir acima do plano aproximadamente definido pelo anel de macrociclo, que é conhecido por ser um pouco distorcido a partir da geometria planar, mas que, no entanto, definem uma orientação espacial restrita dos grupos R'. A presença de todos os R' no mesmo lado do plano definido pelo macrociclo é representada como α4, quando três R' estão no mesmo lado do plano e o último R' está no outro lado, o atropisômero é representado por α3β, quando dois dos R' estão de cada lado e adjacentes uns aos outros a representação do atropisômero é α2β2 e, finalmente, quando dois dos R' estão em cada lado, mas alternam nas posições em relação ao plano do macrociclo a representação do atropisômero é αβαβ.

[005] Verificou-se que os atropisômeros de tetrafenilporfirinas halogenadas podem ser separados e podem ter diferentes coeficientes de absorção molar na região vermelha do espectro eletromagnético (7, 9). Um coeficiente de absorção molar elevado no vermelho, onde os tecidos humanos têm maior transparência do que nas outras regiões do espectro visível, é uma propriedade desejável para PDT porque um corante que absorve mais luz é mais provável que inicie a cascata de reações fotoquímicas que geram ROS. Por outro lado, os atropisômeros de tetrafenilporfirinas halogenadas, tetrafenilclorinas e tetrafenilbacterioclorinas podem ter diferentes tempos de vida em estado excitado (13) que podem influenciar a sua eficácia de PDT. Os curtos tempos de vida de tripleto nas soluções aeradas são associadas a interações mais fortes com oxigênio molecular, possivelmente mediadas por interações de transferência de carga (4). Notavelmente, os atropisômeros na Figura 1 têm números diferentes e diferentes orientações de grupos polares em cada lado do macrociclo e, consequentemente, têm diferentes polaridades. As diferenças de polaridade, forma e volume molecular excluído podem fornecer uma base para sua separação e também ter impacto em sua atividade biológica. Assim, as diferenças no coeficiente de absorção molar, no tempo de vida no estado excitado, na polaridade e no volume molecular excluído dos atropisômeros podem levar a diferenças em suas interações com oxigênio molecular e com alvos biológicos, e têm um impacto até então não revelado em sua atividade PDT. Além disso, com base pelo menos na discussão acima, uma pessoa com conhecimentos comuns na técnica esperaria que os atropisômeros com coeficientes de absorção molar mais altos fossem mais eficazes na terapia fotodinâmica. No entanto, surpreendentemente, o atropisômero da presente invenção que se mostrou ser o mais eficiente na terapia fotodinâmica não é o atropisômero que absorve mais luz.

[006] Tetrafenilbacterioclorinas são relativamente instáveis (14, 15) e não se poderia antecipar que a separação de seus atropisômeros seria viável com procedimentos econômicos. A introdução de átomos de halogênio nas posições orto dos anéis fenila impede a rotação da ligação fenil-macrociclo e estabiliza o macrociclo contra a oxidação. Por isso, as tetrafenilbacterioclorinas halogenadas têm atropisômeros exclusivamente estáveis, com barreiras rotacionais de fenil-macrociclos elevadas e potenciais de oxidação tão altos quanto os de tetrafenilporfirinas. Estas propriedades permitem a separação dos atropisômeros de tetrafenilbacterioclorinas halogenados a temperaturas iguais ou superiores à temperatura ambiente e na presença de luz e oxigênio. Portanto, a separação desses atropisômeros é econômica.

[007] Existem várias ROS que podem ser geradas por fotossensibilizadores. As ROS mais importantes geradas por bacterioclorinas na presença de luz de um comprimento de onda apropriado e de oxigênio molecular são: oxigênio singlete (isto é, o estado eletronicamente excitado mais baixo de oxigênio molecular), íon superóxido, peróxido de hidrogênio e o radical hidroxila (16). O radical hidroxila é o mais reativo desta ROS. Pode reagir com uma ampla gama de alvos biológicos e também pode reagir com o fotossensibilizador que leva ao seu branqueamento. O fotosensibilizador eletronicamente excitado pode ser considerado um catalisador muito especial que gera ROS quando encontra oxigênio molecular. No entanto, quando o fotosensibilizador é branqueado pelas ROS, ele não pode gerar mais ROS. Assim, a eficácia de um fotossensibilizador é dada por um equilíbrio delicado entre a habilidade de um fotossensibilizador de interagir fortemente com o oxigênio molecular e sua capacidade de sobreviver a essa interação sem ser branqueado (4). As diferentes orientações espaciais dos meta-substituintes nos atropisômeros α4, α3β, α2β2 e αβαβ podem oferecer interações distintas e insuspeitas com o oxigênio molecular. Esta invenção demonstra pela primeira vez que os atropisômeros α4, α3β, α2β2 e αβαβ possuem interações diferenciais com oxigênio molecular e/ou ROS manifestados em diferentes tempos de vida do triplete e/ou rendimentos quânticos de fotodecomposição. Essas diferenças podem explicar a atividade diferencial de PDT dos atropisômeros.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] A separação dos atropisômeros α4 e α3β e as composições farmacêuticas enriquecidas nos atropisômeros α4 e α3β revelados nesta invenção são a primeira evidência de que os atropisômeros possuem uma atividade de PDT diferencial e que as suas diferenças podem ser exploradas para melhorar o resultado terapêutico da PDT. "Composto de atropisômero enriquecido" é entendido como uma mistura de atropisômeros obtidos na síntese de tetrafenilclorinas halogenadas e tetrafenilbacterioclorinas halogenadas que foram purificadas para remover parcialmente os menores atropisômeros αβαβ fotoativos e α2β2 presentes na mistura estatística de atropisômeros obtida na síntese, em que as tetrafenilclorinas e as tetrafenilbacterioclorinas possuem átomos de halogênio em pelo menos uma das posições orto dos grupos fenila ou, quando ambas as posições orto estão ocupadas pelo mesmo átomo de halogênio, possuem diferentes substituintes nas duas posições meta dos grupos fenila.

[009] A presente invenção proporciona um processo para a preparação de uma composição farmacêutica enriquecida em atropisômeros α4 e α3β que proporciona um novo conjunto decompostos fotoativos com maior atividade de PDT. São incluídas as composições farmacêuticas em que os atropisômeros da Figura 1 com mais de metade dos grupos R' no mesmo lado do plano definido pelo macrociclo constituem mais de 70% da quantidade total de atropisômeros presentes na composição.

[0010] O processo de preparação da composição farmacêutica da invenção aproveita a capacidade de separar atropisômeros de tetrafenilclorinas halogenadas ou tetrafenilbacterioclorinas halogenadas à temperatura ambiente, ou mesmo a temperaturas superiores à temperatura ambiente, possivelmente na presença de luz e oxigênio, utilizando as suas diferenças em solubilidade, ou em coeficientes de partição, em solventes apropriados ou em diferentes tempos de retenção em cromatografia. A diferente orientação espacial dos grupos polares presentes nos anéis fenila das tetrafenilporfirinas, tetrafenilclorinas ou tetrafenilbacterioclorinas dá origem a diferentes polaridades, formas e volumes excluídos, e permite a separação cromatográfica dos atropisômeros. Além disso, as diferenças na solubilidade, ou nos coeficientes de partição, dos atropisômeros em diferentes solventes permitem mudanças na composição de atropisômeros usando precipitação seletiva, recristalização preferencial, extração com solvente ou simplesmente lavando a mistura de atropisômero com um solvente apropriado. É possível reduzir a fração de um determinado atropisômero de eficácia de PDT mais baixa presente na mistura ou aumentar a fração de outro atropisômero de maior eficácia de PDT também presente na mistura, apenas por dissolução seletiva de parte do desejado ou indesejável atropisômero com um solvente de polaridade apropriada. Também é possível converter parcialmente um atropisômero em outro por tratamento térmico ou fotoquímico, de modo que as moléculas adquiram energia suficiente para superar a rotação impedida de ligações simples de fenil-macrociclo e, assim, alterar a composição da mistura de atropisômero.

[0011] A presente invenção descreve os atropisômeros mais eficientes de tetrafenilclorinas halogenadas e tetrafenilbacterioclorinas para a terapia fotodinâmica de distúrbios hiperproliferativos e de infecções bacterianas e virais e uma composição farmacêutica enriquecida nos dois atropisômeros mais eficientes de tetrafenilclorinas halogenadas, a saber, α3β e α4 apresentadas em Fórmulas (IC) e (I-D), respectivamente, caracterizados por possuir a maioria dos substituintes volumosos na posição meta dos grupos fenila no mesmo lado do plano de macrociclo,

em que:

representa uma ligação simples carbono-carbono ou uma ligação dupla carbono-carbono; as linhas em negrito indicam que os átomos em negrito, e os grupos ligados a eles, são estericamente restritos de forma a existir acima do plano definido pelo anel de macrociclo; X2, X4, X6 e X8 são halogênios (F, Cl, Br); X1, X3, X5 e X7 são halogênios (F, Cl, Br) ou hidrogênio; R1, R2, R3 e R4 são independentemente -OH, -OR ou -SO2R", onde R" são cada um independentemente escolhidos dentre -Cl, -OH, -aminoácido, -OR, -NHR ou -NR2, onde R são alquila de 1 a 12 átomos de carbono ou R2 representa cicloalquila com 2 a 12 átomos de carbono; R5, R6, R7 e R8 são independentemente H, -OH, -OR, -Cl ou -NHR onde R são alquila de 1 a 12 átomos de carbono; ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, em que a quantidade relativa dos atropisômeros ou os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos é mais de 70% do total de atropisômeros na composição farmacêutica.

[0012] Em outra modalidade da presente invenção, a composição farmacêutica é enriquecida nos atropisômeros mais eficientes de tetrafenilclorinas halogenadas e tetrafenilbacterioclorinas, α3β e α4, de modo que os atropisômeros eficientes ou os seus sais farmaceuticamente aceitos constituem (combinados) mais de 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% dos atropisômeros presentes na composição farmacêutica.

[0013] Assim, os compostos de Fórmulas (I-C) e (I-D) podem ser derivados de clorinas com as fórmulas:

[0014] Alternativamente, os compostos de Fórmulas (I-C) e (I-D) podem ser derivados de bacterioclorinas com as fórmulas:

em que: as linhas em negrito indicam que os átomos em negrito e os grupos anexados são restritos estericamente de modo a existir acima do plano definido pelo anel de macrociclo; X2 adequados são halogênios (F, Cl, Br); X1 adequados são hidrogênios ou halogênios (F, Cl, Br); R' adequados são -SO2R", em que R" são cada um independentemente escolhidos de -Cl, -OH, -aminoácido, -OR, -NHR ou -NR2, em que R são alquila de 1 a 12 átomos de carbono ou R2 representa cicloalquila com 2 a 12 átomos de carbono;ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

[0015] Os atropisômeros preferidos das Fórmulas (III-C) e (III-D) são aqueles em que X2 são flúor ou cloro, e X1 são flúor ou cloro ou hidrogênio, e R' são -SO2NHRn onde Rn são alquila com 1 a 6 átomos de carbono.

[0016] Mais especificamente, o atropisômero preferido α4 de Fórmula (III-D), em que X2 são flúor ou cloro, e X1 são flúor ou cloro ou hidrogênio, e R' são -SO2NHRn em que Rn são alquila de 1 a 6 átomos de carbono.

[0017] Os compostos preferidos específicos da invenção incluem o atropisômero α4 de 5,10,15,20-tetraquis (2,6- difluoro-3-N-metilsulfamoilfenil)bacterioclorina, de fórmula LUZ11-D e o atropisômero α3β de 5,10,15,20- tetraquis(2,6-difluoro-3-N-metilsulfamoilfenil) bacterioclorina, de fórmula LUZ11-C.

[0018] Em outra modalidade da presente invenção, a composição farmacêutica é enriquecida no atropisômero mais eficiente de tetrafenilclorinas halogenadas e tetrafenilbacterioclorinas, α4, que tem todos os substituintes volumosos no mesmo lado do plano definido pelo macrociclo, de tal modo que o atropisômero eficiente ou o seu sal farmaceuticamente aceito constitui mais de 20% dos atropisômeros presentes na composição farmacêutica.

[0019] Em outra modalidade da presente invenção, a composição farmacêutica é enriquecida no segundo atropisômero mais eficiente de tetrafenilclorinas halogenadas e tetrafenilbacterioclorinas, α3β, que possui a maioria dos substituintes volumosos no mesmo lado do plano definido pelo macrociclo, de tal modo que o atropisômero eficiente ou o seu sal farmaceuticamente aceito constitui mais de 60% dos atropisômeros presentes na composição farmacêutica.

[0020] Em outra modalidade da presente invenção, a composição farmacêutica é enriquecida no segundo atropisômero mais eficiente de tetrafenilclorinas halogenadas e tetrafenilbacterioclorinas, α3β, que possui a maioria dos substituintes volumosos no mesmo lado do plano definido pelo macrociclo, de tal modo que o atropisômero eficiente ou o seu sal farmaceuticamente aceito constitui mais de 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% dos atropisômeros presentes na composição farmacêutica.

[0021] Em outra modalidade da presente invenção, a composição farmacêutica é enriquecida no atropisômero mais eficiente de tetrafenilclorinas halogenadas e tetrafenilbacterioclorinas, α4, de tal modo que o atropisômero eficiente ou o seu sal farmaceuticamente aceito constitui mais de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% dos atropisômeros presentes na composição farmacêutica.

[0022] Em outra modalidade da presente invenção, a composição farmacêutica compreende adicionalmente um veículo farmaceuticamente aceito.

[0023] A presente invenção também descreve um processo para a preparação de uma composição farmacêutica enriquecida nos dois atropisômeros mais eficientes de tetrafenilclorinas halogenadas e tetrafenilbacterioclorinas, nomeadamente atropisômeros α3β e α4, que possuem a maioria dos substituintes volumosos no mesmo lado do plano definido pelo macrociclo, compreendendo uma etapa de isolar a mistura de ou bacterioclorina de fórmulas:

em que:

representa uma ligação simples carbono-carbono ou uma ligação dupla carbono-carbono; as linhas em negrito indicam que os átomos em negrito e os grupos ligados a eles são estericamente restritos de forma a existir acima do plano definido pelo anel de macrociclo; X2, X4, X6 e X8 são halogênios (F, Cl, Br); X1, X3, X5 e X7 são halogênios (F, Cl, Br) ou hidrogênio; R1, R2, R3 e R4 são independentemente -OH, -OR ou -SO2R", onde R" são, cada um, independentemente escolhidos dentre -Cl, -OH, -aminoácido, -OR, -NHR ou -NR2, onde R é alquila de 1 a 12 átomos de carbono ou R2 representa cicloalquila com 2 a 12 átomos de carbono; R5, R6, R7 e R8 são independentemente H, -OH, -OR, -Cl ou -NHR onde R são alquila de 1 a 12 átomos de carbono; nas quais os atropisômeros com a maioria dos grupos R1, R2, R3 e R4 no mesmo lado do plano de macrociclos são, pelo menos parcialmente, separados por precipitação seletiva, cromatografia, extração com solvente, isomerização rotacional térmica ou fotoquímica ou fotodecomposição seletiva. Assim, as composições farmacêuticas que são enriquecidas nos atropisômeros desejados das fórmulas aqui contidas (por exemplo, enriquecidas em α3β e α4, α3β ou α4) podem ser obtidas por qualquer método, incluindo precipitação seletiva, cromatografia, extração com solvente, isomerização rotacional térmica ou fotoquímica ou fotodecomposição seletiva, ou podem ser enriquecidos pela combinação de lotes isolados ou enriquecidos de um único atropisômero ou combinação de atropisômeros para proporcionar uma composição com a razão desejada de atropisômeros das fórmulas aqui contidas.

[0024] O enriquecimento da composição farmacêutica é possível uma vez que é possível separar parcialmente os atropisômeros αβαβ, α2β2, α3β e α4 aproveitando a diferença de polaridade e/ou volume excluído e/ou forma e/ou fotoestabilidade dos atropisômeros que têm a maioria dos grupos R1, R2, R3 ou R4 no mesmo lado do plano em relação aos atropisômeros que possuem o mesmo número de grupos R1, R2, R3 ou R4 em cada lado do plano. Esta separação é ativada pela estabilidade de cada atropisômero em conjunto com a barreira elevada para a rotação da ligação macrociclo- fenila nos atropisômeros de Fórmula (I).

[0025] Em outra modalidade da presente invenção, a precipitação seletiva da mistura de atropisômeros de clorina ou bacterioclorina dissolvida em primeiro lugar em um solvente de maior polaridade e depois precipitada seletivamente pela adição à solução de um solvente com menor polaridade conduz ao precipitado enriquecido em atropisômeros αβαβ e α2β2 e uma solução enriquecida nos atropisômeros α3β e α4 de tal modo que suas concentrações se adicionem a pelo menos 70% (por exemplo, pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%) da concentração de todos os atropisômeros presentes em solução. Mutatis mutantis, a mistura de atropisômeros pode primeiro ser dissolvida em um solvente de polaridade inferior e a precipitação seletiva obtida com a adição de um solvente de maior polaridade.

[0026] Em outra modalidade da presente invenção, a extração com solvente compreende uma primeira etapa de dissolver a mistura de atropisômeros de clorina ou bacterioclorina com um solvente polar; e uma segunda etapa de adicionar um solvente menos polar que forma uma separação de fase líquido-líquido com o solvente polar, extraindo assim os atropisômeros menos polares. Em outra modalidade da presente invenção, a recristalização compreende a formação de cristais contendo os atropisômeros com a maioria dos grupos R1, R2, R3 ou R4 no mesmo lado do plano de macrociclo que é complementar à composição de atropisômero no licor-mãe.

[0027] Em outra modalidade da presente invenção, a isomerização rotacional térmica ou fotoquímica compreende uma primeira etapa de ligação preferencial de pelo menos um atropisômero da mistura de atropisômeros de clorina ou bacterioclorina a um suporte ao qual pelo menos um atropisômero possui uma elevada afinidade; e uma segunda etapa de fornecer energia térmica ou radiativa suficiente para promover a isomerização rotacional preferencial dos atropisômeros menos ligados ao suporte.

[0028] Em outra modalidade da presente invenção, o suporte é preferencialmente gel de sílica e o atropisômero preferencialmente ligado ao suporte é o atropisômero com a Fórmula (I-D).

[0029] Em outra modalidade da presente invenção, a fotodecomposição seletiva compreende uma primeira etapa de dissover a mistura de atropisômeros de clorina ou bacterioclorina em um solvente aerado; e uma segunda etapa de irradiar com a luz que é absorvida pela mistura de atropisômeros para fotodecompor em maior medida os atropisômeros menos fotoestáveis.

[0030] Uma vantagem dos atropisômeros α3β e α4 da presente invenção reside na sua capacidade de interagir fortemente com o oxigênio molecular para gerar espécies de oxigênio mais reativas e produzir um estresse oxidativo mais forte localmente. Outra vantagem é o aumento da fotoestabilidade que aumenta o volume de espécies de oxigênio reativo para mais fótons absorvidos.

[0031] É também o objetivo desta invenção revelar o uso das composições farmacêuticas aqui descritas para o tratamento de distúrbios hiperproliferativos incluindo, mas não estando limitados a, cânceres ou carcinomas, mielomas, psoríase, degeneração macular, bem como condições pré- cancerosas incluindo, mas não limitado a, displasia cervical e displasia oral.

[0032] É também o objetivo desta invenção revelar o uso das composições farmacêuticas aqui descritas para o tratamento de doenças infecciosas causadas por microorganismos incluindo, mas não se limitando a, vírus, bactérias, rickettsia, micoplasma, protozoários, fungos; ou parasitas, incluindo, mas não se limitando a, invertebrados multicelulares geralmente microscópicos ou muito pequenos, ou óvulos ou formas juvenis do mesmo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0033] Sem intenção de limitar a revelação aqui, este pedido apresenta desenhos anexos de modalidades ilustradas para uma compreensão mais fácil.

[0034] Figura 1. Atropisômeros de tetrafenilbacterioclorinas halogenadas, onde as linhas em negrito representam ligações que estão acima do plano de macrociclo e definem a orientação do grupo R acima ou abaixo desse plano, conforme ilustrado pelos esquemas abaixo das estruturas. O grupo R' representa -SO2R", onde R" são cada um independentemente escolhidos de -Cl, -OH, -aminoácido, -OR, -NHR e -NR2 em que R é alquila de 1 a 12 átomos de carbono ou R2 representa cicloalquila com 2 a 12 átomos de carbono. Os átomos X1 e X2 são, cada um, independentemente escolhidos de halogênio (F, Cl, Br) e átomos de hidrogênio, desde que pelo menos todos os X2 sejam halogênios.

[0035] Figura 2. Cromatograma de UHPLC com detecção a 380 nm de uma amostra de 5,10,15,20-tetraquis(2,6-difluoro- 3-N-metilsulfamoilfenil)clorina obtida na síntese sem solvente.

[0036] Figura 3. Espectro de 1H-RMN de uma amostra de 5,10,15,20-tetraquis(2,6-difluoro-3-N- metilsulfamoilfenil)clorina obtida na síntese sem solvente.

[0037] Figura 4. Cromatograma de HPLC de uma amostra de 5,10,15,20-tetraquis(2,6-difluoro-3-N- metilsulfamoilfenila)bacterioclorina obtida na síntese sem solvente.

[0038] Figura 5. Espectro de 1H-RMN da amostra de 5,10,15,20-tetraquis(2,6-difluoro-3-N-metilsulfamoilfenila) bacterioclorina obtida na síntese sem solvente.

[0039] Figuras 6A, 6B, 6C e 6D. Cromatogramas de HPLC de amostras LUZ11-A, LUZ11-B, LUZ11-C e LUZ11-D separadas por HPLC preparativa.

[0040] Figura 7. Espectro de 1H-RMN da amostra LUZ11-A.

[0041] Figura 8. Espectro de 1H-RMN da amostra LUZ11-B.

[0042] Figura 9. Espectro de 1H-RMN da amostra LUZ11-C.

[0043] Figura 10. Espectro de 1H-RMN da amostra LUZ11- D.

[0044] Figura 11. Estrutura de raio-X do atropisômero α4 de 5,10,15,20-tetraquis(2,6-difluoro-3-N-metilsulfamoilfenil)bacterioclorina, onde os átomos de flúor são representados em amarelo, os átomos de nitrogênio em azul, os átomos de enxofre em verde, os átomos de oxigênio em vermelho e os átomos de carbono em preto.

[0045] Figura 12. A) Espectro de absorção em etanol de amostras LUZ11-A, LUZ11-B, LUZ11-C e LUZ11-D. B) Placas de Beer-Lambert das mesmas amostras utilizadas para calcular os coeficientes de absorção molar das amostras, supondo que toda a massa ponderada seja a massa de LUZ11.

[0046] Figura 13. Cromatogramas de HPLC das frações X e Y revelando o enriquecimento da fração Y na soma dos atropisômeros α3β e α4.

[0047] Figura 14. Decaimento da absorção no pico do maior comprimento de onda de amostras de LUZ11-A (744,5 nm), LUZ11-B (744,5 nm), LUZ11-C (745 nm) e LUZ11-D (746 nm) em metanol:PBS (3:2), em função da duração da irradiação.

[0048] Figura 15. Frações de sobrevivência de células HT-29 para aumentar as doses de fotosensibilizadores das amostras LUZ11, LUZ11-A, LUZ11-B, LUZ11-C e LUZ11-D e uma dose de luz constante de 1 J/cm2 usado para obter os valores IC50 e IC90 apresentados na Tabela 5.

[0049] Figura 16. Frações de sobrevivência de células CT26 para aumentar as doses de fotosensibilizadores das amostras LUZ11, LUZ11-A, LUZ11-B, LUZ11-C e LUZ11-D e uma dose de luz constante de 1 j/cm2, utilizada para obter os valores de IC50 e IC90 apresentados nas Tabelas 1 e 5.

[0050] Figura 17. Plano de Kaplan-Meier do crescimento tumoral de CT26 em camundongos BALB/C após PDT com 0,7 mg/kg do fotosensibilizador indicado no lote e fluência de luz de 41 J/cm2. Os camundongos que permaneceram isentos de tumor 60 dias após o tratamento foram considerados curados.

[0051] Figura 18. Plano de Kaplan-Meier do crescimento tumoral de CT26 em camundongos BALB/C após PDT com 0,7 mg/kg das composições de atropisômero indicadas no lote e fluência de luz de 41 J/cm2. Os camundongos que permaneceram isentos de tumor 60 dias após o tratamento foram considerados curados. A amostra X e a amostra Y são do exemplo 3.

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES

[0052] Referindo-se aos desenhos, aqui são descritas modalidades opcionais com mais detalhes, que, no entanto, não se destinam a limitar o escopo da presente aplicação.

A. Definições

[0053] Para o propósito deste pedido, serão aplicadas as seguintes definições.

[0054] O termo "estereoisômero" se refere a compostos que têm uma constituição química idêntica, mas diferem em relação à disposição de átomos ou de grupos de átomos no espaço.

[0055] "Atropisômero" é um estereoisômero que resulta da rotação axial lenta em torno de uma única ligação, pode interconverter-se termicamente ou fotoquimicamente, mas a interconversão é suficientemente lenta à temperatura ambiente sob a luz ambiente para permitir a separação analítica.

[0056] "Mistura estatística de atropisômeros" de tetrafenilporfirinas halogenadas, tetrafenilclorinas ou tetrafenilbacterioclorinas refere-se à mistura dos atropisômeros αβαβ, α2β2, α3β e α4 obtidos na síntese onde os atropisômeros estão presentes nas seguintes proporções: (α2β2)/(αβαβ) entre 1,5 e 2,5, (α3β)/(αβαβ) entre 3,0 e 4,5, (α4)/(αβαβ) entre 0,6 e 1,2.

[0057] Composições farmacêuticas "enriquecidas em atropisômeros α4 e α3β " são entendidas como misturas de atropisômeros que têm um teor relativo inferior dos atropisômeros menos fotoativos αβαβ e α2β2 em relação ao conteúdo dos atropisômeros mais fotoativos α4 e α3β presentes na mistura estatística de atropisômeros obtido na síntese do composto fotoativo, de modo que os atropisômeros α4 e α3β constituem mais de 70% da mistura.

[0058] "Eficácia de PDT" é a capacidade do composto fotoativo para matar células, bactérias ou vírus, ou para destruir tecido doente, para um determinado fármaco e dose de luz. Uma maior eficácia de PDT corresponde a uma maior extensão de morte celular, morte de microrganismos ou necrose de tecido para a mesma dose de composto fotoativo e leve.

[0059] A "dose de luz" é uma medida do número de fótons entregues ao alvo onde o composto fotoativo está presente.

[0060] "LUZ11" é um nome de código para 5,10,15,20- tetraquis(2,6-difluoro-3-N-metilsulfamoilfenil) bacterioclorina. "LUZ11-A" é uma amostra substancialmente composta pelo atropisômero αβαβ de LUZ11. "LUZ11-B" é uma amostra substancialmente composta pelo atropisômero α2β2 de LUZ11. "LUZ11-C" é uma amostra substancialmente composta pelo atropisômero α3β de LUZ11. "LUZ11-D" é uma amostra substancialmente composta pelo atropisômero α4 de LUZ11.

[0061] "Substancialmente composto" neste contexto se refere a uma composição em que o atropisômero é pelo menos 80% dos atropisômeros presentes na amostra.

[0062] A HPLC é utilizada para significar Cromatografia Líquida de Alta Pressão.

[0063] Tal como aqui utilizado, "distúrbios hiperproliferativos" significam que os distúrbios da condição compartilham como patologia subjacente proliferação celular excessiva causada por crescimento celular não regulado ou anormal e incluem angiogênese descontrolada. Exemplos de distúrbios hiperproliferativos incluem, mas não estão limitados a, cânceres ou carcinomas, mielomas, psoríase, degeneração macular.

[0064] "Tecido hiperproliferativo", como aqui utilizado, significa tecido que cresce fora de controle e inclui tumores e crescimento desenfreado de vasos, como o crescimento de vasos sanguíneos encontrados na degeneração macular relacionada à idade.

[0065] Como uso aqui, "agente infectante" indica microrganismos invasivos ou parasitas. Tal como aqui utilizado, o "microorganismo" designa vírus, bactérias, rickettsia, micoplasma, protozoários, fungos e microorganismos semelhantes, e "parasita" denota invertebrados multicelulares infecciosos, geralmente microscópicos ou muito pequenos, ou óvulos ou formas juvenis.

[0066] A invenção também proporciona uma composição farmacêutica, compreendendo uma quantidade eficaz de um composto aqui descrito (por exemplo, atropisômeros das fórmulas aqui) e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0067] Os níveis de dosagem reais e o tempo de administração dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas desta invenção podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz para obter a resposta terapêutica desejada para um paciente, composição e modo particular de administração, sem ser tóxico (ou inaceitavelmente tóxico) para o paciente.

[0068] Em uso, pelo menos um composto de acordo com a presente invenção (por exemplo, os atropisômeros das fórmulas aqui) é administrado em uma quantidade farmaceuticamente eficaz a um indivíduo que dele necessite em um veículo farmacêutico por meio de injeção intravenosa, intramuscular, subcutânea, intralesional ou intracerebroventricular ou por administração oral ou aplicação tópica. De acordo com a presente invenção, um composto da invenção pode ser administrado sozinho ou em conjunto com uma segunda terapêutica diferente. Por "em conjunto com" entende-se em conjunto, substancialmente simultaneamente ou sequencialmente. Em uma modalidade, um composto da invenção é administrado de forma aguda. O composto da invenção pode, portanto, ser administrado para um curto curso de tratamento, tal como durante cerca de 1 dia a cerca de 1 semana. Em outra modalidade, o composto da invenção pode ser administrado durante um período de tempo mais longo para melhorar distúrbios crônicos, tais como, por exemplo, durante cerca de uma semana a vários meses, dependendo da condição a ser tratada.

[0069] Por "quantidade farmaceuticamente eficaz", tal como aqui utilizado, entende-se uma quantidade de um composto da invenção (por exemplo, atropisômeros das fórmulas aqui contidas), suficientemente elevado para modificar significativamente positivamente a condição a ser tratada, mas suficientemente baixa para evitar efeitos secundários graves (a uma relação benefício/risco razoável), no âmbito de um bom julgamento médico. Uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um composto da invenção variará com o objetivo particular a atingir, a idade e condição física do paciente a ser tratado, a gravidade da doença subjacente, a duração do tratamento, a natureza da terapia concomitante e o composto específico empregado. Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da invenção administrado a uma criança ou a um recém-nascido será reduzida proporcionalmente de acordo com um bom julgamento médico. A quantidade eficaz de um composto da invenção será assim a quantidade mínima que proporcionará o efeito desejado. Além disso, com a terapia fotodinâmica, a "quantidade farmaceuticamente eficaz" da composição ou composto farmacêutico é parcialmente dependente de outros fatores, tais como a dose de luz e o oxigênio, os quais são necessários para se obter um resultado terapêutico. Assim, haverá também uma "quantidade eficaz" de luz, bem como quantidade de oxigênio ao tratar um indivíduo ou paciente. Outros fatores importantes que contribuem para a determinação da "quantidade farmaceuticamente eficaz" de fármacos, luz e oxigênio incluem intervalos de fármacos para luz (o tempo entre administração de fármaco e iluminação do tecido). O intervalo de fármaco para luz é importante porque, por exemplo, administrar uma dose mais elevada de medicamento de 50 mg/kg e iluminar o tecido uma semana depois com uma dose de luz de 500 J/cm2 pode ser tão ineficiente ou ineficaz quanto o uso uma dose de fármaco de 0,01 mg/kg e iluminando o tecido 10 minutos após a administração a uma dose de luz de 0,1 J/cm2. A eliminação de fármacos (metabolismo) pelo organismo entre a administração do fármaco e a iluminação pode diminuir a eficácia da terapia quando o intervalo de fármaco para luz aumenta (torna-se mais longo). No entanto, o aumento do intervalo de fármaco para luz pode levar a uma terapia mais seletiva e a menores efetivos adversos. Assim, pelo menos por estes motivos, o intervalo de fármaco para luz é um fator importante a considerar ao determinar a "quantidade farmaceuticamente eficaz" das composições da presente invenção.

[0070] Além dos fatores discutidos acima que afetam a determinação da "quantidade eficaz" de fármacos, luz, oxigênio e intervalo de fármaco para luz, uma pessoa com conhecimentos comuns na técnica também levaria em consideração a taxa de fluência da luz (quantos fótons são entregues por unidade de área por unidade de tempo). A taxa de fluência é importante porque a entrega de muitos fótons demasiado rápido pode esgotar o oxigênio no tecido e tornar a terapia ineficiente ou ineficaz.

[0071] Finalmente, outro parâmetro que é importante para um tratamento eficaz é a margem do tumor ou tecido que está sendo irradiado. Com os tratamentos fotodinâmicos, o tecido irradiado é o alvo principal da terapia e morrerá primeiro, embora os efeitos sistêmicos (fora do campo de irradiação) também possam ser observados como resultado da estimulação do sistema imunológico do hospedeiro e/ou outras cascatas de efeitos biológicos provocados pelo efeito do tratamento fotodinâmico no alvo primário. Assim, a seleção da margem é tão importante no tratamento de um indivíduo ou paciente usando terapia fotodinâmica, como seria o uso de tratamento cirúrgico.

[0072] Uma vantagem prática decidida da presente invenção é que o composto (por exemplo, os atropisômeros das fórmulas aqui) pode ser administrado de uma maneira conveniente, tal como por via intravenosa, intramuscular, subcutânea, oral, intralesional ou intracerebroventricular ou por aplicação tópica, como em cremes ou géis. Dependendo da via de administração, os ingredientes ativos que compreendem um composto da invenção podem ser obrigados a serem revestidos em um material para proteger o composto da ação de enzimas, ácidos e outras condições naturais que podem inativar o composto. Para administrar um composto da invenção por administração diferente da administração parenteral, o composto pode ser revestido por, ou administrado com um material para prevenir a inativação ou para melhorar a dissolução.

[0073] O composto (por exemplo, atropisômeros das fórmulas aqui contidas) pode ser administrado parentericamente ou intraperitonealmente. As dispersões também podem ser preparadas, por exemplo, em glicerol, polietilenoglicóis líquidos e suas misturas e em óleos.

[0074] As formas farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem soluções estéreis (onde são solúveis) ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Em todos os casos, a forma deve ser estéril e deve ser fluida na medida em que exista uma fácil injetabilidade. Deve ser estável nas condições de fabricação e armazenamento. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, DMSO, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol líquido e semelhantes), suas misturas adequadas e óleos vegetais. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pela utilização de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso da dispersão. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio.

[0075] As soluções injetáveis estéreis são preparadas incorporando o composto da invenção na quantidade requerida no solvente apropriado com vários dos outros ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido de esterilização por filtração. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando os vários compostos esterilizados em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários dos enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação preferidos são a secagem à vácuo e a técnica de liofilização que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma mesma solução filtrada previamente esterilizada.

[0076] Para a administração terapêutica oral, o composto pode ser incorporado com excipientes e utilizado na forma de comprimidos ingeríveis, comprimidos bucais, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, pastilhas e semelhantes. As composições ou preparações de acordo com a presente invenção são preparadas de modo a que uma forma de unidade de dosagem oral contenha uma concentração de composto suficiente para tratar um distúrbio em um indivíduo.

[0077] Alguns exemplos de substâncias que podem servir como veículos farmacêuticos são açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose; amidos, como amido de milho e amido de batata; celulose e seus derivados, tais como carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose e acetatos de celulose; tragancanto em pó; malte; gelatina; talco; ácidos esteáricos; esteacamundongo de magnésio; sulfato de cálcio; óleos vegetais, como óleos de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de gergelim, azeite, óleo de milho e óleo de cupuaçu; polióis, tais como propilenoglicol, glicerina, sorbitol, manitol e polietilenoglicol; ágar; ácidos algínicos; água sem pirogênio; solução salina isotônica; e solução tampão fosfato; leite em pó desnatado; bem como outras substâncias compatíveis com substâncias não tóxicas usadas em formulações farmacêuticas como a vitamina C, estrogênio e equinácea, por exemplo. Também podem estar presentes agentes umidificantes e lubrificantes, tais como laurilsulfato de sódio, bem como agentes corantes, agentes aromatizantes, lubrificantes, excipientes, agentes de produção de comprimidos, estabilizadores, antioxidantes e conservantes.

[0078] Em outra modalidade, a invenção proporciona uma composição possuindo uma faixa de dosagem ou um método como descrito acima, em que a quantidade eficaz do composto aqui delineado (por exemplo, os atropisômeros das fórmulas aqui) varia de cerca de 0,005 μ g/kg a cerca de 200 mg/kg. Em certas modalidades, a quantidade eficaz do composto das fórmulas aqui contidas (por exemplo, os atropisômeros das fórmulas aqui) varia de cerca de 0,02 mg/kg a cerca de 20 mg/kg. Em outra modalidade, a quantidade eficaz do composto delineado aqui varia de cerca de 0,2 mg/kg a 2 mg/kg. Em outra modalidade, a quantidade eficaz do composto delineado aqui varia de cerca de 0,2 mg/kg a 1 mg/kg e a dose de luz varia de 30 a 300 J/cm2. Em outra modalidade, a quantidade eficaz do composto delineado aqui varia de cerca de 0,5 mg/kg a 2 mg/kg e a dose de luz varia de 20 a 150 J/cm2. Em outra modalidade, a quantidade eficaz do composto delineado aqui varia de cerca de 0,05 mg/kg (50 ng/mL) a 5 mg/kg, a dose de luz está entre 3 e 300 J/cm2 e o intervalo fármaco para luz é selecionado de forma concomitante com a administração do fármaco a uma semana após a administração do fármaco.

[0079] Em outras modalidades, a invenção proporciona um método como descrito acima, em que a quantidade eficaz do composto aqui delineado (por exemplo, atropisômeros das fórmulas aqui), no tecido alvo no momento da irradiação, varia entre cerca de 0,1 nM e cerca de 50 μ M. Em certas modalidades, a quantidade eficaz varia de cerca de 10,0 pM a cerca de 10 nM. Em outra modalidade, a quantidade eficaz varia de cerca de 0,2 nM a cerca de 2 nM. Em outra modalidade, a quantidade eficaz varia de cerca de 0,1 μ M a cerca de 100 μ M.

[0080] Outro objeto da presente invenção é um kit que compreende uma composição farmacêutica delineada aqui e instruções para a administração da composição. O kit pode fornecer a composição farmacêutica em qualquer recipiente adequado (isto é, vaso, frasco, seringa, ampola, tubo) e inclui instruções tais como terapia/administração fotodinâmica (por exemplo, instruções de exposição à luz, exposição ao comprimento de onda e instruções de duração).

[0081] Outro objeto da presente invenção é o uso de um composto tal como aqui descrito (por exemplo, atropisômeros das fórmulas aqui) na fabricação de um medicamento para utilização no tratamento de um distúrbio ou doença aqui descrito. Outro objeto da presente invenção é a utilização de um composto como aqui descrito (por exemplo, atropisômeros das fórmulas aqui) para utilização no tratamento de um distúrbio ou doença aqui descrita.

[0082] A citação de uma lista de grupos químicos em qualquer definição de uma variável aqui inclui definições dessa variável como um único grupo ou combinação de grupos listados. A citação de uma modalidade para uma variável aqui inclui essa modalidade como qualquer modalidade única ou em combinação com quaisquer outras modalidades ou porções da mesma. A citação de uma modalidade aqui inclui aquela modalidade como qualquer modalidade única ou em combinação com quaisquer outras modalidades ou porções da mesma.

B. Compostos precursores

[0083] Os precursores de porfirina podem ser preparados usando um processo, descrito nas patentes PCT/EP/012212 (1) e PCT/PT2009/000057 (2), compreendendo as seguintes etapas: (1) redução da porfirina com a Fórmula (IV)

em que: uma mistura estatística de atropisômeros está presente; X2, X4, X6 e X8 são halogênios (F, Cl, Br); X1, X3, X5 e X7 são halogênios (F, Cl, Br) ou hidrogênio; R1, R2, R3 e R4 são independentemente -OH, -OR ou -SO2R", onde R" são, cada um, independentemente escolhidos dentre -Cl, -OH, -aminoácido, -OR, -NHR ou -NR2, onde R é alquila de 1 a 12 átomos de carbono ou R2 representa cicloalquila com 2 a 12 átomos de carbono; R5, R6, R7 e R8 são independentemente H, -OH, -OR, -Cl ou -NHR onde R são alquila de 1 a 12 átomos de carbono, ao derivado de clorina e/ou a derivados de bacterioclorina de formula

em que:

representa uma ligação simples carbono-carbono ou uma ligação dupla carbono-carbono; uma mistura estatística de atropisômeros está presente;utilizando hidrazidas e na presença de bases orgânicas impedidas como descrito na patente PCT/EP/012212 (1);opcionalmente, a etapa de redução pode ser realizada na ausência de solventes e na ausência de bases, conforme descrito na patente PCT/PT2009/000057 (2).

[0084] A hidrazida adequada é p-toluenossulfonil hidrazida, 4-clorobenzenossulfônica hidrazida, 4,4'- oxibis(benzenossulfonil) hidrazida, benzenossulfonil hidrazida, 4-metoxibenzenossulfonil hidrazida ou hidrazida benzóica.

[0085] A base estericamente impedida adequada é selecionada a partir de 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano (DABCO) e 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU).

[0086] A etapa de redução adequada é realizada a uma temperatura de 70 a 200 °C. A etapa de redução adequada é realizada a uma temperatura de pelo menos 100 °C. A etapa de redução adequada é realizada durante pelo menos 5 minutos.

[0087] A etapa de redução adequada é realizada sob uma atmosfera inerte.

[0088] A opção de realizar a reação na ausência de solventes adequada requer a utilização de uma temperatura que esteja acima do ponto de fusão de um dos reagentes, de modo que o outro reagente ou reagentes sejam parcialmente dissolvidos ou dispersos no fundido. Para as reações de estado sólido entre hidrazidas e derivados de porfirina, a reação de estado sólido é adequadamente realizada acima do ponto de fusão da hidrazida.

C. Instrumentos

[0089] As análises elementares foram realizadas em um analisador elementar Leco TruSpec CHNS. 1H-NMR e os espectros foram registrados em um Bruker Avance 400 MHz. As atribuições 1H foram feitas com experimentos 2D COSY e NOESY. Os dados de espectrometria de massa de alta resolução ESI-FIA TOF foram adquiridos usando um espectrômetro de massa Micromass Autospec. HPLC Shimadzu Prominence equipado com uma matriz de diodos (modelo SPD 20 AV). As separações foram seguidas a 743 nm, 23 °C em uma coluna semi-preparativa Inertsil-Phenyl (250* 10 mm; 5 μ m).

[0090] Os espectros de absorção foram registrados em um espectrofotômetro Shimadzu UV-2100. Os espectros de fluorescência foram medidos com um espectrofotômetro Spex Fluorolog 3, com correção para o sistema de dependência de comprimentos de onda (fotomultiplicador RCA C31034). Os espectros de absorção transitória foram medidos com um espectrômetro cinético de fotólise de flash laser de nanossegundo Applied Photophysics LKS 60, usando o terceiro harmônico de um laser Nd/YAG de Quanta Ray GCR 130-01 de Spectra-Physics para excitação, um fotomultiplicador Hamamatsu 1P28 e um osciloscópio Hewlett-Packard Infinium (1 GS/s). As medidas de fotólise instantânea foram feitas na presença de ar e em soluções saturadas de argônio. A fosforescência singleto-oxigênio de temperatura ambiente foi medida a 1270 nm com um fotomultiplicador Hamamatsu R5509-42, arrefecido a 193 K (-80,15°C) em uma câmara de nitrogênio líquido (Produtos para o modelo de pesquisa PC176TSCE005), seguindo a excitação a laser de soluções aeradas a 355 nm, usando uma adaptação de Espectrômetro de fotofísica aplicada. A irradiação de bacterioclorinas nas experiências de fotobranqueamento empregou laser CW emissor a 749 +/- 3 nm de Omicron Laserage.

D. Métodos

[0091] Uma quantidade adequada de cada fração foi dissolvida em solvente analítico até uma concentração de 0,025 mg/ml. Uma fração de 15 μ l da solução preparada foi então analisada por HPLC com detecção UV-Vis. A separação de atropisômeros foi conseguida utilizando uma coluna Zorbax XDB Eclipse Phenyl (150 * 4,6 mm; 5 μ m) e um programa de gradiente de duas fases móveis: metanol (fase móvel A) e uma solução tampão de acetato de amônio, 100 mM, pH 9,5 com metanol a 25:75, v/v (fase móvel B) bombeada a uma taxa de fluxo constante de 1,0 ml/min. A temperatura da coluna foi mantida constante a 20 °C. A quantidade relativa dos quatro atropisômeros LUZ11 foi determinada a 743 nm.

[0092] Os experimentos de fotobranqueamento foram realizados em soluções de metanol:PBS (3:2), em que PBS se refere a soluções salinas tamponadas com fosfato. As soluções foram irradiadas em uma cuveta com um caminho óptico de 1 cm usando um laser CW emissor a 749 + 3 nm de Omicron Laserage. A potência de saída total foi de 640 mW. Para cada composto, a absorbância foi colhida em intervalos de tempo de alguns minutos até horas de irradiação. As absorbâncias iniciais dos compostos foram cerca de 1,0.

[0093] Os espectros de absorção tripleto-tripleto e os tempos de tripleto dos atropisômeros (TT) foram medidos com o equipamento de espectro de absorção transitória descrito acima, com excitação a 355 nm, onde as soluções apresentaram absorbâncias entre 0,25 e 0,30.

[0094] Os rendimentos quânticos de oxigênio de singleto em etanol foram obtidos usando um procedimento descrito na literatura (17), utilizando como referência a fenalenona. O valor da literatura para o rendimento quântico de oxigênio singleto obtido com fenalenona em etanol é ΦΔ = 0,95 (18) .

[0095] As composições farmacêuticas aqui descritas foram avaliadas em estudos in vitro utilizando células tumorais em cultura e irradiação a laser de diodo a 749 nm. As células HT-29 (carcinoma do cólon humano) e CT26 (carcinoma do cólon de camundongo) foram cultivadas em meio Eagle modificado por Dulbecco (Sigma-Aldrich, Steinhelm, Alemanha) suplementado com 10% de soro bovino fetal inativado por calor (FBS) (Biochrom, Berlim, Alemanha) e 100 UI/ml de penicilina - 100 μ g/ml de streptomicina (Lonza, Verviers, Bélgica). As linhagens celulares foram mantidas em frascos de 75 cm2 (Orange Scientific, Brainc- l'Alleud, Bélgica) a 37 °C em atmosfera umidificada com 5% de CO2. As células de confluência de 85 a 90% foram separadas com a solução Trypsin-Versene-EDTA (Lonza, Verviers, Bélgica), contadas e semeadas em placas DB Falcon pretas de 96 poços com fundo plano transparente (Franklin Lakes, NJ, EUA) nas densidades desejadas, em 100 μ l de meio de cultura, e foram deixadas aderir durante a noite. As soluções de reserva de compostos de teste foram preparadas em dimetilsulfóxido e foram diluídas em meio de cultura de modo a obter a concentração desejada para a incubação com as células a 37°C durante 24h no escuro. Cada concentração foi testada, pelo menos, em triplicata. Após a incubação, as células foram lavadas uma vez com 200 μ l de PBS para remover o composto não internalizado e 100 μ l de meio de cultura fresco foi adicionado. As células foram irradiadas (cada poço individualmente) com um modelo de laser de diodo projetado para o cliente LDM750.300.CWA.L.M com o controlador 1201-08D e a cabeça laser 1201-08D (Omicron, Rodgau, Alemanha) que emitem a 749 nm. O feixe laser foi acoplado a uma fibra óptica com uma lente divergente ajustável no final da fibra, que foi fixada em um suporte e direcionada perpendicularmente à placa com as células. A lente de fibra foi ajustada para que a área de irradiação corresponda exatamente à área inferior dos poços da placa, garantindo que cada poço fosse irradiado individual e completamente com uma densidade de potência de 8,0 mW/cm2 no nível da placa. A medição do poder do laser foi realizada com um medidor de energia portátil LaserCheck (Coherent, Inc., Santa Clara, CA, EUA). O tempo de irradiação correspondente a uma dose de luz de 1,0 J/cm2 é de 125 segundos.

[0096] A viabilidade celular foi avaliada 24h após a irradiação utilizando o ensaio de redução da resazurina. Resumidamente, a solução de reserva de sal de resazurina (Sigma-Aldrich, Steinhelm, Alemanha) (0,1 mg/ml em PBS) foi diluída 10% em meio de cultura sem FBS ou antibióticos e foram adicionados 200 μ l às células em cada poço. As placas foram incubadas durante 3 a 4 h à 37 °C. Os valores de absorbância de cada poço foram medidos a 540 nm e 630 nm usando um leitor de microplacas Multiskan Ex (Thermo - Electron Corporation, Vartaa, Finlândia). Os resultados da viabilidade celular são expressos como média ± SD das condições replicadas de pelo menos duas experiências independentes.

[0097] Os estudos de viabilidade celular informam sobre a citotoxicidade dos fármacos. Isto foi quantificado pela expressão da morte celular em relação às células não tratadas (% das células de controle, mantidas no escuro). Os resultados foram plotados como curvas dose-resposta (% de viabilidade celular como função da concentração do fármaco), que permitem a determinação da concentração que reduz a viabilidade celular em 50% (IC50) e a concentração que reduz a viabilidade celular em 90% (IC90) sob uma determinada dose de luz.

[0098] Os camundongos utilizados no presente estudo foram fêmeas BALB/c pesando 20 a 25 g (Charles River Laboratories, Barcelona, Espanha). Os camundongos foram mantidos em uma dieta de laboratório padrão com acesso livre a água potável. A utilização destes animais para fins experimentais foi aprovada pela Autoridade Veterinária Nacional (autorização da DGVA n° 0420/000/000/2011). Para o estabelecimento do tumor, 350.000 células CT26 (CRL-2638™, ATCC-LCG Standards, Barcelona, Espanha) foram retomadas em 0,1 ml de PBS e inoculadas subcutaneamente na coxa direita de cada camundongo. Os tumores foram tratados 8 a 10 dias após a inoculação, quando seus diâmetros atingiram aproximadamente 5 mm. Os camundongos foram tratados com um protocolo vascular-PDT, que começou com a injeção intravenosa do composto (0,7 mg/kg) seguido de 15 minutos depois pela irradiação do tumor com laser de diodo Omicron a 749 nm com potência laser de 173 mW. O feixe laser foi acoplado a uma fibra óptica, com uma lente divergente fixa, que foi posicionada perpendicularmente à superfície do tumor, para irradiar uma área de 1,33 cm2 e entregar uma dose de luz total de 55 J.

E. Propriedades dos compostos

[0099] As absorções dos compostos foram medidas em várias concentrações em μiM e, em todos os casos, observaram-se que seguem a lei de Lambert-Beer. Além disso, o comprimento de onda da absorção máxima (Àmax) noinfravermelho não variou na faixa de concentração estudada. Isso é indicativo de pouca agregação entre as moléculas, que existem principalmente como monômeros nessas concentrações nos solventes estudados. A Tabela 1 apresenta coeficientes de absorção molar em infravermelho (εmax) e màxima de comprimento de onda em etanol obtidos para 5,10,15,20-tetraquis(2,6-difluoro-3-N-metilsulfamoilfenil) bacterioclorina (amostra LUZ11) e seus atropisômeros purificados (amostras LUZ11-A, LUZ11-B, LUZ11-C, LUZ11-D). Esta bacterioclorina possui uma intensa absorção de luz no infravermelho próximo, onde os tecidos humanos são mais transparentes do que visíveis, o que é um recurso de fotosensibilização preferido para PDT. Os atropisômeros têm pequenas diferenças em seu εmax. Por exemplo, εmax diminui em 3% das amostras LUZ11-A para LUZ11-D. A mesma Tabela também apresenta o tempo de vida do tripleto (TT) em soluções de etanol aeradas, produção quântica de fotodecomposição (0PD) em soluções de metanol:PBS (3:2) areadas e rendimentos quânticos de oxigênio singleto (0A) em soluções de etanol aerado.Tabela 1. Propriedades fotofísicas e fotoquímicas de amostras LUZ11 enriquecidas em seus vários atropisômeros em etanol, com exceção do rendimento quântico de fotodecomposição (0PD) que foi medido em metanol:PBS (3:2) e a fototoxicidade para células CT26 in vitro para uma dose de luz de 1 J/cm2.

*Extrapolado a partir da curva de regressão não-linear.

[00100] Os tempos de vida transitórios foram medidos a 400, 610 e 790 nm. Todos os decaimentos do tripleto foram claramente mono-exponenciais e, no etanol saturado com ar, os tempos de vida do tripleto estavam na faixa de 200 a 300 nanosegundos. Tais valores são consistentes com a transferência de energia limitada por difusão do estado tripleto do fotossensibilizador para o oxigênio molecular através de uma interação de transferência de carga (4). A fotodecomposição utilizou um laser CW emissor a 749 ± 3 nm e potência total de 640 mW. Todos os compostos seguiram uma diminuição mono-exponencial em suas intensidades de absorção. O atropisômero mais fotossensível na Tabela 1 é a amostra LUZ11-D, com um rendimento quântico de fotodecomposição ΦPD = 9 x 10-6.

[00101] Todas as emissões de oxigênio singleto medidas em soluções de etanol aerado são muito bem descritas por decaimentos mono-exponenciais, com tempo de vida típico de oxigênio singleto (TΔ ~ 16 μs) . Os valores de ΦΔ da Tabela 1 foram obtidos pelos procedimentos descritos acima.

[00102] Utilizando os métodos descritos acima e detalhados nos exemplos abaixo, as concentrações dos vários atropisômeros necessários para matar 50% das células CT26 in vitro sob uma dose de luz laser de 1 J/cm2 também são apresentadas na Tabela 1. A diferença dramática nas fototoxicidades entre amostras LUZ11-A e LUZ11-D não poderia ser antecipada a partir do mecanismo de ação conhecido de PDT, que é baseado no estresse oxidativo causado pela geração de ROS quando um fotossensibilizador absorve a luz na presença de oxigênio. Na verdade, não se poderia antever que o atropisômero αβαβ possuindo pequenas diferenças na absorção de luz e na eficiência na geração de oxigênio singleto em relação à α4 seria um fotossensibilizador muito mais pobre. Em utilizações anteriores de fotossensibilizadores em PDT, não foi apreciado que os atropisômeros com o mesmo número de grupos volumosos em ambos os lados do plano definido pelo macrociclo não contribuem de forma apreciável para a eficácia de PDT da mistura de atropisômeros. É um objeto central da presente invenção descrever, pela primeira vez, composições farmacêuticas enriquecidas em atropisômeros α3β e α4, onde estes atropisômeros representam mais de 70% de todos os atropisômeros presentes na mistura, que ultrapassam a eficácia de PDT da mistura estatística de atropisômero obtida a partir da sua síntese. É também um objeto da presente invenção descrever uma composição farmacêutica enriquecida em atropisômero α3β, onde este atropisômero representa mais de 60% de todos os atropisômeros presentes na mistura e melhora a sua eficácia em PDT. É também um objeto da presente invenção descrever uma composição farmacêutica enriquecida no atropisômero α4, onde este atropisômero representa mais de 20% de todos os atropisômeros presentes na mistura e melhora a sua eficácia em PDT. É outro objeto da presente invenção descrever, pela primeira vez, a utilização de processos de separação química a temperaturas superiores a 20 °C e na presença de luz e oxigênio, para enriquecer a mistura de atropisômeros nos atropisômeros α3β e α4 de tetrafenilbacterioclorinas previamente consideradas como lábil.

EXEMPLOS

[00103] Esta invenção será agora descrita com mais detalhes nos seguintes EXEMPLOS não limitativos, com referência aos seguintes desenhos.

EXEMPLO 1. SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DOS ATROPISÔMEROS PRESENTES EM UMA TETRAFENILCLORINA SULFONAMIDA FLUORADA

[00104] A síntese química de uma mistura de atropisômeros que satisfazem a Fórmula (II),

em que X1 e X2 são átomos de flúor e R' é o grupo -SO2NHCH3 e a sua caracterização, foi conduzida da seguinte forma.

[00105] A síntese de 5,10,15,20-tetraquis(2,6-difluoro- 3-N-metilsulfamoilfenil)clorina é realizada por reação de p-toluenossulfonil hidrazida (700 ± 10 mg) com 5,10,15,20- tetraquis(2,6-difluoro-3-N-metilsulfamoilfenil) porfirina (100 ± 10 mg) a uma pressão abaixo de 0,6 mbar (60 Pa), aquecendo até 140 ± 1°C durante 15 minutos. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, o produto em bruto da reação é dissolvido em diclorometano («50 mL) e lavado sequencialmente com hidróxido de sódio (0,5 M) e água (3 vezes). A fase orgânica foi seca com sulfato de sódio anidro, filtrada e depois concentrada. A mistura de compostos foi precipitada com hexano. O sólido foi dissolvido em dimetoxietano (DME) (20 mL) e FeCl3-6H2O (1 equivalente) foi adicionado à solução, seguido de 0,1 mL de peróxido de hidrogênio (3% em água). A solução final foi mantida sob agitação, à temperatura ambiente. Após 90 minutos, adicionou-se 0,1 mL de peróxido de hidrogênio (3% em água) e a reação foi interrompida quando o pico de absorção de bacterioclorina («750 nm) desapareceu(90 minutos). Adicionou-se dietil carbonato à solução e a fase orgânica foi então lavada duas vezes com uma solução saturada de tiossulfato de sódio, duas vezes com água destilada e depois seca sobre Na2SO4 anidro. O solvente foi evaporado e purificado por cromatografia em coluna com sílica gel (diclorometano/acetato de etila). A 5,10,15,20- tetraquis(2,6-difluoro-3-N-metilsulfamoilfenil)clorina contendo a mistura de atropisômeros foi obtida com 80 ± 5% de rendimento (80 ± 5 mg). A Figura 2 apresenta o cromatograma de UHPLC com detecção a 380 nm. A separação de todos os atropisômeros de clorina foi conseguida usando uma coluna Acquity BEH C 18 (150* 2,1 mm, 1,7 μ m) e um programa de gradiente de três fases móveis: tampão de acetato de amônio, 50mM (fase móvel A), isopropanol (fase móvel B) e uma solução de metanol:acetonitrila (70:30 v/v) (fase móvel C) bombeada a uma taxa de fluxo constante de 0,2 ml/min. A temperatura da coluna foi mantida constante a 40 °C.Notavelmente, o maior pico, esperado para a formação estatisticamente favorável do atropisômero α3β, é dividido em dois. Isto é atribuído à diferenciação entre a posição do grupo pirrol reduzido do macrociclo entre dois grupos fenila com substituintes volumosos no mesmo lado do plano do macrociclo e a posição do grupo pirrol reduzido entre dois grupos fenila com substituintes volumosos em diferentes lados desse plano. Este exemplo ilustra que é possível separar os atropisômeros de derivados de tetrafenilclorina a 40 °C em virtude de uma combinação inesperada da estabilidade das tetrafenilclorinas e da lentidão da rotação das ligações macrociclo-fenila a esta temperatura.

[00106] A RMN e a MS da amostra de tetrafenilclorina são as seguintes: RMN 1H (400 MHz, CDCI3), δ, ppm: 8,57 (m, 2H, β-H); 8,33-8,21 (m, 8H, Ar-H + β -H); 7,41-7,36 (m, 4H, Ar-H); 4,81-4,79 (m, 4H, NH); 4,22-4,19 (m, 4H, β-H); 2,82-2,76 (m, 12H, CH3); - 1,49 (s, 2H, NH). O espectro de RMN é mostrado na Figura 3.MS (ESI-FIA-TOF) : m/z calculado para (C48H37F8N8O8S4) [M + H]+: 1133.1484, encontrado [M + H]+: 1133.1466

EXEMPLO 2. SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO E SEPARAÇÃO DOS ATROPISÔMEROS PRESENTES EM TETRAFENILBACTERIOCLORINA SULFONAMIDA FLUORADA

[00107] A síntese química de uma mistura de atropisômeros que satisfazem a Fórmula (III),

em que X1 e X2 são átomos de flúor e R' é o grupo -SO2NHCH3, a sua separação em cada um dos atropisômeros e a sua caracterização, foi conduzida da seguinte forma:A síntese de 5,10,15,20-tetraquis(2,6-difluoro-3-N- metilsulfamoilfenil)bacterioclorina (LUZ11) é realizada pela reação direta p-toluenossulfonil hidrazida (7 ± 0,1 g) com 5,10,15,20-tetraquis(2,6-difluoro-3-N-metilsulfamoilfenil)porfirina (1 ± 0,05 g), a uma pressão abaixo de 0,6 mbar (60Pa), aquecendo até 140 °C ± 1 °C durante 60 minutos. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, o resíduo reacional é dissolvido e purificado por cromatografia em coluna com gel de sílica (diclorometano/acetato de etila). A 5,10,15,20- tetraquis(2,6-difluoro-3-N- metilsulfamoilfenil)bacterioclorina contendo uma mistura de quatro atropisômeros foi obtida com 85 ± 5% de rendimento (850 ± 50 mg) com pureza por HPLC > 95%. A Figura 4 apresenta o cromatograma de HPLC da amostra LUZ11. Uma quantidade adequada de amostra foi dissolvida em solvente analítico (solução de N,N-dimetilformamida com Tween20 a 2% p/v). Uma fração de 20 μ l da solução preparada foi então analisada por HPLC com detecção UV-Vis. A separação de atropisômeros foi conseguida utilizando uma coluna Inertsil Phenyl (250* 4,6 mm; 5 μ m) e um programa de gradiente de três fases móveis: metanol (fase móvel A), uma solução de trimetilamina, pH 7,0 (fase móvel B) e uma mistura de solução de trietilamina pH 7,0 com metanol (25:75, v/v) (fase móvel C) bombeada a uma taxa de fluxo constante de 0,5 ml/min). A temperatura da coluna foi mantida constante a 60 °C. Este exemplo ilustra que é possível separar os atropisômeros de derivados de tetrafenilbacterioclorinas a 60 °C em virtude de uma combinação muito inesperada da estabilidade das tetrafenilbacterioclorinas e da lentidão de rotação das ligações macrociclo-fenila a esta temperatura.

[00108] A RMN e a MS da amostra LUZ11 isolada são as seguintes:RMN 1H: (400 MHz, CDCI3) δ ppm: 8,24 (m, 4H, β-H); 8,017,99 (m, 4H, Ar-H); 7,39-7,31 (m, 4H, Ar-H); 4,76-4,67 (m, 4H, NH); 4,05 (s, 8H, β -H); 2,81-2,70 (m, 12H, CH3); -1,39 (s, 2H, NH). O espectro de RMN é mostrado na Figura 5.MS (ESI-FIA-TOF) : m/z calculado para C48H39F8N8O8S4 [M + H]+: 1135,1640, encontrado [M + H]+: 1135,1612.Análise Elementar (C48H38F8N8O8S4.H20): calculada C 50,00, H 3,50, N 9,72, S 11,12, encontrado C 49,88, H 3,47, N 9,38, S 10,94.

[00109] O isolamento dos quatro atropisômeros presentes na amostra LUZ11 sintetizada como acima foi realizado dissolvendo 300 mg da amostra LUZ11 em 12 mL de dimetilformamida (DMF) e 2,5 mL de água. Após a sonicação durante 5 minutos para obter a solubilização completa da amostra LUZ11, os atropisômeros foram separados por HPLC utilizando uma coluna preparativa e as seguintes condições gerais: coluna = Inertsil-Fenila (250 * 10 mm, 5 μ m), fluxo = 3 ml/min, detecção = 743 nm, forno = 23 °C, volume de injeção = 100 μ l, tempo de execução = 70 min, fase móvel A = grau de gradiente de acetonitrila (ACN), fase móvel B = água. Os gradientes empregados na separação de cada atropisômero são apresentados na Tabela 2. Tabela 2. Gradientes utilizados na separação de atropisômeros LUZ11 por HPLC preparativa.

[00110] As Figuras 6A, 6B, 6C e 6D apresentam os cromatogramas de HPLC das amostras separadas LUZ11-A, LUZ11-B, LUZ11-C e LUZ11-D obtidas com o método descrito acima. As quatro amostras também foram caracterizadas por espectroscopia de RMN, espectrometria de massa e análise elementar. Os resultados são apresentados abaixo:LUZ11-A (principalmente αβαβ): RMN 1H (400 MHz, CDCI3): δ, ppm: 8,31-8,26 (m, 4H, Ar- H); 8,04 (s, 4H, β-H); 7,45-7,41 (m, 4H, Ar-H); 4,65-4,63 (m, 4H, NH); 4,08 (s, 8H, β -H); 2,85-2,83 (m, 12H, CH3); - 1,36 (s, 2H, NH). O espectro de RMN é mostrado na Figura 7.MS (ESI-FIA-TOF) : m/z calculado para (C48H39F8N8O8S4) [M + H]+: 1135,1640, encontrado [M + H]+: 1135,1665. Análise Elementar (C48H38F8N8O8S4): calculado C 50,79, H 3,37, N 9,87, encontrado C 50,27, H 3,89, N 9,30.LUZ11-B (principalmente α2β2): RMN 1H (400 MHz, CDCl3): δ, ppm: 8,27-8,24 (m, 4H, Ar- H); 8,03-8,00 (m, 4H, β-H); 7,43-7,36 (m, 4H, Ar-H); 4,71-4,65 (m, 4H, NH); 4,06 (s, 8H, β-H); 2,84-2,77 (m, 12H, CH3); -1,38 (s, 2H, NH). O espectro de RMN é mostrado na Figura 8. MS (ESI-FIA-TOF) : m/z calculado para (C48H39F8N8O8S4) [M + H]+: 1135,1640, encontrado [M + H]+: 1135,1586. Análise Elementar (C48H38F8N8O8S4): calculado C 50,79, H 3,37, N 9,87, encontrado C 50,98, H 3,67, N 9,47. LUZ11-C (principalmente α3β): RMN 1H (400 MHz, CDCl3): δ, ppm: 8,27-8,24 (m, 4H, Ar- H); 8,03-8,00 (m, 4H, β-H); 7,43-7,36 (m, 4H, Ar-H); 4,71-4,65 (m, 4H, NH); 4,06 (s, 8H, p-H); 2,84-2,77 (m, 12H, CH3); -1,38 (s, 2H, NH). O espectro de RMN é mostrado na Figura 9. MS (ESI-FIA-TOF) : m/z calculado para (C48H39F8N8O8S4) [M + H]+: 1135,1640, encontrado [M + H]+: 1135,1657. Análise Elementar (C48H38F8N8O8S4.H2O): calculado C 50,79, H 3,37, N 9,87, encontrado C 50,00, H 3,50, N 9,72. LUZ11-D (principalmente α4): RMN 1H (400 MHz, CDCl3): δ, ppm: 8,29-8,26 (m, 4H, Ar- H); 8,04-8,02 (m, 4H, β-H); 7,46-7,41 (m, 4H, Ar-H); 4,65-4,64 (m, 4H, NH); 4,07 (s, 8H, β-H); 2,85-2,82 (m, 12H, CH3); -1,37 (s, 2H, NH). O espectro de RMN é mostrado na Figura 10. MS (ESI-FIA-TOF) : m/z calculado para (C48H39F8N8O8S4) [M + H]+: 1135,1640, encontrado [M + H]+: 1135,1632. Análise Elementar (C48H38F8N8O8S4.H2O): calculado C 50,79, H 3,37, N 9,87, encontrado C 50,38, H 3,66, N 9,13.

[00111] Um cristal do atropisômero LUZ11-D foi obtido para a determinação estrutural de raios X de modo a confirmar a atribuição. A estrutura de raios X obtida do LUZ11-D é mostrada na Figura 11 e confirma que este é o atropisômero α4. As propriedades fotofísicas das amostras LUZ11-A, LUZ11-B, LUZ11-C e LUZ11-D foram determinadas utilizando os instrumentos e métodos descritos acima. A Figura 12 apresenta os espectros de absorção das quatro amostras. A Tabela 1 coleta os dados relevantes. A Figura 12 também apresenta as parcelas de Lambert-Beer usadas para obter os coeficientes de absorção molar de cada amostra, assumindo que toda a massa ponderada para calcular as concentrações é a massa de atropisômeros LUZ11.

[00112] Este exemplo mostra que os atropisômeros α4 e α3β são suficientemente estáveis para serem obtidos com alta pureza usando processos de separação química a temperaturas acima de 20 °C e na presença de luz e oxigênio. A estabilidade destes atropisômeros foi investigada aquecendo a amostra LUZ11-C em dimetilformamida a altas temperaturas e durante vários períodos de tempo como ilustrado na Tabela 3. A interconversão dos atropisômeros ocorre rapidamente em altas temperaturas sem decomposição apreciável da bacterioclorina sulfonamida fluorada.Tabela 3. Conteúdo de atropisômero relativo após o aquecimento da amostra LUZ11-C em dimetilformamida durante os períodos de tempo e temperaturas indicados e abertos à atmosfera.

EXEMPLO 3. ENRIQUECIMENTO DA MISTURA DE ATROPISÔMEROS UTILIZANDO PRECIPITAÇÃO SELETIVA

[00113] Este exemplo mostra que a mistura de atropisômeros resultante da síntese de tetrafenilbacterioclorinas halogenadas pode ser separada em frações usando métodos simples e escaláveis e que uma fração é enriquecida seletivamente nos atropisômeros α3β e α4.

[00114] Meio grama de LUZ11 é dissolvido em 50 mL de diclorometano em um balão de fundo redondo. Adicionam-se 50 mL de hexano e o balão é ligado a uma bomba de vácuo durante 1 minuto com agitação suave. Alguns dos LUZ11 presentes na solução precipitam no balão. A amostra é filtrada dando a amostra X. Este solvente, contendo diclorometano e hexano, é evaporado até à secura, dando a amostra Y. Ambas as amostras foram analisadas por HPLC para quantificar a quantidade relativa de atropisômero em cada amostra. A Figura 13 apresenta os cromatogramas de HPLC com detecção a 743 nm, descritos na seção de Métodos, revelando que os picos de atropisômeros αβαβ e α2β2 aumentam na amostra X em relação à amostra original de LUZ11 e que o pico do atropisômero α4 aumenta na amostra Y em relação à amostra original de LUZ11. A Tabela 4 apresenta as quantidades relativas dos quatro atropisômeros presentes na amostra LUZ11 inicial e nas frações X e Y. O atropisômero α2β2 tem dois picos, identificados como B1 e B2, pois em bacterioclorinas os grupos R' que estão no mesmo lado do plano pode ser separado por um grupo metino (=C-) ou por uma ponte de metileno (-CH2-). Enquanto a amostra LUZ11 original contém 65,9% de atropisômeros α3β + α4, é notável que a amostra Y contém 80,4% de atropisômeros α3β + α4.

[00115] Assim, a amostra Y é uma composição em que os atropisômeros com a maioria dos grupos R' no mesmo lado do plano definido pelo macrociclo constituem mais de 70% da quantidade total de atropisômeros presentes na composição.Tabela 4. Conteúdo relativo de atropisômeros da amostra LUZ11 e das amostras X e Y.

[00116] A quantidade relativa de atropisômeros α3β + α4 em uma amostra pode constituir qualquer valor até 100% da quantidade total de atropisômeros presentes na composição.

EXEMPLO 4. ESTABILIDADE DIFERENCIAL DOS ATROPISÔMEROS DE BACTERIOCLORINAS HALOGENADAS E SULFONADAS NA PRESENÇA DE LUZ INFRAVERMELHA ABSORVIDA

[00117] Este exemplo demonstra que os atropisômeros de bacterioclorinas halogenadas e sulfonadas possuem diferentes rendimentos quânticos de fotodecomposição quando irradiados com a mesma luz infravermelha utilizada em PDT, o que pode levar a eficiências diferenciais de PDT.

[00118] As amostras LUZ11-A, LUZ11-B, LUZ11-C e LUZ11-D obtidas no Exemplo 2 acima foram separadas independentemente em soluções de PBS:metanol (2:3), transferidas para células de quartzo de 1 cm e os seus espectros de absorção foram registados. Cada célula de quartzo foi colocada sequencialmente no feixe do laser de diodo Omicron de 749 nm, previamente desfocado para ter um diâmetro de feixe coincidente com a janela da célula de quartzo. O poder laser medido nessas condições foi de 640 mW. A irradiação foi interrompida em intervalos de tempo regulares e um novo espectro de absorção foi registrado. O fotobranqueamento segue a cinética de uma reação de primeira ordem na janela de tempo do experimento. A Figura 14 mostra o decaimento das absorções no pico do maior comprimento de onda de absorção das amostras em função do tempo de irradiação. As meias-vidas das amostras LUZ11-A, LUZ11-B, LUZ11-C e LUZ11-D sob estas condições são 4,6, 4,8, 6,4 e 6,5 minutos, respectivamente. Os rendimentos quânticos de fotodecomposição foram calculados como a taxa inicial de desaparecimento da molécula fotossensibilizante dividida pela taxa inicial de absorção de fótons. Os resultados desses cálculos são apresentados na Tabela 1. O atropisômero mais estável é α4, seguido de α3β.

EXEMPLO 5. FOTOTOXICIDADE IN VITRO DE ATROPISÔMEROS LUZ11

[00119] Este exemplo mostra que as amostras LUZ11-A, LUZ11-B, LUZ11-C e LUZ11-D enriquecidas em cada um dos atropisômeros isolados e a amostra LUZ11 original apresentam eficiências de PDT diferenciadoras em relação a linhagens celulares de câncer.

[00120] A atividade fotossensibilizante da amostra LUZ11 original e das amostras LUZ11-A, LUZ11-B, LUZ11-C e LUZ11-D obtidas no Exemplo 2 foram medidas com os materiais e métodos descritos anteriormente. Os cromatogramas de HPLC com detecção a 380 nm indicam que o conteúdo de amostras LUZ11 enriquecidas nas amostras de atropisômeros separados é superior a 80%. As pequenas diferenças de pureza não prejudicam a fototoxicidade.

[00121] As frações de sobrevivência para doses leves de 1 J/cm2 e o tempo de incubação de 24 horas, em relação ao controle no escuro, são retratados na Figura 15 (HT-29) e na Figura 16 (CT26). As concentrações que produziram 50% ou 90% de morte celular para a dose de luz de 1 J/cm2 são apresentadas na Tabela 5 e foram calculadas por interpolação usando análise de regressão não-linear usando o software GraphPad Prism 5 (log [inibidor] versus resposta normalizada - inclinação variável), exceto os valores identificados por um asterisco que foram obtidos por extrapolação.Tabela 5. Resultados de fototoxicidade in vitro para uma dose de luz de 1 J/cm2 a 749 nm em termos de IC50 e IC90 para cada amostra nas linhagens celulares HT-29 e CT26.

* Extrapolado a partir da curva de regressão não-linear

[00122] As fototoxicidades ilustradas nas Figuras 15 e 16 e na Tabela 5 demonstram claramente que os atropisômeros LUZ11 têm eficácia diferencial de PDT in vitro. A fototoxicidade das amostras aumenta de A para D. A amostra original LUZ11, contendo a mistura estatística dos atropisômeros resultantes da síntese, é menos fototóxica in vitro do que as amostras enriquecidas nos atropisômeros α3β e α4. É um achado importante desta invenção que os atropisômeros com a maioria dos meta substituintes dos grupos fenila no mesmo lado do plano definido pelo macrociclo são mais fototóxicos que os atropisômeros com um número igual de tais substituintes em ambos os lados daquele plano. Esta constatação não poderia ter sido antecipada por uma pessoa versada na técnica.

EXEMPLO 6. PDT DO CARCINOMA DE CÓLON DO CAMUNDONGO EM CAMUNDONGOS BALB/C COM ATROPISÔMEROS LUZ11-A, LUZ11-B, LUZ11-C E LUZ11-D

[00123] Este exemplo mostra que cada atropisômero LUZ11 apresenta um perfil distinto de eficácia a longo prazo no tratamento de um modelo de tumor de camundongo com PDT.

[00124] O modelo de tumor foi camundongos BALB/c com tumor CT26 subcutâneo. As células CT26 foram cultivadas em meio DMEM suplementado com soro fetal bovino e antibióticos. As células foram cultivadas a 37 °C em atmosfera umidificada contendo 5% de CO2. As células CT26 (^350.000) foram retomadas em 0,1 ml de PBS e implantadas subcutaneamente na coxa direita dos camundongos BALB/C. Os tumores atingiram 5 mm de diâmetro em cerca de 8 a 10 dias após a implantação. O tratamento foi iniciado quando o tumor atingiu 5 mm de diâmetro em cada animal. O dia em que os tumores atingiram o tamanho do tratamento, os camundongos foram injetados com uma dose de 0,7 mg/kg do fotossensibilizador em um veículo que contém Cremophor EL (Macrogolglicerol Ricinoleato), etanol e solução salina de NaCl 0,9% nas proporções 0,1:0,5:99,4 para LUZ11 e LUZ11-A e 0,5:0,5:99,0 para LUZ11-B, LUZ11-C e LUZ11-D e tratados como descrito na seção Métodos. A fluência de luz empregada no tratamento foi de 41 J/cm2 (isto é, 50 J em uma superfície de 1,33 cm2). As doses de cada composto foram normalizadas levando em consideração o teor de LUZ11 de cada amostra. O grupo de controle (n = 6) recebeu apenas o veículo, sem fotossensibilizador, e foi irradiado nas mesmas condições que os demais grupos de teste.

[00125] Os camundongos foram verificados diariamente, os tumores foram medidos usando duas medidas ortogonais L e W (perpendicular a L) e os volumes calculados com a fórmula V = L x W2 / 2 foram registrados. Quando o diâmetro mais longo de qualquer tumor atingiu 15 mm (ponto final humanitário), o camundongo que carrega esse tumor foi sacrificado e o número de dias decorridos desde o tratamentofoi registrado. A Figura 17 apresenta o gráfico de Kaplan-Meier para as amostras LUZ11, LUZ11-A, LUZ11-B, LUZ11-C e LUZ11-D do Exemplo 2. A fototoxicidade muito maior do atropisômero α4 é manifestada pela morte induzida por PDT, no grupo de amostra LUZ11-D, de 2 camundongos nos dias subsequentes ao tratamento. A sobredosagem com o atropisômero α4 ocorre em uma combinação de dose de fármaco para luz sem letalidade induzida por PDT para outras misturas de atropisômeros. Esta observação é consistente com a fototoxicidade in vitro e mostra que o atropisômero α4 tem a maior eficácia de PDT.

EXEMPLO 7. PDT DO CARCINOMA DE CÓLON DO CAMUNDONGO EM CAMUNDONGOS BALB/C COM COMPOSIÇÕES DE ATROPISÔMEROS ENRIQUECIDOS

[00126] Este exemplo mostra que uma composição farmacêutica enriquecida nos atropisômeros mais fotoativos é preferida para PDT porque apresenta o melhor perfil de eficácia a longo prazo no tratamento de um modelo de tumor de camundongo com PDT.

[00127] O modelo de camundongo e tumor é o mesmo que no Exemplo 6. A PDT também foi realizada com o mesmo protocolo: injeção intravenosa de uma dose nominal de 0,7 mg/kg seguiu 15 minutos depois com a irradiação de um círculo de 1,33 cm2 com 55 J. Esta concentração nominal, em peso da amostra, corresponde a uma concentração de 0,52 mg/kg da quantidade real de estereoisômeros de bacterioclorina presentes nas amostras LUZ11, LUZ11-X, em relação à amostra X e LUZ11-Y, em relação à amostra Y. O veículo utilizado para a administração intravenosa foi o mesmo que no Exemplo 6, mas as amostras X e Y do Exemplo 3 foram empregadas, em paralelo com a amostra LUZ11 caracterizada na Tabela 4. A Figura 18 apresenta o Kaplan- Meier de mistura para a amostra LUZ11 e as amostras X e Y.

[00128] A Figura 18 mostra que, com a fração original de LUZ11, não é possível obter curas de longo prazo com este protocolo de tratamento. A ausência de curas de longo prazo também foi observada no grupo tratado com a amostra X. Além disso, o tempo médio de sobrevivência no tratamento com a amostra X foi 2 dias menor (18 versus 20 dias) do que o tempo médio de sobrevivência com a amostra LUZ11. Por outro lado, o grupo tratado com a amostra Y teve um tempo de sobrevivência médio mais longo e atingiu uma taxa de cura de 50%.

[00129] A capacidade notável de composições farmacêuticas com misturas de atropisômeros enriquecidas em atropisômeros α3β e α4 para melhorar as taxas de cura em PDT é inesperada e são divulgadas pela primeira vez nesta invenção.

EXEMPLO 8. ISOLAMENTO DO ATROPISÔMERO DE LUZ11-C (α3β) POR CROMATOGRAFIA DE COLUNA CLÁSSICA DE FASE REVERSA E HPLC SEMI-PREPARATIVA

[00130] A purificação de LUZ11C foi realizada em duas etapas: i) enriquecimento de amostras em α3β da mistura dos quatro atropisômeros (αβαβ, α2β2, α3β, α4 e impurezas de síntese) utilizando cromatografia de gravidade de gel de sílica reversa (C-18) como fase estacionária, com uma mistura de MeOH/CN3CN/H2O (40:40:20, v/v) como fase móvel; ii) purificação da mistura enriquecida α3β previamente obtida por HPLC semi-preparativa.

i) Enriquecimento de LUZ11-C (α3β) por cromatografia de fase reversa

[00131] LUZ11 (1 g; ensaio 75%) foi dissolvido em acetonitrila (10 mL) e metanol (10 mL), e a mistura foi sonicada durante 5 min. Após solubilização total, adicionou-se lentamente 5 mL de água. Foi preparada uma cromatografia em coluna de vidro (d = 3,5 cm * h = 65 cm) utilizando uma suspensão de eluente (MeOH/CN3CN/H2O (40:40:20, v/v)) e a sílica de fase reversa C-18 (~150 g). A amostra preparada de LUZ11 foi cuidadosamente transferida para a coluna. A mistura de fase móvel foi eluída lentamente através da coluna e as frações contendo o atropisômero α3β foram colhidas. Durante todo o procedimento cromatográfico, a cromatografia em coluna de vidro foi protegida da luz, bem como das frações colhidas. O solvente orgânico foi removido no evaporador rotativo (T < 35 °C). A mistura foi transferida para um funil de extração e LUZ11-C foi recuperada por extração solvente- solvente utilizando diclorometano. A fase orgânica foi seca e o solvente foi removido por evaporação rotativa (T < 35 °C). O balão com o produto foi ligado a uma bomba de vácuo durante pelo menos 72 h a 18 a 23 ° C protegido da luz. Cerca de 300 mg de LUZ11-C foram obtidos.

ii) isolamento LUZ11-C (α3β) por HPLC semi-preparativa

[00132] Uma amostra (300 mg) de fração enriquecida de LUZ11-C (α3β), previamente preparada por gel de sílica de fase inversa C-18, foi dissolvida em 12 mL de DMF e 2,5 mL de água e submetida a sonicação durante 5 minutos ou até a solubilização completa. As condições de HPLC para isolamento de LUZ11-C são descritas abaixo: Coluna: Inertsil-Phenyl (250 * 10 mm; 5 μ m) Fluxo: 3 mL/min Detecção: Vis 743 nm Forno: 23 °C Volume de injeção: 100 μ L Tempo de execução: 70 min. Fase móvel: fase móvel A: grau de gradiente de acetonitrila fase móvel B: Água Tabela 6. Programa de Gradiente

[00133] A mistura foi transferida para um funil de extração e LUZ11-C foi recuperado por extração solvente- solvente utilizando diclorometano. A fase orgânica foi seca e o solvente foi removido por evaporação rotativa (T < 35 °C). O balão com o produto foi ligado a uma bomba de vácuo durante pelo menos 72 h a 18 a 23 °C protegido da luz. Utilizando este método, LUZ11-C foi obtido com um ensaio entre 94% e 96%. O perfil de impurezas desta fração enriquecida com LUZ11-C (α3β) mostrou que os atropisômeros de αβαβ, α2β2 e α4 estavam presentes em menos de 2%. DOCUMENTOS CITADOS 1. M. M. Pereira, L. G. Arnaut, S. J. Formosinho, C. J. P. Monteiro, PCT/EP/012212, Ed. (Universidade de Coimbra, Portugal, 2005), chap. PCT/EP/012212. 2. L. G. Arnaut, M. M. Pereira, S. J. Formosinho, S. Simoes, G. Stochel, K. Urbanska, PCT/PT2009/000057, Ed. (Universidade de Coimbra, Portugal, 2009), chap. PCT/PT2009/000057. 3. J. M. Dabrowski, M. Krzykawska, L. G. Arnaut, M. M. Pereira, C. J. P. Monteiro, S. Simoes, K. Urbanska, G. Stochel, Tissue uptake and photodynamic therapy of mice bearing melanoma with a non-toxic, effective chlorin. ChemMedChem 6, 1715-1726 (2011). 4. L. G. Arnaut, M. M. Pereira, J. M. Dabrowski, E. F. F. Silva, F. A. Schaberle, A. R. Abreu, L. B. Rocha, M. M. Barsan, K. Urbanska, G. Stochel, C. M. A. Brett, Photodynamic Therapy Efficacy Enhanced by Dynamics: The Role of Charge Transfer and Photostability in the Selection of Photosensitizers. Chem. Eur. J. 20, 5346-5357 (2014). 5. L. G. Arnaut, Design of Porphyrin-Based Photosensitizers. Adv. Inorg. Chem. 63, 187-233 (2011) 6. S. R. LaPlante, P. J. Edwards, L. D. Fader, A. Jakalian, O. Hucke, Revealing atropisomer axial chirality in drug discovery. ChemMedChem 6, 505-513 (2011). 7. A. S. M. Ressurreigao, M. Pineiro, L. G. Arnaut, A. M. d. A. R. Gonsalves, Atropisomers of 5,10,15,20- tetraquis(2,6-dichloro-3-sulfamoyl-phenyl)porphyrins. Porphyrins Phthalocyanines 11, 50-57 (2007) 8. A. C. Tome, A. M. S. Silva, I. Alkorta, J. Elguero, Atropisomerism and corformational aspectes of meso- tetraarylporphyrins and related compounds. J. Phorphyrins Phthalocyanines 15, 1-28 (2011). 9. C. J. P. Monteiro, M. M. Pereira, N. Gongalves, C. G. Carvalho, A. R. Abreu, L. G. Arnaut, A. M. S. Silva, Separation and atropisomer isolation of ortho-halogenated tetraarylporphyrins by HPLC. Full characterization using ID and 2D NMR. J. Porphyrins Phthalocyanines 16, 316-323 (2012) 10. W. J. Hagan, D. C. Barber, D. G. Whitten, M. Kelly, F. Albrecht, S. L. Gibson, R. Hilf, Picket-fence porphyrins as potential phototherapeutic agents. Cancer Res. 48, 11481152 (1988). 11. C. J. P. Monteiro, J. Pina, M. M. Pereira, L. G. Arnaut, On the singlet states of porphyrins, chlorins and bacteriochlorins and their ability to harvest red/infrared light. Photochem. Photobiol. Sci. 11, 1233-1238 (2012). 12. E. F. F. Silva, C. Serpa, J. M. Dabrowski, C. J. P. Monteiro, L. G. Arnaut, S. J. Formosinho, G. Stochel, K. Urbanska, S. Simoes, M. M. Pereira, Mechanisms of singlet oxygen and superoxide ion generation by porphyrins and bacteriochlorins. Chem. Eur. J. 16, 9273-9286 (2010). 13. J. M. Dabrowski, M. M. Pereira, L. G. Arnaut, C. J. P. Monteiro, A. F. Peixoto, A. Karocki, K. Urbanska, G. Stochel, Synthesis, photophysical studies and anticancer ativity of a new halogenated water-soluble porphyrin. Photochem. Photobiol. 83, 897-903 (2007). 14. R. Schmidt, C. Tanielian, R. Dunsbach, C. Wolff, Phenalenone, a universal reference compounds for the determination of quantum yields of singlet oxygen. Photochem. Photobiol. A: Chem. 79, 11-17 (1994). 15. Sternberg ED, Dolphin D. Porphyrin-based photosensitizers for use in photodynamic therapy. Tetrahedron 1998;54:4151-202. Silva EFF, Serpa C, Dabrowski JM, Monteiro CJP, Arnaut LG, Formosinho SJ, et al. Mechanisms of singlet oxygen and superoxide ion generation by porphyrins and bacteriochlorins. Chem Eur J. 2010;16:9273-86.

Claims (14)

1. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender atropisômeros das fórmulas:

em que:

representa uma ligação simples carbono-carbono ou uma ligação dupla carbono-carbono; as linhas a negrito indicam que os átomos a negrito, e os grupos anexados a eles, estão estericamente impedidos de modo a existirem acima do plano definido pelo anel de macrociclo; X2, X4, X6 e X8 são flúor, F; X1, X3, X5 e X7 são halogênios, F, Cl, Br, ou hidrogênio; R1, R2, R3 e R4 são independentemente -OH, -OR ou -SO2R’’, onde R’’ são cada um independentemente escolhidos de -Cl, - OH, -aminoácido, -OR, -NHR ou -NR2, onde R são alquila de 1 a 12 átomos de carbono ou R2 representa cicloalquila com 2 a 12 átomos de carbono; R5, R6, R7 e R8 são independentemente H, -OH, -OR, -Cl, ou — NHR onde R são alquila de 1 a 12 átomos de carbono; ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis; em que a quantidade relativa dos referidos atropisômeros ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis é maior do que 70% do total de atropisômeros na referida composição farmacêutica.

2. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de a quantidade relativa do atropisômero das fórmulas:

em que: as linhas a negrito indicam que os átomos a negrito, e os grupos anexados a eles, estão estericamente impedidos de modo a existirem acima do plano definido pelo anel de macrociclo; X2 é flúor, F; X1 são independentemente escolhidos de halogênios, F, Cl, Br, ou hidrogênio; e R’ são -SO2R'', onde R’’ são cada um independentemente escolhidos de -Cl, -OH, -aminoácido, -OR, -NHR ou -NR2 onde R são alquila de 1 a 12 átomos de carbono e R2 representa cicloalquila com 2 a 12 átomos de carbono; ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis; composição farmacêutica.

3. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de a quantidade relativa do atropisômero das fórmulas:

em que: as linhas a negrito indicam que os átomos a negrito, e os grupos anexados a eles, estão estericamente impedidos de modo a existirem acima do plano definido pelo anel de macrociclo; X2 é flúor, F; X1 são independentemente escolhidos de halogênios, F, Cl, Br, ou hidrogênio; e R’ são -SO2R'', onde R’’ são cada um independentemente escolhidos de -Cl, -OH, -aminoácido, -OR, -NHR ou -NR2 onde R são alquila de 1 a 12 átomos de carbono e R2 representa cicloalquila com 2 a 12 átomos de carbono; ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis; ser maior do que 60% do total de atropisômeros na referida composição farmacêutica, ou mais preferencialmente maior do que 70% dos atropisômeros totais na referida composição farmacêutica, ou mais preferencialmente maior do que 80% dos atropisômeros totais na referida composição farmacêutica, ou mais preferencialmente maior do que 90% dos atropisômeros totais na referida composição farmacêutica, ou mais preferencialmente maior do que 95% dos atropisômeros totais na referida composição farmacêutica.

4. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de a composição farmacêutica compreender adicionalmente um transportador farmacêutico.

5. Processo para preparação da composição farmacêutica, conforme descrita em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de compreender um passo de isolamento da mistura de atropisômeros de clorina ou bacterioclorina das fórmulas:

em que:

representa uma ligação simples carbono-carbono ou umaligação dupla carbono-carbono; as linhas a negrito indicam que os átomos a negrito, e os grupos anexados a eles, estão estericamente impedidos de modo a existirem acima do plano definido pelo anel de macrociclo; X2, X4, X6 e X8 são flúor, F; X1, X3, X5 e X7 são halogênios, F, Cl, Br, ou hidrogênio; R1, R2, R3 e R4 são independentemente -OH, —OR ou -SO2R’’, onde R’’ são cada um independentemente escolhidos de -Cl, - OH, -aminoácido, -OR, -NHR ou -NR2, onde R são alquila de 1 a 12 átomos de carbono ou R2 representa cicloalquila com 2 a 12 átomos de carbono; R5, R6, R7 e R8 são independentemente H, -OH, -OR, -Cl, ou - NHR onde R são alquila de 1 a 12 átomos de carbono; no qual os atropisômeros com a maioria dos grupos R1, R2, R3 ou R4 no mesmo lado do plano do macrociclo são, pelo menos parcialmente, separados por precipitação seletiva, cromatografia, extração por solvente, isomerização rotativa térmica ou fotoquímica ou fotodecomposição seletiva.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de a precipitação seletiva dos atropisômeros de clorina ou bacterioclorina ser alcançada por dissolução em primeiro lugar da mistura de atropisômeros em um solvente de polaridade mais elevada e depois precipitação seletiva dos atropisômeros da Fórmula (I-A) e (I-B)

em que:

representa uma ligação simples carbono-carbono ou uma ligação dupla carbono-carbono; as linhas a negrito indicam que os átomos a negrito, e os grupos anexados a eles, estão estericamente impedidos de modo a existirem acima do plano definido pelo anel de macrociclo; X2, X4, X6 e X8 são flúor, F; X1, X3, X5 e X7 são halogênios, F, Cl, Br, ou hidrogênio; R1, R2, R3 e R4 são independentemente -OH, -OR ou -SO2R’’, onde R’’ são cada um independentemente escolhidos de -Cl, - OH, -aminoácido, -OR, -NHR ou -NR2, onde R são alquila de 1 a 12 átomos de carbono ou R2 representa cicloalquila com 2 a 12 átomos de carbono; R5, R6, R7 e R8 são independentemente H, -OH, -OR, -Cl, ou - NHR onde R são alquila de 1 a 12 átomos de carbono; pela adição de um solvente com polaridade mais baixa à solução, o que deixa a solução enriquecida nos atropisômeros Fórmula (I-C) e (I-D)

em que:

representa uma ligação simples carbono-carbono ou uma ligação dupla carbono-carbono; as linhas a negrito indicam que os átomos a negrito, e os grupos anexados a eles, estão estericamente impedidos de modo a existirem acima do plano definido pelo anel de macrociclo; X2, X4, X6 e X8 são flúor, F; X1, X3, X5 e X7 são halogênios, F, Cl, Br, ou hidrogênio; R1, R2, R3 e R4 são independentemente -OH, -OR ou -SO2R’’, onde R’’ são cada um independentemente escolhidos de -Cl, - OH, -aminoácido, -OR, -NHR ou -NR2, onde R são alquila de 1 a 12 átomos de carbono ou R2 representa cicloalquila com 2 a 12 átomos de carbono; R5, R6, R7 e R8 são independentemente H, -OH, -OR, -Cl, ou — NHR onde R são alquila de 1 a 12 átomos de carbono, em que a soma das concentrações dos atropisômeros Fórmula (I-C) e (I-D) na solução constitui pelo menos 70% da concentração de todos os atropisômeros presentes em solução, ou mais preferencialmente mais do que 70% dos atropisômeros totais na referida composição farmacêutica, ou mais preferencialmente mais do que 80% dos atropisômeros totais na referida composição farmacêutica, ou mais preferencialmente mais do que 90% dos atropisômeros totais na referida composição farmacêutica, ou mais preferencialmente mais do que 95% dos atropisômeros totais na referida composição farmacêutica.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de a extração por solvente compreender um primeiro passo de dissolução da mistura de atropisômeros de clorina ou bacterioclorina com um solvente polar; e um segundo passo com a adição de um solvente menos polar que forma uma separação de fases líquida-líquida com o solvente polar extraindo assim os atropisômeros menos polares.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de a recristalização compreender a formação de cristais contendo os atropisômeros com a maioria dos grupos R1, R2, R3 ou R4 no mesmo lado do plano do macrociclo que é complementar à composição de atropisômero no licor-mãe.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de a isomerização rotativa térmica ou fotoquímica compreender um primeiro passo de ligação preferencial de pelo menos um atropisômero da mistura de atropisômeros de clorina ou bacterioclorina a um suporte com o qual o referido pelo menos um atropisômero tem elevada afinidade; e um segundo passo de proporcionar de energia térmica ou rotativa suficiente para promover a isomerização rotativa preferencial dos atropisômeros menos ligados ao suporte.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 5 ou 9, caracterizado pelo fato de o suporte ser preferencialmente sílica gel e o atropisômero preferencialmente ligado ao suporte ser o atropisômero com as fórmulas:

11. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de a fotodecomposição seletiva compreender um primeiro passo de dissolução da mistura de atropisômeros de clorina ou bacterioclorina em um solvente arejado; e um segundo passo de irradiação com luz que é absorvida pela mistura de atropisômeros para fotodecompor até uma maior medida os atropisômeros menos fotoestáveis.

12. Uso da composição farmacêutica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e obtida pelo processo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 11, caracterizado pelo fato de ser destinado ao tratamento de disfunções hiperproliferativas incluindo, mas não estão limitadas a, cânceres ou carcinomas, mielomas, psoríase, degeneração macular e condições pré-cancerígenas.

13. Uso da composição farmacêutica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e obtida pelo processo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 11, caracterizado pelo fato de ser destinado ao tratamento de doenças infeciosas causadas por microrganismos incluindo, mas não se limitando a, vírus, bactérias, Rickettsia, micoplasma, protozoários, fungos; ou parasitas incluindo, mas não se limitando a, invertebrados multicelulares geralmente microscópicos ou muito pequenos, ou seus óvulos ou formas juvenis.

14. Estojo caracterizado pelo fato de compreender uma composição farmacêutica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e instruções para terapia fotodinâmica/administração da composição a um sujeito.

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