BRPI0809432A2 - Biomarcadores de segurança renal preditivos e assinaturas de biomarcadores para monitorar a função renal - Google Patents
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Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "BIOMARCADORES DE SEGURANÇA RENAL PREDITIVOS E ASSINATURAS DE BIOMARCADORES PARA MONITORAR A FUNÇÃO RENAL".
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a assinaturas de biomarcadores e
sua utilização em métodos e dispositivos para a monitoração, prognóstico, diagnóstico e/ou tratamento de toxicidade renal ou hepática e, mais especificamente, de toxicidade tubular renal como conseqüência de doença ou tratamento com fármacos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
A progressão até o estágio terminal da insuficiência renal é o destino final comum de várias nefropatias proteinúricas. O grau de proteinúria está associado à taxa de progressão da doença renal.
Em doenças proteinúricas humanas, as lesões tubulointersticiais são um melhor fator de previsão do declínio da função renal do que os danos glomerulares. Acredita-se que proteínas plasmáticas tubulotóxicas filtradas sejam as responsáveis por esta associação, embora a natureza dessas proteínas seja incerta. As proteínas filtradas exercem parcialmente seus efeitos prejudiciais por meio da ativação de células tubulares proximais (CTP), que excretam chemoquinas e citoquinas, resultando em inflamação, miotransformação de fibroblastos intersticiais, fibrose e apoptose. Isto acaba por levar à insuficiência renal em estágio terminal. Células epiteliais tubulares renais são, portanto, consideradas cruciais na progressão de danos intersticiais. Foi proposto que a proteinúria causa danos tubulares e fibrose intersticiai.
Há uma necessidade constante na arte em determinar e monitorar as funções renal e hepática em animais e no homem após tratamento com fármacos ou quando a função renal fica prejudicada por causa de doença. SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção fornece provas e dispositivos de diagnóstico para
diagnóstico ou prognóstico do estado, função e integridade dos rins e do fígado. Os biomarcadores da invenção, outros parâmetros químicos clínicos ou combinações dos mesmos podem ser convertidos em um ensaio, prova ou dispositivo para diagnóstico do estado do rim ou fígado, para monitorar os eventos adversos tais como nefrotoxicidade ou hepatotoxicidade induzida por fármacos, adaptar regimes de tratamento de fármacos com base no es5 tado do rim ou fígado ou desenvolver uma prova clínica para diagnóstico da doença no rim ou fígado ou sua prevalência.
A invenção possibilita a previsão, classificação, correlação e diagnóstico de toxicidade nos rins ou fígado com base nos dados aqui apresentados.
Também descritos aqui estão estudos com animais, nos quais
nefrotoxicantes e hepatotoxicantes de modelos distintos foram administrados nos animais usando diferentes regimes de dosagem. Amostras biológicas distintas foram colhidas dos animais em momentos diferentes. Urina, sangue, tecidos de órgãos, RNAm de tecidos de órgãos e sangue foram colhi15 dos em momentos diferentes e de grupos de tratamento distintos. Os animais foram avaliados durante o período in vivo e posteriormente, usando métodos distintos, particularmente por meio de observações clínicas, dados in vivo (tais como peso corporal, consumo alimentar, exames macro e microscópicos de órgãos (particularmente do rim e fígado).
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
As figuras mostram as configurações preferidas para fins de exemplo, não como limitações.
A figura 1 é uma listagem dos compostos administrados aos animais nos estudos in vivo.
A figura 2 mostra o número de lesões renais que foram relatadas
em todos os 10 estudos. Os números estão subdivididos por grau e por grupos de tratamento (animais tratados com nefrotoxicante comparados com animais tratados com o veículo e com o hepatotoxicante).
A figura 3 é uma tabela que mostra as lesões histopatológicas renais relatadas nos 10 estudos in vivo. Os números de ocorrências estão listados, divididos em categorias de grau e por grupos de tratamento (tratados com nefrotoxicante comparados com os tratados com o veículo e com o hepatotoxicante).
A figura 4 é uma matriz de histopatologia renal para o estudo do cisplatino. Cada coluna representa uma lesão localizada. Cada coluna corresponde a um animal, onde os animais estão ordenados por grupo de do5 sagem (controles, baixa dosagem, média dosagem e alta dosagem) e dentro de cada grupo de dosagem por momento do encerramento. Se uma lesão foi relatada, o grau é representado por um quadrado laranja com o grau correspondente (grau 1, grau 2-5, não informada/ grau 0). Os processos dominantes estão legendados.
A figura 5 é uma tabela que mostra as lesões histopatológicas
hepáticas relatadas nos 10 estudos in vivo. O número de ocorrências está listado.
A figura 6 é uma tabela que mostra os resultados da análise da característica de receptor-operador (CRO) dos biomarcadores e os padrões 15 atuais para determinadas patologias. A coluna 1 representa o biomarcador, a coluna 2 a entidade molecular, a coluna 3 o meio no qual o biomarcador foi medido e a coluna 4 a patologia para a qual a análise CRO foi realizada. A coluna 5 representa as ASCs e o erro padrão das mesmas. A coluna 6 indica se o valor de um biomarcador aumenta (+) ou diminui (-) na presença da pa20 tologia correspondente. As colunas 7 e 8 mostram os números de animais usados nas análises correspondentes. A coluna 11 mostra a sensibilidade correspondente para especificidade de 95% (coluna 10) e a coluna 9 mostra o limiar correspondente do biomarcador. Além dos biomarcadores de interesse, também os resultados dos padrões atuais de NUS e creatinina sérica 25 são exibidos para as 10 patologias de interesse. Esta tabela demonstra o uso e o desempenho das implementações de dispositivos, ensaios, provas diagnosticas ou kits para diagnóstico dos biomarcadores específicos listados para a monitoração das patologias renais específicas listadas.
A figura 7 é um conjunto de gráficos de dispersão exibindo uma avaliação da hepatotoxicidade por diferentes biomarcadores de proteínas. Os biomarcadores foram obtidos de animais para os quais foi administrado o veículo ou doses diferentes do hepatotoxicante ANIT (alfa-naftilisotiocianato). Neste estudo, foram observadas constatações histopatológicas relacionadas à dosagem no fígado, mas não no rim. Nos gráficos, são mostrados os níveis relativos de concentração (modulações comparadas aos controles). Os níveis de dosagem são representados pelas várias gradações de cor; os 5 momentos da amostragem são representados pelas legendas. Os níveis do biomarcador se correlacionam bem com a dosagem e, portanto, com a hepatotoxicidade relacionada à dosagem. Os biomarcadores representados nestes gráficos mostram a ALT medida no plasma (figura 7A, parte superior), a lipocalina-2 medida no plasma (figura 7A, parte inferior), a GST-mu medida 10 no plasma (figura 7B, parte superior) e a lipocalina-2 medida na urina (figura 7B, parte inferior).
A figura 8 é um conjunto de gráficos de dispersão mostrando uma avaliação de lesões no rim por diferentes biomarcadores de proteína e parâmetros químicos clínicos. Os biomarcadores foram obtidos em animais 15 para os quais foi administrado o veículo ou dosagens diferentes do nefrotoxicante cisplatino. Nos gráficos, são mostrados os níveis relativos de concentração (modulações comparadas aos controles). Os níveis de dosagem são mostrados como legendas no eixo x, os momentos da amostragem são mostrados com legendas das amostras. As amostras têm sua cor graduada 20 conforme o maior grau da constatação histopatológica observada no rim. A barra horizontal indica o maior nível do biomarcador observado para os animais de controle de caso (animais dosados com o veículo sem constatações histopatológicas no rim). Níveis de proteína superiores à barra aumentam significativamente (especificidade de 100% para os controles de caso). Os 25 vários parâmetros clínicos e proteínas detectam lesões no rim com sensibilidades diferentes. A creatinina medida no soro, que é a prova periférica padrão atual para lesões renais e para a função renal é o método menos sensível (figura 8A, parte superior). A cistatina C medida no plasma (figura 8A, parte inferior), a Kim-1 medida na urina (figura 8B, parte superior), a Iipocali30 na-2 medida na urina (figura 8B, parte inferior), a osteopontina medida na urina (figura 8C, parte superior) e a clusterina medida na urina (figura 8C, parte inferior) identificam mais animais com constatações significativas nos rins.
A figura 9 é um conjunto de gráficos de dispersão que mostra uma avaliação de lesões no rim por transcrição de genes diferentes no RNAm do rim. Os biomarcadores foram obtidos em animais para os quais foi 5 administrado o veículo ou dosagens diferentes do nefrotoxicante cisplatino. Nos gráficos, são mostrados os valores de expressão (valores de Ct em relação a Polr2g). Os níveis de dosagem são mostrados como legendas no eixo x, os momentos da amostragem são mostrados com legendas das amostras. As amostras têm sua cor graduada conforme o maior grau da cons10 tatação histopatológica observada no rim. A barra horizontal indica a expressão mais alta (menor valor do gráfico) observada para os animais do controle.
Os valores abaixo da barra correspondem a níveis de expressão significativamente aumentados (100% de especificidade para animais sem 15 dosagem). Tanto o Kim-1 (figura 9A) e o Cyr61 (figura 9B) podem detectar lesões precoces nos rins (em momentos anteriores) e de forma mais sensível (com níveis de dosagem menores) do que através de exame histopatológico.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições. Quando usadas aqui, as expressões "toxicidade re
nal" ou "lesão renal" ou, de forma semelhante, "distúrbio renal" significam insuficiência ou disfunção renal ou do rim, repentina (aguda) ou piorando lentamente com o passar do tempo (crônica), que pode ser desencadeada por várias doenças ou; processos de distúrbios que incluem (entre outros), 25 para o caso de toxicidade renal aguda: sepse I (infecção), choques, traumas, cálculos renais, infecção no rim, toxicidade por fármacos, venenos ou toxinas ou após injeção de contraste iodado (efeito adverso); e, para toxicidade renal crônica: longo histórico de hipertensão, diabetes, insuficiência cardíaca congestiva, lúpus ou anemia de células falciformes. Ambas as formas de 30 insuficiência renal resultam em um desarranjo metabólico que pode colocar a vida em risco.
A expressão "amostras corporais" inclui, entre outras, biópsias, preferencialmente do rim e fluidos corporais tais como sangue, plasma, soro, linfa, líquido cefalorraquidiano, fluido cístico, ascites, urina, fezes e bile. Uma vantagem da invenção é que um marcador pode ser particularmente bem monitorado nos fluidos corporais, tais como plasma ou urina. Por exemplo, o 5 nível de expressão da clusterina pode ser particularmente bem determinado no plasma.
Conforme usado aqui, o termo "indivíduo" se refere a uma pessoa humana, um animal como camundongo ou rato ou uma população ou conjunto de indivíduos.
Conforme usado aqui, o termo "agente candidato" ou "fármaco
candidato" pode se referir a moléculas naturais ou sintéticas tais como proteínas ou seus fragmentos, anticorpos, pequenas moléculas inibidoras ou agonistas, moléculas de ácido nucleico, compostos orgânicos e inorgânicos e similares.
Métodos gerais. Na prática da invenção, muitas técnicas con
vencionais de biologia molecular, microbiologia e ADN recombinante são usadas. Estas técnicas são bastante conhecidas e explicadas, por exemplo, em Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II, e III, 1997 (F. M. Ausubel ed.); Sambrook et ai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Se
cond Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I e II, D. N. Glover ed. (1985); Oligonucleotide Synthesis, M. L. Gait ed. (1984); Hames & Higgins, Nucleic Acid Hybridization, (1985); Transcription and Translation, Hames & Higgins eds. (1984); Animal Cell Culture, R. I. Freshney ed. (1986);
Immobilized Cells and Enzymes, (IRL Press, 1986); Perbal, A Praetieal Guide to Molecular Cloning; da série Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., 1984); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, J. H. Miller & Μ. P. Calos eds. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1987); e Methods in Enzymology Vol. 154 e Vol. 155 (Wu & Grossman e Wu, eds., respectivamente).
Todas as referências aqui citadas estão incorporadas por refe
rência em sua totalidade ao presente e, para todos os fins, da mesma forma que se cada publicação ou patente ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado para incorporação por referência em sua totalidade para todos os fins. Além disso, todos os números de catalogação GenBank1 números de cluster Unigene e de catalogação de proteínas aqui citados são incorporados por referência em sua totalidade ao presente e, 5 para todos os fins, da mesma forma que se cada número fosse indicado especificamente e individualmente para incorporação por referência em sua totalidade para todos os fins.
Biomarcadores da invenção. As expressões do genoma e da proteína de vários biomarcadores (listados nas TABELAS 1 e 2) em tecidos 10 renais foram medidas. Também foi medido o curso da proteína relacionada na urina e no plasma. Uma correlação da expressão do genoma ou da proteína na concentração em tecidos, urina e plasma foi feita com histopatologia e com parâmetros de urinálise como proteinúria (TABELA 2) e parâmetros químicos clínicos do plasma (ver TABELA 2) tais como creatinina, nitrogênio 15 ureico no sangue (NUS) e depuração criativa. A questão que foi investigada era se os biomarcadores urinários renais refletem lesões nos tecidos renais e possivelmente na função renal. A TABELA 1 fornece uma lista de biomarcadores avaliados em um nível de transcrição (RNAm do rim e do fígado) e em nível de proteína (na urina e no sangue). As medições destes biomarcadores na TABELA 1, descritos com mais detalhes abaixo.
TABELA 1
Lista de biomarcadores avaliados em nível de transcrição e em nível de proteína
Nome RNAm Proteína N0 Swissprot Símbolo do aene β-2-mieroglobulina não sim P07151 B2m N-acetil-beta-glucosaminidase, cadeia alfa da beta-hexosaminidase, NAG não sim Q641X3 Hexa Alfa glutationa-S-transferase (alfa-GST) / Glutationa-S-transferase alfa 5 sim sim P46418 Gstaõ Calbindina d28 sim sim P07171 Calbl Clusterina sim sim P05371 Clu Cistatina C sim sim P14841 Cst3 Proteína rica em cisteína-61 (CYR61) sim sim Q9ES72 Cyr61 Fator de crescimento epidérmico (FCE) sim sim P07522 Fce Glutationa S-transferase Mu 1, GST Yb1, mu GST sim sim P04905 Gstml Molécula de lesão renal-1, Receptor celular homólogo 1 do vírus da Hepatite sim sim 054947 Haverl ou Kim 1 A, Kim-1 Lipocalina associada à gelatinase de neutrófilos, HNL1 Lipocalina 2 sim sim P30152 Lcn2 Osteopontina, Fosfoproteína 1 secretada sim sim P08721 Sppl ou 2b7 Podocina sim sim Q8K4G9 Nphs2 Inibidor da metaloproteinase 1, TIMP-1 sim sim P30120 Timpl FCEV / Fator A de crescimento do endotélio vascular sim sim P16612 FCEV do FCEV-A Entre os biomarcadores da invenção, se encontram:
A calbindina D-28k é uma proteína de ligação ao cálcio, membro da grande família EF-hand. A calbindina D-28k está presente em todas as classes de vertebrado e em uma ampla gama de tecidos. Muitos pesquisadores demonstraram que no rim, as concentrações mais altas da calbindina D-28k estão localizadas no túbulo distai, que se correlaciona com o papel desempenhado pelo túbulo distai como o local de absorção do cálcio. Rhoten WB et ai, Anat. Rec. 227:145-151; Borke JL et al., Am. J. Physioi (Renal Fluid Electrolyte Physiol) 257: F842-F849 26 (1989). Além disso, foi demonstrado que a expressão reduzida da calbindina D-28k com a idade pode contribuir para com a redução no transporte de Ca++ no intestino e nos rins. Armbrecht HJ et al., Endocrinology 125: 2950-2956 (1989). A redução da proteína calbindina-D 28k induzida pela ciclosporina A em rins de ratos é conseqüência de uma redução em seu RNAm. Grenet O et ai, Biochem. Pharmacol. 55(7): 1131-1133 (1998); Grenet O et ai, Biochem. Pharmacoi 59(3): 267-272 (2000).
A clusterina, também conhecida como TRPM-2 (do inglês testosterone-repressed prostate message 2) é uma glicoproteína ubíqua, secretada, induzida em vários órgãos, incluindo o rim, em momentos de lesão e/ou 20 remodelagem dos tecidos, que foi encontrada no lúmen tubular dos dutos epiteliais. Jenne DE & Tschopp J, Trends Biochem. Sei. 14: 154-159 (1992). A clusterina pode preservar interações celulares que, do contrário, seriam perturbadas por distúrbios renais. Silkensen JR et ai, J. Am. Soe. Nephrol. 8(2): 302-305 (1997). Além disso, a ciclosporina A (CsA) aumenta os níveis 25 de clusterina no RNAm nos rins de ratos. Darby IA et ai, Exp. Nephrol. 3(4): 234-239 (1995).
O fator de crescimento epidérmico (FCE) é um pequeno polipeptídeo que pertence a uma classe de moléculas que podem fazer a mediação do crescimento e diferenciação celulares e respostas a fases agudas. O 30 RNAm do FCE é transcrito primariamente nas células dos rins. Em várias formas experimentalmente induzidas de insuficiência renal aguda, os níveis de RNAm e de proteína de FCE renais caem acentuadamente e permanecem baixos por um período prolongado. Price PM et ai, Am J PhysioL 268(4 Pt 2): F664-670 (1995). Além disso, acredita-se que FCE desempenha um papel importante na regeneração tubular após danos isquêmicos ao rim (Di Paolo S, et ai, Nephrol Dial Transplant 2: 2687-2693 (1997)) e no tecido re5 nal após nefrotoxicidade induzida por fármacos (Morin NJ et ai, Am. J. Physioi 263: F806-F811 (1992). Níveis de expressão de FCE tem se mostrado acentuadamente reduzidos em pacientes de transplante renal que sofrem com rejeição crônica ou nefrotoxicidade induzida por fármacos. Além disso, foram relatados casos de redução na expressão de FCE nos rins após tra10 tamento com a ciclosporina A (CsA). Deng JT et al., Transplant Proc. 26(5): 2842-2844; Yang CW, et al., Kindey Int. 60: 847-857 (2001).
A molécula de lesão renal-1 (Kim-1) é uma 1 proteína de membrana do tipo 1 que contém um domínio extracelular de imunoglobulina com seis cisteínas. O RNAm e a proteína da Kim-1 são expressos com um nível 15 baixo, quase indetectável no rim normal, mas dramaticamente aumentado nos túbulos proximais no rim pós-isquêmico. A Kim-1 está implicada na restauração da integridade morfológica e funcionamento de rins pósisquêmicos. Ichimura T et ai, J. Bioi Chem. 273: 4135-4142 (1998). A Kim-1 é às vezes descrita como "Havcrl." A expressão tubular precoce e abundan20 te após vários tipos de lesões fazem da Kim-1 um marcador específico de lesões às células tubulares que pode ser relacionado a mecanismos de recuperação ou de danos que direcionam o processo das lesões intersticiais. Consulte o WO 2004/005544, aqui incorporado por referência.
A proteína relacionada à globulina alfa-2u (Alfa-2u), também co25 nhecida como Iipocalina 2 (LCN2) ou Iipocalina associada à gelatinase de neutrófilos (NGAL) em seres humanos, é armazenada em grânulos de neutrófilos. Ela se liga a pequenas substâncias lipofílicas e acredita-se que ela tenha um papel nas inflamações. Bundgaard JR et ai, Biochem. Biophys. Res. Commun. 202: 1468-1475 (1994); Cowland JB & Borregaard N, Geno30 mies 45: 17-23 (1997); Zerega B et al., Eur. J. Cell Biol. 79, 165-172 (2000).
A osteopontina (OPN), também conhecida como fosfoproteína 1 secretada (SPP1), é uma fosfoproteína altamente ácida e glicosilada que contém um modelo de adesão a células de ácido arginina-glicina-aspártico (RGD). A regulação superior de OPN foi demonstrada em vários modelos de lesões renais, sugerindo um papel possível na remodelação e reparo de tecidos. Persy VP et al., Kidney Int. 56(2): 601-611 (1999). A osteopontina 5 também foi identificada como um importante componente em cálculos renais de oxalato de cálcio. Kohri K et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 84: 859-864 (1992). Além disso, a OPN é altamente expressa nas células tubulares distais em ratos com tendência à formação de cálculos renais. Kohri K et a!., J. Bioi Chem. 268: 15180-15184 (1993).
A podocina, também conhecida como PDCN, SRN1, nefrose 2,
idiopática, é uma proteína expressa em podócitos renais que desempenha um papel na regulação da permeabilidade glomerular. Ela é quase exclusivamente expressa nos podócitos dos glomérulos renais fetais e maduros. Mutações de proteínas de podócitos, por exemplo, a podocina, resultam em 15 glomeruloesclerose segmentai focal congênita. Komatsuda A et ai, Ren. Faii 25(1): 87-93 (2003)) e estão especialmente implicadas na síndrome nefrótica esteroide-resistente.
Sabe-se que o fator de crescimento do endotélio vascular (FCEV) promove a angiogênese, aumenta a permeabilidade vascular, serve como agente quimiotático para monócitos e possui um papel no diabetes, cura de feridas, respostas inflamatórias e remodelagem de tecidos. Benjamin LE, Am JPathol. 158: 1181-1184 (2001).
Como cada um dos marcadores pode estar relacionado a constatações patológicas distintas, é possível identificar os produtos de expressão 25 genética dos tais marcadores que estejam particularmente vinculados a uma patologia renal. Por exemplo, o nível de calbindina-D28k é usado como um marcador precoce para a previsão de distúrbios do cálcio para mineralização. O nível de Kim-1 é um marcador para distúrbios renais gerais. O nível de OPN é um marcador precoce para a infiltração de macrófagos, geralmen30 te associada à toxicidade nos rins e um marcador de remodelação de tecidos após lesões renais. O nível de FCE é um marcador precoce para a toxicidade geral dos rins. O nível de clusterina é um marcador precoce para a toxicidade imunomediada dos rins.
A TABELA 2 mostra uma lista de parâmetros químicos clínicos determinados na urina e no sangue. As medições destes biomarcadores na TABELA 2, descritos com mais detalhes abaixo.
TABELA 2
Lista de parâmetros de química clínica Parâmetros da urina Cálcio (Ca++)
Cloreto (CI-)
Creatinina (CREAT)
Depuração de creatinina (CCr)
Fósforo inorgânico (PI)
Lactato desidrogenase (LDH) Magnésio (Mg++)
Potássio (K+)
Sódio (Na+)
Gravidade específica (GE)
Total de proteínas (PROT)
Ureia (UREIA)
Volume (VOLUME)
Cor (COR)
Aparência (AP)
Parâmetros do sangue Albumina (ALB)
Relação albumina/globulina (A/G) Fosfatase alcalina (FA)
Alanina aminotransferase (ALT) Aspartato aminotransferase (AST) Cálcio (Ca++)
Cloreto (CI-)
Creatinina (CREAT)
Glicose (GLIC)
Fósforo inorgânico (PI)
Lactato desidrogenase (LDH) Magnésio (MAGN)
Potássio (K+)
Sódio (Na+)
Bilirrubina total (BT)
Colesterol total (COL)
Total de proteínas (PROT) Triglicerídeos (TRIG)
Ureia (UREIA)
5 Resultados de estudos in vivo e histopatologia. Todos os 10 es
tudos in vivo com ratos foram realizados com sucesso. Uma quantidade suficiente de urina pôde ser coletada de quase todos os animais que foram mortos nos dias 3, 7, 14, 21 e 22. Foram analisados e estão aqui relatados apenas animais para os quais estavam disponíveis conjuntos completos de da10 dos (histopatologia do rim, química clínica urinária, biomarcadores de proteína urinárias, química clínica sanguínea, biomarcadores de proteína plasmática, biomarcadores de RNAm nos rins). No total, dados de 739 animais foram analisados, incluindo 447 animais tratados com nefrotoxicantes, 188 animais tratados com veículos e 104 animais tratados com hepatotoxicantes. 15 Em nove amostras, não havia medições de Kim-1 urinário disponíveis; em 84 amostras, não havia medições de Kim-1 sanguíneo disponíveis. Estas amostras foram excluídas das análises de Kim-1, mas foram incluídas nas análises de outros parâmetros e biomarcadores. Na figura 2, são exibidas as distribuições dos graus das avaliações histopatológicas. A predominância de constatações de grau 1 e de grau 2 e a ausência de lesões de grau 5 indicam que a meta de induzir principalmente de uma nefrotoxicidade leve foi atingida. O número considerável de 5 constatações de grau 1 e algumas de grau 2 nos animais com dosagem de veículo e nos animais com dosagem de hepatotoxicante indica o nível de sensibilidade da avaliação histopatológica executada neste projeto. Nenhuma nefrotoxicidade dependente da dosagem significativa foi induzida pelos hepatotoxicantes. Na figura 03 é mostrada uma listagem detalhada de todas 10 as lesões localizadas relatadas, incluindo o número de ocorrências para cada grau, separadas por animais com dosagem de nefrotoxicantes e os animais do controle (dosagem do veículo e de hepatotoxicantes). Setenta e cinco constatações diferentes localizadas foram observadas.
Os diferentes tipos de lesões não foram geralmente observados de forma isolada, mas tipicamente de forma altamente correlacionada, representando diferentes processos moleculares. Na figura 04, são mostradas todas as constatações histopatológicas para o estudo do cisplatino. Os processos não afetam segmentos únicos isolados do néfron, mas vários segmentos de forma correlacionada (por exemplo, túbulos proximais e túbulos retos descendentes). Além disso, pode ser observada uma seqüência lógica de processos moleculares ao longo dos animais classificados por dosagem e por tempo. Foram constatados casos de necrose como conseqüência das lesões e, então, os processos de regeneração como basofilia e mitose, sendo que processos secundários ocorrem em paralelo (por exemplo, aumento de túbulos, dilatação tubular, descamação celular, etc.).
Para a qualificação dos biomarcadores, há duas conseqüências: primeiro, deve ser obtido um nível apropriado de detalhes de localização que melhor corresponda à expressão de um biomarcador. Em segundo lugar, as descrições histopatológicas simples devem ser integradas aos processos 30 moleculares, que correspondem aos eventos moleculares que desencadeiam a expressão dos biomarcadores. Desta forma, as lesões localizadas foram aqui integradas em 10 processos diferentes, nos quais para cada amostra, o mais alto grau de lesões localizadas correspondentes foi atribuído à patologia integrada. Particularmente, estes 10 processos patológicos são investigados:
1. Danos aos túbulos proximais: Lesões com grau 1 ("mínimas", "poucas", "muito pequenas") ou superiores dos tipos "necrose", "apoptose"
ou "descamação de células tubulares" localizadas em quaisquer dos segmentos tubulares S1, S2 ou S3 ou em não-localizável.
2. Alterações/danos glomerulares: Lesões com grau 1 ("mínimas", "poucas", "muito pequenas") ou superiores dos tipos "proliferação de
células mesangiais", "aumento de células mesangiais", "vacuolização glomerular" ou "fibrose intersticial da cápsula de Bowman."
3. Danos/regeneração/dilatação tubular: Lesões com grau 1 ("mínimas", "poucas", "muito pequenas") ou superior dos tipos "necrose", "apoptose", "descamação de células tubulares", "basofilia" ou "aumento da
mitose" localizados em quaisquer dos segmentos tubulares S1, S2, S3, alça de Henle, túbulos ascendentes grossos, túbulos distais ou dutos coletores ou não localizáveis ou "dilatação tubular" no córtex, medula ou papila.
4. Alterações/lesões glomerulares ou lesões/regeneração/dilatação tubulares: Lesões com grau 1 ("mínimas", "poucas", "muito pequenas")
ou superior dos tipos "proliferação de células mesangiais", "aumento de células mesangiais", "vacuolização glomerular" ou "fibrose intersticial da cápsula de Bowman" ou dos tipos "necrose", "apoptose", "descamação de células tubulares", "basofilia" ou "aumento da mitose" localizados em quaisquer dos segmentos tubulares S1, S2, S3, alça de Henle, túbulos ascendentes gros
sos, túbulos distais ou dutos coletores ou não localizáveis ou "dilatação tubular" no córtex, medula ou papila.
5. Lesões/regeneração do túbulo ascendente grosso: Lesões com grau 1 ("mínimas", "poucas", "muito pequenas") ou superior dos tipos "necrose", "apoptose", "basofilia" ou "aumento da mitose" localizados nos
túbulos ascendentes grossos.
6. Lesões/regeneração do túbulo distai: Lesões com grau 1 ("mínimas", "poucas", "muito pequenas") ou superior dos tipos "necrose", "basofilia" ou "aumento da mitose", localizados nos túbulos distais.
7. Lesões/regeneração dos dutos coletores: Lesões com grau 1 ("mínimas", "poucas", "muito pequenas") ou superior dos tipos "necrose", "apoptose", "descamação de células tubulares" ou "basofilia", nos dutos co
letores.
8. Mineralização tubular: Lesões com grau 1 ("mínimas", "poucas", "muito pequenas") ou superiores do tipo "cilindros intratubulares - mineralização" localizados em quaisquer dos segmentos tubulares S1, S2, S3, alça de Henle, túbulos ascendentes grossos, túbulos distais ou dutos coleto
res.
9. Cilindros hialinos intratubulares: Lesões com grau 1 ("mínimas", "poucas", "muito pequenas") ou superiores do tipo "cilindros intratubulares - hialinos (proteináceos, pigmentados)" localizados em quaisquer dos segmentos tubulares S1, S2, S3, alça de Henle, túbulos ascendentes gros
sos, túbulos distais ou dutos coletores.
10. Hipertrofia do sistema justaglomerular: As patologias observadas no fígado dos animais dos 10 estudos estão listadas na figura 5.
Descrição das análises. Os biomarcadores de proteína foram medidos através de ensaio proteicos multiplexados validados, desenvolvidos 20 e disponibilizados pela RuIesBasedMedicine (Texas, Estados Unidos). Os parâmetros de química clínica (por exemplo, NUS, NAG, creatinina e LDH) foram medidos com ensaios químicos clínicos padrão (dispositivo ADVIA 1650). Os biomarcadores de RNAm foram medidos por ensaios TaqMan Gene Expression da Applied Biosystems em conjuntos de baixa densidade 25 em um instrumento RCP 7900HT em tempo real da Applied Biosystems. O RNAm havia sido extraído de meio rim, usando os procedimentos padrão.
Descrição do pré-processamento de dados. Os valores de concentrações dos biomarcadores obtidos nos dispositivos de análise foram préprocessados de acordo com as etapas a seguir: (1) valores de concentração 30 acima do limite superior de quantificação foram substituídos pelo limite superior de quantificação; (2) valores de concentração abaixo do limite inferior de quantificação foram substituídos pelo limite inferior de quantificação; (3) os biomarcadores urinários foram normalizados para a concentração de creatinina urinária pela divisão de cada amostra pelo valor de creatinina urinária correspondente; e (4) para expressar os dados como modulações, cada valor foi dividido pela média aritmética do grupo de controle correspondente do 5 estudo e com correspondência temporal (geralmente 6 animais).
Descrição da análise dos dados. Todas as análises quantitativas dos dados foram baseadas em análises da característica de receptoroperador (CRO). Em uma análise CRO, o limiar de decisão varia automaticamente para problemas de decisão binária (por exemplo, os controles com10 parados aos animais doentes) e os positivos verdadeiros (sensibilidade) são traçados, em contraposição aos negativos verdadeiros (especificidade-1). A área sob a curva (ASC) é uma medição do poder de diagnóstico combinando a sensibilidade e a especificidade em apenas um valor, no qual um discriminador aleatório corresponde a uma ASC de 0,5 e um discriminador perfeito a 15 1.0 cálculo da ASC foi executado usando integração trapezoidal, conforme descrito por Bradley AP, Pat. Recogn. 30(7):1145-1159 (1997). O erro padrão da ASC foi calculado de acordo com o erro padrão da estatística de Wilcoxon conforme descrito por Bradley (1997).
Como exemplo de aplicação da análise CRO para um determinado biomarcador e patologia, um limiar para o biomarcador/patologia foi estabelecido para uma especificidade mínima predefinida desta forma:
Para certa especificidade mínima (por exemplo 95%) foi determinada primeiramente a menor especificidade possível acima ou ao nível da especificidade mínima. Para esta especificidade exata, o limiar com a maior 25 sensibilidade correspondente foi selecionado. O algoritmo não procura se especificidades mais altas para esta sensibilidade são possíveis com outras alterações ao limiar. Para este limiar, a especificidade e a sensibilidade correspondentes estão aqui relatadas.
Para a análise dos dados, as seguintes definições de animais de controle e de animais doentes foram usadas: (a) Grupo de controle: Animais que receberam dosagem de veículos ou hepatotoxicantes e que não apresentam a lesão investigada, (b) Grupo doente: Animais que receberam a dosagem de nefrotoxicantes e que receberam grau 1 ou superior para a lesão de interesse na avaliação histopatológica.
Animais que receberam dosagem de hepatotoxicante estão incluídos no grupo de controle para testar a especificidade dos marcadores em comparação a outras alterações hepatotóxicas e devido ao fato de que nenhuma nefrotoxicidade relacionada à dosagem foi observada nesses estudos.
Animais que receberam dosagem mais não apresentaram qualquer lesão ou qualquer outro tipo de lesão (excetuando o contexto histopatológico específico de interesse) foram deixados de fora da CRO, pois se considerou que esses animais não estavam "limpos." Este grupo de animais representa um estado indefinido, especialmente quando uma resposta molecular é precoce e mais rápida do que uma manifestação histopatológica. Caso isto não possa ser decidido, se (1) uma única lâmina histopatológica de um rim não for representativa do estado geral do mesmo (histopatologia falso negativo); (2) a resposta molecular for precoce/mais sensível do que a histopatologia, o chamado estado prodrômico ou (3) os animais são falsos positivos se a histopatologia fosse o único verdadeiro (biomarcador falso positivo). O modo mais conservador de tratamento destes animais é excluí-los das análises, uma vez que nenhuma atribuição definitiva a qualquer dos grupos pode ser feita.
Resultados de biomarcadores e patologias de interesse para a monitoração de lesões renais. Os resultados das análises CRO combinando histopatologia, informações do estudo e valores de biomarcadores estão exibidas para as patologias e biomarcadores mais interessantes na figura 6.
Proteínas e parâmetros de química clínica para monitoração e identificação de lesões no fígado. Os biomarcadores foram obtidos de animais para os quais foi administrado o veículo ou doses diferentes do hepatotoxicante ANIT (alfa-naftilisotiocianato). Consulte a figura 7. Neste estudo, 30 foram observadas constatações histopatológicas relacionadas à dosagem no fígado, mas não no rim. Nos gráficos, são mostrados os níveis relativos de concentração (modulações comparadas aos controles). Os níveis de dosagem são representados pelas várias gradações de cor; os momentos da amostragem são representados pelas legendas. Os níveis do biomarcador se correlacionam bem com a dosagem e, portanto, com a hepatotoxicidade relacionada à dosagem. Os biomarcadores representados nestes gráficos 5 mostram a ALT padrão atual, medida no plasma (figura 7A, parte superior) e os novos marcadores lipocalina-2 medida no plasma (figura 7A, parte inferior), GST-mu medida no plasma (figura 7B, parte superior) e lipocalina-2 medida na urina (figura 7B, parte inferior).
Proteínas e parâmetros de química clínica para monitoração e identificação de lesões no rim. Os biomarcadores foram obtidos em animais para os quais foi administrado o veículo ou dosagens diferentes do nefrotoxicante cisplatino. Consulte a figura 7. Nos gráficos, são mostrados os níveis relativos de concentração (modulações comparadas aos controles). Os níveis de dosagem são mostrados como legendas no eixo x, os momentos da amostragem são mostrados com legendas das amostras. As amostras têm sua cor graduada conforme o maior grau da constatação histopatológica observada no rim. A barra horizontal indica o maior nível do biomarcador observado para os animais de controle de caso (animais dosados com o veículo sem constatações histopatológicas no rim). Níveis de proteína superiores à barra aumentam significativamente (especificidade de 100% para os controles de caso). Além disso, outros limiares são possíveis. Limiares específicos para especificidade de 95% estão propostos na figura 6. Os vários parâmetros clínicos e proteínas detectam lesões no rim com sensibilidades diferentes. A creatinina medida no soro, que é a prova periférica padrão atual para lesões renais e para a função renal é o método menos sensível (figura 8A, parte superior). A cistatina C medida no plasma (figura 8A, parte inferior), a Kim-1 medida na urina (figura 8B, parte superior), a lipocalina-2 medida na urina (figura 8B, parte inferior), a osteopontina medida na urina (figura 8C, parte superior) e a clusterina medida na urina (figura 8C, parte inferior) identificam mais animais com constatações significativas nos rins.
Transcrição de genes para monitoração e identificação de lesões nos rins. Os biomarcadores foram obtidos em animais para os quais foi administrado o veículo ou o nefrotoxicante cisplatino. Consulte a figura 9. Nos gráficos, são mostrados os valores de expressão (valores de Ct em relação a Polr2g). Os níveis de dosagem são mostrados como legendas no eixo x, os momentos da amostragem são mostrados com legendas das amostras.
5 As amostras têm sua cor graduada conforme o maior grau da constatação histopatológica observada no rim. A barra horizontal indica a expressão mais alta (menor valor do gráfico) observada para os animais do controle. Os valores abaixo da barra correspondem a níveis de expressão significativamente aumentados (100% de especificidade para animais sem dosagem). Além 10 disso, outros limiares são possíveis. Limiares específicos para especificidade de 95% estão propostos na figura 6. Tanto o Kim-1 (figura 9A) e o Cyr61 (figura 9B) podem ser usados para detectar lesões precoces nos rins (em momentos anteriores) e de forma mais sensível (com níveis de dosagem menores) do que através de exame histopatológico.
Configurações e aspectos da invenção. Usando operações ma
temáticas e os dados aqui descritos, a invenção prevê as seguintes configurações:
A invenção fornece métodos para o diagnóstico, prognóstico e classificação da toxicidade renal e/ou hepática pela utilização de biomarcadores únicos da invenção ou combinações de biomarcadores (parâmetros de química clínica, proteínas, transcrição de RNAm) em matrizes biológicas (urina, sangue, RNAm dos rins e do sangue). A invenção também fornece métodos para o diagnóstico, prognóstico e classificação de constatações histopatológicas, combinações de constatações histopatológicas e mecanismos manifestados por constatações histopatológicas nos rins, fígado ou rins e fígado com a ajuda de medições de biomarcadores únicos ou combinação de biomarcadores (parâmetros de química clínica, proteínas, transcrições de RNAm) em matrizes biológicas únicas ou em matrizes biológicas diferentes. Na utilização da invenção, uma constatação histopatológica dos rins corresponde a uma toxicidade renal ou sintoma de doença renal e uma constatação histopatológica do fígado corresponde a uma toxicidade hepática ou sintoma de doença hepática. Portanto, o nível de expressão ou o nível da função de um marcador em um indivíduo pode ser determinado para, assim, selecionar o agente adequado para o tratamento terapêutico ou profilático do indivíduo. Este conhecimento, quando aplicado ã seleção de uma dosagem ou de um 5 fármaco, pode evitar reações adversas ou falhas na terapia, aumentado portanto a eficiência terapêutica ou profilática no tratamento de indivíduos com modulador de expressão de um marcador. Consulte o WO 2004/005544, aqui incorporado por referência.
A invenção ainda fornece métodos para o diagnóstico, prognóstico e classificação de biomarcadores únicos ou combinações de biomarcadores em matrizes biológicas com a ajuda de biomarcadores únicos ou combinações de biomarcadores nas matrizes biológicas.
A invenção ainda fornece métodos para prognósticos sobre o destino dos indivíduos (por exemplo, a taxa de sobrevivência) com a ajuda das medições dos biomarcadores da invenção em matrizes biológicas.
Em um aspecto, a invenção mostra que os biomarcadores da invenção podem ser usados no prognóstico, classificação e diagnóstico de constatações histopatológicas, combinações de constatações histopatológicas e mecanismos manifestados por constatações histopatológicas nos rins, 20 no fígado ou nos rins e no fígado, com maior sensibilidade e especificidade, de forma mais rápida e com níveis de dosagem inferiores ao de outros biomarcadores.
Em outro aspecto, a invenção mostra que os biomarcadores da invenção podem ser usados no prognóstico, classificação e diagnóstico de 25 constatações histopatológicas, combinações de constatações histopatológicas e mecanismos manifestados por constatações histopatológicas nos rins, no fígado ou nos rins e no fígado no curso do estudo antes da avaliação histopatológica do fígado e do rim no mesmo momento do estudo. Isto significa que a modelagem, diagnóstico, classificação e prognóstico histopatológicos 30 com a ajuda dos biomarcadores são mais precoces, sensíveis e mais específicos do que a própria avaliação histopatológica.
Os métodos da invenção podem ser usados não apenas com os biomarcadores descritos da invenção, mas também com os seus produtos da decomposição ou combinações dos biomarcadores descritos e produtos da decomposição. Os produtos da decomposição podem ser peptídeos ou fragmentos de peptídeos das proteínas descritas ou fragmentos de RNAm e 5 produtos da decomposição das transcrições de RNAm descritas. Além disso, métodos da invenção podem ser usados não apenas com os biomarcadores descritos, mas também com biomarcadores substancialmente similares, como isoformas diferentes, variantes de splicing e fragmentos. Em algumas configurações, os métodos da invenção podem usar polimorfismos de um 10 gene dos biomarcadores descritos da invenção.
A invenção também contempla a implementação desses marcadores, a combinação desses biomarcadores e os modelos, correlações, prognósticos, classificação e diagnóstico dos biomarcadores com histopatologia e outros biomarcadores em um dispositivo. Particularmente, a invenção 15 fornece uma prova, dispositivo, ensaio, prova de biomarcador, kit para exame clínico ou dispositivo de diagnóstico para monitoração ou diagnóstico do estado e função renal ou do estado e função hepática. Em outra configuração, a invenção fornece uma prova, dispositivo, ensaio, prova de biomarcador, kit para exame clínico ou dispositivo de diagnóstico para monitoração ou 20 diagnóstico de efeitos adversos de fármacos nos rins ou no fígado. Em outra configuração, a invenção fornece um prova, dispositivo, ensaio, prova de biomarcador, kit para exame clínico ou dispositivo de diagnóstico para identificação de agentes candidatos (fármacos) que não provoquem ou induzam efeitos adversos nos rins ou no fígado. Ainda em outra configuração, a in25 venção fornece uma prova, dispositivo, ensaio, prova de biomarcador, kit para exame clínico ou dispositivo de diagnóstico para determinar se um indivíduo está respondendo à terapia em respeito à toxicidade dos rins, toxicidade do fígado ou toxicidade dos rins e do fígado.
Os componentes do kit podem se destinar à medição da expressão genética por análise Northern blot, RCP de transcriptase reversa ou RCP quantitativa em tempo real, ADN ramificado, amplificação baseada em seqüência de ácido nucleico (NASBA), amplificação mediada por transcrição, ensaio de proteção de ribonuclease ou microconjuntos. Outra configuração particular oferece um kit, no qual a forma de determinação do nível de expressão genética ou produto de expressão genética é formada por pelo menos um anticorpo específico para uma proteína codificada pelo gene mar5 cador, selecionado dentre os biomarcadores da invenção. O anticorpo é preferencialmente selecionado entre anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, anticorpos humanizados ou quiméricos e fragmentos de anticorpos biologicamente funcionais suficientes para ligação do fragmento do anticorpo ao marcador. Particularmente preferidos são métodos de imunoensaio para 10 determinar o nível de expressão genética.
Em outra modalidade preferida da invenção, um kit é fornecido contendo meios para obtenção de uma amostra corporal do indivíduo, particularmente plasma ou urina. Uma configuração particularmente preferida também possui um recipiente adequado para os meios de determinação do 15 nível de expressão genética e a amostra corporal do indivíduo. Em outra configuração preferida, o kit traz ainda instruções para utilização e interpretação dos resultados do kit.
Em várias modalidades, a invenção fornece provas, dispositivos, ensaios, provas de biomarcadores, kits de provas clínicos ou dispositivos 20 para diagnóstico (i) para identificar agentes candidatos (fármacos) que atenuem um ou vários sintomas da toxicidade renal; (ii) identificar agentes candidatos (fármacos) que atenuem um ou vários sintomas da toxicidade hepática; (iii) comparar o potencial de toxicidade renal de dois agentes (fármacos); e (iv) comparar o potencial de toxicidade do fígado de dois agentes 25 (fármacos).
Por exemplo, a eficácia de um agente na alteração da expressão do marcador pode ser monitorada em ensaios clínicos de indivíduos recebendo tratamento para doença ou toxicidade renal. Em uma configuração preferida, a invenção fornece um método para monitoração da eficácia do 30 tratamento de um indivíduo com um agente (por exemplo, um agonista, antagonista, peptideomimético, proteína, peptídeo, ácido nucleico, pequena molécula ou algum outro fármaco candidato) consistindo nas etapas de: (i) obtenção de uma amostra pré-administração de um indivíduo antes da administração do agente; (ii) detecção do nível de expressão de um ou mais marcadores selecionados da invenção na amostra pré-administração; (iii) obtenção de uma ou mais amostras pós-administração do indivíduo; (iv) de5 tecção do nível de expressão dos marcadores nas amostras pós-administração; (v) comparação do nível de expressão dos marcadores na amostra de pré-administração com o nível de expressão dos marcadores na amostra ou amostras de pós-administração e (vi) alteração da administração do agente ao indivíduo conforme o resultado obtido. Por exemplo, a adminis10 tração modificada do agente pode ser desejada para aumentara expressão dos marcadores para níveis mais altos do que os detectados, ou seja, aumentar a eficácia do agente. Alternativamente, o aumento/redução da administração do agente pode ser desejável para aumentar/diminuir respectivamente a eficácia do agente.
Em uma configuração particular, a invenção fornece um método
para identificação de agentes candidatos para utilização no tratamento da toxicidade renal compreendendo as etapas de (a) contato de uma amostra do tecido renal sujeito à toxicidade com um agente candidato; (b) determinação, a partir do tecido do rim, do nível de expressão genética ou produto de 20 expressão genética, particularmente proteína, correspondendo a um ou mais genes selecionados dentre os biomarcadores da invenção, para obtenção de um primeiro conjunto de valores e (c) comparação do primeiro conjunto de valores com o segundo conjunto de valores correspondente ao nível de expressão genética ou produto de expressão genética, particularmente proteí25 na, avaliados para os mesmos genes e sob condições idênticas às da etapa
(b) em um tecido renal sujeito à toxicidade não induzida pelo agente candidato.
Em outra configuração particular, a invenção fornece um método para identificação de agentes candidatos que não provoquem toxicidade renal ou induzam toxicidade renal, compreendendo as etapas de (a) contato de uma amostra do tecido renal não sujeito à toxicidade com um agente candidato; (b) determinação, a partir do tecido do rim, do nível de expressão genética ou produto de expressão genética, particularmente proteína, correspondendo a um ou mais genes selecionados dentre os biomarcadores da invenção, para obtenção de um primeiro conjunto de valores e (c) comparação do primeiro conjunto de valores com o segundo conjunto de valores cor5 respondente ao nível de expressão genética ou produto de expressão genética, particularmente proteína, avaliados para os mesmos genes e sob condições idênticas às da etapa (b) em um tecido renal não sujeito à toxicidade.
Em outra configuração particular, a invenção fornece um método para comparação dos potenciais citotóxicos renais de dois fármacos candidatos compreendendo as etapas de (a) contato de uma amostra do tecido renal não sujeita à toxicidade com um primeiro fármaco candidato e a determinação, a partir do tecido do rim, do nível de expressão genética ou produto de expressão genética, particularmente proteína, correspondendo a um ou mais genes selecionados dentre os biomarcadores da invenção, para obtenção de um primeiro valor; (b) contato de uma amostra do tecido renal não sujeito a toxicidade com um segundo fármaco candidato e a determinação a partir do tecido renal do nível de expressão genética correspondente a um ou mais genes selecionados dentre os biomarcadores da invenção para obtenção de um segundo valor e (c) comparação do primeiro valor com o segundo valor.
Em outras configurações, a invenção fornece um método terapêutico para o tratamento de toxicidade renal e/ou hepática em um paciente individual por meio da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de modulação que modula no fígado e/ou rim a sín25 tese, a expressão ou a atividade de um ou vários genes, produtos de expressão genética ou proteínas listadas na TABELA 1 para que pelo menos um sintoma ou toxicidade renal/hepática seja atenuado.
Em um aspecto particular da invenção, um método é fornecido para métodos de tratamento, tanto profiláticos quanto terapêuticos, de um indivíduo que tenha, ou que corra o risco de ter um distúrbio renal ou toxicidade renal. A administração de um agente profilático pode ocorrer antes da manifestação dos sintomas característicos do distúrbio renal, de forma que o desenvolvimento do distúrbio renal seja prevenido ou tenha sua progressão adiada.
Em outra configuração particular, a invenção fornece um método de tratamento ou prevenção da toxicidade renal em indivíduos, compreen5 dendo a etapa de administração ao indivíduo citado de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de modulação que realiza a modulação no rim da síntese, expressão ou atividade de um ou mais genes ou produtos de expressão genética, particularmente proteína, do grupo de genes dos biomarcadores da invenção, para que pelo menos um sintoma de toxici10 dade renal seja atenuado.
Em outra configuração particular, a invenção fornece um método de tratamento da toxicidade renal em indivíduos, compreendendo a etapa de administração ao indivíduo citado de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de modulação que realiza a modulação no rim da sín15 tese, expressão ou atividade de um ou mais genes ou produtos de expressão genética, particularmente proteína, do grupo de genes dos biomarcadores da invenção, para que pelo menos um sintoma de toxicidade renal seja atenuado.
Em outra configuração, a invenção fornece um método de trata20 mento da toxicidade renal em um indivíduo recebendo tratamento com um agente citotóxico, compreendendo a etapa de administração ao indivíduo citado de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de modulação que realiza a modulação no rim da síntese, expressão ou atividade de um ou mais genes ou produtos de expressão genética, particularmente 25 proteína, do grupo de genes dos biomarcadores da invenção, para que pelo menos um sintoma de toxicidade renal seja atenuado.
A invenção fornece um método de identificação de outros novos biomarcadores para diagnóstico, prognóstico, classificação ou monitoração de toxicidade renal e/ou toxicidade hepática ou seus sintomas com a ajuda dos marcadores, combinação dos biomarcadores e modelos, correlações, prognósticos, classificações e diagnósticos desta invenção.
Uma vantagem em particular dos métodos acima, ou seja, os métodos para (i) identificação de agentes candidatos, (ii) comparação dos potenciais citotóxicos renais de dois fármacos candidatos e (iii) identificação de agentes candidatos que não provoquem ou induzam a toxicidade renal, é que os mesmos podem ser executados in vitro. Os tecidos renais usados 5 são preferencialmente obtidos de culturas de tecido ou células renais que entraram em contato com um agente citotóxico. O tecido renal também pode ser uma amostra do rim de um indivíduo sujeito à toxicidade renal, mas isto pode limitar a ampla utilização das aplicações ίη-vitro de tais métodos.
Portanto, a invenção fornece uma prova que mede os biomarca10 dores acima mencionados em culturas de tecido ou células renais para prever, classificar ou diagnosticar toxicidade renal e/ou toxicidade renal in vivo. Este pode ser uma única ou uma coleção de células renais ou hepáticas como as linhas de células HK2 de células epiteliais renais humanas 293T, linhas de células renais embrionárias humanas ou linhas de células hepáti15 cas embrionárias humanas, por exemplo. Alterações no perfil de expressão de um perfil de referência basal no qual as células estão expostas a várias condições modificadoras, tais como contato com um fármaco ou outras moléculas ativas, podem ser usadas como uma indicação de tais efeitos.
Culturas de tecidos ou células renais podem estar vantajosamente baseadas em um modelo animal in vivo que emite os distúrbios dos tecidos celulares humanos, preferencialmente os renais. Também pode ser uma única ou uma coleção de células renais como células epiteliais renais humanas 293T ou uma linha de células embrionárias renais humanas, por exemplo. O rim é particularmente suscetível à ação nefrotóxica de fármacos por causa de suas propriedades funcionais incluindo (a) o alto volume do fluxo de sangue renal, que traz grande quantidade de toxinas; (b) a grande área de contato com o fármaco, tanto nos glomérulos ou no epitélio tubular, que possibilita a interação ou absorção da toxina; (c) a capacidade do rim de transferir substâncias ativas, que fornecem mecanismos de transferência específicos para a mediação da absorção celular; (d) decomposição do fármaco, que pode ocorrer nos túbulos renais e levar à formação de metabólitos tóxicos de substâncias originárias não-tóxicas; e) os mecanismos de concentração do rim, que podem aumentar as concentrações urinárias e intersticiais de produtos não absorvidos; a alta taxa metabólica de células tubulares necessárias para o funcionamento normal, que está sujeita a perturbações.
EQUIVALENTES
A invenção não deve ser limitada em termos das configurações particulares descritas neste pedido, que são ilustrações individuais dos aspectos individuais da invenção. Várias modificações e variações desta invenção podem ser feitas sem desvio do espírito e escopo da mesma, como 10 ficará aparente àqueles versados na técnica. Métodos e aparelhos funcionalmente equivalentes dentro do escopo da invenção, além dos enumerados aqui, serão aparentes para aqueles versado na técnica relacionada às descrições acima. Tais modificações e variações devem cair dentro do escopo das reivindicações anexadas. A invenção só deve ser limitada pelos termos 15 das reivindicações anexadas em conjunto com o escopo total de equivalentes para os quais tais reivindicações se destinam.
Claims (4)
1. Método para avaliação da toxicidade renal ou toxicidade hepática em um indivíduo após a administração de um composto suspeito de causar toxicidade renal ou toxicidade hepática, em que a toxicidade renal ou toxicidade hepática é identificada pela medição de um conjunto de biomarcadores em uma amostra do indivíduo e a comparação da quantidade do biomarcador medido com o valor correspondente de um sujeito saudável, em que os biomarcadores são selecionados dentre o grupo formado pelos biomarcadores listados na TABELA 1.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a avaliação da toxicidade hepática é feita pela medição do conjunto de biomarcadores de proteína, compreendendo: (a) lipocalina-2 medida em uma amostra de sangue, plasma ou soro do indivíduo, (b) glutationa S-transferase mu 1 (GST-mu) medida em uma amostra de sangue, plasma ou soro do indivíduo e (c) lipocalina-2, medida em uma amostra de urina do indivíduo.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a avaliação da toxicidade renal é feita pela medição do conjunto de biomarcadores de proteína, compreendendo: (a) cistatina C medida em uma amostra de sangue, plasma ou soro do indivíduo, (b) Molécula de lesão renal-1 (Kim-1), medida em uma amostra de urina do indivíduo e (c) lipocalina-2, medida em uma amostra de urina do indivíduo.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que avaliação da toxicidade renal é feita pela medição do conjunto de biomarcadores de transcrição genética, compreendendo: (a) Molécula de lesão renal-1 (Kim-1) e (c) proteína rica em cisteína-61 (CYR61).
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