BRPI0924639A2 - novos biomarcadores para avaliação de doenças nos rins. - Google Patents

Abstract

NOVOS BIOMARCADORES PARA AVALIAÇÃO DE DOENÇAS NOS RINS A presente invenção está correlacionada a um conjunto biomarcador metabólito para avaliação de doença nos rins, compreendendo pelo menos dois aminoácidos, pelo menos duas acilcarnitinas e, pelo menos, duas aminas biogênicas. Além disso, a presente invenção se refere a um método para avaliação de doença nos rins de um sujeito mamífero, cujo método compreende a obtenção de uma amostra biológica do sujeito, preferivelmente, sangue e/ou urina, e medição na amostra biológica da quantidade de pelo menos dois aminoácidos, pelo menos duas acilcarnitinas e, pelo menos, duas aminas biogênicas, assim como, a um kit, adaptado para a realização do método. Ao empregar os específicos biomarcadores e o método de acordo com a presente invenção, se torna possível, de um modo mais adequado e confiável, avaliar doenças nos rins.

Description

TRANSAR SACAS as ass a.

Y 1/67 | «NOVOS BIOMARCADORES PARA AVALIAÇÃO DE DOENÇAS RENAIS? Campo Técnico A presente invenção se refere a novos biomarcadores para avaliação de s doença renal, mais sensíveis às mudanças patológicas que acontecem nos rins, t " particularmente, em estágio anterior da doença ou do mal ocorrido.

Além disso, a presente invenção se refere a um método para avaliação de doenças renais em um sujeito mamífero e a um kit para realização do método.

Antecedentes da Invenção A ciência metabolômica significa um estudo científico de medição quantitativa global de compostos de baixo peso molecular, que cobre, sistematicamente, os metabólitos fundamentais, que representam toda a faixa de percursos do metabolismo intermediário.

Em uma abordagem de sistemas de biologia, a metabolômica proporciona uma leitura funcional das mudanças determinadas pelo blueprint genético, regulação, abundância e modificação de proteína e influência ambiental.

A capacidade de analisar grandes sistemas de metabólitos extrai a informação biológica que reflete os reais pontos finais funcionais de eventos biológicos abertos, enquanto outras tecnologias genômicas funcionais, como, por exemplo, as tecnologias transcriptômicas e proteômicas, embora — altamente valiosas, indicam simplesmente a causa potencial para a resposta fenotípica.

Portanto, essas tecnologias não podem necessariamente prever os efeitos de drogas ou fármacos, a resposta toxicológica ou estados doentios em nível de fenótipos, a menos que seja adicionada uma validação funcional.

A ciência metabolômica liga esse espaço de informação mediante ilustração, em particular, de tal informação funcional, uma vez que as diferenças de metabólito em fluidos e tecidos biológicos proporcionam a mais próxima ligação às diversas respostas fenotípicas.

É desnecessário dizer que essas mudanças no fenótipo bioquímico são de interesse direto para a indústria farmacêutica, de biotecnologia e de saúde, uma vez que uma apropriada tecnologia permite a prospecção e integração dessa — informação com custo rentável.

Em geral, o fenótipo não é necessariamente previsto pelo genótipo.

O espaçamento entre genótipo e fenótipo é abrangido por diversas reações químicas, cada qual com dependências individuais a diversas influências, incluindo os fármacos,

NR w 2/67 os metabólitos são as moléculas quantificáveis com a ligação mais próxima ao fenótipo.

Diversos estados fenotípicos e genotípicos, tais como, uma resposta tóxica a um fármaco ou prevalência de doença, são previstos por diferenças nas concentrações de metabólitos

— funcionalmente relevantes dentro dos fluidos e tecidos biológicos. " A doença renal crônica (CKD) é uma perda progressiva da função renal nos túbulos e glomérulos, normalmente, irreversível.

A CKD é um problema de saúde pública em todo o mundo, cujas complicações, levam, por exemplo, à ocorrência de deficiência renal, doença cardiovascular e morte prematura.

A CKD pode surgir por diferentes razões, mas, uma principal razão é como uma complicação da diabetes melitus tipo 2, chamada de nefropatia diabética (DN). Na Europa existem cerca de 22,3 milhões de pessoas sofrendo de diabetes, e 94,9% destas sofrem da diabetes tipo 2, a causa principal de doença renal em estágio final (ESRD) na maioria dos países industrializados na Europa (Ha H. et al., 2008). Um terço dos pacientes com ESRD são diabéticos (Wolf Ge Ritz E. 2003) e dados recentes mostram um aumento epidemiológico de ESRD nos pacientes com diabetes tipo 2, mais provavelmente, devido a melhores tratamentos de doença de hipertensão e doença coronárias do coração, resultando numa mais longa sobrevivência de pacientes, suficiente para o desenvolvimento de nefropatia e ESRD (Sampanis Ch., 2008). Nos Estados Unidos, o custo anual do tratamento de ESRD é — esperado como mais que o dobro, de 1995 a 2010, de 11,8 a 28,3 bilhões de dólares.

Os fatores econômicos não foram ainda intensivamente estudados na Europa (Massi- Benedetti M. e CODE-2 Advisory Board, 2002), mas, no custo da diabetes tipo 2 (CODE-2), o estudo do impacto de complicações diabéticas com relação ao custo do tratamento de diabetes foi avaliado.

O estudo mostrou que um paciente sem — complicações teve custos médicos anuais de aproximadamente EUR 1505, e comparado a um paciente com complicações microvasculares que teve despesas médicas anuais de EUR 2563, representa um aumento de 70% (Williams R. et al., 2002). O jornal médico independente líder mundial concluiu recentemente um estudo de longo prazo, incluindo quase meio milhão de adultos, que demonstrou que quase todas as pessoas foram — inconscientes de suas doenças até os últimos estágios da CKD.

Uma vez que a CKD é imaginada de ser tratada e prevenida nos primeiros estágios (Wen C.P. et al., 2008), uma detecção logo no início, poderia amenizar os pacientes de diabetes tipo 2 das

RARAS AE: MRS SEEN AC sc ano NEN 3/67 ! TF complicações é reduzir os custos de saúde pública para-ambos-os-sistei ú pública e dos pacientes particulares. Os rins apresentam diversas funções para manter um adequado funcionamento do corpo, por exemplo, filtrando os produtos residuais e toxinas, mantendo a homeostase e produzindo hormônios. Para manter essa adequada função ? renal, a velocidade com a qual o sangue está sendo filtrado pela membrana glomerular . nos rins deve ser regulada. Uma alta velocidade de filtração glomerular (GFR) é necessária para manter níveis extracelulares estáveis e ótimos de água e solutos (Boron W.F,, e Boulpaep E.L., 2003). A GFR é calculada a partir da liberação da creatinina do soro, da idade, etnia e sexo, sendo usada para dividir a CKD em cinco estágios, onde pelo menos um deles é a doença renal de estágio final (ESRD), pelo que os procedimentos de diálise e transplante são requeridos para a sobrevivência. É bem conhecido que quanto mais cedo a disfunção renal é diagnosticada e tratada, maior será a probabilidade de preservação dos néfrons restantes e, assim, se retarda a progressão da

15. doença. Os marcadores convencionais para avaliação e diagnóstico de doença renal incluem a GFR, creatinina e albumina. A velocidade de filtração glomerular (GFR), após aumento em estágio bastante inicial, é reduzida antes de quaisquer sintomas mostrados. As desvantagens com a medição da GFR incluem o alto custo e —incompatibilidade com o monitoramento da rotina laboratorial. A creatininina do soro, conforme acima mencionado, é o marcador mais comumente usado para calcular a GFR, mas, a cistatina C foi proposta como um marcador mais sensível que pode detectar até mesmo uma branda redução da GFR (Herget-Rosenthal S. et al. 2007). Uma desvantagem é que nenhum método de referência ou material de calibração uniforme —existeparaacistatina C, e adicionais limitações incluem o efeito da disfunção da tiróide, de altas doses de glicocorticóide e, potencialmente, a presença de doenças cardiovasculares em níveis de cistatina C. Devido às limitações que existem nesses marcadores únicos, não se sugere confiar inteiramente nas estimativas da GFR para fazer precisas decisões clínicas. Diferente da doença renal, a idade é o segundo maior fator — que influencia a GFR. Portanto, uma leve diminuição da GFR, nem sempre se deve a j danos causados aos rins, mas, sim, à idade. Também, nem sempre uma redução da GFR é devido a uma doença renal crônica. Assim, a medição da GFR é também considerada ú x * 4/67 — — inconveniente e, desse modo, a função renal é normalmente estimada através da ——— concentração da creatinina do soro.

A creatinina do soro tem sido usada há bastante tempo para detectar doença prejudicial aos rins e, também, para calcular a GFR (Star R. et al., 2002). À creatinina é um produto da quebra do fosfato de creatinina do metabolismo muscular ” (Barr D.B. et al., 2005), e a quantidade da mesma formada a cada dia depende da massa muscular, mas, as concentrações de plasma são bastante constantes dentro do indivíduo. j A concentração de creatinina do soro é afetada por alguns fatores, como, idade, sexo, raça e tamanho do copo e, portanto, a medição da liberação da creatinina é normalmente implementada.

A liberação da creatinina do corpo é através da filtração glomerular nos rins, mas, a creatinina é também ativamente secretada do corpo pelos túbulos.

Essa velocidade depende de fatores genéticos e biológicos, tais como, sexo e idade, e gera uma superestimativa de 15-20% da GFR.

Portanto, a creatinina é considerada um marcador insensível, especialmente, parra pessoas de pouca idade e idosos.

Também, outra deficiência da creatinina é que ela somente detecta danos causados aos rins nos últimos estágios.

A albumina é a mais abundante proteína do plasma (Basi S., et al., 2008) e os danos estruturais aos rins podem se refletidos pela elevada exceção de albumina na urina, chamada de micro-albuminúria, 30-300 mg/24 horas.

A micro-albuminúria se — desenvolve após alguns anos do início da diabetes, e depois de 15-20 anos, progride para macro-albuminúria, uma concentração de albumina na urina superior a 300mg/24 horas.

A presença de albuminúria é uma indicação de nefropatia diabética, sendo normalmente medida com varetas de teste.

Existem algumas deficiências no uso da albumina como marcador de doenças no rim.

Em primeiro lugar, até poucos anos atrás, se acreditava que —aalbumina urinária não-reabsorvida pelas células tubulares mais próximas era excretada pura, mas, a albumina, é realmente excretada como uma mistura de albumina pura e peptídeos derivados de albumina, que não são detectados pelos testes feitos com varetas, e ainda outras espécies de albumina pura que também não são detectadas.

Isso proporciona espaço para falsos resultados de testes negativos (Comper W.D. e Osicka TM, 2005). Em segundo lugar, a albuminúria é uma evidência de nefropatia já existente, portanto, pode se considerar que a albumina não é um biomarcador de prognóstico satisfatório.

Se a nefropatia diabética foi detectada antes do surgimento da micro-albuminúria, a terapia deve ter a possibilidade de impedir ou reverter a progressão oO 5/67 — — daCKD.A medição da albuminúrianão pode identificar todos os pacientes com doença“ renal.

Dois isômeros de metilarginina, dimetilarginina simétrico (SDMA) e dimetilarginina assimétrico (ADMA) foram intensivamente estudados no contexto de — doença renal (Revisão de Fleck C. et al., 2001). Esses isômeros são formados por - resíduos de arginina, sendo modificados de modo pós-translacional pela proteína arginina metiltransferases (PRMTs). Enquanto o SDMA é fisiologicamente bastante i inerte, pelo menos, normalmente, não metabolizado no corpo, o ADMA é de importância biológica, pelo fato de seu potencial como inibidor endógeno de óxido nítrico sintase (SOS), o que significa que elevadas concentrações de ADMA provocam reduzida síntese de óxido nítrico (NO) e, conseqiientemente, leva a uma prejudicada função endotelial.

O acúmulo de ADMA, já há algumas décadas, tem sido acreditado como fator de contribuição para hipertensão, defesa imune e características envolvidas na CKD, e estudos em animais mostraram que a inibição crônica experimentalmente induzida (NOS) provoca hipertensão sistêmica e glomerular, isquemia glomerular, glomerulosclerose, distúrbio túbulo-intersticial, e proteinúria (Zatz R. e Baylis C., 1998). O SDMA também foi observado com significante aumento nos pacientes com CKD, mais ainda que o ADMA.

Também, as acilcarnitinas tem sido correlacionadas com a CKD (Fougue D.etal. 2006). Um aumento de acilcarnitinas livres foi observado no soro de pacientes de CKD, devido à diminuída função excretora do rim prejudicado.

Além disso, o esforço oxidante tem sido correlacionado à progressão de doenças nos rins há muitos anos (Loughrey C.M. et al., 1994, Ha H. et al., 1995). Diversos estudos indicam que o aumento do esforço oxidante devido à hiperglicemia é a — origem de complicações de diabetes micro e macrovasculares (Sakane N. et al., 2008). O esforço oxidante se origina de uma abundância de glicose e ácidos graxos, e quando esses substratos são supridos ao mitocôndria para metabolizar, os elétrons da cadeia de transporte de elétrons podem escapar.

Sulfóxido de metionina é um dos mais diretos indicadores de oxidação por meio de espécies de oxigênio reativo (R.O.S., Mashima R. etal, 2003), mas, não foi ainda implementado como biomarcador para doença renal.

Além disso, foi estudado o papel do ciclo do ácido cítrico na mediação da deficiência renal, onde concentrações de citrato, fumarato, oxaloacetato e malato foram significativamente aumentadas nos pacientes com CKD.

x ? 6/67 l A Nos-pacientes-com CKD,-as-alterações metabólicas renais parecem influenciar as alterações de todo o corpo e o metabolismo aminoácido renal.

Sob condições normais, somente uma limitada quantidade de aminoácidos é excretada com a urina.

Uma diminuição da conversão de fenilalanina em tirosina foi observada, o que levaaum acúmulo de fenilalanina nesses pacientes.

Além disso, os rins prejudicados E afetam a produção de arginina, o que foi demonstrado pela diminuição da síntese de arginina renal, tanto nos estudos clínicos, quanto nos estudos de animais.

Também, a ' reduzida absorção renal de citrulina e liberação de taurina, ornitina, alanina, tirosina e lisina foi observada como presente nos pacientes com CKD avançada.

Além disso, a conversão de citrulina em arginina parece como sendo reduzida.

Além disso, foi sugerido que o metabolismo do triptofano tem importante papel na patogênese da CKD.

A enzima limitadora de velocidade nesse percurso no rim é a indolamina-2,3-dioxigenase (IDO), que converte triptofano em N-formil-cinurenina, que, por sua vez, é catabolizada para cinurenina, e posteriormente para —hidroxicinurenina: Um aumento de atividade da IDO foi observado nos estudos anteriores, com explicação sobre a depleção do triptofano.

Os marcadores inflamatórios, tais como, proteína reativa C, Interleucina 6, Interleucina 18, e Fator de Necrose de Tumor (TNF-o.) foram observados como sendo fatores de aumento e diminuição no soro de pacientes com diabetes e DN.

Isso ocorre em um estágio bastante inicial da doença, e está correlacionado com o grau de albuminúria.

Os biomarcadores conhecidos para diagnóstico de CKD ou DN incluem, por exemplo, diversos marcadores de polipeptídeos (documentos de patentes US 2006/286602 Al, CA 2473814 Al, EP 1972940 Al, US 2009/081713 A1) que apresentam diferente massa molecular e tempos de migração, por exemplo, o polipeptídeo do gene la de deficiência renal crônica (CRFG-la) (documentos de patentes JP 11069985 A, JP 11069984 A), assim como, marcadores de polinucleotídeos (documentos de patentes JP 2003235573 A, e JP 2004187620 A). A cistatina C acima mencionada é uma dentre as proteínas marcadoras usadas para diagnóstico de doença renal (documento de patente JP 11064333 A), juntamente com a proteína de ligação holo- e apo-retinol (RBP), e proteína de Tamm- Horsfall (THP, (documento de patente DE 10327773 Al); calbindina D-28k (uma proteína de ligação de cálcio, membro da grande família EF-mão); molécula 1 de danos

% v 7/67 ———— Fc eausados -ao rim (Kim-1, uma proteína -de membrana tipo 1, contendo um domínio — ——— extracelular de imunoglobulina de seis cisteínas); proteína correlacionada à globulina Alfa-2u (Alfa-2u), também conhecida como lipocalina 2 (LCN2) ou lipocalina associada à neutrofil gelatinase (NGAL) em humanos (armazenada em grânulos de neutrófilos); s — Osteopontina (OPN), também conhecida como fosfoproteína secretada 1 (SPP1, uma 7 fosfoproteína secretada, altamente acídica e glicosilada, contendo um motivo de aderência celular de ácido arginina-glicina-aspártico (RGD)); Fator de Crescimento ] Endotelial Vascular (VEGF, conhecido para promover a angiogênese, aumentar a permeabilidade vascular, e que serve como um quimiotático para monócitos, tendo — papel atuante na diabetes, cicatrização de feridas, respostas inflamatórias e remodelagem de tecidos (documento de patente WO 2008/116867 AI); precursor de N- acetilmuramoil-L-alanina amidase; adiponectina; precursor de proteína AMBP (alfa-1- microglobulina); precursor da cadeia de alfa-proteína de ligação C4b; precursor de ceruloplasmina; precursor de complemento C3; precursor de complemento de componente C9; precursor de coplemento de fator D; glicoproteína alfa-1B; precursor I de beta-2-glicoproteína; precursor II de cofator de heparina; proteína da região da cadeia C; precursor de alfa-2-glicoproteína rico em leucina; precursor do fator derivado de pigmento do epitélio; precursor da proteína de ligação plasma retinol; e subunidade 10 do fator 3 de iniciação de translação (documento de patente EP 1905846 A2).

Os antígenos, as citotoxinas e inibidores de crescimento celular podem ser úteis como biomarcadores (documento de patente WO 2008/101231 A2). O fator de crescimento de fibroblasto 23 (FGF-23) e a adiponectina foram encontrados como sendo marcadores bastante previsíveis para a progressão de doença crônica dos rins, de modo independente e em combinação (documento de patente WO 2008/089936 Al). Outro — método usado para diagnóstico e monitoramento de doença renal ou uma predisposição da mesma consiste na detecção de supressor de tumor de von Hippel-Lindau (pVHL), receptor 4 de quimocina CXC (CXCR4), integrina 3-1, polipeptídeo do Fator de Crescimento alfa derivado de Plaqueta (PDGF-A), fator alfa-1 induzível de Hipoxia (HIFlo), e/ou fator de crescimento beta de Transformação (TGFB) em uma amostra do sujeito (documento de patente US 2008/0038269 Al). Através da medição de lactoferrina, mieloperoxidase, e antígeno carcinoembriônico (CEA) (documento de patente JP 9072906 A) e fibronectina (documento de patente JP 9274036 A), uma doença renal pode ser também diagnosticada.

' v 8/67 O k descri d ível do f 1 W jd conectivo (CTGF) em uma amostra, para decidir a presença e progresso da fibrose renal e associados distúrbios renais, em particular, complicações associadas com diabetes, hiperglicemia e hipertensão (documento de patente US 2004/0224360 A1). No campo dos genômicos, existem também diversos biomarcadores 7 associados a doenças renais.

A presente invenção inclui a identificação de genes expressos somente nas células de interesse clínico ou científico, tais como, os podócitos i ou células mais próximas do túbulo (documento de patente CN 1863928 A). Os marcadores genéticos de antígeno de leucócito humano (HLA), por exemplo, HLA-A11, HLA-DR9 e HLA-DQA1*0302, são todos genes de predisposição para diabetes e nefropatia (documento de patente CN 101294215A). Uma desintegrina e metaloproteinase com tromobospondina tipo 1, motivo 4, e agrecanase-1 (ADAMTS4), foram encontradas como sendo de utilidade como biomarcador do sangue para a CKD (documento de patente WO 2009/002451 A2), assim como, os genes Calbindina-D28k, 15º KIM-1, OPN, EGF, Clusterina, VEGF, OAT-K1, Aldolase A, Aldolase B, Podocina, Alfa-2u, C4 (documento de patente EP 1925677 A2) e ceramida glicosiltransferase (CGT) (documento de patente WO 03057874 Al). Os marcadores de RNA são também usados como marcadores de doença renal (documento de patente EP 2058402 (Al). Assim, por exemplo, um marcador de RNA derim, é selecionado dentre uma proteína regulada de andrógeno específica de rim (KAP), expressa nas células epiteliais dos túbulos renais convolutos mais próximos, uma molécula 1 prejudicial ao rim (KIM-1), uma proteína de membrana expressa nas células epiteliais mais próximas do túbulo, expressão de fator de crescimento epidermal de ligação à heparina (HB-EGF), induzido no rim após um dano isquêmico e seguinte tratamento com um nefrotoxicante, um fator de crescimento 1 de fibroblasto (FGF-1), um fator de crescimento de queratinócito (FGF-7) e o receptor de FGF-7, FGFR2 IIIb induzido no rim após tratamento com um nefrotoxicante, as proteínas de canal de água, aquaporina 1, 2 e 3, que são altamente expressas no rim, a glicoproteína de Tamm- Horsfall, expressa nas células epiteliais do rim e que se localizam nos ramos espessos — ascendentes das alças de Henle e nos túbulos convolutos mais distantes do rim, e finalmente, a expressão do gene de resposta de crescimento precoce (Egr-1), o proto- oncogene (c-fos) e o gene de resposta de esforço (hsp 70), e em que o dito marcador é ativado após dano isquêmico renal.

' t+ 9/67 renal compreendem a medição de atividade de uma protease na urina, através do uso de dois ou mais substratos e análise dos padrões de atividade da protease contra os substratos (documento de patente WO 2008/001840 Al) ou através da medição de ferro — catalítico em humanos (documento de patente US 2007/238760 A1). 7 Mesmo que existam diversos biomarcadores sugeridos para avaliação de doença renal, os únicos descritos e, especificamente, os únicos de uso clínico atual, não i são suficientemente sensíveis, sendo somente detectados em um estado adiantado da doença. Assim, existe ainda uma acentuada necessidade médica para marcadores mais sensíveis para mudanças patológicas no rim, particularmente, em um estágio inicial da doença ou distúrbio.

Embora os acima mencionados marcadores, tais como, albumina e creatinina, tenham sido usados para descoberta de pacientes diabéticos em risco de nefropatia, é da maior importância a descoberta de novos e mais sensíveis 15º biomarcadores metabólicos, que tenham a capacidade de prever ou detectar a nefropatia diabética em um estágio precoce, possibilitando intervir com terapia, para impedir ou, pelo menos, retardar a progressão do dano renal que no fim provoca a doença renal em estágio final (ESRD) e de complicações correlacionadas ao controle.

Em vista dos problemas acima mencionados existentes no estado da técnica, o objeto fundamental da presente invenção é a provisão de novos biomarcadores para avaliação de doenças renais, cujos marcadores são mais sensíveis para mudanças patológicas no rim, particularmente, no estágio inicial da doença ou distúrbio. De modo ótimo, o marcador deve ser facilmente detectável em uma amostra biológica, tal como, no sangue e/ou na urina, seu nível deve ser consistentemente correlacionado ao grau do — dano renal e seu nível de ser modificado. Além disso, constitui um objeto da presente invenção, proporcionar um método de avaliação de doenças renais em uma amostra biológica.

A fim de alcançar os objetivos destacados na presente invenção, os presentes inventores basearam suas investigações na ciência metabolômica, pelo fato de —seter uma ampla percepção das mudanças bioquímicas que ocorrem no rim durante o curso da doença e oferecer diversos novos e potencialmente melhores biomarcadores. De fato, o rim é um órgão, particularmente, metabolicamente ativo, onde os metabólitos estão sendo excretados ou absorvidos, dependendo da sua função no corpo. Portanto,

EAEARESSSSSA NARA ASAE ERAS. N 1 10/67 metabólicos para doença renal, que pudessem também fornecer mais informações sobre o funcionamento dos rins e das reações bioquímicas que ali ocorrem. Os presentes inventores descobriram que um esboço mais global de todos os caminhos e mecanismos —envolvidos6é fornecido quando se utiliza um painel de metabólitos que são alterados com " a progressão da doença renal, ao invés de utilizar somente marcadores individuais, conforme descrito no estado da técnica. Resumo da Invenção Portanto, a presente invenção, conforme definido nas reivindicações anexas, proporciona novos biomarcadores (isto é, um novo conjunto de biomarcadores) adequados para avaliação de doenças renais, que são mais sensíveis às mudanças patológicas no rim, particularmente, no estágio inicial da doença ou distúrbio. Além disso, a presente invenção também proporciona um método para avaliação de doenças renais em um sujeito mamífero, assim como, um kit, adaptado para realização do método.

Breve Descrição dos Desenhos No anexo do presente relatório, são apresentadas e referidas as figuras 1- 14, Estas demonstram exemplos, de acordo com a invenção, do aumento ou da diminuição de um biomarcador metabólico na progressão de uma doença renal.

A figura 1 está correlacionada à dimetilarginina simétrica (SDMA) nos estágios 3-5 da CKD, em pacientes diabéticos e não-diabéticos, e mostra que os pacientes do estágio 5 apresentaram um aumento altamente significativo (p<<0,01) da — proporção, comparado aos pacientes do estágio 3 e estágio 4, o que sugere que a SDMA é um satisfatório biomarcador da progressão da CKD.

A figura 2 se refere à proporção de SDMA nos estágios 3-5 da CKD, e mostra que os pacientes do estágio 5 apresentaram um aumento acentuadamente significativo (p<<0,01) da proporção, comparado com os pacientes dos estágios 3 e 4.

A figura 3 está correlacionada com um gráfico tipo caixa da proporção de SDMA/arginina nos estágios 3-5 da CKD, em pacientes diabéticos e não-diabéticos, e mostra que os pacientes do estágio 5 apresentaram um aumento altamente significativo (p<<0,01) da proporção, comparado aos pacientes do estágio 3 e estágio 4, o que sugere

REAR ESA ADLER ANNA AAA R 3 11/67 ——— — que também uma proporção de SDMA/arginina-é-um-satisfatório-biomarcador da progressão da CKD. A proporção é indicativa de que a SDMA/Arg é um satisfatório marcador de prognóstico e reflete um aumento de atividade da proteína arginina N- metiltransferase II. A figura 4 está correlacionada com um gráfico tipo caixa da proporção de á SDMA/arginina nos estágios 3-5 da CKD, e mostra que os pacientes do estágio 5 apresentaram um aumento altamente significativo (p<<0,01) da proporção, comparado É aos pacientes do estágio 3 e estágio 4. A SDMA é um satisfatório marcador de prognóstico e reflete um aumento de atividade da proteína arginina N-metiltransferase II.

A figura 5 está correlacionada com um gráfico tipo caixa de acilcarnitina e glutarilcarnitina nos estágios 3-5 da CKD, em pacientes diabéticos e não-diabéticos, e mostra que a glutarilcarnitina apresenta elevados níveis nos estágios finais da CKD.

A figura 6 mostra um gráfico tipo caixa de glutarilcarnitina nos estágios 3-5 da CKD.

A figura 7 está correlacionada com gráficos tipo caixa, da proporção citrulina/arginina nos estágios 3-5 da CKD, em pacientes diabéticos e não-diabéticos, e mostra que os pacientes do estágio 5 apresentaram um aumento altamente significativo (p<<0,01) da proporção, comparado aos pacientes do estágio 3, e a proporção é indicativa de uma atividade de enzima alterada no ciclo da uréia.

A figura 8 está correlacionada com gráficos tipo caixa, da proporção citrulina/arginina nos estágios 3-5 da CKD.

A figura 9 está correlacionada com gráficos tipo caixa, da proporção ornitina/arginina nos estágios 3-5 da CKD, em pacientes diabéticos e não-diabéticos, e mostra que os pacientes do estágio 5 apresentaram um aumento altamente significativo —(p<<0,01) da proporção, comparado aos pacientes do estágio 3, somente no caso dos pacientes não-diabéticos, o que indica que esse biomarcador pode ser importante para um diagnóstico diferencial entre diferentes tipos de doenças renais.

A figura 10 está correlacionada com gráficos tipo caixa, da proporção sulfóxido de metionina/metionina nos estágios 3-5 da CKD, em pacientes diabéticos e —não-diabéticos, e mostra que esse marcador de esforço oxidante é acentuadamente e significativamente aumentado (p<<0,01) nos pacientes do estágio 5, comparado com os pacientes do estágio 3.

' 12/67 TA figura 11 está correlacionada com gráficos tipo caixa, da proporção À sulfóxido de metionina (MetSO)/metionina (Met) nos estágios 3-5 da CKD, e mostra que os pacientes do estágio 5 apresentaram um aumento altamente significativo (p<<0,01) da proporção, comparado com os pacientes do estágio 3, o que sugere que —uma proporção MetSO/Met é um satisfatório biomarcador da progressão da CKD. ' A figura 12 está correlacionada com gráficos tipo caixa, de fumarato, nos . estágios 3-5 da CKD, e mostra que uma vez o fumarato não está presente nos estágios iniciais, o fumarato funciona como um marcador qualitativo. A figura 13 está correlacionada com gráficos tipo caixa, de alfa-ceto- —glutarato, nos estágios 3-5 da CKD, em pacientes diabéticos e não-diabéticos, e mostra que os pacientes diabéticos do estágio 5 apresentaram um aumento altamente significativo (p<<0,01) da proporção, comparado aos pacientes diabéticos do estágio 3. A figura 14 está correlacionada com gráficos tipo caixa, de alfa-ceto- glutarato, nos estágios 3-5 da CKD.

Descrição de Modalidades Preferidas Ao utilizar os específicos (conjunto) biomarcadores e o método de acordo com a presente invenção, se torna possível, de um modo mais adequado e confiável, a avaliação de uma doença renal. O termo “avaliação”, no contexto da presente invenção, significa o diagnóstico do início e monitoramento da progressão da doença, em particular, a detecção e acompanhamento da doença nos diferentes estágios. A presente invenção torna possível a previsão e o diagnóstico de uma doença renal de uma maneira aperfeiçoada e em um estágio inicial da doença, além de permitir uma detecção mais sensível das mudanças patológicas que ocorrem no rim. De fato, os biomarcadores de acordo com a invenção são facilmente detectáveis nas amostras biológicas, especificamente, no sangue e/ou na urina, seu nível sendo consistentemente correlacionado ao grau da doença/dano renal causado e suas mudanças de nível. Além disso, a avaliação deve também incluir o fato de que esses marcadores são adequados para avaliar a nefrotoxicidade, tanto nos modelos animais, como em experimentos clínicos da fase I. Em outras palavras, eles são também adequados para avaliar a nefrotoxicidade pré-clínica e clínica, isto é, também em um estágio bastante prematuro do desenvolvimento dos produtos farmacêuticos, notadamente, em modelos de animais ou nos experimentos clínicos da fase 1.

' , 13/67 E & pi : du & tevid, possibilidade de se distinguir dois ou mais estados biológicos entre si, funcionando como um indicador de um processo biológico normal, um processo patogênico ou como uma reação a uma intervenção farmacêutica. Um metabólito é um composto de baixo peso molecular (<1IkDa), menor que o da maioria das proteínas, DNA e outras Í macromoléculas. Pequenas mudanças na atividade das proteínas resultam em grandes mudanças nas reações bioquímicas e seus metabólitos (igual ao biomarcador metabólico, considerando o metabolismo do corpo), cujas concentrações, fluxos e mecanismos de transporte são sensíveis às doenças e intervenções de fármacos. Isso possibilita obter um perfil individual das substâncias fisiológicas e patofisiológicas, refletindo os fatores genéticos e ambientais, como, nutrição, atividade física, flora microbiana e medicamentos. Assim, um biomarcador metabólico proporciona informação mais completa do que, por exemplo, uma proteína ou hormônio que sejam biomarcadores, mas não biomarcadores metabólicos.

Em vista do exposto, o termo biomarcador metabólico, conforme aqui usado, é definido como sendo um composto adequado como indicador do estado de uma doença renal, especificamente, da doença renal crônica (CKD), sendo um metabólito ou um composto metabólico que ocorre durante processos metabólicos no corpo de um mamífero. O termo biomarcador metabólico é também idealizado de compreender uma — proporção de substrato/produto correlacionada a uma reação enzimática.

O biomarcador metabólico (conjunto) medido de acordo com a presente invenção compreende, obrigatoriamente, as seguintes classes de metabólitos (isto é, analitos — amostra que está sendo analisada): pelo menos, dois aminoácidos, pelo menos, duas acilcarnitinas e, pelo menos, duas aminas biogênicas. As definições dessas classes —são conhecidas dos especialistas versados na técnica, entretanto, elementos preferidos dessas classes são resumidos nas Tabelas 1-3 apresentadas a seguir. Além disso, as aminas biogênicas são entendidas como um grupo de compostos biologicamente ativos de ocorrência natural, derivados por descarboxilação enzimática de aminoácidos naturais. Uma substância biogênica é uma substância provida por processos da vida e as aminas biogênicas contem um grupo amino. À maioria dessas aminas atua como neurotransmissores, mas, também, existem algumas ativas na regulação, por exemplo, da pressão sanguínea e temperatura do corpo.

Rana A GEN RNA ANDA RANA NANA NASA: : * 14/67 de biomarcadores compreendendo três classes de metabólitos permite a previsão e diagnóstico de doença renal, de uma maneira aperfeiçoada, e em qualquer estágio prematuro da doença. Especificamente, permite uma detecção mais sensível das —mudanças patológicas que ocorrem no rim. Se uma classe de metabólitos desse grupo for e omitida ou se o número dos metabólitos for reduzido, a avaliação da doença renal se torna menos sensível e menos confiável. Isso, particularmente, se aplica aos estágios Í iniciais da doença, em que, de nenhum modo, se deve confiavelmente realizar a detecção usando métodos e biomarcadores conhecidos. De fato, a medição, ao mesmo tempo, de pelo menos dois aminoácidos, pelo menos duas acilcarnitinas e pelo menos duas aminas biogênicas, permite um diagnóstico mais confiável da doença renal, especificamente da CKD e DN, já nos estágios 1-3, como, também, nos estágios 4 e 5. Esse fato nunca foi descrito nem se tornado óbvio, de acordo com as citações do estado da técnica.

Preferivelmente, o conjunto de biomarcadores compreende ainda uma proporção de produto/substrato correlacionada a uma reação enzimática, mais preferivelmente, a proporção SDMA/arginina, a proporção citrulina/arginina, a proporção ornitina/arginina, e/ou a proporção de sulfóxido de metionina/metionina (conforme figuras anexas). A proporção SDMA/arginina está correlacionada à proteína de enzima arginina N-metiltransferase (PRMT), a proporção de citrulina/arginina está —correlacionada a óxido nítrico sintase (NOS), a proporção ornitina/arginina está correlacionada à arginase e a proporção de sulfóxido de metionina/metionina está correlacionada à oxidação por espécies de oxigênio reativo (ROS). Além disso, ao medir essas proporções, o desempenho diagnóstico do conjunto biomarcador e do método de acordo com a invenção pode ser ainda mais aperfeiçoado.

Mais preferivelmente, o conjunto biomarcador de acordo com a invenção compreende ainda um ou mais metabólitos selecionados do grupo de poliaminas, fosfatidilcolinas, — monossacarídeos e oligossacarideos redutores (açúcares), esfingomielinas, eicosanóides, ácidos biliares e intermediários de metabolismo energético. Exemplos preferidos dessas classes são fornecidos nas Tabelas 4-9 — apresentadas a seguir. Novamente, mediante a medição adicional dos metabólitos dessas classes, o desempenho diagnóstico do conjunto biomarcador e do método de acordo com a invenção pode ser ainda mais aperfeiçoado.

i x 15/67 são selecionados de Cit, Phe, Asn, Trp, His, Orn, Tyr, Met, Ala, Arg, Thr, Lys, Gln, Ser, Val, Glu, e Pro, as acilcarnitinas são selecionadas de CO, C5-DC(C6-OH), C5:1-DC, C8, C9, C10, C10:1, C14:1, e CI8:1, as aminas biogênicas são selecionadas de MetSO, Ss — creatinina, SDMA, ADMA, DMA total, e serotonina, e as proporções são selecionadas de proporção de SDMA/arginina, proporção de citrulina/arginina, proporção de ornitina/arginina, e/ou proporção de sulfóxido de metionina/metionina. í Conforme mencionado acima, a doença a ser avaliada é uma doença renal. Preferivelmente, é a doença renal crônica (CKD), mais preferivelmente, é a nefropatia diabética (DN).

A amostra biológica é obtida de um mamífero, preferivelmente, de um camundongo, rato, porquinho da Índia, cachorro, mini-porco ou um humano. À amostra biológica, preferivelmente, é uma amostra de sangue ou urina, entretanto, qualquer outra amostra biológica conhecida por um especialista versado na técnica que permitas as medições de acordo com a presente invenção são também adequadas. Assim, o método de acordo com a invenção é um método in vitro. Para a medição das concentrações dos metabólitos na amostra biológica, é utilizado um método analítico quantitativo, tal como, cromatografia, espectroscopia, espectroscopia de massa, sendo este último particularmente preferido. O método de cromatografia pode compreender os tipos de GC,LC, HPLC, e UPLC; o método de espectroscopia pode compreender os tipos de UV/Vis, IR, e NMR; e os métodos de espectroscopia de massa pode compreender os tipos de ESI-QgQ, ESI-QGTOF, MALDI-QqgQ, MALDI-QqgTOF, e MALDI-TOF-TOF. É preferido o uso de espectroscopia de massa tipo FIA- e HPLC- em tandem. Esses métodos analíticos, geralmente, são conhecidos por um — especialista versado na técnica.

Parra medição das almejadas quantidades de metabólitos, é usada a ciência metabolômica para quantificar os metabólitos na amostra biológica, incluindo as classes de analitos de aminoácidos, aminas biogênicas, poliaminas, acilcarnitinas, fosfatidilcolinas, mono- e oligossacarídeos redutores, esfingomielinas, eicosanóides, ácidos biliares e intermediários de metabolismo energético. Por intermediários de metabolismo energético deverá ser entendido os açúcares fosforilados, os ácidos orgânicos di- e trivalentes, e os nucleotídeos. Entretanto, de acordo com a invenção, é necessário que entre os metabólitos medidos, pelo menos, as classes de analitos de

' y 16/67 inoácidos, acilcarnitinas inas biogêni : idas. ificação é fei usando a presença de padrões internos isotopicamente rotulados, e determinada pelos métodos conforme descrito acima.

Uma listagem de analitos, incluindo suas abreviações (códigos BC), que são adequados como metabólitos a serem medidos conforme a invenção é apresentada nas Tabelas seguintes.

Tabela 1: Aminoácidos (uM)

» : 17/67 TA ————-Tabela 2: Acilearmitina (INI) :

/ y 18/67

. , 19/67 TT Tabela3: Aminas Biogêitas (IM) A A Tabela 4: Fosfatidilcolinas (uM)

: N 20/67

' * 21/67

' , 22/67 : Tabela 5: Esfingomielinas (uM)

' , 23/67 FT Tabela 6: Prostaglandinas MM) o Tabela 7: Açúcares (uM) Di(sulfato de N-acetilexosamino-ácido urônico)-(N- Di-(ácido —urônico-N-acetilexosamina-sulfato)-ácido

' 24/67 FE pas Di-hexose-(ácidoN-acetilneuramínico) | Tri-hexose-di(N-acetilexosamina) e ácido urônico- : H3-HNAc2 and UA-HN-|hexosamina-ácido urônico-(N-acetilexose)-ácido UA-HNAc-UA urônico Tri-hexose-di(N-acetilexosamina)-(ácido N- Tetra-hexose-di(N-acetilexosamina)-(ácido N- Hexose-(N-acetilexosamina)-(ácido N-

. NJ 25/67

É N-acetilexosamina-ácido urônico-(hexosamina- N-acetilexosamina-ácido urônico-(hexosamina- (Ácido —N-glicolilneuramínico)-(N-acetilexosamina)-

a ' 26/67 [Pr ——Hcido urônico-(N-acetilexosamina)-(ácido —urônico- Ácido urônico-(N-acetilexosamina)- Ácido urônico-(N-acetilexosamina)-ácido urônico-(N-

É J Ácido urônico-(hexosamina-6-sulfato)- ácido urônico- Ácido — urônico-hexosamina-(ácido — urônico — — Ácido urônico-hexosamina-ácido urônico-(N- *) Artigo de medição correlacionado à hexose

CESSA AAA NA SRA NAAS EANES . . 27/67 : :

' : 28/67 Tabela-9: Metabólitos de Metaboli E o M Novo Código Código BC Analitos

BC alpha-KGA alpha-KGA Ácido alfa-cetoglutárico - Diidroxiacetonofosfato + 3- DHAP + 3-PGA DHAP + 3-PGA fosfogliceraldeído Glt-6-P Glt-6-P Gliconato-6-fosfato Hexosebisfosfato (por exemplo, Frutose-1,6- Fru-1,6-BP Hex-BP bisfosfato) Hexosefosfato (por exemplo, Glicose-l- Gle-1-P + Gle-6-P Hex-P fosfato + Glicose-6-fosfato + Frutose-6- + Fru-6-P fosfato) Rib-5-P + Ribul-5- No Pentosefosfato (por exemplo, Ribose-5- ent-. P fosfato + Ribulose-5-fosfato) fisdsaNaaA Pyr+ OAA Pyr + OAA Piruvato + Oxaloacetato Tetrosefosfato (por exemplo, Eritrose-4- Ery-4-P Tetr-P fosfato)

' * 29/67 TT AlémHdisso,a invenção é também dirigida a um kit adaptado para realização do presente — ———— método, onde o kit compreende um dispositivo, cujo dispositivo contém um ou mais poços e um ou mais suplementos impregnados com, pelo menos, um padrão interno.

Esse dispositivo é descrito em detalhes nos documentos de patentes WO 2007/003344 e 5º WO2007/003343, cujos conteúdos são aqui incorporados por essas referências. ' Os exemplos seguintes ajudam a elucidar a presente invenção, sem, de nenhum modo, ter a pretensão de limitar o seu escopo.

Exemplos Comparações foram feitas entre diferentes estágios de doença renal, como, também, comparação de nefropatia diabética com outras doenças renais crônicas.

Informação Geral Seis grupos, diabéticos nos estágios 3-5 da CKD (os estágios oficiais 1-3 foram todos incluídos no que é aqui chamado de estágio 3) e não-diabéticos nos estágios 3-5 da CKD, tiveram coletadas amostras de urina (57) e plasma (76), respectivamente, no Montpellier University Hospital.

Estudos de metabolômica foram usados para quantificar cerca de 320 metabólitos do plasma e 300 da urina, incluindo as classes de aminoácidos, aminas biogênicas, poliaminas, acilcamitinas, fosfatidilcolinas, monossacarídeos e oligossacarídeos redutores, esfingomielinas, eicosanóides, ácidos biliares e intermediários de metabolismo energético (conforme definido acima), na presença de padrões internos isotopicamente rotulados, e determinados por FIA e HPIC — espectrometria de massa em tandem, com múltiplo monitoramento de reação (MRM), usando um aparelho de modelo Sciex 4000 QTrap, com ionização por eletropulverização.

Além disso, 160 ácidos graxos foram quantificados no plasma por — GC-MS/MS.

Os conjuntos de dados foram analisados com análise de componentes principais não-supervisionada (PCA) e análise de discriminantes mínimos quadrados parcialmente supervisionadas (PLS-DA), usando o software MarkerView (Life Technologies). AnáliedeP/UeU A análise foi feita nos pacientes em que o plasma e urina foram disponíveis (isto é, 57; “Análise de P/U”")e também usando somente as amostras de plasma (isto é, 76; “Análise de P”), assim, mostrando que um marcador pode trabalhar

TSUNADE: . ' 30/67 Diferentes comparações foram feitas para avaliar os biomarcadores para a CKD, mas, também, para observar se uma diferença entre nefropatia diabética e outras doenças renais pode ser distinguida.

Portanto, foram feitas comparações entre estágios mais —baixose mais altosdaCKD em todos os pacientes, mas, também, separadamente, nos ' diabéticos e não-diabéticos.

FE Definição de Termos 1 — Supra-regulação e Infra-regulação À 10 Uma supra-regulação significa um aumento na concentração de um metabólito, por exemplo, um aumento na velocidade na qual essa reação bioquímica ocorre, devido, por exemplo, a uma mudança na atividade enzimática.

Para uma infra- regulação, a situação é oposta. 2— Teste-t O teste-t é um teste de hipótese estatística, sendo usado e integrado no software Marker View, e aplicado a cada variável na Tabela, determinando se a média de cada grupo é significativamente diferente de um dado desvio padrão e de um número de amostras, por exemplo, para descobrir se existe uma diferença real entre as médias de dois grupos diferentes. 3-—Valorp O valor-p é a probabilidade de se obter um resultado pelo menos tão extremo quanto o que foi realmente observado, supondo a hipótese nula (a hipótese de nenhuma mudança ou efeito) ser verdadeira.

O valor-p é sempre positivo e quanto menor for o valor, mais baixa será a probabilidade de ser uma ocorrência de mudança.

Um —valorpde 0,05 ou menos, rejeita a hipótese nula ao nível de 5%, o que significa que somente em 5% do tempo, a mudança tem uma chance de ocorrer.

Esse é o nível estabelecido nas presentes Tabelas. 4 — Mudança de Múltiplo de Log (Log-Fold Change) Uma mudança de múltiplo de log é definida como a diferença entre as — concentrações transformadas como log médio em cada condição.

Esse é um modo de descrever quanto maior ou menor é o valor em um grupo comparado a outro.

Assim, por exemplo, uma mudança de múltiplo de log de 0,3 é “equivalente” a um aumento de mudança de exp.(0,3)=1,34 vezes, comparado ao controle (grupo saudável). Além disso,

, ' 31/67 exp.(-0,3)=0,74=(1/1,34) vezes, comparado ao controle ou diminuição de mudança de 1,34 vezes para a doença. — Resultados: ' Os resultados das medições acima descritas são resumidos nas seguintes Tabelas 10-27. As Tabelas 10-18 se referem à “Análise de P/U” e as Tabelas 19-27 se - referem à “Análise de P”. Nas Tabelas os valores de “p” foram obtidos com o teste-t : padrão, implementado no software MarkerView. Um valor positivo de múltiplo de log representa uma supra-regulação do metabólito no estágio mais alto e, vice-versa. As abreviações usadas são: D — diabético; ND — não-diabético; AC — acilcarnitina; SU — açúcar; BN — amina biogênica; SM — esfingomielina; TFA — ácido graxo total; FFA — ácido graxo livre; PC — fosfatidilcolina; OA — ácido orgânico.

Análise de Plasma/Urina (“P/U” Tabela 10 — Metabólitos supra-regulados e infra-regulados, de modo significativo e altamente significativo, comparados nos estágios 4 e 3 da CKD. P/U Mud. Múlt. log Metabólito Classe Valor-p —(Est4/Est.3) CSDC(C=O0H) —AC P 5,65E05 057 ADMA BN U 1,70E-04 -0,44 CiV/Arg PROP. P 2,20E-04 0,16 Phe AA P 0,0005 0,10 Serotonina BN U 0,0009 -0,44 DMA total BN U 0,0011 -0,32 Cit AA P 00013 0,19 C4 AC U 00018 -031 PC aa C42:4 PC P 0,0029 — 0,08 C18:2 AC P 0,0042 — 0,16 SDMA BN U 00056 -027 C10 AC P 0,00855 0,19

; N 32/67 Gy AA UU 0,005 32 CA4:1-DC(C6) AC U 00110 -0,34 Cc9 AC P 00138 0,6 C5-OH(C3-DC-M) AC —U 00138 018 Met-SO BN P 0010 015 . Cc9 AC U 00140 -0,30 PC ae C32:1 PC P 00143 0,08 A C5:1-DC AC U 0017 -0,29 c2 AC P 00154 013 E Creatinina BN U 00162 02 dH SU U 00164 -0,33 Orw/Arg PROP.

P —0,0172 0,10 Ác. cetoglutárico — OA P 0024 031 His AA UU 00217 028 Asn AA P 0,0253 0,06 PC ae C32:2 PC P 00277 0,07 PC ae C44:6 PC P 0,0299 0,09 Or AA P 00306 010 Cc10 AC U 0031 -020 CI10:1 AC U 00325 -0,20 Creatinina BN P 0,0338 0,17 PC aa C30:2 PC P 0,0338 0,06 Cc5 AC U 00340 -026 Ser AA U 00342 0,19 SM (OH) C16:1 SM P 00354 007 His AA P 00362 0,05 cis-C18:1wW7 FFA P 0,0368 0,09 SM C16:0 SM P 0,0369 0,05 H5 SU U 0,0369 -0,25 SDMA BN P 00388 014 cis-C18:1w9 FFA P 0042 O SM C16:1 SM P 004! 005 C5:1 AC U 00443 016

, . 33/67 o EB LA DP DADO HA, 2

Trp AA U 0,0465 -0,21

SM (OH) C14:1 SM P 0,0492 0,07

Met AA U 0,0493 -0,29

7 Tabela 11: Metabólitos supra-regulados e infra-regulados, de modo significativo e altamente significativo, comparados nos estágios 5 e 4 da CKD. a P/U Mud.

Múlt. log E Metabólito Classe Valor-p — (Est.5/Est.4)

“Creatinina — BN —P 341605 035. SDMA BN P 8,22E-05 0,26 SDMA/Arg PROP.

P 0,0001 0,34 total DMA BN P 0,0001 0,27 CS5-DC(C6-0H) AC P 0,0004 0,30 Cit/Arg PROP.

P 0,0006 0,20 Co AC P 00006 -022 PC ae C38:3 PC P 0,0013 -0,12 Om AA U 0,0018 0,89 Pro AA U 0,0028 0,50 SM (OH) C22:2º SM P 0,0038 -0,12 PC aa C36:3 PC P 0,0040 014 Trp AA P 0,0055 -022 Cc3 AC P 00055 -022 PC aa C36:4 PC P 00076 014 Tyr AA P 0,0077 -0,19 SM C22:3 SM P 00080 -012 C9 AC P 0,008 0,24 SM C20:2 SM P 000907 018 C9:0 TFA P 0,0009 0,40 C2 AC P 0,0104 -0,16 PC aa C34:3 PC P 0,0114 -0,20 PC aa C34:4 PC U 0014 -019 SMCI8:1 SM P 0,0115 -0,14

* 34/67 Na AA PP 0 06

PCaaC38:3 “PC U 00125 01

Xle AA P 00131 0,50

Glicosona SU P 0,0136 0,35 PCaaC384 PC P 00143 -0l2 ' GUDCA BA P 00150 -068 PCaaC322 “PC U 00164 015 fá Espermina BN P 00186 178 PCaeC382 “PC P 00238 -010

É Gly AA P 00239 0,29 SM C18:0 SM P 00243 011

PCaaC38:5 PC P 00246 011 PCaeC40:4 “PC P 00251 010

Phe AA P 00259 01

UVA (1) SU U 00280 035 PCaaC40:4 PC U 0020 013 co AC U 00292 031

Tyr/Phe PROP.

U 0,0296 011 PCaaC32:3 PC P 00315 012 PCaeC384 “PC U 00322 -009 cis-CI8:3W6 — TFA P 0,0326 015 PCaaC403 PC P 00354 008

(HNACcUA)L SU —U 00362 0,8 PCacC403 “PC U 00376 -0,09

H-dH SU U 00384 0,33

Tle AA P 00400 108

Leu AA U 00402 0,62 IywoPCaCl6:1t PC —P 0,0403 014

PCaeC32:1 PC P 0044 009

PCaaC342 “PC P 0044 010

CI8:1 AC P 00436 0,92

CI10-DC AC P 0046 0,38

C5:1-DC AC P 007) 019 cis-C22:1wW9 — TFA P 0,04905 0,12

. 35/67 Tabela 12: Metabólitos supra-regulados e infra-regulados, de modo significativo e altamente significativo, comparados nos estágios 5 e 3 da CKD.

P/U Mud.

Múlt. log Metabólito Classe Valor-p — (Est.5/Est.3) - CS-DC(C-OM) —AC P 2/77E-09 088

Creatinina BN P 3,20E-08 0,51

EE Cit/Arg PROP.

P 5,24E-08 0,37 SDMA BN P 7,89E-08 0,41 é DMA total BN P 7,32E-07 0,32 Ác. cetoglutárico —— OA P 1,91E-06 0,38 Pro AA U 3,08E-06 0,85 SDMA/Arg PROP.

P 6,60E-06 0,51 C9 AC P 7,93E-06 0,50 Cit AA P 483E-05 0,28 Trp AA P 0,0002 -0,27 Dopamina BN U 0,0002 -1.06 ADMA BN U 00003 -0/73 C6:1 AC P 0,0004 1.18 CI10:1 AC U 0,0005 -0,55 Tyr/Phe PROP.

P /0,0007 015 Serotonina BN U 0,0008 -0,76 C5:1 AC U 0,0008 -0,38 Cit AA U 0,0014 0,66 Co AC P 00017 -021 C5:1-DC AC P 0004 0,37 C4 AC U 0,0026 -0,50 SM C20:2 SM P 000207 017 C5-OH (C3-DC-M) AC U 0,0027 -0,29 lysoPC a C20:3 PC P 0,0027 -0,16 SM C22:3 SM P 0,0029 014 PC aa C34:4 PC P 0,0035 -0,22 PC aa C34:3 PC P 0004 -0,17

' , 36/67 Fo Eaetato — oO AD o DOA9I AH lysoPC a C14:0 PC P 0,0062 —-0,31 PC aa C36:4 PC P 0,0066 — -0,14 DMA total BN U 0,0077 -0,36 lysoPC a C16:1 PC P 0,0079 — 0,18 " Glicosona SU U 0,0081 0,31 Orn/Arg PROP.

P 0,0082 0,13 a UA (1) SU U 0,0083 0,33 C8 AC P 0,0122 0,49 dH SU U 00143 -0,49 P SU U 0,0152 -0,39 C8:1 AC P 0,0159 0,31 Pro AA P 0,0172 0,13 PC aa C32:1 PC U 0,0176 1.60 Co AC U 0,0185 -0,47 C4:1-DC(C6) AC U 0,01% -0,51 Espermina BN U 0,0209 1.01 lysoPC a C20:4 PC P 0,0212 -0,15 PC aa C38:5 PC P 0,0212 -0,11 TDCA BA P 0,0220 0,55 PC aa C38:4 PC P 0,0231 -0,12 SM C24:0 SM U 0,0236 1.38 HNAc-H6 SU U 0,0245 0,70 PC ae C38:0 PC P 0,0248 -0,11 Met-SO BN P 0,0249 —Q15 PC aa C34:1 PC U 0,0255 1.50 PC aa C36:6 PC P 0,0261 -0,14 C5:1-DC AC U 0,0288 -0,40 SM C20:2 SM U 0,0295 1.20 SM C24:1 SM U 0,030] 1.45 lysoPC a C16:0 PC P 0,0310 — -0,09 Co AC U 00344 -0,35 GCA BA P 0,0360 0,28

' * 37/67 Val AA U 0,0371 0,35 HS-HNAc3 SU U 0,0406 0,82 lysoPC a C1I8:1 PC P 0,0419 -0,09 cis-C18:1wW7 FFA P 0,0422 0,11 il HNAc SU U 0,0422 -0,31 cis-C22:1w9 TFA P 0,0449 0,11

Tyr AA P 0047 04

. SM C22:3 SM vU 0,0493 11

Tabela 13: Metabólitos supra-regulados e infra-regulados, de modo significativo e altamente significativo, comparados em diabéticos nos estágios 4 e 3 da CKD.

P/U Mud.

Múlt. log Metabólito Classe Valor-p (D4/D3) Civarg — PROP P 00046 08

ADMA BN U 0,0048 -035 C5-DC(C6-0H) AC P 0,0079 0,49 C4 AC U 0,0084 -0,35 C4:1 AC P 0,0097 0,30 Serotonina BN U 0,0178 -0,37 cis-C17:2w6 TFA P 0,0205 —-0,23 PC aa C42:4 PC P 0,0227 0,09 Gly AA U 00254 -0,39 Cit AA P 0,0288 0,18 DMA total BN U 0,0299 -027 cis-C22:3w3 FFA P 0,0326 -0,18 cis-C22:6w3 (DHA) TFA P 0,0407 O,11 Ser AA U 0,0435 -0,20 cis-C22:5w3 TFA P 0,0499 0,10

' ' 38/67 altamente significativo, comparados em diabéticos nos estágios 5 e 4 da CKD.

P/U Mud.

Múlt log Metabólito Classe Valor-p —(DS/D4) “Creatinipa — BN P 530E06 048 À : C5-DC(C6-0H) AC P 00002 04 VA (1) SU P 00000 1,06 o C9:0 TFA P 000% O41 DMA total BN P 0,0026 0,32 Ê co AC P 00034 019 Pro AA U 0,0050 0,64 ADMA BN P 0,0053 0,13 SDMA BN P 0,0076 0,26 Espermina BN U 0,0443 1.51 Gly AA P 0,0127 0,11 Ác. fumárico OA P 00160 0/76 Pro AA P 0,0219 0,17 Cc9 AC P 0,0247 0,28 Gln AA P 00249 0,07 SDMA/Arg PROP.

P 0,0276 0,20 Asn AA P 0,0287 0,14 Co AC U 0,0439 -047 Tabela 15: Metabólitos supra-regulados e infra-regulados, de modo significativo e — altamente significativo, comparados em diabéticos nos estágios 5 e 3 da CKD.

P/U Mud.

Múlt. log Metabólito Classe Valor-p —(DS5/D3) “CS-DC(C-O0H) —AC P 424E07 09 Creatinina BN P 835E-07 0,51 Ác.cetoglutárico — OA — P —4,60E-05 0,46 SDMA BN P 00004 040 DMA total BN P 00004 027 C9 AC P 00005 0,44

; ' 39/67 FR AEDEA — BA Po 0007 AML TCA BA P 0,0008 111 C5:1 AC UU 0,0009 -0,39 ADMA BN U 0,0009 -0,76 CI10:1 AC U 0,0010 -0,63 " Cit/Arg PROP.

P 0,0016 0,29 GCA BA P 0,0020 0,61 Dá Pro AA U 0001 03 Dopamina BN U 0,0005 -1.28 Pro AA P 0,0028 0,23 Serotonina BN U 0,0040 -0,98 C5-O0H (C3-DC-M) AC UU 0,0043 -0,31 Cit AA P 0,0043 0,27 Co AC P 0,0087 -0,22 cis-C17:2w6 FFA P 0,0145 -0,13 DMA total BN U 00152 -0,49 C4 AC UU 0,0165 -0,62 Asn AA P 0,0170 0,17 Gln AA P 0,0220 0,09 dH SU U 0,0229 -0,51 C9 AC U 0,0252 -0,45 SDMA/Arg PROP.

P 0,0265 0,36 His AA P 0,0334 0,11 C5:1-DC AC P 0,0349 0,29 SDMA BN U 0,0366 -0,42 SM C20:2 SM P 0,0382 -0,12 PC aa C34:3 PC P 0,0394 -0,15 Co AC U 0,0400 -0,65 C6:0 FFA P 0,0415 -0,07 C4:1-DC(C6) AC U 0,0420 -0,61 GDCA BA P 0,0436 0,41 HNAc SU U 0,0482 -0,41 Tyr/Phe PROP.

P 0,0484 -0,11 í ' 140/67 Tabela 16: Metabólitos supra-regulados e infra-regulados, de modo significativo e altamente significativo, comparados em não-diabéticos nos estágios 4 e 3 da CKD.

P/U Mud.

Múlt. log Metabólito Classe Valor-p (ND4/ND3) P Phe = AA P 00008 GM

Orn/Arg PROP.

P 0,0017 0,18

" Met-SO BN P 0,003 0,25

. Om AA P 0,0030 0,18 Creatinina BN P 0,0033 0,35 Cs AC P 0,0036 0,24 C5-DC(C6-0H) AC P 0,0040 0,68 Asn AA P 0,0044 0,11 ADMA BN P 0,0067 0,13 Cit AA P 0,0067 018 total DMA BN U 0,00866 -0,44 Cc9 AC P 0,0008 042 SDMA BN U 00101 -038 Creatinina BN U 0,0104 -0,28 H5 SU U 0,0110 -0,56 ADMA BN U 0,0131 -0,62 SM C26:1 SM P 0,0144 0,07 Ha SU U 00151 -0,33 PC ae C44:6 PC P 0,0162 0,14 Cl4:2 AC UU 0,0180 — -0,97 CI18:1 AC P 0,0182 010 Pro AA P 0,0185 0,09 cis-C20:2w6 FFA P 0,0193 O11 C10 AC P 00200 023 Cit/Arg PROP.

P 0,0204 0,14 Serotonina BN U 0,0216 -0,60 SM C16:1 SM P 0,0243 0,08 Dopamina BN U 0,0254 -0,44

. « 41/67 AD o Io Ao 025 AA Ác. cetoglutáico — OA P 0,0256 021 DMA total BN P 0,0262 0,16 cis-C18:2w6 FFA P 0,0263 0,12 PC aa C42:0 PC P 0,0298 0,13 ' PC ae C32:2 PC P 0,0308 0,10 Glu AA P 0,0308 0,30 e. cis-C18:2w6 TFA P 0,0313 0,08 C5:1 AC U 0,0323 -0,33 í HNAc SU U 00332 -045 cis-C18:1wW7 FFA P 0,0337 0,14 SM C16:0 SM P 0,0369 0,07 PC ae C32:1 PC P 0,0376 0,09 C5-OH(C3-DC-M) AC —U 0,0383 -026 His AA P 0,0391 0,06 Gln AA P 0,0411 0,03 dH SU UU 0,0417 -0,64 PC aa C42:1 PC P 0,0424 0,12 Cc1l2 AC U 0,0430 -0,34 PC aa C30:2 PC P 0,0443 0,09 C7-DC AC P 0,0460 0,78 Cc8 AC P 00472 0/79 C9 AC U 0,0482 -0,51 PC aa C42:4 PC P 0,0489 0,08 Tabela 17: Metabólitos supra-regulados e infra-regulados, de modo significativo e altamente significativo, comparados em não-diabéticos nos estágios 5 e 4 da CKD.

P/U Mud.

Múlt. log Metabólito Classe Valor-p (NDS/ND4) CM AC U 0000 LM Cit/Arg PROP.

P 0,0006 0,31 SDMA/Arg PROP.

P 0,001] 0,45 PC ae C38:3 PC P 0,0014 -0,18 ú * 42/67 Pe AA P 00M 0H Arg AA UU 0,0030 0,43 Asn AA P 0,0033 017 SM C20:2 SM P 0,0039 -022 ClI4:1 AC U 00042 0,93 . PCaaC38:3 “PC P 00048 -0,19 Tm AA P 0,0050 -0,33 E PCaaC36:3 —PC P 00050 -017 SDMA BN P 0,0054 027 i HI SU U 0,0058 0,64 PCaaC403 “PC DP 0,0059 015 PCaaC343 “PC DP 0,0060 -023 Met AA P 0,0063 -024 Tyr AA P 0,0089 -031 cis-Cl84w3 — TFA P 0,0002 -0,92 H2-dH2 SU U 0,00907 0,41 Gh AA P 00100 -012 PCaeC44:3 —PC P 00101 -0M SM(OH)C222 SM P 00101 018 His AA P 00102 019 PCaeC403 “PC P 00112 -0M Arg AA P 00128 -019 PCaaC40:5 PC P 00130 -0,20 lysoPC a CI6:0/ PC P 0,0133 -0,17 C10-DC AC U 0016 077 Cc3 AC P 00163 -0,30 SM CI8:1 SM P 00182 -018 PCaaC385 — PC DP 00184 018 PCaaC32:3 “PC P 00189 017 Cc12 AC U 00203 0,46 Om AA U 0,02008 136 PCaaC322 — PC P 0021 -019 PCaaC384 PC P 00223 -019

1 ' 43/67

PC aa C42:5 PC P 0,0237 -0,11 PC ae C32:1 PC P 0,0246 -0,11

Glu AA U 00254 0/74 cis-Cl6:1wW13 —“TFA P 0,0255 -0,38 : UA-HNAc-S sU P 0,0259 -0,52 PC ae C40:4 PC P 0,0269 -0,14 iá Xle AA U 0,0293 081 Co AC P 0,02099 -026

Á DMA total BN P 00302 022 PC aa C40:4 PC P 0,0329 -0,3 Thr AA P 0,0332 -021 SM C22:3 SM P 0,0333 -0,13 Ala AA P 0,0338 -0,20

Val AA U 00343 0/74 PC aa C42:4 PC P 0,0353 -011 PC ae C38:2 PC P 0,0354 -0,17 PC aa C36:2 PC P 00363 -0,15 PC ae C44:6 PC P 0,0364 -0,20 PC aa C36:4 PC P 0,0365 -0,15

Glicosona SU U 0,0401 0,49 cis-C18:3w3 TFA P 0,0439 -0,20

Lys AA U 00459 058

PC aa C36:1 PC P 0,0467 -0,11

C4-O0H(C3-DC) AC U 0,0472 028

H3 SU U 0,0472 051

BRINCAR NA AAA ARARAS NASA AAA DADA ASA NR « 44/67 Tabela 18: Metabólitos supra-regulados e infra-regulados, de modo significativo e altamente significativo, comparados em não-diabéticos nos estágios 5 e 3 da CKD.

P/U Mud.

Múlt. log Metabólito Classe Valor-p — (ND5/ND3) Ch AA U 115E06 089 1 Cit/Arg PROP.

P 1.26E-05 0,44 Orn/Arg PROP.

P —2.63E-05 0,28 -. SDMA/Arg PROP.

P —436E-05 0,62 Creatinina BN P 8.73E-05 0,53 Í SDMA BN P —0,0001 0,42 C5-DC(C6-0H) AC P 00002 0,8 DMA total BN P 00002 038 C8 AC P 0,0005 1.06 lysoPCa CI4:0 PC P 0,0006 — -0,78 Pro AA U 0,0006 110 Trp AA P 0,0007 —-0,41 C9 AC P 0,0032 061 Cit AA P 0,0033 0,29 lysoPC a C1I6:0/ PC P 00037 016 HI SU U 0,0045 0,52 Lys AA U 0,0062 0,80 Tyr/Phe PROP.

P 0,0084 —-0,19 cis-C18:1w7 FFA PP 0,0086 — 0,22 cis-C18:1w9 FFA P 00088 027 lysoPC a C20:3 PC P 00097 -023 Arg AA P 00100 0,18 Ác. cetoglutáico OA — P 0,0108 0,29 Met-SO BN P 0,0109 020 PC aa C34:4 PC P 0,0131 -0,38 lysoPC a C20:4º PC P 00135 -026 Tyr AA P 00156 -0,25 MetSO/Met PROP.

P 00160 0,32 Ala AA P 00166 0,18 í ' 45/67 FAVA oo áâ VAA ADA OI AHE CI18:1 AC P 0,0176 0,13 lysoPCaCl6:1 PC P 0,0183 -0,25 SM C20:2 SM U 0,0216 212 His AA P 0,0218 -0,13 í Gn AA P 0,0230 -0,09 Thr AA P 00231 -0,19 fã Thr AA U 0,0235 0,37 Asp AA P 0,0237 1.16 ' SM C22:3 SM P 00252 019 Met AA P 0,0257 -0,16 Dopamina BN UU 0,0268 -0,83 Cl6:2 AC P 0,0281 0,32 SM C16:0 SM U 0,0294 2.56 PC aa C38:4 PC P 0,0299 -0,20 C5:1-DC AC P 00303 0,49 cis-C20:1w9 TFA P 0,0310 0,13 PC aa C38:5 PC P 0,0319 -0,16 Ala AA U 00320 028 H3 SU U 0,0336 0,41 Glicosona SU U 0,0345 0,41 SM C20:2 SM P 00356 -021 cis-C16:1w7 FFA P 0,0375 0,39 cis-C20:1w9 FFA P 0,0391 0,21 cis-C17:1w9 FFA P 00395 0,28 PC aa C36:4 PC P 0,0406 -0,19 Lactato OA P 00407 -019 lysoPCaC28:1 PC P 0,0435 -0,28 lysoPCaCI18:1 PC P 00463 -012 cis-Cl11:1w5 FFA P 0,0495 -0,68 PC ae C38:0 PC P 0,0498 -0,18 Análise de “P”

' . 46/67 — Tabela 19- Metabólitos supra-regulados e infra-regulados, de modo significativo e altamente significativo, comparados nos estágios 4 e 3 da CKD.

Mud.

Múlt. log Metabólito Classe Valorp (Est4/Est.3) “CS-DC(C6-0M) AC —15IE-0S 059 | '« Cit/Arg PROP. 0,0004 0,15 Cit AA 0,0019 0,17 Ff C18:2 AC 0,0019 — 0,16 Phe AA 0,0024 0,08 ] c1o AC 0,00% 0,20 PC aa C42:4 PC 0,0044 0,08 PC ae C32: PC 0,0049 0,08 PC ae C32:2 PC 0,0076 0,08 Met-SO BN 0,0088 0,14 PC ae C44:6 PC 0,0103 0,09 SM (OH) Cl6:1/ SM 0,0105 0,08 PC aa C30:2 PC 0,0128 — 0,07 Creatinina BN 0,0142 0,17 cis-C18:1wW7 FFA 0,0152 0,10 SDMA BN 0,0155 0,16 SM C16:0 SM 0,0158 0,05 PC ae C40:3 PC 0,0194 — 0,07 CI10:1 AC 0,0205 — 0,41 C2 AC 0,0210 011 C9 AC 0,0216 0,23 Asn AA 0,0218 — 0,06 cis-C18:1w9 FFA 0,0220 0,12 Ác. cetoglutárico OA 0,0220 — 0,28 cis-C18:1w7 TFA 0,0224 0,07 PC aa C40:1 PC 0,0225 — 0,19 SM Cl16:1 SM 0,0252 0,06 C8:1 AC 0,0254 0,23 Orn/Arg PROP. 0,0278 0,09 í % 47/67 FF ARE AE — ABBA Trp AA 0,0317 -0,08 CI4:1 AC 0,0320 0,06 SDMA/Arg PROP. 0,0325 0,19 Cc8 AC 0,0338 0,38 f PC aa C42:0 PC 0,0366 0,08

PC aa C42:1 PC 0,0381 — 0,08 e SM(OH)CI4:1 SM —0,0385 0,07

: SM C18:1 SM 0,0400 0,06 SM C26:1 SM 0,0403 0,05 C16:0 TFA 0,0405 0,06 PC ae C30:2 PC 0,0407 0,07 GDCA BA 0,0410 — 0,28 TDCA BA 0,0411 0,80 PC aa C40:2 PC 0,0422 0,06 His AA 0,0439 0,05 PC ae C34:1 PC 0,0477 0,07 PC ae C30:1 PC 0,0481 0,07 Om AA 0,0493 — 0,09

Tabela 20 — Metabólitos supra-regulados e infra-regulados, de modo significativo e altamente significativo, comparados nos estágios 5 e 4 da CKD.

Mud.

Múlt. log Metabólito Classe Valor-p (Est.5/Est.4) VAM SU 728E0 135

Creatinina BN 2,60E-08 0,39 C5-DC(C6-0H) AC 248E-07 0,38 SM (OH) C22:2º SM 7,04E-07 0,16 SDMA/Arg PROP. 1,10E-06 0,34 Glicosona SU 1,49E-06 1.16 SDMA BN 1,84E-06 0,26 Trp AA 1,45E-05 -0,25 DMA total BN 1,86E-05 0,24 ú 48/67 PC ae C38:2 PC 2,33E-05 -0,15 co AC 2,62E-05 -0,23 PC ae C38:3 PC 3,58E-05 -0,13 SM(OH)C22:1 SM — 4,31E-05 -0,15 ' Cc9 AC 0,0001 — 0,98 PC ae C42:3 PC 0,0001 — 0,14 - PC ae C38:1 PC 0,0002 —-0,15 PC ae C40:4 PC 0,0002 — 0,12 i PCaeC342 — PC —0,0002 0,14 PC ae C36:3 PC 0,0002 —-0,12 Tyr AA 0,0003 0,18 C16 AC 0,0003 0,12 PC ae C42:2 PC 0,0004 —-0,14 PC ae C42:4 PC 0,0005 —-0,12 Met AA 0,0007 0,16 Ala AA 0,0008 0,16 PC ae C32:1 PC 0,0009 — 0,10 Cc3 AC 0,0009 —-0,24 CI4:1 AC 0,0010 —-0,11 SM(OH)CI6:1 SM — 0,0010 0,11 PC ae C40:3 PC 0,0010 — 0,10 PC ae C36:4 PC 0,0013 0,12 SM C18:1 SM 00014 0,12 PC ae C34:3 PC 0,0015 — 0,15 Arg AA 0,0017 0,13 C23:0 TFA 0,0017 0,14 SM(OH)CI4:1 SM — 0,0017 0,11 PCaeC44:4 — PC 0,0019 — 0,12 SM C16:1 SM 0,0019 -0,09 PC ae C36:2 PC 0,0024 — 0,11 PC ae C44:5 PC 0,0026 — 0,11 PCaeC32:2 —PC 0,0026 — 0,10

' ú 49/67

C14:2 AC 00027 0,09 IywsoPCaCl6:0 PC — 0,0030 0,12 SM(OH)C24:1 SM — 0,0031 010 PCaeC36:5 —PC 0,0033 0,12 . PCaeC42:5 PC —0,0034 -0,09 PCaeC38:4 “PC 00037 0,10 Ú IwsoPCaCI8:2 PC —0,0040 018 PCaeC44:6 — PC 00044 011 Tyr/Phe PROP. 0,0050 0,10 PCaeC30:1 PC 00051 010 IysoPCaC18:0 PC —0,0052 015

CI8:1 AC —0,0056 011

PCaeC40:1 PC —0,0057 011 PCaaC362 —PC 00057 010 PCaeC40:5 —PC —0,0057 -0,09

PCaaC363 —PC 0,0058 Ol

CI8:2 AC —0,0060 015 cI8 AC —0,0060 01 PCaaC38:3 PC 0,0063 0,10

PCaaC34: — PC —0,0066 010

Phe AA 0,0067 0,09

PCaaC40:2 “PC —0,0068 0,07

PCaaC42:0 “PC 00070 0,10

Thr AA 00071 0,13

PCaaC32:3 “PC 00075 Ol

PCaaC424 —PC 00077 0,09

IwsoPCaCI7:0 PC — 0,0078 0,15

PCacC402 “PC 0,00865 -0,09

PCaeC44:3 “PC 0,00865 0,10

PCaeC38:6 —PC —0,0088 OI!

SM C26:0 SM —0,0000 0,07 trans-CI8:1w9 FFA —0,00900 0,19

; ' 50/67 SMC24:1(PD) SM 0,0091 — -0,07 PC ae C38:5 PC 0,0096 — -0,09 PC aa C32:2 PC 0,0100 — 0,11 lysoPC a C20:3 PC 0,0101 0,15 . Lys AA 0,0116 — 0,11 C2 AC 0,0118 -0,14 - lysoPCa C20:4º PC 0,0131 — 0,15 PC aa C28:1 PC 0,0134 —-0,09 Gl AA 00144 -0,06 8Me-C18:0 FFA 0,0145 -0,43 Ser AA 0,0153 —-0,10 lysoPCa C14:0 PC 0,0165 —-0,24 PC aa C42:1 PC 0,0172 —-0,08 PC ae C30:2 PC 0,0178 -0,09 PC ae C36:1 PC 0,0189 -0,08 cis-C11:1w5 FFA 0,0193 -0,48 PC ae C30:0 PC 0,0194 — 0,10 Ác.fumárico — OA — 0,0198 0,43 cis-C22:1w9 TFA 0,0200 QO11 lysoPC a C28:1/ PC 0,0216 — 0,19 PC aa C38:1 PC 0,0232 -0,08 SM C24:0 SM 0,0237 — -0,07 Val AA 0,0254 —-0,11 lysoPC a C18:1/ PC 0,0263 -0,11 lysoPCa Cl6:1/ PC 0,0272 -0,12 PC aa C40:3 PC 0,0273 -0,07 cis-C17:2w7 TFA 0,0276 -0,13 PC aa C38:4 PC 0,0284 -0,10 cis-C11:1w5 TFA 0,0308 -0,37 SM C16:0 SM 0,0320 -0,05 trans-C18:1W9 — TFA 0,0332 0,09 cis-C17:2W7 FFA 00351 -0,12

' ' 51/67 17Me-C18:0 FFA 0,0355 -0,27 cis-C20:3w6 TFA 0,0390 -0,11 cis-C15:1w5 FFA 0,0402 -0,09 PC ae C40:6 PC 0,0411 -0,08 F PC aa C34:3 PC 0,0442 —-012 C9:0 TFA 0,0469 0,24 á PC ae C42:1 PC 0,0469 —-0,08 MetSO/Met PROP. 0,0471 —O11 His AA 00472 0,07 PC ae C36:0 PC 0,0486 -0,07 PC aa C40:1 PC 0,0489 -0,15 Glu AA 0,0490 -0,26 Tabela 21 — Metabólitos supra-regulados e infra-regulados, de modo significativo e altamente significativo, comparados nos estágios 5 e 3 da CKD.

Mud.

Múlt. log Metabólito Classe Valor-p (Est.5/Est.3) “CS-DOC(C6-0H) AC —3,78E-13 0,98 ||| Creatinina BN 2,67E-11/ 0,57 SDMA BN 1,52E-10 0,42 CiVArg PROP. 8,77E-10 0,34 SDMA/Arg PROP. 1,34E-09 0,53 Trp AA 2,93E-09 -0,33 Ác.

Cetoglutáico OA — 9,96E-09 0,41 Co AC 2,75E-08 0,51 DMA total BN 1,04E-07/ 0,30 C7-DC AC 1,37E-06 0,98 Tyr/Phe PROP. 1,61E-06 -0,15 lysoPC a C20:3 PC 2,35E-05 -0,20 Co AC 2,71E-05 -0,22 Cit AA 7,49E-05 0,22 lysoPCaCI4:0 PC 0,0002 — -0,33

; ' 52/67 o lysoPCaC204 PC 0,004 IB O OrwArg PROP. 0,0008 0,14 SM(OH)C22:1 SM — 0,0008 011 IyoPCaCI6:0 PC 00011 0,13 IysoPCaCI82 PC 0,0012 0,19 - Tyr AA 0,0012 0,16 PC ae C42:3 PC 00013 011 " C23:0 TFA 0,004 0,14 SM(OH)C222 SM 0,0014 0,10 ' Ala AA 0,0018 0,13 IysoPCaCI80 PC 0,002 0,14 IyoPCaCI8:1 PC 0,002 0,14 MetSO/Met PROP. 0,0023 0,25 Trans-C18:1wW9 — FFA —0,0026 0,24 GCA BA 0,0008 04 PC ae C44:4 PC —0,0028 -0,09 Val AA 0,0033 0,12 PC ae C42:2 PC 0,0037 011 C5:1-DC AC —0,0043 028 PC ae C34:3 PC —0,0045 0,13 PC ae C38:2 PC 0,0047 0,10 Arg AA 0,0051011 Cal:0 TFA 0,0055011 Met AA 0,0061 0,13 PC ae C36:3 PC 00066 -0,09 IysoPCaCl6:1 PC —0,0070 015 PC ae C38:1 PC 00074 0,10 Lys AA 0,0089 0,10 Pro AA 0,0097 0,12 PC aa C34:4 PC 00112 017 cis-C17:2W7 TFA 00114 013 PC ae C36:5 PC 0011 0,10 TDCA BA 00138 0,60

DNA SEARA ERAS ASSES CANAL ANE MENA cao: ; « 53/67 cis-C18:14w7 FFA 0012 012 cis-C17:2W7 FFA 0,0145011 Thr AA 0,0152 0,12 PC ae C42:4 PC 00153 0,07 - C8:1 AC 00158 0,39 PC ae C40:1 PC 00159 -0,08 " IysoPCaC28:1 PC 001733 019 wsoPCaC1I7:0 PC 0,0179 012 Met-SO BN 00185 OJ11 cis-C22:1w9 TFA 0,0187 0,10 ADMA BN —0,01900 0,08 cis-C15:1w5 TFA 0,019] -0,09 PC ae C36:4 PC 00192 -0,08 PC ae C34:2 PC 00194 0,08 PC ae C38:3 PC 00210 0,08 Ser AA 0,0218 -0,09 Glu AA 0,0260016 TCA BA 00266 0,58 c3 AC 0,0268 017 PC ae C40:4 PC —0,0283 0,07 cis-C15:1w5 FFA 0,0287 -0,08 cis-C17:2w9 FFA —0,0289 0,10 PC ac C44:5 PC 00291 0,07 c8 AC 0,033] 0,34 PC aa C36:5 PC 0,0333 013 SM C22:3 SM 0,0342 -0,09 SM(OH)C24:1 SM 0,0385 -0,07 Leu AA 0,0413 012 BMe-C18:0 FFA 0,0429 -0,36 PC ae C38:0 PC 0041 010 cis-C18:1w9 FFA 0,0443 0,13

D % 54/67 TT — Fabela 22 — Metabólitos supra-regulados e infra-regulados, de modo significativo 6 —— altamente significativo, comparados em diabéticos nos estágios 4 e 3 da CKD.

Mud.

Múlt. log Metabólito Classe Valor-p (D4/D3) Cr AC 00063 029 || á Cit/Arg PROP. 0,0074 90,15 PC aa C42:4 PC 0,0084 0,11 - CS5-DC(C6-0H) AC 00114 0,49 . Cit AA 0,0134 0,19 cis-C22:6w3 (DHA) TFA 0,0188 0,13 Phe AA 0,0398 0,08 cis-C22:5w3 TFA 0,0438 0,10 GDCA BA 0,0460 0,47 cis-C17:2w6 TFA 0,0471 -0,19 PC ae C38:4 PC 0,0488 0,08 SDMA BN 0,1692 0,14 Creatinina BN 0,7538 0,03 Tabela 23 — Metabólitos supra-regulados e infra-regulados, de modo significativo e — altamente significativo, comparados em diabéticos nos estágios 5 e 4 da CKD.

Mud.

Múlt. log Metabólito Classe Valor-p (D5/D4) “Creatina — BN —4,23E-06 049 UA (1) SU 3,40E-05 1.18 SDMA/Arg PROP. 5,12E-05 0,40 Co AC 5,61E-05 -0,23 CS-DC(C6-0H) AC 8,10E-05 0,48 Glicosona SU 9,48E-05 1.19 SDMA BN 0,0004 0,27 total DMA BN 0,0010 — 0,26 Cc3 AC 0,0024 — -0,27 Trp AA 0,0025 -0,26 SM (OH) C22:2º SM 0,0037 —-0,12

' 1 55/67 17Me-C18:0 FFA —0,0077 -0,50 Tyr AA 0,0100 — -0,18 SM (OH) CI4:1/ SM 00115-011 C1l6 AC 0,0121 0,14 : co AC 0,0145 0,25 Ác.

Fumárico — OA 0,0151 0,75 PR SM(OH)CI6:1 SM — 0,0159 011 trans-C18:1wW9 —“TFA 0,0159 0,14 SM (OH) C22:1! SM 0,0163 0,10 Tyr/Phe PROP. 0,0187 0,12 Cis-Cl6:1w13 TFA /0,0202 0,19 Cit/Arg PROP. 0,0206 0,16 C9:0 TFA 0,0224 0,28 trans-C18:1wW9 —“FFA 0,0236 0,25 Arg AA 0,0255 0,14 PC ae C42:3 PC 0,0283 — 0,11 PC ae C42:4 PC 0,0297 —-0,12 PC ae C44:5 PC 0,0315011 PC ae C38:2 PC 0,0320 —-0,10 PC ae C44:4 PC 0,0322 —-0,12 Ala AA 0,0323 0,16 PC ae C42:5 PC 0,0332 —-0,10 PC ae C38:3 PC 0,0353 — -0,09 HI SU 0,0353 0,15 PC ae C40:4 PC 0,0361 —-0,09 PC ae C42:2 PC 0,0368 — 0,11 PC ae C34:2 PC 0,0406 — -0,10 Cis-Cl7:2W7 — TFA 0,044 0,15 Cis-Cll:iws — FFA —0,0455 —-0,57 Om AA 0,0465 0,12 GUDCA BA 0,0483 — -0,48

' 1 56/67 altamente significativo, comparados em diabéticos nos estágios 5 e 3 da CKD.

Mud.

Múlt. log Metabólito Classe Valor-p (D5/D3) “CS-DC(C6-O0H) AC 289E-07 0,97 ' Creatinina BN 1,03E-06 0,52 SDMA BN 5,67E-06 0,41 E Ác. cetoglutárico OA 1,14E-05 0,46 SDMA/Arg PROP. 3,09E-05 0,51 | co AC —711E-05 -025 Cit/Arg PROP. 0,0001 0,31 C9 AC 0,0002 0,38 Trp AA 0,0004 — -0,29 DMA total BN 0,0004 0,22 GCA BA 0,0013 0,71 cis-C17:2Ww7 FFA 0,0014 -0,15 Tyr/Phe PROP. 0,0018 -0,14 cis-C17:2w7 TFA 0,0028 -0,16 cis-C15:1w5 TFA 0,0083 0,13 cis-C17:2w9 TFA 0,0083 -0,15 C6:0 FFA 0,0085 —-0,07 lysoPC a C20:3 PC 0,0129 — 0,16 cis-C17:2Ww9 FFA 00143 0,13 C3 AC 0,0146 — -0,25 cis-C15:1w5 FFA 0,0158 -0,11 cis-Cl6:1w13 TFA 00158 0,23 PC ae C34:3 PC 0,0162 -0,14 cis-C17:2w6 TFA 0,0175 -0,23 Cit AA 0,0180 — 0,19 PC ae C44:4 PC 0,0221 -0,10 Pro AA 0,0241 0,14 TCA BA 0,0257132 TDCA BA 0,0337 111

V ' 57/67 o PCaeC423 PC 00592 NO

C23:0 TFA 0,0378 -0,14

IlysoPC a CI4:0º PC 0,0455 -0,24

C8:1 AC 0,0462 0,24 IysoPCaC18:1 PC 0,0468 -0,14

Tabela 25 — Metabólitos supra-regulados e infra-regulados, de modo significativo e altamente significativo, comparados em não-diabéticos nos estágios 4 e 3 da CKD.

Mud.

Múlt.

Log Metabólito Classe Valor-p (ND4/ND3) “CS5-DC(C6-0H) AC —.0,0005 0/72

Creatinina BN 0,0005 0,38

C1I8:2 AC 0,0009 — 0,30

Met-SO BN 0,0009 0,24

C10 AC 0,0024 0,30

C9 AC 0,0038 0,41

Orm/Arg PROP. 0,0039 0,16

PC ae C44:6 PC 0,0049 0,15

C8 AC 0,0060 0,98

CI18:1 AC 0,0075 0,13

DMA total BN 0,0077 0,19

CI10:1 AC 0,0087 0,66

PC aa C42:0 PC 0,0104 0,13

PC ae C32:2 PC 0,0117 0,11

12S-HETE BA 0,0123 -0,84

PC aa C42:1 PC 0,0138 0,14 cis-C18:1wW7 TFA 0,0144 0,11

Cit/Arg PROP. 0,0144 0,14

SM C26:1 SM 0,0180 0,07

PC ae C32:1 PC 0,0187 0,09

Ác. cetoglutárico OA 0,0188 0,21

C5 AC 0,0189 0,19

C5:1-DC AC 0,0197 0,40

58/67 :

SM C16:0 SM 0,0208 0,07 cis-C20:2w6 FFA 0,0211 0,10 Cit AA 0,0229 0,15 cis-CI8:lw7 — FFA 0,0043015 Om : AA 0,0269 0,14

: Asn AA 0,0302 0,08 Lactato “OA 0,0306 -0,14 cis-C18:2w6 FFA 0,0313 O11 PC aa.C30:2 PC 0,0313 0,09 SM CI16:1 SM — 0,0320 008 MetSO/Met PROP. 0,0325 0,24 Phe AA 0,0340 0,09 SDMA/Arg PROP. 0,0352 0,27 PC aa C42:2 PC 0,0359 0,11 SDMA BN 0,0375 0,19 PC aa C38:0 PC 0,0396 0,12 cis-C18:2w6 TFA 0,0396 0,07 C8:1 AC 0,0402 0,37 Trp AA —0,0412 -0,13 ADMA BN 0,0430 0,10 SM (OH) Cl6:1! SM 0,0491 0,08 Tyr/Phe PROP. 0,0491 -0,09

Tabela 26 — Metabólitos supra-regulados e infra-regulados, de modo significativo e altamente significativo, comparados em não-diabéticos nos estágios 5 e 4 da CKD.

Mud.

Múlt.

Log Metabólito Classe Valor-p —(NDS/ND4) SM(OM)C222 SM — 821E-05 -020 Cit/Arg PROP. 0,0002 0,24 PC ae C38:3 PC 0,0002 — -0,17 PC ae C38:2 PC 0,0003 -0,21 PC ae C36:3 PC 0,0005 — -0,17 Glicosona SU 0,0005 113 tição 870210000927, de 05/01/2021, pág. 7/94

' ; 59/67 FE AO ABE2 SJFAR 0, 0007 — A, ooo C5-DC(C6-0H) AC — 0,0008 0,29 PC ae C38:1 PC 0,0012 -0,21 SM (OH) C22:1! SM 0,0013 -0,19 Creatinina BN 0,0014 0,30 7 PC ae C40:4 PC 0,0016 -0,14 PC ae C34:2 PC 0,0017 — -0,17 . PCaeC42:3 PC 0,0020 — -0,18 . SDMA BN 0,0022 0,25 PC aa C38:3 PC 0,0024 —-0,16 PC aa C36:3 PC 0,0024 -0,15 Trp AA 0,0025 -0,24 Met AA 0,0026 — -0,19 PC ae C32:1 PC 0,0026 -0,12 PCaaC34:3 PC 0,0032 — 0,18 PC ae C40:3 PC 0,0033 — -0,12 PC ae C44:3 PC 0,0036 -0,16 SM C20:2 SM 0,0039 — -0,17 C9 AC 0,0040 — 0,30 C21:0 TFA 0,0042 0,15 PC aa C34:4 PC 0,0044 — -0,24 PC ae C36:2 PC 0,0050 — -0,14 PC aa C32:2 PC 0,0051 -0,16 SDMA/Arg PROP. 0,0052 0,28 His AA 0,0053 —-0,14 PC aa C36:2 PC 0,0058 — 0,15 PC ae C42:2 PC 0,0058 — -0,17 SM C16:1 SM 0,0060 -0,12 PC aa C40:2 PC 0,0063 — 0,11 PC ae C36:4 PC 0,0067 —-0,14 PC ae C42:4 PC 0,0073 -0,13 SM C24:1 SM 0,0074 — 0,11 Ala AA 0,0077 — 0,16

: í 60/67 total DMA BN 0,0084 0,21 SM C18:1 SM 0,0084 -0,15 PC aa C40:3 PC 0,0094 -0,12 PC ae C34:3 PC 0,0096 -0,19 o PC ae C44:6 PC 0,0102 -0,14 PC ae C40:1 PC 0,0106 — -0,15 nã PC aa C36:1 PC 0,0108 -0,12 PC aa C36:0 PC 0,0109 —-0,12

] SM (OH) C24:1! SM 0,0113 -0,13 PC ae C40:2 PC 0,0116 -0,13

Gln AA 0,0116 -0,09 lysoPC a C18:2º PC 0,0129 -0,24

PC ae C32:2 PC 0,0133 —-O11

Phe AA 0,0135 -0,13

Cl6 AC 0,0136 —-0,10

PC ae C40:5 PC 0,0137 —-0,12

PC aa C38:4 PC 0,0140 — 015

PC ae C36:1 PC 0,0145 -0,11

PC aa C38:5 PC 0,0159 -0,14

Tyr AA 0,0164 -0,18

PC ae C38:0 PC 0,0168 —-018

C23:0 TFA 00172 0,16

PC aa C32:3 PC 0,0180 —-0,14

Co AC 0,0182 —-0,22 lysoPCa C16:0 PC 0,0184 — -0,15

PC aa C36:6 PC 0,0185 —-0,21 lysoPC a C18:0º PC 0,0187 -0,19

Glu AA 0,0191 — -0,34

PC ae C38:6 PC 0,0193 = 0,14

PC ae C38:4 PC 0,0199 — -0,12

PC aa C28:1 PC 0,0218 = -0,13

PC aa C36:4 PC 0,0228 —-0,13

' í 61/67 o PCaeC36:S PC 0,0233 IB

Cis-C18:4w3 TFA — 0,0239 -0,51 PC aa C42:0 PC 0,0246 0,11 C14:2 AC 0,0255 -0,10 PC ae C40:6 PC 0,0265 -0,14 - SM (OH) Cl6:1! SM 0,0266 -0,10 PC ae C34:1 PC 0,0272 -0,10 sã Arg AA 0,0274 -0,11 CI18 AC 0,0276 -0,11 PC ae C36:0 PC 0,0281 -0,09 SM C14:0 SM 0,0289 —-0,12 PC aa C38:1 PC 0,0291 -0,12 SM C24:0 SM 0,0294 -0,10 SM C18:0 SM 0,0297 -0,10 PC ae C44:4 PC 0,0298 -0,12 SM C26:1 SM 0,0302 -0,09 Lys AA 0,0303 -0,11 PC ae C38:5 PC 0,0304 -0,11 PC aa C42:4 PC 0,0330 — -0,10 lysoPC a C17:0 PC 0,0332 -0,18 PC aa C42:1 PC 0,0344 -0,12 Thr AA 0,0347 -0,13 lysoPCa Cl6:1/ PC 0,0368 -0,19 PC ae C44:5 PC 0,0384 -0,11 PC ae C30:1 PC 0,0387 -0,12

SM C22:3 SM 0,0392 -0,11 SM C26:0 SM 0,0395 -0,09 PC ae C34:0 PC 0,0405 -0,09 PC aa C42:5 PC 0,0440 -0,08 PC ae C30:0 PC 0,0443 -0,10 Cis-C20:3w6 TFA — 0,0457 -0,12 lysoPC a C28:1º PC 0,0466 — -0,28

H4 SU 0,0466 — 0,28

' ' 62/67 FE NB:0 ——— o > EFA — 0,0473808 Asn AA 0,0482 -0,09 CI8:1 AC 0,0482 -0,12 C1lI4:1 AC 0,0482 -0,10 PC ae C42:5 PC 0,0492 -0,08 f PC ae C30:2 PC 0,0499 -0,11 Ná Tabela 27 — Metabólitos supra-regulados e infra-regulados, de modo significativo e altamente significativo, comparados em não-diabéticos nos estágios 5 e 3 da CKD.

Mud.

Múlt.

Log Metabólito Classe Valorp (NDS5/ND3) “C5-DC(C6-0H) — AC 142E07 100. Creatinina BN 1,67E-06 0,67 Trp AA 2,03E-06 -0,38 CiV/Arg PROP. 2,65E-06 0,38 SDMA BN 1,59E-05 0,43 Orn/Arg PROP. 2,40E-05 0,22 SDMA/Arg PROP. 2,94E-05 0,55 C9 AC 4,56E-05 0,72 DMA total BN 6,36E-05 0,40 Ác.

Cetoglutáico — OA — 0,0002 0,36 PC aa C34:4 PC 0,0003 -0,38 Tyr/Phe PROP. 0,0005 —-0,16 lysoPC a C20:3 PC 0,0009 -0,24 Cit AA 0,0010 — 0,27 lysoPC a C14:0 PC 0,0012 — -0,44 MetSO/Met PROP. 0,0016 0,32 IysoPC a C20:4 PC 0,0021 — -0,24 C8 AC 0,0028 — 0,96 Ala AA 0,0030 -0,16 SM C22:3 SM 0,0031 -0,18 C5:1-DC AC 0,0034 0,50 Met-SO BN 0,0034 0,18

SS 63/67 o SM-(OH)-922:1-— SM —0;0037 — AH —

Tyr AA 0,0042 -0,19 IysoPC a C18:2 PC 0,0048 -0,21 Met AA 0,0049 -0,15 PC aa C36:6 PC 0,0057 -0,23 r PC aa C36:4 PC 0,0057 -0,18 IysoPC a C28:1 PC 0,0057 -0,35 Ni SM (OH) C22:2 SM 0,0063 0,14 PC aa C38:4 PC 0,0063 -0,18 Arg AA 0,0064 0,13 cis-C11:1w5 FFA 0,0066 -0,61 lysoPC a C16:0 PC 0,0069 -0,15 PC ae C40:1 PC 0,0075 -0,13 PC ae C38:2 PC 0,0078 -0,14 PC ae C38:1 PC 0,0079 -0,16 PC ae C38:0 PC 0,0080 -0,18 Lys AA 0,009] -0,13 lysoPC a C16:1 PC 0,0097 -0,22 SM C20:2 SM 0,0104 -0,18 Thr AA 0,0118 -0,14

ADMA BN 0,0120 0,11 lysoPC a C18:0 PC 0,0126 — -0,17 His AA 0,0126 — -0,10 PC ae C36:4 PC 0,0126 -0,14 Val AA 0,0153 -0,16 PC ae C38:3 PC 0,0167 —-0,15 PC ae C38:4 PC 0,0172 — -0,13 PC aa C38:5 PC 0,0176 —-0,14 C23:0 TFA 001900 0,14 PC ae C42:2 PC 0,0191 — -0,13

C21:0 TFA 0,0194 -0,11

PC ae C42:3 PC 0,0203 -0,11 12S-HETE BA 0,0205 -0,64

ANN 64/67 o PCaaC33 PC 002 AZ Lactato OA 0,0228 -0,15 Cis-C22:1w9 TFA 0,0241 0,13 PC ae C36:3 PC 0,0247 -0,12 IysoPC a C18:1 PC 0,0249 -0,14 f Trans-C18:1w9 FFA 0,0264 0,29 Cis-C18:4w3 TFA 0,0277 -0,59 a PC ae C40:4 PC 0,0291 -0,11 PC ae C44:3 PC 0,0298 -0,12 PC aa C36:3 PC 0,0322 -0,13 SM (OH) C24:1 SM 0,0339 -0,10 Co AC 0,0342 — -0,19 PC aa C36:5 PC 0,0366 -0,18 Leu AA 0,0367 -0,16 PC ae C36:5 PC 0,0376 -0,13 Cis-C20:5w3 (EPA) TFA 0,0392 -0,21 Cis-C18:1wW7 FFA 0,0402 0,17 PC aa C38:3 PC 0,0406 — -0,14 Xle AA 0,0413 = -0,15 PC ae C42:4 PC 0,0431 -0,09 Cis-C20:3w6 TFA 0,0450 0,16 Aplicabilidade Industrial A presente invenção possibilita a previsão e o diagnóstico de doenças renais, de uma maneira aperfeiçoada e em um estágio inicial da doença, e permite ainda uma detecção mais sensível de mudanças patológicas nos rins.

De fato, os biomarcadores de acordo com a invenção podem ser facilmente detectados em amostras biológicas, em particular, amostras de sangue e/ou urina, seu nível sendo consistentemente correlacionado ao grau de doença/distúrbio renal, e às suas mudanças de nível.

Além disso, os biomarcadores de acordo com a invenção são também fundamentalmente valiosos, pelo fato de que podem adequadamente avaliar a nefrotoxicidade em modelos de animais ou em experimentos clínicos da fase LI.

Em outras palavras, são também adequados para avaliar nefrotoxicidade pré-clínica e clínica,

eta 65/67 — isto é, também, em um estágio bastante prematuro do desenvolvimento dos produtos farmacêuticos, notadamente, em modelos de animais ou em experimentos clínicos da fase.

Com base nesses fundamentos, é possível a preparação de um kit, — adequado para ajudar na produção de um diagnóstico mais confiável quando do início de - doenças renais, especificamente, doença renal crônica (CKD) e nefropatia diabética (DN), e monitorar a progressão das mesmas.

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Claims (13)

- ——— REIVINDICAÇÕES — e

1. Conjunto biomarcador metabólico para avaliação de doença nos rins, caracterizado pelo fato de compreender pelo menos dois aminoácidos, pelo menos duas —acilcarnitínas e, pelo menos, duas aminas biogênicas.

2. Conjunto biomarcador, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender aínda uma proporção de produto/substrato em relação a uma reação enzimática, preferivelmente, a proporção SDMA/arginina, a proporção citrulina/arginina, a proporção ornitina/arginina e/ou a proporção sulfóxido de metionina/metionina.

3. Conjunto biomarcador, de acordo com à reivindicação 1 e/ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que os aminoácidos são selecionados da Tabela 1, as acilcarnitinas são selecionadas da Tabela 2 e as aminas biogênicas são selecionadas da Tabela 3, conforme indicado no relatório descritivo, respectivamente.

4, Conjunto biomarcador, de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de compreender ainda um ou mais metabólitos selecionados do grupo que consiste de políaminas, fosfatidilcolinas, mono- e oligossacarídeos redutores, esfingomielinas, eicosanóides, ácidos de bile, açúcares fosforilados, ácidos orgânicos mono-, di- e trivalentes, e nucleotídeos.

5. Conjunto biomarcador, de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que os aminoácidos são selecionados de Cit, Phe, Asn, Trp, His, Orn, Tyr, Met, Ala, Arg, Thr, Lys, Gln, Ser, Val, Glu, e Pro, as acilcarnitinas sao selecionadas de CO, C5-DC(C6-OH), C5:1-DC, C8, C9, CI10, CI0:1, Cl4:1, e CI18:1, as aminas biogênicas são selecionadas de MetSO, creatinina, SDMA, ADMA, DMA total, e serotonina, e as proporções são selecionadas de proporção de —SDMA/arginina, proporção de citrulina/argínina, proporção de ornitina/arginina, e/ou proporção de sulfóxido de metionina/metionina.

2 .. 6, Uso -de uma combinação de metabólitos, compreendendo pelo menos = cc dois aminoácidos, pelo menos duas acilcarnitinas e pelo menos duas aminas biogênicas, caracterizado pelo fato de que o dito uso se faz na forma de um conjunto biomarcador para avaliação de doença dos rins em uma amostra de sangue.

7. Método para avaliação de doença dos rins em um sujeito mamífero, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende a obtenção de uma amostra biológica do sujeito, preferivelmente, sangue e/ou urina, e medição na amostra biológica da quantidade de pelo menos dois aminoácidos, pelo menos duas acilcarnitinas e, pelo menos, duas aminas biogênicas.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de compreender ainda a medição na amostra biológica da proporção de um produto/substrato em relação a uma reação enzimática, preferivelmente, a proporção SDMA/arginina, a proporção citrulina/arginina, a proporção ornitina/arginina e/ou a proporção sulfóxido de metionina/metionina.

9, Método, de acordo com a reivindicação 7 e/ou reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que os aminoácidos são selecionados da Tabela 1, as —acilcarnitinas são selecionadas da Tabela 2 e as aminas biogênicas são selecionadas da Tabela 3, conforme indicado no relatório descritivo, respectivamente.

10, Método, de acordo com quaisquer das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de compreender ainda a medição na amostra biológica da — quantidade de um ou mais metabólitos, selecionados do grupo que consiste de poliaminas, fosfatidilcolinas, mono- e oligossacarídeos redutores, esfingomielinas, eicosanóides, ácidos de bile e intermediários de metabolismo energético,

11. Método, de acordo com quaisquer das reivindicações 7 a 10, caracterizado pelo fato de que os aminoácidos são selecionados de Cit, Phe, Asn, Trp, His, Or, Tyr, Met, Ala, Arg, Thr, Lys, Gln, Ser, Val, Glu, e Pro, as acilcarnitinas sao selecionadas de CO, €S-DC(C6-O0H), C5:1-DC, €8, C9, C10, C10:1, C14:1, é C18:1, as aminas biogênicas são selecionadas de MetSO, creatinina, SDMA, ADMA, DMA total,

e serotonina, e as proporções são selecionadas de proporção de SDMA/arginina; proporção de citrulina/arginina, proporção de ornitina/arginina, e/ou proporção de sulfóxido de metionina/metionina.

Ej

12. Método, de acordo com quaisquer das reivindicações 7 a 11, caracterizado pelo fato de que a medição é baseada em um método analítico quantitativo, preferivelmente, cromatografia, espectroscopia e espectrometria de massa,

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a cromatografia compreende GC, LC, HPLC e UPLC; a espectroscópia compreende UV/Vis, IR, é NMR; e a espectroscopia de massa compreende ES1- QOqO, ESI-QgTOF, MALDI-QqgQ, MALDI-QOqgTOF, e MALDI-TOF-TOE.

14, Método, de acordo com quaisquer das reivindicações 7 a 13, caracterizado pelo fato de que a doença de rins é a doença crônica de rins (CKD), preferivelmente, nefropatia diabética (DN).

15, Kit, adaptado para realização do método de acordo com quaisquer das reivindicações 7-14, caracterizado pelo fato de compreender um dispositivo, cujo — dispositivo compreende um ou mais poços e um ou mais suplementos, impregnados com pelo menos um padrão interno.

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