CN102460160B - 用于评估肾脏疾病的新生物标记物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于评估肾脏疾病的代谢的生物标记物组，所述生物标记物组包含至少两种氨基酸，至少两种酰基肉毒碱和至少两种生物源的胺。而且，本发明涉及一种用于评估哺乳动物受试者中肾脏疾病的方法以及适于实施所述方法的试剂盒，所述方法包括从所述受试者获得生物学样品，优选血液和/或尿，以及测量所述生物学样品中的至少两种氨基酸的量、至少两种酰基肉毒碱的量和至少两种生物源的胺的量。通过使用依照本发明的特异的生物标记物和方法，能够更合适且可靠地评估肾脏疾病。

Description

用于评估肾脏疾病的新生物标记物
技术领域
本发明涉及用于评估肾脏疾病的新生物标记物，所述生物标记物对肾脏中病理学改变较敏感，特别是在疾病或损伤早期阶段。此外，本发明涉及用于评估哺乳动物受试者中肾脏疾病的方法，并涉及用于实施该方法的试剂盒。
背景技术
代谢组学(metabolomics)是对系统地涵盖关键代谢产物的小分子量化合物的综合的定量测量，这些关键代谢产物代表了中间代谢的途径的整个范围。在系统生物学方法中，其提供了通过遗传蓝图，调节，蛋白丰度和修饰，和环境影响决定的改变的功能的资料解析。分析大阵列的代谢产物的能力提取出反应明显的生物学事件的真实功能的终点的生物化学信息，而其他的功能基因组学技术例如转录组学和蛋白组学，虽然非常有价值，但仅指示表型反应的潜在原因。因此它们不能在表型水平必要地预示药物效果、毒物学反应或疾病状态除非加上功能确认。
代谢组学通过特别描述此种功能信息缩小该信息差距，因为在生物学液体和组织之间的代谢产物差异提供了与至各种表型反应最紧密连接。不需要讲，生物化学表型中的此种改变与药物的、生物技术和健康产业有直接关系——一旦合适的技术使得能够对该信息进行挖掘(mining)和整合。
一般而言，表型不是必要地被基因型预测。基因型和表型之间的差距是通过许多生物化学反应引起的，每种反应对包括药物、营养和环境因素的多种影响都有个体依赖。在从基因到表型的生物分子的该链中，代谢产物是与表型最紧密连接的可定量的分子。许多表型和基因型状态，例如对药物的中毒反应或疾病传播被通过在生物学液体和组织中功能上相关的代谢产物的浓度的差异来预测。
慢性肾脏疾病(CKD)为在肾小管和肾小球中的肾脏功能累进的丧失，通常为不可逆的。CKD为世界范围的公共健康问题，具有如肾衰竭、心血管疾病和早产儿死亡的并发症。CKD可由不同原因引起，但一个主要原因是作为来自2型糖尿病的并发症，称为糖尿病肾病(DN)。在欧洲，有大约2230万人受糖尿病折磨，且这些人中94.9％患有2型糖尿病，这是在欧洲大多数工业化国家中终末期肾病(ESRD)的主要原因(Ha H等.2008)。患有ESRD的患者的三分之一为糖尿病患者(Wolf G.&Ritz E.2003)且最近的数据显示在患有2型糖尿病的患者中ESRD的流行病学增加，最可能由于对高血压和冠心病的更好治疗，导致更多患者存活足够长的时间以发展出肾病和ESRD(Sampanis Ch.2008)。在美国，每年用于治疗ESRD的花费于1995年为118亿，预计至2010年超过两倍，为283亿美元。在欧洲的经济因素还没有被广泛地研究(Massi-Benedetti M&CODE-2AdvisoryBoard2002)但在2型糖尿病的花费(CODE-2)研究中糖尿病并发症对糖尿病治疗的花费的影响被评估。该研究显示没有并发症的患者每年医疗费用大约为1505欧元，与此相比有微血管并发症的患者的每年医疗费用为2563欧元，后者增加了70％(Williams R等.2002)。世界领先的独立医学期刊最近总结一项包括近50万成人的长期研究，该研究证明几乎所有受试者直到CKD晚期阶段才知道他们的疾病。因为CKD被认为在较早期阶段是可治疗且可预防的(Wen CP等.2008)，较早的检测将使2型糖尿病患者减轻并发症并对于公共健康系统和患者本身都减少健康护理费用。
肾脏具有几种功能来维持身体的适当功能，例如过滤出废物产物和毒素、保持体内稳态和产生激素。为了维持该适当的肾脏功能，肾脏中血液经肾小球膜被过滤的速率必须被调节。高的肾小球过滤速率(GFR)对于保持水和溶质的稳定的和最佳的细胞外水平是必须的(Boron WF,&Boulpaep EL.2003)。该GFR根据血清肌酸酐清除率、年龄、种族和性别计算，并被用于将CKD分成五个阶段，其中最后一个是终末期肾病(ESRD)且透析和移植对于生存是需要的。现已经知道肾脏功能障碍越快被诊断和治疗，保留剩余的肾单位并因此减缓疾病发展的几率越大。
评估和诊断肾脏疾病的常规标记物包括GFR、肌酸酐和白蛋白。
在非常早期阶段增加之后，GFR在任何症状显示之前减少。用GFR测量的缺点包括高成本和与常规实验室检测不相容。上述的血清肌酸酐为最通常使用的计算GFR的标记物，但半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)C已被提议作为更灵敏的标记物，其可检测甚至温和的GFR减少(Herget-Rosenthal S等.2007)。不利之处是对于半胱氨酸蛋白酶抑制剂C不存在参考方法或统一校准材料，且进一步限制是高的糖皮质激素剂量的甲状腺机能障碍和潜在的存在心血管疾病对半胱氨酸蛋白酶抑制剂C水平的影响。由于这些单一标记物中的限制，因此不建议完全地依赖GFR评估来进行精确的临床决定。除了肾脏疾病，年龄是影响GFR的第二大因素。因此，GFR的温和的减少可能不总是由于肾脏损伤，而是由于年龄。同样，GFR的减少不总是由于慢性肾脏疾病。GFR的测量也被认为是不方便的且因此肾脏功能通常用血清肌酸酐浓度评估。
血清肌酸酐已被长时间用于检测受损的肾脏疾病也被用于计算GFR(Star R.等.2002)。肌酸酐是来自肌肉代谢的磷酸肌酸酐的故障(breakdown)产品(Barr DB.等.2005)且它每天形成的量取决于肌肉量(mass)，但血浆浓度在个体中十分恒定。血清肌酸酐浓度受例如年龄、性别、种族和身体尺寸的影响，因此通常进行肌酸酐清除的测量。来自身体的肌酸酐的清除是通过肾脏中肾小球过滤，但肌酸酐也通过肾小管从血液活性分泌。该速率取决于遗传的和生物学的因素，例如性别和年龄，并导致GFR的15-20％高估。因此，肌酸酐被认为不敏感的标记物，尤其对于小的(small)和上年纪的人。还有，肌酸酐的另一缺点是它仅检测较晚期阶段的肾脏损伤。
白蛋白是最丰富的血浆蛋白(Basi S,等.2008)且对肾脏的结构损伤可通过升高的尿白蛋白排泄被反映，因此被称为微量白蛋白，30-300mg/24h。微量白蛋白尿在糖尿病发生之后发展一些年并在15-20年之后进展为大量白蛋白尿(macroalbuminuria)，尿中白蛋白浓度高于300mg/24h。白蛋白尿的存在为糖尿病肾病的标志并通常用浸渍片(dipstick)测量。白蛋白作为肾脏损伤的标记物有一些缺点。首先，直到几年前人们还相信不被近曲小管细胞重吸收的尿白蛋白被完整排泄，但事实上白蛋白被以完整的白蛋白和不被浸渍片测试检测的白蛋白-衍生的肽，以及另一种也不被检测的完整的白蛋白排泄。这给假阴性测试结果提供了空间。(Comper WD.&Osicka TM.2005)。第二，白蛋白尿是已经存在肾病的证据，因此不将白蛋白作为好的预测性的生物标记物。如果糖尿病肾病在出现大量白蛋白尿之前被检测到，则治疗有可能预防或逆转CKD的进展。白蛋白尿的测量不能鉴定所有患有肾脏损伤的患者。
两种甲基精氨酸异构体对称的二甲基精氨酸(SDMA)和不对称的二甲基精氨酸(ADMA)在肾脏疾病背景中已经被密集研究(参见Fleck C等.2001)。它们通过由蛋白精氨酸甲基转移酶(PRMT)转录后修饰的精氨酸残基形成。然而SDMA在生理学上是非常惰性的，至少在身体中通常不被代谢，ADMA是生物学重要的因为它作为一氧化氮合酶(NOS)的内生抑制剂的潜力，这意味着升高的ADMA浓度引起减少的NO的合成，并因此引起受损的内皮功能。几十年来ADMA的累积被认为对高血压、免疫防御和涉及CKD的特征有贡献，且动物研究已显示实验上诱导的慢性NOS抑制引起系统高血压和肾小球高血压、肾小球局部缺血、肾小球硬化症、肾小管间质性损伤和蛋白尿(Zatz R&Baylis C,1998)。SDMA也已经被发现在患有CKD的患者中显著增加，甚至比ADMA多。
并且，酰基肉毒碱已被关联至CKD(Fougue D等.2006)。游离酰基肉毒碱的增加已在CKD患者的血清中观察到，这是因为损伤的肾脏的减小的排泄功能。
此外，氧化应激已被关联至肾脏疾病的发展多年(Loughrey CM.等.1994,Ha H等.1995)。几项研究显示归因于高血糖的增加的氧化应激是糖尿病的微血管和大血管并发症两者的起源(Sakane N等.2008)。氧化应激起源于丰富的葡萄糖和脂肪酸且当这些物质被供应至线粒体代谢时，来自电子传递链的电子可能逃逸。蛋氨酸亚砜是活性氧物质(ROS)的氧化的最直接指示剂之一(Mashima R等.2003)，但之前它还未被用作肾脏疾病的生物标记物。此外，柠檬酸循环中间体在肾衰竭中的作用已被研究，其中在患有CKD的患者中柠檬酸盐、富马酸盐、草酰乙酸盐和苹果酸盐的浓度显著增加。
在患有CKD的患者中，肾代谢改变显示出影响整个身体和肾氨基酸代谢的改变。在正常条件下，仅有限量的氨基酸随尿排出。苯丙氨酸向酪氨酸的转变的损伤已被观察到，其导致苯丙氨酸在这些患者中的累积。此外，损伤的肾脏影响精氨酸的产生，这在临床和动物研究中都已以肾精氨酸合成的减少显示。而且，减少的瓜氨酸的肾摄取和牛磺酸、鸟氨酸、丙氨酸、酪氨酸和赖氨酸的释放已被观察到存在于有严重的(advanced)CKD的患者中。此外，瓜氨酸至精氨酸的转变显示为减少。
而且，有人建议色氨酸(trypthophan)代谢在CKD的发病中发挥作用。在肾脏的该路径中的限速酶为吲哚胺-2、3-二氧化酶(IDO)，其将色氨酸转化为N-甲酰基-犬尿素，N-甲酰基-犬尿素反过来被分解代谢为犬尿素及之后的羟基犬尿素。IDO的增加的活性已在以前的研究中观察到，这解释了色氨酸的消耗。
炎性标记物例如C-反应蛋白、白介素6、白介素18、肿瘤坏死因子(TNF)-α已被观察到在有糖尿病和DN的患者的血清中增加并且胎球蛋白被观察到减少。此情况发生在疾病的非常早期的阶段，且与白蛋白尿的程度关联。
已知用于CKD或DN的诊断的生物标记物包括例如几种具有不同的分子量和迁移时间的多肽标记物(US 2006286602 A1,CA2473814A1,EP1972940 A1,US 2009081713 A1)，例如慢性肾衰竭基因-1a(CRFG-1a)多肽(JP 11069985 A,JP 11069984 A)，以及多核苷酸标记物(JP 2003235573 A,JP 2004187620 A)。
上述半胱氨酸蛋白酶抑制剂C为所有用于诊断肾脏疾病的标记物蛋白之一(JP 11064333 A)，与全-(holo-)和apo-视黄醇结合蛋白(RBP)、Tamm-Horsfall-蛋白(THP,(DE 10327773A1)。钙结合蛋白D-28k(大的EF-手家族(EF-hand family)的钙结合蛋白成员)、肾脏损伤分子-1(Kim-1,a包含细胞外的、六半胱氨酸免疫球蛋白区的1类膜蛋白),α-2u球蛋白相关的蛋白(α-2u),在人中也称为lipocalin2(LCN2)或中性明胶酶相关的lipocalin(NGAL)(储存于中性粒细胞的颗粒中),骨桥蛋白(OPN),也称为分泌的磷蛋白1(SPPl，分泌的，高酸的和糖基化的包含精氨酸-甘氨酸-天氨酸(RGD)细胞粘附基序的磷蛋白)，血管内皮生长因子(VEGF,已知促进血管发生，增加血管渗透性，作为单核细胞的趋化剂，且在糖尿病、创伤愈合、炎性反应和组织重塑中有作用(WO 2008116867 A1)，N-乙酰基胞壁酰基(acetylmuramoyl)-L-丙氨酸酰胺酶前体，脂肪细胞因子，AMBP蛋白前体(α-1-微球蛋白),C4b-结合蛋白α-链前体，血浆铜蓝蛋白前体，补体C3前体，补体C9前体，补体因子D前体α-IB-糖蛋白，β-2-糖蛋白I前体，肝素辅因子II前体，链C区蛋白，富亮氨酸-α-2-糖蛋白前体，色素上皮衍生的因子前体，血浆视黄醇结合蛋白前体和翻译起始因子3亚单元10(EP1905846A2)。
抗原、细胞毒素和细胞生长抑制剂可被用作生物标记物(WO2008101231 A2)。成纤维细胞生长因子23(FGF-23)和脂肪细胞因子(adiponectin)已被发现为对于慢性肾脏疾病的进展独立地或组合地为良好预示的标记物(WO 2008089936A1)。用于诊断和检测肾脏疾病或其诱因(predisposition)的另一方法通过检测来自受试者的样品中的von Hippel-Lindau肿瘤抑制剂(pVHL)、CXC趋化因子受体4(CXCR4)，integrinβ-1、血小板衍生的生长因子α多肽(PDGF-A)，缺氧可诱导的因子1α(HIF lα)和/或转化生长因子β(TGF β)(US2008/0038269 Al)。通过测量乳铁蛋白，髓过氧化酶和癌胚抗原(CEA)(JP9072906A)和纤连蛋白(JP9274036A)肾脏疾病也可被诊断。
另一所述方法测量样品中结缔组织生长因子(CTGF)的水平以确定肾脏纤维化的存在和进展及相关的肾障碍，特别是与糖尿病、高血糖和高血压关联的并发症。(US 2004/0224360A1)
在基因组学领域，也有几种生物标记物用于肾脏疾病评估。一个发明包含鉴定仅在临床或科学有益的细胞，例如足细胞或近曲小管细胞中表达的基因(CN1863928A)。人白细胞抗原(HLA)基因标记物HLA-A11，HLA-DR9和HLA-DQA1*0302都是糖尿病和肾病的易感基因(CN101294215A)。解聚素和有血小板反应蛋白类型1基序-4的金属蛋白酶、蛋白聚糖酶(aggrecanase)-1(ADAMTS4)已被发现用于CKD的血液生物标记物(WO2009002451A2)以及基因钙结合蛋白-D28k、KIM-1、OPN、EGF、丛生蛋白、VEGF、OAT-K1、醛缩酶A、醛缩酶B、Podocin、α-2u,C4(EP1925677A2)和神经酰胺葡萄糖基转移酶(CGT)(WO03057874A1)。
RNA标记物也被用作肾脏疾病的标记物(EP2058402(A1)。例如，肾脏RNA标记物选自肾近曲小管的表皮细胞中表达的肾脏特异性的雄激素调节蛋白(KAP)、肾脏损伤分子-1(KIM-1)(一种在近曲小管上皮细胞中表达的膜蛋白)，在缺血损伤之后和用肾毒物治疗后在肾脏中诱导表达的肝磷脂结合表皮生长因子(HB-EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF-1)、用肾毒物出料后肾脏中诱导的角化细胞生长因子(FGF-7)和FGF-7受体FGFR2IIIb、水通道蛋白，水通道1、2和3(在肾脏中大量表达)、Tamm-Horsfall糖蛋白(在肾脏上皮细胞中表达并位于Henle管的粗升支(thick ascending limbs)和肾脏的远曲小管)和最后的，早期生长反应基因(Egr-1)，原癌基因(c-fos)和应激反应基因(hsp70)的表达，其在肾脏缺血损伤之后被激活。
先有技术中描述的用于评估肾脏疾病的其他方法包括通过使用两种或多种底物测量尿中蛋白酶活性并分析蛋白酶活性作用该底物的类型(WO2008001840A1)或测量人体中催化的铁(US2007238760A1)。
即使有几种被推荐的用于评估肾脏疾病的生物标记物，但所描述的那些且特别是在当今的临床使用中的那些不是足够敏感的且仅在该疾病的晚期阶段被检测到。因此，对于肾脏中的病理改变，特别是在疾病或损伤的早期阶段的更敏感的标记物仍有显著的医学需求。
虽然上述标记物例如白蛋白和肌酸酐已经用于发现处于患肾病风险的糖尿病患者，但是最重要的是发现新型的和更敏感的代谢生物标记物，这些生物标记物有能力在较早阶段预测或检测糖尿病肾病，使其能用治疗介入以防止或至少减缓最终引起ESRD的肾脏损伤的进展并控制相关的并发症。
考虑到先有技术中存在的上述问题，本发明的目的是提供用于评估肾脏疾病的新的生物标记物，所述标记物对于肾脏中病理改变更敏感，特别是在疾病或损伤的早期阶段。最佳地，所述标记物在生物学样品例如在血液和/或尿中应容易地被检测到，其水平应与肾脏损伤的程度始终关联，且其水平应改变。此外，本发明的一个目的是提供一种用于评估生物学样品中肾脏疾病的方法。
为了实现本发明的目标，本发明人基于他们对代谢组学的研究——因为这可以理解在疾病过程中肾脏中发生的生物化学改变并提供几种新的和潜在的较好的生物标记物。事实上，肾脏是特别的代谢主动的器官，在此代谢产物被排泄或再次吸收，这取决于它们在身体中的功能。因此，对于用于肾脏疾病的代谢生物标记物将有显著的进步，这也将给出更多关于肾脏的功能和其中的生物化学反应的信息。发明人发现在使用一组随着进行性肾脏疾病而改变的代谢产物而不是仅使用如先有技术中的单一标记物时，所有涉及的途径和机制的较综合的图片被给出。
发明概述
因此，本发明，如所附权利要求书中限定的，提供适合用于评估肾脏疾病的新的生物标记物(即新的生物标记物组)，所述生物标记物对肾脏中病理学改变更敏感，特别是在疾病或损伤早期阶段。此外，本发明还提供用于评估哺乳动物受试者中肾脏疾病的方法，以及适于实施该方法的试剂盒。
附图简述
在说明书附件中进行对下图1-14的参考。这些证明了依照本发明的进行性肾脏疾病中代谢生物标记物的增加或减少的实例。
图1涉及糖尿病患者和非糖尿病患者中CKD的阶段3-5中对称的二甲基精氨酸(SDMA)，并显示阶段5患者与阶段3和阶段4患者相比具有高度显著性(p<<0.01)增加的比，这表明SDMA是CKD的进展的好的生物标记物。
图2涉及CKD的阶段3-5中SDMA比并显示阶段5患者与阶段3和阶段4患者相比具有高度显著性(p<<0.01)增加的比。
图3涉及糖尿病患者和非糖尿病患者中CKD的阶段3-5中SDMA/精氨酸比的箱线图，并显示阶段5患者与阶段3和阶段4患者相比具有高度显著性(p<<0.01)增加的比，这表明还有SDMA/精氨酸比是CKD的进展的好的生物标记物。该比为作为好的预示性标记物的SDMA/Arg指示的，且反映了蛋白精氨酸N-甲基转移酶II的增加的活性。
图4涉及CKD的阶段3-5中SDMA/精氨酸比的箱线图并显示阶段5患者与阶段3和阶段4患者相比具有高度显著性(p<<0.01)增加的比。SDMA为好的预示性标记物且反映了蛋白精氨酸N-甲基转移酶II的增加的活性。
图5涉及糖尿病患者和非糖尿病患者中CKD的阶段3-5酰基肉毒碱戊二酰基肉毒碱的箱线图，并显示戊二酰基肉毒碱在CKD较晚的阶段具有提高的水平。
图6显示CKD的阶段3-5中戊二酰基肉毒碱的箱线图。
图7涉及糖尿病患者和非糖尿病患者中CKD的阶段3-5中瓜氨酸/精氨酸比的箱线图，并显示阶段5患者与这阶段3患者相比具有高度显著性(p<<0.01)增加的比，该比指示在尿素循环中改变的酶活性。
图8涉及CKD的阶段3-5中瓜氨酸/精氨酸比的箱线图。
图9涉及糖尿病患者和非糖尿病患者中CKD的阶段3-5中鸟氨酸/精氨酸比的箱线图，并显示仅在非糖尿病患者中阶段5患者与阶段3患者相比具有高度显著性(p<<0.01)增加的比，这表明该生物标记物对于不同类型的肾脏疾病之间的不同的诊断将是重要的。
图10涉及糖尿病患者和非糖尿病患者中CKD的阶段3-5中蛋氨酸亚砜/蛋氨酸比的箱线图，并显示在阶段5患者中与阶段3患者相比该氧化应激标记物高度显著性(p<<0.01)增加。
图11涉及CKD的阶段3-5中蛋氨酸亚砜(MetSO)/蛋氨酸(Met)比的箱线图，并显示阶段5患者与3阶段患者相比具有高度显著性(p<<0.01)增加的比，这表明MetSO/Met比是CKD的进展的好的生物标记物。
图12涉及CKD的阶段3-5中富马酸盐的箱线图，并显示出，因为在早期阶段不存在富马酸盐，因此富马酸盐用作定性标记物。
图13涉及糖尿病患者和非糖尿病患者中CKD的阶段3-5中alpha酮戊二酸盐的箱线图，并显示阶段5糖尿病患者与阶段3糖尿病患者相比具有高度显著性(p<<0.01)增加的比。
图14涉及CKD的阶段3-5中alpha酮戊二酸盐的箱线图。
优选实施方案描述
通过使用依照本发明的特异的(成组的)生物标记物和方法，已能够更合适且可靠地评估肾脏疾病。“评估”在本发明的意义中是指诊断疾病的发生并检测疾病的进展，特别是在不同的阶段检测并标记疾病。本发明使得能够以改进的方式并在疾病的早期阶段预测和诊断肾脏疾病，并使得能更敏感地检测肾脏中的病理学改变。事实上，依照本发明的生物标记物在生物学样品中是容易地被检测的，特别在血液和/或在尿中，它们的水平与肾脏疾病/损伤的程度始终关联，且它们的水平改变。
此外，评估也应包含以下事实：这些标记物适合于在动物模型或在I期临床试验中评估肾毒性。换句话说，它们适合于评估临床前的和临床的肾毒性，即，也在药物研发的非常早期阶段，意即在动物模型中或在I期临床试验中。
一般而言，生物标记物是有价值的工具，因为它能够将两种或多种生物学状态彼此区别开，作为正常生物学过程、致病过程的指示剂，或作为对药物介入的反应。代谢产物是小分子化合物(<1kDa)，比大多数蛋白、DNA和其他大分子小。蛋白活性的小改变引起生物化学反应的大改变，并且它们的代谢产物(＝代谢的生物标记物，看身体的代谢)，其浓度，流动和运输机制是对疾病和药物介入敏感的。这使得能够得到生理学和病理生理学物质的个体曲线，其反映遗传学和环境因素例如营养、体力活动、肠微生物(gut microbal)及药物治疗。因此，代谢的生物标记物比例如其为生物标记物但不是代谢的生物标记物的蛋白或激素给出更广泛的信息。
考虑到这些问题，在此使用的术语代谢的生物标记物被定义为适合作为肾脏疾病的状态，特别是CKD的指示剂的化合物，其为在哺乳动物身体里的代谢过程期间出现的代谢产物或代谢化合物。术语代谢的生物标记物也将包含关于酶反应的产物/底物比。
依照本发明测量的代谢的生物标记物(组)有义务包含以下类别的代谢产物(即，被分析物)：至少两种氨基酸、至少两种酰基肉毒碱和至少两种生物源的胺。这些类别的定义为本领域技术人员已知的，然而，优选的这些类别的成员概述于以下表1-3中。此外，生物源的胺被理解为一组天然产生的通过天然氨基酸的酶的脱羧基衍生的生物学活性化合物。生物源的物质是通过生命过程提供的物质，且所述生物源的胺包含胺基团。它们的大多数作为神经递质，但在调节例如血压和体温方面也有一些活性。
已令人惊异地发现测量一组包含这些类别的代谢产物的生物标记物使得能以改进的方式并在疾病的早期阶段预测并诊断肾脏疾病。特别是，这使得能对肾脏中病理学改变进行更敏感的检测。如果该组的一个类别的代谢产物被省去或如果其数量减少则肾脏疾病的评估变得较少敏感且较少可靠。这特别适用于疾病的早期阶段，所述疾病依照已知方法使用已知所有生物标记物不能可靠地被检测。事实上，同时测量至少两种氨基酸、至少两种酰基肉毒碱和至少两种生物源的胺使得能够更可靠地诊断肾脏疾病，并且特别是CKD和DN，已经处于阶段1-3但也处于阶段4和5。此种事实既未在先有技术中被描述，也不能从先有技术中明显得到。
优选地，生物标记物组还包含关于酶反应的产物/底物的比，更优选，SDMA/精氨酸比，瓜氨酸/精氨酸比，鸟氨酸/精氨酸比和/或蛋氨酸亚砜/蛋氨酸比(参照，所附的图)。SDMA/精氨酸比涉及酶蛋白精氨酸N-甲基转移酶(PRMT)，瓜氨酸/精氨酸比涉及一氧化氮合酶(NOS)，鸟氨酸/精氨酸比涉及精氨酸，且蛋氨酸亚砜/蛋氨酸比涉及通过活性氧物质(ROS)的氧化。此外通过测量这些比，依照本发明的生物标记物组和方法的诊断性能可被进一步改进。
更优选地，依照本发明的生物标记物组还包含一种或多种选自以下的代谢产物：多胺、磷酸卵磷脂、还原的单糖和寡糖(糖)、鞘磷脂、类花生酸、胆汁酸和能量代谢中间产物。这些类别的优选的实例在以下表4-9中给出。此外，通过额外测量这些类别的代谢产物，依照本发明的生物标记物组和方法的诊断性能可被进一步改进。
特别优选的生物标记物组为以下的类别：其中氨基酸选自Cit,Phe,Asn,Trp,His,Orn,Tyr,Met,Ala,Arg,Thr,Lys,Gln,Ser,Val,Glu和Pro，酰基肉毒碱选自CO,C5-DC(C6-OH),C5:1-DC,C8,C9,C10,C10:1,C14:l和C18:1，生物源的胺选自MetSO,肌酸酐,SDMA,ADMA,总DMA和血清素，且比选自SDMA/精氨酸比、鸟氨酸/精氨酸比，和/或蛋氨酸亚砜/蛋氨酸比。
如上所述，待评估的疾病是肾脏疾病。优选地其为慢性肾脏疾病(CKD)，更优选地为糖尿病肾病(DN)。
所述生物学样品得自哺乳动物，优选得自小鼠、大鼠、豚鼠、狗、迷你猪或人。生物学样品优选为血液或尿样品，然而，使得能进行本发明的测量的本领域技术人员已知的任何其他生物学样品也是合适的。因此，依照本发明的方法为体外方法。为测量生物学样品中的代谢产物的浓度，使用定量分析的方法例如色谱、光谱和质谱，而质谱是特别优选的。色谱可包含GC,LC,HPLC和UPLC；光谱可包含UV/Vis,IR和NMR；质谱可包含ESI-QqQ,ESI-QqTOF,MALDI-QqQ,MALDI-QqTOF和MALDI-TOF-TOF。优选的是使用FIA-和HPLC-串联质谱。这些分析方法为本领域技术人员公知。
为测量代谢产物量，靶向的代谢组学被用于定量生物学样品中的代谢产物，包括分析物级别的氨基酸、生物源的胺、多胺、酰基肉毒碱、磷酸卵磷脂、还原的单糖和寡糖、鞘磷脂、类花生酸、胆汁酸和能量代谢中间产物。低于能量代谢中间产物应理解磷酸化的糖，单价、二价和三价有机酸，和核苷酸。然而，依照本发明有必要的是在测量的代谢产物中至少分析物级别的氨基酸、酰基肉毒碱和生物源的胺被包括。在存在同位素标记的内标物时进行定量并通过上述方法测定。适合作为依照本发明待测的代谢产物的包括分析物的缩写(BC码)的分析物的列表在以下表格中被表示。
表1：氨基酸(μM)
Ala 丙氨酸
Arg 精氨酸
Asn 天冬酰胺
Asp 天冬氨酸
Cys 半胱氨酸
Gln 谷氨酰胺
Glu 谷氨酸
Gly 甘氨酸
His 组氨酸
Ile 异亮氨酸
Leu 亮氨酸
Lys 赖氨酸
Met 蛋氨酸
Orn 鸟氨酸
Phe 苯丙氨酸
Pro 脯氨酸
Ser 丝氨酸
Thr 苏氨酸
Trp 色氨酸
Tyr 酪氨酸
Val 缬氨酸
表2：酰基肉毒碱(μM)
BC码 分析物
C0 肉毒碱(游离)
C2 乙酰基肉毒碱
C3 丙酰基肉毒碱
C3：1 丙烯酰基肉毒碱
C3-DC 丙二酰基肉毒碱
C3-DC-M 甲基丙二酰基肉毒碱
C3-OH 羟基丙酰基肉毒碱
C4 丁酰基肉毒碱/异丁酰基肉毒碱
C4：1 丁烯酰基肉毒碱
C4：1-DC(C10) 富马酰基肉毒碱(癸酰基肉毒碱)
C4-OH 3-羟基丁酰基肉毒碱
C5 异戊酰基肉毒碱/2-甲基丁酰基肉毒碱/戊酰基肉毒碱
C5：1 甲基巴豆酰基肉毒碱/3-甲基巴豆酰基肉毒碱
C5：1-DC(C11) 戊烯二酰肉毒碱/新乌头酰肉毒碱(十一酰基肉毒碱)
C5-DC(C6-OH) 戊二酰基肉毒碱
C5-M-DC 甲基戊二酰基肉毒碱
C5-OH 3-羟基异戊酰基肉毒碱/3-羟基-2-甲基丁酰基
C6 己酰基肉毒碱[己酰基肉毒碱]
C6：1 己烯酰基肉毒碱
C6-OH 羟基己酰基肉毒碱[羟基己酰基肉毒碱]
C7 庚酰基肉毒碱[庚酰基肉毒碱]
C7-DC 丁酰胺基肉毒碱Pimelylcarnitine
C8 辛酰基肉毒碱[辛酰基肉毒碱]
C8：1 辛烯酰基肉毒碱
C8-DC 辛二酰基肉毒碱[环庚基肉毒碱]
C9 壬酰基肉毒碱[壬酰基肉毒碱]
C10(C4：1-DC) 癸酰基肉毒碱[癸酰基肉毒碱](富马酰基肉毒碱) tine)
C10：1 癸烯酰基肉毒碱
C10：2 癸二烯酰基肉毒碱
C10-DC 癸二酰基肉毒碱[癸二酰基肉毒碱]
C11(C5：1-DC) 十一酰基肉毒碱(戊烯二酰基肉毒碱/MesaconylCarnitine)
C12 十二烷基肉毒碱[月桂基肉毒碱]
C12：1 十二烯基肉毒碱
C12-DC 十二烷二酰基肉毒碱
C14 十四酰基肉毒碱[肉豆蔻基肉毒碱]
C14：1 十四烯酰基肉毒碱[肉豆蔻烯基肉毒碱]
C14：1-OH 3-羟基十四烯酰基肉毒碱[3-羟基肉豆蔻烯基肉毒碱]
C14：2 十四二烯酰基肉毒碱
C14：2-OH 3-羟基十四二烯酰基肉毒碱
C14-OH 3-羟基十四基肉毒碱[羟基肉豆蔻基肉毒碱]
C16 十六酰基肉毒碱[棕榈酰基肉毒碱]
C16：1 十六烯酰基肉毒碱[棕榈烯酰基肉毒碱]
C16：1-OH 3-羟基十六烯酰基肉毒碱[3-羟基棕榈烯酰基肉毒碱
C16：2 十六烷二烯酰基肉毒碱
C16：2-OH 3-羟基十六烷二烯酰基肉毒碱
C16-OH 3-羟基十六酰基肉毒碱[3-羟基棕榈酰基肉毒碱]
C18 十八酰基肉毒碱[硬脂酰基肉毒碱]
C18：1 十八烯酰基肉毒碱[硬脂烯酰基肉毒碱]
C18：1-OH 3-羟基十八烯酰基肉毒喊[3-羟基硬脂烯酰基肉毒碱]
C18：2 十八烷二烯基肉毒碱[亚油醇基肉毒碱]
C18：2-OH 3-羟基十八烷二烯基肉毒碱[3-羟基亚油醇基肉毒碱]
表3：生物源的胺(μM)
BC码 分析物
ADMA 非对称的二甲基精氨酸
SDMA 对称的二甲基精氨酸
总DMA 总二甲基精氨酸
Histamine 组胺
MetSO 蛋氨酸亚砜
Kynurenine 犬尿酸
Hydroxykynurenine 羟基犬尿酸
PutresCine 腐胺
Spermidine 亚精胺
Spermine 精胺
Serotonin 血清素
Creatinine 肌酸酐
表4：磷酸卵磷脂(μM)
表5：鞘磷脂(μM)
BC码 分析物
SM(OH)C14：1 有酰基残基总C14：1的羟基鞘磷脂
SM(OH)C16：1 有酰基残基总C16：1的羟基鞘磷脂
SM(OH)C22：1 有酰基残基总C22：1的羟基鞘磷脂
SM(OH)C22：2 有酰基残基总C22：2的羟基鞘磷脂
SM(OH)C24：1 有酰基残基总C24：1的羟基鞘磷脂
SM C14：0 有酰基残基总C14：0的鞘磷脂
SM C16：0 有酰基残基总C16：0的鞘磷脂
SM C16：1 有酰基残基总C16：1的鞘磷脂
SM C18：0 有酰基残基总C18：0的鞘磷脂
SM C18：1 有酰基残基总C18：1的鞘磷脂
SM C20：2 有酰基残基总C20：2的鞘磷脂
SM C22：3 有酰基残基总C22：3的鞘鳞脂
SM C24：0 有酰基残基总C24：0的鞘鳞脂
SM C24：1 有酰基残基总C24：1的鞘磷脂
SM C26：0 有酰基残基总C26：0的鞘磷脂
SM C26：1 有酰基残基总C26：1的鞘磷脂
表6：前列腺素(nM)
BC码 分析物
9S-HODE (±)9-羟基-10E，12Z-亚油酸
13S-HODE 13(S)-羟基-9Z，11E-亚油酸
14(15)-EpETE (±)14(15)-环氧-5Z，8Z，11Z，17Z-二十碳四烯酸
12S-HETE 12(S)-羟基-5Z，8Z，10E，14Z-二十碳四烯酸
15S-HETE 15(S)-羟基-5Z，8Z，11Z，13E-二十碳四烯酸
15S-HpETE 15(S)-过氧氢-5Z，8Z，11Z，13E-二十碳四烯酸
LTB4 白细胞二烯B4
5S-HpETE 5(S)-过氧氢-6E，8Z，11Z，14Z-二十碳四烯酸
TXB2 血栓素B2
LTD4 白细胞三烯D4
DHA 二十二碳六烯酸
PGE2 前列腺素E2
8-iso PGF2a 8-异前列腺素F2alpha
PGF2a 前列腺素F2alpha
6-keto-PGF1a 6-酮基前列腺素F1alpha
PGD2 前列腺素D2
AA 花生四烯酸
表7：糖(μM)
*)己糖相关的测量
人工制品
表8：胆汁酸(nM)
BC码 分析物
CA 胆酸
CDCA 鹅脱氧胆酸
DCA 脱氧胆酸
GCA 葡糖胆酸
GCDCA 葡糖鹅脱氧胆酸
GDCA 葡糖脱氧胆酸
GLCA 葡糖石胆酸
GLCAS 葡糖石胆酸硫酸盐
GUDCA 葡糖熊脱氧胆酸
LCA 石胆酸
TCA 牛磺胆酸
TCDCA 牛磺鹅脱氧胆酸
TDCA 牛磺脱氧胆酸
TLCA 牛磺石胆酸
TLCAS 牛磺石胆酸硫酸盐
TUDCA 牛磺熊脱氧胆酸
UDCA 熊脱氧胆酸
表9：来自能量代谢的代谢产物(μM)
此外本发明还涉及适于实施所述方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含设备，该设备包含一个或多个孔和一个或多个用至少一种内标物浸渍的插入物。此设备详细描述于WO2007/003344和WO2007/003343中，这些申请通过引用结合至本文。
如下实施例进一步阐明了本发明而不会预期以任何方式限制该范围。
实施例
在肾脏疾病的不同阶段之间已进行比较，并且也将糖尿病肾病与其他慢性肾脏疾病比较。
通用资料
患有CKD阶段3-5的糖尿病患者(正式阶段1-3为此处所有包含在称作阶段3的阶段)和患有CKD阶段3-5的非糖尿病患者，的六个群的分别的尿(57)和血浆(76)样品，于蒙彼利埃大学医院被收集。靶向的代谢组学被用于定量来自血浆的约320种代谢产物，和来自尿的300种代谢产物，包括以下类别：氨基酸、生物源的胺、多胺、酰基肉毒碱、磷酸卵磷脂、还原的单糖和寡糖、鞘磷脂、类花生酸、胆汁酸和能量代谢中间物(如上述定义的)，在同位素标记的内标物存在下进行，并通过有多重反应检测(MRM)FIA-和HPLC-串联质谱使用有电喷射离子化的Sciex4000QTrap测定。此外，160中脂肪酸在血浆中通过GC-MS/MS定量。将数据组用无监督的主成分分析(PCA)和监督的偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)使用MarkerView软件(生命技术(Life Technologies))进行分析。
分析P/U和U：
在以下两种患者中都进行分析：其中血浆和尿是可用的(即57；“分析P/U”)以及也仅使用血浆样品(即76；“分析F”)，因此显示标记物可以血浆和尿的组合工作，但也可以仅在血浆中测量。进行不同的比较以评估用于CKD的生物标记物，但也用于了解是否在糖尿病肾病和其他肾脏疾病之间的不同可被区别开。因此，在所有患者中CKD的较低和较高阶段之间进行比较，但也分别地在糖尿病患者和非糖尿病患者中进行。
术语定义：
(1)上调和下调：上调是指在代谢产物浓度方面增加，例如，在该生物化学反应发生的速率由于例如酶活性改变的增加。对于下调是相反的方面。
(2)t-检验：t-检验是统计假设检验，并且使用的那种是整合至MarkerView软件中的那种，并且应用于表格中的每种变量并检测给定标准差及样品数量是否对于每组的平均值为显著不同，例如用于发现在两个不同组的均值(平均值)之间是否有真正差异。
(3)p-值：p-值是得到至少如实际观察到那种的极端的结果的可能性，假定零假设(没有变化或影响的假设)为真。P-值总是正的且该值越小作为改变发生的可能性越低。0.05或更少p-值在5％水平拒绝零假设，这意指仅5％的时间该变化是偶发事件。这是在我们的表中设定的水平。
(4)对数-倍数变化：对数-倍数变化被定义为每种条件下平均对数转变浓度之间的差异。这是描述在一组与另一组比较时该值高出或低于多少的方法。例如，0.3的对数-倍数变化“等于”exp(.3)＝1.34倍变化增加，与对照(较健康的组)比较。此外，-0.3的对数-倍数变化“等于”exp(-.3)＝0.74＝(1/1.34)倍变化增加，与对照比较，或与疾病比较1.34的减少倍数变化。
结果：
上述测量的结果概述于以下表10-27中。表10-18涉及“分析P/U”且表19-27涉及“分析P”。这些表中，p-值用MarkerView软件中使用的标准t-检验获得。正的对数倍数代表在较高阶段中代谢产物的上调，反之亦然。缩写为：D,糖尿病患者；ND，非糖尿病患者；AC，酰基肉毒碱；BN，生物源的胺；SM，鞘磷脂；TFA，总脂肪酸；FFA，游离脂肪酸；PC，磷酸卵磷脂；OA，有机酸；BN，生物源的胺；“分析P/U”
表10：在CKD的阶段4和3中比较的高度显著的和显著的上调和下调的代谢产物。
表11：在CKD的阶段5和阶段4中比较的高度显著的和显著的上调和下调的代谢产物。
表12：在CKD的阶段5和阶段3中比较的高度显著的和显著的上调和下调的代谢产物。
表13：在糖尿病患者中CKD的阶段4和阶段3中比较的高度显著的和显著的上调和下调的代谢产物。
表14：在糖尿病患者中CKD的阶段5和阶段4中比较的高度显著的和显著的上调和下调的代谢产物。
表15：在糖尿病患者中CKD的阶段5和阶段3中比较的高度显著的和显著的上调和下调的代谢产物。
表16：在非糖尿病患者中CKD的阶段4和阶段3中比较的高度显著的和显著的上调和下调的代谢产物。血浆/对数-倍数变化
表17：在非糖尿病患者中CKD的阶段5和阶段3中比较的高度显著的和显著的上调和下调的代谢产物
表18：在非糖尿病患者中CKD的阶段5和阶段3中比较的高度显著的和显著的上调和下调的代谢产物。
”分析P”
表19：在CKD的阶段4和3中比较的高度显著的和显著的上调和下调的代谢产物。
表20.在CKD的阶段5和阶段4中比较的高度显著的和显著的上调和下调的代谢产物。
表21：在CKD的阶段5和阶段3中比较的高度显著的和显著的上调和下调的代谢产物。对数-倍数变化
表22.在糖尿病患者中CKD的阶段4和阶段3中比较的高度显著的和显著的上调和下调的代谢产物。
表23：在糖尿病患者中CKD的阶段5和阶段4中比较的高度显著的和显著的上调和下调的代谢产物
表24：在糖尿病患者中CKD的阶段5和阶段3中比较的高度显著的和显著的上调和下调的代谢产物
表25：在非糖尿病患者中CKD的阶段4和阶段3中比较的高度显著的和显著的上调和下调的代谢产物。
表26：在非糖尿病患者中CKD的阶段5和阶段3中比较的高度显著的和显著的上调和下调的代谢产物。
表27：在非糖尿病患者中CKD的阶段5和阶段3中比较的高度显著的和显著的上调和下调的代谢产物。对数-倍数变化
工业实用性
本发明使得能够以改进的方式以及在疾病的早期阶段预测和诊断肾脏疾病，并使得能更敏感地检测肾脏中的病理学改变。事实上，依照本发明的生物标记物在生物学样品中是容易地被检测的，特别在血液和/或在尿中，它们的水平与肾脏疾病/损伤的程度始终关联，且它们的水平改变。此外，依照本发明的生物标记物在基本方法中也是有价值的，所述基本方法中例如它们可适当评估动物模型中或在I期临床试验中的肾毒性。换句话说，它们也适合于评估临床前的和临床的肾毒性，即，也在药物研发的非常早期阶段，意即在动物模型中或在I期临床试验中。
基于此有可能制备适合为有助于更可靠地诊断肾脏疾病，特别是CKD和DN的发生，并检测它们的进展的试剂盒。
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Claims (4)

1.用于评估慢性肾脏疾病的代谢的生物标记物组，其中所述生物标记物组包含至少两种氨基酸，至少两种酰基肉毒碱和至少两种生物源的胺，其中所述氨基酸、所述酰基肉毒碱和所述生物源的胺选自说明书的表10至表27中的任一表。
2.权利要求1的生物标记物组，所述生物标记物组还包含SDMA/精氨酸比，瓜氨酸/精氨酸比，鸟氨酸/精氨酸比和/或蛋氨酸亚砜/蛋氨酸比。
3.权利要求1或2的生物标记物组，所述生物标记物组还包含一种或多种选自以下的代谢产物：多胺、磷酸卵磷脂、还原的单糖和寡糖、鞘磷脂、类花生酸、胆汁酸，和磷酸化的糖，单价、二价、三价有机酸，和核苷酸，其中所述代谢产物选自说明书的表10至表27中的任一表。
4.权利要求1或2的生物标记物组，其中所述氨基酸选自Cit、Phe、Asn、Trp、His、Orn、Tyr、Met、Ala、Arg、Thr、Lys、Gln、Ser、Val、Glu和Pro，所述酰基肉毒碱选自CO、C5-DC(C6-OH)、C5:1-DC、C8、C9、C10、C10:1、C14:l和C18:l，所述生物源的胺选自MetSO、肌酸酐、SDMA、ADMA、总DMA和血清素。
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