KR101361038B1

KR101361038B1 - 신장 이식 후 환자의 뇨 시료로부터 사구체여과율을 예측하는 방법

Info

Publication number: KR101361038B1
Application number: KR20130018876A
Authority: KR
Inventors: 김용림; 윤영란; 서정주
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2013-02-21
Filing date: 2013-02-21
Publication date: 2014-02-12
Also published as: US20140235503A1

Abstract

본 발명은 이식 후 신기능 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 신장 이식 후 환자의 뇨 시료로부터 선별된 주요 5개의 뇨 대사체들의 정규화된 강도를 측정한 후 계산식에 대입하여 예측된 사구체여과율을 계산함으로써 사구체여과율(GFR)을 예측하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 주요 뇨 대사체들을 이용하여 이식 후 신기능 예측에 필요한 정보를 빠르고 정확하게 제공할 수 있는 사구체여과율을 예측하는 방법을 제안한다. 본 발명에서 선별된 대사체들은 사구체여과율과의 근접한 상호관계 및 기능적 관련성 때문에 종래 알려진 개별 마커들 보다 이식 거부반응의 검출에 더 민감하고 정확하게 이용될 수 있다. 따라서 본 발명의 예측방법을 이용하여 이식 동안 이식 거부반응 뿐만 아니라 신기능을 효과적으로 모니터하고 예측할 수 있다.

Description

신장 이식 후 환자의 뇨 시료로부터 사구체여과율을 예측하는 방법 {Prediction method of glomerular filtration rate from urine samples after transplantation}

본 발명은 이식 후 신기능 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 신장 이식 후 환자의 뇨 시료로부터 선별된 주요 5개의 뇨 대사체들의 정규화된 강도를 측정한 후 계산식에 대입하여 예측된 사구체여과율을 계산함으로써 사구체여과율(glomerular filtration rate, GFR)을 예측하는 방법에 관한 것이다.

현재 신장학에서 도전 과제 중 하나는 충분한 특이성(specificity)과 민감성(sensitivity)이 부족하고, 손상이 충분히 역전될 수 없는 단계에서 질병 과정을 탐색하는, 제한된 세트의 확정된 임상 진단 마커이다 (J Am Soc Nephrol 2005;16(7):1886-1903). 신이식 수혜자(recipients)에서 일차 추정의 대리결과 변수(surrogate endpoint)를 폭넓게 고려한, 혈청 크레아티닌을 이용하여 추산된 GFR 조차도, 신기능의 한 측면만 측정하기 때문에 높은 특이성과 감수성을 갖지 못하는 주요 한계를 가지고 있다 (Stevens LA, et al., Med Clin North Am 2005;89(3):457-473). 또한, 신기능이 영향을 받지 않는다면, 크레아티닌 모니터링은 이식에 따른 손상을 검출하지 못할 것이다 (Edelstein CL, et al., Biomarkers in kidney disease. 1st ed. Amsterdam; Boston: Academic Press/Elsevier, 2011). 따라서 이러한 한계를 극복하고 신기능 이상을 초기에 검출하기 위해, 정확하고 민감한 비-침투적인 저비용의 바이오마커 개발이 동종이식 기능(allograft function)의 평가에 대한 고려해야할 가치이어야 한다.

한편, 사구체여과율은 신기능을 평가할 수 있는 여러 방법 중에서 신기능을 가장 잘 반영하는 것으로 알려져 있다 (Campens D, et al., Int J Technol Assess Health Care 1997;13:343-56). 사구체여과율을 정확히 측정하기 위해서는 사구체에서 100% 여과된 후 세뇨관에서 재흡수나 분비되지 않으며, 신장을 통해서만 배설되는 물질인 이눌린 (inulin)이나 ⁵¹Cr-EDTA, 99MTC-labeled diethylenetriamine, iohexol 등을 통해 측정하는 것이 가장 이상적이지만 이 방법들은 시간이 많이 걸리고 검사 방법도 복잡하여 임상에서는 쉽게 사용할 수가 없다 (Kim KJ, et al., J Korean Soc Pediatr Nephrol 2007;11:161-7; Stevens LA, et al., Am J Kidney Dis 2008;51:S77-82). 현재 사구체여과율을 측정하기 위해 임상에서 가장 많이 사용하는 방법은 24시간 소변 검사를 통해 크레아티닌 청소율(creatinine clearance, Ccr)을 측정하는 것과 시스타틴(cystatin) C를 이용하는 것이다. 하지만 실제적으로 24시간 동안 소변을 모아서 크레아티닌 청소율을 측정하는 것은 환자의 일상생활에 불편을 초래 하는 경우가 많다. 따라서 혈중 크레아티닌을 이용하여 간편하게 사구체여과율을 추정하는 방법을 많이 사용하고 있다. 그러나 혈청 크레아티닌은 하루 중에 정상적인 변동폭이 있고 (Cockcroft DW, et al., Nephron 1976;6:31-41; Russell CD, et al., J Nucl Med 1985;26:1243-1247) 단백질 식사에 의한 변수가 있어서 측정방법 중 가장 부정확하며, 크레아티닌 청소율은 신세뇨관 분비에 의한 오차, 소변을 모으는 과정의 번거로움과 오차, 통원치료중 약물이나 식사에 의한 외인성 크레아티닌의 공급에 의한 변수가 있어서 사구체여과율을 대변하기에는 정확하지 못한 단점이 있다 (Jackson JH, et al., Radiology 1985;154:203-20).

이런 단점을 극복할 수 있는 내부 표지자 중 시스타틴 C가 1985년 처음 제시되었고 크레아티닌 보다 연령, 성별, 근육량, 약물 등에 영향을 적게 받는 등 사구체여과율 추정에 더 우수하다는 연구가 많이 나오면서 그에 대한 임상적 유용성에 대해 여러 연구가 있어왔다 (Stevens LA, et al., N Engl J Med 2006;354:2473-83; Hoek FJ, et al., Nephrol Dial Transplant 2003;18:2024-31). 그러나 이런 사구체여과율을 추정하는 여러 방법들 간에 어느 정도 차이가 있는지에 대해 실제적인 데이터가 많지 않다 (Hoek FJ, et al., Nephrol Dial Transplant 2003;18:2024-31).

최근, 고효율의 ‘-체학(-omics)’ 기술 및 생물정보학의 장점들로 인하여 개인의 질병 위험을 분석하기 위한 더 특이적인 주요 바이오마커들이 발견되었다 (Kaddurah-Daouk R, et al,, Annu Rev Pharmacol Toxicol 2008;48:653-683). 대사체학(metabolomics)은 반응(event) 후 수초 또는 수분 내 발생하는 대사체들(크기 1 kDa 미만)의 (선입견이 없는) 모든 가능한 양적 변화의 측정을 포함하여 외부 자극 또는 질병에서 발생하는 분자 메커니즘에서 변화의 종합적인 그림을 제공한다 (Vinayavekhin N, et al., ACS Chem Biol 2010;5(1):91-103). 따라서 이러한 접근은 임상 성과와, 거부반응, 약물 독성, 지연된 이식 기능 및 감염과 같은 신이식 후 신장 이상반응(adverse renal events)을 모니터하는 더 확실한 바이오마커를 찾기 위한 특이적이고 민감한 도구를 제공한다 (Sarwal MM. Curr Opin Organ Transplant 2009;14(5):544-551).

이전의 대사체 연구들은 손상된 이식의 개별 단일 대사체 바이오마커들을 동정하는데 초점이 맞춰져 있지만, 이러한 대사체들은 이식 동안 신기능을 모니터링하는데 특이적이지 않고 (Sreekumar A PL, et al., Nature 2009;457:910-914) 시간이 지남에 따라 신기능과 관련된 대사체 프로파일에서 정량적 변화를 확인하는 그들의 능력에 대해 아직 충분히 밝혀지지 않았다. 본 발명자들의 이전 연구(Phapale PB KS, et al., Kim YL, et al., Clin Pharmacol Ther 2010;87(4):426-436)에서, 액체 크로마토그래피-질량분석(LC/MS)을 이용한 종합적인 뇨 대사체 프로파일링을 통해 면역억제제의 약물동력학(pharmacokinetics) 예측을 위한 대사체 표현형을 확인하였으며, 이는 기존에 보고된 기법들과 통합 데이터 분석보다 더 나은 처리량(throughput) 및 적용범위(coverage)를 제공한다. 따라서 본 발명에서는 신기능의 예측을 위한 종합적이고 특이적인 대사체 마커들을 동정할 목적으로 신이식 환자에 대해 이러한 LC/MS-기반 종합 대사체 분석과 신규한 통합 접근법을 적용하였다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 개별 단일 대사체 바이오마커가 신기능 모니터링에 특이적이지 않고 정량적 변화를 확인하는 능력이 낮은 단점을 해결하기 위해, 이식 후 신기능 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 신장 이식 후 환자의 뇨 시료로부터 주요 대사체들의 정규화된 강도를 측정하고 측정된 값을 예측 식에 대입함으로써 사구체여과율(GFR)을 예측하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 이식 후 신기능 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 신장 이식 후 환자의 뇨 시료로부터 하기 단계들을 통해 사구체여과율(GFR)을 예측하는 방법을 제공한다:

(1) 환자의 뇨 시료로부터 뇨 대사체들 중 5a-안드로스트-3-엔-17-원(AS), 글리코콜산(GC), 스핑코신(SG), 트립토판(TR) 및 히스티딘(HT)에 대해, LC/MS 분석을 이용하여 피크 강도(peak intensity)를 측정하는 단계;

(2) 상기 피크 강도를 분위수 정규화(quantile normalization) 알고리즘을 이용하여 log₂ 정규화를 시행하여 정규화된 대사체 강도(normalized metabolite intensity)를 구하는 단계; 및

(3) 상기 정규화된 대사체 강도를 하기 계산식 1에 대입하여 예측 GFR(GFR_Predicted)을 계산하는 단계.

[계산식 1]

GFR_Predicted = 0.45HT + 0.46AS + 0.39TR + 0.54SG + 0.38GC

본 발명에서, 상기 사구체여과율은 신기능을 평가할 수 있는 여러 방법 중에서 신기능을 가장 잘 반영하는 것으로 알려져 있다 (Campens D, et al., Int J Technol Assess Health Care 1997;13:343-56). ‘사구체여과율(glomerular filtration rate, GFR)’이란 체표면적을 기준으로 사구체가 1분 동안 몇 ml를 여과할 수 있는지 나타내는 수치로, 이는 특정 물질들의 혈중농도 및 소변 내 농도를 통해 간접적으로 측정할 수 있다. 상기 사구체여과율은 신 질환의 조직학적 병변 정도 때문에 발생하는 사구체 여과율의 감소 정도를 임상적으로 조기 발견하거나, 신 질환의 진행을 평가하여 치료의 효과와 예후를 결정하고, 말기 신 질환의 투석이나 이식 치료의 판정, 그리고 신장으로 배설되는 약물의 용량을 결정하는데 결정적인 지표로 측정되고 있다. 특히 이식신의 거부반응이나 면역억제제에 의한 신기능의 저하를 조기에 평가하여 적절한 치료를 하는데 유용한 지표로 이용되고 있다.

본 발명의 2가지 중요 발견은, (1) 통합 데이터 분석을 갖는 LC/MS 기법을 이용한 뇨 대사체 프로파일링이 더 종합적이고 특이적인 대사체 표현형을 제공한다는 것과, (2) 이러한 선별된 대사체 표현형을 이용하여 도출된 예측식이 신이식 후 조기 및 장기간 GFR (2년)을 예측하는데 임상적으로 적용가능하다는 것이다. 본 발명자들이 확인한 바로는, 시간이 지남에 따라 신기능과 관련된 대사체 프로파일들에서 정량적 변화를 밝혀내기 위한 통합 대사체학 분석에 관해서는 본 발명이 최초이다.

우선 LC/MS-기반 대사체학 분석을 적용하여 신이식 후 뇨에서 생화학적 변화들을 모니터하고 뚜렷한 병리생리학적 손상 전 이식 기능(graft function)의 정량을 분석하였다. 신기능에서의 변경이 몇몇 대사 경로 및 뇨에서 대사체의 농도에 영향을 미치기 때문에, 뇨는 신이식에서 대사체학 연구에 대한 이상적인 생체시료(bio-fluid)로 간주된다 (Chan W WM, et al., J Nutr 1974;104(6):678-683). 따라서 뇨를 이용한 대사체학은 바이오마커 발견을 위한 다른 ‘-체학’을 넘어 현저한 장점을 가지므로 이식 기능을 모니터할 수 있다. 또한 LC/MS 기법은 뇨 대사체 전체 및 이식 전후 대사체들의 양적 변화의 상당한 부분을 확인하기 위한 기여 요인(contributing factor)을 가지고 있다.

단일 대사체 또는 개별 바이오마커는 실험적, 생리학적 변이에 민감할 수 있기 때문에 신기능에 대해 특이적이지 않을 수 있다. 예들 들어, 뉴크레오시드 농도 또는 퓨린 대사에서의 변화들은 신기능 뿐만 아니라 암 발병(cancer conditions)에서도 변경으로 발생할 수 있다 (Reynaud C BC, et al., Cancer Lett 1992; 61(3):255-262). 따라서 특이적인 화합물 보다, 의학적 이상을 모니터하기 위한 바이오마커의 특이적 패턴이 실질적으로 필요하다 (Lindon JC, et al., Biomarkers 2004;9(1):1-31). 왜냐하면, 대사체 네트워크 분석은 개별 마커 측정 보다 질병 마커의 더 나은 종합적인 생물학적 정보를 제공하고 PLS(partial least squares) 모델은 5개 대사체로 대표되는 대사 경로의 상대적 기여도에서 차이를 제공하기 때문에, 이러한 통합적인 접근법은 단일 대사체 또는 바이오마커와 관련된 신기능을 예측하고 모니터하기 위한 더 정확하고 특이적인 대사체들을 찾는데 기여한다.

본 발명에서는 GFR의 예측과 모니터링을 위한 5개의 대사체들을 선별하였다. 이들 대사체 및 그들의 연관 경로는 이식 후 풍부하게 되었다. 이들 대사체는 아미노산과 관련 물질대사(TR 및 SG), 히스티딘 물질대사(HT) 및 담즙산과 스테로이드 물질대사(AS 및 GC)와 같은 특이적 생화학적 경로에 연결되어 있었다. 면역-조절 기능을 갖는 트립토판은 이식 후 염증의 정상 생리학 또는 병리학의 변화에 의해 증가하는 것으로 보인다 (Sadeghi M, et al., Human immunology 2012;73(2):186-192). 또한, 히스티딘은 손상된 신장에서 그것의 항염증 및 항산화 효과로 인해 이식 후 증가될 수 있다 (Watanabe M SM, et al., Am J Clin Nutr 2008;87(6):1860-1866). 동물 연구에서, 글리코콜산은 급성 동종이식 거부반응 후 신기능의 회복에 따라 증가되었고 (Fang W, et al., Muscle & nerve 1997;20(3):286-292), 신장 생리학의 조절자로 잘 알려진 스핑코신은 염증과 면역을 포함하여, 세포 사멸의 다양한 경로를 조절하기 때문에 이식 후 증가되었다 (Park SW, et al., J Am Soc Nephrol 2012;23(2):266-280).

담즙산과 스테로이드 물질대사로부터 유래된 대부분의 대사체들은 이식 후 풍부하게 되었다. 비록 이식 후 머지않아 외인성 스테로이드(예컨대, 메틸프레드니솔론)의 투여량을 증가시켰더라도, 스테로이드의 농도는 이식 후 면역반응의 변화들과, 스테로이드의 생성에 필수적인 시토크롬 P450 및 AKR1D1(delta4-3-oxosteroid 5beta-reductase)과 같은 효소들로 인하여 증가되었다 (Ron Caspi HF, et al., Nucleic Acids Res 2008;36:D623D631). 따라서 본 발명에서는, 이식 후 스테로이드와 답즙산의 증가된 농도가 성공적인 신기능 회복을 나타내었다. 이와 같이, 스테로이드와 담즙산은 신이식 모니터링에 대한 잠재적인 새로운 마커가 될 수 있다. 또한 본 발명자들은 이식 전 샘플에서 히드록시옥타데카디에노산(hydroxyoctadecadienoic acid), 디메틸아르기닌(dimethylarginine), L-티로신(L-tyrosine), 베타인(betaine), 구아니디노아세테이트(guanidinoacetate), 구아니디노숙신산(guanidinosuccinic acid), 호모시스테인(homocysteine)과 같은 몇몇 다른 대사체들에서 증가를 추정적으로 확인하였다 (데이터 미도시). 이들 마커는 이식 전 신기능 장애의 중요 마커로서 보고되어 있지만 (Wishart DS. Curr Opin Nephrol Hypertens 15 2006;15:637-642) GFR 예측에 대한 낮은 중요도 때문에(VIP < 1.3) 본 발명의 PLS 모델에서는 제외되었다.

더불어, 본 발명은 조기 및 장기 GFR 예측을 위한 선별된 대사체 표현형들로부터 도출된 식의 유용성을 확인하였다. 다른 GRF-평가 식은 단일 시점에서 개발되고 입증되었으며 추산된 GFR에서는 오차가 발생할 수 있다 (Stevens LA, et al., Current opinion in nephrology and hypertension 2010;19(3):298-307). 그러나 본 발명의 예측 식은 신이식 후 2년까지 시간이 지남에 따라 좋은 성과를 나타내었다. 이와 같이, 이들 뇨 대사체 표현형들은 신이식 후 GFR에서의 변화를 예측하기 위한 합리적이고 임상적으로 적용 가능한 바이오마커가 될 수 있다.

그러나 본 발명자들은, 트리메틸아민 N-옥사이드(trimethylamine N-oxide, TMAO), 베타인, 구연산염(citrates) 및 아민(amines)과 같은, 이전에 보고된 NMR 및 GC/MS에 의한 이식 거부를 모니터링하기 위한 바이오마커들을 측정할 수 없었다. 왜냐하면, 1) (스테로이드와 같은) 대사체들의 서로 다른 클래스를 밝혀낼 수 있는 다른 방법들과 LC/MS 사이의 대사체학 수렴(metabolome convergence)에서 고유한 차이점(inherent differences), 그리고 2) 정상 동종이식 기능을 갖는 안정한 뇨 샘플을 이용하는 것 때문이다. 본 발명의 결과는 거부반응이 없는 안정한 동종이식 기능에 기초하지만, 선별된 5개 대사체들은 GFR과의 근접한 상호관계 및 기능적 관련성 때문에 이식 거부반응의 조기 검출에 사용될 수 있다. 이와 같이, 이들 마커는 개별 마커들 보다 이식 거부반응의 검출에 더 민감하고 정확하며 의미 있는 것이다. 그 단계들은 다음과 같다: (1) 임상 실험에서 종래 분석법(O. N. J Chromatogr A 2001;935(1-2):267-278) 및 단일 크로마토그래피 기법(Turnell DC CJ. et al., Clin Chem 1982;28(3):527-531)을 이용한 선별된 5개 대사체들의 피크 강도를 측정, (2) 값들을 정규화한 후 제시된 식에 대입하여 평균과 유닛 변수(unit variance)를 제로가 되게 한다. 이러한 접근법은 GFR에 대한 정규화된 값을 산출하여 이식 동안 이식 거부반응 뿐만 아니라 신기능을 모니터하고 예측할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 사구체여과율을 예측하는 방법을 구현하는 프로그램을 기록한 컴퓨터로 판독 가능한 기록매체를 제공한다. 상술한 신장 이식 후 환자의 뇨 시료로부터 사구체여과율을 예측하는 방법은 컴퓨터에 의하여 수행될 수 있으며, 컴퓨터에서 실행하기 위한 프로그램을 기록하는 컴퓨터 판독 가능한 기록매체에 기록될 수 있다.

구체적으로, 컴퓨터에서 실행하기 위한 프로그램은 환자의 뇨 시료로부터 뇨 대사체들 중 5a-안드로스트-3-엔-17-원(AS), 글리코콜산(GC), 스핑코신(SG), 트립토판(TR) 및 히스티딘(HT)에 대해, LC/MS 분석을 이용하여 피크 강도(peak intensity)를 측정하는 측정부; 측정된 피크 강도를 입력하는 정보입력부; 입력된 피크 강도를 분위수 정규화(quantile normalization) 알고리즘을 이용하여 log₂ 정규화를 시행하여 정규화된 대사체 강도(normalized metabolite intensity)를 구하고 정규화된 대사체 강도를 사전에 입력된 하기 계산식 1에 따라 계산하는 정보처리부; 및 처리된 정보를 판독하는 정보판독부로 구성된다.

[계산식 1]

GFR_Predicted = 0.45HT + 0.46AS + 0.39TR + 0.54SG + 0.38GC

상기 측정부는 소정의 뇨 시료로부터 대사체의 피크 강도를 측정하기 위해 LC/MS 분석기기와 연결되어 있거나 그와 동일한 분석방법이 구현된 측정 장치를 포함할 수 있다.

상기 정보입력부는, 상기 측정부에서 측정된 데이터 값이 자동 저장되거나 임의의 입력장치를 통해 정보처리부로 전송될 수 있다.

상기 정보처리부는, 본 발명에 따른 GFR 예측식은 당해 분야의 컴퓨터 프로그래머에 의하여 용이하게 작성되어 저장되어 있고 입력받은 피크 강도의 정규화 데이터 값을 상기 예측식에 대입하여 계산하게 된다.

상기 정보판독부는, 정보처리부로부터 얻은 예측 GFR 값을 사용자가 모니터등을 통해 식별하고 판독할 수 있도록 디스플레이한다.

상기와 같이, 본 발명의 사구체여과율을 예측하는 방법은 컴퓨터 프로그램으로 구현이 가능하며 컴퓨터 프로그래머에 의하여 용이하게 제작될 수 있다. 또한, 상기 프로그램은 컴퓨터가 읽을 수 있는 기록매체(readable media)에 저장되고, 컴퓨터에 의하여 읽혀지고 실행됨으로써 이식 후 신기능 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 구현한다. 상기 기록매체는 자기 기록매체, 광 기록매체, 및 캐리어 웨이브 매체를 포함한다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명은 주요 뇨 대사체들을 이용하여 이식 후 신기능 예측에 필요한 정보를 빠르고 정확하게 제공할 수 있는 사구체여과율을 예측하는 방법을 제안한다. 본 발명에서 선별된 대사체들은 사구체여과율과의 근접한 상호관계 및 기능적 관련성 때문에 종래 알려진 개별 마커들 보다 이식 거부반응의 검출에 더 민감하고 정확하게 이용될 수 있다. 따라서 본 발명의 예측방법을 이용하여 이식 동안 이식 거부반응 뿐만 아니라 신기능을 효과적으로 모니터하고 예측할 수 있다.

도 1은 신 이식 후 뇨 샘플링 시점을 나타낸다.
도 2는 12명의 환자에서 혈청 크레아티닌 농도(a)와 측정된 GFR 값(b)의 이식 전-후 변화를 나타낸다.
도 3은 뇨 샘플을 액체 크로마토그래피-질량분석(LC/MS)하여 무작위 대사체 프로파일링 데이터를 생성하는 과정을 설명한다.
도 4는 환자의 뇨와 품질관리(QC) 샘플들에서 얻은 주성분분석(principle component analysis, PCA) 스코어 플롯(LV1 vs LV2)을 나타낸다. 동일한 분석 배치(batch)에서 검은색 점은 환자의 샘플을, 빨간점은 QC 샘플들을 나타낸다. 13 QC 샘플들(5 initial and 8 throughout the sample sequence)을 환자의 샘플로 분석하였다. 잘 뭉쳐져 있는 QC 샘플은 분석이 유효하고 LC/MS 분석 시 주요 기기편향이 없음을 의미한다.
도 5는 GFR과 높은 상관관계를 갖는 대사체들의 선별을 위한 뇨 LC/MS 대사체 데이터의 PLS 모델링을 나타낸다.
도 5a는 처음 두 개의 잠재변수(latent variables, LVs)에 대한 PLS 스코어 플롯으로, 여기서 각 점은 이식 동안 수집된 환자 뇨 샘플을 나타내고, LC/MS 분석(X 변수)과 측정된 GFR(Y 변수)에서 얻은 대사체 프로파일 데이터로부터 스코어 (또는 계수)로서 구성된다. 첫 번째 LV(LV1)는 세 개의 분리된 그룹(원 표시)을 나타내는, 이식 동안 대사체 프로파일에서 요구되는 변이(화살표)를 나타내고, 두 번째 LV(LV2)는 환자들 사이에 개개인 간의 변이를 나타낸다.
도 5b는 상기 PLS 모델을 위한 PLS 로딩 플롯으로, 각 점은 LC/MS 데이터로부터 검출되고 PLS LV1 대 LV2의 로딩에 대한 GFR과 그들 각각의 로딩(회귀계수)으로서 구성된 대사체 특성 (총 999개)을 나타낸다. 검은색 화살표는 GFR과 양성 상관관계를 나탄내다. 더 큰 로딩 계수 값 (양성 또는 음성)을 갖는 대사체 변수들은 GFR과 매우 높은 상관관계를 가지며 (빨간색 박스로 표시됨; VIP > 1.3) GFR의 동정 및 예측을 위해 선택되었다. 파란색 상향 화살표는 GFR과 양성 상관관계를 갖는 대사체들을 나타내는 반면 빨간색 하향 화살표는 음성 상관관계를 나타낸다.
도 5c는 계수값을 갖는 동정된 현저한 대사체들의 일부 리스트이다.
도 5d는 치환된 모델(좌)로부터 얻은 모든 R² (적합도)와 Q² (모델의 예측가능성) 값이 원래 모델(우측 끝) 보다 더 작음을 나타내는, 우연적 상관관계와 데이터 오버핏(data over-fitting)을 체크하기 위한, 치환 시험에 의해 본 발명의 PLS 모델의 내부 유효성 검증을 나타낸다.
도 6은 모든 999 대사체 변수들을 이용하여 PLS 모델에 의한 예측 GFR 대 관찰된 GFR 값에 대한 교차-검증 플롯이다. 교차-검증은 데이터셋의 1/7^th 배제와 외부 샘플 셋으로서 배제된 데이터를 예측하는 것을 통해 수행하였다.
도 7은 최종 PLS 식에 대한 내부 유효성 플롯은 5개의 대사체 PLS 식이 GFR 예측에 유효함을 나타내는 것이다. 모든 치환된 R2 및 Q2 값 (좌측 끝)이 원래 모델(우측 끝)의 값 이하이고 Y축에서 절편은 -0.136이다.
도 8은 25개 동정된 대사체들에 대한 대사체 네트워크이다. 각 노드는 대사체를 나타내고 노드의 크기는 GRF과의 상관관계 정도에 비례한다. 노드의 경계는 GRF과의 양성(파란색) 및 음성(빨간색) 상관관계에 기초하여 채색하였다. 연결 에지(connecting edges)는 여러 가지 중간물과의 대사체 직접 반응 (실선) 또는 반응가능성 (점선)을 나타낸다; 관련 효소들은 실선 에지 위에 명명됨. 이러한 대사체 네트워크는 노드의 서로 다른 색상으로 나타나는, 주요 3개 대사(metabolism) 모듈에서 구별을 가능하게 한다. 효소 또는 유전자와 경로/반응에 사용된 모든 약어 KEGG 식별자(http://www.genome.jp/kegg/kegg3.html)에 기초한다.
도 9는 이식 동안 현저한 대사체들의 정규화된 강도에서 변화를 나타낸 것이다. HT, histidine; AP, acetylspermidine; TR, tryptophan; AS, 5a-androst-3-en-17one; AM, adenosyl methionine; DC, 3a,7a-Dihydroxy-5b-cholestane; GC, Glychocholic acid; SG, sphingosine; PG, Phenylglycine; KA, Kynuerenic acid; PC, Phosphocreatine; CN, Camosine; DG, Dimethylguanosine
도 9a는 GFR과 양성 상관관계에 있는 동정된 대사체의 일부에 대한 이식 후 일수에 따른 정규화된 강도 변화를 나타낸다 (도 5b에서 파란색 표시).
도 9b는 GFR과 음성 상관관계에 있는 동정된 대사체의 일부에 대한 이식 후 일수에 따른 정규화된 강도 변화를 나타낸다 (도 5b에서 빨간색 표시).
도 10은 이식 후 90일(a) 및 2년(b)까지 관찰된 GFR에 대한 선별된 5개의 대사체들을 이용한 PLS 식으로부터 도출된 예측 GFR(GFR_Predicted)에 관한 산포도(Scatter plot)이다. AS = 5a-androst-3-en-17-one GC = glycocholic acid SG = sphingosine TR = tryptophan; HT = histidine.
도 10a는 5개 대사체 농도만을 이용한 본 발명의 예측식(GFR_Predicted = 0.45HT + 0.46AS + 0.39TR + 0.54SG + 0.38GC)이 이식 후 90일간 GFR을 잘 예측함을 나타낸다.
도 10b는 본 발명의 예측식이 2년까지 GFR 값의 예측에 적합함(R² = 0.5031)을 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실험방법

1) 연구방법과 환자의 자격

전향적 탐구 연구를 하였고 연구 전 동의서를 받은 12명의 신이식을 처음 시행한 환자들을 대상으로 하였다. 18세 이하이거나 이식 전 3개월 내에 울혈성 심부전, 간부전, 종양 또는 전염병, 심장질환, 다기관 이식 또는 이식실패가 예측되는 특이한 임상적 사건이 있었던 사람은 배제하였다. 모든 환자들은 연구기간 동안 타크로리무스(tacrolimus), 코르티코스테로이드(corticosteroids), 및 마이코페노레이트 모페틸(mycophenolate mofetil) 또는 미조리빈(mizoribine)의 삼중 면역억제제 요법을 시행하였다.

2) LC/MS기반 무작위 대사체 프로파일링

무작위의 대사체 프로파일을 분석하기 위해, LC/MS 분석은 하기의 과정에 따라 수행되었다: 뇨 샘플 준비, 풀-스캔(full scan; 50900 m/z ratio of mass to charage) LC/MS 분석, 데이타 전처리(data preprocessing), 피크 검출과 정렬(peak detection and alignment), 피크 강도 정규화(peak intensity normalization), 및 다향성 통계 분석을 위해 데이터 테이블 생성(export annotated peak data table production). 선형 이온-트랩 질량분석기(LXQ; Thermo Electron, Waltham, MA)에 연결된 Alliance HPLC (Waters)로 구성된 LC/MS 분석 시스템을 사용하였다.

3) 뇨 샘플 준비

대사체 분석을 위해, 면역억제제 투여에 앞서 첫 아침 소변을 신 이식 2일 전과 신 이식 후 5, 30, 90일 이후에 수집하였다 (도 1). 단백질 침전에 대한 내부표준(internal standard)으로 브로모페닐알라닌(bromophenylalanine), 튜버시딘(tubercidin) 및 아미트립틸린(amitriptyline)을 포함하는 아세토나이트릴(acetonitrile, Merck, Germany) 400 에 각 소변 샘플 200 을 희석하였다. 소변 샘플은 2000 rpm에서 5분간 원심분리하고 4℃에서 30분간 둔 다음, 그 상층액을 LC/MS 분석에 사용하였다.

4) LC/MS 분석

준비된 샘플의 5 을 LC/MS 시스템에 주입하였다. 뇨 대사체들의 분리는 40℃에서 Kinetex C18 (100×2.1 mm i.d., 2.6 μm particle size) 칼럼을 사용하였다. 수용성 0.1% 포름산(formic acid)(A) 및 아세토나이트릴에 첨가한 0.1% 포름산(B)이 포함된 이동상(mobile phase)은 3분간 10% B에서 순차적 시작을 하는데, 12분간 80% B로 증가시키고, 다시 25분간 90% B로 증가되어, 4분 동안 일정하게 유지되었다. 시스템은 6.5분간 10% B의 출발조건으로 재평형(re-equilibrate)시켜 총 실행시간(runtime)을 35분으로 하였다. 질량분석기는 5 kV의 전자분무 이온화 전압(electro-spray ionization voltage)으로 50-900 m/z이며, 모세관 온도(capillary temperature) 280℃, 시스 가스(sheath gas flow) 20 유닛, 튜브 렌즈(tube lens) 120 V, 모세관 전압(capillary voltage) 35 V로 풀-스캔 양성-이온 모드(full-scan positive-ion mode)로 사용하였다. 체계적 변이(systematic variation)를 피하기 위해, 모든 샘플들은 LC/MS 분석 전에 무작위로 사용하였고 품질관리(QC) 샘플은 모든 샘플들에서 내부표준과 함께 사용하였다.

5) 데이터 전처리, 피크 검출과 정렬

대사체들의 크로마토그램 정보를 다변형 통계분석에 적합한 데이터셋으로 전환하기 위해, 데이터 전처리는 XCMS 소프트웨어 버전 1.22.1을 사용하여 배경분리(background subtractions), 피크 필터링과 검출(peak filtering and detection), 및 피크 정렬(peak alignment)을 포함하여 수행되었다. 이 프로그램은 3차원 LC/MS 데이터(m/z, retention time (T), ion intensity)를 쉽게 처리할 수 있는 2차원 데이터 매트릭스(a pair of m/z and T)로 전환한다. 이러한 처리 스텝은 default XCMS parameter들을 사용하여 다음과 같이 이루어진다 (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/xcms.html): 0.1 m/z for peak picking, peak-width at half-maximum of 30 s, and peak group bandwidth of 10; the signal-to-noise ratio threshold was set to 10. 피크 검출과 XCMS에 의한 de-convolution 후에 각 검출된 대사체 피크는 그것의 m/z와 T에 따라 동정되었다. 블랭크 크로마토그램은 Xcalibur software utility (Thermo Electron)를 사용하여 샘플 크로마토그램에서 background subtraction로 사용되었다. 파일들은 이후 Xcalibur file-converting utility를 사용하여 NetCDF 포맷으로 전환하였다.

6) 데이터 정규화 및 대체

측정된 피크 강도들은 R 언어(R language; version 2.11.1)를 갖는 preprocessCore package (Bolstad B. M. et al., Bioinformatics 2002;19(2):185-193)의 분위수 정규화(quantile normalization) 알고리즘을 이용하여 log2 강도로 정규화함으로써 체계적 변이를 제거하였다. 이후 정규화된 피크 강도는 CSV 파일로 전환하여 독특한 피크 식별자(unique peak identifiers)에 따라 주석달린 피크 데이터(annotated peak data) 표를 만들었다. 본 발명자들은 검출 한계 보다 낮으면서, 해당 대사체 이온에서 관찰되고 간주되는 최소 피크 영역을 갖는 이들 대사체 이온의 낮은 생성량(low abundance)로 인하여, 50% 이상의 결측값(missing value)을 갖는 피크들은 배제하였다. 결국, m/z와 T를 갖는 정규화된 피크 강도를 통계적 분석에 사용하였다. 상기 3개의 내부표준은 모든 샘플들에 포함시켜 임의의 변수들을 보정하였다. 전체 T와 피크 영역 변이(변동계수, CV)는 20%가 넘지 않게 하였다. QC 샘플(CV > 20%)에서 허용불가한 변이를 갖는 피크들과, 약제 또는 약제 대사체들의 m/z에 대응하는 피크들은 전환된 피크 데이타에서 배제하였다.

7) 다변량 데이터 분석

신기능과 예후에 관여하는 가장 중요한 대사체(metabolite)를 찾기 위해, SIMCA P+ software(version 12; Umetrics, Uppsala, Sweden)를 사용하여 PLS(partial least squares) 모델인 감독 다변량 분석(supervised multivariate analysis)을 시행하였다. PLS 모델(Burnham AJ, et al., Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 1999;48:167-180)은, 1) 단일잔류법(leave-one-out approach)을 사용한 교차-검증(cross-validation), 2) 20 치환 시험(20 permutation tests)을 적용한 내부 검증(internal validation), 3) 적합도(R²) 및 예측 능력(Q²)의 비교에 의해 예측에 대한 능력을 증명하기 위해 실증하였다.

8) PLS 모델

PLS 모델은 다변량 X변수의 차원성을 감소시키고 X변수(metabolite profiles)와 Y변수 간의 (GFR) 관계 (latent variables, LVs)의 선상조합을 관찰하여 GFR(glomerular filtration rate)을 예측한다. 따라서 PLS 분석은 대사체들에 대한 회귀계수(regression coefficients; PLS loadings)와 샘플에 대한 PLS 스코어를 정의하는 대사체 변수의 선상 조합에 의한 각 LV에 대한 계수를 만든다. 처음 두 LV들은 높은 예측 능력과 낮은 데이터 변수에 기초해 결정되었으며, 이는 그들의 교차-검증 Q²값과 고유값(eigenvalues)을 설명한다. PLS 모델링 후, 투사에 대한 변수 영향(variable influence on projection, VIP)을 필수적으로 시험하여 GFR에 가장 기여하는 특이 대사체들 또는 그 데이터에서 관찰되는 패턴을 측정하고 분석하였다. 본 발명자들은 VIP 값을 사용하여 PLS 모델에서 GFR과 가장 관련되고 GFR을 예측하는데(VIP > 1.3) 가장 기여하는 대사체 프로파일들을 선별하였다.

9) 대사체 동정

뚜렷한 대사체들(VIP > 1.3)을 선별하기 위해, LC/MS/MS를 기본으로 하는 방법(tandem mass spectrometry)을 적용하여 각각의 m/z와 T에 대한 MS/MS 스펙트럼을 구하였다. 그 후, HMDB (al DSWe. HMDB: Nucleic Acids Res 2007;35:D521D526), Metlin (Smith CAM et al., Ther Drug Monit 2005;27(6):747-751) 및 LIPID MAPS (Foubister V. J Proteome Res 2003;2(3):576)와 같은 참조 대사체 데이터베이스, 및 관련 문헌에 대사체 이온의 MS/MS 스펙트럼을 매칭시킴으로써 후보 대사체들을 동정하였다. 대사체 동정의 결과를 확인하기 위해, 선별된 대사체 이온들과 이들 후보 대사체들의 상업표준(commercial standard)을 비교하였다. 상업표준이 용이하지 않는 경우에는 추정 동정(putative identification)을 수행하였다. 결합 스테로이드(conjugated steroids), 글리세로포스포리피드(glycerophospholipids), 결합 뉴클레오시드(conjugated nucleosides)의 경우, 예측 단편화 패턴(predictive fragmentation patterns)과 T 역시 정확한 이름 보다 그들의 화학적 클래스를 동정한 것으로 간주하였다. 따라서 본 발명자들은 가능한 단편화 반응 메카니즘을 통해 얻은 MS/MS 데이터로부터 화학적 구조를 확인하였다. MS 기법이 가지고 있는 일부 한계와 대사체학 자원의 제한된 이용가능성으로 인해, 선별된 모든 대사체들을 명명할 수는 없었다.

10) 대사체 네트워크 분석

대사체 동정한 다음, Cytoscape (version 2.6.2)와, KEGG (Goto MKaS. KEGG: Nucleic Acids Res 2000;28(1):27-30), HMDB 및 MetaCyc 경로 데이터베이스(Ron Caspi HF, et al., Nucleic Acids Res 2008;36:D623D631), 그리고 다른 문헌(Isabelle Dufort PS, et al., The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology 2001;77(4-5):223-227)을 이용하여 대사체 네트워크를 그렸다. 효소들 또는 유전자들에 대한 모든 약어들은 KEGG 식별자를 사용하였다 (http://www.genome.jp/kegg/kegg3.html).

실시예 1. 환자 특성

12명의 환자 평균나이는 42±10.4 살이며 이식 후 90일까지 관찰하였다. 총환자의 66.7%가 만성 사구체 신염을 가지고 있었으며 90일까지 급성 거부는 없었다. 크레아티닌 레벨에 의해 추산되는 GFR은 8.6±2.57 ml/min/1.73m²에서 80.9±49.86 ml/min/1.73m²로 증가하였고 이식 후 90일에는 88.7±23.82 ml/min/1.73 m² 로 안정화되었다 (도 2 참조). GFR은 신기능을 가장 잘 나타내므로 (Herget-Rosenthal S BA, et al., Clin Biochem 2007;40(3-4):153-161), PLS 분석에서 변수(Y)로 사용하였다. 5일째는 뇨량(urine volume; 평균 1354.8±578.2 ml)이 유의하게 증가하였으며, 이식 후 90일에는 뇨 배출량(urine output)이 870.0±445.98 ml로 안정화되었다.

실시예 2. 신장 이식 전 후 뇨 대사체 프로파일링

12명의 신 이식 환자에서 이식 전후에 수집한 뇨 샘플을 이용하여 무작위 대사체 프로파일을 확보하였다 (도 3 참조). 각 피크 강도(peak-intensity)는 개인의 뇨 대사체를 나타낸다. 뇨 대사체 분석의 크로마토그램은 배경(background)과 외인성(drug) 피크를 제외한 후 치료 시간에 따라 유의한 피크의 차이를 보였다. 약물과 약물 대사체들에 대응하는 피크를 제외한 후, 각각의 강도(피크 영역)를 갖는 내인성(endogenous) 대사체들로부터 대사체 데이터셋으로서 999개 공통 대사체 이온들을 얻었다. 이들의 강도는 뒤이은 다변형 데이터 분석 동안 예측 변수(X)로 사용되었다. 품질관리 값의 주성분분석(principle component analysis, PCA) 플롯(plot)은 LC/MS 프로파일링 분석의 안정성과 재현성이 실험적 또는 기계적 변이에 의한 것이 아니라 환자들의 생리학적 조건에 의해 유발되는 대사체 농도 변화들에서 얻어진다는 것을 확인하였다 (도 4 참조).

실시예 3. GFR 과 높은 상관관계를 갖는 대사체의 선별

PLS 모델을 사용하여 GFR과 가장 높은 상관관계를 갖는 후보 대사체들을 선별하였다. 우선, 높은 적합도(R² = 0.82)와 높은 고유값(LVs에 대해 각각 15.8 및 3.83)으로 표시되는 PLS 분석으로부터 통계적으로 유의한 2개의 LVs (LV1 및 LV2)를 선별하였다. 두 LV들에서 PLS 스코어는 환자 샘플 간에 세 개의 그룹을 보여주고 있다 (도 5a 참조). 화살표에 의해 표시되는 플롯의 궤적(trajectory)은 대사체 프로파일에서 유의한 변화를 나타내는데, 이는 시간이 경과함에 따라 GFR과 잘 연관되어 있음을 나타낸다. 이식 전후 사이의 대사체 변화들은 명확하지만 이식 후 30일과 90일에 모아진 샘플들 간에는 대사체가 겹쳐지는 경향을 보인다. 이러한 경향은 신장이식 후에 신기능이 안정화되어 샘플들 간의 차이가 감소하기 때문인 것으로 보인다. PLS 모델은 높은 예측가능성(high predictability)(Q2=0.702)을 가지며 모두 81.9%의 총 변이(total variation)를 설명하였다. LV2는 대사체 프로파일에서 개개인 간의 변이를 설명하였고(35.6%), LV1은 도 3a에서 화살표로 나타낸 바와 같이 이식 동안의 대사체 변화를 나타낸다(46.3%). 도 5b에서 LV1에 대해 높은 계수값(coefficient values)을 갖는 대사체들은 GFR과 높은 연관성이 있으며 GFR을 예측하는데 기여한다. 파란색 위쪽 화살표는 GFR과 직접 또는 양성 상관관계(positive correlation)를 갖는 대사체들을 나타내며, 빨간색 아래쪽 화살표는 반대 또는 음성 상관관계를 나타낸다.

가장 유의한 대사체들을 분석하기 위해, GFR을 예측하는데 각 대사체의 상대적 중요성을 반영하는 LV1로부터 그들의 VIP 값을 사용하였다. 111개의 선별된 대사체들은 도 3b의 빨간색 박스로 표시하였다 (VIP > 1.3). 이들 대사체의 일부는 신이식 후 대사체 레벨이 증가하는 GFR과 양성 상관관계를 보이는 반면, 다른 것들은 반대경향을 갖는 음성 상관관계를 보이고 있다 (도 6). 도 3c는 GFR과 함께 계수값을 갖는 동정된 유의한 대사체들의 일부 리스트를 보여준다. 일부 VIP 값은 더 높은 신뢰구간(confidence intervals)을 보여주는데 (도 5c 및 도 6), 이는 PLS 모델에 대한 대사체의 가능한 기여가 실험적 변이 때문일 수 있음을 보여주는 것이므로, 이러한 대사체 특성은 이후 분석에서 배제되었다.

랜덤 치환 시험(20 random permutation test)(Fredrik Lindgren BH, et al., Journal of Chemometrics 1998;10(5-6):521-532), 및 7번의 교차-검증(cross-validation)(Svante Wold JT, et al., Some recent developments in PLS modeling Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems 2001;58(2):131-150)으로 내부 검증에 의한 PLS 모델을 확인하였다. 도 5d에 나타난 바와 같이, 치환된 모델(permuted model, 좌측 끝)의 적합도(R²)와 예측가능성(Q²)은 원래 모델(original model, 우측 끝) 보다 훨씬 작다. 또한 -0.05에서 음의 절편(negative intercept)은 이 모델에서 데이터의 오버핏(over-fitting)이 없음을 나타낸다. 데이터셋의 1/7^th 배제를 통해 교차-검증하는 것과, 새로운 모델을 사용해 배제된 샘플들을 예측하는 것은, 15.5 ml/min/1.73 m²의 GFR에 대한 예측의 RMSE(root mean square error)를 제공한다 (도 7). 111개의 선택된 대사체를 사용하여 예측된 모든 GFR 값은 실제 측정된 GFR과 우수하게 일치하였다 (R² = 0.819, 데이터 미도시). 이러한 결과는 PLS 모델의 유효성과 GFR을 예측하기 위한 선택된 대사체 마커들을 보증한다.

실시예 4. GFR 과 관련된 주요 대사체의 동정

선별된 111개의 대사체들(VIP > 1.3)의 화학적 분석을 위해, LC/MS/MS 방법을 사용하였다. 하기 표 1에 나타난 25개 대사체들 가운데 15개 주요 대사체들의 관련된 대사경로가 VIP의 내림차순으로 하기 표 2에 요약되어 있다.

Metabolite	HMDB ID	m/z ( MS→S/ MS )	Retention time ( min )
Creatinine*	HMDB00562	^†114,115 →86	1.3
L-Proline*	HMDB00162	116 →69, 89	1.4
Guanidinoacetate	HMDB00128	118	1.3
Creatine*	HMDB00064	132 →111, 90	1.4
L-Lysine*	HMDB00182	^†146,147 →129, 127,100	1.3
2-Phenylglycine*	HMDB02210	152 →135, 106	1.3
L-Histidine*	HMDB00177	^†156, 157→110	1.2
L-Arginine*	HMDB00517	175 →157, 130	1.2
Citrulline*	HMDB00904	176 →158,116	2
N1-Acetylspermidine	HMDB01276	188 →117,130,171, 146	1.2
Kynurenic acid*	HMDB00715	190 →172,162	1.4
L-Tryptophan*	HMDB00929	205 →188	2.1
Phosphocreatine	HMDB01511	212 →132	1.4
Carnosine*	HMDB00033	227 →210,180	1.3
Deoxycytidine*	HMDB00014	228 →112	1.3
Cytidine*	HMDB00089	244 →112	1.4
5a-Androst-3-en-17-one	HMDB06046	^†273,274 →257	16.5
Androstenol*	HMDB05935	275 →257	12.8
Guanosine*	HMDB00133	284 →152	2.7
Adrenosterone*	HMDB06772	301 →241, 139, 268, 283	13.3
N2,N2-Dimethylguanosine*	HMDB04824	312 →180	1.5
S-Adenosylmethionine	HMDB01185	400	13.1
3a,7a-Dihydroxy-5b-cholestane*	HMDB06893	404.5, 405 →387, 309, 285, 267	16.6
Glycocholic acid*	HMDB00138	^†466 →430,412, 448	14.4
Sphingosine	HMDB00252	300 →241, 282	9.7
m/z, ratio mass to charge; MS, mass spectrometry; *, identified using authentic standards and others were putatively identified ^†, m/z from isotopepatterns is included HMDB, Human metabolomedatabase

Metabolite name	HMDB ID	VIP	Pathway / reaction or class	Reference
3a,7a-Dihydroxy- 5b-cholestane	HMDB06893	2.1	Bile acid biosynthesis	KEGG pathway (ko00 120, 121)
5a-Androst-3-en-17-one	HMDB06046	1.9	Steroids and steroid derivatives	HMDB class
Phenylglycine	HMDB02210	1.8	Glycine, serine, and threonine metabolism	KEGG pathway (map00260)
Creatinine	HMDB00562	1.7	Creatine and creatinine metabolism	Ref 34 and KEGG pathway (ko00330)
N1-Acetylspermidine	HMDB01276	1.7	Spermineand spermidine degradation	MetaCyc and KEGGpathway (ko00330)
N2-Dimethylguanosine	HMDB04824	1.7	Purine metabolism	KEGGpathway (ko00230)
Phosphocreatine	HMDB01511	1.7	Creatine and creatinine metabolism	Ref 34 and KEGG pathway (ko00330)
L-Histidine	HMDB00177	1.6	Histidine metabolism	KEGG pathway (ko00340)
L-Tryptophan	HMDB00929	1.6	Glycine, serine, and threoninemetabolism	KEGG pathway (map00260)
Carnosine	HMDB00033	1.5	Histidine metabolism	KEGG pathway (ko00340)
S-Adenosylmethionine*	HMDB01185	1.5	Arginine and proline metabolism	KEGG pathway (ko00330)
Glycocholic acid	HMDB00138	1.5	Bile acid biosynthesis	KEGG pathway (ko00120, 121)
Kynurenic acid	HMDB00715	1.5	Tryptophan metabolism	KEGG pathway (ko00380)
L-Proline	HMDB00162	1.5	Arginine and proline metabolism	KEGG pathway (ko00330)
Sphingosine	HMDB00252	1.3	Sphingolipid metabolism	KEGGpathway (ko00330)
VIP, variable influence on projection; KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, All abbreviations used for pathways and reactions are from KEGG identifiers (http://genome.jp/keg/kegg3.html)

실시예 5. 동정된 대사체의 대사 네트워크 분석

이러한 서로 다른 대사체 사이의 생화학적 상관관계 및 신장 기능을 예측하는데 있어 그들의 기능적 역할을 이해하기 위해, 15개의 분리된 대사체 및 데이터베이스로부터 얻은 관련 대사 경로에 기초한 대사 상호작용체(interactome)와의 이웃들(neighobrs)을 이용하여 가설적인 대사 네트워크를 구축하였다 (도 8 참조).

이러한 네트워크는 1) 크레아티닌-카르니틴(creatinine-carnitine) (Wyss M K-DR. Physiol Rev 2000;80(3):1107-1213), 2) 요소회로(urea cycle)와 다른 아미노산들, 그리고 3) 뉴클레오시드/퓨린(nucleoside/purine)과 스테로이드(steroid) 또는 담즙산(bile acid)에 관련된 주요 네트워크 모듈들과 대표적 물질대사(metabolism)를 보여준다. 이러한 결과는 주요 대사 경로에서 이들 대사체, 효소 또는 유전자들이 신이식 후 신기능과의 뚜렷한 기능적 관련성을 가진다는 것을 보여준다. 크레아티닌-카르니틴, 트립토판(tryptophan), 글리신(glycine), 퓨린(purine), 콜레스테롤(cholesterol) 및 담즙산 물질대사에서 구축된 네트워크에서 일부 대사체들은 이미 신기능에 영향을 미친다고 알려져 있다 (Wishart DS. Metabolomics: American Journal of Transplantation 2005;5:28142820). 또한 CNDP1, 크레아티닌 키나아제와 같은 네트워크에 관여하는 일부 효소들, 및 일부 요소회로 효소들도 신장 기능/장애와 관련되어 있는 것으로 알려져 있다 (Chan W WM, et al., J Nutr 1974;104(6):678-683). 그러나 상기 네트워크에 있는 몇몇 대사체들은 신기능에 대한 마커로 보고된 적이 없으므로, 신이식 동안 신기능을 모니터하기 위한 새로운 마커가 될 수 있다.

실시예 6. 신이식 동안 GFR 에 따른 동정된 대사체들의 변화

15개의 동정된 대사체들의 정규화된 강도(normalized intensity)는 치료 과정에서 변화하였다. GFR과 양성 상관관계(positive correlated)에 있는, 이들 대사체의 일부는 신이식 5일 후에 급격히 증가하였으며, 이후 약간 감소하여 30일과 90일에는 안정 수준이 되었다 (도 9a). 또한 이들 대사체들은 대사 네트워크에서 블루 에지 노드(blue edge node)로 나타나 있다 (도 8). 반면 음성 상관관계(positive correlated)에 있는, 다른 대사체들은 신이식 후 5일째에 감소하여 점차 증가하였고 90일째에 안정화되었으며 (도 9b), 레드 에지 노드(red edge node)로 나타나 있다 (도 8). 이러한 패턴은 동정된 대사체들과 그들의 관련 대사 경로들이 이식 후에 GFR과 양성 또는 음성 관계, 및 GFR의 회복에 따라 증가 또는 감소가 예상됨을 나타내었다. 주요 대사체 네트워크에서, 담증산과 스테로이드 물질 대사는 이식 후에 뚜렷하게 증가하였다. 그러나 크레아틴-크레아티닌 경로와 요소회로 및 퓨린 물질대사는 GFR과 그들의 역전관계(inverse relationship)로 인하여 이식 후에 감소가 예상되었다.

이러한 결과에 따르면, 3a, 7a-디하이드록시-5b-콜레스탄(7a-dihydroxy-5b-cholestane), 글리코콜산(glycocholic acid), 페닐글리신(phenylglycine), 트립토판(tryptophan) 및 N2-디메틸구아노신(N2-dimethylguanosine)과 같은 이들 15개의 대사체들은, 1) GFR과의 더 높은 상관계수, 2) 크레아티닌 보다 더 주요 대사 경로를 대표함 (표 1 참조), 그리고 3) 이식 동안 신기능 회복에 따른 변화 때문에, 신기능의 예측 마커로서 단일 뇨 대사체(single urinary metabolites)와 비슷하거나 더 우수하다고 판단할 수 있다.

실시예 7. GFR 을 예측하기 위한 임상 적용 가능한 대사체

동정된 15개의 대사체들이 모두 실제 임상에서 GFR을 예측하는데 여전히 확실하지는 않다. 따라서 기존에 보고된 통합 접근법(integrative approach)(Phapale PB KS, et al., Clin Pharmacol Ther 2010;87(4):426-436)을 적용하여, 1) PLS 모델에서 얻은 GFR에 대한 계수와 예측능력(예, VIP); 2) 대사체 네트워크에서 세개의 주요 모듈을 대표할 것; 그리고 3) 임상 시험에서 측정이 용이할 것에 근거하여 대사 표현형(metabolic phenotype)을 선별하였다. 최종적으로, 5개의 대사체들, 예들 들어, 5a-안드로스트-3-엔-17-원(5a-androst-3-en-17-one)(AS; VIP=1.9), 글리코콜산(glycocholic acid)(GC; VIP=1.5), 스핑코신(sphingosine)(SG; VIP=1.3), 트립토판(tryptophan)(TR; VIP=1.6) 및 히스티딘(histidine)(HT; VIP=1.6)이 선별되었다. 이들 5개의 대사체들은 다음의 대사 경로를 대표한다: 아미노산과 관련 물질대사(TR 및 SG), 히스티딘 물질대사, 및 담즙산과 스테로이드 물질대사(AS 및 GC). 다시 말해, 이들 5개의 대사체들은 그들이 관련 경로를 갖는 주요 네트워크 모듈을 대표하고, GFR의 예측을 개선하는데 사용될 수 있다.

실시예 8. 뇨 대사체에 기초한 GFR 에 대한 신규한 예측식의 유도

GFR에 대한 예측식은 상기 실험방법에서 설명한 바와 같이, 5개의 선별된 대사체들과 GFR 사이의 PLS 분석으로부터 PLS loading을 이용하여 다음과 같은 과정을 통해 도출되었다.

(1) LC/MS analysis를 이용하여 뇨 대사체를 분석한다: 999개의 common metabolite ions (metabolite features, three-dimensional data, 단위: m/z, retention time (T), and ion intensity).

(2) LC/MS 분석 후 도출된 자료를 분석 가능한 형태로 전환한다 (Data preprocessing by XCMS software version 1.22.1). XCMS 프로그램(http://metlin.scripps.edu/xcms/index.php)을 이용하여 non-linear retention time alignment, feature detection 그리고 feature matching을 시행하였다. 이를 통해 three dimensional data (m/z, retention time, 그리고 ion intensity)가 two dimensional data (단위: a pair of m/z and T과 ion intensity)로 전환되었고, 999개의 대사체가 standard로 이용되었다 (Anal . Chem. 2006, 78, 779-787). 이후 Systematic variation을 제거하기 위해 측정된 peak intensity는 R software를 이용하여 log₂ 정규화를 시행하여 정규화된 대사체 강도(normalized metabolite intensity)를 구하였다.

(3) SIMCA P+ software (version 12; Umetrics, Uppsala, Sweden)를 이용하여 PLS 분석으로 GFR과 가장 correlation이 높은 metabolites를 찾는다. PLS(the partial least squares)은 X variable의 dimensionality를 줄이고자 할 때 사용되는 모델 중 하나로, 값이 알려져 있는 Y variable (본 발명에서는 GFR)을 이용하여 예측오차를 최소화하는 GFR_predicted를 찾기 위해 회귀분석을 반복하는 방법이다. 본 발명의 예측식에서는 999개의 metabolite의 이식 -2일, 5일, 30일, 90일째의 값이 각 X variable로, 이 시기에 상응하는 GFR값이 Y variable로 선택되어 SIMCA software를 통해 PLS modeling 을 시행하였고, Y varible과 가장 correlation이 높은 metabolite를 VIP (variable importance in the projection) 수치를 통해 선택하였다. VIP 값은 모델에서의 모든 X term (Xk)이 Y에 대해 미치는 영향 (correlation)을 계산한 값이다 SIMCA software에서는 자동적으로 VIP value와 correlation coefficients 값을 계산해준다. 전체 뇨 대사체에서 GFR과 가장 상관관계가 높은 대사체 111개를 선택한다 (선택기준: VIP가 1.3이상인 대사체).

(4) 선택된 대사체를 LC/MS/MS-based method와 대사체 database( human metabolome database (HDMB), metabolite and tandem MS data base (METLIN), lipid metabolite and pathways strategy (LIPID MAPS), and relevant literature)를 이용하여 15개의 대사체를 찾는다.

(5) 대사체 네트워크 분석을 통해 15개의 대사체가 신기능과 관련된 metabolic pathway 중 어떤 pathway에 속하는 지 확인하고 integrative approach 를 이용하여 GFR과 높은 상관관계를 가지고, 현재 널리 사용 중인 신장기능 biomarker인 creatinine을 대체할 수 있고, 신장기능 관련 metabolic pathway와 관련되며, 이식 전후에 변화가 뚜렷한 대사체 5개를 선택한다.

(6) 선택된 5개 대사체의 신기능 예측 정도를 살펴보기 위해 5가지 대사체를 X variable에 GFR을 Y variable에 대입하여 마찬가지로 PLS modeling을 시행하여 correlation coefficient를 구하였고 아래의 예측식을 도출하였다.

GFR_Predicted = 0.45HT + 0.46AS + 0.39TR + 0.54SG + 0.38GC

(7) 상기 식을 이용하여 GFR을 예측할 때는 각 metabolites의 normalized metabolite intensity 값을 대입한다 (단위: 없음).

모든 샘플들에 대한 GFR_Predicted는 관찰된 GFR과 뛰어난 상관관계를 보였다 (R² = 0.71; 도 10a). 이들 다섯 대사체들만 갖는 신규한 PLS 모델은 모든 999개의 대사체들을 갖는 원래 모델(original model)과 비교하여 유사한 예측 능력을 가졌다 (Q² = 0.67). 이 모델의 내부 검증(internal validation)은 허용 가능한 정도로 나타났다. 또한 이 식의 예측가능성은 2년째에 GFR_Predicted가 관찰된 GFR과 수용할만한 상관관계를 나타낸다는 사실에 의해 입증되었다 (R²=0.50, 도 10b). 이러한 결과는 이 예측식이 신이식 후 초기(early) 및 장기간(long-term) GFR을 예측하는데 적합하다는 것을 나타낸다.

Claims

이식 후 신기능 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 하기 단계들을 포함하는 신장 이식 후 환자의 뇨 시료로부터 사구체여과율(GFR)을 예측하는 방법:
(1) 환자의 뇨 시료로부터 뇨 대사체들 중 5a-안드로스트-3-엔-17-원(AS), 글리코콜산(GC), 스핑코신(SG), 트립토판(TR) 및 히스티딘(HT)에 대해, LC/MS 분석을 이용하여 피크 강도(peak intensity)를 측정하는 단계;
(2) 상기 피크 강도를 분위수 정규화(quantile normalization) 알고리즘을 이용하여 log₂ 정규화를 시행하여 정규화된 대사체 강도(normalized metabolite intensity)를 구하는 단계; 및
(3) 상기 정규화된 대사체 강도를 하기 계산식 1에 대입하여 예측 GFR(GFR_Predicted)을 계산하는 단계.
[계산식 1]
GFR_Predicted = 0.45HT + 0.46AS + 0.39TR + 0.54SG + 0.38GC
제 1항에 있어서, 상기 신기능 예측은 신장 이식 후 2년까지 장기간 예측 가능한 것을 특징으로 하는 사구체여과율을 예측하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 따른 방법을 구현하는 프로그램을 기록한 컴퓨터로 판독 가능한 기록매체.