CN104251895B - 一种快速检测吸附剂吸附性能的方法 - Google Patents

一种快速检测吸附剂吸附性能的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种快速检测吸附剂吸附性能的方法，采用超高效液相色谱系统对有关物质进行检测，采用ACQUITY UPLC BEH130C18色谱柱、紫外检测器，以乙腈或甲醇为流动相A，以水为流动相B，梯度洗脱。发明在五分钟内达到基线分离且峰形良好，便于进行进一步的定量及定性分析，大大缩短了检测用时，提高了检测效率，可一次性对肌酐三项进行定量和定性分析，能够一次性检测吸附剂对肌酐三项的吸附率及吸附量，从而快速、高效、准确地反映出吸附剂的吸附性能，同时本发明实现了在肌酐三项物质同时存在的情况下进行吸附实验，其结果能更真实地反应吸附剂对血液中各种物质的吸附性能。

Description

一种快速检测吸附剂吸附性能的方法
技术领域
本发明涉及一种化合物检测方法，尤其涉及一种快速检测吸附剂吸附性能的方法。
背景技术
肌酐三项由戊巴比妥钠、维生素B12和肌酐组成，分别代表了小分子物质、中分子量物质和体内代谢物质。对肌酐三项的吸附性能分别代表对中小分子和代谢物质的吸附能力，是评价血液灌流吸附剂性能的综合指标。
目前对血液灌流吸附剂性能采用的检测方法是，使用这三种物质分别检测吸附剂对其的吸附性，使用紫外分光光度计分别对这三种化合物的紫外吸收光谱分开进行检测，分别制定标准曲线求出浓度进而计算出吸附率。该方法的局限在于每次都需要配制三种化合物的溶液，再分别对吸附剂进行三次吸附实验，并且需要分别制作三条标准曲线，才能求出吸附剂对某一物质的吸附率。该实验过程繁琐且对样品的消耗量大，特别是对于研发过程中，试产的样品量少且较为珍贵，分开多次实验成本较高，造成较大浪费。同时完成整个检测周期较长，不利于快速地对产品性能进行快速评价，不能满足产品研发进度需求。另一方面，血液中同时存在着中小分子和各种代谢物质，对肌酐三项分开检测，无法反应吸附剂的实际吸附效果，与真实情况存在较大偏差，从而很难对技术的发展起到积极的推动作用。
普通的高效液相色谱无法实现肌酐三项物质的快速有效分离，特别是对于极性较大的肌酐，通常的色谱方法保留时间长、峰形拖尾严重且需要额外添加竞争性的胺类如三乙胺以改善峰形，很难同时实现肌酐与戊巴比妥钠、维生素B12的有效分离。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点，本发明提供了一种快速检测吸附剂吸附性能的方法。通过超高效液相色谱一次性对肌酐三项进行定量和/或定性分析的方法，能够一次性检测吸附剂对肌酐三项的吸附率及吸附量，从而快速、高效、准确地反映出吸附剂的吸附性能。
本发明的第一个方面是提供一种一次性对肌酐三项进行定量和/或定性检测的方法，包括以下步骤：
配制含有肌酐三项的混合溶液，采用超高效液相色谱系统对有关物质进行检测，所述含有肌酐三项的混合溶液为含有戊巴比妥钠、肌酐和维生素B12的混合的溶液，其中，测定条件如下：
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH130C18色谱柱，2.1mm×50mm，1.7μm
检测器：紫外检测器
检测波长：200-400nm
柱温：35-45℃
流动相：以乙腈或甲醇为流动相A，以水为流动相B，梯度洗脱
流速：0.1-1.5ml/min
梯度洗脱程序：
时间(min) 流动相A％ 流动相B％
0 9-11 89-91
2-3 13-17 83-87
3.2-3.8 78-82 18-22
4.0 100 0
5 100 0
优选地，柱温为40℃。
优选地，梯度洗脱程序为：
时间(min) 流动相A％ 流动相B％
0 10 90
3 15 85
3.5 80 20
4.0 100 0
5 100 0
其中，可利用色谱参数对肌酐三项进行定性分析，例如可以通过保留值定性、加入样品增加峰高法定性等。
其中，可以采用归一化法、内标法或外标法等对肌酐三项进行定量分析。
本发明的第二个方面是提供一种快速检测吸附剂吸附性能的方法，包括以下步骤：
(1)对照样品的制备
配制S溶液，所述S溶液为包含戊巴比妥钠、肌酐和维生素B12的混合溶液，其中各个成分的浓度根据对所测吸附剂的性能的特殊要求，或者根据实验目的进行设置；
(2)供测样品的制备
取S溶液，称取吸附剂投入到S溶液中，置于某一温度下恒温振荡吸附至少1小时，取上层清液称为A溶液；
(3)吸附性能检测
采用超高效液相色谱系统对溶液S和溶液A进行检测，通过对溶液S和溶液A的色谱图中对应肌酐三项物质的峰进行峰面积的分别比对，可得出吸附前后溶液中相应物质的量的变化，进而求出吸附剂在某一温度下对肌酐三项的各物质的吸附率；或者
配制了一系列标准浓度的溶液，采用超高效液相色谱系统对一系列标准浓度的溶液和A溶液进行检测，绘制标准曲线，以峰面积为x轴，溶液浓度或相应的吸附率为Y轴作线性拟合，根据拟合结果得出吸附剂在某一温度下对肌酐三项的各物质的吸附率；
其中，超高效液相色谱系统检测的具体条件如下：
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH130C18色谱柱，2.1mm×50mm，1.7μm
检测器：紫外检测器
检测波长：200-400nm
柱温：35-45℃
流动相：以乙腈或甲醇为流动相A，以水为流动相B，梯度洗脱
流速：0.1-1.5ml/min
梯度洗脱程序：
时间(min) 流动相A％ 流动相B％
0 9-11 89-91
2-3 13-17 83-87
3.2-3.8 78-82 18-22
4.0 100 0
5 100 0
优选地，柱温为40℃。
优选地，梯度洗脱程序为：
时间(min) 流动相A％ 流动相B％
0 10 90
3 15 85
3.5 80 20
4.0 100 0
5 100 0
发明提供了通过采用超高效液相色谱系统，选择适当的色谱分离柱，采用一定比例的流动相组合，以梯度洗脱的方式，实现对戊巴比妥钠、肌酐和维生素B12的快速检测，在五分钟内达到基线分离且峰形良好，便于进行进一步的定量及定性分析本发明的方法大大缩短了检测用时，提高了检测效率。可一次性对肌酐三项进行定量和定性分析，能够一次性检测吸附剂对肌酐三项的吸附率及吸附量，从而快速、高效、准确地反映出吸附剂的吸附性能，同时本发明实现了在肌酐三项物质同时存在的情况下进行吸附实验，其结果能更真实地反应吸附剂对血液中各种物质的吸附性能。
附图说明
图1为戊巴比妥钠、肌酐和维生素B12的混合物分离图谱及其相对应的单一图谱；
图2为在不同波长下对同一浓度肌酐三项物质戊巴比妥钠、肌酐和维生素B12的混合物的检测图谱；
图3为不同稀释倍数下，肌酐三项物质对应峰的积分面积结果。
具体实施方式
下面参照附图，结合具体的实施例对本发明做进一步的描述，以更好地理解本发明。
实施例1 戊巴比妥钠、肌酐和维生素B12的混合物分离
(1)样品的配制
配制戊巴比妥钠、肌酐和维生素B12溶液以及三者的混合溶液，其中，混合溶液中戊巴比妥钠为80mg/L，肌酐为35mg/L，维生素B12为25mg/L；
(2)液相分离
采用Waters的ACQUITY超高效液相色谱仪(ACQUITY UPLC)，对样品进行分离检测，具体条件如下：
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH130C18色谱柱，2.1mm×50mm，1.7μm
检测器：紫外检测器
检测波长：200-400nm
柱温：40℃
流动相：以甲醇为流动相A，以水为流动相B，梯度洗脱
流速：0.3ml/min
梯度洗脱程序：
时间(min) 流动相A％ 流动相B％
0 10 90
3 15 85
3.5 80 20
4.0 100 0
5 100 0
检测结果如图1所示，由图1可知，本发明可同时实现肌酐与戊巴比妥钠、维生素B12的有效分离，能够一次性对肌酐三项进行定量和/或定性检测。
YY0464-2009中对肌酐三项物质的检测波长分别为：肌酐对应232nm，维生素B12对应361nm，戊巴比妥钠对应240nm。我们分别在色谱图上对上述三个波长分别检测，其对应波长检索结果图2所示，其中，A的检测波长为232nm，B的检测波长为361nm，C的检测波长为240nm，由图2可知，在本发明提供的方法的全波长(200-400nm)扫描下，肌酐三项物质都有明显的特征峰。
实施例2 肌酐三项化合物梯度浓度下的吸附率、浓度及线性拟合度
(1)对照样品的制备
本实施例采用戊巴比妥钠为80mg/L，肌酐35mg/L，维生素B12为25mg/L配制成肌酐三项的混合溶液，记为溶液S1，取四份溶液S1，分别稀释4倍、8倍、16倍、32倍，对应稀释后的溶液分别记为溶液S4、S8、S16和S32。做不同倍数的稀释，是为了证明本方法在不同浓度下的准确性，能够在不同浓度下的峰面积进行拟合，其拟合常数达到0.999(最大为1)，说明本方法在实验的浓度范围内所检测的结果准确性高，且具有一致性，可在不同批次的实验中做横向比较。
(2)液相色谱分离
采用Waters(沃特世)色谱系统对溶液S1、S4、S8、S16和S32进行色谱分离，采用紫外检测器进行检测，具体条件如下：
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH130C18色谱柱，2.1mm×50mm，1.7μm
检测器：紫外检测器
检测波长：200-400nm
柱温：40℃
流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，梯度洗脱
流速：0.3ml/min
梯度洗脱程序：
时间(min) 流动相A％ 流动相B％
0 10 90
3 15 85
3.5 80 20
4.0 100 0
5 100 0
。检测结果如图3所示。
(3)吸附率和吸附后溶液浓度的计算
注：表中吸附率的计算以S1溶液的浓度为原始浓度，吸附后溶液的浓度分别以S4、S8、S16、S32中相应物质的浓度计算。
结论：根据本例中的结果，以峰面积-浓度作拟合曲线，以任意在该浓度范围内的溶液进行色谱分离后，将峰面积代入拟合曲线，即可得出所测溶液中相应物质的浓度，其拟合度达到0.99以上。另外，用吸附率代替浓度作吸附率-峰面积的拟合曲线，直接将积分后峰面积代入，即可得出吸附率，其拟合度也达到0.99以上。
实施例3 检测吸附剂完成吸附实验后对肌酐三项的吸附率
(1)对照样品的制备
配制包含戊巴比妥钠、肌酐和维生素B12的溶液S1，戊巴比妥钠为80mg/L，肌酐35mg/L，维生素B12为25mg/L。
(2)供测样品的制备
取溶液S125ml置于50ml具塞锥形瓶中，称取干燥吸附剂(湿态可折合成干重)1.0g投入瓶中，置于37℃±1℃的环境中恒温振荡吸附1小时。取上层清液称为溶液A。
(3)液相色谱分离
采用Waters(沃特世)色谱系统对溶液S和溶液A进行色谱分离，采用紫外检测器进行检测，具体条件如下：
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH130C18色谱柱，2.1mm×50mm，1.7μm
检测器：紫外检测器
检测波长：200-400nm
柱温：40℃
流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，梯度洗脱
流速：0.3ml/min
梯度洗脱程序：
时间(min) 流动相A％ 流动相B％
0 10 90
3 15 85
3.5 80 20
4.0 100 0
5 100 0
(4)吸附率计算
根据(3)中的检测结果，同时根据YY0464-2009中推荐的方法分别对肌酐三项物质做单个的吸附实验并检测，其结果以及本方法所测结果对比如下：
注：表中A1、A2、A3是对溶液A进行的三次平行试验。
结论：从上述与YY0464-2009的比较结果可以得出，在一定的浓度下，肌酐三项同时检测的结果与该方法基本一致。同时，从本例的结果可看出在吸附剂同时对肌酐三项物质同时吸附时，由于存在竞争的作用，吸附剂对肌酐的吸附量有微小下降，但对于戊巴比妥钠和维生素B12的吸附量基本不受影响，可通过调节吸附前原始溶液相应物质的浓度从而确定吸附剂对某一物质的吸附能力。另外，本例中也可采用“实施例2”中制作的拟合曲线求出吸附后溶液的浓度和吸附率。
实施例4 在肌酐三项混合溶液中增加维生素B12的浓度来考察吸附剂对其吸附能力
(1)对照样品的制备
配制系列包含戊巴比妥钠、肌酐和维生素B12的混合溶液，其中均含戊巴比妥钠为80mg/L，肌酐35mg/L，维生素B12的浓度分别为25mg/L(溶液S1)、50mg/L(溶液S2)和100mg/L(溶液S3)。
(2)供测样品的制备
分别取溶液S1、S2、S3各25ml置于50ml具塞锥形瓶中，称取干燥吸附剂(湿态可折合成干重)1.0g投入瓶中，置于37℃±1℃的环境中恒温振荡吸附1小时。取上层清液称为溶液A1、A2、A3。
(3)液相色谱分离
采用Waters(沃特世)色谱系统及对溶液S1、S2、S3和A1、A2、A3进行色谱分离，采用紫外检测器进行检测，具体条件如下：
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH130C18色谱柱，2.1mm×50mm，1.7μm
检测器：紫外检测器
检测波长：200-400nm
柱温：40℃
流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，梯度洗脱
流速：1ml/min
梯度洗脱程序：
时间(min) 流动相A％ 流动相B％
0 10 90
3 15 85
3.5 80 20
4.0 100 0
5 100 0
(4)吸附率计算
根据液相色谱分离结果，积分数据列表如下：
结论：在逐步增加维生素B12而保持肌酐和戊巴比妥钠浓度不变的情况下，在本方法中仍然能得到很好的分离度，根据积分面积的比对计算各个浓度下的吸附率，可知该检测所用吸附剂对维生素B12的吸附性在其浓度增加到一定程度后达到饱和且维生素B12的增加会影响到肌酐和戊巴比妥钠的吸附性能，但影响不大。
实施例5 在肌酐和戊巴比妥钠的混合液中，逐步减少肌酐的量确定其饱和吸附量
(1)对照样品的制备
配制系列包含戊巴比妥钠、肌酐的混合溶液，其中均含戊巴比妥钠为80mg/L，肌酐的浓度分别为35mg/L(溶液S1)、25mg/L(溶液S2)和15mg/L(溶液S3)。
(2)供测样品的制备
分别取溶液S1、S2、S3各25ml置于50ml具塞锥形瓶中，称取干燥吸附剂(湿态可折合成干重)1.0g投入瓶中，置于37℃±1℃的环境中恒温振荡吸附1小时。取上层清液称为溶液A1、A2、A3。
(3)液相色谱分离
采用Waters(沃特世)色谱系统及对溶液S1、S2、S3和A1、A2、A3进行色谱分离，采用紫外检测器进行检测，具体条件如下：
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH130C18色谱柱，2.1mm×50mm，1.7μm
检测器：紫外检测器
检测波长：200-400nm
柱温：40℃
流动相：以乙腈或甲醇为流动相A，以水为流动相B，梯度洗脱
流速：1ml/min
梯度洗脱程序：
时间(min) 流动相A％ 流动相B％
0 10 90
3 15 85
3.5 80 20
4.0 100 0
5 100 0
(4)吸附率计算
根据液相色谱分离结果，对两物质进行峰面积积分，并通过峰面积比对分别计算其吸附率，结果如下表：
结论：可知通过调节其中某一物质的量，确定吸附剂对其的饱和吸附量。在本例中，所用吸附剂对肌酐的饱和吸附量为1mg吸附剂在25ml肌酐浓度为15mg/L的溶液中对肌酐能达到饱和吸附。根据本例中方法分析出的的结果，可以快速判断吸附剂对代谢物质(肌酐)的吸附能力。
在梯度洗脱程序中，我们可以细微调整流动相的比例，例如在第一阶段流动相A的比例为9-11％，第二阶段流动相A的比例为13-17％(例如13％、14％、16％或17％)，第三阶段流动相A的比例为78-82％(例如78％、79％、81％、或82％)，我们也可以细微调整流动相改变的时间点，例如第二阶段流动相变化的时间点可以为2-3min(例如2min、2.2min、2.5min或2.8min)，第三阶段流动相变化的时间点可以为3.2-3.8min(例如3.2min、3.4min、3.6min或3.8min)。经检测，本发明采用上述调整的梯度洗脱程序也能同时实现肌酐三项物质的有效分离。
在柱温方面，经检测本发明采用35-45℃(例如35℃、37℃、39℃、42℃或45℃)能同时实现肌酐三项物质的有效分离。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (8)

1.一种一次性对肌酐三项进行定量和/或定性检测的方法，其特征在于，配制含有肌酐三项的混合溶液，采用超高效液相色谱系统对有关物质进行检测，所述含有肌酐三项的混合溶液为含有戊巴比妥钠、肌酐和维生素B12的混合的溶液，其中，测定条件如下：
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH130 C18色谱柱，2.1mm×50mm，1.7μm
检测器：紫外检测器
检测波长：200-400nm
柱温：35-45℃
流动相：以乙腈或甲醇为流动相A，以水为流动相B，梯度洗脱
流速：0.1-1.5ml/min
梯度洗脱程序：
。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，柱温为40℃。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，梯度洗脱程序为：
。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用色谱保留参数对肌酐三项进行定性分析。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用归一化法、内标法或外标法对肌酐三项进行定量分析。
6.一种快速检测吸附剂吸附性能的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对照样品的制备
配制S溶液，所述S溶液为包含戊巴比妥钠、肌酐和维生素B12的混合溶液，其中各个成分的浓度根据对所测吸附剂的性能进行设置；
(2)供测样品的制备
取S溶液，称取吸附剂投入到S溶液中，置于某一温度下恒温振荡吸附至少1小时，取上层清液称为A溶液；
(3)吸附性能检测
采用超高效液相色谱系统对溶液S和溶液A进行检测，通过对溶液S和溶液A的色谱图中对应肌酐三项物质的峰进行峰面积的分别比对，可得出吸附前后溶液中相应物质的量的变化，进而求出吸附剂在某一温度下对肌酐三项的各物质的吸附率；或者
配制了一系列标准浓度的溶液，采用超高效液相色谱系统对一系列标准浓度的溶液和A溶液进行检测，绘制标准曲线，以峰面积为x轴，溶液浓度或相应的吸附率为Y轴作线性拟合，根据拟合结果得出吸附剂在某一温度下对肌酐三项的各物质的吸附率；
其中，超高效液相色谱系统检测的具体条件如下：
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH130 C18色谱柱，2.1mm×50mm，1.7μm
检测器：紫外检测器
检测波长：200-400nm
柱温：35-45℃
流动相：以乙腈或甲醇为流动相A，以水为流动相B，梯度洗脱
流速：0.1-1.5ml/min
梯度洗脱程序：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，柱温为40℃。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，梯度洗脱程序：
。
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