BRPI0708485A2 - métodos para distinguir isÈmeros usando espectrometria de massa - Google Patents

Abstract

MéTODOS PARA DISTINGUIR iSOMEROS USANDO ESPECTROMETRIA DE MASSA A presente invenção refere-se a métodos para distinguir isómeros de dimetilarginina. Também são apresentados métodos e composições para diagnosticar distúrbios cardiovasculares.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOSPARA DISTINGUIR ISÔMEROS USANDO ESPECTROMETRIA DEMASSA".

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

Este pedido reivindica prioridade para o Pedido US Série N060/778.483, depositado em 2 de março de 2006, cujo conteúdo encontra-seaqui incorporado a título de referência.Sumário

A presente invenção refere-se, entre outras coisas, a distinguirisômeros moleculares usando espectrometria de massa. Por exemplo, esterelatório descritivo apresenta um método para detectar um ou os dois isôme-ros de dimetilarginina, usando espectrometria de massa em série.

Esses métodos têm várias aplicações e podem ser usados paradetectar dimetilarginina em uma amostra (por exemplo, uma amostra prove-niente de uma síntese ou uma amostra de um indivíduo). No contexto dediagnóstico, os métodos podem ser usados para obter um perfil metabólicopara um indivíduo (por exemplo, um ser humano). Um perfil metabólico éconstituído de informações que incluem informações sobre o estado de umou ambos os membros de um par de isômeros de um metabólito, por exem-plo, um ou ambos de: dimetilarginina assimétrica (ADMA) dimetilargininasimétrica (SDMA), os dois isômeros de dimetilarginina:

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Em algumas modalidades, um perfil metabólico inclui informa-ções sobre outras moléculas, por exemplo, outros metabólitos. O perfil me-tabólico resultante pode ser usado para avaliar o estado de saúde de umindivíduo (por exemplo, um ser humano), tal como a presença ou ausênciade um distúrbio, por exemplo, um distúrbio vascular (por exemplo, um dis-túrbio cardiovascular ou um distúrbio hipertensivo).

Em um aspecto, este relatório descritivo apresenta um métodopara distinguir isômeros de dimetilarginina. O método inclui as etapas de:ionizar uma amostra para gerar íons; selecionar íons tendo uma proporçãode massa para carga {m/z) em uma faixa de m/z, fragmentar os íons sele-cionados para produzir íons filhotes; e detectar uma ou ambas de dimetilar-ginina assimétrica (ADMA) e dimetilarginina simétrica (SDMA) na amostrapor detecção de um ou ambos do sinal m/z de um íon filhote a um m/z únicopara ADMA e o sinal m/z de um íon filhote a um m/z único para SDMA.

Em um outro aspecto, este relatório descritivo apresenta um mé-todo para distinguir isômeros de dimetilarginina, método este que inclui asetapas de: ionizar uma amostra para gerar íons; selecionar íons tendo umaproporção de massa para carga (m/z) em uma faixa de m/z, fragmentar osíons selecionados para produzir íons filhotes; e detectar uma ou ambas dapresença do sinal m/z de um íon filhote a cerca de m/z 46 e da presença dosinal m/z de um íon filhote a cerca de m/z 172, onde o sinal m/z de um íonfilhote a cerca de m/z 46 indica que a amostra compreende dimetilargininaassimétrica (ADMA) e o sinal m/z de um íon filhote a cerca de m/z 172 indicaque a amostra compreende dimetilarginina simétrica (SDMA). A faixa dem/z pode ser de cerca de m/z 203.

Em um outro aspecto, este relatório descritivo apresenta um mé-todo para detectar dimetilarginina simétrica (SDMA), método este que incluias etapas de: ionizar uma amostra para gerar íons; selecionar íons tendouma proporção de massa para carga (m/z) em uma faixa de m/z, fragmentaros íons selecionados para produzir íons filhotes; e detectar dimetilargininasimétrica (SDMA) na amostra detectando o sinal m/z de um íon filhote a cer-ca de m/z 172. A faixa de m/z pode ser de cerca de m/z 203.

Em um outro aspecto, este relatório descritivo apresenta um mé-todo para detectar dimetilarginina assimétrica (ADMA). O método inclui asetapas de: ionizar uma amostra para gerar íons; selecionar íons tendo umaproporção de massa para carga (m/z) em uma faixa de m/z, fragmentar osíons selecionados para produzir íons filhotes; e detectar dimetilarginina as-simétrica (ADMA) na amostra detectando o sinal m/z de um íon filhote a cer-ca de m/z 46. A faixa de m/z pode ser de cerca de m/z 203.

Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descri-tos acima, um padrão interno é adicionado à amostra antes da ionização daamostra. O padrão interno pode ser, ou conter, um isômero de dimetilargi-nina que inclui pelo menos um átomo pesado. O padrão interno pode conterou ser um isômero de SDMA de referência tendo pelo menos um átomo pe-sado, e um isômero de ADMA de referência tendo pelo menos um átomopesado e onde os isômeros de SDMA e de ADMA de referência têm pesosatômicos diferentes.

Em um outro aspecto, este relatório descritivo apresenta um mé-todo para detectar isômeros de dimetilarginina, método este que inclui asetapas de: fornecer uma amostra que inclui um ou mais padrões internos,onde pelo menos um padrão interno é um isômero de dimetilarginina con-tendo pelo menos um átomo pesado; ionizar uma amostra para gerar íons;selecionar íons tendo uma faixa de m/z correspondente à faixa que é ade-quada para isolar isômeros de dimetilarginina (por exemplo, de ocorrêncianatural) e selecionar íons em uma ou mais faixas de m/z adicionais, as fai-xas sendo adequadas para isolar o um ou mais padrões internos; fragmen-tar os íons selecionados para produzir íons filhotes; detectar dimetilargininaassimétrica (ADMA) e/ou dimetilarginina simétrica (SDMA) na amostra pordetecção de um ou mais do sinal m/z de um íon filhote único para ADMAe/ou um ou mais do sinal m/z de um íon filhote único para SDMA usando osíons filhotes; e detectar o um ou mais padrões internos.

Em algumas modalidades, a faixa m/z corresponde à faixa que éadequada para isolar isômeros de dimetilarginina é cerca de m/z 203. Emalgumas modalidades, a amostra pode incluir um primeiro padrão internoque é um isômero de SDMA tendo pelo menos um átomo pesado, e um se-gundo padrão interno que é um isômero de ADMA tendo pelo menos umátomo pesado e onde os isômeros de SDMA e de ADMA têm pesos atômi-cos diferentes . Em algumas modalidades, a amostra inclui um primeiro pa-drão interno que é um isômero de SDMA tendo pelo menos um átomo pe-sado, e um segundo padrão interno que é um isômero de ADMA tendo pelomenos um átomo pesado e onde os isômeros de SDMA e de ADMA têmpesos atômicos iguais.

Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descri-tos acima, o método pode incluir ainda a etapa de medir o nível de SDMAe/ou ADMA na amostra.

Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descri-tos acima, a amostra que é ionizada pode ser uma amostra biológica. Aamostra biológica pode ser, ou conter, sangue, soro, plasma, linfa, fluídoamniótico, saliva, fluído cerebrospinhal, fluído lacrimal, muco, urina, cuspe,ou suor.

Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descri-tos acima, a amostra que é ionizada pode conter compostos além da dimeti-larginina. A amostra que é ionizada pode conter compostos que não co-migram em uma coluna de cromatografia por exclusão de tamanho.

Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descri-tos acima, é possível detectar um ou mais analitos adicionais. O um oumais analitos adicionais podem ser biomoléculas metabólicas. O um oumais analitos adicionais podem ser aminoácidos ou acilcarnitinas. O um oumais analitos adicionais são selecionados do grupo que consiste em: citruli-na, dimetilamina, arginina, ortnitina, homocisteína, e creatina. Em algumasmodalidades, o um ou mais analitos adicionais podem ser medidos, por e-xemplo, usando espectrometria de massa em série.

Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descri-tos acima, a amostra não é quimicamente modificada antes da ionização daamostra. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritosacima, a amostra é quimicamente modificada antes da ionização da amos-tra.

Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descri-tos acima, o nível de um sinal a cerca de m/z 46 e o nívei de um sinal a cer-ca de m/z 172 pode ser medido, por exemplo, determinando o resultado deuma função dependente do sinal m/z de íon filhote a cerca de m/z 46 e dosinal m/z de íon filhote a cerca de m/z 172.

Em um outro aspecto, este relatório descritivo apresenta um mé-todo para diagnosticar um distúrbio caracterizado por níveis alterados deADMA ou SDMA, o método compreendendo: fornecer uma amostra biológi-ca de um indivíduo; ionizar a amostra biológica para gerar íons; selecionaríons tendo uma proporção de massa para carga {m/z) em uma faixa de m/z,fragmentar os íons selecionados para produzir íons filhotes; e medir o nívelde ADMA em função do sinal m/z de um íon filhote a cerca de m/z 46 e onível de SDMA em função do sinal m/z de um íon filhote a cerca de m/z 172,onde um nível alterado de um ou ambos de ADMA e SDMA na amostra bio-lógica em relação ao nível em uma amostra de referência é uma indicaçãode que o indivíduo tem, ou corre o risco de desenvolver, um distúrbio carac-terizado por níveis alterados de ADMA ou SDMA. O distúrbio pode caracte-rizar-se por níveis de ADMA aumentados e/ou níveis de SDMA aumentados.

O distúrbio caracterizado por níveis alterados de ADMA ou SDMA pode serum distúrbio vascular e/ou um distúrbio hipertensivo. O distúrbio hipertensi-vo pode ser pré-eclâmpsia. A faixa de m/z range pode ser cerca de m/z 203.

A amostra biológica que é ionizada pode conter compostos além da dimeti-larginina. O indivíduo pode ser um mamífero, por exemplo, um ser humano.

O distúrbio vascular pode ser um distúrbio cardiovascular ou um distúrbiohipertensivo. O distúrbio hipertensivo pode ser pré-eclâmpsia. O distúrbiocardiovascular pode ser aterosclerose. O distúrbio vascular pode ser diabe-tes, hipercolesterolemia, insuficiência renal, ou hipertensão. Em algumasmodalidades, é possível medir o nível do sinal m/z de um íon filhote a cercade m/z 46 e o nível do sinal m/z de um íon filhote a cerca de m/z 172. Aamostra de referência pode ser de um indivíduo que não tem, não tem sus-peita de ter, nem corre o risco de desenvolver um distúrbio cardiovascular.

A amostra biológica pode ser, ou conter, sangue, soro, plasma, linfa, fluídoamniótico, saliva, fluído cerebrospinhal, fluído lacrimal, muco, urina, cuspe,ou suor.Em algumas modalidades, um ou mais analitos adicionais. Po-dem ser medidos um ou mais analitos adicionais pode ser citrulina, dimeti-lamina, arginina, ortnitina, homocisteína, e creatina. O um ou mais analitosadicionais podem ser aminoácidos ou acilcarnitinas. O um ou mais analitosadicionais podem ser medidos, por exemplo, usando espectrometria demassa.

Em algumas modalidades, um padrão interno pode ser adicio-nado à amostra biológica antes da ionização da amostra. O padrão internopode ser, ou conter, um isômero de dimetilarginina que inclui pelo menosum átomo pesado. O padrão interno pode ser, ou conter, um isômero deSDMA tendo pelo menos um átomo pesado, e um isômero de ADMA tendopelo menos um átomo pesado e onde os isômeros de SDMA e de ADMAtêm pesos atômicos diferentes .

Em ainda um outro aspecto, este relatório descritivo apresentaum método para diagnosticar um distúrbio vascular em um indivíduo, méto-do este que inclui as etapas de: fornecer uma amostra biológica de um indi-víduo; ionizar a amostra biológica para gerar íons; selecionar íons tendouma proporção de massa para carga (m/z) em uma faixa de m/z, fragmen-tar os íons selecionados para produzir íons filhotes; e medir um ou ambosdo nível de ADMA em função do sinal m/z de um íon filhote a cerca de m/z46 e do nível de SDMA em função do sinal m/z de um íon filhote a cerca dem/z 172, onde um nível elevado de um ou ambos de ADMA e SDMA na a-mostra biológica em relação ao nível em uma amostra de referência é umaindicação de que o indivíduo tem, ou corre o risco de desenvolver, um dis-túrbio vascular. A faixa de m/z pode ser cerca de m/z 203. A amostra bio-lógica que é ionizada pode conter compostos além da dimetilarginina. Oindivíduo pode ser um mamífero, por exemplo, um ser humano. O distúrbiovascular pode ser um distúrbio cardiovascular ou um distúrbio hipertensivo.O distúrbio hipertensivo pode ser pré-eclâmpsia. O distúrbio cardiovascularpode ser aterosclerose. O distúrbio vascular pode ser diabetes, hipercoles-terolemia, insuficiência renal, ou hipertensão. Em algumas modalidades, épossível medir o nível do sinal m/z de um íon filhote a cerca de m/z 46 e onível do sinal m/z de um íon filhote a cerca de m/z 172. A amostra de refe-rência pode ser de um indivíduo que não tem, não tem suspeita de ter, nemcorre o risco de desenvolver um distúrbio cardiovascular.

Em algumas modalidades, é possível medir um ou mais analitos adicionais. O um ou mais analitos adicionais podem ser citrulina, dimetila-mina, arginina, ortnitina, homocisteína, e creatina. O um ou mais analitosadicionais podem ser aminoácidos ou acilcarnitinas. O um ou mais analitosadicionais podem ser medidos, por exemplo, usando espectrometria demassa. A amostra biológica pode ser, ou conter, sangue, soro, plasma, Iin- fa, fluído amniótico, saliva, fluído cerebrospinhal, fluído lacrimal, muco, uri-I na, cuspe, ou suor. A amostra biológica que é ionizada pode ser, ou conter,compostos além da dimetilarginina.

Em algumas modalidades, o método pode incluir a etapa de:depois de diagnosticar o indivíduo como tendo, ou correndo o risco de de-senvolver, um distúrbio vascular, administrar ao indivíduo um ou mais agen-tes terapêuticos. O um ou mais agentes terapêuticos são um ou mais anti-hipertensivos, um ou mais agentes redutores de colesterol, ou um ou maisbeta bloqueadores. O um ou mais anti-hipertensivos podem ser diuréticos,inibidores da enzima conversora de angiotensina, vasodilatadores, ou alfabloqueadores. O um ou mais agentes abaixadores de colesterol podem serestatinas.

Em algumas modalidades, um padrão interno pode ser adicio-nado à amostra biológica antes da ionização da amostra. O padrão internopode ser, ou conter, um isômero de dimetilarginina que inclui pelo menosum átomo pesado. O padrão interno pode ser, ou conter, um isômero deSDMA tendo pelo menos um átomo pesado, e um isômero de ADMA tendopelo menos um átomo pesado e onde os isômeros de SDMA e de ADMAtêm pesos atômicos diferentes .

Em um outro aspecto, este relatório descritivo fornece um méto-do para diagnosticar pré-eclâmpsia em um indivíduo, método este que incluias etapas de: fornecer uma amostra biológica de um indivíduo; ionizar aamostra biológica para gerar íons; selecionar íons tendo uma proporção demassa para carga (m/z) em uma faixa de m/z, fragmentar os íons seleciona-dos para produzir íons filhotes; e medir um ou ambos do nível de ADMA emfunção do sinal m/z de um íon filhote a cerca de m/z 46 e do nível de SDMAem função do sinal m/z de um íon filhote a cerca de m/z 172, onde um nívelelevado de um ou ambos de ADMA e SDMA na amostra biológica em rela-ção ao nível em uma amostra de referência é uma indicação de que o indi-víduo tem, ou corre o risco de desenvolver, pré-eclâmpsia. A faixa de m/zpode ser cerca de m/z 203. O indivíduo pode ser um mamífero, por exem-plo, um ser humano.

Em ainda um outro aspecto, este relatório descritivo fornece ummétodo para avaliar a resposta de um indivíduo a um agente terapêutico. Ométodo pode incluir as etapas de: fornecer uma amostra biológica de umindivíduo tratado com um agente terapêutico; ionizar a amostra biológicapara gerar íons; selecionar íons tendo uma proporção de massa para carga{m/z) em uma faixa de m/z, fragmentar os íons selecionados para produziríons filhotes; e medir um ou ambos do nível de ADMA em função do sinalm/z de um íon filhote a cerca de m/z 46 e do nível de SDMA em função dosinal m/z de um íon filhote a cerca de m/z 172, onde o mesmo nível ou umnível elevado de um ou ambos de ADMA e SDMA na amostra biológica emrelação ao nível em uma amostra biológica obtida do indivíduo antes do tra-tamento é uma indicação de que o indivíduo não está respondendo ao tra-tamento e um nível reduzido de um ou ambos de ADMA e SDMA na amos-tra biológica em relação à amostra biológica obtida do indivíduo antes dotratamento é uma indicação de que o indivíduo está respondendo ao trata-mento. A faixa de m/z pode ser cerca de m/z 203. O indivíduo pode ser ummamífero, por exemplo, um ser humano. Em algumas modalidades, é pos-sível medir um ou mais analitos adicionais. O um ou mais analitos adicio-nais podem ser citrulina, dimetilamina, arginina, ortnitina, homocisteína, ecreatina. O um ou mais analitos adicionais podem ser aminoácidos ou acil-carnitinas. O um ou mais analitos adicionais podem ser medidos, por e-xemplo, usando espectrometria de massa. A amostra biológica pode ser, ouconter, sangue, soro, plasma, linfa, fluído amniótico, saliva, fluído cerebros-pinhal, fluído lacrimal, muco, urina, cuspe, ou suor. A amostra biológica queé ionizada pode ser, ou conter, compostos além da dimetilarginina. O indi-víduo pode ser um indivíduo que tem, ou com suspeita de ter, um distúrbiovascular. O distúrbio vascular pode ser um distúrbio hipertensivo tal comopré-eclâmpsia. O distúrbio vascular pode ser um distúrbio cardiovascular talcomo aterosclerose. O distúrbio vascular pode ser diabetes, hipercolestero-lemia, insuficiência renal, ou hipertensão.

Em algumas modalidades, é possível medir o nível de ADMA e onível de SDMA. Em algumas modalidades, o método também pode incluir:se o indivíduo não está respondendo ao tratamento, administrar ao indivíduoum ou mais agentes terapêuticos diferentes. O um ou mais agentes terapêu-ticos são um ou mais anti-hipertensivos, um ou mais agentes abaixadoresde colesterol, ou um ou mais beta bloqueadores. O um ou mais anti-hipertensivos podem ser diuréticos, inibidores da enzima conversora de an-giotensina, vasodilatadores, ou alfa bloqueadores. O um ou mais agentesabaixadores de colesterol podem ser estatinas.

Em algumas modalidades, o método pode incluir: se o indivíduoestiver respondendo ao tratamento, continuar a administrar o mesmo agenteterapêutico ao indivíduo.

Em um outro aspecto, este relatório descritivo fornece um méto-do para fornecer um perfil metabólico para um indivíduo, o método compre-endendo: fornecer uma amostra biológica de um indivíduo; ionizar a amostrabiológica para gerar íons; selecionar íons tendo uma proporção de massapara carga (m/z) em uma faixa de m/z, fragmentar os íons selecionados paraproduzir íons filhotes; e detectar um ou ambos do sinal m/z de um íon filhotea cerca de m/z 46 e do sinal m/z de um íon filhote a cerca de m/z 172; e for-necer um perfil metabólico do indivíduo que inclui um parâmetro que é fun-ção de um ou ambos do sinal m/z de íon filhote a cerca de m/z 46 e do sinalm/z de íon filhote a cerca de m/z 172. A faixa de m/z pode ser cerca de m/z203. O indivíduo pode ser um mamífero, por exemplo, um ser humano. Oindivíduo pode ser um indivíduo com suspeita de ter um distúrbio cardiovas-cular. Em algumas modalidades, é possívei medir um ou mais analitos adi-cionais. O um ou mais analitos adicionais podem ser citrulina, dimetilamina,arginina, ortnitina, homocisteína, e creatina. O um ou mais analitos adicio-nais podem ser aminoácidos ou acilcarnitinas. O um ou mais analitos adi-cionais podem ser medidos, por exemplo, usando espectrometria de massa.

A amostra biológica pode ser, ou conter, sangue, soro, plasma, linfa, fluídoamniótico, saliva, fluído cerebrospinhal, fluído lacrimal, muco, urina, cuspe,ou suor. A amostra biológica que é ionizada pode ser, ou conter, compostosalém da dimetilarginina. O indivíduo pode ser um indivíduo que tem, oucom suspeita de ter, um distúrbio vascular. O distúrbio vascular pode ser10um distúrbio hipertensivo tal como pré-eclâmpsia. O distúrbio vascular podeser um distúrbio cardiovascular tal como aterosclerose. O distúrbio vascularpode ser diabetes, hipercolesterolemia, insuficiência renal, ou hipertensão.

Em algumas modalidades, é possível medir o nível do sinal m/zde um íon filhote a cerca de m/z 46 e da presença do sinal m/z de um íonfilhote a cerca de m/z 172.

Em algumas modalidades, é possível medir um ou mais analitosadicionais. O um ou mais analitos adicionais podem ser qualquer um daque-les descritos neste relatório descritivo. O um ou mais analitos adicionais po-dem ser medidos usando espectrometria de massa.

Em ainda um outro aspecto, este relatório descritivo apresentaum perfil metabólico para um indivíduo obtido pelo método compreendendo:fornecer uma amostra biológica de um indivíduo; ionizar a amostra biológicapara gerar íons; selecionar íons tendo uma proporção de massa para carga(m/z) em uma faixa de m/z, fragmentar os íons selecionados para produziríons filhotes; e medir um ou ambos do nível de ADMA em função do sinalm/z de um íon filhote a cerca de m/z 46 e do nível de SDMA em função dosinal m/z de um íon filhote a cerca de m/z 172 para obter o perfil metabólicodo indivíduo. A faixa de m/z pode ser cerca de m/z 203. O indivíduo podeser um mamífero, por exemplo, um ser humano. O indivíduo pode ser umindivíduo com suspeita de ter um distúrbio vascular. Em algumas modalida-des, é possível medir um ou mais analitos adicionais. O um ou mais analitosadicionais podem ser qualquer um daqueles descritos neste relatório descri-tivo. O um ou mais analitos adicionais podem ser medidos usando espec-trometria de massa.

Em um outro aspecto, este relatório descritivo fornece um méto-do para diagnosticar um distúrbio vascular em um indivíduo, o método com-preendendo: fornecer um perfil metabólico descrito neste relatório descritivo;e comparar um ou ambos do nível de ADMA e do nível de SDMA no perfilmetabólico com o nível de ADMA e o nível de SDMA em um perfil metabóli-co de referência, onde um nível elevado de um ou ambos de ADMA e SDMAem comparação com o nível no perfil metabólico de referência é uma indica-ção de que o indivíduo tem, ou corre o risco de desenvolver, um distúrbiovascular.

Em um outro aspecto, este relatório descritivo fornece um méto-do para avaliar um composto, o método compreendendo: contatar uma célu-la ou um indivíduo com o composto; ionizar uma amostra da célula ou doindivíduo para gerar íons; selecionar íons tendo uma proporção de massapara carga {m/z) em uma faixa de m/z, fragmentar os íons selecionados paraproduzir íons filhotes; e medir o nível de um ou ambos de ADMA em funçãodo sinal m/z de um íon filhote a cerca de m/z 46 e o nível de SDMA em fun-ção do sinal m/z de um íon filhote a cerca de m/z 172, onde uma alteraçãoem um ou ambos do nível de ADMA e do nível de SDMA na amostra obtidada célula ou do indivíduo contatada com o composto em comparação com onível em uma amostra de uma célula ou de um indivíduo não contatada como composto indica que o composto é um composto que é um modulador dosníveis de ADMA ou SDMA. A célula pode ser a célula de um mamífero, porexemplo, uma célula de ser humano. A célula pode ser uma célula endote-lial. A célula pode ser uma célula expressando eNOS. A célula pode serobtida de um indivíduo que tem, ou com risco de desenvolver, um distúrbiovascular.

Em algumas modalidades, é possível medir um ou mais analitosadicionais. O um ou mais analitos adicionais podem ser qualquer um da-queles descritos neste relatório descritivo. O um ou mais analitos adicionaispodem ser medidos usando espectrometria de massa.Em um outro aspecto, este relatório descritivo apresenta um kitpara detectar dimetilarginina assimétrica (ADMA) e dimetilarginina simétrica(SDMA), o kit compreendendo: um ou ambos de ADMA e SDMA, onde umou ambos de ADMA e SDMA compreendem pelo menos um isótopo de á-tomo pesado; e, opcionalmente, instruções de como detectar SDMA eADMA. O kit pode conter um ácido orgânico tal como ácido oxálico.

Em um outro aspecto, este relatório descritivo apresenta um kitpara dimetilarginina assimétrica (ADMA) e dimetilarginina simétrica (SDMA),o kit compreendendo: um ou ambos de ADMA e SDMA, onde um ou ambosde ADMA e SDMA compreendem pelo menos um isótopo de átomo pesado;um ácido orgânico; e, opcionalmente, instruções de como detectar SDMA eADMA. O ácido orgânico pode ser ácido oxálico.

Em algumas modalidades de qualquer um dos kits descritosnesta invenção, os kits também podem conter um aplicativo de computadorútil para detectar um ou ambos de ADMA ou SDMA.

Em algumas modalidades de qualquer um dos kits descritosnesta invenção, os kits também podem conter um ou mais padrões internosadicionais úteis na detecção de uma ou mais de quaisquer das biomoléculas(por exemplo, biomoléculas metabólicas) descritas nesta invenção.

Os métodos descritos nesta invenção têm várias aplicações.Por exemplo, os métodos podem ser usados para avaliar a pureza de umaamostra, por exemplo, a pureza de um produto de síntese química ou deuma purificação. Ele pode ser usado para determinar uma reação química,por exemplo, na qual um isômero de dimetilarginina é um reagente, interme-diário ou produto. A reação pode ocorrer in vitro, por exemplo, em uma sis-tema livre de células ou em células, ou in vivo.

Este relatório descritivo também apresenta uma composição queinclui ADMA contendo pelo menos um isótopo de átomo pesado, e que épelo menos 10, 20, 60, 80, 90, 95, 97, 98, 98, 99,5% pura. A composiçãopode ter uma concentração maior que cerca de 1 pM (por exemplo, maiorque cerca de 1 nM). Por exemplo, a molécula de ADMA tem um peso atô-mico pelo menos 1, 2, 3, 4, unidades atômicas maior que a ADMA natural.A composição pode ser substancialmente livre de ADMA que tem uma pro-porção de massa/carga de cerca de 203. A composição pode ser usadacomo um padrão interno. Por exemplo, a composição pode ser adicionadaa uma amostra.

Este relatório descritivo também apresenta uma composição queinclui SDMA contendo pelo menos um isótopo de átomo pesado, e que épelo menos 10, 20, 60, 80, 90, 95, 97, 98, 98, 99,5% pura. A composiçãopode ter uma concentração maior que cerca de 1 pM (por exemplo, maiorque cerca de 1 nM). Por exemplo, a molécula de SDMA tem um peso atô-mico pelo menos 1, 2, 3, 4, unidades atômicas maior que a SDMA natural. Acomposição pode ser substancialmente livre de SDMA que tem uma propor-ção de massa/carga de cerca de 203. A composição pode ser usada comoum padrão interno. Por exemplo, a composição pode ser adicionada a umaamostra.

O relatório descritivo apresenta ainda uma composição que in-clui ADMA contendo pelo menos um isótopo de átomo pesado e SDMA con-tendo pelo menos um isótopo de átomo pesado. Tipicamente, esses isôme-ros pesados de dimetilarginina têm uma proporção de massa/carga diferentedo outro. A composição pode ser usada como um padrão interno. Por e-xemplo, a composição pode ser adicionada a uma amostra. Em uma moda-lidade, a composição é substancialmente livre de ADMA que tem uma pro-porção de massa/carga (m/z) de cerca de 203. Em uma outra modalidade, acomposição inclui ainda SDMA que tem uma proporção de massa/carga decerca de 203.

Muitos espectrômetros de massa possuem precisões de massapara alta resolução. Por exemplo, no caso de um íon com uma única carga(por exemplo, um íon de ADMA ou SDMA com uma única carga), esta faixacorresponde a 0,6 m/z. Neste relatório descritivo, os íons com uma únicacarga positiva dos isômeros de dimetilarginina têm um m/z nominal de 203.

Por conseguinte, tais faixas podem ser usadas nesta invenção. Por exem-plo, a seleção de íons com uma proporção de massa para carga (m/z) decerca de 203 pode ser implementada usando um canal que varia de 202,7 a203,3. Deve ficar entendido que os métodos descritos nesta invenção tam-bém abrangem o uso de íons de dimetilarginina com múltiplas cargas (porexemplo, duas ou três), íons com múltiplas cargas estes que por conseguin-te afetam a precisão de massa e a faixa amu de resolução. Por exemplo,para um íon com duas cargas, a faixa amu corresponde a 0,3 m/z e assimpor diante. Variações mínimas (por exemplo, variações na calibragem) emum espectrômetro de massa podem resultar em sinais m/z de íon primitivo efilhote no isômero de dimetilarginina que não coincidem com aqueles apre-sentados neste relatório descritivo, mas o sinal m/z correspondente àquelesdescritos podem ser facilmente identificados e usados, por exemplo, porcompensação do desvio na calibragem.

Todas as publicações, pedidos de patente, patentes, e outrasreferências mencionadas neste relatório descritivo estão aqui incorporadosem sua integridade a título de referência. Os materiais, métodos, e exem-pios descritos nesta invenção são apenas ilustrativos e não pretendem serlimitativos.

Outros aspectos e vantagens da invenção tornar-se-ão aparen-tes a partir da descrição a seguir, dos desenhos, e das reivindicações.Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 é uma representação esquemática representando aestrutura química da arginina, dimetilarginina assimétrica (ADMA), e dimeti-larginina simétrica (SDMA).

A figura 2 é um espectro de massa em série da SDMA e repre-sentação esquemática da fragmentação de SDMA e fragmentos (ionizadose neutros) produzidos na fragmentação. "A" indica o íon primitivo de SDMAcom uma proporção de massa para carga (m/z) de 203. "B" indica o íon dofragmento filhote específico de SDMA com m/z 172. O espectro de massarepresenta sinais m/z do íon filhote detectados subsequente à fragmentaçãode uma amostra contendo SDMA incluindo o íon primitivo (m/z 203) e ofragmento específico de SDMA (m/z 172; indicado pela seta). O eixo dos Xrepresenta a proporção massa para carga (m/z) e o eixo dos Y representa aabundância relativa (percentagem) de cada íon na amostra.A figura 3 é um espectro de massa em série da ADMA e repre-sentação esquemática da fragmentação de ADMA e fragmentos (ionizadose neutros) produzidos na fragmentação. "A" indica o íon primitivo de ADMAcom uma proporção de massa para carga (m/z) de 203. "B" indica o íon dofragmento filhote específico de ADMA com m/z 46. O espectro de massarepresenta sinais m/z do íon filhote detectados subsequente à fragmentaçãode uma amostra contendo ADMA incluindo o íon primitivo {m/z 203) e ofragmento específico de ADMA (m/z 46; indicado pela seta). O eixo dos Xrepresenta a proporção massa para carga (m/z) e o eixo dos Y representa aabundância relativa (percentagem) de cada íon na amostra.

A figura 4 é um espectro de massa em série (experimento co-

nhecido como monitoramento de múltiplas reações ou MRM) de uma amos-tra de sangue mostrando os perfis de tempo da corrente iônica total (TIC)superposta de SDMA e ADMA (superior; Monitoramento de Múltiplas Rea-ções) e um par de espectros de massa correlatos mostrando a quantidaderelativa da ADMA (esquerda) e SDMA (direita) na amostra em relação à(controle). Os respectivos perfis de tempo TIC para ADMA e SDMA estãoindicados pelas setas (superior). O eixo dos X dos perfis de TIC está emunidades de número de imagens ("scans") e o eixo dos Y representa a a-bundância relativa. Para os dois espectros de massa inferiores, o eixo dosX representa a proporção massa para carga (m/z) e o eixo dos Y representaa abundância relativa (percentagem) de cada íon na amostra.

A figura 5 é uma representação esquemática mostrando as es-truturas químicas de dois padrões internos nos métodos descritos nesta in-venção: dimetilarginina simétrica rotulada com deutério (SDMA; esquerda) edimetilarginina assimétrica rotulada com deutério (ADMA; direita).

Descrição Detalhada

A tecnologia descrita nesta invenção refere-se à detecção deuma ou mais formas de isômeros moleculares de maneira que identifica ca-da isômero de forma única. Em uma modalidade, o método inclui ionizaruma amostra para gerar íons; selecionar íons tendo uma proporção de mas-sa para carga (m/z) na faixa m/z correspondente ao grupo de isômeros;fragmentar os íons selecionados para produzir íons filhotes; e detectar um,dois ou mais dos isômeros detectando pelo menos um sinal m/z para um íonfilhote único para um dos isômeros. Em uma muitas implementações, o mé-todo permite detectar simultaneamente cada isômero do grupo de isômeros.

Os métodos descritos nesta invenção podem ser usados paradistinguir entre (e medir) isômeros de dimetilarginina (SDMA e/ou ADMA).Nas aplicações desses métodos, é possível obter perfis metabólicos paraum indivíduo (por exemplo, um ser humano), perfil este que reflete a situa-ção de pelo menos dimetilarginina assimétrica (ADMA) e/ou dimetilargininasimétrica (SDMA). O perfil metabólico resultante pode ser usado para avali-ar o estado de saúde de um indivíduo (por exemplo, um ser humano), talcomo a presença ou ausência de um distúrbio metabólico ou um distúrbiovascular (por exemplo, um distúrbio cardiovascular ou um distúrbio hiperten-sivo).

Espectrometria de massa

A espectrometria de massa em série pode ser usada para dis-tinguir e/ou medir isômeros. Na espectrometria de massa em série, doisanalisadores de massa estão ligados em série via uma célula de colisão. Oprimeiro analisador de massa (MS-1) é usado para selecionar um íon deinteresse (por exemplo, um íon de uma proporção específica de massa paracarga (m/z)). Os íons selecionados são então transferidos para uma célulade colisão onde eles são fragmentados por colisões com um gás inerte. Es-te processo é chamado de dissociação colisionalmente ativada (CAD). De-pois de os íons primitivos (às vezes chamados de precursor) terem sidofragmentados, o segundo analisador de massa (MS-2) é usado para explo-rar e detectar todos os íons filhotes produzidos ou para selecionar e detectaríons de fragmentos particulares.

No exemplo 1 (abaixo), a espectrometria de massa em série foiusada para isolar os íons precursores de ADMA e SDMA, fragmentar os í-ons, e detectar picos específicos que são indicativos da presença destesdois compostos na amostra. SDMA e ADMA são moléculas isoméricas (videfigura 1) e, como tais, têm o mesmo peso molecular (vide figs. 2 e 3). Noentanto, as duas moléculas diferem pela posição de seus dois grupos metil.Como mostrado na figura 1, SDMA tem uma distribuição simétrica da substi-tuição metila com um grupo metila em cada uma das porções nitrogênio deguanidino disponíveis, ao passo que ADMA contém dois grupos metila nomesmo nitrogênio do grupo guanidino.

Em um tipo de espectrometria de massa em série, conhecidacomo exploração dos íons produzidos, os íons primitivos (neste caso SDMAm/z 203 ou ADMA m/z 203) são selecionados em MS-1 e transferidos parauma célula de colisão onde eles fragmentam (exemplificado pelas represen-tações esquemáticas nas figs. 2 e 3). Os fragmentos produzidos por cadaI íon primitivo são detectados por exploração MS-2 resultando em uma ima-gem do íon produzido (ou filhote) de cada íon primitivo selecionado. A figura2 mostra um pico único correspondendo à SDMA em 172 m/z, ao passo quea figura 3 mostra um pico único correspondendo à ADMA em 46 m/z. dessaforma, SDMA e ADMA podem ser distinguidas em uma única amostra emuma análise.

A figura 4 mostra que SDMA, ADMA e arginina podem ser dis-tinguidas em uma única amostra em uma análise usando monitoramento demúltiplas reações (exploração por MRM). Em um tipo de espectrometria demassa em série conhecido como monitoramento de múltiplas reações(MRM), um íon primitivo de interesse é selecionado em MS-1, fragmentadona célula de colisão e um íon de fragmento específico resultante da ativaçãocolisional é selecionado em MS-2 e finalmente detectado. MS-1 e MS-2 sãofixados para selecionar respectivamente os pares de íons primitivo e defragmento correspondentes de interesse para um período de tempo prede-terminado (poucos milissegundos). Esta transição íon primitivo específico-íon produzido pode ser considerada como um canal de detecção. Se fornecessário detectar analitos adicionados, canais de detecção adicionaiscom transições de massa específicas podem ser introduzidos na experiên-cia. Os dados de todas as transições de massa (canais) selecionadas po-dem ser adquiridos em seqüência para obter as informações desejadas. Adetecção e quantificação de SDMA e ADMA em uma mistura podem ser ob-tidas empregando a transição de massa específica para cada um dessescompostos da seguinte maneira: para ADMA: MS-1 fixado para selecionar etransmitir o íon primitivo em m/z 203, MS-2 fixado para selecionar e transmi-tir o íon produzido específico em m/z 46 (canal 1 ou transição de MRM 1); epara SDMA: MS-1 fixado para selecionar e transmitir o íon primitivo em m/z203, MS-2 fixado para selecionar e transmitir o íon produzido específico emm/z 172 (canal 2 ou transição de MRM 2). Estas duas transições de MRMpodem ser medidas seqüencialmente a partir da mesma amostra por umperíodo de tempo predeterminado para detectar a presença e/ou a concen-tração de uma mistura desses compostos em tal amostra. Nestas experiên-cias de MRM, são detectados os íons de fragmento verdadeiros {m/z 46 oum/z 172). No entanto, é o m/z do íon primitivo correspondente que é regis-trado no espectro de MRM.

Devido ao fato de que, neste exemplo, os íons primitivos deSDMA e ADMA têm o mesmo m/z, cada canal gera seu próprio espectrooferecendo resolução completa entre esses dois isômeros. Os espectrosmostrados na figura 4 foram obtidos da maneira descrita acima, no entanto,as transições de massa específicas para arginina foram acrescentadas acada canal para mostrar que quando o m/z dos íons primitivos difere datransição de massa dos analitos, ambas as transições de massa podem serregistradas no mesmo espectro. Estes métodos também podem ser usadospara distinguir outros isômeros moleculares, contanto que, com a fragmen-tação, sejam produzidos íons com proporções m/z diferentes.

A detecção simultânea de arginina (por exemplo, como mostra-do na figura 4) demonstra que padrões internos rotulados com isótopos es-táveis para um ou ambos de ADMA e SDMS podem ser adicionados a umaamostra, com o que pode ser efetuada a quantificação de ADMA e SDMA.Tal marcação de ADMA e SDMA com isótopos resulta em um desvio demassa, embora retendo propriedades físico-químicas muito similares entreos compostos rotulados e não rotulados.

Em geral, é possível adicionar um ou mais padrões internos auma concentração conhecida a uma amostra para permitir a quantificaçãodo analito de interesse (por exemplo, ADMA e/ou SDMA). Por exemplo, pa-ra uma amostra analisada usando espectrometria de massa em série, aproporção dos sinais produzidos por ADMA, SDMA e seus padrões internoscorrespondentes pode ser usada para determinar as quantidades dessescompostos na amostra. Os padrões internos também podem ser adiciona-dos para distinguir moléculas de ocorrência natural (endógenas). Os pa-drões internos podem ser preparados em uma solução de extração antes demisturar uma amostra (por exemplo, uma amostra de sangue) e a soluçãode extração. Alternativamente, os padrões internos podem ser adicionadosà mistura em qualquer etapa na preparação da amostra que garanta queesses padrões internos não serão removidos da mistura durante o proces-samento da amostra (por exemplo depois de uma extração líquido-líquido ouuma extração de fase sólida).

Os padrões internos, ou analitos de referência, para um isômero(ou outras moléculas, por exemplo, biomoléculas descritas neste relatóriodescritivo) detectados por um método descrito nesta invenção podem serqualquer modificação ou análogo de um isômero que é detectável por es-pectrometria de massa. Um analito de referência é separadamente detectá-vel na biomolécula com base em características físicas únicas, tal como umamassa ou proporção de massa para carga única. Como descrito acima, umpadrão interno comumente usado para espectrometria de massa é uma for-ma isotopicamente rotulada estável ou um derivado químico de um isômero.Por exemplo, análogos rotulados com isótopos estáveis podem ser usadospara quantificar SDMA e ADMA usando a técnica conhecida como espec-trometria de massa por diluição de isótopos onde o analito e os padrões in-ternos são processados na mesma amostra. Padrões internos podem sercriados de modo que 1) a marcação cause um desvio na massa de pelomenos 1 unidade de massa e 2) nenhum dos rótulos de isótopos estáveisfique localizado em sítios lábeis para prevenir alterações. Os rótulos podemser 2H (D)1 15N, 13C ou 18O em qualquer combinação. A localização real dosrótulos na molécula pode variar desde que o pré-requisito 2 (acima) seja sa-tisfeito. Além disso, a posição dos rótulos da alteração potencial na massados íons de fragmento também pode ser usada para confirmar separação dopadrão interno e analitos. Exemplos de padrões internos potenciais úteisnos métodos descritos nesta invenção incluem, porém sem limitação:

<formula>formula see original document page 21</formula>

Vários tipos de espectrômetros de massa encontram-se disponí-veis ou podem ser produzidos com várias configurações, todos eles poden-do ser úteis nos métodos descritos nesta invenção. Em geral, um espec-trômetro de massa possui os seguintes componentes principais: uma entra-da de amostra, uma fonte iônica, uma célula de colisão, um analisador demassa, um detector, um sistema de vácuo, e um sistema de controle do ins-trumento, e um sistema de dados. Uma diferença na entrada de amostra,fonte iônico, e analisador de massa geralmente define o tipo de instrumentoe suas capacidades. Por exemplo, uma entrada pode ser uma fonte de cro-matografia líquida em coluna capilar ou pode ser uma sonda ou plataformadireta tal como usada em dessorção a laser assistida por matriz. Fontesiônicas comuns são, por exemplo, "electropulverização", incluindo "nanopul-verização" e "micropulverização" ou dessorção a laser assistida por matriz.

Analisadores de massa comuns incluem filtros de massa quadrupolares,analisadores de massa por tempo de vôo (de preferência um analisador demassa por tempo de vôo de aceleração ortogonal), filtros de massa com si-fão de íons, analisadores com setor magnético, ou analisadores de massapor ressonância ciclotrônica de íons por transformada de Fourier ("FTICR").

A célula de colisão pode ser, por exemplo, um conjunto de hastes quadrupo-lares, um conjunto de hastes hexapolares, ou um conjunto de hastes octo-polares. A célula de colisão de preferência forma um envoltório substanci-almente estanque a gás distante da entrada de íons e da abertura de saídade íons. Um gás de colisão tal como hélio, argônio, nitrogênio, ar ou metanopode ser introduzido na célula de colisão.

Os exemplos específicos descritos neste relatório descritivo fo-ram realizados usando espectrômetros de massa em série (vide, por exem-plo, o exemplo 1).

Amostras adequadas para os métodos descritos nesta invençãoincluem qualquer líquido biológico, célula, tecido, ou fração dos mesmos,que inclui biomoléculas indicativas de um estado metabólico. Uma amostrapode ser, por exemplo, um espécime obtido de um indivíduo (por exemplo,um mamífero tal como um ser humano) ou pode ser derivada de tal indiví-duo. Por exemplo, uma amostra pode ser uma seção de tecido obtida porbiópsia, ou células que são colocadas em cultura de tecido ou adaptadaspara cultura de tecido. Amostras exemplificativas das mesmas incluem fi-broblastos cultivados, células de fluído amniótico cultivadas, e amostras devilo coriônico. Uma amostra também pode ser um espécime de um líquidobiológico tal como urina, sangue, plasma, soro, saliva, sêmen, cuspe, fluídocerebrospinhal, lágrimas, muco, e outros. Uma amostra pode ser ainda fra-cionada, se desejado, em uma fração contendo tipos específicos de células.Por exemplo, uma amostra de sangue pode ser fracionada em soro ou emfrações contendo tipos particulares de células sangüíneas tais como célulassangüíneas vermelhas ou células sangüíneas brancas (leucócitos). Se de-sejado, uma amostra pode ser uma combinação de amostras de um indiví-duo tal como uma combinação de uma amostra de tecido e de líquido, e ou-tras. Métodos para obter amostras que preservam a atividade ou integrida-de das moléculas na amostra são bastante conhecidos pelos versados natécnica. Tais métodos incluem o uso de tampões e/ou inibidores apropria-dos, que incluem inibidores de nuclease, protease e fosfatase, que preser-vam ou minimizam alterações nas moléculas na amostra. Tais inibidoresincluem, por exemplo, quelantes tais como ácido etilenodiaminatetraacético(EDTA), ácido bis(P-aminoetil éter)N,N,N1 ,N1-tetraacético de etileno glicol(EGTA), inibidores de protease tais como fluoreto de fenilmetilsulfonila(PMSF), aprotinina, leupeptina, antipaína e outros, e inibidores de fosfatasetais como fosfato, fluoreto de sódio, vanadato e outros. Tampões e condi-ções apropriados para isolar moléculas são bastante conhecidos pelos es-pecialistas na técnica e podem variar dependendo, por exemplo, do tipo demolécula na amostra a ser caracterizada (vide, por exemplo, Ausubel et al.Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons,New York (1999); Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (ColdSpring Harbor Laboratory Press (1988); Harlow & Lane, Using Antibodies: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1999); Tietz Textbook of Cli-nicai Chemistry, 3rd ed. Burtis & Ashwood, eds. W.B. Saunders, Philadel-phia, (1999)). Uma amostra também pode ser processada para eliminar ouminimizar a presença de substâncias interferentes. Para uso nos métodosdescritos nesta invenção, uma amostra pode estar em vários estados físi-cos. Por exemplo, uma amostra pode ser um líquido ou sólido, pode serdissolvida ou suspendida em um líquido, pode estar em uma emulsão ougel, e pode ser absorvida em um material. Como um exemplo não limitativo,uma amostra pode ser uma amostra de sangue líquido, amostra de soro lí-quido, amostra de célula branca líquida, sangue seco, soro, ou amostra decélula branca, ou uma tal amostra absorvida em um substrato de papel oupolímero.

Antes de efetuar a espectrometria de massa, uma amostra podeser extraída usando uma solução de extração (vide abaixo). Para os méto-dos descritos nesta invenção, uma amostra (por exemplo, uma amostra ex-traída) não requer outras modificações químicas antes da análise usandoespectrometria de massa em série. Por exemplo, uma etapa de derivatiza-ção particular não é um requisito para detecção específica e simultânea deADMA e SDMA. No entanto, se a detecção de outros analitos na amostrarequer algum tipo de derivatização da amostra, esta derivatização pode ser aplicada à SDMA e ADMA se apropriado ou adequado. Neste caso, a mas-sa dos íons primitivos para SDMA e ADMA vai ser alterada mas a naturezaespecífica dos íons produzidos a partir de SDMA e ADMA, não. Por exem-plo, se for necessária uma etapa de esterificação para detectar e medir umgrupo de analitos tais como acilcarnitinas ou aminoácidos, SDMA e ADMAtambém podem ser esterificadas, esterificação esta que não afeta a detec-ção específica e simultânea de ADMA e SDMA ou dos analitos adicionais.Mais especificamente, se os analitos extraídos precisarem ser convertidosem ésteres butílico, SDMA e ADMA também podem ser convertidas em és-teres butílicos. Neste caso a massa e portanto a m/z para SDMA e ADMAserão alteradas de 203 para 259. No entanto, a produção dos picos de m/zem 46 e 172 específicos para ADMA e SDMA1 respectivamente, permaneceinalterada. Portanto, SDMA e ADMA derivatizadas podem ser detectadasmonitorando-se os canais MS-1 e MS-2 de MRM 259 a 46 para ADMA e 259a 172 para SDMA. Uma etapa de butilação pode ser usada para a análisede aminoácidos e acilcartininas presentes em amostras de sangue total se-cadas em papel-filtro (ou outras amostras). Por conseguinte, a espectrome-tria de massa pode ser usada para detectar SDMA e ADMA a partir de taisI amostras ao mesmo tempo que, por exemplo, aminoácidos, acilcarnitinas, eoutros analitos.

Em algumas aplicações dos métodos descritos nesta invenção,um ácido orgânico tal como ácido oxálico pode ser adicionado a uma solu-ção de extração ou diretamente a uma amostra. Por exemplo, o ácido orgâ-nico pode ser adicionado até uma concentração final de cerca de 0,1% (porexemplo, cerca de 0,01%, cerca de 0,05%, cerca de 0,15%, cerca de 0,2%,cerca de 0,25%, cerca de 0,3%, cerca de 0,4%, cerca de 0,45%, ou cercade 0,5%) v/v na amostra extraída. Se o ácido orgânico for adicionado à a-mostra antes da extração, as condições podem minimizar a perda do ácidoorgânico. Em algumas aplicações, um ácido orgânico pode ser adicionado auma solução (por exemplo, uma solução de limpeza ou enxágüe) injetada namáquina subsequente à análise de uma amostra.

Aplicações exemplificativas

Os métodos descritos nesta invenção podem ser usados paraobter um perfil molecular para uma amostra. O perfil pode incluir informa-ções que indicam se um isômero molecular particular está presente e tipi-camente inclui informações sobre a presença (seja qualitativa ou quantitati-va) de cada isômero de um grupo particular.

Em algumas aplicações desses métodos de espectrometria demassa, é possível obter perfis metabólicos para um indivíduo (por exemplo,um ser humano). Por exemplo, os perfis podem incluir o nível de ADMAe/ou SDMA em um indivíduo (por exemplo, um ser humano). Outras biomo-léculas também podem ser detectadas, quantificadas, e/ou avaliadas, inclu-indo, por exemplo, um ou mais de NMMA, ornitina, citrulina, homocisteína ecreatinina, em uma amostra biológica usando espectrometria de massa emsérie. As informações resultantes (perfil metabólico) podem ser usados pa-ra avaliar o estado de saúde de um indivíduo (por exemplo, um ser huma-no), tal como a presença ou ausência de um distúrbio, por exemplo, metabó-lico ou vascular (por exemplo, distúrbio hipertensivo ou cardiovascular), oupara avaliar o risco de um distúrbio.

O estado metabólico de um indivíduo (por exemplo, um mamífe-ro tal como um ser humano) pode ser refletido, por exemplo, pela presença,quantidade, proporções, e modificações de aminoácidos no corpo. Metila-ção pós-tradução é um exemplo de uma modificação de aminoácidos quepode ser indicativa de um estado metabólico. Os principais produtos de me-tilação produzidos durante o andamento de renovação de proteínas sãoADMA e SDMA. Essas formas metiladas de arginina têm papéis importan-tes na função normal de um organismo, e portanto aumentos ou reduçõesanormais em suas quantidades podem alterar funções fisiológicas em umorganismo. Como um exemplo, ADMA, assim como um outro derivado dearginina, NMMA (monometil arginina), são inibidores conhecidos para a en-zima, óxido nítrico sintase endotelial (eNOS). eNOS desempenha um papelna regulação das funções endoteliais e cardiovasculares (vide, por exemplo,King et al. (1995) Reprod. Fértil. Dev. 7(6):1581-1584 e Jin et al. (1996) JCardiovasc. Pharmacol. 28(3):439-446). Quando as de ADMA em um orga-nismo aumentam, a atividade de eNOS é inibida, e o resultado fisiológico éfunção endotelial reduzida, uma condição que ocorre em muitas doençasque incluem hipertensão, pré-eclâmpsia, diabetes, insuficiência renal e hi-percolesterolemia. A SDMA não inibe eNOS, mas possui a mesma via quea ADMA para entrada de células e pode por conseguinte afetar a funçãoendotelial. Como um exemplo, vários estudos mostraram níveis de SDMAalterados em indivíduos com distúrbios renais (vide por exemplo Lluch P. etal. (2006) Experimental Biology and Medicine 231:70-75 e Kielstein J.T. etal. (2006) Nephrology Dialysis Transplantation 21(9):2446-2451.)

A quantidade e/ou proporções de outros aminoácidos tambémpodem refletir um estado de função endotelial e distúrbios correspondentes.Por exemplo, arginina é convertida em citrulina e oxido nítrico, que é um ou-tro mediador na função endotelial. Além disso, a ADMA é convertida emcitrulina e dimetilamina (DMA). A quantidade de arginina e/ou citrulina podeassim revelar um estado da função das células endoteliais. Vários estudosmostraram relações de níveis de ADMA e outras biomoléculas e estadospatológicos. Por exemplo, Millatt et al. ((2003) Circulation 108(12):1420-1)apresentaram dados demonstrando que o modelo de rato de hipertensãoI pulmonar crônica induzida por hipoxia está associado a concentrações pul-monares aumentadas do inibidor de NOS ADMA. Além disso, os ratos comhipertensão pulmonar apresentaram expressão pulmonar e atividade reduzi-das da enzima metabolizadora de ADMA DDAH I. Homocisteína e creatini-na são outras biomoléculas que desempenham papéis em doenças vascula-res. Por exemplo, estudos mostraram que a determinação dos níveis dehomocisteína pode ajudar na avaliação do risco cardiovascular em popula-ções hipertensas (vide, por exemplo, Bortolotto et al. (1999) Hypertension34(4 Pt 2):837-42). Além disso, as pesquisas mostraram que quando oxidonítrico sintase é inibida, há produção insuficiente de oxido nítrico. Óxido ní-trico é um vasodilatador; níveis reduzidos de óxido nítrico mostraram-se re-lacionados à hipertensão. Portanto, informações sobre a quantidade de taisbiomoléculas podem ser usadas como um prognosticador para o risco dedesenvolver uma distúrbio hipertensivo ou cardiovascular.

Portanto, a habilidade de distinguir isômeros de dimetilarginina --ADMA e SDMA - seja isolados ou junto com outras biomoléculas (por e-xemplo, biomoléculas metabólica), pode ser útil para avaliar o estado de sa-úde de um indivíduo. Por conseguinte, é possível, ao mesmo tempo, detec-tar outros aminoácidos tais como NMMA, arginina, ornitina, citrulina, e ho-mocisteína, assim como outras biomoléculas tais como creatinina, na amos-tra, por exemplo, identificando picos únicos para tais moléculas na análisepor espectrometria de massa. A Tabela 1 inclui uma lista inesgotável deanalitos (por exemplo, biomoléculas) que podem ser simultaneamente de-tectadas com ADMA e/ou SDMA usando os métodos descritos nesta inven-ção.

Tabela 1

<table>table see original document page 27</column></row><table><table>table see original document page 28</column></row><table>

Um perfil metabólico obtido pelos métodos descritos nesta in-venção podem ser usados para diagnosticar ou prognosticar a suscetibilida-de a uma variedade de distúrbios metabólicos ou vasculares (por exemplo,cardiovasculares ou hipertensivos) porque os indicadores bioquímicos (porexemplo, SDMA e/ou ADMA) examinados podem ser indicativos de tais dis-túrbios, quer ou não que sintomas fisiológicos ou comportamentais do dis-I túrbio tenham se tornado aparentes (por exemplo, alguém com suspeita deter um distúrbio metabólico ou vascular (por exemplo, cardiovascular ou dis-túrbio hipertensivo). Um perfil metabólico como o descrito nesta invençãopode ser útil para monitorar o metabolismo de um indivíduo (por exemplo,um mamífero tal como um ser humano), tal como de alguém passando portratamento para um distúrbio metabólico. Como um exemplo não limitativo,os métodos podem ser usados para determinar a eficácia terapêutica de umtratamento particular. Com base nesta determinação, é possível oferecer aoindivíduo opções terapêuticas adicionais ou alternativas. O perfil metabólicotambém pode ser útil para avaliar a aceitação do de uma modalidade de tra-tamento particular pelo paciente, tal como restrição dietética. Por conse-guinte, a tecnologia descrita nesta invenção é aplicável ao rastreamento,diagnóstico, prognóstico, terapia de monitoramento e aceitação, e qualqueroutra aplicação na qual é útil determinar a presença ou a quantidade degrupos de duas ou mais biomoléculas, tais como duas ou mais de ADMA,SDMA, NMMA, arginina, ornitina, citrulina, homocisteína e creatinina,.

Um perfil metabólico gerado usando os métodos descritos nestainvenção pode ser obtido usando uma variedade de amostras biológicas.Amostras adequadas incluem aquelas descritas acima.

Em um aspecto, um perfil metabólico como o descrito nesta in-venção pode ser usado para a avaliar a presença ou ausência de um dis-túrbio hipertensivo. Distúrbios hipertensivos são as complicações médicascomuns na gravidez, e a causa principal de doenças e morte maternas einfantis em todo o mundo. Eles incluem pelo menos duas entidades diferen-tes: uma (hipertensão induzida pela gravidez, PIH) aparece pela primeiravez durante a gravidez e revertida com o parto. A outra (hipertensão crôni-ca), é uma condição preexistente não associada porém coincidente com agravidez, que pode se manifestar pela primeira durante a gravidez e quenão é resolvida com o parto. Independente do estado de gravidez ou não-gravidez, em muitos casos a hipertensão é resultado de espasmo de vasospequenos (vasoconstricção). Portanto, os principais riscos para o feto resul-tam da perfusão placentária diminuída levando a um suprimento reduzido dooxigênio e nutrientes necessários para o desenvolvimento e bem-estar fetal.Os riscos maternos incluem hipoperfusão de órgãos importantes tais comorim, fígado, e cérebro. Distúrbios hipertensivos incluem, por exemplo, pré-eclâmpsia, eclâmpsia, hipertensão na gravidez (HIP), hipertensão de Gold-blatt, hipertensão adrenal, hipertensão maligna, hipertensão ocular, hiper-tensão renal, ou hipertensão crônica. Distúrbios hipertensivos podem resul-tar em edema cerebral ou renal e hemorragia e derrame.

Em outros aspectos, um perfil metabólico como o descrito nestainvenção pode ser usado para avaliar a presença ou ausência de distúrbioscardiovasculares, tais como hiperhomocisteinamia, diabetes melito, hiperco-lesterolemia, hiperglicemia e resistência à insulina, doença cardíaca corona-riana, doença cerebrovascular, aterosclerose e doença vascular periférica.Um grupo de biomoléculas para detecção usando os métodos descritos nes-ta invenção pode ser selecionado com base na condição patológica particu-lar a ser detectada. As condições patológicas associadas à ADMA, SDMA1NNMA1 arginina, citrulina, e outras, são conhecidas pelos especialistas natécnica. Como um exemplo, condições patológicas associadas à ADMA eoutras biomoléculas estão descritas em Lin & Lin (2004) Acta Cardiol Sin2:201-211. Em alguns casos, é possível gerar um perfil metabólico de umindivíduo já identificado como tendo ou com risco de desenvolver um distúr-bio metabólico ou vascular tal como um distúrbio cardiovascular ou hiperten-sivo, por exemplo, para monitorar a situação do distúrbio do indivíduo, aresposta do indivíduo a uma modalidade de tratamento particular, ou a acei-tação do regime de tratamento por um indivíduo.

Indivíduos de todas as idades podem ser afetados por distúrbiosmetabólicos ou vasculares diagnosticados usando um perfil metabólico des-crito nesta invenção. Portanto, uma amostra usada em um método descritonesta invenção pode ser obtida de um indivíduo (por exemplo, um ser hu-mano) de qualquer idade, incluindo um neonato, recém-nascido, bebê, cri-ança, e adulto, tal como uma mulher grávida. Os métodos também podemser usados para indivíduos com risco de desenvolver um distúrbio metabóli-co ou vascular. Tais indivíduos incluem aqueles que têm (i) um históricofamiliar de (um pré-disposição genética) para tais distúrbios ou (ii) um oumais fatores de risco para desenvolver tais distúrbios. Fatores de risco e-xemplificativos para distúrbios cardiovasculares ou hipertensivos incluem:exposição a estresse prolongado (emocional ou físico), fumo, uma dieta ricaem gorduras ou colesterol, um estilo de vida sedentário, ou um ou mais me-dicamentos que aumentam a pressão sangüínea.

Os métodos descritos nesta invenção envolvem determinar apresença ou a quantidade de pelo menos duas biomoléculas (por exemplo,dois ou mais isômeros), por exemplo simultaneamente, onde a presença ouquantidade de cada biomolécula está correlacionada com a presença ouausência de um distúrbio metabólico, cardiovascular, ou hipertensivo. Osmétodos descritos nesta invenção podem ser usados quantitativamente, sedesejado, para possibilitar a comparação dos resultados de amostras deteste com uma quantidade padrão conhecida ou predeterminada de um ana-lito(s) particular(es) (por exemplo, usando um padrão interno como descritoacima). Os métodos também podem ser usados quantitativamente quandouma amostra de teste é comparada com uma amostra de referência, quepode ser uma referência normal ou uma referência de distúrbio metabólico.Neste formato, a quantidade relativa de biomoléculas pode ser indicativa deum distúrbio metabólico. Uma amostra de referência, por exemplo, pode serde um indivíduo que tem, sem suspeita de ter, sem o risco de desenvolverum distúrbio tal como um distúrbio metabólico ou vascular (por exemplo,distúrbio cardiovascular ou hipertensivo).

Geralmente, um valor de corte para uma dada biomolécula podevariar e seria conhecido na literatura para analitos e enzimas comumentetestados. Adaptações rotineiras óbvias de métodos conhecidos na literaturapodem ser usadas para estabelecer valores de corte para analitos raramen-te testados. Um valor de corte é tipicamente uma quantidade de biomolécu-la, ou proporção com uma outra biomolécula, acima ou abaixo do qual éconsiderado indicativo de um distúrbio metabólico ou causa para um novoexame. Portanto, de acordo com a tecnologia descrita nesta invenção umnível de referência de pelo menos uma biomolécula em um tipo de amostraparticular é identificado como um valor de corte, acima do qual existe umacorrelação significativa entre a presença da pelo menos uma biomolécula ea presença (ou ausência) de um distúrbio metabólico. Deve ficar entendidoque grupos de biomoléculas podem ser interpretados como um todo, empartes ou em termos de analito por analito.

Os versados na técnica vão reconhecer que alguns valores decorte não são absolutos no sentido de que correlações clínicas ainda sãosignificativas em uma gama de valores em qualquer lado do corte; no entan-to, é possível selecionar um valor de corte ótimo (por exemplo escores de Hvariáveis, e outros) da biomolécula para tipos de amostras particulares. Osvalores de corte determinados para uso nos métodos descritos nesta inven-ção geralmente são comparados com limites publicados mas podem ser in-dividualizados para a metodologia usada e para a população de pacientes.Deve ficar entendido que aprimoramentos nos valores de corte ótimos po-dem ser determinados dependendo da sofisticação dos métodos estatísticosusados e do número e fonte das amostras usadas para determinar valoresde nível de referência para as diferentes biomoléculas e tipos de amostras.Portanto, os valores de corte estabelecidos podem ser ajustados para maisou para menos, com base em reavaliações periódicas ou mudanças na me-todologia ou distribuição da população. Além disso, valores de corte especí-ficos para o instrumento podem ser usados, se desejado, por exemplo talcomo quando a comparabilidade de desempenho inter-instrumentos é <10%.

O nível de referência pode ser determinado por uma variedadede métodos, contanto que o nível de referência resultante forneça precisa-mente uma quantidade de cada biomolécula acima que existe em um pri-meiro grupo de indivíduos (por exemplo, seres humanos) tendo uma proba-bilidade de distúrbio metabólico diferente de um segundo grupo de indiví-duos tendo uma quantidade de atividade de analito ou enzima metabólicosabaixo do nível de referência. O nível de referência pode ser determinadopor comparação da quantidade de biomoléculas, por exemplo, em popula-ções de indivíduos (por exemplo, pacientes) com o mesmo distúrbio metabó-lico. Isto pode ser realizado, por exemplo, por análise de histograma, naqual um grupo inteiro de pacientes são graficamente representados, ondeum primeiro eixo representa a quantidade de biomolécula e um segundoeixo representa o número de indivíduos no grupo cuja amostra contém umaou mais biomoléculas em uma quantidade dada. Dois ou mais grupos sepa-rados de indivíduos podem ser determinados por identificação de subgruposde populações do grupo que têm o mesmo nível de biomoléculas ou níveissimilares de biomoléculas. A determinação do nível de referência pode en-tão ser feita com base em uma quantidade que melhor distingue esses gru-pos separados. O nível de referência pode ser um único número, igualmen-te aplicável a cada indivíduo, ou o nível de referência pode variar, de acordocom as subpopulações específicas de indivíduos. Por exemplo, indivíduosmais velhos podem ter um nível de referência diferente de indivíduos maisjovens para o mesmo distúrbio metabólico. Além disso, um indivíduo comdoença mais avançada (por exemplo, uma forma mais avançada de um dis-túrbio cardiovascular) pode ter um valor de referência diferente do de umaforma mais branda da doença.

Métodos para identificar compostos que modulam os níveis de ADMA ouSDMA

Também são fornecidos nesta invenção métodos para identificarcompostos que modulam (por exemplo, diminuem) os níveis de ADMA e/ouSDMA em uma célula. Como níveis desregulados destes dois metabólicossão associados a um maior risco de certos distúrbios (por exemplo, distúr-bios cardiovasculares e hipertensivos), os compostos identificados destamaneira podem ser úteis no tratamento de distúrbios cardiovasculares e hi-pertensivos. Células que podem ser contatadas com o composto candidatopodem ser de qualquer espécie desde que as células produzam ADMA ouSDMA (seja sinteticamente ou naturalmente). As células podem ser célulasou linhagens de células primárias e podem ser de qualquer tipo histológico,por exemplo, sem limitação, células epiteliais, fibroblastos, células linfóides,macrófagos/monócitos, granulócitos, queratinócitos, células neuronais, oucélulas musculares. As células podem ser cultivadas em pratos de culturade tecido. Geralmente é preferível cultivar as células em placas de ensaiode múltiplos compartimentos (por exemplo placas de ensaio de 96 compar-timentos ou de 384 compartimentos) para que vários compostos candidatospossam avaliados ao mesmo tempo. O composto candidato (opcionalmentea várias concentrações variando, por exemplo, de 0,001 nM a 10 mM) podeser adicionado a uma solução (por exemplo, meio de cultura) contendo ascélulas ou, quando o composto é uma proteína, as células podem expressaro mesmo de forma recombinante. Subsequente à incubação das célulasexpressando ADMA e/ou SDMA, a presença ou o nível de ADMA e/ou SDMApode ser determinado usando os métodos de espectrometria de massa des-critos nesta invenção. Antes da detecção, as células podem ser Iisadas emcondições que permitam que seja preparada uma amostra que seja compa-tível com espectrometria de massa em série. Geralmente um composto decontrole pode ser adicionado a um grupo de células seja para controle posi-tivo ou para controle negativo. Por exemplo, um composto que se sabe au-mentar ou diminuir a quantidade de ADMA ou SDMA pode ser adicionado aum grupo de células (por exemplo, um composto que inibe a proteína argini-na metiltransferase; vide, por exemplo, Leiper et al. (2005) Eur. J Clin.Pharma. 62(Supp1):33-35). Um composto que se sabe não modular o nívelde ADMA ou SDMA também pode ser adicionado a um grupo de células.

Os compostos identificados em qualquer um dos métodos des-critos nesta invenção incluem várias classes químicas. Os compostos po-dem ser biomoléculas incluindo, porém sem limitação, peptídios, polipeptí-dios, peptidomiméticos (por exemplo, peptóides), aminoácidos, análogos deaminoácidos, sacarídeos, ácidos graxos, esteróides, purinas, pirimidinas,derivados ou análogos estruturais dos mesmos, polinucleotídeos, e análo-gos de polinucleotídeos. Os compostos podem ser compostos de moléculaspequenas ou compostos de moléculas grandes.

A identificação dos compostos de teste através do uso de váriasbibliotecas descritas nesta invenção permite a subsequente modificação docomposto de teste "hit" ou "lead" para otimizar a capacidade do "hit" ou "le-ad" de modular os níveis de ADMA e/ou SDMA em uma célula.

Deve ficar entendido que modificações que não afetam substan-cialmente a atividade das várias modalidades desta invenção também estãoincluídas na definição da invenção oferecida neste relatório descritivo. Porconseguinte, o exemplo a seguir pretende ilustrar, e não limitar, a presenteinvenção.

Exemplo 1

Este exemplo descreve uma experiência na qual ADMA e SDMApresentes em uma única amostra foram distinguidos usando espectrometriade massa. A amostra foi preparada inoculando ADMA e SDMA em sanguetotal em concentrações aproximadamente equimolares. Arginina também foiinoculada na mesma alíquota de sangue para servir como uma referência deintensidade relativa. O sangue foi então distribuído em papel-filtro e deixadosecar à temperatura ambiente por 24 horas. Pequenas punções (1/8" cada)foram excisadas da amostra de sangue seco e distribuídas nos comparti-mentos de uma placa de microtitulação. As punções com mancha de san-gue assim produzidas foram então extraídas na placa de microtitulação comuma solução aquosa de metanol (contendo 80% de metanol, 20% de água e0,1% de ácido acético) por aproximadamente 30 minutos. O extrato foi inje-tado diretamente, com a ajuda de um auto-classificador, no espectrômetrode massa sem modificação química posterior e sem qualquer separaçãocromatográfica nítida ("upfront") (por exemplo, HPLC preliminar). As experi-ências foram realizadas usando um quadrupolo triplo Sciex API 2000 ou umquadrupolo triplo Waters Quattro Micro. Os dois espectrômetros de massaestavam equipados com "electropulverização" como fontes de íons.

A análise por espectrometria de massa em série da amostraconsistiu em dois grupos de canais de monitoramento de múltiplas reações(MRM). Em um grupo, foram monitoradas as seguintes transições de mas-sa: m/z 175 para m/z 70 e m/z 203 para m/z 46 (vide figs. 2 e 3). A primeiratransição de massa corresponde a uma fragmentação específica para argi-nina e a segunda a uma fragmentação específica para ADMA. No segundogrupo de canais de MRM, a arginina e SDMA foram monitoradas pelas se-guintes transições de massa: m/z 175 para m/z 70 e m/z 203 para m/z 172para arginina e SDMA, respectivamente. A transição para arginina corres-ponde à perda neutra de 105 unidades de massa atômica (amu) e represen-ta a perda nominal dos grupos carboxílico e guanidino do íon protonado. Atransição específica para ADMA representa a formação do íon de dimetilamônio a partir da ADMA protonada e a transição específica para SDMArepresenta a perda neutra de 31 amu que é equivalente à perda neutra dametil amina.

Mesmo sem quantificação absoluto, o exame das intensidadesde ADMA e SDMA em relação às intensidades da arginina diferencia estesdois íons isoméricos. Neste exemplo pode-se ver que a intensidade daSDMA em relação àquela da arginina é maior que aquela da ADMA contra aarginina. Esta tendência indica que esses dois isômeros apresentam sensi-bilidade diferencial na experiência de espectrometria de massa em série. Asmedidas de arginina, SDMA e ADMA podem ser afetadas por moléculas re-siduais (transporte) de analito (por exemplo, ADMA ou SDMA) remanescen-tes no espectrômetro de massa. A adição de ácido oxálico à preparação deamostra reduziu significativamente os efeitos de transporte observados. Afigura 4 mostra um exemplo dos espectros de MRM do exemplo descritoacima.

Embora a presente invenção tenha sido descrita com referênciaa modalidades específicas da mesma, deve ficar entendido pelos versadosna técnica que várias alterações podem ser feitas e equivalentes podem sersubstituídos sem se afastar do verdadeiro espírito e escopo da invenção.Além disso, muitas modificações podem ser feitas para adaptar uma situa-ção particular, material, composição de matéria, processo, etapa ou etapasdo processo, ao objetivo, espírito e escopo da presente invenção. Todasestas modificações devem ser consideradas dentro do escopo da presenteinvenção.

Claims (128)

1. Método para distinguir isômeros de dimetilarginina, o métodocompreendendo:ionizar uma amostra para gerar íons;selecionar íons tendo uma proporção de massa para carga (m/z)em uma faixa de m/z,fragmentar os íons selecionados para produzir íons filhotes; edetectar uma ou ambas de dimetilarginina assimétrica (ADMA) edimetilarginina simétrica (SDMA) na amostra por detecção de um ou ambosdo sinal m/z de um íon filhote em um m/z único para ADMA e do sinal m/zde um íon filhote em um m/z único para SDMA.

2. Método para distinguir isômeros de dimetilarginina, o métodocompreendendo:ionizar uma amostra para gerar íons;selecionar íons tendo uma proporção de massa para carga (m/z)em uma faixa de m/z,fragmentar os íons selecionados para produzir íons filhotes; edetectar uma ou ambas da presença do sinal m/z de um íon fi-lhote a cerca de m/z 46 e da presença do sinal m/z de um íon filhote a cercade m/z 172, em que o sinal m/z de um íon filhote a cerca de m/z 46 indicaque a amostra compreende dimetilarginina assimétrica (ADMA) e o sinal m/zde um íon filhote a cerca de m/z 172 indica que a amostra compreende di-metilarginina simétrica (SDMA).

3. Método para detectar dimetilarginina simétrica (SDMA), o mé-todo compreendendo:ionizar uma amostra para gerar íons;selecionar íons tendo uma proporção de massa para carga (m/z)em uma faixa de m/z,fragmentar os íons selecionados para produzir íons filhotes; edetectar dimetilarginina simétrica (SDMA) na amostra por detec-ção do sinal m/z de um íon filhote a cerca de m/z 172.

4. Método para detectar dimetilarginina assimétrica (ADMA), ométodo compreendendo:ionizar uma amostra para gerar íons;selecionar íons tendo uma proporção de massa para carga {m/z)em uma faixa de m/z,fragmentar os íons selecionados para produzir íons filhotes; edetectar dimetilarginina assimétrica (ADMA) na amostra por de-tecção do sinal m/z de um íon filhote a cerca de m/z 46.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4,em que a faixa de m/z é cerca de m/z 203.

6. Método para detectar isômeros de dimetilarginina, o métodocompreendendo:fornecer uma amostra que inclui um ou mais padrões internos,em que pelo menos um padrão interno é um isômero de dimetilarginina con-tendo pelo menos um átomo pesado;ionizar uma amostra para gerar íons;selecionar íons tendo uma faixa de m/z correspondente à faixaque é adequada para isolar isômeros de dimetilarginina e selecionar íons emuma ou mais faixas de m/z adicionais, as faixas sendo adequadas para iso-lar o um ou mais padrões internos; .fragmentar os íons selecionados para produzir íons filhotes;detectar dimetilarginina assimétrica (ADMA) e/ou dimetilargininasimétrica (SDMA) na amostra por detecção de um ou mais do sinal m/z deum íon filhote único para ADMA e/ou um ou mais do sinal m/z de um íonfilhote único para SDMA usando os íons filhotes; edetectar o um ou mais padrões internos.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que a faixa dem/z correspondente à faixa que é adequada para isolar isômeros de dimeti-larginina é cerca de m/z 203.

8. Método de acordo com a reivindicação 6 ou 7, em que a a-mostra inclui um primeiro padrão interno que é um isômero de SDMA tendopelo menos um átomo pesado, e um segundo padrão interno que é um isô-mero de ADMA tendo pelo menos um átomo pesado e ern que os isômerosde SDMA e de ADMA têm pesos atômicos diferentes .8. Método de acordo com a reivindicação 6 ou 7, em que a a-mostra inclui um primeiro padrão interno que é um isômero de SDMA tendopelo menos um átomo pesado, e um segundo padrão interno que é um isô-mero de ADMA tendo pelo menos um átomo pesado e em que os isômerosde SDMA e de ADMA têm pesos atômicos iguais.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8,compreendendo ainda medir o nível de SDMA na amostra.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9,compreendendo ainda medir o nível de ADMA.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1--10, compreendendo ainda medir o nível de SDMA e de ADMA.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1--11, em que a amostra que é ionizada é uma amostra biológica.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, em que a amos-tra biológica compreende sangue, soro, plasma, linfa, fluído amniótico, sali-va, fluído cerebrospinhal, fluído lacrimal, muco, urina, cuspe, ou suor.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1--13, em que a amostra que é ionizada contém compostos além da dimetilar-ginina.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1--14, em que a amostra que é ionizada contém compostos que não co-migramem uma coluna de cromatografia por exclusão de tamanho.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1--14, em que são detectados um ou mais analitos adicionais.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o um oumais analitos adicionais são biomoléculas metabólicas.

18. Método de acordo com a reivindicação 16 ou 17, em que oum ou mais analitos adicionais são aminoácidos.

19. Método de acordo com a reivindicação 16 ou 17, em que oum ou mais analitos adicionais são acilcarnitinas.

20. Método de acordo com a reivindicação 16 ou 17, em que oum ou mais analitos adicionais são selecionados do grupo que consiste em:citrulina, dimetilamina, arginina, ortnitina, homocisteína, e creatina.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 16-20, em que o um ou mais analitos adicionais são medidos.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o um oumais analitos adicionais são medidos usando espectroscopia de massa emsérie.

23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-22, em que a amostra não é quimicamente modificada antes da ionizaçãoda amostra.

24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-22, em que a amostra é quimicamente modificada antes da ionização daamostra.

25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-24,em que um padrão interno é adicionado à amostra antes da ionização daamostra.

26. Método de acordo com as reivindicações 1-5 ou 9-25, emque o padrão interno compreende um isômero de dimetilarginina que incluipelo menos um átomo pesado.

27. Método de acordo com as reivindicações 1-5 ou 9-25, emque o padrão interno contém um isômero de SDMA de referência tendo pelomenos um átomo pesado, e um isômero de ADMA de referência tendo pelomenos um átomo pesado e em que os isômeros de SDMA e de ADMA dereferência têm pesos atômicos diferentes.

28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1--27, em que o nível de um sinal a cerca de m/z 46 e o nível de um sinal a cer-ca de m/z 172 são medidos.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, compreendendoainda determinar o resultado de uma função dependente do sinal m/z de íonfilhote a cerca de m/z 46 e do sinal m/z de íon filhote a cerca de m/z 172.

30. Método para diagnosticar um distúrbio caracterizado por ní-veis alterados de ADMA ou SDMA, o método compreendendo:fornecer uma amostra biológica de um indivíduo;ionizar a amostra biológica para gerar íons;selecionar íons tendo uma proporção de massa para carga (m/z)em uma faixa de m/z,fragmentar os íons selecionados para produzir íons filhotes; emedir o nível de ADMA em função do sinal m/z de um íon filhotea cerca de m/z 46 e o nível de SDMA em função do sinal m/z de um íon fi-lhote a cerca de m/z 172,em que um nível alterado de um ou ambos de ADMA e SDMAna amostra biológica em relação ao nível em uma amostra de referência éuma indicação de que o indivíduo tem, ou corre o risco de desenvolver, umdistúrbio caracterizado por níveis alterados de ADMA ou SDMA.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, em que o distúr-bio é caracterizado por níveis de ADMA aumentados.

32. Método de acordo com a reivindicação 30 ou 31, em que odistúrbio é caracterizado por níveis de SDMA aumentados.

33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 30--32, em que o distúrbio é caracterizado por níveis de ADMA aumentados eníveis de SDMA aumentados.

34. Método de acordo com a reivindicação 30, em que o distúr-bio caracterizado por níveis alterados de ADMA ou SDMA é um distúrbiovascular.

35. Método de acordo com a reivindicação 30, em que o distúr-bio caracterizado por níveis alterados de ADMA ou SDMA é um distúrbiorenal.

36. Método de acordo com a reivindicação 30, em que o distúr-bio caracterizado por níveis alterados de ADMA ou SDMA é um distúrbiohipertensivo.

37. Método de acordo com a reivindicação 36, em que o distúr-bio hipertensivo é pré-eclâmpsia.

38. Método para diagnosticar um distúrbio vascular em um indi-víduo, o método compreendendo:fornecer uma amostra biológica de um indivíduo;ionizar a amostra biológica para gerar íons;selecionar íons tendo uma proporção de massa para carga {m/z)em uma faixa de m/z,fragmentar os íons selecionados para produzir íons filhotes; emedir um ou ambos do nível de ADMA em função do sinal m/zde um íon filhote a cerca de m/z 46 e do nível de SDMA em função do sinalm/z de um íon filhote a cerca de m/z 172,em que um nível elevado de um ou ambos de ADMA e SDMAna amostra biológica em relação ao nível em uma amostra de referência éuma indicação de que o indivíduo tem, ou corre o risco de desenvolver, umdistúrbio vascular.

39. Método de acordo com as reivindicações 30-38, em que afaixa de m/z é cerca de m/z 203.

40. Método de acordo com as reivindicações 30-39, em que aamostra biológica que é ionizada contém compostos além da dimetilarginina.

41. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 30--40, em que o indivíduo é um mamífero.

42. Método de acordo com a reivindicação 41, em que o mamí-fero é um ser humano.

43. Método de acordo com a reivindicação 38-42, em que o dis-túrbio vascular é um distúrbio cardiovascular.

44. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 38--40, em que o distúrbio vascular é um distúrbio hipertensivo.

45. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 38--40, em que o distúrbio vascular é selecionado do grupo que consiste em:diabetes, hipercolesterolemia, insuficiência renal, hipertensão, e pré-eclâmpsia.

46. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 38--45, em que o distúrbio vascular é aterosclerose.

47. Método de acordo com a reivindicação 44, em que o distúr-bio hipertensivo é pré-eclâmpsia.47. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 38--46, em que o nível do sinal m/z de um íon filhote a cerca de m/z 46 e o níveldo sinal m/z de um íon filhote a cerca de m/z 172 é medido.

48. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 38--46, em que a amostra de referência é de um indivíduo que não tem, não temsuspeita de ter, nem corre o risco de desenvolver um distúrbio cardiovascular.

49. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 30--48, compreendendo ainda medir um ou mais analitos adicionais.

50. Método de acordo com a reivindicação 49, em que o um oumais analitos adicionais são selecionados do grupo que consiste em: citruli-na, dimetilamina, arginina, ortnitina, homocisteína, e creatina.

51. Método de acordo com a reivindicação 49, em que o um oumais analitos adicionais são aminoácidos.

52. Método de acordo com a reivindicação 49, em que o um oumais analitos adicionais são acilcarnitinas.

53. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 49--52, em que o um ou mais analitos adicionais são medidos usando espec-trometria de massa.

54. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 38--53, compreendendo ainda depois de diagnosticar o indivíduo como tendo,ou correndo o risco de desenvolver, um distúrbio vascular, administrar aoindivíduo um ou mais agentes terapêuticos.

55. Método de acordo com a reivindicação 54, em que o um oumais agentes terapêuticos são um ou mais anti-hipertensivos, um ou maisagentes abaixadores de colesterol, ou um ou mais beta bloqueadores.

56. Método de acordo com a reivindicação 55, em que o um oumais anti-hipertensivos são diuréticos, inibidores da enzima conversora deangiotensina, vasodilatadores, ou alfa bloqueadores.

57. Método de acordo com a reivindicação 55, em que o um oumais agentes abaixadores de colesterol são estatinas.

58. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 30--57, em que a amostra biológica compreende sangue, soro, plasma, linfa,fluído amniótico, saliva, fluído cerebrospinhal, fluído lacrimal, muco, urina,cuspe, ou suor.

59. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 30--58, em que um padrão interno é adicionado a uma amostra biológica antesda ionização da amostra.

60. Método de acordo com a reivindicação 59, em que o padrãointerno compreende um isômero de dimetilarginina que inclui pelo menosum átomo pesado.

61. Método de acordo com a reivindicação 59, em que o padrãointerno contém um isômero de SDMA tendo pelo menos um átomo pesado,e um isômero de ADMA tendo pelo menos um átomo pesado e em que osisômeros de SDMA e de ADMA têm pesos atômicos diferentes .

62. Método para diagnosticar pré-eclâmpsia em um indivíduo, ométodo compreendendo:fornecer uma amostra biológica de um indivíduo;ionizar a amostra biológica para gerar íons;selecionar íons tendo uma proporção de massa para carga (m/z)em uma faixa de m/z,fragmentar os íons selecionados para produzir íons filhotes; emedir um ou ambos do nível de ADMA em função do sinal m/zde um íon filhote a cerca de m/z 46 e do nível de SDMA em função do sinalm/z de um íon filhote a cerca de m/z 172,em que um nível elevado de um ou ambos de ADMA e SDMAna amostra biológica em relação ao nível em uma amostra de referência éuma indicação de que o indivíduo tem, ou corre o risco de desenvolver, pré-eclâmpsia.

63. Método de acordo com a reivindicação 62, em que a faixa dem/z é cerca de m/z 203.

64. Método de acordo com a reivindicação 62 ou 63, em que oindivíduo é um mamífero.

65. Método de acordo com a reivindicação 64, em que o mamí-fero é um ser humano.

66. Método para avaliar a resposta de um indivíduo a um agenteterapêutico, o método compreendendo:fornecer uma amostra biológica de um indivíduo tratado com umagente terapêutico;ionizar a amostra biológica para gerar íons;selecionar íons tendo uma proporção de massa para carga (m/z)em uma faixa de m/z,fragmentar os íons selecionados para produzir íons filhotes; emedir um ou ambos do nível de ADMA em função do sinal m/zde um íon filhote a cerca de m/z 46 e do nível de SDMA em função do sinalm/z de um íon filhote a cerca de m/z 172,em que o mesmo nível ou um nível elevado de um ou ambos deADMA e SDMA na amostra biológica em relação ao nível em uma amostrabiológica obtida do indivíduo antes do tratamento é uma indicação de que oindivíduo não está respondendo ao tratamento e um nível reduzido de umou ambos de ADMA e SDMA na amostra biológica em relação à amostrabiológica obtida do indivíduo antes do tratamento é uma indicação de que oindivíduo está respondendo ao tratamento.

67. Método de acordo com a reivindicação 66, em que o nível deADMA e o nível de SDMA são medidos.

68. Método de acordo com a reivindicação 67, em que a faixa dem/z é cerca de m/z 203.

69. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 66--69, em que a amostra biológica que é ionizada contém compostos além dadimetilarginina.

70. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 66--70, compreendendo ainda: se o indivíduo não está respondendo ao trata-mento, administrar ao indivíduo um ou mais agentes terapêuticos diferentes.

71. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 66--70, em que o indivíduo tem, ou está com suspeita de ter, um distúrbio vascu-lar.

72. Método de acordo com a reivindicação 71, em que o distúr-bio vascular é um distúrbio hipertensivo.

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74. Método de acordo com a reivindicação 71, em que o distúr-bio vascular é selecionado do grupo que consiste em: diabetes, hipercoles-terolemia, insuficiência renal, hipertensão, e pré-eclâmpsia.

75. Método de acordo com a reivindicação 71, em que o distúr-bio vascular é um distúrbio cardiovascular.

76. Método de acordo com a reivindicação 75, em que o distúr-bio cardiovascular é aterosclerose.

77. Método de acordo com a reivindicação 72, em que o distúr-bio hipertensivo é pré-eclâmpsia.

78. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 70--77, em que o um ou mais agentes terapêuticos são um ou mais anti-hipertensivos, um ou mais agentes abaixadores de colesterol, ou um oumais beta bloqueadores.

79. Método de acordo com a reivindicação 78, em que o um oumais anti-hipertensivos são diuréticos, inibidores da enzima conversora deangiotensina, vasodilatadores, ou alfa bloqueadores.

80. Método de acordo com a reivindicação 78, em que o um oumais agentes abaixadores de colesterol são estatinas.

81. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 66--69, compreendendo ainda se o indivíduo estiver respondendo ao tratamen-to, continuar a administrar o mesmo agente terapêutico ao indivíduo.

82. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 66--82, em que o indivíduo é um mamífero.

83. Método de acordo com a reivindicação 82, em que o mamí-fero é um ser humano.

84. Método para fornecer um perfil metabólico para um indiví-duo, o método compreendendo:fornecer uma amostra biológica de um indivíduo;ionizar a amostra biológica para gerar íons;selecionar íons tendo uma proporção de massa para carga (m/z)em uma faixa de m/z,fragmentar os íons selecionados para produzir íons filhotes; edetectar uma ou ambas do sinal m/z de um íon filhote a cerca dem/z 46 e o sinal m/z de um íon filhote a cerca de m/z 172; efornecer um perfil metabólico do indivíduo que inclui um parâme-tro que é função de um ou ambos do sinal m/z de íon filhote a cerca de m/z-46 e do sinal m/z de íon filhote a cerca de m/z 172.

85. Método de acordo com a reivindicação 84, em que em que afaixa de m/z é cerca de m/z 203.

86. Método de acordo com a reivindicação 84 ou 85, em que aamostra biológica que é ionizada contém compostos além da dimetilarginina.

87. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 84--86, em que o nível do sinal m/z de um íon filhote a cerca de m/z 46 e dapresença do sinal m/z de um íon filhote a cerca de m/z 172 são medidos.

88. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 84--87, compreendendo ainda medir um ou mais analitos adicionais.

89. Método de acordo com a reivindicação 88, em que o um oumais analitos adicionais são biomoléculas metabólicas.

90. Método de acordo com a reivindicação 88 ou 89, em que oum ou mais analitos adicionais são selecionados do grupo que consiste em:citrulina, dimetilamina, arginina, ortnitina, homocisteína, e creatina.

91. Método de acordo com a reivindicação 88 ou 89, em que oum ou mais analitos adicionais são aminoácidos.

92. Método de acordo com a reivindicação 88 ou 89, em que oum ou mais analitos adicionais são acilcarnitinas.

93. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 88--92, em que o um ou mais analitos adicionais são medidos usando espec-trometria de massa.

94. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 88--93, em que o indivíduo é um mamífero.

95. Método de acordo com a reivindicação 94, em que o indiví-duo é um ser humano.

96. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 88--95, em que o indivíduo é um indivíduo com suspeita de ter um distúrbio car-diovascular.

97. Perfil metabólico para um indivíduo obtido pelo método com-preendendo:fornecer uma amostra biológica de um indivíduo;ionizar a amostra biológica para gerar íons;selecionar íons tendo uma proporção de massa para carga (m/z)em uma faixa de m/z,fragmentar os íons selecionados para produzir íons filhotes; emedir um ou ambos do nível de ADMA em função do sinal m/zde um íon filhote a cerca de m/z 46 e do nível de SDMA em função do sinalm/z de um íon filhote a cerca de m/z 172 para obter o perfil metabólico doindivíduo.

98. Método de acordo com a reivindicação 97, em que a faixa dem/z é cerca de m/z 203.

99. Método de acordo com a reivindicação 97 ou 98, compreen-dendo ainda medir um ou mais analitos adicionais.

100. Método de acordo com a reivindicação 99, em que o um oumais analitos adicionais são biomoléculas metabólicas.

101. Método de acordo com a reivindicação 98 ou 99, em que oum ou mais analitos adicionais são selecionados do grupo que consiste em:citrulina, dimetilamina, arginina, ortnitina, homocisteína, e creatina.

102. Método de acordo com a reivindicação 98 ou 99, em que oum ou mais analitos adicionais são aminoácidos.

103. Método de acordo com a reivindicação 98 ou 99, em que oum ou mais analitos adicionais são acilcarnitinas.

104. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-98-103, em que o um ou mais analitos adicionais são medidos usando es-pectrometria de massa.

105. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-97-105, em que o indivíduo é um mamífero.

106. Método de acordo com a reivindicação 105, em que o indi-víduo é um ser humano.

107. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-97-106, em que o indivíduo é um indivíduo com suspeita de ter um distúrbiovascular.

108. Método para diagnosticar um distúrbio vascular em um in-divíduo, o método compreendendo:fornecer o perfil metabólico como definido na reivindicação 97; ecomparar um ou ambos do nível de ADMA e do nível de SDMAno perfil metabólico com o nível de ADMA e o nível de SDMA em um perfilmetabólico de referência,em que um nível elevado de um ou ambos de ADMA e SDMAem comparação com o nível no perfil metabólico de referência é uma indica-ção de que o indivíduo tem, ou corre o risco de desenvolver, um distúrbiovascular.

109. Método para avaliar um composto, o método compreen-dendo:contatar uma célula ou um indivíduo com o composto;ionizar uma amostra da célula ou do indivíduo para gerar íons;selecionar íons tendo uma proporção de massa para carga (m/z)em uma faixa de m/z,fragmentar os íons selecionados para produzir íons filhotes; emedir o nível de um ou ambos de ADMA em função do sinal m/zde um íon filhote a cerca de m/z 46 e do nível de SDMA em função do sinal m/z de um íon filhote a cerca de m/z 172,em que uma alteração em um ou ambos do nível de ADMA e donível de SDMA na amostra obtida da célula ou do indivíduo contato com ocomposto em comparação com o nível em uma amostra de uma célula ouindivíduo não contatado com o composto indica que o composto é um com-posto que é um modulador dos níveis de ADMA ou SDMA.

110. Método de acordo com a reivindicação 109, em que a célu-la é uma célula de mamífero.

111. Método de acordo com a reivindicação 110, em que a célu-la de mamífero é uma célula de ser humano.

112. Método de acordo com a reivindicação 110 ou 111, em queuma célula é uma célula endotelial.

113. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-109-112, em que a célula expressa eNOS.

114. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações109-113, em que a célula é obtida de um indivíduo que tem, ou corre o riscode desenvolver, um distúrbio vascular.

115. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-109-114, compreendendo ainda medir um ou mais analitos adicionais.

116. Método de acordo com a reivindicação 115, em que o umou mais analitos adicionais são biomoléculas metabólicas.

117. Método de acordo com a reivindicação 115 ou 116, em queo um ou mais analitos adicionais são selecionados do grupo que consisteem: citrulina, dimetilamina, arginina, ortnitina, homocisteína, e creatina.

118. Método de acordo com a reivindicação 115 ou 116, em queo um ou mais analitos adicionais são aminoácidos.

119. Método de acordo com a reivindicação 115 ou 116, em que o um ou mais analitos adicionais são acilcarnitinas.

120. Composição compreendendo dimetilarginina assimétrica(ADMA) compreendendo pelo menos um isótopo de átomo pesado.

121. Composição compreendendo dimetilarginina simétrica(SDMA) compreendendo pelo menos um isótopo de átomo pesado.

122. Composição compreendendo dimetilarginina assimétrica(ADMA) e dimetilarginina simétrica (SDMA)1 em que um ou ambos de ADMAe SDMA compreendem pelo menos um isótopo de átomo pesado.

123. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 120-122, em que o isótopo de átomo pesado é deutério.

124. Kit for detectar dimetilarginina assimétrica (ADMA) e dimeti-larginina simétrica (SDMA), o kit compreendendo:um ou ambos de ADMA e SDMA, em que um ou ambos deADMA e SDMA compreendem pelo menos um isótopo de átomo pesado; einstruções de como detectar SDMA e ADMA.

125. Kit de acordo com a reivindicação 124, compreendendoainda um ácido orgânico.

126. Kit para detectar dimetilarginina assimétrica (ADMA) e di-metilarginina simétrica (SDMA), o kit compreendendo:um ou ambos de ADMA e SDMA, em que um ou ambos deADMA e SDMA compreendem pelo menos um isótopo de átomo pesado;um ácido orgânico; einstruções de como detectar SDMA e ADMA.

127. Kit de acordo com a reivindicação 125 ou 126, em que oácido orgânico é ácido oxálico.

128. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 124--127, compreendendo ainda um programa de computador para detectar umaou ambas de ADMA ou SDMA.