BRPI0808332A2 - "polipeptídeos receptores de ativina variante e seus usos" - Google Patents

Description

"POLI PEPTÍ DEOS RECEPTORES DE AT IVINA VARIANTE E SEUS USOS"

REFERÊNCIA CRUZADA COM AS APLICAÇÕES RELACIONADAS

Este pedido reivindica o beneficio do pedido provisório norte-americano com número de série 61/065,474, depositado em 11 de fevereiro de 2008, e o pedido provisório norte-americano com número de série 60/905,459, depositado em 6 de março de 2007, cujas revelações são referidas e incorporadas à presente por referência.

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

0 campo técnico desta invenção se refere aos membros da família do fator de transformação de crescimento β (TGF-β) e dos receptores TGF-β solúveis, assim como aos métodos de modulação das atividades dos membros da familia TGF-β no tratamento de vários distúrbios.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

A família de proteínas do fator de transformação de crescimento β (TGF-β) inclui os fatores de transformação de crescimento -β (TGF-β), as ativinas, proteínas morfogênicas ósseas (BMP), fatores de crescimento de nervos (NGFs), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), e fatores de crescimento/diferenciação (GDFs). Esses membros da familia estão envolvidos na regulação de uma ampla gama de processos biológicos, incluindo a proliferação celular, a diferenciação e demais funções.

0 fator de crescimento/diferenciação 8 (GDF-8), também denominado de miostatina, é um membro da família TGF-β expresso na maior parte nas células de desenvolvimento e do tecido muscular esquelético adulto. A miostatina parece desempenhar um papel essencial controlando negativamente o crescimento muscular esquelético (McPherron et al., Nature (London) 387, 83-90 (1997)). A miostatina antagonizante demonstrou aumentar a massa muscular magra nos animais (McFerron et al., supra, Zimmers et al. , Science 296:1486 (2002)) .

Outro membro da família de proteínas TGF-β é um fator relacionado de crescimento/diferenciação, GDF-Il. 0 GDF-Il tem aproximadamente 90% da identidade da seqüência de aminoácidos da miostatina. O GDF-Il desempenha um papel na padronização axial 10 de animais em desenvolvimento (Oh et al, Genes Dev 11:1812-26 (1997)), e também parece desempenhar um papel no desenvolvimento e no crescimento do músculo esquelético.

As ativinas A, B e AB são os homodímeros e heterodímeros, respectivamente, de duas cadeias polipeptídicas, βΑ 15 e βΒ (Vale et al. Nature 321, 776-779 (1986), Ling et al., Nature 321, 779-782 (1986)). As ativinas foram descobertas originalmente como peptídeos gonadais envolvidos na regulação da síntese do hormônio folículo-estimulante e acredita-se agora que estejam envolvidas na regulação de várias das atividades biológicas. A 20 ativina A é uma forma predominante de ativina.

A ativina, miostatina, GDF-Il e outros membros da superfamília TGF-β ligam e sinalizam por meio de uma combinação de receptores de ativina tipo II e ativina tipo IIB, ambos sendo quinases serina/treonina transmembrana (Harrison et al., J. Biol. 25 Chem. 279, 28036-28044 (2004)). Estudos de ligação cruzada determinaram que a miostatina é capaz de ligar os receptores de ativina tipo II ActRIIA e ActRIIB in vitro (Lee et al. , PNAS USA 98:9306-11 (2001)). Existem também evidências que o GDF-Il liga-se tanto ao ActRIIA como ao ActRIIB (Oh et al., Genes Dev 16:2749-54 (2002)) .

A expressão da proteína TGF-β é sabida como estando associada a uma variedade de doenças e distúrbios.

Portanto, moléculas terapêuticas capazes de antagonizar várias proteínas TGF-β simultaneamente podem ser particularmente efetivas para essas doenças e distúrbios.

Além disso, a produção de produtos terapêuticos de proteína pode se complicar por problemas que ocorrem durante a 10 expressão e a purificação da proteína. Um problema é a agregação de proteínas durante a expressão ou purificação. O acúmulo de altos níveis de proteínas durante as condições de cultura celular pode levar à agregação. Os processos de purificação podem expor a proteína a outros fatores que promovem ainda maior agregação 15 (Cromwell, M.E.M. et al., The AAPS Journal 8:E572-E579, 2006). Podem ser feitas tentativas para a mitigação dos fatores que causam a agregação; entretanto, existe a necessidade para que as proteínas indicadas tenham uma menor tendência para a formação de agregados. A presente invenção satisfaz a necessidade de moléculas 20 terapêuticas que se ligam a múltiplos ligandos, tendo agregação reduzida e, portanto maior capacidade de fabricação, para a produção de forma eficiente de proteínas úteis para o tratamento de estados de doenças relacionadas com o TGF-β.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona uma proteína

isolada que compreende um polipeptídeo (denominado vActRIIB) IIB do receptor de ativina variante humana. Como usado no presente, o termo polipeptídeo vActRIIB se refere tanto aos polipeptídeos vActRIIB humanos como aos polipeptideos vActRIIB5 humanos. Em uma configuração, a proteína compreende um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 2 ou 18 onde os aminoácidos em qualquer posição E28 ou R40, ou em ambas as posições E28 e R40 são substituídos por outro aminoácido não ativo, e onde o polipeptídeo é capaz de ligar a miostatina, a ativina A ou o GDF-Il. Em uma confiauracão, a proteína compreende um polipeptídeo com uma seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 2 ou 18 em que os aminoácidos nas posições E28 ou R40, ou em ambas E28 e R40 são substituídos por um aminoácido não ativo, e onde o peptídeo de sinal é removido, e onde o polipeptídeo é capaz de ligar a miostatina, a ativina A ou o GDF-Il. Em uma configuração, a proteína compreende um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 2 ou 18 em que os aminoácidos nas posições E28 ou R40, ou ambas E28 e R40 são substituídos por outro aminoácido, onde a seqüência do sinal é removida, e o N-terminal do polipeptídeo maduro é truncado, e onde o polipeptídeo é capaz da ligação da miostatina, da ativina A ou do GDF-Il. Em uma configuração, o polipeptídeo vActRIIB truncado maduro N-terminal não possui os quatro aminoácidos N-terminais ou os seis aminoácidos N-terminais da seqüência madura, em que o polipeptídeo é capaz de ligação da miostatina, da ativina A ou do GDF-Il. Em uma configuração, a substituição na posição E28 é selecionada no grupo que consiste em W, YeA. Em outra configuração, a substituição na posição E28 é selecionada do grupo de aminoácidos que consistem de A, F, Q, V,

I, L, Μ, K, H, W e Y. Em outra configuração, a substituição na posição R40 é selecionada do grupo de aminoácidos que consistem de

G, Q, Μ, H, K e N. Em outra configuração, a substituição na posição E28 é selecionada do grupo de aminoácidos que consistem de A, F, Q, V, I, L, Μ, K, H, W e Y e a substituição na posição R40 é selecionada do grupo de aminoácidos que consistem de A, G, Q, M,

H, KeN. Em outra configuração, o polipeptídeo ainda compreende uma proteína heteróloga. Em uma configuração, a proteína heteróloga é um domínio Fe. Em outra configuração, o domínio Fc é um domínio IgG Fc humano.

Em uma configuração, a proteína compreende polipeptídeos tendo uma seqüência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95 e 97.

Em outra configuração, a proteína compreende um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo tendo uma seqüência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19,

21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94, 96 ou seu complemento.

Em outro aspecto, a presente invenção provê uma molécula de ácido nucléico isolada compreendendo um 20 polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo vActRIIB. Em uma configuração, a molécula de ácido nucléico compreende um polinucleotídeo tendo a seqüência de ácido nucléico indicada na SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 69, 71, 92, 25 94, 96 ou seu complemento.

Em outra configuração, a molécula de ácido nucléico compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo consistindo da seqüência de aminoácidos indicada no grupo SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95 e 97. Em outra configuração, a molécula de ácido nucléico ainda compreende uma seqüência reguladora 5 transcripcional ou translacional. Em outro aspecto, é provido um vetor recombinante compreendendo a molécula de ácido nucléico vActRIIB. Em outro aspecto, são providas células hospedeiras “ “compreendendo os vetores recombinantes, assim como métodos para a produção dos polipeptídeos vActRIIB.

A presente invenção ainda provê uma composição

contendo pelo menos um polipeptídeo vActRIIB ou proteína da presente invenção. Em uma configuração, a composição é uma composição farmacêutica contendo o polipeptídeo vActRIIB ou proteína em uma mistura com um transportador farmaceuticamente aceitável.

Em outro aspecto, a presente invenção provê um método para o tratamento ou a prevenção de uma doença de atrofia muscular em um indivíduo sofrendo desta doença por meio da administração de uma composição terapêutica contendo um 20 polipeptídeo vActRIIB ou proteína ao indivíduo. A doença de atrofia muscular inclui ou resulta, sem limitações, das seguintes condições: câncer, caquexia, distrofia muscular, esclerose lateral amiotrófica, doença pulmonar obstrutiva congestiva, insuficiência cardíaca crônica, caquexia química, caquexia de HIV/AIDS, 25 insuficiência renal, uremia, artrite reumatóide, sarcopenia relacionada à idade, fragilidade relacionada à idade, atrofia orgânica, síndrome do túnel do carpo, deprivação androgênica e atrofia muscular devido à inatividade por prolongado repouso na cama, danos à coluna espinhal, AVC, fratura óssea e velhice. A atrofia muscular também pode resultar da falta de peso devida a voos espaciais, resistência à insulina, atrofia muscular devida a queimaduras, deprivação androgênica e demais distúrbios. Em outro 5 aspecto, a presente invenção provê um método para o tratamento de uma doença relacionada à expressão da ativina A. Em uma configuração, a doença é o câncer. Em outro aspecto, a presente

_____invenção- provê-um-método'de-~tratãméntó~ de um distúrbio metaooiico

que compreende a administração de uma composição terapêutica a um indivíduo que precise deste tratamento, onde o distúrbio metabólico é selecionado de perda óssea, diabetes, obesidade, tolerância reduzida à glicose, hiperglicemia, deprivação androgênica e síndrome metabólica. Em outro aspecto, a invenção provê o uso da composição terapêutica na preparação de um medicamento para o tratamento dos distúrbios acima. Em outro aspecto, a presente invenção provê um método de terapia genética compreendendo a administração de um vetor que codifica um polipeptídeo vActRIIB ou proteína da presente invenção a um indivíduo que dele precise, onde o vetor é capaz de expressar o polipeptídeo vActRIIB ou a proteína no indivíduo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 mostra a seqüência de aminoácidos do IgGlFc ActRIIB-humano solúvel do tipo selvagem (SEQ ID NO: 98). A seqüência do peptídeo sinalizador está em negrito, seguida pelo 25 domínio extracelular do AetRIIB maduro e do IgGl Fc humano em itálico, incluindo uma região de articulação parcial. Os aminoácidos E28 e R40 estão sublinhados. A seqüência de ligação GGGGS (SEQ ID NO: 75) está em itálico e sublinhada. A Figura 2 mostra a seqüência de aminoácidos do IgGlFc ActRIIB5-humano solúvel (SEQ ID NO: 99) . A seqüência do peptideo sinalizador está em negrito, seguida pelo domínio solúvel do ActRIIB5 maduro e do IgGl Fc humano, incluindo a região de 5 articulação parcial, que está em itálico. E28 e R40 estão sublinhados. A seqüência de ligação (GGGGS) (SEQ ID NO: 75) está em itálico e sublinhada.

— - - · "A" “Figura- ”3^ mostra o efeito do tratamento

vActRIIB-Fc E28W solúvel na massa testicular (Figura 3A) e ovariana (Figura 3B) em camundongos knockout inibina-a.

A Figura 4 mostra o efeito do tratamento vActRIIB-Fc E28W solúvel nas taxas de sobreviventes de camundongos knockout inibina-α machos (Figura 4A) e fêmeas (Figura 4B).

A Figura 5 mostra o efeito do tratamento vActRIIB-Fc E28W solúvel no peso corporal de camundongos portadores de tumor 2 6 de cólon.

A Figura 6 mostra o efeito do tratamento vActRIIB-Fc E28W solúvel na sobrevida de camundongos portadores de tumor 26 de cólon.

DESCRIÇÃO DETALHADA

São reveladas as proteínas compreendendo os polipeptídeos (vActRIIB) do receptor IIB de ativina humana variante. Essas proteínas e polipeptídeos se caracterizam pela capacidade de se ligarem a pelo menos uma de três proteínas TGF-β, 25 miostatina (GDF-8), ativina A e GDF-11, e inibirem as atividades dessas proteínas. Essas proteínas e polipeptídeos também demonstram uma tendência reduzida de agregação comparadas aos polipeptídeos que não contenham as modificações reveladas na presente. As modificações consistem de substituições de aminoácidos nas posições 28, 40, ou em ambas 28 e 40 com referência ao ActRIIB de tipo selvagem com número de acessão NP_001097 (SEQ ID NO: 47) , e ao domínio extracelular de ActRIIB 5 (SEQ ID NO: 18) ou ActRIIB5 (SEQ ID NO: 2).

Como usado na presente, o termo "membros da família TGF-β" ou "proteínas TGF-β" se refere aos fatores de ‘ ' ~ crescimento” êstruturãlmehte relacionados da família do fator de transformação de crescimento, incluindo as ativinas, e proteínas 10 (GDF) do fator de crescimento e diferencial (Kingsley et al. Genes Dev. 8: 133-146 (1994), McPherron et al. Growth factors and cytokines in health and disease, Vol. 1B, D. LeRoith e C.Bondy. ed., JAI Press Inc., Greenwich, Conn, USA: pp 357-393).

0 GDF-8, também denominado de miostatina, é um regulador negativo do tecido muscular esquelético (McPherron et al. PNAS USA 94:12457-12461 (1997)). A miostatina é sintetizada como um complexo protéico inativo com aproximadamente 37 5 aminoácidos de comprimento, tendo Acesso ao GenBank No: AAB8 6694 (SEQ ID NO: 49) para humanos. A proteína precursora é ativada por clivagem proteolítica em um sítio de processamento tetrabásico para produzir um prodomínio inativo N-terminal e uma proteína Cterminal de aproximadamente 109 aminoácidos que dimeriza para formar um homodímero com cerca de 25 kDa. Este homodímero é a proteína madura, biologicamente ativa (Zimmers et al., Science 296, 1486 (2002)).

Como usado na presente, o termo "prodomínio" ou "propeptídeo" se refere à proteína N-terminal inativa que é clivada para liberar a proteína C-terminal ativa. Como usado na presente, o termo "miostatina" ou "miostatina madura" se refere ao polipeptídeo maduro, C-terminal biologicamente ativo, sob forma de monômero, dímero ou outra forma, assim como fragmentos biologicamente ativos ou polipeptídeos relacionados, incluindo 5 variantes alélicas, variantes de splicing e peptídeos de fusão e polipeptídeos. Comunicou-se que a miostatina madura tem 100% de identidade seauencial entre muitas espécies, incluindo humanos, camundongos, galinhas, porcos, perus e ratos (Lee et al., PNAS 98, 9306 (2001)).

Como usado na presente, GDF-Il se refere ao BMP

(proteína morfogênica óssea) tendo número de acessão Swissprot 095390 (SEQ ID NO: 50) , assim como variantes e homólogos de espécie dessa proteína. O GDF-Il tem aproximadamente 90% de identidade com a miostatina no nível aminoácido. O GDF-Il está 15 envolvido na regulação da padronização anterior/posterior do esqueleto axial (McPherron et al, Nature Genet. 22 (93): 260-264 (1999); Gamer et al, Dev. Biol. 208 (1), 222-232 (1999)), mas funções pós-natais são desconhecidas.

A ativina A é o homodímero das cadeias polipeptídeas BA. Como usado na presente, o termo "ativina A" se refere à proteína ativina tendo Acesso ao GenBank No: NM_002192 (SEQ ID NO: 48), assim como variantes e homólogos de espécie dessa proteína.

Receptores de Ativina Como usado na presente, o termo receptores de

ativina tipo II B (ActRIIB) se refere a receptores de ativina humana com número de acessão NP_001097 (SEQ ID NO: 47) . O termo ActRIIB solúvel inclui o domínio extracelular do ActRIIB (SEQ ID NO: 18), ActRI ΙΒ5 (SEQ ID NO: 2) e essas seqüências onde a arginina na posição 64 é também substituída por alanina.

Polipeptídeos ActRIIB solúveis variantes

A presente invenção provê proteínas isoladas compreendendo polipeptídeos do receptor ActIIB solúveis da variante humana (denominados no presente como polipeptídeos wsrtRTTR. ou Dolipeptideos variantes). Como usado na presente o termo "proteína vActRIIB" se refere a uma proteína compreenuenuu a polipeptídeo vActRIIB. Como usado na presente o termo "isolado" se refere a uma proteína ou molécula de polipeptídeo purificada em um determinado grau a partir de material endógeno. Esses polipeptídeos e proteínas são caracterizados como tendo a capacidade de ligar e inibir a atividade da ativina A, da miostatina ou do GDF-Il. Em algumas configurações, a afinidade de ligação dos polipeptídeos variantes da ativina A, da miostatina ou do GDF-Il é aperfeiçoada quando comparada aos polipeptídeos do tipo selvagem.

Em uma configuração, o polipeptídeo vActRIIB tem a seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 2 ou 18 em que os aminoácidos na posição E28 ou R40, ou em ambas as posições E28 e R40 são substituídos por outro aminoácido não ativo, e onde o polipeptídeo é capaz de ligar a miostatina, a ativina A ou o GDF

11. Em outra configuração, os polipeptídeos vActRIIB são as versões maduras, ou as versões maduras truncadas dessas 25 seqüências. Como usado na presente o termo "polipeptídeo vActRIIB maduro" se refere ao polipeptídeo tendo a seqüência do sinal aminoácido removida. Em uma configuração, as seqüências maduras são, por exemplo, os aminoácidos 19 a 160 da SEQ ID NO: 2, e os aminoácidos 19 a 134 da SEQ ID NO: 18, onde um ou ambos os aminoácidos nas posições 28 e 40 são substituídos por outro aminoácido não ativo e os polipeptídeos retêm a capacidade de ligação à ativina A, à miostatina ou ao GDF-Il. Como usado na 5 presente, o termo polipeptídeo vActRIIB maduro truncado se refere ao polipeptídeo tendo a seqüência de sinal e, além disso, os aminoácidos do N-terminal do polipeptídeo maduro removidos. Em uma configuração, os aminoácidos 4 N-terminal maduros ou os aminoácidos 6 N-terminal do polipeptídeo maduro são removidos. 10 Nesta configuração, as seqüências maduras truncadas são, por exemplo, aminoácidos 23 a 160 da SEQ ID NO: 2, ou aminoácidos 25 a 160 da SEQ ID NO: 2; e aminoácidos 23 a 134 da SEQ ID NO: 18, ou aminoácidos 25 a 134 da SEQ ID NO: 18 onde um ou ambos aminoácidos nas posições 28 e 40 são substituídos por aminoácidos do tipo não 15 selvagem que retêm a capacidade de ligação à ativina A, à miostatina ou ao GDF-Il. Como usado na presente, o termo "posição 28" e "posição 40" (isto é, E28 e R40) se refere à posição de aminoácido com referência às seqüências SEQ ID NO: 2 e 18 que incluem uma seqüência do sinal aminoácido 18. Para consistência, 20 se o polipeptídeo maduro vActRIIBs tiver substituições na posição 10 e/ou na posição 22, ou polipeptídeos maduros truncados tiverem substituições na posição 6 e/ou posição 18, ou substituições na posição 4 e/ou posição 16 com relação às seqüências maduras ou truncadas, essas variantes ainda serão mencionadas com relação ao 25 comprimento total SEQ ID NO: 2 e 18, ou como mostrado na Figura 1 ou 2, isto é, a substituição de aminoácido na posição E28 e/ou R40. Essas configurações maduras ou configurações N-terminal truncadas estão exemplificadas abaixo. Em uma configuração, a substituição na posição E28 é selecionada do grupo de aminoácidos que consiste em W, Y e A. Em uma configuração, a substituição na posição 28 é W. Em outra configuração, a substituição na posição 28 é selecionada do grupo de aminoácidos que consiste em A, F, Q, V, I, L, Μ, K, H, W e Y. Em outra configuração, a substituição na posição 40 é selecionada do grupo de aminoácidos que consiste em G, Q, Μ, H, KeN. Em outra configuração, a substituição na posição 28 é selecionada do grupo de aminoácidos que consiste em A, F, Q, V, I, L, Μ, K, H, W e Y e a substituição na posição 40 é selecionada do grupo de aminoácidos que consiste em A, G, Q, Μ, Η, K, e N. Em uma configuração, a proteína compreende polipeptídeos tendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72,

87, 88, 91, 93, 95, e 97. Em outra configuração, a proteína compreende a polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo tendo uma seqüência de aminoácidos indicada no grupo que consiste na SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 20 37, 39, 41, 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94, 96 ou seu complemento.

Em uma configuração, as seqüências de sinais são removidas do polipeptídeo vActRIIB, deixando os polipeptídeos variantes maduros. Podem ser usados peptídeos de vários sinais na 25 preparação dos polipeptídeos do presente pedido. Os peptídeos de sinalização podem ter a seqüência mostrada nas Figuras 1 e 2 (SEQ ID NO: 73) , ou seqüências de sinalização alternativas como a SEQ ID NO: 74, a seqüência de sinal para SEQ ID NO: 2 e 18. Pode ser usado qualquer outro peptideo de sinalização para a expressão dos polipeptídeos vActRIIB ou vActRIIB5.

Em outra configuração, o polipeptídeo vActRIIBs tem seqüências que são substancialmente similares à SEQ ID NO: 2 e 5 18. Como usado na presente, o termo "substancialmente similar" se refere a polipeptídeos tendo pelo menos cerca de 80% de identidade, pelo menos cerca de 85% identidade, pelo menos cerca de 90% identidade, pelo menos cerca de 95% identidade, pelo menos cerca de 98% identidade, ou pelo menos cerca de 99% identidade com 10 a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 e 18, e onde um ou ambos os aminoácidos nas posições 28 e/ou 40 são substituídos por aminoácidos do tipo não selvagem, onde o polipeptídeo retém a atividade do polipeptídeo da SEQ ID NO: 2 e

18, que é a capacidade de ligação e inibição da miostatina, da 15 ativina A ou do GDF-Il. Além disso, o termo polipeptídeo vActRIIB inclui fragmentos da SEQ ID NO: 2 ou 18 como os truncamentos NeC terminais contendo as substituições na posição 28 e /ou 40 descritas na presente, onde o polipeptídeo pode ligar e inibir a miostatina, a ativina A ou o GDF-Il.

Como usado na presente, o termo "derivativo" dos

polipeptídeos vActRIIB e vActRIIB5 se refere à anexação de pelo menos um outro meio químico, ou pelo menos um outro polipeptídeo para formar conjugados covalentes ou agregados, como os grupos glicosil, lipídeos, grupos acetil ou C-terminal ou polipeptídeos 25 de fusão N-terminais, conjugação com as moléculas PEG e outras modificações que são descritas mais completamente abaixo. Os polipeptídeos receptores variantes ActRIIB (vActRIIB) também podem incluir outras modificações e derivativos, incluindo modificações nos terminais CeN que surgem do processamento devido à expressão em vários tipos celulares, como células de mamíferos, E. coli, fermentos e outras células recombinantes hospedeiras. Também estão incluídos fragmentos do polipeptídeo vActRIIB e polipeptídeos 5 compreendendo sítio(s) de N-glicosilação inativados, sítio(s) inativados de processamento de protease ou substituição(ões) de aminoácidos conservadoras das seqüências polipeptídias indicadas

...... ria SEQ ID ~N0: 4, 6,~8,T 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32,

34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95 e 97.

Como usado na presente, o termo "atividade do polipeptídeo vActRIIB ou vActRIIB5" ou "uma atividade biológica de um polipeptídeo ActRIIB ou ActRIIB5 solúvel" se refere a uma ou mais atividades in vitro ou in vivo dos polipeptídeos vActRIIB e vActRIIB5, incluindo sem limitações, as demonstradas no Exemplo abaixo. As atividades do polipeptídeo vActRIIBs incluem, sem limitações, a capacidade de ligação à miostatina ou à ativina A ou ao GDF-11, e a capacidade de reduzir ou de neutralizar uma atividade da miostatina ou da ativina A ou do GDF-11. Como usado na presente, o termo "capaz de ligação" à miostatina, ativina A, ou ao GDF-11 se refere à ligação medida por métodos conhecidos na técnica, como o método de Biacore descrito no Exemplo 2 abaixo. Também, no Exemplo 2, o ensaio pMARE C2C12 baseado em células mede a atividade neutralizadora da ativina A, a atividade neutralizadora da miostatina e a atividade neutralizadora do GDF

11. As atividades in vivo incluem, sem limitações, o aumento do peso muscular, o aumento da massa muscular magra, o aumento da massa muscular esquelética, a redução da massa de gordura como demonstrado nos modelos animais abaixo e como conhecido na técnica. As atividades biológicas ainda incluem a redução ou a prevenção da caquexia causada por certos tipos de tumores, evitando o crescimento de determinados tipos de tumores, e 5 aumentando a sobrevida de certos modelos animais. São feitas outras discussões abaixo sobre as atividades do polipeptídeo vActRIIB.

Os polipeptídeos da presente invenção ainda compreendem polipeptídeos heterólogos ligados ao polipeptídeo vActRIIB, seja diretamente ou por uma seqüência de ligação para formar uma proteína de fusão. Como usado na presente, o termo "proteína de fusão" se refere a uma proteína tendo um polipeptídeo heterólogo anexado por técnicas de DNA recombinante. Os polipeptídeos heterólogos incluem, sem limitações, os polipeptídeos Fe, suas identificações e domínios zíper de leucina para a promoção da oligomerização e estabilização dos polipeptídeos ActRIIB variantes como descrito, por exemplo, na WO 00/29581, incorporada à presente por referência. Em uma configuração, o polipeptídeo heterólogo é um polipeptídeo Fc ou domínio. Em uma configuração, o domínio Fc é selecionado a partir de um domínio Fe IgGl, IgG2, e IgG4 humano. São providos na SEQ ID NO: 80, 82 e 84. O vActRIIB pode ainda compreender todos ou uma parte da seqüência hinge do IgGl, IgG2, ou IgG4 adjacente à sua região respectiva Fe IgG. A seqüência hinge completa de IgGl, IgG2 e IgG4 é provida na SEQ ID NO: 76, 77, e 78 respectivamente.

O polipeptídeo vActRIIB pode ainda opcionalmente compreender uma seqüência ligante. Os ligantes servem primariamente como espaçadores entre um polipeptídeo e um segundo polipeptídeo heterólogo ou outro tipo de fusão ou entre dois ou mais polipeptídeos ActRIIB variantes. Em uma configuração, o ligante é feito de aminoácidos unidos por ligações peptídeas, preferivelmente de 1 a 20 aminoácidos unidos por ligações 5 peptídeas, onde os aminoácidos são selecionados entre os 20 aminoácidos de ocorrência natural. Um ou mais desses aminoácidos podem ser glicosilados, como compreendido pelos técnicos. Em uma configuração, os 1 a 20 aminoácidos são selecionados a partir da glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina e lisina. De 10 preferência, o ligante é composto de uma maioria de aminoácidos que são estericamente não obstruídos, como a glicina e alanina. Ligantes exemplares são as poliglicinas (particularmente (Gly)5, (Gly)8, poli (Gly-Ala) e as polialaninas. Um ligante exemplar adequado mostrado nos Exemplos abaixo é o (Gly)4Ser (SEQ ID NO: 15 75). Em outra configuração, o vActRIIB pode compreender um ligante hinge, que é uma seqüência de ligação que é provida adjacente à região hinge, como exemplificada na SEQ ID NO: 79.

Os ligantes são também ligantes não peptídeos. Por exemplo, podem ser usados os ligantes alquil como -NH-(CH2)S20 C(O)-, onde s = 2-20. Esses ligantes alquil podem ainda ser substituídos por qualquer grupo não estericamente obstrutivo como alquil inferior (ex., Ci-C6) acil inferior, halogênio (ex., Cl, Br), CN, NH2, fenil, etc.

Em uma configuração, o polipeptídeo vActRIIBs pode ser anexado a um polipeptídeo Fe, diretamente ou por meio de um ligante, ou por meio de um ligante hinge. Em uma configuração, o Fc é um IgG Fc humano. 0 vActRIIB anexo ao Fc inclui, por exemplo, vActRIIB-IgGlFe, E28A (SEQ ID NO: 60); vActRIIB-IgGlFc, E28W (SEQ ID NO: 62), vActRI IB-IgGlFc, E28Y (SEQ ID NO: 64), vActRIIB-IgG Fe, R40G (SEQ ID NO: 66), vActRIIB5-IgGlFc, E28A (SEQ ID NO: 70), e vActRIIB5-IgGlFc E28W (SEQ ID NO: 72), como mostrado nas Tabelas 1 e 2, e descritos nos Exemplos presentes. Outras 5 configurações incluem vActRIIB-IgG2 Fe, E28W(SEQ ID NO: 91), vActRI IB-1 gG2 Fe, E28Y (SEQ ID NO: 93) e vActRI IB-IgG2 Fc (SEQ ID NO: 95) . As variantes foram demonstradas como produtoras de menos agregação comparadas ao ActRIIB-IgG2 IgG2 do tipo selvagem, como demonstrado nos Exemplos abaixo.

O polipeptídeo vActRIIBs revelado na presente

também pode ser anexado a uma molécula não peptídea com o objetivo de conferir propriedades desejadas como a redução da degradação e/ou aumento da meia-vida, redução de toxicidade, redução de imunogenicidade e/ou aumento da atividade biológica dos 15 polipeptídeos ActRIIB. As moléculas exemplares incluem, sem limitações, polímeros lineares como o polietilenoglicol (PEG), polilisina, um dextrano; um lipídeo; um grupo de colesterol (como um esteróide); um carboidrato ou uma molécula oligossacarídea.

Em outro aspecto, a presente invenção provê 20 moléculas isoladas de ácido nucléico compreendendo polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo vActRIIBs da presente invenção. Como usado na presente, o termo "isolado" se refere a moléculas de ácido nucléico purificadas até certo grau a partir de material endógeno. Em uma configuração, a molécula de 25 ácido nucléico da presente invenção compreende um polinucleotídeo que codifica os polipeptídeos da SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14,

16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95 e 97. Devido à degenerescência conhecida do código genético, onde mais de um códon pode codificar o mesmo aminoácido, uma seqüência de DNA pode variar daquela mostrada na SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 51, 5 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94 e 96 ou da fita complementar da SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94 e 96, e ainda codificar um polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 10 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95 e 97. Essas seqüências de DNA variante podem resultar de mutações silenciosas que ocorrem durante a mutação, ou podem ser o produto de mutagênese deliberada dessas seqüências.

Em outra configuração, a molécula de ácido

nucléico da presente invenção compreende um polinucleotídeo tendo a seqüência polinucleotídea indicada na SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11,

13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94 e 96 ou a fita 20 complementar da SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94 e 96. Em outra configuração, a presente invenção provê moléculas de ácido nucléico que hibridizam em condições rigorosas ou moderadas com as regiões codificadoras de 25 polipeptídeos da SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94 e 96, onde o polipeptídeo codificado compreende uma seqüência de aminoácidos como indicada na SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87,

88, 91, 93, 95 e 97 e onde o polipeptídeo codificado mantém a atividade de um polipeptídeo vActRIIB.

As moléculas de ácido nucléico da invenção

incluem DNA sob as formas de fita simples e fita dupla, assim como seu complemento RNA. O DNA inclui, por exemplo, cDNA, DNA genômico, DNA sintético, DNA amplificado por PCR e suas combinações. O DNA genômico pode ser isolado por técnicas convencionais, como pelo uso do DNA da SEQ ID NO: 1 ou 17, ou de um fragmento adequado deste, como sonda. O DNA genômico que codifica os polipeptídeos ActRIIB é obtido a partir de bibliotecas genômicas disponíveis para algumas espécies. O DNA sintético é disponível a partir da síntese química dos fragmentos oligonucleotídeos de superposição seguidos pelo conjunto de fragmentos para a reconstituição de parte ou de todas as regiões de codificação e das seqüências de flanqueamento. O RNA pode ser obtido a partir de vetores de expressão procariótica que direcionam a síntese de alto nível do mRNA, como os vetores que usam os promotores T7 e a RNA polimerase. O cDNA é obtido das bibliotecas preparadas a partir do mRNA isolado de vários tecidos que expressam o ActRIIB. As moléculas de DNA da invenção incluem genes de comprimento total, assim como polinucleotídeos e seus fragmentos. 0 gene de comprimento total também pode incluir seqüências que codificam a seqüência de sinalização N-terminal.

Em outro aspecto da presente invenção, também são providos vetores de expressão contendo as seqüências de ácidos nucléicos, sendo também providas células hospedeiras transformadas por esses vetores e métodos para a produção dos polipeptídeos vActRIIB. 0 termo "vetor de expressão" se refere a um plasmídeo, fago, vírus ou vetor para a expressão de um polipeptídeo de uma seqüência polinucleotídea. Os vetores para a expressão dos 5 polipeptídeos vActRIIB contêm um mínimo de seqüências necessário para a propagação do vetor e para a expressão do inserto clonado. Um vetor de expressão compreende uma unidade transcripcional compreendendo um conjunto de (1) um elemento ou elementos genéticos tendo um papel regulatório na expressão do gene, por 10 exemplo, promotores ou estimuladores, (2) uma seqüência que codifica polipeptídeos vActRIIB para serem transcritos em mRNA e transladados para proteínas, e (3) seqüências de transcrição adequada de início e término. Essas seqüências podem ainda incluir um marcador de seleção. Os vetores adequados para a expressão nas 15 células hospedeiras são prontamente disponíveis e as moléculas de ácido nucléico são inseridas nos vetores usando técnicas padrão de DNA recombinante. Esses vetores podem incluir promotores que operam em tecidos específicos, e vetores virais para a expressão do vActRIIB em células alvo humanas ou de animais. Um vetor de 20 expressão exemplar adequado para a expressão do vActRIIB é o pDSRa, (descrito na WO 90/14363, incorporada à presente por referência) e seus derivados, contendo polinucleotídeos vActRIIB, assim como quaisquer outros vetores adequados conhecidos na técnica ou descritos abaixo.

O pedido ainda provê métodos para a produção de

polipeptídeos vActRIIB. Pode ser usada uma variedade de outros sistemas de expressão/hospedeiros. Esses sistemas incluem, sem limitações, microorganismos como bactérias transformadas com bacteriófagos recombinantes, vetores de expressão de DNA plasmídeos ou cosmídeos; levedo transformado por vetores de expressão de levedo; sistemas de células de insetos infectados por vírus vetores de expressão (ex., baculovírus); sistemas celulares 5 de plantas transfectados por vetores de expressão viral (ex., vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; vírus do mosaico do tabaco, TMV) ou transformados por vetores de expressão bacteriana (ex., plasmídeo Ti ou pBR322); ou sistemas celulares de animais.. As células de mamíferos úteis para a produção de proteínas 10 recombinantes incluem, sem limitações, as células VERO, as células HeLa, linhas celulares de ovário de hamster chinês (CHO) ou seus derivados, como linhas celulares Veggie CHO e relacionadas, que crescem em meio isento de soro (ver Rasmussen et al. , 1998, Cytotechnology 28:31) ou a cepa CHO DX-B11, que é deficiente em 15 DHFR (ver Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216- 20) células COS como a linha COS-7 de células renais de macacos (ATCC CRL 1651) (ver Gluzman et al., 1981, Cell 23:175), W138, BHK, HepG2, 3T3 (ATCC CCL 163), RIN, MDCK, A549, PC12, K562, células L, células C127, linhas celulares BHK (ATCC CRL 10), a 20 linha celular CV1/EBNA derivada da linha celular renal do macaco verde africano CVl (ATCC CCL 70) (ver McMahan et al. , 1991, EMBO J. 10:2821), células renais embriônicas humanas como 293, 293 EBNA ou MSR 293, células A431 epidérmicas humanas, células Colo205 humanas, outras linhas celulares transformadas de primatas, 25 células diplóides normais, cepas celulares derivadas da cultura in vitro de tecido primário, explantes primários, células HL-60, U937, HaK ou Jurkat. A expressão mamífera permite a produção de polipeptídeos secretados ou solúveis que podem ser recuperados do meio de crescimento.

Usando um adequado sistema de vetor hospedeiro, os polipeptídeos vActRIIB são produzidos de maneira recombinante pela cultura de uma célula hospedeira transformada com um vetor de 5 expressão contendo as moléculas de ácido nucléico da presente invenção em condições que permitam a produção. As células transformadas podem ser usadas na produção de polipeptídeos de alta produtividade e de longo prazo. Uma vez sendo essas células transformadas com vetores que contenham marcadores selecionáveis 10 assim como o desejado cassette de expressão, as células podem ser deixadas crescendo por 1 a 2 dias em um meio enriquecido antes que sejam mudadas para o meio seletivo. O marcador selecionável é projetado para permitir o crescimento e a recuperação das células que expressam com sucesso as seqüências introduzidas. Massas 15 resistentes de células estavelmente transformadas podem proliferar usando as adequadas técnicas de cultura de tecidos na linha celular empregada. É encontrada uma visão geral da expressão de proteínas recombinantes em Methods of Enzymology, v. 185, Goeddell, D.V., ed., Academic Press (1990).

Em alguns casos, como na expressão usando

sistemas procarióticos, os polipeptídeos expressos desta invenção podem precisar ser "redobrados" e oxidados em uma estrutura terciária adequada e serem geradas ligações de dissulfeto para ser biologicamente ativa. O redobramento pode ser feito usando vários 25 procedimentos bem conhecidos na técnica. Esses métodos incluem, por exemplo, a exposição do polipeptídeo solubilizado a um pH normalmente acima de 7 na presença de um agente caotrópico. A seleção do agente caotropo é similar às escolhas usadas para a inclusão da solubilização do corpo; entretanto, um caotropo é comumente usado em menor concentração. Os agentes caotrópicos exemplares são a guanidina e a uréia. Na maioria dos casos, a solução de redobramento/oxidação também deverá conter um agente 5 redutor mais sua forma oxidada em proporção especifica para gerar um determinado potencial redox que permite a ocorrência da mistura do dissulfeto para a formação de pontes de cisteína. Alquns pares redox comumente usados incluem a cisteína / cistamina, glutationa / ditiobisGSH, cloreto cúprico, ditiotreitol DTT/ditiano DTT e 2- 10 mercaptoetanol (bME)/ditio-bME. Em muitos exemplos, pode ser usado um cossolvente para aumentar a eficiência do redobramento. Os cossolventes normalmente usados incluem o glicerol, o polietilenoglicol de vários pesos moleculares e a arginina.

Além disso, os polipeptídeos podem ser 15 sintetizados em solução ou em um suporte sólido de acordo com as técnicas convencionais. Existem comercialmente vários sintetizadores automáticos, podendo ser usados de acordo com os protocolos conhecidos. Ver, por exemplo, Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d.Ed., Pierce Chemical Co. (1984); Tam 20 et al., J Am Chem Soc, 105:6442, (1983); Merrifield, Science 232:341-347 (1986); Barany and Merrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, eds, Academic Press, New York, 1-284; Barany et al., Int J Pep Protein Res, 30:705-739 (1987).

Os polipeptídeos e as proteínas da presente invenção que podem ser purificados de acordo com as técnicas de purificação de proteínas são bem conhecidos pelos técnicos no assunto. Essas técnicas envolvem, em um nível, o fracionamento bruto das frações proteináceas e não proteináceas. Tendo separado os polipeptídeos peptídeos de outras proteínas, o peptídeo ou o polipeptídeo de interesse pode ser mais purificado usando técnicas cromatográficas e eletroforéticas para a obtenção da purificação parcial ou completa (ou purificação para homogeneidade). 0 termo "polipeptídeo isolado" ou "polipeptídeo purificado" como usado na presente, se refere a uma composição, que pode ser isolada de outros componentes, em que o polipeptídeo é purificado até um grau relativo a seu estado de obtenção natural. Portanto, um polipeptídeo purificado também se refere a um polipeptídeo livre do ambiente em que pode ocorrer naturalmente. Em geral, "purificado" se refere a uma composição polipeptídia que foi submetida a fracionamento para a remoção de vários outros componentes, e cuja composição retém substancialmente sua atividade biológica expressa. Onde é usado o termo "substancialmente purificado", esta indicação se refere a um peptídeo ou composição polipeptídia onde o polipeptídeo ou peptídeo forma o principal componente da composição, como constituindo cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 85% ou cerca de 90% ou mais das proteínas na composição.

Serão bem conhecidas várias técnicas adequadas para a purificação pelos técnicos no assunto. Estas incluem, por exemplo, a precipitação com sulfato de amônio, PEG, anticorpos (imunoprecipitação) e similares ou por desnaturação térmica, 25 seguida por centrifugação; cromatografia como a cromatografia por afinidade (Colunas de proteína-A), troca iônica, filtração em gel, fase reversa, hidroxilapatita, cromatografia por interação hidrofóbica; focalização isoelétrica; eletroforese em gel; e combinações dessas técnicas. Como geralmente conhecido na técnica, acredita-se que a ordem de condução das várias etapas de purificação pode ser alterada, ou que determinadas etapas podem ser omitidas, resultando ainda em um método adequado para a 5 preparação de um polipeptídeo substancialmente purificado. São fornecidas as exemplares etapas de purificação nos Exemplos abaixo.

Serão conhecidos. vários métodos para a quantificação do grau de purificação do polipeptídeo pelos técnicos no assunto à luz da presente revelação. Estes incluem, por exemplo, a determinação da atividade de ligação específica de uma fração ativa, ou a avaliação da quantidade de peptídeo ou polipeptídeo em uma fração pela análise SDS/PAGE. Um método preferido para a avaliação da pureza de uma fração de polipeptídeo é calcular a atividade de ligação da fração, e compará-la à atividade de ligação do extrato inicial, e assim calcular o grau de purificação, avaliado no presente por um "número de vezes de purificação." As reais unidades usadas para representar a quantidade da atividade de ligação serão, é claro, dependentes da técnica particular de ensaio escolhida para acompanhar a purificação e de se o polipeptídeo ou peptídeo demonstra uma atividade de ligação detectável.

Polipeptídeos tipo IIB de ativina variante unemse a ligandos que ativam as cascatas de degradação muscular. Os 25 polipeptídeos vActRIIB capazes de ligar e inibir a atividade dos ligandos ativina A, miostatina, e/ou GDF-11, têm potencial terapêutico contra as doenças que envolvem a atrofia muscular, assim como o tratamento de determinados cânceres e de outras doenças como mostrado nos Exemplos abaixo.

Entretanto, pode ocorrer agregação ao expressar ou purificar ou polipeptídeos ActRIIB ou ActRIIB5 do tipo selvagem. Esta agregação inclui a formação de oligômeros 5 estruturados durante a expressão e a geração de agregados não estruturados tanto durante a expressão como após a purificação do Dolioeotideo.

As abordagens combinadas da análise de estruturas, do modelamento molecular e de espectrometria de massa 10 indicaram que a multimerização pode surgir nos polipeptídeos ActRIIB por meio da formação da ligação dissulfeto intermolecular auxiliada por interações eletrostáticas e de ligação de hidrogênio entre os polipeptídeos ActRIIB não glicosilados. Existem significativas ligações de hidrogênio na interface de duas 15 moléculas ActRIIB; entre a cadeia lateral E28 em um ActRIIB e a cadeia lateral R40 no outro ActRIIB, por exemplo. Além disso, existem críticas interações eletrostáticas entre E28 em um ActRIIB e R40 no outro ActRIIB.

Essas interações eletrostáticas podem contribuir 20 de forma significativa para aumentar a população dos dímeros temporais ActRIIB, resultando na promoção de formação de ligação não covalente e/ou covalente entre as unidades ActRIIB. A interação entre resíduos 28 e 40 é a mais crítica dessas interações, já que esses dois resíduos estão envolvidos em 25 ligações duplas de hidrogênio e uma forte interação eletrostática. Os resíduos 28 e 40 estão envolvidos nas interações ActRIIB:ActRIIB e não nas interações ActRIIB:ligando. Assim, os resíduos 28 e 40 podem ser substituídos por aminoácidos não ativos de acordo com a invenção, para melhorar a solubilidade e reduzir a agregação dos polipeptídeos receptores. Portanto, ο E28 e o R40 foram substituídos respectivamente por outros possíveis aminoácidos naturais, expressos e testados por Biacore, como 5 mostrado abaixo. A ligação determinada por Biacore é mostrada nas Tabelas IA e IB no Exemplo 2 abaixo. Além disso, está determinada abaixo a agregação dos polipeptídeos vActRIIB.

Os resultados nos Exemplos abaixo mostram reduzida agregação dos polipeptídeos vActRIIB e das proteínas tendo as substituições de aminoácidos descritas na presente, ainda retendo a capacidade de ligar e neutralizar a miostatina, a ativina A ou o GDF-11.

Anticorpos

A presente invenção ainda inclui anticorpos que se ligam aos polipeptídeos ActRIIB variantes, incluindo aqueles que especificamente ligam aos polipeptídeos vActRIIB da presente invenção. Como usado na presente, o termo "liga especificamente" se refere aos anticorpos tendo afinidade de ligação (Ka) com os polipeptídeos vActRIIB de IO6 M'1 ou mais. Como usado na presente, o termo "anticorpo" se refere aos anticorpos intactos, incluindo anticorpos policlonais (ver, por exemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds) , Cold Spring Harbor Press, (1988) ) , and monoclonal antibodies (ver, por exemplo, patente norteamericana Nos. RE 32.011, 4.902.614, 4.543.439 e 4.411.993, e Monoclonal Antibodies: A New Dimension in Biological Analysis, Plenum Press, Kennett, McKearn and Bechtol (eds.) (1980)). Como usado na presente, o termo "anticorpo" também se refere a um fragmento de um anticorpo como um F(ab), F(ab'), F(ab')2, Fv, Fe, e anticorpos de cadeia simples, que são produzidos por técnicas de DNA recombinante ou por clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos. 0 termo "anticorpo" também se refere aos anticorpos biespecíficos ou bifuncionais, que são um anticorpo 5 híbrido artificial tendo dois pares diferentes de cadeia leve/pesada e dois diferentes sítios de ligação. Anticorpos biesoecíficos podem ser produzidos por vários métodos, incluindo a fusão de hibridomas ou a ligação de fragmentos Fab'. (Ver Songsivilai et al, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990), Kostelny 10 et al., J. Immunol.148:1547-1553 (1992)).

Como usado na presente, o termo "anticorpo" também se refere a anticorpos quiméricos, isto é, anticorpos tendo um domínio constante de imunoglobina de anticorpos humanos acoplados a um ou mais domínio variável imunoglobina de anticorpos 15 não humanos ou de seus fragmentos (ver, por exemplo, patente norte-americana No. 5.595.898 e patente norte-americana No. 5.693.493). Anticorpos também se referem a anticorpos "humanizados" (ver, por exemplo, patente norte-americana No. 4.816.567 and WO 94/10332), minicorpos (WO 94/09817), maxicorpos e 20 anticorpos produzidos por animais transgênicos, onde um animal transgênico contendo uma proporção do anticorpo humano produzindo genes, porém deficiente na produção de anticorpos endógenos, é capaz de produzir anticorpos humanos (ver, por exemplo, Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), e a patente norte25 americana No. 6,300,129). 0 termo "anticorpos" também inclui anticorpos multiméricos, ou um complexo de ordem superior de proteínas, como anticorpos heterodiméricos e anticorpos antiidiotípicos. "Anticorpos" também inclui anticorpos antiidiotípicos. Podem ser usados os anticorpos contra v ActRIIB, por exemplo, para identificar e quantificar o vActRIIB in vitro e in vivo.

Estão também incluídos os anticorpos policlonais de qualquer mamífero, por exemplo, anticorpos de camundongos e de ratos e anticorpos de coelhos, que se ligam especificamente aos polipeptídeos vActRIIB descritos na presente, incluindo SEQ ID NO:

4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95 e 97.

Esses anticorpos têm uso como ferramentas de pesquisa e nos ensaios quantitativos para a detecção e ensaio dos polipeptídeos revelados na presente. Esses anticorpos são produzidos usando os métodos acima descritos e conhecidos na técnica.

Composições farmacêuticas

Também são providas as composições farmacêuticas contendo as proteínas e os polipeptídeos vActRIIB da presente invenção. Essas composições compreendem uma quantidade 20 terapeuticamente ou profilaticamente efetiva do polipeptídeo ou da proteína na mistura com materiais farmaceuticamente aceitáveis e materiais de formulações fisiologicamente aceitáveis. A composição farmacêutica pode conter materiais de formulação para a modificação, manutenção ou preservação, por exemplo, do pH, da 25 osmolaridade, da viscosidade, da claridade, da cor, da isotonicidade, do odor, esterilidade, estabilidade, da taxa de dissolução ou de liberação, da adsorção ou da penetração da composição. Os materiais adequados de formulação incluem, sem limitações, os aminoácidos (como a glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina); antimicrobianos; antioxidantes (como o ácido ascórbico, sulfito de sódio ou o hidrogênio sulfito de sódio); tampões (como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos, 5 demais ácidos orgânicos); agentes de volume(como o manitol ou glicina), agentes de quelação (como o ácido etilenodiamino tetraacético (EDTA)); aqentes complexantes (como cafeína, polivinilpirrolidona, betaciclodextrina ou

hidroxipropilbetaciclodextrina); fillers; monossacarídeos;

dissacarídeos e outros carboidratos (como glucose, manose ou dextrinas); proteínas (como albumina sérica, gelatina ou as imunoglobulinas); colorantes; agentes flavorizantes e de diluição; agentes emulsificadores; polímeros hidrofílicos (como polivinilpirrolidona); polipeptídeos de baixo peso molecular; 15 contraíons formadores de sal (como o sódio); preservativos (como o cloreto de banzalcônio, ácido benzóico, ácido salicílico, timerosal, álcool fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorexidina, ácido sórbico ou propilenoglicol ou

polietilenoglicol); álcoois de açúcar (como manitol ou sorbitol); 20 agentes de suspensão; surfactantes ou agentes umectantes (como plurônico, PEG, ésteres de sorbitan, polissorbatos como polissorbato 20, polissorbato 80, triton, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes ampliadores de estabilidade (sacarose ou sorbitol); agentes ampliadores de tonicidade (como 25 haletos metálicos alcalinos (de preferência cloreto de sódio ou de potássio, manitol, sorbitol) ; veículos de administração; diluentes; excipientes e/ou adjuvantes farmacêuticos. (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990).

A composição farmacêutica ideal será determinada pelos técnicos no assunto, dependendo, por exemplo, da via de administração pretendida, do formato da administração e da dosagem 5 desejada. Ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. Essas composições podem influenciar o estado físico, a estabilidade, a taxa de liberação in vivo e a taxa de clearance in vivo do polipeptídeo. Por exemplo, podem ser composições adequadas a água para injeções, a solução salina fisiológica para 10 administração parenteral.

0 meio ou veículo primário de uma composição farmacêutica pode ter natureza aquosa ou não aquosa. Por exemplo, um meio ou veículo adequado pode ser a água para injeções, a solução salina fisiológica ou o fluido cerebroespinhal artificial, 15 possivelmente suplementado por outros materiais comuns nas composições para administração parenteral. A solução salina neutral tamponada ou a solução salina misturada com albumina sérica são outros exemplos. Outras composições farmacêuticas exemplares compreendem o tampão Tris com pH cerca de 7,0-8,5, ou 20 tampão acetato com pH cerca de 4,0-5,5, que ainda podem incluir o sorbitol ou um substituto adequado. Em uma configuração da presente invenção, as composições podem ser preparadas para armazenagem misturando a composição selecionada tendo o desejado grau de pureza com agentes ideais de formulação (Remington's 25 Pharmaceutical Sciences, supra) sob a forma de um bolo liofilizado ou de uma solução aquosa. Além disso, a composição terapêutica pode ser formulada como um liofilizado usando os excipientes adequados como a sacarose. As formulações podem ser administradas por vários métodos, por exemplo, por terapia de inalação, oral, ou por injeção. Quando for feita a administração parenteral, as composições terapêuticas para uso nesta invenção podem ser sob a 5 forma de solução aquosa aceitável parenteralmente, isenta de pirogênios, compreendendo o polipeptídeo desejado em um veículo farmaceuticamente aceitável. Um veículo particularmente adequado para injeção parenteral é a água distilada estéril, em que é formulado um polipeptídeo como solução estéril e isotônica, 10 adequadamente preservada. Ainda outra preparação pode envolver a formulação da molécula desejada com um agente, como microesferas injetáveis, partículas bioerodíveis, compostos poliméricos (ácido polilático, ácido poliglicólico), contas ou lipossomos, que proporcionam a liberação controlada ou sustentada do produto, que 15 pode então ser administrado por meio de uma injeção depot. Também pode ser usado o ácido hialurônico, e isto pode ter o efeito de

I .

promover a duração sustentada na circulação. Outros meios adequados para a introdução da molécula desejada incluem os dispositivos implantáveis para a administração de medicamentos.

Em outro aspecto, as formulações farmacêuticas

adequadas para a administração injetável podem ser formuladas em soluções aquosas, de preferência em tampões fisiologicamente compatíveis como na solução de Hanks, solução de Ringer ou em solução salina fisiologicamente tamponada. As suspensões para 25 injeção aquosa podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, como a carboximetilcelulose sódica, o sorbitol ou o dextrano. Além disso, as suspensões de compostos ativos podem ser preparadas como adequadas suspensões de injeção oleosa. Os solventes ou veículos liofílicos adequados incluem os óleos graxos, como o óleo de sésamo ou ésteres sintéticos de ácidos graxos, como oleato de etila, triglicérides ou lipossomos. Aminopolímeros policatiônicos não lipídicos também podem ser 5 usados na administração. Opcionalmente, a suspensão também pode conter adequados estabilizadores ou agentes para aumentarem a solubilidade dos compostos e permitir a preparação de soluções altamente concentradas. Em outra configuração, a composição farmacêutica pode ser formulada para inalação. As soluções de 10 inalação também podem ser formuladas com um propelente para administração em aerossol. Em ainda outra configuração, as soluções podem ser nebulizadas. A administração pulmonar é ainda descrita no Pedido PCT No. PCT/US94/001875, que descreve a administração pulmonar de proteínas quimicamente modificadas.

É também contemplado que certas formulações podem

ser administradas por via oral. Em uma configuração da presente invenção, as moléculas que são administradas dessa forma podem ser formuladas com ou sem esses veículos normalmente usados na composição de formas farmacêuticas sólidas como comprimidos e 20 cápsulas. Por exemplo, uma cápsula pode ser projetada para a liberação da arte ativa da formulação no ponto do trato gastrintestinal quando a biodisponibilidade for maximizada e a degradação pré-sistemica for minimizada. Podem ser incluídos outros agentes para facilitarem a absorção da molécula 25 terapêutica. Diluentes, flavorizantes, ceras de baixo ponto de fusão, óleos vegetais, lubrificantes, agentes de suspensão, agentes para a desintegração de comprimidos e aglomerantes também podem ser empregados. Também podem ser formuladas composições farmacêuticas para administração oral usando veículos farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica em dosagens adequadas para administração oral. Esses veículos permitem que as composições farmacêuticas sejam formuladas como comprimidos, 5 pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, misturas, suspensões e similares para ingestão pelo paciente.

As oreoaracões farmacêuticas cara uso oral Dodem ser obtidas pela combinação de compostos ativos com excipiente sólido e o processamento da mistura resultante de grânulos (opcionalmente, após moagem) para a obtenção dos comprimidos ou dos núcleos das drágeas. Podem ser adicionados os auxiliares adequados, se desejado. Os excipientes adequados incluem fillers de carboidratos ou protéicos, como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol e sorbitol; amido de milho, trigo, arroz, batata ou outras plantas; celulose, como metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, ou sódio carboximetilcelulose; gomas, incluindo arábica e tragacanto; e proteínas, como gelatina e colágeno. Se desejado, podem ser adicionados agentes de desintegração ou solubilização, como polivinilpirrolidona de ligação cruzada, agar e ácido algínico ou um de seus sais, como alginato de sódio.

Podem ser usados núcleos de drágeas em conjunto com os revestimentos adequados, como soluções de açúcar concentrado, que também podem conter goma arábica, talco, 25 polivinilpirrolidona, carbopol gel, polietilenoglicol e/ou dióxido de titânio, soluções de verniz e solventes orgânicos adequados ou misturas de solventes. Podem ser adicionados corantes de cuba ou pigmentos aos comprimidos ou revestimentos de drágeas para a identificação do produto ou para caracterizar a quantidade do composto ativo, isto é, da dosagem.

As preparações farmacêuticas que podem ser usadas oralmente também incluem as cápsulas do tipo push-fit feitas de 5 gelatina, assim como cápsulas macias seladas feitas de gelatina e um revestimento, como glicerol ou sorbitol. Cápsulas do tipo pushfit podem conter princípios ativos misturados a fillers ou a aglomerantes, como lactose ou amidos, lubrificantes, como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizadores. Nas 10 cápsulas macias, os princípios ativos podem ser dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, como em óleos graxos, líquidos, ou em polietilenoglicol líquido com ou sem estabilizadores.

Outras composições farmacêuticas ficarão evidentes para os técnicos no assunto, incluindo formulações 15 envolvendo polipeptídeos em formulações de administração sustentada ou controlada. Também são conhecidas técnicas para os peritos no assunto para a formulação de vários outros meios de administração sustentados ou controlados, como veículos lipossomos, micropartículas bioerodíveis ou contas porosas e 20 injeções depot. Ver, por exemplo, PCT/US93/00829 que descreve a liberação controlada de micropartículas poliméricas porosas para a administração de composições farmacêuticas. Outros exemplos de preparações de liberação sustentada incluem matrizes poliméricas semipermeáveis sob a forma de artigos conformados, ex., filmes ou 25 microcápsulas. As matrizes de liberação sustentada podem incluir poliésteres, hidrogéis, polilactídeos (patente norte-americana 3.773.919, EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutâmico e gamaetil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 (1983), poli (2-hidroxietil-metacrilato) (Langer et al. , J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277, (1981); Langer et al. , Chem. Tech.,12:98-105(1982)), etilenovinil acetato (Langer et al., supra) ou ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (EP 133,988).

Composições de liberação sustentada também incluem lipossomos, que podem ser preparados por qualquer um dos vários métodos conhecidos na técnica. Ver, ex., Eppstein et al., PNAS (USA), 82:3688 (1985); EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949.

A composição farmacêutica a ser usada para a 10 administração in vivo deve ser normalmente estéril. Isto pode ser conseguido por filtração por meio de membranas de filtração estéreis. Quando a composição for liofilizada, a esterilização por este método tanto pode ser feita antes como depois da liofilização e reconstituição. A composição para administração parenteral pode 15 ser armazenada sob forma liofilizada ou em solução. Além disso, composições parenteral geralmente são colocadas em um recipiente com porta de acesso estéril, por exemplo, em bolsa ou frasco de solução intravenosa com um bujão que possa ser perfurado por uma agulha hipodérmica para injeção.

Uma vez a composição farmacêutica tendo sido

formulada, pode ser guardada em frascos estéreis como uma solução, suspensão, gel, emulsão, sólido ou um pó desidratado ou liofilizado. Essas formulações podem ser guardadas tanto sob a forma de uso imediato ou sob uma forma (ex., liofilizada) que exija reconstituição antes da administração.

Em uma configuração especifica, a presente invenção é direcionada a kits para a produção de uma unidade para administração em dose única. Os kits podem incluir tanto um primeiro recipiente com a proteína seca e um segundo recipiente tendo uma formulação aquosa. Também incluídos no escopo desta invenção estão os kits contendo seringas preenchidas multicamerais e simples (ex., seringas de líquidos e lioseringas).

Uma quantidade efetiva da composição farmacêutica

a ser empregada terapeuticamente dependerá, por exemplo, do contexto e dos obietivos terapêuticos. Os técnicos no assunto apreciarão que os níveis adequados de dosagem para o tratamento variarão dependendo, em parte, da molécula administrada, da 10 indicação para a qual o polipeptídeo estiver sendo usado, da via de administração, e do tamanho (peso corporal, superfície corporal ou do tamanho do órgão) e da condição (da idade e da saúde geral) do paciente. Assim, o clínico pode titular a dosagem e modificar a via de administração para obter o efeito terapêutico ideal. Uma 15 dosagem típica pode variar entre cerca de 0,1 mg/kg até cerca de 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores acima mencionados. As composições de polipeptídeos podem ser, de preferência, injetadas ou administradas via intravenosa. As composições farmacêuticas de longa atuação podem ser administradas a cada três ou quatro dias, 20 a cada semana ou a cada duas semanas, dependendo da meia-vida e da taxa de clearance da formulação em particular. A frequência da dosagem dependerá dos parâmetros farmacocinéticos do polipeptídeo na formulação usada. Normalmente, a composição é administrada até que seja atingida a dosagem que obtiver o efeito desejado. A 25 composição pode, portanto, ser administrada como dose simples, ou como doses múltiplas (nas mesmas ou em diferentes concentrações/dosagens) no tempo, ou como infusão contínua. Outros refinamentos da dosagem adequada são normalmente feitos. Podem ser obtidas as dosagens adequadas com o uso dos dados adequados de dose-resposta.

A via de administração da composição farmacêutica está de acordo com os métodos conhecidos, ex., por via oral, injeção intravenosa, intraperitoneal, intracerebral

(intraparenquimal), intracerebroventricular, intramuscular,

intraocular, intra-arterial, intraportal, intralesional,

intramedular, . intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutânea ou intraperitoneal; assim como por meio intranasal, entérica, tópica, sublingual, uretral, vaginal ou retal, por meio de sistemas de liberação sustentada ou por dispositivos de implantes. Quando desejado, as composições podem ser administradas por injeção de bolo ou continuamente por infusão, ou por dispositivos de implantes. Alternativamente ou adicionalmente, a composição pode ser localmente administrada via implantação de uma membrana, esponja ou outro material adequado, no qual a molécula desejada tenha sido absorvida ou encapsulada. Quando for usado um dispositivo de implante, o dispositivo pode ser implantado em qualquer tecido ou órgão adequado, podendo a administração da molécula desejada ser feita por difusão, bolo de liberação temporizada ou por administração contínua.

Em certos casos, os polipeptídeos vActRIIB da presente invenção podem ser administrados implantando determinadas células que foram produzidas geneticamente, usando métodos como os 25 descritos na presente, para expressar e secretar o polipeptídeo. Essas células podem ser animais ou humanas, podendo ser autólogas, heterólogas ou xenogênicas. Opcionalmente, as células podem ser imortalizadas. Para reduzir a possibilidade de uma resposta imunológica, as células podem ser encapsuladas para evitar a infiltração dos tecidos vizinhos. Os materiais de encapsulação são normalmente biocompativeis, alojamentos poliméricos semipermeáveis ou membranas que permitam a liberação do(s) produto(s) 5 polipeptídeo(s) , mas que evite a destruição das células pelo sistema imunológico do paciente ou por outros fatores prejudiciais dos tecidos circundantes.

Também é projetada a terapia genética vActRIIB in vivo, onde uma molécula de ácido nucléico codificando vActRIIB, ou um derivado do vActRIIB é diretamente introduzido no indivíduo. Por exemplo, uma seqüência ácido nucléica codificando um vActRIIB é introduzida nas células alvo por meio de injeção local de uma construção ácido nucléica, com ou sem um vetor adequado de administração, como um vetor viral adeno-associado. Outros vetores virais incluem, sem limitações, retrovírus, adenovírus, herpes simplex, vírus e vetores papiloma virais. A transferência física do vetor viral pode ser obtida in vivo por injeção local da construção ácido nucléica desejada ou outro vetor adequado de administração contendo a desejada seqüência ácido nucléica, de transferência mediada por lipossomo, injeção direta (DNA nu) , ou bombardeio de micropartículas de biobalística (gene-gun).

Usos das Composições vActRIIB

A presente invenção proporciona métodos e composições farmacêuticas para a redução ou a neutralização da 25 quantidade ou da atividade da miostatina, ativina A ou GDF-11 in vivo e in vitro pelo contato dos polipeptídeos com o polipeptídeo vActRIIB. Os polipeptídeos vActRIIB têm alta afinidade com a miostatina, ativina Aeo GDF-11, sendo capazes de reduzir e inibir as atividades biológicas de pelo menos uma entre a miostatina, a ativina Aeo GDF-11. Em algumas configurações, os polipeptídeos vActRIIB demonstram melhor atividade quando comparados com os polipeptídeos ActRIIB de tipo selvagem. Isto fica demonstrado nos Exemplos abaixo.

Em um aspecto, a presente invenção provê métodos e reaqentes para o tratamento de distúrbios relacionados com a miostatina e/ou com a ativina A em um paciente que necessite por meio da administração de uma dosagem efetiva de uma composição 10 vActRIIB ao indivíduo. Como usado na presente, o termo "indivíduo" se refere a qualquer animal, como os mamíferos, incluindo os humanos.

As composições da presente invenção são usadas para aumentar a massa muscular magra como uma porcentagem do peso corporal e reduzir a massa de gordura como uma porcentagem do peso corporal.

Os distúrbios que podem ser tratados com uma composição vActRIIB incluem, sem limitações, várias formas de atrofia muscular, assim como de distúrbios metabólicos como o 20 diabetes e seus distúrbios relacionados, assim como doenças ósseodegenerativas como a osteoporose. As composições vActRIIB demonstraram ser efetivas no tratamento dos distúrbios da atrofia muscular em vários modelos de doenças apresentados no Exemplo 3 abaixo. Isto ficou demonstrado no tratamento da atrofia muscular 25 em camundongos knockout para inibina-α, no tratamento da atrofia muscular em modelos de caquexia de câncer do cólon-26, na prevenção da atrofia muscular em modelo de suspensão de membro traseiro, no tratamento de fêmeas OXV que demonstram aumento da massa muscular magra, na redução da massa de gordura e no aumento do teor mineral ósseo.

Os distúrbios da atrofia muscular também incluem distrofias como a distrofia muscular de Duchenne, a distrofia

muscular progressiva, a distrofia muscular do tipo de Becker, a distrofia muscular Dejerine-Landouzy, a distrofia muscular de Erb, e a distrofia muscular neuroaxonal infantil. Outros distúrbios de atrofias musculares surgem de doenças crônicas ou de distúrbios como a esclerose lateral amiotrófica, a doença pulmonar obstrutiva 10 congestiva, câncer, AIDS, insuficiência renal, atrofia orgânica, deprivação androgênica e artrite reumatóide.

A sobreexpressão da miostatina e/ou da ativina pode contribuir para a caquexia, uma síndrome muscular severa e de atrofia muscular. A efetividade dos polipeptídeos vActRIIB no tratamento de caquexias em modelos animais está demonstrada no Exemplo 3 abaixo. A caquexia também pode surgir devido à artrite reumatóide, nefropatia diabética, insuficiência renal, quimioterapia, ferimentos devidos à queimaduras, assim como devido a outras causas. Em outro exemplo, as concentrações séricas e intramusculares da proteína miostatina-imunoreativa aumentaram nos homens com atrofia muscular relacionada à AIDS e inversamente relacionadas à massa sem gordura (Gonzalez-Cadavid et al., PNAS USA 95: 14938-14943 (1998)}. Os níveis de miostatina também mostraram aumentar como resposta a danos de queimaduras, resultando em um efeito muscular catabólico (Lang et al, FASEB J

15, 1807-1809 (2001)). Outras condições que resultam em atrofia muscular podem surgir a partir da inatividade devida à incapacidade, como pelo confinamento a uma cadeira de rodas, repouso prolongado na cama devido a AVC, doenças, danos à coluna, fratura ou trauma ósseo e atrofia muscular em ambiente de microgravidade (voos espaciais). Por exemplo, a proteína imunorreativa plasmática da miostatina demonstrou aumentar após repouso prolongado na cama (Zachwiej a et al. J Gravit Physiol.

6 (2):11(1999) . Também foi achado que os músculos de ratos expostos λ nin flrribifinte de microaravidade durante um voo espacial expressou uma maior quantidade de miostatina comparado com os músculos de ratos que não estiveram expostos (Lalani et al., J.Endocrin 167 (3):417-28 (2000)).

Além disso, aumentos na gordura relacionados à idade nas taxas musculares, e a atrofia muscular relacionada à idade parecem estar relacionadas com a miostatina. Por exemplo, a proteína média imunorreativa da miostatina sérica aumentou com a 15 idade em grupos de jovens (19-35 anos), em pessoas de idade mediana (36-75 anos) e nos idosos (76-92 anos) entre homens e mulheres, enquanto a massa muscular média e a massa sem gordura declinaram com a idade nesses grupos (Yarasheski et al. J Nutr Aging 6(5):343-8 (2002)). Além disso, a miostatina foi achada 20 expressando em baixos níveis no músculo cardíaco, sendo a expressão regulada para cima nos cardiomiócitos após um infarto (Sharma et al. , J Cell Physiol. 180 (1) : 1 — 9 (1999)). Portanto, a redução dos níveis de miostatina no músculo cardíaco pode melhorar sua recuperação após um infarto.

A miostatina também parece influenciar os

distúrbios metabólicos, incluindo o diabetes do tipo 2, o diabetes mellitus não-insulino dependente, a hiperglicemia e a obesidade. Por exemplo, a falta de miostatina demonstrou melhorar os fenótipos obeso e diabético de dois modelos de camundongos (Yen et al. FASEB J. 8:479 (1994). Foi demonstrado no pedido norteamericano série no: 11/590,962, na publicação do pedido norteamericano No: 2007/0117130, que os vetores AAV-ActRIIB5 aumentam a 5 taxa de músculo-gordura em um animal, em particular em modelos de animais obesos. Os polipeptideos vActRIIB da presente revelação, como da SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95 são adequados para tais usos. 10 Portanto, a redução da composição de gordura pela administração das composições da presente invenção melhora o diabetes, a obesidade e as condições hiperglicêmicas em animais. Além disso, composições contendo os polipeptideos vActRIIB podem reduzir a ingestão alimentar em pessoas obesas, como demonstrado no pedido 15 norte-americano série no: 11/590.962, na publicação do pedido norte-americano No: 2007/0117130 para o polipeptideo ActRIIB5.

A administração dos polipeptideos ActRIIB da presente invenção pode melhorar a resistência óssea e reduzir a osteoporose e outras doenças ósseo-degenerativas. Isto ficou 20 demonstrado no modelo de camundongo OVX descrito abaixo. Também foi achado, por exemplo, que os camundongos com deficiência de miostatina demonstraram um aumento no teor mineral e na densidade do úmero do camundongo, e aumento do teor mineral tanto do osso trabecular como cortical na região de ligação muscular, assim como 25 massa muscular aumentada (Hamrick et al. Calcif Tissue Int 71(1):63-8 (2002)). Além disso, as composições vActRIIB da presente invenção podem ser usadas para tratar os efeitos da deprivação androgênica, como a terapia de deprivação androgênica usada para o tratamento do câncer de próstata.

A presente invenção também provê métodos e composições para o aumento da massa muscular em animais para alimentação, administrando uma dosagem efetiva das proteínas 5 vActRIIB ao animal. Como o polipeptídeo maduro miostatina Cterminal é idêntico em todas as espécies testadas, os polipeptideos vActRIIB deveriam ser efetivos para aumentar a massa muscular e reduzir a gordura em todas as espécies agriculturalmente importantes, incluindo o gado, galinhas, perus e 10 porcos.

Os polipeptideos vActRIIB e as composições da presente invenção também antagonizam a atividade da ativina A. A ativina A é conhecida como sendo expressa em certos tipos de cânceres, particularmente tumores gonadais, como carcinomas 15 ovarianos e provocando caquexia severa. (Ciprano et al. Endocrinol 141 (7) : 2319-27 (2000), Shou et al., Endocrinol 138 (ll):5000-5 (1997); Coerver et al, Mol Endocrinol 10(5):534-43 (1996); Ito et al. British J Cancer 82 (8):1415-20 (2000), Lambert-Messerlian, et al, Gynecologic Oncology 74:93-7 (1999). No Exemplo 3 abaixo, os 20 polipeptideos vActRIIB da presente invenção demonstraram ser efetivos no tratamento da caquexia severa, reduzindo as dimensões do tumor e prolongando a sobrevida em modelos de camundongos knockout para inibina-a e em modelos de camundongos com caquexia de câncer de cólon 26. Portanto, as composições da presente 25 revelação podem ser usadas no tratamento de condições relacionadas com a sobreexpressão da ativina A, assim como da expressão da miostatina, como na caquexia de determinados cânceres e no tratamento de certos tumores gonadais. As composições da presente revelação podem ser usadas individualmente ou em combinação com outros agentes terapêuticos para ampliar os efeitos terapêuticos ou reduzir os potenciais efeitos colaterais. Essas propriedades incluem maior atividade, maior solubilidade, degradação reduzida, aumento da meia-vida, reduzida toxicidade e reduzida imunogenicidade. Assim, as comDosicões da Dresente revelação são úteis nos longos regimes ' " " de tratamento. Ãíém disso, as propriedades de hidrofilicidade e de hidrofobicidade dos compostos da invenção são bem equilibradas, aumentando assim suas utilidades tanto para usos in vitro como especialmente usos in vivo. Especificamente, os compostos da revelação têm um grau adequado de solubilidade em meio aquoso que permite a absorção e a biodisponibilidade no corpo, mantendo também um grau de solubilidade em lipideos que permite que os compostos atravessem a membrana celular para um suposto sítio de ação, como uma determinada massa muscular.

Além disso, os polipeptideos vActRIIB da presente invenção são úteis na detecção e quantificação da miostatina, da ativina A ou do GDF-Il em qualquer número de ensaios. Em geral, os 20 polipeptideos ActRIIB da presente invenção são úteis como agentes de captura para ligar e imobilizar a miostatina, a ativina A ou o GDF-Il em vários ensaios, similares aos descritos, por exemplo, em Asai, ed., Methods in Cell Biology, 37, Antibodies in Cell Biology, Academic Press, Inc., New York (1993). Os polipeptideos 25 podem ser rotulados de alguma forma ou podem reagir com uma terceira molécula com um anticorpo que esteja rotulado para permitir que a miostatina seja detectada e quantificada. Por exemplo, um polipeptídeo ou uma terceira molécula pode ser modificada com um meio detectável, como biotina, que pode então ser ligada por uma quarta molécula, como uma estreptavidina rotulada por enzima ou outras proteínas. (Akerstrom, J Immunol 135:2589 (1985); Chaubert, Mod Pathol 10:585 (1997)).

Tendo sido descrita a invenção, são oferecidos os

seguintes exemplos como ilustração, sem limitações.

Exemplo 1

-------- ----- — - — ' 'Expressão e Purificação de polipeptideos vActRIIB

Foram usados os seguintes métodos para expressar e purificar os polipeptideos ActRIIB variantes.

O cDNA do receptor humano da ativina tipo IIB foi isolado de uma biblioteca cDNA com origem em testículos humanos (Clontech, Inc.) e clonado como descrito no pedido norte-americano série no: 11/590.962, na publicação do pedido norte-americano No: 2007/0117130.

Determinação da substituições de aminoácidos As abordagens combinadas de análise estrutural, de modelamento molecular e de espectrometria de massa indicaram que a agregação (oligomerização) pode surgir no ActRIIB por meio 20 da formação da ligação do dissulfeto intermolecular acionado pelas interações eletrostáticas e de ligação H entre moléculas ActRIIB não glieosiladas. Os resíduos 28 e 40 foram determinados como estando envolvidos nas interações ActRIIB:ActRIIB e não nas interações ActRIIB com seus ligandos.

Inicialmente, ο E28 e o R40 na ActRIIB-Fc foram

substituídos por A em cada posição. Análises de difusão luminosa e de espectrometria de massa confirmaram que a fração do vActRIIBIgGlFc totalmente glicosilada, do E28A e da VActRIIB-IgGlFc R40A aumentou significativamente comparada com a proteína do tipo selvagem. VActRIIB-IgGlFc E28A e R40A foram incubadas a 37 0C por

6 dias, resultando em pouca ou nenhuma agregação comparada com o tipo selvagem. As substituições de aminoácidos nas posições 28 e 40 (com relação à SEQ ID NO: 2 e 18 com a seqüência de sinalização) foram feitas para aliviar ou evitar a agregação que

nnHo nrnrrpr Hnrsnt-p Λ pmrpqsÃn nu nnri f ί Γ.3Π30 fio ActRIIB tÍDO

"selvagem (SÉQ ID NO: 2 e 18). Esta agregação foi identificada como formação de oligômero estruturado durante a expressão e a geração de agregado não estruturado tanto durante a expressão como após a purificação da proteína.

A agregação nos diferentes estágios dos processos de produção e purificação foi determinada usando cromatografia por exclusão de tamanho de acordo com o procedimento abaixo.

O seguinte método exemplar foi usado para

produzir os polipeptideos ActRIIB variantes (vActRIIB e vActRIIB5). Os polinucleotídeos codificando o vActRIIB, E28W (SEQ ID NO: 23) foram fundidos aos polinucleotídeos codificando o domínio IgGl Fc humano (SEQ ID NO: 82) ou os polinucleotídeos 20 codificando o IgG2 Fc humano (SEQ ID NO: 84) , por meio de uma seqüência hinge ligante (nucleotídeos codificando SEQ ID NO: 79) usando a extensão de sobreposição PCR e usando primers contendo a mutação resultante em E28W. A seqüência polinucleotídea completa é a SEQ ID NO: 61. Os fragmentos de DNA de fita dupla foram 25 subclonados em pTT5 (Biotechnology Research Institute, National Research Council Canada (NRCC), 6100 Avenue Royalmount, Montréal (Québec) Canada H4P 2R2), pDSRa descrito em W0/9014363) e/ou derivados de pDSRa. Em outras configurações, polinucleotídeos codificando os polipeptideos vActRIIB foram anexados aos polinucleotídeos codificando o ligante GGGGS (SEQ ID NO: 75) ou seus multímeros e/ou hinge ligantes (como SEQ ID NO: 79).

Foi feita a expressão transiente dos vActRIIB-Fc e vActRIIB5-Fc produzidos como a seguir.

As variantes produzidas das duas moléculas acima foram expressas de forma transiente em células 293-6E adaptadas em suspensão isenta de soro (National Research Council of Canada, Ottawa, Canada) mantidas em meio FreeStyle™ (Invitrogen 10 Corporation, Carlsbad, CA) suplementadas com 250 μg/ml de geneticina (Invitrogen) e 0,1% de Pluronic F68 (Invitrogen). As transfecções foram feitas como culturas IL. Em resumo,' o inóculo celular cresceu até 1,1 x IO6 células/ml em um frasco de agitação fernbach de 4L (Corning, Inc.). A cultura em frasco de agitação 15 foi mantida em uma plataforma de agitação Innova 2150 (News Brunswick Scientific, Edison, NJ) a 65 RPM que foi colocada em um incubador umidificado mantido a 37 0C e 5% CO2. Na ocasião da transfecção, as células 293-6E foram diluídas até 1,0 x IO6 células/ml.

Foram formados os complexos de transfecção em 100

ml de meio FreeStyle. 1 mg de DNA plasmídeo foi primeiramente adicionado ao meio seguido por 3 ml de reagente de transfecção FuGene HD (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). 0 complexo de transfecção foi incubado em temperatura ambiente por 25 aproximadamente 15 minutos e então adicionado às células no frasco de agitação. Vinte e quatro horas pós-transfecção, foram adicionados 20% (p/v) de peptona TNl (OrganoTechnie S. A., TeknieScience, QC, Canada) para obter uma concentração final de 0,5% (p/v). A transfecção/expressão foi feita por 4-7 dias, após o que o meio condicionado foi colhido por centrifugação a 4.000 RPM por 60 minutos a 4°C.

A transfecção e a expressão foram feitas como a seguir. As linhas celulares IgG2-Fc vActRIIB-humanas (hu) foram criadas pela transfecção de células hospedeiras CHO estáveis com os plasmídeos de expressão pDC323-vActRIIB (E28W)-huIgG2 Fc e pDC~324-vActRIIB (E28W)-huIgG2 Fc (de acordo com Bianchi et al., Biotech and Bioengineering, 84(4):439-44 4 (2003)) usando um procedimento padrão de eletroporação. Após a transfecção da linha da célula hospedeira com os plasmídeos de expressão, as células foram cultivadas em meio de seleção isento de soro sem GHT por 2-3 semanas para permitir a seleção do plasmídeo e a recuperação das células As células são selecionadas até que tenham viabilidade superior a 85%. Este conjunto de células transfectadas foi então colocado em cultura em meio contendo metotrexato 150 nM.

Clonagem da Linha Celular

Foi feito um banco de células dos clones selecionados de acordo com o seguinte procedimento. Um conjunto 20 amplificado de células transfectadas estáveis foi semeado em placas de 96 poços, e os clones candidatos foram avaliados quanto ao crescimento e desempenho de produtividade em estudos de pequena escala. Foram preparados bancos celulares pré-master (PMCB) de aproximadamente 60 frascos a partir do clone escolhido. Todos os 25 PMCBs foram testados quanto à esterilidade, micoplasma e vírus.

Uma linha celular que expressa o vActRIIB-Fc foi medida usando um processo típico de fed-batch. As células foram inoculadas em um biorreator Wave (Wave Biotech LLC). A cultura foi alimentada três vezes com bolo. Foram colhidos IOL no dia 10, sendo o restante colhido no dia 11; ambas as colheitas passaram por filtração em profundidade, seguida por filtração estéril. Os meios condicionados foram filtrados em um pré-filtro de 10 5 polegadas com 0,45/0,2 micron, seguido por uma filtração em filtro de 6 polegadas com 0,2 micron.

Purificação da Proteína

Aproximadamente 5 L do meio condicionado contendo ActRIIB-Fc (tanto IgGl como IgG2), ActRIIB5-Fc (tanto IgGl como 10 IgG2), e suas variantes foram concentrados usando um filtro de membrana com fluxo tangencial de 5 ft2 10K (Pall) . O material concentrado foi aplicado em uma coluna Protein A High Performance Column™ (GE Healthcare) de 5 mL que foi equilibrada com PBS (da Dulbecco sem cloreto de magnésio ou cloreto de cálcio). Após a 15 lavagem da coluna com o tampão de equilíbrio a absorbância em 280 nm (OD2So) foi inferior a 0,1, a proteína de ligação foi eluída com 0,1 M glicina-HCl, pH 2,7, e imediatamente neutralizada com I M Tris-HCl, pH 8,5. 0 conjunto neutralizado eluído foi concentrado até um volume de 1 ml e aplicado em uma coluna 320 ml Sephacryl 20 200 (GE Healthcare) que foi equilibrada em PBS (da Dulbecco sem cloreto de magnésio ou cloreto de cálcio. Foram operados géis 4- 20% SDS PAGE (Invitrogen) para determinar quais as frações para a realização do pool. Esses polipeptideos foram testados com relação à atividade e o grau de agregação, como mostrado abaixo.

Opcionalmente, os polipeptideos podem ainda ser

purificados, usando, por exemplo, uma coluna Shp-Sepharose. A concentração foi determinada usando OD280.

Exemplo 2 Ensaios de atividade in vitro

As amostras dos polipeptideos vActRIIB purificadas como acima descritas foram diluídas com soro salino tamponado com fosfato (PBS: 2,67 mM de cloreto de potássio, 138 mM 5 de cloreto de sódio, 1,47 mM de fosfato monobásico de potássio, 8,1 mM de fosfato dibásico de sódio, pH 7,4) até 0,2 mg/ml, innihafin s 37 0C Dor 6 dias. e então aolicadas em MALDI-MS (espectrometria de massa por dessorção/ionização laser matriz assistida), análises SEC e/ou SEC-LS. A agregação dos 10 polipeptideos wt e variantes após a etapa de purificação da proteína A foi determinada usando SEC ou SEC-LS, e o peso molecular das moléculas confirmado usando o procedimento MALDI-MS descrito abaixo.

Cromatografia por Exclusão de Tamanho (SEC). Foram feitos experimentos no sistema HPLC Agilent 1100 com duas colunas (T0S0HAAS G3000swxl, 7,8 x 300 mm) em tandem. Foi usado 2x PBS na fase móvel a 0,5 ml/minuto.

Cromatografia por exclusão de tamanho - difusão Iuminosa(SEC-LS). Foram feitos experimentos no sistema HPLC 20 Agilent 1100 com uma coluna de filtração gel Superdex-200 (Amersham Pharmacia, Waukesha, WI). As amostras passaram então por um detector de difusão luminosa laser Wyatt miniDawn LS e um Refratômetro Wyatt Optilab DSP (Wyatt Technology Co., Santa Barbara, CA) para determinar a massa molecular. O PBS foi usado 25 como fase móvel a 0,4 ml/minuto.

Espectrometria De Massa Por Dessorção/ionização Laser Matriz Assistida. As amostras foram misturadas (1:1) com ácido sinapínico e aplicadas ao MALDI-MS (Applied Biosystems Voyager System 2009). Este procedimento foi usado para verificar o peso molecular das moléculas.

Determinou-se a afinidade de ligação e dos valores IC50 da ativina e da miostatina como descrita abaixo.

Ensaio Qualitativo BIAcore®. E28 e R40 foram

respectivamente substituídos respectivamente por outros aminoácidos naturais em fusões com IgGl Fc como descrito acima. Estes foram gerados com ou sem ligantes, como mostrado nas Tabelas abaixo. Cada amostra VActRIIB-IgGlFc dos meios condicionados foi capturada em anticorpo IgGl Fc antiumano de cabra (Jackson Imrnuno Research, cat# 109-005-098, lote 63550) com revestimento superficial CM5. 20 nM de ativina A foram injetados nas superfícies da amostra capturada usando BIACore2000 (BIACore Life Sciences, Piscataway, New Jersey). Os sensorgramas resultantes foram normalizados no RL capturado (500 RU) de variantes vActRIIBIgGlFc. A resposta de ligação normalizada (RU) para as mesmas variantes é mostrada na Tabela 2, sendo ainda descrita abaixo. Foi também determinada a afinidade relativa de ligação da ativina por meio de medições Biacore usando meios condicionados obtidos da expressão celular de mamíferos. A ativina A (20 nM) foi usada para capturar o polipeptídeo receptor solúvel nos meios condicionados sendo normalizados os sinais SPR medidos. SPR normalizado de +++++: > 60, ++++: 40 — 60, +++: 20 — 40, ++: 10 — 20, +: 5 — 10, <5.

A Tabela IA e a Tabela IB resumem os resultados

dos dados de ligação relativa. A tabela abaixo mostra determinadas configurações do vActRIIB-IgGlFc, em particular ligadas à ativina A com maior afinidade que a do tipo selvagem, ou afinidade retida comparável com a do tipo selvagem.

Tabela IA

Ligação ActRIIB-IgGl Fc Projetada e do Tipo

Selvagem (Transfectantes Estáveis)

CHO Expressão Molécula Res28 Res 4 0 Ligante Ligação (SEQ ID relativa NO: 75) de ativina CHOO Estável ActRIIB5 (E 2 8) m nenhum +++ (E28A(E28) CHO Estável ActRIIB5 E28A Nenhu nenhum +++ m CHO Estável ActRIIB5 E28A Nenhu GGGGS +++ m CHOO Estável ActRIIB5 nenhum R4 0A GGGGS +++ CHO Estável ActRIIB5 E28W R4 0A GGGGS ++++ CHO Estável ActRIIB nenhum Nenhu GGGGS ++++ (E28) m CHO Estável ActRIIB E28A Nenhu GGGGS +++ m CHO Estável ActRIIB E28A Nenhu 2(GGGGS) +++ m COS Estável ActRIIB nenhum Nenhu nenhum ++ (E28) m COS Estável ActRIIB E28A Nenhu nenhum ++ m COS Estável ActRIIB nenhum R4 0A nenhum ++ (E28) Tabela IB

Ligação ActRIIB-IgGl Fc Projetada e do Tipo

Selvagem (Transfectantes Transientes)

COS Transiente ActRII E28W nenhum GGGGS ++ + + + B (R40) COS Transiente ActRII E28Y nenhum GGGGS + ++++ B (R40) COS Transiente ActRII nenhum R40G GGGGS + + + B (E28) COS Transiente ActRII E28F nenhum GGGGS +++ B (R40) COS Transiente ActRII nenhum nenhum GGGGS + B (E28) (R40) COS Transiente AetRII nenhum nenhum GGGGS + R fR4m CHO Transiente ActRII E28A nenhum nenhum B (R40) COS Transiente AetRII E28T nenhum GGGGS B (R40) COS Transiente AetRII E28Q nenhum GGGGS + B (R40) COS Transiente AetRII E28S nenhum GGGGS B (R40) COS Transiente AetRII E28D nenhum GGGGS B (R40) COS Transiente AetRII E28V nenhum GGGGS + B (R4 0) COS Transiente AetRII E28I nenhum GGGGS ++ B (R4 0) COS Transiente AetRII E28L nenhum GGGGS + B (R4 0) COS Transiente AetRII E28C nenhum GGGGS B (R40) COS Transiente AetRII E28G nenhum GGGGS B (R40} COS Transiente AetRII E28P nenhum GGGGS B (R40) COS Transiente AetRII E28R nenhum GGGGS B (R40) COS Transiente AetRII E28N nenhum GGGGS B (R40) COS Transiente AetRII E28A nenhum GGGGS + B (R40) COS Transiente ActRII E28M nenhum GGGGS + + B (R40) COS Transiente ActRII E28K nenhum GGGGS + B (R40) COS Transiente AetRII E28H nenhum GGGGS + B (R40) COS Transiente AetRII nenhum R40Q GGGGS + R COS Transiente ActRII nenhum R4-0P GGGGS B (E28) CHO Transiente AetRII nenhum R4 0A GGGGS + B (E 2 8) COS Transiente AetRII nenhum R40L GGGGS B (E28) COS Transiente AetRII nenhum R40T GGGGS B (E28) COS Transiente AetRII nenhum R40F GGGGS B (E28) COS Transiente AetRII nenhum R40Y GGGGS B (E28) COS Transiente AetRII nenhum R40V GGGGS B (E28) COS Transiente AetRII nenhum R40S GGGGS B (E28) COS Transiente AetRII nenhum R40M GGGGS + B (E28) COS Transiente AetRII nenhum R40H GGGGS ++ B (E28) COS Transiente AetRII nenhum R40I GGGGS B (E28) COS Transiente ActRII nenhum R40C GGGGS B (E28) COS Transiente AetRII nenhum R40K GGGGS + + B (E28) COS Transiente AetRII nenhum R40N GGGGS + + B (E28) Ensaio de atividade baseado em Células C2C12 As variantes vActRIIB5-IgGlFc e vActRIIB-IgGlFc

foram geradas como acima descritas. A capacidade dessas variantes para inibir a ligação da ativina A ou da miostatina ao receptor de ativina IIB receptor foi testada usando um ensaio de atividade baseado em células como descrito abaixo.

roí geraaa uma nnna ceiuiar repórter responsiva à miostatina/ativina/GDF-11 pela transfecção de células mioblastos C2C12 (ATCC N°: CRL-1772) com uma construção pMARE-luc. A 10 construção pMARE-luc é feita pela clonagem de doze repetições da seqüência CAGA, representando os elementos de resposta da miostatina/ativina (Dennler et al. EMBO 17: 3091-3100 (1998)) em um vetor repórter pLuc-MCS (Stratagene cat # 219087) a montante da caixa TATA. As células C2C12 expressam naturalmente o receptor 15 ativina IIB em suas superfícies celulares. Quando a miostatina/ativina A/GDF-11 liga os receptores celulares, é ativado o caminho Smad, e o Smad fosforilado se liga aos elementos de resposta (Macias-Silva et al. Cell 87:1215 (1996)), resultando na expressão do gene luciferase. A atividade da luciferase foi 20 então medida usando um kit comercial de ensaio repórter da luciferase (cat # E4550, Promega, Madison, WI) de acordo com o protocolo do fabricante. Foi usada uma linha estável de células C2C12 que foi transfectada com pMARE-luc (C2C12/pMARE) para medir a atividade de acordo com o seguinte procedimento. As células 25 repórter foram colocadas em placas em 96 poços de cultura. Foi feita a varredura usando diluições das fusões ActRIIB-IgGl Fc variantes e do tipo selvagem construídas como acima descrito com a concentração fixada em ativina 4 nM. A ativina A foi pré-encubada com os receptores em várias concentrações. A atividade da ativina foi medida determinando a atividade da luciferase nas culturas tratadas. Foram determinados os valores IC50 de cada polipeptideo.

Estes são mostrados na Tabela 2. 0 mesmo procedimento foi feito para as fusões ActRIIB-huIgG2 Fc produzidas como acima descrito para a determinação da miostatina. Foram usadas proteína A wt purificada e variantes na determinação dos valores IC50 da miostatina usando a mesma metodologia. Para esta determinação, os 10 polipeptideos foram pré-incubados com miostatina 4nM. Além disso, foi determinado o grau de agregação usando os procedimentos acima descritos. Esses valores são dados na Tabela 3 abaixo.

listadas na Tabela IA, ainda foram purificadas várias variantes 15 ActRIIB-IgGl Fc e três variantes ActRIIB5-IgGl Fc em conjunto com os polipeptideos do tipo selvagem e analisados por SPR (ressonância de plasmon de superfície) com ativina A 20 nM. A Tabela 2 mostra a afinidade de ligação SPR dos polipeptideos VActRIIB-IgGl Fc selecionados para a ativina. A ativina A (20 nM) 20 foi usada para capturar os polipeptideos vActRIIB nas amostras e os sinais medidos SPR foram normalizados. Foram obtidos os valores IC50 a partir dos ensaios de inibição de ativina baseados em células acima descritos. Os erros padrão foram inferiores a 10% em todos os resultados.

Tabela 2

Fora do conjunto das variantes ActRIIB5-IgGl Fc

RU normalizado

SPR (RU =

IC50 (nM) Ativina

Variante

unidade de

resposta) ActRIIB-IgGlFc (SEQ ID NO: 35 8,20 58) vActRIIB-IgGlFe, E28A (SEQ ID 20 25, 30 NO: 60) VActRIIB-IgGlFc, E28W (SEQ ID 128 2, 07 NO: 62) vActRIIB-IgGlFc, E28Y (SEQ ID 115 2,10 NO: 64) NO: 66) 18 ActRIIB5-IgGlFc (SEQ ID NO: 37 68) vActRIIB5-IgGlFc, E28A (SEQ Q ID NO: 70) vActRIIB5-IgGlFe, E28W (SEQ 45 16,86 ID NO: 72) Como mostrado acima na Tabela 2, o valor IC50 de VActRIIB-IgGlFc (E28W) para o bloqueio da ativina foi 2,07 nM e o valor IC50 da VActRIIB-IgGlFc (E28Y) foi 2,1 nM comparado ao tipo selvagem. Além disso, as variantes E28W e E28Y da VActRIIB-IgGlFc foram estáveis e não se agregaram quando purificadas.

Foi determinado também o valor IC50 em um ensaio de bloqueio da miostatina baseado em células para os outros polipeptideos variantes. Essas variantes eram os polipeptideos 10 vActRIIB truncados maduros que não possuíam a seqüência de sinalização e os primeiros seis aminoácidos do N-terminal. Essas seqüências são mostradas na Tabela 3. A Tabela 3 mostra a agregação porcentual da proteína após a purificação da proteína A, e o valor IC50 com relação à miostatina. Pode ser visto que a 15 agregação porcentual é muito menor para os polipeptideos variantes quando comparada com a do tipo selvagem. Resultados similares foram obtidos para os polipeptideos vActRIIB maduros truncados sem a seqüência de sinalização e os quatro aminoácidos N-terminais e com substituições idênticas como mostrado abaixo.

Tabela 3

Variant ActRIIB Ligan IgG2 Fc % agre¬ IC50 e te--- gação (nM) ActRIIB Hinge para -Fc ensaio de miosta -tina a na célula hActRII ETRE28CI YYNANWELERT GGGGS APPVAGPSVFLFP 13% 1,1 B- NQSGLERCEGEQDKRLHC VECPP PKPKDTLMISRTP IiIgG2Fc YASWRNS SGTIELVKKGC CP EVTCVVVDVSHED (SEQ ID WLDDFNCYDRQECVATEE (SEQ PEVQFNWYVDGVE NO: 89) NPQVYFCCCEGNFCNERF ID VHNAKTKPREEQF THLPEAGGPEVTYEPPPT NO: NSTFRVVSVLTVV APT (SEQ ID NO: 79) HQDWLNGKEYKCK 86) VSNKGLPAPEIKT ISKTKGQPREPQV YTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPMLDS DGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO: 80) hActRII ETRW28CI YYNANWELERT GGGSV APPVAGPSVFLFP 2% 0,9 B- NQSGLRCEGEQDKRLHCY ECPPC PKPKDTLMISRTP IiIgG2Fc ASWRNSSGTIELVKKGCW P EVTCVVVDVSHED (E28W) LDDFNCYDRQECVATEEN (SEQ PEVQFNWYVDGVE (SEQ ID PQVYFCCCEGNFCNERFT ID VHNAKTKPREEQF NO: 91) HLPEAGGPEVTYEPPPTA NO: NSTFRVVSVLTVV PT (SEQ ID NO: 87) 79) HQDWLNGKEYKCK VSNKGLPAPIEKT ISKTKGQPREPQV YTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPMLDS DGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO: 80) hActRII ETRY2aCI YYNANWELERT GGGGS APPVAGPSVFLFP 4% 1,0 B- NQSGLERCEGEQDKRLHC VECPP PKPKDTLMISRTP hIgG2Fc YASWRNSSGTIELVKKGC CP EVTCVVVDVSHED (Ε28Υ) (SEQ ID NO: 93)

WLDDFCYDRQECVATEEN PQVYFCCCEGNFCNERFT HLPEAGGPEVTYEPPPTA PT (SEQ ID NO: 88)

(SEQ PEVQFNWYVDGVE ID VHNAKTKPREEQF NO: NSTFRVVSVLTVV 79) HQDWLNGKEYKCK VSNKGLPAPIEKT ISKTKGQPREPQV YTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPMLDS DGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQK ID NO: 80) A Tabela 4 identifica as seqüências correspondentes à SEQ ID NO: 1-99 na listagem seqüencial.

Tabela 4

SEQ Descrição ID NO 1 ActRIIB5 domínio extracelular, polinucleotídeo 2 ActRIIB5 domínio extracelular, polipeptideo 3 vActRIIB5 E28A polinucleotídeo 4 vActRIIB5 E28A polipeptideo vActRIIB5 E28A e R40A polinucleotídeo 6 vActRIIB5 E28A e R40A polipeptideo 7 vActRIIB5 E28W polinucleotídeo 8 vActRIIB5 E28W polipeptideo 9 vActRIIB5 E28Y polinucleotídeo vActRIIB5 E28Y polipeptideo 11 vActRIIB5 E28X onde X é A, F, Q, V, I, L, Μ, K, H, W ou Y polinucleotídeo 12 vActRIIB5 E28X onde X é A, F, Q, V, I, L, Μ, K, H, W ou Y polipeptideo 13 vActRIIB5 E28X e R40X, onde X (28) é A, F, Q, V, I, L, Μ, K, H, W ou Y onde X (40) é A, G, Q, Μ, H, K ou N polinucleotídeo 14 vActRIIB5 E28X e R40X, onde X(28) é A, F, Q, V, I, L, Μ, K, H, W ou Y onde X (40) é A, G, Q, Μ, H, K ou N polipeptideo vActRIIB5 R40X onde X é G, Q, Μ, H, K ou N polinucleotídeo 16 vActRIIB5 R40X onde X é G, Q, Μ, H, K ou N polipeptideo 17 ActRIIB domínio extracelular, polinucleotídeo 18 ActRIIB domínio extracelular, polipeptideo 19 vActRIIB E28A polinucleotídeo vActRIIB E28A polipeptideo 21 vActRIIB E28A e R40A polinucleotídeo 22 vActRIIB E28A e R40A polipeptideo 23 vActRIIB E28W polinucleotídeo 24 vActRIIB E28W polipeptideo vActRIIB E28Y polinucleotídeo 26 vActRIIB E28Y polipeptideo 27 vActRIIB E28X onde X é A, F, Q1 Vr I, L, Μ, K, H, W ou Y polinucleotídeo 28 vActRIIB E28X onde X é A, F, Q, V, I, L, Μ, K, H, W ou Y polipeptideo 29 vActRIIB E28X e R40X, onde X(28) é A, F, Q, V, I, L, Μ, K, H, Y ou W onde X (40) é A, G, Q, Μ, H, K ou N polinucleotídeo vActRIIB E28X e R40X, λιλλΙο V/r>Q\ Á Ά Trn\7TT. MTfHY Τλ7 Viiu^ «k \ ί W vi r *■·*/ polipeptideo 31 vActRIIB R40X onde X é G, Q, Μ, H, K ou N polinucleotídeo 32 vActRIIB R40X onde X é Gr Qr Μ, H, K ou N polipeptideo 33 vActRIIB R64A, E28A polinucleotídeo 34 vActRIIB R64A, E28A polipeptideo vActRIIB R64A, E28A e R40A polinucleotídeo 36 vActRIIB R64A, E28A e R40A polipeptideo 37 vActRIIB R64A, E28W polinucleotídeo 38 vActRIIB R64A, E28W polipeptideo 39 vActRIIB R64A, E28Y polinucleotídeo 40 vActRIIB R64A, E28Y polipeptideo 41 vActRIIB R64A, E28X onde X é A, F, Q, V, I, L, Μ, K, H, Y ou W polinucleotídeo 42 vActRIIB R64A, E28X onde X é A, F, Q, V, I, L, Μ, K, H, Y ou W polipeptideo 43 vActRIIB R64A, E28X e R40X, onde X (28) é A, F, Q, V, I, L, Μ, K, H, W ou Y onde X (40) é A, G, Q, Μ, H, K ou N polinucleotídeo 44 vActRIIB R64A, E28X e R40X, onde X (28) é A, F, Q, V, I, L, Μ, K, H, W ou Y onde X (40) é A, G, Q, Μ, H, K ou N polipeptideo 45 vActRIIB R64A, R40X onde X é G, Q, Μ, H, K ou N polinucleotídeo 46 vActRIIB R64A, R40X onde X é G, Q, Μ, H, K ou N polipeptideo 47 Seqüência de Acessão NP 001097 (ActRIIB tipo selvagem) polipeptideo 48 Seqüência de Acessão NM 002192 (Ativina A) polipeptideo 49 Seqüência de Acessão AAB86694 (Miostatina) polipeptideo 50 Seqüência de Acessão 095390 (GDF-Il) polipeptideo 51 vActRIIB5 E28X e R40X, onde X = qualquer polinucleotídeo de aminoácido 52 vActRIIB5 E28X e R40X, onde X = qualquer polipeptideo de aminoácido 53 vActRIIB E28X e R40X, onde X = qualquer polinucleotídeo de aminoácido 54 vActRIIB E28X e R40X, onde X = qualquer polipeptideo de aminoácido 55 vActRIIB R64A, E28X e R40X, onde X = qualquer polinucleotídeo de aminoácido 56 vActRIIB R64A, E28X e R40X, onde X = qualquer polipeptideo de aminoácido 57 ActRIIB-IgGlFc polinucleotídeo maduro 58 ActRIIB-IgGlFc polipeptideo maduro 59 VActRIIB-IgGlFc E28A (E10A) polinucleotídeo maduro 60 vActRIIB-IgGlFc E28A (ElOA) polipeptideo maduro 61 VActRIIB-IgGlFc E28W (E10W) polinucleotídeo maduro 62 vActRIIB-IgGlFc E28W (E10W) polipeptideo maduro 63 vActRIIB-IgGlFc E28Y (E10Y) polinucleotídeo maduro 64 vActRIIB-IgGlFc E28Y (E10Y) polipeptideo maduro bb vActRIItS-igülfc maauro k^uij poupeptiaeo mauuru 67 vActRIIB5-IgGlFc polinucleotídeo maduro 68 vActRIIB5-IgGlFc polipeptideo maduro 69 vActRIIB5-IgGlFc E28A (E10A) polinucleotídeo maduro 70 vActRIIB5-IgGlFc E28A (E10A) polipeptideo maduro 71 vActRIIB5-IgGlFc E28W (E10W) polinucleotídeo maduro E10W 72 vActRIIB5-IgGlFc E28W (E10W) polipeptideo maduro ElOW 73 Seqüência de sinalização mostrada nas Figuras 1 e 2 74 Seqüência de sinalização alternativa 75 Ligante 76 Regiões de hinge completas para IgGl 77 Região de hinge completa para IgG2 78 Região de hinge completa para IgG4 79 Ligante hinge 80 IgG2 Fc polipeptideo 81 IgG2 Fc nucleotídeo degenerado 82 IgGl Fc polipeptideo 83 IgGl Fc polinucleotídeo 84 IgG4 Fe polipeptideo 85 IgG4 Fc polinucleotídeo---degenerado 86 ActRIIB polipeptideo wt truncado maduro 87 vActRIIB (E4W) (E28W) polipeptideo maduro truncado 88 vActRIIB (E4Y) (E28Y) polipeptideo maduro truncado 89 ActRIIB-IgG2Fc polipeptideo maduro truncado 90 ActRIIB-IgG2 Fc polinucleotídeo maduro truncado degenerado 91 vActRIIB-IgG2Fe (E4W) E28W polipeptideo maduro truncado 92 vActRIIB-IgG2Fc (E4W) E28W polinucleotídeo maduro truncado 93 vActRIIB-IgG2Fc (E4Y) E28Y polipeptideo maduro truncado 94 vActRIIB-IgG2Fc (E4Y) E28Y polinucleotídeo maduro truncado 95 vActRIIB-IgG2 Fc (E4A) E28A polipeptideo maduro truncado 96 vActRIIB-IgG2 Fc (E4A) E28A polinucleotídeo maduro truncado degenerado 97 vActRIIB---IgG2 Fc (E4X) E28X-onde X é A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W ou Y polipeptideo maduro truncado 98 Figura I-ActRIIB-IgGl Fc 99 Figura 2---ActRIIB5-IgGl Fc Exemplo 3 Tratamentos in vivo usando vActRIIB Todos os seguintes estudos com animais foram feitos usando o polipeptideo vActRIIB-IgG2 Fc maduro truncado (E28W) , (SEQ ID NO: 91) , de acordo com os procedimentos descritos abaixo.

Tratamento da atrofia muscular em Camundongos Deficientes de Inibina-a

A inibina-a é um inibidor de ocorrência natural da ativina A. Os camundongos que não possuem a inibina-a 10 demonstram níveis significativamente elevados de ativina A na circulação e sofrem de uma síndrome de atrofia letal que está associada à formação espontânea de tumores como tumores ovarianos, cânceres testiculares e cânceres adrenais (Matzuk et al., PNAS 91 (19) :8817-21 (1994), Cipriano et al. Endocrinology 121(7): 2319- 15 27(2000), Matzuk et al., Nature 360 (6402):313-9 (1992)). Para os seguintes experimentos foram adquiridos camundongos knockout para inibina-α (C57BL/6J) de Charles River Laboratories. Os efeitos do polipeptideo vActRIIB-IgG2 Fc E28W (SEQ ID NO: 91) (doravante denominado E28W ou polipeptideo E28W, ou receptor solúvel E28W) no 20 peso corporal e na massa muscular foram examinados nos camundongos knockout para inibina-α. Foi feito um estudo de 14 dias com injeção única em camundongos knockout para inibina-α machos com 8 semanas de idade. Com 8 semanas de idade, os camundongos knockout para inibina-α machos tinham perdido mais de 25% do peso corporal 25 quando comparados aos camundongos de controle de mesma ninhada, de tipo selvagem e mesma idade. 5 dos camundongos knockout receberam uma injeção subcutânea única de E28W (30 mg/kg), enquanto 5 camundongos knockout receberam subcutaneamente um volume igual de PBS (veículo) no dia 0. Como controle basal, 5 camundongos do tipo selvagem e mesma idade receberam uma injeção única subcutânea de veículo no dia 0. Os camundongos foram pesados no dia 0, dia 7 e dia 14. No final do dia 14, todos os camundongos foram 5 sacrificados e analisados seus pesos de carcaça magra e massa muscular da panturrilha em necropsia. No dia 14 do período de estudo, o peso corporal médio dos camundongos knockout tratados com veículo caiu em aproximadamente 1,1 g de 22,5 g no dia 0 para 21,4 g no dia 14. Em contrapartida, o peso corporal médio dos 10 camundongos knockout tratados com E28W demonstrou um importante ganho de 11 g a partir de 22,1 g no dia 0 para 33,1 g no dia 14. A análise terminal da necropsia revelou que o polipeptideo E28W virtualmente dobrou o peso de carcaça magra e a massa muscular da panturrilha nos camundongos knockout para inibina-α, como mostrado 15 abaixo. O peso médio de carcaça magra dos camundongos knockout tratados com E28W foi de aproximadamente 14,9 g comparado com aproximadamente 8,0 g dos camundongos knockout tratados com veículo, e de aproximadamente 12,1 g para os camundongos de controle do tipo selvagem tratados com veículo. O peso médio 20 muscular da panturrilha (de ambas as pernas) dos camundongos knockout tratados com E28W foi aproximadamente de 42 6 mg comparado com aproximadamente 209 mg dos camundongos knockout tratados com veículo, e de aproximadamente 324 mg camundongos de controle do tipo selvagem tratados com veículo. Esses resultados demonstram a 25 efetividade do polipeptideo E28W no tratamento dos estados doentes de perda de peso e de atrofia muscular estando sumarizados na Tabela abaixo.

WT mais KO mais KO mais E28W Veículo Veículo Peso Corporal 28,64 +/- 1,11 21,36 +/- 33,10 + /- 1,56 0, 99* *# Carcaça Magra (g) 12,07 +/- 0,36 8,00 +/- 0,29* 14,90 +/- 0,77 *# Músculo 0,324 +/- 0,209 +/- 0,426 +/Panturrilha (g) 0, 014 0,012* 0, 024** * · D<' Π DcI \τ<ζ Τλ7Τ 4- V*= ι γίι Ί r> ? ώ · P^O-OS \τ<ζ KO 4·

Veículo.

Os efeitos da administração do polipeptideo E28W nas taxas de formação de tumores testiculares e ovarianos foram analisados em camundongos KO inibina-α machos e fêmeas, respectivamente. Neste estudo, 11 dos camundongos knockout inibina-α, incluindo machos de 8 semanas (n=5) e fêmeas de 9 semanas (n=6), foram tratados com única injeção subcutânea de E28W (30 mg/kg), enquanto outros 11 camundongos knockout inibina-a, incluindo machos (n=5) e fêmeas (n=6) de mesmas idades receberam uma injeção de volume igual de PBS (veículo) . Além disso, 11 dos camundongos de controle de mesma ninhada do tipo selvagem incluindo machos (n=5) e fêmeas (n=6) de idades iguais receberam injeção única do veículo. Duas semanas após o tratamento, os camundongos foram sacrificados e submetidos à necropsia para examinar as taxas de formação de tumores testiculares e ovarianos visualmente identificáveis. Observou-se que 10 dos 11 camundongos knockout tratados com veículo desenvolveram tumores identificáveis. Especificamente, foram encontradas formações de tumores testiculares e ovarianos em 5 dos 5 machos e em 5 das 6 fêmeas examinadas, respectivamente. As dimensões desses tumores foram determinadas como entre 2-3 vezes maiores que os correspondentes testículos ou ovários normais em camundongos de controle do tipo selvagem. Isto é mostrado na Figura 3. Somente 10% (1 entre 11) dos camundongos knockout para inibina-α tratados com E28W demonstraram visíveis formações de tumores.

Especificamente, nas fêmeas, 1 entre 6 dos camundongos knockout para inibina-α tratados com E28W desenvolveu um tumor ovariano identificável, considerando que 5 entre 6 dos knockouts fêmeas não tratados tiveram pequena ou nenhuma alteração na dimensão ou na morfologia geral do ovário, comparados com os controles de mesmas 10 idades do tipo selvagem. 5 entre 5 dos camundongos knockout machos tratados com E28W não mostraram tumores visíveis, com pouca ou nenhuma alteração no tamanho ou na morfologia geral dos testículos em comparação com os controles de mesmas idades do tipo selvagem. Esses resultados demonstram que a administração do E28W foi 15 efetiva para a redução da formação de tumores testiculares e ovarianos nos camundongos KO para inibina-α, sugerindo uma utilidade clínica para a terapia de receptor solúvel no tratamento do câncer.

A efetividade do polipeptideo E28W no tratamento 20 da anorexia foi examinada em camundongos knockout para inibina-a machos. Neste estudo, o consumo de alimentos dos camundongos knockout para inibina-α (n=5) foi significativamente reduzido comparado ao dos camundongos de mesma idade e do tipo selvagem (n=10). Observou-se que a ingestão alimentar dos camundongos 25 knockout para inibina-α E28W tratados foi significativamente aumentada durante o período de exame de 3 semanas. A ingestão alimentar média semanal dos camundongos knockout tratados com E28W aumentou até um nível um pouco maior que o dos camundongos de controle de mesma idade do tipo selvagem, e foi cerca de 50% maior que a ingestão alimentar média semanal dos camundongos knockout tratados com veículo. Assim, os dados mostram que o tratamento com E28W foi altamente efetivo para a melhora da anorexia nos camundongos KO para inibina-a.

0 efeito do tratamento E28W na sobrevida foi examinado em camundongos KO para inibina-α machos e fêmeas, respectivamente. .Para os machos, 25 KO camundongos para inibina-a com cerca de 50 dias de idade receberam o polipeptideo E28W (10 10 mg/kg/semana, subcutâneo), enquanto 26 camundongos KO para inibina-α de mesma idade receberam veículo (PBS). 19 camundongos de mesma idade do tipo selvagem machos receberam veículo e foram usados como controle basal. Os camundongos knockout tratados com veículo começaram a morrer no dia 15 do estudo (com cerca de 65 15 dias de idade) . No dia 34 do experimento (com cerca de 84 dias de idade), 50 % dos camundongos knockout tratados com veículo tinham morrido, e no dia 78 (com cerca de 128 dias de idade) , 100% deles tinham morrido.

Por sua vez, nenhum dos 25 camundongos knockout 20 tratados com o polipeptideo E28W, ou dos 19 camundongos de controle do tipo selvagem tratados com veículo, morreu antes do dia 78 do estudo (com cerca de 128 dias de idade) . Entre os camundongos knockout tratados com E28W, 1 entre 25 morreu no dia 78 do estudo (com cerca de 128 dias de idade) e 24 entre 25 25 sobreviveram além do dia 100 (com cerca de 150 dias de idade) . Nenhum dos camundongos do tipo selvagem tratados com veículo morreu durante o período de estudo de 100 dias. Foram obtidos os resultados similares de sobrevida em camundongos KO fêmeas para inibina-α. 22 dos camundongos KO fêmeas para inibina-α com aproximadamente 50 dias de idade foram tratados com E28W (10 mg/kg/semana, subcutâneo), enquanto 23 camundongos KO fêmeas para inibina-α de mesma idade foram tratados com PBS (veículo). No 5 intermédio, 17 dos camundongos de controle fêmeas do tipo selvagem foram tratados com veículo. Os camundongos knockout fêmeas tratados com veículo começaram a morrer no dia 40 do estudo (com cerca de 90 dias de idade). No dia 58 do experimento (com cerca de 108 dias de idade), 50% dos camundongos knockout fêmeas tratados 10 com veículo haviam morrido, e no dia 86 do estudo (com cerca de 136 dias de idade) 100% deles havia morrido. Em contraste, somente cerca de 5% (1 entre 22) dos camundongos knockout fêmeas tratados com E28W havia morrido, enquanto cerca de 90% (20 entre 22) sobreviveram além do dia 120 do estudo (com cerca de 170 dias de 15 idade). Nenhum dos camundongos do tipo selvagem tratados com veículo havia morrido no período de estudo de 120 dias. Portanto, os dados demonstram que a terapia com o polipeptideo E28W é efetiva para o real prolongamento na sobrevida dos camundongos machos e fêmeas knockout para inibina-α. É fornecida na Figura 4 20 uma plotagem esquemática das curvas de sobrevida dos camundongos knockout machos e fêmeas.

Tratamento da atrofia muscular nos camundongos portadores de tumor de cólon-2 6

Os camundongos portadores de tumor de cólon-2 6 são um modelo animal pré-clínico amplamente usado para o estudo da caquexia no câncer (Fujita et al., Int J Cancer 68 (5):637-43 (1996), Kwak et al., Cancer Research 64 (22) :8193-8 (2004)). O efeito do polipeptideo E28W na alteração do peso corporal, na massa muscular e na taxa de sobrevida foi estudado nos camundongos portadores de tumor. As células do tumor de cólon-26 (C-26) foram implantadas de maneira subcutânea em 40 camundongos CDFl machos com 10 semanas de idade, com 0,5 x IO6 células por camundongo.

Este implante de tumor foi feito no dia 0. Iniciando no dia 5 após a implantação do tumor, vinte camundongos C-2 6 foram tratados semanalmente com inieção subcutânea de 10 mq/kg de vActRIIB IgG2 Fc E28W (SEQ ID NO: 91) , enquanto vinte camundongos C-26 foram tratados com um veículo (PBS). Ao mesmo tempo, 10 camundongos 10 normais de idades e pesos combinados foram tratados somente com um veículo (PBS). O peso corporal e a ingestão alimentar foram determinados 3 vezes por semana. Os camundongos portadores de tumor foram inspecionados duas vezes ao dia com relação à sobrevida. Foram medidos os tamanhos dos tumores usando calibres 15 (Ultra-Cal IV IP65 electronic caliper, Fred V Fowler Co. Boston MA) ligados a um computador PC, sendo os valores automaticamente registrados em uma planilha em um arquivo de dados Microsoft Excel. Como mostrado na Figura 5, duas semanas após o implante do tumor, os camundongos com tumores C-26 desenvolveram caquexia 20 severa e perderam dramaticamente o peso corporal. 0 tratamento E28W mitigou de maneira efetiva a perda de peso corporal nos camundongos portadores de tumor. 0 peso corporal médio dos camundongos portadores de tumor tratados com E28W foi significativamente maior que o dos camundongos portadores de tumor 25 tratados com veículo (p<0,001, do dia 7 ao dia 33 após a inoculação do tumor. Teste T não pareado, Graph pad Software Inc. San Diego CA).

Não houve diferenças no tamanho do tumor entre os grupos tratados com polipeptideo E28W e com veículo, indicando que

o tratamento não teve efeito no crescimento do tumor C-2 6. A análise necroscópica terminal mostrou que a massa da carcaça magra média e o peso muscular da panturrilha dos camundongos portadores 5 de tumor C-26 tratados com E28W foram significativamente maiores que as dos camundongos portadores de tumor tratados com veículo (d<0.001 tanto Dara a carcaca maara como músculo da panturrilha).

0 efeito do E28W na sobrevida dos camundongos portadores de tumor C-2 6 é mostrado na Figura 6. Os camundongos tratados com veículo começaram a morrer cerca do dia 14 pós a implantação do tumor. No dia 35 pós implantação do tumor, todos os 20 camundongos portadores de tumor C-26 tratados com veículo morreram; entretanto, 17 entre 20 camundongos portadores de tumor C-26 tratados com E28W ainda sobreviviam. Assim, o tratamento E28W levou a um prolongamento significativo da sobrevida dos camundongos portadores de tumor C-26 (p<0,0001, teste quiquadrado). Portanto, o polipeptideo E28W não foi somente efetivo na manutenção do peso corporal e da massa muscular, mas também no prolongamento da sobrevida dos camundongos portadores de tumor C26.

Tratamento dos Camundongos com Suspensão do

Membro Traseiro

Foi usado o modelo de camundongo com suspensão do membro traseiro para examinar o efeito do vActRIIB-IgG2 Fc E28W 25 (SEQ ID NO: 91) na massa muscular no estado de desuso. 0 procedimento de suspensão do membro traseiro é essencialmente o mesmo mencionado por Carlson CJ el al (Carlson CJ, Booth FW and Gordon SE: Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 277: R601- RR606, 1999). Foram usados camundongos fêmeas C57BL/6 de nove semanas de idade no estudo. Um total de 60 camundongos foi dividido nos três grupos seguintes: I. Grupo de controle de baseline não suspenso (20 camundongos) tratados com veículo (PBS), 2. Grupo com suspensão dos membros traseiros (20 camundongos) tratados com veículo, e 3. Grupo de camundongos com suspensão dos membros traseiros (20 camundongos) tratados com vActRIIB-IgG2 Fe, E28W. Especificamente, .fo.i administrada. . . uma., única inje.ção subcutânea tanto de 30 mg/kg de vActRIIB-IgG 2 Fc E28W ou veículo respectivamente aos grupos supramencionados, na ocasião do início da suspensão dos membros traseiros. Foram medidas as alterações do peso corporal longitudinalmente 2-3 vezes por semana. 5 camundongos de cada grupo foram sacrificados nas seguintes 4 ocasiões: dia 1, dia 3, dia 7 e dia 14. Foram determinados os pesos do músculo da panturrilha via necropsia.

Como mostrado na Tabela abaixo, a suspensão dos membros traseiros levou a uma perda significativa no peso corporal de até 10%. O tratamento dos camundongos suspensos pelos membros traseiros com vActRIIB-IgG2 Fc E28W levou a um significativo ganho 20 de peso corporal até um nível maior que o dos grupo de suspensão dos membros traseiros tratado com veículo como do grupo de controle de baseline não suspenso, analisados por medições ANOVA. Durante o período de estudo de duas semanas, o ganho de peso corporal médio do grupo de tratamento vActRIIB-IgG2 Fc E28W (SEQ 25 ID NO: 91) foi de 12,6% em comparação com uma queda de 0,2% no grupo de suspensão tratado com veículo e de 4,8% de ganho de peso no grupo de controle de baseline não suspenso, respectivamente. Os resultados da necropsia temporal mostraram que a massa muscular do membro traseiro mudou em paralelo com os pesos corporais. 0 tratamento dos camundongos suspensos com vActRIIB-IgG2 Fc (E28W) mitigou completamente a perda muscular. Portanto, os resultados deste experimento mostram que o E28W é efetivo no tratamento da atrofia muscular associada ao desuso.

Grupo/dias (alteração dia 3 (%) dia 7 (%) dia 14 (%) de peso corporal %) TVT Í* Λ _ U O -L D-DO 9 /I S- 9 Q& δ «a no i- vtij.L;u-Lu --- ±\J f \J '0 U f \J O \J f C. O HS + E28W, 30 mg/ml -9,7% 2,1% 12, 6% Tratamento dos Camundongos OVX

Camundongos fêmeas ovariectomizados C57B16 (OVX)

são considerados como um modelo para o hipergonadismo e a osteoporose femininos. Foram ovariectomizados 24 camundongos C57B16 fêmeas com a idade de 3 meses e deixados recuperando por 3 meses. Com a idade de 6 meses, 24 camundongos OVX, assim como 24 camundongos C57B16 de controle de mesmas idades com operação fictícia foram medidos com relação a alterações longitudinais no peso corporal, na massa muscular e de gordura por NMR e massa óssea (PIXImus-GE LUNAR Corporation) em um período de tratamento de 3 meses. No final do período, os animais foram sacrificados, e colhidos os tecidos musculares na necropsia terminal e submetidos a uma análise de raios-X Faxitron e microCT (Faxitron X-ray Corporation and GE Medicai system). Ficou demonstrado que o receptor E28W variante (SEQ ID NO: 91) foi efetivo para o aumento do peso corporal, especificamente da massa muscular esquelética magra e da massa óssea, reduzindo o teor de gorduras dos camundongos até o nível visto nos camundongos não ovariectomizados. Especificamente, em um período de 12 semanas, a massa muscular magra aumentou de 20 g para 27,0 g nos camundongos OVX tratados com E28W, comparados aos 20 g a 27,5 g dos camundongos com operação fictícia tratados com E28W, comparados com quase nenhum aumento na massa muscular magra dos OVX mais veículo ou fictício mais veículo (cerca de 19 gramas para os OVX 5 mais veículo e cerca de 20 g para o tipo selvagem mais veículo) . No mesmo estudo, os camundongos OVX tratados com E28W mostraram reduzida massa de crordura de 8 g em média por animal a cerca de 4 g na média por animal, comparada com a dos animais com operação fictícia, no final das 12 semanas de estudo. Os camundongos OVX 10 tratados com veículo, por sua vez, não perderam massa de gordura em qualquer momento durante o estudo. Finalmente, foi aumentada a massa óssea nos camundongos OVX tratados com E28W comparados com os camundongos OVX tratados com veículo. A análise do BMC (teor mineral ósseo) do fêmur/tíbia do osso dissecado colhido durante a 15 necropsia terminal foi determinada por análise pQCT (Tomografia Computadorizada Quantitativa Periférica). Os camundongos OVX tratados com E28W aumentaram o BMC em cerca de 0,045 g/cm para cerca de 0, 055 g/cm no final das 12 semanas de estudo, que é comparável ao BMC final dos animais tratados com veículo e com 20 operação fictícia. Os camundongos OVX tratados com veículo mostraram cerca do mesmo BMC de 0,045 g/cm no final das 12 semanas de estudo. Os camundongos do tipo selvagem tratados com E28W mostraram um aumento de BMC de cerca de 0, 054 g/cm para cerca de 0, 065 g/cm no final das 12 semanas de estudo. Esses estudos 25 demonstram a efetividade do polipeptideo E28W como potencial tratamento da fragilidade, osteoporose e da obesidade na velhice.

A presente invenção não deve ter seu escopo limitado pelas configurações específicas descritas na presente, que devem ser simples ilustrações dos aspectos individuais da invenção, estando os métodos e componentes funcionalmente equivalentes dentro do escopo da invenção. Na verdade, várias modificações da invenção, além das mostradas e descritas na 5 presente se tornarão aparentes para os técnicos no assunto a partir da descrição acima e dos desenhos de acompanhamento. Essas modificações pretendem estar dentro do escopo das reivindicações anexas. . _. Amgen - Al219wonon-EP (2).txt SEQUENCE LISTING

<110> SUN, DEONGHOON

TAM, LEI-TING TONV HAN1 HQ

KWAK1 KEITH SOO-NYUNG ZHOU, XIAOLAN

<120> VARIANT ACTIVIN RECEPTOR POLYPEPTIDES AND USES THEREOF

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<213> Homo sapiens <220>

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Página 37 Amgen - Al219wonon-EP (2).txt

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Página 38 Amgen - Al219wonon-EP (2).txt

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<400> 50

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Página 40 Amgen - Al219wonon-EP (2).txt

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Página 41 Amgen - Al219wonon-EP (2).txt <222> (118)..(120)

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<210> 56

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<213> Homo sapiens

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912

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Página 57 Amgen - Al219wonon-EP (2).txt Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 290 295 300

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<400> 65

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Página 58

48

96

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912

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Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 245 250 255

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<213> Homo sapiens

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Página 65 Amgen - Al219wonon-EP (2).txt

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145 150 155 160

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Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

165 170 175

acc ctc atg ate tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

180 185 190

gtg age cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac gqc

vai Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

iqç ·>πη ?ης

gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac

Val Glu VaT His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

210 215 220

age acg tac cgt gtg gtc age gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg

Ser Thr Tyr Arg VaT Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

225 230 235 240

ctg aat gqc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca

Leu Asn GTy Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

245 250 255

gcc ccc ate gag aaa acc ate tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys GTy Gln Pro Arg Glu

260 265 270

cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac

Pro Gln VaT Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

275 280 285

cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa gqc ttc tat ccc age gac ate

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu vai Lys GTy Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

290 295 300

gcc gtg gag tgg gag age aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc

Ala VaT Glu Trp Glu Ser Asn GTy Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

305 310 315 320

acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac gqc tcc ttc ttc ctc tac age aag

Thr Pro Pro VaT Leu Asp Ser Asp GTy Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

325 330 335

ctc acc gtg gac aag age agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc

Leu Thr VaT Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln GTy Asn Val Phe Ser Cys

340 345 350

tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag age ctc

Ser VaT Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

355 360 365

tcc ctg tct ccg ggt aaa tga Ser Leu Ser Pro GTy Lys 370

<210> 72

<211> 374

<212> PRT

<213> Homo sapiens

480

528

576

624

672

720

768

816

864

912

960

1008

1056

1104

1125

Pági na 68 Amgen - Al219wonon-EP (2).txt <400> 72

Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Trp Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala 10 15

Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu 20 25 30

Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser

35 40 45

Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe 50 55 60

65 70 75 80

Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr 85 90 95

His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Gly Pro Trp Ala Ser Thr Thr 100 105 110

Ile Pro Ser Gly Gly Pro Glu Ala Thr Ala Ala Ala Gly Asp Gln Gly 115 120 125

Ser Gly Ala Leu Trp Leu Cys Leu Glu Gly Pro Ala His Glu Gly Gly 130 135 140

Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 145 150 155 160

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 165 170 175

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 180 185 190

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 195 200 205

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 210 215 220

Ser Thr Tyr Arg Val vai Ser Val Leu Thr vai Leu His Gln Asp Trp 225 230 235 240

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 245 250 255

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 260 265 270

Pági na 69 Amgen - Al219wonon-EP C2).txt Pro Gln vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 275 280 285

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 290 295 300

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

305 310 315 320

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

325 330 335

340 " 345 350

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 355 360 365

Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370

<210> 73

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 73

Met Thr Ala Pro Trp Val Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Trp 10 15

Pro Gly

<210> 74

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 74

Met Thr Ala Pro Trp Val Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys 10 15

Ala Gly

<210> 75

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 75

Gly Gly Gly Gly ser 1 5

<210> 76

Página 70 Amgen - Al219WOnon-EP (2).txt <211> 15 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 76

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 10 15

<210> 77 <211> 12 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 77

Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro i ς m

<210> 78 <211> 12 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 78

Glu ser Lys Thr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro 10

<210> 79 <211> 12 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 79

Gly Gly Gly Gly Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro 10

<210> 80 <211> 216 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 80

Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 10 15

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 20 25 30

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val 35 40 45

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 50 55 60

Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln 65 70 75 80

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys vai Ser Asn Lys Gly 85 90 95

Página 71 Amgen - Al219wonon-EP (2).txt Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro 100 105 110

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 115 120 125

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 130 135 140

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 145 150 155 160

165

170

175

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 180 185 190

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 195 200 205

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215

<210> 81

<2ll> 648

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS <222> (1)..(648)

<220>

<221> modified_base <222> (3).. (3)

<223> a, c, t, g, unknown or other <220>

<221> modifiecLbase <222> (6)..(6)

<223> a, c, t, g, unknown or other <220>

<221> modified_base <222> (9)..(9)

<223> a, c, t, g, unknown or other <220>

<221> modified_base <222> (12)..(12)

<223> a, c, t, g, unknown or other <220>

<221> modified_base <222> (15)..(15)

<223> a, c, t, g, unknown or other

Página 72 Amgen - Al219WOnon-EP (2).txt <220>

<221> modified_base <222> (18)..(18)

<223> a, c, t, g, unknown or other <220>

<221> modified_base <222> (21)..(24)

<223> a, c, t, g, unknown or other <220>

<221> modified_base <222> (27)..(27)

<223> a, c, t, g, unknown or other <220>

<223> a, c, t, g, unknown or other <220>

<221> modified_base <222> (39)..(39)

<223> a, c, t, g, unknown or other <220>

<221> modified_base <222> (42)..(42)

<223> a, c, t, g, unknown or other <220>

<221> modified_base <222> (48)..(48)

<223> a, c, t, g, unknown or other <220>

<221> modified_base <222> (57)..(57)

<223> a, c, t, g, unknown or other <220>

<221> modified_base <222> (60)..(60)

<223> a, c, t, g, unknown or other <220>

<221> modified_base <222> (67)..(72)

<223> a, c, t, g, unknown or other <220>

<221> modified_base <222> (75)..(75)

<223> a, c, t, g, unknown or other <220>

<221> modified_base <222> (78)..(78)

<223> a, c, t, g, unknown or other <220>

<221> modified_base <222> (84)..(84)

<223> a, c, t, g, unknown or other <220>

<221> modified_base <222> (87)..(87)

Página 73 Amgen - Al219wonon-EP (2).txt <223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modifiecLbase <222> (93)..(93)

<223> a, c, t, g, unknown or other <220>

<221> modified_base <222> (96)..(96)

<223> a, c, t, g, unknown or other <220>

<221> modified_base <222> (99)..(99)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<221> modified_base <222> (105)..(108)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (120)..(120)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (126)..(126)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (144)..(144)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (150)..(150)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (153)..(153)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (159)..(159)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (168)..(168)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (174)..(174)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (180)..(183)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

Página 74 Amgen - Al219WOnon-EP (2).txt <221> modified_base <222> (199)..(201)

<22B> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (204)..(204)

<22B> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (208)..(210)

<22B> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base

<220>

<221> modified_base <222> (216)..(219)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (222)..(222)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (225)..(225)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (228)..(228)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (231)..(231)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (234)..(234)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (249)..(249)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (255)..(255)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (276)..(279)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (288)..(288)

<223> a, c, t, g, unknown or other

página 75 Amgen - Al219WOnon-EP (2).txt <220>

<221> modified_base <222> (291)..(291)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (294)..(294)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (297)..(297)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<222> (300)..(300)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (312)..(312)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (316)..(318)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (324)..(324)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (330)..(330)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (336)..(339)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (345)..(345)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (351)..(351)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (357)..(357)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (360)..(360)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base

Página 76 Amgen - Al219wonon-EP (2).txt <222> (363)..(363)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (366)..(372)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (384)..(384)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (396)..(399)

<220>

<221> modified_base <222> (402)..(402)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (405)..(405)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (411)..(411)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (414)..(414)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (420)..(420)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (429)..(432)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (441)..(441)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (444)..(444)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (454)..(456)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (462)..(462)

<223> a, c, t, g, unknown or other

Pági na 77 Amgen - Al219WOnon-EP (2).txt <220>

<221> modified_base <222> (468)..(468)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (486)..(486)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (489)..(489)

<22B> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<223> à, c, t^ g, unknown or other <220>

<221> modified_base <222> (495)..(495)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (501)..(501)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (505)..(507)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (513)..(516)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (525)..(525)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (529)..(531)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (537)..(537)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (540)..(540)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (543)..(543)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (550)..(555)

Página 78 Amgen - Al219W0non-EP (2).txt <223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (567)..(567)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (573)..(573)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (577)..(579)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<221> modified_base <222> (583)..(585)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (588)..(588)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (600)..(600)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (603)..(603)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (618)..(618)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (625)..(627)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (630)..(633)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (636)..(639)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (642)..(642)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (645)..(645)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<400> 81

Página 79 - Al219WOnon-EP gtn tty ytn tty Val Phe Leu Phe 10

gcn ccn Ala Pro 1

aar gay Lys Asp

gtn gay Val Asp

gay ggn Asp Gly 50

65

gay tgg Asp Trp

ytn ccn Leu Pro

nnn gar Arg Glu

aar aay Lys Asn 130

gay ath Asp Ile 145

aar acn Lys Thr

nnn aar Ser Lys

nnn tgy Ser Cys

nnn ytn Ser Leu 210

ccn gtn Pro Val

acn ytn Thr Leu 20

gtn nnn Val ser 35

gtn gar Val Glu

ytn aay Leu Asn

gcn ccn Ala Pro 100

ccn car Pro Gln 115

car gtn Gln vai

gcn gtn Ala Val

acn ccn Thr Pro

ytn acn Leu Thr 180

nnn gtn Ser Val 195

nnn ytn Ser Leu

gcn ggn Ala Gly 5

atg ath Met Ile

cay gar His Glu

gtn cay Val His

t-1-ν nnn

70

ggn aar Gly Lys 85

ath gar Ile Glu

gtn tay Val Tyr

nnn ytn Ser Leu

gar tgg Glu Trp 150

ccn atg Pro Met 165

gtn gay val Asp

atg cay Met His

nnn ccn ser Pro

Amgen ccn nnn Pro Ser

nnn nnn Ser Arg

gay ccn Asp Pro 40

aay gcn Asn Ala 55

m-n ntn

gar tay Glu Tyr

aar acn Lys Thr

acn ytn Thr Leu 120

acn tgy Thr Cys 135

gar nnn Glu Ser

ytn gay Leu Asp

aar nnn Lys ser

gar gcn Glu Ala 200

ggn aar Gly Lys 215

acn ccn Thr Pro 25

gar gtn Glu Val

aar acn Lys Thr

nnn αΐη

aar tgy Lys Cys 90

ath nnn Ile ser 105

ccn ccn Pro Pro

ytn gtn Leu val

aay ggn Asn Gly

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<210> 82

<211> 217

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 82

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 10 15

48

96

144

192

240

288

336

384

432

480

528

576

624

648

Pro Lys Asp Ile Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

Página 80 Amgen - Al219wonon-EP (2).txt 25 30

Val Val Asp val Ser His Glu Asp Pro Glu val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45

Val Gly Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg val val Ser val Leu Thr val Leu His 65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys ac on ςς

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Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 115 120 125

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Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn val 180 185 190

Phe Ser cys Ser val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215

<210> 83 <211> 651 <212> DNA

<213> Homo sapiens <400> 83 cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacatcctc 60 atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 120 gaggtcaagt tcaactggta cgtgggcggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 180 cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 240 gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 300 atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 360 Página 81 Amgen - Al219wonon -EP (2).txt cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 420 ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 480 aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 540 gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 600 ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaatg a 651 <210> 84

<211> 217

<212> PRT

<213> Homo sapiens

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Página 82 Amgen - Al219wonon-EP (2).txt Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215

<210> 85 <211> 651 <212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS <222> (1)..(651)

<222> (3)..(3)

<223> a, c, t, g, unknown or other <220>

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Página 83 Amgen - Al219wonon-EP (2).txt <222> (51)..(51)

<223> a, c, t, g, unknown or other <220>

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<220>

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Página 84 Amgen - Al219WOnon-EP (2).txt <220>

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<22B> a, c, t, g, unknown or other

<220>

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<220>

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<220>

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Página 85 Amgen - Al219wonon-Ep (2).txt <223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<223> a, c, t, g, unknown or other

Página 87 Amgen - Al219WOnon-EP (2).txt <220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<223> a, c, t, g, unknown or other

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<220>

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<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

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<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

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<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

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Página 88 Amgen - Al219WOnon-EP (2).txt <222> (516)..(519)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

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<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

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<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

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<220>

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<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

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<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

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<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

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<220>

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<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

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<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

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<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

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<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

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<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (606)..(606)

<223> a, c, t, g, unknown or other

Página 89 Amgen - Al219W0non-EP (2).txt <220>

<221> modified_base <222> (621)..(621)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

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<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base

<222> (633)..(636)

<223> a, c, t, g, unknown or other <220>

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<223> a, c, t, g, unknown or other <220>

<221> modified_base <222> (645)..(645)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (648)..(648)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<400> 85

gcn ccn gar tty ytn ggn ggn ccn nnn gtn tty ytn tty ccn ccn aar

Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 10 15

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gtn gtn gay gtn nnn car gar gay ccn gar gtn car tty aay tgg tay Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu val Gln Phe Asn Trp Tyr 40 45

gtn gay ggn gtn gar gtn cay aay gcn aar acn aar ccn nnn gar gar Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60

car tty aay nnn acn tay nnn gtn gtn nnn gtn ytn acn gtn ytn cay Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg val val Ser val Leu Thr val Leu His 65 70 75 80

car gay tgg ytn aay ggn aar gar tay aar tgy aar gtn nnn aay aar Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys val Ser Asn Lys 85 90 95

ggn ytn ccn nnn nnn ath gar aar acn ath nnn aar gcn aar ggn car Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110

ccn nnn gar ccn car gtn tay acn ytn ccn ccn nnn car gar gar atg Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met 115 120 125

acn aar aay car gtn nnn ytn acn tgy ytn gtn aar ggn tty tay ccn Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140

nnn gay ath gcn gtn gar tgg gar nnn aay ggn car ccn gar aay aay

Página 90

48

96

144

192

240

288

336

384

432

480 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn tay aar acn acn ccn ccn gtn ytn gay nnn gay ggn nnn tty tty ytn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 tay nnn nnn ytn acn gtn gay aar nnn nnn tgg car gar ggn aay gtn Tyr Ser Arg Leu Thr val ASp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val 180 185 190 tty nnn tgy nnn gtn atg cay gar gcn ytn cay aay cay tay acn car Phe ser Cys Ser val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205

aar nnn ytn nnn ytn nnn ytn ggn aar Lvs Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

<210> 86 <211> 110 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 86

Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg 10 15

Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg

25 30

Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu

35 40 45

Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln

50 55 60

Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys

65 70 75 80

Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly 85 90 95

Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr Ala Pro Thr 100 105 110

<210> 87

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 87

Glu Thr Arg Trp Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg 10 15

Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg 20 25 30

528

576

624

651

Página 91 Amgen - Al219wonon-EP (2).txt Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu 40 45

Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln 50 55 60

Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln val Tyr Phe Cys Cys Cys 65 70 75 80

Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly 85 90 95

vl a Drn Thr

<210> 88 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 88

Glu Thr Arg Tyr Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg 10 15

Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg 20 25 30

Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu 35 40 45

val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln 50 55 60

Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys 65 70 75 80

Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly 85 90 95

Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr Ala Pro Thr 100 105 110

<210> 89

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<223> a, c, t, g, unknown or other

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<221> modified_base <222> (156)..(156)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (165)..(165)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (187)..(189)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (201)..(201)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (204)..(204)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (207)..(207)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (219)..(219)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (225)..(225)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (246)..(246)

<223> a, c, t, g, unknown or other

Página 104 Amgen - Al219WOnon-EP (2).txt <220>

<221> modified_base <222> (262)..(264)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

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<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (276)..(276)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<223> a, c, t, g, unknown or other <220>

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<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

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<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

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<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (294)..(294)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (300)..(300)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

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<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

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<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

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<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

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<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (321)..(321)

Página 105 Amgen - Al219WOnon-EP (2).txt <223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (324)..(324)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

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<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

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<223> a, c, t, g, unknown or other

<221> modified_base <222> (333)..(333)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

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<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

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<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

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<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

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<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

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<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (360)..(360)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (366)..(366)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (369)..(369)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (372)..(372)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

Página 106 Amgen - Al219WOnon-EP (2).txt <221> modified_base <222> (375)..(375)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (378)..(378)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (381)..(381)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base

α,η,ίΛ

<220>

<221> modified_base <222> (387)..(390)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (393)..(393)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (399)..(399)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (405)..(405)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (408)..(408)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (414)..(414)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (423)..(423)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (426)..(426)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (433)..(438)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (441)..(441)

<223> a, c, t, g, unknown or other

Página 107 <220> <221> modified_base <222> (444)..(444)

<22Β> a, c, t, g, unknown

<220>

<221> modified_base <222> (450)..(450)

<22Β> a, c, t, g, unknown

<220>

<221> modified_base <222> (453)..(453)

<223> a, c, t, g, unknown

<222> (459)..(459)

<223> a, c, t, g, unknown

<220>

<221> modified_base <222> (462)..(462)

<223> a, c, t, g, unknown

<220>

<221> modified_base <222> (465)..(465)

<223> a, c, t, g, unknown

<220>

<221> modified_base <222> (471)..(474)

<223> a, c, t, g, unknown

<220>

<221> modified_base <222> (486)..(486)

<223> a, c, t, g, unknown

<220>

<221> modified_base <222> (492)..(492)

<223> a, c, t, g, unknown

<220>

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<223> a, c, t, g, unknown

<220>

<221> modified_base <222> (516)..(516)

<223> a, c, t, g, unknown

<220>

<221> modified_base <222> (519)..(519)

<223> a, c, t, g, unknown

<220>

<221> modified_base <222> (525)..(525)

<223> a, c, t, g, unknown

<220>

<221> modified_base

Amgen - Al219wonon-EP (2).txt

or other

or other

or other

or other

or other

or other

or other

or other

or other

or other

or other

or other

or other

Pági na 108 Amgen - Al219WOnon-EP (2).txt <222> (534)..(534)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (540)..(540)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (546)..(549)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (565)..(567)

<220>

<221> modified_base <222> (570)..(570)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (574)..(576)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (579)..(579)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (582)..(585)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (588)..(588)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (591)..(591)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (594)..(594)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (597)..(597)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (600)..(600)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (615)..(615)

<223> a, c, t, g, unknown or other

página 109 Amgen - Al219WOnon-EP (2).txt <220>

<221> modified_base <222> (621)..(621)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (642)..(645)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (654)..(654)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<223> a, c, t, g, unknown or other <220>

<221> modified_base <222> (660)..(660)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (663)..(663)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (666)..(666)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (678)..(678)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (682)..(684)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (690)..(690)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (696)..(696)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (702)..(705)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (711)..(711)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (717)..(717)

Página 110 Amgen - Al219wonon-EP (2).txt <223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (723)..(723)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (726)..(726)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (729)..(729)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<221> modified_base <222> (732)..(738)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (750)..(750)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (762)..(765)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (768)..(768)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (771)..(771)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (777)..(777)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (780)..(780)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (786)..(786)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (795)..(798)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (807)..(807)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

Página 111 Amgen - Al219wonon-EP (2).txt <221> modified_base

<222> (810)..(810)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (820)..(822)

<22B> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (828)..(828)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base

<220>

<221> modified_base <222> (852)..(852)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (855)..(855)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (858)..(858)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (861)..(861)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (867)..(867)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (871)..(873)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (879)..(882)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (891)..(891)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (895)..(897)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (903)..(903)

<223> a, c, t, g, unknown or other

Página 112 Amgen - Al219wonon-EP (2).txt <220>

<221> modified_base <222> (906)..(906)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (909)..(909)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (916)..(921)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<222> (933)..(933)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (939)..(939)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (943)..(945)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (949)..(951)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (954)..(954)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (966)..(966)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (969)..(969)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (984)..(984)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (991)..(993)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (996)..(999)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base

Página 113 Amgen - Al219wonon-EP (2).txt <222> (1002)..(1005)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (1008)..(1008)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<220>

<221> modified_base <222> (1011)..(1011)

<223> a, c, t, g, unknown or other

<400> 96

gar acn nnn gcn tgy ath tay tay aay gcn aay tgg gar ytn gar nnn Glu Thr Arg Ala Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg -1 c m 1 ς

acn aay car nnn ggn ytn gar nnn tgy gar ggn gar car gay aar nnn Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg 25 30

ytn cay tgy tay gcn nnn tgg nnn aay nnn nnn ggn acn ath gar ytn Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn ser ser Gly Thr Ile Glu Leu 40 45

gtn aar aar ggn tgy tgg ytn gay gay tty aay tgy tay gay nnn car Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln 50 55 60

gar tgy gtn gcn acn gar gar aay ccn car gtn tay tty tgy tgy tgy Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys 65 70 75 80

gar ggn aay tty tgy aay gar nnn tty acn cay ytn ccn gar gcn ggn Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly 85 90 95

n ccn gar gtn acn tay gar ccn ccn ccn acn gcn ccn acn ggn ggn y Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr Ala Pro Thr Gly Gly 100 105 110

ggn ggn nnn gtn gar tgy ccn ccn tgy ccn gcn ccn ccn gtn gcn ggn Gly Gly Ser val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly 115 120 125

ccn nnn gtn tty ytn tty ccn ccn aar ccn aar gay acn ytn atg ath Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 130 135 140

nnn nnn acn ccn gar gtn acn tgy gtn gtn gtn gay gtn nnn cay gar Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 145 150 155 160

gay ccn gar gtn car tty aay tgg tay gtn gay ggn gtn gar gtn cay Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr val Asp Gly Val Glu Val His 165 170 175

aay gcn aar acn aar ccn nnn gar gar car tty aay nnn acn tty nnn Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg 180 185 190

gtn gtn nnn gtn ytn acn gtn gtn cay car gay tgg ytn aay ggn aar Val Val Ser Val Leu Thr val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 195 200 205

gar tay aar tgy aar gtn nnn aay aar ggn ytn ccn gcn ccn ath gar Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu

Página 114

48

96

144

192

240

288

336

384

432

480

528

576

624

672 Amgen - Al219wonon-EP (2).txt 210 215 220

aar acn ath nnn aar acn aar ggn car ccn nnn gar ccn car gtn tay

Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

225 230 235 240

acn ytn ccn ccn nnn nnn gar gar atg acn aar aay car gtn nnn ytn

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln val Ser Leu

245 250 255

acn tgy ytn gtn aar ggn tty tay ccn nnn gay ath gcn gtn gar tgg

Thr Cys Leu val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala val Glu Trp

260 265 270

gar nnn aay ggn car ccn gar aay aay tay aar acn acn ccn ccn atg

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met

■>7C 9Rf»

ytn gay nnn gay ggn nnn tty tty ytn tay nnn aar ytn acn gtn gay

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr val Asp

290 295 300

aar nnn nnn tgg car car ggn aay gtn tty nnn tgy nnn gtn atg cay

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn val Phe Ser Cys Ser Val Met His

305 310 315 320

gar gcn ytn cay aay cay tay acn car aar nnn ytn nnn ytn nnn ccn

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325 330 335

ggn aar Gly Lys

<210> 97 <211> 338 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (4) . . (4) <22 3> Ala, Phe, Gln <400> 97 Glu Thr Arg Xaa cys 1 5 10 15

Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg 20 25 30

Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu 35 40 45

val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln 50 55 60

Glu Cys val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln val Tyr Phe Cys Cys Cys 65 70 75 80

Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly 85 90 95

Página 115

720

768

816

864

yi2

960

1008

1014 Amgen - Al219W0non-EP (2).txt Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr Ala Pro Thr Gly Gly 100 105 HO

Gly Gly Ser val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly 115 120 125

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 130 135 140

Ser Arg Thr Pro Glu val Thr Cys val val Val Asp Val Ser His Glu 145 150 155 160

Asp Pro Glu val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu val His 165 170 175

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg 180 185 190

val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 195 200 205

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu 210 215 220

Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 225 230 235 240

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

245 250 255

Thr cys Leu val Lys Gly Phe Tyr Pro ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 260 265 270

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met 275 280 285

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr val Asp 290 295 300

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser val Met His

305 310 315 320

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325 330 335

Gly Lys

<210> 98 <211> 367

Página 116 Amgen - Al219WOnon-EP (2).txt <212> PRT

<213> Homo sapiens <220>

<221> M0D_RES <222> (64)..(64)

<223> Ala or Arg

<400> 98

Met Thr Ala Pro Trp vai Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Trp 10 15

Pro Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr 20 25 BO

Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg 35 40 45

Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Xaa 50 55 60

Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp 65 70 75 80

Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn 85 90 95

Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg 100 105 110

Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu vai Thr Tyr Glu Pro 115 120 125

Pro Pro Thr Ala Pro Thr Gly Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Thr His 130 135 140

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 145 150 155 160

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 165 170 175

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 180 185 190

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 195 200 205

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 210 215 220

Val Leu Thr vai Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 225 230 235 240

Página 117 Amgen - Al219WOnon-EP (2).txt Cys Lys vai Ser

Asn

245

Lys Ala Leu

Pro Ala 250

Pro Ile Glu Lys

Thr

255

Ile

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 260 265 270

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 275 280 285

val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 290 295 300

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 305 310 315 320

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 325 330 335

Trp Gln Gln Gly Asn val Phe Ser Cys Ser val Met His Glu Ala Leu 340 345 350

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 355 360 365

<210> 99 <211> 392 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> M0D_RES <222> (64)..(64) <223> Ala or Arg

<400> 99

Met Thr Ala Pro Trp Val Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Trp 10 15

Pro Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr 20 25 30

Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gly Ser Gly Leu Glu Arg 35 40 45

Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala ser Trp Xaa 50 55 60

Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp 65 70 75 80

Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn 85 90 95

Pági na 118 Amgen - Al219W0non-EP (2).txt Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg 100 105 HO

Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Gly Pro Trp Ala Ser 115 120 125

Thr Thr Ile Pro Ser Gly Gly Pro Glu Ala Thr Ala Ala Ala Gly Asp 130 135 140

Gln Gly Ser Gly Ala Leu Trp Leu Cys Leu Glu Gly Pro Ala His Glu 145 150 155 160

Gly Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 165 170 175

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 180 185 190

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 195 200 205

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 210 215 220

val Asp Gly Val Glu val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 225 230 235 240

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr val Leu His 245 250 255

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 260 265 270

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile ser Lys Ala Lys Gly Gln 275 280 285

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 290 295 300

Thr Lys Asn Gln val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 305 310 315 320

Ser Asp Ile Ala val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 325 330 335

Tyr Leu Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 340 345 350

Tyr Ser Lys Leu Thr val Asp Lys Ser Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 355 360 365

Página 119 Amgen - Al219WOnon-EP (2).txt Ser Cys Ser val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 370 375 380

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 385 390

Página 120

Claims (29)

1. Proteína isolada compreendendo um polipeptídeo IIB do receptor de ativina variante (vActRIIB), caracterizada pelo fato de que o referido polipeptídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo tendo a seqüência polipeptídica estabelecida na SEQ ID NO: 18, exceto por uma simples substituição de aminoácido na posição 28, onde a substituição é selecionada a partir de qualquer um dos A, F, Q, V, I, L, Μ, K, H, W e Y para E; (b) um polipeptídeo tendo a seqüência polipeptídica estabelecida nos aminoácidos 19 a 134 da SEQ ID NO: 18, exceto por uma simples substituição de aminoácido na posição 28, onde a substituição é selecionada a partir de qualquer um dos A, F, Q, V, I, L, Μ, K, H, W e Y para E; (c) um polipeptídeo tendo a seqüência polipeptídica estabelecida nos aminoácidos 23 a 134 da SEQ ID NO: 18, exceto por uma simples substituição de aminoácido na posição 28, onde a substituição é selecionada a partir de qualquer um dos A, F, Q, V, I, L, Μ, K, H, W e Y para E; (d) um polipeptídeo tendo a seqüência polipeptídica estabelecida nos aminoácidos 25 a 134 da SEQ ID NO: 18, exceto por uma simples substituição de aminoácido na posição 28, onde a substituição é selecionada a partir de qualquer um dos A, F, Q, V, I, L, Μ, K, H, W e Y para E; (e) um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade com qualquer um dos (a) a (d) , onde a substituição na posição 28 é selecionada a partir de qualquer um dos A, F, Q, V, I, L, Μ, Κ, Η, W e Y para Ε, e onde ο polipeptídeo é capaz de ligar a miostatina, a ativina A ou o GDF-Il.

2. Proteína isolada compreendendo um polipeptídeo IIB do receptor de ativina variante (vActRIIB), caracterizada pelo fato de que o referido polipeptídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo tendo a seqüência polipeptídica estabelecida na SEQ ID NO: 2, exceto por uma simples substituição de aminoácido na posição 28, onde a substituição é selecionada a partir de qualquer um dos A, F, Q, V, I, L, Μ, K, H, WeY para E; (b) um polipeptídeo tendo a seqüência polipeptídica estabelecida nos aminoácidos 19 a 160 da SEQ ID NO: 2, exceto por uma simples substituição de aminoácido na posição28, onde a substituição é selecionada a partir de qualquer um dos A, F, Q, V, I, L, Μ, K, H, W e Y para E; (c) um polipeptídeo tendo a seqüência polipeptídica estabelecida nos aminoácidos 23 a 160 da SEQ ID NO:2, exceto por uma simples substituição de aminoácido na posição 28, onde a substituição é selecionada a partir de qualquer um dos A, F, Q, V, I, L, Μ, K, H, W e Y para E; (d) um polipeptídeo tendo a seqüência polipeptídica estabelecida nos aminoácidos 25 a 160 da SEQ ID NO: 2, exceto por uma simples substituição de aminoácido na posição25 28, onde a substituição é selecionada a partir de qualquer um dos A, F, Q, V, I, L, Μ, K, H, W e Y para E; (e) um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade com qualquer um dos (a) a (c) , onde a substituição na posição 28 é selecionada a partir de qualquer um dos A, F, Q, V, I, L, Μ, K, H, W e Y para E, e onde o polipeptídeo é capaz de ligar a miostatina, ativina A ou o GDF-Il.

3. Proteína isolada compreendendo um polipeptídeo IIB do receptor de ativina variante (vActRIIB), caracterizada pelo fato de que o referido polipeptídeo é selecionado a partir do aruDO aue consiste em: (a) um polipeptídeo tendo a seqüência polipeptídica estabelecida na SEQ ID NO: 2 ou na SEQ ID NO: 18, exceto por uma simples substituição de aminoácido na posição 28, onde a substituição é selecionada a partir de um dos A, F, Q, V, I, L, Μ, K, H, W e Y para E, e uma simples substituição de aminoácido na posição 40, onde a substituição é selecionada a partir de A, G, Q, Μ, H, K e N para R; (b) um polipeptídeo tendo a seqüência polipeptídica estabelecida nos aminoácidos 19 a 160 da SEQ ID NO: 2 ou de 19 a 134 da SEQ ID NO: 18, exceto por uma simples substituição de aminoácido na posição 28, onde a substituição é selecionada a partir de um dos A, F, Q, V, I, L, Μ, K, H, W e Y para E, e uma simples substituição de aminoácido na posição 40, onde a substituição é selecionada de A, G, Q, Μ, H, K e N para R; (c) um polipeptídeo tendo a seqüência polipeptídica estabelecida nos aminoácidos 23 a 160 da SEQ ID NO: 2 ou de 23 a 134 da SEQ ID NO: 18, exceto por uma simples substituição de aminoácido na posição 28, onde a substituição é selecionada a partir de um dos A, F, Q, V, I, L, Μ, K, H, W e Y para E e uma simples substituição de aminoácido na posição 40, onde a substituição é selecionada de A, G, Q, Μ, H, K e N para R; (d) um polipeptídeo tendo a seqüência polipeptídica estabelecida nos aminoácidos 25 a 160 da SEQ ID NO: 2 ou de 25 a 134 para SEQ ID NO: 18, exceto por uma simples substituição de aminoácido na posição 28, onde a substituição é selecionada a partir de um dos A, F, Q, V, I, L, Μ, K, H, W e Y para E, e uma simples substituição de aminoácido na posição 40, onde a substituição é selecionada de A, G, Q, Μ, H, K e N para R; (e) um polipeptídeo_ tendo pelo menos 90% de identidade com qualquer um dos (a) a (d), onde a substituição na posição 28 é selecionada a partir de qualquer um dos A, F, Q, V, 1, L, Μ, K, H, W e Y para E, e onde a substituição na posição 40 é selecionada de uma simples substituição de aminoácido na posição 40, onde a substituição é selecionada de A, G, Q, Μ, H, K e N para R, e onde o polipeptídeo é capaz de ligar a miostatina, ativina A ou o GDF-Il.

4. Proteína isolada compreendendo um polipeptídeo IIB do receptor de ativina variante (vActRIIB), caracterizada pelo fato de que o referido polipeptídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo tendo a seqüência polipeptídica estabelecida na SEQ ID NO: 2, ou SEQ ID NO: 18, exceto por uma simples substituição de aminoácido na posição 40, onde a substituição é selecionada de A, G, Q, Μ, H, K e N para R; (b) um polipeptídeo tendo a seqüência polipeptídica estabelecida nos aminoácidos 19 a 160 da SEQ ID NO: 2, ou de 19 a 134 da SEQ ID NO: 18, exceto por uma simples substituição de aminoácido na posição 40, onde a substituição é selecionada de A, G, Q, Μ, H, K e N para R; (c) um polipeptídeo tendo a seqüência polipeptídica estabelecida nos aminoácidos 23 a 160 da SEQ ID NO:2, ou de 23 a134 para SEQ ID NO: 18, exceto por uma simples substituição de aminoácido na posição 40, onde a substituição é selecionada de A, G, Q, Μ, H, K e N para R; (d) um polipeptídeo tendo a seqüência DoliDeDtídica estabelecida nos aminoácidos 25 a 160 da SEQ ID NO:2 ou de 25 a134 para SEQ ID NO: 18, exceto por uma simples substituição de aminoácido na posição 40, onde a substituição é selecionada de A, G, Q, Μ, H, K e N para R; (e) um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade com qualquer um de (a) a (d) , onde a substituição na posição 40 é selecionada de A, G, Q, Μ, H, K e N para R, e onde o polipeptídeo é capaz de ligar a miostatina, ativina A ou GDF-Il.

5. Proteína isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a substituição é na posição 28 e é selecionada de A, W ou Y para E.

6. Proteína isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo ainda compreende uma substituição A para R na posição 64.

7. Proteína isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo tem a seqüência selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26,28, 30, 32, 34, 36 , 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 87 e 88.

8. Proteína isolada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo tem a seqüência selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 20, 24, 26, 28, 34, 38, 40, 42, 87 e 88.

9. Proteína isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo é fundido com pelo menos um polipeptídeo heterólogo.

10. Proteína isolada, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo heterólogo é um domínio Fc humano.

11. Proteína isolada, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a proteína ainda compreende um ligante.

12. Proteína, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a proteína tem a seqüência selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 60, 62, 64, 66, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95 e 97.

13. Proteína, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a proteína tem a seqüência estabelecida na SEQ ID NO: 91.

14. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade efetiva da proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13 em mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável.

15. Molécula isolada de ácido nucléico caracterizada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo codificando a proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13.

16. Molécula isolada de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: (a) um polinucleotídeo tendo a seqüência selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 , 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43,45, 51, 53, 59, 61, 63, 65 , 69, 71, 92, 94 e 96 ou seu complemento; e (b) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo a seqüência selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 12, 14, 16, 20, 22,24, 26, 28, 30 , 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 70, 72, 87, 88, 91 , 93, 95 e 97.

17. Molécula isolada de ácido nucléico caracterizada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: (a) um polinucleotídeo tendo a seqüência selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 19, 23,25, 27, 33, 37 , 39, 41, 59, 61, 63, 92, 94 e 96, ou seu complemento, e (b) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo a seqüência selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 20, 24, 26, 28, 34, 38, 40, 42, 60, 62, 64,87, 88, 91 , 93, 95 e 97.

18. Vetor de expressão recombinante caracterizado pelo fato de que compreende os ácidos nucléicos de acordo com qualquer uma das reivindicações 15, 16, ou 17.

19. Célula hospedeira recombinante caracterizado pelo fato de que compreende o vetor de acordo com a reivindicação18 .

20. Método para a produção da proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, caracterizado pelo fato de que compreende a cultura da célula hospedeira da reivindicação 19, expressando assim a proteína.

21. Método para a inibição da miostatina em um indivíduo com necessidade deste tratamento, caracterizado pelo fato de aue compreende a administração de uma auantidade terapeuticamente efetiva da proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13 ou da composição da reivindicação 14 ao indivíduo.

22. Método para aumentar a massa muscular magra ou aumentar a relação da massa muscular magra com relação à massa de gordura em um indivíduo com necessidade deste tratamento, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva da proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13 ou da composição da reivindicação 14 ao indivíduo.

23. Método para o tratamento de uma doença ou distúrbio de atrofia muscular em um indivíduo com necessidade deste tratamento, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva da proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13 ou da composição da reivindicação 14 ao indivíduo.

24. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio de atrofia muscular é selecionada de distrofia muscular, esclerose lateral amiotrófica, doença pulmonar obstrutiva congestiva, insuficiência cardíaca crônica, caquexia do câncer, AIDS, caquexia devida à insuficiência renal, uremia, caquexia devida à artrite reumatóide, sarcopenia relacionada à idade, atrofia orgânica, síndrome do túnel do carpo, deprivação androgênica, caquexia devida a ferimentos por queimaduras, nefropatia diabética e atrofia muscular devida ao prolongado repouso na cama, danos à coluna espinhal, fratura óssea, AVC, velhice ou exposição à microgravidade.

25. Método para o tratamento de distúrbio metabólico em um indivíduo com necessidade deste tratamento caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva da proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13 ou da composição da reivindicação 14 ao indivíduo.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o distúrbio metabólico é selecionado de diabetes, obesidade, hiperglicemia e perda óssea.

27. Método para o tratamento de uma doença em que a ativina é sobreexpressa em um indivíduo com necessidade deste tratamento caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva da proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13 ou da composição da reivindicação 14 ao indivíduo.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a doença é o câncer.

29. Método para o tratamento de um distúrbio de atrofia muscular ou distúrbio metabólico em um indivíduo com necessidade deste tratamento, caracterizado pelo fato de que compreende a administração do vetor da reivindicação 18 ao indivíduo, onde o vetor é capaz de direcionar a expressão dos polipeptídeos vActRIIB no indivíduo.