ES2613043T3 - Polipéptidos receptores de activina variantes y usos de los mismos - Google Patents
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Abstract
Una proteína aislada que comprende un polipéptido receptor de activina IIB variante (vActRIIB), en la que dicho polipéptido se selecciona entre el grupo que consiste en: (a) un polipéptido que tiene la secuencia polipeptídica expuesta en la SEQ ID NO: 18, excepto por una única sustitución de aminoácido en la posición 28, en el que la sustitución se selecciona entre una cualquiera de E por A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W e Y; (b) un polipéptido que tiene la secuencia polipeptídica expuesta en los aminoácidos 19 a 134 de la SEQ ID NO: 18, excepto por una única sustitución de aminoácido en la posición 28, en el que la sustitución se selecciona entre una cualquiera de E por A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W e Y; (c) un polipéptido que tiene la secuencia polipeptídica expuesta en los aminoácidos 23 a 134 de la SEQ ID NO: 18, excepto por una única sustitución de aminoácido en la posición 28, en el que la sustitución se selecciona entre una cualquiera de E por A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W e Y; (d) un polipéptido que tiene la secuencia polipeptídica expuesta en los aminoácidos 25 a 134 de la SEQ ID NO: 15 18, excepto por una única sustitución de aminoácido en la posición 28, en el que la sustitución se selecciona entre una cualquiera de E por A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W e Y; (e) un polipéptido que tiene al menos un 90 % de identidad con uno cualquiera de (a) a (d), en el que la sustitución en la posición 28 se selecciona entre una cualquiera de E por A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W e Y, y en el que el polipéptido es capaz de unirse a miostatina, activina A o GDF-11.
Description
Polipéptidos receptores de activina variantes y usos de los mismos
Campo técnico de la invención 5
El campo técnico de esta invención se refiere a miembros de la familia del factor de crecimiento transformante-β (TGF-β) y receptores de TGF-β solubles, así como a la modulación de las actividades de miembros de la familia del TGF-β para el tratamiento de diversos trastornos.
10
Antecedentes de la invención
La familia de proteínas del factor de crecimiento transformante β (TGF-β) incluye los factores de crecimiento transformantes-β (TGF-β), activinas, proteínas morfogénicas óseas (BMP), factores de crecimiento nervioso (NGF), factor neurotrófico obtenido del cerebro (BDNF), y factores de crecimiento/diferenciación (GDF). Estos miembros de 15 la familia están implicados en la regulación de una amplia gama de procesos biológicos incluyendo proliferación, diferenciación y otras funciones celulares.
El factor de crecimiento/diferenciación 8 (GDF-8), también denominado miostatina, es un miembro de la familia de TGF-β expresado en su mayor parte en las células de tejido de músculo esquelético en desarrollo y adulto. La 20 miostatina parece desempeñar un papel esencial en el control negativo del crecimiento del músculo esquelético (McPherron et al., Nature (Londres) 387, 83-90 (1997)). La antagonización de la miostatina ha demostrado incrementar la masa muscular magra en animales (McFerron et al., mencionado anteriormente, Zimmers et al., Science 296: 1486 (2002)).
25
Otro miembro de la familia de proteínas de TGF-β es un factor de crecimiento/diferenciación relacionado, GDF-11. GDF-11 tiene aproximadamente un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de miostatina. GDF-11 tiene un papel en la formación del patrón axial en animales en desarrollo (Oh et al, Genes Dev 11: 1812-26 (1997)), y también parece desempeñar un papel en el desarrollo y crecimiento del músculo esquelético.
30
Las activinas A, B y AB son los homodímeros y heterodímero respectivamente de dos cadenas polipeptídicas, βA y βB (Vale et al. Nature 321, 776-779 (1986), Ling et al., Nature 321, 779-782 (1986)). Las activinas fueron descubiertas originalmente como péptidos gonadales implicados en la regulación de la síntesis de hormona estimuladora del folículo, y ahora se cree que están implicadas en la regulación de una serie de actividades biológicas. La activina A es una forma predominante de activina. 35
La activina, miostatina, GDF-11 y otros miembros de la superfamilia de TGF-β se unen y se señalizan a través de una combinación de receptores de activina de tipo II y activina de tipo IIB, ambos de los cuales son serina/treonina quinasas transmembrana (Harrison et al., J. Biol. Chem. 279, 28036-28044 (2004)). Estudios de reticulación han determinado que la miostatina es capaz de unirse a los receptores de activina de tipo II ActRIIA y ActRIIB in vitro 40 (Lee et al., PNAS EE. UU. 98: 9306-11 (2001)). También hay indicios de que GDF-11 se une tanto a ActRIIA como a ActRIIB (Oh et al., Genes Dev 16: 2749-54 (2002)).
Se sabe que la expresión de la proteína TGF-β está asociada con diversas enfermedades y trastornos. Por lo tanto, moléculas terapéuticas capaces de antagonizar varias proteínas de TGF-β simultáneamente pueden ser 45 particularmente eficaces para estas enfermedades y trastornos.
Además, la producción de productos terapéuticos proteicos puede complicarse mediante problemas que se producen durante la expresión y purificación de la proteína. Un problema es la agregación de proteínas durante la expresión o purificación. La acumulación de niveles elevados de proteína durante condiciones de cultivo celular 50 puede causar agregación. Los procesos de purificación pueden exponer a la proteína a factores adicionales que promueven agregación adicional (Cromwell, M.E.M. et al., The AAPS Journal 8: E572-E579, 2006). Se han realizado intentos de mitigar los factores que causan agregación, sin embargo, existe una necesidad de proteínas diseñadas para tener una menor tendencia a formar agregados. La presente invención satisface la necesidad de moléculas terapéuticas que se unen a múltiples ligandos, y tienen agregación reducida y por lo tanto capacidad de fabricación 55 mejorada, con el fin de producir de forma eficiente proteínas útiles para tratar patologías relacionadas con TGF-β.
Sumario de la invención
Tal como se usa en el presente documento, la expresión polipéptido vActRIIB se refiere tanto a polipéptidos 60 vActRIIB humanos como polipéptidos vActRIIB5 humanos.
La presente invención proporciona una proteína aislada que comprende un polipéptido receptor de activina IIB variante (vActRIIB) en el que dicho polipéptido se selecciona entre el grupo que consiste en:
65
(a) un polipéptido que tiene la secuencia polipeptídica expuesta en la SEQ ID NO: 18, excepto por una única sustitución de aminoácido en la posición 28, en el que la sustitución se selecciona entre una cualquiera de E por A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W e Y;
(b) un polipéptido que tiene la secuencia polipeptídica expuesta en los aminoácidos 19 a 134 de la SEQ ID NO: 18, excepto por una única sustitución de aminoácido en la posición 28, en el que la sustitución se selecciona 5 entre una cualquiera de E por A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W e Y;
(c) un polipéptido que tiene la secuencia polipeptídica expuesta en los aminoácidos 23 a 134 de la SEQ ID NO: 18, excepto por una única sustitución de aminoácido en la posición 28, en el que la sustitución se selecciona entre una cualquiera de E por A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W e Y;
(d) un polipéptido que tiene la secuencia polipeptídica expuesta en los aminoácidos 25 a 134 de la SEQ ID NO: 10 18, excepto por una única sustitución de aminoácido en la posición 28, en la que la sustitución se selecciona entre una cualquiera de E por A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W e Y;
(e) un polipéptido que tiene al menos un 90 % de identidad con uno cualquiera de (a) a (d),
en el que la sustitución en la posición 28 se selecciona entre una cualquiera de E por A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W e Y, 15 y en el que el polipéptido es capaz de unirse a miostatina, activina A o GDF-11.
En un aspecto de la divulgación, la proteína comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o 18 en la que los aminoácidos en la posición E28 o R40, o ambas posiciones E28 y R40 están sustituidos por otro aminoácido no nativo, y en el que el polipéptido es capaz de unirse a miostatina, activina A o 20 GDF-11. En un aspecto de la divulgación, la proteína comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o 18 en el que los aminoácidos en las posiciones E28 o R40, o tanto E28 como R40 están sustituidos por un aminoácido no nativo, y en el que el péptido señal está eliminado, y en el que el polipéptido es capaz de unirse a miostatina, activina A o GDF-11. En un aspecto de la divulgación, la proteína comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o 18 en el que los 25 aminoácidos en las posiciones E28 o R40, o tanto E28 como R40 están sustituidos por otro aminoácido, en el que la secuencia señal está eliminada, y el extremo N del polipéptido maduro está truncado, y en el que el polipéptido es capaz de unirse a miostatina, activina A o GDF-11. En un aspecto de la divulgación, el polipéptido vActRIIB truncado maduro N-terminal carece de los cuatro aminoácidos N-terminales o los seis aminoácidos N-terminales de la secuencia madura, en el que el polipéptido es capaz de unirse a miostatina, activina A o GDF-11. En una 30 realización, la sustitución en la posición E28 se selecciona entre el grupo que consiste en W, Y y A. En una realización adicional, la sustitución en la posición E28 se selecciona entre el grupo de aminoácidos que consiste en A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W e Y. En una realización adicional, el polipéptido comprende además una proteína heteróloga. En una realización, la proteína heteróloga es un dominio Fc humano. En una realización adicional, el dominio Fc humano es un dominio IgG2 Fc humano. 35
En una realización, la proteína comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NO: 20, 24, 26, 28, 34, 38, 40, 42, 87 u 88.
En otra realización, la proteína comprende un polipéptido codificado por el polinucleótido que tiene la secuencia 40 expuesta en las SEQ ID NO: 19, 23, 25, 27, 33, 37, 39, 41, 59, 61, 63, 92, 94, 96 o su complemento.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido vActRIIB variante de la invención. En una realización, la molécula de ácido nucleico comprende un polinucleótido que tiene la secuencia de ácido nucleico expuesta en las SEQ ID NO: 19, 23, 45 25, 27, 33, 37, 39, 41, 59, 61, 63, 92, 94, 96 o su complemento.
En otra realización, la molécula de ácido nucleico comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 20, 24, 26, 28, 34, 38, 40, 42,60, 62, 64, 87, 88, 91, 93, 95 y 97. En un aspecto adicional de la divulgación, la molécula de ácido 50 nucleico comprende además una secuencia reguladora transcripcional o traduccional. En otro aspecto, se proporciona un vector recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico de vActRIIB. En otro aspecto, se proporcionan células hospedadoras que comprenden el vector recombinantes, y se proporcionan métodos de producción de los polipéptidos vActRIIB.
55
La presente divulgación proporciona además una composición que contiene al menos un polipéptido o proteína vActRIIB de la presente invención. En una realización, la composición es una composición farmacéutica que contiene el polipéptido o proteína vActRIIB en mezcla con a transportador farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la presente invención proporciona la proteína o composición de la invención para uso: 60
(i) para inhibir la actividad de miostatina o incrementar la masa muscular magra o incrementar la relación de masa muscular magra con respecto a masa grasa en un sujeto que necesita dicho tratamiento;
(ii) para tratar una enfermedad o trastorno metabólico de pérdida muscular en un sujeto que necesita dicho tratamiento; o 65
(iii) para tratar una enfermedad en la que la activina se sobreexpresa en un sujeto que necesita dicho tratamiento. La enfermedad de pérdida muscular incluye o resulta de, aunque sin limitarse a, las siguientes afecciones: caquexia cancerosa, distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, insuficiencia cardiaca crónica, caquexia química, caquexia a partir de VIH/SIDA, insuficiencia renal, uremia, artritis reumatoide, sarcopenia asociada a la edad, fragilidad asociada a la edad, atrofia de órganos, síndrome del túnel carpiano, supresión androgénica, y pérdida muscular debida a inactividad 5 consecuencia de reposo prolongado, lesión de médula espinal, ictus, fractura ósea y envejecimiento. La pérdida muscular también puede resultar de ingravidez debida a vuelo espacial, resistencia a insulina, pérdida muscular debida a quemaduras, supresión androgénica, y otros trastornos. En una realización, la enfermedad en la que la activina se sobreexpresa es cáncer. El trastorno metabólico puede seleccionarse entre pérdida ósea, diabetes, obesidad, intolerancia a la glucosa, hiperglucemia, supresión androgénica y síndrome metabólico. La presente 10 divulgación proporciona el uso de la composición terapéutica en la preparación de un medicamento para tratar los trastornos anteriores. En otro aspecto, la presente invención proporciona un vector que codifica un polipéptido o proteína vActRIIB de la presente invención para uso en el tratamiento de un trastorno de pérdida muscular o trastorno metabólico en un sujeto que necesita dicho tratamiento, en el que el vector es capaz de dirigir la expresión de los polipéptidos vActRIIB en el sujeto. 15
Breve descripción de las figuras
Figura 1. La figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos de IgG1Fc humano de ActRIIB soluble de tipo silvestre (SEQ ID NO: 98). La secuencia del péptido señal está en negrita, seguida por el dominio extraceluar de 20 ActRIIB maduro, y el IgG1 Fc humano en cursiva, que incluye una región bisagra parcial. Los aminoácidos E28 y R40 están subrayados. La secuencia enlazadora GGGGS (SEQ ID NO: 75) está en cursiva y subrayada.
Figura 2. La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos de IgG1Fc humano de ActRIIB soluble (SEQ ID NO: 99). La secuencia del péptido señal está en negrita, seguida por el dominio soluble de ActRIIB5 maduro, y el IgG1 Fc humano, que incluye a región bisagra parcial, está en cursiva. E28 y R40 están subrayados. La 25 secuencia enlazadora (GGGGS) (SEQ ID NO: 75) está en cursiva y subrayada.
Figura 3. La figura 3 muestra el efecto de tratamiento con vActRIIB-Fc E28W soluble sobre una masa testicular (figura 3A) y ovárica (figura 3B) en ratones con inactivación de inhibina-α.
Figura 4. La figura 4 muestra el efecto de tratamiento con vActRIIB-Fc E28W soluble sobre las tasas de supervivencia en ratones con inactivación de inhibina-α macho (figura 4A) y hembra (figura 4B). 30
Figura 5. La figura 5 muestra el efecto de tratamiento con vActRIIB-Fc E28W soluble sobre el peso corporal en ratones portadores del tumor de colon 26.
Figura 6. La figura 6 muestra el efecto de tratamiento con vActRIIB-Fc E28W soluble sobre la supervivencia de ratones portadores del tumor de colon 26.
35
Descripción detallada
Se desvelan las proteínas que comprenden polipéptidos receptores de activina IIB humana variantes (vActRIIB). Estas proteínas y polipéptidos se caracterizan por su capacidad para unirse a al menos una de tres proteínas de TGF-β, miostatina (GDF-8), activina A y GDF-11, y para inhibir las actividades de estas proteínas. Estas proteínas y 40 polipéptidos también muestran una tendencia reducida a agregarse en comparación con polipéptidos que no contienen las modificaciones desveladas en el presente documento. Las modificaciones consisten en sustituciones de aminoácidos en las posiciones 28, 40, o tanto 28 como 40 con referencia al ActRIIB de tipo silvestre de número de acceso NP_001097 (SEQ ID NO: 47), y el dominio extracelular de ActRIIB (SEQ ID NO: 18) o ActRIIB5 (SEQ ID NO: 2). 45
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "miembros de la familia de TGF-β" o "proteínas de TGF-β" se refiere a los factores de crecimiento relacionados estructuralmente de la familia del factor de crecimiento transformante que incluye activinas, y proteínas del factor de crecimiento y diferencial (GDF) (Kingsley et al. Genes Dev. 8: 133-146 (1994), McPherron et al. Growth factors and cytokines in health and disease, Vol. 1B, D. LeRoith 50 and C. Bondy. ed., JAI Press Inc., Greenwich, Conn, EE. UU.: págs. 357-393).
GDF-8, también denominado miostatina, es un regulador negativo del tejido del músculo esquelético (McPherron et al. PNAS EE. UU. 94: 12457-12461 (1997)). La miostatina se sintetiza como un complejo de proteínas inactivas de aproximadamente 375 aminoácidos de longitud, que tiene el N.º de acceso al GenBank: AAB86694 (SEQ ID NO: 49) 55 para ser humano. La proteína precursora se activa mediante escisión proteolítica en un sitio de procesamiento tetrabásico para producir un prodominio inactivo N-terminal y una proteína C-terminal de aproximadamente 109 aminoácidos que dimeriza para formar un homodímero de aproximadamente 25 kDa. Este homodímero es la proteína biológicamente activa y madura (Zimmers et al., Science 296, 1486 (2002)).
60
Tal como se usa en el presente documento, el término "prodominio" o "propéptido" se refiere a la proteína N-terminal inactiva que es escindida para liberar la proteína C-terminal activa. Tal como se usa en el presente documento, el término "miostatina" o "miostatina madura" se refiere al polipéptido C-terminal biológicamente activo y maduro, en forma de monómero, dímero u otra, así como fragmentos biológicamente activos o polipéptidos relacionados que incluyen variantes alélicas, variantes de corte y empalme, y péptidos y polipéptidos de fusión. Se ha descrito que la 65 miostatina madura tiene un 100 % de identidad de secuencia entre muchas especies que incluyen ser humano, ratón, pollo, porcinos, pavo, y rata (Lee et al., PNAS 98, 9306 (2001)).
Tal como se usa en el presente documento, GDF-11 se refiere a la BMP (proteína morfogénica ósea) que tiene el número de acceso de Swissprot 095390 (SEQ ID NO: 50), así como variantes y especies homólogas de esa proteína. GDF-11 tiene aproximadamente un 90 % de identidad con miostatina a nivel de aminoácidos. GDF-11 está 5 implicado en la regulación de la formación del patrón anterior/posterior del esqueleto axial (McPherron et al, Nature Genet. 22 (93): 260-264 (1999); Gamer et al, Dev. Biol. 208 (1), 222-232 (1999)) pero las funciones postnatales se desconocen.
La activina A es el homodímero de las cadenas polipeptídicas βA. Tal como se usa en el presente documento, el 10 término "activina A" se refiere a la proteína activina que tiene el N.º de acceso al GenBank: NM_002192 (SEQ ID NO: 48), así como variantes y especies homólogas de esa proteína.
Receptores de activina
15
Tal como se usa en el presente documento, la expresión receptores B de activina de tipo II (ActRIIB) se refiere a receptores de activina humanos que tienen el número de acceso NP_001097 (SEQ ID NO: 47). La expresión ActRIIB soluble abarca el dominio extracelular de ActRIIB (SEQ ID NO: 18), ActRIIB5 (SEQ ID NO: 2) y estas secuencias en las que la arginina en la posición 64 es sustituida por alanina, también.
20
Polipéptidos ActRIIB solubles variantes
La presente divulgación proporciona proteínas aisladas que comprenden polipéptidos del receptor ActIIB solubles variantes humanos (denominados en el presente documento polipéptidos vActRIIB, o polipéptidos variantes). Tal como se usa en el presente documento, la expresión "proteína vActRIIB" se refiere a una proteína que comprende 25 un polipéptido vActRIIB. Tal como se usa en el presente documento, el término "aislado/a" se refiere a una molécula de proteína o polipéptido purificada en cierto grado a partir de material endógeno. Estos polipéptidos y proteínas se caracterizan por tener la capacidad de unirse a, e inhibir la actividad de, una cualquiera de activina A, miostatina, o GDF-11. En algunos aspectos, la afinidad de unión de los polipéptidos variantes por activina A, miostatina o GDF-11 mejora en comparación con polipéptidos de tipo silvestre. 30
En un aspecto, el polipéptido vActRIIB tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o 18, en la que los aminoácidos en la posición E28 o R40, o tanto en la posición E28 como en la R40 están sustituidos por otro aminoácido no nativo, y en el que el polipéptido es capaz de unirse a miostatina, activina A o GDF-11. En otro aspecto, los polipéptidos vActRIIB son las versiones maduras, o las versiones maduras truncadas de estas 35 secuencias. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "polipéptido vActRIIB maduro" se refiere al polipéptido que tiene la secuencia señal de aminoácidos eliminada. En un aspecto, las secuencias maduras son, por ejemplo, los aminoácidos 19 a 160 de la SEQ ID NO: 2, y los aminoácidos 19 a 134 de la SEQ ID NO: 18, en las que uno o ambos aminoácidos en las posiciones 28 y 40 están sustituidos por otro aminoácido no nativo y los polipéptidos conservan la capacidad de unirse a activina A, miostatina o GDF-11. Tal como se usa en el presente 40 documento, la expresión polipéptido vActRIIB maduro truncado se refiere al polipéptido que tiene la secuencia señal y además los aminoácidos desde el extremo N del polipéptido maduro eliminados. En un aspecto, los 4 aminoácidos N-terminales maduros o los 6 aminoácidos N-terminales del polipéptido maduro se eliminan. En este aspecto, las secuencias maduras truncadas son, por ejemplo, los aminoácidos 23 a 160 de la SEQ ID NO: 2, o los aminoácidos 25 a 160 de la SEQ ID NO: 2; y los aminoácidos 23 a 134 de la SEQ ID NO: 18, o los aminoácidos 25 a 134 de la 45 SEQ ID NO: 18 en las que uno o ambos aminoácidos en las posiciones 28 y 40 están sustituidos por aminoácidos no de tipo silvestre que conservan la capacidad de unirse a activina A, miostatina o GDF-11. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "posición 28" y "posición 40" (es decir, E28 y R40) se refiere a la posición de aminoácidos con referencia a las secuencias SEQ ID NO: 2 y 18 que incluyen una secuencia señal de 18 aminoácidos. Por coherencia, si los polipéptidos vActRIIB maduros tienen sustituciones en la posición 10 y/o la 50 posición 22, o los polipéptidos maduros truncados tienen sustituciones en la posición 6 y/o la posición 18, o sustituciones en las posiciones 4 y/o la posición 16 con respecto a las secuencias maduras o maduras truncadas, estas variantes aún estarán referenciadas con respecto a las SEQ ID NO: 2 y 18 de longitud completa, o tal como se muestra en la figura 1 o 2, es decir, la sustitución de aminoácidos en la posición E28 y/o R40. Dichos aspectos maduros o aspectos truncados N-terminales se ejemplifican a continuación. 55
En un aspecto, la sustitución en la posición E28 se selecciona entre el grupo de aminoácidos que consiste en W, Y y A. En un aspecto, la sustitución en la posición 28 es W. En un aspecto adicional, la sustitución en la posición 28 se selecciona entre el grupo de aminoácidos que consiste en A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W e Y. En un aspecto adicional, la sustitución en la posición 40 se selecciona entre el grupo de aminoácidos que consiste en G, Q, M, H, K y N. En 60 un aspecto adicional, la sustitución en la posición 28 se selecciona entre el grupo de aminoácidos que consiste en A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W e Y, y la sustitución en la posición 40 se selecciona entre el grupo de aminoácidos que consiste en A, G, Q, M, H, K y N. En un aspecto, la proteína comprende polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95 y 97. En otro aspecto, la 65 proteína comprende un polipéptido codificado por el polinucleótido que tiene la secuencia expuesta en el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94, 96 o su complemento.
En un aspecto, las secuencias señal se eliminan del polipéptido vActRIIB, dejando los polipéptidos variantes maduros. Pueden usarse diversos péptidos señal en la preparación de los polipéptidos de la presente solicitud. Los 5 péptidos señal pueden tener la secuencia mostrada en la figuras 1 y 2 (SEQ ID NO: 73), o secuencias señal alternativas tales como la SEQ ID NO: 74, la secuencia señal para la SEQ ID NO: 2 y 18. Pueden usarse cualesquiera otros péptidos señal útiles para expresar polipéptidos vActRIIB o vActRIIB5.
En otro aspecto, los polipéptidos vActRIIB tienen secuencias que son sustancialmente similares a las SEQ ID NO: 2 10 y 18. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "sustancialmente similares" se refiere a polipéptidos que tiene al menos aproximadamente el 80 % de identidad, al menos aproximadamente el 85 % de identidad, al menos aproximadamente el 90 % de identidad, al menos aproximadamente el 95 % de identidad, al menos aproximadamente el 98 % de identidad, o al menos aproximadamente el 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2 y 18, y en los que uno o ambos aminoácidos en las posiciones 28 y/o 40 15 están sustituidos por aminoácidos no de tipo silvestre, en los que el polipéptido conserva la capacidad del polipéptido de la SEQ ID NO: 2 y 18, que es la capacidad de unirse a, e inhibir, miostatina, activina A o GDF-11. Además, la expresión polipéptido vActRIIB abarca fragmentos de la SEQ ID NO: 2 o 18 tales como truncamientos N y C terminales que contienen las sustituciones en la posición 28 y/o 40 descritas en el presente documento, en las que el polipéptido es capaz de unirse a, e inhibir, miostatina, activina A o GDF-11. 20
Tal como se usa en el presente documento, el término "derivado" de los polipéptidos vActRIIB y vActRIIB5 de ratón se refiere a la fijación de al menos un resto químico adicional, o al menos un polipéptido adicional para formar conjugados covalentes o agregados tales como grupos glucosilo, lípidos, grupos acetilo, o polipéptidos de fusión C-terminal o N-terminal, conjugación a moléculas de PEG, y otras modificaciones que se describen más 25 completamente a continuación. Los polipéptidos receptores de ActRIIB variantes (vActRIIB) también pueden incluir modificaciones y derivados adicionales, incluyendo modificaciones a los extremos C y N que surgen como consecuencia del procesamiento debido a la expresión en diversos tipos celulares tales como células de mamífero, E. coli, levaduras y otras células hospedadoras recombinantes. Además se incluyen fragmentos del polipéptido vActRIIB y polipéptidos que comprenden uno o más sitios de N-glucosilación inactivados, uno o más sitios de 30 procesamiento de proteasa inactivados, o una o más sustituciones de aminoácidos conservativas, de las secuencias polipeptídicas expuestas en las SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95 y 97.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión una "actividad del polipéptido vActRIIB o vActRIIB5" o "una 35 actividad biológica de un polipéptido ActRIIB o ActRIIB5 soluble" se refiere a una o más actividades in vitro o in vivo de los polipéptidos vActRIIB y vActRIIB5 que incluyen, aunque sin limitarse a, las demostradas en el ejemplo a continuación. Las actividades de los polipéptidos vActRIIB incluyen, aunque sin limitarse a, la capacidad de unirse a miostatina o activina A o GDF-11, y la capacidad de reducir o neutralizar una actividad de miostatina o activina A o GDF-11. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "capaz de unirse" a miostatina, activina A o GDF-40 11 se refiere a la unión medida mediante métodos conocidos en la técnica, tales como el método de Biacore descrito en el ejemplo 2 a continuación. Además, en el ejemplo 2, el ensayo basado en células pMARE C2C12 mide la actividad de neutralización de activina A, la actividad de neutralización de miostatina, y la actividad de neutralización de GDF-11. Las actividades in vivo incluyen, aunque sin limitarse a, incrementar el peso corporal, incrementar la masa muscular magra, incrementar la masa de músculo esquelético, reducir la masa grasa, tal como se demuestra 45 en modelos animales a continuación y tal como se conoce en la técnica. Las actividades biológicas incluyen además reducir o prevenir caquexia causada por ciertos tipos de tumores, prevenir el crecimiento de ciertos tipos de tumores, e incrementar la supervivencia de ciertos modelos animales. A continuación se proporciona una descripción adicional de actividades del polipéptido vActRIIB.
50
Los polipéptidos de la presente invención comprende además polipéptidos heterólogos fijados al polipéptido vActRIIB directamente o a través de una secuencia enlazadora para formar una proteína de fusión. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "proteína de fusión " se refiere a una proteína que tiene un polipéptido heterólogo fijado mediante técnicas de ADN recombinante. Los polipéptidos heterólogos incluyen, aunque sin limitarse a, polipéptidos de Fc, sus marcadores y dominios de cremallera de leucina para promover la 55 oligomerización y estabilización de los polipéptidos ActRIIB variantes tal como describe, por ejemplo, en el documento WO 00/29581. En un aspecto, el polipéptido heterólogo es un polipéptido o dominio de Fc. En un aspecto, el dominio Fc se selecciona entre un dominio IgG1, IgG2 e IgG4 Fc humano. Estos se proporcionan en las SEQ ID NO: 80, 82 y 84. El vActRIIB pude comprender además toda o una parte de la secuencia bisagra de la IgG1, IgG2 o IgG4 adyacente a su región IgG Fc respectiva. La secuencia bisagra completa para IgG1, IgG2 e IgG4 se 60 proporcionan en las SEQ ID NO: 76, 77 y 78 respectivamente.
El polipéptido vActRIIB puede comprender opcionalmente además una secuencia "enlazadora". Los enlazadores sirven principalmente como separador entre un polipéptido y un segundo polipéptido heterólogo u otro tipo de fusión o entre dos o más polipéptidos ActRIIB variantes. En un aspecto, el enlazador está compuesto por aminoácidos 65 enlazados entre sí mediante enlaces peptídicos, preferentemente de 1 a 20 aminoácidos enlazados mediante enlaces peptídicos, en los que los aminoácidos se seleccionan entre los 20 aminoácidos de origen natural. Uno o más de estos aminoácidos pueden estar glucosilados, tal como es entendido por los expertos en la materia. En un aspecto, los 1 a 20 aminoácidos se seleccionan entre glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina y lisina. Preferentemente, un enlazador está compuesto por una mayoría de aminoácidos que no presentan impedimento estérico, tales como glicina y alanina. Enlazadores ejemplares son poliglicinas (particularmente (Gly)enlaces peptídicos, en los que los aminoácidos se seleccionan entre los 20 aminoácidos de origen natural. Uno o más de estos aminoácidos pueden estar glucosilados, tal como es entendido por los expertos en la materia. En un aspecto, los 1 a 20 aminoácidos se seleccionan entre glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina y lisina. Preferentemente, un enlazador está compuesto por una mayoría de aminoácidos que no presentan impedimento estérico, tales como glicina y alanina. Enlazadores ejemplares son poliglicinas (particularmente (Gly)enlaces peptídicos, en los que los aminoácidos se seleccionan entre los 20 aminoácidos de origen natural. Uno o más de estos aminoácidos pueden estar glucosilados, tal como es entendido por los expertos en la materia. En un aspecto, los 1 a 20 aminoácidos se seleccionan entre glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina y lisina. Preferentemente, un enlazador está compuesto por una mayoría de aminoácidos que no presentan impedimento estérico, tales como glicina y alanina. Enlazadores ejemplares son poliglicinas (particularmente (Gly)enlaces peptídicos, en los que los aminoácidos se seleccionan entre los 20 aminoácidos de origen natural. Uno o más de estos aminoácidos pueden estar glucosilados, tal como es entendido por los expertos en la materia. En un aspecto, los 1 a 20 aminoácidos se seleccionan entre glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina y lisina. Preferentemente, un enlazador está compuesto por una mayoría de aminoácidos que no presentan impedimento estérico, tales como glicina y alanina. Enlazadores ejemplares son poliglicinas (particularmente (Gly)enlaces peptídicos, en los que los aminoácidos se seleccionan entre los 20 aminoácidos de origen natural. Uno o más de estos aminoácidos pueden estar glucosilados, tal como es entendido por los expertos en la materia. En un aspecto, los 1 a 20 aminoácidos se seleccionan entre glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina y lisina. Preferentemente, un enlazador está compuesto por una mayoría de aminoácidos que no presentan impedimento estérico, tales como glicina y alanina. Enlazadores ejemplares son poliglicinas (particularmente (Gly)enlaces peptídicos, en los que los aminoácidos se seleccionan entre los 20 aminoácidos de origen natural. Uno o más de estos aminoácidos pueden estar glucosilados, tal como es entendido por los expertos en la materia. En un aspecto, los 1 a 20 aminoácidos se seleccionan entre glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina y lisina. Preferentemente, un enlazador está compuesto por una mayoría de aminoácidos que no presentan impedimento estérico, tales como glicina y alanina. Enlazadores ejemplares son poliglicinas (particularmente (Gly)enlaces peptídicos, en los que los aminoácidos se seleccionan entre los 20 aminoácidos de origen natural. Uno o más de estos aminoácidos pueden estar glucosilados, tal como es entendido por los expertos en la materia. En un aspecto, los 1 a 20 aminoácidos se seleccionan entre glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina y lisina. Preferentemente, un enlazador está compuesto por una mayoría de aminoácidos que no presentan impedimento estérico, tales como glicina y alanina. Enlazadores ejemplares son poliglicinas (particularmente (Gly)
Los enlazadores también son enlazadores no peptídicos. Por ejemplo, pueden usarse enlazadores alquílicos tales 10 como - NH-(CH2)s-C(O)-, en el que s = 2-20. Estos enlazadores alquílicos pueden estar sustituidos además por cualquier grupo sin impedimento estérico tal como alquilo inferior (por ejemplo, C1-C6) acilo inferior, halógeno (por ejemplo, Cl, Br), CN, NH2, fenilo, etc.
En un aspecto, los polipéptidos vActRIIB pueden estar fijados a un polipéptido Fc, directamente o mediante un 15 enlazador, o mediante un enlazador bisagra. En un aspecto, el Fc es un IgG Fc humano. vActRIIB fijados a Fc incluyen por ejemplo, vActRIIB-IgG1Fc, E28A (SEQ ID NO: 60); vActRIIB-IgG1Fc, E28W (SEQ ID NO: 62), vActRIIB-IgG1Fc, E28Y (SEQ ID NO: 64), vActRIIB-IgG Fc, R40G (SEQ ID NO: 66), vActRIIB5-IgG1Fc, E28A (SEQ ID NO: 70) y vActRIIB5-IgG1Fc E28W (SEQ ID NO: 72), tal como se muestra en las tablas 1 y 2, y se describe en los ejemplos en el presente documento. Aspectos adicionales incluyen vActRIIB-IgG2 Fc, E28W (SEQ ID NO: 91), 20 vActRIIB-IgG2 Fc, E28Y (SEQ ID NO: 93) y vActRIIB-IgG2 Fc (SEQ ID NO: 95). Las variantes han demostrado producir menos agregación en comparación con la IgG2, ActRIIB-IgG2 de tipo silvestre, tal como se demuestra en los ejemplos a continuación.
Los polipéptidos vActRIIB desvelados en el presente documento también pueden estar fijados a una molécula no 25 polipeptídica con el fin de otorgar propiedades deseadas, tales como reducir la degradación y/o incrementar la semivida, reducir la toxicidad, reducir la inmunogenicidad, y/o incrementar la actividad biológica de los polipéptidos ActRIIB. Las moléculas ejemplares incluyen aunque sin limitarse a polímeros lineales tales como polietilenglicol (PEG), polilisina, un dextrano; un lípido; un grupo colesterol (tal como un esteroide); un carbohidrato, o una molécula de oligosacárido. 30
En otro aspecto, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden polinucleótidos que codifican los polipéptidos vActRIIB de la presente invención. Tal como se usa en el presente documento, el término "aislado/a" se refiere a moléculas de ácido nucleico purificadas en cierto grado a partir de material endógeno. En un aspecto, la molécula de ácido nucleico de la presente divulgación comprende un 35 polinucleótido que codifica los polipéptidos de las SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95 y 97. Debido a la conocida degeneración del código genético, en el que más de un codón pueden codificar el mismo aminoácido, una secuencia de ADN puede variar respecto a la mostrada en las SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94 y 96 o la cadena complementaria de las SEQ ID 40 NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94 y 96, y seguir codificando un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95 y 97. Dichas secuencias de ADN variantes pueden resultar de mutaciones silenciosas que se producen durante la producción, o pueden ser el producto de mutagénesis deliberadas de estas secuencias. 45
En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico de la presente divulgación comprende un polinucleótido que tiene la secuencia de polinucleótidos expuesta en las SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94 y 96 o la cadena complementaria de las SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94 y 50 96. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona moléculas de ácido nucleico que hibridan en condiciones rigurosas o moderadas con las regiones que codifican polipéptidos de las SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94 y 96 en las que el polipéptido codificado comprende una secuencia de aminoácidos tal como se expone en las SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 55 95 y 97 y en las que el polipéptido codificado mantiene una actividad de un polipéptido vActRIIB.
Moléculas de ácido nucleico de la divulgación incluyen ADN en forma tanto monocatenaria como bicatenaria, así como el complemento de ARN del mismo. El ADN incluye, por ejemplo, ADNc, ADN genómico, ADN sintético, ADN amplificado por PCR, y combinaciones de los mismos. El ADN genómico puede aislarse mediante técnicas 60 convencionales, tales como usando el ADN de la SEQ ID NO: 1 o 17, o un fragmento adecuado del mismo, como sonda. El ADN genómico que codifica polipéptidos ActRIIB se obtiene de bibliotecas genómicas que están disponibles de una serie de especies. El ADN sintético está disponible de síntesis química de fragmentos de oligonucleótidos solapantes seguidos por ensamblaje de los fragmentos para reconstituir parte o todo de las regiones codificantes y secuencias flanqueantes. El ARN puede obtenerse a partir de vectores de expresión 65 procariotas que dirigen síntesis de alto nivel de ARNm, tales como vectores que usan promotores de T7 y ARN polimerasa. El ADNc se obtiene de bibliotecas preparadas a partir de ARNm aislado de diversos tejidos que expresan ActRIIB. Las moléculas de ADN de la divulgación incluyen genes de longitud completa, así como polinucleótidos y fragmentos de los mismos. El gen de longitud completa también puede incluir secuencias que codifican la secuencia señal N-terminal.
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En otro aspecto de la presente divulgación, también se proporcionan vectores de expresión que contienen las secuencias de ácido nucleico, y células hospedadoras transformadas con dichos vectores y métodos de producción de los polipéptidos vActRIIB. La expresión "vector de expresión" se refiere a un plásmido, fago, virus o vector para expresar un polipéptido a partir de una secuencia de polinucleótido. Los vectores para la expresión de los polipéptidos vActRIIB que contienen, como mínimo, secuencias requeridas para la propagación de vectores y para la 10 expresión del inserto clonado. Un vector de expresión comprende una unidad transcripcional que comprende un conjunto de (1) un elemento o elementos genéticos que tienen un papel regulador en la expresión génica, por ejemplo, promotores o potenciadores, (2) una secuencia que codifica polipéptidos vActRIIB a transcribir a ARNm y traducir a proteínas, y (3) secuencias de iniciación y terminación de la transcripción apropiadas. Estas secuencias pueden incluir además un marcador de selección. Vectores adecuados para la expresión en células hospedadoras 15 están fácilmente disponibles y las moléculas de ácido nucleico se insertan en los vectores usando técnicas de ADN recombinante estándar. Dichos vectores pueden incluir promotores que funcionan en tejidos específicos, y vectores virales para la expresión de vActRIIB en células humanas o animales diana. Un vector de expresión ejemplar adecuado para la expresión de vActRIIB es el pDSRa, (descrito en el documento WO 90/14363) y sus derivados, que contienen polinucleótidos vActRIIB, así como cualesquiera vectores adecuados adicionales conocidos en la 20 técnica o descritos a continuación.
La solicitud proporciona, además, métodos de preparación de polipéptidos vActRIIB. Pueden utilizarse diversos otros sistemas de expresión/hospedadores. Estos sistemas incluyen, aunque sin limitarse a, microorganismos tales como bacterias transformadas con bacteriófagos recombinantes, vectores de expresión de ADN plasmídicos o cosmídicos; 25 levaduras transformadas con vectores de expresión en levaduras; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus); sistemas de células vegetales transfectadas con vectores de expresión en virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmido Ti o pBR322); o sistemas de células animales. Células de mamífero útiles en la producción de proteínas recombinantes incluyen, aunque sin limitarse a, 30 células VERO, células HeLa, líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO), o sus derivados tales como Veggie CHO y líneas celulares relacionadas que crecen en medios libres de suero (véase Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28: 31) o la cepa de CHO DX-B11, que es deficiente en DHFR (véase Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 77: 4216-20) células COS tales como la línea COS-7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651) (véase Gluzman et al., 1981, Cell 23: 175), líneas celulares W138, BHK, HepG2, 3T3 (ATCC CCL 163), RIN, 35 MDCK, A549, PC12, K562, células L, células C127, BHK (ATCC CRL 10), la línea celular CV1/EBNA derivada de la línea celular de riñón de mono verde africano CV1 (ATCC CCL 70) (véase McMahan et al., 1991, EMBO J. 10: 2821), líneas celulares de riñón embrionario humano tales como 293, 293 EBNA o MSR 293, células A431 epidérmicas humanas, células Colo205 humanas, otras líneas celulares de primate transformadas, células diploides normales, estirpes de células derivadas de cultivo in vitro de tejido primario, explantes primarios, células HL-60, 40 U937, HaK o Jurkat. La expresión en mamíferos permite la producción de polipéptidos secretados o solubles que pueden recuperarse del medio de cultivo.
Usando un sistema de hospedador-vector apropiado, se producen polipéptidos vActRIIB de forma recombinante cultivando una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que contiene las moléculas de ácido 45 nucleico de la presente divulgación en condiciones que permiten la producción. Las células transformadas pueden usarse para producción de polipéptidos de alto rendimiento, a largo plazo. Una vez que dichas células están transformadas con vectores que contienen marcadores seleccionables, así como la casete de expresión deseada, se puede permitir crecer a las células durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de que se cambien a un medio selectivo. El marcador seleccionable está diseñado para permitir el crecimiento y la recuperación de células que 50 expresan con éxito las secuencias introducidas. Se puede hacer proliferar masas resistentes de células transformadas de forma estable usando técnicas de cultivo tisular apropiadas para la línea celular empleada. Una visión de conjunto de la expresión de proteínas recombinantes se encuentra en el documento Methods of Enzymology, v. 185, Goeddell, D.V., ed., Academic Press (1990).
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En algunos casos, tales como en la expresión usando sistemas procariotas, puede ser necesario “replegar” y oxidar los polipéptidos expresados de esta divulgación a una estructura terciaria apropiada y generarse puentes disulfuro con el fin de ser biológicamente activa. El replegamiento puede conseguirse usando una serie de procedimientos bien conocidos en la técnica. Dichos procedimientos incluyen, por ejemplo, exponer al polipéptido solubilizado a un pH habitualmente por encima de 7 en presencia de un agente caotrópico. La selección del caótropo es similar a las 60 elecciones usadas para solubilización del cuerpo de inclusión, sin embargo un caótropo se usa normalmente a una concentración más baja. Son agentes caotrópicos ejemplares guanidina y urea. En la mayoría de los casos, la solución de replegamiento/oxidación también contendrá un agente de reducción más su forma oxidada en una relación específica para generar un potencial redox particular, lo que permite que se produzca el reordenamiento de disulfuros para la formación de puentes de cisteína. Algunos pares redox usados habitualmente incluyen 65 cisteína/cistamina, glutatión/ditiobisGSH, cloruro cúprico, ditiotreitol DTT/ditiano DTT, y 2-mercaptoetanol (bME)/ditio-bME. En muchos casos, puede usarse un codisolvente para incrementar la eficiencia del replegamiento. Los codisolventes usados habitualmente incluyen glicerol, polietilenglicol de diversos pesos moleculares, y arginina.
Además, los polipéptidos pueden sintetizarse en solución o sobre un soporte sólido de acuerdo con técnicas convencionales. Diversos sintetizadores automáticos están disponibles en el mercado y pueden usarse de acuerdo 5 con protocolos conocidos. Véase, por ejemplo, Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª Ed., Pierce Chemical Co. (1984); Tam et al., J Am Chem Soc, 105: 6442, (1983); Merrifield, Science 232: 341-347 (1986); Barany y Merrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, eds, Academic Press, Nueva York, 1-284; Barany et al., Int J Pep Protein Res, 30: 705-739 (1987).
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Los polipéptidos y proteínas de la presente divulgación pueden purificarse de acuerdo con técnicas de purificación de proteínas que son bien conocidas para los expertos en la materia. Estas técnicas implican, a un nivel, el fraccionamiento en bruto de las fracciones proteicas y no proteicas. Habiendo separado los polipéptidos peptídicos de otras proteínas, el péptido o polipéptido de interés puede purificarse adicionalmente usando técnicas cromatográficas y electroforéticas para conseguir purificación parcial o completa (o purificación hasta 15 homogeneidad). La expresión "polipéptido aislado" o "polipéptido purificado", tal como se usa en el presente documento, pretende referirse a una composición, aislable de otros componentes, en la que el polipéptido se purifica a cualquier grado con respecto a su estado obtenible de forma natural. Un polipéptido purificable también se refiere, por lo tanto, a un polipéptido que está libre del entorno en el que puede originarse de forma natural. Generalmente, "purificado/a" se referirá a una composición polipeptídica que ha sido sometida a fraccionamiento para eliminar 20 diversos otros componentes, y una composición que sustancialmente conserva su actividad biológica expresada. Donde se usa la expresión "sustancialmente purificado/a", esta designación se referirá a una composición peptídica o polipeptídica en la que el polipéptido o péptido forma el componente fundamental de la composición, tal como constituyendo aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, o aproximadamente el 90 % o más de las proteínas en la composición. 25
Diversas técnicas adecuadas para uso en purificación serán bien conocidas por to los expertos en la materia. Éstas incluyen, por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio, PEG, anticuerpos (inmunoprecipitación) y similares o mediante desnaturalización con calor, seguida por centrifugado; cromatografía tal como cromatografía por afinidad (columnas de Proteína-A), de intercambio iónico, filtración en gel, fase inversa, hidroxilapatita, cromatografía de 30 interacción hidrófoba; enfoque isoeléctrico; electroforesis en gel; y combinaciones de estas técnicas. Tal como se conoce generalmente en la técnica, se cree que el orden en que se llevan a cabo las diversas etapas de purificación se puede cambiar, o que ciertas etapas se pueden omitir, y seguir dando como resultado un método adecuado para la preparación de un polipéptido sustancialmente purificado. Se proporcionan etapas de purificación ejemplares en los ejemplos a continuación. 35
Diversos métodos para cuantificar el grado de purificación de polipéptido serán conocidos por los expertos en la materia a la luz de la presente divulgación. Estos incluyen, por ejemplo, determinar la actividad de unión específica de una fracción activa, o evaluar la cantidad de péptido o polipéptido dentro de una fracción mediante análisis SDS/PAGE. Un método preferido para evaluar la pureza de una fracción polipeptídica es calcular la actividad de 40 unión de la fracción, para compararla con la actividad de unión del extracto inicial, y para, de este modo, calcular el grado de purificación, evaluado en el presente documento mediante un "número de veces de purificación". Las unidades reales usadas para representar la cantidad de actividad de unión dependerá, por supuesto, de la técnica de ensayo particular seleccionada para seguir la purificación y si el polipéptido o péptido exhibe o no una actividad de unión detectable. 45
Polipéptidos de activina de tipo IIB variantes se unen a ligandos que activan cascadas de degradación muscular. Polipéptidos vActRIIB capaces de unirse a, e inhibir, la actividad de los ligandos activina A, miostatina y/o GDF-11, tienen potencial terapéutico contra las enfermedades que implican atrofia muscular, así como el tratamiento de ciertos cánceres, y otras enfermedades tal como se muestra en los ejemplos a continuación. 50
Sin embargo, la agregación puede producirse cuando se expresan o se purifican polipéptidos ActRIIB o ActRIIB5 de tipo silvestre. Esta agregación incluye formación de oligómeros estructurados durante la expresión y la generación de agregados no estructurados tanto durante la expresión como después de la purificación de polipéptidos.
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Los enfoques combinados de análisis estructural, modelización molecular, y espectrometría de masas han indicado que puede surgir multimerización en polipéptidos ActRIIB mediante la formación de puentes disulfuro intermoleculares ayudada mediante interacciones electrostáticas y por puentes de hidrógeno entre polipéptidos ActRIIB no glucosilados. Existen puentes de hidrógeno significativos en la interfaz de dos moléculas de ActRIIB; entre la cadena lateral de E28 en un ActRIIB y la cadena lateral de R40 en el otro ActRIIB, por ejemplo. Además, 60 existen interacciones electrostáticas críticas entre E28 en un ActRIIB y R40 en el otro ActRIIB.
Estas interacciones electrostáticas pueden contribuir significativamente a incrementar la población de dímeros de ActRIIB temporales, dando como resultado la promoción de formación de enlaces no covalentes y/o covalentes entre unidades de ActRIIB. La interacción entre los residuos 28 y 40 es la más crítica entre estas interacciones, dado que 65 estos dos residuos están implicados en puentes de hidrógeno dobles y una interacción electrostática fuerte. Los residuos 28 y 40 están implicados en interacciones ActRIIB:ActRIIB y no en interacciones ActRIIB:ligando. Por lo tanto, los residuos 28 y 40 pueden sustituirse con aminoácidos no nativos de acuerdo con la divulgación, para mejorar la solubilidad, y reducir la agregación de los polipéptidos receptores. Por lo tanto, E28 y R40 se sustituyeron respectivamente con otros posibles aminoácidos naturales, expresados, y ensayados por Biacore, tal como se muestra a continuación. La unión determinada por Biacore se muestra en las tablas 1A y 1B en el ejemplo 2 a 5 continuación. Además, el porcentaje de agregación de los polipéptidos vActRIIB se determina a continuación.
Los resultados en los ejemplos a continuación, muestran agregación reducida para polipéptidos y proteínas vActRIIB que tienen las sustituciones de aminoácidos descritas en el presente documento, mientras que conservan la capacidad de unirse a y neutralizar miostatina, activina A o GDF-11. 10
Anticuerpos
La presente divulgación incluye además anticuerpos que se unen específicamente a polipéptidos ActRIIB variantes, incluyendo aquellos que se unen específicamente a los polipéptidos vActRIIB de la presente divulgación. Tal como 15 se usa en el presente documento, la expresión "se unen específicamente" se refiere a anticuerpos que tienen una afinidad de unión (Ka) por polipéptidos vActRIIB de 106 M-1 o mayor. Tal como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a anticuerpos intactos que incluyen anticuerpos policlonales (véase, por ejemplo Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lane (eds), Cold Spring Harbor Press, (1988)) y anticuerpos monoclonales (véase, por ejemplo, patentes de Estados Unidos N.° RE 32.011, 4.902.614, 4.543.439 y 4.411.993 y 20 Monoclonal Antibodies: A New Dimension in Biological Analysis, Plenum Press, Kennett, McKearn y Bechtol (eds.) (1980)). Tal como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" también se refiere a un fragmento de un anticuerpo, tal como F(ab), F(ab'), F(ab')2 Fv, Fc y anticuerpos monocatenarios que se producen mediante técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. El término "anticuerpo" también se refiere a anticuerpos biespecíficos o bifuncionales, que son un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos 25 pares de cadena pesada/ligera diferentes y dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos biespecíficos se pueden producir mediante diversos métodos, incluyendo fusión de hibridomas o enlace de fragmentos Fab'. (Véase, Songsivilai et al., Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny et al., J. ImmunoI. 148: 1547-1553 (1992)).
Tal como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" también se refiere a anticuerpos quiméricos, es 30 decir, anticuerpos que tienen un dominio de inmunoglobulina de anticuerpo constante humano acoplado a uno o más dominios de inmunoglobulina de anticuerpo variable no humano o fragmentos de los mismos (véanse, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 5.595.898 y la patente de Estados Unidos N.° 5.693.493). Los anticuerpos también se refieren a anticuerpos "humanizados" (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 5.595.898 y el documento WO 5.693.493), minicuerpos (documento WO 94/09817), maxicuerpos y anticuerpos producidos por 35 animales transgénicos, en los cuales un animal transgénico que contiene una parte del anticuerpo humano que produce genes pero que carece de la producción de anticuerpos endógenos es capaz de producir anticuerpos humanos (véase, por ejemplo, Mendez et al., Nature Genetics 15: 146-156 (1997) y patente de Estados Unidos N.° 6.300.129). El término "anticuerpos" también incluye anticuerpos multiméricos o un complejo de proteínas de orden superior, tal como anticuerpos heterodiméricos y anticuerpos anti-idiotípicos. "Anticuerpos" también incluye 40 anticuerpos anti-idiotípicos. Los anticuerpos contra vActRIIB también se pueden usar, por ejemplo, para identificar y cuantificar vActRIIB in vitro e in vivo.
También están incluidos anticuerpos policlonales de cualquier mamífero, por ejemplo anticuerpos de ratón y de rata, y anticuerpos de conejo, que se unen específicamente a los polipéptidos vActRIIB descritos en el presente 45 documento, incluyendo las SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95 y 97.
Dichos anticuerpos son útiles como herramientas de investigación y en ensayos cuantitativos para detectar y ensayar los polipéptidos desvelados en el presente documento. Dichos anticuerpos se preparan usando métodos 50 descritos anteriormente y tal como se conoce en la técnica.
Composiciones farmacéuticas
Las composiciones farmacéuticas que contienen los polipéptidos y proteínas vActRIIB de la presente invención 55 también se proporcionan. Dichas composiciones comprenden una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz del polipéptido o proteína en mezcla con materiales farmacéuticamente aceptables y materiales de formulación fisiológicamente aceptables. La composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución o liberación, adsorción o penetración de la composición. Los materiales de 60 formulación adecuados incluyen, aunque sin limitarse a, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina); antimicrobianos; antioxidantes (tales como ácido ascórbico, sulfito de sodio o hidrógeno-sulfito de sodio); tampones (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCI, citratos, fosfatos, otros ácidos orgánicos); agentes de volumen (tales como manitol o glicina), agentes quelantes (tales como ácido etilendiamina tetraacético (EDTA)); agentes de formación de complejos (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-65 betaciclodextrina); cargas; monosacáridos; disacáridos y otros carbohidratos (tales como glucosa, manosa o dextrinas); proteínas (tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas); agentes colorantes; saborizantes y diluyentes; agentes emulsionantes; polímeros hidrófilos (tales como polivinilpirrolidona); polipéptidos de peso molecular bajo; contraiones formadores de sales (tales como sodio); conservantes (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno); disolventes (tales como glicerina, propilenglicol o 5 polietilenglicol); alcoholes de azúcar (tales como manitol o sorbitol); agentes de suspensión; tensioactivos o agentes humectantes (tales como plurónicos, PEG, esteres de sorbitán, polisorbatos tales como polisorbato 20, polisorbato 80, tritón, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes potenciadores de la estabilidad (sacarosa o sorbitol); agentes potenciadores de la tonicidad (tales como haluros de metales alcalinos (preferentemente cloruro de sodio o de potasio, manitol sorbitol); vehículos de administración; diluyentes; excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos. 10 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edición, AR. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990).
La composición farmacéutica óptima será determinada por un experto en la materia dependiendo de, por ejemplo, la vía de administración pretendida, el formato de administración y la dosis deseada. Véase por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, mencionado anteriormente. Dichas composiciones pueden influir sobre el estado físico, 15 estabilidad, velocidad de liberación in vivo y velocidad de aclaramiento in vivo del polipéptido. Por ejemplo, las composiciones adecuadas pueden ser agua para inyección, solución salina fisiológica para administración parenteral.
El vehículo o transportador primario en una composición farmacéutica puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. 20 Por ejemplo, un vehículo o transportador adecuado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica o líquido cefalorraquídeo artificial, posiblemente suplementado con otros materiales comunes en composiciones para administración parenteral. La solución salina tamponada neutra o la solución salina mezclada con albúmina sérica son vehículos ejemplares adicionales. Otras composiciones farmacéuticas ejemplares comprenden tampón Tris de aproximadamente pH 7,0-8,5 o tampón de acetato de aproximadamente pH 4,0-5,5, que pueden incluir además 25 sorbitol o un sustituto adecuado del mismo. En un aspecto de la presente divulgación, las composiciones se pueden preparar para almacenamiento mezclando la composición seleccionada que tiene el grado deseado de pureza con agentes de formulación opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, mencionado anteriormente) en forma de una torta liofilizada o una solución acuosa. Además, la composición terapéutica se puede formular como un liofilizado usando excipientes apropiados, tales como sacarosa. 30
Las formulaciones se pueden administrar mediante diversos métodos, por ejemplo, mediante terapias de inhalación, por vía oral o mediante inyección. Cuando se contempla la administración parenteral, las composiciones terapéuticas para uso en esta divulgación pueden estar en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable libre de pirógenos que comprende el polipéptido deseado en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo 35 particularmente adecuado para inyección parenteral es agua destilada estéril en la cual un polipéptido se formula como una solución isotónica estéril, conservada de forma apropiada. Otra preparación más puede implicar la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bioerosionables, compuestos poliméricos (ácido poliláctico, ácido poliglicólico), perlas o liposomas, que proporciona la liberación controlada o sostenida del producto que se puede administrar, a continuación, a través de una inyección de 40 liberación prolongada. También se puede usar ácido hialurónico y éste puede tener el efecto de promover la duración sostenida en la circulación. Otros medios adecuados para la introducción de la molécula deseada incluyen dispositivos de administración de fármacos implantables.
En otro aspecto, las formulaciones farmacéuticas adecuadas para administración inyectable se pueden formular en 45 soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles, tales como solución de Hank, solución de Ringer o solución salina tamponada fisiológicamente. Las suspensiones para inyección acuosa pueden contener sustancias que incrementan la viscosidad de la suspensión, tales como carboxilmetilcelulosa sódica, sorbitol o dextrano. Adicionalmente, las suspensiones de los compuestos activos se pueden preparar como suspensiones para inyección oleosa apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites 50 grasos, tales como aceite de sésamo o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo, triglicéridos o liposomas. También se pueden usar polímeros amino policatiónicos no lipídicos para administración. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados para incrementar la solubilidad de los compuestos y permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. En otro aspecto, una composición farmacéutica se puede formular para inhalación. Las soluciones de inhalación también se pueden formular con un 55 propulsor para administración por aerosol. En otro aspecto más, las soluciones se pueden nebulizar. La administración pulmonar se describe adicionalmente en la solicitud PCT N.° PCT/US94/001875, que describe administración pulmonar de proteínas modificadas químicamente.
También se contempla que ciertas formulaciones se puedan administrar por vía oral. En una realización de la 60 presente divulgación, las moléculas que se administran de esta manera se pueden formular con o sin aquellos transportadores usados de forma habitual en la preparación de compuestos de formas de dosificación sólidas, tales como comprimidos y cápsulas. Por ejemplo, se puede diseñar una cápsula para liberar la parte activa de la formulación en el punto en el tracto gastrointestinal en el que la biodisponibilidad está maximizada y la degradación presistémica está minimizada. Los agentes adicionales se pueden incluir para facilitar la absorción de la molécula 65 terapéutica. También pueden emplearse diluyentes, saborizantes, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes disgregantes de comprimidos y aglutinantes. Las composiciones farmacéuticas para administración oral también pueden formularse usando transportadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica en dosis adecuadas para administración oral. Dichos transportadores permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas semilíquidas, suspensiones y similares, para ingestión por el paciente. 5
Las preparaciones farmacéuticas para uso oral pueden obtenerse a través de la combinación de compuestos activos con excipientes sólidos y procesando la mezcla resultante de gránulos (opcionalmente, después de molienda) para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Se pueden añadir sustancias auxiliares adecuadas, si se desea. Los excipientes adecuados incluyen cargas de carbohidrato o proteína, tales como azúcares, incluyendo, lactosa, 10 sacarosa, manitol y sorbitol, almidón de maíz, trigo, arroz, patata u otras plantas; celulosa, tal como metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximetilcelulosa sódica; gomas, incluyendo goma arábiga y goma de tragacanto; y proteínas, tales como gelatina y colágeno. Si se desea, se pueden añadir agentes disgregantes o solubilizantes, tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar y ácido algínico o una sal de los mismos, tal como alginato de sodio.
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Los núcleos de grageas se pueden usar junto con revestimientos adecuados, tales como soluciones de azúcar concentradas, que también pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones de laca y disolventes orgánicos o mezclas de disolventes adecuadas. Pueden añadirse colorantes o pigmentos a los revestimientos de comprimidos o grageas para identificación de producto o para caracterizar la cantidad de compuesto activo, es decir, la dosis. 20
Las preparaciones farmacéuticas que se pueden usar por vía oral también incluyen cápsulas duras hechas de gelatina, así como también cápsulas blandas selladas hechas de gelatina y un revestimiento, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener ingredientes activos mezclados con cargas o aglutinantes, tales como lactosa o almidones, lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En 25 cápsulas blandas, los compuestos activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, líquidos o polietilenglicol líquido con o sin estabilizantes.
Las composiciones farmacéuticas adicionales serán evidentes para los expertos en la materia, incluyendo formulaciones que implican polipéptidos en formulaciones de administración sostenida o controlada. Las técnicas 30 para formular diversos medios de administración sostenida o controlada diferentes, tales como transportadores de liposoma, micropartículas bioerosionables o perlas porosas e inyecciones de liberación prolongada, también son conocidas por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, el documento PCT/US93/00829 que describe la liberación controlada de micropartículas poliméricas porosas para la administración de composiciones farmacéuticas. Ejemplos adicionales de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices poliméricas 35 semipermeables en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, poliláctidos (documentos U.S. 3.773.919, EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22: 547-556 (1983), poli (2-hidroxietil-metacrilato) (Langeretal., J. Biomed. Matee. Res., 15: 167-277, (1981); Langer et al., Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)), acetato de etilenvinilo (Langer et al., mencionado anteriormente) o ácido poli-D(-)-3hidroxibutírico 40 (documento EP 133.988). Las composiciones de liberación sostenida también incluyen liposomas, que pueden prepararse mediante cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, el documento Eppstein el al., PNAS (EE.UU.), 82: 3688 (1985); documentos EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949.
La composición farmacéutica que se usará para administración in vivo normalmente debe ser estéril. Esto se puede 45 conseguir mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Cuando la composición está liofilizada, la esterilización usando este método se puede llevar a cabo antes o después de la liofilización y reconstitución. La composición para administración parenteral se pueda almacenar en forma liofilizada o en solución. Además, las composiciones parenterales en general se colocan en un recipiente que tiene un orificio de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de solución intravenosa que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección 50 hipodérmica.
Una vez que se ha formulado la composición farmacéutica, la misma se puede almacenar en viales estériles como una solución, suspensión, gel, emulsión, un sólido o un polvo deshidratado o liofilizado. Dichas formulaciones pueden almacenarse en una forma lista para usar o en una forma (por ejemplo, liofilizada) que requiere 55 reconstitución antes de la administración.
En un aspecto específico, la presente divulgación se refiere a kits para producir una unidad de administración de dosis única. Los kits pueden contener, cada uno, tanto un primer recipiente que tiene una proteína seca como un segundo recipiente que tiene una formulación acuosa. Dentro del alcance de esta divulgación también se incluyen 60 kits que contienen jeringas precargadas de cámara única o multicámaras (por ejemplo, jeringas de líquido y liojeringas).
Una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que empleará terapéuticamente dependerá, por ejemplo, del contexto terapéutico y los objetivos. Un experto en la materia apreciará que los niveles de dosis apropiados para 65 tratamiento variarán por lo tanto, dependiendo, en parte, de la molécula administrada, la indicación para la cual el polipéptido se está usando, la vía de administración y el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño de órgano) y el estado (edad y estado de salud general) del paciente. Por consiguiente, el facultativo puede valorar cuantitativamente la dosis y modificar la vía de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosis típica puede variar de aproximadamente 0,1 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Las composiciones polipeptídicas pueden inyectarse, preferentemente, o 5 administrarse por vía intravenosa. Las composiciones farmacéuticas de acción prolongada pueden administrarse cada tres a cuatro días, cada semana o cada dos semanas dependiendo de la semivida y la velocidad de aclaramiento de la formulación particular. La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos del polipéptido en la formulación usada. Normalmente, una composición se administra hasta que se consiga una dosis que consigue el efecto deseado. La composición, por lo tanto, puede administrarse como una 10 sola dosis o como dosis múltiples (a concentraciones/dosis iguales o diferentes) a lo largo del tiempo o como una infusión continua. El afinamiento adicional de la dosis apropiada se realiza de forma rutinaria. Las dosis apropiadas se pueden determinar a través del uso de datos de dosis-respuesta apropiados.
La vía de administración de la composición farmacéutica está de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo por 15 vía oral, a través de inyección por vías intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimática), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial, intraportal, intralesional, por vía intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutánea o intraperitoneal; así como también por medios intranasales, enterales, tópicos, sublinguales, uretrales, vaginales o rectales, mediante sistemas de liberación sostenida o mediante dispositivos de implante. Cuando se desee, las composiciones pueden administrarse mediante inyección 20 en embolada o de forma continua mediante infusión o mediante un dispositivo de implante. Como alternativa o adicionalmente, la composición puede administrarse por vía local a través del implante de una membrana, esponja u otro material apropiado en el cual se ha absorbido o encapsulado la molécula deseada. Cuando se usa un dispositivo de implante, el dispositivo puede implantarse en cualquier tejido u órgano adecuado y la administración de la molécula deseada puede ser a través de difusión, embolada de liberación temporizada o administración 25 continua.
En algunos casos, los polipéptidos vActRIIB de la presente divulgación pueden administrarse implantando determinadas células que han sido manipuladas genéticamente, usando métodos tales como los descritos en el presente documento, para expresar y secretar el polipéptido. Dichas células pueden ser células animales o humanas 30 y pueden ser autólogas, heterólogas o xenógenas. Opcionalmente, las células pueden ser inmortalizadas. Con el fin de reducir la posibilidad de una respuesta inmunitaria, las células pueden encapsularse para evitar la infiltración de tejidos circundantes. Los materiales de encapsulación son normalmente compartimentos o membranas poliméricas semipermeables biocompatibles que permiten la liberación del producto o productos polipeptídicos pero evitan la destrucción de las células mediante el sistema inmunitario del paciente o mediante otros factores dañinos de los 35 tejidos circundantes.
También se prevé la terapia génica in vivo de vActRIIB, en la que una molécula de ácido nucleico que codifica vActRIIB o una variante o un derivado de vActRIIB se introducen directamente en el sujeto. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica un vActRIIB se introduce en células diana a través de inyección local de 40 una construcción de ácido nucleico con o sin un vector de administración apropiado, tal como un vector de virus adenoasociado. Los vectores virales alternativos incluyen, aunque no se limitan a, vectores de retrovirus, adenovirus, virus del herpes simple y virus del papiloma. La transferencia física del vector de virus puede conseguirse in vivo mediante inyección local de la construcción de ácido nucleico deseada u otro vector de administración apropiado que contiene la secuencia de ácido nucleico deseada, transferencia mediada por 45 liposomas, inyección directa (ADN desnudo) o bombardeo con micropartículas (pistola génica).
Usos de composiciones de vActRIIB
La presente divulgación proporciona métodos y composiciones farmacéuticas para reducir o neutralizar la cantidad o 50 actividad de miostatina, activina A o GDF-11 in vivo e in vitro poniendo en contacto los polipéptidos con el polipéptido vActRIIB. Los polipéptidos vActRIIB tienen una elevada afinidad por miostatina, activina A y GDF-11, y son capaces de reducir e inhibir las actividades biológicas de al menos uno de miostatina, activina A y GDF-11. En algunos aspectos, los polipéptidos vActRIIB muestran actividad mejorada en comparación con los polipéptidos de ActRIIB de tipo silvestre. Esto se demuestra en los ejemplos a continuación. 55
En un aspecto, la presente divulgación proporciona métodos y reactivos para tratar trastornos relacionados con miostatina y/o relacionados con activina A en un sujeto que necesita dicho tratamiento administrando una dosis eficaz de una composición de vActRIIB al sujeto. Tal como se usa en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a cualquier animal, tal como mamíferos, incluyendo seres humanos. 60
Las composiciones de la presente divulgación se usan para incrementar la masa muscular magra como un porcentaje de peso corporal y reducir la masa grasa como porcentaje de peso corporal.
Los trastornos que pueden tratarse mediante una composición de vActRIIB incluyen, aunque sin limitarse a, diversas 65 formas de pérdida muscular, así como trastornos metabólicos tales como diabetes y trastornos relacionados, y enfermedades degenerativas óseas tales como osteoporosis. Las composiciones de vActRIIB han demostrado ser eficaces para tratar trastornos de pérdida muscular en diversos modelos de enfermedad expuestos en el ejemplo 3 a continuación. Esto se demostró en el tratamiento de pérdida muscular en ratones con inactivación de inhibina-α, tratamiento de pérdida muscular en modelos de caquexia cancerosa de colon-26, prevención de atrofia muscular en modelo de suspensión de la extremidad posterior, tratamiento de una hembra OXV que muestra un incremento de la 5 masa muscular magra, reducción de la masa grasa e incremento del contenido mineral óseo.
Los trastornos de pérdida muscular también incluyen distrofias tales como distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular progresiva, distrofia muscular de tipo Becker, distrofia muscular de Dejerine-Landouzy, distrofia muscular de Erb, y distrofia muscular neuroaxonal infantil. Trastornos de pérdida muscular adicional surgen a partir de 10 enfermedades o trastornos crónicos tales como esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, cáncer, SIDA, insuficiencia renal, atrofia de órganos, supresión androgénica y artritis reumatoide.
La sobreexpresión de miostatina y/o activina puede contribuir a la caquexia, síndrome de pérdida muscular y grasa grave. La eficacia de los polipéptidos vActRIIB en el tratamiento de caquexias en modelos animales se muestra en el 15 ejemplo 3. La caquexia también surge debido a artritis reumatoide, nefropatía diabética, insuficiencia renal, quimioterapia, lesión debida a quemaduras, así como otras causas. En otro ejemplo, se descubrió que las concentraciones séricas e intramusculares de proteína inmunorreactiva miostatina se incrementaban en hombres que mostraban pérdida muscular relacionada con SIDA y estaba relacionada de forma inversa con la masa libre de grasa ((Gonzalez-Cadavid et al., PNAS EE. UU. 95: 14938-14943 (1998)). También se ha demostrado que los 20 niveles de miostatina se incrementan en respuesta a lesiones por quemaduras, dando como resultado un efecto muscular catabólico (Lang et al, FASEB J 15, 1807-1809 (2001)). Las afecciones adicionales que dan como resultado la pérdida muscular pueden surgir de inactividad debido a incapacidad tal como confinamiento en una silla de ruedas, reposo en cama prolongado debido a ictus, enfermedad, lesión de médula espinal, fractura ósea o traumatismo y atrofia muscular en un entorno de microgravedad (vuelo espacial). Por ejemplo, se descubrió que la 25 proteína inmunorreactiva miostatina en plasma se incrementa después de reposo en cama prolongado (Zachwieja et al. J G ravit Physiol. 6 (2): 11 (1999). También se descubrió que los músculos de ratas expuestas a un entorno de microgravedad durante un vuelo espacial expresaban una cantidad incrementada de miostatina en comparación con los músculos de ratas que no estaban expuestas (Lalani et al., J. Endocrin 167 (3): 417-28 (2000)).
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Además, los incrementos relacionados con la edad en relaciones de grasa con respecto a músculo y la atrofia muscular asociada a la edad parecen estar relacionados con la miostatina. Por ejemplo, la proteína inmunorreactiva miostatina sérica promedio se incrementaba con la edad en grupos de hombres y mujeres jóvenes (19-35 años de edad), de mediana edad (36-75 años de edad) y ancianos (76-92 años de edad), mientras que la masa muscular promedio y la masa libre de grasa se reducían con la edad en estos grupos (Yarasheski et al. J Nutr Aging 6 (5): 35 343-8 (2002)). Además, se ha descubierto ahora que la miostatina se expresa a niveles bajos en músculo cardíaco y la expresión está regulada positivamente en cardiomiocitos después de un infarto (Sharma et al., J Cell Physiol. 180 (1): 1-9 (1999)). Por lo tanto, la reducción de los niveles de miostatina en el músculo cardíaco puede mejorar la recuperación del músculo cardíaco después de un infarto.
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La miostatina parece influir también sobre los trastornos metabólicos incluyendo diabetes de tipo 2, diabetes mellitus no dependiente de insulina, hiperglucemia y obesidad. Por ejemplo, se ha demostrado que la carencia de miostatina mejora los fenotipos obeso y diabético de dos modelos de ratón (Yen et al. FASEB J. 8: 479 (1994). Se ha demostrado en la solicitud de Estados Unidos n.º de serie: 11/590.962, publicación de solicitud de Estados Unidos n.º: 2007/0117130, que los vectores AAV-ActRIIB5 incrementan la relación de músculo con respecto a grasa en un 45 animal, en particular para modelos animales obesos. Los polipéptidos vActRIIB de la presente divulgación, tales como SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95 son adecuados para dichos usos. Por lo tanto, la reducción de la composición de grasa mediante la administración de las composiciones de la presente divulgación mejorará las afecciones diabetes, obesidad e hiperglucémicas en animales. Además, composiciones que contienen los polipéptidos vActRIIB pueden 50 reducir la ingesta de alimentos en individuos obesos, tal como se demuestra en la solicitud de Estados Unidos n.º de serie: 11/590.962, publicación de solicitud de Estados Unidos n.º: 2007/0117130 para el polipéptido de ActRIIB5.
Administrar los polipéptidos ActRIIB de la presente divulgación puede mejorar la resistencia ósea y reducir la osteoporosis y otras enfermedades óseas degenerativas. Esto se ha demostrado en el modelo en ratón OVX 55 descrito a continuación. También se ha descubierto, por ejemplo, que los ratones deficientes en miostatina incrementaban el contenido de minerales y la densidad del húmero de ratón e incrementaban el contenido mineral de hueso tanto trabecular como cortical en las regiones donde se fijan los músculos, así como masa muscular incrementada (Hamrick et al. Calcif Tissue Int 71(1): 63-8 (2002)). Además, las composiciones de vActRIIB de la presente divulgación pueden usarse para tratar los efectos de la supresión androgénica tal como terapia de 60 supresión androgénica usada para el tratamiento del cáncer de próstata.
La presente divulgación también proporciona métodos y composiciones para incrementar la masa muscular en animales para alimentación mediante la administración de una dosis eficaz de las proteínas vActRIIB al animal. Debido a que el polipéptido de miostatina C-terminal maduro es idéntico en todas las especies ensayadas, se 65 esperaría que las proteínas vActRIIB fueran eficaces para incrementar la masa muscular y reducir la grasa en cualquier especie importante para la agricultura incluyendo ganado, pollos, pavos y cerdos.
Los polipéptidos y composiciones de vActRIIB de la presente divulgación también antagonizan la actividad de activina A. Se conoce que la activina A se expresa en ciertos tipos de cánceres, particularmente tumores gonadales tales como carcinomas ováricos y que causan caquexia grave (Ciprano et al. Endocrinol141 (7): 2319-27 (2000), 5 Shou el al., Endocrinol138 (11): 5000-5 (1997); Coerver et al, Mol Endocrinol 10 (5): 534-43 (1996); Ito et al. British J Cancer 82 (8): 1415-20 (2000), Lambert-Messerllan, et al, Gynecologic Oncology 74: 93-7 (1999). En el ejemplo 3 a continuación, los polipéptidos vActRIIB de la presente divulgación han demostrado ser eficaces en el tratamiento de caquexia grave, reducción del tamaño del tumor y prolongación de la supervivencia en modelos en ratones con inactivación de inhibina-α y modelos en ratones con caquexia cancerosa de colon-26. Por lo tanto, las 10 composiciones de la presente divulgación pueden usarse para tratar afecciones relacionadas con la sobreexpresión de activina A, así como también sobreexpresión de miostatina, tales como caquexia a partir de ciertos cánceres y el tratamiento de determinados tumores de tipo gonadal.
Las composiciones de la presente divulgación pueden usarse en solitario o en combinación con otros agentes 15 terapéuticos para potenciar sus efectos terapéuticos o reducir los efectos secundarios potenciales. Estas propiedades incluyen actividad incrementada, solubilidad incrementada, degradación reducida, semivida incrementada, toxicidad reducida e inmunogenicidad reducida. Por lo tanto, las composiciones de la presente invención son útiles para regímenes de tratamiento prolongados. Además, las propiedades de hidrofilia e hidrofobia de los compuestos de la divulgación están bien equilibradas, potenciando de ese modo su utilidad para usos tanto in 20 vitro como especialmente in vivo. Específicamente, los compuestos de la divulgación tienen un grado apropiado de solubilidad en medios acuosos, lo que permite la absorción y biodisponibilidad en el organismo, a la vez que también tienen un grado de solubilidad en lípidos que permite que los compuestos atraviesen la membrana celular a un sitio de acción supuesto, tal como una masa muscular particular.
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Además, los polipéptidos vActRIIB de la presente divulgación son útiles para detectar y cuantificar miostatina, activina A o GDF-11 en cualquier cantidad de ensayos. En general, los polipéptidos ActRIIB de la presente invención son útiles como agentes de captura para unirse a e inmovilizar miostatina, activina A o GDF-11 en diversos ensayos, similares a los descritos, por ejemplo, en Asai, ed., Methods In Cell Biology, 37, Antibodies In Cell Biology, Academic Press, Inc., Nueva York (1993). Los polipéptidos pueden estar marcados de alguna manera o pueden reaccionar con 30 una tercera molécula, tal como un anticuerpo que está marcado para posibilitar que se detecte y se cuantifique la miostatina. Por ejemplo, un polipéptido o una tercera molécula pueden modificarse con un resto detectable, tal como biotina, que después puede unirse a una cuarta molécula, tal como estreptavidina marcada con enzima u otras proteínas (Akerstrom, J Immunol135: 2589 (1985); Chaubert, Mod Pathol 10: 585 (1997)).
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Habiendo descrito la divulgación, se ofrecen los siguientes ejemplos a modo de ilustración y no de limitación.
Ejemplo 1
Expresión y purificación de polipéptidos vActRIIB 40
Se usaron los siguientes métodos para expresar y purificar los polipéptidos ActRIIB variantes.
El ADNc del receptor de activina de tipo IIB humana se aisló de una biblioteca de ADNc de origen en los testículos humanos (Clontech, Inc.) y se clonó tal como se describe en la solicitud de Estados Unidos n.º de serie: 11/590.962, 45 publicación de solicitud de Estados Unidos n.º: 2007/0117130.
Determinación de sustituciones de aminoácidos
Los enfoques combinados de análisis estructural, modelización molecular y espectrometría de masas indicaron que 50 la agregación (oligomerización) puede surgir en ActRIIB a través de la formación de puentes disulfuro intermoleculares desencadenada mediante interacciones electrostáticas y de formación de puentes de H entre moléculas de ActRIIB no glucosiladas. Se determinó que los residuos 28 y 40 estaban implicados en interacciones ActRIIB:ActRIIB y no en interacciones de ActRIIB con sus ligandos.
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Inicialmente, E28 y R40 en ActRIIB-Fc se sustituyeron con A en cada posición. Los análisis de dispersión de la luz y espectrometría de masas confirmaron que la fracción de vActRIIB-IgG1Fc, E28A y vActRIIB-IgG1Fc R40A completamente glucosiladas se incrementaron de forma significativa en comparación con la proteína de tipo silvestre. E28A y R40A vActRIIB-IgG1Fc se incubaron a 37 °C durante 6 días, dando como resultado poca o ninguna agregación en comparación con el tipo silvestre. Las sustituciones de aminoácidos en las posiciones 28 y 40 (con 60 respecto a las SEQ ID NO: 2 y 18 con la secuencia señal) se realizaron para aliviar o prevenir la agregación que puede producirse durante la expresión o la purificación del ActRIIB de tipo silvestre (SEQ ID NO: 2 y 18). Esta agregación ha sido identificada como formación de oligómeros estructurados durante la expresión y generación de agregados no estructurados, tanto durante la expresión como después de la purificación de proteínas.
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Se determinó la agregación en diferentes fases de los procesos de producción y purificación usando cromatografía de exclusión por tamaño de acuerdo con los procedimientos a continuación.
Se usó el siguiente método ejemplar para producir los polipéptidos ActRIIB variantes (vActRIIB y vActRIIB5). Se fusionaron polinucleótidos que codifican el vActRIIB, E28W (SEQ ID NO: 23) a polinucleótidos que codifican el dominio IgG1 Fc humano (SEQ ID NO: 82) o polinucleótidos que codifican IgG2 Fc humano (SEQ ID NO: 84), 5 mediante una secuencia enlazadora bisagra (nucleótidos que codifican la SEQ ID NO: 79) usando extensión solapante por PCR usando cebadores que contienen la mutación que da como resultado E28W. La secuencia de polinucleótidos completa es la SEQ ID NO: 61. Fragmentos de ADN bicatenarios se subclonaron en pTT5 (Biotechnology Research Institute, National Research Council Canada (NRCC), 6100 Avenue Royalmount, Montreal (Quebec) Canadá H4P 2R2), pDSRα (descrito en el documento WO/9014363) y/o derivados de pDSRα. En otros 10 aspectos, polinucleótidos que codifican polipéptidos vActRIIB se fijaron a polinucleótidos que codifican el enlazador GGGGS (SEQ ID NO: 75) o multímeros de los mismos, y o enlazadores bisagra (tales como la SEQ ID NO: 79).
La expresión transitoria de vActRIIB-Fc y vActRIIB5-Fc genomanipulados se llevó a cabo de la siguiente manera.
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Las variantes genomanipuladas de las dos moléculas anteriores se expresaron de forma transitoria en células 293-6E adaptadas por suspensión libre de suero (National Research Council of Canada, Ottawa, Canadá) mantenidas en medio FreeStyle™ (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) suplementado con 250 µg/ml de geneticina (Invitrogen) y Pluronic F68 al 0,1 % (Invitrogen). Se realizaron transfecciones como cultivos de 1 l. En resumen, el inóculo celular se cultivó a 1,1 × 106 células/ml en un matraz para agitación Fernbach de 4 l (Corning, Inc.). El cultivo en matraz 20 para agitación se mantuvo en una plataforma agitadora Innova 2150 (News Brunswick Scientific, Edison, NJ) a 65 RPM que se colocó en una incubadora humidificada mantenida a 37 °C y CO2 al 5 %. En el momento de la transfección, las células 293-6E se diluyeron a 1,0 × 106 células/ml.
Los complejos de transfección se formaron en 100 ml de medio FreeStyle. 1 mg de ADN plasmídico se añadió en 25 primer lugar al medio, seguido por 3 ml de reactivo de transfección FuGene HD (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). El complejo de transfección se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 15 minutos y a continuación se añadió a las células en el matraz para agitación. Veinticuatro horas después de la transfección, el 20 % (p/v) de peptona TN1 (OrganoTechnie S.A., TeknieScience, QC, Canadá) se añadió para alcanzar una concentración final del 0,5 % (p/v). La transfección/expresión se realizó durante 4-7 días, después de lo 30 cual el medio acondicionado se recogió mediante centrifugado a 4.000 RPM durante 60 minutos a 4 °C.
Se llevó a cabo transfección y expresión estable de la siguiente manera. Las líneas celulares IgG2-Fc de vActRIIB-humano (hu) se crearon transfectando células hospedadoras CHO estables con los plásmidos de expresión pDC323-vActRIIB (E28W)-huIgG2 Fc y pDC324-vActRIIB (E28W)-huIgG2 Fc (de acuerdo con Bianchi et al., Biotech 35 and Bioengineering, 84(4): 439-444 (2003)) usando un procedimiento de electroporación estándar. Después de la transfección de la línea celular hospedadora con los plásmidos de expresión las células se cultivaron en medio de selección libre de suero son GHT durante 2-3 semanas para permitir la selección del plásmido y la recuperación de las células. Las células se seleccionan hasta que consiguen más del 85 % de viabilidad. Esta combinación de células transfectadas se cultivó a continuación en medio que contenía metotrexato 150 nM. 40
Clonación de la línea celular
Se preparó un banco de células de clones seleccionados de acuerdo con el siguiente procedimiento. Una combinación amplificada de células transfectadas estables se sembró en placas de 96 pocillos, y clones candidatos 45 se evaluaron para crecimiento y rendimiento de productividad en estudios a pequeña escala. Bancos de células Pre-master (PMCB) de aproximadamente 60 viales se prepararon a partir del clon seleccionado. Todos los PMCB se ensayaron para esterilidad, micoplasma y virus.
Una línea celular que expresaba vActRIIB-Fc se aumentó a escala usando un proceso de alimentación discontinua 50 típico. Las células se inocularon en un biorreactor Wave (Wave Biotech LLC). El cultivo se alimentó tres veces con alimentaciones en embolada. Se recogieron 10 l el día 10, el resto se recogió el día 11; ambas recogidas se sometieron a filtración profunda seguida por filtración estéril. El medio acondicionado se filtró a través de un prefiltro de 10 pulgadas 0,45/0,2 micrómetros, seguida por una filtración a través de un filtro de 6 pulgadas 0,2 micrómetos.
55
Purificación de proteínas
Aproximadamente 5 l del medio acondicionado que contenía ActRIIB-Fc (tanto IgG1 como IgG2), ActRIIB5-Fc (tanto IgG1 como IgG2), y variantes de éstas se concentraron usando un filtro de flujo tangencial de membrana 10K de 5 pies2 (Pall). El material concentrado se aplicó a una columna Protein A High Performance Column™ de 5 ml (GE 60 Healthcare) que había sido equilibrado con PBS (de Dulbecco son cloruro de magnesio o cloruro de calcio). Después de lavar la columna con el tampón de equilibrado hasta que la absorbancia a 280 nm (DO280) era menor que 0,1, la proteína unida se eluyó con glicina-HCl 0,1 M, pH 2,7, y se neutralizó inmediatamente con Tris-HCl 1 M, pH 8,5. La combinación eluida neutralizada se concentró a un volumen de 1 ml y se aplicó a una columna Sephacryl-200 de 320 ml (GE Healthcare) que se equilibró en PBS (de Dulbecco sin cloruro de magnesio o cloruro de calcio. 65 Se realizaron series en geles de SDS PAGE al 4-20 % (Invitrogen) para determinar qué fracciones combinar. Estos polipéptidos se ensayaron para actividad, y grado de agregación, tal como se muestra a continuación.
Opcionalmente, los polipéptidos pueden purificarse adicionalmente, usando por ejemplo, una columna Shp-Sepharose. La concentración se determinó usando DO280.
5
Ejemplo 2
Ensayos de actividad in vitro
Muestras de polipéptidos vActRIIB purificados, tal como se ha descrito anteriormente, se diluyeron con solución 10 salina tamponada con fosfato (PBS: cloruro de potasio 2,67 mM, cloruro de sodio 138 mM, fosfato de potasio monobásico 1,47 mM, fosfato de sodio dibásico 8,1 mM, pH 7,4) a 0,2 mg/ml, se incubaron a 37 °C durante 6 días, a continuación se aplicaron a análisis por MALDI-MS (desorción/ionización láser asistida por matriz-espectrometría de masas), SEC y/o SEC-LS. La agregación de los polipéptidos de tipo silvestre y variantes después de la etapa de purificación con proteína A se determinó usando SEC o SEC-LS, y el peso molecular de las moléculas se confirmó 15 usando el procedimiento MALDI-MS descrito a continuación.
Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Se realizaron experimentos en un sistema de HPLC Agilent 1100 con dos columnas (TOSOHAAS G3000swxl, 7,8 x 300 mm) en tándem. Se usó 2x PBS como fase móvil a 0,5 ml/minuto.
Cromatografía de exclusión por tamaño-dispersión de luz (SEC-LS). Se realizaron experimentos en un sistema de 20 HPLC Agilent 1100 con una columna de filtración en gel Superdex-200 (Amersham Pharmacia, Waukesha, WI). Las muestras se hicieron pasar a continuación a través de un detector de dispersión de luz láser Wyatt miniDawn LS y un refractómetro Wyatt Optilab DSP (Wyatt Technology Co., Santa Barbara, CA) para determinar la masa molecular. Se usó PBS como la fase móvil a 0,4 ml/minuto. Desorción/ionización láser asistida por matriz-espectrometría de masas. Las muestras se mezclaron (1:1) con ácido sinapínico y se aplicaron a MALDI-MS (Applied Biosystems 25 Voyager System 2009). Este procedimiento se usó para comprobar el peso molecular de las moléculas.
La determinación de la afinidad de unión, y los valores de CI50 para activina y miostatina se obtuvieron tal como se describe a continuación.
Ensayo BIAcore® cualitativo. E28 y R40 se sustituyeron respectivamente con otros aminoácidos naturales en 30 fusiones con IgG1 Fc, tal como se ha descrito anteriormente. Estos se generaron con o sin enlazadores, tal como se muestra en las tablas a continuación. Cada muestra de vActRIIB-IgGlFc procedente de medio acondicionado se capturó sobre anticuerpo de cabra anti-IgG1 Fc humano (Jackson Immuno Research, n.º de cat. 109-005-098, lote 63550) revestido en superficie con CM5. 20 nM de Activina A se inyectaron sobre superficies de muestra capturadas usando BIACore2000 (BIACore Life Sciences, Piscataway, Nueva Jersey). Los sensogramas resultantes se 35 normalizaron a la RL capturada (500 UR) de variantes de vActRIIB-IgG1Fc. La respuesta de unión normalizada (UR) para algunas variantes se muestra en la tabla 2, y se describe adicionalmente a continuación. También se determinó la afinidad de unión relativa para activina mediante mediciones de Biacore usando medio acondicionado obtenido de la expresión de células de mamífero. Se usó activina A (20 nM) para capturar el polipéptido receptor soluble en el medio acondicionado y las señales de SPR medidas se normalizaron. SPR normalizada de +++++: > 60, ++++: 40 - 40 60, +++: 20 - 40, ++: 10 - 20, +: 5 - 10, -: <5.
La tabla 1A y la tabla 1B resumen los resultados de los datos de unión relativa. La tabla a continuación muestra que ciertos aspectos del vActRIIB-IgG1Fc en particular se unían a activina A con mayor afinidad que el tipo silvestre, o conservaban afinidad comparable con el tipo silvestre. 45
Tabla IA
- Unión a ActRIIB-IgG1 Fc de tipo silvestre y genomanipulado (Transfectantes estables)
- CHO
- Expresión Molécula Res28 Res40 Enlazador (SEQ ID NO: 75) Unión a activina relativa
- CHO
- Estable ActRIIB5 ninguno (E28) Ninguno ninguno +++
- CHO
- Estable ActRIIB5 E28A Ninguno ninguno +++
- CHO
- Estable ActRIIB5 E28A Ninguno GGGGS +++
- CHO
- Estable ActRIIB5 ninguno R40A GGGGS +++
- CHO
- Estable ActRIIB5 E28W R40A GGGGS ++++
- CHO
- Estable ActRIIB ninguno (E28) Ninguno GGGGS ++++
- CHO
- Estable ActRIIB E28A Ninguno GGGGS +++
- CHO
- Estable ActRIIB E28A Ninguno 2(GGGGS) +++
- COS
- Estable ActRIIB ninguno (E28) Ninguno ninguno ++
- COS
- Estable ActRIIB E28A Ninguno ninguno ++
- COS
- Estable ActRIIB ninguno (E28) R40A ninguno ++
Tabla IB
- Unión a ActRIIB-IgG1 Fc de tipo silvestre y genomanipulado (Transfectantes transitorios)
- COS
- Transitorio ActRIIB E28W ninguno (R40) GGGGS +++++
- COS
- Transitorio ActRIIB E28Y ninguno (R40) GGGGS +++++
- Unión a ActRIIB-IgG1 Fc de tipo silvestre y genomanipulado (Transfectantes transitorios)
- COS
- Transitorio ActRIIB ninguno (E28) R40G GGGGS +++
- COS
- Transitorio ActRIIB E28F ninguno (R40) GGGGS +++
- COS
- Transitorio ActRIIB ninguno (E28) ninguno (R40) GGGGS +
- COS
- Transitorio ActRIIB ninguno (E28) ninguno (R40) GGGGS +
- CHO
- Transitorio ActRIIB E28A ninguno (R40) ninguno -
- COS
- Transitorio ActRIIB E28T ninguno (R40) GGGGS -
- COS
- Transitorio ActRIIB E28Q ninguno (R40) GGGGS +
- COS
- Transitorio ActRIIB E28S ninguno (R40) GGGGS -
- COS
- Transitorio ActRIIB E28D ninguno (R40) GGGGS -
- COS
- Transitorio ActRIIB E28V ninguno (R40) GGGGS +
- COS
- Transitorio ActRIIB E28I ninguno (R40) GGGGS ++
- COS
- Transitorio ActRIIB E28L ninguno (R40) GGGGS +
- COS
- Transitorio ActRIIB E28C ninguno (R40) GGGGS -
- COS
- Transitorio ActRIIB E28G ninguno (R40) GGGGS -
- COS
- Transitorio ActRIIB E28P ninguno (R40) GGGGS -
- COS
- Transitorio ActRIIB E28R ninguno (R40) GGGGS -
- COS
- Transitorio ActRIIB E28N ninguno (R40) GGGGS -
- COS
- Transitorio ActRIIB E28A ninguno (R40) GGGGS +
- COS
- Transitorio ActRIIB E28M ninguno (R40) GGGGS ++
- COS
- Transitorio ActRIIB E28K ninguno (R40) GGGGS +
- COS
- Transitorio ActRIIB E28H ninguno (R40) GGGGS +
- COS
- Transitorio ActRIIB ninguno (E28) R40Q GGGGS +
- COS
- Transitorio ActRIIB ninguno (E28) R40P GGGGS -
- CHO
- Transitorio ActRIIB ninguno(E28) R40A GGGGS +
- COS
- Transitorio ActRIIB ninguno (E28) R40L GGGGS -
- COS
- Transitorio ActRIIB ninguno (E28) R40T GGGGS -
- COS
- Transitorio ActRIIB ninguno (E28) R40F GGGGS -
- COS
- Transitorio ActRIIB ninguno (E28) R40Y GGGGS -
- COS
- Transitorio ActRIIB ninguno (E28) R40V GGGGS -
- COS
- Transitorio ActRIIB ninguno (E28) R40S GGGGS -
- COS
- Transitorio ActRIIB ninguno (E28) R40M GGGGS +
- COS
- Transitorio ActRIIB ninguno (E28) R40H GGGGS ++
- COS
- Transitorio ActRIIB ninguno (E28) R40I GGGGS -
- COS
- Transitorio ActRIIB ninguno (E28) R40C GGGGS -
- COS
- Transitorio ActRIIB ninguno (E28) R40K GGGGS ++
- COS
- Transitorio ActRIIB ninguno (E28) R40N GGGGS ++
Ensayo de actividad basado en células C2C12
Se generaron variantes vActRIIB5-IgG1Fc y vActRIIB-IgG1Fc tal como se ha descrito anteriormente. La capacidad de estas variantes para inhibir la unión de activina A o miostatina al receptor de activina IIB se ensayó usando un 5 ensayo de actividad basado en células, tal como se describe a continuación.
Una línea celular informadora sensible a miostatina/activina/GDF-11 se generó mediante transfección de células de mioblastos C2C12 (N.º ATCC: CRL-1772) con una construcción pMARE-luc. La construcción pMARE-luc se prepara clonando doce repeticiones de la secuencia CAGA, que representa los elementos de respuesta a miostatina/activina 10 (Dennler et al. EMBO 17: 3091-3100 (1998)) en un vector informador pLuc-MCS (Stratagene n.º de cat. 219087) cadena arriba de la caja TATA. Las células C2C12 expresan de forma natural el receptor de activina IIB en su superficie celular. Cuando miostatina/activinaA/GDF-11 se une a los receptores celulares, la ruta Smad se activa, y Smad fosforilado se une al elemento de respuesta (Macias-Silva et al. Cell 87: 1215 (1996)), dando como resultado la expresión del gen de luciferasa. La actividad luciferasa se midió a continuación usando un kit de ensayo 15 informador de luciferasa comercial (n.º de cat. E4550, Promega, Madison, WI) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Una línea estable de células C2C12 que ha sido transfectada con pMARE-luc (C2C12/pMARE) se usó para medir la actividad de acuerdo con el siguiente procedimiento. Células informadoras se sembraron en cultivos de 96 pocillos. Se realizó cribado usando diluciones de las fusiones ActRIIB-IgG1 Fc de tipo silvestre y variante construidas tal como se ha descrito anteriormente, con la concentración fijada a activina 4 nM. La activina A se 20 preincubó con los receptores a varias concentraciones. La actividad activina se midió determinando la actividad luciferasa en los cultivos tratados. Los valores de CI50 se determinaron para cada polipéptido. Estos se muestran en la tabla 2. El mismo procedimiento se siguió para fusiones ActRIIB-huIgG2 Fc producidas tal como se ha descrito anteriormente para la determinación de miostatina. Se usaron proteína A purificada de tipo silvestre y variantes en la determinación de valores de CI50 para miostatina usando la misma metodología. Para esta determinación, los 25 polipéptidos se preincubaron con miostatina 4 nM. Además, el grado de agregación se determinó usando los procedimientos descritos anteriormente. Estos valores se dan en la tabla 3 a continuación.
Del conjunto de variantes de ActRIIB5-IgG1 Fc que se enumeran en la Tabla 1A, varias variantes de ActRIIB-IgG1 Fc y tres variantes de ActRIIB5-IgG1 Fc junto con los polipéptidos de tipo silvestre se purificaron adicionalmente y se analizaron mediante SPR (resonancia del plasmón superficial) a activina A 20 nM. La tabla 2 muestra la afinidad de unión de SPR de polipéptidos vActRIIB-IgG1 Fc seleccionados para activina. La activina A (20 nM) se usó para capturar polipéptidos vActRIIB en las muestras y las señales de SPR medidas se normalizaron. Los valores de CI50 5 se obtuvieron de ensayos de inhibición de activina basado en células descritos anteriormente. Los errores estándar son menores del 10 % para todos los resultados.
Tabla 2
- Variante
- UR normalizada de SPR (UR = unidad de respuesta) CI50 (nM) Activina
- ActRIIB-IgG1Fc (SEQ ID NO:58)
- 35 8,20
- vActRIIB-IgG1Fc, E28A (SEQ ID NO:60)
- 20 25,30
- vActRIIB-IgG1Fc, E28W (SEQ ID NO:62)
- 128 2,07
- vActRIIB-IgG1Fc, E28Y (SEQ ID NO:64)
- 115 2,10
- vActRIIB-IgG1Fc, R40G (SEQ ID NO:66)
- 18
- ActRIIB5-IgG1Fc (SEQ ID NO:68)
- 37
- vActRIIB5-IgG1Fc, E28A (SEQ ID NO:70)
- 8
- vActRIIB5-IgG1Fc, E28W (SEQ ID NO:72)
- 45 16,86
10
Tal como se ha mostrado anteriormente en la tabla 2 anterior, el valor de CI50 de vActRIIB-IgG1Fc (E28W) para bloquear activina fue de 2,07 nM y el valor de CI50 de vActRIIB-IgG1Fc (E28Y) fue de 2,1 nM en comparación con el tipo silvestre. Además, las variantes E28W y E28Y de vActRIIB-IgG1Fc fueron estables y no se agregaban una vez purificadas.
15
El valor de CI50 en un ensayo basado en células de bloqueo de miostatina se determinó para polipéptidos variantes adicionales también. Estas variantes fueron los polipéptidos vActRIIB truncados maduros que carecían de la secuencia señal y los primeros seis aminoácidos del extremo N. estas secuencias se muestran en la tabla 3. La tabla 3 muestra el porcentaje de agregación de la proteína después de la purificación de la proteína A, y el valor de CI50 con respecto a miostatina. Puede verse que el porcentaje de agregación es mucho menor para los polipéptidos 20 variantes en comparación con el tipo silvestre. Se obtuvieron resultados similares para polipéptidos vActRIIB truncados maduros sin la secuencia señal y los cuatro aminoácidos N-terminales, y con sustituciones idénticas, tal como se muestra a continuación.
La tabla 4 identifica las secuencias que corresponden a las SEQ ID NO: 1-99 en la lista de secuencias.
Tabla 4
- SEQ ID NO
- Descripción
- 1
- ActRIIB5 dominio extracelular, polinucleótido
- 2
- ActRIIB5 dominio extracelular, polipéptido
- 3
- vActRIIB5 E28A polinucleótido
- 4
- vActRIIB5 E28A polipéptido
- 5
- vActRIIB5 E28A y R40A polinucleótido
- 6
- vActRIIB5 E28A y R40A polipéptido
- 7
- vActRIIB5 E28W polinucleótido
- 8
- vActRIIB5 E28W polipéptido
- 9
- vActRIIB5 E28Y polinucleótido
- 10
- vActRIIB5 E28Y polipéptido
- 11
- vActRIIB5 E28X en el que X es A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W o Y
- polinucleótido
- 12
- vActRIIB5 E28X en el que X es A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W o Y polipéptido
- 13
- vActRIIB5 E28X y R40X,
- en el que X(28) es A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W o Y
- en el que X(40) es A, G, Q, M, H, K o N
- polinucleótido
- 14
- vActRIIB5 E28X y R40X,
- en el que X(28) es A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W o Y
- en el que X(40) es A, G, Q, M, H, K o N
- polipéptido
- 15
- vActRIIB5 R40X en el que X es G, Q, M, H, K o N polinucleótido
- 16
- vActRIIB5 R40X en el que X es G, Q, M, H, K o N polipéptido
- 17
- ActRIIB dominio extracelular, polinucleótido
- 18
- ActRIIB dominio extracelular, polipéptido,
- 19
- vActRIIB E28A polinucleótido
- 20
- vActRIIB E28A polipéptido
- 21
- vActRIIB E28A y R40A polinucleótido
- 22
- vActRIIB E28A y R40A polipéptido
- 23
- vActRIIB E28W polinucleótido
- 24
- vActRIIB E28W polipéptido
- 25
- vActRIIB E28Y polinucleótido
- 26
- vActRIIB E28Y polipéptido
- 27
- vActRIIB E28X en el que X es A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W o Y
- polinucleótido
- 28
- vActRIIB E28X en el que X es A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W o Y polipéptido
- 29
- vActRIIB E28X y R40X,
- en el que X(28) es A, F, Q, V, I, L, M, K, H, Y o W
- en el que X(40) es A, G, Q, M, H, K o N
- polinucleótido
- 30
- vActRIIB E28X y R40X,
- en el que X(28) es A, F, Q, V, I, L, M, K, H, Y o W
- en el que X(40) es A, G, Q, M, H, K o N
- polipéptido
- 31
- vActRIIB R40X en el que X es G, Q, M, H, K o N polinucleótido
- 32
- vActRIIB R40X en el que X es G, Q, M, H, K o N polipéptido
- 33
- vActRIIB R64A, E28A polinucleótido
- 34
- vActRIIB R64A, E28A polipéptido
- 35
- vActRIIB R64A, E28A y R40A polinucleótido
- 36
- vActRIIB R64A, E28A y R40A polipéptido
- 37
- vActRIIB R64A, E28W polinucleótido
- 38
- vActRIIB R64A, E28W polipéptido
- 39
- vActRIIB R64A, E28Y polinucleótido
- 40
- vActRIIB R64A, E28Y polipéptido
- 41
- vActRIIB R64A, E28X en el que X es A, F, Q, V, I, L, M, K, H, Y o W
- polinucleótido
- 42
- vActRIIB R64A, E28X en el que X es A, F, Q, V, I, L, M, K, H, Y o W
- polipéptido
- 43
- vActRIIB R64A, E28X y R40X,
- SEQ ID NO
- Descripción
- en el que X(28) es A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W o Y
- en el que X(40) es A, G, Q, M, H, K o N
- polinucleótido
- 44
- vActRIIB R64A, E28X y R40X,
- en el que X(28) es A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W o Y
- en el que X(40) es A, G, Q, M, H, K o N
- polipéptido
- 45
- vActRIIB R64A, R40X en el que X es G, Q, M, H, K o N polinucleótido
- 46
- vActRIIB R64A, R40X en el que X es G, Q, M, H, K o N polipéptido
- 47
- Acceso de secuencia NP_001097 (ActRIIB de tipo silvestre) polipéptido
- 48
- Acceso de secuencia NM_002192 (Activina A) polipéptido
- 49
- Acceso de secuencia AAB86694 (Miostatina) polipéptido
- 50
- Acceso de secuencia 095390 (GDF-11) polipéptido
- 51
- vActRIIB5 E28X y R40X, en el que X = cualquier aminoácido polinucleótido
- 52
- vActRIIB5 E28X y R40X, en el que X = cualquier aminoácido polipéptido
- 53
- vActRIIB E28X y R40X, en el que X = cualquier aminoácido polinucleótido
- 54
- vActRIIB E28X y R40X, en el que X = cualquier aminoácido polipéptido
- 55
- vActRIIB R64A, E28X y R40X, en el que X = cualquier aminoácido
- polinucleótido
- 56
- vActRIIB R64A, E28X y R40X, en el que X = cualquier aminoácido polipéptido
- 57
- ActRIIB-IgG1Fc polinucleótido maduro
- 58
- ActRIIB-IgG1Fc polipéptido maduro
- 59
- vActRIIB-IgG1Fc E28A (E10A) polinucleótido maduro
- 60
- vActRIIB-IgG1Fc E28A (E10A) polipéptido maduro
- 61
- vActRIIB-IgG1Fc E28W (E10W) polinucleótido maduro
- 62
- vActRIIB-IgG1Fc E28W (E10W) polipéptido maduro
- 63
- vActRIIB-IgG1Fc E28Y (E10Y) polinucleótido maduro
- 64
- vActRIIB-IgG1Fc E28Y (E10Y) polipéptido maduro
- 65
- vActRIIB-IgG1Fc R40G (R22G) polinucleótido maduro
- 66
- vActRIIB-IgG1Fc, R40G maduro (R22G) polipéptido maduro
- 67
- vActRIIB5-IgG1Fc polinucleótido maduro
- 68
- vActRIIB5-IgG1Fc polipéptido maduro
- 69
- vActRIIB5-IgG1Fc E28A (E10A) polinucleótido maduro
- 70
- vActRIIB5-IgG1Fc E28A (E10A) polipéptido maduro
- 71
- vActRIIB5-IgG1Fc E28W (E10W) polinucleótido maduro E10W
- 72
- vActRIIB5-IgG1Fc E28W (E10W) polipéptido maduro E10W
- 73
- Secuencia señal mostrada en la figuras 1 y 2
- 74
- Secuencia señal alternativa
- 75
- Enlazador
- 76
- Regiones bisagra completas para IgG1
- 77
- Región bisagra completa para IgG2
- 78
- Región bisagra completa para IgG4
- 79
- Enlazador bisagra
- 80
- IgG2 Fc polipéptido
- 81
- IgG2 Fc nucleótido degenerado
- 82
- IgG1 Fc polipéptido
- 83
- IgG1 Fc polinucleótido
- 84
- IgG4 Fc polipéptido
- 85
- IgG4 Fc polinucleótido-degenerado
- 86
- ActRIIB polipéptido de tipo silvestre truncado maduro
- 87
- vActRIIB (E4W) (E28W) polipéptido truncado maduro
- 88
- vActRIIB (E4Y) (E28Y) polipéptido truncado maduro
- 89
- ActRIIB-IgG2Fc polipéptido truncado maduro
- 90
- ActRIIB-IgG2 Fc polinucleótido degenerado truncado maduro
- 91
- vActRIIB-IgG2Fc (E4W) E28W polipéptido truncado maduro
- 92
- vActRIIB-IgG2Fc (E4W) E28W polinucleótido truncado maduro
- 93
- vActRIIB-IgG2Fc (E4Y) E28Y polipéptido truncado maduro
- 94
- vActRIIB-IgG2Fc (E4Y) E28Y polinucleótido truncado maduro
- 95
- vActRIIB-IgG2 Fc (E4A) E28A polipéptido truncado maduro
- 96
- vActRIIB-IgG2 Fc (E4A) E28A polinucleótido degenerado truncado maduro
- 97
- vActRIIB-IgG2 Fc (E4X) E28X-en el que X es A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W o Y polipéptido truncado maduro
- SEQ ID NO
- Descripción
- 98
- Figura 1-ActRIIB-IgG1 Fc
- 99
- Figura 2-ActRIIB5-IgG1 Fc
Ejemplo 3
Tratamientos in vivo usando vActRIIB
5
Todos los siguientes estudios en animales se llevaron a cabo usando el polipéptido truncado maduro vActRIIB-IgG2 Fc (E28W), (SEQ ID NO: 91), de acuerdo con los procedimientos descritos a continuación.
Tratamiento de la pérdida muscular en ratones deficientes en inhibina-α
10
La inhibina-α es un inhibidor de origen natural de activina A. Los ratones que carecen de inhibina-α muestran niveles de activina A significativamente elevados en circulación y padecen de un síndrome de pérdida letal que está asociado con la formación espontanea de tumores tales como cánceres de ovario, testiculares y cánceres suprarrenales (Matzuk et al., PNAS 91(19): 8817-21 (1994), Cipriano et al. Endocrinology 121(7): 2319-27(2000), Matzuk et al., Nature 360(6402): 313-9 (1992)). Para los siguientes experimentos, ratones con inactivación de 15 inhibina-α (C57BL/6J) se obtuvieron de Charles River Laboratories. Los efectos de vActRIIB-IgG2 Fc E28W (SEQ ID NO: 91) (en lo sucesivo polipéptido E28W o E28W, o receptor soluble E28W) sobre el peso corporal y la masa muscular se examinaron en ratones con inactivación de inhibina-α. Se realizó un estudio de inyección única de 14 días en ratones machos de 8 semanas de edad con inactivación de inhibina-α. A las 8 semanas de edad, los ratones macho con inactivación de inhibina-α habían perdido más del 25 % de peso corporal en comparación con ratones de 20 control de la misma camada de tipo silvestre y de edad similar. A 5 de los ratones con inactivación se les administró una única inyección subcutánea de E28W (30 mg/kg), mientras que a 5 ratones con inactivación se les administró por vía subcutánea un volumen igual de PBS (vehículo) el día 0. Como control inicial, a 5 ratones de tipo silvestre de edad similar se les administró una única inyección subcutánea de vehículo el día 0. Los ratones se pesaron el día 0, día 7 y día 14. Al final del día 14, todos los ratones fueros sacrificados, y sus pesos magros del cadáver y masa 25 muscular de la parte inferior de la pata se analizaron mediante necropsia. Durante el periodo de estudio de 14 días, el peso corporal promedio de los ratones con inactivación tratados con vehículo cayó en aproximadamente 1,1 g de 22,5 g el día 0 a 21,4 g el día 14. En contraste, el peso corporal promedio de los ratones con inactivación tratados con E28W mostró un aumento drástico de 11 g desde 22,1 g el día 0 a 33,1 g el día 14. El análisis por necropsia terminal reveló que el polipéptido E28W doblaba virtualmente el peso magro del cadáver y la masa muscular de la 30 parte inferior de la pata en los ratones con inactivación de inhibina-α, tal como se muestra a continuación. El peso magro del cadáver promedio de los ratones con inactivación tratados con E28W fue de aproximadamente 14,9 g en comparación con aproximadamente 8,0 g para los ratones con inactivación tratados con vehículo, y aproximadamente 12,1 g para ratones de control de tipo silvestre tratados con vehículo. El peso del músculo de la parte inferior de la pata promedio (de ambas patas) de los ratones con inactivación tratados con E28W fue 35 aproximadamente 426 mg en comparación con aproximadamente 209 mg para los ratones con inactivación tratados con vehículo, y aproximadamente 324 mg para ratones de control de tipo silvestre tratados con vehículo. Estos resultados demuestran la eficacia del polipéptido E28W para el tratamiento de patologías de pérdida de peso y pérdida muscular y ser resumen en la tabla a continuación.
40
- WT más vehículo KO más vehículo KO más E28W
- Peso corporal
- 28,64 +/- 1,11 21,36 +/- 0,99* 33,10 +/- 1,56 *#
- Cadáver magro (g)
- 12,07 +/- 0,36 8,00 +/- 0,29* 14,90 +/- 0,77 *#
- Músculo de la parte inferior de la pata (g)
- 0,324 +/- 0,014 0,209 +/- 0,012* 0,426 +/- 0,024*#
- *: P < 0,05 frente a WT + Veh; #: P < 0,05 frente a KO + Veh.
Los efectos de la administración del polipéptido E28W sobre las velocidades de formación de tumores testiculares y ováricos se examinaron en ratones KO para inhibina-α macho y hembra, respectivamente. En este estudio, 11 de los ratones con inactivación de inhibina-α, incluyendo machos de 8 semanas de edad (n = 5) y hembras de 9 semanas de edad (n = 6), fueron tratados con una única inyección subcutánea de E28W (30 mg/kg), mientras que 11 de los 45 ratones con inactivación de inhibina-α, incluyendo machos (n=5) y hembras (n=6) de edad similar recibieron una única inyección de un volumen igual de PBS (vehículo). Además, a 11 de los ratones de control de la misma camada de tipo silvestre, incluyendo machos (n = 5) y hembras (n = 6) de edad similar se les administró una única inyección de vehículo. Dos semanas después del tratamiento, los ratones fueros sacrificados y se sometieron a necropsia para examinar las velocidades de formación de tumores testiculares y ováricos visualmente identificables. Se observó que 50 10 de los 11 ratones con inactivación tratados con vehículo desarrollaron tumores identificables. Específicamente, se descubrieron formaciones de tumores testiculares y ováricos en 5 de los 5 machos y 5 de las 6 hembras examinadas, respectivamente. Se descubrió que los tamaños de estos tumores eran 2-3 veces más grandes que el testículo u ovario normal correspondiente en ratones de control de tipo silvestre. Esto se muestra en la figura 3. Solamente el 10 % (1 de 11) de los ratones con inactivación de inhibina-α tratados con E28W mostraron formación 55 de tumores visible. Específicamente, en hembras, 1 de 6 de los ratones con inactivación tratados con E28W desarrollaron un tumor ovárico identificable, mientras que 5 de 6 de aquellos con inactivación hembra no tratados presentaban pocos o ningún cambio en el tamaño o la morfología macroscópica del ovario en comparación con controles de tipo silvestre de edad similar. 5 de 5 de los ratones con inactivación macho tratados con E28W no mostraron ningún tumor visible con pocos o ningún cambio en el tamaño o la morfología macroscópica del testículo en comparación con los controles de tipo silvestre de edad similar. Estos resultados demuestran que la administración de E28W fue eficaz para reducir la formación de tumores testiculares y ováricos en los ratones con 5 inactivación (KO) de inhibina-α, lo que sugiere una utilidad clínica para la terapia con receptor soluble en el tratamiento del cáncer.
La eficacia del polipéptido E28W en el tratamiento de la anorexia se examinó en ratones macho con inactivación de inhibina-α. En este estudio, el consumo de alimento en los ratones con inactivación de inhibina-α (n = 5) se redujo 10 significativamente en comparación con el de los ratones de tipo silvestre de edad similar (n = 10). Se observó que la ingesta de alimento de los ratones con inactivación de inhibina-α tratados con E28W se incrementó significativamente durante un periodo de 3 semanas examinado. La ingesta de alimento semanal promedio en los ratones con inactivación tratados con E28W se incrementaba hasta un nivel ligeramente más elevado que aquel en los ratones de control de tipo silvestre de edad similar, y fue aproximadamente un 50 % mayor que la ingesta de 15 alimentos semanal promedio de los ratones con inactivación tratados con el vehículo. Por lo tanto, los datos muestran que el tratamiento con E28W fue altamente eficaz para mejorar la anorexia en los ratones KO para inhibina-α.
El efecto del tratamiento con E28W sobre la supervivencia se examinó en ratones KO para inhibina-α machos y 20 hembra, respectivamente. Para machos, a 25 ratones KO para inhibina-α de aproximadamente 50 días de edad se les administró el polipéptido E28W (10 mg/kg/semana, SC), mientras que 26 ratones KO para inhibina-α de edad similar recibieron vehículo (PBS). 19 ratones macho de tipo silvestre de edad similar recibieron vehículo y se usaron como control inicial. Los ratones con inactivación tratados con vehículo comenzaron a morir el día 15 del estudio (aproximadamente 65 días de edad). El día 34 del experimento (aproximadamente 84 días de edad), el 50 % de los 25 ratones con inactivación tratados con vehículo había muerto, y el día 78 (aproximadamente 128 días de edad), el 100 % de ellos habían muerto. En contraste, ninguno de los 25 ratones con inactivación tratados con el polipéptido E28W, o de los 19 ratones de control de tipo silvestre tratados con vehículo, murieron antes del día 78 del estudio (aproximadamente 128 días de edad). En los ratones con inactivación tratados con E28W, 1 de 25 murieron el día 78 del estudio (aproximadamente 128 días de edad) y 24 de 25 sobrevivieron más allá del día 100 30 (aproximadamente 150 días de edad). Ninguno de los ratones de tipo silvestre tratados con vehículo murió durante el periodo de estudio de 100 días. Se obtuvieron resultados de supervivencia similares en ratones hembra KO para inhibina-α. 22 de los ratones hembra KO para inhibina-α de aproximadamente 50 días de edad se trataron con E28W (10 mg/kg/semana, SC), mientras que 23 ratones hembra KO para inhibina-α de la misma edad se trataron con PBS (vehículo). Mientras tanto, 17 de los ratones hembra de control de tipo silvestre fueron tratados con 35 vehículo. Los ratones hembra con inactivación tratados con vehículo comenzaron a morir el día 40 del estudio (aproximadamente 90 días de edad). El día 58 del experimento (aproximadamente 108 días de edad), el 50 % de los ratones hembra con inactivación tratados con vehículo habían muerto, y el día 86 del estudio (aproximadamente 136 días de edad) el 100 % de ellos habían muerto. En contraste, solamente aproximadamente el 5 % (1 de 22) de los ratones hembra con inactivación tratados con E28W habían muerto mientras que aproximadamente el 90 % (20 de 40 22) sobrevivieron más allá del día 120 del estudio (aproximadamente 170 días de edad). Ninguno de los ratones de tipo silvestre tratados con vehículo murió durante el periodo de estudio de 120 días. Por lo tanto, los datos demuestran que la terapia con el polipéptido E28W es eficaz para prolongar drásticamente la supervivencia de ratones tanto macho como hembra con inactivación de inhibina-α. Un gráfico esquemático de las curvas de supervivencia para los ratones tanto macho como hembra se proporciona en la figura 4. 45
Tratamiento de pérdida muscular en ratones portadores de tumor de colon-26
Los ratones portadores de tumor colon-26 constituyen un modelo animal preclínico usado ampliamente para estudiar caquexia cancerosa (Fujita et al., Int J Cancer 68(5): 637-43 (1996), Kwak et al., Cancer Research 64(22): 8193-8 50 (2004)). El efecto del polipéptido E28W sobre el cambio de peso corporal, la masa muscular y la tasa de supervivencia se estudiaron en los ratones portadores del tumor. Células tumorales de colon-26 (C-26) se implantaron por vía subcutánea en 40 ratones CDF macho de 10 semanas de edad a 0,5 x 106 células por ratón. La implantación del tumor se realizó el día 0. Comenzando el día 5 después de la implantación del tumor, veinte ratones C-26 se trataron semanalmente con una inyección subcutánea de 10 mg/kg de vActRIIB IgG2 Fc E28W (SEQ ID 55 NO: 91), mientras que veinte ratones C-26 se trataron con un vehículo (PBS). Al mismo tiempo, 10 ratones normales de edad y peso similares se trataron con un vehículo (PBS) solamente. El peso corporal y la ingesta de alimentos se determinaron 3 veces por semana. Los ratones portadores de tumor se inspeccionaron dos veces al día para supervivencia. Los tamaños del tumor se midieron usando calibres (calibre electrónico Ultra-Cal IV IP65, Fred V Fowler Co. Boston MA) conectados a un ordenador PC y los valores se registraron automáticamente en una hoja de 60 cálculo en un archivo de datos de Microsoft Excel. Tal como se muestra en la figura 5, dos semanas después de la implantación del tumor, los ratones que portaban tumores C-26 desarrollaron caquexia grave y perdieron su peso corporal drásticamente. El tratamiento con E28W mitigó eficazmente la pérdida de peso corporal en los ratones portadores de tumor. El peso corporal promedio de los ratones portadores de tumor tratados con E28W era significativamente mayor que el de los ratones portadores de tumor tratados con vehículo (p < 0,001, desde el día 7 65 al día 33 después de la inoculación del tumor. Prueba de la t para datos independientes, Graph pad Software Inc. San Diego CA).
No había ninguna diferencia en el tamaño del tumor entre los grupos tratados con el polipéptido E28W y tratados con vehículo, lo que indicaba que el tratamiento no tenía ningún efecto sobre el crecimiento del tumor C-26. El 5 análisis por necropsia terminal mostraron que la masa magra del cadáver y el peso del músculo de la parte inferior de la pata promedio de los ratones portadores de C-26 tratados con E28W de tumor fueron significativamente mayores que los de los ratones portadores de tumor tratados con vehículo (p<0,001 tanto para cadáver magro como para músculo de la parte inferior de la pata). El efecto del E28W sobre la supervivencia de los ratones portadores de tumor C-26 se muestra en la figura 6. Los ratones tratados con vehículo comenzaron a morir aproximadamente el 10 día 14 después de la implantación del tumor. El día 35 después de la implantación del tumor, los 20 ratones portadores de tumor C-26 tratados con vehículo, murieron; sin embargo 17 de 20 ratones portadores de tumor C-26 tratados con E28W aun sobrevivían. Por lo tanto, el tratamiento con E28W causaba una prolongación significativa de la supervivencia de los ratones portadores de tumor C-26 (p < 0,0001, prueba de chi cuadrado). Por lo tanto, el polipéptido E28W no era solamente eficaz para mantener el peso corporal y la masa muscular sino también para 15 prolongar la supervivencia de los ratones portadores de tumor C-26.
Tratamiento de ratones con suspensión de la extremidad posterior
El modelo en ratón con suspensión de la extremidad posterior se usó para examinar el efecto de vActRIIB-IgG2 Fc 20 E28W (SEQ ID NO: 91) sobre la masa muscular en estado de inactividad. El procedimiento de suspensión de la extremidad posterior es esencialmente el mismo que el descrito previamente por Carlson CJ et al (Carlson CJ, Booth FW y Gordon SE: Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 277: R601-RR606, 1999). Se usaron ratones C57BL/6 hembra de nueve semanas de edad para el estudio. Un total de 60 ratones se dividieron en tres grupos de la siguiente manera: 1. Grupo de control inicial no suspendido (20 ratones) tratados con vehículo (PBS), 2. Grupo de 25 suspensión de la extremidad posterior (20 ratones) tratados con vehículo, y 3. Grupo de ratones con suspensión de la extremidad posterior (20 ratones) tratados con vActRIIB-IgG2 Fc, E28W. Específicamente, una única inyección SC de 30 mg/kg de vActRIIB-IgG 2 Fc E28W o vehículo se administró a los grupos descritos anteriormente, respectivamente, en el momento del inicio de la suspensión de la extremidad posterior. Los cambios de peso corporal se midieron longitudinalmente 2-3 veces por semana. 5 ratones de cada grupo se sacrificaron en los 30 siguientes 4 puntos temporales diferentes: día 1, día 3, día 7 y día 14. Los pesos del músculo de la parte inferior de la pata se determinaron mediante necropsia.
Tal como se muestra en la tabla a continuación, la suspensión de la extremidad posterior causó una pérdida significativa de peso corporal hasta el 10 %. El tratamiento de ratones con suspensión de la extremidad posterior con 35 vActRIIB-IgG2 Fc E28W causó un aumento de peso corporal significativo a un nivel más elevado que el grupo de suspensión de la extremidad posterior tratado con vehículo o el grupo de control inicial sin suspensión, tal como se analiza mediante medición con ANOVA. Durante el periodo de estudio de dos semanas, el aumento de peso corporal promedio del grupo de tratamiento con vActRIIB-IgG2 Fc E28W (SEQ ID NO: 91) fue del 12,6 % en comparación con la caída del 0,2 % en el grupo con suspensión tratado con vehículo y el 4,8 % de aumento de peso 40 en el grupo de control inicial sin suspensión, respectivamente. Los resultados de necropsia de evolución temporal mostraron que la masa muscular de la extremidad posterior cambió en paralelo a los pesos corporales. El tratamiento de los ratones suspendidos con vActRIIB-IgG2 Fc (E28W) mitigó completamente la pérdida muscular. Por lo tanto, los resultados de este experimento muestran que E28W es eficaz en el tratamiento de atrofia muscular asociada con inactividad. 45
- Grupo/días (% de cambio de peso corporal)
- día 3 (%) día 7 (%) día 14 (%)
- Sin susp. de la extremidad posterior + PBS
- 2,4 % 2,9 % 4,8 %
- Susp. de la extremidad posterior + vehículo
- -10,0 % -3,0 % -0,2 %
- Susp. de la extremidad posterior + E28W, 30 mg/ml
- -9,7 % 2,1 % 12,6 %
Tratamiento de ratones OVX
Se considera que los ratones C57B16 hembra ovariectomizados (OVX) son un modelo para hipogonadismo y 50 osteoporosis femeninas. 24 ratones C57B16 hembra fueron ovariectomizados a los 3 meses de edad y se les permitió recuperarse durante 3 meses. A los 6 meses de edad, 24 ratones OVX así como 24 ratones C57B16 de control operados de forma simulada de edad similar se midieron para cambios longitudinales de peso corporal, músculo y masa grasa mediante RMN y masa ósea (PIXImus-GE LUNAR Corporation) durante un periodo de tratamiento de 3 meses. Al final del periodo, los animales fueron sacrificados, y los tejidos óseos se recogieron 55 durante necropsia terminal y se sometieron a análisis mediante irradiador de rayos X y microTC Faxitron X (Faxitron X-ray Corporation y GE Medical system). Se demostró que el receptor variante de E28W (SEQ ID NO: 91) era eficaz para incrementar el peso corporal, específicamente masa de músculo esquelético magra, y masa ósea, mientras que reducía el contenido de grasa de los ratones hasta el nivel visto en ratones sin ovariectomizar. Específicamente, durante un periodo de 12 semanas, la masa muscular magra se incrementó de 20 g a 27,0 g para ratones OVX 60 tratados con E28W, en comparación con de 20 g a 27,5 g para ratones operados de forma simulada tratados con E28W, en comparación con casi ningún incremento de la masa muscular magra para OVX más vehículo o simulados más vehículo (aproximadamente 19 gramos para OVX más vehículo y aproximadamente 20 g para tipo silvestre más vehículo). En el mismo estudio, ratones OVX tratados con E28W mostraban masa grasa reducida desde 8 g de promedio por animal hasta aproximadamente 4 g de promedio por animal, comparable con los animales operados de forma simulada, al final del estudio de 12 semanas. Los ratones OVX tratados con el vehículo, en contraste, no perdieron masa grasa en ningún momento durante el estudio. Finalmente, la masa ósea se incrementó en los 5 ratones OVX tratados con E28W en comparación con ratones OVX tratados con vehículo. El análisis del BMC (contenido mineral óseo) del fémur/la tibia del hueso seccionado recogido durante la necropsia terminal se determinó mediante análisis por pQCT (Tomografía computarizada cuantitativa periférica). Los ratones OVX tratados con E28W incrementaban el BMC de aproximadamente 0,045 g/cm a aproximadamente 0,055 g/cm al final del estudio de 12 semanas, lo que es comparable con el BMC final de animales tratados con vehículo operados de forma 10 simulada. Los ratones OVX tratados con vehículo mostraron aproximadamente el mismo BMC de 0,045 g/cm al final del estudio de 12 semanas. Los ratones de tipo silvestre tratados con E28W mostraron un incremento de BMC de aproximadamente 0,054 g/cm a aproximadamente 0,065 g/cm al final del estudio de 12 semanas. Estos estudios demuestran la eficacia del polipéptido E28W como tratamientos potenciales de fragilidad, osteoporosis y obesidad en envejecimiento. 15
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Arrgen Inc. Sun, Jeonghoon Tam Lei-Ting Tony Han, HQ Kwak, Keith Soo-Nyung Zhou, Xiaolan
20
<120> POLIPÉPTIDOS RECEPTORES DE ACTIVINA VARIANTES Y USOS DE LOS MISMOS
<130> A- 1219- WO- PCT
<140> A asignar 25
<141>
<150> 60/ 905.459
<151>
30
<150> 61/ 065.474
<151>
<160> 99
35
<170> Fast SEQ para Windows Versión 4.0
<210> 1
<211> 480
<212> ADN 40
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(480) 45
<400> 1
<210> 2
<211> 160
<212> PRT 5
<213> Homo sapiens
<400> 2
<210> 3
<211> 480
<212> ADN 5
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(480) 10
<220>
<221> variación
<222> 84
<223> n = a, c, t o g 15
<400> 3
<210> 4
<211> 160
<212> PRT 5
<213> Homo sapiens
<400> 4
10
<210> 5
<211> 480
<212> ADN
<213> Homo sapiens 15
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(480)
20
<220>
<221> variación
<222> 84
<223> n = a, c, t o g
25
<220>
<221> variación
<222> 120
<223> n = a, c, t o g
5
<400> 5
<210> 6 10
<211> 160
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6 15
<210> 7
<211> 480
<212> ADN 5
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(480) 10
<400> 7
<210> 8
<211> 160
<212> PRT 5
<213> Homo sapiens
<400> 8
10
<210> 9
<211> 480
<212> ADN 5
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(480) 10
<400> 9
<210> 10
<211> 160
<212> PRT 5
<213> Homo sapiens
<400> 10
10
<210> 11
<211> 480
<212> ADN
<213> Homo sapiens 5
<220>
<221> variación
<222> (82)...(84)
<223> n = a, c, t o g 10
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(480)
15
<400> 11
20
<210> 12
<211> 160
<212> PRT
<213> Homo sapiens
25
<220>
<221> VARIANTE
<222> 28
<223> Xaa = Ala o Phe o Gln o Val o Ile o Leu o Met o Lys o His o Trp o Tyr
<400> 12
5
<210> 13
<211> 480
<212> ADN
<213> Homo sapiens
10
<220>
<221> variación
<222> (82)...(84)
<223> n = a, c, t o g
15
<220>
<221> variación
<222> (118)...(120)
<223> n = a, c, t o g
20
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(480)
<400> 13 25
<210> 14
<211> 160
<212> PRT 5
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANTE
<222> 28 10
<223> Xaa = Ala o Phe o Gln o Val o Ile o Leu o Met o Lys o His o Trp o Tyr
<220>
<221> VARIANTE
<222> 40 15
<223> Xaa = Ala o Gly o Gln o Met o His o Lys o Asn
<400> 14
<210> 15
<211> 480
<212> ADN 5
<213> Homo sapiens
<220>
<221> variación
<222> (118)...(120) 10
<223> n = a, c, t o g
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(480) 15
<400> 15
<210> 16
<211> 160
<212> PRT 5
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANTE
<222> 40 10
<223> Xaa = Gly o Gln o Met o His o Lys o Asn
<400> 16
<210> 17
<211> 402
<212> ADN 5
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(402) 10
<400> 17
15
<210> 18
<211> 134
<212> PRT
<213> Homo sapiens 5
<400> 18
10
<210> 19
<211> 402
<212> ADN
<213> Homo sapiens
15
<220>
<221> variación
<222> 84
<223> n = a, c, t o g
20
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(402)
<400> 19 25
<210> 20
<211> 134
<212> PRT 5
<213> Homo sapiens
<400> 20
10
<210> 21
<211> 402
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> variación
<222> 84 5
<223> n = a, c, t o g
<220>
<221> variación
<222> 120 10
<223> n = a, c, t o g
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(402) 15
<400> 21
20
<210> 22
<211> 134
<212> PRT
<213> Homo sapiens
25
<400> 22
<210> 23
<211> 402
<212> ADN 5
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(402) 10
<400> 23
15
<210> 24
<211> 134
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24 5
<210> 25
<211> 402 10
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS 15
<222> (1)...(402)
<400> 25
<210> 26
<211> 134
<212> PRT 5
<213> Homo sapiens
<400> 26
10
<210> 27
<211> 402
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> variación 5
<222> (82)...(84)
<223> n = a, c, t o g
<220>
<221> CDS 10
<222> (1)...(402)
<400> 27
15
<210> 28
<211> 134
<212> PRT
<213> Homo sapiens 20
<220>
<221> VARIANTE
<222> 28
<223> Xaa = Ala o Phe o Gln o Val o Ile o Leu o Met o Lys o His o Trp o Tyr 25
<400> 28
<210> 29
<211> 402
<212> ADN 5
<213> Homo sapiens
<220>
<221> variación
<222> (82)...(84) 10
<223> n = a, c, t o g
<220>
<221> variación
<222> (118)...(120) 15
<223> n = a, c, t o g
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(402) 20
<400> 29
<210> 30
<211> 134
<212> PRT 5
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANTE
<222> 28 10
<223> Xaa = Ala CR Phe o Gln o Val o Ile o Leu o Met o Lys o His o Tyr o Trp
<220>
<221> VARIANTE
<222> 40 15
<223> Xaa = Ala o Gly o Gln o Met o His o Lys o Asn
<400> 30
<210> 31
<211> 402
<212> ADN 5
<213> Homo sapiens
<220>
<221> variación
<222> (118)...(120) 10
<223> n = a, c, t o g
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(402) 15
<400> 31
<210> 32
<211> 134
<212> PRT 5
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANTE
<222> 40 10
<223> Xaa = Gly o Gln o Met o His o Lys o Asn
<400> 32
15
<210> 33
<211> 402
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220> 5
<221> variación
<222> 84
<223> n = a, c, t o g
<220> 10
<221> variación
<222> 192
<223> n = a, c, t o g
<220> 15
<221> CDS
<222> (1)...(402)
<400> 33
20
<210> 34
<211> 134
<212> PRT 25
<213> Homo sapiens
<400> 34
<210> 35
<211> 402
<212> ADN 5
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(402) 10
<220>
<221> variación
<222> 84
<223> n = a, c, t o g 15
<400> 35
<210> 36
<211> 134
<212> PRT 5
<213> Homo sapiens
<400> 36
10
<210> 37
<211> 402
<212> ADN
<213> Homo sapiens 15
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(402)
<220> 5
<221> variación
<222> 192
<223> n = a, c, t o g
<400> 37 10
<210> 38
<211> 134 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
20
<210> 39
<211> 402
<212> ADN 5
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(402) 10
<400> 39
15
<210> 40
<211> 134
<212> PRT
<213> Homo sapiens
5
<400> 40
<210> 41 10
<211> 402
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220> 15
<221> variación
<222> (82)...(84)
<223> n = a, c, t o g
<220> 20
<221> CDS
<222> (1)...(402)
<400> 41
25
<210> 42
<211> 134
<212> PRT 5
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANTE
<222> 28 10
<223> Xaa = Ala o Phe o Gln o Val o Ile o Leu o Met o Lys o His o Tyr o Trp
<400> 42
<210> 43
<211> 402
<212> ADN 5
<213> Homo sapiens
<220>
<221> variación
<222> (82)...(84) 10
<223> n = a, c, t o g
<220>
<221> variación
<222> (118)...(120) 15
<223> n = a, c, t o g
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(402) 20
<400> 43
<210> 44
<211> 134
<212> PRT 5
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANTE
<222> 28 10
<223> Xaa = Ala o Phe o Gln o Val o Ile o Leu o Met CR Lys o His o Trp o Tyr
<220>
<221> VARIANTE
<222> 40 15
<223> Xaa = Ala o Gly o Gln o Met o His o Lys o Asn
<400> 44
20
<210> 45
<211> 402
<212> ADN 5
<213> Homo sapiens
<220>
<221> variación
<222> (118)...(120) 10
<223> n = a, c, t o g
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(402) 15
<400> 45
20
<210> 46
<211> 134
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANTE
<222> 40 5
<223> Xaa = Gly o Glu o Met o His o Lys o Asn
<400> 46
10
<210> 47
<211> 512
<212> PRT
<213> Homo sapiens 15
<400> 47
<210> 48
<211> 426
<212> PRT
<213> Homo sapiens
5
<400> 48
<210> 49 10
<211> 375
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 49
5
<210> 50
<211> 217
<212> PRT 10
<213> Homo sapiens
<400> 50
<210> 51
<211> 480
<212> ADN 5
<213> Homo sapiens
<220>
<221> variación
<222> (1)...(480) 10
<223> n = a, c, t o g
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(480) 15
<400> 51
<210> 52
<211> 160
<212> PRT 5
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANTE
<222> 28 10
<223> Xaa = cualquier aminoácido
<220>
<221> VARIANTE
<222> 40 15
<223> Xaa = cualquier aminoácido
<400> 52
<210> 53
<211> 402
<212> ADN 5
<213> Homo sapiens
<220>
<221> variación
<222> (1)...(402) 10
<223> n = a, c, t o g
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(402) 15
<400> 53
<210> 54
<211> 134
<212> PRT 5
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANTE
<222> 28 10
<223> Xaa = cualquier aminoácido
<220>
<221> VARIANTE
<222> 40 15
<223> Xaa = cualquier aminoácido
<400> 54
<210> 55
<211> 402
<212> ADN 5
<213> Homo sapiens
<220>
<221> variación
<222> (1)...(402) 10
<223> n = a, c, t o g
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(402) 15
<400> 55
<210> 56
<211> 134
<212> PRT 5
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANTE
<222> 28 10
<223> Xaa = cualquier aminoácido
<220>
<221> VARIANTE
<222> 40 15
<223> Xaa = cualquier aminoácido
<400> 56
20
<210> 57
<211> 1044
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 57
<210> 58
<211> 348
<212> PRT 5
<213> Homo sapiens
<400> 58
10
<210> 59
<211> 1044
<212> ADN
<213> Homo sapiens 15
<400> 59
<210> 60
<211> 348
<212> PRT 5
<213> Homo sapiens
<400> 60
10
<210> 61
<211> 1044
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 61 5
<210> 62
<211> 348
<212> PRT 5
<213> Homo sapiens
<400> 62
<210> 63
<211> 1044
<212> ADN 5
<213> Homo sapiens
<400> 63
<210> 64
<211> 348
<212> PRT 5
<213> Homo sapiens
<400> 64
<210> 65
<211> 1044
<212> ADN 5
<213> Homo sapiens
<400> 65
<210> 66
<211> 348
<212> PRT 5
<213> Homo sapiens
<400> 66
<210> 67
<211> 1125
<212> ADN 5
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(1125) 10
<400> 67
<210> 68
<211> 374
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 68 5
<210> 69
<211> 1125 10
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> variación 15
<222> (1)...(1125)
<223> n = a, c, t o g
<220>
<221> CDS 20
<222> (1)...(1125)
<400> 69
5
<210> 70
<211> 374
<212> PRT 5
<213> Homo sapiens
<400> 70
<210> 71
<211> 1125
<212> ADN 5
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(1125) 10
<400> 71
<210> 72
<211> 374
<212> PRT 5
<213> Homo sapiens
<400> 72
<210> 73
<211> 18
<212> PRT 5
<213> Homo sapiens
<400> 73
10
<210> 74
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens 15
<400> 74
5
<210> 75
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
10
<400> 75
<210> 76 15
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 76 20
<210> 77
<211> 12 25
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 77
30
<210> 78
<211> 12
<212> PRT 35
<213> Homo sapiens
<400> 78
40
<210> 79
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens 45
<400> 79
50
<210> 80
<211> 216
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 80
5
<210> 81
<211> 648
<212> ADN 10
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(648) 15
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(648)
<223> n = a, c, t o g 20
<400> 81
<210> 82
<211> 217
<212> PRT 5
<213> Homo sapiens
<400> 82
<210> 83
<211> 651
<212> ADN 5
<213> Homo sapiens
<400> 83
10
<210> 84
<211> 217
<212> PRT
<213> Homo sapiens 15
<400> 84
<210> 85
<211> 651
<212> ADN 5
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(651) 10
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(651)
<223> n = A, T, C o G 15
<400> 85
<210> 86
<211> 110
<212> PRT 5
<213> Homo sapiens
<400> 86
<210> 87
<211> 110
<212> PRT 5
<213> Homo sapiens
<400> 87
10
<210> 88
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens 15
<400> 88
20
<210> 89
<211> 338
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 89
5
<210> 90
<211> 1014
<212> ADN
<213> Homo sapiens 10
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(1014)
15
<400> 90
<210> 91
<211> 338
<212> PRT 5
<213> Homo sapiens
<400> 91
<210> 92
<211> 1014 5
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS 10
<222> (1)...(1014)
<400> 92
15
<210> 93
<211> 338
<212> PRT 5
<213> Homo sapiens
<400> 93
10
<210> 94
<211> 1014
<212> ADN
<213> Homo sapiens 15
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(1014)
<400> 94
<210> 95
<211> 338
<212> PRT 5
<213> Homo sapiens
<400> 95
<210> 96
<211> 1014
<212> ADN 5
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(1014) 10
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(1014)
<223> n = a, t o g 15
<400> 96
<210> 97
<211> 338
<212> PRT 5
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANTE
<222> 4 10
<223> Xaa = Al a o Phe o Gln o Val o Ile o Leu o Met o Lys o His o Trp o Tyr
<400> 97
<210> 98
<211> 367
<212> PRT 5
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANTE
<222> 64 10
<223> Xaa = Al a o Arg
<400> 98
<210> 99
<211> 392
<212> PRT 5
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANTE
<222> 64 10
<223> Xaa = Ala o Arg
<400> 99
Claims (18)
- REIVINDICACIONES1. Una proteína aislada que comprende un polipéptido receptor de activina IIB variante (vActRIIB), en la que dicho polipéptido se selecciona entre el grupo que consiste en:5(a) un polipéptido que tiene la secuencia polipeptídica expuesta en la SEQ ID NO: 18, excepto por una única sustitución de aminoácido en la posición 28, en el que la sustitución se selecciona entre una cualquiera de E por A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W e Y;(b) un polipéptido que tiene la secuencia polipeptídica expuesta en los aminoácidos 19 a 134 de la SEQ ID NO: 18, excepto por una única sustitución de aminoácido en la posición 28, en el que la sustitución se selecciona 10 entre una cualquiera de E por A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W e Y;(c) un polipéptido que tiene la secuencia polipeptídica expuesta en los aminoácidos 23 a 134 de la SEQ ID NO: 18, excepto por una única sustitución de aminoácido en la posición 28, en el que la sustitución se selecciona entre una cualquiera de E por A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W e Y;(d) un polipéptido que tiene la secuencia polipeptídica expuesta en los aminoácidos 25 a 134 de la SEQ ID NO: 15 18, excepto por una única sustitución de aminoácido en la posición 28, en el que la sustitución se selecciona entre una cualquiera de E por A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W e Y;(e) un polipéptido que tiene al menos un 90 % de identidad con uno cualquiera de (a) a (d), en el que la sustitución en la posición 28 se selecciona entre una cualquiera de E por A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W e Y, y en el que el polipéptido es capaz de unirse a miostatina, activina A o GDF-11. 20
- 2. La proteína aislada de la reivindicación 1, en la que(i) la sustitución en la posición 28 se selecciona entre E por A, W o Y; o(ii) el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1(e) comprende además la sustitución R por A en la posición 25 64.
- 3. La proteína aislada de la reivindicación 2, en la que la sustitución en la posición 28 se selecciona entre E por A, W o Y.30
- 4. La proteína aislada de la reivindicación 3, en la que la sustitución en la posición 28 es E por W.
- 5. La proteína aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el polipéptido tiene la secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 20, 24, 26, 28, 34, 38, 40, 42, y 87 u 88.35
- 6. La proteína aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que(i) el polipéptido está fusionado a al menos un polipéptido heterólogo;(ii) el polipéptido está fusionado a al menos un polipéptido heterólogo, en el que el polipéptido heterólogo es un dominio Fc humano; o 40(iii) el polipéptido está fusionado a al menos un polipéptido heterólogo, en el que el polipéptido heterólogo es un dominio Fc humano y en el que la proteína comprende además un enlazador.
- 7. La proteína aislada de la reivindicación 6, en la que45(a) el polipéptido tiene al menos un 99 % de identidad con el polipéptido de la reivindicación 4 y tiene una sustitución de E por W en la posición 28; y(b) el polipéptido está fusionado a al menos un polipéptido heterólogo, en el que el polipéptido heterólogo es un dominio IgG2 Fc humano que tiene la secuencia polipeptídica expuesta en la SEQ ID NO: 80 y en el que la proteína comprende además el enlazador bisagra que tiene la secuencia polipeptídica expuesta en la SEQ ID 50 NO: 79.
- 8. La proteína aislada de la reivindicación 6, en la que la proteína tiene la secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 60, 62, 64, 87, 88, 91, 93, 95 y 97.55
- 9. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en mezcla con un transportador farmacéuticamente aceptable.
- 10. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8. 60
- 11. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 10, que comprende un polinucleótido seleccionado entre el grupo que consiste en:(a) un polinucleótido que tiene la secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 19, 23, 65 25, 27, 33, 37, 39, 41, 59, 61, 63, 92, 94 y 96 o su complemento; y(b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 20, 24, 26, 28, 34, 38, 40, 42, 60, 62, 64, 87, 88, 91, 93, 95 y 97.
- 12. Un vector de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 10 u 11.5
- 13. Una célula hospedadora que comprende el vector recombinante de la reivindicación 12.
- 14. Un método de producción de la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 13, expresando de este modo la proteína.10
- 15. La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o la composición de la reivindicación 9 para uso(i) para inhibir la actividad de miostatina o incrementar la masa muscular magra o incrementar la relación de masa muscular magra con respecto a masa grasa en un sujeto que necesita dicho tratamiento;(ii) para tratar una enfermedad o trastorno metabólico de pérdida muscular en un sujeto que necesita dicho 15 tratamiento; o(iii) para tratar una enfermedad en la que la activina se sobreexpresa, en un sujeto que necesita dicho tratamiento.
- 16. La proteína o la composición para uso de acuerdo con la reivindicación 15, en la que la enfermedad o trastorno 20 metabólico de pérdida muscular se selecciona entre distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, insuficiencia cardiaca crónica, caquexia cancerosa, SIDA, caquexia debida a insuficiencia renal, uremia, caquexia debida a artritis reumatoide, sarcopenia asociada a la edad, atrofia de órganos, síndrome del túnel carpiano, supresión androgénica, caquexia debida a lesión por quemaduras, nefropatía diabética, y pérdida muscular debida a reposo en cama prolongado, lesión de médula espinal, ictus, fractura ósea, 25 envejecimiento, exposición a microgravedad, diabetes, obesidad, hiperglucemia y pérdida ósea.
- 17. La proteína o la composición para uso de acuerdo con la reivindicación 15, en la que la enfermedad en la que la activina se sobreexpresa es cáncer.30
- 18. La proteína o la composición para uso de acuerdo con la reivindicación 17, en la que el cáncer es cáncer de ovario.
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