BRPI0712508A2 - sistemas para produzir composto bio-orgánico e para fabricar compostos isoprenóides, métodos para produzir um composto bio-orgánico e para produzir um composto isoprenóide, sistema de produção de composição de combustìvel, e, método para fabricar uma composição de combustìvel - Google Patents

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Abstract

SISTEMAS PARA PRODUZIR COMPOSTOS BIO-ORGáNICO E PARA FABRICAR COMPOSTOS ISOPRENóIDES, MéTODOS PARA PRODUZIR UM COMPOSTO BIO-ORGáNICO E PARA PRODUZIR UM COMPOSTO ISOPRENóIDE, SISTEMA DE PRODUçãO DE COMPOSIçãO DE COMBUSTìVEL, E, MéTODO PARA FABRICAR UMA COMPOSIçãO DE COMBUSTìVEL. Um sistema e método para produzir compostos bio-orgânicos podem incluir um vaso, uma primeira fase que compreende um meio aquoso incluindo células hospedeiras capazes de produzir um composto bio-orgânico, onde o composto bio-orgânico compreende uma segunda fase em contato com o meio aquoso.

Description

"SISTEMAS PARA PRODUZIR COMPOSTO BIO-ORGÂNICO E PARA FABRICAR COMPOSTOS ISOPRENÓIDES, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM COMPOSTO BIO-ORGÂNICO E PARA PRODUZIR UM COMPOSTO ISOPRENÓIDE, SISTEMA DE PRODUÇÃO DE COMPOSIÇÃO DE COMBUSTÍVEL, E, MÉTODO PARA FABRICAR UMA COMPOSIÇÃO DE COMBUSTÍVEL"
REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS
Este pedido reivindica o benefício dos pedidos provisórios U.S. N- 60/808.989 depositado em 26 de maio de 2006 intitulado MICROOGRANISMS FOR PRODUCTION OF ISOPRENÓIDES; US 60/808.666 depositado em 26 de maio de 2006 intitulado BIOFUELS AND METHODS FOR PRODUCTION; U.S. 60/870.592 depositado em 12 de dezembro de 2006 intitulado PRODUCTION OF ISOPRENÓIDES; e U.S. 60/922.782, depositado em 10 de abril de 2007 intitulado APPARATUS FOR FABRICAR BIO-ORGANICS COMPOUNDS os conteúdos de todas as quais são aqui incorporadas por referência em suas totalidades.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Tradicionalmente, os compostos bio-orgânicos de interesse foram fabricados pela extração de fontes naturais tais como plantas, micróbios e animais. Entretanto, os rendimentos de extração são usualmente muito baixos visto que a maioria dos compostos bio-orgânicos acumulam na natureza em quantidades pequenas. Dado que estas quantidades são muito menores do que é para muitas aplicações comerciais, permanece uma necessidade para sistemas e procedimentos que produzam compostos bio- orgânicos em uma escala industrial.
A presente invenção trata desta necessidade. São fornecidos vários sistemas em escala industrial para fabricar compostos bio-orgânicos usando células hospedeiras. Estes compostos bio-orgânicos têm pelo menos cinco átomos de carbono e podem ser um carboidrato tal como um mono- ou poli-álcool, éster, éter, aldeído, cetona ou um hidrocarboneto tal como um alcano, alceno ou alcino. O composto bio-orgânico pode ser linear ou cíclico e pode ser saturado ou não saturado.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção fornece vários sistemas de produção de composto bio-orgânico. Em um aspecto, um sistema de produção de composto bio-orgânico é fornecido que compreende:
a. pelo menos um vaso tendo uma capacidade de pelo menos 100 litros;
b. um meio aquoso, dentro do vaso, que compreende uma primeira fase;
c. uma pluralidade de células hospedeiras, dentro do meio aquoso, capaz de fabricar, produzir ou sintetizar pelo menos um composto bio-orgânico; e,
d. uma segunda fase orgânica líquida, que compreende o pelo menos um composto bio-orgânico, em contato com a primeira fase.
Em um outro aspecto, um método de produzir pelo menos um composto bio-orgânico é fornecido. O método compreende:
a. cultivar em um meio aquoso uma pluralidade de células hospedeiras que fabriquem, produzam ou sintetizem o pelo menos um composto bio-orgânico em que o meio aquoso compreende uma primeira fase;
b. formar uma segunda fase orgânica que compreende o composto bio-orgânico em contato com a primeira fase;
c. separar pelo menos uma porção da segunda fase orgânica da primeira fase; e,
d. isolar o pelo menos um composto bio-orgânico da segunda fase orgânica.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS
A Figura 1 é um vaso tendo uma capacidade de pelo menos 100 litros para o uso na presente invenção.
A Figura 2 é uma outra forma de realização de vaso.
A Figura 3 é uma representação esquemática do caminho do mevalonato ("MEV") para a produção de difosfato de isopentenila ("IPP").
A Figura 4 é uma representação esquemática do caminho de DXP para a produção de IPP e pirofosfato de dimetilalila ("DMAPP"). Dxs é l-desóxi-D-xilulose-5-fosfato sintase; Dxr é l-desóxi-D-xilulose-5-fosfato redutoisomerase (também conhecido como IspC); IspD é 4-difosfocitidil-2C- metil-D-eritritol sintase; IspE é 4-difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol sintase; IspF é 2C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato sintase; IspG é 1-hidróxi-2- metil-2-(E)-butenil 4-difosfato sintase (IspG); e ispH é isopentenil/dimetilalil difosfato sintase.
A Figura 5 é uma representação esquemática da conversão de IPP e DMAPP para geranil pirofosfato ("GPP"), farnesil pirofosfato ("FPP") e geranilgeranil pirofosfato ("GGPP").
A Figura 6 mostra um mapa de expressão do plasmídeo pMBIS-gpps.
A Figura 7 mostra um mapa de expressão do plasmídeo Pam00408
A Figura 8 mostra um mapa de expressão do plasmídeo pAM424.
A Figura 9 mostra um mapa de expressão dos plasmídeos pTrc99A-ADS, pTrc99A-FSA, pTrc99A-LLS, pTrc99A-LMS, pTrc99A- GTS, pTre99A-APS, pTrc99A-BPS, pTrc99A-PHS, pTrc99A-TS, pTrc99A- CS, pTrc99A-SS e pAM373.
A Figura 10 são esquemáticos para a construção de plasmídeos pAM489-pAM498.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Definições A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado como habitualmente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual esta invenção pertence. Referência é feita aqui a vários termos que devem ser definidos como tendo os seguintes significados:
"Composto bio-orgânico" refere-se a um composto orgânico tendo pelo menos cinco átomos de carbono que pode ser fabricado por uma célula hospedeira tomando-se uma fonte de carbono de carboidrato e converter a fonte de carbono de carboidrato no produto desejado.
"Caminho da desóxi-xilulose 5-fosfato" ou "caminho de DXP" é aqui usado para se referir ao caminho que converte gliceraldeído-3-fosfato e piruvato a IPP e DMAPP. O caminho de DXP é esquematicamente ilustrado na Figura 4.
"Endógeno" refere-se a uma substância ou processo que pode ocorrer naturalmente, por exemplo, em uma célula hospedeira não recombinante.
"Ácido nucleico heterólogo" como aqui usado refere-se a um ácido nucleico em que pelo menos um dos seguintes é verdadeiro: (a) o ácido nucleico é estranho ("exógeno") a (isto é, não naturalmente encontrado em) uma dada célula hospedeira; (b) o ácido nucleico compreende uma seqüência de nucleotídeo que é naturalmente encontrada em (isto é, é "endógeno a") uma dada célula hospedeira, mas a seqüência de nucleotídeo é produzida em uma quantidade não natural (por exemplo, maior do que o esperado ou maior do que o naturalmente encontrado) na célula; (c) o ácido nucleico compreende uma seqüência de nucleotídeo que difere na seqüência de uma seqüência de nucleotídeo endógeno, mas a seqüência de nucleotídeo codifica a mesma proteína (tendo a mesma ou substancialmente a mesma seqüência de aminoácido) e é produzida em uma quantidade não natural (por exemplo, maior do que o esperado ou maior do que o naturalmente encontrado) na célula; ou (d) o ácido nucleico compreende duas ou mais seqüências de nucleotídeo que não são encontradas na mesma relação entre si na natureza (por exemplo, o ácido nucleico é recombinante).
"Célula hospedeira" e "microorganismo" são usados intercambiavelmente aqui para se referir a qualquer célula viva archae, bacteriana ou eucariótica na qual um ácido nucleico heterólogo pode ser ou foi inserido. O termo também diz respeito à progênie da célula original, que pode não ser necessária e completamente idêntica em morfologia ou em genômicos ou complemento de DNA total ao precursor original, devido à mutação natural, acidental ou deliberada.
"Isoprenóide" e "composto isoprenóide" são aqui usados intercambiavelmente e referem-se a um composto derivável de difosfato de isopentenila.
"Isolado" e "isolar" quando aludido a um composto bio- orgânico é o enriquecimento da quantidade do composto bio-orgânico em uma composição. Conseqüentemente, a quantidade do composto bio-orgânico em uma composição depois que o composto bio-orgânico foi isolado ou submetido a uma etapa de isolação é maior do que a quantidade presente na composição antes de tal etapa.
O "caminho de mevalonato" ou "caminho MEV" é aqui usado para se referir ao caminho biossintético que converte acetil-CoA a IPP. O caminho MEV é esquematicamente ilustrado na Figura 3.
"Que ocorre naturalmente" como aplicado a um ácido nucleico, uma enzima, uma célula ou um organismo, refere-se a um ácido nucleico, enzima, célula ou organismo que é encontrado na natureza. Por exemplo, uma seqüência de polipeptídeo ou polinucleotídeo que está presente em um organismo que pode ser isolado de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificado por um ser humano no laboratório é que ocorre naturalmente. "Opcional" ou "opcionalmente" significa que a característica ou estrutura subseqüentemente descritas podem estar presentes ou não ou que o evento ou circunstância subseqüentemente descritos podem ocorrer ou não e que a descrição inclui casos onde uma característica ou estrutura particulares estão presentes e casos onde a característica ou estrutura estão ausentes ou casos onde o evento ou circunstância ocorrem e casos onde o evento ou circunstância não ocorrem.
"Pirofosfato" é aqui usado intercambiavelmente com "difosfato".
Como aqui usado, uma composição que é um composto "substancialmente puro" é substancialmente livre de um ou mais outros compostos, isto é, a composição contém mais do que 80% em vol., mais do que 90% em vol., mais do que 95% em vol., mais do que 96% em vol., mais do que 97% em vol., mais do que 98% em vol., mais do que 99% em vol., mais do que 99,5% em vol., mais do que 99,6% em vol., mais do que 99,7% em vol., mais do que 99,8% em vol., mais do que 99,9% em vol. do composto; ou menos do que 20% em vol., menos do que 10% em vol., menos do que 5% em vol., menos do que 4% em vol., menos do que 3% em vol., menos do que 2% em vol., menos do que 1% em vol., menos do que 0,5% em vol., menos do que 0,1% em vol. ou menos do que 0,01% em vol. do um ou mais outros compostos, com base no volume total da composição.
Na seguinte descrição, todos os números aqui divulgados são valores aproximados, independente se as palavras "cerca de" ou "aproximado" são usadas em conexão com eles. Estes podem variar em 1 porcento, 2 porcento, 5 porcento, ou, algumas vezes, 10 a 20 porcento. Sempre que uma faixa numérica com um limite inferior, RL e um limite superior, RU, é divulgada, qualquer número que caia dentro da faixa é especificamente divulgada. Em particular, os seguintes números dentro da faixa são especificamente divulgados: R = RL + k*(RU-RL), em que k é uma variável que varia de 1 porcento a 100 porcento com um incremento de 1 porcento, isto é, k é 1 porcento, 2 porcento, 3 porcento, 4 porcento, 5 porcento,..., 50 porcento, 51 porcento, 52 porcento,..., 95 porcento, 96 porcento, 97 porcento, 98 porcento, 99 porcento ou 100 porcento. Além disso, qualquer faixa numérica definida pelos números R como definido no acima também é especificamente divulgada.
Além das definições acima, certos compostos aqui descritos têm uma ou mais ligações duplas que podem existir como o isômero Z ou E. A invenção em certas formas de realização abrange estes compostos como isômeros individuais em uma forma substancialmente pura assim como misturas de vários isômeros, por exemplo, misturas racêmicas de estereoisômero.
Aparelho para Fabricar Compostos Bio-orgânicos
A presente invenção fornece vários sistemas de produção para fabricar composto bio-orgânicos. Em algumas formas de realização, os compostos bio-orgânicos podem ser produzidos usando processos de fermentação por batelada, contínuo, batelada alimentada ou semi-contínuo.
A fermentação por batelada pode ser um sistema fechado onde a composição do meio é fixada no começo da fermentação e não submetida a alterações artificiais durante a fermentação. Assim, no começo da fermentação o meio é inoculado com o organismo ou organismos desejados e a fermentação é permitida ocorrer se adicionar nada ao sistema. Em algumas formas de realização, entretanto, a fermentação por "batelada" é batelada com respeito à adição de fonte de carbono e tentativas são freqüentemente feitas no controle de fatores tais como pH e concentração de oxigênio. Nos sistemas por batelada as composições de metabólito e biomassa do sistema podem mudar constantemente até o momento que a fermentação é interrompida. Dentro das culturas por batelada, as células podem ser controladas através de uma fase de demora estática a uma fase Iog de alto desenvolvimento e finalmente a uma fase estacionária onde a taxa de desenvolvimento é diminuída ou interrompida. Se não tratadas, as células na fase estacionária eventualmente morrerão. As células na fase log no geral são responsáveis pelo grosso de produção de produto final ou intermediário.
Uma variação no sistema de batelada padrão é o sistema de batelada alimentada. Os processos de fermentação em batelada alimentada também são adequados na presente invenção e compreendem um sistema de batelada típico com a exceção de que fonte de carbono ou substrato adicionais são adicionados em incrementos conforme a fermentação progride. Os sistemas de batelada alimentada são úteis quando a repressão de catabólito é adequada para inibir o metabolismo das células e onde é desejável ter quantidades limitadas de substrato no meio. As medições da concentração de substrato real nos sistemas de batelada alimentada é difícil e é portanto estimada com base nas mudanças de fatores mensuráveis tais como pH, oxigênio dissolvido e a pressão parcial de gases residuais tais como CO2-A fermentação contínua é um sistema aberto onde um meio de fermentação definida é adicionado continuamente a um ou mais biorreatores que podem estar em série e uma quantidade igual de meio condicionado é removida simultaneamente do sistema para processamento adicional. A fermentação contínua no geral mantém as culturas em uma densidade alta constante onde as células são primariamente no desenvolvimento da fase log. A fermentação contínua permite a modulação de um fator ou qualquer número de fatores que afetam o crescimento da célula ou concentração do produto final. Por exemplo, um método manterá um nutriente limitante tal como a fonte de carbono ou o nível de nitrogênio em uma taxa fixa e permitirá que todos os outros parâmetros sejam restringidos. Em outros sistemas vários fatores que afetam o crescimento podem ser alterados continuamente enquanto que a concentração de célula é mantida constante. Sistemas contínuos empenham-se em manter as condições de crescimento em estado constante e assim a perda de célula devido ao meio que é retirado deve ser equilibrada contra a taxa de crescimento da célula na fermentação.
Conseqüentemente, em algumas formas de realização da invenção, um sistema de produção bio-orgânico é fornecido que compreende:
a. pelo menos um vaso tendo uma capacidade de pelo menos 100 litros;
b. um meio aquoso, dentro do pelo menos um vaso, que compreende uma primeira fase;
c. uma pluralidade de células hospedeiras, dentro do meio aquoso, capaz de fabricar, produzir ou sintetizar pelo menos um composto bio-orgânico; e,
d. uma segunda fase orgânica líquida que compreende o pelo menos um composto bio-orgânico em contato com a primeira fase.
Um vaso adequado para o uso na presente invenção pode ser qualquer vaso para conter as células hospedeiras e meio aquoso para a fermentação. Por exemplo, o vaso pode ser um tanque para um reator ou fermentador ou pode ser uma parte de uma centrífuga que pode separar materiais mais pesados de materiais mais leves em etapas de processamento subseqüentes. Alternativamente, um ou uma pluralidade de vasos podem ser usados em um processo contínuo ou semi-contínuo.
Um exemplo ilustrativo geral de um vaso adequado 100 é mostrado na Figura 1. O vaso 100 inclui: um orifício de entrada 120 para a adição de células hospedeiras, meios de fermentação e outros compostos, nutrientes ou composições para ajudar, regular ou melhorar a fermentação das células hospedeiras, produção do composto ou compostos bio-orgânicos e desempenho de etapas de produção adicionais no vaso; um orifício de saída 130 para remover os materiais durante ou no final do processo de fermentação e uma saída de gás 140 para ventilar gases de exaustão tais como dióxido de carbono produzido durante ou depois do processo de fermentação. O vaso 100 pode ser completamente enchido com células hospedeiras, meios de fermentação e outros materiais de modo que não exista espaço para o gás no topo do vaso. Alternativamente, o vaso 100 pode ser parcialmente enchido deixando assim espaço vazio ocupado por um gás. A quantidade, pressão e composição do gás no espaço vazio pode ser controlado para otimizar ou maximizar o crescimento das células hospedeiras e a produção do composto bio-orgânico ou compostos bio-orgânicos. Por exemplo, durante a fermentação de células hospedeiras aeróbicas, o gás tipicamente pode compreender ar ou outro gás contendo oxigênio em várias pressões acima, na ou abaixo da pressão atmosférica, por exemplo para as células microaerofílicas e nanaeróbicas a concentração de oxigênio do gás pode ser controlada dentro de uma faixa mais baixa do que a concentração atmosférica embora ainda acima de zero durante a fermentação para as células hospedeiras anaeróbicas, o gás tipicamente tem pouco a nenhum oxigênio e pode completamente compreender pela maior parte ou completamente de nitrogênio ou outro gás adequado.
Em um sistema fechado, o orifício de entrada 120, orifício de saída 130 e saída de gás 140 do vaso 100 mostrado na Figura 1 podem ser fechados ou sob pressão positiva durante o processo de fermentação. De modo alternativo, particularmente quando do uso de células hospedeiras aeróbicas, o vaso 100 pode ser usado como um sistema aberto por meio do qual um ou mais dos orifícios e saídas são abertos para a atmosfera fornecendo um sistema para a transferência de massa de gás/líquido (entrada de ar ou oxigênio e saída de dióxido de carbono). Se desejado, a saída de gás 140 pode funcionar tanto como uma saída de gás quanto como uma entrada de gás onde oxigênio ou ar ou outro gás podem ser introduzidos no sistema. Em algumas formas de realização, o vaso 100 inclui entradas de gás separadas e saídas de gás separadas. Em tais sistemas abertos, aparelhagem adicional pode ser incluído no vaso para prevenir contaminação ou infiltração de outros organismos ou outros materiais no vaso durante a fermentação.
Uma outra forma de realização de vaso é ilustrada na Figura 2. Além do orifício de entrada 220, orifício de saída 230, entrada de gás 235 e saída de gás 240 similares ao vaso na Figura 1, o vaso 200 da Figura 2 inclui um agitador 250 para mistura. Em algumas formas de realização, o agitador 250 pode compreender um eixo acionado por motor 252 que pode incluir um selo de eixo 251 e é conectado a um ou mais hélices de impulsão 254. O agitador 250 pode ser tipicamente ligado ao topo ou fundo do vaso 200. Opcionalmente, cada hélice de impulsão 254 pode ser terminada com uma ou mais pás 256. As hélices de impulsão 254 podem ser de qualquer forma adequada e pode ser especificamente selecionada para controlar quantidade de mistura, taxa de crescimento das células hospedeiras, taxa de produção do composto bio-orgânico, taxa de cisalhamento e taxas de transferência de oxigênio ou outros gases. Adicionalmente, um ou mais defletores 258 podem ser adicionados ao vaso 200 para melhorar ainda mais a mistura. Em uma outro forma de realização, a agitação pode ser fornecida na forma de uma linha de reciclo com uma bomba que retira material de uma porção do vaso tal como o fundo e reintroduz o material no vaso em uma outra porção do vaso tal como no topo. A agitação dentro do vaso das células hospedeiras e do meio de fermentação ajuda a garantir que as células hospedeiras sejam expostas aos nutrientes adequados para permitir que elas cresçam e produzam os compostos bio-orgânicos.
Se o processo de fermentação é um processo aeróbico, oxigênio ou ar podem ser borbulhados através de um pulverizador 260 para a transferência de massa gás/líquido melhorada. O pulverizador 260 pode incluir uma ou mais saídas de gás (não mostradas) que são submergidas dentro dos meios de fermentação, preferivelmente no ou próximo ao fundo do vaso. Em algumas formas de realização, o pulverizador 260 pode ser um anel pulverizador tendo múltiplas saídas de gás dispostas em uma configuração no geral circular ou redonda. Alternativamente, para organismos sensíveis ao cisalhamento ou para reduzir a espumação, a aeração passiva do vaso pode ser fornecida, tal como o uso de várias peneiras de aeração, membranas, fibras ou outros dispositivos de aeração passiva ou pela remoção de uma porção do meio do vaso, oxigenando-o e retornando-o ao vaso.
Se controle de temperatura é desejado, então um aquecedor ou trocador de calor pode ser usado para aquecer ou esfriar a reação de fermentação. Em um forma de realização, a temperatura pode ser controlada usando uma camisa de aquecimento/esfriamento 270 circundante e/ou ligada a pelo menos uma porção do vaso 200 que pode ser conectado a um trocador de calor (não mostrado) que circula fluido de troca de calor controlado na temperatura através da camisa 270. Alternativamente, um aquecedor ou trocador de calor pode ser imerso no meio de fermentação. Os exemplos ilustrativos deste tipo de aquecedor ou trocador de calor incluem um aquecedor de imersão elétrico, um trocador de calor de tubo espiralado ou linear imerso que carrega um fluido de troca de calor tal como água ou óleo aquecidos e um ou mais pulverizadores que injetam uma corrente aquecida tal como ar e/ou água no meio de fermentação. Alternativa ou adicionalmente, um aquecedor ou trocador de calor pode ser ligado ao lado externo do vaso. Tais aquecedores e trocadores de calor incluem fita térmica elétrica nas paredes laterais externas do vaso e linhas de reciclo aquecidas ou encamisadas ligadas ao vaso.
O vaso 200 pode incluir entrada adicional e orifícios de saída. Em algumas formas de realização, a entrada adicional e orifícios de saída podem estar localizados no topo, lados ou fundo do vaso 200. Em algumas formas de realização, os orifícios de entrada adicionais incluem linhas alimentadas para a adição de oxigênio ou outros gases, nutrientes, espuma e agentes de controle de pH durante a reação de fermentação. Qualquer um dos orifícios de entrada e saída pode incluir mecanismos de esterilização para usos múltiplos incluindo uso em processo e conexão ou reconexão múltiplos durante o processo de fermentação.
Além disso, um ou mais orifícios sonda 280 e/ou válvulas de amostragem 290 podem ser posicionados em vários lugares no vaso 200 para ajudar a monitorar parâmetros críticos tais como concentrações de vários produtos e metabólitos, pH, nível de líquido, pressão, espuma, concentração de oxigênio dissolvido, temperatura, taxa de agitação, energia, voltagem, posições de válvula e densidade de célula durante o processo de fermentação.
Deve ser entendido que os vasos nas Figuras 1 e 2 são para propósitos ilustrativos e que muitas configurações de vaso diferentes para o processo de fermentação podem ser usadas, por exemplo, de acordo com o tipo de célula hospedeira, do composto ou compostos bio-orgânicos produzidos, do volume de produção, do tipo de processo de fermentação, do tipo de processamento a jusante, do processo de separação e outras considerações.
Um vaso tal como aquele mostrado na Figura 2 é adequado para o uso nos processos de fermentação por batelada. Se um processo de fermentação contínuo ou semi-contínuo é desejado (como oposto a um processo de fermentação por batelada) onde materiais são constantemente adicionados a ou retirados do vaso, o vaso tipicamente inclui orifícios de entrada e saída adicionais que podem estar localizados no topo, fundo ou nas laterais do vaso. Estes orifícios de entrada e saída adicionais facilitam o fluxo de materiais dentro e fora do vaso. Em algumas formas de realização, um ou mais vasos continuamente recebem células hospedeiras, meio de fermentação e aditivos opcionais enquanto continuamente descarregam células hospedeiras, subprodutos e/ou compostos bio-orgânicos dos vasos. Nestas formas de realização, a descarga de um vaso pode ser usada como o estoque de alimentação para um outro vaso que opcionalmente também recebe células hospedeiras, meio de fermentação, nutrientes e/ou outros aditivos frescos. Um único vaso ou uma série de vasos juntos podem ser configurados para fornecer o tempo de residência médio desejado para as células hospedeiras. Uma porção da descarga de um dos vasos a jusante pode ser retornada a um ou mais vasos a montante para reciclar a descarga para um estágio mais no início do processamento ou outros materiais das etapas de processamento mais a jusante podem ser reintroduzidos nos vasos.
Os vasos usados em algumas formas de realização da presente invenção incluem aparelhagem adicional que podem ser ligadas ao vaso para facilitar o processamento. Tal aparelhagem pode incluir aparelhagem adicional para facilitar o processamento de limpeza no lugar e esterilização no lugar. Em algumas formas de realização, um, alguns ou cada um dos orifícios, saídas, entradas, válvulas e toda a aparelhagem dentro do vaso pode ser esterilizado no lugar. Em algumas formas de realização, a esterilização pode ocorrer usando esterilização com vapor. Por exemplo, qualquer um dos orifícios, saídas ou válvulas de amostragem podem incluir ou ter ligado a elas aparelhagem adicional que forneça abastecimento de vapor ao e retorno de condensado do orifício de saída ou válvula tal que a mesma possa ser esterilizada com vapor antes do uso ou reuso.
O vaso ou vasos podem ter uma capacidade de pelo menos 1OO litros. Em algumas formas de realização, o vaso tem uma capacidade de 100 a 3.000.000 litros tal como pelo menos 1000 litros, pelo menos 5.000 litros, pelo menos 10.000 litros, vaso de pelo menos 25.000 litros, pelo menos 50.000 litros, pelo menos 75.000 litros, pelo menos 100.000 litros, pelo menos 250.000 litros, pelo menos 500.000 litros ou pelo menos 1.000.000 litros.
O vaso ou vasos podem incluir ou ter ligado a eles sensores e sondas para medir vários parâmetros tais como pressão, pH, concentração de oxigênio dissolvido, temperatura, taxas de fluxo de gás, taxas de fluxo de líquido, nível de líquido, posições de válvula, espumação, agitação, energia, voltagem e quaisquer outros parâmetros úteis no controle ou otimização do crescimento das células hospedeiras e da produção do composto ou compostos bio-orgânicos. Os sensores e sondas podem alimentar informação a um ou mais sistemas automatizados para controlar e registrar os vários parâmetros medidos e para ajustar qualquer um dos vários parâmetros controlando-se as taxas de fluxo de ar, energia, aquecimento ou esfriamento para controlar a temperatura do vaso, rpms de agitação, bombas, esterilização ou limpeza no lugar do vaso ou qualquer uma das válvulas de entrada, saída, adição, amostragem ou outros orifícios, controle do fluxo de saída ou qualquer outro mecanismo relevante para controlar um parâmetro ou parâmetros da fermentação. Tais ajustes podem ocorrer usando qualquer mecanismo de controle conhecido, tais como por exemplo, controle ou atuação de várias válvulas, bombas ou motores e podem usar sistemas de controle proporcional, proporcional-integral ou proporcional-integral- derivativo.
O sistema ou sistemas automatizados podem ser adicionalmente controlados e monitorados por um sistema de controle central, que pode ser um sistema de controle amplo local ou da planta e pode controlar a produção de apenas um processo de produção de composto bio-orgânico ou processos de produção de composto bio-orgânico múltiplos. O sistema ou sistemas automatizados e sistema de controle central podem compreender qualquer software, fírmware e/ou hardware adequados, que podem ser patenteados ou em circulação ou uma combinação destes e pode comunicar usando qualquer sistema de comunicação adequado. Os exemplos não limitantes de tais sistemas de comunicação incluem sistemas fisicamente conectados que podem ser digitais ou analógicos e podem incluir conexão direta ou estar na forma de uma rede tal como um LAN ou um WAN ou eternet. Além disso, em algumas formas de realização o sistema de comunicação pode ser sem fio e pode ser patenteado, BLUETOOTH, ultra wide band, 802,11 a,b,g ou η ou ZigBee, incluindo TDMA, FDMA, OFDM e CDMA e pode operar em qualquer faixa de freqüência adequada tal como 2,4 GHz ou 5,8 GHz.
Qualquer um dos vasos usados na produção dos compostos bio-orgânicos pode incluir aparelhagem adicional, tal como agitadores adicionais, orifícios de entrada adicionais, orifícios de saída, orifícios de amostragem, equipamento de aquecimento/resfriamento adicional, tal como serpentina de aquecimento adicional, equipamento de aeração adicional tal como pulverizadores adicionais, sensores e sondas adicionais, equipamento de limpeza ou esterilização adicionais para facilitar o processamento ou qualquer outro parâmetro da fermentação.
Em algumas formas de realização da invenção, um sistema de produção de isoprenóide é fornecido que compreende:
a. pelo menos um vaso tendo uma capacidade de pelo menos 100 litros;
b. um meio aquoso, dentro do pelo menos um vaso, que compreende uma primeira fase;
c. uma pluralidade de células hospedeiras, dentro do meio aquoso, capaz de fabricar, produzir ou sintetizar um ou mais compostos de isoprenóide; e,
d. uma segunda fase orgânica líquida que compreende o um ou mais compostos de isoprenóide em contato com a primeira fase.
Em algumas formas de realização, o composto ou compostos de isoprenóide são um isoprenóide C5. Estes compostos são derivados de uma unidade de isopreno e também são chamados semi-terpenos. Um exemplo ilustrativo de um semi-terpeno é o isopreno. Em outras formas de realização, o composto ou compostos de isoprenóide é um isoprenóide C10. Estes compostos são derivados de duas unidade de isoprenos e também são chamados monoterpenos. Um exemplo ilustrativo de um monoterpeno é mirceno. Em outras formas de realização, o composto ou compostos de isoprenóide é um isoprenóide C15. Estes compostos são derivados de três unidades de isopreno e também são chamados sesquiterpenos. Um exemplo ilustrativo de um sesquiterpeno é patchoulol (que também é conhecido como álcool de patchouli). Em outras formas de realização, o composto ou compostos de isoprenóide é um isoprenóide C20. Estes compostos são derivados de quatro unidades de isopreno e também chamados diterpenos. Um exemplo ilustrativo de um diterpeno é taxadieno. Já em outros exemplos, o composto ou compostos de isoprenóide é um isoprenóide C20+. Estes compostos são derivados de mais do que quatro unidades de isopreno e incluem: triterpenos (compostos de isoprenóide C30 derivados de 6 unidades de isopreno) tais como esqualeno; tetraterpenos (compostos de isoprenóide C40 derivados de 8 isoprenóides) tais como β-caroteno; e politerpenos (compostos de isoprenóide C40+ derivados de mais do que 8 unidades de isopreno) tais como poliisopreno. Em algumas formas de realização, o composto ou compostos de isoprenóide podem ser qualquer combinação de dois ou mais compostos de isoprenóide.
Em um outro aspecto da presente invenção, um método para produzir pelo menos um composto bio-orgânico é fornecido que compreende:
a. cultivar em um meio aquoso uma pluralidade de células hospedeiras que produzam, fabriquem ou sintetizem pelo menos um composto bio-orgânico em que o meio aquoso compreende uma primeira fase;
b. formar uma segunda fase orgânica líquida que compreenda o pelo menos um composto bio-orgânico em contato com a primeira fase;
c. separar pelo menos uma porção da segunda fase da primeira fase; e,
d. isolar o pelo menos um composto bio-orgânico da segunda fase.
O sistema de produção de isoprenóide pode incluir um ou mais componentes de processamento adicionais incluindo: 1) um ou mais sistemas de separação para separar o pelo menos um composto bio-orgânico do meio aquoso e a segunda fase orgânica; 2) um ou mais reatores para alterar biológica ou quimicamente o pelo menos um composto bio-orgânico tal como pela adição, substituição, hidrogenação, alquilação, hidroxilação, condensação, halogenação ou qualquer outra reação adequada; 2) um ou mais vasos de mistura ou sistemas para misturar o pelo menos um composto bio- orgânico com um ou mais componentes adicionais; 3) e um ou mais sistemas de purificação ou separação adicionais para purificar ainda mais a composição bio-orgânica ou o pelo menos um composto bio-orgânico.
A segunda fase pode compreender o pelo menos um composto bio-orgânico. O composto bio-orgânico pode formar uma porção, a maior parte ou substancialmente toda da segunda fase. Em certas formas de realização, o composto bio-orgânico forma 1% a 99%, tal como 5% a 95%, 10% a 90%, 20% a 80%, 25% a 75%, 35% a 65% ou 40% a 50% da segunda fase. Em certas formas de realização, a segunda fase consiste essencialmente do composto bio-orgânico.
Em algumas formas de realização, a pluralidade de células hospedeiras inclui mais do que um tipo de célula hospedeira, tal como mais do que uma espécie ou cepa de células hospedeiras, por exemplo 2 a 5 espécies ou cepas de células hospedeiras, por exemplo 2, 3, 4 ou 5 espécies ou cepas de células hospedeiras. Em algumas formas de realização a pluralidade of células hospedeiras pode produzir mais do que um composto bio-orgânico, tal como 2 a 5 compostos bio-orgânicos, por exemplo 2, 3, 4 ou 5 compostos bio-orgânicos.
O composto ou compostos bio-orgânicos podem ser isolados da primeira fase e/ou segunda fase usando qualquer método de separação adequado. Em algumas formas de realização, o composto bio-orgânico é isolado da segunda fase tal que o mesmo seja substancialmente puro. Em algumas formas de realização, a segunda fase orgânica ocorre espontaneamente como um resultado das interações químicas e moleculares tais como diferenças na solubilidade ou hidrofobicidade, densidade, concentração ou qualquer outro mecanismo de separação de fase espontâneo. Em outras formas de realização, a separação da primeira e segunda fases é induzida em um vaso ou vasos ou sistema de separação que podem ser o mesmo ou um vaso ou vasos ou sistema de processamento diferentes como o vaso ou vasos de fermentação. Em algumas formas de realização, a separação de fase é induzida pela centrifugação tal como centrifugação contínua ou em batelada. Em outras formas de realização, a separação de fase é induzida pela introdução de um desemulsificador ou um agente de nucleação na reação de fermentação. Um desemulsificador impede ou limita a quantidade do composto ou compostos bio-orgânicos que emulsificam com a fase aquosa. Exemplos ilustrativos de desemulsificadores incluem floculantes e coagulantes. Um agente de nucleação facilita a agregação de gotículas menores do composto bio-orgânico para coalescer e eventualmente formar uma fase separada. Se quantidades suficientes de um agente de nucleação são usadas, o próprio agente de nucleação forma uma segunda fase orgânica na qual o composto bio-orgânico migra. Os exemplo ilustrativos de agentes de nucleação incluem gotículas do próprio composto ou compostos bio-orgânicos e solventes orgânicos tais como dodecano, miristato de isopropila e oleato de metila. Algumas formas de realização podem incluir uma combinação de um ou mais dos materiais e métodos de separação de fase acima.
Uma vez que a separação de fase ocorre, as fases separadas podem ser individualmente tiradas do vaso de separação. Qualquer quantidade da segunda fase pode ser separada da primeira fase, por exemplo, toda, uma porção, 1% a 100% tal como 5% a 95%, 10% a 90%, 20% a 80%, 25% a 75%, 35% a 65% ou 40% a 50% da segunda fase pode ser separada da primeira fase. Se a segunda fase orgânica é menos densa do que a primeira fase aquosa, então uma ou mais torneiras podem ser fornecidas ou colocadas no vaso de separação próximo da interface entre as duas fases (preferivelmente dentro da segunda fase orgânica) para decantar a segunda fase orgânica antes de remover a fase aquosa mais densa. Alternativamente, a primeira fase aquosa pode ser removida do vaso de separação usando uma saída próxima do fundo do vaso de separação até que a segunda fase orgânica apareça. Ponto no qual, a segunda fase orgânica pode ser transferida em um local separado para processamento adicional ou armazenagem. Tanto a primeira fase aquosa quanto a segunda fase orgânica podem fluir para fora do vaso de separação sob a força da gravidade, pressão de gás ou através do uso de uma bomba ou bombas ou uma combinação destes.
Se a segunda fase orgânica é mais densa do que a primeira fase aquosa, então uma ou mais torneiras podem ser fornecidas ou colocadas no vaso de separação próximo à interface entre as duas fases (preferivelmente dentro da segunda fase orgânica) para decantar a primeira fase aquosa antes de remover a segunda fase orgânica mais densa. Alternativamente a segunda fase orgânica pode ser removida do vaso de separação usando um saída próxima ao fundo do vaso de separação.
Para um processo contínuo em que a primeira fase aquosa é mais densa do que a segunda fase orgânica, um vaso de separação com uma ou mais torneiras pode conter um volume especificado do meio de fermentação e células hospedeiras e a segunda fase orgânica continuamente produzida pode ser decantada através das torneiras para armazenagem ou processamento adicional. Se a segunda fase orgânica é mais densa do que a primeira fase aquosa, a segunda fase orgânica pode ser removida continuamente do fundo do vaso de separação a uma razão que impeça o esgotamento completo da segunda fase orgânica do vaso de separação para evitar a drenagem da primeira fase aquosa. Em algumas formas de realização, o composto bio-orgânico pode ser isolado da segunda fase orgânica usando absorção, um processo em que as moléculas se movem de um líquido volumoso para a superfície de absorventes. Exemplos ilustrativos de absorventes incluem carbono ativado; aluminas; aluminossilicatos tais como zeólitos; argilas tais como greda de pisoeiro; peneiras moleculares; polímeros orgânicos tais como poliestireno e resinas; e sílicas tais como gel de sílica. Dependendo do absorvente usado, o absorvente pode ser usado para capturar o produto bio-orgânico desejado ou subprodutos não desejados. A isolação pela absorção pode ser realizada usando um processo em batelada, contínuo ou semi-contínuo.
Em outras formas de realização, o composto bio-orgânico pode ser isolado da segunda fase orgânica usando destilação, um método de separar substâncias com base nas diferenças em suas volatilidades. Na destilação por batelada, um lote inteiro de liquido é inicialmente carregado em um vaso e depois aquecido ou reduzido em pressão dentro do vaso. Vapor é desse modo continuamente gerado e pode ser condensado para formar um destilado líquido que é coletado. Na destilação de equilíbrio contínua, uma alimentação líquida que flui continuamente é aquecida ou reduzida em pressão de modo a causar vaporização parcial da mistura e recuperação separada dos componentes de líquido e vapor. O líquido e o vapor desprendem-se enquanto fluem através de uma coluna de destilação e os produtos emergem como correntes de vapor e líquido. Quando o vapor e líquido aproximam-se do equilíbrio de fase, isto é chamado um processo de cintilação. Se desejado, o produto de vapor pode ser condensado para formar um destilado líquido.
Em outras formas de realização, o composto ou compostos bio-orgânicos são isolados da segunda fase orgânica usando extração de gás- líquido. Este processo também é conhecido como despojamento e é a transferência de um componente dissolvido em uma corrente líquida em uma corrente de vapor em uma forma mais concentrada. A temperatura e pressão podem ser otimizados para a transferência do composto bio-orgânico desejado. Exemplos ilustrativos de correntes de vapor incluem ar e vapor. Tipicamente, a corrente de líquido flui para baixo em uma coluna enquanto a corrente de vapor é borbulhada para cima (fluindo em contracorrente em relação à corrente de líquido).
Em outras formas de realização, o composto bio-orgânico é isolado da segunda fase orgânica usando a extração de líquido-líquido. Também conhecida como extração com solvente, extração de líquido-líquido é a transferência de uma substância de uma fase líquida em uma outra fase líquida imiscível.
Em um sistema de extração de líquido-líquido por batelada, o líquido alimentado (a segunda fase orgânica) é misturado com uma segunda fase líquida imiscível em um vaso adequado. A mistura é depois permitida sedimentar em camadas e separar em extrato e rafinato e a camada mais leve pode ser decantada do vaso. O composto ou compostos bio-orgânicos desejados podem estar no extrato ou rafinato dependendo do produto e solvente usados.
Em um sistema de extração de líquido-líquido contínuo, diferenças em densidade, pressão de vapor em uma dada temperatura ou pontos de ebulição são usados para separar o produto bio-orgânico desejado do líquido alimentado (a fase orgânica). Tais sistemas podem usar tanques misturadores/sedimentadores, torres ou colunas, centrífugas e combinações destas para efetuar a separação.
Em outras formas de realização, o composto bio-orgânico é isolado da segunda fase orgânica e/ou da primeira fase aquosa usando ultrafiltração, um processo de membrana impulsionado por pressão usado para separar componentes de solução na base de tamanho e forma moleculares. Sob uma diferença de pressão aplicada através de uma membrana de ultrafiltração, solvente e espécies de soluto pequenas passam através da membrana e são coletadas como permeado enquanto que as espécies de soluto maiores são retidas pela membrana e recuperadas como um retido concentrado. A ultrafiltração envolve solutos cujas dimensões moleculares são dez ou mais vezes maiores do que aquelas do solvente e estão usualmente abaixo de 1/2 mícron no tamanho. Os solutos ou os materiais a serem separados usualmente têm pesos moleculares maiores do que 500 amu, tais como macromoléculas, dispersões coloidais e emulsões. Um exemplo não limitante de um sistema de ultrafiltração é um sistema de ultrafiltração de fluxo tangencial.
Em algumas formas de realização, as células hospedeiras são capazes de produzir de cerca de 10 a cerca de 50 gramas, mais do que cerca de 15 gramas, mais do que cerca de 20 gramas, mais do que cerca de 25 gramas ou mais do que cerca de 30 gramas de composto bio-orgânico por litro de meio de fermentação.
Em algumas formas de realização, as células hospedeiras são capazes de produzir de cerca de 50 a cerca de 1500 miligramas, tal como mais do que cerca de 100 miligramas, mais do que cerca de 150 miligramas, mais do que cerca de 200 miligramas, mais do que cerca de 250 miligramas, mais do que cerca de 500 miligramas, mais do que cerca de 750 miligramas ou mais do que cerca de 1000 miligramas de composto bio-orgânico por grama de peso de célula seca.
Sistema de Produção de Composição de Combustível
Em algumas formas de realização, a invenção compreende um sistema de produção de composição de combustível que compreende:
a. pelo menos um vaso tendo uma capacidade de pelo menos 100 litros;
b. um meio aquoso, dentro do vaso, que compreende uma primeira fase;
c. uma pluralidade de células hospedeiras, dentro do meio aquoso, capaz de fabricar, produzir ou sintetizar pelo menos um composto bio-orgânico; e,
d. uma segunda fase orgânica líquida que compreende o pelo menos um composto bio-orgânico em contato com a primeira fase.
O sistema de produção de composição de combustível pode incluir um ou mais componentes de processamento adicionais incluindo: 1) um ou mais sistemas de separação para separar o pelo menos um composto bio-orgânico do meio aquoso e a segunda fase orgânica; 2) um ou mais reatores para alterar biológica ou quimicamente o pelo menos um composto bio-orgânico tal como pela adição, substituição, hidrogenação, alquilação, hidroxilação, condensação, halogenação ou qualquer outra reação adequada; 2) um ou mais vasos de mistura ou sistemas para misturar o pelo menos um composto bio-orgânico com um ou mais componentes de combustível adicionais tais como um combustível com base em petróleo, um aditivo de combustível ou uma combinação destes; e, 3) um ou mais sistemas de purificação ou separação adicionais para purificar ainda mais a composição de combustível ou o pelo menos um composto bio-orgânico.
Em algumas formas de realização, o aditivo de combustível é selecionado do grupo que consiste de oxigenados, antioxidantes, protetores ambientais, melhoradores da estabilidade térmica, melhoradores de cetano, estabilizadores, melhoradores de fluxo frio, melhoradores de combustão, anti- espumantes, aditivos anti-névoa, inibidores de corrosão, melhoradores de lubricidade, inibidores da formação de gelo, aditivos de limpeza de injetor, supressores de fumaça, aditivos redutores de arraste, desativadores de metal, dispersantes, detergentes, desemulsificadores, pigmentos, marcadores, dissipadores estáticos, biocidas e combinações destes.
Em algumas formas de realização, o sistema de produção de composição de combustível compreende:
a) um ou mais sistemas de fermentação em batelada, batelada alimentada ou de fluxo contínuo que compreendem:
i) pelo menos um vaso tendo uma capacidade de pelo menos 100 litros;
ii) um meio aquoso, dentro do pelo menos um vaso, que compreende uma primeira fase;
iii) uma pluralidade de células hospedeiras, dentro do meio aquoso, capaz de fabricar, produzir ou sintetizar pelo menos um composto bio-orgânico; e,
iv) uma segunda fase orgânica líquida que compreende o pelo menos um composto bio-orgânico em contato com a primeira fase;
b) um ou mais sistemas de separação de primeira fase por meio dos quais a primeira fase e a segunda fase orgânica ou um ou mais componentes da segunda fase orgânica são separados;
c) opcionalmente um ou mais sistemas de separação de segunda fase por meio dos quais o pelo menos um composto bio-orgânico é separado da segunda fase orgânica;
d) opcionalmente um ou mais reatores ou vasos em que o pelo menos um composto bio-orgânico é química ou biologicamente modificado;
e) opcionalmente um ou mais sistemas de purificação por meio dos quais o composto bio-orgânico ou o composto bio-orgânico modificado é purificado ou mais purificado;
f) opcionalmente um ou mais vasos de mistura ou sistemas para misturar o pelo menos um composto bio-orgânico com um ou mais componentes de combustível adicionais; e
g) opcionalmente um ou mais sistemas de purificação adicionais por meio dos quais a mistura do pelo menos um composto bio- orgânico e o um ou mais componentes de combustível adicionais é purificado ou mais purificado.
Em algumas formas de realização, o um ou mais sistemas de separação de primeira fase compreende um ou mais sistemas, vasos ou outros componentes de separação de fase aqui detalhados configurados especificamente para separar a primeira fase da segunda fase orgânica. Em algumas formas de realização o um ou mais sistemas de separação de segunda fase inclui um ou mais sistemas, vasos ou componentes de separação de fase aqui detalhados configurados especificamente para separar o composto ou compostos bio-orgânicos da segunda fase orgânica.
Em algumas formas de realização, o um ou mais reatores em que o pelo menos um composto bio-orgânico é química ou biologicamente modificado compreende o mesmo vaso ou vasos ou diferentes usados para a fermentação ou os sistemas de separação. Alternativamente, o um ou mais reatores podem compreender um ou mais vasos diferentes, que podem incluir aparelhagem, sensores, orifícios, sondas e/ou sistemas de controle adicionais adequados para a reação ou reações específicas ou outras modificações ao composto ou compostos bio-orgânicos que são aqui representados. Os reatores podem ser reatores em batelada, batelada alimentada ou contínuo.
Em algumas formas de realização, os compostos bio-orgânicos ou compostos bio-orgânicos modificados ou as composições de combustível podem ser purificados ou mais purificados usando um ou mais sistemas de purificação. Os sistemas de purificação podem compreender qualquer sistema de purificação adequado incluindo qualquer sistema que possa remover compostos não desejados ou compostos bio-orgânicos ou que possam separar os compostos não desejados dos compostos bio-orgânicos. Em algumas formas de realização, o sistema de purificação pode compreender um ou mais sistemas, vasos ou componentes de separação de fase aqui detalhados que possam ser especificamente configurados para se obter a pureza desejada do composto ou compostos bio-orgânicos. Em algumas formas de realização, a purificação pode ser realizada usando um ou mais sistemas de separação em série para se obter a pureza desejada. Em algumas formas de realização, os sistemas de separação podem ser configurados de modo diferente um do outro de modo a obter a pureza na maneira escalonada.
Em algumas formas de realização, a purificação será realizada para se obter as especificações ou exigências de leis federais, estaduais ou locais, regras ou regulamentos para os compostos bio-orgânicos ou para composições de combustível. Em algumas formas de realização, a purificação pode melhorar a funcionalidade dos compostos bio-orgânicos ou composições de combustível além das exigências de leis federais ou estaduais, regras ou regulamentos. Em algumas formas de realização, as leis, regras ou regulamentos federais, estaduais ou locais pode dizer respeito às emissões ambientais, desempenho de combustível, incentivos de taxa e outros incentivos econômicos. Em algumas formas de realização, a purificação pode reduzir o impacto ambiental de, pegada de carbono de, eficiência de combustível obtido de, confiabilidade obtida de, energia disponível de ou custos econômicos de longa duração dos compostos bio-orgânicos ou composições de combustível.
Em algumas formas de realização o sistema de composição de combustível inclui um ou mais vasos de mistura ou sistemas para misturar o pelo menos um composto bio-orgânico com um ou mais componentes de combustível adicionais. O vaso de mistura ou sistema de mistura podem ser quaisquer vasos ou sistemas adequados. O vaso de mistura pode incluir qualquer ou todas das entradas, saídas, orifícios, sensores, sondas, agitadores e outra aparelhagem identificada para o vaso de produção de composto bio- orgânico. O vaso de mistura pode misturar um ou mais componentes de combustível com o composto ou compostos bio-orgânicos. Por exemplo, 2 a 5 componentes de combustível, tal como 3 ou 4 componentes de combustível. O sistema de mistura pode ser por batelada, contínuo ou batelada alimentada.
Em algumas formas de realização, a invenção compreende um método de fabricar uma composição de combustível que compreende: a. cultivar em um meio aquoso uma pluralidade de células hospedeiras que produzam, fabriquem ou sintetizem pelo menos um composto bio-orgânico em que o meio aquoso compreende uma primeira fase;
b. formar uma segunda fase orgânica líquida que compreenda o pelo menos um composto bio-orgânico em contato com a primeira fase;
c. separar pelo menos uma porção da segunda fase da primeira fase;
d. isolar o pelo menos um composto bio-orgânico da segunda fase;
e. opcionalmente modificar química ou biologicamente o pelo menos um composto bio-orgânico;
f. opcionalmente purificar o composto bio-orgânico ou o composto bio-orgânico modificado;
g. opcionalmente misturar o pelo menos um composto bio- orgânico com um ou mais componentes de combustível adicionais; e
g) opcionalmente purificar a mistura do um ou mais compostos bio-orgânicos e o um ou mais componentes de combustível adicionais.
Em algumas formas de realização, a composição de combustível compreende uma composição de biocombustível. Em algumas formas de realização, o biocombustível compreende ainda pelo menos um composto bio-orgânico e um combustível com base em petróleo, um aditivo de combustível ou uma combinação destes. Em outras formas de realização, o combustível com base em petróleo é uma gasolina, combustível de jato, querosene, combustível diesel ou uma combinação destes.
Em algumas formas de realização, o sistema de produção de composto bio-orgânico ou o sistema de produção de composição de combustível pode ser construída ou criada aperfeiçoando-se uma instalação de produção de etanol.
Em algumas formas de realização, os sistemas de produção de composição de combustível pode compreender um ou mais sistemas de controle automatizados. Os sistemas de controle automatizados podem ser os mesmos ou diferentes dos sistemas de controle para o sistema de produção de bio-orgânico e podem compreender vários sensores, sondas e outros equipamentos para medir e controlar os vários parâmetros de processo associados com cada sistema dentro do sistema de composição de combustível e cada etapa ou os métodos de produção da composição de combustível. O sistema ou sistemas automatizados podem ser adicionalmente controlados e monitorados por um sistema de controle central, que pode ser um sistema de controle amplo local ou de fábrica e pode controlar a produção apenas de um processo de produção de composto bio-orgânico ou processos de produção de composto bio-orgânico múltiplos. O sistema ou sistemas automatizados e o sistema de controle central podem compreender qualquer software, fírmware e/ou aparelhagem adequados, que podem ser patenteados ou em circulação ou uma combinação destes e pode comunicar usando qualquer sistema de comunicação adequado. Os exemplos não limitantes de tais sistemas de comunicação incluem sistemas fisicamente conectados que podem ser digitais ou analógicos e podem incluir conexão direta ou estar na forma de uma rede tal como uma LAN ou uma WAN ou eternet. Além disso, em algumas formas de realização o sistema de comunicação pode ser sem fio e pode ser patenteado, BLUETOOTH, ultra wide band, 802.11 a,b,g ou η ou ZigBee, incluindo TDMA, FDMA, OFDM e CDMA e pode operar em qualquer faixa de freqüência adequada tal como 2,4 GHz ou 5,8 GHz.
Células Hospedeiras
Qualquer célula hospedeira adequada pode ser usada na prática da presente invenção. Em algumas formas de realização, a célula hospedeira é um microorganismo hospedeiro geneticamente modificado em que as moléculas de ácido nucleico foram inseridas, deletadas ou modificadas (isto é, mutadas; por exemplo, pela inserção, deleção, substituição e/ou inversão de nucleotídeos), para produzir o composto bio-orgânico desejado ou efetuar um rendimento aumentado do composto bio-orgânico desejado.
Os exemplos ilustrativos de células hospedeiras adequadas incluem qualquer célula archae, bacteriana ou eucariótica. Os exemplos de células archae incluem, mas não são limitadas àquelas pertencentes aos gêneros: Aeropirum, Archaeglobus, Halobacterium, Metanococcus, Metanobacterium, Pirococcus, Sulfolobus e Thermoplasma. Os exemplos ilustrativos de espécies archae incluem mas não são limitadas a: Aeropirum pernix, Archaeoglobus fulgidus, Metanococcus jannaschii, Metanobacterium thermoautotrophicum, Pirococcus abyssi, Pirococcus horikoshii, Thermoplasma acidophilum, Thermoplasma volcanium.
Os exemplos de células bacterianas incluem, mas não são limitadas àquelas pertencentes aos gêneros: Agrobacterium, Aliciclobacillus, Anabaena, Anacystis, Arthrobacter, Azobacter, Bacillus, Brevibacterium, Chromatium, Clostridium, Corynebacterium, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Lactobacillus, Lactococcus, Mesorhizobium, Metilobacterium, Microbacterium, Phormidium, Pseudomonas, Rhodobacter, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Rhodococcus, Salmonella, Scenedesmun, Serratia, Shigella, Staphlococcus, Strepromyces, Synnecoccus e Zymomonas.
Os exemplos ilustrativos de espécies bacterianas incluem mas não são limitadas a: Bacillus subtilis, Bacillus amiloliquefacines, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium immariophilum, Clostridium beigerinckii, Enterobacter sakazakii, Escherichia coli, Lactococcus lactis, Mesorhizobium Ioti, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mevalonii, Pseudomonas pudica, Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides, Rhodospirillum rubrum, Salmonella enterica, Salmonella typhi, Salmonella iyphimurium, Shigella dysenteriae, Shigella jlexneri, Shigella sonnei, Staphilococcus aureus e outras. No geral, se uma célula hospedeira bacteriana é usada, uma cepa não patogênica é preferida. Os exemplos ilustrativos de espécies com cepas não patogênicas incluem mas não são limitadas a: Bacillus subtilis, Escherichia eoli, Lactibacillus aeidophilus, Lactobacillus helvetieus, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mevalonii, Pseudomonas pudita, Rhodobaeter sphaeroides, Rodobaeter capsulatus, Rhodospirillum rubrum e outras.
Os exemplos de células eucarióticas incluem mas não são limitadas às células fungicas. Os exemplos de células fungicas incluem, mas não são limitados àquelas pertencentes aos gêneros: Aspergillus, Candida, Chrysosporium, Cryotoeoeeus, Fusarium, Kluyveromyces, Neotyphodium, Neurospora, Penieillium, Piehia, Saccharomyees, Triehoderma e Xanthophillomyces (antigamente Phaffia).
Os exemplos ilustrativos de espécies eucarióticas incluem mas não são limitados a: Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Candida albieans, Chrysosporium lueknowense, Fusarium gramipróximaum, Fusarium venenatum, Kluyveromyces laetis, Neurospora crassa, Piehia angusta, Pichia finlandica, Piehia kodamae, Pichia membranaefaeiens, Piehia metanolica, Piehia opuntiae, Piehia pastoris, Piehia pijperi, Piehia quereuum, Piehia salietaria, Piehia thermotolerans, Piehia trehalophila, Piehia stipitis, Streptomyees ambofaeiens, Streptomyees aureofaeiens, Streptomyees aureus, Saccaromyees bayanus, Saccaromyees boulardi, Saccharomyees eerevisiae, Streptomyees fungieidieus, Streptomyees griseoehromogenes, Streptomyees griseus, Streptomyees lividans, Streptomyees olivogriseus, Streptomyees rameus, Streptomyees tanashiensis, Streptomyees vinaeeus, Triehoderma reesei e Xanthophillomyces dendrorhous (antigamente Phaffia rhodozyma).
No geral, se uma célula eucariótica é usada, uma cepa não patogênica é preferida. Os exemplos ilustrativos de espécies com cepas não patogênicas incluem mas não são limitadas a: Fusarium graminearum, Fusarium venenatum, Pichia pastoris, Saccaromyces boulardi e Saccaromyees eerevisiae.
Em algumas formas de realização, as células hospedeiras da presente invenção foram designadas pelo Food and Drug Administration como GRAS ou No Geral Consideradas Como Seguras. Os exemplos ilustrativos de tais cepas incluem: Bacillus subtilis, Lactibacillus aeidophilus, Lactobacillus helveticus e Saccharomyees eerevisiae. Caminhos de Engenharia para fabricar Compostos Bio-orgânicos
Um exemplo ilustrativo de uma classe de compostos bio- orgânicos é isoprenóides. Estes compreendem uma família diversa de mais de 40.000 produtos individuais, muitos dos quais são vitais para os organismos vivos. Os isoprenóides servem para manter a fluidez celular, transporte de elétron, e outras funções metabólicas. Além da sua utilidade na fabricação de composições de combustível, um vasto número de isoprenóides naturais e sintéticos são úteis como produtos farmacêuticos, cosméticos, perfumes, pigmentos e corantes, fungicidas, anti-sépticos, nutracêuticos e intermediários químicos finos.
Compostos de isoprenóide são fabricados na natureza através de dois caminhos metabólicos diferentes que convergem em IPP e seu isômero, DMAPP. No geral, eucariotas outros que não plantas usam o caminho do isoprenóide MEY exclusivamente para converter acetil-CoA a IPP, que é subseqüentemente isomerizada a DMAPP. Os procariotas, com algumas exceções, usam o caminho independente de mevalonato ou DXP para produzir IPP e DMAPP separadamente através de um ponto ramificado. No geral, as plantas usam tanto os caminhos de MEV e DXP para a síntese de IPP. Os métodos aqui descritos para engenheirar os caminhos de MEV e DXP para fabricar o composto de isoprenóide desejado pode ser facilmente adaptado para similarmente engenheirar outros caminhos para fabricar outros compostos bio-orgânicos.
Caminho de MEV
Uma representação esquemática do caminho de MEV é descrito na Figura 3. No geral, o caminho compreende seis etapas.
Na primeira etapa, duas moléculas de acetil-coenzima A são enzimaticamente combinadas para formar acetoacetil-CoA. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, acetil-CoA tiolase (também conhecida como acetil-CoA acetiltransferase). Os exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeo incluem mas não são limitadas às seguintes número de acesso no GenBank e o organismo do qual as seqüências derivaram: (NC_000913 REGIÃO: 2324131..2325315; Escherichia coli), (D49362; Paracoccus denitrifieans) e (L20428; Saccharomyees eerevisiae).
Na segunda etapa do caminho MEV, acetoacetil-CoA é enzimaticamente condensada com uma outra molécula de acetil-CoA para formar 3-hidróxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA). Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, a HMG-CoA sintase. Os exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeo incluem mas não são limitadas a: (NC_001145. complemento 19061..20536; Saccharomyees eerevisiae), (X96617; Saccharomyees eerevisiae), (X83882; Arabidopsis thaliana), (AB037907; Kitasatospora griseola), (BT007302; Homo sapiens) e (NC_002758, Rótulo local SAV2546, GeneID 1122571; Staphilococcus aureus).
Na terceira etapa, HMG-CoA é enzimaticamente convertida para mevalonato. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, HMG-CoA redutase. Os exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeo incluem mas não são limitadas a: (NM_206548; Drosophila melanogaster), (NC_002758, Rótulo local SAV2545, GeneID 1122570; Staphilococcus aureus), (NM 204485; Gallus gallus), (ABO 15627; Streptomyees sp. KO 3988), (AF542543; Nieotiana attenuata), (AB037907; Kitasatospora griseola), (ΑΧ 128213, que fornece a seqüência que codifica um HMGR truncado; Saccharomyces eerevisiae) e (NC 001145: complemento (115734.. 118898; Saccharomyees eerevisiae).
Na quarta etapa, mevalonato é enzimaticamente fosforilado para formar mevalonato 5-fosfato. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, a mevalonato quinase. Os exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeo incluem mas não são limitadas a: (L77688; Arabidopsis thaliana) e (X55875; Saccharomyees eerevisiae).
Na quinta etapa, um segundo grupo de fosfato é enzimaticamente adicionado ao mevalonato 5-fosfato para formar mevalonato 5-pirofosfato. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, fosfomevalonato quinase. Os exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeo incluem mas não são limitadas a: (AF429385; Hevea brasiliensis), (NM 006556; Homo sapiens) e (NCJ)Ol 145. complemento 712315..713670; Saceharomyces eerevisiae).
Na sexta etapa, mevalonato 5-pirofosfato é enzimaticamente convertido em IPP. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, mevalonato pirofosfato descarboxilase. Os exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeo incluem mas não são limitadas a: (X97557; Saccharomyees eerevisiae), (AF290095; Enteroeoeeus faeeium) e (U49260; Homo sapiens).
Se IPP deve ser convertido ao DMAPP, então uma sétima etapa é requerida. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, a IPP isomerase. Os exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeo incluem mas não são limitadas a: (NC 000913, 3031087..3031635; Eseheriehia eoli) e (AF082326; Haematoeoeeus pluvialis). Se a conversão a DMAPP é requerida, uma expressão aumentada da IPP isomerase garante que a conversão de IPP em DMAPP não representa uma etapa limitante de taxa no caminho global. Caminho de DXP
Uma representação esquemática do caminho de DXP é descrito na Figura 4. No geral, o caminho de DXP compreende sete etapas. Na primeira etapa, o piruvato é condensado com D-gliceraldeído 3-fosfato para fabricar l-desóxi-D-xilulose-5-fosfato. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, l-desóxi-D-xilulose-5-fosfato sintase. Os exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeo incluem mas não são limitados a: (AF035440; Escherichia coli), (NC_002947, rótulo local PP0527; Pseudomonas putida KT2440), (CP000026, rótulo local SPA2301; Salmonella enterica Paratyphi, ver ATCC 9150), (NC_007493, rótulo local RSP 0254; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1), (NC_005296, rótulo local RPA0952; Rhodopseudomonas palustris CGA009), (NC_004556, rótulo local PD1293; Xilella fastidiosa Temeculal) e (NC_003076, rótulo local AT5G11380; Arabidopsis thaliana).
Na segunda etapa, l-desóxi-D-xilulose-5-fosfato é convertida a 2C-metil-D-eritritol-4-fosfato. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, l-desóxi-D-xilulose-5-fosfato redutoisomerase. Os exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeo incluem mas não são limitadas a: (AB013300; Eseheriehia coli), (AF148852; Arabidopsis thaliana), (NC_002947, rótulo local PP1597; Pseudomonas putida KT2440), (AL939124, rótulo local SC05694; Streptomyces coelieolor A3(2)), (NC_007493, rótulo local RSP_2709; Rhodobaeter sphaeroides 2.4.1) e (NC_007492, rótulo local Pfl l 107; Pseudomonas fluorescens PfO-1).
Na terceira etapa, 2C-metil-D-eritritol-4-fosfato é convertido para 4-difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, 4-difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol sintase. Os exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeo incluem mas não são limitadas a: (AF230736; Eseheriehia coli), (NC_007493, rótulo local RSP_2835; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1), (NC 003071, rótulo local AT2G02500; Arabidopsis thaliana) e (NC_002947, rótulojocal PPl614; Pseudomonas putida KT2440).
Na quarta etapa, 4-difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol é convertido para 4-difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol-2-fosfato. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, 4-difosfocitidil-2C-metil-D- eritritol quinase. Os exemplos ilustrativos das seqüências de nucleotídeo incluem mas não são limitadas a: (AF216300; Escherichia eolí) e (NC_007493, rótulo local RSP_1779; Rhodobaeter sphaeroides 2.4.1).
Na quinta etapa, 4-difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol-2-fosfato é convertido para 2C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, 2C-metil-D-eritritol 2,4- ciclodifosfato sintase. Os exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeo incluem mas não são limitadas a: (AF230738; Eseheriehia eolí), (NC_007493, rótulo local RSP_6071; Rhodobaeter sphaeroides 2.4.1) e (NC_002947, rótulojocal PP 1618; Pseudomonasputida KT2440).
Na sexta etapa, 2C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato é convertido para l-hidróxi-2-metil-2-(E)-butenil-4-difosfato. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, l-hidróxi-2-metil-2-(E)- butenil-4-difosfato sintase. Os exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeo incluem mas não são limitadas a: (AY033515; Escheriehia eolí), (NC 002947, rótulo local PP0853; Pseudomonas putida KT2440) e (NC 007493, rótulo local RSP_2982; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1).
Na sétima etapa, l-hidróxi-2-metil-2-(E)-butenil-4-difosfato é convertido em IPP ou seu isômero, DMAPP. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, a isopentil/dimetilalil difosfato sintase. Os exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeo incluem mas não são limitadas a: (AY062212; Eseheriehia coli) e (NC 002947, rótulo local PP0606; Pseudomonas putida KT2440).
Em algumas formas de realização, "conversa cruzada" (ou interferência) entre os processos metabólicos da própria célula hospedeira e aqueles processos envolvidos com a produção de IPP como fornecido pela presente invenção são minimizados ou totalmente eliminados. Por exemplo, a conversa cruzada é minimizada ou totalmente eliminada quando o microorganismo hospedeiro conta exclusivamente no caminho de DXP para sintetizar IPP e um caminho MEV é introduzido para fornecer IPP adicionais. Tais organismos hospedeiros não seriam equipados para alterar a expressão das enzimas do caminho MEV ou processar os intermediários associados com o caminho MEV. Os organismos que contam exclusiva ou predominantemente no caminho de DXP incluem, por exemplo, Escherichia coli.
Em algumas formas de realização, a célula hospedeira produz IPP por intermédio do caminho MEV, exclusivamente ou em combinação com o caminho de DXP. Em outras formas de realização, um caminho de DXP do hospedeiro é funcionalmente invalidado de modo que a célula hospedeira produza IPP exclusivamente através de um caminho MEV heterologamente introduzido. O caminho de DXP pode ser funcionalmente invalidado invalidando-se a expressão de gene ou inativado-se a função de uma ou mais das enzimas do caminho de DXP que ocorre naturalmente.
Em outras formas de realização, a célula hospedeira produz IPP por intermédio do caminho de DXP, exclusivamente ou em combinação com o caminho MEV. Em outras formas de realização, um caminho MEV do hospedeiro é funcionalmente invalidado de modo que a célula hospedeira produza IPP exclusivamente através de um caminho de DXP heterologamente introduzido. O caminho MEV pode ser funcionalmente invalidado invalidando-se a expressão de gene ou inativando-se a função de uma ou mais das enzimas do caminho MEV que ocorre naturalmente.
Compostos C5
Os compostos bio-orgânicos C5 exemplares são semi-terpenos que são no geral são derivados de IPP ou DMAPP. Um exemplo ilustrativo de um semi-terpeno é o isopreno.
Isopreno
Isopreno, cuja estrutura é
<formula>formula see original document page 39</formula>
é encontrado em muitas plantas. O isopreno é fabricado a partir de IPP pela isopreno sintase. Os exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeo adequadas incluem mas não são limitados a: (AB198190; Populus alba) e (AJ294819; Polulus alba χ Polulus tremula).
Compostos C10
Os compostos bio-orgânicos C10 exemplares são monoterpenos que são no geral derivados de geranil pirofosfato (GPP) que por sua vez é fabricado pela condensação de IPP com DMAPP. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, a geranil pirofosfato sintase.
A Figura 5 mostra esquematicamente como IPP e DMAPP podem produzir GPP, que pode ser ainda processado a um monoterpeno.
Os exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeo para a geranil pirofosfato sintase incluem mas não são limitadas a: (AF513111; Abies grandis), (AF513112; Abies grandis), (AF513113; Abies grandis), (AY534686; Antirrhinum majus), (AY534687; Antirrhinum majus), (Y17376; Arabidopsis thaliana), (AEO16877, Local AP 11092; Bacillus cereus; ATCC 14579), (AJ243739; Citrus sinensis), (AY534745; Clarkia breweri), (AY953508; Ips pini), (DQ286930; Lycopersicon eseulentum), (AF 182828; Mentha χ piperita), (AF182827; Mentha χ piperita), (MPI249453; Mentha χ piperita), (PZE431697, Local CAD24425; Paracoccus zeaxanthinifaeiens), (AY866498; Pierorhiza kurrooa), (AY351862; Vitis vinifèra) e (AF203881, Local AAF12843; Zymomonas mobilis).
GPP é depois subseqüentemente convertido a uma variedade de compostos C10. Os exemplos ilustrativos de compostos C10 incluem mas não são limitados a:
Careno
Careno, cuja estrutura é
<formula>formula see original document page 40</formula>
é encontrado na resina de muitas árvores, particularmente árvores de pinheiro. Careno é fabricado de GPP a partir da careno sintase. Os exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeo adequadas incluem mas não são limitadas a: (AF461460, REGIÃO 43.,1926; Picea abies) e (AF527416, REGIÃO: 78.. 1871; Salvia stenophilla).
Geraniol
Geraniol (também conhecido como rhodnol), cuja estrutura é
<formula>formula see original document page 40</formula>
é o componente principal de óleo de rosa e óleo de palmarosa. Este também ocorre no gerânio, limão e citronela. O geraniol é fabricado a partir de GPP pela geraniol sintase. Os exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeo adequadas incluem mas não são limitados a: (AJ457070; Cinnamomum tenuipilum), (AY362553; Ocimum basilicum), (DQ234300; Perillafrutescens cepa 1864), (DQ234299; Perilla citriodora cepa 1861), (DQ234298; Perilla eitriodora cepa 4935) e (DQ088667; Perilla citriodora)
Linalool
Linalool, cuja estrutura é
<formula>formula see original document page 40</formula>
é encontrado em muitas flores e plantas de condimento tais como sementes de coentro. Linalool é fabricado a partir de GPP pela linalool sintase. Os exemplos ilustrativos de uma seqüência de nucleotídeo adequada incluem mas não são limitados a: (AF497485; Arabidopsis thaliana), (AC002294, Local AAB71482; Arabidopsis thaliana), (AY059757; Arabidopsis thaliana), (NM_104793; Arabidopsis thaliana), (AF154124; Artemisia annua), (AF067603; Clarkia breweri), (AF067602; Clarkia concinna), (AF067601; Clarkia breweri), (U58314; Clarkia breweri), (AY840091; Lycopersicon esculentum), (DQ263741; Lavandula angustifolia), (AY083653; Mentha citrate), (AY693647; Ocimum basilieum), (XM_463918; Oryza sativa), (AP004078, Local BAD07605; Oryza sativa), (XM_463918, Local XP.463918; Oryza sativa), (AY917193; Perilla eitriodora), (AF271259; Perilla frutescens), (AY473623; Picea abies), (DQ195274; Picea sitehensis) e (AF444798; Perillafrutescens var. crispa cultivar N2 79).
Limoneno
Limoneno, cuja estrutura é
é encontrado na casca de frutas cítricas e hortelã. Limoneno é fabricado a partir de GPP pela limoneno sintase. Os exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeo adequadas incluem mas não são limitadas a: (+)-limoneno sintases (AF514287, REGIÃO: 47..1867; Citrus limon) e (AY055214, REGIÃO: 48.. 1889; Agastaehe rugosa) e (-)-limoneno sintases (DQ195275, REGIÃO: 1..1905; Picea sitehensis), (AF006193, REGIÃO: 73.. 1986; Abies grandis) e (MHC4SLSP, REGIÃO: 29.. 1828; Mentha spieata).
Mirceno
Mirceno, cuja estrutura é é encontrado no óleo essencial em muitas plantas incluindo louro, verbena e myreia da qual o mesmo recebe o seu nome. Mirceno é fabricado a partir de GPP pela mirceno sintase. Os exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeo adequadas incluem mas não são limitadas a: (U87908; Abies grandis), (AYl95609; Antirrhinum majus), (AYl95608; Antirrhinum majus), (NM_127982; Arabidopsis thaliana TPS10), (NM_113485; Arabidopsis thaliana ATTPS-CIN), (NM 113483; Arabidopsis thaliana ATTPS-CIN), (AF271259; Perillafrutescens), (AY473626; Picea abies), (AF369919; Picea abies) e (AJ304839; Quereus ilex).
Ocimeno
α- e β-Ocimeno, cujas estruturas são
<formula>formula see original document page 42</formula>
respectivamente,
são encontrados em uma variedade de plantas e frutas incluindo Ocimum basilicum e é fabricada a partir de GPP pela Ocimeno sintase. Os exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeo adequadas incluem mas não são limitadas a: (AY195607; Antirrhinum majus), (AYl 95609; Antirrhinum majus), (AYl 95608; Antirrhinum majus), (Al(221024; Arabidopsis thaliana), (NM 113485; Arabidopsis thaliana ATTPS-CIN), (NM_113483; Arabidopsis thaliana ATTPS-CIN), (NM_117775; Arabidopsis thaliana ATTPS03), (NM 001036574; Arabidopsis thaliana ATTPS03), (NM_127982; Arabidopsis thaliana TPS 10), (AB 110642; Citrus unshiu CitMTSL4) e (AY575970; Lotus cornieulatus var. japonieus).
α-Pineno
α-Pineno, cuja estrutura é
<formula>formula see original document page 42</formula>
é encontrado em árvores de pinheiro e eucalipto. α-Pineno é fabricado de GPP pela α-pineno sintase. Os exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeo adequadas incluem mas não são limitadas a: (+) α-pineno sintase (AF543530, REGIÃO: 1..1887; Pinus taeda), (-)a-pineno sintase (AF543527, REGIÃO: 32.. 1921; Pinus taeda) e (+)/(-)cc-pineno sintase (AGU87909, REGIÃO: 6111892; Abies grandis).
3-Pineno
β-Pineno, cuja estrutura é
<formula>formula see original document page 43</formula>
é encontrado em árvores de pinheiro, alecrim, salsa, endro, manjericão e rosa. β-Pineno é fabricado a partir de GPP pela β-pineno sintase. Os exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeo adequadas incluem mas não são limitadas a: (-) β-pinene sintases (AF276072, REGIÃO: 1..1749; Artemisia annua) e (AF514288, REGIÃO: 26.. 1834; Citrus Limon).
Sabineno
Sabineno, cuja estrutura é
<formula>formula see original document page 43</formula>
é encontrado na pimenta do reino, semente de cenoura, sálvia e árvores de chá. Sabineno é fabricado a partir de GPP pela sabineno sintase. Um exemplo ilustrativo de uma seqüência de nucleotídeo adequada inclui mas não é limitada a AF051901, REGIÃO: 26.. 1798 a partir da Salvia officinalis.
γ-Terpineno
γ-Terpineno, cuja estrutura é
<formula>formula see original document page 43</formula>
é um constituinte do óleo essencial de frutas cítricas. Bioquimicamente, γ- terpineno é fabricado a partir de GPP por uma γ-terpineno sintase. Os exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeo adequadas incluem: (AF514286, REGIÃO: 30..1832 de Citrus limon) e (ABI 10640, REGIÃO 1 ..1803 de Citrus unshiu).
Terpinoleno
Terpinoleno, cuja estrutura é é encontrado na groselha preta, cipreste, goiaba, lichia, mamão, pinheiro e chá. Terpinoleno é fabricado a partir de GPP pela terpinoleno sintase. Os exemplos ilustrativos de uma seqüência de nucleotídeo adequada incluem mas não são limitados a: (AY693650 de Oscimum basilicum) e (AY906866, REGIÃO: 10.. 1887 de Pseudotsuga menziesii).
Compostos C15
Os compostos bio-orgânicos C15 exemplares são sesquiterpenos que são no geral derivados da farnesil pirofosfato (FPP) que por sua vez é fabricado pela condensação de duas moléculas de IPP com uma molécula de DMAPP. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, a farnesil pirofosfato sintase.
A Figura 5 também mostra esquematicamente como IPP e DMAPP podem ser combinados para produzir FPP, que pode ser ainda processado a um sesquiterpeno.
Os exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeo para a farnesil pirofosfato sintase incluem mas não são limitadas a: (ATU80605; Arabidopsis thaliana), (ATHFPS2R; Arabidopsis thaliana), (AAU36376; Artemisia annud), (AF461050; Bos taurus), (D00694; Escherichia coli K-12), (AE009951, Local AAL95523; Fusobaeterium nueleatum subsp. nueleatum ATCC 25586), (GFFPPSGEN; Gibberella fujikuroi), (CP000009, Local AAW60034; Gluconobacter oxydans 621H), (AFO19892; Helianthus annuus), (HUMFAPS; Homo sapiens), (KLPFPSQCR; Kluyveromyces laetis), (LAU15777; Lupinus albus), (LAU20771; Lupinus albus), (AF309508; Mus museulus), (NCFPPSGEN; Neurospora crassa), (PAFPS1; Parthenium argentatum), (PAFPS2; Parthenium argentatum), (RATFAPS; Rattus norvegieus), (YSCFPP; Saceharomyces eerevisiae), (D89104; Schizosaecharomyees pombe), (CP000003, Local AAT87386; Streptoeoeeus pyogenes), (CP000017, Local AAZ51849; Streptoeoeeus pyogenes), (NC_008022, Local YP_598856; Streptoeoeeus pyogenes MGAS 10270), (NC 008023, Local YP_600845; Streptoeoeeus pyogenes MGAS2096), (NC_008024, Local YP 602832; Streptoeoeeus pyogenes MGAS 10750) e (MZEFPS; Zea mays).
Alternativamente, FPP também pode ser fabricado pela adição de IPP a GPP. Os exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeo que codificam uma enzima capaz desta reação incluem mas não são limitados a: (AE000657, Local AAC06913; Aquifex aeolieus VF5), (NM_202836; Arabidopsis thaliana), (D84432, Local BAA12575; Baeillus subtilis), (U12678, Local AAC28894; Bradyrhizobium japonieum USDA 110), (BACFDPS; Geobacillus stearothermophilus), (NC_002940, Local NP 873754; Haemophilus duereyi 35000HP), (L42023, Local AAC23087; Haemophilus influenzae Rd KW20), (J05262; Homo sapiens), (YP395294; Lactobacillus sakei subsp. sakei 23K), (NC_005823, Local YP_000273; Leptospira interrogans serovar Copenhageni str. Fioeruz L1-130), (AB003187; Microeoeeus luteus), (NC 002946, Local YP 208768; Neisseria gonorrhoeae FA 1090), (U00090, Local AAB91752; Rhizobium sp. NGR234), (J05091; Saccharomyees eerevisae), (CP000031, Local AAV93568; Silieibaeter pomeroyi DSS-3), (AE008481, Local AAK99890; Streptoeoeeus pneumoniae R6) e (NC 004556, Local NP 779706; Xilella fastidiosa Temeculal).
FPP é depois subseqüentemente convertido a uma variedade de compostos C15. Os exemplos ilustrativos de compostos C15 incluem mas não são limitados a:
Amorfadieno
Amorfadieno, cuja estrutura é
<formula>formula see original document page 46</formula>
é um precursor para a artemisinina que é fabricada pela Artemisia anna. Amorfadieno é fabricado a partir da FPP pela amorfadieno sintase. Um exemplo ilustrativo de uma seqüência de nucleotídeo adequada é a SEQ ID NO. 37 da Publicação de Patente U.S. Na 2004/0005678.
A Figura 5 mostra esquematicamente como IPP e DMAPP pode ser combinado para produzir FPP, que pode ser depois processado ainda para produzir amorfadieno.
g-Farneseno
<formula>formula see original document page 46</formula>
é encontrado em várias fontes biológicas incluindo mas não limitadas às glândulas de Dufour em formigas e no revestimento de cascas de maçã e pêra. α-Farneseno é fabricado a partir de FPP pela α-farneseno sintase. Os exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeo adequadas incluem mas não são limitadas a DQ309034 a partir de Pirus communis cultivar d'Anjou (pêra; nome do gene AFS1) e AY182241 de Malus domestica (maçã; gene AFS 1). Pechouus et al., Planta 219(1): 84-94 (2004).
β-Farneseno
β-Farneseno, cuja estrutura é
α-Farneseno, cuja estrutura é <formula>formula see original document page 47</formula>
é encontrado em várias fontes biológicas incluindo mas não limitadas a afídios e óleos essenciais tais como de hortelã. Em algumas plantas tais como batata selvagem, β-farneseno é sintetizado como um repelente de inseto natural. β-Farneseno é fabricado a partir da FPP pela β-farneseno sintase. Os exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeo adequadas incluem mas não é limitado ao número de acesso do GenBank AF024615 a partir de Mentha χ piperita (hortelã; gene Tspal 1) e AY835398 de Artemisia annua. Picaud et al., Phytochemistry 66(9): 961-967 (2005).
Farnesol
Farnesol, cuja estrutura é
<formula>formula see original document page 47</formula> é encontrado em várias fontes biológicas incluindo insetos e óleos essenciais tais como de cintronela, neroli, ciclamen, capim limão, angélica e rosa. Farnesol é fabricado a partir de FPP por uma hidroxilase tal como farnesol sintase. Os exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeo adequadas incluem mas não são limitadas ao número de acesso ao GenBank AF529266 de Zea mays e YDR481C de Saccharomyces eerevisiae (gene Pho8). Song, L.. Applied Biochemistry and Biotechnology 128: 149-158 (2006).
Nerolidol
Nerolidol, cuja estrutura é
<formula>formula see original document page 47</formula>
também é conhecido como peruviol e é encontrado em várias fontes biológicas incluindo como óleos essenciais tais como de neroli, gengibre, jasmim, lavanda, árvore de chá e capim limão. Nerolidol é fabricado a partir de FPP por uma hidroxilase tal como nerolidol sintase. Um exemplo ilustrativo de uma seqüência de nucleotídeo adequada inclui mas não é limitada a AF529266 de Zea mays (milho; gene tpsl). Patchoulol
Patchoulol, cuja estrutura é
<formula>formula see original document page 48</formula>
também é conhecido como álcool de patchouli e é um constituinte do óleo essencial de Pogostemon patchouli. Patchouliol é fabricado a partir de FPP pela patchouliol sintase. Um exemplo ilustrativo de uma seqüência de nucleotídeo adequada inclui mas não é limitada a AY508730 REGIÃO: 1.. 1659 de Pogostemon cablin.
Valeneceno
Valeneceno, cuja estrutura é
<formula>formula see original document page 48</formula>
é um dos componentes químicos principais do aroma e sabor das laranjas e é encontrado nas cascas de laranja. Valeneceno é fabricado a partir de FPP da nootkatone sintase. Os exemplos ilustrativos de uma seqüência de nucleotídeo adequada inclui mas não é limitada a AF441124 REGIÃO: 1..1647 de Citrus sinensis e AY917195 REGIÃO: 1..1653 de Perilla frutescens.
Compostos C20
Os compostos bio-orgânicos C20 exemplares são diterpenos que são no geral derivados de geranilgeraniol pirofosfato (GGPP) que por sua vez é fabricado pela condensação de três moléculas de IPP com uma molécula de DMAPP. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, a geranilgeranil pirofosfato sintase.
DMAPP podem ser combinados para produzir GGPP, que pode ser ainda processado a um diterpeno ou pode ser ainda processado para produzir um carotenóide.
A Figura 5 também mostra esquematicamente como IPP e Os exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeo para a geranilgeranil pirofosfato sintase incluem mas não são limitados a: (ATHGERPIRS; Arabidopsis thaliana), (BT005328; Arabidopsis thaliana), (NM_119845; Arabidopsis thaliana), (NZ_AAJM010003 80, Local ZP 00743052; Bacillus thuringiensis serovar israelensis, ATCC 35646 sql563), (CRGGPPS; Catharanthus roseus), (NZ_AABF02000074, Local ZP00144509; Fusobacterium nucleatum subsp. vineentii, ATCC 49256), (GFGGPPSGN; Gibberellafujikur oi), (AY371321; Ginkgo biloba), (AB055496; Hevea brasiliensis), (ABO 17971; Homo sapiens), (MC1276129; Mueor eircinelloides f lusitanieus), (ABO 16044; Mus museulus), (AABX01000298, Local NCUO1427; Neurospora crassa), (NCU20940; Neurospora crassa), (NZ_AAKL01000008, Local ZP_00943566; Ralstonia solanacearum UW551), (ABI 18238; Rattus norvegicus), (SCU31632; Saccharomyces eerevisiae), (ABO 16095; Synechococcus elongates), (SAGGPS; Sinapis alba), (SSOGDS; Sulfolobus acidoealdarius), (NC_007759, Local YP_461832; Syntrophus aciditrophicus SB) e (NC_006840, Local YP_204095; Vibrio fiseheri ES 114).
Alternativamente, GGPP também pode ser fabricado pela adição de IPP ao FPP. Os exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeo que codificam uma enzima capaz desta reação incluem mas não são limitadas a: (NM_112315; Arabidopsis thaliana), (ERWCRTE; Pantoea agglomerans), (D90087, Local BAA14124; Pantoea ananatis), (X52291, Local CAA36538; Rhodobaeter eapsulatus), (AF195122, Local AAF24294; Rhodobaeter sphaeroides) e (NC 004350, Local NP 721015; Streptoeoceus mutans UAl 59).
GGPP é depois subseqüentemente convertido a uma variedade de isoprenóides C2o- Os exemplos ilustrativos de compostos C20 incluem mas não são limitados a:
Geranilgeraniol Geranilgeraniol, cuja estrutura é
<formula>formula see original document page 50</formula>
é um constituinte do óleo de madeira de Cedrela toona e do óleo de linhaça. Geranilgeraniol pode ser fabricado por exemplo, pela adição às construções de expressão um gene da fosfatase depois o gene para uma GGPP sintase.
Abietadieno
<formula>formula see original document page 50</formula>
e é encontrado em árvores tais como Abies grandis. Abietadieno é fabricado pela abietadieno sintase. Um exemplo ilustrativo de uma seqüência de nucleotídeo adequada inclui mas não é limitado a: (U50768; Abies grandis) e (AY473 621; Picea abies).
Compostos C2O+
<formula>formula see original document page 50</formula>
Os compostos bio-orgânicos C2o+ também estão dentro do escopo da presente invenção. Os exemplos ilustrativos de tais compostos incluem sesterterpenos (composto C25 fabricado a partir de cinco unidades de isopreno), triterpenos (compostos C30 fabricados a partir de seis unidades de isopreno) e tetraterpenos (composto C40 fabricado a partir de oito unidades de isopreno). Estes compostos são fabricados usando-se métodos similares aqui descritos e substituindo ou adicionando seqüências de nucleotídeo para a(s) sintase(s) apropriada(s).
Caminhos de Engenharia
<formula>formula see original document page 50</formula>
Embora para propósitos ilustrativos, a invenção foi descrita com referência à engenharia dos caminhos de MEV e/ou DXP, estes métodos podem ser adaptados para engenheirar similarmente caminhos adequados para fabricar compostos que não de isoprenóide bio-orgânicos. Estes caminhos são tipicamente engenheirados usando a tecnologia de DNA recombinante pela expressão de seqüências heterólogas adequadas que codificam uma ou mais enzimas.
Os ácidos de nucleotídeo objetos podem ser expressados por um vetor único ou múltiplos. Os ácidos nucleicos podem ser dispostos em um único operon ou em operons separados que são colocados em um vetor ou múltiplos. Onde desejado, dois vetores de expressão podem ser utilizados, cada um dos quais contém uma ou mais seqüências heterólogas operavelmente ligados em um único operon. Embora a escolha de vetor único ou múltiplos e o uso de vetor único ou múltiplos possa depender do tamanho das seqüências heterólogas e a capacidade dos vetores, o mesmo será amplamente dependente do rendimento global de um dado composto bio- orgânico que o vetor é capaz de fornecer quando expressado em uma célula hospedeira selecionada. Em alguns casos, o sistema de expressão de operon duplo fornece um rendimento mais alto do composto bio-orgânico. Os vetores objeto podem permanecer epissomicamente replicável ou como uma parte integral do genoma da célula hospedeira. Tipicamente, o último é preferido para uma propagação prolongada da célula hospedeira.
Em certas células hospedeiras, os ácidos nucleicos objeto podem ser controlados por um ou mais operons. Em alguns casos, um dois ou três sistemas de operon fornecem um rendimento mais alto de um composto bio-orgânico em relação a um sistema de operon único.
Onde desejado, as seqüências de ácido nucleico objeto podem ser modificadas para refletir a preferência de códon de uma célula hospedeira selecionada para efetuar uma expressão mais alta de tais seqüências em um célula hospedeira. Por exemplo, as seqüências de nucleotídeo objeto em algumas formas de realização serão modificadas quanto a preferência de códon de levedura. Ver, por exemplo, Bennetzen e Hall (1982) J: Biol. Chem. 257(6): 3026-3031. Como um outro exemplo não limitante, as seqüências de nucleotídeo em outras formas de realização serão modificadas quanto a preferência de códon da E. coli. Ver, por exemplo, Gouy e Gautier (1982) Nucleic Acids Res. 10(22): 7055-7074; Eyre-Walker (1996) Mol. BioL Evol. 13(6): 864-872. Ver também Nakamura et ai. (2000) Nucleic Acids Res. 28(1): 292. Tabelas de uso de códon para muitos organismos são disponíveis, que podem ser usadas como uma referência no planejamento de seqüências da presente invenção. O uso de códons prevalescentes de um dado microorganismo hospedeiro no geral aumenta a probabilidade de tradução e por este motivo o nível de expressão das seqüências desejadas.
A preparação dos ácidos nucleicos objeto pode ser realizada por uma variedade de técnicas recombinantes e procedimentos sintéticos de rotina. Em resumo, os ácidos nucleicos objeto podem ser preparados fragmentos de DNA genômico, cDNAs e RNAs, todos os quais podem ser extraídos diretamente de uma célula ou recombinantemente produzidos por vários processos de amplificação incluindo mas não limitados à PCR e rt-PCR.
A síntese química direta de ácidos nucleicos tipicamente envolve a adição seqüencial de monômeros de nucleotídeo bloqueados em 3' e bloqueados em 5' ao grupo 5'-hidroxila terminal de uma cadeia polimérica de nucleotídeo em crescimento, em que cada adição é efetuada pelo ataque nucleofílico do grupo 5'-hidroxila terminal da cadeia em crescimento na posição 3' do monômero adicionado, que é tipicamente um derivado de fósforo, tal como um fosfotriéster, fosforamidita ou semelhante. Tal metodologia é conhecida por aqueles de habilidade comum na técnica e é descrita nos textos e literatura pertinentes (por exemplo, Matteuci et ai. (1980) Tet. Lett. 521: 719; Pat. U.S. N- 4.500.707 concedida a Caruthers et al.; e Pats. U.S. N- 5.436.327 e 5.700.637 concedida a Southern et al.).
O nível de transcrição de um ácido nucleico em um microorganismo hospedeiro pode ser aumentado de vários modos. Por exemplo, isto pode ser obtido aumentando-se o número de cópias da seqüência de nucleotídeo que codifica a enzima (por exemplo, usando-se um vetor de expressão de número de cópia alta que compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a enzima ou pela introdução de cópias adicionais de uma seqüência de nucleotídeo que codifica a enzima no genoma do microorganismo hospedeiro, por exemplo, pela recombinação mediada por recA, uso de vetores "suicida", recombinação usando fago lambda recombinase e/ou inserção por intermédio de um transposon ou elemento equivalente a transposon). Além disso, isto pode ser realizado trocando-se a ordem das regiões codificadoras no mRNA policistrônico de um operon ou rompimento de um operon em genes individuais, cada um com os seus próprios elementos de controle ou aumentando a força do promotor (seqüência de controle de início de transcrição ou transcrição) ao qual a região codificadora da enzima está operavelmente ligada (por exemplo, usando um promotor de consenso indutível por arabinose ou lactose em um microorganismo hospedeiro de Escherichia coli no lugar de um promotor indutível por lactose modificado, tal como aquele encontrado em pBluescript e os plasmídeos pBBRIMCS) ou usando um promotor indutível e induzindo o promotor indutível pela adição de um produto químico a um meio de cultivo. O nível da tradução de uma seqüência de nucleotídeo em um microorganismo hospedeiro pode ser aumentado de vários modos, incluindo, mas não limitado a, aumentar a estabilidade do mRNA, modificando a seqüência do sítio de ligação de ribossoma, modificando a distância ou seqüência entre o sítio de ligação de ribossoma e o códon de partida da seqüência que codifica a enzima, modificando a região intercistrônica inteira localizada "a montante de ou adjacente ao lado 5' do códon de partida da região codificadora da enzima, estabilizando a extremidade 3' do transcrito de mRNA usando grampos de cabelo e seqüências especializadas, modificando o uso de códon da enzima, alterando a expressão de tRNAs de códon raro usados na biossíntese da enzima e/ou aumentando a estabilidade da enzima, como, por exemplo, por intermédio da mutação da sua seqüência codificadora. A determinação de códons preferidos e tRNAs de códon raro pode estar fundamentada em uma análise de seqüência de genes derivados do microorganismo hospedeiro.
O vetor objeto pode ser construído para produzir um nível desejado de números de cópia da enzima codificada. Em algumas formas de realização, os vetores objeto produzem pelo menos 10, entre 10 e 20, entre 20 e 50, entre 50 e 100 ou ainda mais alto do que 100 cópias da enzima desejada. Os plasmídeos de número de cópia baixo no geral fornecem menos do que cerca de 20 cópias de plasmídeo por célula; os plasmídeos de número de cópia médio no geral fornecem menos do que cerca de 20 cópias de plasmídeo por célula a cerca de 50 cópias de plasmídeo por célula ou de cerca de 20 cópias de plasmídeo por célula a cerca de 80 cópias de plasmídeo por célula; e os plasmídeos de número de cópia alto no geral fornecem menos do que cerca de 80 cópias de plasmídeo por célula a cerca de 200 cópias de plasmídeo por célula ou mais.
Os vetores de expressão de cópia baixa adequados para Escherichia coli incluem, mas não são limitados a, pACYC184, pBeloBacl 1, pBR332, pBAD33, pBBRIMCS e seus derivados, pSClOl, SuperCos (cosmídeo) e pWE15 (cosmídeo). Os vetores de expressão de cópia média adequados para Escherichia coli incluem, mas não são limitados a pTrc99A, pBAD24 e os vetores contendo uma origem ColEl de replicação e seus derivados. Os vetores de expressão de cópia alta adequados para Eseheriehia coli incluem, mas não são limitadas aos vetores pUC, pBluescript, pGEM e pTZ. Os vetores de expressão de cópia baixa adequados (centroméricos) para levedura incluem, mas não são limitados a, pRS415 e pRS416 (Sikorski & Hieter (1989) Genetics 122: 19-27). Os vetores de expressão de 2 mícrons de cópia alta adequados em levedura incluem, mas não são limitados a, pRS425 e pRS426 (Christainson et ai. (1992) Gene 110: 119-122). Os vetores de expressão de 2 mícrons alternativos incluem variantes não selecionáveis do vetor de 2 mícrons (Bruschi & Ludwig (1988) Curr. Genet. 15: 83-90) ou plasmídeos de 2 mícrons intactos que carregam um cassete de expressão (como exemplificado no Ped. de Pat U.S. 2005/0084972) ou plasmídeos de 2 mícrons que carregam um marcador de seleção defeituoso tal como LEU2d (Erhanrt et al. (1983) J. Bacteriol. 156 (2): 625635) ou URA3d (Okkels (1996) Annals of the New York Academy of Sciences 782(1): 202-207).
Os elementos reguladores que incluem, por exemplo, promotores e operadores também podem ser engenheirados para aumentar o fluxo metabólico dos caminhos engenheirados aumentando-se a expressão de um ou mais genes que desempenham um papel significante na determinação do rendimento global do composto bio-orgânico produzido. Um promotor é uma seqüência de nucleotídeos que inicia e controla a transcrição de uma seqüência de ácido nucleico por uma enzima da RNA polimerase. Um operador é uma seqüência de nucleotídeos adjacente ao promotor que funciona para controlar a transcrição da seqüência de ácido nucleico desejada.
O operador contém um domínio de ligação de proteína onde uma proteína repressora específica pode ligar. Na ausência de uma proteína repressora adequada, a transcrição inicia através do promotor. Na presença de uma proteína repressora adequada, a proteína repressora liga-se ao operador e por meio deste inibe a transcrição do promotor.
Em algumas formas de realização da presente invenção, os promotores usados em vetores de expressão são indutíveis. Em outras formas de realização, os promotores usados em vetores de expressão são constitutivos. Em algumas formas de realização, uma ou mais seqüências de ácido nucleico são operavelmente ligadas a um promotor indutível e uma ou mais outras seqüências de ácido nucleico são operavelmente ligadas a um promotor constitutivo. Os exemplos não limitantes de promotores adequados para o uso em células hospedeiras procarióticas incluem um promotor da T7 RNA polimerase de bacteriófago; um promotor trp; um promotor do operon lac; um promotor híbrido, por exemplo, um promotor híbrido lac/tac, um promotor híbrido tac/trc, um promotor trp/lac, um promotor T7/lac; um promotor trc; um promotor tac e outros; um promotor araBAD; promotores regulados in vivo, tais como um promotor ssaG ou um promotor relacionado (ver, por exemplo, a Publicação de Patente U.S. N° 20040131637), um promotor pagC (Pulkkinen e Miller, J. Bacteriol. (1991) 173(1): 86-93; Alpuche-Aranda et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 89(21): 10079-83), um promotor nirB (Harborne et al. (1992) Mol. Micro. 6: 2805-2813) e outros (ver, por exemplo, Dunstan et al. (1999) Infect. Immun. 67: 5133-5141; McKelvie et al. (2004) Vaccine 22: 3243-3255; e Chatfield et al. (1992) Biotechnol. 10: 888-892); um promotor sigma70, por exemplo, um promotor sigma70 de consenso (ver, por exemplo, Acessos no GenBank Nas AX798980, AX798961 e AX798183); um promotor de fase estacionária, por exemplo, um promotor dps, um promotor spv e outros; um promotor derivado da ilha de patogenicidade SPI-2 (ver, por exemplo, W096/17951); um promotor actA (ver, por exemplo, Shetron-Rama et al. (2002) Infect. Immun. 70: 1087- 1096); um promotor rpsM (ver, por exemplo, Valdivia e Falkow (1996) Mol. Microbiol. 22: 367-378); um promotor tet (ver, por exemplo, Hillen et al. (1989) Em Saenger W. e Heinemann U. (eds) Topics in Molecular and Structural Biology, Protein-Nucleic Acid Interaction. Macmillan, Londres, UK, Vol. 10, pp. 143-162); um promotor SP6 (ver, por exemplo, Melton et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12: 7035-7056); e outras.
Em algumas formas de realização, a atividade total de uma enzima heteróloga que desempenha um papel grande no rendimento global de um composto bio-orgânico em relação às outras enzimas nos respectivos caminhos é aumentada pela expressão da enzima a partir de um promotor forte. Os promotores fortes adequados para Escherichia coli incluem, mas não são limitados a Trc, Tac, T5, T7 e PLambda- Em uma outra forma de realização da presente invenção, a atividade total de uma ou mais enzimas do caminho engenheiradas em um hospedeiro é aumentada pela expressão da enzima a partir de um promotor forte em um plasmídeo de número de cópia alto. Os exemplos adequados, para Eseheriehia coli incluem, mas não são limitados ao uso de promotores Trc, Tac, T5, T7 e PLambdaCom vetores pBAD24, pBAD 18, pGEM, pBluescript, pUC e pTZ.
Os exemplos não limitantes de promotores adequados para o uso em células eucarióticas hospedeiras incluem, mas não são limitados a, um promotor inicial imediato de CMV, um promotor da timidina quinase do HSV, um promotor SV40 inicial ou tardio, LTRs de retrovírus e um promotor da metalotioneína-I de camundongo.
Os exemplos não limitantes de promotores constitutivos adequados para o uso em células hospedeiras procarióticas incluem um promotor sigma70 (por exemplo, um promotor sigma70 de consenso). Os exemplos não limitantes de promotores indutíveis adequados para o uso em células hospedeiras bacterianas incluem o pL de bacteriófago λ; Plac; Ptrp; Ptac (promotor híbrido Ptrp-lac); um promotor indutível por isopropil-beta- D44 tiogalactopiranosídeo (IPTG), por exemplo, um promotor IacZ; um promotor indutível por tetraciclina; um promotor indutível por arabinose, por exemplo, PBAD (ver, por exemplo, Guzman et al. (1995) J. Bacteriol. 177: 4121-4130); um promotor indutível por xilose, por exemplo, Pxil (ver, por exemplo, Kim et al: (1996) Gene 181: 71-76); um promotor GAL1; um promotor de triptofano; um promotor lac; um promotor indutível por álcool, por exemplo, um promotor indutível por metanol, um promotor indutível por etanol; um promotor indutível por rafinose; um promotor indutível por calor, por exemplo, promotor PL lambda indutível por calor; um promotor controlado por um repressor sensível ao calor (por exemplo, vetores de expressão com base em lambda reprimido com CI857; ver, por exemplo, Hoffmann et ai. (1999) FEMS Microbiol Lett. 177(2): 327-34); e outros.
Os exemplos não limitantes de promotores constitutivos adequados para o uso em células hospedeiras de levedura incluem um promotor ADHl, um ADH2, um PGK ou um LEU2. Os exemplos não limitantes de promotores indutíveis adequados para o uso em células hospedeiras de levedura incluem, mas não são limitados a, um promotor indutível pela galactose divergente tal como um promotor GAL 1 ou um GAL (West et al (1984) Mol. Cell. BioL 4(11): 2467-2478) ou um promotor CUP1. Onde desejado, o vetor objeto compreende um promotor que é mais forte do que um promotor Lac da E. Coli nativa.
Os exemplos não limitantes de operadores para o uso em células hospedeiras bacterianas incluem um operador do promotor da lactose (a proteína repressora de LacI muda a conformação quando contatada com lactose, impedindo deste modo a proteína repressora LacI de ligar ao operador), um operador do promotor de triptofano (quando complexado com triptofano, a proteína repressora de TrpR tem uma conformação que liga o operador; na ausência de triptofano, a proteína repressora de TrpR tem uma conformação que não se liga ao operador) e um operador do promotor tac (ver, por exemplo, deBoer et al. (1983) Proc. NatL Acad. Sei. U.S.A. 80: 21-25.).
Os genes no vetor de expressão tipicamente também codificará um sítio de ligação de ribossoma para a tradução direta (isto é, síntese) de qualquer produto de gene de mRNA codificado. Quanto aos sítios de ligação de ribossoma adequados para o uso na Escherichia coli, ver Shine et al (1975) Nature 254: 34 e Steitz, em Biological Regulation and Development: Gene Expression (ed. R. F. Goldberger), vol. 1, p. 349, 1979, Plenum Publi shing, N.Y. A inserção do sítio de ligação de ribossoma que codifica a seqüência de nucleotídeo 5'-AAAACA-3' a montante de uma seqüência codificadora facilita a tradução eficiente em um microorganismo hospedeiro de levedura (Looman et al. (1993) Nuc. Ac. Res. 21: 4268-4271; Yun et al., (1996) Mol. Microbiol. 19: 1225-1239).
Outros elementos regulatórios que podem ser usados em um vetor de expressão incluem elementos realçadores de transcrição e terminadores de transcrição. Ver, por exemplo, Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153: 516-544.
Um vetor de expressão pode ser adequado para o uso em tipos particulares de microorganismos hospedeiros e não em outros. Uma pessoa de habilidade comum na técnica, entretanto, pode facilmente determinar através da experimentação de rotina se um vetor de expressão particular é adequado para um dado microorganismo hospedeiro. Por exemplo, o vetor de expressão pode ser introduzido no organismo hospedeiro, que é depois monitorado quanto a viabilidade e expressão de quaisquer genes contidos no vetor.
O vetor de expressão também pode conter um ou mais genes marcadores selecionáveis que, na expressão, confere um ou mais traços fenotípicos úteis para selecionar ou de outro modo identificar células hospedeiras que carregam o vetor de expressão. Os exemplos não limitantes de marcadores selecionáveis adequados para as células eucarióticas incluem a diidrofoliato redutase e a resistência à neomicina. Os exemplos não limitantes de marcadores selecionáveis adequados para as células procarióticas incluem a resistência à tetraciclina, ampicilina, cloranfenicol, carbenicilina e canamicina.
Para a produção de um produto bio-orgânico em uma escala industrial, pode ser impraticável ou muito caro usar um marcador selecionável que requeira a adição de um antibiótico aos meios de fermentação. Conseqüentemente, algumas formas de realização da presente invenção utilizam células hospedeiras que não requerem o uso de um marcador selecionável que confere resistência a antibiótico para garantir a manutenção de plasmídeo (vetor de expressão). Nestas formas de realização da presente invenção, o vetor de expressão contém um sistema de manutenção de plasmídeo tal como o plasmídeo 60-kb IncP (RK2), opcionalmente junto com o sistema de replicação e/ou segregação de plasmídeo RK2, para efetuar a retenção de plasmídeo na ausência de seleção de antibiótico (ver, por exemplo, Sia et al. (1995) J. Bacteriol. 177: 2789-97; Pansegrau et al. (1994) J. Mol. Biol. 239: 623-63). Um sistema de manutenção de plasmídeo adequado para este propósito é codificado pelo operon parDE de RK2, que codifica uma toxina estável e uma antitoxina instável. A antitoxina pode inibir a ação letal da toxina pela interação de proteína-proteína direta. As células que perdem o vetor de expressão que abriga o operon parDE são rapidamente destituídos da antitoxina instável, resultando na toxina estável causando depois a morte da célula. O sistema de replicação do plasmídeo RK2 é codificado pelo gene trfA, que codifica uma proteína de replicação de DNA.
O sistema de segregação de plasmídeo RK2 é codificado pelo operon parCBA, que codifica proteínas que funcionam para resolver multímeros de plasmídeo que podem surgir da replicação de DNA.
Os vetores objetos podem ser introduzidos em uma célula hospedeira estável ou transitoriamente por uma variedade de técnicas estabelecidas. Por exemplo, um método envolve um tratamento pelo cloreto de cálcio em que o vetor de expressão é introduzido por intermédio de um precipitado de cálcio. Outros sais, por exemplo fosfato de cálcio, também pode ser usado seguindo um procedimento similar. Além disso, a eletroporação (isto é, a aplicação de corrente para aumentar a permeabilidade de células aos ácidos nucleicos) pode ser usada. Outros métodos de transformação incluem microinjeção, transformação mediada com DEAE dextrano e choque térmico na presença de acetato de lítio. Complexos, lipossomas e dendrímeros de lítio também podem ser utilizados para transfectar o microorganismo hospedeiro. Na transformação, uma variedade de métodos podem ser praticados para identificar as células hospedeiras nas quais os vetores objeto foram introduzidos. Um método de seleção exemplar envolve subcultivar células individuais para formar colônias individuais, seguido pelo teste quanto a expressão do produto de gene desejado. Um outro método acarreta necessariamente selecionar células hospedeiras transformadas com base nos traços fenotípicos conferidos através da expressão de genes marcadores selecionáveis contidos dentro do vetor de expressão. Aqueles de habilidade podem identificar geneticamente células hospedeiras modificadas usando estes ou outros métodos disponíveis na técnica.
A introdução de várias seqüências do caminho da invenção em um célula hospedeira pode ser confirmada pelos métodos tais como PCR, Southern blot ou hibridização de Northern blot. Por exemplo, ácidos nucleicos podem ser preparados a partir das células hospedeiras resultantes e as seqüências específicas de interesse podem ser amplificadas pela PCR usando iniciadores específicos para as seqüências de interesse. O produto amplificado é submetido à eletroforese em gel de agarose, eletroforese em gel de poliacrilamida ou eletroforese capilar, seguido pelo fingimento com brometo de etídio, solução Verde de SYBR ou semelhante ou detecção de DNA com uma detecção por UV. Alternativamente, as sondas de ácido nucleico específicas para as seqüências de interesse podem ser utilizadas em uma reação de hibridização. A expressão de uma seqüência de gene específica pode ser averiguada detectando-se o mRNA correspondente por intermédio da PCR ligada à transcrição reversa, hibridização de Northern blot, ou por imunoensaios usando anticorpos reativos com o produto de gene codificado. Os imunoensaios exemplares incluem mas não são limitados ao ELISA, radioimunoensaios e imunoensaios intercalados.
O rendimento de um composto bio-orgânico por intermédio de um ou mais caminhos metabólicos aqui divulgados pode ser aumentado pela inibição de reações que desviam intermediários das etapas produtivas na direção da formação do produto bio-orgânico. A inibição das reações improdutivas pode ser obtida reduzindo-se a expressão e/ou atividade de enzimas envolvidas em uma ou mais reações improdutivas. Tais reações incluem reações colaterais do ciclo de TCA que leva à biossíntese de ácidos graxos, biossíntese de alanina, o supercaminho de aspartato, gliconeogênese, heme biossíntese e/ou biossíntese de glutamato, a um nível que afete o rendimento global do composto bio-orgânico.
Uma variedade de métodos estão disponíveis para silenciar ou eliminar um gene de interesse. Por exemplo, uma expressão de gene reduzida pode ser realizada pela deleção, mutação e/ou rearranjo de gene. A mesma também pode ser realizada com o uso de RNA de anti-sentido, siRNA, miRNA, ribozimas, DNA de filamento triplo e inibidores de transcrição e/ou tradução. Além disso, transposons podem ser utilizados para romper a expressão de gene, por exemplo, inserindo-o entre o promotor e a região codificadora ou entre dois genes adjacentes para inativar um ou ambos os genes.
A quantidade de microorganismo por litro de fermentação ou a densidade de microorganismo, podem ser medidas medindo-se o peso do microorganismo isolado a partir de um volume dado do meio de fermentação. Uma medida comum é o peso seco de células por litro de meio de fermentação. Um outro método que pode ser usado para monitorar a fermentação enquanto a mesma está em progresso é por uma medição da densidade óptica do meio. Um método comum é medir a densidade óptica em um comprimento de onda de 600 nm, aludido a OD600 ou a OD. A OD pode estar correlacionada com a densidade de um tipo específico de organismo dentro de um meio específico, mas as relações específicas entre a OD e a quantidade de microorganismo por volume no geral não será aplicável através de todos os tipos de organismos em todos os tipos de meio. Uma curva de calibração pode ser criada medindo-se a OD e o peso de célula seca em uma faixa de densidades de célula. Em alguns casos, estas correlações podem ser usadas em fermentação diferente do mesmo ou de microorganismos similares no mesmo ou meio similar.
EXEMPLOS
A prática da presente invenção pode utilizar, a menos que de outro modo indicado, técnicas convencionais da indústria biossintética e outras, que estão dentro da habilidade da técnica. Até o grau em que tais técnicas não são descritas aqui completamente, pode-se encontrar ampla referência para as mesmas na literatura científica.
Nos seguintes exemplos, esforços foram feitos para garantir a precisão com respeito aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura e assim por diante), mas variação e desvio podem ser ajustados e no evento de que um erro na correção nos números relatados aqui exista, uma pessoa de habilidade comum nas técnicas à qual esta invenção pertence pode deduzir a quantidade correta em vista da divulgação aqui remanescente. A menos que de outro modo indicado, a temperatura é relatada em graus Celsius e a pressão está na ou próxima da pressão atmosférica ao nível do mar. Todos os reagentes, a menos que de outro modo indicado, foram comercialmente obtidos. Os seguintes exemplos são intencionados apenas para propósitos ilustrativos e não limitam de nenhum modo o escopo da presente invenção.
Exemplo 1
Este exemplo descreve métodos para fabricar plasmídeos de expressão que codificam enzimas do caminho do MEV de Saccharomyces eerevisiae organizadas em operons.
O plasmídeo de expressão pMevT foi gerado pela inserção do operon MevT (SEQ ID NO: 1) no vetor pBAD33. O operon MevT codifica o conjunto de enzimas do caminho do MEV que juntas transformam o precursor ubíquo acetil-CoA para (R)-mevalonato, a saber acetoacetil-CoA tiolase, HMG-CoA sintase e HMG-CoA redutase. o operon MevT foi gerado pela amplificação pela PCR a partir do DNA genômico da Escherichia coli da seqüência codificadora do gene atoB (número de acesso do GenBank NC_000913 REGIÃO: 2324131..2325315) (codifica uma acetoacetil-CoA tiolase), do DNA genômico de Saccharomyees eerevisiae a seqüência codificadora do gene ERGl3 (número de acesso do GenBank X96617, REGIÃO: 220.. 1695) (codifica uma HMG-CoA sintase) e do DNA genômico de Saccharomyees eerevisiae um segmento da região codificadora do gene HMGl (número de acesso do GenBank M22002, REGIÃO: 1660..3165) (codifica uma HMG-CoA redutase truncada (tHMGR)). O iniciador de PCR a montante usado para a amplificação do fragmento de gene de HMGl incluiu um códon de partida artificial. Os fragmentos amplificados foram unidos juntos usando extensões sobrepostas (SOEing), processo durante o qual os sítios de ligação ribossômica foram introduzidos depois do atoB e das seqüências codificadoras de ERG13. Depois da adição das projeções de 3Ά, o operon MevT foi ligado no vetor de clonagem TA pCR4 (Invitrogen, Carlsbad, CA) e seqüenciado para garantir a precisão. O operon MevT foi subseqüentemente ligado no sítio de enzima de restrição XmaI PstI do vetor pBAD33 (Guzman et ai. (1995) J. Bacteriol. 177(14): 4121-4130). Para colocar o operon sob o controle do promotor PLac, o fragmento araC- PBADNsil-Xmal de pBAD33 foi substituído com o fragmento Nsil-XmaI de pBBRIMCS, produzindo o plasmídeo de expressão pMevT (ver a Patente U.S. Número 7.192.751).0 plasmídeo de expressão pAM36-MevT66 foi gerado pela inserção do operon MevT66 no vetor pAM36. O vetor pAM36 foi gerado pela inserção de um cassete de oligonucleotídeo contendo sítios de enzima de restrição Asel-Sfil-AsiSI-XhoI-Pael-FsII-Pmel no vetor pACYC184 (número de acesso do GenBank X06403) e pela remoção do gene de resistência tet em pACYC 184. O operon MevT66 foi sinteticamente gerado usando a seqüência de nucleotídeo SEQ ID NO: 1 como um padrão, que compreende o gene atoB de Escherichia coli (número de acesso do GenBank NC 000913 REGIÃO: 2324131..2325315), o gene ERG13 de Saccharomyees cerevisiae (número de acesso do GenBank X96617, REGIÃO: 220.. 1695) e uma versão truncada do gene HMG1 de Saccharomyces cerevisiae (número de acesso do GenBank M22002, REGIÃO: 1777..3285), todas as três seqüências sendo otimizadas no códon para a expressão em Eseherichia coli. O operon MevT66 sinteticamente gerado foi flanqueado por um sítio de enzima de restrição 5' EcoRI e um sítio de enzima de restrição 3' Hind III e assim pôde ser clonado em sítios de enzima de restrição compatíveis de um vetor de clonagem tal como um vetor de origem pUC ou pACYC padrão. A partir desta construção, o operon MevT66 foi amplificado pela PCR com sítios de enzima de restrição SfiI e AsiSI flanqueadores, o fragmento de DNA amplificado foi digerido até a conclusão usando enzimas de restrição SfiI e AsiSI, a mistura de reação foi resolvida pela eletroforese em gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 4,2 kb foi extraído em gel usando um kit de purificação em gel Qiagen (Valencia, CA) e o fragmento de DNA isolado foi ligado no sítio de enzima de restrição SfiI AsiSI do vetor pAM36, produzindo plasmídeo de expressão pAM36-MevT66.
O plasmídeo de expressão pAM25 foi gerado pela inserção do operon MevT66 no vetor pAM29. O vetor pAM29 foi criado montando-se a origem pl5A de replicação e gene de resistência kan de pZS24-MCSl (Lutz e Bujard (1997) Nucl Acids Res. 25: 1203-1210) com um promotor IacUVS gerado pelo oligonucleotídeo. A construção de síntese de DNA que compreende o operon MevT66 (ver acima) foi digerido até a conclusão usando enzimas de restrição EcoRI e Hind III, a mistura de reação foi resolvida pela eletroforese em gel, o fragmento de DNA de 4,2 kb foi extraído em gel e o fragmento de DNA isolado foi ligado no sítio de enzima de restrição EcoRl HindIII de pAM29, produzindo o plasmídeo de expressão ρΑΜ25.
O plasmídeo de expressão pMevB-Cm foi gerado pela inserção do operon MevB no vetor pBBRIMCS-l. O operon MevB codifica o conjunto de enzimas que juntas convertem (R)-mevalonato para IPP, a saber a mevalonato quinase, fosfomevalonato quinase, e mevalonato pirofosfato carboxilase. O operon MevB foi gerado pela amplificação pela PCR do DNA genômico de Saccharomyces eerevisiae, das seqüências codificadoras do gene ERG12 (número de acesso do GenBank X55875, REGIÃO: 580..1911) (codifica uma mevalonato quinase), do gene ERG8 (número de acesso do GenBank Z49939, REGIÃO: 3363..4718) (codifica uma fosfomevalonato quinase) e o gene MYDl (número de acesso do GenBank X97557, REGIÃO: 544.. 1734) (codifica uma mevalonato pirofosfato carboxilase) e junção dos fragmentos de PCR juntos usando extensões de sobreposição (SOEing). Escolhendo-se as seqüências de iniciador apropriadas, os códons de parada de ERG12 e ERG8 foram mudados de TAA para TAG durante a amplificação para introduzir sítios de ligação de ribossoma. Depois da adição de projeções 3' A, o operon MevB foi ligado no vetor de clonagem TA pCR4 (Invitrogen, Carlsbad, CA). O operon MevB foi excisado pela digestão da construção de clonagem até a conclusão usando enzima de restrição Pstl, resolvendo a mistura de reação pela eletroforese em gel, extraindo do gel o fragmento de DNA de 4,2 kb e ligando o fragmento de DNA isolado no sítio de enzima de restrição Pstl do vetor pBBRIMCS-l (Kovach et al.. Gene 166(1): 175-176 (1995)), produzindo o plasmídeo de expressão pMevB-Cm.
O plasmídeo de expressão pMBI foi gerado pela inserção do operon MBI no vetor pBBRlMCS-3. O operon MBI codifica as mesmas enzimas como o operon MevB, assim como uma isopentenil pirofosfatase isomerase que catalisa a conversão de IPP para DMAPP. O operon MBI foi gerado pela amplificação pela PCR de DNA genômico da Eseheriehia eoli da seqüência codificadora do gene idi (número de acesso do GenBank AF 119715) usando iniciadores que contiveram um sítio de enzima de restrição XmaI nas suas extremidades 5', digerindo o fragmento de DNA amplificado até a conclusão usando a enzima de restrição XmaI, resolvendo a mistura de reação pela eletroforese em gel, extraindo do gel o fragmento de 0,5 kb e ligando o fragmento de DNA isolado no sítio de enzima de restrição XmaI do plasmídeo de expressão pMevB-Cm, colocando desse modo idi na extremidade 3' do operon MevB. O operon MBI foi subclonado nos sítios de enzima de restrição SalI e SacI do vetor pBBRIMCS-3 (Kovach et ai. Gene 166(1): 175-176 (1995)), produzindo o plasmídeo de expressão pMBI (ver a Patente U.S. Número 7.192.751).
O plasmídeo de expressão pMBIS foi gerado pela inserção do gene ispA no pMBI. O gene ispA codifica uma farnesil pirofosfato sintase que catalisa a conversão de IPP e DMAPP a FPP. A seqüência codificadora do gene ispA (número de acesso do GenBank D00694, REGIÃO: 484.. 1383) foi amplificada pela PCR aminoácido partir do DNA genômico de Escheriehia eoli usando um iniciador avançado com um sítio de enzima de restrição SacII e um iniciador reverso com um sítio de enzima de restrição Saci. O produto de PCR amplificado foi digerido até a conclusão com enzimas de restrição SaeII e Saci, a mistura de reação foi resolvida pela eletroforese em gel e o fragmento de DNA de 0,9 kb foi extraído em gel. O fragmento de DNA isolado foi ligado no sítio de enzima de restrição SaeII SaeI de pMBI, colocando deste modo o gene ispA 3' de idi e o operon MevB e produzindo o plasmídeo de expressão pMBIS (ver a Patente U.S. Número 7.192.751).
O plasmídeo de expressão pMBIS-gpps foi derivado do plasmídeo de expressão pMBIS pela substituição da seqüência codificadora ispA com uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma geranil difosfato sintase ("gpps"). Um fragmento de DNA que compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a geranil difosfato sintase foi gerado sinteticamente usando a seqüência codificadora do gene gpps de Arabidopsis thaliana (número de acesso do GenBank Yl7376, REGIÃO: 52.. 1320), otimizado no códon para a expressão na Escherichia coli, como um padrão. A seqüência de nucleotídeo foi flanqueada por um sítio de enzima de restrição SadI líder e um sítio de enzima de restrição SacI terminal e pode ser clonado em sítios de enzima de restrição compatíveis de um vetor de clonagem tal como um vetor de origem pUC ou pACYC padrão. A seqüência da geranil difosfato sintase sinteticamente gerada foi isolada pela digestão da construção de síntese de DNA até a conclusão usando as enzimas de restrição SaeII e Saci, resolvendo a mistura de reação pela eletroforese em gel, extraindo do gel o fragmento de DNA de aproximadamente 1,3 kb e ligando o fragmento de DNA isolado no sítio de enzima de restrição SacII SacI do plasmídeo de expressão pMBIS, produzindo o plasmídeo de expressão pMBIS-gpps (ver a Figura 6 para um mapa de plasmídeo).
O plasmídeo de expressão pAM45 foi gerado pela inserção do operon MBIS no pAM36-MevT66 e adicionando promotores lacUV5 em frente dos dois operons. O operon MBIS foi amplificado pela PCR a partir de pMBIS usando iniciadores que compreendem um sítio de enzima de restrição 5' XhoI e um sítio de enzima de restrição 3' PaeL O produto de PCR amplificado foi digerido até a conclusão usando enzimas de restrição XhoI e PacI, a mistura de reação foi resolvida pela eletroforese em gel, o fragmento de DNA de 5,4 kb foi extraído em gel e o fragmento de DNA isolado foi ligado no sítio de enzima de restrição XhoI PaeI de pAM36-MevT66, produzindo o plasmídeo pAM43. Um fragmento de DNA que compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica o promotor lacUV5 foi sintetizado a partir dos oligonucleotídeos e sub-clonados nos sítios de enzima de restrição AscI SfiI e AsiSI XhoI de pAM43, produzindo o plasmídeo de expressão pAM45.
Exemplo 2 Este exemplo descreve métodos para fabricar vetores de expressão que codificam enzimas do caminho MEV de Staphilococcus aureus organizadas em operons.
O plasmídeo de expressão pAM41 foi derivado do plasmídeo de expressão pAM25 pela substituição da seqüência codificadora do gene HlfriGI, que codifica a HMG-CoA redutase de Saccharomyces eerevisiae, com a seqüência codificadora do gene mvaA, que codifica a HMG-CoA redutase de Staphilococcus aureus (número de acesso do GenBank BAOOOO17, REGIÃO: 2Ó88925..2687648). A seqüência codificadora do gene mvaA amplificada pela PCR a partir do DNA genômico de Staphiloccoccus aureus subsp. aureus (ATCC 70069) usando iniciadores 449 mvaA SpeI (SEQ ID NO: 2) e 4-49 navaARAM (SEQ ID NO: 3), o fragmento de DNA amplificado foi digerido até a conclusão usando enzima de restrição SpeI, a mistura de reação foi resolvida pela eletroforese em gel e o fragmento de DNA de aproximadamente 1,3 kb foi extraído em gel. A seqüência codificadora HMGl foi removida do pAM25 pela digestão do plasmídeo até a conclusão usando enzima de restrição HindIII. As projeções de terminal do fragmento de DNA linear resultante foram embotadas usando T4 DNA polimerase. O fragmento de DNA foi depois parcialmente digerido usando enzima de restrição SpeI, a mistura de reação foi resolvida pela eletroforese em gel e o fragmento de DNA de 4,8 kb foi extraído em gel. O fragmento de DNA isolado foi ligado com o produto de PCR de mvaA digerido com SpeI, produzindo o plasmídeo de expressão pAM41. A seqüência de nucleotídeo do operon atoB(opt):ERG13(opt):mvaA contido em pAM41 é a SEQ ID NO: 41. ERG13 também é conhecido como HMGS ou HMG-CoA sintase.
O plasmídeo de expressão pAM52 foi derivado do plasmídeo de expressão pAM41 pela substituição da seqüência codificadora do gene ERG13, que codifica a HMG-CoA sintase de Saccharomyees eerevisiae, com a seqüência codificadora do gene mvaS, que codifica a HMG-CoA sintase de Staphilococcus aureus (número de acesso do GenBank BA000017, REGIÃO: 2689180..2690346). A seqüência codificadora do gene mvaS foi amplificada pela PCR a partir do DNA genômico de Staphiloccoccus aureus subsp. aureus (ATCC 70069) usando iniciadores HMGS 5' Sa mvaS-S (SEQ ID NO: 4) e HMGS 3' Sa mvaS-AS (SEQ ID NO: 5) e o fragmento amplificado de DNA foi usado como um iniciador de PCR para substituir a seqüência codificadora do gene HMGI em pAM41 de acordo com o método de Geiser et al. (BioTechniques 31: 88-92 (2001)), produzindo o plasmídeo de expressão pAM52. A seqüência de nucleotídeo do operon atoB(opt):mvaS:mvaA contido em pAM52 é a SEQ ID NO: 42.
O plasmídeo de expressão pAM97 foi derivado do plasmídeo de expressão pAM45 pela substituição do operon MevT66 com o operon (atoB(opt):mvaS:mvaA) de plasmídeo de expressão pAM52. O plasmídeo de expressão pAM45 foi digerido até a conclusão usando as enzimas de restrição AsiSI e SfiI, a mistura de reação foi resolvida pela eletroforese em gel e o fragmento de DNA de 8,3 kb que carece do operon MevT66 foi extraído em gel. O operon (atoB(opt):mvaS:mvaA) de pAM52 foi amplificado pela PCR usando iniciadores 19-25 atoB Sfil-S (SEQ ID NO: 6) e 19-25 mvaA-AsiSI- AS (SEQ ID NO: 7), o produto de PCR foi digerido até a conclusão usando enzimas de restrição SfiI e AsiSI, a mistura de reação foi resolvida pela eletroforese em gel, o fragmento de DNA de 3,7 kb foi extraído em gel e o fragmento de DNA isolado foi ligado no sítio de enzima de restrição AsiSI SfiI do plasmídeo de expressão pAM45, produzindo o plasmídeo de expressão pAM97.
O plasmídeo de expressão pAM97-MBI foi derivado do plasmídeo de expressão pAM97 e pAM45 pela substituição do operon MBIS de pAM97 com o operon MBI de pAM45. O operon MBI foi amplificado pela PCR a partir de pAM45 usando iniciadores 9-70C (SEQ ID NO: 8) e 26- 39B (SEQ ID NO: 9), a mistura de reação foi resolvida pela eletroforese em gel, o fragmento de DNA de 4,5 kb foi extraído em gel e o fragmento de DNA isolado foi digerido até a conclusão usando enzimas de restrição SacI e XhoI. O plasmídeo de expressão pAM97 foi digerido até a conclusão usando enzimas de restrição SacI e XhoI, a mistura de reação foi resolvida pela eletroforese em gel, o fragmento de 7,6 kb foi extraído em gel e o fragmento de DNA isolado foi ligado com o produto de PCR do operon MBI, produzindo o plasmídeo de expressão pAM97-MBI.
O plasmídeo de expressão pAM97-MevB foi derivado do plasmídeo de expressão pAM97 e pAM45 pela substituição do operon MBIS de pAM97 com o operon MevB de pAM45. O operon MevB foi amplificado pela PCR a partir de pAM45 usando iniciadores 9-70C (SEQ ID NO: 8) e 26- 39A (SEQ ID NO: 10), a mistura de reação foi resolvida pela eletroforese em gel, o fragmento de DNA de 3,9 kb foi extraído em gel e o fragmento de DNA isolado foi digerido até a conclusão usando enzimas de restrição SacI e XhoI. O plasmídeo de expressão pAM97 foi digerido até a conclusão usando enzimas de restrição SacI e XhoI, a mistura de reação foi resolvida pela eletroforese em gel, o fragmento de 7,6 kb foi extraído em gel e o fragmento de DNA isolado foi ligado com o produto de PCR do operon MevB, produzindo o plasmídeo de expressão pAM97-MevB.
O plasmídeo de expressão pAM128 foi gerado pela inserção dos operons (atoB(opt):mvaS:mvaA) e MBIS do plasmídeo de expressão pAM97 em um vetor que compreende os sistemas de replicação, segregação e manutenção do plasmídeo RK2, que remove a necessidade contínua para a seleção de antibiótico de transformantes da célula hospedeira. O plasmídeo RK2 foi digerido até a conclusão usando enzima de restrição PstI, a mistura de reação foi resolvida pela eletroforese em gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 6,3 kb contendo o local par inteiro foi extraído em gel e o fragmento de DNA isolado foi subclonado no sítio de enzima de restrição PstI do mini réplicon RK2 pRRIO (Roberts et al. (1990) J. Bacteriol 172(11): 6204-6216), produzindo o vetor pAM 132. O plasmídeo de expressão pAM97 foi digerido até a conclusão usando as enzimas de restrição AscI e SacI, a mistura de reação foi resolvida pela eletroforese em gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 9,4 kb foi extraído em gel e o fragmento de DNA isolado foi ligado no sítio de enzima de restrição MluI SacI de pAM132, produzindo o plasmídeo de expressão pAM 128.
Exemplo 3
Este exemplo descreve métodos para fabricar vetores de expressão que codificam enzimas do caminho MEV de Enterocoeeus faeealis organizados em operons.
O plasmídeo pAM16 foi gerado pela inserção da seqüência codificadora do gene mvaE de Enterocoeeus faeealis (número de acesso do GenBank AF290092 REGIÃO: 1479.,3890) (codifica uma acetil-CoA acetiltransferase/HMG-CoA redutase (HMGR)) no vetor pBlueScripII-KS(+). A seqüência codificadora do gene mvaE foi amplificado pela PCR a partir do DNA genômico de Enterocoeeus faeealis (ATCC 700802) usando iniciadores 4-40 5' fosforilados mvaSF BamHI (SEQ ID NO: 11) e 4-40 mvaERHindIII (SEQ ID NO: 12). (Note que o iniciador 4-40 mvaEF BamHI muda o códon de início do gene mvaE de TTG para ATG no produto de PCR amplificado). O produto de PCR resultante foi ligado no sítio de enzima de restrição SmaI de pBIueScripII-KS(+) (Stratagene, La Jolla, CA), produzindo o plasmídeo de expressão pAM16.
O plasmídeo pAM18 foi gerado pela inserção da seqüência codificadora do gene mvaS de Enterocoeeus faeealis (número de acesso do GenBank AF290092 REGIÃO: 142.. 1293) (codifica uma HMG-CoA sintase (HMGS)) no vetor pBlueScripII-KS(+). A seqüência codificadora do gene mvaS foi amplificada pela PCR a partir de DNA genômico de Enterococcus faeealis (ATCC 700802) usando iniciadores 4-40 5' fosforilados mvaSF BglII (SEQ ID NO: 13) e 439 mvaSR BamHI (SEQ ID NO: 14) e o produto de PCR foi ligado no sítio de enzima de restrição SmaI de pBlueScripII-KS(+) (Stratagene, La Jolla, CA), produzindo o plasmídeo de expressão pAM18.
O plasmídeo de expressão pAM22 foi gerado pela inserção da seqüência codificadora do gene mvaE do plasmídeo de expressão pAM16 no vetor pZE21-PL_iac01. O vetor pZE21- Pl-I3cO1 é um derivado do vetor pZE21- MCS-I em que o promotor tet foi substituído com o promotor PL_|ac0i (Lutz e Bujard (1997) Nucl Acids Res. 25: 1203-1210). O plasmídeo de expressão pAMló foi digerido até a conclusão usando as enzimas de restrição BamHI e HindIII, a mistura de reação foi resolvida pela eletroforese em gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 2,4 kb contendo a seqüência codificadora mvaE foi extraído em gel e o fragmento de DNA isolado foi inserido no sítio de enzima de restrição BamHI HindIII de pZE21 PL-iaCoi produzindo o plasmídeo de expressão pAM22.
O plasmídeo de expressão pAM33 foi gerado pela inserção da seqüência codificadora do gene mvaS de plasmídeo de expressão pAM18 no plasmídeo de expressão pAM22. O plasmídeo de expressão pAM18 foi digerido até a conclusão usando enzimas de restrição BglII e BamHI, a mistura de reação foi resolvida pela eletroforese em gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 1,2 kb contendo a seqüência codificadora do gene mvaS foi extraído em gel e o fragmento de DNA isolado foi inserido no sítio BamHI do plasmídeo de expressão pAM22, produzindo o plasmídeo de expressão pAM33.
O plasmídeo de expressão pAM34 foi gerado pela inserção do operon mvaS-mvaE do plasmídeo de expressão pAM33 no vetor pAM29. O operon mvaS-mvaE foi isolado digerindo-se parcialmente pAM33 usando enzima de restrição EcoRI, digerindo o fragmento de DNA linear resultante usando a enzima de restrição MluI, resolvendo a mistura de reação pela eletroforese em gel e extraindo do gel o fragmento de DNA de aproximadamente 3,6 kb. A cadeia principal de vetor de pAM29 foi obtida pela digestão até a conclusão do vetor de expressão pAM25 usando as enzimas de restrição MluI e EcoRI, resolvendo a mistura de reação pela eletroforese em gel e extraindo do gel o fragmento de DNA de aproximadamente 2,1 kb. Os dois fragmentos de DNA isolados foram ligados, produzindo o plasmídeo de expressão pAM34.
Exemplo 4
Este exemplo descreve métodos para fabricar plasmídeos de expressão que codificam enzimas do caminho de DXP de Escherichia coli organizadas em operons.
O plasmídeo de expressão pAM408 foi gerado pela inserção dos genes que codificam as enzimas do caminho de DXP do "topo" no vetor pAM29. As enzimas do caminho de DXP de "topo" incluem a 1-desóxi-D- xilulose-5-fosfato sintase (codificada pelo gene dxs de Escherichia coli), 1- desóxi-D-xilulose-5-fosfato redutoisomerase (codificada pelo gene dxr de Eseheriehia coli), 4-difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol sintase (codificada pelo gene ispD de Escheriehia coli) e 4-difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol sintase (codificada pelo gene ispE de Escherichia coli), que juntas transformam piruvato e D-gliceraldeído-3-fosfato em 4-difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol- 2-fosfato. Os fragmentos de DNA que compreendem as seqüências de nucleotídeo que codificam enzimas do caminho de DXP do "topo" foram gerados pela amplificação pela PCR das seqüências codificadoras dos genes dxs (número de acesso do GenBank U00096 REGIÃO: 437539..439401), dxr (número de acesso do GenBank U00096 REGIÃO: 193521..194717), ispD (número de acesso do GenBank U00096 REGIÃO: 2869803..2870512) e ispE (número de acesso do GenBank U00096 REGIÃO 1261249.. 1262100) da cepa DHl de Escherichia coli (ATCC #33849) com seqüências de Shine Dalgarno otimamente alinhadas e sítios de enzima de restrição 5' e 3' usando os iniciadores de PCR mostrados nas SEQ ID NOS: 15 a 18. Os produtos de PCR foram resolvidos pela eletroforese em gel, extraídos em gel usando um kit de purificação em gel Qiagen (Valencia, CA), digerido até a conclusão usando enzimas de restrição apropriadas (XhoI e KpnI para o produto de PCR que compreende o gene dxs; KpnI e ApaI para o produto de PCR que compreende o gene dxr; ApaI e NdeI para o produto de PCR que compreende o gene ispD; NdeI e MluI para o produto de PCR que compreende o gene ispE) e purificado usando um kit de purificação pela PCR Qiagen (Valencia, CA). Quantidades ligeiramente equimolares de cada produto de PCR foram depois adicionadas a uma reação de ligação para a montagem dos genes individuais em um operon. A partir desta reação de ligação, 1 μl da mistura de reação foi usado para amplificar pela PCR 2 cassetes de gene separados, a saber os cassetes de gene dxs-dxr e o ispDispE. O cassete de gene dxs-dxr foi amplificado pela PCR usando iniciadores 67-1A-C (SEQ ID NO: 15) e 67- ID-C (SEQ ID NO: 18) e o cassete de gene ispD-ispE foi amplificado pela PCR usando iniciadores 67-1E-C (SEQ ID NO: 19) e 67-1H-C (SEQ ID NO: 22). Os dois produtos de PCR foram resolvidos pela eletroforese em gel e extraídos em gel. O produto de PCR que compreende o cassete de gene dxs- dxr foi digerido até a conclusão usando as enzimas de restrição XhoI e ApaI e o produto de PCR que compreende o cassete de gene ispD-ispE foi digerido até a conclusão usando as enzimas de restrição ApaI e MluI e os dois produtos de PCR foram purificados. O vetor pAM29 foi digerido até a conclusão usando as enzimas de restrição SalI e MluI e os dois produtos de PCR digeridos contendo o operon do caminho de DXP do "topo" foram ligados no sítio de enzima de restrição SalI MluI do vetor pAM29, produzindo o plasmídeo de expressão pAM408 (ver a Figura 7 para um mapa de plasmídeo).
O plasmídeo de expressão pAM409 foi gerado pela inserção dos genes que codificam enzimas do caminho de DXP "fundo" no vetor pAM369. As enzimas do caminho de DXP "fundo" incluem 2C-metil-D- eritritol 2,4-ciclodifosfato sintase (codificado pelo gene ispF de Escherichia coli), l-hidróxi-2-metil-2-(E)-butenil-4-difosfato sintase (codificado pelo gene ispG da Escherichia coli) e isopentenil/dimetilalil difosfato sintase (codificado pelo gene ispH da Escherichia coli), que juntos transformam o 4- difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol-2-fosfato a IPP e DMAPP. IPP também é convertido a DMAPP através da atividade da isopentil difosfato isomerase (codificada pelo gene idi da Escherichia coli). DMAPP pode ser ainda convertido a FPP através da atividade de farnesil difosfato sintase (codificada pelo gene ispA de Escherichia coli). Um operon que codifica enzimas do caminho de DXP "fundo" assim como uma isopentil difosfato isomerase e uma farnesil difosfato sintase foram geradas pela amplificação pela PCR dos genes ispF (número de acesso do GenBank U00096 REGIÃO: 2869323..2869802), ispG (número de acesso do GenBank U00096 REGIÃO: 2638708..2639826), ispH {número de acesso do GenBank U00096 REGIÃO: 26277..27227), idi (número de acesso do GenBank AFl 19715) e ispA (número de acesso do GenBank D00694 REGIÃO: 484..1383) da cepa DHl da Escherichia coli (ATCC #33849) com seqüências de Shine Dalgarno otimamente adicionada e sítios de enzima de restrição 5' e 3' usando os iniciadores de PCR apropriados. Os produtos de PCR foram resolvidos pela eletroforese em gel, extraído em gel, digerido com as enzimas de restrição apropriadas (BamHI e ApaI para o produto de PCR que compreende o gene ispF; KpnI e ApaI para o produto de PCR que compreende o gene ispG; SalI e KpnI para o produto de PCR que compreende o gene ispH; SalI e HindIII para o produto de PCR que compreende o gene idi; HindIII e NcoI para o produto de PCR que compreende o gene ispA) e purificado. Quantidades aproximadamente equimolares de cada produto foram depois adicionadas a uma reação de ligação para montar os genes individuais em um operon. A partir desta reação de ligação, 1 μΐ de mistura de reação foi usado para amplificar pela PCR 2 cassetes de gene separados, a saber os cassetes de gene ispF-ispG e o ispH-idi-ispA. O cassete de gene ispF-ispG foi amplificado pela PCR usando iniciadores 67-2A-C (SEQ ID NO: 23) e 67-2D-C (SEQ ID NO: 26) e o cassete de gene ispH-idi-ispA foi amplificado pela PCR usando iniciadores 67-2E-C (SEQ ID NO: 27) e 67-2J-C (SEQ ID NO: 32). Os dois produtos da PCR foram resolvidos pela eletroforese em gel e extraídos em gel. O produto da PCR que compreende o cassete de gene ispF-ispG foi digerido até a conclusão usando as enzimas de restrição BamHI e KpnI e o produto de PCR que compreende o cassete de gene ispH-idi-ispA foi digerido até a conclusão usando as enzimas de restrição KpnI e NcoI e os dois produtos de PCR foram purificados. O vetor pAM369 foi criado pela montagem da origem pl5A de replicação de pAM29 e o gene da beta-lactamase para a resistência à ampicilina de pZE12-luc (Lutz e Bujard (1997) Nucl Acids Res. 25: 1203-1210) com um promotor lacUV5 gerado em oligonucleotídeo. O vetor pAM369 foi digerido até a conclusão usando enzimas de restrição BamHI e NcoI e os 2 produtos de PCR isolados que contiveram o operon do caminho de DXP "fundo" foram ligados no sítio de enzima de restrição BamHI NcoI do vetor pAM369, produzindo o plasmídeo de expressão pAM409.
O plasmídeo de expressão pAM424, um derivado do plasmídeo de expressão pAM409 contendo a origem RK2 da faixa de hospedeiro ampla de replicação, foi gerado pela transferência do promotor lacUV5 e o operon ispFGH-idi-ispA de pAM409 para o vetor pAM257. O vetor pAM257 foi gerado como segue: o local par de RK2 foi amplificado pela PCR a partir do DNA plasmídico de RK2 (Meyer et al. (1975) Science 190: 1226-1228) usando iniciadores 9-156A (SEQ ID NO: 33) e 9-156B (SEQ ID NO: 34), o produto de PCR de 2,6 kb foi digerido até a conclusão usando as enzimas de restrição AatII e XhoI e o fragmento de DNA foi ligado em um plasmídeo contendo a origem pl5 de replicação e o gene da resistência ao cloranfenicol do vetor pZA31-luc (Lutz e Bujard (1997) Nucl Acids Res. 25: 1203-1210), produzindo plasmídeo pAM3 7 -par, pAM37-par foi digerido até a conclusão usando enzimas de restrição SacI e HindIIl, a mistura de reação foi resolvida pela eletroforese em gel, o fragmento de DNA que compreende o local par de RK2 e o gene da resistência ao cloranfenicol foi extraído em gel e o fragmento de DNA isolado foi ligado no sítio SacIHindIII 5 do mini-replicon RK2 pRR10 (Roberts et al. (1990) J Bacteriol. 172: 6204- 6216), produzindo o vetor ρAMl33; pAM133 foi digerido até a conclusão usando as enzimas de restrição BglII e HindIII, a mistura de reação foi resolvida pela eletroforese em gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 6,4 kb que carece do gene da resistência à ampicilina e a origem conjugativa oriT foi extraída em gel e o fragmento de DNA isolado foi ligado com um fragmento de DNA sinteticamente gerado que compreende um sítio de clonagem múltiplo que conteve sítios de enzima de restrição PeiI e XhoI, produzindo o vetor pAM257. O plasmídeo de expressão pAM409 foi digerido até a conclusão usando as enzimas de restrição XhoI e PeiI, a mistura de reação foi resolvida pela eletroforese em gel e o fragmento de DNA de aproximadamente 4,4 kb foi extraído em gel. O vetor pAM257 foi digerido até a conclusão usando enzimas de restrição XhoI e PciI e o fragmento de DNA isolado contendo o promotor lacUV5 e o operon ispFGH-idi-ispA foi ligado no sítio de enzima de restrição XhoI PeiI do vetor pAM257, produzindo o plasmídeo de expressão pAM424 (ver a Figura 8 para um mapa de plasmídeo).
Exemplo 5
Este exemplo descreve métodos para fabricar plasmídeos de expressão que codificam enzimas que convertem FPP ou GPP.
O plasmídeo de expressão pTrc99A-ADS foi gerado pela inserção do uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma amorpha-4,11- dieno sintase ("ADS") no vetor pTrc99A. A seqüência da amorpha-4,11- dieno sintase foi gerada sinteticamente, de modo que na tradução a seqüência de aminoácido seria idêntica àquela descrita por Merke et al. (2000) Ach. Biochem. Biophys. 381: 173-180, de modo que a seqüência de nucleotídeo que codifica a amorpha-4,11-dieno sintase foi otimizada para a expressão em Escherichia coli e de modo que a seqüência de nucleotídeo fosse flanqueada por um sítio de enzima de restrição 5' NcoI e um 3' XmaI (ver a Patente U.S. Número 7.192.751). A seqüência de nucleotídeo foi digerida até a conclusão usando enzimas de restrição NcoI e XmaI, a mistura de reação foi resolvida pela eletroforese em gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 1,6 kb foi extraído do gel e o fragmento de DNA isolado foi inserido no sítio de enzima de restrição NeoI XmaI do vetor pTrc99A (Amman et al. (1985) Gene 40: 183-190), produzindo o plasmídeo de expressão pTrc99A-ADS (ver a Figura 9 para um mapa de plasmídeo).
O plasmídeo de expressão pAM113 é um derivado resistente ao cloranfenicol do pTrc99A-ADS. Este foi gerado pela amplificação pela PCR do gene da resistência ao cloranfenicol a partir do vetor pZA31-luc (Lutz e Bujard (1997) Nucl Acids Res. 25: 1203-1210) usando iniciadores 5'- fosforilados 19-137 cml-pAM37-AS (SEQ ID NO: 35) e 19-137 cml-pAM37- S (SEQ ID NO: 36) e inserindo o produto de PCR de 920 pares de base no sítio de enzima de restrição FspI do plasmídeo de expressão pTrc99A-ADS, produzindo plasmídeo de expressão ρAMl 13.
O plasmídeo de expressão pC9 foi gerado pela inserção de um fragmento de DNA genômico de Bacillus subtilis 6051 que compreende a seqüência codificadora do gene nudF e seqüências genômicas a montante (número de acesso do GenBank 299116 REGIÃO: 49364..48548) no vetor pTrc99A (Arnann et al. (1988) Gene 69: 301-315). O plasmídeo de expressão pNudF-H foi gerado pela inserção da seqüência codificadora do gene 6051 nudF de Baeillus subtilis (número de acesso do GenBank Z99116 REGIÃO: 49105..48548) no vetor pTrc99A. O plasmídeo de expressão pyhfR foi gerado pela inserção da seqüência codificadora do gene 6051 yhflt do Bacillus subtilis (número de acesso do GenBank Z99109 REGIÃO: 97583..97002) no vetor pTrc99A.
O plasmídeo de expressão pAM373 foi gerado pela inserção de uma seqüência de nucleotídeo que codifica a β-farneseno sintase ("FSB") de Artemisia annua (número de acesso do GenBank AY835398), otimizado no códon para a expressão na Escherichia coli, no vetor pTrc99A. A seqüência de nucleotídeo que codifica a β-farneseno sintase foi gerada sinteticamente e foi amplificada pela PCR a partir da sua construção de síntese de DNA usando os iniciadores apropriados. Para criar um sítio de enzima de restrição NcoI líder no produto de PCR que compreende a seqüência codificadora da β-farneseno sintase, o códon que codifica o segundo aminoácido na seqüência de polipeptídeo original (TCG que codifica serina) foi substituído por um códon que codifica ácido aspártico (GAC) no iniciador da 5' PCR (SEQ ID NO: 37). O produto de PCR resultante foi parcialmente digerido usando enzima de restrição NcoI e digerido até a conclusão usando enzima de restrição SaeI, a mistura de reação foi resolvida pela eletroforese em gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 1,7 kb que compreende a seqüência codificadora da β-farneseno sintase foi extraído em gel e o fragmento de DNA isolado foi ligado no sítio de enzima de restrição NeoI SaeI do vetor pTrc99A, produzindo o plasmídeo de expressão pAM373 (ver a Figura 9 para um mapa de plasmídeo).
Os plasmídeos de expressão pTrc99A-FSA, pTrc99A-GTS, pTrc99A-PS, pTrc99ATS foram gerados pela inserção do um fragmento de DNA que compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma a- farneseno sintase ("FSA"), uma γ-terpineno sintase ("GTS"), uma a-pineno sintase ("APS") ou uma terpinoleno sintase ("TS") no vetor pTrc99A. O inserto de fragmento de DNA foi gerado sinteticamente, usando como um padrão por exemplo a seqüência codificadora do gene da α-farneseno sintase de Picea abies (número de acesso do GenBank AY473627, REGIÃO: 24.. 1766), a seqüência codificadora do gene da β-farneseno sintase de Artemisia annua (número de acesso do GenBank AY835398), a seqüência codificadora do gene da 7-terpinene sintase de Citrus limon (número de acesso do GenBank AF514286 REGIÃO: 30.. 1832), a seqüência codificadora do gene da α-pineno sintase de Abies grandis (número de acesso do GenBank U87909, REGIÃO: 6.. 1892) ou de Pinus taeda (número de acesso do GenBank AF543530 REGIÃO: 1..1887) ou a seqüência codifícadora do gene da terpinoleno sintase de Ocimum basilicum (número de acesso do GenBank AY693650) ou de Pseudotsuga menziesii (número de acesso do GenBank AY906866 REGIÃO: 10.. 1887) ou de Abies grandis (número de acesso do GenBank AF139206), todas as seqüências de nucleotídeo sendo otimizadas no códon para a expressão em Eseherichia coli. Os fragmentos de DNA para FSA foram amplificados pela PCR a partir da sua construção de síntese de DNA usando as seqüências de iniciador SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 40. O produto de PCR resultante foi digerido até a conclusão usando as enzimas de restrição NeoI e Saci, a mistura de reação foi resolvida pela eletroforese em gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 1,7 kb que compreende a seqüência codifícadora da α-farneseno sintase foi extraída em gel e o fragmento de DNA isolado foi ligado no sítio de enzima de restrição NcoI SaeI do vetor pTrc99A, produzindo o plasmídeo de expressão pTrc99A-FSA (ver a Figura 9 para um mapa de plasmídeo). Os fragmentos de DNA para GTS, APS e TS foram designados como sendo flanqueados por um sítio de enzima de restrição XmaI líder e um sítio de enzima de restrição XbaI terminal e foram clonados em sítios de enzima de restrição compatíveis de um vetor de clonagem tal como um vetor de origem pUC ou pACYC padrão, a partir do qual eles puderam ser liberados mais uma vez pela digestão até a conclusão da construção de síntese de DNA usando enzimas de restrição XbaI e XmaI, resolvendo a mistura de reação pela eletroforese em gel e extraindo do gel o fragmento de DNA de 1,7 a 1,9 que codifica a terpeno sintase. Os fragmentos de DNA isolados foram ligados no sítio de enzima de restrição XmaI XbaI do vetor pTrc99A (Amman et ai. Gene 40: 183-190 (1985)), produzindo plasmídeos pTrc99A-GTS, pTrc99A-APS ou pTrc99A-TS (ver a Figura 9 para mapas de plasmídeo).
Os plasmídeos de expressão pRS425-FSA e pRS425-FSB foram gerados pela inserção de uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma α-farneseno sintase ("FSA") ou uma β-farneseno sintase ("FSB"), respectivamente, no vetor pRS425-Gall (Mumberg et al., (1994) Nucl. Acids. Res. 22(25): 5767-5768). Os insertos de seqüência de nucleotídeo foram gerados sinteticamente, usando como um padrão por exemplo a seqüência codificadora do gene da α-farneseno sintase de Picea abies (número de acesso do GenBank AY473627, REGIÃO: 24.. 1766) ou do gene da β- farneseno sintase de Artemisia annua (número de acesso do GenBank AY835398), otimizadas no códon para expressão em Saccharomyces eerevisiae. A seqüência de nucleotídeo sinteticamente gerada foi flanqueada por um sítio 5' BamHI e um sítio 3' XhoI e pôde ser assim clonada em sítios de enzima de restrição compatíveis de um vetor de clonagem tal como um vetor de origem pUC ou pACYC padrão. A seqüência de nucleotídeo sinteticamente gerada foi isolada pela digestão até a conclusão da construção de síntese de DNA usando enzimas de restrição BamHI e XhoI. A mistura de reação foi resolvida pela eletroforese em gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 1,7 kb que compreende a seqüência codificadora da a- farneseno sintase ou β-farneseno sintase foi extraído em gel e o fragmento de DNA isolado foi ligado no sítio de enzima de restrição BamHI XhoI do vetor pRS425-Gal 1, produzindo plasmídeo de expressão pRS425-FSA ou pRS425- FSB, respectivamente.
Os plasmídeos de expressão pTrc99A-LLS, pTrc99A-LMS, pTrc99A-BPS, pTrc99APHS, pTrc99A-CS e pTrc99A-SS são gerados pela inserção de uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma linalool sintase ("LLS"), limoneno sintase ("LMS"), β-pineno sintase ("BPS"), β-felandreno ("PHS"), careno sintase ("CS") ou sabinina sintase ("SS") no vetor pTrc99A. Os insertos de seqüência de nucleotídeo são gerados sinteticamente, usando como um padrão por exemplo a seqüência codificadora do gene da linalool sintase de Artemisia annua (número de acesso do GenBank AF154124, REGIÃO: 13.. 1764), a seqüência codificadora do gene da limoneno sintase de Abies grandis (número de acesso do GenBank AF006193 REGIÃO: 73..1986), a seqüência codificadora da β-pineno sintase de Artemisia annua (número de acesso do GenBank AF276072 REGIÃO: 1..1749), a seqüência codificadora do gene da β-felandreno sintase de Abies grandis (número de acesso do GenBank AF139205 REGIÃO: 34.. 1926), a seqüência codificadora do gene da careno sintase de Salvia stenophilla (número de acesso do GenBank AF527416 REGIÃO: 78..1871) ou a seqüência codificadora do gene da sabineno sintase de Salvia officinalis (número de acesso do GenBank AF051901 REGIÃO: 26.. 1798). as seqüências de nucleotídeo que codificam a β-pineno, sabinina e β-felandreno sintases são flanqueadas por um sítio de enzima de restrição XmaI líder e um sítio de enzima de restrição XbaI terminal, as seqüências de nucleotídeo que codificam as linalool e careno sintases são flanqueados por um sítio de enzima de restrição NcoI líder e um sítio de enzima de restrição XmaI terminal e a seqüência de nucleotídeo que codifica a limoneno sintase é flanqueada por um sítio de enzima de restrição NcoI líder e um sítio de enzima de restrição PstI terminal. As construções de síntese de DNA são digeridas até a conclusão usando XmaI e XbaI (para as construções de β-pineno, sabinino e β-felandreno sintase), as enzimas de restrição NeoI e XmaI (para as construções de linalool e carena sintase) ou as enzimas de restrição XbaI e PstI (para a construção da limoneno sintase). As misturas de reação são resolvidas pela eletroforese em gel, os fragmentos de DNA de aproximadamente 1,7 a 1,9 kb são extraídos em gel e os fragmentos de DNA isolados são ligados no sítio de enzima de restrição XmaI XbaI (para os insertos da β-pineno, sabinino e β-felandreno sintase), o sítio de enzima de restrição NcoI XmaI (para os insertos da linalool e carena sintase) ou o sítio de enzima de restrição XbaI PstI (para os insertos da limoneno sintase) do vetor pTrc99A, produzindo os plasmídeos de expressão pTrc99A-LLS5 pTrc99A- LMS, pTrc99A-BPS, pTrc99A-PHS, pTrc99ACS e pTrc99A-SS (ver a Figura 9 para os mapas de plasmídeo).
Exemplo 6
Este exemplo descreve a geração de cepas hospedeiras de Escherichia eoli úteis na invenção.
Como detalhado na Tabela 1, as cepas hospedeiras foram criadas pela transformação de células precursoras de Eseheriehia eoli quimicamente competentes com um ou mais plasmídeos de expressão do Exemplo 1 até 5.
Tabela 1. Cepas hospedeiras de E. eoli
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Os transformantes de célula hospedeira foram selecionados em ágar de Luria Bertoni (LB) contendo antibióticos como detalhado na Tabela 1. As colônias únicas foram transferidas do ágar LB para tubos de cultura contendo 5 ml de meio líquido LB e antibióticos. Os transformantes de célula hospedeira B003, B617, B618, B619, B650, B651, B652 e B653 foram incubados a 30°C em um agitador rotativo a 250 rpm por 30 horas. Todos os outros transformantes de célula hospedeira foram incubados a 37°C em agitador rotativo a 250 rpm até que a cultura atingisse a fase estacionária. As células foram adaptadas ao meio mínimo passando-as através de 4 a 5 corridas sucessivas de meio M9-MOPS contendo 0,8% de glicose e antibióticos (ver a Tabela 2 para a composição do meio M9-MOPS). As células foram armazenadas a -80°C em crio-frascos em alíquotas de estoque de 1 ml fabricadas de 400 μl de glicerol a 50% estéril e cultura líquida de 600 μl.
Tabela 2 - Composição do Meio de Cultura M9-MOPS
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Exemplo 7
Este exemplo demonstra a estabilidade do plasmídeo de expressão na ausência de antibióticos em uma cepa hospedeira de Escherichia coli que abriga um plasmídeo de expressão que compreende os sistemas de replicação, segregação e manutenção do plasmídeo RK2.
Uma cultura de semente da cepa hospedeira B255 foi estabelecida pela adição de uma alíquota de estoque da cepa a um frasco de 125 ml contendo 40 ml de M9-MOPS, 2% de glicose, 0,5% de extrato de levedura e antibióticos como detalhado na Tabela 1 e cultivando-se a cultura durante a noite.
A cultura de semente foi usada para inocular em uma OD6oo inicial de aproximadamente 0,05, dois frascos de 250 ml cada um contendo 40 ml de meio M9-MOPS, 2% de glicose e 0,5% de extrato de levedura. A cultura #1 também conteve 100 μg/ml de carbenicilina e 34 μg/ml de cloranfenicol. A cultura #2 não recebe nenhum antibiótico. Ambas as culturas foram incubada a 37°C em agitador rotativo a 250 rpm até que elas atingissem uma OD6QO de aproximadamente 0,2, ponto no qual a produção de amorfa- 4,11-dieno nas células hospedeiras foi induzida pela adição de 40 μl de IPTG 1 M ao meio de cultura. No momento da indução, as culturas foram sobrepostas com 8 ml de uma sobreposição orgânica para capturar o amorfa- 4,11-dieno. As amostras foram periodicamente tomadas para um total de 72 horas. A produção de amorfa-4,11-dieno pela cepa hospedeira nas 2 culturas foi confirmada pela GC/MS como descrito no Exemplo 10.
Para avaliar a estabilidade de plasmídeo nas duas culturas de célula, uma amostra de cada cultura foi removida em 72 horas e riscada em uma placa de ágar LB (nenhum antibiótico). Depois da incubação durante a noite a 37°C, 50 colônias individuais derivadas de cada cultura foram plaqueadas em réplica em uma placa de ágar LB mais antibióticos (34 μg/ml de cloranfenicol, 100 μg/ml de carbenicilina) e uma placa de ágar LB menos antibióticos (nenhum antibiótico). Depois de uma outra incubação durante a noite a 37°C, as placas de ágar LB mais antibióticos e ágar LB menos antibióticos foram cada uma descobertas conter aproximadamente 50 colônias, indicando que a retenção de plasmídeo tanto na presença quanto na ausência de antibióticos no meio de cultura foi de aproximadamente 100%.
Exemplo 8
Este exemplo demonstra atividade e estabilidade específicas aumentadas do HMGR de Enterococcus faecalis comparada com tHMGR de Saecharomyces eerevisiae em uma cepa hospedeira de Escheriehia eoli.
As culturas de sementes das cepas hospedeiras B61 e B62 foram estabelecidas pela adição de uma alíquota de estoque de cada cepa a frascos de 125 ml contendo 20 ml de meio M9-MOPS, 0,8% de glicose e antibióticos como detalhado na Tabela 5 e cultivando-se as culturas até a saturação. As culturas de sementes foram diluídas 1:100 em 140 ml de meio fresco em um frasco de 500 ml e cultivadas mais uma vez a uma OD550 de aproximadamente 0,1, ponto no qual a produção de amorfa-4,11-dieno foi induzida pela adição de 140 μl de IPTG 1 M a cada cultura. A 4, 12, 20, 28, 36 e 49 horas após a indução, as amostras foram removidas de cada cultura e as células foram pelotizadas pela centrifiigação. As pelotas de célula foram subitamente congeladas em gelo seco e depois armazenadas a -80°C.
Para conduzir ensaios de enzima, as pelotas de célula foram descongeladas em gelo e depois lisadas usando Bugbuster (Novagen, Madison, WI) contendo a mistura de inibidor de protease #3 (Calbiochem, San Diego, CA), benzonase (20 μl por 5 ml de bugbuster; Novagen, Madison, WI), e lisozima (30 μg/ml). A atividade de enzima do Saccharomyces cerevisiae tHMGR foi ensaiado em 50 mM de Tris HCl (pH 7,5), 0,2 mM de NADPH (Sigma, St. Louis, MO) e 0,3 mM do sal sódico de DL-3-hidróxi-3- metilglutaril coenzima A (HMG-CoA) (Sigma, St. Louis, MO). O ensaio foi iniciado pela adição de lisado de célula e o desaparecimento de NADPH foi monitorado pela absorbância a 340 nM. Para explicar o desaparecimento não específico de NADPH, os resultados obtidos em um ensaio de controle que carece de HMG-CoA foram subtraídos dos resultados obtidos em amostras de teste. A atividade de enzima do HMGR de Enteroeoecus faeealis foi medida similarmente exceto que o tampão de ensaio conteve 100 mM de tampão de fosfato de potássio (pH 6,5), 0,4 mM de NADPH, 1,0 mM de EDTA e 100 mM de KCl.
Os ensaios de proteína foram feitos pelo método de Bradford ((1976) Anal Biochem. 72: 248-254). As atividades específicas foram calculadas como Anmol de NADPH/min/mg de proteína.
Exemplo 9
Este exemplo descreve a calibração de OD600 com peso de célula seca ("DCW").
Para obter as relações entre DCW e OD600, uma cepa representativa, B32, foi cultivada em processos de densidade de célula alta similar àqueles descritos nos Exemplos IOa 12. As amostras foram tiradas do começo ao fim das corridas e a OD600 e DCW foram medidos para cada amostra. Para determinar o DCW, as células foram pelotizadas e o sobrenadante descartado. A pelota de célula foi lavada uma vez com água e foi depois secada em uma estufa a 80°C por pelo menos 3 dias. Os tubos contendo pelotas de célula foram pesados, o peso do tubo foi subtraído dos pesos medidos e o peso remanescente foi dividido pelo volume inicial de cada amostra (0,0015 L) para se obter o DCW.
Exemplo 10
Este exemplo demonstra a produção aumentada de amorfa- 4,11-dieno nas cepas hospedeiras de Escherichia coli que expressam o HMGR e HMGS de Staphilococcus aureus comparada com as cepas hospedeiras que expressam o tHMGR e HMGS de Saccharomyees eerevisiae.
As culturas de sementes das cepas hospedeiras B32, B153, B210, B282, B292, B86, B255 e B256 foram estabelecidas pela adição de uma alíquota de estoque de cada cepa para separar frascos de 125 ml contendo 25 ml de meio M9-MOPS, 0,8% de glicose e antibióticos como detalhado na Tabela 1 e cultivando-se as culturas durante a noite.
As culturas de sementes foram usadas para inocular em uma OD60O inicial de aproximadamente 0,05 frascos de 250 ml separados contendo 40 ml de meio M9-MOPS, 2% de glicose e antibióticos. As culturas foram incubadas a 3 0°C em agitador rotativo a 250 rpm até que elas atingissem uma OD600 de aproximadamente 0,2, ponto no qual a produção de amorfa-4,11- dieno nas células hospedeiras foi induzida pela adição de 40 μl de IPTG 1 M ao meio de cultura. As culturas foram cobertas com 8 ml de uma cobertura orgânica (por exemplo, dodecano, oleato de metila ou miristato de isopropila). As amostras da camada de cobertura orgânica e o caldo foram coletadas uma vez ao dia por 72 horas. As amostras de caldo foram usadas para medir a OD600. A concentração de amorfa-4,11-dieno foi medida pela transferência dos 5 μl da camada de cobertura orgânica a um frasco de vidro limpo contendo 500 μl de acetato de etila reforçado com beta- ou trans-cariofileno como um padrão interno.
As amostras de cobertura orgânica/acetato de etila foram analisadas em um cromatógrafo a gás/espectrômetro de massa (GC/MS) Hewlett-Packard 6890 varrendo-se apenas para dois íons, o íon molecular (204 m/z) e o íon de 189 m/z, como descrito em Martin et ai. (2001) Biotechnol. Bioeng. 75: 497-503. Para acelerar tempos de condução, o programa de temperatura e a matriz da coluna foram modificados para se obter resolução de pico ótima e os tempos de condução globais mais curtos. Uma amostra de 1 μl foi separada na GC usando uma coluna DB-XLB (disponível da Agilent Technologies, Inc.. Palo Alto, CA) e gás carregador de hélio. O programa de temperatura para a análise foi como segue: 100°C por 0,75 minutos, aumentando a temperatura em 60°C/minuto até uma temperatura de 300°C e uma contenção a 300°C por 0,5 minuto. As amostras resolvidas foram analisadas por um detector seletivo de massa Hewlett- Packard modelo 5973 que monitorou os íons de 189 e 204 m/z. Os espectros de massa anteriores demonstraram que o produto da amorfa-4,11-dieno sintase foi amorfa-4,11-dieno e que amorfa-4,11-dieno teve um tempo de retenção de 3,7 minutos usando este protocolo de GC. Beta- ou trans- cariofileno foi usado como um padrão interno para a quantificação. O título de morfa-4,11-dieno foi calculado usando a razão de padrão interno para áreas de pico de amorfa-4,11-dieno com base em uma curva de calibração quantitativa de amorfa-4,11-dieno purificado (0,63 a 10 mg/L de KJF17-109- 3) em acetato de etila reforçado com cariofileno.
Exemplo 11
Este exemplo demonstra a produção aumentada de amorfa- 4,11-dieno por uma cepa hospedeira de Escherichia coli cultivada em temperatura subótima.
Uma cultura de semente da cepa hospedeira B32 foi estabelecida adicionando-se 0,5 ml de uma alíquota de estoque da cepa a um frasco de 250 ml contendo 50 ml de meio M9-MOPS e antibióticos como detalhado na Tabela 1 e cultivando-se a cultura durante a noite a 37°C em agitador rotativo a 250 rpm.
A cultura de semente foi usada para inocular em uma OD600 inicial de aproximadamente 0,05 quatro frascos de 250 ml, cada um contendo 40 ml de meio de batelada de fermentador (ver a Tabela 6 para a composição do meio), 100 raM de tampão MOPS pH 7,1 e antibióticos. As culturas foram incubadas em agitador rotativo a 250 rpm a 30°C ou 37°C até que elas atingissem uma OD600 de 0,18 a 0,22, ponto no qual a produção de amorfa- 4,11-dieno nas células hospedeiras foi induzida adicionando-se 40 μl de IPTG 1 M ao meio de cultura. No momento da indução, as culturas foram cobertas com 8 ml de uma cobertura orgânica para capturar o amorfa-4,11 -dieno. As amostras foram coletadas uma vez ao dia e analisadas como descrito no Exemplo 10.
Exemplo 12
Este exemplo demonstra a produção aumentada de amorfa- 4,11-dieno por uma cepa hospedeira de Escherichia coli cultivada sob condições de fonte de carbono restritas.
Uma cultura de semente da cepa hospedeira B32 para as corridas de fermentação 050608-1 e 050629-1 foi estabelecida adicionando-se 0,25 μl de uma alíquota de estoque da cepa a um frasco de 250 ml contendo 50 ml de meio M9-MOPS e antibióticos como detalhado na Tabela 1 e incubando-se a cultura a 37°C em agitador rotativo a 250 rpm até que ele atingisse uma OD500 de 1 a 2.
Uma cultura de semente da cepa hospedeira B32 para a corrida de fermentação 060403-3 foi estabelecida adicionando-se uma alíquota de estoque da cepa a um frasco de 250 ml contendo 50 ml de meio M9-MOPS e antibióticos como detalhado na Tabela 1 e incubando-se a cultura durante a noite a 37°C em agitador rotativo a 250 rpm. A cultura de semente foi usada para inocular a uma OD600 inicial de aproximadamente 1 um frasco de 250 ml contendo 40 ml de meio M9-MOPS e antibióticos e a cultura foi mais uma vez incubada a 37°C em agitador rotativo a 250 rpm até que ela atingisse uma OD60O de 3 a 5.
Para todos os processos de fermentação, o KH2PO4, K2HPO4 3H20, EDTA, ácido cítrico e (NH4)2SO4 foram esterilizados com calor no biorreator (2L Applikon Bioconsole ADI 1025s com controladores ADI 1010, Applikon Biotechnology, Foster City, CA). Os componentes de meio remanescentes foram esterilizados por filtração como soluções de estoque e injetados através da placa de topo. A Tabela 3 mostra a composição final média para as corridas de fermentação 050608-1 e 050629-1. A Tabela 4 mostra a composição média final para a corrida de fermentação 060403-3. O volume de partida para a corrida 050608-1 foi de 0,8 L, o volume de partida para a 050629-1 foi de 1,2 L e o volume de partida para a 060403-3 foi de 1 L. Todas as corridas foram inoculadas injetando-se 50 ml da cultura de semente através da placa de topo.
Tabela 3 - Composição de Meio de Fermentação das Corridas de Fermentação 050608-1 e 050629-1
<table>table see original document page 92</column></row><table> Tabela 4 - Composição de Meio de Fermentação da Corrida de Fermentação 060403-3
<table>table see original document page 93</column></row><table>
Para a corrida de fermentação 050608-1 (carbono em excesso), a alimentação foi iniciada na indução e as taxas de alimentação foram ajustadas manualmente. Para a corrida de fermentação 050629-1 (restrita em carbono), a alimentação foi liberada para o fermentador de acordo com o protocolo mostrado na Tabela 5. Para a corrida de fermentação 060403-3 (carbono mais baixo), a alimentação foi iniciada automaticamente quando o bolo de glicose inicial (15 g) foi exaurido e o oxigênio dissolvido reforçado. Até um máximo de 27,6 g/h, a taxa da alimentação foi calculada de acordo com a seguinte equação:
<formula>formula see original document page 93</formula>
em que to é o tempo no qual a glicose inicial foi esgotada. Ao atingir a razão máxima, a alimentação de glicose foi restrita a uma razão de 9,5 g/h e mantida constante nesta razão para o resto da corrida. Tabela 5 - Protocolo de Alimentação para a Corrida de Fermentação 050629-1
<table>table see original document page 94</column></row><table>
As corridas 050608-1 e 050629-1 foram realizadas a 37°C. O fluxo de ar no biorreator foi ajustado de 1 a 2 L/min; o pH foi mantido a 7 usando hidróxido de amônio e/ou hidróxido de sódio; a agitação inicial foi de 500 a 600 rpm; a espuma foi controlada com anti-espumante B (Sigma- Aldich, St. Louis, MO); os níveis de oxigênio dissolvido foram mantidos acima de 30% usando uma cascata de agitação. Depois de 5 a 6 horas de cultivo, a produção de amorfa-4,11-dieno pelas células hospedeiras foi induzida adicionando-se 0,8 ml de IPTG 1 M à corrida 050608-1 e 1,2 ml de IPTG à corrida 050629-1. Na indução, a temperatura da cultura foi reduzida para 30°C.
A corrida 060403-3 foi realizada a 3 0°C. O fluxo de ar no biorreator foi ajustado a 12 L/min; o pH foi mantido a 7 usando hidróxido de amônio. O oxigênio dissolvido foi mantido acima de 30% por uma cascata de agitação e enriquecimento de oxigênio. Em uma OD600 de aproximadamente 28 (19 horas depois da inoculação), a produção de amorfa-4,11-dieno pelas células hospedeiras foi induzida adicionando-se 1 ml de IPTG 1 M.
Amorfa-4,11-dieno foi capturado e extraído de acordo com dois protocolos diferentes. Para as corridas 050608-1 e 050629-1, amorfa- 4,11-dieno volátil presente no gás desprendido foi capturado ventilando-se o gás desprendido através de uma lavador de gás contendo 200 ml de heptanol.
O heptanol foi depois diluído em acetato de etila até que a concentração de amorfa-4,11-dieno na amostra estivesse entre 0,63 mg/L e 20 mg/L. Para a corrida 060403-3, amorfa-4,11-dieno foi capturado no biorreator adicionando- se 200 ml de uma cobertura orgânica ao fermentador no momento da indução.
A concentração de produto foi medida combinando-se 25 μl de caldo mais cobertura orgânica com 975 μl de acetonitrila, agitando a amostra na velocidade máxima em um misturador Fisher Vortex Genie 2® (Scientific Industries, Inc.. Bohemia, NY) por pelo menos 3 minutos, removendo as células da amostra pela centrifugação e diluindo a solução de acetonitrila em acetato de etila até que a concentração de amorpha-4,11 -dieno na amostra estivesse entre 0,63 e 20 mg/L. As amostras de acetato de etila foram analisadas pela GC/MS como descrito no Exemplo 10.
Exemplo 13
Este exemplo demonstra produção aumentada de amorfa-4,11- dieno por uma cepa hospedeira de Escherichia coli cultivada sob condições de fonte de carbono restritas e na temperatura subótima.
Um cultura de semente da cepa hospedeira B153 foi estabelecida adicionando-se uma alíquota de estoque da cepa a um frasco de 250 ml contendo 50 ml de meio M9-MOPS e antibióticos como detalhado na Tabela 1 e cultivando a cultura a 37°C em agitador rotativo a 250 rpm a uma OD600 de 3,5 a 4,5.
Biorreatores de 2 L (Biocontroller ADI 1010 com Bioconsole ADI 1025, Applikon Biotechnology, Foster City, CA) foram ajustados e conduzidos no mesmo modo como descrito no Exemplo 12 para a corrida 060403-3, exceto que a cepa e o tempo de indução foram variados.
A produção de amorfa-4,11-dieno nas células hospedeiras foi induzida adicionando-se 1 ml de IPTG 1 M ao meio de cultura. Amorfa-4,11- dieno foi capturado e extraído de acordo com dois protocolos diferentes. Em um método, o amorfa-4,11-dieno volátil presente no gás desprendido foi capturado ventilando-se o gás desprendido através de um lavador de gás contendo 200 ml de heptanol. O heptanol foi depois diluído em acetato de etila até que a concentração de amorfa-4,11 -dieno na amostra estivesse entre 0,63 e 20 mg/L. em um outro, amorfa-4,11-dieno foi capturado adicionando- se 200 ml de uma cobertura orgânica ao fermentador no momento da indução.
Amorfa-4,11-dieno foi extraído do meio de cultura combinando-se 25 μl de caldo com 975 μΐ de acetonitrila, agitando a amostra na velocidade máxima em um misturador Fisher Vortex Genie 2® (Scientific Industries, Inc.. Bohemia, NY) por pelo menos 3 minutos, removendo as células da amostra pela centrifugação e diluindo a solução de acetonitrila em acetato de etila até que a concentração de amorfa-4,11-dieno na amostra estivesse entre 0,63 e 20 mg/L. As amostras de acetato de etila foram analisadas pela GC/MS como descrito no Exemplo 10.
Exemplo 14
Este exemplo demonstra a produção de amorfa-4,11-dieno aumentada por uma cepa hospedeira da Escherichia coli cultivada sob condições de fonte de carbono e nitrogênio restritas e na temperatura subótima.
Uma cultura de semente da cepa hospedeira B86 foi estabelecida adicionando-se uma alíquota de estoque da cepa a um frasco de 250 ml contendo 50 ml de meio M9-MOPS e antibióticos como detalhado na Tabela 1. A cultura foi cultivada durante a noite a 37°C em agitador rotativo a 250 rpm, sub-cultivada na manhã seguinte no mesmo meio a uma OD600 de aproximadamente 1 e cultivada mais uma vez a 37°C e 250 rpm a uma OD600 de 3 a 5.
Quatro biorreatores de 2 L (Biocontroller ADI 1010 com Bioconsole ADI 1025, Applikon Biotechnology, Foster City, CA) foram ajustados e conduzidos no mesmo modo como descrito no Exemplo 12 para a corrida 060403-3, exceto que as corridas restritas de nitrogênio não contiveram sulfato de amônio na alimentação.
Uma alimentação de glicose exponencial com um tempo de duplicação de 6 horas foi iniciada automaticamente quando o bolo de glicose inicial (15 g) foi exaurido e o oxigênio dissolvido reforçado. Até um máximo de 30,4 g/h, a razão da alimentação foi calculada de acordo com a seguinte equação:
<formula>formula see original document page 97</formula>
em que 0 é a taxa de crescimento específica e t0 é o tempo no qual o bolo de glicose inicial foi esgotado. Ao atingir a razão máxima, a alimentação de glicose foi reduzida a uma razão de 11,4 g/h e mantida constante nesta razão pelo resto da corrida. Nas corridas de fermentação 060710-4, 060724-5 e 060619-5 (restrito de carbono e nitrogênio), a alimentação de glicose foi ainda reduzida quando a restrição de amônia levou ao acúmulo de glicose no meio.
A fermentação foi realizada na temperatura reduzida de 30°C. O fluxo de ar no biorreator foi ajustado a 1 wm; a agitação inicial foi a 700 rpm; a espuma foi controlada com anti-espumante B (Sigma-Aldich, St. Louis, MO); e a tensão de oxigênio dissolvido foi controlada a 40% usando uma cascata de agitação (700 a 1.200 rpm) e enriquecimento de oxigênio. Na corrida de fermentação 060327-3 (restrita em carbono), o pH foi mantido a 7 usando 20% de NH4OH; nas corridas de fermentação 060710-4, 060724-5 e 060619-5 (restritas em carbono e nitrogênio), o pH foi mantido a 7 inicialmente usando 20% de NH4OH e iniciando em 72 horas usando uma mistura 50/50 de NaOH 2,5 N e NH4OH 10 N, para restringir ainda mais a quantidade de amônia que entra no fermentador.
A produção de amorfa-4,11-dieno nas células hospedeiras foi induzida a uma OD600 de aproximadamente 30 adicionando-se 1 ml de IPTG 1 M ao meio de cultura.
Amorfa-4,11-dieno foi capturado cobrindo-se o meio com 10% (v/v) de uma cobertura orgânica. Amorfa-4,11-dieno foi depois extraído combinando-se 25 μl de caldo com 975 μl de metanol, agitando a amostra na velocidade máxima em um misturador Fisher Vortex Genie 2® (Scientific Industries, Inc.. Bohemia, N.Y.) por pelo menos 15 minutos, removendo as células da amostra pela centrifugação e adicionando 10 μl da solução de metanol a 990 μΐ de acetato de etila contendo 10 μΙ/L de trans-cariofileno.
As amostras foram analisadas pela GC/MS como descrito no Exemplo 10.
Exemplo 15
Este exemplo descreve a produção de amorfa-4,11-dieno por intermédio do caminho de DXP em uma cepa hospedeira de Escherichia coli.
As culturas de sementes das cepas hospedeiras B003, B617, B618 e B619 foram estabelecidas adicionando-se uma alíquota de estoque de cada cepa para separar frascos de 125 ml contendo 25 ml de M9-MOPS e antibióticos como detalhado na Tabela 1 e cultivando-se as culturas durante a noite.
As culturas de sementes foram usadas para inocular em uma OD60O inicial de aproximadamente 0,05, frascos separados de 250 ml contendo 40 ml de meio M9-MOPS, 45 μg/ml de tiamina, micronutrientes, l,00E-5 mol/L de FeS04, 0,1 M de MOPS, 0,5% de extrato de levedura, 20 g/L de D- glicose e antibióticos. As culturas foram incubadas a 30°C em um agitador de incubação umidificado a 250 rpm até que elas atingissem uma OD6oo de 0,2 a 0,3, ponto no qual a produção de amorfa-4,11-dieno nas células hospedeiras foi induzida adicionando-se 40 μΐ de IPTG 1 M ao meio de cultura.
No momento da indução, as culturas foram cobertas com 8 ml de uma cobertura orgânica para capturar o amorfa-4,11-dieno. As amostras foram coletadas em vários pontos de tempo e amorfa-4,11 -dieno foi extraído e analisado pela GC/MS como descrito no Exemplo 10. Experimentos foram realizados usando 2 clones independentes de cada cepa hospedeira e resultados foram calculados em média. O desvio entre as amostras foi descoberto ser menor do que 10%.
Exemplo 16
Este exemplo descreve a produção de 3-metil-but-3-en-l-ol e 3- metil-but-2-en-l-ol em cepa hospedeiras de Escherichia coli.
As culturas de sementes das cepas hospedeiras B286, B287, B288 e B291 foram estabelecidas riscando-se um alíquota de estoque de cada cepa em ágar LB contendo antibióticos como detalhado na Tabela 1. Três colônias independentes foram selecionadas para cada cepa e cada colônia foi inoculada em 7 ml de meio de LB contendo antibióticos. As culturas foram cultivadas durante a noite a 37°C em agitador rotativo a 250 rpm até a última fase exponencial. As culturas foram depois inoculadas a uma OD600 de aproximadamente 0,05, em um frasco de 250 ml contendo 40 ml de M9- MOPS, 2% de glicose, 0,5% de extrato de levedura e antibióticos. As culturas foram cultivadas durante a noite a 37°C em agitador rotativo a 250 rpm até que elas atingissem uma OD600 de aproximadamente 0,2, ponto no qual elas foram induzidas adicionando-se 40 μl de IPTG 1 M. As culturas foram cultivadas por 72 horas a 3 0°C em agitador rotativo a 250 rpm. Uma a duas vezes ao dia, a OD600 de cada cultura foi medida e uma amostra de 700 μl foi removida. Para extrair o 3-metil-but-3-en-l-ol e 3-metil-but-2-en-l-ol do caldo de cultura, 600 μl de acetato de etila foram adicionados a 300 μl de cada amostra removida. A amostra foi depois turbilhonada por 15 minutos e 400 μl da fase de acetato de etila superior foi transferida a um frasco de vidro limpo para análise.
As amostras foram analisadas em um cromatógrafo a gás- espectrômetro de massa (GC/MS) Hewlett-Packard 6890. Uma amostra de 1 μl foi separada no GC usando uma coluna DB-5 (Agilent Technologies, Inc.. Palo Alto, CA) e gás carregador de hélio. O programa de temperatura para a análise foi como segue: 60°C por 3 minutos, aumentando a temperatura a 60°C/minuto até uma temperatura de 300°C e uma contenção a 300°C por 2 minutos. O tempo de condução total foi de 9 minutos. As amostras resolvidas foram analisadas por um detector seletivo de massa Hewlett-Packard modelo 5973. Os espectros de massa anteriores demonstraram que o 3-metil-3-buten- 1-ol e 3-metil-2-buten-1-ol têm um tempo de retenção de 2,067 minutos usando este protocolo de GC. Para focalizar a detecção no 3-metil-but-3-en-l- ol e 3-metil-but-2-en-1-ol, um método de monitoramento de íon seletivo foi utilizado que monitora apenas íons 56 e 68 em 3-metil-but-3-en-1-ol e 3- metil-but-2-en-1-ol.
Exemplo 17
Este exemplo descreve a produção de amorfa-4,11-dieno por uma cepa hospedeira do Saccharomyces eerevisiae.
A geração de cepa hospedeira EPY224 está descrita em Ro et al. (Nature 440: 940-943; 2006) e na Publicação de Patente PCT WO 2007/005604. A cepa hospedeira EPY224 foi curada do plasmídeo de expressão pRS425ADS cultivando-se em meio YPD (Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 ed.. ISBN 0-87969-728-8), plaqueando quanto a colônias únicas em ágar YPD e depois embutindo pedaços de colônias únicas em ágar CSM-Met His e ágar CSM- Met Leu. Os clones que cresceram em ágar CSM-Met His mas não em ágar CSM-Met Leu foram curados (isto é, perderam o plasmídeo pRS425ADS).
Um tal clone foi designado EPY300. EPY300 foi transformado com plasmídeo de expressão pRS425-ADSLEU2d, um plasmídeo idêntico ao pRS425-ADS exceto que ao invés de LEU2 ele conteve um marcador de seleção LEU2d (Erhart e Hollenberg (1983) J. Bacterial. 156: 625-635) produzindo a cepa hospedeira Yl 85.
Os transformantes de célula hospedeira Y185 foram selecionados em meios definidos sintéticos, contendo 2% de glicose e todos os aminoácidos exceto histidina, leucina e metionina (CSM-glicose; MP Biomedicals, Solon, OH). A cepa hospedeira EPY300 é auxotrófica quanto à biossíntese de leucina (leu2), mas o plasmídeo de expressão pRS425-ADS- LEU2d em Yl 85 restaura a prototrofia de leucina (LEU2). Colônias únicas foram embutidas em meio seletivo (CSM-glicose-histidina, leucina, metionina) e cultivadas por 2 dias. As células foram raspadas da placa e transferidas para 1 ml de glicerol a 25% (v/v) em um criotubo. A suspensão foi misturada e depois armazenada a -80°C.
Frascos de semente da cepa hospedeira Yl 85 foram estabelecidas adicionando-se uma alíquota de estoque da cepa a um frasco de 125 ml contendo 25 ml de CSM-glicose que carece de leucina e metionina e cultivando-se as culturas durante a noite. As culturas foram usadas para inocular em uma OD600 inicial de aproximadamente 0,05 um frasco de 250 ml com defletor contendo 40 ml de meios definidos sintéticos que carecem de leucina e contendo 0,2% de glicose, 1,8% de galactose e 1 mM de metionina. A cultura foi incubada a 3O°C em agitador rotativo a 200 rpm. Porque a presença de glicose no meio impede a indução do promotor GALl pela galactose, a produção de amorfa-4,11-dieno não foi induzida até que as células tivessem usado a glicose no meio e tivesse mudado para o uso da galactose como a sua fonte de carbono principal. No momento da inoculação, as culturas foram cobertas com 8 ml de uma cobertura orgânica para capturar o amorfa-4,11-dieno. As amostras foram coletadas em 72 horas pela transferência dos 5 μl da camada de solvente orgânico para um frasco de vidro limpo contendo 500 μl de acetato de etila contendo uma concentração conhecida de beta- ou trans-cariofileno como um padrão interno.
As amostras de cobertura orgânica/acetato de etila foram analisadas em um cromatógrafo a gás/ espectrômetro de massa (GC/MS) Hewlett-Packard 6890 como descrito no Exemplo 10. Depois de 72 horas de cultivo, 3 culturas de levedura foram descobertas produzir 60,68, 54,48 e 59,25 mg/L de amorfa-4,11-dieno.
Exemplo 19
Este exemplo descreve a produção de amorfa-4,11-dieno em uma cepa hospedeira de Saccharomyces cerevisiae onde a cepa hospedeira inclui um caminho de mevalonato nativo assim como um caminho de mevalonato heterólogo que está sob o controle de um controle regulatório heterólogo.
As cepas de levedura CEN.PK2-1C (Y002) (MATA; ura3-52; trpl-289; leu2-3.112; his3.Al; MAL2-8C; SUC2) e CEN.PK2-1D (Y003) (MATalfa; ura3-52; trpl-289; leu2-3.112; his3Al; MAL2-8C; SUC2) (J. P. van Dijken et al.. Enzyme Microb Technol 26, 706 (1 de junho de 2000) foram cultivadas em meio rico padrão (YPD) ou em meio sintético definido (D. Rose, F. Winston, P. Heiter, Methods in yeast genetics: a laboratório course manual. (Cold Spring Harbor Laboratório Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1990) que carecem de nutrientes apropriados permitindo a seleção de transformantes integrativos, retenção de plasmídeo e progênie meiótica.
As transformações mediadas pelo DNA em S. cerevisiae foram conduzidas usando o procedimento do acetato de lítio como descrito por R. H. Schiestl, R. D. Gietz, Curr Genet 16, 339 (Dez, 1989). Todos os rompimentos e substituições de gene foram confirmados pela análise fenotípica, reação da cadeia de polimerase de colônia ("PCR") e seqüenciamento de genômico DNA amplificado. Os plasmídeos pAM489-pAM498 foram construídos usando o pCR 2.1 (Invitrogen, Carlsbad CA) e são esquematicamente descritos pela Figura 7A-C e Tabela 6. As seqüências marcadores de HISMX são descritas em M. S. Longtine et al.. Yeast 14, 953 (Julho, 1998). A propagação de DNA plasmídico foi realizada na cepa DH5a da Eseherichia co li. Tabela 6
<table>table see original document page 103</column></row><table>
As cepas Y002 e Y003 de S. cerevisiae foram preparadas para a introdução de genes do caminho de mevalonato indutíveis pelo seguinte. O promotor ERG9 foi substituído com o promotor MET3 de S. cerevisiae pela amplificação pela PCR da região KanMX-PMET3 de pAM328 (SEQ ID NO: 43) usando iniciadores 50-56-pwl00-G (SEQ ID NO: 44) e 50-56-pwl01-G (SEQ ID NO: 45) contendo 45 pares de base de homologia ao promotor nativo ERG9. 10 μΐ do produto de PCR resultante foram transformados nas cepas Y002 e Y003 exponencialmente crescentes usando 40% p/p de polietileno glicol 3350 (Sigma-Aldrich St Louis, MO), 100 mM de acetato de lítio (Sigma), 10 μg de DNA de esperma de salmão (Invitrogen) e incubação a 30°C por 30 minutos seguido por um choque térmico de 42°C por 30 minutos (como descrito por Schiestl & Gietz, Curr. Genet. 16: 339 (1989)). Recombinantes positivos foram identificados pela sua capacidade para crescer em meio rico contendo 0,5 μg/ml de Geneticin (Invitrogen Co, Carlsbad, CA) e confirmados pela PCR de diagnóstico. Aos clones resultantes foram dados a designação Y93 (ΜΑΤ A) e Y94 (ΜΑΤ alfa). Em seguida, a matriz de leitura aberta ADEJ foi substituída com o gene LEU2 de Candida glabrata (CgLEU2). O local genômico de CgLEU2 de 3,5KB foi amplificado a partir do DNA genômico de C. glabrata (ATCC, Manassas, YA) usando iniciadores 61-67-CPK066-G (SEQ ID NO: 46) e 61-67-CPK067-G (SEQ ID NO: 47) contendo 50 pares de base de homologia flanqueadora à matriz de leitura aberta ADEl (ORF). 10 μg do produto de PCR resultante foram transformados em Y93 e Y94 que crescem exponencialmente como descrito acima. As cepas adel foram selecionadas quanto ao crescimento na ausência de suplementação com leucina e confirmadas pela PCR de diagnóstico. Aos clones resultantes foram dados a designação Y176 (ΜΑΤ A) e Y177 (ΜΑΤ alfa).
Para gerar a cepa Yl 88 de S. cerevisiae, 2 μg de DNA plasmídico de pAM491 (SEQ ID NO: 48) e pAM495 (SEQ ID NO: 49), respectivamente, foram digeridos durante a noite com PmeI (New England Biolabs, Beverly, MA) e introduzidos em Y176 que cresce exponencialmente como descrito acima. Os recombinantes positivos foram selecionados quanto ao crescimento em meio carecendo de uracila e histidina. A integração no local genômico correto foi confirmada pela PCR de diagnóstico.
Para gerar a cepa Yl 89 de S. cerevisiae, 2 μg de DNA plasmídico de pAM489 (SEQ ID NO: 50) e pAM497 (SEQ ID NO: 51), respectivamente, foram digeridos durante a noite com PmeI e introduzidos em Y 177 que cresce exponencialmente como descrito acima. Os recombinantes positivos foram selecionados quanto ao crescimento em meio que carece de triptofano e histidina. A integração no local genômico correto foi confirmada pela PCR de diagnóstico.
Aproximadamente 1 X IO7 células de Yl88 e Yl89 foram misturadas em uma placa de meio YPD por 6 horas na temperatura ambiente para permitir o acasalamento. A cultura de célula misturada foi depois plaqueada em meio carecendo de histidina, uracila e triptofano para selecionar quanto ao crescimento de células diplóides. 2 μg de DNA plasmídico de pAM493 (SEQ ID NO: 52) foram digeridos durante a noite com PmeI e introduzidos em células diplóides que crescem exponencialmente como descrito acima. Recombinantes positivos foram selecionados quanto ao crescimento em meio que carece de adenina. A integração no local genômico correto foi confirmado pela PCR de diagnóstico. À cepa resultante foi dada a designação Y238.
Para gerar cepas haplóides contendo o complemento completo de genes introduzidos, Y238 foi esporulado em acetato de potássio a 2% e 0,02% de meio líquido de rafínose. Aproximadamente 200 tétrades genéticas (tétrades são produtos meióticos quadri-germinados) foram isolados usando um micromanipulador série MSM300 da Singer Instruments (Singer Instrument Co, LTD. Somerset, UK). Isolados genéticos independentes contendo o complemento apropriado de material genético introduzido foram identificados pela sua capacidade de crescer na ausência de adenina, histidina, uracila e triptofano. A integração de todo o DNA introduzido foi confirmada pela PCR de diagnóstico. Às cepas resultantes foram dadas a designação Y210 (ΜΑΤ A) e Y211 (ΜΑΤ alfa).
2 μg de DNA plasmídico de pAM426 (SEQ ID NO: 53), contendo Amorfadeína Sintase (ADS) otimizada no códon da S. cerevisiae expressada a partir do promotor GALl da S. cerevisiae, foi introduzido em Y210 e Y211 que cresce exponencialmente como descrito acima. As cepas de S. cerevisiae que contiveram o plasmídeo pAM426 foram selecionados quanto a sua capacidade para crescer na ausência de suplementação de leucina. As cepas resultantes foram dadas a designação Y225 (ΜΑΤ A) e Y227 (ΜΑΤ alfa).
2 μg de DNA plasmídico de pAM322 (SEQ ID NO: 54), contendo Amorfadeína Sintase S. cerevisiae otimizada no códon (ADS) e citocromo P450 monooxigenase (AMO) expressada a partir da GALl de S. cerevisiae e a citocromo P450 oxidorredutase (CPR) expressada a partir do promotor GAL10 da S. cerevisiae, foi introduzido em Y210 e Y211 que crescem exponencialmente como descrito acima. As cepas de S. cerevisiae que contiveram o plasmídeo pAM322 foram selecionadas quanto a sua capacidade para crescer na ausência de suplementação de leucina. Às cepas resultantes foram dadas a designação Y222 (ΜΑΤ A) e Y224 (ΜΑΤ alfa). Exemplo 19
Este exemplo descreve a produção de α-farneseno ou β- farneseno em cepas hospedeiras de Escherichia coli.
As culturas de sementes de cepas hospedeiras B552 e B592 foram estabelecidas adicionando-se uma alíquota de estoque de cada cepa a um frasco de 125 ml contendo 25 ml de M9-MOPS, 0,8% de glicose, 0,5% de extrato de levedura e antibióticos como detalhado na Tabela 1 e cultivando-se as culturas durante a noite.
As culturas de sementes foram usadas para inocular em uma OD60O inicial de aproximadamente 0,05, frascos de 250 ml contendo 40 ml de M9-MOPS, 2% de glicose, 0,5% de extrato de levedura, e antibióticos. As culturas foram incubadas a 3 0°C em agitador rotativo a 250 rpm até que elas atingissem uma OD600 de aproximadamente 0,2, ponto no qual a produção de α-farneseno ou β-farneseno nas células hospedeiras foi induzida adicionando- se 40 μl de IPTG 1 M. No momento da indução, as culturas foram cobertas com 8 ml de uma cobertura orgânica para capturar o α-farneseno. As amostras foram coletadas a cada 24 horas até 120 horas (total de 5 pontos de tempo) pela transferência de 2 μl a 10 μl da camada de cobertura orgânica a um frasco de vidro limpo contendo 1 ml de acetato de etila reforçado com trans-cariofileno como um padrão interno. Além disso, alíquotas de 1 ml das culturas foram giradas, as pelotas de célula foram recolocadas em suspensão em 250 μl de água estéril e as suspensões de célula foram transferidas para um frasco de vidro contendo 1 ml de acetato de etila reforçados com trans- cariofileno como um padrão interno. Além disso, alíquotas de 0,5 ml do caldo de cultura integral foram adicionadas a frascos de vidro contendo 1 ml de acetato de etila reforçados com trans-cariofileno como um padrão interno. As amostras de caldo de cultura integral foram extraídas no acetato de etila turbilhonando-se os frascos de vidro por 10 minutos, depois do que 600 μΐ da extração em acetato de etila foram transferidos para um frasco de vidro limpo. As amostras de cobertura orgânica/acetato de etila e as amostras de caldo de cultura integral extraídas com acetato de etila foram analisadas em um cromatógrafo a gás Agilent 6890N equipado com um espectrômetro de massa Agilent 5975 (GC/MS) no modo de varredura completa (50 a 500 m/z). Para acelerar os tempos de condução, o programa de temperatura e a matriz da coluna foram modificados para se obter resolução de pico ótima e o tempo de condução global mais curto. Uma amostra de 1 μl foi separada usando uma coluna HP-5MS (Agilent Technologies, Inc.. Palo Alto, CA) e gás carregador de hélio. O programa de temperatura para a análise foi como segue: 15O°C de contenção por 3 minutos, aumentando a temperatura em 250CVminuto até uma temperatura de 200°C, aumentando a temperatura em 60°C/minuto até uma temperatura de 3 00°C e uma contenção a 300°C por 1 minuto. Os espectros de massa anteriores demonstraram que o produto da β-farneseno sintase foi o β-farneseno e que o β-farneseno teve um tempo de retenção de 4,33 minutos usando este protocolo GC. Os títulos de farneseno foram calculados comparando-se as áreas de pico geradas contra uma curva de calibração quantitativa de β-farneseno purificado (Sigma- Aldrich Chemical Company, St. Louis, MO) em acetato de etila reforçado com trans-cariofileno.
A cepa hospedeira B592 produziu aproximadamente 400 mg/L de α-farneseno em 120 horas (calculado em média de 3 clones independentes) e teve uma produtividade específica máxima de aproximadamente 46 mg/L/OD600. A cepa hospedeira B552 produziu aproximadamente 1,1 g/L de β-farneseno em 120 horas (calculado em média de 3 clones independentes) e teve uma produtividade específica máxima de aproximadamente 96 mg/L/OD600 (1 clone representativo).
Exemplo 20
Este exemplo descreve a produção de β-farneseno por intermédio do caminho de DXP em uma cepa hospedeira de Escherichia coli. As culturas de sementes das cepas hospedeiras B650, B651, B652 e B653 foram estabelecidas adicionando-se uma alíquota de estoque de cada cepa a frascos de 125 ml separados contendo 25 ml de M9-MOPS e antibióticos como detalhado na Tabela 1 e cultivando-se as culturas durante a noite.
As culturas de sementes foram usadas para inocular em uma OD600 inicial de aproximadamente 0,05 frascos de 250 ml separados contendo 40 ml de meio mínimo M9-MOPS, 45 μg/ml de tiamina, micronutrientes, l,00E-5 mol/L de FeSO4, 0,1 M de MOPS, 0,5% de extrato de levedura, 20 g/L de D-glicose e antibióticos. As culturas foram incubadas a 30°C em um agitador de incubação umidificado a 250 rpm até que elas atingissem uma OD600 de 0,2 a 0,3, ponto no qual a produção de β-farneseno nas células hospedeiras foi induzida adicionando-se 40 μl de IPTG 1 M ao meio de cultura. No momento da indução, as culturas foram cobertas com 8 ml de uma cobertura orgânica para capturar o β-farneseno. As amostras foram coletadas em vários pontos de tempo pela transferência dos 100 μl de amostras da camada de cobertura orgânica superior a um tubo limpo. O tubo foi centrifugado para separar quaisquer células ou meios remanescentes e 10 μl das amostras de cobertura orgânica foram transferidas em 500 μΐ de acetato de etila reforçados com beta- ou trans-cariofileno como um padrão interno em frascos de GC de vidro limpo. As misturas foram turbilhonadas por 30 segundos e depois analisadas como descrito no Exemplo 18. A cepa hospedeira B653 de Escherichia coli produziu aproximadamente 7 mg/g de DCW β-farneseno.
Exemplo 21
Este exemplo descreve a produção de α-farneseno ou β- farneseno em uma cepa hospedeira de Saceharomyces eerevisiae.
A cepa EPY300 foi gerada remo vendo-se o plasmídeo de expressão da cepa EPY224 de Saccharomyees eerevisiae (Ro et al. (2006) Nature 440: 940-943; Publicação de Patente PCT WO 2007/005604) cultivando-se em meio rico. A cepa EPY300 foi depois transformada com plasmídeos de expressão pRS425-FSA ou pR425-FSB, produzindo cepas hospedeiras Y166.e Y164, respectivamente.
Os transformantes de célula hospedeira foram selecionados em meios definidos sintéticos, contendo 2% de glicose e todos os aminoácidos exceto leucina (SM-glu). A cepa hospedeira EPY300 foi auxotrófíca quanto a biossíntese de leucina (leu2), mas os plasmídeos de expressão pRS425-FSA ou pRS425-FSB restauram a prototrofia de leucina (LEU2). As colônias únicas foram transferidas para frascos de cultura contendo 5 ml de SM-glu líquido que carece de leucina. As culturas foram incubadas agitando-se a 30°C até que o cultivo atinja a fase estacionária. As células foram armazenadas a -80°C em crio-frascos em alíquotas congeladas de 1 ml fabricadas de 400 μl de 50% de glicerol e 600 μl de cultura líquida.
As culturas de sementes foram estabelecidas adicionando-se uma alíquota de estoque a um frasco de 125 ml contendo 25 ml de SM-glu que carece de leucina e cultivando as culturas durante a noite. As culturas de sementes foram usadas para inocular em uma OD600 inicial de aproximadamente 0,05 frascos de 250 ml com defletor contendo 40 ml de meio definido sintético que carece de leucina, 0,2% de glicose e 1,8% de galactose. As culturas foram incubadas a 30°C em agitador rotativo a 200 rpm. Porque a presença de glicose no meio impede a indução do promotor GalI pela galactose, a produção de farneseno não foi induzida até que as células usassem a glicose no meio e trocassem para o uso da galactose como a sua fonte principal de carbono. As culturas são cobertas com 8 ml de oleato de metila ou miristato de isopropila. As amostras foram coletadas uma vez a cada 24 horas pela transferência de 2 a 10 μl da camada de solvente orgânico a um frasco de vidro limpo contendo 500 μl de acetato de etila contendo uma concentração conhecida de beta- ou trans-cariofileno como um padrão interno. Além disso, alíquotas de 0,5 ml do caldo de cultura integral foram adicionadas a frascos de vidro contendo 1 ml de acetato de etila reforçado com trans-cariofileno como um padrão interno. As amostras de caldo de cultura integral foram extraídas no acetato de etila turbilhonando-se os frascos de vidro por 10 minutos, depois que 600 μl da extração com acetato de etila foram transferidos para um frasco de vidro limpo.
A cepa hospedeira Yl66 produziu aproximadamente 9,8 mg/L de α-farneseno em 120 horas (calculado em média de 3 clones independentes) e teve uma produtividade específica máxima de aproximadamente 3 mg/L/OD6oo (1 clone representativo). A cepa hospedeira Y164 produziu aproximadamente 56 mg/L de β-farneseno em 120 horas (calculado em média de 3 clones independentes) e teve uma produtividade específica máxima de aproximadamente 20 mg/L/OD600 (1 clone representativo).
Exemplo 22
Este exemplo descreve a produção de γ-terpineno, α-pineno e terpinoleno em cepas hospedeiras de Escherichia coli.
As culturas de sementes das cepas hospedeiras para a produção de γ-terpineno (DHl-Tlr[pMevT, pMevB-Gpps, pAM445] de E. coli), a- pineno (DHl-Tlr[pMevT, pMevB-Gpps, pAM443 ou pAM442] de E. coli) ou terpinoleno (DHl-Tlr[pMevT, pMevB-Gpps, pAM444] de E. coli) foram estabelecidas adicionando-se uma alíquota de estoque de cada cepa a frascos de 125 ml separados contendo 25 ml de M9-MOPS, 2% de glicose, 0,5% de extrato de levedura e antibióticos como detalhado na Tabela 1 e cultivando-se as culturas durante a noite até a fase exponencial tardia.
As culturas de sementes foram usadas para inocular em uma OD60O inicial de aproximadamente 0,05, frascos de 250 ml contendo 40 ml de M9-MOPS, 2% de glicose, 0,5% de extrato de levedura e antibióticos. No momento da inoculação, as culturas também foram cobertas com 4 ml de hexadecano. As culturas foram incubadas a 30°C em agitador rotativo de 200 a 250 rpm até que elas atingissem uma OD600 de aproximadamente 0,2, ponto no qual a produção do composto de interesse nas células hospedeiras foi induzida adicionando-se 40 μl de IPTG 1 M. As amostras foram coletadas uma vez ao dia por 96 horas pela transferência dos 200 μl da camada de hexadecano a um tubo de microcentrífuga de 0,6 ml. Para a análise, a camada de hexadecano foi diluída 1:1 ou 1:10 com acetato de etila reforçado com trans-cariofileno como um padrão interno em um frasco de GC de 1,8 ml.
Além disso, alíquotas de 1 ml das culturas foram giradas, as pelotas de célula foram recolocadas em suspensão em 250 μl de água estéril e as suspensões de célula foram transferidas a um frasco de vidro contendo 1 ml de acetato de etila reforçado com trans-cariofileno como um padrão interno. As pelotas de célula foram extraídas no acetato de etila turbilhonando-se os frasco de vidros por 15 minutos, depois que 500 μΐ da extração de acetato de etila foram transferidos para um frasco de vidro limpo.
As amostras de hexadecano/acetato de etila e as amostras de pelota de célula extraídas com acetato de etila foram analisadas em um cromatógrafo a gás Agilent 6890N equipado com um espectrômetro de massa Agilent 5975 (GC/MS) no modo de varredura completo (50 a 500 m/z). Para acelerar os tempos de condução, o programa de temperatura e matriz de coluna foram modificados para se obter a resolução de pico ótima e o tempo de condução global mais curto. Uma amostra de 1 μΐ foi dividida (uma razão de divisão entre 1:2 e 1:50 foi selecionada com base na concentração de amostra) e depois separada usando uma coluna HP-5MS (Agilent Technologies, Inc.. Palo Alto, CA) e gás carregador de hélio. O programa de temperatura para a análise foi como segue: 750C mantido por 3 minutos, aumentando a temperatura a 20°C/minuto até uma temperatura de 115°C, aumentando a temperatura a 60°C/minuto até uma temperatura de 300°C e uma contenção a 300°C por 0,5 minuto. Os vários produtos, γ-terpineno, a- pineno e terpinoleno foram observados em 5,4, 4,1, 5,4 e 5,9 minutos, respectivamente. Os títulos foram calculados comparando-se as áreas de pico geradas contra uma curva de calibração quantitativa de padrões purificados em acetato de etila reforçado com trans-cariofileno.
Exemplo 23
Este exemplo descreve a produção de linalool, limoneno, β- pineno, β-felandreno, careno ou sabinino em cepas hospedeiras de Escherichia coli.
As culturas de sementes são estabelecidas adicionando-se uma alíquota de estoque de cada cepa a frascos de 125 ml separados contendo 25 ml de M9-MOPS, 0,5% de extrato de levedura, 2% de glicose e antibióticos como detalhado na Tabela 1 e cultivando-se as culturas durante a noite.
As culturas de sementes são usadas para inocular em uma OD60O inicial de aproximadamente 0,05, frascos de 250 ml com defletores contendo 40 ml de M9-MOPS, 0,5% de extrato de levedura, 2% de glicose e antibióticos. As culturas são incubadas a 30°C em agitador rotativo a 250 rpm até que elas atingissem uma OD600 de aproximadamente 0,2, ponto no qual a produção do composto de interesse nas células hospedeiras é induzida adicionando-se 40 μl de IPTG 1 M ao meio de cultura. O composto de interesse é separado do meio de cultura através da extração de solvente- solvente ou pela sedimentação e decantação se o título do composto de interesse for grande o bastante para saturar o meio e para formar uma segunda fase. LISTAGEM DE SEOÍJÊNCIAS
SEQ ID NO: 1
Operon MevT66
gaattcaaaggagg aaaataaaatgaagaactgtgtgattgtttctgcggtccg cacggcgatcggcagctttaacggctctttagcgagcacctctgcaatcgatctg
ggtgcgacggtcattaaggccgccattgaacgcgccaaaatcgacagccagcao
gttgatgaggtgatcatgggcaatgtgttacaagccggcctgggtcaaaaccca
gcgcgtcaagcactgttaaaatctggtctggccgagaccgtgtgtggcttcaccg
tcaataaggtttgcggctctggcctgaagagcgtggccctggcagcacaagcga
ttcaagccggtcaggcacaaagcatcgttgcgggtggcatggagaacatgtctc
tggcgccgtacttattagatgccaaagcccgcagcggttatcgcctgggcgatgg
tcaggtotacgacgtcatcttacgcgatggcttaatgtgcgcgacccacggttac
cacatgggtattacggccgaaaacgtggcgaaagaatacggcattacgcgcgag
atgcach3atgaattagcactgcactctcagcgcaaagcagcagccgcgatcgag
tctggtgcgtttacggcggaaatcgtgccagttaacgtggtcacocgcaagaag
acgttcgttttcagccaggacgagttcccgaaggcaaacagcaccgcggaggcc
ttaggtgccttacgcccagcctttgacaaagcgggcacggtcaccgccggtaatg
cgaocggcatcaatgatggtgcagcggcactggtcatcatggaagagagcgccg
cattagcagcgggtctgaccccattagcgcgcattaaatcttatgccagcggcgg
cgtcc^accagccctgatgggcatgggtccggtcccagccacck^aaaaagccct
gcaattagcgggcctgcaactggccgacattgatctgatcgaggcgaacgaggc
gtttgcagcgcagttcctggcggtgggtaagaatctgggcttcgacagcgagaa
agtcaatgtgaacggtggcgcgattgcgttaggccatccgattggtgcaagcgg
cgcacgcatcttagtgacgttactgcacgccatgcaggcacgcgacaagacctta
ggcctggcgaccttatgtattggtggcggtcaaggtatcgccatggtgatcgaac
gcctgaactgaagatctaggaggaaagcaaaatgaaactgagcaccaagctgtg
ctggtgtggcatcaagggtcgcctgcgcccacaaaagcagcaacagctgcacaa
cacgaacctgcaaatgaccgagctgaaaaagcagaagacggccgagcaaaaga
cccgcccgcagaacgttggcatcaagggcatccagatttatatcccgacgcagtg
tgtcaaccaatctgagctggagaaattcgatggcgtcagccagggtaagtacac
catcogcctgggccagaccaacatgagcttcgtgaacgaccgtgaggacatcta
ttctatgagcctgacggtgctgtctaagctgatcaagagctacaacatcoacacg aataagatcggtcgtctogaggtgootacggagacgctoattgacaagacicaaa
agcgtgaagtctgtcttaatgcagctgttcggcgagaacacggatgtcgagggt
atcgacaccctgaacgcgtgttacggcggcaccaacgcactgttcaatagcctga
actggattgagagcaacgcctgggatggccgcoatgcgatcgtcgtgtgcggcg
atatcgccatctatgacaagggtgcggcacgtccgaccggcggtgcaggcaccg
ttgcgatgtggattggcccggacgcaccaattgtcttcgattctgtccgcgcgtc
ttacatggagcacgcctacgacttttacaagccggacttcacgagcgaatacccg
tacgtggacggccacttctctctgacctgctatgtgaaggcgctggaccaggttt
ataagtcttatagcaaaaaggcgatttctaagggcctggtcagcgacccggcag
gcagcgacgccctgaacgtgctgaagtatttcgactacaacgtgttccatgtccc
gacctgcaaattagtgaccaaatcttatggccgcctgttatataatgatttccgt
gccaacccgcagctgttcccggaggttgacgccgagctggcgacgcgtgattac
gacgaoagcctgaccgacaagaacatcgagaagaccttcgtcaacgtcgcgaag
ccgttccacaaagagcgtgtggcccaaagcctgatcgtcccgaccaacacgggc
aacatgtataccgcgtctgtctacgcggcattcgcgagcctgctgaattacgtcg
gttctgacgacctgcagggcaagcgcgttggcctgttcagctacggtagcggctt
agcggçcagcctgtatagctgcaaaattgtcggcgacgtccagcacatcatcaa
ggagctggacatcaccaacaagctggcgaagcgcatcaccgagacgccgaaag
attacgaggcagcgatcgagttacgcgagaatgcgcatctgaagaagaacttca
agccgcaaggtagcatcgagcacctgcagagcggcgtctactacctgacgaaca
ttgacgacaagttccgccgttcttatgacgtcaaaaagtaactagtaggaggaa
aacatcatggtgctgacgaacaaaaccgtcattagcggcagcaaggtgaagtct
ctgagcagcgcccaaagctctagcagcggcccgtctagcagcagcgaggaggac
gacagccgtgacattgagtctctggacaagaagatccgcccgctggaggagtta
gaggccctgctgagcagcggcaacaccaagcagctgaagaacaagg aagttgc
agcgctggtgatccacggtaagctgccactgtatgcgctggaaaagaaactggg
cgatacoacocgtgcggtcgcggtgcgtcgcaaagccttaagcatcttagcgga
ggccccggtgttagccagcgaccgcctgccgtacaagaactacgactacgaccg
cgtgtttggcgcgtgctgcgagaatgtcattggctacatgccgttaccggttggt
gtgatcggcccgctggtcattgatggcacgagctatcacattccaatggcgacca
cggaaggttgcttagtcgccagcgccatgcgtggctgtaaggcgattaacgccg
gcggtggcgcgacgaccgtgttaaccaaggatggtatgacgcgcggtccggtcg
tccgcttcccaacgctgaagcgcagcggcgcgtgtaagatttggctggattctga
ggagggccaaaacgcgatcaagaaagccttcaactctacgagccgtttcgcgcg tttacagcatatccagacctocctggccggcgacctgctgttcatgcgcticcgc
accaccacgggcgatgcgatgggcatgaacatgatcagcaagggcgtcgaatat
agcctgaaacaaatggtggaagaatatggctgggaggacatggaggttgtctct
gtgagcggcaactattgcaccgacaagaagccggcagccattaactggattgag
ggtcgcggcaaaagcgtcgtggcagaagcgaccatcccaggcgacgtggtccgt
aaggttctgaagagcgacgtcagcgccctggttgagttaaatatcgcgaaaaac
ctggtcggcagcgcgatggcgggcagcgtgggtggctitaacgcacatgcagcg
aatctggttacggcggttttct^agccttaggtcaggacccagcccaaaatgtcg
agagcagcaactgcattaccttaatgaaagaggttgacggtgacctgcgcatca
gcgttfctatgccgtctatcgaggtcggcacgatcggcggcggcaccgttttaga
accgcaaggtgcgatgctggatctgctgggcgtgcgcggcccacatgcaacggc
cccaggcaccaatgcccgccaactggcccgtatcgtggcctgcgcggttctggcg
ggtgagctgagcctgtgcgccgcattagccgcgggccatttagttcaatctcaca
tgacccacaaccgcaagccggcagaaccaaccaagccaaataacctggacgcaa
ccgacattaaccgtctgaaggatggcagcgtcacgtgcattaaaagctgagcat
GCTACTAAGCTT SEQ ID NO: 2
Iniciador 4-49 mvaA SpeI
s'-gctactagtaggaggaaaacatcatgcaaagtttagataagaatttccg-34
SEQ ID NO: 3
Iniciador 4-49 mvaAR XbaI
5' -GCTTCTAGACTATTGTTGTCT AATTTCTTGT AAAATGCG-3' SEQ ID NO: 4
Iniciador HMGS 5' Sa mvaS-S 5*-
gaactgaagatctaggagg aaagc aaaatgacaataggtatcgacaaaataaa ct-3'
SEQ ID NO: 5
Inieiador HMGS 3' Sa mvaS-AS
5'-ttgcatgatgttttcctcctactagttactctggtctgtgatattcgcgaac-3'
SEQ ID NO: 6
Inieiador 19-25 atoB SfiI-S
Si-GcTAGGccATCCTGGCCATGAAGAACTGTGTGATTGTTTCTG-S'
SEQ ID NO: 7
Inieiador 19-25 mva.A-AsiSI-AS 5' -GCTTGCGATCGCCGGCGG ATTTGTCCTACTC AG-3' SEQ ID NO: 8 Iniciador 9-70C
5' -CC ACCTCG AG ATGTC ATT ACCGTTCTTAACTTCTG-3' SEQ ID NO: 9 Iniciador 26-39B
5' -TGGTGGAGCTCTT ATTTAAGCTGGGT AAATGC AGAT AATCG-3' SEQ ID NO: 10 Iniciador 26-39A
5' -TTCTTGAGCTCTTATTCCTTTGGT AGACC AGTCTTTGCG-3' SEQ ID NO: 11
Inieiadores 4-40 mvaEF BamHI
5' -tatggatcctaaggaggatatttagatgaaaacaotagrrattattgatgc - 3*
SEQ ID NO: 12
Inieiador 4-40 mvaER HindIII
5' - AGCT AAGCTTTT ATTGTTTTCTT AAATC ATTTAAA ATAGC-3' SEQ ID NO: 13 Inieiador 4-40 mvaSF B gill
s' -tatagatcttaaggaggatatttagatgacaattgggattgataaaattag - 3*
SEQ ID NO: 14
Iniciador 4-39 mvaSR BamHI
5' -TTTGG ATCCTT AGTTTCG AT AAG AGCGAACGG-3' SEQ ID NO: 15
Inieiador 67-IA-C para a amplifieação pela PCR da seqüência codificadora do gene dxs
5'- ACA CTC GAG GAG GAA TAA ATG AGT TTT GAT ATT GCC AAA TAC CCG -3' SEQ ID NO: 16
Inieiador 67-IB-C para a amplifieação pela PCR da seqüência codificadora do gene dxs
5'-TGA TGG TAC CTT ATG CCA GCC AGG CCT TGA TTT TGG C-3' SEQ ID NO: 17
Iniciador 67-IC-C para a amplificação pela PCR da seqüência codificadora do gene dxr
5'- ACT AGG TAC CAG GAG GAA TAA ATG AAG CAA CTC ACC ATT CTG GGC -3'
SEQ ID NO: 18
Iniciador 67-ID-C para a amplificação pela PCR da seqüência codificadora do gene dxr
5'- AAT TGA TGG GCC CTC AGC TTG CGA GAC GCA TCA CCT C -3' SEQ ID NO: 19
Iniciador 67-IE-C para a amplifícação pela PCR da seqüência codificadora do gene ispD
5'- CAT AAA GGG CCC AGG AGG AAT AAA TGG CAA CCA CTC ATT TGG ATG -3'
SEQ ID NO: 20
Iniciador 67-IF-C para a amplifícação pela PCR da seqüência codificadora do gene ispD
5'- TAT TGT TCA TAT GT'T ATG TAT TCT CCT GAT GGA TGG TTC G-3'
SEQ ID NO: 21
Iniciador 67-IG-C para a amplifícação pela PCR da seqüência codificadora do gene ispE
5'- AAC TAA CAC ATA TGA GGA GGA ATA AAT GCG GAC ACA GTG GCC CTC -3'
SEQ ID NO: 22
Iniciador 67-IH-C para a amplifícação pela PCR da seqüência codificadora do gene ispE
5'- TGT TAG TTA CGC GTT TAA AGC ATG GCT CTG TGC AAT GG - 3'
SEQ ID NO: 23
Iniciador 67-2A-C para a amplificação pela PCR da seqüência codificadora do gene ispF
5'- ACG GGA TCC AGG AGG AAT AAA TGC GAA TTG GAC ACG GTT TTG ACG -3' SEQ ID NO: 24
Iniciador 67-2B-C para a amplificação pela PCR da seqüência codificadora do gene ispF
5'- TTT AGT TGG GCC CTC ATT TTG TTG CCT TAA TGA GTA GCG CC-3'
SEQ ID NO: 25
Iniciador 67-2C-C para a amplificação pela PCR da seqüência codificadora do gene ispG
5'- TAC TAA GGG CCC AGG AGG AAA TAA TGC ATA ACC AGG CTC CAA TTC AAC G -3' SEQ ID NO: 26
Iniciador 67-2D-C para a amplificação pela PCR da seqüência codificadora do gene ispG
5'- TCC GGG TAC CTT ATT TTT CAA CCT GCT GAA CGT CAA TTC G-3'
SEQ ID NO: 27
Iniciador 67-2E-C para a amplificação pela PCR da seqüência codificadora do gene ispH
5'- AAC AGG TAC CAG GAG GAA ATA ATG CAG ATC CTG TTG GCC AAC C-3' SEQ ID NO: 28
Iniciador 67-2F-C para a amplificação pela PCR da seqüência codificadora do gene ispH
5'- TGG ATG AAG TCG ACT TAA TCG ACT TCA CGA ATA TCG ACA CGC AGC -3'
SEQ ID NO: 29
Iniciador 67-2G-C para a amplificação pela PCR da seqüência codificadora do gene idi
5'- CAT CAA GTC GAC AGG AGG AAA TAA TGC AAA CGG AAC ACG TCA TTT TAT TG -3'
SEQ ID NO: 30
Iniciador 67-2H-C para a amplificação pela PCR da seqüência codificadora do gene idi
5'- TAA TGC AAG CTT ATT TAA GCT GGG TAA ATG CAG ATA ATC G-3'
SEQ ID NO: 31
Iniciador 67-2I-C para a amplificação pela PCR da seqüência codiflcadora do gene ispA
5'- CAG TAA AGC TTA GGA GGA AAT AAT GGA CTT TCC GCA GCA ACT CG -3'
SEQ ID NO: 32
Iniciador 67-2J-C para a amplificação pela PCR da seqüência codiflcadora do gene ispA
5'- TAG TTC CAT GGT TAT TTA TTA CGC TGG ATG ATG TAG TCC GC -3'
SEQ ID NO: 33
Iniciador 9-156A para a amplificação pela PCR do local par de RK2 5'- ACATAGACGTCGGGAAAGCGAGGATCTAGGTAGGG -3'
SEQ ID NO: 34
Iniciador 9-156B para a amplificação pela PCR do local par de RK2 5'- TTCCCGCTCGAGGTGGCGGACCATATAGGCAGATCAG -3'
SEQ ID NO: 35
Iniciador 19-137 cml-pAM37-AS 5 '-GACGTCGATATCTGGCGAAAATG-3' SEQ ID NO: 36
Iniciador 19-137 cml-pAM37-S 5' -TACTAGTGCTTGGATTCTC ACC-3' SEQ ID NO: 37
ATGAAGAACTGTGTGAITGTTTCTGCGGTCCGCACGGCGATCGGCAOCTTTAACG ,
GCTCTITAGCGAGCACCTCTGCAATCGATCTGGGTGCGACGGTCATTAAGGCCGC
CATTGAACGCGCCAAAATCGACAGCCAGCACGTTGATGAGGTGATCATGGGCAA
TGTGTTACAAGCCGOCCTGGGTCAAAACCCAQCGCGTCAAGCACTGTTAAAATCT
GGTCTGGCCGAGACCGTGTGTGGCTTCACCGTCAATAAGGTTTGCGGCTCTGGCC
TGAAGAGCGTGGCCCTGGCAGCACAAGCGATTCAAGCCGGTCAGGCACAAAGCA
TCGTTGCGGGTGGCATGGAGAACATGTCTCTGGCGCCGTACTTATTAGATGCCAA 2
AGCCCGCAGCGGTTATCGCCIXKKjCGATGGTCAGGTGTACGACXITCATCTTACCK:
GATGGCTTAATGTGCGCGACCCACGGTTACCACATGGGTATTACGGCCGAAAAC
GTGGCGAAAGAATACGGCATTACGCGCGAGATGCAGGATGAATTAGCACTGCAC
TCTCAGCGCAAAGCAGCAGCCGCGATCOAGTCTGGTGCGTTTACGGCGG AAATC
GTGCCAGTTAACGTGGTCACGCGCAAGAAGACGTTCGTTTTCAGCGAGGACGAG ;
TTCCCGAAGGCAAACAGCACCGCGGAGGCCTTAGGTGCCriACGCCCAGCCTTTG
ACAAAGCGGGCACGGTCACCGCCGGTAATGCGAGCGGCATCAATGATGGTGCAG
CGGCACTGGTCATCATGGAAGAQAGCGCCGCATTAGCAGCGGGTCTGACCCCAT
TAGCGCGCAITAAATCTTATGCCAGCGGCGGCGTCCCACCAGCCCTGATGGGCAT
GGGTCCGGTGCCAGCCACGCAAAAAGCCCTGCAATTAGCGGGCCTGCAACTGGC
CGACATTGATCTGATCGAGGCGAACGAGGCGTTTGCAGCGCAGTTCCTGGCGGT 2
gggtaagaatctgggcttcgacagcgagaaagtcaatgtgaacggtggcgcgat
TGCGTTAGGCCATCCGATTGGTGCAAGCGGCGCACGCATCTTAGTGACGTTACTG CACGCCATGCAGGCACGCGACAAGACCTTAGGCCTGGCGACCTTATGTATTGGTG GCGGTCAAGGTATCGCCATOGTGATCGAACGCCTGAACTGAAGATCTAGGAGGA
aagcaaaatgaaactgagcaccaagctgtgctggtgtggcatcaagggtcgcct gcgcccacaaaagcagcaacagctgcacaacacgaacctgcaaatgaccgagct gaaaaagcagaaoacggccgagcaaaagacccxxíccgcagaacgtrggcatca
agggcatccagatttatatcccgacgcagtgtgtcaaccaatctgagctggaga
aattcgatggcgtcagccagggtaagtacaccatcggcctgggccagaccaaca
tgagcttcgtgaacgaccgtgaggacatctattctatgagcctgacggtgctgtc
taagctgatcaagaoctacaacatcgacacgaataagatcggtcgtctggaggt
gggtacggagacgctgattgacaagagcaaaagcgtgaagtctgtcttaatgca
gctgttcggcgagaacacggatgtcgagggtatcgacaccctgaacgcgtgtta
cggcggcaccaacgcactgttcaatagcctgaactggatigagagcaacgcctg
ggatggccgcgaixjcgatcgtcgtgtgcggcgatatcgccatctatgacaaggg
tgcggcacgtccgaccggcggtgcaggcaccgttgcgatgtggattggcccgga
cgcaccaattgtcttcgattctgtccgcgcgtcttacatggagcacgcctacgac
ttttaolagccckjacitcacgagcgaatacccgtacgtggacggccacttcrcrc
tgacctgctatgtgaaggcgctggaccaggtttataagtcrtatagcaaaaaggc
gatttctaagggcctggtcagcgacccggcaggcagcgacgccctgaacgtgct
gaagtatttcgactacaacgtgtrccatgtcccgacctgcaaattagtgaccaaa
tcttatggccgcctgttatataatgatttccgtgccaacccgcagctgttcccgga
gqttgacgccgagctggcgacgcgtgattacgacgagagcctgaccgacaagaa
catcgagaagaccttcgtcaacgtcgcgaagccgttccacaaagagcgtgtggc
ccaaagcctgatcgtcccgaccaacacgggcaacatgtataccgcgtctgtctac
gcggcattcgcgagcctgctgaattacgtcggttctgacgacctgcagggcaagc
gcgttggcctgttcagctacggtagcggcttagcggccagcctgtatagctgcaa
aattgtcggcgacgtccagcacatcatcaaggagctggacatcaccaacaagct
ggcgaagcgcatcaccgagacgcggaaagattacgaggcagcgatcgagttacg
cgagaatgcgcatctgaagaagaacttcaagccgcaaggtagcatcgagcacct
gcagagcogcgtctactacctgacgaacattgacgacaagttccgccgttcttat
gacgtcaaaaagtaactagtaggaggaaaacatcatgcaaagtttagataagaa
iitccgacatttatctcgtcaacaaaagttacaacaattggtagataagcaatgg
watcagaagatcaattcoacatittattgaatcatccattaattgatgaggaag
tagcaaatagtttaattgaaaatgtcatcgcgcaaggtgcattacccgttggatt
attaccgaatatcattgtggacgataaggcatatgttgtacctatgatggtggaa
gagccttcagttgtcgctgcagctagttatggtgcaaagctagtgaatcagactg
gcggatttaaaacggtatcttctgaacgtattatgataggtcaaatcgtctttga
tggcgttgacgatactgaaaaattatcagcagacattaaagctttagaaaagca
aattcataaaattgcggatgaggcatatccttctattaaagcgcgtggtggtggt taccaacotatagctattgatacatttcctgagcaacagttactatctttaaaag tatttgttgatacgaaagatgctatgggcgctaatatgcttaatacgattttaga ggccataactgcatttitaaaaaatgaatctccacaaagcgacattttaatgagt ATTTTATCCAATCATGCAACAGCGTCCXjTTGTTAAAGTTCAAGGCGAAATTGACG
ttaaagatttagcaaggggcgagagaactggagaagaggttgccaaacgaatg
gaacgtgcttctgtattggcacaagttgatattcatcgtgctgcaacacataata
aaggtgttatgaatggcatacatgccgttgttrtagcaacaggaaatgatacgcg
tggtgcagaagcaagtgcgcatocatacgcgagtcxjtgacggacagtatcgtgg
tattgcaacatggagatacgatcaaaaacgtcaacgtttaattggtacaataga
agtgcctatgacattggcaatcgttggcggtggtacaaaagtattaccaattgct
aaagcttctttagaattgctaaatgtagattcagcacaagaattaggtcatgtag
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cgtgcgaatacacaagtagctgaacck:attttacaagaaattagacaacaatag SEQ ID NO: 42
Operon atoB(opt):mvaS(opt):mvaA
atgaagaactgtgtgattgtnrrctgcggtccgcacggcgatcggcagctttaacg gctctttagcgagcacctctgcaatcgatctgggtgcgacggtcattaagqccgc
cattgaacgcgccaaaatcgacagccagcacgttgatgaggtgatcatgggcaa tgtgttacaagccggcctgggtcaaaacccagcgcgtcaagcactgttaaaatct
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tgaagagcgtggccctggcagcacaagcoattcaagccggtcaggcacaaagca
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gtgccagttaacgtggtcacgcgcaagaagacgttcgttttcagccaggacgag
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tgcgttaggccatccgattggtgcaagcggcgcacgcatcttagtgacgttactg
cacgccatgcack3cacg€gacaagaccnrtaggcctggcgacctratgtattggtg gcggtcaaggtatcgccatggtgatcxíaacgcctgaactgaagatctaggagga
aagcaaaatgacaataggtatcgacaaaataaacttttacgttccaaagtacta
tgtagac atggctaaattagcagaagcacgccaagtagacccaaacaaattttt
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ttgcacataatccaagcattttggcattaaatgaagatgctgttgcttacactga
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aaaagcaaattcataaaattgcggatgaggcatatccttctattaaaocgcgtg gtggtogttaccaacgtatagctattoatacatttcctgagcaacagttactatc
tttaaaagtatttgttgatacgaaagatgctatgggcgctaatatgcttaatacg
attttagaggccataactgcatttttaaaaaatgaatctccacaaagcgacattt
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atcgtggtattgcaacatggagatacgatcaaaaacgtcaacgtttaattggtac
aatagaagtgcctatgacattggcaatcgttggcggtggtacaaaagtattacc
aattgctaaagcttcrttagaattgctaaatgtagattcagcacaagaattaggt catgtagttgctgccgttggtxragcacagaactttgcagcatgtcgcgcgctcg tttccgaaggtatccagcaaggccatatgagcttgcaatataaatcittagctat
TGTTGTAGGTGCAAAAGGTGATGAAATTGCGCAAGTAGCTGAAGCATrGAAGCA agaaccccgtgcgaatacacaagtagctgaacgcattttacaagaaattagaca
acaatag SEQ ID NO: 43
ρ AM328-ERG9-KANMX-MET3 promotor-ERG9 (excluindo a cadeia principal do vetor)
CAATACCGACrrACCATCCTATTTGCTTTGCCCTTTTTCriTTCCACTGCATGGCG
gcgttagtatcgaatggatggcggcgttagtatcgaatcgacagcagtatagcg accagcattcacatacgattgacc^atoatattacrttctgcgcacttaacttcg
catctgggcagatgatgtcgaggcgaaaaaaaatataaatcacgctaacatttg
attaaaatagaacaactacaatataaaaaaactatacaaatgacaagttcttga
aaacaagaatctttttattgtcagtactgattagaaaaactcatcgagcatcaaa
tgaaactgcaatirattcatatcaggattatcaataccátatitttgaaaaagcc
gtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagat
cctggtatcggtctgcgatrccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttc
ccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaa
tccggtgagaatggcaaaagcttatgcatncttrccagacrrtgtrcaacaggcc agccattacgcrcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcg tgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattaca aacaggaatcgaatqcaaccggcgcagoaacactgccagcgcatcaacaatatt
TTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTGCCGGGGATC
gcagtggtgagtaaccatgcatcatcaogagtacggataaaatgcttgatggtc
GGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACAT
CATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGCtctt
CCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAC3CCCAT
ttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggccrcgaaacgt
gagtcttttccttacccatggttgtttatgttcggatgtgatgtgagaactgtatc
ctagcaagattttaaaaggaagtatatgaaagaagaacctcagtggcaaatcct
AACCTTTTATATTTCTCTACAGGGGCGCGGCGTGGGGACAATTCAACGCGTCTGT GAGGGGAGCGTTTCCCTGCTCGCAGGTCTGCAGCGAGGAGCCGTAAI i 11 iGCTT CGCGCCGTGCGGCCATCAAAATGTATGGATGCAAATGAITATACATGGGOATGT atgggctaaatgtacgggcgacagtcacatcatgcccctgagctgcgcacgtca
agactctcaaggagggtattctgggcctccatgtcgctggccgggtgacccggc ggggacgaggcaagctaaacagatctgatcttgaaactgagtaagatgctcaga
atacccgtcaagataagagtataatgtagagtaatataccaagtattcagcatat
tctcctcttcrrtrgtataaatcacggaagggatgatttataagaaaaatgaata
CTATTACACTTCAiTrACCACCCTCrGATCTAGATTTTCCAACGATATOTACGTAG
tggtataaggtgagggggtccacagatataacatcgtttaaittagtactaacag
AGACTTTTGTCACAACTACATATAAGTGTACAAATATAGTACAGATATGACACAC
TTGTAGCGCCAACGCGCATCCTACGGATTGCTGACAGAAAAAAAGGTCACGTGA
CCAGAAAAGTCACGTGTAATTTTGTAACTCACCGCATTCTAGCGGTCCCTGTCGT
gcacactgcactcaacaccataaaccttagcaacctccaaaggaaatcaccgta
taacaaagccacagttttacaacitagtctcritatgaagttacrtaccaatgaga
aatagaggctctttctcgagaaatatgaatatggatatatatatatatatatata
TATATATATATATATGTAAACTTGGTTCOTTTTAGCTTGTGATCTCTAGCTTGGG
tctctctctgtcgtaacagttgtgatatcggctgccttcatctcgaccggatgcaa
tgccaattgtaatagctttcccatgttaattatactttattctt
SEQ ID NO: 44
GAGTGAACCTGCTGCCTGGCGTGCTCTGACTCAGTACATTTCATAG TGGATGGCG GCGTTAGTATC SEQ ID NO: 45
CGTGTATACGTTTTCCGCTTCTGCTCTTCGTCTTTTCTCTTCTTCCGA TATCACAAC TGTTACGA SEQ ID NO: 46
GGTAAGACGGTTGGGTTTTATCTTTTGCAGTTGGTACTATT AAGAA CAATCACAG GAAACAGCTATGACC SEQ ID NO: 47
TTGCGTTTTGTACTTTGGTTCGCTCAATTTTGCAGGT AGAT AATCGA AAAGTTGTA AAACGACGGCCAGT SEQ ID NO: 48
seqüência de pAM491 (excluindo a cadeia principal de vetor) gtttaaacttgctaaattcgagtgaaacacaggaagaccagaaaatcctcatttc atcc atattaac aataatttc aaatgritatttgcattaittg aa actagggaag acaagcaacgaaacg'rtttgaaa^\ttttgagtatt'rtcaataaatttgtagagga ctcagatattgaaaaaaagctacagcaattaatacttgataagaagagtattoa gaagggcaacggttcatcatctcatggatctgcacatoaacaaacaccagagtc aaacgacgttgaaattgaggctactgcgccaattgatgacaatacagacgatga taacaaaccgaagttatctgatgtagaaaaggattaaagatgctaagagatagt
CATATTTATGGTGAAGGATAAGTTrrGACCATCAAAGAAGGTTAATGTGOCTGTO gtitcagggtccatacccgggagttatgacaatracaacaacagaattctttcta
tatatgcacgaacttgtaatatggaagaaattatgacgtacaaactataaagta
aatattttacgtaacacatggtgctgttgtgcttctttttcaagagaataccaatg
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ttatatcagtggcgtccaaatrgttagottttottggltcagcagottrcctottg tg(k}tcatatgacttrgaaccaaatcgccggctgctack3gcagq\cataaooat aattcacctgccaagacggcacaggcaactattcttgctaattgacgtgcgttgg
taccacgagcggtagcatgtgggcctcttacacctaataagtccaacatggcacc
ttgtggttctagaacagtaccaccaccgatggtacctacttcgatggatggcatg
GATACGGAAATTCTCAAATCACCGTCCACITCTTrCATCAATGTTATACAGTTOG
aactttcgacaitttgtgcaggatcitgtcctaatgccaagaaaacagctgtcac TAAAITAGCTGCATGTGCGTTAAATCCACC AACAGACCC AGCC ATTGCAG ATCCA ACCAAATTCTTAGCAATGTTCAACTCAACCAATGCGGAAACATCACrrmTAACA CTTTTCTGACAACATCACCAGGAATAGTAGCTTCTGCGACGACACTCTTACCACG ACXTITCGATCCAGTTGATGGCAGCTGGTTTTTroTCGOTAC^
ACGGAGACAACCTCCATATCTTCCCAGCC^TACTCTrCTACCAITTGCTTTAATGA
gtattcgacaccctragaaatcatattcatacccattgcgtcaccagtagttgttc
TAAATCTCATGAAGAGTAAATCrCCraCTAOACAAGTTTGAATATGTTGCAGACG
TGCAAATCTTGATGTAGAGTTAAAAGCTTTTTTAATTGCGTTTTGTCCCTCTTCTG
AGTCTAACCATATCTTACAGGCACCAGATCTTTTCAAAGTTGGGAAACGGACTAC
TGGGCCTCTTGTCATACCATCCTTAGTTAAAACAGTTGTTGCACCACCGCCAGCA
TTGATTGCCTTACAGCCACGCATGGCAGAAGCTACCAAACAACCCTCTGTAGTTG
CCATTGGTATATGATAAGATGTACCATCGATAACCAAGGGGCCTATAACACCAA
CGGGCAAAGGCATGTAACCTATAACATTTTCACAACAAGCGCCAAATACGCGGT
CGTAGTCATAATTTTTATATGGTAAACGATCAGATGCTAATACAGGAGCTTCTGC
CAAAATTGAAAGAGCCTTCCTACGTACCGCAACCGCTCTCGTAGTATCACCTAAT
TTTTTCTCCAAAGCGTACAAAGGTAACTTACCGTGAATAACCAAGGCAGCGACCT
CTTTGTTCTTCAATTGTTTTGTATTTCCACTAC1TAATAATGCTTCTAATTC
AAGGACGTAlTTTCTTATCCAAGCTTTCAATATCGCGGGAATCATCnrTCCTCACTA
GATGATGAAGGTCCTGATGAGCTCGATTGCGCAGATGATAAACTTTTGACTTTCG
ATCCAGAAATGACTGTTTTATTGGlTAAAACTGGTGTAGAAGCCTrrTGTACAGG
ACK:AGTAAAAGACTTCTTGGTGACTTCAGTCTTCACCAATTCGTCTGCAG€CATT
ATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAGAGGTATATTAACAATrTTTTTGTTGA
TACTTTTATGACATTTGAATAAGAAGTAATACAAACCGAAAATGTTGAAAGTATT
agttaaagtggttatgcagcttttgcatttatatatctgttaatagatcaaaaat
CATCGCTTCGCTGATTAATTACCCCAGAAATAAGGCTAAAAAACTAATCGCATTA
TTATCCTATGGTTGTTAATTTGATTCGTTGATTTGAAGGTTrGTGGGGCCAGGTTA
CTGCCAATnTTCCTCrrCATAACCATAAAAGCTAGTATTGTAGAATCTTTATTGT
TCGGAGCAGTGCGGCGCGAGGCACATCTGCGTTTCAGGAACGCGACCGGTGAAG
ACCAGGACGCACGGAGGAGAGTCTTCCGTCGGAGGGCTGTCGCCCGCTCGGCGG
cnrrctaatccgtacttcaatatagcaatgagcagttaagcgtawactgaaagtt
CCAAAGAGAAGGTTTTITTAGGCrAAGATAATGGGGCTCTTTACATTTCCACAAC
ATATAAGTAAGATTAGATATGGATATGTATATGGTGGTATTGCCATGTAATATGA
TTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCAAAAAAA AAGTAAGAATTTTTGAAAATTCA
ATATAAATGAAACTCTCAACTAAACTTTGTTGGTGTGGTATTAAAGGAAGACTTA ggccgc aaaagcaacaacaattacacaatacaaacttgcaaatgactg aactaa
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ccaacgcgttgttcaactctitgaactggattgaatctaacgcatgggatggtag
agacgccattgtagtttgcggtgatattgccatctacgataagggtgccgcaaga
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AGATTTCACCAGCGAATATCCTTACGTCGATGGTCATlTTTCATTAACriTGTTACG
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ctattaaactatgttggatctgacgacttacaaggcaagcgtgttggtrtattttc
ttacggttccggtttagctgcatcrrctatattxntgcaaaattgttggtgacgtcc
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agcctgctttttttagctctcatitaatagagtagttttttaatctatatactagg aaaactctttatttaataacaatgatatatatatacccgggaagcttttcaattc
ggtaatctccgagcagaaggaagaacgaaggaaggagcacagacttagattgg tatatatacgcatatgtggtgttgaagaaacatgaaattgcccagta ttctt aac ccaactgcacagaacaaaaacctgcaggaaacgaagataaatcatgtcgaaagc tacatataaggaacgtgctgctactcatccragtcctgttgctgccaagcrattt aatatcatgcacgaaaagcaaac^aacttgtgtgcttcattggatgttcgtacca
CCAAGGAATTACrGGAGTTAGTTGAAGCATTAGGTCCCAAAArrrGTTTACTAAA
AACACATGTGGATATCITGACTGATTTrrCCATGGAGGGCACAGTTAAGCCGCTA
AAGGCATTATCCGCCAAGTACAATTTTTTACTCTTCGAAGACAGAAAATTTGCTG
acattggtaatacagtcaaattgcagtactctgcgggtgtatacagaatagcag
AATOGGCAGACATTACGAATGCACACGGTGTGGTGGGCCCAGGTATTGTTAGCG
GTTTGAAGCAGGCGGCGGAAGAAGTAACAAAGGAACCTAGAGGCCTTTTGATGT
TAGCAGAATrGTCATGCAAGGGCTCCCTAGCTACTGGAGAATATACTAAGGGTA
CTGTTGACATTGCGAAGAGCGACAAAGATTTTGTTATCOGCTTTATTGCTCAAAG
AGACATOGGTGGAAGAOATGAAGGTTACGATTGGTTGATTATGACACCCGGTGT
gggtttagatgacaagggagacgcattgggtcaacagtatagaaccgtggatga tgtggtctctacaggatctgacattattattgttgggtttaaac
SEQ ID NO: 49
Seqüência de pAM492 (excluindo a cadeia principal de vetor) GTTTAAACTTGCTAAATTCGAGTGAAACACAGGAAGACCAGAAAATCCTCATTTC ATCCATATTAACAATAATTTCAAATGTTTAlTTGCATTATTTGAAACrAGGGAAG ACAAGCAACGAAACGmiTGAAAATrrrGAGTATrrrCAATAAATTTGTAGAGG actcagatattgaaaa AAAGCTACAGCAATTAATACTTGATAAGAAGAGTATrG AGAAGGGCAACGGTTCATCATCTCATGGATCTGCACATGAACAAACACCAGAGT CAAACGACGTrGAAATrGAGGCTACTGCGCCAATTGATGACAATACAGACGATG ATAACAAACCGAAGTTATCTGATGTAGAAAAGGATTAAAGATGCTAAGAGATAG TGATOATATTTCATAAATAATGTAATTCTATATATGTTAATTACCnTTTT^ GCATATTTATGGTGAAGGATAAGTrTTGACCATCAAAGAAGGTTAATGTGGCTGT GGTTTCAGGGTCCATACCCGGGTATATA TATATCATTGTT ATT AAATAAAGAGTT
ttcctagtatatagattaaaaaactactctattaaatgagagctaaaaaaagca
GGCTGCCAAAAAAATAAAGCATTTATGAAGGGGGTTCAGCAAGATGCAATCGAT
gggggaagattattttttaacatcgtaagatcitctaaatttgtcatcgatgttg gtcaagtagtaaacaccactttgcaaatgctcaatggaaccttgaggtttgaagt
tcttcttcaaatgggcatttictctcaatrcgatggcagcttcgtaatcctttgga
GTTTCGGTGATTCTCrrGGCTAATTTGTTAGTAATATCTAATTCCTTGATAATATG
ttggacgtcaccaacaattttgcaagaatatagagatgcagctaaaccggaacc
GTAAGAAAATAAACCAACACGCTTGCCTTGTAAGTCGTCAGATCCAACATAGTTT
AATAGAGATGCAAAGGCCKX:ATAAACAGATGCGGTGTACATGTTACCTGTGTTT gttggaacaatcaaagattgggcaactctctctttgtgcíaatggcttagcaacat
taacaaaagttttttcaatgttcttatcggttaaagattcgtcataaitcgcgagt
agctaattcggcgtcaacttctgggaacaattgaggattggctctgaaatcgtta
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tctttttttagttcagtcatttgcaag1ttgtatt
ggcctaagtcttcctrtaataccacaccaacaaagtttagttgagagtttcatttt
atgtgatgattgattgattgattgtacagtitgtttttcttaatatctatttcgat
gacttctatatgatattgcactaacaagaagatattataatgcaattgatacaag
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agtc IiIiT 1gctggaacggttc agcgg aaaagacgc ATCGCTCTrrTTGCTTCTA
gaaoaaatgccagcaaaagaatctcttgacagtgactgacagcaaaaatgtctt
tttctaactagtaacaaggctaagatatcagcctgaaataaagggtggtgaagt
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aaagtgttttaaatacagatacatacatgaacatatgcacgtatagcckxcaaat gtcggtaatgggatcggcttactaattataaaatgcatcatagaaatcgttgaag ttgacgcagcgactcgagatccataggagcaactcatgtctgaacttcaacgatt
tcratgatgcattttataattagtaagccgatcccattaccgacatttgggcgct atacgtgcatatgttcatgtatgtatctgtatttaaaacactttrgtattattttt
cctcatatatgtgtataggtttatacggatgatttaattattacttcaccaccctt
tatttcaggctgatatctragccttgttacragttagaaaaagacatttrtgcrgt cagtcactgtcaagagattcitttgctgocatttcttctagaagcaaaaagagcg
atgcgtcrntccgctgaaccgttccagcaaaaaagactaccaacgcaatatgga ttgtc agaatc atataaaa ga gaagcaaataactccttgtcttgtatcaattgca ttataatatcttcttgttagtgcaatatcatatagaagtcatcgaaatagatatt
aagaaaaacaaactgtacaatcaatcaatcaatcatcacataaaatggctgcag accaa wggtgaagactgaagtcaccaagaagtcttttactgctcctgtacaaaa ggcttctacaccagtittaaccaataaaacagtcatttctggatcgaaagtcaaa agtttatcatctgcgcaatcgagctcatcaggaccttcatcatctagtgaogaag atgattcccgcgatattgaaagcttggataagaaaatacgtcctttagaagaatt agaagcattattaagtagtggaaatacaaaacaattgaagaacaaagaggtcgc tgccitggttattcacggtaagwacctttgtacgctttggagaaaaaattaggt
gatactacgagagcggttgcggtacgtaggaaggctctttcaatttrggcagaa
gctcctgtattagcatctgatcgittaccatataaaaattatgactacgaccgcg
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tggtgcaacaactgttttaactaaggatggtatgacaagaggcccagtagtccgt
ttcccaactitgaaaagatctggtgcctgtaagatatggttagactcagaagagg
gacaaaacgcaattaaaaaagcttttaactctacatcaagatttgcacgtctgca
acatattgaaacttgtctagcaggagatttactcttcatgagatttagaacaact
actggtgacgcaatgggtatgaatatgatttctaaqggtgtcgaatactcattaa
agcaaatggtagaagagtatggctgggaagatatggaggttgtctccgtttctg gtaactactgtaccgacaaaaaaccagctgccatcaactggatcgaaggtcgtg gtaagagtgtcgtcgcagaagctactattcctggtgatgttgtcagaaaagtgtt
aaaaagtgatgtttccgcatrggttgagttgaacattgctaagaatttggttgga
tctgcaatggctgggtctgttggtggatttaacgcacatgcagctaatttagtga
cagctgtttrcttggcattaggacaagatcctgcacaaaatgtcgaaagttccaa
ctgtataacattgatoaaagaagtggacggtgatttgagaatttccgtatccatg
ccatccatcgaagtaggtaccatcggtggtggtactgttctagaaccacaaggtg
ccatgttggacttattaggtgtaagaggcccacatgctaccgctcctggtaccaa
cgcacgtcaattagcaagaatagttgcctgtgccgtcttggcaggtgaattatcc
ttatgtgctgccctagcagccggccatttggttcaaaotcatatgacccacaaca
ggaaacctgctgaaccaacaaaacctaacaattrggacgccactgatataaatc
gtttg aaagatgggtccgtcacctgcattaaatcctaaacttagtcatacgtcat tggta ttctcttgaaaaagaa gcac aacagcaccatgtgttacgtaaaatatita ctttatagtttgtacgtcataatttcrrccatattacaagttcgtgcatatataga aagaattctgttgttgtaattgtcataactcccgggaagcttttcaatrcatcttt ΤΤΤΤΤΤΊΓΤΤΟΤΓΟΤΤΓΤΪΙ
ctccgagcagaaggaagaacgaaggaaogagcacagacitagattggtatatat
ACGCATATGTGGTGTTGAAGAAACATGAAATTGCCCAGTATTCTTAACCCAACTG CACAGAACAAAAACCTGCAGGAAACGAAGATAAATCATGTCGAAAGCTACATAT
aaggaacgtgctgctactcatcctagtcctgttgctgccaagctatttaatatca tgcacgaaaagcaaacaaacttgtgtgcttcattggatgttcgtaccaccaagga
attactggagttagttgaagcartaggtcccaaaatttgtrractaaaaacacat
gtggatatcttgactgattittccatggagggcacagttaagccgctaaaggcat
TATCCGCCAAGTACAATlTTTTACTClTCGAAGACAGAAAAm
taatacagtcaaattgcagtactctgcgggtgtatacagaatagcagaatgggc agacattacgaatgcacacggtgtggtgggcccaggtattgttagcggtttgaa
GCAGGCGGCGGAAGAAGTAACAAAGG AACCTAGAGGCCrTTTGATGTTAGCAGA
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SEQ ID NO: 50
Seqüência de pAM489 (excluindo a cadeia principal de vetor) GTTTAAACTACTATTAGCTGAATTGCCACTGCTATCGTTGTTAGTGGCGTTAGTGC
ttgcattcaaagacatggagggcgttattacgccggagctcctcgacagcagatc
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SEQ ID NO: 51
Seqüência de pAM497 (excluindo a cadeia principal de vetor) gtttaaacttttccaataggtggttagcaatc^
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SEQID NO: 52
Seqüência de pAM493 (excluindo a cadeia principal de vetor) gtttaaactacrcagtatatraagtttcgaattgaagggcgaactcttattcgaa
gtcggagtcaccacaacacttccgcccatactctccgaatcctcgtttcctaaag
taagtttacrrccacttgtaggcctattattaatgatatctgaataatcctctatt agggttggatcattcagtagcgcgtgcgattgaaaggagtccatgcccgacgtc gacgtgattagcgaagocgcgtaaccattgtcatgtctagcagctatagaacta acctccttgacaccacttgcggaagtctcatcaacatgctcttccttattactcat tctctrraccaaqcaoagaatgttatctaaaaactacgtgtatttcacctctttctc
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tttrcrtatccaagcittcaatatcgcgggaatcatcttccrcactagatgatgaa GGTCCTGATGAGCTCGATTGCGCAGATGATAAACTTTTGACTTTCGATCCAGAAA
tgactgttttattggttaaaactggtgtagaagccttttgtacaggagcagtaaa AGACTTCTTGGTGACTTCACrrcriTCACCAATTGGTCTGCAGCCATTATAGTTT^ CTCCTTGACOTTAAAGTATAGAGGTATATTAACAATTTTTTaTTGATACTTTTATG acatttgaataagaagtaatacaaaccgaaaatgttgaaagtattagttaaagt ggttatgcagcitttocatttatatatctgttaatagatcaaaaatcatcgcttcg
ctgattaattaccccagaaataaggctaaaaaactaatcgca*xtattatccratg gttgttaatttgattcgttgatttgaaggtttgtck3ggccackjttactgccaattt ttcctcttcataaccataaaagctagtattgtagaatctttattgttcggagcagt gcggcgcgaggcacatctgcgtttcaggaacgcgaccggtgaagaccaggacgc acggaggagagtcttccgtcggagggctgtcgcccgctcxk5cggcttctaatccg tacttcaatatagcaatgagcagttaagcgtattactgaaagttccaaagagaa
gattagatatggatatgtatatggtggtattgccatgtaatatgattattaaact tctttgcgtccatccaaaaaaaaagtaagaattt1tgaaaattcaatataaatga ctgccgacaacaatagtatgccccatggtgcagtatctagttacgccaaattagt gcaaaaccaaacacctgaagacattttggaagagtttcctgaaatratrccatta
caacaaagacctaatacccgatctagtgagacgtcaaatgacgaaagcggagaa
ACATGTrnTCTGGTCATGATGAGGAGCAAATTAAG'lTAATGAATGAAAATTGTA
ttgttttggattgggacgataatoctattggtgccggtaccaagaaagtttgtca
TTTAATGGAAAATATTGAAAAGGGTTTAtTACATCGTGCATTC^
tcaatgaacaaggtgaattacttrtacaacaaagagccactgaaaaaataactt
tccctgatctttggactaacacatgctgctctcatccactatgtattgatgacgaa
ttaggtttgaagggtaagctagacgataagattaagggcgcrattactgcggcg
gtgagaaaactagatcatgaattaggtattccagaagatgaaactaagacaagg
ggtaagtttcactttttaaacagaatccattacatggcaccaagcaatgaaccat
ggggtgaacatgaaattgattacatcctattttataagatcaacgctaaagaaa
acttgactgtcaacccaaacgtcaatgaagttagagacttcaaatgggtttcacc
aaatgattrgaaaactatgtttgctgacccaagttacaagtttacg
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ctgaagtggaaaatgacaggcaaattcatagaatgctataacaacgcgtcaata atataggctacataaaaatcataataactttgttatcatagcaaaatgtgatata aaacgtttcatttcacctgaaaaatagtaaaaataggcgacaaaaatccttagt
aatatgtaaactttattttctttattracccgggagtcagtctgactcttgcgaga gatgaggatgtaataatactaatctcgaagatgccatctaatacatatagacata
catatatatatatatacatrcratatattcttacccagattctttgaggtaagacg
gttgggttttatcttttgcagttggtactattaagaacaatcgaatcataagcatt
GCTTACAAAGAATACACATACGAAATATTAACGATAATGTCAATTACG AAGACT
gaactggacggtatattgccattggtggccagaggtaaagttagagacatatat
gaggtagacgctggtacgttgcrgtttgttgctacggatcgtatctctgcatatg
ACGTTATTATGGAAAACAGCATTCCTGAAAAGGGGATCCTATTGACCAAACTX3TC
agagttctggttcaagttcctgtccaacgatgttcgtaatcatttggtcgacatc
gccccaggtaagactattttcgattatctacctgcaaaattgagcgaaccaaagt
acaaaacgcaactagaagaccgctctctattggttcacaaacataaactaattcc
ATTGGAAGTAATTGTCAGAGGCTACATCACCGGATCTGCTTGOAAAGAGTACGT
aaaaacaggtactgtgcatggtttgaaacaacctcaaggacttaaagaatctca
agagttcccagaaccaatcttcaccccatcgaccaaggctgaacaaggtgaaca
TGACGAAAACATCrrCTCCTGCCCAGGCCGCTGAGCTGGTGGGTGAAGATTTGTCA
CGTAGAGTGGCAGAACTGGCTGTAAAACTGTACTCCAAGTGCAAAGATTATGCT
aaggagaagggcatcatcatcgcagacactaaattgtttaaac
SEQ ID NO: 53
Seqüência de pAM426
TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGAC
GGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGC
gtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagca
GATTGTACTGAGAGTGCACCATATCGACTACGTCGTAAGGCCGTTTCTGACAGAG
TAAAATTCTTGAGGGAACTTTCACCATTATGGGAAATGCrrCAAGAAGGTATTGA
CTTAAACTCCATCAAATGGTCAGGTCATTGAGTG i i 1111ATTTGTTGTA IT 1Ί1"1Ί
TTTITTAGAGAAAATCCTCCAATATCAAATTAOGAATCGTAGTTTCATGATT^
GTTACACCTAACTTTTTGTGTGGTGCCCTCCTCCTTGTCAATATTAATGTTA.4AGT
GCAATTCriTTIX:CTrATCACGTTGAG<XATrAGTATCAATTrGCTTACCTGTATT
cctttactatcctcctttttctccttcttgataaatgtatgtagattgcgtatatag
TTrCGTCTACCCTATGAACATATTCCATTTTGTAATrrCGTGTCGTTTCTATTATGA
ATTrCATITATAAAGTrFATGTACAAATATCATAAAAAAAGAGAATCTTTrTAAG
CAAGGATTTTCTTAACTTCTTCGGCGACAGCATCACCGACTTCGGTGGTACTGTT
GGAACCACCTAAATCACCAGTTCTGATACCTGCATCCAAAACCirTTTAACTGCA
TCTTCAATGGCCrTACCTTCTTCAGGCAAGTTCAATGACAATTTCAACATCATTGC agcagacaagataotggcgataggotcaaccttattctttggcaaatctooagc agaaccgtggcatggttcgtacaaaccaaatgcggtgttcttgtctggcaaaga ggccaaggacgcagatggcaacaaacccaaggaacctgggataacggaggctt catcggagatgatatcaccaaacatgttgctggtoattataataccatttaggtg
ggttgggttcttaactaggatcatggcggcagaatcaatcaattgatgttgaacc
ttcaatgtagggaattcgtt<ntgatggtttcctccacagtttttct(x
tgaagaggccaaaagattagctttatccaaggaccaaataggcaatggtggctc
atgttgtagggccatgaaagcggccattcttgtoattctttgcacttctggaacg
gtgtattgttcactatcccaagcgacaccatcaccatcgtcttcctttctcttacc
aaagtaaatacctcccactaattctctgacaacaacgaagtcagtacctitagca
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Claims (48)

1. Sistema para produzir composto bio-orgânico, caracterizado pelo fato de que compreende: a. um vaso tendo uma capacidade de pelo menos 100 litros; b. um meio aquoso, dentro do vaso, formando uma primeira fase; c. uma pluralidade de células hospedeiras, dentro do meio aquoso, capaz de fabricar pelo menos um composto bio-orgânico; e, d. uma segunda fase orgânica líquida, que compreende o pelo menos um composto bio-orgânico, em contato com a primeira fase.
2. Sistema de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um composto bio-orgânico é um composto bio- orgânico C5.
3. Sistema de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um composto bio-orgânico é um composto bio- orgânico C10.
4. Sistema de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um composto bio-orgânico é um composto bio- orgânico C15.
5. Sistema de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um composto bio-orgânico é um composto bio- orgânico C2O.
6. Sistema de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um composto bio-orgânico é um composto bio- orgânico C2O+.
7. Sistema de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um composto bio-orgânico é um composto isoprenóide.
8. Sistema de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vaso tem uma capacidade de pelo menos 1000 litros.
9. Sistema de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vaso tem uma capacidade de pelo menos 10.000 litros.
10. Sistema de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vaso tem uma capacidade de pelo menos 50.000 litros.
11. Sistema de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vaso tem uma capacidade de pelo menos 100.000 litros.
12. Sistema de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vaso tem uma capacidade de pelo menos 500.000 litros.
13. Sistema de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vaso tem uma capacidade de pelo menos 1.000.000 litros.
14. Sistema de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a segunda fase orgânica compreende o composto bio- orgânico.
15. Sistema de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a segunda fase orgânica compreende pelo menos 90% de composto bio-orgânico.
16. Sistema para fabricar compostos isoprenóides C5-C2O caracterizado pelo fato de que compreende: a. um vaso tendo uma capacidade de pelo menos 100 litros; b. um meio aquoso, dentro do vaso, que compreende uma primeira fase; c. uma pluralidade de células hospedeiras, dentro do meio aquoso, capaz de fabricar pelo menos um isoprenóide; e, d. uma segunda fase orgânica líquida, que compreende o pelo menos um isoprenóide, em contato com a primeira fase.
17. Sistema de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o composto isoprenóide é um semi-terpeno.
18. Sistema de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o composto isoprenóide é um monoterpeno.
19. Sistema de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o composto isoprenóide é um sesquiterpeno.
20. Sistema de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o composto isoprenóide é um diterpeno.
21. Método para produzir um composto bio-orgânico, caracterizado pelo fato de que compreende: a. cultivar em um meio aquoso uma pluralidade de células hospedeiras que produzam pelo menos um composto bio-orgânico em que o meio aquoso e as células hospedeiras compreendem uma primeira fase; b. formar uma segunda fase orgânica líquida que compreenda o pelo menos um composto bio-orgânico em contato com a segunda fase; c. separar pelo menos um porção da segunda fase da primeira fase; e, d. isolar o pelo menos um composto bio-orgânico da segunda fase.
22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a segunda fase orgânica é formada pela indução.
23. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a segunda fase orgânica é separada decantando-se a segunda fase da primeira fase.
24. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um composto bio-orgânico é um composto bio- orgânico C5.
25. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um composto bio-orgânico é um composto bio- orgânico C10.
26. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um composto bio-orgânico é um composto bio- orgânico C15.
27. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um composto bio-orgânico é um composto bio- orgânico C20.
28. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um composto bio-orgânico é um composto bio- orgânico C2O+.
29. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a etapa de isolamento compreende adsorção.
30. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a etapa de isolamento compreende destilação.
31. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a etapa de isolamento compreende extração de gás-líquido.
32. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a etapa de isolamento compreende extração de líquido- líquido.
33. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a etapa de isolamento compreende ultra-filtração.
34. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um composto bio-orgânico é um composto isoprenóide.
35. Método para produzir um composto isoprenóide C5-C2O, caracterizado pelo fato de que compreende: a. cultivar em um meio aquoso uma pluralidade de células hospedeiras que produzam pelo menos um composto isoprenóide C5-C20 em um vaso tendo uma capacidade de pelo menos 100 litros; b. formar uma fase orgânica que compreenda o pelo menos um composto isoprenóide C5-C20; c. separar pelo menos uma porção da fase orgânica do meio aquoso; e, d. isolar o pelo menos um composto isoprenóide C5-C2O da fase orgânica.
36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um composto isoprenóide é um semi-terpeno.
37. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um composto isoprenóide é um monoterpeno.
38. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um composto isoprenóide é um sesquiterpeno.
39. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um composto isoprenóide é um diterpeno.
40. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a fase orgânica é formada pela indução.
41. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a fase orgânica é separada decantando-se a fase orgânica da fase aquosa.
42. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a etapa de isolamento compreende adsorção.
43. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a etapa de isolamento compreende destilação.
44. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a etapa de isolamento compreende extração de gás-líquido.
45. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a etapa de isolamento compreende extração de líquido-líquido.
46. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a etapa de isolamento compreende ultra-filtração.
47. Sistema de produção de composição de combustível, caracterizado pelo fato de que compreende: a) um ou mais sistemas de fermentação compreendendo: i) pelo menos um vaso tendo uma capacidade de pelo menos -100 litros; ii) um meio aquoso, dentro do pelo menos um vaso, que compreende uma primeira fase; iii) uma pluralidade de células hospedeiras, dentro do meio aquoso, capaz de fabricar, produzir ou sintetizar pelo menos um composto bio-orgânico; e, iv) uma segunda fase orgânica líquida que compreende o pelo menos um composto bio-orgânico em contato com a primeira fase; b) um ou mais sistemas de separação de primeira fase por meio dos quais a primeira fase e a segunda fase orgânicas ou um ou mais componentes da segunda fase orgânica são separados; c) opcionalmente um ou mais sistemas de separação de segunda fase por meio dos quais o pelo menos um composto bio-orgânico é separado da segunda fase orgânica; d) opcionalmente um ou mais reatores ou vasos em que o pelo menos um composto bio-orgânico é química ou biologicamente modificado; e) opcionalmente um ou mais sistemas de purificação por meio dos quais o composto bio-orgânico ou o composto bio-orgânico modificado é purificado ou mais purificado; f) opcionalmente um ou mais vasos de mistura ou sistemas para misturar o pelo menos um composto bio-orgânico com um ou mais componentes de combustível adicionais; e g) opcionalmente um ou mais sistemas de purificação adicionais por meio dos quais a mistura do pelo menos um composto bio- orgânico e o um ou mais componentes de combustível adicionais são purificados ou mais purificados.
48. Método para fabricar uma composição de combustível, caracterizado pelo fato de que compreende: a. cultivar em um meio aquoso uma pluralidade de células hospedeiras que produzam, fabriquem ou sintetizem pelo menos um composto bio-orgânico em que o meio aquoso compreende uma primeira fase; b. formar uma segunda fase orgânica líquida que compreenda o pelo menos um composto bio-orgânico em contato com a primeira fase; c. separar pelo menos uma porção da segunda fase da primeira fase; d. isolar o pelo menos um composto bio-orgânico da segunda fase; e. opcionalmente, por meio químico ou biológico, modificar o pelo menos um composto bio-orgânico; f. opcionalmente purificar o composto bio-orgânico ou o composto bio-orgânico modificado; g. opcionalmente misturar o pelo menos um composto bio- orgânico com um ou mais componentes de combustíveis adicionais; e h. opcionalmente purificar a mistura dos um ou mais compostos bio-orgânicos e o um ou mais compostos de combustíveis adicionais
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