MX2008014970A - Aparato para elaborar compuestos bio-organicos. - Google Patents

Aparato para elaborar compuestos bio-organicos.

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Abstract

Un sistema y método para producir compuestos bio-orgánicos que puede incluir un recipiente, una primera fase que comprende un medio acuoso que incluye células huésped capaces de producir un compuesto bio-orgánico, donde el compuesto bio-orgánico comprende una segunda fase en contacto con el medio acuoso.

Description

APARATO PARA ELABORAR COMPUESTOS BIO-ORGANICOS REFERENCIA CRUZADA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de las solicitudes provisionales Norteamericanas nos. 60/808,989 presentada el 26 de mayo de 2006, titulada MICROORGANISMS FOR PRODUCTION OF ISOPRENOIDS ; US 60/808,666 presentada el 26 de mayo de 2006, titulada BIOFUELS AND METHODS FOR PRODUCTION; U.S. 60/870,592 presentada el 12 de diciembre de 2006, titulada PRODUCTION OF ISOPRENOIDS; y U.S. 60/922,782, presentada el 10 de abril de 2007, titulada APARATO PARA ELABORAR COMPUESTOS BIO-ORGÁNICOS , los contenidos de las cuales se incorporan en su totalidad en la presente para referencia .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Tradicionalmente, los compuestos bio-orgánicos de interés se han elaborado mediante la extracción a partir de recursos naturales tales como plantas, microbios, y animales. Sin embargo, los productos de la extracción son usualmente muy escasos, ya que la mayoría de los compuestos bio-orgánicos se acumulan en la naturaleza en pequeñas cantidades. Dado que estas cantidades son mucho menores que las de muchas solicitudes comerciales, persiste una necesidad de sistemas y procedimientos que produzcan compuestos bio- orgánicos a un nivel industrial . La presente invención atiende esta necesidad. Se proporcionan varios sistemas a escala industrial para elaborar compuestos bio-orgánicos utilizando células huésped. Estos compuestos bio-orgánicos tienen por lo menos cinco átomos de carbono y pueden ser un carbohidrato tal como un mono o polialcohol, éster, éter, aldehido, acetona, o un hidrocarburo tal como un alcano, alqueno, o alquino. El compuesto bio-orgánico puede ser lineal o cíclico y puede ser saturado o no saturado.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona varios sistemas de producción de compuestos bio-orgánicos. En un aspecto, se proporciona un sistema de producción de compuestos bio-orgánicos, el cual comprende: a. cuando menos un recipiente que tiene una capacidad de por lo menos 100 litros; b. un medio acuoso, dentro del recipiente, que comprende una primera fase; c. una pluralidad de células huésped, dentro el medio acuoso, capaces de hacer, producir o sintetizar por lo menos un compuesto bio-orgánico; y, d. una segunda fase orgánica líquida, que comprende por lo menos un compuesto bio-orgánico, en contacto con la primera fase . En otro aspecto, se proporciona un método para producir por lo menos un compuesto bio-orgánico . El método comprende : a. cultivar en un medio acuoso una pluralidad de células huésped que hacen, producen o sintetizan por lo menos un compuesto bio-orgánico en donde el medio acuoso comprende una primera fase ; b. formar una segunda fase orgánica que comprende el compuesto bio-orgánico en contacto con la primera fase; c. separar por lo menos una porción de la segunda fase orgánica a partir de la primera fase; y, d. aislar por lo menos un compuesto bio-orgánico a partir de la segunda fase orgánica.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es un recipiente que tiene una capacidad de por lo menos 100 litros para su uso en la presente invención. La Figura 2 es otra modalidad con recipiente. La Figura 3 es una representación esquemática de la ruta del mevalonato ( "MEV" ) para la producción de difosfato de isopentenilo ("IPP"). La Figura 4 es una representación esquemática de la ruta de DXP para la producción de IPP y pirofosfato de dimetilalilo ("DMAPP"). Dxs es l-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa; Dxr es l-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato reductoisomerasa (también conocida como IspC) ; IspD es 4-difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol sintasa; IspE es 4-difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol sintasa; IspF es 2C-metil-D-eritritol 2 , 4 -ciclodifosfato sintasa; IspG es 1-hidroxi-2 -metil-2 - (E) -butenil 4-difosfato sintasa (IspG); e ispH es isopentenil/dimetilalil difosfato sintasa. La Figura 5 es una representación esquemática de la conversión de IPP y DMAPP a pirofosfato de geranilo ("GPP"), pirofosfato de farnesilo ("FPP"), y pirofosfato de geranilgeranilo ( "GGPP" ) . La Figura 6 muestra un mapa del plásmido de expresión pMBIS-gpps. La Figura 7 muestra un mapa del plásmido de expresión Pam00408. La Figura 8 muestra un mapa del plásmido de expresión pAM424. La Figura 9 muestra un mapa de los plásmidos de expresión pTrc99A-ADS, pTrc99A-FSA, pTrc99A-LLS, pTrc99A-LMS, pTrc99A-GTS, pTrc99A-APS, pTrc99A-BPS, pTrc99A-PHS, pTrc99A-TS, pTrc99A-CS, pTrc99A-SS, y pAM373. La Figura 10 son representaciones esquemáticas para la construcción de los plásmidos pAM489-pAM498.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que comúnmente entiende alguien con experiencia ordinaria en la técnica a la que esta invención pertenece. Se hace referencia aquí a varios términos que deben definirse para tener los siguientes significados : "Compuesto bio-orgánico" se refiere un compuesto orgánico que tiene por lo menos cinco átomos de carbono que pueden hacerse por una célula huésped al tomar una fuente de carbono de carbohidratos y convertir la fuente de carbono de carbohidratos en el producto deseado. "Ruta de 5-fosfato de desoxixilulosa" o "ruta de DXP" se utiliza en la presente para referirse a la ruta que convierte el gliceraldehído-3-fosfato y piruvato en IPP y DMAPP. La ruta de DXP se ilustra esquemáticamente en la Figura 4. "Endógeno" se refiere a una sustancia o proceso de formación natural, por ejemplo, en una célula huésped no recombinante . "Ácido nucleico heterólogo" , como se utiliza en la presente, se refiere a ácido nucleico en donde por lo menos uno de los siguientes es cierto: (a) el ácido nucleico es extraño ("exógeno") a (es decir, que no se encuentra naturalmente en) una célula huésped determinada; (b) el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que se encuentra naturalmente en (es decir, es "endógena a") una célula huésped determinada, pero la secuencia de nucleótidos se produce en una cantidad no natural (por ejemplo, mayor de la esperada o mayor de la que se encuentra naturalmente) en una célula; (c) el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que difiere en la secuencia a partir de una secuencia de nucleótidos endógena, pero la secuencia de nucleótidos codifica la misma proteína (que tiene la misma o sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos) y se produce en una cantidad no natural (por ejemplo, mayor de la esperada o mayor de la que se encuentra naturalmente) en la célula; o (d) el ácido nucleico comprende dos o más secuencias de nucleótidos que no se encuentran en la misma relación mutua en la naturaleza (por ejemplo, el ácido nucleico es recombinante) . "Célula huésped" y "microorganismo" se utilizan de forma intercambiable en la presente para referirse a cualquier célula viva de archae, bacteriana, o eucariótica en la que se ha insertado un ácido nucleico heterólogo. El término también se relaciona con la progenie de la célula original, no necesariamente pueden ser idénticas por completo en morfología o en complemento de ADN genómico o total al padre original, debido a una mutación natural, accidental, o deliberada . "El isoprenoide" y "compuesto isoprenoide" se utilizan de forma intercambiable en la presente y se refieren a un compuesto derivado a partir de difosfato de isopentenilo . "Aislado" y "aislar" cuando se refiere a un compuesto bio-orgánico es el enriquecimiento de la cantidad del compuesto bio-orgánico en una composición. Por consiguiente, la cantidad del compuesto bio-orgánico en una composición después de que el compuesto bio-orgánico se ha aislado o sometido a una paso de aislamiento es más de la cantidad presente en la composición antes de tal paso. "Ruta de mevalonato" o "Ruta de MEV" se utiliza en la presente para referirse a la ruta biosintética que convierte acetil-CoA en IPP. La ruta de MEV se ilustra esquemáticamente en la Figura 3. "De formación natural" como se aplica a un ácido nucleico, una enzima, una célula, o un organismo, se refiere a un ácido nucleico, enzima, célula, u organismo que se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptidos o polinucleótidos que está presente en un organismo que puede aislarse a partir de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado intencionalmente por un humano en el laboratorio de formación natural.
"Opcional" u "opcionalmente" significa que la característica o estructura descrita en lo siguiente puede o no estar presente, o que el caso o circunstancia descrita en lo siguiente puede ocurrir o no, y que la descripción incluye ejemplos donde una característica o estructura particular está presente y ejemplos donde la característica o estructura está ausente, o ejemplos donde el caso o circunstancia ocurre y ejemplos donde el caso o circunstancia no ocurre. "Pirofosfato" se utiliza de forma intercambiable en la presente con "difosfato" . Como se utiliza en la presente, una composición que es un compuesto "sustancialmente puro" es sustancialmente libre de uno o más compuestos adicionales, es decir, la composición contiene más de 80 % de vol . , más de 90 % de vol., más de 95 % de vol., más de 96 % de vol., más de 97 % de vol., más de 98 % de vol., más de 99 % de vol., más de 99.5 % de vol., más de 99.6 % de vol., más de 99.7 % de vol., más de 99.8 % de vol., más de 99.9 % de vol. del compuesto; o menos de 20 % de vol., menos de 10 % de vol., menos de 5 % de vol., menos de 4 % de vol., menos de 3 % de vol., menos de 2 % de vol . , menos de 1 % de vol . , menos de 0.5 % de vol . , menos de 0.1 % de vol., o menos de 0.01 % de vol. de uno o más compuestos adicionales, con base en el volumen total de la composición. En la siguiente descripción, todos los números descritos en la presente son valores aproximados, independientemente de si la palabra "aproximadamente" o "aproximado" se utiliza junto con los mismos. Pueden variar por 1 por ciento, 2 por ciento, 5 por ciento, o, algunas veces, 10 a 20 por ciento. Siempre que se describa un margen numérico con un límite bajo, RL y un límite alto, RU, cualquier número que caiga dentro del margen se describe específicamente. En particular, los siguientes números dentro del margen se describen específicamente: R=RL+k* (RU-RL) , en donde k es una variable en un margen de 1 por ciento a 100 por ciento con un incremento de 1 por ciento, es decir, k es 1 por ciento, 2 por ciento, 3 por ciento, 4 por ciento, 5 por ciento, ... , 50 por ciento, 51 por ciento, 52 por ciento, ... , 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento, 99 por ciento, o 100 por ciento. Además, cualquier margen numérico definido por dos números R como se define en lo anterior también se describe específicamente. Además de las definiciones en lo anterior,- ciertos compuestos descritos en la presente tienen uno o más enlaces dobles que pueden existir como ya sea el isómero Z o E. La invención en ciertas modalidades abarca estos compuestos como isómeros individuales en una forma sustancialmente pura, así como mezclas de varios isómeros, por ejemplo, mezclas racémicas de estereoisómeros .
Aparato para Elaborar Compuestos Bio-orgánicos La presente invención proporciona varios sistemas de producción para elaborar compuestos bio-orgánicos . En algunas modalidades, los compuestos bio-orgánicos se pueden producir utilizando procesos de fermentación por lotes, continuos, por lotes alimentados o semi-continuos . La fermentación por lotes puede ser un sistema cerrado donde la composición del medio se fija al comienzo de la fermentación y no se somete a alteraciones artificiales durante la fermentación. Asi, al comienzo de la fermentación, el medio se hace inocular con el organismo u organismos deseados y se permite que ocurra la fermentación sin agregar nada al sistema. En algunas modalidades, sin embargo, la fermentación "por lotes" es por lotes con respecto a la adición de una fuente de carbono y a menudo se intenta controlar factores tales como concentración de pH y oxígeno. En los sistemas por lotes, las composiciones de metabolito y biomasa del sistema pueden cambiar constantemente hasta que la fermentación se detiene. Dentro de los cultivos por lotes, las células pueden moderar a través de una fase estática retrasada a una fase logarítmica de alto crecimiento y finalmente a una fase detenida donde el índice de crecimiento disminuye o se detiene. Si no se tratan, las células en la fase detenida morirán con el tiempo. Las células en la fase logarítmica generalmente son responsables por el volumen de producción del producto final o intermediario. Una variación en el sistema por lotes normal es el sistema por lotes alimentados. Los procesos de fermentación por lotes alimentados también son adecuados en la presente invención y comprenden un sistema por lotes típico con la excepción que se agrega una fuente adicional de carbono o sustrato en incrementos conforme progresa la fermentación. Los sistemas de alimentación por lotes alimentados son útiles cuando la represión por catabolitos es apta para inhibir el metabolismo de las células y donde es deseable tener cantidades de sustrato limitadas en el medio. La medición de la concentración real de sustrato en sistemas por lotes alimentados es difícil y, por lo tanto, se estima con base en los cambios de factores cuantificables tales como pH, oxígeno disuelto y la presión parcial de gases residuales tales como C02. La fermentación continua es un sistema abierto donde se agrega continuamente un medio de fermentación definido a uno o más bio-reactores que pueden estar en serie y se remueve una cantidad equivalente de medio condicionado de manera simultánea a partir del sistema para procesamiento adicional. La fermentación continua generalmente mantiene los cultivos a una alta densidad constante, donde las células están, en primer lugar, en fase logarítmica de crecimiento. La fermentación continua permite la modulación de un factor o cualquier número de factores que afectan el crecimiento celular o concentración del producto final. Por ejemplo, un método mantendrá un nutriente limitante tal como la fuente de carbono o nivel de nitrógeno a un índice fijo y permitirá que se moderen todos los otros parámetros. En otros sistemas, un número de factores que afectan el crecimiento pueden alterarse continuamente mientras que la concentración celular se mantiene constante. Los sistemas continuos luchan para mantener las condiciones de crecimiento en un estado constante y, así, la pérdida celular que se debe a la extracción del medio debe balancearse contra el índice de crecimiento celular en la fermentación. Por consiguiente, en algunas modalidades de la invención, se proporciona un sistema de producción bio-orgánica que comprende: a. por lo menos un recipiente que tiene una capacidad de por lo menos 100 litros; b. un medio acuoso, dentro de por lo menos un recipiente, que comprende una primera fase; c. una pluralidad de células huésped, dentro del medio acuoso, capaces de hacer, producir o sintetizar por lo menos un compuesto bio-orgánico; y, d. una segunda fase orgánica líquida que comprende por lo menos un compuesto bio-orgánico en contacto con la primera fase.
Un recipiente adecuado para su uso en la presente invención puede ser cualquier recipiente para contener las células huésped y medio acuoso para fermentación. Por ejemplo, el recipiente puede ser un tanque para un reactor o termentador o puede ser una parte de una centrifugadora que puede separar materiales más pesados a partir de materiales más ligeros en pasos subsiguientes de procesamiento. Alternativamente, uno o una pluralidad de recipientes puede utilizarse en un proceso continuo o semi-continuo . Un ejemplo ilustrativo general de un recipiente 100 adecuado se muestra en la Figura 1. El recipiente 100 incluye: un puerto 120 de entrada para la adición de células huésped, un medio de fermentación, y otros compuestos, nutrientes o composiciones para ayudar, regular o mejorar la fermentación de las células huésped, producción del compuesto o compuestos bio-orgánicos , y desempeño de pasos adicionales de producción dentro del recipiente; un puerto 130 de salida para remover los materiales durante o al final del proceso de fermentación, y una salida 140 de gas para ventilar gases de combustión tales como dióxido de carbono que se produce durante o después del proceso de fermentación. El recipiente 100 puede llenarse por completo con células huésped, un medio de fermentación y otros materiales de modo que no quede espacio para gas en la parte superior del recipiente. Alternativamente, el recipiente 100 puede llenarse de manera parcial para así dejar espacio vacío ocupado por un gas. La cantidad, presión y composición del gas en el espacio vacío puede controlarse para optimizar o maximizar el crecimiento de las células huésped y producción del compuesto bio-orgánico o compuestos bio-orgánicos . Por ejemplo, típicamente durante la fermentación de células huésped aeróbicas, el gas puede comprender aire u otros gases que contienen oxígeno a varias presiones por encima, o por debajo de la presión atmosférica, por ejemplo, para células huésped microaerófilas y anaeróbicas, la concentración de oxígeno del gas puede controlarse dentro un margen más bajo que la concentración atmosférica mientras que aún está por encima de cero durante la fermentación para células huésped anaeróbicas, típicamente, el gas tiene poco o ningún oxígeno y puede comprender nitrógeno de manera casi completa o completa u otro gas adecuado. En un sistema cerrado, el puerto 120 de entrada, el puerto 130 de salida y la salida 140 de gas del recipiente 100 que se muestra en la Figura 1 pueden estar cerrados o bajo presión positiva durante el proceso de fermentación. Alternativamente, en particular cuando se utilizan células huésped aeróbicas, el recipiente 100 puede utilizarse como un sistema abierto por medio del cual uno o más de los puertos y salida están abiertos a la atmósfera, lo que provee un sistema para transferencia de masas gaseosas/líquidas (aire u oxígeno dentro y dióxido de carbono fuera) . Si se desea, la salida 140 de gas puede funcionar ya sea como una salida de gas y como una entrada de gas, donde puede introducirse oxígeno o aire u otros gases dentro del sistema. En algunas modalidades, el recipiente 100 incluye entradas de gas separadas y salidas de gas separadas. En tales sistemas abiertos, puede incluirse hardware adicional sobre el recipiente para prevenir la contaminación o infiltración de otros organismos u otros materiales dentro del recipiente durante la fermentación. Otra modalidad con recipiente se ilustra en la Figura 2. Además del puerto 220 de entrada, puerto 230 de salida, entrada 235 de gas, y salida 240 de gas similares al recipiente en la Figura 1, el recipiente 200 de la Figura 2 incluye un agitador 250 para mezclar. En algunas modalidades, el agitador 250 puede comprender un árbol 252 accionado por motor que puede incluir un sello 251 de árbol y está conectado a uno o más impulsores 254. Típicamente, el agitador 250 puede fijarse a la parte superior o inferior del recipiente 200. Opcionalmente , cada impulsor 254 puede terminar con una o más canaletas 256. Los impulsores 254 pueden tener cualquier forma adecuada y pueden seleccionarse de manera específica para controlar la cantidad de mezcla, el índice de crecimiento de las células huésped, el índice de producción del compuesto bio-orgánico, índice de esfuerzo cortante y oxígeno u otros índices de transferencia de gases. Adicionalmente , pueden agregarse al recipiente 200 uno o más deflectores 258 para mejorar la mezcla aún más. En otra modalidad, la agitación puede proporcionarse para formar una línea de reciclaje con una bomba que succiona material a partir de una porción del recipiente tal como la parte inferior y reintroduce el material dentro del recipiente a otra porción del recipiente tal como la parte superior. La agitación dentro el recipiente de las células huésped y el medio de fermentación ayudan a asegurar que las células huésped se expongan a nutrientes adecuados para permitirles crecer y producir los compuestos bio-orgánicos . Si el proceso de fermentación es un proceso aeróbico, oxígeno o aire puede hacerse burbujear a través de un tubo 260 burbujeador para una transferencia mejorada de masas gaseosas/líquidas . El tubo 260 burbujeador puede incluir una o más salidas de gas (no mostradas) que se sumergen dentro del medio de fermentación, preferiblemente en o cerca de la parte inferior del recipiente. En algunas modalidades, el tubo 260 burbujeador puede ser un anillo rociador que tiene múltiples salidas de gas dispuestas en una configuración generalmente circular o redonda.
Alternativamente, para organismos sensibles al esfuerzo cortante o para reducir la producción de espuma, puede proporcionarse aireación pasiva del recipiente, tal como la utilización de varias rejillas de aireación, membranas, fibras u otros dispositivos de aeración pasiva o al remover una porción del medio a partir del recipiente, oxigenarlo y regresarlo al recipiente. Si se desea controlar la temperatura, entonces puede utilizarse un calentador o intercambiador de calor para calentar o enfriar la reacción de fermentación. En una modalidad, la temperatura puede controlarse utilizando una cubierta 270 calentadora/enfriadora alrededor y/o fijada a por lo menos una porción del recipiente 200 que puede estar conectada a un intercambiador de calor (no mostrado) que distribuye fluido de intercambio de calor de temperatura controlada a través de la cubierta 270. Alternativamente, un calentador, o intercambiador de calor puede sumergirse en el medio de fermentación. Ejemplos ilustrativos de este tipo de calentador o intercambiador de calor incluyen un calentador de inmersión eléctrico, intercambiador de calor con tubo de inmersión enrollado o lineal que lleva un fluido de intercambio de calor tal como agua o aceite calientes, y uno o más tubos burbuj eadores que inyectan un flujo caliente tal como aire y/o agua dentro del medio de fermentación. Alternativa o adicionalmente, un calentador o intercambiador de calor puede fijarse al exterior del recipiente. Tales calentadores e intercambiadores de calor incluyen cinta calefactora eléctrica sobre las paredes laterales exteriores del recipiente y lineas de reciclaje calientes o cubiertas fijadas al recipiente. El recipiente 200 puede incluir puertos adicionales de entrada y salida. En algunas modalidades, los puertos adicionales de entrada y salida pueden ubicarse sobre la parte superior, a los lados o en la parte inferior del recipiente 200. En algunas modalidades, los puertos adicionales de entrada incluyen líneas de suministro para la adición de oxígeno u otros gases, nutrientes, espuma y agentes controladores de pH durante la reacción de fermentación. Cualquiera de los puertos de entrada y salida puede incluir mecanismos de esterilización para múltiples usos, incluyendo sus usos en el proceso, y conexión o reconexión múltiple durante el proceso de fermentación. Además, uno o más puertos 280 de detección y/o válvulas 290 de muestreo pueden ubicarse en varios lugares sobre el recipiente 200 para ayudar a monitorear parámetros críticos tales como concentraciones de varios productos y metabolitos, pH, nivel de líquidos, presión, espuma, concentración de oxígeno disuelto, temperatura, índice de agitación, poder, voltaje, posiciones de las válvula y densidad celular durante el proceso de fermentación. Debe entenderse que los recipientes en las Figuras 1 y 2 son para propósitos ilustrativos y que puede utilizarse muchas configuraciones diferentes de recipiente para el proceso de fermentación, por ejemplo, de acuerdo con el tipo de célula huésped, el compuesto o compuestos bio-orgánicos que se producen, el volumen de producción, el tipo de proceso de fermentación, el tipo de procesamiento corriente abajo, el proceso de separación y otras consideraciones. Un recipiente tal como el que se muestra en la Figura 2 es adecuado para su uso en procesos de fermentación por lotes. Si se desea un proceso de fermentación continuo o semi-continuo (contrariamente a un proceso de fermentación por lotes) donde los materiales se agregan constantemente a o se retiran del recipiente, típicamente el recipiente incluye puertos adicionales de entrada y salida que pueden estar ubicados sobre la parte superior, inferior o sobre los lados del recipiente. Estos puertos adicionales de entrada y salida facilitan el flujo de materiales dentro y fuera del recipiente. En algunas modalidades, uno o más recipientes reciben células huésped continuamente, medio de fermentación, y aditivos opcionales mientras descargan células huésped de manera continua, productos derivados, y/o compuestos bio-orgánicos de los recipientes. En estas modalidades, la descarga de un recipiente puede utilizarse como la materia prima para otro recipiente que opcionalmente recibe también células huésped nuevas, un medio de fermentación, nutrientes, y/u otros aditivos. Un solo recipiente o una serie de recipientes juntos pueden configurarse para proporcionar el tiempo de residencia promedio deseado para las células huésped. Una porción de la descarga de uno de los recipientes corriente abajo puede regresarse a uno o más recipientes corriente arriba para reciclar la descarga a un nivel de procesamiento previo, o pueden reintroducirse otros materiales a partir de más pasos de procesamiento corriente abajo dentro de los recipientes. Los recipientes utilizados en algunas modalidades de la presente invención incluyen hardware adicional que puede fijarse al recipiente para facilitar el procesamiento. Tal hardware puede incluir hardware adicional para facilitar el procesamiento de limpieza in situ y esterilización in situ. En algunas modalidades, uno, algunos o cada uno de los puertos, salidas, entradas, válvulas y todo el hardware dentro del recipiente puede esterilizarse in situ. En algunas modalidades, la esterilización puede ocurrir utilizando esterilización por vapor. Por ejemplo, cualquiera de los puertos, salidas o válvulas de muestreo pueden incluir o tener hardware adicional fijado a ellos que proporciona suministro de vapor y retorno de condensado al puerto, salida o válvula de modo que pueda esterilizarse por vapor antes de la utilización o reutilización. El recipiente o recipientes pueden tener una capacidad de por lo menos 100 litros. En algunas modalidades, el recipiente tiene una capacidad desde 100 hasta 3,000,000 litros, tal como un recipiente de por lo menos 1000 litros, por lo menos 5,000 litros, por lo menos 10,000 litros, por lo menos 25,000 litros, por lo menos 50,000 litros, por lo menos 75,000 litros, por lo menos 100,000 litros, por lo menos 250,000 litros, por lo menos 500,000 litros o por lo menos 1,000,000 litros. El recipiente o recipientes pueden incluir o tener fijados a ellos sensores y detectores para medir varios parámetros tales como presión, pH, concentración de oxígeno disuelto, temperatura, índices de flujo de gases, índices de flujo de líquidos, nivel de líquidos, posiciones de las válvulas, producción de espuma, agitación, poder, voltaje y cualquier otro parámetro útil para controlar u optimizar el crecimiento de las células huésped y la producción del compuesto o compuestos bio-orgánicos . Los sensores y detectores pueden alimentar información a uno o más sistemas automatizados para controlar y registrar los diversos parámetros medidos y para ajustar cualquiera de los diversos parámetros al controlar los índices de flujo de aire, poder, calentamiento o enfriamiento para controlar la temperatura del recipiente, rpms de agitación, bombas, esterilización o limpieza in situ del recipiente o cualquier entrada, salida, adición, válvulas de muestreo u otros puertos, control del flujo de salida o cualquier otro mecanismo relevante para controlar un parámetro o parámetros de la fermentación. Tales ajustes pueden ocurrir utilizando cualquier mecanismo de control conocido, tales como por ejemplo, control o activación de varias válvulas, bombas o motores y puede utilizar sistemas de control proporcional, proporcional integral o proporcional integral derivativo. Adicionalmente , el sistema o sistemas automatizados pueden controlarse y monitorearse mediante un sistema de control central, que puede ser un amplio sistema de control local o de planta y puede controlar la producción de sólo un proceso de producción de compuestos bio-org nicos o múltiples procesos de producción de compuestos bio-orgánicos. El sistema o sistemas automatizados y sistema de control central pueden comprender cualquier software adecuado, firmware y/o hardware, que pueden ser de propiedad exclusiva o ser comerciales o una combinación de los mismos y pueden comunicarse utilizando cualquier sistema de comunicación adecuado. Ejemplos no limitantes de tales sistemas de comunicación incluyen sistemas de cableado que pueden ser digitales o análogos, y pueden incluir conexión directa o estar en la forma de una red tal como una LAN o una WAN o eternet. Además, en algunas modalidades, el sistema de comunicación puede ser inalámbrico y puede tener ser de propiedad exclusiva, BLUETOOTH, banda ultra ancha, 802.11 a,b,g o n o ZigBee, incluyendo TD A, FDMA, OFDM, y CDMA y pueden funcionar en cualquier banda de frecuencia adecuada tal como 2.4 GHz o 5.8 GHz . Cualquiera de los recipientes utilizados en la producción de los compuestos bio-orgánicos puede incluir hardware adicional, tal como agitadores adicionales, puertos de entrada adicionales, puertos de salida, puertos de muestreo, equipo calentador/enfriador adicional, tal como rollos calefactores adicionales, equipo de aireación adicional tal como tubos burbuj eadores adicionales, sensores y detectores adicionales, equipo de limpieza o esterilización adicional para facilitar el procesamiento o cualquier otro parámetro de la fermentación. En algunas modalidades de la invención, se proporciona un sistema de producción de isoprenoides que comprende : a. por lo menos un recipiente que tiene una capacidad de por lo menos 100 litros; b. un medio acuoso, dentro de por lo menos un recipiente, que comprende una primera fase; c. una pluralidad de células huésped, dentro del medio acuoso, capaces de hacer, producir o sintetizar uno o más compuestos isoprenoides; y, d. una segunda fase orgánica líquida que comprende uno o más compuestos isoprenoides en contacto con la primera fase . En algunas modalidades, el compuesto o compuestos isoprenoides es un isoprenoide de 5 átomos de carbono. Estos compuestos se derivan a partir de una unidad isoprenoide y se denominan también hemiterpenos . Un ejemplo ilustrativo de un hemiterpeno es isopreno. En otras modalidades, el compuesto o compuestos isoprenoides son un isoprenoide de 10 átomos de carbono. Estos compuestos se derivan a partir de dos unidades isopreno y se denominan también monoterpenos . Un ejemplo ilustrativo de un monoterpeno es mirceno. En otras modalidades, el compuesto o compuestos isoprenoides son un isoprenoide de 15 átomos de carbono. Estos compuestos se derivan a partir de tres unidades isopreno y se denominan también sesquiterpenos . Un ejemplo ilustrativo de un sesquiterpeno es pachulol (que también se conoce como alcohol de pachuli) . En otras modalidades, el compuesto o compuestos isoprenoides son un isoprenoide de 20 átomos de carbono. Estos compuestos se derivan a partir de cuatro unidades isopreno y también se denominan diterpenos. Un ejemplo ilustrativo de un diterpeno es taxadieno. En aún otros ejemplos, el compuesto o compuestos isoprenoides son un isoprenoide de 20+ átomos de carbono. Estos compuestos se derivan a partir de más de cuatro unidades isopreno e incluyen: triterpenos (compuestos isoprenoides de 30 átomos de carbono derivados a partir de 6 unidades isopreno) tales como esqualeno; tetraterpenos (compuestos isoprenoides de 40 átomos de carbono derivados a partir de 8 isoprenoides) tales como ß-caroteno; y politerpenos (compuestos isoprenoides de 40+ átomos de carbono derivados a partir de más de 8 unidades isopreno) tales como poliisopreno . En algunas modalidades, el compuesto o compuestos isoprenoides pueden ser cualquier combinación de dos o más compuestos isoprenoides. En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para producir por lo menos un compuesto bio-orgánico que comprende: a. cultivar en un medio acuoso una pluralidad de células huésped que producen, hacen o sintetizan por lo menos un compuesto bio-orgánico, en donde el medio acuoso comprende una primera fase ; b. formar una segunda fase orgánica líquida que comprende por lo menos un compuesto bio-orgánico en contacto con la primera fase; c. separar por lo menos una porción de la segunda fase a partir de la primera fase; y, d. aislar por lo menos un compuesto bio-orgánico a partir de la segunda fase. El sistema de producción de isoprenoides puede incluir uno o más componentes adicionales de procesamiento incluyendo: 1) uno o más sistemas de separación para separar por lo menos un compuesto bio-orgánico a partir del medio acuoso y la segunda fase orgánica; 2) uno o más reactores para alterar biológica o químicamente por lo menos un compuesto bio-orgánico tal como mediante adición, sustitución, hidrogenación, alquilación, hidroxilación, condensación, halogenación o cualquier otra reacción adecuada; 2) uno o más recipientes para mezclar o sistemas para mezclar por lo menos un compuesto bio-orgánico con uno o más componentes adicionales; 3) y uno o más sistemas de purificación o separación adicionales para purificar aún más la composición bio-orgánica o por lo menos un compuesto bio-orgánico . La segunda fase puede comprender por lo menos un compuesto bio-orgánico. El compuesto bio-orgánico puede formar una porción, casi toda, o sustancialmente toda la segunda fase. En ciertas modalidades, el compuesto bio-orgánico forma 1% a 99%, tal como 5% a 95%, 10% a 90%, 20% a 80%, 25% a 75%, 35% a 65%, o 40% a 50% de la segunda fase. En ciertas modalidades, la segunda fase consiste esencialmente del compuesto bio-orgánico. En algunas modalidades, la pluralidad de células huésped incluye más de uno tipo de célula huésped, tales como más de una especie o cepa de células huésped, por ejemplo, 2-5 especies o cepas de células huésped, por ejemplo 2, 3, 4 ó 5 especies o cepas de células huésped. En algunas modalidades, la pluralidad de células huésped puede producir más de un compuesto bio-orgánico, tal como 2-5 compuestos bio-orgánicos , por ejemplo 2, 3, 4, o 5 compuestos bio- orgánicos . El compuesto o compuestos bio-orgánicos pueden aislarse de la primera fase y/o segunda fase utilizando cualquier método de separación adecuado. En algunas modalidades, el compuesto bio-orgánico se aisla de la segunda fase de modo que es sustancialmente puro. En algunas modalidades, la segunda fase orgánica ocurre espontáneamente como resultado de interacciones químicas y moleculares tales como diferencias en solubilidad, o hidrofobicidad, densidad, concentración o cualquier otro mecanismo de separación de fase espontánea. En otras modalidades, la separación de la primera y segunda fase se induce en un recipiente o recipientes o sistema de separación que puede ser el mismo recipiente o recipientes o sistema de procesamiento o uno distinto del recipiente o recipientes de fermentación. En algunas modalidades, se induce la separación de la fase mediante centrifugación tal como centrifugación continua o por lotes. En otras modalidades, se induce la separación de la fase mediante la introducción de un desemulsificador o un agente creador de núcleos dentro de la reacción de fermentación. Un desemulsificador previene o limita la cantidad del compuesto o compuestos bio-orgánicos que emulsifican con la fase acuosa. Ejemplos ilustrativos de desemulsificadores incluyen floculantes y coagulantes. Un agente creador de núcleos facilita la adición de pequeñas gotitas del compuesto bio-orgánico para mezclarse y, con el tiempo, forma una fase separada. Si se utilizan cantidades suficientes de un agente creador de núcleos, el agente creador de núcleos por si mismo forma una segunda fase orgánica dentro de la cual emigra el compuesto bio-orgánico. Ejemplos ilustrativos de agentes creadores de núcleos incluyen gotitas del compuesto o compuestos bio-orgánicos por sí mismos y solventes orgánicos tales como dodecano, miristato de isopropilo, y oleato de metilo. Algunas modalidades pueden incluir una combinación de uno o más de los materiales y métodos de la fase de separación descrita en lo anterior. Una vez que ocurre la separación de la fase, las fases separadas se extraen individualmente del recipiente de separación. Cualquier cantidad de la segunda fase puede separarse de la primera fase, por ejemplo, todas, una porción, 1% a 100% tales como 5% a 95%, 10% a 90%, 20% a 80%, 25% a 75%, 35% a 65%, o 40% a 50% de la segunda fase puede separarse de la primera fase. Si la segunda fase orgánica es menos densa que la primera fase acuosa, entonces uno o más grifos pueden proporcionarse o colocarse sobre el recipiente de separación cerca de la interfaz entre las dos fases (preferiblemente, dentro la segunda fase orgánica) para decantar la segunda fase orgánica antes de remover la fase acuosa más densa. Alternativamente, la primera fase acuosa puede removerse del recipiente de separación utilizando una salida cerca de la parte inferior del recipiente de separación hasta que aparezca la segunda fase orgánica. En este punto, la segunda fase orgánica puede transferirse dentro de una ubicación separada para procesamiento o almacenamiento adicional. Tanto la primera fase acuosa como la segunda fase orgánica pueden fluir fuera del recipiente de separación bajo la fuerza de gravedad, presión de gas o a través de la utilización de una bomba o bombas o una combinación de las mismas. Si la segunda fase " orgánica es más densa que la primera fase acuosa, entonces uno o más grifos pueden proporcionarse o colocarse sobre el recipiente de separación cerca de la interfaz entre las dos fases (preferiblemente, dentro la segunda fase orgánica) para decantar la primera fase acuosa antes de remover la segunda fase orgánica más densa. Alternativamente, la segunda fase orgánica puede removerse del recipiente de separación utilizando una salida cerca de la parte inferior del recipiente de separación. Para un proceso continuo en el que la primera fase acuosa es más densa que la segunda fase orgánica, un recipiente de separación con uno o más grifos puede contener un volumen específico del medio de fermentación y células huésped, y la segunda fase orgánica que se produce continuamente puede decantarse a través de los grifos para almacenamiento o procesamiento adicional. Si la segunda fase orgánica es más densa que la primera fase acuosa, la segunda fase orgánica puede removerse continuamente de la parte inferior del recipiente de separación a un índice que previene la reducción drástica completa de la segunda fase orgánica del recipiente de separación para evitar la extracción de la primera fase acuosa. En algunas modalidades, el compuesto bio-orgánico puede aislarse de la segunda fase orgánica utilizando adsorción, un proceso en el cual las moléculas se mueven a partir de un líquido sin envasar sobre la superficie de adsorbentes. Ejemplos ilustrativos de adsorbentes incluyen carbono activado; aluminas; aluminosilicatos tales como zeolitas; arcillas tales como tierra de batán; tamices moleculares; polímeros orgánicos tales como poliestireno y resinas; y sílices tales como gel de sílice. Dependiendo del adsorbente utilizado, el adsorbente puede utilizarse para capturar el producto bio-orgánico deseado o productos derivados no deseados. El aislamiento mediante adsorción puede realizarse utilizando un proceso por lotes, continuo o semi-continuo . En otras modalidades, el compuesto bio-orgánico puede aislarse de la segunda fase orgánica utilizando destilación, un método de separación de sustancias con base en las diferencias en sus volatilidades. En la destilación por lotes, un lote entero de líquido se carga inicialmente en un recipiente y entonces se calienta o se reduce en presión dentro del recipiente. Así, el vapor se genera continuamente y puede condensarse para formar un destilado líquido el cual se recolecta. En la destilación de equilibrio continuo, un suministro de líquido que fluye continuamente se calienta o se reduce en presión para causar vaporización parcial de la mezcla y la recuperación separada de componentes de liquido y vapor. El líquido y vapor se desacoplan al fluir a través de una columna de destilación, y los productos emergen como corrientes de vapor y de líquido. Cuando el vapor y el líquido se acercan al equilibrio de la fase, se le denomina un proceso intermitente. Si se desea, el producto de vapor puede condensarse para formar un destilado líquido. En otras modalidades, el compuesto o compuestos bio-orgánicos se aislan de la segunda fase orgánica utilizando extracción de gases y líquidos. Este proceso se conoce también como disolución y es la transferencia de un componente disuelto en una corriente de líquido dentro de un corriente de vapor en una forma más concentrada. La temperatura y presión puede optimizarse para la transferencia del compuesto bio-orgánico deseado. Ejemplos ilustrativos de corrientes de vapor incluyen aire y vapor. Típicamente, la corriente de líquido fluye hacia abajo de la columna mientras que la corriente de vapor se hace burbujear hacia arriba (fluyendo en contracorriente con respecto a la corriente de líquido) . En otras modalidades, el compuesto bio-orgánico se aisla de la segunda fase orgánica utilizando extracción de líquido- líquido . También conocida como extracción de solventes, la extracción de líquido- líquido es la transferencia de una sustancia a partir de una fase líquida dentro de otra fase líquida inmiscible. En un sistema de extracción de líquido- líquido por lotes, el líquido alimentado (la segunda fase orgánica) se mezcla con una segunda fase líquida inmiscible en un recipiente adecuado. Se permite entonces que la mezcla se asiente en capas y se separe en extractos y se refine y la capa más ligera puede decantarse del recipiente. El compuesto o compuestos bio-orgánicos deseados pueden estar en el extracto o refinarse dependiendo del producto y solvente utilizados . En un sistema continuo de extracción de líquido-líquido, se utilizan las diferencias en densidad, presión de vapor a una temperatura determinada, o puntos de ebullición para separar el producto bio-orgánico deseado del líquido alimentado (la fase orgánica) . Tales sistemas pueden utilizar tanques para mezcla/asentamiento, torres o columnas, centrifugadoras y combinaciones de las mismas para efectuar la separación.
En otras modalidades, el compuesto bio-orgánico se aisla de la segunda fase orgánica y/o la primera fase acuosa utilizando ultrafiltración, un proceso membranal activado por presión utilizado para separar componentes de una solución con base en el tamaño y forma molecular. Bajo una presión aplicada, la diferencia entre una membrana de ultrafiltración, solvente y especie pequeña de soluto pasan a través de la membrana y se recolectan como permeato mientras que las especies más grandes de soluto se retienen mediante la membrana y se recuperan como un retentato concentrado. La ultrafiltración involucra solutos cuyas dimensiones moleculares son diez o más veces más grandes que los del solvente y, usualmente, tienen un tamaño de por debajo de ½ miera. Los solutos o los materiales que se van a separar usualmente tienen pesos moleculares mayores de 500 amu, tales como macromoléculas , dispersiones coloidales, y emulsiones. Un ejemplo no limitante de un sistema de ultrafiltración es un sistema de ultrafiltración de flujo tangencial. En algunas modalidades, las células huésped son capaces de producir de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 gramos, más de aproximadamente 15 gramos, más de aproximadamente 20 gramos, más de aproximadamente 25 gramos o más de aproximadamente 30 gramos de compuesto bio-orgánico por litro del medio de fermentación. En algunas modalidades, las células huésped son capaces de producir de aproximadamente 50 a aproximadamente 1500 miligramos, tal como más de aproximadamente 100 miligramos, más de aproximadamente 150 miligramos, más de aproximadamente 200 miligramos, más de aproximadamente 250 miligramos, más de aproximadamente 500 miligramos, más de aproximadamente 750 miligramos o más de aproximadamente 1000 miligramos de compuesto bio-orgánico por gramo de peso seco celular .
Sistema de Producción de Composición de Combustible En algunas modalidades, la invención comprende un sistema de producción de composición de combustible que comprende : a. por lo menos un recipiente que tiene una capacidad de por lo menos 100 litros; b. un medio acuoso, dentro del recipiente, que comprende una primera fase; c. una pluralidad de células huésped, dentro del medio acuoso, capaces de hacer, producir o sintetizar por lo menos un compuesto bio-orgánico; y, d. una segunda fase orgánica líquida que comprende por lo menos un compuesto bio-orgánico en contacto con la primera fase. El sistema de producción de composición de combustible puede incluir uno o más componentes de procesamiento adicionales, incluyendo: 1) uno o más sistemas de separación para separar por lo menos un compuesto bio-orgánico del medio acuoso y la segunda fase orgánica; 2) uno o más reactores para alterar biológica o químicamente por lo menos un compuesto bio-orgánico tal como mediante adición, sustitución, hidrogenación, alquilación, hidroxilación, condensación, halogenación o cualquier otra reacción adecuada; 2) uno o más recipientes para mezclar o sistemas para mezclar por lo menos un compuesto bio-orgánico con uno o más componentes de combustible adicionales tales como un combustible a base de petróleo, un aditivo de combustible o una combinación de los mismos; y, 3) uno o más sistemas de purificación o separación adicionales para purificar aún más la composición de combustible o por lo menos un compuesto bio-orgánico. En algunas modalidades, el aditivo de combustible se selecciona del grupo que consiste de oxigenados, antioxidantes, protectores ambientales, mej oradores de la estabilidad térmica, mejoradores de cetano, estabilizadores, mejoradores de flujo frío, mejoradores de combustión, antiespumantes , aditivos antiniebla, inhibidores de corrosión, mejoradores de lubricidad, mejoradores de congelación, aditivos para la limpieza de inyectores, supresores de humo, aditivos reductores de resistencia, desactivadores de metales, dispersantes, detergentes, desemulsificadores , tinturas, marcadores, disipadores estáticos, biocidas y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el sistema de producción de composición de combustible comprende: a) uno o más sistemas de fermentación por lotes, por lotes alimentados o flujo continuo que comprende: i) por lo menos un recipiente que tiene una capacidad de por lo menos 100 litros; ii) un medio acuoso, dentro de por lo menos un recipiente, que comprende una primera fase; iii) una pluralidad de células huésped, dentro del medio acuoso, capaces de hacer, producir o sintetizar por lo menos un compuesto bio-orgánico; y, iv) una segunda fase orgánica líquida que comprende por lo menos un compuesto bio-orgánico en contacto con la primera fase; b) uno o más sistemas de separación de la primera fase, mediante los cuales se separan la primera fase y la segunda fase orgánica o uno o más componentes de la segunda fase orgánica; c) opcionalmente uno o más sistemas de separación de la segunda fase, mediante los cuales se separa por lo menos un compuesto bio-orgánico de la segunda fase orgánica; d) opcionalmente uno o más reactores o recipientes, en donde por lo menos un compuesto bio-orgánico se modifica química o biológicamente; e) opcionalmente uno o más sistemas de purificación por medio de los cuales se purifica o se purifica aún más el compuesto bio-orgánico o el compuesto bio-orgánico modificado; f) opcionalmente uno o más recipientes para mezclar o sistemas para mezclar por lo menos un compuesto bio-orgánico con uno o más componentes de combustible adicionales; y g) opcionalmente uno o más sistemas de purificación adicionales por medio de los cuales se purifica o se purifica aún más la mezcla de por lo menos un compuesto bio-orgánico y uno o más componentes de combustible adicionales . En algunas modalidades, uno o más sistemas de separación de la primera fase comprenden uno o más sistemas, recipientes u otros componentes de separación de fases que se detallan en la presente están configurados de manera específica para separar la primera fase de la segunda fase orgánica. En algunas modalidades, uno o más sistemas de separación de la segunda fase incluyen uno o más sistemas, recipientes o componentes de separación de las fases que se detallan en la presente están configurados de manera específica para separar el compuesto o compuestos bio-orgánicos de la segunda fase orgánica. En algunas modalidades, uno o más reactores en donde se modifica por lo menos un compuesto bio-orgánico química o biológicamente comprenden el mismo o diferente recipiente o recipientes utilizados para la fermentación o los sistemas de separación. Alternativamente, uno o más reactores pueden comprender uno o más recipientes diferentes, que pueden incluir hardware adicional, sensores, puertos, detectores, y/o sistemas de control adecuados para la reacción o reacciones específicas u otras modificaciones al compuesto o compuestos bio-orgánicos que se realizan en el mismo. Los reactores pueden ser reactores por lotes, alimentados por lotes o continuos. En algunas modalidades, los compuestos bio-orgánicos o compuestos bio-orgánicos modificados o las composiciones de combustible pueden purificarse o purificarse aún más utilizando uno o más sistemas de purificación. Los sistemas de purificación pueden comprender cualquier sistema de purificación adecuado incluyendo cualquier sistema que pueda remover compuestos no deseados del compuesto o compuestos bio-orgánicos o que pueda separar los compuestos no deseados de los compuestos bio-orgánicos. En algunas modalidades, el sistema de purificación puede comprender uno o más sistemas, recipientes o componentes de separación de las fases que se detallan en la presente que pueden configurarse manera específica para lograr la pureza deseada del compuesto o compuestos bio-orgánicos. En algunas modalidades, la purificación puede llevarse a cabo utilizando uno o más sistemas de separación en serie para lograr la pureza deseada. En algunas modalidades, los sistemas de separación pueden configurarse de manera diferente entre sí para lograr la pureza paso a paso. En algunas modalidades, la purificación se llevará a cabo para cumplir con especificaciones o requerimientos de leyes federales, estatales o locales, normas o regulaciones para los compuestos bio-orgánicos o para composiciones de combustible. En algunas modalidades, la purificación puede mejorar la funcionalidad de los compuestos bio-orgánicos o composiciones de combustible más allá de los requerimientos de las leyes federales o estatales, normas o regulaciones. En algunas modalidades, las leyes federales, estatales o locales, normas o regulaciones pueden aplicarse a emisiones ambientales, rendimiento de combustible, incentivos tributarios, y otros incentivos económicos. En algunas modalidades, la purificación puede reducir el impacto ambiental de, huella de carbono de, eficiencia de combustible obtenida a partir de, conflabilidad obtenida a partir de, energía disponible a partir de, o costo económico a largo plazo de los compuestos bio-orgánicos o composiciones de combustible . En algunas modalidades, el sistema de composición de combustible incluye uno o más recipientes para mezclar o sistemas para mezclar por lo menos un compuesto bio-orgánico con uno o más componentes de combustible adicionales. El recipiente para mezclar o sistema para mezclar puede ser cualquier recipiente o sistema adecuado. El recipiente para mezclar puede incluir cualquiera o todas las entradas, salidas, puertos, sensores, detectores, agitadores y otro hardware identificado para el recipiente de producción del compuesto bio-orgánico. El recipiente para mezclar puede mezclar uno o más componentes de combustible con el compuesto o compuestos bio-orgánicos . Por ejemplo, 2-5 componentes de combustible, tales como 3 ó 4 componentes de combustible. El sistema para mezclar puede ser por lotes, continuo o alimentado por lotes. En algunas modalidades, la invención comprende un método para hacer una composición de combustible que comprende : a. cultivar en un medio acuoso una pluralidad de células huésped que producen, hacen o sintetizan por lo menos un compuesto bio-orgánico, en donde el medio acuoso comprende una primera f se; b. formar una segunda fase orgánica líquida que comprende por lo menos un compuesto bio-orgánico en contacto con la primera fase; c. separar por lo menos una porción de la segunda fase de la primera fase; d. aislar por lo menos un compuesto bio-orgánico de la segunda fase ; e. opcionalmente modificar química o biológicamente por lo menos un compuesto bio-orgánico; f. opcionalmente purificar el compuesto bio-orgánico o el compuesto bio-orgánico modificado; g. opcionalmente mezclar por lo menos un compuesto bio-orgánico con uno o más componentes de combustible adicionales; y g) opcionalmente purificar la mezcla de uno o más compuestos bio-orgánicos y uno o más componentes de combustible adicionales. En algunas modalidades, la composición de combustible comprende una composición de biocombustible . En algunas modalidades, el biocombustible comprende además por lo menos un compuesto bio-orgánico y un combustible a base de petróleo, un aditivo de combustible o una combinación de los mismos. En modalidades adicionales, el combustible a base de petróleo es una gasolina, combustible para aeroplano, queroseno, combustible diesel o una combinación de los mismos . En algunas modalidades, el sistema de producción de compuestos bio-orgánicos o el sistema de producción de composición de combustible puede construirse o crearse al acondicionar instalaciones para la producción de etanol.
En algunas modalidades, los sistemas de producción de composición de combustible pueden comprender uno o más sistemas de control automatizado. Los sistemas de control automatizado pueden ser los mismos o diferentes de los sistemas de control para el sistema de producción bio-orgánica y pueden comprender varios sensores, detectores y otros equipos para medir y controlar los diversos parámetros del proceso asociados con cada sistema dentro del sistema de composición de combustible y cada paso o los métodos para la producción de composición de combustible. Adicionalmente , el sistema o sistemas automatizados pueden controlarse y observarse mediante un sistema de control central, que puede ser un amplio sistema de control local o de planta y puede controlar la producción de sólo un proceso de producción de compuestos bio-orgánicos o múltiples procesos de producción de compuestos bio-orgánicos. El sistema o sistemas automatizados y sistema de control central pueden comprender cualquier software, firmware y/o hardware adecuado, los cuales pueden ser de propiedad exclusiva o ser comerciales o una combinación de los mismos y pueden comunicarse utilizando cualquier sistema de comunicación adecuado. Ejemplos no limitantes de tales sistemas de comunicación incluyen sistemas de cableado que pueden ser digitales o análogos, y puede incluir conexión directa o estar en la forma de una red tal como una LAN o una WAN o eternet . Además, en algunas modalidades, el sistema de comunicación puede ser inalámbrico y puede ser de propiedad exclusiva, BLUETOOTH, banda ultra ancha, 802.11 a,b,g o n o ZigBee, incluyendo TDMA, FDMA, OFDM, y CDMA y puede funcionar en cualquier banda de frecuencia adecuada tal como 2.4 GHz o 5.8 GHz .
Células Huésped Puede utilizarse cualquier célula huésped adecuada en la práctica de la presente invención. En algunas modalidades, la célula huésped es un microorganismo huésped genéticamente modificado en el que se han insertado, suprimido o modificado moléculas de ácido nucleico (es decir, se han hecho mutar; por ejemplo, mediante inserción, supresión, sustitución, y/o inversión de nucleótidos) , para ya sea producir el compuesto bio-orgánico deseado, o efectuar un rendimiento aumentado del compuesto bio-orgánico deseado. Ejemplos ilustrativos de células huésped adecuadas incluyen cualquier célula de archae, bacteriana, o eucariótica. Ejemplos de células de archae incluyen, pero no se limita a las que pertenecen a los géneros: Aeropyrum, Archaeglobus, Halobacterium, Methanococcus, Methanobacterium, Pyrococcus, Sulfolobus, y Thermoplasma . Ejemplos ilustrativos de especie de archae incluyen pero no se limitan a: Aeropyrum pernix, Archaeoglobus fulgidus, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Pyrococcus abyssi, Pyrococcus horikoshii , Thermoplasma acidophílum, Thermoplasma volcanium. Ejemplos de células bacterianas incluyen, pero no se limita a las que pertenecen a los géneros: Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anacystis, Arthrobacter, Azobacter, Bacillus, Brevibacterium, Chromatíum, Clostridíum, Corynebacterium, Enterobacter, Erwínia, Escherichia, Lactobacillus, Lactococcus, Mesorhizobium, Methylobacterium, Microbacterium, Phormidium, Pseudomonas, Rhodobacter, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Rhodococcus, Salmonella, Scenedesmun, Serratia, Shigella, Staphylococcus, Strepromyces, Synnecoccus, y Zymomonas . Ejemplos ilustrativos de especie bacteriana incluyen pero no se limitan a: Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefacines, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium i mariophilum, Clostridíum beigerinckii , Enterobacter sakazakii , Escherichia coli, Lactococcus lactis, Mesorhizobium loti, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mevalonii , Pseudomonas púdica, Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides, Rhodospirillum rubrum, Salmonella entérica, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, y similares. En general, si se utiliza una célula huésped bacteriana, es preferible una cepa no patogénica. Ejemplos ilustrativos de especie con cepas no patogénicas incluyen pero no se limitan a: Bacillus subtilis, Escherichia coli, Lactibacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas evalonii , Pseudomonas pudi a, Rhodobacter sphaeroides, Rodobacter capsulatus, Rhodospirillum rubrum, y similares. Ejemplos de células eucarióticas incluyen pero no se limitan a células fúngica. Ejemplos de células fúngicas incluyen, pero no se limitan a aquellas que pertenecen a los géneros: Aspergillus, Candida, Chrysosporium, Cryotococcus, Fusarium, Kluyveromyces, Neotyphodium, Neurospora, Penicillium, Pichia, Saccharomyces , Trichoderma y Xanthophyllomyces (anteriormente Phaffia) . Ejemplos ilustrativos de especie eucariótica incluyen pero no se limitan a: Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Candida albicans, Chrysosporium lucknowense, Fusarium graminearum, Fusarium venenatum, Kluyveromyces lactis, Neurospora crassa, Pichia augusta, Pichia finlandica, Pichia kodamae, Pichia membranaefaciens, Pichia methanolica, Pichia opuntiae, Pichia pastoris, Pichia pijperi, Pichia quercuum, Pichia salictaria, Pichia thermotolerans, Pichia trehalophila, Pichia stipitis, Streptomyces ambofaciens, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces aureus, Saccaromyces bayanus, Saccaromyces boulardi, Saccharomyces cerevisiae, Streptomyces fungicidicus, Streptomyces griseochromogenes, Streptomyces griseus, Streptomyces lividans, Streptomyces olivogriseus, Streptomyces rameus, Streptomyces tanashiensis, Streptomyces vinaceus, Trichoderma reesei y Xanthophyllomyces dendrorhous (anteriormente Phaffia rhodozyma) . En general, si se utiliza una célula eucariótica, es preferible una cepa no patogénica. Ejemplos ilustrativos de especies con cepas no patogénicas incluyen pero no se limitan a: Fusarium graminearum, Fusarium venenatum, Pichia pastoris, Saccaromyces boulardi , y Saccaromyces cerevisiae . En algunas modalidades, las células huésped de la presente invención han sido designadas por la Administración de Alimentos y Fármacos como GRAS o Generalmente Reconocido Como Seguro. Ejemplos ilustrativos de tales cepas incluyen: Bacillus subtilis, Lactibacillus acidophilus, Lactobacillus helvetíc s, y Saccharomyces cerevisiae .
Rutas de la Ingeniería para hacer Compuestos Bio-Orgánicos Un ejemplo ilustrativo de una clase de compuestos bio-orgánicos son los isoprenoides . Estos comprenden una familia diversa de más de 40,000 productos individuales, muchos de los cuales son vitales para los organismos vivos. Los isoprenoides sirven para mantener fluidez celular, transporte de electrones, y otras funciones metabólicas. Además de su utilidad para hacer composiciones de combustible, un vasto número de isoprenoides naturales y sintéticos son útiles como productos farmacéuticos, cosméticos, perfumes, pigmentos y colorantes, fungicidas, antisépticos, nutracéuticos , e intermediarios químicos refinados. Los compuestos isoprenoides se producen en la naturaleza a través de dos rutas metabólicas diferentes que convergen en IPP y su isómero, DMAPP. En general, las eucariotas distintas de las plantas utilizan la ruta isoprenoide MEV exclusivamente para convertir acetil-CoA en IPP, que de manera subsiguiente se isomeriza a DMAPP. Las procariotas, con algunas excepciones, utilizan la ruta independiente de mevalonato o DXP para producir IPP y DMAPP de forma separada a través de un punto de ramificación. En general, las plantas utilizan la ruta MEV y DXP para la síntesis IPP. Los métodos descritos en la presente para diseñar mediante ingeniería la ruta MEV y DXP para hacer el compuesto isoprenoide deseado pueden adaptarse fácilmente para diseñar mediante ingeniería de manera similar otras rutas para hacer otros compuestos bio-org nicos .
Ruta de MEV Una representación esquemática de la ruta de MEV se describe en la Figura 3. En general, la ruta comprende seis pasos.
En el primer paso, dos moléculas de acetil-coenzima A se combinan enzimáticamente para formar acetoacetil-CoA. Una enzima conocida porque cataliza este paso es, por ejemplo, acetil-CoA tiolasa (también conocida como acetil-CoA acetiltransferasa) . Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos incluyen pero no se limitan a los siguientes números de acceso al GenBank y el organismo a partir del cual se derivaron las secuencias: (NC_000913 REGION: 2324131..2325315 ; Escherichia coli) , (D49362; Paracoccus denitrificans) , y (L20428; Saccharomyces cerevisiae) . En el segundo paso de la ruta de MEV, acetoacetil-CoA se condensa enzimáticamente con otra molécula de acetil-CoA para formar 3 -hidroxi-3 -metilglutaril-CoA (HMG-CoA) . Una enzima conocida por catalizar este paso es, por ejemplo, HMG-CoA sintasa. Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos incluyen pero no se limitan a: (NC_001145. complemento 19061..20536 ; Saccharomyces cerevisiae) , (X96617; Saccharomyces cerevisiae) , (X83882; Arabidopsis thaliana) , (AB037907; Kitasatospora griseola) , (BT007302; Homo sapiens), y (NC_002758, Locus tag SAV2546, GeneID 1122571; Staphylococcus aureus) . En el tercer paso, HMG-CoA se convierte enzimáticamente en mevalonato. Una enzima conocida por catalizar este paso es, por ejemplo, HMG-CoA reductasa. Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos incluyen pero no se limitan a: (NM_206548; Drosophila melanogaster) , (NC_002758, Locus tag SAV2545, GeneID 1122570; Staphylococcus aureus) , (NM_204485; Gallus gallus) , (AB015627; Streptomyces sp. KO 3988), (AF542543; Nicotiana attenuata) , (AB037907; Kitasatospora griseola) , (AX128213, proporcionando la secuencia que codifica un H GR truncado; Saccharomyces cerevisiae) , y (NC_001145: complemento ( 115734..118898 ; Saccharomyces cerevisiae) . En el cuarto paso, el mevalonato se fosforila enzimáticamente para formar mevalonato 5-fosfato. Una enzima conocida por catalizar este paso es, por ejemplo, mevalonato quinasa. Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos incluyen pero no se limitan a: (L77688; Arabidopsis thaliana) , y (X55875; Saccharomyces cerevisiae) . En el quinto paso, se agrega enzimáticamente un segundo grupo fosfato a mevalonato 5-fosfato para formar mevalonato 5-pirofosfato. Una enzima conocida por catalizar este paso es, por ejemplo, fosfomevalonato quinasa. Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos incluyen pero no se limitan a: (AF429385; Hevea brasiliensis) , (NM_006556; Homo sapiens), y (NC_001145. complemento 712315..713670 ; Saccharomyces cerevisiae) . En el sexto paso, mevalonato 5-pirofosfato se convierte enzimáticamente en IPP. Una enzima conocida por catalizar este paso es, por ejemplo, mevalonato pirofosfato decarboxilasa . Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos incluyen pero no se limitan a: (X97557; Saccharo yces cerevisiae) , (AF290095; Enterococcus faeciu ) , y (U49260; Homo sapiens) . Si IPP se va a convertir en DMAPP, entonces se requiere un séptimo paso. Una enzima conocida por catalizar este paso es, por ejemplo, IPP isomerasa. Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos incluyen pero no se limitan a: (NC_000913, 3031087..3031635 ; Escherichia coli) , y (AF082326; Hae atococcus pluvialis) . Si se requiere la conversión a DMAPP, una elevada expresión de IPP isomerasa asegura que la conversión de IPP en DMAPP no represente un paso que limite el índice en la ruta completa.
Ruta de DXP Una representación esquemática de la ruta de DXP se describe en la Figura 4. En general, la ruta de DXP comprende siete pasos. En el primer paso, el piruvato se condensa con 3-fosfato de D-gliceraldehído para hacer 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato. Una enzima conocida por catalizar este paso es, por ejemplo, l-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa. Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos incluyen pero no se limitan a: (AF035440; Escherichia coli), (NC_002947, locus tag PP0527; Pseudomonas putida KT2440) , (CP000026, locus tag SPA2301; Salmonella entérica Paratyphi, véase ATCC 9150), (NC_007493, locus tag RSP_0254; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1), (NC_005296, locus tag RPA0952; Rhodopseudomonas palustris CGA009) , (NC_004556, locus tag PD1293; Xylella fastidiosa Temeculal) , y (NC_003076, locus tag AT5G11380; Arabidopsis thaliana) . En el segundo paso, l-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato se convierte en 2C-metil-D-eritritol-4 - fosfato . Una enzima conocida por catalizar este paso es, por ejemplo, 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato reductoisomerasa . Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos incluyen pero no se limitan a: (AB013300; Escherichia coli) , (AF148852; Arabidopsis thaliana), (NC_002947, locus tag PP1597; Pseudomonas putida KT2440) , (AL939124, locus tag SC05694; Strepto yces coelicolor A3(2)), (NC_007493, locus tag RSP 2709; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1), y (NC 007492, locus tag Pfl_1107; Pseudomonas fluorescens PfO-1) . En el tercer paso, 2C-metil-D-eritritol-4-fosfato se convierte en 4-difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol . Una enzima conocida por catalizar este paso es, por ejemplo, 4-difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol sintasa. Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos incluyen pero no se limitan a: (AF230736; Escherichia coli), (NC_007493, locus tag RSP_2835; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1), (NC_003071, locus tag AT2G02500; Arabidopsis thaliana), y (NC_002947, locus tag PP1614; Pseudomonas putida KT2440) .
En el cuarto paso, 4-difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol se convierte en 4 -difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol-2-fosfato . Una enzima conocida por catalizar este paso es, por ejemplo, 4 -difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol quinasa. Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos incluyen pero no se limitan a: (AF216300; Escherichia coli) y (NC_007493, locus tag RSP_1779; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1) . En el quinto paso, 4 -difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol-2-fosfato se convierte en 2C-metil-D-eritritol 2, 4 -ciclodifosfato . Una enzima conocida por catalizar este paso es, por ejemplo, 2C-metil-D-eritritol 2 , 4 -ciclodifosfato sintasa. Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos incluyen pero no se limitan a: (AF230738; Escherichia coli), (NC_007493, locus tag RSP_6071; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1), y (NC_002947, locus_tag PP 1618; Pseudomonas putida KT2440) . En el sexto paso, 2C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato se convierte en l-hidroxi-2-metil-2- (E) -butenil-4 -difosfato . Una enzima conocida por catalizar este paso es, por ejemplo, l-hidroxi-2-metil-2- (E) -butenil-4-difosfato sintasa. Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos incluyen pero no se limitan a: (AY033515; Escherichia coli), (NC_002947, locus tag PP0853; Pseudomonas putida KT2440), y (NC_007493, locus tag RSP_2982; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1) . En el séptimo paso, l-hidroxi-2 -metil-2 - (E) -butenil-4 -difosfato se convierte en ya sea IPP o su isómero, D APP. Una enzima conocida por catalizar este paso es, por ejemplo, isopentil/dimetilalil difosfato sintasa. Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleotidos incluyen pero no se limitan a: (AY062212; Escherichia coli) y (NC_002947, locus tag PP0606; Pseudomonas putida KT2440) . En algunas modalidades, "acción cruzada" (o interferencia) entre los propios procesos metabólicos de la célula huésped y los procesos involucrados con la producción de IPP como se proporciona por la presente invención se minimizan o eliminan por completo. Por ejemplo, la acción cruzada se minimiza o elimina por completo cuando el microorganismo huésped depende exclusivamente de la ruta de DXP para sintetizar IPP, y se introduce una ruta de MEV para proporcionar IPP adicional . Tales organismos huésped no estarían aquipados para alterar la expresión de enzimas de la ruta de MEV o procesar los intermediarios asociados con la ruta de MEV. Los organismos que dependen exclusiva o predominantemente de la -ruta de DXP incluyen, por ejemplo, Escherichia coli. En algunas modalidades, la célula huésped produce IPP a través de la ruta de MEV, ya sea exclusivamente o en combinación con la ruta de DXP. En otras modalidades, la ruta de DXP de un huésped se deshabilita funcionalmente de modo que la célula huésped produce IPP exclusivamente a través de una ruta de MEV introducido de manera heterologa. La ruta de DXP puede deshabilitarse funcionalmente al deshabilitar la expresión de genes o al no activar la función de una o más de las enzimas que ocurren naturalmente en la ruta de DXP. En otras modalidades, la célula huésped produce IPP a través de la ruta de DXP, ya sea exclusivamente o en combinación con la Ruta de MEV. En otras modalidades, una ruta de MEV de un huésped se deshabilita funcionalmente de modo que la célula huésped produce IPP exclusivamente a través de una ruta de DXP introducida de manera heterologa. La ruta de MEV puede deshabilitarse funcionalmente al deshabilitar la expresión de genes o al no activar la función de una o más de las enzimas que ocurren naturalmente en la ruta de MEV.
Compuestos de 5 átomos de carbono Compuestos ejemplares bio-orgánicos de 5 átomos de carbono son hemiterpenos que generalmente se derivan a partir de IPP o DMAPP. Un ejemplo ilustrativo de un hemiterpeno es isopreno .
Isopreno El isopreno, cuya estructura es se encuentra en muchas plantas. El isopreno se produce a partir de IPP mediante isopreno sintasa. Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos adecuadas incluyen pero no se limitan a: (AB 198190; Populus alba) y (AJ294819; Polulus alba x Polulus trémula) .
Compuestos de 10 átomos de carbono Compuestos ejemplares bio-orgánicos de 10 átomos de carbono son monoterpenos que generalmente se derivan a partir de pirofosfato de geranilo (GPP) que a su vez se produce mediante la condensación de IPP con DMAPP. Una enzima conocida por catalizar este paso es, por ejemplo, pirofosfato de geranilo sintasa. La Figura 5 muestra esquemáticamente cómo IPP y DMAPP pueden producir GPP, que puede procesarse aún más en un monoterpeno . Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos para pirofosfato de geranilo sintasa incluyen pero no se limitan a: (AF513111; Abies granáis), (AF513112; Abies granáis), (AF513113; Abies granáis), (AY534686; Antirrhinum ajus) , (AY534687; Antirrhinum majus) , (Y17376; Arabiáopsis thaliana) , (AE016877, Locus AP 11092; Bacillus cereus; ATCC 14579), (AJ243739; Citrus sinensis) , (AY534745; Clarkia breweri) , (AY953508; Ips pini) , (DQ286930; Lycopersicon esculentum) , (AF 182828; Mentha x piperita) , (AF182827; Mentha x piperita), (MPI249453; Mentha x piperita), (PZE431697, Locus CAD24425; Paracoccus zeaxanthinifaciens) , (AY866498; Picrorhiza kurrooa) , (AY351862; Vitis vinifera) , y (AF203881, Locus AAF12843; Zy o onas mobilis) . El GPP se convierte entonces de manera subsiguiente en una variedad de compuestos de 10 átomos de carbono. Ejemplos ilustrativos de compuestos de 10 átomos de carbono incluyen pero no se limitan a: Careno careno, cuya estructura se encuentra en la resina de muchos árboles, en particular árboles de pino. El careno se produce a partir de GPP a partir de careno sintasa. Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos adecuadas incluyen pero no se limitan a: (AF461460, REGION 43..1926; Picea abies) y (AF527416, REGION: 78..1871; Salvia stenophylla) .
Geraniol El geraniol (también conocido como rodnol) , cuya estructura es es el componente principal de aceite de rosas y aceite de palmarosa. También ocurre en geranios, limones, y citronela. El geraniol se produce a partir de GPP mediante geraniol sintasa. Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos adecuadas incluyen pero no se limitan a: (AJ457070; Cinnamomum tenuipilum) , (??362553; Ocimum basilicum) , (DQ234300; cepa de Perilla frutescens 1864), (DQ234299; cepa de Perilla citriodora 1861), (DQ234298; cepa de Perilla citriodora 4935), y (DQ088667; Perilla citriodora) Linalol El linalol, cuya estructura es se encuentra en muchas flores y plantas de especias tales como semillas de cilantro. El Linalol se produce a partir de GPP mediante linalool sintasa. Ejemplos ilustrativos de una secuencia de nucleótidos adecuada incluyen pero no se limitan a: (AF497485; Arabidopsis thaliana) , (AC002294, Locus AAB71482; Arabidopsis thaliana) , (AY059757; Arabidopsis thaliana) , (NM_104793; Arabidopsis thaliana) , (AF154124; Artemisia annua) , (AF067603; Clarkia breweri) , (AF067602; Clarkia concinna) , (AF067601; Clarkia breweri) , (U58314; Clarkia breweri), (AY840091; Lycopersicon esculentum) , (DQ263741; Lavandula angustífolia) , (AY083653; Mentha citrate) , (AY693647; Ocimum basilicum) , (XM_463918; Oryza sativa), (AP004078, Locus BAD07605; Oryza sativa), (XM_463918, Locus XP_463918; Oryza sativa), (AY917193; Perilla citriodora) , (AF271259; Perilla frutescens) , (AY473623; Picea abies) , (DQ195274; Picea sitchensis) , y (AF444798; Perilla frutescens var . crispa cultivar No. 79).
Limoneno El limoneno, cuya estructura se encuentra en la cáscara de frutas cítricas y hierbabuena. El limoneno se produce a partir de GPP mediante limoneno sintasa. Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos adecuadas incluyen pero no se limitan a: (+) - limoneno sintasas (AF514287, REGION: 47..1867; Citrus limón) y (AY055214, REGION: 48..1889; Agastache rugosa) y (-)- limoneno sintasas (DQ195275, REGION: 1..1905; Picea sitchensis) , (AF006193, REGION: 73..1986; Abies granáis), y (MHC4SLSP , REGION: 29..1828; Mentha spicata) .
Mirceno El mirceno, cuya estructura es se encuentra en el aceite esencial en muchas plantas incluyendo árbol de laurel, verbena, y mircia, a partir de la cual obtiene su nombre. El mirceno se produce a partir de GPP mediante mirceno sintasa. Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos adecuadas incluyen pero no se limitan a: (U87908; Abies granáis), (AY195609; Antirrhinum majus) , (AY195608; Antirrhinum majus) , (NM_127982; Arabiáopsis thaliana TPS10), (NM_113485; Arabiáopsis thaliana ATTPS-CIN) , (NM_113483; Arabiáopsis thaliana ATTPS-CIN) , (AF271259; Perilla frutescens) , (AY473626; Picea abies), (AF369919; Picea abies), y (AJ304839; Quercus ilex) .
Ocimeno El a- y ß-ocimeno, cuyas estructuras son respectivamente se encuentran en una variedad de plantas y frutas incluyendo Ocimum basilicum y se produce a partir de GPP mediante ocimeno sintasa. Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos adecuadas incluyen pero no se limitan a: (AY195607; Antirrhinum majus) , (AY195609; Antirrhinum ajus) , (AY195608 Anti rhinum majus), (AK221024; Arabidopsis thaliana) , (NM_113485; Arabidopsis thaliana ATTPS-C1N) , (NM_113483; Arabidopsis thaliana ATTPS-CIN) , (NM_117775; Arabidopsis thaliana ATTPS03) , (NM_001036574 ; Arabidopsis thaliana ATTPS03 ) , (NM_127982; Arabidopsis thaliana TPS 10), (AB110642; Citrus unshiu Cit TSL4), y (AY575970; Lotus corniculatus var. japonicus) . a-Pineno El a-pineno, cuya estructura es se encuentra en árboles de pino y eucalipto. El a-pineno se produce a partir de GPP mediante a-pineno sintasa. Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos adecuadas incluyen pero no se limitan a: (+) -pineno sintasa (AF543530, REGION: 1..1887; Pinus taeda) , (-) a-pineno sintasa (AF543527, REGION: 32..1921; Pinus taeda), y (+)/(-) a-pineno sintasa (AGU87909, REGION: 6111892; Abies granáis). ß-Pineno El ß-pineno, cuya estructura se encuentra en árboles de pino, romero, perejil, eneldo, albahaca, y rosas. El ß-Pineno se produce a partir de GPP mediante ß-pineno sintasa. Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos adecuadas incluyen pero no se limitan a: (-)ß-???e?? sintasas (AF276072, REGION: 1..1749; Artemisia annua) y (AF514288, REGION: 26..1834; Citrus limón) .
Sabineno El sabineno, cuya estructura se encuentra en pimienta negra, semillas de zanahoria, salvia, y árboles de té. El sabineno se produce a partir de GPP mediante sabineno sintasa. Un ejemplo ilustrativo de una secuencia de nucleótidos adecuada incluye pero no se limita a AF051901, REGION: 26..1798 a partir de Salvia officinalis.
?-Terpineno El ?-terpineno, cuya estructura es un constituyente del aceite esencial a partir de frutas cítricas. Bioquímicamente, el ?-terpineno se produce a partir de GPP mediante una ?-terpineno sintasa. Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos adecuadas incluyen: (AF514286, REGION: 30..1832 a partir de Citrus limón) y (AB110640, REGIÓN 1..1803 a partir de Citrus unshiu) .
Terpinoleno El terpinoleno, cuya estructura se encuentra en la grosella negra, ciprés, guayaba, lichi, papaya, pino, y té. El terpinoleno se produce a partir de GPP mediante terpinoleno sintasa. Ejemplos ilustrativos de una secuencia de nucleótidos adecuada incluyen pero no se limitan a: (AY693650 a partir de Oscimum basilicum) y (AY906866, REGION: 10..1887 a partir de Pseudotsuga menziesii) . Compuestos de 15 átomos de carbono Compuestos bio-orgánicos ejemplares de 15 átomos de carbono son sesquiterpenos que generalmente se derivan a partir de pirofosfato de farnesilo (FPP) que a su vez se produce mediante la condensación de dos moléculas de IPP con una molécula de D APP. Una enzima conocida por catalizar este paso es, por ejemplo, farnesilo pirofosfato sintasa. La Figura 5 también muestra esquemáticamente cómo IPP y DMAPP pueden combinarse para producir FPP, que puede procesarse aún más en un sesquiterpeno . Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos para farnesilo pirofosfato sintasa incluyen pero no se limitan a: (ATU80605; Arabidopsis thaliana) , (ATHFPS2R; Arabidopsis thaliana) , (AAU36376; Artemisia annua) , (AF461050; Bos taurus) , (D00694; Escherichia coli K-12) , (AE009951, Locus AAL95523; Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum ATCC 25586), (GFFPPSGEN; Gibberella fujikuroi) , (CP000009, Locus AAW60034; Gluconobacter oxydans 621H) , (AF019892; Helianthus annuus) , (HUMFAPS; Homo sapiens), (KLPFPSQCR; Kluyveromyces lactis) , (LAU15777; Lupinus albus) , (LAU20771; Lupinus albus), (AF309508; Mus musculus) , (NCFPPSGEN; Neurospora crassa) , (PAFPS2; Parthenium argentatum), (PAFPS2 ; Parthenium argentatum) , (RATFAPS ; Rattus norvegicus) , (YSCFPP; Saccharomyces cerevisiae) , (D89104; Schizosaccharomyces pombe) , (CP000003, Locus AAT87386; Streptococcus pyogenes) , (CP000017, Locus AAZ51849; Streptococcus pyogenes) , (NC_008022, Locus YP_598856; Streptococcus pyogenes MGAS10270) , (NC_008023, Locus YP_600845; Streptococcus pyogenes MGAS2096) , (NC_008024, Locus YP_602832; Streptococcus pyogenes MGAS10750) , y (MZEFPS Zea mays) . Alternativamente, FPP puede producirse también agregando IPP a GPP. Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos que se codifican por una enzima capaz de esta reacción incluyen pero no se limitan a: (AE000657, Locus AAC06913; Aquifex aeolicus VF5 ) , (NM_202836; Arabidopsis thaliana) , (D84432, Locus BAA12575; Bacillus subtílis) , (U12678, Locus AAC28894; Bradyrhizobium japonicum USDA 110), (BACFDPS; Geobacillus stearothermophilus) , (NC_002940, Locus NP 873754; Haemophilus ducreyi 35000HP) , (L42023, Locus AAC23087; Haemophilus influenzae Rd KW20) , (J05262; Homo sapiens) , (YP 395294; Lactobacillus sakeí subsp. sakei 23K) , (NC_005823, Locus YP_000273; Leptospira interrogans serovar Copenhageni str. Fiocruz Ll-130) , (AB003187; Micrococcus luteus) , (NC_002946, Locus ??>_208768; Neisseria gonorrhoeae FA 1090), (U00090, Locus AAB91752; Rhizobium sp. NGR234), (J05091; Saccharomyces cerevisae) , (CP000031, Locus AAV93568; Silicíjacter pomeroyi DSS-3), (AE008481, Locus AAK99890; Streptococcus pneumoniae R6) , y (NC_004556, Locus NP 779706; Xylella fastidiosa Temeculal) . FPP se convierte entonces de manera subsiguiente en una variedad de compuestos de 15 átomos de carbono. Ejemplos ilustrativos de compuestos de 15 átomos de carbono incluyen, pero no se limitan a: Amorfadieno El amorfadieno, cuya estructura es es un precursor de la artemisinina la cual se produce mediante Artemisia anna. El amorfadieno se produce a partir de FPP mediante amorfadieno sintasa. Un ejemplo ilustrativo de una secuencia de nucleótidos adecuada es SEQ ID NO. 37 de la Publicación de Patente Norteamericana No. 2004/0005678. La Figura 5 muestra esquemáticamente cómo IPP y DMAPP pueden combinarse para producir FPP, que puede entonces procesarse aún más para producir amorfadieno. oc-Farneseno El a-farneseno, cuya estructura es se encuentra en varias fuentes biológicas incluyendo pero no se limita a la glándula de Dufour en hormigas y en el recubrimiento de las cáscaras manzana y pera. El a-farneseno se produce a partir de FPP mediante a-farneseno sintasa. Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos adecuadas incluyen pero no se limitan a DQ309034 a partir de Pyrus communis cultivar d'Anjou (pera; gen ñame AFS1) y AY182241 a partir de Malus domestica (manzana; gen AFS1) . Pechouus et al., Planta 219(1): 84-94 (2004). ß-Farneseno El ß-farneseno, cuya estructura es se encuentra en varias fuentes biológicas incluyendo pero no se limita a áfidos y aceites esenciales tales como los de hierbabuena. En algunas plantas tales como la papa silvestre, el ß-farneseno se sintetiza como un repelente natural para insectos. El ß-Fameseno se produce a partir de FPP mediante ß-farneseno sintasa. Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos adecuadas incluyen pero no se limitan al número de acceso en el GenBank AF024615 a partir de Mentha x piperita (hierbabuena; gen Tspall) , y AY835398 a partir de Artemisia annua. Picaud et al., Phytochemistry 66 (9) : 961-967 (2005) .
Farnesol El farnesol, cuya estructura se encuentra en varias fuentes biológicas incluyendo insectos y aceites esenciales tales como los de la cintronela, neroli, ciclamino, limoncillo, tuberosa, y rosas. El farnesol se produce a partir de FPP mediante una hidroxilasa tal como farnesol sintasa. Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos adecuadas incluyen pero no se limitan al número de acceso en el GenBank AF529266 a partir de Zea mays y YDR481 C a partir de Saccharo yces cerevisiae (gen Pho8) . Song, L., Applied Biochemistry y Biotecnología 128 : 149-158 (2006) .
Nerolidol El nerolidol, cuya estructura es también conocida como peruviol, y se encuentra en varias fuentes biológicas incluyendo aceites esenciales tales como los de neroli, jengibre, jazmín, lavanda, árbol de te, y limoncillo. El nerolidol se produce a partir de FPP mediante una hidroxilasa tal como nerolidol sintasa. Un ejemplo ilustrativo de una secuencia de nucleótidos adecuada incluye pero no se limita a AF529266 a partir de Zea mays (maize; gen tpsl) .
Pachulol pachulol, cuya estructura también conocida como alcohol de pachuli y es un constituyente del aceite esencial de Pogostemon patchouli. ?G pachulol se produce a partir de FPP mediante pachulol sintasa. Un ejemplo ilustrativo de una secuencia de nucleótidos adecuada incluye pero no se limita a AY508730 REGION: 1..1659 a partir de Pogostemon cablin.
Valenceno El Valenceno, cuya estructura es es uno de los componentes químicos principales de el aroma y sabor de las naranjas y se encuentra en las cáscaras de naranja. El valenceno se produce a partir de FPP mediante nootkatona sintasa. Ejemplos ilustrativos de una secuencia de nucleótidos adecuada incluye pero no se limita a AF441124 REGION: 1..1647 a partir de Citrus sinensis y AY917195 REGION: 1..1653 a partir de Perilla frutescens.
Compuestos de 20 átomos de carbono Compuestos bio-orgánicos ejemplares de 20 átomos de carbono son diterpenos que generalmente se derivan a partir de geranilgeraniol pirofosfato (GGPP) que a su vez se produce mediante la condensación de tres moléculas de IPP con una molécula de DMAPP. Una enzima conocida por catalizar este paso es, por ejemplo, pirofosfato de geranilgeranilo sintasa. La Figura 5 también muestra esquemáticamente cómo IPP y DMAPP pueden combinarse para producir GGPP, que puede procesarse aún más en un diterpeno, o puede procesarse aún más para producir un carotenoide. Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos para pirofosfato de geranilgeranilo sintasa incluyen pero no se limitan a: ( THGERPYRS ; Arabidopsis thaliana) , (BT005328; Arabidopsis thaliana) , (NM_119845; Arabidopsis thaliana) , (NZ_AAJM01000380, Locus ZP_00743052 ; Bacillus thuringiensis serovar israelensis, ATCC 35646 sgl563) , (CRGGPPS; Catharanthus roseus) , (NZ_AABF02000074 , Locus ZP 00144509; Fuso£»acterium nucleatum subsp. vincentii, ATCC 49256), (GFGGPPSGN; Gibberella fujikuroi), (AY371321; Ginkgo biloba) , (AB055496; Hevea brasiliensis) , (AB017971; Horno sapiens), (MCI276129; Mucor circinelloides f. lusitanicus) , (AB016044; Mus usculus) , (AABX01000298 , Locus NCU01427; Neurospora crassa) , (NCU20940; Neurospora crassa) , (NZ_AAKL01000008 , Locus ZP 00943566; Ralstonia solanacearum UW551) , (AB118238; Rattus norvegicus) , (SCU31632; Saccharomyces cerevisiae) , (AB016095; extensiones de Synechococcus ) , (SAGGPS; Sinapis alba), (SSOGDS; Sulfolobus acídocaldarius) , (NC_007759, Locus YP_461832; Syntrophus aciditrophicus SB) , y (NC_006840, Locus YP_204095; Vibrio frscheri ES 114) . Alternativamente, GGPP puede producirse también agregando IPP a FPP. Ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos que codifican una enzima capaz de esta reacción incluyen pero no se limitan a: (NM_112315; Arabidopsis thaliana) , (ERWCRTE; Pantoea agglomerans) , (D90087, Locus BAA14124; Pantoea ananatis) , (X52291, Locus CAA36538; Rhodobacter capsulatus) , (AF195122, Locus AAF24294; Rhodobacter sphaeroides) , y (NC_0043 50, Locus NP_721015; Streptococcus mutans UA159) . GGPP se convierte entonces de manera subsiguiente en una variedad de isoprenoides de 20 átomos de carbono. Ejemplos ilustrativos de compuestos de 20 átomos de carbono incluyen pero no se limitan a: Geranigeraniol El geranigeraniol , cuya estructura es es un constituyente de aceite de madera a partir de Cedrela toona y de aceite de linaza. El geranigeraniol puede hacerse, por ejemplo, al agregar a las construcciones de expresión un gen de fosfatasa después del gen para una GGPP sintasa .
Abietadieno abietadieno abarca los siguientes isómeros y se encuentra en árboles tales como Abies granáis. El abietadieno se produce mediante abietadieno sintasa. Un ejemplo ilustrativo de una secuencia de nucleótidos adecuada incluye pero no se limita a: (U50768,- Abies granáis) y (AY473621; Picea abies).
Compuestos de 20+ átomos de carbono Los compuestos bio-orgánicos de 20+ átomos de carbono también están dentro del alcance de la presente invención. Ejemplos ilustrativos de tales compuestos incluyen sesterterpenos (compuesto de 25 átomos de carbono hecho a partir de cinco unidades isopreno) , triterpenos (compuestos de 30 átomos de carbono hechos a partir de seis unidades isopreno) , y tetraterpenos (compuesto de 40 átomos de carbono hecho a partir de ocho unidades isopreno) . Estos compuestos se producen mediante la utilización de métodos similares descritos en la presente y al sustituir o agregar secuencias de nucleótidos para la sintasa o sintasas apropiadas.
Rutas de Ingeniería Aunque es para propósitos ilustrativos, la invención se ha descrito con referencia a diseñar mediante ingeniería la ruta de MEV y/o DXPs, estos métodos pueden adaptarse a rutas adecuadas diseñadas de manera similar mediante ingeniería para hacer compuestos bio-orgánicos no isoprenoides . Típicamente, estas rutas se modifican mediante ingeniería utilizando tecnología de ADN recombinante mediante la expresión de secuencias heterólogas adecuadas que codifican una o más enzimas. Los ácidos nucleótidos que son sujetos de estudio pueden expresarse mediante vectores únicos o múltiples. Los ácidos nucleicos pueden organizarse en un solo operón, o en operones separados que se colocan en uno o múltiples vectores. Donde se desee, dos vectores de expresión pueden emplearse, cada uno de los cuales contiene una o más secuencias heterólogas operablemente ligadas en un solo operón. Aunque la elección de vectores únicos o múltiples y la utilización de operones únicos o múltiples puede depender del tamaño de las secuencias heterólogas y la capacidad de los vectores, dependerá en gran medida del rendimiento global de un compuesto bio-orgánico determinado que el vector pueda proporcionar cuando se exprese en una célula huésped seleccionada. En algunos ejemplos, un sistema de expresión de dos operones proporciona un rendimiento más alto del compuesto bio-orgánico. Los vectores que son sujetos de estudio pueden permanecer episomalmente replicables, o como una parte integral del genoma de la célula huésped. Típicamente, se prefiere lo último para una propagación continua de la célula huésped. En ciertas células huésped, los ácidos nucleicos que son sujetos de estudio pueden controlarse mediante uno o más operones. En algunos ejemplos, un sistema de dos o tres operones proporciona un rendimiento más alto de un compuesto bio-orgánico en comparación con un sistema de un solo operón. Donde se desee, las secuencias de ácido nucleico objeto pueden modificarse para reflejar la preferencia de codones de una célula huésped seleccionará para efectuar una expresión más alta de tales secuencias en una célula huésped. Por ejemplo, en algunas modalidades, las secuencias de nucleótidos objeto pueden modificarse para la preferencia de codones de levadura. Véase, por ejemplo, Bennetzen y Hall (1982) J: Biol. Chem . 257(6): 3026-3031. Como otro ejemplo no limitante, la secuencia de nucleótidos se modificará en otras modalidades para preferencia de codones de E. coli. Véase, por ejemplo, Gouy y Gautier (1982) Nucleic Acids Res. 10 (22) : 7055-707 ; Eyre-Walker (1996) Mol. Biol. Evol . 13 (6) : 864-872. Véase también Nakamura et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28(1) :292. Las tablas de utilización de codones para muchos organismos están disponibles, las cuales pueden utilizarse como una referencia en el diseño de las secuencias de la presente invención. La utilización de codones predominantes de un microorganismo huésped determinado generalmente aumenta la probabilidad de traducción, y, por ende, el nivel de expresión de las secuencias deseadas. La preparación de ácidos nucleicos objeto puede llevarse a cabo mediante una variedad de técnicas recombinante y procedimientos de síntesis rutinarios. En resumen, los ácidos nucleicos objeto pueden prepararse como fragmentos genómicos de ADN, cADN, y ARN, la totalidad de los cuales puede extraerse directa o recombinantemente de una célula que se produce mediante varios procesos de amplificación, incluyendo pero no se limita a PCR y rt-PCR. La síntesis química directa de ácidos nucleicos típicamente involucra la adición secuencial de los nucleótidos de monómeros 3 ' -bloqueados y 5 ' -bloqueados en el grupo terminal 5'-hidroxilo de una creciente cadena polimérica de nucleótidos, en donde cada adición se efectúa mediante ataque nucleofílico del grupo terminal 5'-hidroxilo de la cadena creciente en la posición 3' del monómero agregado, el cual es típicamente un derivado de fósforo, tal como un fosfotriéster, fosforamidita, o similares. Tal metodología es conocida para aquellos con experiencia ordinaria en la técnica y se describe en los textos y literatura pertinentes (por ejemplo, Matteuci et al. (1980) Tet. Lett. 521:719; Patente Norteamericana No. 4,500,707 a Caruthers et al.; y Patentes Norteamericanas Nos. 5,436,327 y 5,700,637 a Southern et al.). El nivel de trascripción de un ácido nucleico en un microorganismo huésped puede incrementarse de diversas maneras. Por ejemplo, este puede lograrse al incrementar el número de copias de la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima (por ejemplo, mediante la utilización un vector de expresión de un número de copias más elevado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima, o mediante la introducción de copias adicionales de una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima dentro del i genoma del microorganismo huésped, por ejemplo, mediante recombinación mediada por recA, utilización de vectores "suicidas", recombinación utilizando recombinasa de bateriófago lambda, y/o inserción a través de elemento transposón o transposable) . Además, esta puede llevarse a cabo cambiando el orden de las regiones de codificación en el ARNm policistrónico de un operón o rompiendo un operón dentro de genes individuales, cada uno con sus propios elementos de control, o incrementando la fuerza del promotor (iniciación de la trascripción o secuencia de control de la trascripción) a la que la región de codificación de la enzima está operablemente ligadas (por ejemplo, utilizando un promotor unánime inducible por arabinosa o lactosa en un microorganismo huésped de Escherichia coli in situ de un promotor modificado inducible por lactosa, tal como el que se encuentra en los plásmidos pBluescript y pBBRIMCS) , o utilizando un promotor inducible e inducir el promotor inducible agregando un químico a un medio de crecimiento. El nivel de traducción de una secuencia de nucleótidos en un microorganismo huésped puede incrementarse de diversas maneras, incluyendo, pero no se limita a, incrementar la estabilidad del ARNm, modificar la secuencia del sitio de unión del ribosoma, modificar la distancia o secuencia entre el sitio de unión del ribosoma y el codón de inicio de la secuencia que codifica la enzima, modificar la región intercistrónica completa ubicada "corriente arriba de" o adyacente al lado 5' y el codón de inicio de la región de codificación de la enzima, estabilizar el extremo 3' de la trascripción de ARNm utilizando horquillas y secuencias especializadas, modificar la utilización de codones de la enzima, alterar la expresión de ARNt de codones raros utilizados en la biosíntesis de la enzima, y/o aumentar la estabilidad de la enzima, como, por ejemplo, a través de la mutación de su secuencia de codificación. La determinación de ARNt de codones preferidos y codones raros puede ser con base en un análisis de la secuencia de genes derivados a partir del microorganismo huésped. El vector objeto puede construirse para tener un rendimiento de un nivel deseado de números de copias de la enzima codificada. En algunas modalidades, los vectores objeto tienen un rendimiento de por lo menos 10, entre 10 a 20, entre 20-50, entre 50-100, o incluso más de 100 copias de la enzima deseada. Los plásmidos de bajo número de copias generalmente proporcionan menos de aproximadamente 20 copias del plásmido por célula; los plásmidos de medio número de copias generalmente proporcionan de aproximadamente 20 copias del plásmido por célula a aproximadamente 50 copias del plásmido por célula, o de aproximadamente 20 copias del plásmido por célula a aproximadamente 80 copias del plásmido por célula; y los plásmidos de alto número de copias generalmente proporcionan de aproximadamente 80 copias del plásmido por célula a aproximadamente 200 copias del plásmido por célula, o más. Los vectores adecuados de expresión baja de copias para Escherichia coli incluyen, pero no se limita a, pACYC184, pBeloBacll, pBR332, pBAD33, pBBRIMCS y sus derivados, pSClOl, SuperCos (cósmido) , y pWE15 (cósmido) . Los vectores adecuados de expresión media de copias para Escherichia coli incluyen, pero no se limitan a pTrc99A, pBAD24, y vectores que contienen un origen ColEl de replicación y sus derivados. Los vectores adecuados de expresión elevada de copias para Escherichia coli incluyen, pero no se limita a, vectores pUC, pBluescript, pGEM, y pTZ . Los vectores de expresión baja de copias (centroméricos) para levadura incluyen, pero no se limita a, pRS415 y pRS416 (Sikorski & Hieter (1989) Genetics 122:19-27). Los vectores de expresión elevada de copias de 2 mieras en levadura incluyen, pero no se limitan a, pRS425 y pRS426 (Christainson et al. (1992) Gene 110:119-122). Los vectores alternativos de expresión de 2 mieras incluyen variantes no seleccionables del vector de 2 mieras (Bruschi & Ludwig (1988) Curr. Genet. 15:83-90) o plásmidos intactos de 2 mieras que llevan un cassette de expresión (como se ejemplifica en la Solicitud de Patente Norteamericana 20050084972) o plásmidos de 2 mieras que llevan un marcador de selección defectuoso tal como LEU2d (Erhanrt et al. (1983) J. Bacteriol . 156 (2): 625-635) o URA3d (Okkels (1996) Annals of the New York Academy of Sciences 782(1): 202-207). Los elementos reguladores incluyen, por ejemplo, promotores y operadores que también pueden modificarse mediante ingeniería para aumentar el flujo metabólico de las rutas modificadas mediante ingeniería al aumentar la expresión de uno o más genes que desempeñan un papel significativo en la determinación del rendimiento global del compuesto bio-orgánico que se produce. Un promotor es a secuencia de nucleótidos que inicia y controla la trascripción de una secuencia de ácidos nucleicos mediante una enzima de polimerasa de ARN. Un operador es una secuencia de nucleótidos adyacente al promotor que funciona para controlar la trascripción de la secuencia de ácidos nucleicos deseada. El operador contiene un dominio unido a proteínas, donde puede unirse una proteína represora específica. En la ausencia de una proteína represora adecuada, la trascripción se inicia a través del promotor. En la presencia de una proteína represora adecuada, la proteína represora se une al operador y, así, inhibe la trascripción a partir del promotor . En algunas modalidades de la presente invención, los promotores utilizados en vectores de expresión son inducibles. En otras modalidades, los promotores utilizados en vectores de expresión son constitutivos. En algunas modalidades, una o más las secuencias de ácido nucleico están operablemente ligadas a un promotor inducible, y una u otras secuencias de ácido nucleico más están operablemente ligadas a un promotor constitutivo. Ejemplos no limitantes de promotores adecuados para su uso en células huésped procariotas incluyen un promotor de polimerasa de ARN T7 bacteriófago; un promotor de trp; un promotor de operones de lac; un promotor híbrido, por ejemplo, un promotor híbrido de lac/tac, un promotor híbrido de tac/trc, un promotor de trp/lac, un promotor de T7/lac; un promotor de trc; un promotor de tac, y similares; un promotor araBAD; promotores regulados in vivo, tales como un promotor de ssaG o un promotor relacionado (véase, por ejemplo, la Publicación de Patente Norteamericana No. 20040131637) , un promotor de pagC (Pulkkinen y Miller, J. Bacteriol. (1991) 173 (1) : 86-93 ; Alpuche-Aranda et al. (1992) Proc . Nati. Acad. Sci. EE.UU. 89 (21) : 10079-83) , un promotor nirB (Harborne et al. (1992) Mol. Micro. 6:2805-2813), y similares (véase, por ejemplo, Dunstan et al. (1999) Infect. Immun. 67:5133-5141; McKelvie et al. (2004) Vaccine 22:3243-3255; y Chatfield et al. (1992) Biotechnol. 10:888-892); un promotor de sigma70, por ejemplo, un promotor unánime de sigma70 (véase, por ejemplo, los Números de Acceso en el GenBank AX798980, AX798961, y AX798183); un promotor de fase detenida, por ejemplo, un promotor de dps, un promotor de spv, y similares; un promotor derivado a partir de la isla de patogenicidad SPI-2 (véase, por ejemplo, W096/17951) ; un promotor de actA (véase, por ejemplo, Shetron-Rama et al. (2002) Infect.
Immun. 70:1087-1096); un promotor de rpsM (véase, por ejemplo, Valdivia y Falkow (1996) Mol. Microbiol . 22:367 378); un promotor de tet (véase, por ejemplo, Hillen et al. (1989) In Saenger W. y Heinemann U. (eds) Topics in Molecular and Structural Biology, Protein-Nucleic Acid Interaction. Macmillan, London, Reino Unido, Vol. 10, pp. 143-162); un promotor de SP6 (véase, por ejemplo, Melton et al. (1984) Nucí. Acids Res. 12:7035-7056); y similares. En algunas modalidades, la actividad total de una enzima heterologa que desempeña un papel más importante en el rendimiento global de un compuesto bio-orgánico en relación con otras enzimas en las rutas respectivas se aumenta expresando la enzima a partir de un promotor fuerte. Los promotores fuertes adecuados para Escherichia coli incluyen, pero no se limita a Trc, Tac, T5, T7, y PLambda- En otra modalidad de la presente invención, la total actividad de uno o más enzimas de ruta que se modifican mediante ingeniería en un huésped se aumenta al expresar la enzima a partir de un promotor fuerte en un plásmido de alto número de copias . Ejemplos adecuados, para Escherichia coli incluyen, pero no se limitan a la utilización de promotores de Trc, Tac, T5 , T7, y PLambda con vectores pBAD24, pBAD 18, pGEM, pBluescript, pUC, y pTZ. Ejemplos no limitantes de promotores adecuados para su uso en células huésped eucarióticas incluyen, pero no se limitan a, un promotor inmediato temprano de CMV, un promotor timidina quinasa de HSV, un promotor temprano o tardío de SV40, LTR de retrovirus, y un promotor de ratón metalotioneína-I . Ejemplos no limitantes de promotores constitutivos adecuados para su uso en células huésped procariotas incluyen un promotor de sigma70 (por ejemplo, un promotor unánime de sigma70) . Ejemplos no limitantes de promotores inducibles adecuados para su uso en células bacterianas huésped incluyen el pL de ? bacteriófaga; Plac; Ptrp; Ptac (promotor híbrido de Ptrp-lac) ; un promotor inducible por isopropil -beta-D44 tiogalactopiranosida (IPTG) , por ejemplo, un promotor de lacZ; un promotor inducible por tetraciclina; un promotor inducible por arabinosa, por ejemplo, PBAD (véase, por ejemplo, Guzman et al. (1995) J. Bacteriol. 177:4121-4130); un promotor inducible por xilosa, por ejemplo, Pxil (véase, por ejemplo, Kim et al: (1996) Gene 181:71-76); un promotor de GALl; un promotor de triptófano; un promotor de lac; un promotor inducible por alcohol, por ejemplo, un promotor inducible por metanol, un promotor inducible por etanol; un promotor inducible por rafinosa; un promotor inducible por calor, por ejemplo, promotor lambda PL inducible por calor; un promotor controlado mediante un represor sensible al calor (por ejemplo, vectores de expresión reprimida de CI857 con base en lambda; véase, por ejemplo, Hoffmann et al. (1999) FEMS Microbiol Lett . 177 (2) : 327-34 ) ; y similares. Ejemplos no limitantes de promotores constitutivos adecuados para su uso en células huésped de levadura incluyen un promotor ADH1, ADH2 , PGK, o LEU2. Ejemplos no limitantes de promotores inducibles adecuados para su uso en células huésped de levadura incluyen, pero no se limita a, un promotor divergente inducido por lactosa tal como un promotor de GAL 1 o GAL 10 (West at al. (1984) Mol. Cell. Biol. 4 (11) : 2467-2478) , o un de promotor CUP1. Donde se desee, el vector objeto comprende un promotor que es más fuerte que un promotor de E. Coli Lac nativo. Ejemplos no limitantes de operadores para su uso en células bacterianas huésped incluyen un operador promotor de lactosa (la proteína represora de LacI cambia de conformación cuando se pone en contacto con lactasa, así, previene que la proteína represora de LacI se una con el operador) , un operador promotor de triptófano (cuando forma un complejo con triptófano, la proteína represora de TrpR tiene una conformación que se une con el operador; en la ausencia de triptófano, la proteína represora de TrpR tiene una conformación que no se une con el operador) , y un operador promotor de tac (véase, por ejemplo, deBoer et al. (1983) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 80:21-25.). Los genes en el vector de expresión típicamente codificarán también un sitio de unión del ribosoma para la traducción directa (es decir, síntesis) de cualquier producto genético de ARMm modificado. Para sitios adecuados de unión del ribosoma para su uso en Escherichia coli, véase Shine et al. (1975) Nature 254:34, y Steitz, en Biological Regulation and Development: Gene Expression (ed. R. F. Goldberger) , vol. 1, p. 349, 1979, Plenum Publishing, N.Y. La inserción del sitio de unión del ribosoma que codifica la secuencia de nucleótidos 5'-AAAACA-3' corriente arriba de una secuencia de codificación facilita la traducción eficiente en un microorganismo huésped de levadura (Looman et al. (1993) Nuc . Ac. Res. 21:4268-4271; Yun et . al. (1996) Mol. Microbiol. 19 : 1225-1239) . Otros elementos reguladores que pueden utilizarse en un vector de expresión incluyen elementos mej oradores de trascripción y terminadores de trascripción. Véase, por ejemplo, Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544. Un vector de expresión puede ser adecuado para su uso en tipos particulares de microorganismos huésped y no otros. Una persona con experiencia ordinaria en la técnica, sin embargo, puede determinar rápidamente a través de experimentación rutinaria si un vector de expresión particular es adecuado para un microorganismo huésped determinado. Por ejemplo, el vector de expresión puede introducirse dentro del organismo huésped, el cual se observa entonces para la viabilidad y expresión de cualquier gen contenido en el vector. El vector de expresión puede contener también uno o más genes de marcadores seleccionables que, con la expresión, confieren uno o más atributos fenotipicos útiles para seleccionar o de otro modo identificar células huésped que portan el vector de expresión. Ejemplos no limitantes de marcadores seleccionables adecuados para células eucariotas incluyen resistencia al dihidrofolato reductasa y neomicina. Ejemplos no limitantes de marcadores seleccionables adecuados para células procariotas incluyen resistencia a la tetraciclina, ampicilina, cloranfenicol , carbenicilina, y canamicina . Para la producción de un producto bio-orgánico a un nivel industrial, puede ser poco práctico o demasiado costoso utilizar un marcador seleccionable que requiere la adición de un antibiótico al medio de fermentación. Por consiguiente, algunas modalidades de la presente invención emplean células huésped que no requieren la utilización de una resistencia a antibióticos que confiere un marcador seleccionable para asegurar la conservación del plásmido (vector de expresión) . En estas modalidades de la presente invención, el vector de expresión contiene un sistema de conservación de plásmidos tal como el plásmido 60-kb IncP (RK2) , opcionalmente junto con el sistema de segregación y/o replicación de plásmidos RK2 , para efectuar la retención de plásmidos en la ausencia de la selección de antibióticos (véase, por ejemplo, Sia et al. (1995) J. Bacteriol. 177:2789-97; Pansegrau et al. (1994) J. Mol. Biol. 239:623-63). Un sistema adecuado de conservación de plásmidos para este propósito se codifica mediante el operón parDE de RK2 , que codifica una toxina estable y una antitoxina inestable. La antitoxina puede inhibir la acción letal de la toxina mediante interacción directa de proteína-proteína. Las células que pierden el vector de expresión que alberga al operón parDE se despojan rápidamente de la antitoxina inestable, lo que provoca que la toxina estable cause entonces la muerte celular. El sistema de replicación del plásmido RK2 se codifica mediante el gen trfA, que codifica una proteína de replicación de ADN. El sistema de segregación del plásmido RK2 se codifica mediante el operón parCBA, el cual codifica proteínas que funcionan para resolver multímeros de plásmido que pueden surgir a partir de la replicación de ADN. Los vectores objeto pueden introducirse en una célula huésped estable o temporalmente mediante una variedad de técnicas establecidas. Por ejemplo, un método involucra un tratamiento de cloruro de calcio, en donde el vector de expresión se introduce a través de un precipitado de calcio. Otras sales, por ejemplo fosfato de calcio, pueden utilizarse también siguiendo un procedimiento similar. Además, puede utilizarse la electroporación (es decir, la aplicación de corriente para aumentar la permeabilidad de las células a ácidos nucleicos) . Otros métodos de transformación incluyen microinyección, transformación mediada por dextrina DEAE, y golpe de calor en presencia de acetato de litio. Los complejos lípidos, liposomas, y dendrímeros pueden emplearse también para transfectar el microorganismo huésped. Con la transformación, una variedad de métodos pueden practicarse para identificar las células huésped en las que se han introducido los vectores objeto. Un método de selección ejemplar involucra subcultivar células individuales para formar colonias individuales, seguido por la prueba de la expresión del producto genético deseado. Otro método conlleva seleccionar células huésped transformadas con base en atributos fenotípicos conferidos a través de la expresión de genes de marcadores seleccionables contenidos en el vector de expresión. Las personas con experiencia en la técnica pueden identificar células huésped genéticamente modificadas utilizando estos u otros métodos disponibles en la técnica. La introducción de varias secuencias de rutas de la invención dentro de una célula huésped puede confirmarse mediante métodos tales como hibridación de PC , transferencia de Southern o transferencia de Northern. Por ejemplo, pueden prepararse ácidos nucleicos a partir de las células huésped resultantes, y las secuencias específicas de interés pueden amplificarse mediante PCR utilizando cebadores específicos para las secuencias de interés. El producto amplificado se somete a electroforesis en geles de agarosa, electroforesis en geles de poliacrilamida o electroforesis capilar, seguida de tinción con bromuro de etidio, solución de SYBR Green o similares, o detección de ADN con una detección UV. Alternativamente, los detectores específicos de ácido nucleico para las secuencias de interés pueden emplearse en una reacción de hibridación. La expresión de una secuencia de genes específicos puede determinarse mediante la detección del ARNm correspondiente a través de reveres- trascripción hibridación acoplada de PCR, transferencia de Northern, o mediante inmunoensayos utilizando anticuerpos reactivos con el producto genético modificado. Los inmunoensayos ejemplares incluyen pero no se limita a ELISA, radioinmunoensayos , e inmunoensayos intercalado. El rendimiento de un compuesto bio-orgánico a través de una o más rutas metabólicas descritas en la presente puede aumentarse mediante reacciones inhibidoras que desvían intermediarios a partir de pasos productivos hacia la formación del producto bio-orgánico. La inhibición de las reacciones improductivas puede lograrse al reducir la expresión y/o actividad de enzimas involucradas en una o más reacciones improductivas. Tales reacciones incluyen reacciones secundarias del ciclo de TCA que lleva a una biosíntesis de ácidos grasos, biosíntesis de alanina, la superruta de aspartato, gluconeogénesis , biosíntesis de pigmentos, y/o biosíntesis de glutamato, a un nivel que afecta el rendimiento global del compuesto bio-orgánico. Una variedad de métodos está disponibles para destruir o derribar un gen de interés. Por ejemplo, una expresión reducida de genes puede llevarse a cabo mediante supresión, mutación, y/o reestructuración de genes. También puede llevarse a cabo con la utilización de ARN antisentido, siAR , miARN, ribozimas, ADN de cadena triple, e inhibidores de trascripción y/o traducción. Además, los transposones pueden emplearse para desestabilizar la expresión de genes, por ejemplo, al insertarlos entre el promotor y la región de codificación, o entre dos genes adyacente para desactivar uno o ambos genes. La cantidad de microorganismos por litro de fermentación, o la densidad de microorganismos, puede medirse al medir el peso del microorganismo aislado de un volumen determinado del medio de fermentación. Una medida común es el peso seco de células por litro de medio de fermentación. Otro método que puede utilizarse para observar la fermentación mientras ésta progresa es mediante una medida de la densidad óptica del medio. Un método común es medir la densidad óptica en una longitud de onda de 600 nm, que se refiere a la OD60o, a la OD . La OD puede correlacionarse con la densidad de un tipo específico de organismo dentro un medio específico, pero la relación específica entre la OD y cantidad de microorganismo por volumen generalmente no será aplicable para todos los tipos de organismos en todos los tipos de medios. Una curva de calibración puede crearse al medir la OD y el peso seco celular sobre un margen de densidades celulares. En algunos casos, estas correlaciones pueden utilizarse en diferentes fermentaciones del mismo microorganismo o similar en el mismo medio o similar.
EJEMPLOS La práctica de la presente invención puede emplear, a menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de la industria biosintética y similares, que se encuentran dentro de la experiencia en la técnica. En la medida en que estas técnicas no se describen por completo en la presente, es posible encontrar amplia referencia respecto a ellas en la literatura científica. En los siguientes ejemplos, se han hecho esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, y así sucesivamente) , pero pueden existir variaciones y desviaciones, y en el caso de que exista un error de copiado en los números que se informan en la presente, una persona con experiencia ordinaria en la técnica a la que esta invención pertenece puede deducir la cantidad correcta en vista del resto de la descripción en la presente. A menos que se indique de otro modo, la temperatura se informa en grados Celsius, y la presión está en, o cerca de la presión atmosférica a nivel del mar. Todos los reactivos, a menos que se indique de otra manera, se obtuvieron comercialmente . Se pretende que los siguientes ejemplos tengan propósitos ilustrativos únicamente y no limiten en cualquier forma el alcance de la presente invención.
Ejemplo 1 Este ejemplo describe métodos para elaborar plásmidos de expresión que codifican enzimas de la ruta de MEV a partir de Saccharomyces cerevisiae organizado en operones . La expresión del plásmido pMevT se generó al insertar el operón MevT (SEQ ID NO: 1) dentro del vector pBAD33. El operón MevT codifica el conjunto de enzimas de la ruta de MEV, que juntas transforman el precursor ubicuo acetil-CoA en (R) -mevalonato, es decir, acetoacetil-CoA tiolasa, HMG-CoA sintasa, y HMG-CoA reductasa. El operón MevT se generó mediante amplificación de PCR a partir de ADN genómico de Escherichia culi, la secuencia de codificación del gen atoB (número de acceso en el GenBank NC_000913 REGIÓN: 2324131..2325315) (codifica un acetoacetil-CoA tiolasa) , a partir de ADN genómico de Saccharomyces cerevisiae, la secuencia de codificación del gen ERG13 (número de acceso en el GenBank X96617, REGIÓN: 220..1695) (codifica una HMG-CoA sintasa) , y a partir de ADN genómico de Saccharomyces cerevisiae, un segmento de la región de codificación del gen HMG1 (número ' de acceso en el GenBank M22002, REGIÓN: 1660..3165) (codifica una HMGCoA reductasa truncada (tHMGR) ) . El cebador de PCR corriente arriba utilizado para la amplificación del fragmento de gen HMG1 incluyó un codón de inicio artificial. Los fragmentos amplificados se unieron utilizando extensiones superpuestas (SOEing) , proceso durante el cual los sitios de unión del ribosoma se introdujeron después de las secuencias de codificación atoB y ERG13. Después de la adición de las terminales 3' A, el operón MevT se ligó dentro del vector TA de clonación pCR4 (Invitrogen, Carlsbad, CA) , y se hizo secuenciar para asegurar la precisión. El operón MevT se ligó subsecuentemente dentro del Xmal Pstl sitio enzimático de restricción del vector pBAD33 (Guzman et al. (1995) J. Bacteriol. 177(14): 4121-4130). Para colocar el operón bajo el control del promotor PLac / el fragmento araC-PBADNsil- -Xmal de pBAD33 se reemplazó con el fragmento Nsil-Xmal de pBBRIMCS, que dio como resultado el plásmido de expresión pMevT (véase la Patente Norteamericana No. 7,192,751). El plásmido de expresión pAM36-MevT66 se generó mediante la inserción del operón MevT66 dentro del vector pAM36. El vector pAM36 se generó mediante la inserción de un cassette oligonucleótido que contiene los sitios enzimáticos de restricción Ascl-Sfil-AsiSI-Xhol-Pacl-Fsll-Pmel dentro del vector pACYC184 (número de acceso en el GenBank X06403) , y mediante la remoción del gen de resistencia de prueba en pACYC 184. El operón MevT66 se generó de manera sintética utilizando la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1 como una plantilla, que comprende el gen . atoB de Escherichia coli (número de acceso en el GenBank NC_000913 REGIÓN: 2324131..2325315) , el gen ERG13 de Saccharomyces cerevisiae (número de acceso en el GenBank X96617, REGIÓN: 220..1695), y una versión truncada del gen HMGl de Saccharomyces cerevisiae (número de acceso en el GenBank M22002, REGIÓN: 1777..3285), todas las tres secuencias con optimización de codones para expresión en Escherichia coli. El operón MevT66 generado sintéticamente se flanqueó mediante un sitio enzimático de restricción 5' EcoRI y un sitio enzimático de restricción 3' Hind III, y pudieron así clonarse dentro de sitios enzimáticos de restricción compatibles de un vector de clonación tal como un vector de origen normal pUC o pACYC. A partir de esta construcción, el operón MevT66 se amplificó por PCR con los sitios enzimático de restricción de flanqueo Sfrl y AsiSl, el fragmento de ADN amplificado se metabolizó hasta su terminación utilizando las enzimas de restricción Sftl y AsiSI, la mezcla de reacción se resolvió mediante electroforesis en geles, el fragmento de ADN de aproximadamente 4.2 kb se extrajo por medio de geles utilizando un equipo de purificación de geles Qiagen (Valencia, CA) , y el fragmento aislado de ADN se ligó dentro del sitio enzimático de restricción Sfrl AsiSI del vector pAM36, que dio como resultado el plásmido de expresión pAM36-MevT66. El plásmido de expresión pAM25 se generó mediante la inserción del operón MevT66 dentro del vector pAM29. El vector pAM29 se creó al ensamblar el origen pl5A de replicación y gen de resistencia kan de pZS24-MCSl (Lutz y Bujard (1997) Nucí Acids Res. 25:1203-1210) con un promotor de lacUV5 generado por oligonucleótidos . La construcción de síntesis de ADN que comprende el operón MevT66 (véase en lo anterior) se metabolizó hasta su terminación utilizando enzimas de restricción EcoRI y Hind III, la mezcla de reacción se resolvió mediante electroforesis en geles, el fragmento de ADN de 4.2 kb se extrajo mediante geles, y el fragmento aislado de ADN se ligó dentro del sitio enzimático de restricción EcoRI Hindlll de pAM29, que dio como resultado el plásmido de expresión pAM25. El plásmido de expresión pMevB-Cm se generó mediante la inserción del operón MevB dentro del vector pBBRIMCS-l. El operón MevB codifica el conjunto de enzimas que juntas convierten (R) -mevalonato en IPP, es decir, mevalonato quinasa, fosfomevalonato quinasa, y mevalonato pirofosfato carboxilasa. El operón MevB se generó mediante amplificación por PCR de ADN genómico de Saccharomyces cerevisiae la secuencia de codificación del gene ERG12 (número de acceso en el GenBank X55875, REGIÓN: 580..1911) (codifica una mevalonato quinasa) , el gen ERG8 (número de acceso en el GenBank Z49939, REGIÓN: 3363..4718) (codifica una fosfomevalonato quinasa) , y el gen MVD1 (número de acceso en el GenBank X97557, REGIÓN: 544..1734) (codifica una mevalonato pirofosfato carboxilasa) , y mediante la unión de fragmentos de PCR utilizando extensiones superpuestas (SOEing) . Al elegir secuencias de cebadores apropiadas, los codones de parada de ERG12 y ERG8 se cambiaron de TAA a TAG durante la amplificación para introducir sitios de unión del ribosoma. Después de la adición de terminales 3' A, el operón MevB se ligó dentro del vector TA de clonación pCR4 (Invitrogen, Carlsbad, CA) . El operón MevB se extirpó la metabolización de la construcción de clonación hasta su terminación utilizando la enzima de restricción Pstl, resolviendo la mezcla de reacción mediante electroforesis en geles, extrayendo mediante geles el fragmento de ADN de 4.2 kb, y ligando el fragmento aislado de ADN dentro del sitio enzimático de restricción Pstl del vector pBBRIMCS-1 (Kovach et al., Gene 166 (1): 175-176 (1995)), que dio como resultado el plásmido de expresión pMevB-Cm. El plásmido de expresión pMBI se generó mediante la inserción del operón MBI dentro del vector pBBRIMCS-3. El operón MBI codifica las mismas enzimas que el operón MevB, así como una isopentenil pirofosfatasa isomerasa que cataliza la conversión de IPP en DMAPP. El operón MBI se generó mediante amplificación por PCR de ADN genómico de Escherichia coli la secuencia de codificación del gen idi (número de acceso en el GenBank AF 119715) utilizando cebadores que contenían un sitio enzimático de restricción Xmal en sus extremos 5', metabolizando el fragmento de ADN amplificado hasta su terminación utilizando la enzima de restricción Xmal, resolviendo la mezcla de reacción mediante electroforesis en geles, extrayendo por medio de geles el fragmento de 0.5 kb, y ligando el fragmento aislado de ADN dentro del sitio enzimático de restricción Xmal del plásmido de expresión pMevB-Cm, colocando así el idi en el extremo 3' del operón MevB. El operón MBI se subclonó dentro del sitio enzimático de restricción Salí y Sacl del vector pBBRIMCS-3 (Kovach et al., Gene 166(1): 175-176 (1995)), que dio como resultado el plásmido de expresión pMBI (véase Patente Norteamericana No. 7,192,751). El plásmido de expresión pMBIS se generó mediante la inserción del gen ispA dentro de pMBI . El gen ispA gen codifica una farnesil pirofosfato sintasa que cataliza la conversión de IPP y DMAPP en FPP. La secuencia de codificación del gen ispA (número de acceso en el GenBank D00694, REGIÓN: 484..1383) se amplificó por PCR de ADN genómico de Escherichia coli utilizando un cebador adelantado con un sitio enzimático de restricción Sacll y un cebador inverso con un sitio enzimático de restricción Sacl . El producto de PCR amplificado se metabolizó hasta su terminación con las enzimas de restricción Sacll y Sacl, la mezcla de reacción se resolvió mediante electroforesis en geles, y el fragmento de ADN 0.9 kb se extrajo mediante geles. El fragmento aislado de ADN se ligó dentro del sitio enzimático de restricción Sacll Sacl de pMBI, colocando así el gen ispA 3' de idi y el operón MevB, y que dio como resultado el plásmido de expresión pMBIS (véase Patente Norteamericana No. 7,192,751). El plásmido de expresión pMBIS-gpps se derivó a partir del plásmido de expresión pMBIS al reemplazar la secuencia de codificación ispA con una secuencia de nucleótidos que codifica una geranil difosfato sintasa ("gpps"). Un fragmento de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la geranil difosfato sintasa se generó sintéticamente utilizando la secuencia de codificación del gen gpps de Arabidopsis thaliana (número de acceso en el GenBank Y17376, REGIÓN: 52..1320), con optimización de codones para expresión en Escherichia coli, como una plantilla. La secuencia de nucleótidos se flanqueó mediante un sitio líder enzimático de restricción Sacll y un sitio terminal enzimático de restricción Sacl, y puede clonarse dentro de un sitio enzimático de restricción compatible de un vector de clonación tal como un vector de origen normal pUC o pACYC. La secuencia geranil difosfato sintasa generada sintéticamente se aisló al metabolizar la construcción de síntesis de ADN hasta su terminación utilizando las enzimas de restricción Sacll y Sacl, resolviendo la mezcla de reacción mediante electroforesis en geles, extrayendo por medio de geles el fragmento de ADN de aproximadamente 13 kb, y ligando el fragmento aislado de ADN dentro del sitio enzimático de restricción Sacll Sacl del plásmido de expresión p BIS, que dio como resultado el plásmido de expresión pMBIS-gpps (véase la Figura 6 para un mapa de plásmido) . El plásmido de expresión pAM45 se generó mediante la inserción del operón MBIS dentro de pAM36- evT66 y agregando promotores de IacUVS en frente de los dos operones . El operón MBIS se amplificó por PCR de pMBIS utilizando cebadores que comprenden un sitio enzimático de restricción 5' Xhol y un sitio enzimático de restricción 3' Pací. El producto de PCR amplificado se metabolizó hasta su terminación utilizando las enzimas de restricción Xhol y Pací, la mezcla de reacción se resolvió mediante electroforesis en geles, el fragmento de ADN de 5.4 kb se extrajo mediante geles, y el fragmento aislado de ADN se ligó dentro del sitio enzimático de restricción Xhol Pací de pAM36-MevT66 , que dio como resultado el plásmido pAM43.. Un fragmento de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el promotor de lacUV5 se sintetizó a partir de oligonucleótidos y se subclonó dentro de los sitios enzimáticos de restricción Xhol Ascl Sfil y AsiSI de pAM43, que dieron como resultado el plásmido de expresión pAM45.
Ejemplo 2 Este ejemplo describe métodos para elaborar vectores de expresión que codifican enzimas de la ruta de MEV a partir de Staphylococcus aureus organizado en operones. El plásmido de expresión pAM41 se derivó a partir de plásmido de expresión pA 25 al reemplazar la secuencia de codificación del gen HIVIGI, que codifica la HMG-CoA reductasa de Saccharomyces cerevisiae, con la secuencia de codificación del gen mvaA, que codifica la HMG-CoA reductasa de Staphylococcus aureus (número de acceso en el GenBank BA000017, REGIÓN: 2688925..2687648 ) . La secuencia de codificación del gen mvaA se amplificó por PCR de ADN genómico de Staphyloccoccus aureus subespecie aureus (ATCC 70069) utilizando cebadores 4-49 mvaA Spel (SEQ ID NO: 2) y 4-49 rnvaAR Xbal (SEQ ID NO: 3) , el fragmento de ADN amplificado se metabolizó hasta su terminación utilizando la enzima de restricción Spel, la mezcla de reacción se resolvió mediante electroforesis en geles, y el fragmento de ADN de aproximadamente 1.3 kb se extrajo mediante geles. La secuencia de codificación HMG1 se removió de pAM25 al metabolizar el plásmido hasta su terminación utilizando la enzima de restricción Hindlll. Los extremos terminales del fragmento de ADN resultante se despuntaron utilizando polimerasa de ADN T4. El fragmento de ADN se metabolizó entonces parcialmente utilizando la enzima de restricción Spel, la mezcla de reacción se resolvió mediante electroforesis en geles, y el fragmento de ADN de 4.8 kb se extrajo mediante geles. El fragmento aislado de ADN se ligó con el producto mvaA de PCR metabolizado con Spel, que dio como resultado el plásmido de expresión pAM41. La secuencia de nucleótidos del operón atoB (opt) : ERG13 (opt):mvaA contenida en pAM41 es SEQ ID NO: 41. ERG13 es también conocida como HMGS o HMG-CoA sintasa. El plásmido de expresión pAM52 se derivó a partir de plásmido de expresión pAM41 al reemplazar la secuencia de codificación del gen ERGI3 , que codifica la HMG-CoA sintasa de Saccharomyces cerevisiae, con la secuencia de codificación del gen mvaS, que codifica la HMG-CoA sintasa de Staphylococcus aureus (número de acceso en el GenBank BA000017, REGIÓN: 2689180..2690346) . La secuencia de codificación del gen mvaS se amplificó por PCR a partir de ADN genómico de Staphyloccoccus aureus subespecie aureus (ATCC 70069) utilizando cebadores HMGS 5' Sa mvaS-S (SEQ ID NO: 4) y HMGS 3' Sa mvaS-AS (SEQ ID NO: 5), y el fragmento de ADN amplificado se utilizó como un cebador de PCR para reemplazar la secuencia de codificación del gen HMG1 en pAM41, de acuerdo con el método de Geiser et al.
(BioTechniques 31:88-92 (2001)), que dio como resultado el plásmido de expresión pAM52. La secuencia de nucleótidos del operón atoB (opt) :mvaS:mvaA contenida en pAM52 es SEQ ID NO: 42. El plásmido de expresión pAM97 se derivó a partir del plásmido de expresión pAM45 al reemplazar el operón MevT66 con el operón (atoB (opt) :mvaS :mvaA) del plásmido de expresión pAM52. El plásmido de expresión pAM45 se metabolizó hasta su terminación utilizando las enzimas de restricción AsiSI y Sfil, la mezcla de reacción se resolvió mediante electroforesis en geles, y el fragmento de ADN de 8.3 kb carente del operón MevT66 se extrajo mediante geles. El operón (atoB (opt) :mvaS :mvaA) de pAM52 se amplificó por PCR utilizando cebadores 19-25 atoB Sfil-S (SEQ ID NO: 6) y 19-25 mvaA-AsiSI-AS (SEQ ID NO: 7) , el producto de PCR se metabolizó hasta su terminación utilizando las enzimas de restricción Sfil y AsiSI, la mezcla de reacción se resolvió mediante electroforesis en geles, el fragmento de ADN de 3.7 kb se extrajo mediante geles, y el fragmento aislado de ADN se ligó dentro del sitio enzimático de restricción AsiSI Sfil del plásmido de expresión pAM45, que dio como resultado el plásmido de expresión pAM97. El plásmido de expresión pAM97-MBI se derivó a partir del plásmido de expresión pAM97 y pAM45 al reemplazar el operón MBIS de pAM97 con el operón MBI de pAM45. El operón MBI se amplificó por PCR a partir de pA 45 utilizando cebadores 9-70C (SEQ ID NO: 8) y 26-39B (SEQ ID NO: 9), la mezcla de reacción se resolvió mediante electroforesis en geles, el fragmento de ADN de 4.5 kb se extrajo mediante geles, y el fragmento aislado de ADN se metabolizó hasta su terminación utilizando las enzimas de restricción Sacl y Xhol. El plásmido de expresión pAM97 se metabolizó hasta su terminación utilizando las enzimas de restricción Sacl y Xhol, la mezcla de reacción se resolvió mediante electroforesis en geles, el fragmento de 7.6 kb se extrajo mediante geles, y el fragmento aislado de ADN se ligó con el producto de PCR del operón MBI, que dio como resultado el plásmido de expresión pAM97-MBl. El plásmido de expresión pAM97-MevB se derivó a partir del plásmido de expresión pAM97 y pAM45 al reemplazar el operón MBIS de pAM97 con el operón MevB de pAM45. El operón MevB se amplificó por PCR a partir de pAM45 utilizando cebadores 9-70C (SEQ ID NO: 8) y 26-39A (SEQ ID NO: 10) , la mezcla de reacción se resolvió mediante electroforesis en geles, el fragmento de ADN 3.9 kb se extrajo mediante geles, y el fragmento aislado de ADN se metabolizó hasta su terminación utilizando las enzimas de restricción Sacl y Xhol. El plásmido de expresión pAM97 se metabolizó hasta su terminación utilizando las enzimas de restricción Sacl y Xhol, la mezcla de reacción se resolvió mediante electroforesis en geles, el fragmento de 7.6 kb se extrajo mediante geles, y el fragmento aislado de ADN se ligó con producto de PCR del operón MevB, que dio como resultado el plásmido de expresión pAM97-MevB. El plásmido de expresión pAM128 se generó mediante la inserción de los operones (atoB(opt): mvaS: mvaA) y BIS del plásmido de expresión pAM97 dentro de un vector que comprende el sistema de replicación, segregación, y mantenimiento del plásmido RK2 , que obvia la necesidad continua de selección de antibióticos de transformantes de células huésped. El plásmido RK2 se metabolizó hasta su terminación utilizando la enzima de restricción Pstl, la mezcla de reacción se resolvió mediante electroforesis en geles, el fragmento de ADN de aproximadamente 6.3 kb que contiene el par locus entero se extrajo mediante geles, y el fragmento aislado de ADN se subclonó dentro del sitio enzimático de restricción Pstl del mini replicón de RK2 pRRIO (Roberts et al. (1990) J" Bacteriol. 172(11): 6204-6216), que dio como resultado un vector pAM132. El plásmido de expresión pAM97 se metabolizó hasta su terminación utilizando las enzimas de restricción Ascl y Sacl, la mezcla de reacción se resolvió mediante electroforesis en geles, el fragmento de ADN de aproximadamente 9.4 kb se extrajo mediante geles, y el fragmento aislado de ADN se ligó dentro del sitio enzimático de restricción Mlul Sacl de pA 132, que dio como resultado el plásmido de expresión pAM128.
Ejemplo 3 Este ejemplo describe métodos para elaborar vectores de expresión que codifican enzimas de la ruta de MEV de Enterococcus faecalis organizado en operones. El plásmido pAM16 se generó mediante la inserción de la secuencia de codificación del gen mvaE de Enterococcus faecalis (número de acceso en el GenBank AF290092 REGIÓN: 1479..3890) (codifica una acetil-CoA acetiltransferasa/H G-CoA reductasa (HMGR) ) dentro del vector pBlueScripII-KS (+) . La secuencia de codificación del gen mvaE se amplificó por PCR a partir de ADN genómico de Enterococcus faecalis (ATCC 700802) utilizando cebadores 5' fosforilados 4-40 mvaEF BamHI (SEQ ID NO: 11) y 4-40 mvaERHindlll (SEQ ID NO: 12) . (Nótese que el cebador 4-40 mvaEF BamHI cambia el codón de inicio del gen mvaE de TTG a ATG en el producto de PCR amplificado.) El producto de PCR resultante se ligó dentro del sitio enzimático de restricción Smal de pBlueScripII-KS (+) (Stratagene, La Jolla, CA) , que dio como resultado el plásmido de expresión pAM16. El plásmido pA 18 se generó mediante la inserción de la secuencia de codificación del gen mvaS de Enterococcus faecalis (número de acceso en el GenBank AF290092 REGIÓN: 142..1293) (codifica una H G-CoA sintasa (HMGS) ) dentro del vector pBlueScripII-KS (+) . La secuencia de codificación del gen mvaS se amplificó por PCR a partir de ADN genómico de Enterococcus faecalis (ATCC 700802) utilizando cebadores 5' fosforilados 4-40 mvaSF BglII (SEQ ID NO: 13) y 4-39 mvaSR BamHI (SEQ ID NO: 14) , y el producto de PCR se ligó dentro del sitio enzimático de restricción Smal de pBlueScripII-KS( +) (Stratagene, La Jolla, CA) , que dio como resultado el plásmido de expresión pAM18. El plásmido de expresión pAM22 se generó mediante la inserción de la secuencia de codificación del gen mvaE del plásmido de expresión pAM16 dentro del vector Pze21-PL-iac0i . El vector Pze21-PL-iac0i es un derivado del vector pZE21-MCS-l en el que el promotor tet se reemplazó con el promotor PL-iacoi (Lutz y Bujard (1997) Nucí Acids Res. 25:1203-1210). El plásmido de expresión pAM16 se metabolizó hasta su terminación utilizando LAS enzimas de restricción BamHI y Hindlll, la mezcla de reacción se resolvió mediante electroforesis en geles, el fragmento de ADN de aproximadamente 2.4 kb que contiene la secuencia de codificación mvaE se extrajo mediante geles, y el fragmento aislado de ADN se insertó dentro del sitio enzimático de restricción BamHI Hindlll de pZE21-PL.lac0i, que dio como resultado el plásmido de expresión pAM22. El plásmido de expresión pAM33 se generó mediante la inserción de la secuencia de codificación del gen mvaS del plásmido de expresión pAM18 dentro del plásmido de expresión pAM22. El plásmido de expresión pAM18 se metabolizó hasta su terminación utilizando las enzimas de restricción Bglll y BamHI, la mezcla de reacción se resolvió mediante electroforesis en geles, el fragmento de ADN de aproximadamente 1.2 kb que contiene la secuencia de codificación del gen mvaS se extrajo mediante geles, y el fragmento aislado de ADN se insertó dentro del sitio BamHI del plásmido de expresión pAM22, que dio como resultado el plásmido de expresión pAM33. El plásmido de expresión pAM34 se generó mediante la inserción del operón mvaS-mvaE del plásmido de expresión pA 33 dentro del vector pAM29. El operón mvaS-mvaE se aisló mediante al metabolizar parcialmente pAM33 utilizando la enzima de restricción EcoRI, metabolizando el fragmento de ADN lineal resultante utilizando la enzima de restricción Mlul, resolviendo la mezcla de reacción mediante electroforesis en geles, y extrayendo por medio de geles el fragmento de ADN de aproximadamente 3.6 kb. La columna del vector pAM29 se obtuvo al metabolizat hasta su terminación el vector de expresión pAM25 utilizando las enzimas de restricción MIul y EcoRI, resolviendo la mezcla de reacción mediante electroforesis en geles, y extrayendo por medio de geles el fragmento de ADN de aproximadamente 2.1 kb. Los dos fragmentos aislados de ADN se ligaron, lo que dio como resultado el plásmido de expresión pAM34.
Ejemplo 4 Este ejemplo describe métodos para elaborar plásmidos de expresión que codifican enzimas de la ruta de DXP a partir de Escherichia coli organizado en operones. El plásmido de expresión pAM408 se generó mediante la inserción de genes que codifican enzimas de la ruta "superior" de DXP dentro del vector pAM29. Las enzimas de la ruta "superior" de DXP incluyen l-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa (codificada mediante el gen dxs de Escherichia coli), l-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato reductoisomerasa (codificada mediante el gen dxr de Escherichia coli), 4 -difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol sintasa (codificada mediante el gen ispD de Escherichia coli), y 4-difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol sintasa (codificada mediante el gen ispE de Escherichia coli), que juntas transforman piruvato y D-gliceraldehído-3-fosfato en 4-difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol-2-fosfato .
Los fragmentos de ADN que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican enzimas de la ruta "superior" de DXP se generaron mediante la amplificación por PCR de las secuencias de codificación de los genes dxs (número de acceso en el GenBank U00096 REGIÓ : 437539..439401) , dxr (número de acceso en el GenBank U00096 REGIÓN: 193521..194717 ) , ispD (número de acceso en el GenBank U00096 REGIÓN: 2869803..2870512) , e ispE (número de acceso en el GenBank U00096 REGIÓN 1261249..1262100) de la cepa DH1 de Escherichia coli (ATCC #33849) con secuencias óptimas Shine Dalgarno agregadas y los sitios enzimáticos de restricción 5' y 3' utilizando los cebadores de PCR que se muestran en la SEQ ID NOS: 15-18. Los productos de PCR se resolvieron mediante electroforesis en geles, se extrajeron por medio de geles utilizando un equipo de purificación de geles Qiagen (Valencia, CA) , se metabolizaron hasta su terminación utilizando enzimas de restricción apropiadas (Xhol y Kpnl para el producto de PCR que comprende el gen dxs; Kpnl y Apal para el producto de PCR que comprende el gen dxr; Apal y Ndel para el producto de PCR que comprende el gen ispD; Ndel y Mlul para el producto de PCR que comprende el gen ispE) , y se purificaron utilizando un equipo de purificación de PCR Qiagen (Valencia, CA) . Cantidades equimolares aproximadas de cada producto de PCR se agregaron entonces a una reacción de ligación para ensamblar los genes individuales dentro de un operón. A partir de esta reacción de ligación, ?µ? de mezcla de reacción se utilizó para PCR amplificar 2 cassettes genéticos separados, es decir, los cassettes genéticos dxs-dxr y ispD-ispE. El cassette genético dxs-dxr se amplificó por PCR utilizando cebadores 67-1A-C (SEQ ID NO: 15) y 67-1D-C (SEQ ID NO: 18) , y el cassette genético ispD-ispE se amplificó por PCR utilizando cebadores 67-1E-C (SEQ ID NO: 19) y 67-1H-C (SEQ ID NO: 22) . Los dos productos de PCR se resolvieron mediante electroforesis en geles, y se extrajeron mediante geles. El producto de PCR que comprende el cassette genético dxs-dxr se metabolizó hasta su terminación utilizando las enzimas de restricción Xhol y Apal, y el producto de PCR que comprende el cassette genético ispD-ispE se metabolizó hasta su terminación utilizando las enzimas de restricción Apal y Mlul, y los dos productos de PCRs se purificaron. El vector pAM29 se metabolizó hasta su terminación utilizando las enzimas de restricción Salí y Mlul, y los dos producto metabolizados de PCR que contienen la ruta "superior" del operón DXP se ligaron dentro del sitio enzimático de restricción Sa2I Mlul del vector pAM29, que dio como resultado el plásmido de expresión pAM408 (véase la Figura 7 para un mapa de plásmidos) . El plásmido de expresión pAM409 se generó mediante la inserción de genes que codifican enzimas de la ruta "inferior" de DXP dentro del vector pAM369. Las enzimas de la ruta "inferior" de DXP incluyen 2C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato sintasa (codificada mediante el gen ispF de Escherichia coli) , l-hidroxi-2-metil-2- (E) -butenil-4-difosfato sintasa (codificada mediante el gen ispG de Escherichia coli) , e isopentenil/dimetilalil difosfato sintasa (codificada mediante el gen ispH de Escherichia coli), que juntas transforman 4-difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol-2-fosfato en IPP y DMAPP. IPP también se convierte en DMAPP a través de la actividad de la isopentil difosfato isomerasa (codificada mediante el gen idi de Escherichia coli) . DMAPP puede convertirse además en FPP a través de la actividad de la farnesil difosfato sintasa (codificada mediante el gen ispA de Escherichia coli) . Un operón que codifica enzimas de la ruta "inferior" de DXP así como una isopentil difosfato isomerasa y una farnesil difosfato sintasa se generaron mediante amplificación por PCR los genes ispF (número de acceso en el GenBank U00096 REGIÓN: 2869323..2869802) , ispG (número de acceso en el GenBank U00096 REGIÓN: 2638708..2639826) , ispH (número de acceso en el GenBank U00096 REGIÓN: 26277..27227 ) , idi (número de acceso en el GenBank AF119715) , y ispA (número de acceso en el GenBank D00694 REGIÓN: 484..1383) de la cepa DHI de Escherichia coli (ATCC #33849) con secuencias óptimas de Shine Dalgarno agregadas y los sitios enzimáticos de restricción 5' y 3' utilizando los cebadores de PCR apropiados . Los productos de PCR se resolvieron mediante electroforesis en geles, se extrajeron mediante geles, se metabolizaron con las enzimas de restricción apropiadas (BamHl y Apal para el producto de PCR que comprende el gen ispF; Kpnl y Apal para el producto de PCR que comprende el gen ispG; Salí y Kpnl para el producto de PCR que comprende el gen ispH; Salí y Hindlll para el producto de PCR que comprende el gen idi; Hindlll y Ncol para el producto de PCR que comprende el gen ispA) , y se purificaron. Las cantidades equimolares aproximadas de cada producto de PCR se agregaron entonces a una reacción de ligación para ensamblar los genes individuales dentro de un operón. A partir de esta reacción de ligación, ?µ? de la mezcla de reacción se utilizó para amplificar por PCR 2 cassettes genéticos separados, es decir, los cassettes genéticos ispF-ispG y ispH-idi-ispA. El cassette genético ispF-ispG se amplificó por PCR utilizando cebadores 67-2A-C (SEQ ID NO: 23) y 67-2D-C (SEQ ID NO: 26), y el cassette genético ispH-idi-ispA se amplificó por PCR utilizando cebadores 67-2E-C (SEQ ID NO: 27) y 67-2J-C (SEQ ID NO: 32) . Los dos productos de PCR se resolvieron mediante electroforesis en geles, y se extrajeron mediante geles. El producto de PCR que comprende el cassette genético ispF-ispG se metabolizó hasta su terminación utilizando las enzimas de restricción BamHl y Kpnl, y el producto de PCR que comprende el cassette genético ispH-idi-ispA se metabolizó hasta su terminación utilizando las enzimas de restricción Kpnl y Ncol, y los dos productos de PCR se purificaron. El vector pAM369 se creó al ensamblar el origen de replicación pl5A de pAM29 y gen de beta- lactamasa para resistencia a ampicilina de pZE12-luc (Lutz y Bujard (1997) Nucí Acids Res. 25:1203-1210) con un promotor de lacUV5 generado por oligonucleótidos . El vector pAM369 se metabolizó hasta su terminación utilizando las enzimas de restricción Ba Hl y Ncol, y los 2 productos aislados de PCR que contienen la ruta "inferior" del operón DXP se ligaron dentro del sitio enzimático de restricción BamHl Ncol del vector pAM369, que dio como resultado el plásmido de expresión pAM409. El plásmido de expresión pAM424, un derivado del plásmido de expresión pAM409 que contiene el origen de replicación RK2 con amplio margen de huéspedes, se generó mediante la transferencia del promotor lacUV5 y el operón ispFGH-idi-ispA de pAM409 al vector pAM257. El vector pAM257 se generó como sigue: el par locus RK2 se amplificó por PCR del ADN del plásmido RK2 (Meyer et al. (1975) Science 190:1226-1228) utilizando cebadores 9-156A (SEQ ID NO: 33) y 9-156B (SEQ ID NO: 34), el producto de PCR de 2.6 kb se metabolizó hasta su terminación utilizando las enzimas de restricción Aatll y Xhol, y el fragmento de ADN se ligó dentro de un plásmido que contiene el origen de replicación pl5 y el gen de resistencia al cloranfenicol del vector pZA31-luc (Lutz y Bujard (1997) Nucí Acids Res. 25:1203-1210) , que dio como resultado el plásmido pA 37-par,- pAM37-par se metabolizó hasta su terminación utilizando las enzimas de restricción Sacl y Hindlll, la mezcla de reacción se resolvió mediante electroforesis en geles, el fragmento de ADN que comprende el par locus RK2 y el gen de resistencia al cloranfenicol se extrajo mediante geles, y el fragmento aislado de ADN se ligó dentro del sitio Sacl Hindlll del mini replicón de RK2 pRRIO (Roberts et al. (1990) J Bacteriol. 172:6204-6216), que dio como resultado el vector pAM133; pAM133 se metabolizó hasta su terminación utilizando las enzimas de restricción Bglll y Hindlll, la mezcla de reacción se resolvió mediante electroforesis en geles, el fragmento de ADN de aproximadamente 6.4 kb carente del gen de resistencia a la ampicilina y origen conjugativo oriT se extrajeron mediante geles, y el fragmento aislado de ADN se ligó con un fragmento de ADN generado sintéticamente que comprende un sitio de clonación múltiple que contenía los sitios enzimáticos de restricción Pcil y Xhol, que dio como resultado el vector pAM257. El plásmido de expresión pAM409 se metabolizó hasta su terminación utilizando las enzimas de restricción Xhol y Pcil, la mezcla de reacción se resolvió mediante electroforesis en geles, y el fragmento de ADN de aproximadamente 4.4 kb se extrajo mediante geles. El vector pAM257 se metabolizó hasta su terminación utilizando las enzimas de restricción Xhol y Pcil, y el fragmento aislado de ADN que contiene el promotor IacUV5 y operón ispFGH-idi-ispA se ligó dentro del sitio enzimático de restricción Xhol Pcil del vector pAM257, que dio como resultado el plásmido de expresión pAM424 (véase la Figura 8 para un mapa de plásmidos) .
Ejemplo 5 Este ejemplo describe métodos para elaborar plásmidos de expresión que codifican enzimas que convierten FPP o GPP. El plásmido de expresión pTrc99A-ADS se generó mediante la inserción de una secuencia de nucleótidos que codifica una amorfa-4 , 11-dieno sintasa ("ADS") dentro del vector pTrc99A. La secuencia de amorfa-4 , 11-dieno sintasa se generó sintéticamente, de modo que la traducción de la secuencia de aminoácidos fuera idéntica a la descrita por Merke et al. (2000) Ach. Biochem. Biophys . 381:173-180, de modo que la secuencia de nucleótidos que codifica la amorfa-4, 11-dieno sintasa se optimizó para expresión en Escherichia coli, y de modo que la secuencia de nucleótidos se flanqueó mediante un sitio enzimático de restricción 5' Ncol y 3' Xmal (véase Patente Norteamericana No. 7,192,751). La secuencia de nucleótidos se metabolizó hasta su terminación utilizando las enzimas de restricción Ncol y Xmal, la mezcla de reacción se resolvió mediante electroforesis en geles, el fragmento de ADN de aproximadamente 1.6 kb se extrajo por medio de geles, y el fragmento aislado de ADN se insertó dentro del sitio enzimático de restricción Ncol Xmal del vector pTrc99A (Ammán et al. (1985) Gene 40:183-190), que dio como resultado el plásmido de expresión pTrc99A-ADS (véase la Figura 9 un mapa de plásmidos) . El plásmido de expresión pA 113 es un derivado resistente al cloranfenicol de pTrc99A-ADS. Este se generó mediante la amplificación por PCR del gen de resistencia al cloranfenicol del vector pZA31-luc (Lutz y Bujard (1997) Nucí Acids Res. 25:1203-1210) utilizando cebadores 5' fosforilados 19-137 cml-pAM37-AS (SEQ ID ?0: 35)y 19-137 cml-pAM37-S (SEQ ID NO: 36) , y insertando el producto 920 bp de PCR dentro del sitio enzimático de restricción Fspl de plásmido de expresión pTrc99A-ADS, que dio como resultado el plásmido de expresión pAM113. El plásmido de expresión pC9 se generó mediante la inserción de un fragmento de ADN genómico de Bacillus subtilis 6051 que comprende la secuencia de codificación del gen nudF y secuencias genómicas corriente arriba (número de acceso en el GenBank 299116 REGIÓN: 49364.48548) dentro del vector pTrc99A (Amann et al. (1988) Gene 69:301-315). El plásmido de expresión pNudF-H se generó mediante la inserción de la secuencia de codificación del gen de Bacillus subtilis 6051 nudF (número de acceso en el GenBank Z99116 REGIÓN: 49105..48548) dentro del vector pTrc99A. El plásmido de expresión pyhfR se generó mediante la inserción de la secuencia de codificación del gen de Bacillus subtilis 6051 yhjR (número de acceso en el GenBank Z99109 REGIÓN: 97583..97002) dentro del vector pTrc99A. El plásmido de expresión pA 373 se generó mediante la inserción de una secuencia de nucleótidos que codifica la ß-farneseno sintasa ("FSB") de Artemisia annua (número de acceso en el GenBank AY835398) , con optimización de codones para expresión en Escherichia coli, dentro del vector pTrc99A. La secuencia de nucleótidos que codifica la ß-farneseno sintasa se generó sintéticamente, y se amplificó mediante PCR a partir de su construcción de síntesis de ADN utilizando los cebadores apropiados. Para crear un sitio enzimático de restricción líder Ncol en el producto de PCR que comprende la secuencia de codificación de ß-farneseno sintasa, el codón que codifica el segundo aminoácido en la secuencia de polipéptidos original (codificación TCG para serina) se reemplazó mediante un codón que codifica ácido aspártico (GAC) en el cebador de PCR 5' (SEQ ID NO: 37) . El producto resultante de PCR se metabolizó parcialmente utilizando la enzima de restricción Ncol, y se metabolizó hasta su terminación utilizando la enzima de restricción Sacl, la mezcla de reacción se resolvió mediante electroforesis en geles, el fragmento de ADN de aproximadamente 1.7 kb que comprende la secuencia de codificación de ß-farneseno sintasa se extrajo mediante geles, y el fragmento aislado de ADN se ligó dentro del sitio enzimático de restricción Ncol Sacl del vector pTrc99A, que dio como resultado el plásmido de expresión pAM373 (véase la Figura 9 para un mapa de plásmidos) . Los plásmidos de expresión pTrc99A-FSA, pTrc99A-GTS, pTrc99A-PS, pTrc99ATS se generaron mediante la inserción de un fragmento de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una a-farneseno sintasa ("FSA"), una ?-terpineno sintasa ("GTS"), una a-pineno sintasa ("APS"), o una terpinoleno sintasa ("TS") dentro del vector pTrc99A. El inserto de fragmento de ADN se generó sintéticamente, utilizando como una plantilla, por ejemplo, la secuencia de codificación del gen de farneseno sintasa de Picea abies (número de acceso en el GenBank AY473627, REGIÓN: 24..1766), la secuencia de codificación del gen de ß-farneseno sintasa de Artemisia annua (número de acceso en el GenBank AY835398) , la secuencia de codificación del gen de ?-terpineno sintasa de Citrus limón (número de acceso en el GenBank AF514286 REGIÓN: 30..1832), la secuencia de codificación del gen de a-pineno sintasa de Abies granáis (número de acceso en el GenBank U87909, REGIÓN: 6..1892) o de Pinus taeda (número de acceso en el GenBank AF543530 REGIÓN: 1..1887), o la secuencia de codificación del gen de terpinoleno sintasa de Ocimum basilicum (número de acceso en el GenBank AY693650) o de Pseudotsuga menziesii (número de acceso en el GenBank AY906866 REGIÓN : 10..1887 ) o de Abies granáis (número de acceso en el GenBank AF139206) , todas las secuencias de nucleótidos tienen optimización de codones para expresión en Escherichia coli. Los fragmentos de ADN para FSA se amplificaron mediante PCR a partir de su construcción de síntesis de ADN utilizando las secuencias de cebadores SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 40. El producto resultante de PCR se metabolizó hasta su terminación utilizando las enzimas de restricción Ncol y Sacl, la mezcla de reacción se resolvió mediante electroforesis en geles, el fragmento de ADN de aproximadamente 1.7 kb que comprende la secuencia de codificación de a-farneseno sintasa se extrajo mediante geles, y el fragmento aislado de ADN se ligó dentro del sitio enzimático de restricción Ncol Sacl del vector pTrc99A, que dio como resultado el plásmido de expresión pTrc99A-FSA (véase la Figura 9 para un mapa de plásmidos) . Los fragmentos de ADN para GTS, APS, y TS se designaron para flanquearse mediante un sitio enzimático de restricción líder Xmal y un sitio enzimático de restricción terminal Xbal, y se clonaron en los sitios enzimáticos de restricción compatibles de un vector de clonación tal como un vector de origen normal pUC o pACYC, a partir del cual podrían liberarse nuevamente mediante la metabolización de la construcción de síntesis de ADN hasta su terminación utilizando las enzimas de restricción Xbal y Xmal , resolviendo la mezcla de reacción mediante electroforesis en geles, y extrayendo por medio de geles la terpeno sintasa de 1.7 a 1.9 que codifica el fragmento de ADN. Los fragmentos aislados de ADN se ligaron dentro del sitio enzimático de restricción Xmal Xbal del vector pTrc99A (Ammán et al., Gene 40:183-190 (1985)), que dio como resultado los plásmidos pTrc99A-GTS, pTrc99A-APS, o pTrc99A-TS (véase la Figura 9 para mapas de plásmidos) . Los plásmidos de expresión pRS425-FSA y pRS425-FSB se generaron mediante la inserción de una secuencia de nucleótidos que codifica una -farneseno sintasa ("FSA") o una ß-farneseno sintasa ("FSB"), respectivamente, dentro del vector pRS425-Gall (Mumberg et . al. (1994) Nucí. Acids. Res. 22(25): 5767-5768). Los insertos de secuencia de nucleótidos se generaron sintéticamente, utilizando como una plantilla, por ejemplo, la secuencia de codificación del gen de o¡-farneseno sintasa de Picea abies (número de acceso en el GenBank AY473627, REGIÓN: 24..1766) o del gen de ß-farneseno sintasa de Artemisia annua (número de acceso en el GenBank AY835398) , con optimización de codones para expresión en Saccharomyces cerevisiae . La secuencia de nucleótidos generada sintéticamente se flanqueó mediante un sitio 5' BamHI y un sitio 3' Xhol , y pudo clonarse así en sitios enzimáticos compatibles de a vector de clonación tal como un vector de origen normal pUC o pACYC. La secuencia de nucleótidos generada sintéticamente se aisló mediante la metabolización hasta su terminación de la construcción de síntesis de ADN utilizando las enzimas de restricción BamHI y Xhol. La mezcla de reacción se resolvió mediante electroforesis en geles, el fragmento de ADN de aproximadamente 1.7 kb que comprende la secuencia de codificación de a-farneseno sintasa o ß-farneseno sintasa se extrajo mediante geles, y el fragmento aislado de ADN se ligó dentro del sitio enzimático de restricción BamHJ Xhol del vector pRS425-Gall, que dio como resultado el plásmido de expresión pRS425-FSA o pRS425-FSB, respectivamente. Los plásmidos de expresión pTrc99A-LLS, pTrc99A-LMS, pTrc99A-BPS, pTrc99APHS, pTrc99A-CS, y pTrc99A-SS se generan mediante la inserción de una secuencia de nucleótidos que codifica una linalol sintasa ( "LLS" ) , limoneno sintasa ("LMS"), ß-pineno sintasa ("BPS"), ß-felandreno ("PHS"), careno sintasa ("CS"), o sabinina sintasa ("SS") dentro del vector pTrc99A. Los insertos de la secuencia de nucleótidos se generan sintéticamente, utilizando como una plantilla, por ejemplo, la secuencia de codificación del gen de linalol sintasa de Artemisia annua (número de acceso en el GenBank AF154124, REGIÓN: 13..1764), la secuencia de codificación del gen de limoneno sintasa de Abies granáis (número de acceso en el GenBank AF006193 REGIÓN: 73..1986), la secuencia de codificación de la ß-pineno sintasa de Artemisia annua (número de acceso en el GenBank AF276072 REGIÓN: 1..1749), la secuencia de codificación del gen de ß-felandreno sintasa de Abies granáis (número de acceso en el GenBank AF139205 REGIÓN: 34..1926), la secuencia de codificación del gen de careno sintasa gen de Salvia stenophylla (número de acceso en el GenBank AF527416 REGIÓN: 78..1871), o la secuencia de codificación del gen de sabineno sintasa de Salvia officinalis (número de acceso en el GenBank AF051901 REGIÓN: 26..1798). Las secuencias de nucleótidos que codifican la ß-pineno, sabinina, y ß-felandreno sintasas se flanquean mediante un sitio enzimático de restricción líder Xmal y un sitio enzimático de restricción terminal Xbal, las secuencias de nucleótidos que codifican la linalol y careno sintasas se flanquean mediante un sitio enzimático de restricción líder Ncol y un sitio enzimático de restricción terminal Xmal, y la secuencia de nucleótidos que codifica la limoneno sintasa se flanquea mediante un sitio enzimático de restricción líder Ncol y un sitio enzimático de restricción terminal Pstl. Las construcciones de síntesis de ADN se metabolizan hasta su terminación utilizando las enzimas de restricción Xmal y Xbal (para las construcciones de ß-pineno, sabinina, y ß-felandreno sintasa) , Ncol y Xmal (para las construcciones de linalol y careno sintasa) , o las enzimas de restricción Xbal y PstI (para la construcción de limoneno sintasa) . Las mezclas de reacción se resuelven mediante electroforesis en geles, los fragmentos de ADN de aproximadamente 1.7 a 1..9 kb se extrajeron mediante geles, y los fragmentos aislados de ADN se ligan dentro del sitio enzimático de restricción Xmal Xbal (para los insertos de ß-pineno, sabinina, y ß-felandreno sintasa) , el sitio enzimático de restricción Ncol Xmal (para los insertos de linalol y careno sintasa) , o el sitio enzimático de restricción Xbal PstI (para el inserto de limoneno sintasa) del vector pTrc99A, que dio como resultado los plásmidos de expresión pTrc99A-LLS, pTrc99A-LMS, pTrc99A-BPS, pTrc99A-PHS, pTrc99ACS, y pTrc99A-SS (véase la Figura 9 para mapas de plásmidos) .
Ejemplo 6 Este ejemplo describe la generación de cepas huésped de Escherichia coli útiles en la invención. Como se detalla en la Tabla 1, las cepas huésped se crearon mediante la transformación química competente de células madre de Escherichia coli con uno o más plásmidos de expresión de los Ejemplos 1 a 5.
Tabla 1. Cepas huésped de E. coli Los transformantes de la célula huésped se seleccionaron con agar Luria Bertoni (LB) que contiene antibióticos, como se detalla en Tabla 1. Las colonias individuales se transfirieron de agar LB a tubos de cultivo que contienen 5 mL de medio líquido LB y antibióticos. Los transformantes de las células huésped B003, B617, B618, B619, B650, B651, B652, y B653 se incubaron a 30°C en un agitador giratorio a 250 rpm durante 30 horas. Todos los otros transformantes de las células huésped se incubaron a 37°C en un agitador giratorio a 250 rpm hasta que el crecimiento alcanzó la fase detenida. Las células se adaptaron a un medio mínimo pasándolas a través de 4 a 5 rondas sucesivas de medio M9-MOPS que contiene 0.8% de glucosa y antibióticos (véase la Tabla 2 para la composición del medio M9-MOPS) . Las células se almacenaron a -80°C en frascos de crioprecipitado en alícuotas para almacenamiento de 1 mL compuestas por 400 uL de 50% de glicerol estéril y 600 uL de cultivo líquido.
Tabla 2 - Composición del Medio de Cultivo M9-MOPS Ejemplo 7 Este ejemplo demuestra la estabilidad de los plásmidos de expresión en la ausencia de antibióticos en una cepa huésped de Escherichia coli que contiene un plásmido de expresión que comprende el sistema de replicación, segregación, y mantenimiento del plásmido RK2. Un cultivo de semillas de la cepa huésped B255 se estableció agregando una alícuota para almacenamiento de la cepa en un frasco de 125 mL que contiene 40 mL de M9-MOPS, 2% de glucosa, 0.5% de extracto de levadura, y antibióticos, como se detalla en la Tabla 1, y al hacer crecer el cultivo durante la noche . Se utilizó el cultivo de semillas para inocular en una OD6oo inicial de aproximadamente 0.05, dos matraces de 250 mL, conteniendo cada uno 40 mL del medio M9-MOPS, 2% de glucosa y 0.5% de extracto de levadura. El cultivo #1 también contenía 100 g/mL de carbenicilina y 34 g/mL de cloranfenicol . El cultivo #2 no recibió ningún antibiótico. Ambos cultivos se incubaron a 37°C en un agitador giratorio a 250 rpm hasta que alcanzaron una OD6oo de aproximadamente 0.2, en cuyo punto la producción del amorfa-4 , 11-dieno en las células huéspedes se indujo agregando 40 pL de 1M IPTG al medio de cultivo. En el momento de la inducción, los cultivos se recubrieron con 8 mL de un revestimiento orgánico para capturar el amorfa-4 , 11-dieno . Se tomaron muestras periódicamente durante un total de 72 horas. La producción del amorfa-4 , 11-dieno por la cepa huésped en los 2 cultivos se confirmó por GC/MS como se describe en el Ejemplo 10. Para evaluar la estabilidad plasmática en los dos cultivos celulares, se removió una muestra de cada cultivo en 72 horas y se mantuvo sobre una placa de agar LB (sin antibióticos) . Después de una incubación nocturna a 37°C, 50 colonias individuales derivadas de cada cultivo se formaron en placas por duplicado sobre una placa de LB agar-más-antibióticos (34 g/mL de cloranfenicol , 100 g/mL de carbenicilina) y una placa de LB agar-menos-antibióticos (sin antibióticos) . Después de otra incubación nocturna a 37°C, se encontró que cada una de las placas de LB agar-más-antibióticos y de LB agar-menos antibióticos contenía aproximadamente 50 colonias, indicando que la retención de plásmido tanto en la presencia como en la ausencia de antibióticos en el medio de cultivo había sido aproximadamente 100%.
Ejemplo 8 Este ejemplo demuestra la actividad y estabilidad específica incrementada de la HMGR del Enterococcus faecalis comparada a la tHMGR de Saccharomyces cerevisiae en una cepa huésped de Escherichia coli. Cultivos de semillas de las cepas huéspedes B61 y B62 se asentaron agregando una alícuota en existencia de cada cepa a 125 mL de los matraces conteniendo 20 mL del medio M9- OPS, 0.8% de glucosa, y antibióticos como se detalla en la Tabla 5, y cultivando los cultivos para saturación. Los cultivos de semillas se diluyeron 1:100 en 140 mL de un medio recién preparado en un matraz de 500 mL, y se cultivaron nuevamente a una OD550 de aproximadamente 0.1, en cuyo punto la producción del amorfa-4 , 11-dieno se indujo agregando 140 L de 1M IPTG a cada cultivo. En 4, 12, 20, 28, 36 y 49 horas de post-inducción, las muestras se removieron de cada cultivo, y las células se granularon por centrifugación. Los gránulos celulares se crio-protegieron en hielo seco, y luego se almacenaron a -80°C. Para conducir los ensayos enzimáticos, los gránulos celulares se descongelaron sobre hielo y luego se lisaron utilizando Bugbuster (Novagen, Madison, WI) conteniendo una mezcla #3 inhibidora de proteasa (Calbiochem, San Diego, CA) , benzonasa (20 pL oer5 mL bugbuster; Novagen, Madison, WI) y lisozima (30 pg/mL) . La actividad enzimática de la tHMGR de Saccharomyces cerevisiae se evaluó en 50 mM de Tris HC1 (pH 7.5), 0.2 mM de NADPH (Sigma, St . Louis, MO) y 0.3 mM de la sal sódica de la coenzima A de DL-3-hidroxi-3-metilglutarilo (HMG-CoA) (Sigma, St. Louis, MO) . El ensayo se inició agregando el lisato celular, y la desaparición de la NADPH se monitoreo por absorbancia a 350 nM. Para determinar la desaparición no específica de la NADPH, resultados obtenidos en un ensayo control que carecen de HMG-CoA se sustrajeron de resultados obtenidos en muestras de prueba. La actividad enzimática de la HMGR de Enterococcus faecalis se midió en forma similar excepto que el tampón de ensayo contenía 100 mM de tampón de fosfato de potasio (pH 6.5), 0.4 mM de NADPH, 1.0 mM de EDTA y 100 mM de KC1. Se hicieron los ensayos de proteínas por el método de Bradford ((1976) Anal Biochem. 72:248-254). Se calcularon las actividades específicas como Anmol de la proteína NADPH/min/mg. Ejemplo 9 Este ejemplo describe la calibración de la OD60o con un peso celular seco ("DCW"). Para obtener la relación entre el DCW y la OD600, una cepa representativa B32, se cultivó en procesos de densidad celular elevados similares a aquellos descritos en los Ejemplos 10-12. Se tomaron muestras en todas las producciones, y la OD60o y el DCW se midieron para cada muestra. Para determinar el DCW, las células se granularon y el sobrenadante se desechó. El gránulo celular se lavó una vez con agua, y luego se secó en un horno a 80°C durante por lo menos 3 días. Los tubos que contienen gránulos celulares se pesaron, el peso del tubo se sustrajo de los pesos medidos, y el peso restante se dividió por el volumen inicial de cada muestra (0.0015 L) para obtener el DCW.
Ejemplo 10 Este ejemplo demuestra la producción incrementada del amorfa-4 , 11-dieno en cepas huéspedes de Escherichia coli la HMGR y HMGS de Staphylococcus aureus comparadas con las cepas huéspedes que expresan la tHMGR y la HMGS de Saccharomyces cerevisiae . Los cultivos de semillas de las cepas huéspedes B32, B153, B210, B282, B292, B86, B255 y B256 se establecieron agregando una alícuota en existencia de cada cepa para separar matraces de 125 mL que contienen 25 mL del medio M9-M0PS, 0.8% de glucosa y antibióticos como se detalla en la Tabla 1, y cultivando los cultivos durante la noche. Los cultivos de semillas se utilizaron para inocularse en una OD60o inicial de aproximadamente 0.05 de matraces de 250 mL separados conteniendo 40 mL de medio M9-MOPS, 2% de glucosa, y antibióticos. Los cultivos se incubaron a 30°C en un agitador giratorio a 250 rpm hasta que alcanzaron una OD6oo de aproximadamente 0.2, en cuyo punto la producción del amorfa-4 , 11 -dieno en las células huéspedes se indujo agregando 40 L de 1M IPTG al medio de cultivo. Los cultivos se recubrieron con 8 mL de un revestimiento orgánico (por ejemplo, dodecano, oleato de metilo o miristato de isopropilo) . Se tomaron muestras de la capa del revestimiento orgánico y el caldo una vez al día durante 72 horas. Se utilizaron muestras del caldo para medir la OD6oo- Se midió la concentración del amorfa-4 , 11-dieno transfiriendo 5 L de la capa de revestimiento orgánico a un frasco de vidrio limpio que contiene 500 L de acetato de etilo adicionado con beta o trans-cariofileno como un estándar inicial. Se analizaron las muestras del revestimiento orgánico/acetato de etilo en un cromatógrafo de gas/espectómetro de masa Hewlett-Packard 6890 (GC/MS) barriendo sólo para dos iones, el ión molecular (204 m/z) y el ión 189 m/z, como se describe en Martin et al. (2001) Biotechnol. Bioeng. 75:497-503. Para agilizar los tiempos de ejecución, el programa de temperatura y la matriz de columna se modificó para lograr la resolución pico óptima y el tiempo de ejecución. Se separó una muestra de 1 L en el GC utilizando una columna DB-XLB (disponible de Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA) y gas helio portador. El programa de temperatura para el análisis fue como sigue: 100 °C durante 0.75 minutos, incrementando la temperatura a 60°C/minuto a una temperatura de 300°C, y una retención a 300°C durante 0.5 minutos. Se analizaron las muestras resueltas por un detector selectivo de masa Hewlett-Packard modelo 5973 que monitorea iones 189 y 204 m/z. El espectro de masa previo demostró que el producto del amorfa-4 , 11-dieno sintasa fue amorfa-4 , 11-dieno y que el amorfa-4 , 11-dieno tuvo un tiempo de retención de 3.7 minutos utilizando este protocolo GC. Se utilizó el beta o trans-cariofileno como un estándar interno para cuantificación . Se calculó el título del amorfa-4 , 11-dieno utilizando la relación del estándar interno a las áreas pico del amorfa-4 , 11-dieno basado en una curva de calibración cuantitativa del amorfa-4 , 11-dieno purificado (0.63-10 mg/L de KJF17-109-3) en acetato de etilo adicionado con cariofileno.
Ejemplo 11 Este ejemplo demuestra la producción incrementada del amorfa-4 , 11-dieno por una cepa huésped de Escherichia coli cultivada a una temperatura sub-óptima. Un cultivo de semillas de la cepa huésped B32 se estableció agregando 0.5 mL de una alícuota en existencia de la cepa a un matraz de 250 mL conteniendo 50 mL del medio 9-MOPS y antibióticos como se detalla en la Tabla 1, y cultivando el cultivo durante la noche a 37°C en un agitador giratorio a 250 rpm. Se utilizó el cultivo de semillas para inocularse en una OD6oo inicial de aproximadamente 0.05, cuatro matraces de 250 mL, cada uno conteniendo 40 mL del medio de termentador discontinuo (véase la Tabla 6 para la composición del medio), 100 mM del tampón MOPS pH 7.1, y antibióticos. Los cultivos se incubaron en un agitador giratorio a 250 rpm ya sea a 30°C o 37°C, hasta que alcanzaron una OD600 de 0.18 a 0.22, en cuyo punto la producción del amorfa-4 , 11-dieno en las células huéspedes se indujo agregando 40 L de 1 IPTG al medio de cultivo. En el momento de la inducción, los cultivos se recubrieron con 8 mL de un revestimiento orgánico para capturar el amorfa-4 , 11-dieno . Se tomaron muestras una vez al día, y se analizaron como se describe en el Ejemplo 10.
Ejemplo 12 Este ejemplo demuestra la producción incrementada del amorfa-4 , 11-dieno por una cepa huésped de Escherichia coli cultivada bajo condiciones restringidas de la fuente de carbono . Un cultivo de semillas de la cepa B32 huésped para los procesos de ejecución de fermentación 050608-1 y 050629-1 se estableció agregando 0.25 L de una alícuota en existencia de la cepa a un matraz de 250 mL conteniendo 50 mL del medio 9- OPS y antibióticos como se describe en la Tabla 1, e incubando el cultivo a 37 °C en un agitador giratorio a 250 rpm hasta que alcanzó una OD6oo de 1 a 2. Un cultivo de semillas de la cepa huésped B32 el proceso de ejecución de fermentación 060403-3 se estableció agregando una alícuota en existencia de la cepa a un matraz de 250 mL conteniendo 50 mL del medio M9-MOPS y antibióticos como se detalla en la Tabla 1, e incubando el cultivo durante la noche a 37°C en un agitador giratorio a 250 rpm. El cultivo de semillas se utilizó para inocularse en una OD6oo inicial de aproximadamente 1 matraz de 250 mL conteniendo 40 mL del medio M9-MOPS y antibióticos, y el cultivo se incubó de nuevo a 37 °C en un agitador giratorio a 250 rpm hasta que alcanzó una OD600 de 3 a 5. Para todos los procesos de fermentación, el KH2P04, K2HP04/ 3H20, EDTA, ácido cítrico y (NH4)2S04 se esterilizaron con calor en el biorreactor (2L Applikon Bioconsole ADI 1025s con controladores ADI 1010, Applikon Biotechnology, Foster City, CA) . Los componentes del medio restante se esterilizaron por filtro como soluciones madre y se inyectaron a través de la placa principal. La Tabla 3 muestra la composición de medio final para procesos de ejecución de fermentación 050608-1 y 050629-1. La Tabla 4 muestra la composición del medio final para el proceso de ejecución de fermentación 060403-3. El volumen de partida para el proceso de ejecución 050608-1 fue 0.8 L, el volumen de partida para 050629-1 fue 1.2 L y el volumen de partida para 060403-3 fue 1 L. Todos los procesos de ejecución se inocularon inyectando 50 mL del cultivo de semillas a través de la placa principal.
TABLA 3 - Composición del Medio de Fermentación de los Procesos de Ejecución de Fermentación 050608-1 y 050629-1.
Tabla 4 - Composición del Medio de Fermentación del Proceso de Ejecución de Fermentación 060403-3 Para el proceso de ejecución de fermentación 050608-1 (carbono en exceso) , se inició la alimentación en la inducción, y los índices de alimentación se ajustaron manualmente. Para el proceso de ejecución de fermentación 050629-1 (carbono restringido) , se suministró la alimentación al termentador de acuerdo con el protocolo mostrado en la Tabla 5. Para el proceso de ejecución de fermentación 060403-3 (carbono más bajo) , la alimentación se inició automáticamente cuando el bolo de glucosa inicial (15 g) se agotó y el oxígeno disuelto se adicionó. Hasta un máximo de 27.6 g/hora, la velocidad de la alimentación se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación: µ = 0?2 S(t0)«\5g en donde to es el tiempo en el cual se eliminó la glucosa inicial. Al alcanzar la velocidad máxima, se restringió la alimentación de la glucosa a una velocidad de 9.5 g/hora, y se mantuvo constante en esta velocidad para el resto del proceso de ejecución.
Tabla 5 - Protocolo de Alimentación para el Proceso de Ejecución de Fermentación 050629-1 Tiempo de ejecución Velocidad de Alimentación (horas) de Glucosa (g/hora) 0 0 7 0.37 10 0.74 12 1.11 14 1.48 16 2.22 18 2.96 20 3.69 22 4.80 24 5.91 31 7.39 33 5.54 47 3.69 Los procesos de ejecución 050608-1 y 050629-1 se llevaron a cabo a 37°C. El flujo de aire en el biorreactor se estableció a 1-2 L/min; se mantuvo el pH a 7 utilizando hidróxido de amonio y/o hidróxido de sodio; la agitación inicial fue 500-600 rpm; se controló la espuma con antiespuma B (Sigma-Aldrich, St . Louis, MO) ; se mantuvieron los niveles de oxígeno disuelto sobre 30% utilizando una cascada de agitación. Después de 5-6 horas de cultivo, la producción del amorfa-4 , 11-dieno por las células huéspedes se indujo agregando 0.8 mL de 1M IPTG al proceso de ejecución 050608-1 y 1.2 mL de IPTG al proceso de ejecución 050629-1. En la inducción, la temperatura del cultivo se redujo a 30°C. El proceso de ejecución 060403-3 se llevó a cabo a 30°C. El flujo de aire en el biorreactor se estableció a 1-2 L/min; el pH se mantuvo en 7 utilizando hidróxido de amonio. El oxígeno disuelto se mantuvo sobre 30% por una cascada de agitación y un enriquecimiento del oxígeno. En una OD60o de aproximadamente 28 (19 horas después de la inoculación) , la producción del amorfa-4 , 11-dieno por las células huéspedes se indujo agregando 1 mL de 1 IPTG. Se capturó y extrajo el amorfa-4 , 11-dieno de acuerdo a dos diferentes protocolos. Para los procesos de ejecución 050608-1 y 050629-1, el amorfa-4 , 11 -dieno volátil presente en el gas residual se capturó ventilando el gas residual a través de un lavador de gas conteniendo 200 mL de heptanol . El heptanol se diluyó entonces en acetato de etilo hasta que la concentración del amorfa-4 , 11-dieno en la muestra estuvo entre 0.63 mg/L y 20 mg/L. Para el proceso de ejecución 060403-3, se capturó el amorfa-4 , 11-dieno en el biorreactor agregando 200 mL de un revestimiento orgánico al termentador en el momento de la inducción. Se midió la concentración del producto combinando 25 pL del caldo más el revestimiento orgánico con 975 pL de acetonitrilo, agitando la muestra a una velocidad máxima en un mezclador Fisher Vortex Genie 2™ (Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY) durante al menos 3 minutos, removiendo las células de la muestra por centrifugación, y diluyendo la solución de acetonitrilo en acetato de etilo hasta que la concentración de amorfa-4 , 11-dieno en la muestra estuvo entre 0.63 y 20 mg/L. Las muestras de acetato de etilo se analizaron por GC/MS como se describe en el Ejemplo 10.
Ejemplo 13 Este ejemplo demuestra la producción incrementada de amorfa-4 , 11-dieno por una cepa huésped de Escherichia coli cultivada bajo condiciones restringidas de fuente de carbono y a temperatura subóptima. Un cultivo de semillas de la cepa huésped B153 se estableció agregando una alícuota en existencia de la cepa a un matraz de 250 mL conteniendo 50 mL del medio M9-MOPS y antibióticos como se detalla en la Tabla 1, y cultivando el cultivo a 37 °C en un agitador giratorio a 250 rpm a una OD60o de 3.5 a 4.5. Biorreactores de 2 L (Biocontrolador ADI 1010 con Bioconsola ADI 1025, Applikon Biotechnology, Foster City, CA) , se ensamblaron y activaron en la misma forma como se describe en el Ejemplo 12 para el proceso de ejecución 060403-3, excepto que la cepa y el momento de la inducción variaron. La producción del amorfa-4 , 11 -dieno en las células huéspedes se indujo agregando 1 mL de 1 M IPTG al medio de cultivo. Se capturó y extrajo el amorfa-4 , 11-dieno de acuerdo con dos diferentes protocolos. En un método, el amorfa-4, 11-dieno volátil presente en el gas residual se capturó ventilando el gas residual a través del lavador de gas conteniendo 200 mL de heptanol . El heptanol se diluyó entonces en acetato de etilo hasta que la concentración de amorfa-4 , 11-dieno en la muestra estuvo entre 0.63 y 20 mg/L, en otro amorfa-4 , 11 -dieno se capturó agregando 200 mL de un revestimiento orgánico al fermentador en el momento de la inducción . Se extrajo el amorfa-4 , 11-dieno del medio de cultivo combinando 25 uL del caldo con 975 uL de acetonitrilo, agitando la muestra a una velocidad máxima en un mezclador Fisher Vortex Genie 2™ (Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY) durante al menos 3 minutos, removiendo células de la muestra por centrifugación, y diluyendo la solución de acetonitrilo en acetato de etilo hasta que la concentración de amorfa-4 , 11-dieno en la muestra estuvo entre 0.63 y 20 mg/L. Se analizaron las muestras de acetato de etilo por GC/MS como se describe en el Ejemplo 10.
Ejemplo 14 Este ejemplo demuestra la producción incrementada de amorfa-4 , 11-dieno por una cepa huésped de Escherichia coli cultivada bajo condiciones restringidas de una fuente de carbono y nitrógeno y a temperatura subóptima. Un cultivo de semillas de la cepa huésped B86 se estableció agregando una alícuota en existencia de la cepa a un matraz de 250 mL conteniendo 50 mL del medio M9- OPS y antibióticos como se detalla en la Tabla 1. El cultivo se cultivó durante la noche a 37°C en un agitador giratorio a 250 rpm, sub-cultivado la siguiente mañana en el mismo medio en una OD6oo de aproximadamente 1, y se cultivó de nuevo a 37°C y 250 rpm a una OD600 de 3 a 5. Cuatro biorreactores de 2 L (Biocontrolador ADI 1010 con Bioconsola ADI 1025, Applikon, Biotechnology, Foster City, CA) se ensamblaron y activaron en la misma forma como se describe en el Ejemplo 12 para el proceso de ejecución 060403-3, excepto que los procesos de ejecución restringidos por el nitrógeno no contuvieron sulfato de amoniaco en la alimentación . Una alimentación de glucosa exponencial con un tiempo de duplicación de 6 horas se inició automáticamente cuando el bolo de glucosa inicial (15 g) se agotó y el oxígeno disuelto se adicionó. En un máximo de 30.4 g/hora, se calculó la velocidad de alimentación de acuerdo con la siguiente ecuación: m„( = 50^"<'-'") ^ = 0.12 min"' S0=\5g en donde ? es el índice de crecimiento específico, y t0 es el tiempo en el cual el bolo de glucosa inicial se eliminó. Al alcanzar el índice máximo, la alimentación de la glucosa se redujo a una velocidad de 11.4 g/hora, y se mantuvo constante en esta velocidad para el resto del proceso de ejecución. En los procesos de ejecución de fermentación 060710-4, 060724-5 y 060619-5 (carbono y nitrógeno restringido) , la alimentación de glucosa se redujo además cuando la restricción de amoniaco condujo a acumulación de glucosa en el medio. Se llevó a cabo la fermentación a la temperatura reducida de 30°C. El flujo de aire en el biorreactor se estableció a 1 vvm; la agitación inicial fue a 700 rpm; se controló la espuma con una antiespuma B (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ; y se controló la tensión disuelta del oxígeno a 40% utilizando una cascada de agitación (700-1,200 rpm) y un enriquecimiento del oxígeno. En el proceso de ejecución de fermentación 060327-3 (carbón restringido) , el pH se mantuvo a 7 utilizando 20% de NH40H; en los procesos de ejecución de fermentación 060710-4, 060724-5 y 060619-5 (carbono y nitrógeno restringido) , el pH se mantuvo a 7 inicialmente utilizando 20% de NH4OH, e iniciando a 72 horas utilizando una mezcla de 50/50 de 2.5 N de NaOH y 10 N de NH4OH, para restringir además la cantidad de amoniaco que entra al termentador. La producción del amorfa-4 , 11-dieno en las células huéspedes se indujo a una OD60o de aproximadamente 30, agregando 1 mL de 1M IPTG al medio de cultivo. Se capturó el amorfa-4 , 11-dieno recubriendo el medio con 10% (v/v) de un revestimiento orgánico. Se extrajo entonces el amorfa-4 , 11-dieno combinando 25 µ?_ del caldo con 975 L de metanol, agitando la muestra a una velocidad máxima en un mezclador Fisher Vortex Genie 2™ (Scientific Industries, Inc., Bohemia, N.Y.) durante al menos 15 minutos, removiendo las células de la muestra por centrifugación, y agregando 10 µ?? de la solución de metanol a 990 pL de acetato de etilo que contiene 10 uL/L del trans-cariofileno . Se analizaron las muestras por GC/MS como se describe en el Ejemplo 10.
Ejemplo 15 Este ejemplo describe la producción del amorfa-4, 11-dieno mediante la trayectoria de DXP en una cepa huésped de Escherichia coli. Cultivos de semillas de las cepas huéspedes B003, B617, B618 y B619 se establecieron agregando una alícuota en existencia de cada cepa para separar matraces de 125 mL que contienen 25 mL de M9-M0PS y antibióticos como se detalla en la Tabla 1, y cultivando los cultivos durante la noche. Se utilizaron cultivos de semillas para inocularse en una OD60o inicial de aproximadamente 0.05, matraces de 250 mL separados que contienen 40 mL del medio M9- 0PS, 45 ug/mL de tiamina, micronutrientes , 1.00E-5 mol/L de FeS04 , 0.1 M de MOPS, 0.5% de extracto de levadura, 20 g/L de D-glucosa y antibióticos. Se incubaron los cultivos a 30°C en un agitador de incubación humidificado a 250 rpm hasta que alcanzaron una OD6oo de 0.2 a 0.3, en cuyo punto la producción del amorfa-4 , 11-dieno en las células huéspedes se indujo agregando 40 uL de 1M IPTG al medio de cultivo. En el momento de la inducción, los cultivos se recubren con 8 mL de un revestimiento orgánico para capturar el amorfa- , 11-dieno . Se toman muestras en varios puntos de tiempo, y el amorf - , 11-dieno se extrajo y analizó por GC/MS como se describe en el Ejemplo 10. Se realizaron experimentos utilizando 2 clones independientes de cada cepa huésped, y los resultados se promedian. La desviación entre las muestras se encontró que es menor de 10%.
Ejemplo 16 Este ejemplo describe la producción de 3-metil-but- en-l-ol y 3-metil-but-2-en-l-ol en cepas huéspedes de Escherichia coli. Los cultivos de semillas de las cepas huéspedes B286, B287 y B291 se establecieron al mantener una alícuota en existencia de cada cepa en agar LB conteniendo antibióticos como se detalla en la Tabla 1. Tres colonias independientes se seleccionaron para cada cepa, y cada colonia se inoculó en 7 mL de un medio LB que contiene antibióticos. Los cultivos se cultivaron durante la noche a 37°C en un agitador giratorio a 250 rpm hasta la última fase exponencial. Los cultivos se inocularon entonces en una OD60o de aproximadamente 0.05, en un matraz de 250 mL que contiene 40 mL de M9-MOPS, 2% de glucosa, 0.5% de extracto de levadura, y antibióticos. Los cultivos se cultivaron durante la noche a 37°C en un agitador giratorio a 250 rpm hasta que alcanzaron una OD6oo de aproximadamente 0.2, en cuyo punto se indujeron agregando 40 uL de 1M IPTG. Los cultivos se cultivaron durante 72 horas a 30°C en un agitador giratorio a 250 rpm. Una a dos veces al día, la OD60o de cada cultivo se midió, y se removió una muestra de 700 uL. Para extraer el 3-metil-but-3 -en-l-ol y 3-metil-but-2-en-l-ol a partir del caldo de cultivo, se agregó 600 uL de acetato de etilo a 300 uL de cada muestra removida. La muestra se agitó con vórtice durante 15 minutos, y se transfirió 400 uL de la fase de acetato de etilo superior a un frasco de vidrio limpio para análisis. Las muestras se analizaron en un cromatógrafo de gas/espectrómetro de masa Hewlett-Packard 6890 (GC/MS) . Se separó una muestra de 1 uL en el GC utilizando una columna DB-5 (Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA) y un gas portador de helio. El programa de temperatura para el análisis fue como sigue: 60 °C durante 3 minutos, incrementando la temperatura a 60°C/minuto a una temperatura de 300°C, y una retención a 300°C durante 2 minutos. El tiempo de activación total fue 9 minutos. Se analizaron las muestras resueltas por un detector selectivo de masa Hewlett-Packard modelo 5973. El espectro de masa previo demostró que el 3-metil-3-buten-l-ol y el 3-metil-2-buten-l-ol tienen un tiempo de retención de 2.067 minutos utilizando este protocolo GC. Se empleó la detección de enfoque en el 3-metil-but-3-en-l-ol y el 3-metil-but-2-en-l-ol, un método de monitoreo de ión selectivo que monitorea sólo iones 56 y 58 en un 3-metil-but-3-en-l-ol y 3-metil-but-2-en-l-ol .
Ejemplo 17 Este ejemplo describe la producción del amorfa-4,11-dieno por una cepa huésped de Saccharomyces cerevisiae. La generación de la cepa huésped EPY224 se describe en Ro et al. {Nature 440:940-943; 2006) y en la Publicación de Patente PCT WO2007/005604. La cepa huésped EPY224 se curó del plásmido de expresión pRS425ADS por crecimiento en un medio YPD ( ethods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005, ed. , ISBN 0-87969-728-8), formando en placas para colonias sencillas en agar YPD, y luego parchando las colonias sencillas sobre agar CSM-Met His y agar CSM-Met Leu. Los clones que crecen en el agar CSM-Met His, pero no en CSM-Met Leu se curaron (es decir, habían perdido el plásmido pRS425ADS) . Se designó un clon EPY300. Se transformó el EPY300 con un plásmido de expresión pRS425-ADS-LEU2d, un plásmido idéntico a pRS425-ADS excepto que en lugar de LEU2 contiene un marcador de selección LEU2d (Erhart y Hollenberg (1983) J. Bacteriol. 156:625-635) produciendo la cepa huésped Y185. Se seleccionaron transformantes de la célula huésped Y185 en un medio sintético definido, conteniendo 2% de glucosa y todos los aminoácidos excepto histidina, leucina y metionina (CSM-glucosa; MP Biomedicals, Solón, OH) . La célula huésped EPY300 es autotrófica para biosíntesis de leucina (leu2) , pero el plásmido de expresión pRS425-ADS-LEU2d en Y185 restaura la prototrofia de la leucina {LEU2) . Se parcharon colonias sencillas sobre un medio selectivo (CSM-glucosa-histidina, leucina, metionina) y se cultivaron durante 2 días. Las células se rasparon de la placa y se transfirieron a 1 mL de 25% (v/v) de glicerol en un criotubo. La suspensión se mezcló y luego se almacenó a -80°C.
Los matraces de semillas de la célula huésped Y185 se establecieron agregando una alícuota en existencias de la cepa a un matraz de 125 mL conteniendo 25 mL de CSM-glucosa que carece de leucina y metionina, y cultivando los cultivos durante la noche. Los cultivos se utilizaron para inocularse a una OD6oo inicial de aproximadamente 0.05, un matraz de fondo dentado de 250 mL que contiene 40 mL del medio sintético definido que carece de leucina y conteniendo 0.2% de glucosa, 1.8% de galactosa y 1 mM de metionina. El cultivo se incubó a 30°C en un agitador giratorio a 200 rpm. Debido a que la presencia de la glucosa en el medio evita la inducción del promotor GAL1 por galactosa, la producción de amorfa-4,11-dieno no se indujo hasta que las células habían utilizado la glucosa en el medio y se habían invertido utilizando galactosa como su principal fuente de carbono. En el momento de la inoculación, los cultivos se recubrieron con 8 mL de un revestimiento orgánico para capturar el amorfa-4,11-dieno. Se tomaron muestras en 72 horas transfiriendo 5 uL de la capa de solvente orgánico a un frasco de vidrio limpio que contiene 500 uL de acetato de etilo conteniendo una concentración conocida de beta o trans-cariofileno como un estándar interno. Se analizaron las muestras del revestimiento orgánico/acetato de etilo en un cromatógrafo de gas/espectrómetro de masa Hewlett-Packard 6890 (GC/MS) como se describe en el Ejemplo 10. Después de 72 horas de crecimiento, se encontraron 3 cultivos de levadura para producir 60.68, 54.48 y 59.25 mg/L de amorfa-4 , 11-dieno .
Ejemplo 19 Este ejemplo describe la producción de amorfa-4, 11-dieno en una cepa huésped de Saccharomyces cerevisiae en donde la cepa huésped incluye una trayectoria de mevalonato nativa así como una trayectoria de mevalonato heterologo que está bajo control de un control regulador heterologo. Las cepas de levadura CEN.PK2-1C (Y002) (MATA; ura3-52; trpl-289; leu2-3, 112; his3Al; MAL2-8C; SUC2) y CEN.PK2-1D (Y003) (MATalfa; ura3-52; trpl-289; leu2-3, 112; his3Al; MAL2-8C; SUC2 ) (J.P. van Dijken et al., Enzyme Microb Technol 26, 706 (junio 1 de 2000) se cultivaron en un medio rico estándar (YPD) o en un medio sintético definido (.D. Rose, F. Winston, P. Heiter, Methods in yeast genetics : a laboratory course manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1990), que carece de nutrientes apropiados permitiendo la selección de transformantes integrativos , retención plasmática y progenie meiótica . Las transformaciones mediadas por ADN en S. cerevisiae se condujeron utilizando el procedimiento de acetato de litio como se describe por R. H. Schiestl, R.D. Gietz, Curr Genet 16, 339 (Diciembre de 1989) . Todas las interrupciones genéticas y reemplazos se confirmaron por análisis fenotípico, colonia de reacción de cadena de polimerasa ("PCR") y secuenciando el ADN genómico amplificado. Los plásmido pAM489-pAM498 se construyeron utilizando el pCR 2.1 (Invitrogen, Carlsbad CA) y se describen esquemáticamente por las Figuras 7A-C y la Tabla 6. Las secuencias marcadoras HISMX se describen en M.S. Longtine et al. Yeast 14, 953 (julio de 1998) . La propagación del ADN plásmido se realizó en la cepa DH5 de Escherichia coli.
Tabla 6 Se prepararon las cepas Y002 y Y003 de S. cerevisiae para la introducción de genes de trayectoria del mevalonato inducible por lo siguiente. Se reemplazó el promotor ERG9 con el promotor MET3 de S. cerevisiae por amplificación de PCR de la región KanMX-PMET3 de pAM328 (SEQ ID NO: 43) utilizando cebadores 50-56 pwl00-G (SEQ ID NO: 44) y 50-56-pwlOl-G (SEQ ID NO: 45) conteniendo 45 pares de bases de homología al promotor ERG9 nativo. 10 pg del producto de PCR resultante se transformó cultivando exponencialmente las cepas Y002 y Y003 utilizando 40% de p/p de polietilenglicol 3350 (Sigma-Aldrich St Louis, MO) , 100 mM de acetato de litio (Sigma) , 10 g de ADN de esperma de salmón (Invitrogen) y la incubación a 30 °C durante 30 minutos seguida por un choque térmico de 42 °C durante 30 minutos (como se describe por Schiestl & Gietz, Curr. Genet. 16:339 (1989)). Se identificaron recombinantes positivos para su capacidad para cultivarse en un medio rico que contiene 0.5 pg/mL de Geneticina (Invitrogen Co, Carlsbad, CA) y se confirmaron por PCR en el diagnóstico. Los clones resultantes se dieron en la designación Y93 (MAT A) y Y94 (MAT alfa) . Después, el marco de lectura abierto ADE1 se reemplazó con el gen LEU2 de Candida glabrata {CgLEU2) . El sitio genómico 3.5 KG CgLEU2 se amplificó a partir del ADN genómico de C. glabrata (ATCC, Manassas, VA) utilizando cebadores 61-67-CPK066-G (SEQ ID NO: 46) y 61-67-CPK067-G (SEQ ID NO: 47) conteniendo 50 pares de bases de la homología de flanqueo al marco de lectura abierto (ORF) ADE1. 10 \ig del producto de PCR resultante se transformó para cultivar exponencialmente Y93 y Y94 como se describe anteriormente. Se seleccionaron las cepas adel para crecimiento en la ausencia de un suplemento de leucina y se confirmó para PCR en el diagnóstico. Los clones resultantes se dieron en la designación Y176 (MAT A) y Y177 (MAT alfa) . Para generar la cepa Y188 de S. cerevisiae, 2 g del ADN plásmido a partir de pAM491 (SEQ ID NO: 48) y pAM495 (SEQ ID NO: 49) , respectivamente, se digirieron durante la noche con Pmel (New England Biolabs, Beverly, MA) y se introdujeron cultivando exponencialmente Y176 como se describe anteriormente. Se seleccionaron recombinantes positivos para el crecimiento en un medio careciendo de uracilo e histidina. Se confirmó la integración en el sitio genómico correcto por PCR en el diagnóstico. Para generar la cepa Y189 de S. cerevisiae, 2 g del ADN plásmido a partir de pAM489 (SEQ ID NO: 50) y pAM497 (SEQ ID NO: 51) , respectivamente, se digirieron durante la noche con Pmel y se introdujeron cultivando exponencialmente Y177 como se describe anteriormente. Se seleccionaron recombinantes positivos para el crecimiento en un medio careciendo de triptófano e histidina. Se confirmó la integración en el sitio genómico correcto por PCR en el diagnóstico. Aproximadamente 1 x 107 células de Y188 y Y189 se mezclaron en una placa del medio YPD durante 6 horas a temperatura ambiente para permitir el acoplamiento. El cultivo celular mezclado se formó entonces en placas al medio que carece de histidina, uracilo y triptófano para seleccionar para crecimiento de células diploides. 2 pg del ADN plásmido de pAM493 (SEQ ID NO: 52) se digirió durante la noche con Pmel y se introdujo para cultivar exponencialmente células diploides como se describe anteriormente. Se seleccionaron recombinantes positivos para crecimiento en un medio que carece de adenina. La integración en el sitio genómico correcto se confirmó por PCR en el diagnóstico. La cepa resultante se dio la designación Y238. Para generar cepas haploides que contienen el complemento completo de los genes introducidos, Y238 se produjo en esporas en 2% de acetato de potasio y 0.02% de un medio líquido de rafinosa. Aproximadamente 200 tétradas genéticas (tétradas son cuatro productos meióticos en esporas) se aislaron utilizando un micromanipulador serie Singer Instruments MSM300 (Singer Instrument Co, LTD. Somerset, RU) . Los aislados genéticos independientes que contienen el complemento apropiado del material genético introducido se identificaron por su capacidad para cultivarse en la ausencia de adenina, histidina, uracilo y triptófano. La integración de todo el ADN introducido se confirmó por PCR en el diagnóstico. Las cepas resultantes se dieron en la designación Y210 (MAT A) y Y211 ( AT alfa) . 2 pg del ADN plásmido de pAM426 (SEQ ID NO: 53), conteniendo una Amorfadeina Sintasa (ADS) optimizada con el codón de S. cerevisiae expresada del promotor GAL1 de S. cerevisiae, se introdujo al cultivar exponencialmente Y210 y Y211 como se describe anteriormente. Las cepas de S. cerevisiae que contenía el plásmido pAM426 se seleccionaron por su capacidad para cultivarse en la ausencia del suplemento de leucina. Las cepas resultantes se dieron en la designación Y225 (MAT A) y Y227 (MAT alfa) . 2 µg del ADN plásmido de pAM322 (SEQ ID NO: 54) , conteniendo la Amorfadeina Sintasa (ADS) optimizada con el codón de S. cerevisiae y la citocromo P450 monooxigenasa (AMO) expresada de la GAL1 de S. cerevisiae y la citocromo P450 oxido reductasa (CPR) expresada del promotor GALIO de S. cerevisiae, se introdujo al cultivar exponencialmente Y210 y Y211 como se describe anteriormente. Las cepas de S. cerevisiae que contenían el plásmido pAM322 se seleccionaron por su capacidad para cultivarse en la ausencia del suplemento de leucina. Las cepas resultantes se dieron en la designación Y222 (MAT A) y Y224 (MAT alfa) .
Ejemplo 19 Este ejemplo describe la producción de a-farneseno o ß-farneseno en cepas huéspedes de Escheríchia coli. Los cultivos de semillas de las cepas huéspedes B552 y B592 se establecieron agregando una alícuota en existencia de cada cepa a un matraz de 125 mL conteniendo 25 mL de M9-MOPS, 0.8% de glucosa, 0.5% de extracto de levadura, y antibióticos como se describe en la Tabla 1, y cultivando los cultivos durante la noche. Se utilizaron los cultivos de semillas para inocularse en una OD60o inicial de aproximadamente 0.05, matraces de 250 mL que contienen 40 mL de MP-MOPS, 2% de glucosa, 0.5% de extracto de levadura y antibióticos. Se incubaron los cultivos a 30°C en un agitador giratorio a 250 rpm hasta que alcanzaron una OD6oo de aproximadamente 0.2, en cuyo punto la producción del a-farneseno o ß-farneseno en las células huéspedes se indujeron agregando 40 L de 1M IPTG. En el momento de la inducción, los cultivos se recubrieron con 8 mL de un revestimiento orgánico para capturar el a-farneseno. Se tomaron las muestras cada 24 horas hasta 120 horas (un total de 5 puntos de tiempo) transfiriendo 2 uL a 10 uL de la capa de revestimiento orgánico a un frasco de vidrio limpio que contiene 1 mL de acetato de etilo adicionado con trans-cariofileno como un estándar interno. Además, se hicieron girar 1 mL de alícuotas de los cultivos, los gránulos celulares se volvieron a suspender en 250 uL de agua estéril, y las suspensiones celulares se transfirieron a un frasco de vidrio conteniendo 1 mL de acetato de etilo adicionado con trans-cariofileno como un estándar interno. Además, 0.5 mL de alícuotas del caldo de cultivo completo se agregaron a frascos de vidrio conteniendo 1 mL de acetato de etilo adicionado con trans-cariofileno como un estándar interno. Las muestras del caldo de cultivo completo se extrajeron en el acetato de etilo agitando con vórtice los frascos de vidrio durante 10 minutos, después de lo cual 600 uL de la extracción de acetato de etilo se transfirió a un frasco de vidrio limpio. Se analizaron las muestras del revestimiento orgánico/acetato de etilo y las muestras de caldo de cultivo completo extraído del acetato de etilo en un cromatógrafo de gas Agilent 6890N equipado con un espectrómetro de masa Agilent 5975 (GC/MS) en un modo de barrido total (50-500 m/z) . Para agilizar los tiempos de ejecución, el programa de temperatura y la matriz de columna se modificó para lograr la resolución pico óptima y el tiempo de ejecución total más corto. Se separó una muestra de 1 uL utilizando una columna HP-5MS (Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA) y el gas portador de helio. El programa de temperatura para el análisis fue como sigue: retención de 150 °C durante 3 minutos, incrementando la temperatura a 25°C/minuto a una temperatura de 200°C, incrementando la temperatura a 60°C/minuto a una temperatura de 300°C y una retención a 300°C durante 1 minuto. El espectro de masa previo demostró que el producto de ß-farneseno sintasa fue ß-farneseno, y que el ß-farneseno tuvo un tiempo de retención de 4.33 minutos utilizando este protocolo GC. Los títulos de farneseno se calcularon comparando las áreas pico generadas contra una curva de calibración cuantitativa de ß-farneseno purificado (Sigma-Aldrich Chemical Company, St. Louis, MO) , en acetato de etilo adicionado con trans-cariofileno . La cepa huésped B592 produjo aproximadamente 400 mg/1 de a-farneseno en 120 horas (promediado sobre 3 clones independientes) , y tuvo una productividad específica máxima de aproximadamente 46 mg/L/OD600. La cepa huésped B552 produjo aproximadamente 1.1 g/L del ß-farneseno en 120 horas (promedio sobre 3 clones independientes) , y tuvo una productividad específica máxima de aproximadamente 96 mg/L/OD60o (1 clon representativo) .
Ejemplo 20 Este ejemplo describe la producción del ß-farneseno mediante la trayectoria DXP en una cepa huésped de Escherichia coli. Los cultivos de semillas de las cepas huéspedes B650, B651, B652 y B653 se establecieron agregando una alícuota en existencia de cada cepa para separar los matraces de 125 mL que contienen 25 mL de M9-MOPS y antibióticos como se detalla en la Tabla 1, y cultivando los cultivos durante la noche . Los cultivos de semillas se utilizaron para inocularse en una OD6oo inicial de aproximadamente 0.05, matraces de 250 mL separados que contienen 40 mL del medio mínimo de M9-MOPS, 45 ug/mL de tiamina, micronutrientes , 1.00E-5 mol/L de FeS04 , 0.1 M de MOPS, 0.5% de extracto de levadura, 20 g/1 de D-glucosa, y antibióticos. Los cultivos se incubaron a 30°C en un agitador de incubación humidificado a 250 rpm hasta que alcanzaron una OD60o de 0.2 a 0.3, en cuyo punto la producción de ß-farneseno en las células huéspedes se indujo agregando 40 uL de 1 M IPTG al medio de cultivo. En el momento de la inducción, los cultivos se recubrieron con 8 mL de un revestimiento orgánico para capturar el ß-farneseno. Se tomaron muestras en varios puntos de tiempo transfiriendo 100 uL de las muestras en la capa de revestimiento orgánico a un tubo limpio. El tubo se centrifugó para separar cualesquiera células o medios restantes, y 10 uL de las muestras del revestimiento orgánico se transfirieron en 500 uL de acetato de etilo adicionadas con beta o trans-cariofileno como un estándar mínimo en frascos GC de vidrio limpio. Las mezclas se agitaron en vórtice durante 30 segundos, y luego se analizaron como se describe en el Ejemplo 18. La cepa huésped B653 de Escherichia coli produjo aproximadamente 7 mg/g de DCW ß-farneseno .
Ejemplo 21 Este ejemplo describe la producción de a-farneseno o ß- farneseno en una cepa huésped de Saccharomyces cerevisiae . La cepa EPY300 se generó removiendo el plásmido de expresión a partir de la cepa EPY224 de Saccharomyces cerevisiae (Ro et al. (2006) Nature 440:940-943; Publicación de Patente PCT WO2007/005604 ) cultivando en un medio rico. La cepa EPY300 se transformó entonces con plásmidos de expresión pRS425-FSA o pR425-FSB, produciendo cepas huéspedes Y166 y Y164, respectivamente. Se seleccionaron transformantes de células huéspedes en un medio sintético definido, conteniendo 2% de glucosa y todos los aminoácidos excepto leucina (SM-glu) . La cepa huésped EPY300 fue autotrófica para la biosintesis de leucina (leu2) , pero el plásmido de expresión pRS425-FSA o pRS425-FSB restaura la prototrofia de la leucina (LEU2) . Se transformaron colonias sencillas a frascos de cultivo conteniendo 5 mL de SM-glu que carece de leucina. Los cultivos se incubaron agitando a 30 °C hasta que el crecimiento alcanza la fase estacionaria. Las células se almacenaron a -80°C en crio-frascos en 1 mL de alícuotas congeladas hechas de 400 uL de 50% de glicerol y 600 uL del cultivo líquido. Se establecieron los cultivos de semillas agregando una alícuota en existencia a un matraz de 125 mL conteniendo 25 mL de SM-glu que carece de leucina, y cultivando los cultivos durante la noche. Se utilizaron los cultivos de semillas para inocularse a una OD60o inicial de aproximadamente 0.05, matraces deflectores de 250 mL que contienen 40 mL del medio sintético definido que carece de leucina, 0.2% de glucosa y 1.8% de galactosa. Se incubaron los cultivos a 30°C en un agitador giratorio a 200 rpm. Debido a que la presencia de la glucosa en el medio evita la inducción del promotor Gall por la galactosa, la producción de farneseno no se indujo hasta el uso de las células en la glucosa en el medio y la interrupción utilizando galactosa como su fuente de carbono principal. Los cultivos se recubren con 8 mL de oleato de metilo o miristato de isopropilo. Se tomaron muestras una vez cada 24 horas transfiriendo 2-10 uL de la capa de solvente orgánico a un frasco de vidrio limpio conteniendo 500 uL de acetato de etilo que contiene una concentración conocida de beta o trans-cariofileno como un estándar interno. Además, 0.5 mL de alícuotas del caldo de cultivo completo se agregaron a un frasco de vidrio que contiene 1 mL de acetato de etilo adicionado con trans-cariofileno como un estándar interno. Las muestras de caldo de cultivo completas se extrajeron en el acetato de etilo agitando con vórtex los frascos de vidrio durante 10 minutos, después de lo cual se transfirió 600 uL de la extracción de acetato de etilo a un frasco de vidrio limpio. La cepa huésped Y166 produjo aproximadamente 9.8 mg/1 de un a-farneseno a 120 horas (promediado sobre 3 clones independientes) y tuvo una productividad específica máxima de aproximadamente 3 mg/L/OD60o (1 clon representativo) . La cepa huésped Y164 produjo aproximadamente 56 mg/L de ß-farneseno en 120 horas (promediado sobre 3 clones independientes) y tuvo una productividad específica máxima de aproximadamente 20 mg/L/OD6oo (1 clon representativo) .
Ejemplo 22 Este ejemplo describe la producción de ?-terpineno, a-pineno y terpinoleno en cepas huéspedes de Escherichia coli . Los cultivos de semillas de las cepas huéspedes para la producción de ?-terpineno (E. coli DHl-Tlr [pMEvT, pMevB-Gpps, pAM445] , a-pineno (E. coli DHl-Tlr [pMevT, pMevB-Gpps, pAM443 o pAM442] ) , o terpinoleno (E . coli DHl-Tlr [pMevT, pMevB-Gpps, pAM444] se establecieron agregando una alícuota en existencias de cada cepa para separar matraces de 125 mL que contienen 25 mL de 9-MOPS, 2% de glucosa, 0.5% de extracto de levadura, y antibióticos como se detalla en la Tabla 1, y cultivando los cultivos durante la noche a la última fase exponencial. Se utilizaron cultivos de semillas para inocularse en una OD6oo inicial de aproximadamente 0.05, matraces de 250 mL que contienen 40 mL de M9-MOPS, 2% de glucosa, 0.5% de extracto de levadura, y antibióticos. En el momento de la inoculación, los cultivos se recubrieron también con 4 mL de hexadecano. Los cultivos se incubaron a 30°C en un agitador giratorio a 200-250 rpm hasta que alcanzaron una OD6oo de aproximadamente 0.2, en cuyo punto la producción del compuesto de interés en las células huéspedes en las células huéspedes se indujo agregando 40 uL de 1M IPTG. Se tomaron las muestras una vez al día durante 96 horas transfiriendo 200 uL de la capa de hexadecano a un tubo para microcentrifuga . Para análisis, se diluyó el revestimiento de hexadecano 1:1 ó 1:10 con acetato de etilo adicionado con trans-cariofileno como un estándar interno en un frasco GC de 1.8 mL. Además, 1 mL de alícuotas de los cultivos se hicieron girar, los granulos celulares se volvieron a suspender en 250 uL de agua estéril, y las suspensiones celulares se transfirieron a un frasco de vidrio conteniendo 1 mL de acetato de etilo adicionado con trans-cariofileno como un estándar interno. Los gránulos celulares se extrajeron en el acetato de etilo girando en vórtex los frascos de vidrio durante 15 minutos, después de lo cual 500 uL de la extracción de acetato de etilo se transfirió a un frasco de vidrio limpio. Las muestras de hexadecano/acetato de etilo y las muestras de acetato de etilo-gránulos celulares extraídos se analizaron en un cromatógrafo de gas Agilent 6890N equipado con un espectrómetro de masa Agilent 5975 (GC/ S) en un modo de barrido total (50-500 m/z) . Para agilizar los tiempos de ejecución, el programa de temperatura y la matriz de columna se modificó para lograr la resolución pico óptima y el tiempo de ejecución total más corto. Se dividió una muestra de 1 uL (una relación de división entre 1:2 y 1:50 se seleccionó con base en la concentración de la muestra) y luego se separó utilizando una columna HP-5MS (Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA) y un gas portador de helio. El programa de temperatura para el análisis fue como sigue: retención a 75 °C durante 3 minutos, incrementando la temperatura a 20°C/minuto a una temperatura de 115°C, incrementando la temperatura a 60°C/minuto a una temperatura de 300°C y una retención a 300°C durante 0.5 minutos. Los diversos productos, ?-terpineno, a-pineno y terpinoleno se observaron en 5.4, 4.1, 5.4 y 5.9 minutos, respectivamente. Los títulos se calcularon comparando las áreas pico generadas contra una curva de calibración cuantitativa de estándares purificados en acetato de etilo adicionado con trans-cariofileno .
Ejemplo 23 Este ejemplo describe la producción de linalool, limoneno, ß-pineno, ß-felandreno, careno o sabinina en cepas huéspedes de Escherichia coli. Se establecieron cultivos celulares agregando una alícuota en existencia de cada cepa para separar matraces de 125 mL que contienen 25 mL de 9-M0PS, 0.5% de extracto de levadura, 2% de glucosa y antibióticos como se detalla en la Tabla 1, y cultivando los cultivos durante la noche. Se utilizan los cultivos de semillas para inocularse a una ODSOo inicial de aproximadamente 0.05, matraces de fondo dentado de 250 mL que contienen 40 mL de M9-M0PS, 0.5% de extracto de levadura, 2% de glucosa y antibióticos. Los cultivos se incuban a 30°C en un agitador giratorio a 250 rpm hasta que alcanzaron una OD60o de aproximadamente 0.2, en cuyo punto la producción del compuesto de interés en las células huéspedes se induce agregando 40 uL de 1M IPTG al medio de cultivo. El compuesto de interés se separa del medio de cultivo mediante la extracción de solvente-solvente, o por asentamiento y decantación si el título del compuesto de interés es suficientemente grande para saturar el medio y para formar una segunda fase .

Claims (48)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un sistema de producción de compuestos bio-orgánicos que comprende: a. un recipiente que tiene una capacidad de por lo menos 100 litros; b. un medio acuoso, dentro del recipiente, que forma una primera fase ; c. una pluralidad de células huésped, dentro del medio acuoso, capaz de hacer por lo menos un compuesto bio-orgánico; y, d. una segunda fase orgánica líquida, que comprende por lo menos un compuesto bio-orgánico, en contacto con la primera fase.
  2. 2. El sistema como en la reivindicación 1, en donde por lo menos un compuesto bio-orgánico es un compuesto bio-orgánico- de 5 átomos de carbono.
  3. 3. El sistema como en la reivindicación 2, en donde por lo menos un compuesto bio-orgánico es un compuesto bio-orgánico de 10 átomos de carbono.
  4. 4. El sistema como en la reivindicación 2, en donde por lo menos un compuesto bio-orgánico es un compuesto bio-orgánico de 15 átomos de carbono.
  5. 5. El sistema como en la reivindicación 2, en donde por lo menos un compuesto bio-orgánico es un compuesto bio-orgánico de 20 átomos de carbono.
  6. 6. El sistema como en la reivindicación 2, en donde por lo menos un compuesto bio-orgánico es un compuesto bio-orgánico de 20+ átomos de carbono.
  7. 7. El sistema como en la reivindicación 1, en donde por lo menos un compuesto bio-orgánico es un compuesto isoprenoide .
  8. 8. El sistema como en la reivindicación 1, en donde el recipiente tiene una capacidad de por lo menos 1000 litros .
  9. 9. El sistema como en la reivindicación 1, en donde el recipiente tiene una capacidad de por lo menos 10,000 litros.
  10. 10. El sistema como en la reivindicación 1, en donde el recipiente tiene una capacidad de por lo menos 50,000 litros.
  11. 11. El sistema como en la reivindicación 1, en donde el recipiente tiene una capacidad de por lo menos 100,000 litros.
  12. 12. El sistema como en la reivindicación 1, en donde el recipiente tiene una capacidad de por lo menos 500,000 litros.
  13. 13. El sistema como en la reivindicación 1, en donde el recipiente tiene una capacidad de por lo menos 1,000,000 litros.
  14. 14. El sistema como en la reivindicación 1, en donde la segunda fase orgánica comprende el compuesto bio-orgánico .
  15. 15. El sistema como en la reivindicación 1, en donde la segunda fase orgánica comprende por lo menos 90% del compuesto bio-orgánico .
  16. 16. Un sistema para elaborar compuestos isoprenoides de 5 a 20 átomos de carbono que comprende: a. un recipiente que tiene una capacidad de por lo menos 100 litros; b. un medio acuoso, dentro del recipiente, que comprende una primera fase; c. una pluralidad de células huésped, dentro del medio acuoso, capaz de hacer por lo menos un isoprenoide; y, d. una segunda fase orgánica líquida, que comprende por lo menos un isoprenoide, en contacto con la primera fase.
  17. 17. El sistema de la reivindicación 16, en donde el compuesto isoprenoide es un hemiterpeno.
  18. 18. El sistema de la reivindicación 16, en donde el compuesto isoprenoide es un monoterpeno.
  19. 19. El sistema de la reivindicación 16, en donde el compuesto isoprenoide es un sesquiterpeno .
  20. 20. El sistema de la reivindicación 16, en donde el compuesto isoprenoide es un diterpeno.
  21. 21. Un método para producir un compuesto bio- orgánico que comprende : a. cultivar en un medio acuoso una pluralidad de células huésped que producen por lo menos un compuesto bio-orgánico, en donde el medio acuoso y células huésped comprenden una primera fase; b. formar una segunda fase orgánica líquida que comprende por lo menos un compuesto bio-orgánico en contacto con la segunda fase; c. separar por lo menos una porción de la segunda fase a partir de la primera fase; y, d. aislar por lo menos un compuesto bio-orgánico a partir de la segunda fase.
  22. 22. El método de la reivindicación 21, en donde la segunda fase orgánica se forma mediante inducción.
  23. 23. El método de la reivindicación 21, en donde la segunda fase orgánica se separa al decantar la segunda fase a partir de la primera fase.
  24. 24. El sistema como en la reivindicación 21, en donde por lo menos un compuesto bio-orgánico es un compuesto bio-orgánico de 5 átomos de carbono.
  25. 25. El sistema como en la reivindicación 21, en donde por lo menos un compuesto bio-orgánico es un compuesto bio-orgánico de 10 átomos de carbono.
  26. 26. El sistema como en la reivindicación 21, en donde por lo menos un compuesto bio-orgánico es un compuesto bio-orgánico de 15 átomos de carbono.
  27. 27. El sistema como en la reivindicación 21, en donde por lo menos un compuesto bio-orgánico es un compuesto bio-orgánico de 20 átomos de carbono.
  28. 28. El sistema como en la reivindicación 21, en donde por lo menos un compuesto bio-orgánico es un compuesto bio-orgánico de 20+ átomos de carbono.
  29. 29. El método de la reivindicación 21, en donde el paso de aislamiento comprende adsorción.
  30. 30. El método de la reivindicación 21, donde el paso de aislamiento comprende destilación.
  31. 31. El método de la reivindicación 21, en donde el paso de aislamiento comprende extracción de gas-líquido.
  32. 32. El método de la reivindicación 21, en donde el paso de aislamiento comprende extracción de líquido- líquido .
  33. 33. El método de la reivindicación 21, en donde el paso de aislamiento comprende ultrafiltración.
  34. 34. El método de la reivindicación 21, en donde por lo menos un compuesto bio-orgánico es un compuesto isoprenoide.
  35. 35. Un método para producir un compuesto isoprenoide de 5 a 20 átomos de carbono que comprende: a. cultivar en un medio acuoso una pluralidad de células huésped que producen por lo menos un compuesto isoprenoide de 5 a 20 átomos de carbono en un recipiente que tiene una capacidad de por lo menos 100 litros; b. formar una fase orgánica que comprende por lo menos un compuesto isoprenoide de 5 a 20 átomos de carbono; c. separar por lo menos una porción de la fase orgánica del medio acuoso; y, d. aislar por lo menos un compuesto isoprenoide de 5 a 20 átomos de carbono de la fase orgánica.
  36. 36. El método de la reivindicación 35, en donde por lo menos un compuesto isoprenoide es un hemiterpeno.
  37. 37. El método de la reivindicación 35, en donde por lo menos un compuesto isoprenoide es un monoterpeno.
  38. 38. El método de la reivindicación 35, en donde por lo menos un compuesto isoprenoide es un sesquiterpeno .
  39. 39. El método de la reivindicación 35, en donde por lo menos un compuesto isoprenoide es un diterpeno.
  40. 40. El método de la reivindicación 35, en donde la fase orgánica se forma mediante inducción.
  41. 41. El método de la reivindicación 35, en donde la fase orgánica se separa mediante la decantación la fase orgánica de la fase acuosa.
  42. 42. El método de la reivindicación 35, en donde el paso de aislamiento comprende adsorción.
  43. 43. El método de la reivindicación 35, en donde el paso de aislamiento comprende destilación.
  44. 44. El método de la reivindicación 35, en donde el paso de aislamiento comprende extracción de gas-liquido.
  45. 45. El método de la reivindicación 35, en donde el paso de aislamiento comprende extracción de líquido- líquido .
  46. 46. El método de la reivindicación 35, en donde el paso de aislamiento comprende ultrafiltración.
  47. 47. Un sistema de producción de composición de combustible que comprende: a. uno o más sistemas de fermentación que comprenden: i) por lo menos un recipiente que tiene una capacidad de por lo menos 100 litros; ii) un medio acuoso, dentro de por lo menos un recipiente, que comprende una primera fase; iii) una pluralidad de células huésped, dentro del medio acuoso, capaces de hacer, producir o sintetizar por lo menos un compuesto bio-orgánico; y, iv) una segunda fase orgánica líquida que comprende por lo menos un compuesto bio-orgánico en contacto con la primera fase; b. uno o más sistemas de separación de la primera fase, por medio de los cuales la primera fase y la segunda fase orgánica o uno o más componentes de la segunda fase orgánica se separan; e. opcionalmente, uno o más sistemas de separación de la segunda fase, por medio de los cuales por lo menos un compuesto bio-orgánico se separa de la segunda fase orgánica; d. opcionalmente, uno o más reactores o recipientes, en donde por lo menos un compuesto bio-orgánico se modifica química o biológicamente; e. opcionalmente, uno o más sistemas de purificación por medio de los cuales el compuesto bio-orgánico o el compuesto bio-orgánico modificado se purifica o se purifica aún más; f. opcionalmente, uno o más recipientes para mezclar o sistemas para mezclar por lo menos un compuesto bio-orgánico con uno o más componentes adicionales de combustible; y g. opcionalmente, uno o más sistemas adicionales de purificación, por medio de los cuales la mezcla de por lo menos un compuesto bio-orgánico y uno o más componentes adicionales de combustible se purifican o se purifican aún más .
  48. 48. Un método para hacer una composición de combustible que comprende; a. cultivar en un medio acuoso una pluralidad de células huésped que producen, hacen o sintetizan por lo menos un compuesto bio-orgánico, en donde el medio acuoso comprende una primera fase; b. formar una segunda fase orgánica líquida que comprende por lo menos un compuesto bio-orgánico en contacto con la primera fase; c. separar por lo menos una porción de la segunda fase de la primera fase; d. aislar por lo menos un compuesto bio-orgánico de la segunda fase; e. opcionalmente , modificar química o biológicamente por lo menos un compuesto bio-orgánico; f. opcionalmente, purificar el compuesto bio-orgánico o el compuesto bio-orgánico modificado; g. opcionalmente, mezclar por lo menos un compuesto bio-orgánico. con uno o más componentes adicionales de combustible; y h. opcionalmente, purificar la mezcla de uno o más compuestos bio-orgánicos y uno o más componentes adicionales de combustible. RESUMEN DE LA INVENCIÓN Un sistema y método para producir compuestos bio-orgánicos que puede incluir un recipiente, una primera fase que comprende un medio acuoso que incluye células huésped capaces de producir un compuesto bio-orgánico, donde el compuesto bio-orgánico comprende una segunda fase en contacto con el medio acuoso.
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