CN105331518A - 制造生物有机化合物的设备 - Google Patents

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Abstract

生产生物有机化合物的系统和方法，其包括容器、包括水性培养基的第一相，所述水性培养基含有能够生产生物有机化合物的宿主细胞，其中所述生物有机化合物组成与水性培养基接触的第二相。

Description

制造生物有机化合物的设备
本申请是申请号为200780028412.4的申请的分案申请。
原申请的申请日：2007年05月25日
原申请的申请号：200780028412.4
原申请的发明名称：制造生物有机化合物的设备
相关申请的交叉参考
本申请要求2006年5月26日提交的名称为“生产类异戊二烯的微生物(MICROOGRANISMSFORPRODUCTIONOFISOPRENOIDS)”的美国临时申请60/808,989；2006年5月26日提交的名称为“生物燃料及其生产方法(BIOFUELSANDMETHODSFORPRODUCTION)”的美国专利US60/808,666；2006年12月12日提交的名称为“类异戊二烯的生产(PRODUCTIONOFISOPRENOIDS)”的美国专利U.S.60/870,592；和2007年4月10日提交的名称为“制造生物有机化合物的设备(APPARATUSFORMAKINGBIO-ORGANICCOMPOUNDS)”的美国专利U.S.60/922,782的优先权，它们的所有内容全部引入本文作为参考。
发明背景
传统上，通过从自然资源例如植物、微生物和动物中提取来制造感兴趣的生物有机化合物。但是，提取产量通常是非常低的，因为绝大部分生物有机化合物在自然界中都以很小的数量来积累。虽然这些数量远远少于许多商业应用所需，但是仍然存在对以工业规模生产生物有机化合物的系统和方法的需求。
本发明符合了这种需要。本发明提供的是采用宿主细胞制造生物有机化合物的各种工业规模的系统。这些生物有机化合物具有至少五个碳原子，而且可以是碳水化合物，例如单或多元醇、酯、醚、醛、酮，或者碳氢化合物例如烷、烯、或炔。所述生物有机化合物可以是线状的或者环状的，并且可以是饱和的或者不饱和的。
发明概述
本发明提供了各种生物有机化合物的生产系统。一方面，提供了生物有机化合物的生产系统，其包括：
a.至少一个容量至少100升的容器；
b.容器内的水性培养基，组成第一相；
c.水性培养基内的大量宿主细胞，其能够制造、生产或者合成至少一种生物有机化合物；和，
d.与第一相接触的液体有机第二相，其包含所述至少一种生物有机化合物。
另一方面，本发明提供了生产至少一种生物有机化合物的方法。该方法包括：
a.在水性培养基中培养大量宿主细胞，这些宿主细胞制造、生产或者合成至少一种生物有机化合物，其中该水性培养基组成第一相；
b.形成与第一相接触的有机第二相，该有机第二相包含所述生物有机化合物；
c.从第一相中分离有机第二相的至少一部分；和，
d.从有机第二相中分离所述至少一种生物有机化合物。
附图说明
图1是本发明中使用的容量至少100升的容器。
图2是容器的另一个实施方案。
图3是生产异戊烯二磷酸(“IPP”)的甲羟戊酸(“MEV”)途径的图解说明。
图4是生产IPP和二甲基丙烯焦磷酸(“DMAPP”)的DXP途径的图解说明。Dxs是1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶；Dxr是1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(也称为IspC)；IspD是4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶；IspE是4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶；IspF是2C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环二磷酸合成酶；IspG是1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合成酶(IspG)；而且ispH是异戊烯/二甲基丙烯二磷酸合成酶。
图5是IPP和DMAPP转化成香叶基焦磷酸(“GPP”)、法尼西基焦磷酸(“FPP”)、和香叶基香叶基焦磷酸(“GGPP”)的图示。
图6显示了表达质粒pMBIS-gpps的图谱。
图7显示了表达质粒Pam00408的图谱。
图8显示了表达质粒pAM424的图谱。
图9显示了表达质粒pTrc99A-ADS、pTrc99A-FSA、pTrc99A-LLS、pTrc99A-LMS、pTrc99A-GTS、pTrc99A-APS、pTrc99A-BPS、pTrc99A-PHS、pTrc99A-TS、pTrc99A-CS、pTrc99A-SS、和pAM373的图谱。
图10是质粒pAM489-pAM498的质粒构建图。
发明详述
定义
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语均与本发明所属技术领域普通技术人员的常规理解具有相同含义。本文所引用的许多术语被定义为具有如下含义：
“生物有机化合物”是指具有至少五个碳原子，可以由宿主细胞通过摄取碳水化合物碳源并将碳水化合物碳源转化成期望的产物来制造的有机化合物。
本文中使用的“脱氧木酮糖5-磷酸途径”或者“DXP途径”是指将甘油醛-3-磷酸和丙酮酸转化成IPP和DMAPP的途径。DXP途径在图4中进行图示说明。
“内源性的”是指可以天然存在，例如存在于未重组的宿主细胞中的物质或者过程。
如同本文使用的，“外源核酸”是指符合以下条件的至少一个的核酸：(a)所述核酸对给定的宿主细胞来说是外来的(“外源的”)(即，从细胞中不能天然发现的)；(b)所述核酸包含天然存在于给定的宿主细胞中的核苷酸序列(即，对细胞是“内源性的”)，但是该核苷酸序列在所述细胞中以反常数量(例如，多于预期或者多于天然发现的数量)产生；(c)所述核酸包含序列上与内源性核苷酸序列不同的核苷酸序列，但是该核苷酸序列编码相同的蛋白(具有相同或者实质上相同的氨基酸序列)，而且在所述细胞中以反常数量(例如，多于预期或者多于天然发现的数量)产生；或者(d)所述核酸包含两种或者更多种核苷酸序列，这些核苷酸序列彼此在天然界并未发现具有相同的联系(例如，该核酸是重组的)。
本文中“宿主细胞”和“微生物”可互换使用，是指其中可以被或者已经被插入外源核酸的任何古细菌、细菌、或者真核活细胞。该术语也涉及原始细胞的后代，它们由于自然的、意外的或者蓄意的突变而可能不一定与原始的亲代在形态学上完全一致，或者在基因组或总DNA上完全互补。
本文中“类异戊二烯”和“类异戊二烯化合物”可互换使用，是指源自异戊烯二磷酸的化合物。
当“分离”涉及生物有机化合物时，是指在组合物中富集一定量的生物有机化合物。因此，在生物有机化合物被分离或者进行分离步骤后，组合物中的生物有机化合物的数量将多于该步骤前该组合物中存在的数量。
本文中使用的“甲羟戊酸途径”或者“MEV途径”是指将乙酰辅酶A转化成IPP的生物合成途径。MEV途径在图3中图示说明。
当“天然存在”被应用于核酸、酶、细胞、或者生物体时，是指在自然界中发现的核酸、酶、细胞、或者生物体。例如，存在于可从自然界来源中分离的生物中，并且没有被人在实验室中刻意修饰过的多肽或者多核苷酸序列是天然存在的。
“可选择”或者“可选择地”是指其随后描述的特征或结构可以存在也可以不存在，或者该随后描述的事件或情况可以发生也可以不发生，而且该描述包括特定的特征或结构存在的情况和特征或结构不存在的情况，或者事件或情况发生的情况和事件或情况不发生的情况。
本文中“焦磷酸”与“二磷酸”可互换使用。
如同本文中使用的，是“基本纯”的化合物的组合物基本上不含一种或多种其它化合物，即所述组合物包含占该组合物总体积的多于80体积％、多于90体积％、多于95体积％、多于96体积％、多于97体积％、多于98体积％、多于99体积％、多于99.5体积％、多于99.6体积％、多于99.7体积％、多于99.8体积％、多于99.9体积％的所述化合物；或者少于20体积％、少于10体积％、少于5体积％、少于4体积％、少于3体积％、少于2体积％、少于1体积％、少于0.5体积％、少于0.1体积％、或少于0.01体积％的一种或多种其他化合物。
在以下描述中，不论是否使用词语“大约”或者“近似”与其相连，本文公开的所有数字都是近似值。它们可以变化1％、2％、5％，或者有时10％到20％。每当公开具有下限RL和上限RU的数值范围时，则任何落在该范围内的数字都是具体公开的。具体地，该范围内的以下数字是具体公开的：R＝RL+k*(RU-RL)，其中k是范围从1％到100％，增量为1％的变量，即k是1％、2％、3％、4％、5％、…、50％、51％、52％、…、95％、96％、97％、98％、99％、或者100％。此外，如同上所定义的，任何被两个R数字限定的数值范围，也是被具体公开的。
除了以上的定义之外，本文描述的特定化合物具有可以作为Z或者E异构体存在的一个或多个双键。在一些实施方案中，本发明包括以基本纯的形式作为单独异构体的这些化合物，和各种异构体的混合物，例如，立体异构物的外消旋混合物。
制造生物有机化合物的设备
本发明提供了制造生物有机化合物的各种生产系统。在一些实施方案中，所述生物有机化合物可以使用分批的、连续的、补料分批的、或者半连续的发酵过程来生产。
分批发酵可以是封闭系统，其中培养基组分在发酵开始时是固定的，而且在发酵期间没有人为地改变。因此，在发酵开始时，培养基用期望的生物体接种，而且不向系统中加入任何东西让发酵发生。然而，在一些实施方案中，“分批”发酵对于碳源的添加是分批的，而且经常尝试对控制因子例如pH和氧气浓度进行控制。在分批系统中，系统的代谢物和生物量组分可以不断地改变，直到发酵停止时。在分批培养内，细胞可以从静态迟缓期，高速生长的对数期，直至最终生长速率减少或停止的稳定期发生变化。如果不加处理，稳定期的细胞将最终死亡。对数期的细胞通常负责大部分终产物或者中间产物的生产。
标准分批系统的一个变化是补料分批系统。补料分批发酵过程也合适本发明，而且包含典型的分批系统，但在发酵过程中要以增量加入额外的碳源或底物。当降解物阻遏倾向于抑制细胞代谢时和期望在培养基中含有一定数量的底物时，补料分批系统是有用的。在补料分批系统中，实际的底物浓度是难以测量的，因此基于可测量因子例如pH、溶解的氧气、和废气例如CO2的分压的变化来进行估计。
连续发酵是一个开放系统，其中确定成分的发酵培养基被连续加入到一个或多个生物反应器中，这些生物反应器可以是串联的，并且可同时从系统中取出等量的条件培养基供其它加工。连续发酵通常将培养物保持在恒定的高密度以使细胞主要在对数期生长。连续发酵允许对影响细胞生长或者终产物浓度的单个因子或者任何数量的因子进行调节。例如，一种方法会让一定量的营养物例如碳源或氮水平保持在固定比率，并让所有其它参数减弱。在其它系统中，影响生长的许多因子可以被连续地改变，而细胞浓度保持不变。连续系统致力于保持稳定状态的生长状况，因此，由于抽走培养基而损失的细胞必须与发酵的细胞生长速率平衡。
因此，在本发明的一些实施方案中，提供了生物有机生产系统，其包括：
a.至少一个容量至少100升的容器；
b.在所述至少一个容器内的水性培养基，其组成第一相；
c.水性培养基内的大量宿主细胞，其能够制造、生产或者合成至少一种生物有机化合物；和
d.与第一相接触的液体有机第二相，其包含所述至少一种生物有机化合物。
在本发明中使用的合适容器可以是任何可盛装供发酵用宿主细胞和水性培养基的容器。例如，容器可以是用作反应器或者发酵器的罐，或者它可以是离心机的一部分，可以在后续加工步骤中将较重的原料和较轻的原料分离开。或者，一个或多个容器可以在连续或半连续过程中使用。
合适的容器100的一般示例性的实施例如图1所示。容器100包括：入口接口120，其用于向容器中添加宿主细胞、发酵培养基、和其它化合物、营养物或者组分以协助、调节或者改进宿主细胞的发酵、生物有机化合物的生产、和另外的生产步骤的进行；出口接口130，用于在发酵过程期间或者结束后取出原料；和气体出口140，用于排出废气，例如发酵过程期间或者发酵过程后产生的二氧化碳。容器100可以完全被宿主细胞、发酵培养基和其它原料充满，以使容器顶部没有容纳气体的空间。或者，容器100可以被部分充满，从而留下空间供容纳气体。空间中气体的数量、压力、和组分可以被控制，以优化或者最大化宿主细胞的生长和生物有机化合物的生产。例如，在需氧宿主细胞发酵期间，气体典型地可以以高于、等于或低于大气压的各种压力包含空气或者其它包含氧气的气体；例如，对于微需氧和厌氧宿主细胞，气体的氧气浓度可以被控制在低于大气浓度但仍然高于零的范围之内，而在厌氧宿主细胞发酵期间，气体典型地几乎或完全不含氧气，而且可以完全地包含大部分或者全部氮气或者其它合适的气体。
在封闭系统中，如图1中所示的容器100的入口接口120、出口接口130、和气体出口140，在发酵过程期间可以被关闭或者处于正压下。或者，尤其在使用需氧宿主细胞时，容器100可以被用作开放系统，从而对大气打开一个或多个接口和出口，以提供气体/液体物质转移(吸入空气或氧气并排出二氧化碳)系统。如果需要，气体出口140可以同时作为气体出口和气体入口，其中氧气或空气或者其它气体可以从那里被导入系统中。在一些实施方案中，容器100包含单独的气体入口和单独的气体出口。在这样的开放系统中，容器上可能包含其它的硬件，以防止其它生物或其它原料在发酵期间污染或者渗透至容器中。
另一个容器的实施方案如图2所示。除了与图1中的容器类似的入口接口220、出口接口230、气体入口235和气体出口240之外，图2中的容器200包括用于混合的搅拌子250。在一些实施方案中，搅拌子250包括马达驱动轴252，该马达驱动轴252包括轴封251并且与一个或多个叶轮254连接。搅拌子250可以典型地附着在容器200的顶部或者底部上。可选择地，每一叶轮254末端可以具有一个或多个浆叶256。叶轮254可以是任何合适的形状，并且可以被特定地选择以控制混合的数量、宿主细胞的生长速率、生物有机化合物的生产速率、收获速率、和氧气或者其它气体的转移速率。此外，一个或多个挡板258可以被添加到容器200中，以进一步提高混合。在另一个实施方案中，搅拌可通过带有泵的再循环线路的形式进行，所述泵从容器的一部分例如底部抽出原料，并将原料重新引入到容器的另一部分例如顶部。在宿主细胞和发酵培养基的容器内的搅拌，有助于保证宿主细胞暴露于足够的营养物中，从而让其能生长并且生产生物有机化合物。
如果发酵过程是需氧过程，氧气或者空气可以通过喷头260鼓泡进入，以改善气体/液体物质转移。喷头260可以包括一个或多个淹没在发酵培养基中的气体出口(未显示)，优选位于或接近容器底部。在一些实施方案中，喷头260可以是具有多个气体出口的喷射环，通常以环形或圆形结构排列。可选地，为了收获敏感生物或者减少泡沫，可以对容器进行被动通气，例如使用各种通气纱窗、膜、纤维、或其它被动通气装置，或者从容器中取出培养基的一部分，给其供氧，再让其返回到容器中。
如果希望进行温度控制，那么可以使用加热器或者热交换器来加热或者冷却发酵反应。在一个实施方案中，可以使用环绕和/或附着在容器200的至少一部分上的加热/冷却套管270来控制温度，所述容器200可与热交换器(未显示)连接从而使温度控制的热交换液体通过套管270循环。或者，加热器或者热交换器可以浸没在发酵培养基中。这一类型的加热器或者热交换器的示例性实施例包括：浸没式电加热器、带热交换液体例如热水或油的螺旋形或线形管的浸没式热交换器、和一个或多个向发酵培养基中注入热流例如空气和/或水的喷头。或者或附加地，加热器或者热交换器可以附着在容器外表面。这样的加热器和热交换器包括容器外侧壁上的电加热带，和附着在容器上的加热或夹套的再循环管道。
容器200可以包含另外的入口和出口接口。在一些实施方案中，另外的入口和出口接口可以位于容器200的顶部、侧部或者底部。在一些实施方案中，另外的入口接口包括给料管道，用于在发酵反应过程中加入氧气或其它气体、营养物、泡沫和pH控制剂。任何入口和出口接口都可以包含灭菌装置，供多种用途，包括过程中的使用和发酵过程中的多个连接或重连接。
另外，一个或多个探头接口280和/或样本阀290可以被放置在容器200的多个部位以帮助监测关键性的参数，例如发酵过程中各种产物和代谢物的浓度、pH、液位、压力、泡沫、溶解氧气浓度、温度、搅拌速率、功率、电压、阀位置和细胞密度。
应该理解，图1和图2中的容器是用于举例的目的，而且，可以采用许多不同的容器构造用于发酵过程，例如，依照宿主细胞的类型、生产的生物有机化合物、生产体积、发酵过程的类型、下游加工的类型、分离过程、和其它考虑因素来采用。
容器，例如如图2所示的，适于在分批发酵过程中使用。如果期望进行不断地向容器中加入或者排出原料的连续或者半连续发酵过程(与分批发酵过程相反)，则容器典型地包括另外的入口和出口接口，所述接口可位于容器的顶部、底部、或者侧部。这些另外的入口和出口接口有利于原料流入和流出容器。在一些实施方案中，一个或多个容器连续地接收宿主细胞、发酵培养基、和可选的添加剂，同时连续地从容器中排出宿主细胞、副产物、和/或生物有机化合物。在这些实施方案中，一个容器中的排放物可被用作另一容器的给料，所述另一容器可选择地也接收新鲜的宿主细胞、发酵培养基、营养物、和/或其它添加剂。单一容器，或者一系列容器一起可以被构造成提供宿主细胞的期望平均停留时间。来自下游容器之一的排放物的一部分，可以回到一个或多个上游容器中，从而将排放物再循环到加工的较早阶段，或者来自更加下游加工步骤的其它原料可以被再引入到容器中。
在本发明的一些实施方案中使用的容器包含另外的可附着在容器上的硬件以有利于加工过程。这样的硬件可以包括用于促进原地清洁和原地灭菌加工的另外的硬件。在一些实施方案中，接口、出口、入口、阀门中的一个、某些或者各个，和所有容器内的硬件，可进行原地灭菌。在一些实施方案中，灭菌可以使用蒸汽灭菌进行。例如，接口、出口、或者样本阀中的任何一个，可以包括另外的硬件，或者将另外的硬件附着其上，该硬件提供蒸汽供给和冷凝液返回至接口出口或者阀门，使得其在使用或者重新使用前被蒸汽灭菌。
所述容器的容量可以是至少100升。在一些实施方案中，容器的容量是100到3,000,000升，例如至少1000升、至少5,000升、至少10,000升、容器至少25,000升、至少50,000升、至少75,000升、至少100,000升、至少250,000升、至少500,000升、或者至少1,000,000升。
所述容器可以包含或者具有传感器和探头附着在其上，以供测量各种参数，例如压力、pH、溶解氧气浓度、温度、气体流动速率、液体流动速率、液位、阀门位置、泡沫、搅拌、功率、电压和用于控制或者优化宿主细胞的生长和生物有机化合物的生产的任何其它参数。传感器和探头可以为一个或多个自动化系统提供信息，用来控制和记录各种测量的参数，并且通过控制空气流速，功率，加热或冷却以控制容器温度，搅拌转速，泵，容器或者任何入口、出口、加样口、样本阀或其它接口的原地灭菌或清洁，出口流动控制，或者用于控制发酵参数的任何其它相关机制，来调节任何的各种参数。这样的调节可以使用任何已知的控制机制发生，例如，控制或者启动各种阀门、泵或者马达，而且可以使用比例、比例-积分或者比例-积分-微分控制系统。
自动化系统可以另外地被中央控制系统控制和监测，中央控制系统可以是局部的或者工厂范围的控制系统，而且可以控制生产仅仅一种生物有机化合物的生产过程或者多种生物有机化合物的生产过程。自动化系统和中央控制系统可以包含任何合适的软件、固件和/或硬件，它们可以是私有的或现货供应的，或者两者的组合，而且可以使用任何合适的通信系统进行通讯。这类通信系统的非限制性实施例，包括硬连线系统，它可以是数码的或类似的，而且可以包括直接连接或者是网络形式例如LAN或者WAN或者以太网。另外，在一些实施方案中，通信系统可以是无线的，而且可以是私有的，蓝牙，超宽带，802.11a、b、g或n，或者ZigBee，包括TDMA、FDMA、OFDM和CDMA，而且可以在任何合适的波段运行，例如2.4GHz或5.8GHz。
任何在生物有机化合物的生产中使用的容器，均可以包含另外的硬件，例如另外的搅拌子，另外的入口接口、出口接口、样本接口，另外的加热/冷却设备例如另外的加热线圈，另外的通气设备例如另外的喷头，另外的传感器和探头，另外的清洁或灭菌设备以促进加工或者其它任何的发酵参数。
在本发明的一些实施方案中，提供类异戊二烯生产系统，其包括：
a.至少一个容量至少100升的容器；
b.在该至少一个容器内的水性培养基，其组成第一相；
c.水性培养基内的大量宿主细胞，所述宿主细胞能够制造、生产或者合成一种或多种类异戊二烯化合物；和
d.与第一相接触的液体有机第二相，其包含所述一种或多种类异戊二烯化合物。
在一些实施方案中，类异戊二烯化合物是C5类异戊二烯。这些化合物源自一个异戊二烯单元，并且也被称作半萜。半萜的一个示例性实施例是异戊二烯。在其它实施方案中，类异戊二烯化合物是C10类异戊二烯。这些化合物源自两个异戊二烯单元，并且也被称作单萜。单萜的一个示例性实施例是月桂烯。在其它实施方案中，类异戊二烯化合物是C15类异戊二烯。这些化合物源自三个异戊二烯单元，并且也被称作倍半萜。倍半萜的一个示例性实施例是绿叶醇(它也被称作广藿香醇)。在其它实施方案中，类异戊二烯化合物是C20类异戊二烯。这些化合物源自四个异戊二烯单元，并且也被称作二萜。二萜的一个示例性实施例是紫杉烯。在其它实施例中，类异戊二烯化合物是C20+类异戊二烯。这些化合物源自超过四个的异戊二烯单元，而且包括：三萜(C30类异戊二烯化合物，源自6个异戊二烯单元)例如鲨烯；四萜(C40类异戊二烯化合物，源自8个类异戊二烯)例如β-胡萝卜素；和多萜(C40+类异戊二烯化合物，源自超过8个异戊二烯单元)例如聚异戊二烯。在一些实施方案中，类异戊二烯化合物可以是两种或更多类异戊二烯化合物的任意组合物。
在本发明的另一方面，提供生产至少一种生物有机化合物的方法，其包括：
a.在水性培养基中培养大量宿主细胞，以生产、制造或者合成至少一种生物有机化合物，其中水性培养基组成第一相；
b.形成与第一相接触的液体有机第二相，其包括所述至少一种生物有机化合物；
c.从第一相中分离第二相的至少一部分；和，
d.从第二相中分离该至少一种生物有机化合物。
类异戊二烯生产系统可以包含一项或多项另外的加工组件，其包括：1)一个或多个分离系统，用于从水性培养基和有机第二相中分离所述至少一种生物有机化合物；2)一个或多个反应器，用于生物或化学地修饰所述至少一种生物有机化合物，例如通过加成、取代、氢化、烷基化、羟基化、缩合、卤化、或者任何其它合适的反应；2)一个或多个混合容器或系统，用于将所述至少一种生物有机化合物与一种或多种附加组分混合；3)和一个或多个另外的纯化或分离系统，用于进一步纯化所述生物有机组合物或所述至少一种生物有机化合物。
第二相可以包含所述至少一种生物有机化合物。生物有机化合物可以组成第二相的一部分、绝大部分、或者基本上全部。在一些实施方案中，生物有机化合物组成了1％到99％，例如5％到95％、10％到90％、20％到80％、25％到75％、35％到65％、或者40％到50％的第二相。在一些实施方案中，所述第二相基本上由生物有机化合物组成。
在一些实施方案中，大量的宿主细胞包含多于一种类型的宿主细胞，例如多于一个种属或者菌株的宿主细胞，例如2-5个种或者菌株的宿主细胞，例如2、3、4或5个种或者菌株的宿主细胞。在一些实施方案中，大量宿主细胞可以生产多于一种的生物有机化合物，例如2-5种生物有机化合物，例如2、3、4或5种生物有机化合物。
可以使用任何合适的分离方法，从第一相和/或第二相中分离生物有机化合物。在一些实施方案中，生物有机化合物从第二相中分离由此是基本纯的。
在一些实施方案中，有机第二相由于化学和分子相互作用而自发形成，例如溶解性或疏水性、密度、浓度、或者任何其它的自发的相分离机制的差异。在其它实施方案中，第一和第二相的分离是在分离容器中、或者系统中诱导的，所述容器或系统可以是与发酵容器相同或不同的容器或加工系统。在一些实施方案中，相分离通过离心例如连续或者分批离心来诱导的。在其它实施方案中，相分离是通过向发酵反应中引入破乳剂或者成核剂来诱导的。破乳剂阻止或限制了生物有机化合物在水相中乳化的数量。破乳剂的示例性实施例包括絮凝剂和混凝剂。成核剂促进了生物有机化合物的微小液滴的聚合，以合并和最终形成分离的相。如果使用足够数量的成核剂，成核剂本身可形成有机第二相，生物有机化合物可向其中迁移。成核剂的示例性实施例包括生物有机化合物本身的液滴和有机溶剂，例如十二烷、肉豆蔻酸异丙酯和油酸甲酯。一些实施方案可包括一种或多种上述相分离材料和方法的组合。
一旦相分离发生，分离的相可以单独地从分离容器中抽出。任何数量的第二相均可从第一相中分离，例如，全部，一部分，1％到100％，例如5％到95％、10％到90％、20％到80％、25％到75％、35％到65％、或者40％到50％的第二相可从第一相中分离得到。如果有机第二相没有水性第一相密度大，则可以提供或放置一个或多个龙头位于分离容器上接近两相分界面(最好在有机第二相中)处，从而在取出密度较大的水相前排出有机第二相。或者，可以通过接近分离容器底部的出口，从分离容器中取出水性第一相，直至有机第二相出现。在这个时间点，有机第二相可以被转移至单独的部位用于进一步加工或者储存。水性第一和有机第二相都可以在重力影响、气体压力下，或者通过泵或泵的组合使用，从分离容器中流出。
如果有机第二相比水性第一相密度大，则可以提供或放置一个或多个龙头位于分离容器上接近两相分界面(最好在有机第二相中)处，以在取出密度较大的有机第二相前排出水性第一相。或者，可以使用接近分离容器底部的出口，从分离容器中取出有机第二相。
对于其中水性第一相比有机第二相密度大的连续过程而言，带一个或多个龙头的分离容器可以包含确定体积的发酵培养基和宿主细胞，而连续产生的有机第二相则可以通过龙头排出，用于储存或者进一步加工。如果有机第二相比水性第一相密度大，所述有机第二相可以以防止将有机第二相从分离容器中完全排空的速率从分离容器的底部连续地取出，以免抽出水性第一相。
在一些实施方案中，可以使用吸附(分子从大量液体移动到吸附剂表面的过程)从有机第二相中分离生物有机化合物。吸附剂的示例性实施例，包括活性碳；矾土；铝硅酸盐例如沸石；粘土例如漂白土；分子筛；有机聚合物，例如聚苯乙烯和树脂；和二氧化硅如硅胶。根据所使用的吸附剂，所述吸附剂可以被用来捕获期望的生物有机产物或不想要的副产物。可以使用分批、连续或者半连续过程来实现通过吸附产生的分离。
在其它实施方案中，可能使用蒸馏(一种基于其挥发性的不同来分离物质的方法)从有机第二相中分离生物有机化合物。在分批蒸馏中，液体的全部分批首先被充入容器，并在容器内加热或者减压。从而连续地产生蒸汽，并被浓缩以形成收集的液体馏出物。在连续平衡蒸馏中，为了引起混合物的部分蒸发以及液体和蒸汽组分的分离回收，连续地流动的液体给料被加热或者减压。在流经蒸馏柱期间，液体和蒸汽分开，并且产物作为蒸汽流和液体流出现。当蒸汽和液体接近相平衡时，其被称为闪蒸过程。如果需要，蒸汽产物可以被浓缩以形成液体馏出物。
在其它实施方案中，使用气-液萃取从有机第二相中分离生物有机化合物。这个过程也被称作汽提，该过程是溶解在液体流中的组分以更加浓缩形式向蒸汽流中的转移。温度和压力可为所期望的生物有机化合物的转移进行优化。蒸汽流的示例性实施例包括空气和蒸汽。典型地，液体流从柱中流下，并且同时蒸汽流往上冒泡(与液体流流向相反)。
在其它实施方案中，使用液-液萃取从有机第二相中分离生物有机化合物。液-液萃取也被称作溶剂萃取，是从一种液体相中向另一种不相溶的液体相中进行的物质转移。
在分批液-液萃取系统中，料液(有机第二相)与不相溶的第二液体相在合适的容器中混合。然后让混合物静置分层，并分离成萃取液和剩余液，而且较轻的层可以从容器中排出。根据产物和使用的溶剂，期望的生物有机化合物可存在于萃取液或者剩余液中。
在连续液-液萃取系统中，可利用密度、给定温度下的蒸汽压力、或者沸点的不同从料液(有机相)中分离期望的生物有机产物。这样的系统可以使用混合/沉淀罐、塔或柱、离心机，及其组合来实现分离。
在其它实施方案中，使用超滤(一种基于分子大小和形状来分离溶液组分的压力驱动的膜过程)从有机第二相和/或水性第一相中分离生物有机化合物。在超滤膜两边应用不同的压力情况下，溶剂和微小的溶质种类透过膜并作为渗透液收集，而较大的溶质种类被膜保留并作为浓缩的滞留物回收。超滤涉及的溶质的分子尺寸是溶剂的十倍多或者更多，而且其大小通常低于1/2微米。被分离的溶质或者材料通常具有大于500amu的分子量，例如高分子、胶体分散液和乳液。超滤系统的非限制性实施例为切向流超滤系统。
在一些实施方案中，宿主细胞能够产生每升发酵培养基大约10克到大约50克、超过大约15克、超过大约20克、超过大约25克、或者超过大约30克的生物有机化合物。
在一些实施方案中，宿主细胞能够生产每克干细胞重量大约50到大约1500毫克，例如超过大约100毫克、超过大约150毫克、超过大约200毫克、超过大约250毫克、超过大约500毫克、超过大约750毫克、或者超过大约1000毫克的生物有机化合物。
燃料组合物生产系统
在一些实施方案中，本发明包含燃料组合物生产系统，其包括：
a.至少一个容量至少100升的容器；
b.容器内的水性培养基，组成第一相；
c.水性培养基内的大量宿主细胞，其能够制造、生产或者合成至少一种生物有机化合物；和
d.与第一相接触的液体有机第二相，其包含所述至少一种生物有机化合物。
燃料组合物生产系统可以包含一项或多项另外的加工组件，包括：1)一个或多个分离系统，用于从水性培养基和有机第二相中分离所述至少一种生物有机化合物；2)一个或多个反应器，用于生物或化学地修饰该至少一种生物有机化合物，例如通过加成、取代、氢化、烷基化、羟基化、缩合、卤化、或者任何其它合适的反应；2)一个或多个混合容器或系统，用于混合该至少一种生物有机化合物和一种或多种附加的燃料组分，例如石油基燃料、燃料添加剂、及其组合；和3)一个或多个另外的纯化或分离系统，用于进一步纯化该燃料组合物或该至少一种生物有机化合物。
在一些实施方案中，燃料添加剂选自：氧化剂、抗氧化剂、环境保护剂、热稳定性改进剂、十六烷值改进剂、稳定剂、低温流动性改进剂、助燃剂、抗泡沫剂、抗烟雾添加剂、腐蚀抑制剂、润滑改进剂、结冰抑制剂、喷油器清洁添加剂、抑烟剂、减阻添加剂、金属减活剂、分散剂、洗涤剂、破乳剂、染料、标记物、静电驱散剂、生物杀灭剂、及其组合。
在一些实施方案中，所述燃料组合物生产系统包含：
a)一个或多个分批、补料分批、或者连续流动发酵系统，包含：
i)至少一个容量至少100升的容器；
ii)在该至少一个容器内的水性培养基，组成第一相；
iii)水性培养基内的大量宿主细胞，其能够制造、生产或者合成至少一种生物有机化合物；和，
iv)与第一相接触的液体有机第二相，其包含所述至少一种生物有机化合物；
b)一个或多个第一相分离系统，从而分离第一相和第二有机相或者第二有机相的一种或多种成分；
c)可选择地一个或多个第二相分离系统，从而从第二有机相中分离该至少一种生物有机化合物；
d)可选择地一个或多个反应器或容器，其中至少一种生物有机化合物被化学地或生物地修饰；
e)可选择地一个或多个纯化系统，其中所述生物有机化合物或者修饰过的生物有机化合物被纯化或者进一步纯化；
f)可选择地一个或多个混合容器或者系统，用于混合所述至少一种生物有机化合物和一种或多种附加的燃料组分；和
g)可选择地一个或多个进一步纯化的系统，其中所述至少一种生物有机化合物和所述一种或多种附加的燃料组分的混合物被纯化或者进一步纯化。
在一些实施方案中，该一个或多个第一相分离系统包含一个或多个系统、容器、或者本文详述的其它相分离组件，所述分离组件具体构造用于从第二有机相中分离第一相。在一些实施方案中，该一个或多个第二相分离系统包含一个或多个系统、容器或者本文详述的具体构造用于从第二有机相中分离生物有机化合物的相分离组件。
在一些实施方案中，在其中至少一种生物有机化合物被化学地或生物地修饰的所述的一个或多个反应器，包含与发酵或分离系统中使用的相同或不同的容器。或者，该一个或多个反应器可以包含一个或多个不同的容器，其可以包含另外的硬件、传感器、接口、探头和/或控制系统，以适合在其中进行生物有机化合物的特定反应或其它修饰。所述反应器可以是分批、补料分批或者连续反应器。
在一些实施方案中，所述生物有机化合物、或修饰的生物有机化合物、或者燃料组合物，可以采用一个或多个纯化系统进行纯化或进一步纯化。所述纯化系统可以包含任何合适的纯化系统，包括可以从生物有机化合物中除去不需要的化合物，或者可从生物有机化合物中分离不需要的化合物的任何系统。在一些实施方案中，所述纯化系统可以包含一个或多个系统、容器或者本文详述的具体构造用于获得期望的生物有机化合物纯度的相分离组件。在一些实施方案中，所述纯化可以采用一个或多个分离系统串联来实现以获得期望的纯度。在一些实施方案中，为了以逐步方式获得纯度，所述分离系统可以被构造得彼此不同。
在一些实施方案中，可进行纯化以满足联邦、州或地方的法律、法规或规定对生物有机化合物或对燃料组合物的规范或要求。在一些实施方案中，在联邦或州的法律、法规或规定的要求之外，所述纯化还可以改进生物有机化合物或者燃料组合物的功能。在一些实施方案中，联邦、州或地方的法律、法规或规定可能涉及环境排放、燃料性能、税收激励和其它经济激励。在一些实施方案中，所述纯化可以减少生物有机化合物或者燃料组合物的环境影响、碳足迹、从中获得的燃料效能、从中获得的可靠性、从中可得到的能量、或者长期经济成本。
在一些实施方案中，所述燃料组合物系统包含一个或多个混合容器或系统，用于将所述至少一种生物有机化合物与一种或多种附加的燃料组分混合。混合容器或混合系统可以是任何合适的容器或系统。混合容器可以包含被鉴定用于生物有机化合物生产容器的任何或所有的入口、出口、接口、传感器、探头、搅拌子和其它相关硬件。混合容器可以将一种或多种燃料组分与生物有机化合物混合。例如，2-5种燃料组分，例如3或4种燃料组分。混合系统可以是分批、连续或者补料分批的。
在一些实施方案中，本发明包含制造燃料组合物的方法，其包括：
a.在水性培养基中培养大量宿主细胞，以生产、制造或者合成至少一种生物有机化合物，其中水性培养基组成第一相；
b.形成与第一相接触的液体有机第二相，其包括所述至少一种生物有机化合物；
c.从第一相中分离第二相的至少一部分；
d.从第二相中分离所述至少一种生物有机化合物；
e.可选择地化学地或生物地修饰所述至少一种生物有机化合物；
f.可选择地纯化生物有机化合物或者修饰的生物有机化合物；
g.可选择地混合该至少一种生物有机化合物和一种或多种附加的燃料组分；和
g)可选择地纯化该一种或多种生物有机化合物和该一种或多种附加的燃料组分的混合物。
在一些实施方案中，所述燃料组合物包含生物燃料组合物。在一些实施方案中，所述生物燃料进一步包含至少一种生物有机化合物，和石油基燃料、燃料添加剂或其组合。在进一步的实施方案中，所述石油基燃料是汽油、喷气燃料、煤油、柴油、或其组合。
在一些实施方案中，所述生物有机化合物生产系统或者燃料组合物生产系统可以通过改造乙醇生产设备来建设或者创建。
在一些实施方案中，所述燃料组合物生产系统可以包含一个或多个自动化控制系统。该自动化控制系统可以与生物有机生产系统的控制系统相同或者不同，而且可以包含各种传感器、探头和其它设备，用于测量和控制与燃料组合物系统内的各个系统和燃料组合物生产方法的各步骤相关的各种过程参数。该自动化系统可以另外地被中央控制系统控制和监测，所述中央控制系统可以是局部的或者工厂范围的控制系统，而且可以控制生产仅仅一种生物有机化合物的生产过程或者多种生物有机化合物的生产过程。自动化系统和中央控制系统可以包含任何合适的软件、固件和/或硬件，它们可以是私有的或现货供应的，或其组合，而且可以使用任何合适的通信系统进行通讯。这类通信系统的非限制性实施例，包括数码的或其类似的硬连线系统，而且可以包括直接连接或以网络形式，例如LAN或者WAN或者以太网。另外，在一些实施方案中，所述通信系统可以是无线的，而且可以是私有的，蓝牙，超宽带，802.11a、b、g或n，或者ZigBee，包括TDMA、FDMA、OFDM和CDMA，而且可以在任何合适的波段运行，例如2.4GHz或5.8GHz。
宿主细胞
任何合适的宿主细胞均可用于实现本发明。在一些实施方案中，该宿主细胞是遗传修饰的宿主微生物，其中的核酸分子被插入、缺失或修饰(即突变；例如通过插入、缺失、取代和/或倒位核苷酸)，以生产期望的生物有机化合物，或有效地增加期望的生物有机化合物的产量。
合适的宿主细胞的示例性实施例，包括所有古细菌、细菌、或者真核细胞。古细菌细胞的实施例，包括但不限于属于以下属的那些：气火菌属(Aeropyrum)、古丸菌属(Archaeoglobus)、盐杆菌属(Halobacterium)、甲烷球菌属(Methanococcus)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、火球菌属(Pyrococcus)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、和热原体属(Thermoplasma)。古细菌种类的示例性实施例，包括但不限于：敏捷气火菌(Aeropyrumpernix)、发光古丸菌(Archaeoglobusfulgidus)、詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)、嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)、深海火球菌(Pyrococcusabyssi)、堀越氏火球菌(Pyrococcushorikoshii)、嗜酸热原体(Thermoplasmaacidophilum)、火山热原体(Thermoplasmavolcanium)。
细菌细胞的实施例，包括但不限于属于以下属的那些：土壤杆菌属(Agrobacterium)、脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、鱼腥蓝细菌属(Anabaena)、组囊蓝细菌属(Anacystis)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、着色菌属(Chromatium)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、埃希氏菌属(Escherichia)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、席蓝细菌属(Phormidium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红细菌属(Rhodobacter)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红螺菌属(Rhodospirillum)、红球菌属(Rhodococcus)、沙门氏菌属(Salmonella)、栅列蓝细菌属(Scenedesmun)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、聚球蓝细菌属(Synnecoccus)、和发酵单胞菌属(Zymomonas)。
细菌种类的示例性实施例，包括但不限于：枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、产氨短杆菌(Brevibacteriumammoniagenes)、嗜氨短杆菌(Brevibacteriumimmariophilum)、拜氏梭菌(Clostridiumbeigerinckii)、阪崎氏肠杆菌(Enterobactersakazakii)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobiumloti)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、迈氏假单胞菌(Pseudomonasmevalonii)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、荚膜红细菌(Rhodobactercapsulatus)、球形红细菌(Rhodobactersphaeroides)、深红红螺菌(Rhodospirillumrubrum)、肠道沙门氏菌(Salmonellaenterica)、伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、痢疾志贺氏菌(Shigelladysenteriae)、弗氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)、宋内氏志贺氏菌(Shigellasonnei)、金黄色葡萄球菌等。
通常，如果使用细菌宿主细胞，优选非致病性菌株。非致病性菌株种类的示例性实施例，包括但不限于：枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)、(大肠杆菌(Escherichiacoli)、嗜酸乳杆菌(Lactibacillusacidophilus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、迈氏假单胞菌(Pseudomonasmevalonii)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、球形红细菌(Rhodobactersphaeroides)、荚膜红细菌(Rodobactercapsulatus)、深红红螺菌(Rhodospirillumrubrum)等。
真核细胞的实施例，包括但不限于真菌细胞。真菌细胞的实施例，包括但不限于属于以下属的那些：曲霉属(Aspergillus)、念珠菌属(Candida)、金孢属(Chrysosporium)、隐球菌属(Cryptococcus)、镰孢属(Fusarium)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、内生真菌属(Neotyphodium)、脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、木霉属(Trichoderma)、和法夫酵母属(Xanthophyllomyces)(以前称作Phaffia)。
真核种类的示例性实施例，包括但不限于：构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、拉氏金孢菌(Chrysosporiumlucknowense)、禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)、镰孢霉(Fusariumvenenatum)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、安格斯毕赤酵母(Pichiaangusta)、芬兰毕赤酵母(Pichiafinlandica)、儿玉氏毕赤酵母(Pichiakodamae)、膜醭毕赤酵母(Pichiamembranaefaciens)、甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)、仙人掌毕赤酵母(Pichiaopuntiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、珀氏毕赤酵母(Pichiapijperi)、栎树毕赤酵母(Pichiaquercuum)、千屈菜毕赤酵母(Pichiasalictaria)、耐热毕赤酵母(Pichiathermotolerans)、嗜海藻糖毕赤酵母(Pichiatrehalophila)、树干毕赤酵母(Pichiastipitis)、生二素链霉菌(Streptomycesambofaciens)、金霉素链霉菌(Streptomycesaureofaciens)、金色链霉菌(Streptomycesaureus)、贝酵母(Saccaromycesbayanus)、果酒酵母(Saccaromycesboulardi)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、杀真菌素链霉菌(Streptomycesfungicidicus)、灰色产色链霉菌(Streptomycesgriseochromogenes)、灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)、变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)、橄榄灰链霉菌(Streptomycesolivogriseus)、枝链霉菌(Streptomycesrameus)、田无链霉菌(Streptomycestanashiensis)、酒红链霉菌(Streptomycesvinaceus)、里氏木霉(Trichodermareesei)、和红法夫酵母Xanthophyllomycesdendrorhous(以前称作Phaffiarhodozyma)。
通常，如果使用真核细胞，优选非致病性菌株。非致病性菌株种类的示例性实施例，包括但不限于：禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)、镰孢霉(Fusariumvenenatum)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、果酒酵母(Saccaromycesboulardi)、和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
在一些实施方案中，本发明的宿主细胞已经被食品和药物管理局明确为GRAS或者一般认为安全的。这样的菌株的示例性实施例包括：枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)、嗜酸乳杆菌(Lactibacillusacidophilus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
设计制造生物有机化合物的途径
一类生物有机化合物的示例性实施例是类异戊二烯。它们包含超过40,000个独立产物的多样家族，其中的许多是活着的生物必不可少的。类异戊二烯为保持细胞流动性、电子传递、和其它代谢功能服务。除了其在制造燃料组合物中的用途外，巨大数量的天然的和合成的类异戊二烯，可作为药物、化妆品、香料、颜料和着色剂、杀真菌剂、防腐剂、保健品、和精细化工中间体来使用。
类异戊二烯化合物在自然界中通过两种不同的代谢途径制造，它们交汇于IPP和其异构体DMAPP。通常，与植物不同，真核生物特有地使用MEV类异戊二烯途径将乙酰辅酶A转化成IPP，其随后异构成为DMAPP。原核生物，有一部分例外，通过一个分枝点，分别使用甲羟戊酸独立的或者DXP途径来生产IPP和DMAPP。通常，植物同时使用MEV和DXP途径来合成IPP。本文描述的用于设计MEV和DXP途径来制造期望的类异戊二烯化合物的方法，可以被容易地修改为类似的设计其它途径用来制造其它生物有机化合物。
MEV途径
MEV途径的图解说明如图3所示。通常，该途径一般包含六个步骤。
在第一步中，两分子的乙酰辅酶A被酶结合，形成乙酰乙酰辅酶A。已知用于催化该步骤的酶是，例如，乙酰辅酶A硫解酶(也被称作乙酰辅酶A乙酰基转移酶)。核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于以下GenBank登录号和序列从其来源的生物：(NC_000913区域：2324131..2325315；大肠杆菌)、(D49362；脱氮副球菌)、和(L20428；酿酒酵母)。
在MEV途径的第二步中，乙酰乙酰辅酶A与另一分子的乙酰辅酶A被酶缩合，形成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)。已知用于催化该步骤的酶是，例如，HMG-CoA合成酶。核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于：(NC_001145，互补19061..20536；酿酒酵母)、(X96617；酿酒酵母)、(X83882；拟南芥)、(AB037907；浅灰北里孢菌)、(BT007302；智人)、和(NC_002758，位点标记SAV2546，GeneID1122571；金黄色葡萄球菌)。
在第三步中，HMG-CoA被酶转化成甲羟戊酸。已知用于催化该步骤的酶是，例如，HMG-CoA还原酶。核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于：(NM_206548；黑腹果蝇)、(NC_002758，位点标记SAV2545，GeneID1122570；金黄色葡萄球菌)、(NM_204485；原鸡)、(AB015627；链霉菌属KO3988)、(AF542543；渐尖烟草)、(AB037907；浅灰北里孢菌)、(AX128213，提供的序列编码截短的HMGR；酿酒酵母)、和(NC-001145：互补115734..118898；酿酒酵母)。
在第四步中，甲羟戊酸被酶磷酸化，形成甲羟戊酸5-磷酸。已知用于催化该步骤的酶是，例如，甲羟戊酸激酶。核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于：(L77688；拟南芥)和(X55875；酿酒酵母)。
在第五步中，第二个磷酸基团被酶加到甲羟戊酸5-磷酸上，形成甲羟戊酸5-焦磷酸。已知用于催化该步骤的酶是，例如，磷酸甲羟戊酸激酶。核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于：(AF429385；巴西橡胶树)、(NM_006556；智人)、和(NC_001145，互补712315..713670；酿酒酵母)。
在第六步中，甲羟戊酸5-焦磷酸被酶转化成IPP。已知用于催化该步骤的酶是，例如，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶。核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于：(X97557；酿酒酵母)、(AF290095；屎肠球菌)、和(U49260；智人)。
如果IPP要被转化成DMAPP，那么需要第七步。已知用于催化该步骤的酶是，例如，IPP异构酶。核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于：(NC_000913，3031087..3031635；大肠杆菌)和(AF082326；雨生红球藻)。如果需要转化成DMAPP，IPP异构酶的增加表达将保证IPP向DMAPP的转化不是代表整个途径的限速步骤。
DXP途径
DXP途径的图解说明如图4所示。DXP途径一般包含七个步骤。在第一步中，丙酮酸与D-甘油醛3-磷酸缩合，制造1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸。已知用于催化该步骤的酶是，例如，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶。核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于：(AF035440；大肠杆菌)、(NC_002947，位点标记PP0527；恶臭假单胞菌KT2440)、(CP000026，位点标记SPA2301；肠道副伤寒沙门氏菌，参见ATCC9150)、(NC_007493，位点标记RSP_0254；球形红细菌2.4.1)、(NC_005296，位点标记RPA0952；沼泽红假单胞菌CGA009)、(NC_004556，位点标记PD1293；蒂梅丘拉1苛养木杆菌(XylellafastidiosaTemecula1))、和(NC_003076，位点标记AT5G11380；拟南芥)。
在第二步中，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸被转化成2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸。已知用于催化该步骤的酶是，例如，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶。核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于：(AB013300；大肠杆菌)、(AF148852；拟南芥)、(NC_002947，位点标记PP1597；恶臭假单胞菌KT2440)、(AL939124，位点标记SCO5694；天蓝色链霉菌A3(2))、(NC_007493，位点标记RSP_2709；球形红细菌2.4.1)、和(NC_007492，位点标记Pfl_1107；荧光假单胞菌PfO-1)。
在第三步中，2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸被转化成4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇。已知用于催化该步骤的酶是，例如，4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶。核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于：(AF230736；大肠杆菌)、(NC_007493，位点标记RSP_2835；球形红细菌2.4.1)、(NC_003071，位点标记AT2G02500；拟南芥)、和(NC_002947，位点标记PP1614；恶臭假单胞菌KT2440)。
在第四步中，4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇被转化成4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇-2-磷酸。已知用于催化该步骤的酶是，例如，4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇激酶。核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于：(AF216300；大肠杆菌)和(NC_007493，位点标记RSP_1779；球形红细菌2.4.1)。
在第五步中，4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇-2-磷酸被转化成2C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环二磷酸。已知用于催化该步骤的酶是，例如，2C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环二磷酸合成酶。核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于：(AF230738；大肠杆菌)、(NC_007493，位点标记RSP_6071；球形红细菌2.4.1)、和(NC_002947，位点标记PP1618；恶臭假单胞菌KT2440)。
在第六步中，2C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环二磷酸被转化成1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸。已知用于催化该步骤的酶是，例如，1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合成酶。核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于：(AY033515；大肠杆菌)、(NC_002947，位点标记PP0853；恶臭假单胞菌KT2440)、和(NC_007493，位点标记RSP_2982；球形红细菌2.4.1)。
在第七步中，1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸被转化成IPP或其异构体DMAPP。已知用于催化该步骤的酶是，例如，异戊基/二甲基丙烯二磷酸合成酶。核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于：(AY062212；大肠杆菌)和(NC_002947，位点标记PP0606；恶臭假单胞菌KT2440)。
在一些实施方案中，宿主细胞自身的代谢过程和如本发明所提供的那些涉及IPP生产过程之间的“串扰”(或者干扰)被最小化或者完全消除。例如，当宿主微生物专有地依靠DXP途径来合成IPP，并且引入MEV途径来提供另外的IPP时，串扰被最小化或者完全消除。这样的宿主生物将不能够改变MEV途径的酶的表达或者加工与MEV途径相关的中间产物。专有地或者主要地依赖DXP途径的生物包括，例如，大肠杆菌。
在一些实施方案中，所述宿主细胞通过MEV途径，专有地或者与DXP途径相结合地生产IPP。在其它实施方案中，宿主的DXP途径是功能失活的，因此宿主细胞专有地通过外源导入的MEV途径来生产IPP。DXP途径可以是功能失活的，其通过阻碍基因表达或者让一种或多种天然存在的DXP途径的酶功能失活来实现。
在其它实施方案中，宿主细胞通过DXP途径，专有地或者与MEV途径相结合地生产IPP。在其它实施方案中，宿主的MEV途径是功能失活的，从而宿主细胞专有地通过外源导入的DXP途径来生产IPP。MEV途径可以是功能失活的，其通过阻碍基因表达或者让一种或多种天然存在的MEV途径的酶功能失活来实现。
C5化合物
示范的C5生物有机化合物是半萜，它们通常源自IPP或者DMAPP。半萜的一示例性实施例是异戊二烯。
异戊二烯
异戊二烯，其结构是
在许多植物中被发现。异戊二烯是采用异戊二烯合成酶由IPP制造的。合适的核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于：(AB198190；银白杨)和(AJ294819；银白杨x欧洲山杨)。
C10化合物
示范的C10生物有机化合物是通常源自香叶基焦磷酸(GPP)的单萜，GPP是通过IPP和DMAPP的缩合来制造的。已知用于催化该步骤的酶是，例如，香叶基焦磷酸合成酶。
图5图解显示了IPP和DMAPP是如何生产GPP的，GPP可以被进一步加工成单萜。
香叶基焦磷酸合成酶的核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于：(AF513111；北美冷杉)、(AF513112；北美冷杉)、(AF513113；北美冷杉)、(AY534686；金鱼草)、(AY534687；金鱼草)、(Y17376；拟南芥)、(AE016877，位点AP11092；蜡状芽孢杆菌；ATCC14579)、(AJ243739；甜橙)、(AY534745；伯惠绣衣)、(AY953508；美松齿小蠹)、(DQ286930；番茄)、(AF182828；辣薄荷)、(AF182827；辣薄荷)、(MPI249453；辣薄荷)、(PZE431697，位点CAD24425；产玉米黄质副球菌)、(AY866498；胡黄连)、(AY351862；葡萄)、和(AF203881，位点AAF12843；运动发酵单胞菌)。
GPP随后被转化成多种C10化合物。C10化合物的示例性实施例，包括但不限于：
蒈烯
蒈烯，其结构是
在许多树的树脂中被发现，特别是松树。蒈烯是采用蒈烯合成酶由GPP制造的。合适的核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于：(AF461460，区域43..1926；欧洲云杉)和(AF527416，区域：78..1871；狭叶鼠尾草)。
牻牛儿醇
牻牛儿醇(也被称作香叶醇)，其结构是
是玫瑰油和玫瑰草油的主要成分。它也在天竺葵、柠檬、和香茅中存在。牻牛儿醇是采用牻牛儿醇合成酶由GPP制造的。合适的核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于：(AJ457070；细毛樟)、(AY362553；罗勒)、(DQ234300；紫苏品系1864)、(DQ234299；柠檬紫苏品系1861)、(DQ234298；柠檬紫苏品系4935)、和(DQ088667；柠檬紫苏)。
芳樟醇
芳樟醇，其结构是
在许多花和香料植物例如芫荽籽中被发现。芳樟醇是采用芳樟醇合成酶由GPP制造的。合适的核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于：(AF497485；拟南芥)、(AC002294，位点AAB71482；拟南芥)、(AY059757；拟南芥)、(NM_104793；拟南芥)、(AF154124；黄花蒿)、(AF067603；伯惠绣衣)、(AF067602；矮送春花)、(AF067601；伯惠绣衣)、(U58314；伯惠绣衣)、(AY840091；番茄)、(DQ263741；薰衣草)、(AY083653；柠檬薄荷)、(AY693647；罗勒)、(XM_463918；稻)、(AP004078，位点BAD07605；稻)、(XM_463918，位点XP_463918；稻)、(AY917193；柠檬紫苏)、(AF271259；紫苏)、(AY473623；欧洲云杉)、(DQ195274；北美云杉)、和(AF444798；回回苏(Perillafrutescensvar.crispa)品种号79)。
柠檬烯
柠檬烯，其结构是
在柑橘属水果的外皮和薄荷中被发现。柠檬烯是采用柠檬烯合成酶由GPP制造的。合适的核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于：(+)-柠檬烯合成酶(AF514287，区域：47..1867；柠檬)和(AY055214，区域：48..1889；藿香)，和(-)-柠檬烯合成酶(DQ195275，区域：1..1905；北美云杉)、(AF006193，区域：73..1986；北美冷杉)、和(MHC4SLSP，区域：29..1828；绿薄荷)。
月桂烯
月桂烯，其结构是
在许多植物包括月桂树、马鞭草和月桂叶的香精油中被发现，它就是由月桂叶而得名的。月桂烯是用月桂烯合成酶由GPP制造的。合适的核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于：(U87908；北美冷杉)、(AY195609；金鱼草)、(AY195608；金鱼草)、(NM_127982；拟南芥TPS10)、(NM_113485；拟南芥ATTPS-CIN)、(NM_113483；拟南芥ATTPS-CIN)、(AF271259；紫苏)、(AY473626；欧洲云杉)、(AF369919；欧洲云杉)、和(AJ304839；冬青栎)。
罗勒烯
α-和β-罗勒烯，它们的结构分别是
在多种植物和水果包括罗勒(Ocimumbasilicum)中被发现，而且是采用罗勒烯合成酶由GPP制造的。合适的核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于：(AY195607；金鱼草)、(AY195609；金鱼草)、(AY195608；金鱼草)、(AK221024；拟南芥)、(NM_113485；拟南芥ATTPS-CIN)、(NM_113483；拟南芥ATTPS-CIN)、(NM_117775；拟南芥ATTPS03)、(NM_001036574；拟南芥ATTPS03)、(NM_127982；拟南芥TPS10)、(AB110642；柑橘CitMTSL4)、和(AY575970；光叶百脉根)。
α-蒎烯
α-蒎烯，其结构是
在松树和桉树中被发现。α-蒎烯是采用α-蒎烯合成酶由GPP制造的。合适的核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于：(+)α-蒎烯合成酶(AF543530，区域：1..1887；火炬松)、(-)α-蒎烯合成酶(AF543527，区域：32..1921；火炬松)、和(+)/(-)α-蒎烯合成酶(AGU87909，区域：6111892；北美冷杉)。
β-蒎烯
β-蒎烯，其结构是
在松树、迷迭香、欧芹、莳萝、罗勒、和玫瑰中被发现。β-蒎烯是用β-蒎烯合成酶由GPP制造的。合适的核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于：(-)β-蒎烯合成酶(AF276072，区域：1..1749；黄花蒿)和(AF514288，区域：26..1834；柠檬)。
桧萜
桧萜，其结构是
在黑胡椒、胡萝卜种子、鼠尾草和茶树中被发现。桧萜是采用桧萜合成酶由GPP制造的。合适的核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于AF051901，区域：26..1798，来自药用鼠尾草。
γ-萜品烯
γ-萜品烯，其结构是
是来自柑橘属水果的香精油的组成成分。生物化学上，γ-萜品烯是用γ-萜品烯合成酶由GPP制造的。合适的核苷酸序列的示例性实施例，包括：(AF514286，区域：30..1832，来自柠檬)和(AB110640，区域1..1803，来自柑橘)。
萜品油烯
萜品油烯，其结构是
在黑醋栗、柏树、番石榴、荔枝、番木瓜、松树、和茶树中被发现。萜品油烯是采用萜品油烯合成酶由GPP制造的。合适的核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于：(AY693650，来自罗勒)和(AY906866，区域：10..1887来自花旗松)。
C15化合物
示例性的C15生物有机化合物是通常源自法尼西基焦磷酸(FPP)的倍半萜，FPP是通过两分子IPP和一分子DMAPP的缩合制造的。已知用于催化该步骤的酶是，例如，法尼西基焦磷酸合成酶。
图5也图解显示了IPP和DMAPP是如何结合来生产FPP的，FPP可以被进一步加工成倍半萜。
法尼西基焦磷酸合成酶核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于：(ATU80605；拟南芥)、(ATHFPS2R；拟南芥)、(AAU36376；黄花蒿)、(AF461050；牛)、(D00694；大肠杆菌K-12)、(AE009951，位点AAL95523；具核梭杆菌具核亚种(Fusobacteriumnucleatumsubsp.nucleatum)ATCC25586)、(GFFPPSGEN；藤仓赤霉)、(CP000009，位点AAW60034；氧化葡糖杆菌621H)、(AF019892；向日葵)、(HUMFAPS；智人)、(KLPFPSQCR；乳酸克鲁维酵母)、(LAU15777；白羽扇豆)、(LAU20771；白羽扇豆)、(AF309508；小家鼠)、(NCFPPSGEN；粗糙脉孢菌)、(PAFPS1；银胶菊)、(PAFPS2；银胶菊)、(RATFAPS；褐家鼠、(YSCFPP；酿酒酵母)、(D89104；粟酒裂殖酵母)、(CP000003，位点AAT87386；酿脓链球菌)、(CP000017，位点AAZ51849；酿脓链球菌)、(NC_008022，位点YP_598856；酿脓链球菌MGAS10270)、(NC_008023，位点YP600845；酿脓链球菌MGAS2096)、(NC_008024，位点YP_602832；酿脓链球菌MGAS10750)、和(MZEFPS；玉米)。
或者，FPP也可以通过将IPP添加到GPP上制造。编码能够催化该反应的酶的核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于：(AE000657，位点AAC06913；风产液菌VF5)、(NM_202836；拟南芥)、(D84432，位点BAA12575；枯草芽胞杆菌)、(U12678，位点AAC28894；大豆慢生根瘤菌USDA110)、(BACFDPS；嗜热脂肪地芽孢杆菌)、(NC_002940，位点NP_873754；杜克雷嗜血杆菌35000ΗP)、(L42023，位点AAC23087；流感嗜血杆菌RdKW20)、(J05262；智人)、(YP_395294；清酒乳杆菌清酒亚种23K)、(NC_005823，位点YP_000273；问号钩端螺旋体哥本哈根血清型Fiocruz菌株(LeptospirainterrogansserovarCopenhagenistr.Fiocruz)L1-130)、(AB003187；藤黄微球菌)、(NC_002946，位点YP_208768；淋病奈瑟氏球菌FA1090)、(U00090，位点AAB91752；根瘤菌属NGR234)、(J05091；酿酒酵母)、(CP000031，位点AAV93568；波氏硅杆菌DSS-3)、(AE008481，位点AAK99890；肺炎链球菌R6)、和(NC__004556、位点NP779706；蒂梅丘拉1苛养木杆菌(XylellafastidiosaTemecula1))。
FPP随后被转化成多种C15化合物。C15化合物的示例性实施例，包括但不限于：
紫穗槐二烯
紫穗槐二烯，其结构是
是由黄花蒿制造的青蒿素的前体。紫穗槐二烯是采用紫穗槐二烯合成酶由FPP制造的。合适的核苷酸序列的一示例性实施例是美国专利申请号2004/0005678中的SEQIDNO.37序列。
图5图解显示了IPP和DMAPP是如何结合用于生产FPP的，然后FPP可以被进一步加工来生产紫穗槐二烯。
α-法呢烯
α-法呢烯，其结构是
在多种生物资源中被发现，包括但不限于蚂蚁的Dufour’s腺，以及苹果和梨的果皮涂层。α-法呢烯是采用α-法呢烯合成酶由FPP制造的。合适的核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于DQ309034，来自西洋梨品种d'Anjou(梨；基因名AFS1)和AY182241，来自苹果(苹果；基因AFS1)。Pechouus等，Planta219(1):84-94(2004)。
β-法呢烯
β-法呢烯，其结构是
在多种生物资源中被发现，包括但不限于蚜虫，和例如来自薄荷的香精油。在某些植物例如野生土豆中，β-法呢烯作为天然的驱虫剂被合成。β-法呢烯是采用β-法呢烯合成酶由FPP制造的。合适的核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于来自辣薄荷(薄荷；基因Tspal1)的GenBank登录号AF024615，和来自黄花蒿的AY835398。Picaud等，Phytochemistry66(9):961-967(2005)。
法呢醇
法呢醇，其结构是
在多种生物资源中被发现，包括昆虫，和例如来自香茅、橙花、仙客来、柠檬草、晚香玉、和玫瑰的香精油。法呢醇是采用羟化酶例如法呢醇合成酶由FPP制造的。合适的核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于来自玉米的GenBank登录号AF529266，和来自酿酒酵母(基因Pho8)的YDR481C，。Song,L.，AppliedBiochemistryandBiotechnology128:149-158(2006)。
橙花叔醇
橙花叔醇，其结构是
也被称作橙花油醇，在多种生物资源中被发现，包括例如来自橙花、姜、茉莉、薰衣草、茶树、和柠檬草的香精油。橙花叔醇是采用羟化酶例如橙花叔醇合成酶由FPP制造的。合适的核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于来自玉米(玉米；基因tps1)的AF529266。
绿叶醇
绿叶醇，其结构是
也被称作广藿香醇，是广藿香香精油的组成成分。绿叶醇是用绿叶醇合成酶由FPP制造的。合适的核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于来自广藿香的AY508730，区域：1..1659。
巴伦西亚橘烯
巴伦西亚橘烯，其结构是
是橘子气味和香味的主要化学成分之一，在橘子皮中被发现。巴伦西亚橘烯是用香柏酮合成酶由FPP制造的。合适的核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于来自甜橙的AF441124，区域：1..1647，和来自紫苏的AY917195，区域：1..1653。
C20化合物
示例性的C20生物有机化合物是通常源自香叶基牻牛儿醇焦磷酸(GGPP)的二萜，GGPP是通过三分子IPP和一分子DMAPP的缩合来制造的。已知用于催化该步骤的酶是，例如，香叶基香叶基焦磷酸合成酶。
图5也图解显示了IPP和DMAPP是如何结合来生产GGPP的，GGPP可以被进一步加工成二萜，或者可以被进一步加工来生产类胡萝卜素。
香叶基香叶基焦磷酸合成酶核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于：(ATHGERPYRS；拟南芥)、(BT005328；拟南芥)、(NM_119845；拟南芥)、(NZ_AAJM01000380，位点ZP_00743052；苏云金芽孢杆菌以色列血清型，ATCC35646sq1563)、(CRGGPPS；长春花)、(NZ_AABF02000074，位点ZP_00144509；具核梭杆菌文氏亚种，ATCC49256)、(GFGGPPSGN；藤仓赤霉)、(AY371321；银杏)、(AB055496；巴西橡胶树)、(AB017971；智人)、(MCI276129；葡萄牙卷枝毛霉)、(AB016044；小家鼠)、(AABX01000298，位点NCU01427；粗糙脉孢菌)、(NCU20940；粗糙脉孢菌)、(NZ_AAKL01000008，位点ZP_00943566；青枯菌UW551)、(AB118238；褐家鼠)、(SCU31632；酿酒酵母)、(AB016095；细长聚球蓝细菌)、(SAGGPS；白芥)、(SSOGDS；嗜酸热硫化叶菌)、(NC_007759，位点YP_461832；酸养互营菌SB)、和(NC_006840，位点YP_204095；费氏弧菌ES114)。
或者，GGPP也可以通过将IPP添加到FPP上来制造。编码能够催化该反应的酶的核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于：(NM_112315；拟南芥)、(ERWCRTE；成团泛菌)、(D90087，位点BAA14124；菠萝泛菌)、(X52291，位点CAA36538；荚膜红细菌)、(AF195122，位点AAF24294；球形红细菌)、和(NC_004350，位点NP_721015；变异链球菌UA159)。
GGPP随后被转化成多种C20类异戊二烯。C20化合物的示例性实施例，包括但不限于：
香叶基牻牛儿醇
香叶基牻牛儿醇，其结构是
是来自红椿(Cedrelatoona)的木油和亚麻籽油的组成成分。香叶基牻牛儿醇可以通过，例如将磷酸酶基加入表达构建体中GGPP合成酶基因的后面来制造。
松香二烯
松香二烯包含以下异构体：
在例如北美冷杉的树木中被发现。松香二烯是用松香二烯合成酶制造的。合适的核苷酸序列的示例性实施例，包括但不限于：(U50768；北美冷杉)和(AY473621；欧洲云杉)。
C20+化合物
C20+生物有机化合物也包括在本发明的范围之内。这样的化合物的示例性实施例包括二倍半萜(由五个异戊二烯单元制造的C25化合物)、三萜(由六个异戊二烯单元制造的C30化合物)、和四萜(由八个异戊二烯单元制造的C40化合物)。这些化合物是使用本文描述的类似方法，并且取代或者添加了适当的合成酶的核苷酸序列来制造的。
设计途径
尽管是用于说明的用途，本发明已经参考关于MEV和/或DXP途径的设计进行了描述，这些方法可以被改造为类似地合适的途径设计来制造非类异戊二烯的生物有机化合物。这些途径是典型地使用重组DNA技术，通过表达编码一种或多种酶的合适的外源序列的来设计的。
目的核苷酸可以通过单个或多个载体表达。核酸可以排列在单个操纵子，或者位于一个或多个载体的分开的操纵子中。当需要时，可以使用两个表达载体，其分别包含一个或多个外源序列可操纵地与单一操纵子相连接。尽管单个或多个载体以及单个或多个操纵子的选择可取决于外源序列的大小和载体的容量，它更大程度上取决于当在选定宿主细胞中表达时，载体能够提供的给定生物有机化合物的总产量。在某些情况下，两个操纵子的表达系统提供更高产量的生物有机化合物。目的载体可以保持为游离地可复制，或作为宿主细胞基因组的组成部分。典型地，后者优选用于宿主细胞的持续增殖。
在某些宿主细胞中，目的核酸可以被一个或多个操纵子控制。在某些情况下，两个或三个操纵子的系统比单个操纵子的系统提供更高产量的生物有机化合物。
当需要时，目的核酸序列可以被修饰，以反映选定宿主细胞的密码子偏好性从而实现该序列在宿主细胞中的较高表达。例如，目的核苷酸序列将在一些实施方案中被修饰以适应酵母的密码子偏好性。参见，例如，Bennetzen和Hall(1982)J:Biol.Chem.257(6):3026-3031。作为另一个非限制性实施例，核苷酸序列将在其它实施方案中被修饰以适应大肠杆菌(E.coli)的密码子偏好性。参见，例如，Gouy和Gautier(1982)NucleicAcidsRes.10(22):7055-7074；Eyre-Walker(1996)MoI.Biol.Evol.13(6):864-872。也参见Nakamura等(2000)NucleicAcidsRes.28(1):292。许多生物的密码子使用表是已知的，其可在本发明的序列设计中作为参考。给定宿主微生物的普遍密码子的使用，通常增加转录的可能性，因此增加了期望序列的表达水平。
目的核酸的制备可以通过多种常规重组技术和合成方法来实现。简单地说，目的核酸可以是制备的基因组DNA片段、cDNA和RNA，其全部可以直接从细胞中提取，或者通过各种扩增方法重组生产，其包括但不限于PCR和rt-PCR。
核酸的直接化学合成典型地涉及向延伸中的核苷酸聚合链的末端5'-羟基上依次添加3'-封闭和5'-封闭的核苷酸单体，其中每一次添加通过延伸中的链的末端5'-羟基对添加的单体的3'-位置上的亲核攻击来实现，所述添加的单体是典型的磷衍生物，例如磷酸三酯、亚磷酰胺或其类似物。这样的方法是本领域中普通的技术人员已知的，而且在相关的文章和文献(例如，Matteuci等(1980)Tet.Lett.521:719；Caruthers等，美国专利号4,500,707；和Southern等，美国专利号5,436,327和5,700,637)中描述。
核酸在宿主微生物中的转录水平可以用多种方法提高。例如，可以通过提高编码酶的核苷酸序列的拷贝数来实现(例如，通过使用较高拷贝数的包含编码酶的核苷酸序列的表达载体，或通过向宿主微生物的基因组中导入编码酶的核苷酸序列的另外拷贝，例如，通过recA介导的重组、使用“自杀”载体、使用λ噬菌体重组酶的重组、和/或通过转座子或转座元件的插入)。此外，通过改变操纵子的多顺反子mRNA上的编码区的顺序，或者分解操纵子成为各自带它本身的控制元件的独立基因，或者增加了与酶编码区可操纵连接的启动子(转录起始或者转录控制序列)的强度(例如，在大肠杆菌宿主微生物中，使用共有的阿拉伯糖或乳糖诱导的启动子代替修饰的乳糖诱导的启动子，例如在pBluescript和pBBR1MCS质粒中发现的那一种)，或者使用诱导型启动子并通过向生长培养基中添加化学药品来诱导该诱导型启动子来实现。核苷酸序列在宿主微生物中的转录水平可以用许多方法提高，包括但不限于增加mRNA的稳定性，修饰核糖体结合位点序列，修饰核糖体结合位点和酶编码序列的起始密码子之间的距离或序列，修饰位于“上游”或者邻近酶编码区的起始密码子5'一侧的全部顺反子间区域，使用发夹和专门设计的序列稳定mRNA转录子的3'端，修饰酶使用的密码子，改变酶的生物合成中使用的稀有密码子tRNA的表达，和/或增加酶的稳定性，如，例如，通过它的编码序列的突变。可基于源自宿主微生物的基因序列分析来确定首选密码子和稀有密码子的tRNA。
可以构建目的载体，以生产所编码的酶的期望水平的拷贝数。在一些实施方案中，目的载体产生至少10个、10到20个之间、20-50个之间、50-100个之间、或者甚至高于100个拷贝的期望的酶。低拷贝数质粒通常提供少于大约20个质粒拷贝每细胞；中拷贝数质粒通常提供从大约20个质粒拷贝每细胞到大约50个质粒拷贝每细胞，或者从大约20个质粒拷贝每细胞到大约80个质粒拷贝每细胞；而高拷贝数质粒通常提供从大约80个质粒拷贝每细胞到大约200个质粒拷贝每细胞，或者更多。
大肠杆菌的合适的低拷贝表达载体，包括但不限于pACYC184、pBeloBac11、pBR332、pBAD33、pBBR1MCS及其衍生物、pSC101、SuperCos(粘粒)、和pWE15(粘粒)。大肠杆菌的合适的中拷贝表达载体，包括但不限于pTrc99A、pBAD24、和包含CoIE1复制起点的载体及其衍生物。大肠杆菌的合适的高拷贝数表达载体，包括但不限于pUC、pBluescript、pGEM和pTZ载体。酵母的合适的低拷贝(着丝粒)表达载体，包括但不限于pRS415和pRS416(Sikorski&Hieter(1989)Genetics122:19-27)。酵母中合适的高拷贝2微米表达载体，包括但不限于pRS425和pRS426(Christainson等(1992)Gene110:119-122)。替代的2微米表达载体包括2微米载体的非选择标记的变种(Bruschi&Ludwig(1988)Curr.Genet.15:83-90)、或者具有表达盒的完整的2微米质粒(如同美国专利申请20050084972中例证的)、或者具有缺陷型筛选标记的2微米质粒，例如LEU2d(Erhanrt等(1983)J.Bacteriol.156(2):625-635)或者URA3d(Okkels(1996)AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences782(1):202-207)。
包括例如启动子和操纵子在内的调节元件，也可以被设计，用于通过增加一个或多个在决定生物有机化合物产生的总产量中担任重要角色的基因的表达，来增加设计途径的代谢流量。启动子是通过RNA聚合酶，起始和控制核酸序列的转录的核苷酸序列。操纵子是邻近启动子的核苷酸序列，其功能为控制期望的核酸序列的转录。操纵子包含可以与特定的阻遏蛋白结合的蛋白结合区域。当缺乏合适的阻遏蛋白时，转录通过启动子起始。当存在合适的阻遏蛋白时，阻遏蛋白与操纵子结合，并因而抑制了从启动子的转录。
在本发明的一些实施方案中，表达载体中使用的启动子是诱导型的。在其它实施方案中，表达载体中使用的启动子是组成型的。在一些实施方案中，一个或多个核酸序列可操纵地与诱导型启动子连接，并且一个或多个其它的核酸序列可操纵地与组成型启动子连接。
在原核宿主细胞中使用的合适的启动子的非限制性实施例包括：噬菌体T7RNA聚合酶启动子；trp启动子；lac操纵子启动子；杂合启动子，例如lac/tac杂合启动子、tac/trc杂合启动子、trp/lac启动子、T7/lac启动子；trc启动子；tac启动子等；araBAD启动子；体内调节启动子，例如ssaG启动子或相关启动子(参见，例如，美国专利申请号20040131637)、pagC启动子(Pulkkinen和Miller，J.Bacteriol.(1991)173(1):86-93；Alpuche-Aranda等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89(21):10079-83)、nirB启动子(Harborne等(1992)MoI.Micro.6:2805-2813)等等(参见，例如，Dunstan等(1999)Infect.Immun.67:5133-5141；McKelvie等(2004)Vaccine22:3243-3255；和Chatfield等(1992)Biotechnol.10:888-892)；sigma70启动子，例如共有的sigma70启动子(参见，例如GenBank登录号AX798980、AX798961、和AX798183)；稳定期启动子，例如dps启动子、spv启动子等；源自致病性胰岛SPI-2的启动子(参见，例如WO96/17951)；actA启动子(参见，例如，Shetron-Rama等(2002)Infect.Immun.70:1087-1096)；rpsM启动子(参见，例如，Valdivia和Falkow(1996)MoI.Microbiol.22:367-378)；tet启动子(参见，例如，Hillen等(1989)，在SaengerW.和HeinemannU.(编辑)的TopicsinMolecularandStructuralBiology，Protein-NucleicAcidInteraction第10卷143-162页，Macmillan，伦敦，UK)；SP6启动子(参见，例如Melton等(1984)Nucl.AcidsRes.12:7035-7056)；等等。
在一些实施方案中，在各自途径中在生物有机化合物的总产量中比其它酶起更重要的作用的外源酶的总活性，通过用强启动子表达该酶来增加。大肠杆菌的合适的强启动子包括但不限于Trc、Tac、T5、T7和Pλ。在本发明的另一个实施方案中，一种或多种设计的途径的酶在宿主中的总活性，通过在高拷贝数质粒中用强启动子表达该酶来增加。大肠杆菌合适的例子包括但不限于使用Trc、Tac、T5、T7和Pλ启动子，以及pBAD24、pBAD18、pGEM、pBluescript、pUC、和pTZ载体。
真核宿主细胞中使用的合适的启动子的非限制性实施例包括但不限于CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期或晚期SV40启动子、来自逆转录病毒的LTR、和小鼠的金属硫蛋白-I启动子。
原核宿主细胞中使用的合适的组成型启动子的非限制性实施例包括sigma70启动子(例如，共有的sigma70启动子)。在细菌宿主细胞中使用的合适的诱导型启动子的非限制性实施例包括噬菌体λ的pL；Plac；Ptrp；Ptac(Ptrp-lac杂合启动子)；异丙基-β-D44硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的启动子，例如lacZ启动子；四环素诱导的启动子；阿拉伯糖诱导的启动子，例如PBAD(参见，例如Guzman等(1995)J.Bacteriol.177:4121-4130)；木糖诱导的启动子，例如Pxy1(参见，例如Kim等(1996)Gene181:71-76)；GAL1启动子；色氨酸启动子；lac启动子；醇诱导的启动子，例如甲醇诱导的启动子和乙醇诱导的启动子；棉籽糖诱导的启动子；热诱导的启动子，例如热诱导的λPL启动子；由热敏感阻遏物控制的启动子(例如CI857阻遏的基于λ的表达载体；参见，例如Hoffmann等(1999)FEMSMicrobiolLett.177(2):327-34)；等等。
在酵母宿主细胞中使用的合适的组成型启动子的非限制性实施例包括ADH1、ADH2、PGK、或者LEU2启动子。在酵母宿主细胞中使用的合适的诱导型启动子的非限制性实施例包括但不限于发散半乳糖诱导的启动子，例如GAL1或GAL10启动子(West等(1984)MoI.Cell.Biol.4(11):2467-2478)，或者CUP1启动子。当需要时，目的载体包含比天然大肠杆菌(E.coli)Lac启动子强的启动子。
细菌宿主细胞中使用的操纵子的非限制性实施例，包括乳糖启动子操纵子(LacI阻遏蛋白与乳糖接触时改变了构型从而阻止了LacI阻遏蛋白与操纵子结合)、色氨酸启动子操纵子(当与色氨酸复合时，TrpR阻遏蛋白具有的构型能与操纵子结合；当缺乏色氨酸时，TrpR阻遏蛋白具有的构型不与操纵子结合)、和tac启动子操纵子(参见，例如，deBoer等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:21-25)。
表达载体中的基因典型地也编码核糖体结合位点，以引导任何mRNA基因编码产物的转录(即合成)。大肠杆菌中使用的合适的核糖体结合位点，参见Shine等(1975)Nature254:34，和Steitz，BiologicalRegulationandDevelopment:GeneExpression(R.F.Goldberger编辑)第1卷349页，1979，PlenumPublishing，NY)。在编码序列上游插入编码5'-AAAACA-3'核苷酸序列的核糖体结合位点，有助于在酵母宿主微生物中的高效转录(Looman等(1993)Nuc.Ac.Res.21:4268-4271；Yun等(1996)Mol.Microbiol.19:1225-1239)。
可在表达载体中使用的其它调节元件，包括转录增强子元件和转录终止子。参见，例如Bitter等(1987)MethodsinEnzymology，153:516-544。
表达载体可以是适合在特定类型的宿主微生物而非其它中使用的。然而，本领域普通技术人员可以容易地通过常规实验来确定特定的表达载体是否适合给定的宿主微生物。例如，可以向宿主生物中导入表达载体，并随后监测包含在载体中的任何基因的活力和表达。
表达载体也可以包含一个或多个筛选标记基因，当表达时，表现了一个或多个表型特征用于筛选或者鉴定携带表达载体的宿主细胞。真核细胞的合适的筛选标记的非限制性实施例包括二氢叶酸还原酶和新霉素抗性。原核细胞的合适的筛选标记的非限制性实施例包括四环素、氨苄青霉素、氯霉素、羧苄青霉素、和卡那霉素抗性。
为了以工业规模生产生物有机产物，需要向发酵培养基中添加抗生素的筛选标记的使用可能是不实用的或者过于昂贵的。因此，本发明的一些实施方案使用不要求利用赋予抗生素抗性的筛选标记来确保质粒(表达载体)的保持的宿主细胞。在本发明的这些实施方案中，表达载体包含质粒保持系统例如60-kbIncP(RK2)质粒，可选择地同时带有RK2质粒复制和/或分离系统，从而在缺乏抗生素筛选情况下，实现质粒保留(参见，例如Sia等(1995)J.Bacteriol.177:2789-97；Pansegrau等(1994)J.Mol.Biol.239:623-63)。用于该目的的合适的质粒保持系统是由RK2的parDE操纵子编码的，其编码一种稳定的毒素和一种不稳定的抗毒素。抗毒素可通过直接的蛋白-蛋白相互作用，抑制毒素的致死作用。缺乏包含parDE操纵子的表达载体的细胞很快被剥夺了该不稳定的抗毒素，导致稳定的毒素然后引起细胞死亡。RK2质粒复制系统由trfA基因编码，它编码DNA复制蛋白。RK2质粒分离系统由parCBA操纵子编码，它所编码的蛋白的功能是分解可能由DNA复制产生的质粒多聚体。
采用各种已建立的技术，目的载体可以被稳定地或者短暂地导入到宿主细胞中。例如，一种方法涉及氯化钙处理，其中表达载体通过钙沉淀导入。其它的盐，例如磷酸钙，也可以按照类似的方法使用。此外，可以使用电穿孔(即应用电流来增加细胞对核酸的透性)。其它的转化方法包括显微注射、DEAE葡聚糖介导的转化、和醋酸锂存在下的热休克。脂质复合物、脂质体和树枝状聚合物也可被用来转染宿主微生物。
在转化时，可以采用多种方法来鉴定已经导入目的载体的宿主细胞。一示范的筛选方法涉及继代培养独立的细胞以形成独立克隆，接着测试期望的基因产物的表达。另一方法需要基于表达载体内包含的筛选标记基因的表达所赋予的表型特征，来筛选转化的宿主细胞。采用这些或那些本领域已知的方法，本领域普通技术人员可以鉴定遗传修饰的宿主细胞。
本发明的各种途径序列向宿主细胞中的导入，可以通过方法例如PCR、Southern或Northern印迹杂交来确认。例如，可以从得到的宿主细胞中制备核酸，而感兴趣的特定序列可以使用特异于感兴趣的序列的引物，通过PCR来扩增。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳或者毛细管电泳，接着用溴化乙锭、SYBRGreen溶液或类似物染色，或者用UV检测来检测DNA。或者，可以在杂交反应中使用特异于感兴趣的序列的核酸探针。通过逆转录PCR、Northern印迹杂交，或者凭借免疫测定，使用与编码的基因产物反应的抗体，来检测相应的mRNA，从而来确定特定基因序列的表达。免疫测定的例子包括但不限于ELISA、放射免疫测定和夹心免疫测定。
本文公开的经一种或多种代谢途径生产的生物有机化合物的产量可通过抑制将中间产物从朝向生物有机产物形成的生产步骤中转移的反应来提高。通过减少在一个或多个非生产性的反应中所涉及的酶的表达和/或活性，可以达到对非生产性反应的抑制。这样的反应包括TCA循环的副反应，它们以影响生物有机化合物的总产量的水平，导致脂肪酸的生物合成、丙氨酸的生物合成、天冬氨酸超级途径、糖原异生、血红素的生物合成、和/或谷氨酸的生物合成。
可以使用多种方法来敲除(knock-out)或者敲减(knock-down)感兴趣的基因。例如，基因表达的减少，可以通过缺失、突变和/或基因重排来实现。它也可以使用反义RNA、siRNA、miRNA、核酶、三链DNA、以及转录和/或翻译抑制剂来执行。另外，可以使用转座子来干扰基因表达，例如，通过在启动子和编码区之间、或者两个邻近基因之间插入来失活一个或者两个基因。
每升发酵物中的微生物数量，或者微生物密度，可以通过测量从一定体积的发酵培养基中分离的微生物重量来测量。常用的标准是每升发酵培养基的细胞干重量。另一个可以用来在进行时监测发酵的方法是通过测量培养基的光密度。常用的方法是在波长600nm处测量光密度，称为OD600值或者OD值。OD值可以与特定培养基内的特定类型生物的密度相关联，但是OD值和每体积微生物数量之间的特定关系通常并不适合所有类型的培养基中的所有类型的生物。通过在一系列细胞密度上测量OD值和干细胞重量，可以创建校准曲线。在某些情况下，这些相互关系可以在相同或类似的微生物在相同或类似的培养基中的不同发酵中使用。
实施例
除非另外指出，本发明的实施可以使用在本领域技术范围内的生物合成工业的常规技术等等。在一定程度上这些技术没有在本文中全部描述，可以在科学文献中发现足够的相关参考。
在以下实施例中，已经作了努力来保证相关使用的数字(例如数量、温度等等)的精确度，但是变化和偏差是可以理解的，而且如果本文报告的数字存在笔误，本发明所述领域的普通的技术人员可以基于本文披露的剩余部分，推导出正确的数量。除非另外指出，温度以摄氏度报告，而压力是或者接近海平面的大气压。所有的试剂，除非另外指出，是商业获得的。以下实施例仅仅供说明性的用途，并且不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
本实施例描述了制备在操纵子中排列的，编码来自酿酒酵母的MEV途径的酶的表达质粒的方法。
通过将MevT操纵子(SEQIDNO：1)插入到pBAD33载体来制备表达质粒pMevT。MevT操纵子编码MEV途径的酶的集合，所述的酶共同将普遍存在的前体乙酰辅酶A转换成(R)-甲羟戊酸，即乙酰乙酰辅酶A硫解酶、HMG-CoA合成酶、和HMG-CoA还原酶。通过从大肠杆菌基因组DNA中PCR扩增atoB基因的编码序列(GenBank登录号NC_000913区域：2324131..2325315)(编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶)，从酿酒酵母基因组DNA中PCR扩增ERG13基因的编码序列(GenBank登录号X96617，区域：220..1695)(编码HMG-CoA合成酶)，以及从酿酒酵母基因组DNA中PCR扩增HMG1基因的编码区片段(GenBank登录号M22002，区域：1660..3165)(编码截短的HMG-CoA还原酶(tHMGR))，来制备MevT操纵子。用于扩增HMG1基因片段的上游PCR引物包含人造的起始密码子。扩增的片段使用重叠延伸(拼接法)拼接到一起，在该过程中，核糖体结合位点被导入到atoB和ERG13编码序列之后。在添加3'A突出末端后，将MevT操纵子连接至TA克隆载体pCR4(Invitrogen，Carlsbad，CA)上，并测序来保证准确性。MevT操纵子随后被连接至载体pBAD33(Guzman等(1995)J.Bacteriol.177(14):4121-4130)的XmaIPstI限制性内切酶位点上。为了将操纵子放置于PLac启动子的控制下，pBAD33的araC-PBADNsiI-XmaI片段被替换为pBBR1MCS的NsiI-XmaI片段，产生表达质粒pMevT(参见美国专利号7,192,751)。
通过将MevT66操纵子插入pAM36载体中来制备表达质粒pAM36-MevT66。通过将包含AscI-SfiI-AsiSI-XhoI-PacI-FsIl-PmeI限制性内切酶位点的寡核苷酸盒插入到pACYC184载体(GenBank登录号XO6403)中并去除pACYC184中的tet抗性基因来制备载体pAM36。MevT66操纵子是采用核苷酸序列SEQIDNO：1作为模板合成制备的，所述序列包括来自大肠杆菌的atoB基因(GenBank登录号NC_000913区域：2324131..2325315)，来自酿酒酵母的ERG13基因(GenBank登录号X96617，区域：220..1695)，和来自酿酒酵母的HMG1基因的删节版(GenBank登录号M22002，区域：1777..3285)，所有三个序列均被密码子优化以在大肠杆菌中表达。合成产生的MevT66操纵子侧面带5'EcoRI限制性内切酶位点和3'HindIII限制性内切酶位点，并因此可以被克隆至克隆载体的相容性限制性内切酶位点上，例如标准的pUC或pACYC来源的载体。从该构建体中PCR扩增侧面带SfiI和AsiSI限制性内切酶位点MevT66操纵子，使用SfiI和AsiSI限制性内切酶完全消化扩增的DNA片段，通过凝胶电泳分离反应混合物，使用Qiagen凝胶纯化试剂盒(Valencia，CA)，凝胶提取大约4.2kb的DNA片段，将分离的DNA片段连接到pAM36载体的SfiIAsiSI限制性内切酶位点上，生成表达质粒pAM36-MevT66。
通过将MevT66操纵子插入到pAM29载体中制备表达质粒pAM25。通过组装p15A复制起点、来自pZS24-MCS1(Lutz和Bujard(1997)NuclAcidsRes.25:1203-1210)的kan抗性基因、和寡核苷酸生成的lacUV5启动子来制备载体pAM29。使用EcoRI和HindIII限制性内切酶将包含MevT66操纵子(参见上文)的DNA合成构建体完全消化，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取4.2kb的DNA片段，将分离的DNA片段连接到pAM29的EcoRIHindIII限制性内切酶位点上，产生表达质粒pAM25。
通过将MevB操纵子插入到pBBR1MCS-1载体上产生表达质粒pMevB-Cm。MevB操纵子编码了酶的集合，所述酶共同将(R)-甲羟戊酸转化成IPP，即甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、和甲羟戊酸焦磷酸羧化酶。通过从酿酒酵母基因组DNA中PCR扩增ERG12基因(GenBank登录号X55875，区域：580..1911)(编码甲羟戊酸激酶)、ERG8基因(GenBank登录号Z49939，区域：3363..4718)(编码磷酸甲羟戊酸激酶)、和MVD1基因(GenBank登录号X97557，区域：544..1734)(编码甲羟戊酸焦磷酸羧化酶)的编码序列，并使用重叠延伸(拼接法)将PCR片段拼接到一起，制备MevB操纵子。通过选择适当的引物序列，在扩增期间把ERG12和ERG8的终止子从TAA改成TAG，以导入核糖体结合位点。在添加3'A突出末端后，将MevB操纵子连接到TA克隆载体pCR4(Invitrogen，Carlsbad，CA)上。通过使用PstI限制性内切酶完全消化克隆载体来剪切MevB操纵子，通过凝胶电泳来分离反应混合物，凝胶提取4.2kb的DNA片段，并将分离的DNA片段连接到载体pBBR1MCS-1(Kovach等，Gene166(1):175-176(1995))的PstI限制性内切酶位点上，产生表达质粒pMevB-Cm。
通过将MBI操纵子插入到pBBR1MCS-3载体来制备表达质粒pMBI。MBI操纵子编码与MevB操纵子相同的酶，以及催化IPP转化成DMAPP的异戊烯焦磷酸异构酶。使用在5'端含有XmaI限制性内切酶位点的引物，从大肠杆菌基因组DNA中PCR扩增idi基因的编码序列(GenBank登录号AF119715)，生成MBI操纵子；使用XmaI限制性内切酶完全消化扩增的DNA片段，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取0.5kb的片段，并将分离的DNA片段连接到表达质粒pMevB-Cm的XmaI限制性内切酶位点上，从而将idi置于MevB操纵子的3'端。MBI操纵子被亚克隆至载体pBBR1MCS-3(Kovach等，Gene166(1):175-176(1995))的SalI和SacI限制性内切酶位点上，产生表达质粒pMBI(参见美国专利号7,192,751)。
通过将ispA基因插入到pMBI中来制备表达质粒pMBIS。ispA基因编码法尼西基焦磷酸合成酶，其催化IPP和DMAPP转化成FPP。使用带SacII限制性内切酶位点的正向引物和带SacI限制性内切酶位点的反向引物，从大肠杆菌基因组DNA中，PCR扩增ispA基因的编码序列(GenBank登录号D00694，区域：484..1383)。使用SacII和SacI限制性内切酶完全消化扩增的PCR产物，通过凝胶电泳分离反应混合物，并凝胶提取0.9kb的DNA片段。将分离的DNA片段连接到pMBI的SacIISacI限制性内切酶位点上，从而将ispA基因置于idi和MevB操纵子的3'端，并产生表达质粒pMBIS(参见美国专利号7,192,751)。
表达质粒pMBIS-gpps来源于表达质粒pMBIS，其通过将ispA编码序列替换为编码香叶基二磷酸合成酶(“gpps”)的核苷酸序列来制备。包含编码香叶基二磷酸合成酶的核苷酸序列的DNA片段是合成制备的，其使用进行密码子优化以在大肠杆菌中表达的拟南芥的gpps基因编码序列(GenBank登录号Y17376，区域：52..1320)作为模板。核苷酸序列侧面带有起始端SacII限制性内切酶位点和末端SacI限制性内切酶位点，并且被克隆至克隆载体的相容性限制性内切酶位点上，例如标准的pUC或pACYC来源的载体。通过使用SacII和SacI限制性内切酶完全消化DNA合成构建体来分离合成制备的香叶基二磷酸合成酶序列，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取大约1.3kb的DNA片段，将分离的DNA片段连接至表达质粒pMBIS的SacIISacI限制性内切酶位点上，产生表达质粒pMBIS-gpps(质粒图谱参见图6)。
通过将MBIS操纵子插入到pAM36-MevT66中，并在两个操纵子前面添加lacUV5启动子来制备表达质粒pAM45。使用包含5'XhoI限制性内切酶位点和3'PacI限制性内切酶位点的引物，从pMBIS中PCR扩增MBIS操纵子。使用XhoI和PacI限制性内切酶完全消化扩增的PCR产物，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取5.4kb的DNA片段，分离的DNA片段被连接到pAM36-MevT66的XhoIPacI限制性内切酶位点上，产生质粒pAM43。用寡核苷酸合成包含编码lacUV5启动子的核苷酸序列的DNA片段，并亚克隆至pAM43的AscISfiI和AsiSIXhoI限制性内切酶位点上，产生表达质粒pAM45。
实施例2
本实施例描述了制备在操纵子中排列的，编码来自金黄色葡萄球菌的MEV途径的酶的表达载体的方法。
表达质粒pAM41来源于表达质粒pAM25，其通过将编码酿酒酵母HMG-CoA还原酶的HMG1基因编码序列替换为编码金黄色葡萄球菌HMG-CoA还原酶的mvaA基因编码序列(GenBank登录号BA000017，区域：2688925..2687648)制备。使用引物4-49mvaASpeI(SEQIDNO：2)和4-49mvaARXbaI(SEQIDNO：3)，从金黄色葡萄球菌金黄亚种(ATCC70069)基因组DNA中，PCR扩增mvaA基因的编码序列，使用SpeI限制性内切酶完全消化扩增的DNA片段，通过凝胶电泳分离反应混合物，并凝胶提取大约1.3kb的DNA片段。通过使用HindIII限制性内切酶完全消化pAM25，从pAM25中去除HMG1编码序列。得到的线形DNA片段的突出末端使用T4DNA聚合酶补平。然后使用SpeI限制性内切酶部分消化DNA片段，通过凝胶电泳分离反应混合物，并凝胶提取4.8kb的DNA片段。分离的DNA片段与经SpeI消化的mvaAPCR产物连接，产生表达质粒pAM41。在pAM41中包含的atoB(opt):ERG13(opt):mvaA操纵子的核苷酸序列为SEQIDNO：41。ERG13也被称作HMGS，或者HMG-CoA合成酶。
表达质粒pAM52来源于表达质粒pAM41，通过将编码酿酒酵母HMG-CoA合成酶的ERG13基因编码序列替换为编码金黄色葡萄球菌HMG-CoA合成酶的mvaS基因编码序列(GenBank登录号BA000017，区域：2689180..2690346)来制备。使用引物HMGS5'SamvaS-S(SEQIDNO：4)和HMGS3'SamvaS-AS(SEQIDNO：5)，从金黄色葡萄球菌金黄亚种(ATCC70069)基因组DNA中，PCR扩增mvaS基因的编码序列，并依照Geiser等(BioTechniques31:88-92(2001))的方法，使用扩增的DNA片段作为PCR引物，来替换pAM41中的HMG1基因编码序列，从而产生表达质粒pAM52。在pAM52中包含的atoB(opt):mvaS:mvaA操纵子的核苷酸序列是SEQIDNO：42。
表达质粒pAM97来源于表达质粒pAM45，通过将MevT66操纵子替换为表达质粒pAM52的(atoB(opt):mvaS:mvaA)操纵子来制备。采用AsiSI和SfiI限制性内切酶完全消化表达质粒pAM45，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取缺乏MevT66操纵子的8.3kbDNA片段。使用引物19-25atoBSfiI-S(SEQIDNO：6)和19-25mvaA-AsiSI-AS(SEQIDNO：7)，PCR扩增pAM52的(atoB(opt):mvaS:mvaA)操纵子，使用SfiI和AsiSI限制性内切酶完全消化PCR产物，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取3.7kb的DNA片段，将分离的DNA片段连接到表达质粒pAM45的AsiSISfiI限制性内切酶位点上，产生表达质粒pAM97。
表达质粒pAM97-MBI来源于表达质粒pAM97和pAM45，将pAM97的MBIS操纵子替换为pAM45的MBI操纵子来制备。使用引物9-70C(SEQIDNO：8)和26-39B(SEQIDNO：9)，从pAM45中PCR扩增MBI操纵子，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取4.5kb的DNA片段，使用SacI和XhoI限制性内切酶完全消化分离的DNA片段。采用SacI和XhoI限制性内切酶完全消化表达质粒pAM97，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取7.6kb片段，将分离的DNA片段与MBI操纵子的PCR产物连接，产生表达质粒pAM97-MBI。
表达质粒pAM97-MevB来源于表达质粒pAM97和pAM45，将pAM97的MBIS操纵子替换为pAM45的MevB操纵子。使用引物9-70C(SEQIDNO：8)和26-39A(SEQIDNO：10)，从pAM45中PCR扩增MevB操纵子，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取3.9kb的DNA片段，使用SacI和XhoI限制性内切酶完全消化分离的DNA片段。使用SacI和XhoI限制性内切酶完全消化表达质粒pAM97，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取7.6kb片段，将分离的DNA片段与MevB操纵子的PCR产物连接，产生表达质粒pAM97-MevB。
通过将表达质粒pAM97的(atoB(opt):mvaS:mvaA)和MBIS操纵子插入到包含RK2质粒复制、分离和保持系统的载体中来制备表达质粒pAM128，其避免了对宿主细胞转化株抗生素筛选的持续需求。使用PstI限制性内切酶完全消化RK2质粒，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取包含完整par位点的大约6.3kbDNA片段，将分离的DNA片段亚克隆到微型RK2复制子pRR10(Roberts等(1990)JBacteriol.172(11):6204-6216)的PstI限制性内切酶位点中，产生载体pAM132。采用AscI和SacI限制性内切酶完全消化表达质粒pAM97，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取大约9.4kb的DNA片段，将分离的DNA片段连接到pAM132的MluISacI限制性内切酶位点上，产生表达质粒pAM128。
实施例3
本实施例描述了制备在操纵子中排列的，编码来自粪肠球菌的MEV途径的酶的表达载体的方法。
质粒pAM16通过将粪肠球菌的mvaE基因编码序列(GenBank登录号AF290092区域：1479..3890)(编码乙酰辅酶A乙酰基转移酶/HMG-CoA还原酶(HMGR))插入到pBlueScripII-KS(+)载体中来制备。使用5'磷酸化的引物4-40mvaEFBamHI(SEQIDNO：11)和4-40mvaERHindIII(SEQIDNO：12)，从粪肠球菌基因组DNA(ATCC700802)中PCR扩增mvaE基因的编码序列。(注意，引物4-40mvaEFBamHI在扩增的PCR产物中将mvaE基因的起始密码子从TTG改成了ATG。)得到的PCR产物被连接到pBlueScripII-KS(+)(Stratagene，LaJolla，CA)的SmaI限制性内切酶位点上，产生表达质粒pAM16。
通过将粪肠球菌的mvaS基因编码序列(GenBank登录号AF290092区域：142..1293)(编码HMG-CoA合成酶(HMGS))插入到pBlueScripII-KS(+)载体中来制备质粒pAM18。使用5'磷酸化的引物4-40mvaSFBglII(SEQIDNO：13)和4-39mvaSRBamHI(SEQIDNO：14)，从粪肠球菌基因组DNA(ATCC700802)中，PCR扩增mvaS基因的编码序列，将PCR产物连接至pBlueScripII-KS(+)(Stratagene，LaJolla，CA)的SmaI限制性内切酶位点上，产生表达质粒pAM18。
通过将表达质粒pAM16的mvaE基因编码序列插入到pZE21-PL-lacOl载体中来制备表达质粒pAM22。载体pZE21-PL-lacOl是载体pZE21-MCS-1的衍生物，其中的tet启动子被替换为PL-lacOl启动子(Lutz和Bujard(1997)NuclAcidsRes.25:1203-1210)。使用BamHI和HindIII限制性内切酶完全消化表达质粒pAM16，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取包含mvaE编码序列的大约2.4kbDNA片段，将分离的DNA片段插入到pZE21-PL-lacOl的BamHIHindIII限制性内切酶位点中，产生表达质粒pAM22。
通过将表达质粒pAM18的mvaS基因编码序列插入到表达质粒pAM22中来制备表达质粒pAM33。使用BglII和BamHI限制性内切酶完全消化表达质粒pAM18，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取包含mvaS基因编码序列的大约1.2kbDNA片段，将分离的DNA片段插入到表达质粒pAM22的BamHI位点中，产生表达质粒pAM33。
通过将表达质粒pAM33的mvaS-mvaE操纵子插入到载体pAM29中来制备表达质粒pAM34。通过使用EcoRI限制性内切酶部分消化pAM33分离得到mvaS-mvaE操纵子，得到的线形DNA片段使用MluI限制性内切酶消化，通过凝胶电泳分离反应混合物，并凝胶提取大约3.6kb的DNA片段。通过使用MluI和EcoRI限制性内切酶完全消化表达载体pAM25，获得pAM29的载体骨架，通过凝胶电泳分离反应混合物，并凝胶提取大约2.1kb的DNA片段。连接两段分离的DNA片段，产生表达质粒pAM34。
实施例4
本实施例描述了制备在操纵子中排列的，编码来自大肠杆菌的DXP途径的酶的表达质粒的方法。
通过将编码DXP途径“顶部”的酶的基因插入到pAM29载体中来制备表达质粒pAM408。DXP途径“顶部”的酶包括1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(由大肠杆菌的dxs基因编码)、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(由大肠杆菌的dxr基因编码)、4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶(由大肠杆菌的ispD基因编码)、和4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶(由大肠杆菌的ispE基因编码)，它们共同将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸转化成4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇-2-磷酸。通过使用SEQIDNO：15-18中所示的PCR引物，从大肠杆菌菌株DH1(ATCC#33849)中PCR扩增dxs(GenBank登录号U00096区域：437539..439401)、dxr(GenBank登录号U00096区域：193521..194717)、ispD(GenBank登录号U00096区域：2869803..2870512)、和ispE(GenBank登录号U00096区域1261249..1262100)基因的编码序列并添加最优的ShineDalgarno序列和5'和3'限制性内切酶位点来制备包含编码DXP途径”顶部”的酶的核苷酸序列的DNA片段。PCR产物通过凝胶电泳分离，使用Qiagen(Valencia，CA)凝胶纯化试剂盒凝胶提取，采用适当的限制性内切酶(XhoI和KpnI用于包含dxs基因的PCR产物；KpnI和ApaI用于包含dxr基因的PCR产物；ApaI和NdeI用于包含ispD基因的PCR产物；NdeI和MluI用于包含ispE基因的PCR产物)完全消化，并使用Qiagen(Valencia，CA)PCR纯化试剂盒纯化。随后，将大致相等摩尔数的每一PCR产物的加入到连接反应中，以将独立的基因组装成操纵子。对该连接反应，1μl反应混合物用来PCR扩增2个分离的基因盒，即dxs-dxr和ispD-ispE基因盒。使用引物67-1A-C(SEQIDNO：15)和67-lD-C(SEQIDNO：18)来PCR扩增dxs-dxr基因盒，并且使用引物67-1E-C(SEQIDNO：19)和67-lH-C(SEQIDNO：22)来PCR扩增ispD-ispE基因盒。两种PCR产物通过凝胶电泳分离，并进行凝胶提取。使用XhoI和ApaI限制性内切酶完全消化包含dxs-dxr基因盒的PCR产物，使用ApaI和MluI限制性内切酶完全消化包含ispD-ispE基因盒的PCR产物，并纯化这两种PCR产物。使用SalI和MluI限制性内切酶完全消化载体pAM29，将包含“顶部”DXP途径操纵子的两种消化后的PCR产物连接到pAM29载体的SalIMluI限制性内切酶位点上，产生表达质粒pAM408(质粒图谱参见图7)。
通过将编码DXP途径”底部”的酶的基因插入到pAM369载体中来制备表达质粒pAM409。DXP途径”底部”的酶包括2C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环二磷酸合成酶(由大肠杆菌的ispF基因编码)、1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合成酶(由大肠杆菌的ispG基因编码)、和异戊烯/二甲基丙烯二磷酸合成酶(由大肠杆菌的ispH基因编码)，它们共同将4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇-2-磷酸转换成IPP和DMAPP。IPP也通过异戊基二磷酸异构酶(由大肠杆菌的idi基因编码)的活性，转化成DMAPP。DMAPP可以通过法尼西基二磷酸合成酶(由大肠杆菌的ispA基因编码)的活性，进一步转化成FPP。通过使用适当的PCR引物，从大肠杆菌菌株DH1(ATCC#33849)中PCR扩增ispF(GenBank登录号U00096区域：2869323..2869802)、ispG(GenBank登录号U00096区域：2638708..2639826)、ispH(GenBank登录号U00096区域：26277..27227)、idi(GenBank登录号AF119715)和ispA(GenBank登录号D00694区域：484..1383)基因并添加最优的ShineDalgarno序列和5'和3'限制性内切酶位点，来制备编码DXP途径”底部”的酶以及异戊基二磷酸异构酶和法尼西基二磷酸合成酶的操纵子。PCR产物通过凝胶电泳分离，凝胶提取，用适当的限制性内切酶消化(BamHI和ApaI用于包含ispF基因的PCR产物；KpnI和ApaI用于包含ispG基因的PCR产物；SalI和KpnI用于包含ispH基因的PCR产物；SalI和HindIII用于包含idi基因的PCR产物；HindIII和NcoI用于包含ispA基因的PCR产物)，并纯化。然后，将大致相等摩尔数的每一PCR产物加入到连接反应中，以将独立的基因组装成操纵子。对该连接反应，1μl反应混合物被用来PCR扩增2个分离的基因盒，即ispF-ispG和ispH-idi-ispA基因盒。使用引物67-2A-C(SEQIDNO：23)和67-2D-C(SEQIDNO：26)来PCR扩增ispF-ispG基因盒，并且使用引物67-2E-C(SEQIDNO：27)和67-2J-C(SEQIDNO：32)来PCR扩增ispH-idi-ispA基因盒。通过凝胶电泳分离两种PCR产物，并进行凝胶提取。使用BamHI和KpnI限制性内切酶完全消化包含ispF-ispG基因盒的PCR产物，使用KpnI和NcoI限制性内切酶完全消化包含ispH-idi-ispA基因盒的PCR产物，并纯化这两种PCR产物。通过组装来自pAM29的p15A复制起点、来自pZE12-luc(Lutz和Bujard(1997)NuclAcidsRes.25:1203-1210)的氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因、和寡核苷酸生成的lacUV5启动子，构建载体pAM369。使用BamHI和NcoI限制性内切酶完全消化载体pAM369，将包含“底部”DXP途径操纵子的2种分离的PCR产物连接到pAM369载体的BamHINcoI限制性内切酶位点上，产生表达质粒pAM409。
通过将pAM409的lacUV5启动子和ispFGH-idi-ispA操纵子转移到pAM257载体上来制备表达质粒pAM424，一包含较宽宿主范围的RK2复制起点的表达质粒pAM409的衍生物。载体pAM257是如下制备的：使用引物9-156A(SEQIDNO：33)和9-156B(SEQIDNO：34)，从RK2质粒DNA(Meyer等(1975)Science190:1226-1228)中PCR扩增RK2par位点，使用AatII和XhoI限制性内切酶完全消化该2.6kb的PCR产物，将DNA片段连接至包含p15复制起点和来自载体pZA31-luc(Lutz和Bujard(1997)NuclAcidsRes.25:1203-1210)的氯霉素抗性基因的质粒中，产生质粒pAM37-par；使用限制性内切酶SacI和HindIII完全消化pAM37-par，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取包含RK2par位点和氯霉素抗性基因的DNA片段，将分离的DNA片段连接到微型RK2复制子pRR10(Roberts等(1990)JBacteriol.172:6204-6216)的SacIHindIII位点上，产生载体pAM133；使用BglII和HindIII限制性内切酶完全消化pAM133，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取缺乏氨苄青霉素抗性基因和oriT接合起点的大约6.4kbDNA片段，将分离的DNA片段与合成制备的包含含有PciI和XhoI限制性内切酶位点的多克隆位点的DNA片段连接，生成载体pAM257。使用XhoI和PciI限制性内切酶完全消化表达质粒pAM409，通过凝胶电泳分离反应混合物，并凝胶提取大约4.4kb的DNA片段。使用限制性内切酶XhoI和PciI完全消化载体pAM257，并且包含lacUV5启动子和ispFGH-idi-ispA操纵子的分离的DNA片段被连接到pAM257载体的XhoIPciI限制性内切酶位点上，产生表达质粒pAM424(质粒图谱参见图8)。
实施例5
本实施例描述了制备编码转化FPP或GPP的酶的表达质粒的方法。
通过将编码紫穗槐-4,11-二烯合成酶(“ADS”)的核苷酸序列插入到载体pTrc99A中来制备表达质粒pTrc99A-ADS。紫穗槐-4,11-二烯合成酶序列是合成制备的，因此在转录时，氨基酸序列将与Merke等(2000)Ach.Biochem.Biophys.381:173-180中描述的相同，从而编码紫穗槐-4,11-二烯合成酶的核苷酸序列被优化用于在大肠杆菌中表达，因此核苷酸序列侧面带5'NcoI和3'XmaI限制性内切酶位点(参见美国专利号7,192,751)。使用NcoI和XmaI限制性内切酶完全消化该核苷酸序列，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取大约1.6kb的DNA片段，并将分离的DNA片段插入到pTrc99A载体(Amman等(1985)Gene40:183-190)的NcoIXmaI限制性内切酶位点上，产生表达质粒pTrc99A-ADS(质粒图谱参见图9)。
表达质粒pAM113是pTrc99A-ADS的氯霉素抗性衍生物。其通过如下方法制备：使用5'-磷酸化的引物19-137cml-pAM37-AS(SEQIDNO：35)和19-137cml-pAM37-S(SEQIDNO：36)，从载体pZA31-luc(Lutz和Bujard(1997)NuclAcidsRes.25:1203-1210)中，PCR扩增氯霉素抗性基因，并将920bp的PCR产物插入到表达质粒pTrc99A-ADS的FspI限制性内切酶位点中，产生表达质粒pAM113。
通过将包含nudF基因编码序列和上游基因组序列的枯草芽胞杆菌6051基因组DNA片段(GenBank登录号Z99116区域：49364..48548)，插入到载体pTrc99A(Amann等(1988)Gene69:301-315)中来制备表达质粒pC9。通过将枯草芽胞杆菌6051的nudF基因编码序列(GenBank登录号Z99116区域：49105..48548)插入到载体pTrc99A中来制备表达质粒pNudF-H。通过将枯草芽胞杆菌6051的yhfR基因编码序列(GenBank登录号Z99109区域：97583..97002)插入到载体pTrc99A中来制备表达质粒pyhfR。
通过将被密码子优化以在大肠杆菌中表达的编码黄花蒿的β-法呢烯合成酶(“FSB”)的核苷酸序列(GenBank登录号AY835398)，插入到pTrc99A载体中来制备表达质粒pAM373。编码β-法呢烯合成酶的核苷酸序列是合成制备的，其使用适当的引物从它的DNA合成构建体中通过PCR扩增得到。为了在包含β-法呢烯合成酶编码序列的PCR产物中创建一起始端NcoI限制性内切酶位点，原始多肽序列中编码第二个氨基酸的密码子(TCG编码丝氨酸)，在5'PCR引物(SEQIDNO：37)中被替换为编码天冬氨酸(GAC)的密码子。使用NcoI限制性内切酶部分消化得到的PCR产物，并使用SacI限制性内切酶完全消化，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取包含β-法呢烯合成酶编码序列的大约1.7kbDNA片段，将分离的DNA片段连接到pTrc99A载体的NcoISacI限制性内切酶位点上，产生表达质粒pAM373(质粒图谱参见图9)。
通过将包含编码α-法呢烯合成酶(“FSA”)、γ-萜品烯合成酶(“GTS”)、α-蒎烯合成酶(“APS”)、或者萜品油烯合成酶(“TS”)的核苷酸序列的DNA片段，插入到pTrc99A载体中来制备表达质粒pTrc99A-FSA、pTrc99A-GTS、pTrc99A-PS、pTrc99A-TS。插入的DNA片段是合成制备的，作为模板使用的是，例如欧洲云杉的α-法呢烯合成酶基因编码序列(GenBank登录号AY473627，区域：24..1766)；黄花蒿的β-法呢烯合成酶基因编码序列(GenBank登录号AY835398)；柠檬的γ-萜品烯合成酶基因编码序列(GenBank登录号AF514286区域：30..1832)；北美冷杉(GenBank登录号U87909，区域：6..1892)或火炬松(GenBank登录号AF543530区域：1..1887)的α-蒎烯合成酶基因编码序列；或者罗勒(GenBank登录号AY693650)、花旗松(GenBank登录号AY906866区域：10..1887)、或北美冷杉(GenBank登录号AF139206)的萜品油烯合成酶基因编码序列，所有的核苷酸序列被密码子优化用于在大肠杆菌中表达。使用SEQIDNO：39和SEQIDNO：40的引物序列，从其DNA合成构建体中通过PCR扩增FSA的DNA片段。使用NcoI和SacI限制性内切酶完全消化得到的PCR产物，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取包含α-法呢烯合成酶编码序列的大约1.7kbDNA片段，将分离的DNA片段连接到pTrc99A载体的NcoISacI限制性内切酶位点上，产生表达质粒pTrc99A-FSA(质粒图谱参见图9)。GTS、APS和TS的DNA片段被设计成侧面带有起始端XmaI限制性内切酶位点和末端XbaI限制性内切酶位点，并且被克隆至克隆载体的相容性限制性内切酶位点上，例如标准的pUC或pACYC来源的载体，通过使用XbaI和XmaI限制性内切酶完全消化DNA合成构建体，所述DNA片段可以从中被重新释放，通过凝胶电泳分离反应混合物，并凝胶提取1.7到1.9的编码萜合成酶的DNA片段。将分离的DNA片段连接到载体pTrc99A(Amman等，Gene40:183-190(1985))的XmaIXbaI限制性内切酶位点上，产生质粒pTrc99A-GTS、pTrc99A-APS或者pTrc99A-TS(质粒图谱参见图9)。
通过将编码α-法呢烯合成酶(“FSA”)或者β-法呢烯合成酶(“FSB”)的核苷酸序列分别插入到pRS425-Gal1载体(Mumberg等(1994)Nucl.Acids.Res.22(25):5767-5768)中来制备表达质粒pRS425-FSA和pRS425-FSB。插入的核苷酸序列是合成制备的，作为模板使用的是：例如欧洲云杉的α-法呢烯合成酶基因编码序列(GenBank登录号AY473627，区域：24..1766)或黄花蒿的β-法呢烯合成酶基因编码序列(GenBank登录号AY835398)，其进行密码子优化用于在酿酒酵母中表达。所述合成制备的核苷酸序列侧面带5'BamHI位点和3'XhoI位点，并由此可以被克隆至克隆载体的相容性限制性内切酶位点上，例如标准的pUC或pACYC来源载体。通过使用BamHI和XhoI限制性内切酶完全消化DNA合成构建体来分离合成制备的核苷酸序列。通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取包含α-法呢烯合成酶或者β-法呢烯合成酶编码序列的大约1.7kbDNA片段，将分离的DNA片段连接到pRS425-Gal1载体的BamHIXhoI限制性内切酶位点上，分别产生表达质粒pRS425-FSA或pRS425-FSB。
通过将编码芳樟醇合成酶(“LLS”)、柠檬烯合成酶(“LMS”)、β-蒎烯合成酶(“BPS”)、β-水芹烯(“PHS”)、蒈烯合成酶(“CS”)、或者桧宁合成酶(“SS”)的核苷酸序列插入到pTrc99A载体中来制备表达质粒pTrc99A-LLS、pTrc99A-LMS、pTrc99A-BPS、pTrc99A-PHS、pTrc99A-CS、和pTrc99A-SS。插入的核苷酸序列是合成制备的，作为模板的使用是：例如黄花蒿的芳樟醇合成酶基因编码序列(GenBank登录号AF154124，区域：13..1764)、北美冷杉的柠檬烯合成酶基因编码序列(GenBank登录号AF006193区域：73..1986)、黄花蒿的β-蒎烯合成酶编码序列(GenBank登录号AF276072区域：1..1749)、北美冷杉的β-水芹烯合成酶基因编码序列(GenBank登录号AF139205区域：34..1926)、狭叶鼠尾草的蒈烯合成酶基因编码序列(GenBank登录号AF527416区域：78..1871)、或药用鼠尾草的桧萜合成酶基因编码序列(GenBank登录号AF051901区域：26..1798)。编码β-蒎烯、桧宁和β-水芹烯合成酶的核苷酸序列侧面带有起始端XmaI限制性内切酶位点和末端XbaI限制性内切酶位点，编码芳樟醇和蒈烯合成酶的核苷酸序列侧面带有起始端NcoI限制性内切酶位点和末端XmaI限制性内切酶位点，而编码柠檬烯合成酶的核苷酸序列侧面带有起始端NcoI限制性内切酶位点和末端PstI限制性内切酶位点。使用XmaI和XbaI(用于β-蒎烯、桧宁和β-水芹烯合成酶的载体)、NcoI和XmaI限制性内切酶(用于芳樟醇和蒈烯合成酶的载体)、或XbaI和PstI限制性内切酶(用于柠檬烯合成酶的载体)完全消化DNA合成构建体。通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取大约1.7到1.9kb的DNA片段，将分离的DNA片段连接到pTrc99A载体的XmaIXbaI限制性内切酶位点(用于β-蒎烯、桧宁和β-水芹烯合成酶的插入)、NcoIXmaI限制性内切酶位点(用于芳樟醇和蒈烯合成酶的插入)、或XbaIPstI限制性内切酶位点(用于柠檬烯合成酶的插入)上，产生表达质粒pTrc99A-LLS、pTrc99A-LMS、pTrc99A-BPS、pTrc99A-PHS、pTrc99A-CS和pTrc99A-SS(质粒图参见图9)。
实施例6
本实施例描述了本发明中使用的大肠杆菌宿主菌的制备。
如同表1中详述的，采用实施例1到5中的一种或多种表达质粒来化学转化感受态的大肠杆菌亲代细胞，以构建宿主菌。
表1.大肠杆菌(E.coli)宿主菌
在含有如表1中详述的抗生素的LuriaBertoni(LB)琼脂上筛选宿主细胞转化株。单个克隆从LB琼脂上转移到含5mLLB液体培养基和抗生素的培养管中。B003、B617、B618、B619、B650、B651、B652和B653宿主细胞转化株在30℃在摇床上在250rpm培养30小时。所有的其它宿主细胞转化株在37℃在摇床上在250rpm培养，直到生长到达稳定期。通过将其在含有0.8％葡萄糖和抗生素的M9-MOPS培养基(M9-MOPS培养基的组分参见表2)中连续传代4到5次，让细胞适应基本培养基。细胞在-80℃置于冷冻瓶中的由400μL无菌的50％甘油和600μL液体培养基组成的1mL储存分装液中保存。
表2-M9-MOPS培养基的组分
成分 重量(每升)
Na2HPO4 7H2O 12.8g
KH2PO4 3g
NaCl 0.5g
NH4Cl 1g
MgSO4 2mmol
CaCl2 0.1mmol
硫胺素 0.1ug
缓冲液pH7.4 100mmol
(NH3)6Mo7O24 4H2O 3.7ug
H3BO4 25ug
CoCl2 7.1ug
CuSO4 2.4ug
MnCl2 16ug
ZnSO4 2.9ug
FeSO4 0.28mg
实施例7
本实施例证明了在没有抗生素的情况下，大肠杆菌宿主菌中的表达质粒的稳定性，该宿主菌含有的表达质粒包含了RK2质粒复制、分离和保持系统。
通过将菌株的储存分装液加入到装有如表1中详述的40mLM9-MOPS、2％葡萄糖、0.5％酵母提取物、和抗生素的125mL瓶中，并使培养物生长过夜，从而建立宿主菌B255的接种培养物。
将接种培养物以初始OD600值约0.05的浓度接种在每一包含40mLM9-MOPS培养基、2％葡萄糖、和0.5％酵母提取物的两个250mL瓶中。培养物#1还包含100ug/mL羧苄青霉素和34ug/mL氯霉素。培养物#2没有加入任何抗生素。两份培养物在37℃在摇床上在250rpm培养，直到它们到达OD600值约0.2，在该时间点，通过向培养基中加入40uL的1MIPTG，诱导紫穗槐-4,11-二烯在宿主细胞中的产生。在诱导的时候，用8mL的有机覆盖层覆盖在培养物上面，以收获紫穗槐-4,11-二烯。在总共72小时中，定时取样。在2份培养物中通过宿主菌生产的紫穗槐-4,11-二烯按照实施例10所述通过GC/MS确认。
为了评估两份细胞培养物中的质粒稳定性，在第72小时，每份培养物取出一个样本，并在LB琼脂板(无抗生素)上划线接种。在37℃过夜培养后，源自每份培养物的50个单克隆在LB琼脂-(+)-抗生素(34ug/mL氯霉素，100ug/mL羧苄青霉素)板和LB琼脂-(-)-抗生素(无抗生素)板上重复涂板。在37℃再次过夜培养后，发现LB琼脂-(+)-抗生素和LB琼脂-(-)-抗生素板各自包含大约50个克隆，这表明在培养基中抗生素存在和缺乏下，质粒保留都是大约100％。
实施例8
本实施例证明了与酿酒酵母tHMGR相比，粪肠球菌HMGR在大肠杆菌宿主菌中显示出增加的比活性和稳定性。
将各个菌株的储存分装液加入到装有如表5中详述的20mLM9-MOPS培养基、0.8％葡萄糖、和抗生素的125mL瓶中，并让培养物生长至饱和，以建立宿主菌B61和B62的接种培养物。在500mL瓶中，接种培养物以1:100稀释到140mL新鲜培养基中，并再次生长到OD550值约0.1，在该时间点，通过向每份培养物中加入140uL的1MIPTG，诱导紫穗槐-4,11-二烯的生产。在诱导后的第4、12、20、28、36和49小时，从每份培养物中取出样本，细胞经离心沉淀。将细胞沉淀在干冰上快速冷冻，然后在-80℃储存。
为了进行酶活性测定，细胞沉淀在冰上解冻，然后使用Bugbuster(Novagen，Madison，WI)裂解，其包括蛋白酶抑制剂混合物#3(Calbiochem，SanDiego，CA)、benzonase(20μLoer5mLbugbuster；Novagen，Madison，WI)和溶菌酶(30ug/mL)。酿酒酵母tHMGR的酶活性在50mMTrisHCl(pH7.5)、0.2mMNADPH(Sigma，St.Louis，MO)和0.3mMDL-3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)钠盐(Sigma，St.Louis，MO)中进行测定。所述测定通过加入细胞裂解液来开始，并通过340nM吸光度来监测NADPH的消失。为了计算NADPH的非特异性消失，从测试样本所获得的结果中减去在缺乏HMG-CoA的对照测验中获得的结果。除了测定的缓冲液包含100mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)、0.4mMNADPH、1.0mMEDTA和100mMKCl之外，粪肠球菌HMGR的酶活性进行类似地测量。
通过Bradford((1976)AnalBiochem.72:248-254)的方法来进行蛋白活性测定。比活性被计算为ΔnmolNADPH/分钟/mg蛋白。
实施例9
本实施例描述了OD600值和干细胞重量(“DCW”)的校准。
为了获得DCW和OD600值之间的关系，将代表菌株B32按照与实施例10-12中所述的那些类似的高细胞密度方法中生长。在过程中取样，并对每一样本测量OD600和DCW值。为了测定DCW值，沉淀细胞，并弃去上清液。细胞沉淀用水洗涤一次，然后在烤箱中在80℃干燥至少3天。包含细胞沉淀的管被称重，从测得的重量中减去管的重量，用剩下的重量除以每一样本的初始体积(0.0015L)，以获得DCW值。
实施例10
本实施例证明了与表达酿酒酵母tHMGR和HMGS的宿主菌相比，表达金黄色葡萄球菌HMGR和HMGS的大肠杆菌宿主菌中，紫穗槐-4,11-二烯的产量增加。
将各个菌株的储存分装液加入到装有如表1中详述的25mLM9-MOPS培养基、0.8％葡萄糖、和抗生素的独立的125mL瓶中，并让培养物生长过夜，建立宿主菌B32、B153、B210、B282、B292、B86、B255和B256的接种培养物。
将接种培养物以初始OD600值约0.05的浓度接种在装有40mLM9-MOPS培养基、2％葡萄糖、和抗生素的独立的250mL瓶中。培养物在30℃在摇床上在250rpm培养，直到其达到OD600值约0.2，在该时间点，通过向培养基中加入40uL的1MIPTG，诱导紫穗槐-4,11-二烯在宿主细胞中的生产。用8mL的有机覆盖层(例如十二烷、油酸甲酯或者肉豆蔻酸异丙酯)覆盖在培养物上。72小时中，每天取有机覆盖层和培养液的样本一次。培养液样本用来测量OD600值。将5uL有机覆盖层转移到装有500uL以β-或反式-石竹烯作为内部标准标定的乙酸乙酯的干净的玻璃瓶中，测量紫穗槐-4,11-二烯的浓度。
如Martin等(2001)Biotechnol.Bioeng.75:497-503中所述，通过仅仅扫描两种离子，分子离子(204m/z)和189m/z离子，在Hewlett-Packard6890气相色谱/质谱分析仪(GC/MS)上分析有机覆盖层/乙酸乙酯样本。为了加快运行时间，温度程序和列矩阵被修改，以达到最优的峰分辨度和最短的总运行时间。1uL样本在GC上使用DB-XLB柱(可从AgilentTechnologies公司，PaloAlto，CA购得)和氦运载气体分离。分析的温度程序如下：在100℃0.75分钟，以60℃/分钟增温到温度300℃，并在300℃保持0.5分钟。分解的样本通过Hewlett-Packard5973型质谱选择性探测器分析，监测189和204m/z离子。先前的质谱证明了紫穗槐-4,11-二烯合成酶的产物是紫穗槐-4,11-二烯，以及使用该GC方法，紫穗槐-4,11-二烯具有3.7分钟的滞留时间。使用β-或反式-石竹烯作为内部标准用于定量。使用内部标准和紫穗槐-4,11-二烯的峰面积的比率，基于纯的紫穗槐-4,11-二烯(0.63-10mg/L，KJF17-109-3)在用石竹烯标定的乙酸乙酯中的定量校准曲线，计算紫穗槐-4,11-二烯的滴度。
实施例11
本实施例证明了通过在次优温度下生长的大肠杆菌宿主菌中的紫穗槐-4,11-二烯的产量增加。
将0.5mL的菌株储存分装液加入到如表1中详述的包含50mLM9-MOPS培养基和抗生素的250mL瓶中，并让培养物在37℃在摇床上在250rpm生长过夜，建立宿主菌B32的接种培养物。
将接种培养物以初始OD600值约0.05的浓度接种在每一装有40mL发酵罐分批培养基(培养基组分参见表6)、100mMMOPS缓冲液pH7.1和抗生素的四个250mL瓶中。培养物在摇床上在250rpm在30℃或者37℃培养，直到其达到OD600值0.18到0.22，在该时间点，通过向培养基中加入40uL的1MIPTG，诱导紫穗槐-4,11-二烯在宿主细胞中的生产。在诱导时，用8mL的有机覆盖层覆盖在培养物上面，以收获紫穗槐-4,11-二烯。每天取样一次，并如实施例10所述进行分析。
实施例12
本实施例证明了在碳源受限条件下生长的大肠杆菌宿主菌中紫穗槐-4,11-二烯的产量增加。
将0.25uL的菌株储存分装液加入到装有如表1中详述的50mLM9-MOPS培养基和抗生素的250mL瓶中，并让培养物在37℃在摇床上在250rpm培养，直至其到达OD600值1到2，建立用于发酵流程050608-1和050629-1的宿主菌B32的接种培养物。
将菌株的储存分装液加入到装有如表1中详述的50mLM9-MOPS培养基和抗生素的250mL瓶中，并让培养物在37℃在摇床上在250rpm培养过夜，建立用于发酵流程060403-3的宿主菌B32的接种培养物。使用接种培养物以初始OD600值约1的浓度接种在装有40mLM9-MOPS培养基和抗生素的250mL瓶中，培养物在37℃在摇床上在250rpm再次培养，直至其达到OD600值3到5。
对于所有的发酵过程，KH2PO4、K2HPO43H2O、EDTA、柠檬酸、和(NH4)2SO4均在生物反应器(2LApplikonBioconsoleADI1025s带ADI1010控制器，ApplikonBiotechnology，FosterCity，CA)中进行加热灭菌。剩下的培养基组分，如储存液，进行过滤灭菌，并通过封头注入。表3显示了发酵流程050608-1和050629-1的最终培养基组合物。表4显示了发酵流程060403-3的最终培养基组合物。流程050608-1的起始体积是0.8L，050629-1的起始体积是1.2L，而060403-3的起始体积是1L。所有的流程通过从封头注入50mL接种培养物来进行接种。
表3-发酵流程050608-1和050629-1的发酵培养基组分
表4-发酵流程060403-3的发酵培养基组分
成分 分批培养基(每升) 料液(每升)
葡萄糖 15g 650g
KH2PO4 4.2g -
K2HPO43H2O 15.7g -
柠檬酸 1.7g -
(NH4)2SO4 2g -
MgSO47H2O 1.2g 12g
EDTA 8.4mg 13mg
CoCl26H2O 2.5mg 4mg
MnCl24H2O 15mg 23.5mg
CuCl22H2O 1.5mg 2.5mg
H3BO4 3mg 5mg
Na2MoO42H2O 2.5mg 4mg
Zn(CH3COO)22H2O 13mg 16mg
柠檬酸铁(III)水合物 100mg 40mg
盐酸硫胺素 4.5mg -
羧苄青霉素 100ug 100ug
四环素 5ug 5ug
氯霉素 34ug 34ug
对于发酵流程050608-1(碳过量)，给料在诱导时开始，而且给料速率是手动调节的。对于发酵流程050629-1(碳受限)，按照表5中显示的方法向发酵罐中进行给料。对于发酵流程060403-3(最低碳量)，当初始葡萄糖剂量(15g)耗尽而且溶解氧气达到峰值时，给料自动开始。直到最大值27.6g/小时，给料速率依照以下方程式计算：
ms(t)＝S(t0)μeμ(t-t0)
μ＝0.12
S(t0)＝15g
其中t0是初始葡萄糖耗尽的时间。当到达最大速率时，葡萄糖给料被限制在速率9.5g/小时，而且在流程的剩余部分恒定保持在该速率。
表5发酵流程050629-1的给料方法
运行时间(小时) 葡萄糖给料速率(g/小时)
0 0
7 0.37
10 0.74
12 1.11
14 1.48
16 2.22
18 2.96
20 3.69
22 4.80
24 5.91
31 7.39
33 5.54
47 3.69
流程050608-1和050629-1在37℃下进行。生物反应器中的空气流量被设置为1-2L/分钟；使用氢氧化铵和/或氢氧化钠将pH保持在7；初始搅拌是500-600rpm；用抗泡沫剂B(Sigma-Aldich，St.Louis，MO)控制泡沫；使用搅拌叶栅，保持溶解氧气水平在30％以上。培养5-6小时后，通过向流程050608-1中加入0.8mL的1MIPTG和向流程050629-1中加入1.2mLIPTG，诱导宿主细胞生产紫穗槐-4，11-二烯。在诱导时，培养温度被降到30℃。
流程060403-3在30℃进行。生物反应器中的空气流量被设置为1-2L/分钟；使用氢氧化铵将pH保持在7。通过搅拌叶栅和氧气富集，溶解的氧气被保持在30％以上。在OD600值达到约28时(接种19小时后)，通过加入1mL的1MIPTG，诱导宿主细胞生产紫穗槐-4，11-二烯。
依照两个不同的方法，收获并萃取紫穗槐-4,11-二烯。对于流程050608-1和050629-1，通过将废气经含有200mL庚醇的气体洗涤器排放，可收集废气中存在的挥发性的紫穗槐-4,11-二烯。然后用乙酸乙酯稀释庚醇，直到样本中的紫穗槐-4,11-二烯浓度在0.63mg/L和20mg/L之间。对于流程060403-3，通过在诱导时，向发酵罐中加入200mL的有机覆盖层，在生物反应器中收集紫穗槐-4,11-二烯。产物浓度通过将25uL培养液加上有机覆盖层和975uL乙腈结合，将样本在FisherVortexGenie2TM混合器(ScientificIndustries公司，Bohemia，NY)上以最大速度振荡至少3分钟，通过离心从样本中去除细胞，用乙酸乙酯稀释乙腈溶液，直到样本中的紫穗槐-4.11-二烯浓度在0.63和20mg/L之间来进行测量。如实施例10中所述，通过GC/MS分析乙酸乙酯样本。
实施例13
本实施例证明了在碳源受限条件下和次优温度下生长的大肠杆菌宿主菌中紫穗槐-4,11-二烯的产量增加。
将菌株的储存分装液加入到装有如表1中详述的50mLM9-MOPS培养基和抗生素的250mL瓶中，并让培养物在37℃在摇床上在250rpm生长到OD600值3.5到4.5，建立宿主菌B153的接种培养物。
除了菌株和诱导时间发生变化外，按照如实施例12中对流程060403-3描述的同样的方法，建立和运行2L生物反应器(BiocontrollerADI1010带BioconsoleADI1025，ApplikonBiotechnology，FosterCity，CA)。
通过向培养基中加入1mL的1MIPTG，诱导紫穗槐-4,11-二烯在宿主细胞中的生产。依照两个不同的方法收获和萃取紫穗槐-4,11-二烯。在一个方法中，通过将废气经含有200mL庚醇的气体洗涤器排放，来收集废气中存在的挥发性的紫穗槐-4,11-二烯。然后用乙酸乙酯稀释庚醇，直到样本中的紫穗槐-4,11-二烯浓度达到0.63和20mg/L之间。在另一个方法中，通过在诱导时，向发酵罐中加入200mL的有机覆盖层，来收集紫穗槐-4,11-二烯。
紫穗槐-4,11-二烯通过将25uL培养液和975uL乙腈结合，并将样本在FisherVortexGenie2TM混合器(ScientificIndustries公司，Bohemia，NY)上以最大速度振荡至少3分钟，通过离心从样本中除去细胞，用乙酸乙酯稀释乙腈溶液，直到样本中的紫穗槐-4,11-二烯浓度达到0.63和20mg/L之间，来从培养基中进行萃取。如实施例10中所述，通过GC/MS分析乙酸乙酯样本。
实施例14
本实施例证明了在碳和氮源受限条件下和次优温度下生长的大肠杆菌宿主菌中紫穗槐-4,11-二烯的产量增加。
将菌株的储存分装液加入到装有如表1中详述的50mLM9-MOPS培养基和抗生素的250mL瓶中，建立宿主菌B86的接种培养物。培养物在37℃在摇床上在250rpm生长过夜，次日早上以OD600值约1的浓度在同样的培养基中继代培养，并在37℃和250rpm再次生长至OD600值3到5。
除了氮受限的流程在给料中不包含硫酸铵外，按照如实施例12中对流程060403-3描述的同样的方法，建立和运行四个2L生物反应器(BiocontrollerADI1010带BioconsoleADI1025，ApplikonBiotechnology，FosterCity，CA)。
当初始葡萄糖剂量(15g)耗尽而且溶解的氧气达到峰值时，倍增时间为6小时的指数葡萄糖给料自动开始。直到最大值30.4g/小时，给料速率依照以下方程式计算：
ms(t)＝S0μeμ(t-t0)
μ＝0.12min-1
S0＝15g
其中□是特定生长速率，而t0是初始葡萄糖剂量耗尽的时间。当到达最大速率时，葡萄糖给料减少到速率11.4g/小时，而且在流程的剩余部分恒定保持在该速率。在发酵运行060710-4、060724-5和060619-5(碳和氮受限)中，当氨受限导致了培养基中的葡萄糖积累时，葡萄糖给料进一步减少。
发酵在降低的温度30℃下进行。生物反应器中的空气流量被设置在1vvm；初始搅拌是700rpm；用抗泡沫剂B(Sigma-Aldich，St.Louis，MO)控制泡沫；并使用搅拌叶栅(700-1200rpm)和氧气富集，将溶解的氧气压控制在40％。在发酵运行060327-3(碳受限)中，使用20％NH4OH将pH保持在7；在发酵运行060710-4、060724-5和060619-5(碳和氮受限)中，初始使用20％NH4OH，并且在第72小时开始使用2.5NNaOH和10NNH4OH的50/50混合物，将pH保持在7，以进一步限制进入发酵罐的氨数量。
在OD600值大约30时，通过向培养基中加入1mL的1MIPTG，诱导紫穗槐-4,11-二烯在宿主细胞中的生产。
采用10％(v/v)的有机覆盖层覆盖培养基，来收获紫穗槐-4,11-二烯。然后紫穗槐-4,11-二烯，通过将25uL培养液和975uL甲醇结合，将样本在FisherVortexGenie2TM混合器(ScientificIndustries公司，Bohemia，NY)上以最大速度振荡至少15分钟，通过离心从样本中去除细胞，并将10uL甲醇溶液加入到990uL包含10uL/L反式-石竹烯的乙酸乙酯中，来进行萃取。
按照实施例10所述，通过GC/MS来分析样本。
实施例15
本实施例描述了在大肠杆菌宿主菌中通过DXP途径生产紫穗槐-4,11-二烯。
将每一菌株的储存分装液加入到装有如表1中详述的25mLM9-MOPS和抗生素的独立的125mL瓶中，并让培养物生长过夜，建立宿主菌B003、B617、B618、和B619的接种培养物。
使用接种培养物以初始OD600值约0.05的浓度，接种在装有40mLM9-MOPS培养基、45ug/mL硫胺素、微量营养素、1.00E-5mol/LFeSO4、0.1MMOPS、0.5％酵母提取物、20g/LD-葡萄糖、和抗生素的独立的250mL瓶中。培养物在30℃在潮湿的培养摇床中在250rpm培养，直到其达到OD600值0.2到0.3，在该时间点，通过向培养基中加入40uL的1MIPTG，诱导宿主细胞中紫穗槐-4,11-二烯的生产。
在诱导的时候，用8mL的有机覆盖层覆盖在培养物上面，以收获紫穗槐-4,11-二烯。在各个时间点取样，萃取紫穗槐-4,11-二烯，并按照实施例10所述，通过GC/MS进行分析。采用每一宿主菌的2个独立克隆来进行实验，取结果的平均值。样本之间的偏差被发现小于10％。
实施例16
本实施例描述了大肠杆菌宿主菌中3-甲基-丁-3-烯-1-醇和3-甲基-丁-2-烯-1-醇的生产。
每一菌株的储存分装液在含有如表1中详述的抗生素的LB琼脂上划线培养，建立宿主菌B286、B287、B288、和B291的接种培养物。每一菌株挑取三个独立克隆，并将每个克隆接种到7mL含有抗生素的LB培养基中。培养物在37℃在摇床上在250rpm生长过夜，直到对数期晚期。然后，培养物以OD600值约0.05的浓度，接种到装有40mlM9-MOPS、2％葡萄糖、0.5％酵母提取物、和抗生素的250mL瓶中。培养物在37℃在摇床上在250rpm生长过夜，直到其达到OD600值大约0.2，在该时间点，通过加入40uL的1MIPTG，对其进行诱导。培养物在30℃在摇床上在250rpm生长72小时。每天一到两次，测量每一培养物的OD600值，并取样700uL。为了从培养液中萃取3-甲基-丁-3-烯-1-醇和3-甲基-丁-2-烯-1-醇，向300uL的每一取出的样本中加入600uL乙酸乙酯。然后振荡样本15分钟，并将400uL上层乙酸乙酯相转移到干净的玻璃瓶中用于分析。
样本在Hewlett-Packard6890气相色谱/质谱分析仪(GC/MS)上进行分析。1uL样本在GC上使用DB-5柱(AgilentTechnologies公司，PaloAlto，CA)和氦运载气体分离。分析的温度程序如下：在60℃3分钟，以60℃/分钟增温到温度300℃，并在300℃保持2分钟。总的运行时间是9分钟。分解的样本通过Hewlett-Packard5973型质谱选择性探测器进行分析。先前的质谱证明了使用该GC方法，3-甲基-3-丁烯-1-醇和3-甲基-2-丁烯-1-醇具有2.067分钟的滞留时间。为了将检测聚焦在3-甲基-丁-3-烯-1-醇和3-甲基-丁-2-烯-1-醇上，使用选择性离子监测方法，仅仅监测3-甲基-丁-3-烯-1-醇和3-甲基-丁-2-烯-1-醇中的离子56和68。
实施例17
本实施例描述了酿酒酵母宿主菌中的紫穗槐-4,11-二烯的生产。
宿主菌EPY224的制备在Ro等(Nature440:940-943；2006)和PCT专利公开号WO2007/005604中进行描述。通过在YPD培养基中生长(MethodsinYeastGenetics:AColdSpringHarborLaboratoryCourseManual，2005版，ISBN0-87969-728-8)，在宿主菌EPY224中缺失表达质粒pRS425ADS，用单个克隆在YPD琼脂上涂板，然后用单个克隆在CSM-MetHis琼脂和CSM-MetLeu琼脂上点斑。在CSM-MetHis琼脂上生长但不在CSM-MetLeu琼脂上生长的克隆是缺失的(即已经丢失了质粒pRS425ADS)。一个这样的克隆被命名为EPY300。用表达质粒pRS425-ADS-LEU2d转化EPY300，除了其包括LEU2d筛选标记(Erhart和Hollenberg(1983)J.Bacteriol.156:625-635)而不是LEU2外，质粒pRS425-ADS-LEU2d与pRS425-ADS相同，生成宿主菌Y185。
Y185宿主细胞转化株在含有2％葡萄糖和除组氨酸、亮氨酸和蛋氨酸以外的所有氨基酸的合成的确定成分培养基(CSM-葡萄糖；MPBiomedicals，Solon，OH)上进行筛选。宿主菌EPY300对亮氨酸的生物合成是营养缺陷型的(Ieu2)，但Y185中的表达质粒pRS425-ADS-LEU2d恢复了亮氨酸原养能力(LEU2)。将单个克隆点斑至选择性培养基(CSM-葡萄糖-组氨酸，亮氨酸，蛋氨酸)上，并生长2天。从培养板上刮取细胞并转移到冷冻管中的1mL的25％(v/v)甘油中。混合悬浮液，然后在-80℃储存。
将菌株的储存分装液加入到装有25mL缺乏亮氨酸和蛋氨酸的CSM-葡萄糖的125mL瓶中，并让培养物生长过夜，建立宿主菌Y185的接种瓶。将培养物以初始OD600值约0.05的浓度，接种在装有40mL缺乏亮氨酸而且包含0.2％葡萄糖、1.8％半乳糖、和1mM蛋氨酸的合成的确定成分培养基的250mL挡板瓶中。培养物在30℃在摇床上在200rpm培养。因为培养基中葡萄糖的存在阻止了GAL1启动子通过半乳糖的诱导，紫穗槐-4,11-二烯的生产未被诱导，直到细胞耗尽培养基中的葡萄糖并转换到使用半乳糖作为它们的主要碳源。在接种时，用8mL的有机覆盖层覆盖在培养物上面，以收获紫穗槐-4,11-二烯。在第72小时取样，转移5uL有机溶剂层到装有500uL包含已知浓度的β-或反式-石竹烯作为内部标准的乙酸乙酯的干净的玻璃瓶中。
有机覆盖层/乙酸乙酯样本按照实施例10所述，在Hewlett-Packard6890气相色谱/质谱分析仪(GC/MS)上进行分析。
生长72小时后，发现3个酵母培养物产生60.68、54.48和59.25mg/L的紫穗槐-4,11-二烯。
实施例19
本实施例描述了在酿酒酵母宿主菌中的紫穗槐-4,11-二烯的生产，其中所述宿主菌包含天然甲羟戊酸途径，以及在外源调节控制因子的控制下的外源甲羟戊酸途径。
酵母菌株CEN.PK2-1C(Y002)(MATA；ura3-52；trp1-289；Ieu2-3,112；his3Δ1；MAL2-8C；SUC2)和CEN.PK2-1D(Y003)(MATα；ura3-52；trp1-289；Ieu2-3,112；his3Δ1；MAL2-8C；SUC2)(J.P.vanDijken等，EnzymeMicrobTechnol26，706(2000年6月1日))，在标准的富营养培养基(YPD)或者确定成分的合成培养基中进行培养(.D.Rose，F.Winston，P.Heiter，Methodsinyeastgenetics:alaboratorycoursemanual.(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，1990))，并缺乏适当的营养物，从而筛选整合的转化株、质粒滞留、和减数分裂后代。
按照如R.H.Schiestl，R.D.Gietz，CurrGenet16，339(1989年12月)中描述的醋酸锂方法进行DNA介导的向酿酒酵母中的转化。通过表型分析、菌落的聚合酶链式反应(“PCR”)和扩增的基因组DNA的测序来确定所有的基因中断和置换。使用pCR2.1(Invitrogen，CarlsbadCA)来构建质粒pAM489-pAM498，并且通过图7A-C和表6图解说明。HISMX标记序列在M.S.Longtine等，Yeast14，953(1998年7月)中描述。在大肠杆菌菌株DH5α中进行质粒DNA的增殖。
表6
酿酒酵母菌株Y002和Y003按照下述方法制备用于导入可诱导的甲羟戊酸途径基因。使用含有与天然ERG9启动子同源的45个碱基对的引物50-56-pw100-G(SEQIDNO：44)和50-56-pw101-G(SEQIDNO：45)，从pAM328(SEQIDNO：43)中PCR扩增KanMX-PMET3区域，将ERG9启动子替换为酿酒酵母的MET3启动子。采用40％w/w聚乙二醇3350(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、100mM醋酸锂(Sigma公司)、10μg鲑鱼精子DNA(Invitrogen公司)在30℃培养30分钟，随后在42℃热休克30分钟(如Schiestl&Gietz，Curr.Genet.16:339(1989)所述)，将10μg得到的PCR产物转化到对数生长的Y002和Y003菌株中。通过其在含有0.5μg/ml遗传霉素(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)的富营养培养基上生长的能力来鉴别阳性重组子，并通过PCR鉴定来确认。将获得的克隆命名为Y93(MATA)和Y94(MATα)。然后，ADE1开放阅读框被光滑念珠菌的LEU2基因(CgLEU2)所替换。使用含有与ADE1开放阅读框(ORF)侧面同源的50个碱基对的引物61-67-CPK066-G(SEQIDNO：46)和61-67-CPK067-G(SEQIDNO：47)，从光滑念珠菌基因组DNA(ATCC，Manassas，VA)中，扩增3.5KB的CgLEU2基因组位点。按照上文所述，将10μg得到的PCR产物转化到对数生长的Y93和Y94中，ade1-菌株在缺乏亮氨酸的补充培养基上进行生长筛选，并通过PCR鉴定来确认。得到的克隆命名为Y176(MATA)和Y177(MATα)。
为了制备酿酒酵母菌株Y188，将分别来自pAM491(SEQIDNO：48)和pAM495(SEQIDNO：49)的2μg的质粒DNA，用PmeI(NewEnglandBiolabs，Beverly，MA)消化过夜，并按照上文所述，导入到对数生长的Y176中。通过在缺乏尿嘧啶和组氨酸的培养基上生长来筛选阳性重组子。通过PCR鉴定来确认向正确基因组位点中的整合。
为了制备酿酒酵母菌株Y189，分别来自pAM489(SEQIDNO：50)和pAM497(SEQIDNO：51)的2μg的质粒DNA，用PmeI消化过夜，并按照上文所述，导入到对数生长的Y177中。通过在缺乏色氨酸和组氨酸的培养基上生长来筛选阳性重组子。通过PCR鉴定来确认向正确基因组位点中的整合。
来自Y188和Y189的约1×107个细胞在室温下在YPD培养基板上混合6小时，让其杂交。随后，将混合的细胞培养物涂板于缺乏组氨酸、尿嘧啶和色氨酸的培养基上，以筛选二倍体细胞的生长。用PmeI消化过夜来自pAM493(SEQIDNO：52)的2μg的质粒DNA，并按照上文所述，导入到对数生长的二倍体细胞中。通过在缺乏腺嘌呤的培养基上的生长来筛选阳性重组子。通过PCR鉴定来确认向正确基因组位点中的整合。得到的菌株被命名为Y238。
为了制备包含完全互补的导入基因的单倍体菌株，Y238在含2％醋酸钾和0.02％棉籽糖的液体培养基中产孢。使用SingerInstrumentsMSM300系列显微操作器(SingerInstrumentCo,LTD，Somerset，UK)，分离大约200个遗传的四分孢子(四分孢子是四孢子的减数分裂产物)。通过其在腺嘌呤、组氨酸、尿嘧啶和色氨酸缺乏下的生长的能力，来识别包含导入的遗传材料的适当互补的独立的遗传分离株。通过PCR鉴定来确认所有导入DNA的整合。得到的菌株被命名为Y210(MATA)和Y211(MATα)。
将来自pAM426(SEQIDNO：53)的2μg的质粒DNA，所述DNA包含由酿酒酵母GAL1启动子表达的酿酒酵母密码子优化的紫穗槐二烯合成酶(ADS)，按照上文所述，导入到对数生长的Y210和Y211中。根据其在缺乏亮氨酸的补充培养基上生长的能力，筛选包含pAM426质粒的酿酒酵母菌株。得到的菌株被命名Y225(MATA)和Y227(MATα)。
将2μg的来自pAM322(SEQIDNO：54)的质粒DNA，所述DNA包含由酿酒酵母GAL1表达的酿酒酵母密码子优化的紫穗槐二烯合成酶(ADS)和细胞色素P450单加氧酶(AMO)，和由酿酒酵母GAL10启动子表达的细胞色素P450氧化还原酶(CPR)，按照上文所述，导入到对数生长的Y210和Y211中。通过其在缺乏亮氨酸的补充培养基上生长的能力，筛选包含pAM322质粒的酿酒酵母菌株。得到的菌株被命名为Y222(MATA)和Y224(MATα)。
实施例19
本实施例描述了大肠杆菌宿主菌中的α-法呢烯或者β-法呢烯的生产。
将每一菌株的储存分装液加入到装有如表1中详述的25mLM9-MOPS、0.8％葡萄糖、0.5％酵母提取物和抗生素的125mL瓶中，并让培养物生长过夜，建立宿主菌B552和B592的接种培养物。
将接种培养物以初始OD600值约0.05的浓度，接种在包含40mLM9-MOPS、2％葡萄糖、0.5％酵母提取物、和抗生素的250mL瓶中。培养物在30℃在摇床上在250rpm培养，直到其达到OD600值约0.2，在该时间点，通过加入40uL的1MIPTG，诱导宿主细胞中产生α-法呢烯或者β-法呢烯。在诱导的时候，用8mL的有机覆盖层覆盖在培养物上，以收获α-法呢烯。每24小时取样，转移2uL到10uL有机覆盖层到装有1mL采用反式-石竹烯作为内部标准标定的乙酸乙酯的干净的玻璃瓶中，直到120小时(总计5个时间点)。另外，旋转沉淀1mL的分装培养物，细胞沉淀重悬于250uL无菌水中，将细胞悬浮液转移至装有1mL采用反式-石竹烯作为内部标准标定的乙酸乙酯的玻璃瓶中。另外，整个培养液的0.5mL的分装液被加入到装有1mL采用反式-石竹烯作为内部标准标定的乙酸乙酯的玻璃瓶中。通过振荡玻璃瓶10分钟，之后将600uL乙酸乙酯萃取液转移到干净的玻璃瓶中，来通过乙酸乙酯萃取整个培养液样本。
在配备了Agilent5975质谱分析仪的Agilent6890N气相色谱仪(GC/MS)上，以全扫描模式(50-500m/z)来分析有机覆盖层/乙酸乙酯样本和乙酸乙酯萃取的整个培养液样本。为了加快运行时间，温度程序和列矩阵被修改，以达到最优的峰分辨度和最短的总运行时间。使用HP-5MS柱(AgilentTechnologies公司，PaloAlto，CA)和氦运载气体来分离1uL样本。分析的温度程序如下：在150℃保持3分钟，以25℃/分钟增温到温度200℃，以60℃/分钟增温到温度300℃，并在300℃保持1分钟。先前的质谱证明了β-法呢烯合成酶的产物是β-法呢烯，以及使用该GC方法，β-法呢烯具有4.33分钟的滞留时间。用生成的峰面积和纯的β-法呢烯(Sigma-AldrichChemicalCompany，St.Louis，MO)在反式-石竹烯标定的乙酸乙酯中的定量校准曲线对照，计算法呢烯的滴度。
在120小时，宿主菌B592产生大约400mg/L的α-法呢烯(超过3个独立克隆的平均值)，而且最大单位生产率是大约46mg/L/OD600。在120小时，宿主菌B552产生大约1.1g/L的β-法呢烯(超过3个独立克隆的平均值)，而且最大单位生产率是大约96mg/L/OD600(1个代表克隆)。
实施例20
本实施例描述了β-法呢烯通过DXP途径在大肠杆菌宿主菌中的生产。
将每一菌株的储存分装液加入到装有如表1中详述的25mLM9-MOPS和抗生素的独立的125mL瓶中，并让培养物生长过夜，建立宿主菌B650、B651、B652和B653的接种培养物。
将接种培养物以初始OD600值约0.05的浓度，接种在装有40mLM9-MOPS基本培养基、45ug/mL硫胺素、微量营养素、1.00E-5mol/LFeSO4、0.1MMOPS、0.5％酵母提取物、20g/LD-葡萄糖、和抗生素的独立的250mL瓶中。培养物在30℃在潮湿的培养摇床中在250rpm培养，直到其达到OD600值0.2到0.3，在该时间点，通过向培养基中加入40uL的1MIPTG，诱导宿主细胞中产生β-法呢烯。在诱导的时候，用8mL的有机覆盖层覆盖在培养物上面，以收获β-法呢烯。在各个时间点取样，将100uL的上层有机覆盖层的样本转移到干净的管中。离心试管，以分离任意残留细胞或者培养基，将10uL有机覆盖层样本转移至装有500uL采用β-或反式-石竹烯作为内部标准标定的乙酸乙酯的干净的玻璃GC瓶中。将混合物振荡30秒，然后按照实施例18所述来进行分析。大肠杆菌宿主菌B653产生约7mg/gDCW的β-法呢烯。
实施例21
本实施例描述了酿酒酵母宿主菌中的α-法呢烯或者β-法呢烯的生产。
通过在富营养培养基中培养，从酿酒酵母菌株EPY224(Ro等(2006)Nature440:940-943；PCT专利公开号WO2007/005604)中除去表达质粒，来制备菌株EPY300。然后用表达质粒pRS425-FSA或pR425-FSB转化菌株EPY300，分别产生宿主菌Y166和Y164。
在含有2％葡萄糖和除亮氨酸以外的所有氨基酸的合成的确定成分培养基(SM-glu)上筛选宿主细胞转化株。宿主菌EPY300对亮氨酸的生物合成是营养缺陷型的(Ieu2)，但是表达质粒pRS425-FSA或者pRS425-FSB恢复了亮氨酸原养能力(LEU2)。单个克隆被转移到装有5mL缺乏亮氨酸的液体SM-glu的培养瓶中。培养物在30℃振荡培养，直到生长达到稳定期。细胞在-80℃置于冷冻瓶中的由400μL无菌的50％甘油和600μL液体培养基组成的1mL储存分装液中保存。
将储存分装液加入到装有25mL缺乏亮氨酸的SM-glu的125mL瓶中，并让培养物生长过夜，以建立接种培养物。将接种培养物以初始OD600值约0.05的浓度，接种在包含40mL缺乏亮氨酸的合成的确定成分培养基、0.2％葡萄糖、和1.8％半乳糖的250mL挡板瓶中。培养物在30℃在摇床上在200rpm培养。因为培养基中葡萄糖的存在阻止了Gal1启动子通过半乳糖的诱导，法呢烯生产未被诱导，直到细胞耗尽培养基中的葡萄糖并转换到使用半乳糖作为其主要碳源。采用8mL的油酸甲酯或者肉豆蔻酸异丙酯覆盖于培养物上面。每24小时取样一次，将2-10uL有机溶剂层转移至装有500uL的包含已知浓度的β-或反式-石竹烯作为内部标准的乙酸乙酯的干净的玻璃瓶中。另外，整个培养液的0.5mL的分装液被加入到包含1mL采用反式-石竹烯作为内部标准标定的乙酸乙酯的玻璃瓶中。通过振荡玻璃瓶10分钟，之后将600uL乙酸乙酯萃取液转移到干净的玻璃瓶中，来用乙酸乙酯萃取整个培养液样本。
在120小时，宿主菌Y166产生大约9.8mg/L的α-法呢烯(超过3个独立克隆的平均值)，而且最大单位生产率是大约3mg/L/OD600(1个代表克隆)。在120小时，宿主菌Y164产生大约56mg/L的β-法呢烯(超过3个独立克隆的平均值)，而且最大单位生产率是大约20mg/L/OD600(1个代表克隆)。
实施例22
本实施例描述了大肠杆菌宿主菌中的γ-萜品烯、α-蒎烯和萜品油烯的生产。
将每一菌株的储存分装液加入到装有如表1中详述的25mLM9-MOPS、2％葡萄糖、0.5％酵母提取物、和抗生素的独立的125mL瓶中，并让培养物生长过夜到对数期晚期，建立生产γ-萜品烯(大肠杆菌DH1-T1r[pMevT、pMevB-Gpps、pAM445])、α-蒎烯(大肠杆菌DH1-T1r[pMevT、pMevB-Gpps、pAM443或者pAM442])、或者萜品油烯(大肠杆菌DH1-T1r[pMevT、pMevB-Gpps、pAM444]的宿主菌的接种培养物。
将接种培养物以初始OD600值约0.05的浓度，接种在包含40mLM9-MOPS、2％葡萄糖、0.5％酵母提取物、和抗生素的250mL瓶中。在接种的时候，也用4mL十六烷来覆盖培养物。培养物在30℃在摇床上在200-250rpm培养，直到其达到OD600值约0.2，在该时间点，通过加入40uL的1MIPTG，诱导宿主细胞中产生宿主细胞感兴趣的化合物。96小时中，每天取样一次，将200uL的十六烷层转移到0.6mL微量离心管中。为了进行分析，十六烷覆盖层在1.8mLGC瓶中用反式-石竹烯作为内部标准标定的乙酸乙酯以1:1或者1:10稀释。此外，旋转沉淀培养物的1mL分装液，在250uL无菌水中重悬沉淀，细胞悬浮液被转移到装有1mL采用反式-石竹烯作为内部标准标定的乙酸乙酯的玻璃瓶中。通过振荡玻璃瓶15分钟，随后将500uL乙酸乙酯萃取液转移到干净的玻璃瓶中，来采用乙酸乙酯萃取细胞沉淀。
在配备了Agilent5975质谱分析仪的Agilent6890N气相色谱仪(GC/MS)上，以全扫描模式(50-500m/z)来分析十六烷/乙酸乙酯样本和乙酸乙酯萃取的细胞沉淀样本。为了加快运行时间，温度程序和列矩阵被修改，以达到最优的峰分辨度和最短的总运行时间。1μL样本被分流(基于样本浓度，在1:2和1:50之间选择分流比)，然后使用HP-5MS柱(AgilentTechnologies公司，PaloAlto，CA)和氦运载气体分离。分析的温度程序如下：在75℃保持3分钟，以20℃/分钟增温到温度115℃，以60℃/分钟增温到温度300℃，并在300℃保持0.5分钟。各种产物，γ-萜品烯、α-蒎烯和萜品油烯分别在第5.4、4.1、5.4、和5.9分钟观察到。用产生的峰面积和纯的标准在反式-石竹烯加标的乙酸乙酯中的定量校准曲线对照，计算滴度。
实施例23
本实施例描述了大肠杆菌宿主菌中的芳樟醇、柠檬烯、β-蒎烯、β-水芹烯、蒈烯、或者桧宁的生产。
将各个菌株的储存分装液加入到装有如表1中详述的25mLM9-MOPS、0.5％酵母提取物、2％葡萄糖、和抗生素的独立的125mL瓶中，并让培养物生长过夜，建立接种培养物。
将接种培养物以初始OD600值约0.05的浓度，接种在装有40mLM9-MOPS、0.5％酵母提取物、2％葡萄糖、和抗生素的250mL挡板瓶中。培养物在30℃在摇床上在250rpm培养，直到其达到OD600值大约0.2，在该时间点，通过向培养基中加入40uL的1MIPTG，诱导宿主细胞中产生感兴趣的化合物。通过溶剂-溶剂萃取从培养基中分离感兴趣的化合物，或者，如果感兴趣的化合物的滴度大到足以饱和培养基并形成第二相的话，可通过沉淀和倾析来分离感兴趣的化合物。
序列表
SEQIDNO：1
MevT66操纵子
GAATTCAAAGGAGGAAAATAAAATGAAGAACTGTGTGATTGTTTCTGCGGTCCGCACGGCGATCGGCAGCTTTAACGGCTCTTTAGCGAGCACCTCTGCAATCGATCTGGGTGCGACGGTCATTAAGGCCGCCATTGAACGCGCCAAAATCGACAGCCAGCACGTTGATGAGGTGATCATGGGCAATGTGTTACAAGCCGGCCTGGGTCAAAACCCAGCGCGTCAAGCACTGTTAAAATCTGGTCTGGCCGAGACCGTGTGTGGCTTCACCGTCAATAAGGTTTGCGGCTCTGGCCTGAAGAGCGTGGCCCTGGCAGCACAAGCGATTCAAGCCGGTCAGGCACAAAGCATCGTTGCGGGTGGCATGGAGAACATGTCTCTGGCGCCGTACTTATTAGATGCCAAAGCCCGCAGCGGTTATCGCCTGGGCGATGGTCAGGTGTACGACGTCATCTTACGCGATGGCTTAATGTGCGCGACCCACGGTTACCACATGGGTATTACGGCCGAAAACGTGGCGAAAGAATACGGCATTACGCGCGAGATGCAGGATGAATTAGCACTGCACTCTCAGCGCAAAGCAGCAGCCGCGATCGAGTCTGGTGCGTTTACGGCGGAAATCGTGCCAGTTAACGTGGTCACGCGCAAGAAGACGTTCGTTTTCAGCCAGGACGAGTTCCCGAAGGCAAACAGCACCGCGGAGGCCTTAGGTGCCTTACGCCCAGCCTTTGACAAAGCGGGCACGGTCACCGCCGGTAATGCGAGCGGCATCAATGATGGTGCAGCGGCACTGGTCATCATGGAAGAGAGCGCCGCATTAGCAGCGGGTCTGACCCCATTAGCGCGCATTAAATCTTATGCCAGCGGCGGCGTCCCACCAGCCCTGATGGGCATGGGTCCGGTCCCAGCCACGCAAAAAGCCCTGCAATTAGCGGGCCTGCAACTGGCCGACATTGATCTGATCGAGGCGAACGAGGCGTTTGCAGCGCAGTTCCTGGCGGTGGGTAAGAATCTGGGCTTCGACAGCGAGAAAGTCAATGTGAACGGTGGCGCGATTGCGTTAGGCCATCCGATTGGTGCAAGCGGCGCACGCATCTTAGTGACGTTACTGCACGCCATGCAGGCACGCGACAAGACCTTAGGCCTGGCGACCTTATGTATTGGTGGCGGTCAAGGTATCGCCATGGTGATCGAACGCCTGAACTGAAGATCTAGGAGGAAAGCAAAATGAAACTGAGCACCAAGCTGTGCTGGTGTGGCATCAAGGGTCGCCTGCGCCCACAAAAGCAGCAACAGCTGCACAACACGAACCTGCAAATGACCGAGCTGAAAAAGCAGAAGACGGCCGAGCAAAAGACCCGCCCGCAGAACGTTGGCATCAAGGGCATCCAGATTTATATCCCGACGCAGTGTGTCAACCAATCTGAGCTGGAGAAATTCGATGGCGTCAGCCAGGGTAAGTACACCATCGGCCTGGGCCAGACCAACATGAGCTTCGTGAACGACCGTGAGGACATCTATTCTATGAGCCTGACGGTGCTGTCTAAGCTGATCAAGAGCTACAACATCGACACGAATAAGATCGGTCGTCTGGAGGTGGGTACGGAGACGCTGATTGACAAGAGCAAAAGCGTGAAGTCTGTCTTAATGCAGCTGTTCGGCGAGAACACGGATGTCGAGGGTATCGACACCCTGAACGCGTGTTACGGCGGCACCAACGCACTGTTCAATAGCCTGAACTGGATTGAGAGCAACGCCTGGGATGGCCGCGATGCGATCGTCGTGTGCGGCGATATCGCCATCTATGACAAGGGTGCGGCACGTCCGACCGGCGGTGCAGGCACCGTTGCGATGTGGATTGGCCCGGACGCACCAATTGTCTTCGATTCTGTCCGCGCGTCTTACATGGAGCACGCCTACGACTTTTACAAGCCGGACTTCACGAGCGAATACCCGTACGTGGACGGCCACTTCTCTCTGACCTGCTATGTGAAGGCGCTGGACCAGGTTTATAAGTCTTATAGCAAAAAGGCGATTTCTAAGGGCCTGGTCAGCGACCCGGCAGGCAGCGACGCCCTGAACGTGCTGAAGTATTTCGACTACAACGTGTTCCATGTCCCGACCTGCAAATTAGTGACCAAATCTTATGGCCGCCTGTTATATAATGATTTCCGTGCCAACCCGCAGCTGTTCCCGGAGGTTGACGCCGAGCTGGCGACGCGTGATTACGACGAGAGCCTGACCGACAAGAACATCGAGAAGACCTTCGTCAACGTCGCGAAGCCGTTCCACAAAGAGCGTGTGGCCCAAAGCCTGATCGTCCCGACCAACACGGGCAACATGTATACCGCGTCTGTCTACGCGGCATTCGCGAGCCTGCTGAATTACGTCGGTTCTGACGACCTGCAGGGCAAGCGCGTTGGCCTGTTCAGCTACGGTAGCGGCTTAGCGGCCAGCCTGTATAGCTGCAAAATTGTCGGCGACGTCCAGCACATCATCAAGGAGCTGGACATCACCAACAAGCTGGCGAAGCGCATCACCGAGACGCCGAAAGATTACGAGGCAGCGATCGAGTTACGCGAGAATGCGCATCTGAAGAAGAACTTCAAGCCGCAAGGTAGCATCGAGCACCTGCAGAGCGGCGTCTACTACCTGACGAACATTGACGACAAGTTCCGCCGTTCTTATGACGTCAAAAAGTAACTAGTAGGAGGAAAACATCATGGTGCTGACGAACAAAACCGTCATTAGCGGCAGCAAGGTGAAGTCTCTGAGCAGCGCCCAAAGCTCTAGCAGCGGCCCGTCTAGCAGCAGCGAGGAGGACGACAGCCGTGACATTGAGTCTCTGGACAAGAAGATCCGCCCGCTGGAGGAGTTAGAGGCCCTGCTGAGCAGCGGCAACACCAAGCAGCTGAAGAACAAGGAAGTTGCAGCGCTGGTGATCCACGGTAAGCTGCCACTGTATGCGCTGGAAAAGAAACTGGGCGATACGACGCGTGCGGTCGCGGTGCGTCGCAAAGCCTTAAGCATCTTAGCGGAGGCCCCGGTGTTAGCCAGCGACCGCCTGCCGTACAAGAACTACGACTACGACCGCGTGTTTGGCGCGTGCTGCGAGAATGTCATTGGCTACATGCCGTTACCGGTTGGTGTGATCGGCCCGCTGGTCATTGATGGCACGAGCTATCACATTCCAATGGCGACCACGGAAGGTTGCTTAGTCGCCAGCGCCATGCGTGGCTGTAAGGCGATTAACGCCGGCGGTGGCGCGACGACCGTGTTAACCAAGGATGGTATGACGCGCGGTCCGGTCGTCCGCTTCCCAACGCTGAAGCGCAGCGGCGCGTGTAAGATTTGGCTGGATTCTGAGGAGGGCCAAAACGCGATCAAGAAAGCCTTCAACTCTACGAGCCGTTTCGCGCGTTTACAGCATATCCAGACCTGCCTGGCCGGCGACCTGCTGTTCATGCGCTTCCGCACCACCACGGGCGATGCGATGGGCATGAACATGATCAGCAAGGGCGTCGAATATAGCCTGAAACAAATGGTGGAAGAATATGGCTGGGAGGACATGGAGGTTGTCTCTGTGAGCGGCAACTATTGCACCGACAAGAAGCCGGCAGCCATTAACTGGATTGAGGGTCGCGGCAAAAGCGTCGTGGCAGAAGCGACCATCCCAGGCGACGTGGTCCGTAAGGTTCTGAAGAGCGACGTCAGCGCCCTGGTTGAGTTAAATATCGCGAAAAACCTGGTCGGCAGCGCGATGGCGGGCAGCGTGGGTGGCTTTAACGCACATGCAGCGAATCTGGTTACGGCGGTTTTCTTAGCCTTAGGTCAGGACCCAGCCCAAAATGTCGAGAGCAGCAACTGCATTACCTTAATGAAAGAGGTTGACGGTGACCTGCGCATCAGCGTTTCTATGCCGTCTATCGAGGTCGGCACGATCGGCGGCGGCACCGTTTTAGAACCGCAAGGTGCGATGCTGGATCTGCTGGGCGTGCGCGGCCCACATGCAACGGCCCCAGGCACCAATGCCCGCCAACTGGCCCGTATCGTGGCCTGCGCGGTTCTGGCGGGTGAGCTGAGCCTGTGCGCCGCATTAGCCGCGGGCCATTTAGTTCAATCTCACATGACCCACAACCGCAAGCCGGCAGAACCAACCAAGCCAAATAACCTGGACGCAACCGACATTAACCGTCTGAAGGATGGCAGCGTCACGTGCATTAAAAGCTGAGCATGCTACTAAGCTT
SEQIDNO：2
引物4-49mvaASpeI
5’-GCTACTAGTAGGAGGAAAACATCATGCAAAGTTTAGATAAGAATTTCCG-3’
SEQIDNO：3
引物4-49mvaARXbaI
5’-GCTTCTAGACTATTGTTGTCTAATTTCTTGTAAAATGCG-3’
SEQIDNO：4
引物HMGS5′SamvaS-S
5’-
GAACTGAAGATCTAGGAGGAAAGCAAAATGACAATAGGTATCGACAAAATAAACT-3’
SEQIDNO：5
引物HMGS3′SamvaS-AS
5’-TTGCATGATGTTTTCCTCCTACTAGTTACTCTGGTCTGTGATATTCGCGAAC-3’
SEQIDNO：6
引物19-25atoBSfiI-S
5’-GCTAGGCCATCCTGGCCATGAAGAACTGTGTGATTGTTTCTG-3’
SEQIDNO：7
引物19-25mvaA-AsiSI-AS
5’-GCTTGCGATCGCCGGCGGATTTGTCCTACTCAG-3’
SEQIDNO：8
引物9-70C
5’-CCACCTCGAGATGTCATTACCGTTCTTAACTTCTG-3’
SEQIDNO：9
引物26-39B
5’-TGGTGGAGCTCTTATTTAAGCTGGGTAAATGCAGATAATCG-3’
SEQIDNO：10
引物26-39A
5’-TTCTTGAGCTCTTATTCCTTTGGTAGACCAGTCTTTGCG-3’
SEQIDNO：11
引物4-40mvaEFBamHI
5’-TATGGATCCTAAGGAGGATATTTAGATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC-3’
SEQIDNO：12
引物4-40mvaERHindIII
5’-AGCTAAGCTTTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC-3’
SEQIDNO：13
引物4-40mvaSFBglII
5’-TATAGATCTTAAGGAGGATATTTAGATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG-3’
SEQIDNO：14
引物4-39mvaSRBamHI
5’-TTTGGATCCTTAGTTTCGATAAGAGCGAACGG-3’
SEQIDNO：15
引物67-1A-C，供PCR扩增dxs基因的编码序列
5′-ACACTCGAGGAGGAATAAATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCG-3′
SEQIDNO：16
引物67-1B-C，供PCR扩增dxs基因的编码序列
5′-TGATGGTACCTTATGCCAGCCAGGCCTTGATTTTGGC-3′
SEQIDNO：17
引物67-1C-C，供PCR扩增dxr基因的编码序列
5′-ACTAGGTACCAGGAGGAATAAATGAAGCAACTCACCATTCTGGGC-3′
SEQIDNO：18
引物67-1D-C，供PCR扩增dxr基因的编码序列
5′-AATTGATGGGCCCTCAGCTTGCGAGACGCATCACCTC-3′
SEQIDNO：19
引物67-1E-C，供PCR扩增ispD基因的编码序列
5′-CATAAAGGGCCCAGGAGGAATAAATGGCAACCACTCATTTGGATG-3′
SEQIDNO：20
引物67-1F-C，供PCR扩增ispD基因的编码序列
5′-TATTGTTCATATGTTATGTATTCTCCTGATGGATGGTTCG-3′
SEQIDNO：21
引物67-1G-C，供PCR扩增ispE基因的编码序列
5′-AACTAACACATATGAGGAGGAATAAATGCGGACACAGTGGCCCTC-3′
SEQIDNO：22
引物67-1H-C，供PCR扩增ispE基因的编码序列
5′-TGTTAGTTACGCGTTTAAAGCATGGCTCTGTGCAATGG-3′
SEQIDNO：23
引物67-2A-C，供PCR扩增ispF基因的编码序列
5′-ACGGGATCCAGGAGGAATAAATGCGAATTGGACACGGTTTTGACG-3′
SEQIDNO：24
引物67-2B-C，供PCR扩增ispF基因的编码序列
5′-TTTAGTTGGGCCCTCATTTTGTTGCCTTAATGAGTAGCGCC-3′
SEQIDNO：25
引物67-2C-C，供PCR扩增ispG基因的编码序列
5′-TACTAAGGGCCCAGGAGGAAATAATGCATAACCAGGCTCCAATTCAACG-3′
SEQIDNO：26
引物67-2D-C，供PCR扩增ispG基因的编码序列
5′-TCCGGGTACCTTATTTTTCAACCTGCTGAACGTCAATTCG-3′
SEQIDNO：27
引物67-2E-C，供PCR扩增ispH基因的编码序列
5′-AACAGGTACCAGGAGGAAATAATGCAGATCCTGTTGGCCAACC-3′
SEQIDNO：28
引物67-2F-C，供PCR扩增ispH基因的编码序列
5′-TGGATGAAGTCGACTTAATCGACTTCACGAATATCGACACGCAGC-3′
SEQIDNO：29
引物67-2G-C，供PCR扩增idi基因的编码序列
5′-CATCAAGTCGACAGGAGGAAATAATGCAAACGGAACACGTCATTTTATTG-3′
SEQIDNO：30
引物67-2H-C，供PCR扩增idi基因的编码序列
5′-TAATGCAAGCTTATTTAAGCTGGGTAAATGCAGATAATCG-3′
SEQIDNO：31
引物67-2I-C，供PCR扩增ispA基因的编码序列
5′-CAGTAAAGCTTAGGAGGAAATAATGGACTTTCCGCAGCAACTCG-3′
SEQIDNO：32
引物67-2J-C，供PCR扩增ispA基因的编码序列
5′-TAGTTCCATGGTTATTTATTACGCTGGATGATGTAGTCCGC-3′
SEQIDNO：33
引物9-156A，供PCR扩增RK2par位点
5’-ACATAGACGTCGGGAAAGCGAGGATCTAGGTAGGG-3′
SEQIDNO：34
引物9-156B，供PCR扩增RK2par位点
5’-TTCCCGCTCGAGGTGGCGGACCATATAGGCAGATCAG-3′
SEQIDNO：35
引物19-137cml-pAM37-AS
5’-GACGTCGATATCTGGCGAAAATG-3’
SEQIDNO：36
引物19-137cml-pAM37-S
5’-TACTAGTGCTTGGATTCTCACC-3’
SEQIDNO：37
编码β-法呢烯合成酶的核苷酸序列的PCR扩增引物
5’-CCATGGACACTCTGCCGATCTCTTCCGTAAGC-3’
SEQIDNO：38
编码β-法呢烯合成酶的核苷酸序列的PCR扩增引物
5’-GAGCTCTCATACGACCATAGGGTGTACG-3’
SEQIDNO：39
编码α-法呢烯合成酶的核苷酸序列的PCR扩增引物
5’-CCATGGACCTGGCAGTAGAAATTGC-3’
SEQIDNO：40
编码α-法呢烯合成酶的核苷酸序列的PCR扩增引物
5’-GAGCTCTTACATCGGTACCGGCTCCAG-3’
SEQIDNO：41
atoB(opt)：HMGS(opt)：mvaA操纵子
ATGAAGAACTGTGTGATTGTTTCTGCGGTCCGCACGGCGATCGGCAGCTTTAACGGCTCTTTAGCGAGCACCTCTGCAATCGATCTGGGTGCGACGGTCATTAAGGCCGCCATTGAACGCGCCAAAATCGACAGCCAGCACGTTGATGAGGTGATCATGGGCAATGTGTTACAAGCCGGCCTGGGTCAAAACCCAGCGCGTCAAGCACTGTTAAAATCTGGTCTGGCCGAGACCGTGTGTGGCTTCACCGTCAATAAGGTTTGCGGCTCTGGCCTGAAGAGCGTGGCCCTGGCAGCACAAGCGATTCAAGCCGGTCAGGCACAAAGCATCGTTGCGGGTGGCATGGAGAACATGTCTCTGGCGCCGTACTTATTAGATGCCAAAGCCCGCAGCGGTTATCGCCTGGGCGATGGTCAGGTGTACGACGTCATCTTACGCGATGGCTTAATGTGCGCGACCCACGGTTACCACATGGGTATTACGGCCGAAAACGTGGCGAAAGAATACGGCATTACGCGCGAGATGCAGGATGAATTAGCACTGCACTCTCAGCGCAAAGCAGCAGCCGCGATCGAGTCTGGTGCGTTTACGGCGGAAATCGTGCCAGTTAACGTGGTCACGCGCAAGAAGACGTTCGTTTTCAGCCAGGACGAGTTCCCGAAGGCAAACAGCACCGCGGAGGCCTTAGGTGCCTTACGCCCAGCCTTTGACAAAGCGGGCACGGTCACCGCCGGTAATGCGAGCGGCATCAATGATGGTGCAGCGGCACTGGTCATCATGGAAGAGAGCGCCGCATTAGCAGCGGGTCTGACCCCATTAGCGCGCATTAAATCTTATGCCAGCGGCGGCGTCCCACCAGCCCTGATGGGCATGGGTCCGGTCCCAGCCACGCAAAAAGCCCTGCAATTAGCGGGCCTGCAACTGGCCGACATTGATCTGATCGAGGCGAACGAGGCGTTTGCAGCGCAGTTCCTGGCGGTGGGTAAGAATCTGGGCTTCGACAGCGAGAAAGTCAATGTGAACGGTGGCGCGATTGCGTTAGGCCATCCGATTGGTGCAAGCGGCGCACGCATCTTAGTGACGTTACTGCACGCCATGCAGGCACGCGACAAGACCTTAGGCCTGGCGACCTTATGTATTGGTGGCGGTCAAGGTATCGCCATGGTGATCGAACGCCTGAACTGAAGATCTAGGAGGAAAGCAAAATGAAACTGAGCACCAAGCTGTGCTGGTGTGGCATCAAGGGTCGCCTGCGCCCACAAAAGCAGCAACAGCTGCACAACACGAACCTGCAAATGACCGAGCTGAAAAAGCAGAAGACGGCCGAGCAAAAGACCCGCCCGCAGAACGTTGGCATCAAGGGCATCCAGATTTATATCCCGACGCAGTGTGTCAACCAATCTGAGCTGGAGAAATTCGATGGCGTCAGCCAGGGTAAGTACACCATCGGCCTGGGCCAGACCAACATGAGCTTCGTGAACGACCGTGAGGACATCTATTCTATGAGCCTGACGGTGCTGTCTAAGCTGATCAAGAGCTACAACATCGACACGAATAAGATCGGTCGTCTGGAGGTGGGTACGGAGACGCTGATTGACAAGAGCAAAAGCGTGAAGTCTGTCTTAATGCAGCTGTTCGGCGAGAACACGGATGTCGAGGGTATCGACACCCTGAACGCGTGTTACGGCGGCACCAACGCACTGTTCAATAGCCTGAACTGGATTGAGAGCAACGCCTGGGATGGCCGCGATGCGATCGTCGTGTGCGGCGATATCGCCATCTATGACAAGGGTGCGGCACGTCCGACCGGCGGTGCAGGCACCGTTGCGATGTGGATTGGCCCGGACGCACCAATTGTCTTCGATTCTGTCCGCGCGTCTTACATGGAGCACGCCTACGACTTTTACAAGCCGGACTTCACGAGCGAATACCCGTACGTGGACGGCCACTTCTCTCTGACCTGCTATGTGAAGGCGCTGGACCAGGTTTATAAGTCTTATAGCAAAAAGGCGATTTCTAAGGGCCTGGTCAGCGACCCGGCAGGCAGCGACGCCCTGAACGTGCTGAAGTATTTCGACTACAACGTGTTCCATGTCCCGACCTGCAAATTAGTGACCAAATCTTATGGCCGCCTGTTATATAATGATTTCCGTGCCAACCCGCAGCTGTTCCCGGAGGTTGACGCCGAGCTGGCGACGCGTGATTACGACGAGAGCCTGACCGACAAGAACATCGAGAAGACCTTCGTCAACGTCGCGAAGCCGTTCCACAAAGAGCGTGTGGCCCAAAGCCTGATCGTCCCGACCAACACGGGCAACATGTATACCGCGTCTGTCTACGCGGCATTCGCGAGCCTGCTGAATTACGTCGGTTCTGACGACCTGCAGGGCAAGCGCGTTGGCCTGTTCAGCTACGGTAGCGGCTTAGCGGCCAGCCTGTATAGCTGCAAAATTGTCGGCGACGTCCAGCACATCATCAAGGAGCTGGACATCACCAACAAGCTGGCGAAGCGCATCACCGAGACGCCGAAAGATTACGAGGCAGCGATCGAGTTACGCGAGAATGCGCATCTGAAGAAGAACTTCAAGCCGCAAGGTAGCATCGAGCACCTGCAGAGCGGCGTCTACTACCTGACGAACATTGACGACAAGTTCCGCCGTTCTTATGACGTCAAAAAGTAACTAGTAGGAGGAAAACATCATGCAAAGTTTAGATAAGAATTTCCGACATTTATCTCGTCAACAAAAGTTACAACAATTGGTAGATAAGCAATGGTTATCAGAAGATCAATTCGACATTTTATTGAATCATCCATTAATTGATGAGGAAGTAGCAAATAGTTTAATTGAAAATGTCATCGCGCAAGGTGCATTACCCGTTGGATTATTACCGAATATCATTGTGGACGATAAGGCATATGTTGTACCTATGATGGTGGAAGAGCCTTCAGTTGTCGCTGCAGCTAGTTATGGTGCAAAGCTAGTGAATCAGACTGGCGGATTTAAAACGGTATCTTCTGAACGTATTATGATAGGTCAAATCGTCTTTGATGGCGTTGACGATACTGAAAAATTATCAGCAGACATTAAAGCTTTAGAAAAGCAAATTCATAAAATTGCGGATGAGGCATATCCTTCTATTAAAGCGCGTGGTGGTGGTTACCAACGTATAGCTATTGATACATTTCCTGAGCAACAGTTACTATCTTTAAAAGTATTTGTTGATACGAAAGATGCTATGGGCGCTAATATGCTTAATACGATTTTAGAGGCCATAACTGCATTTTTAAAAAATGAATCTCCACAAAGCGACATTTTAATGAGTATTTTATCCAATCATGCAACAGCGTCCGTTGTTAAAGTTCAAGGCGAAATTGACGTTAAAGATTTAGCAAGGGGCGAGAGAACTGGAGAAGAGGTTGCCAAACGAATGGAACGTGCTTCTGTATTGGCACAAGTTGATATTCATCGTGCTGCAACACATAATAAAGGTGTTATGAATGGCATACATGCCGTTGTTTTAGCAACAGGAAATGATACGCGTGGTGCAGAAGCAAGTGCGCATGCATACGCGAGTCGTGACGGACAGTATCGTGGTATTGCAACATGGAGATACGATCAAAAACGTCAACGTTTAATTGGTACAATAGAAGTGCCTATGACATTGGCAATCGTTGGCGGTGGTACAAAAGTATTACCAATTGCTAAAGCTTCTTTAGAATTGCTAAATGTAGATTCAGCACAAGAATTAGGTCATGTAGTTGCTGCCGTTGGTTTAGCACAGAACTTTGCAGCATGTCGCGCGCTCGTTTCCGAAGGTATCCAGCAAGGCCATATGAGCTTGCAATATAAATCTTTAGCTATTGTTGTAGGTGCAAAAGGTGATGAAATTGCGCAAGTAGCTGAAGCATTGAAGCAAGAACCCCGTGCGAATACACAAGTAGCTGAACGCATTTTACAAGAAATTAGACAACAATAG
SEQIDNO：42
atoB(opt)：mvaS(opt)：mvaA操纵子
ATGAAGAACTGTGTGATTGTTTCTGCGGTCCGCACGGCGATCGGCAGCTTTAACGGCTCTTTAGCGAGCACCTCTGCAATCGATCTGGGTGCGACGGTCATTAAGGCCGCCATTGAACGCGCCAAAATCGACAGCCAGCACGTTGATGAGGTGATCATGGGCAATGTGTTACAAGCCGGCCTGGGTCAAAACCCAGCGCGTCAAGCACTGTTAAAATCTGGTCTGGCCGAGACCGTGTGTGGCTTCACCGTCAATAAGGTTTGCGGCTCTGGCCTGAAGAGCGTGGCCCTGGCAGCACAAGCGATTCAAGCCGGTCAGGCACAAAGCATCGTTGCGGGTGGCATGGAGAACATGTCTCTGGCGCCGTACTTATTAGATGCCAAAGCCCGCAGCGGTTATCGCCTGGGCGATGGTCAGGTGTACGACGTCATCTTACGCGATGGCTTAATGTGCGCGACCCACGGTTACCACATGGGTATTACGGCCGAAAACGTGGCGAAAGAATACGGCATTACGCGCGAGATGCAGGATGAATTAGCACTGCACTCTCAGCGCAAAGCAGCAGCCGCGATCGAGTCTGGTGCGTTTACGGCGGAAATCGTGCCAGTTAACGTGGTCACGCGCAAGAAGACGTTCGTTTTCAGCCAGGACGAGTTCCCGAAGGCAAACAGCACCGCGGAGGCCTTAGGTGCCTTACGCCCAGCCTTTGACAAAGCGGGCACGGTCACCGCCGGTAATGCGAGCGGCATCAATGATGGTGCAGCGGCACTGGTCATCATGGAAGAGAGCGCCGCATTAGCAGCGGGTCTGACCCCATTAGCGCGCATTAAATCTTATGCCAGCGGCGGCGTCCCACCAGCCCTGATGGGCATGGGTCCGGTCCCAGCCACGCAAAAAGCCCTGCAATTAGCGGGCCTGCAACTGGCCGACATTGATCTGATCGAGGCGAACGAGGCGTTTGCAGCGCAGTTCCTGGCGGTGGGTAAGAATCTGGGCTTCGACAGCGAGAAAGTCAATGTGAACGGTGGCGCGATTGCGTTAGGCCATCCGATTGGTGCAAGCGGCGCACGCATCTTAGTGACGTTACTGCACGCCATGCAGGCACGCGACAAGACCTTAGGCCTGGCGACCTTATGTATTGGTGGCGGTCAAGGTATCGCCATGGTGATCGAACGCCTGAACTGAAGATCTAGGAGGAAAGCAAAATGACAATAGGTATCGACAAAATAAACTTTTACGTTCCAAAGTACTATGTAGACATGGCTAAATTAGCAGAAGCACGCCAAGTAGACCCAAACAAATTTTTAATTGGAATTGGTCAAACTGAAATGGCTGTTAGTCCTGTAAACCAAGACATCGTTTCAATGGGCGCTAACGCTGCTAAGGACATTATAACAGACGAAGATAAAAAGAAAATTGGTATGGTAATTGTGGCAACTGAATCAGCAGTTGATGCTGCTAAAGCAGCCGCTGTTCAAATTCACAACTTATTAGGTATTCAACCTTTTGCACGTTGCTTTGAAATGAAAGAAGCTTGTTATGCTGCAACACCAGCAATTCAATTAGCTAAAGATTATTTAGCAACTAGACCGAATGAAAAAGTATTAGTTATTGCTACAGATACAGCACGTTATGGATTGAATTCAGGCGGCGAGCCAACACAAGGTGCTGGCGCAGTTGCGATGGTTATTGCACATAATCCAAGCATTTTGGCATTAAATGAAGATGCTGTTGCTTACACTGAAGACGTTTATGATTTCTGGCGTCCAACTGGACATAAATATCCATTAGTTGATGGTGCATTATCTAAAGATGCTTATATCCGCTCATTCCAACAAAGCTGGAATGAATACGCAAAACGTCAAGGTAAGTCGCTAGCTGACTTCGCATCTCTATGCTTCCATGTTCCATTTACAAAAATGGGTAAAAAGGCATTAGAGTCAATCATTGATAACGCTGATGAAACAACTCAAGAGCGTTTACGTTCAGGATATGAAGATGCTGTAGATTATAACCGTTATGTCGGTAATATTTATACTGGATCATTATATTTAAGCCTAATATCATTACTTGAAAATCGTGATTTACAAGCTGGTGAAACAATCGGTTTATTCAGTTATGGCTCAGGTTCAGTTGGTGAATTTTATAGTGCGACATTAGTTGAAGGCTACAAAGATCATTTAGATCAAGCTGCACATAAAGCATTATTAAATAACCGTACTGAAGTATCTGTTGATGCATATGAAACATTCTTCAAACGTTTTGATGACGTTGAATTTGACGAAGAACAAGATGCTGTTCATGAAGATCGTCATATTTTCTACTTATCAAATATTGAAAATAACGTTCGCGAATATCACAGACCAGAGTAACTAGTAGGAGGAAAACATCATGCAAAGTTTAGATAAGAATTTCCGACATTTATCTCGTCAACAAAAGTTACAACAATTGGTAGATAAGCAATGGTTATCAGAAGATCAATTCGACATTTTATTGAATCATCCATTAATTGATGAGGAAGTAGCAAATAGTTTAATTGAAAATGTCATCGCGCAAGGTGCATTACCCGTTGGATTATTACCGAATATCATTGTGGACGATAAGGCATATGTTGTACCTATGATGGTGGAAGAGCCTTCAGTTGTCGCTGCAGCTAGTTATGGTGCAAAGCTAGTGAATCAGACTGGCGGATTTAAAACGGTATCTTCTGAACGTATTATGATAGGTCAAATCGTCTTTGATGGCGTTGACGATACTGAAAAATTATCAGCAGACATTAAAGCTTTAGAAAAGCAAATTCATAAAATTGCGGATGAGGCATATCCTTCTATTAAAGCGCGTGGTGGTGGTTACCAACGTATAGCTATTGATACATTTCCTGAGCAACAGTTACTATCTTTAAAAGTATTTGTTGATACGAAAGATGCTATGGGCGCTAATATGCTTAATACGATTTTAGAGGCCATAACTGCATTTTTAAAAAATGAATCTCCACAAAGCGACATTTTAATGAGTATTTTATCCAATCATGCAACAGCGTCCGTTGTTAAAGTTCAAGGCGAAATTGACGTTAAAGATTTAGCAAGGGGCGAGAGAACTGGAGAAGAGGTTGCCAAACGAATGGAACGTGCTTCTGTATTGGCACAAGTTGATATTCATCGTGCTGCAACACATAATAAAGGTGTTATGAATGGCATACATGCCGTTGTTTTAGCAACAGGAAATGATACGCGTGGTGCAGAAGCAAGTGCGCATGCATACGCGAGTCGTGACGGACAGTATCGTGGTATTGCAACATGGAGATACGATCAAAAACGTCAACGTTTAATTGGTACAATAGAAGTGCCTATGACATTGGCAATCGTTGGCGGTGGTACAAAAGTATTACCAATTGCTAAAGCTTCTTTAGAATTGCTAAATGTAGATTCAGCACAAGAATTAGGTCATGTAGTTGCTGCCGTTGGTTTAGCACAGAACTTTGCAGCATGTCGCGCGCTCGTTTCCGAAGGTATCCAGCAAGGCCATATGAGCTTGCAATATAAATCTTTAGCTATTGTTGTAGGTGCAAAAGGTGATGAAATTGCGCAAGTAGCTGAAGCATTGAAGCAAGAACCCCGTGCGAATACACAAGTAGCTGAACGCATTTTACAAGAAATTAGACAACAATAG
SEQIDNO：43
pAM328-ERG9-KANMX-MET3启动子-ERG9(不包括载体骨架)
CAATACCGACTTACCATCCTATTTGCTTTGCCCTTTTTCTTTTCCACTGCATGGCGGCGTTAGTATCGAATGGATGGCGGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGCGACCAGCATTCACATACGATTGACGCATGATATTACTTTCTGCGCACTTAACTTCGCATCTGGGCAGATGATGTCGAGGCGAAAAAAAATATAAATCACGCTAACATTTGATTAAAATAGAACAACTACAATATAAAAAAACTATACAAATGACAAGTTCTTGAAAACAAGAATCTTTTTATTGTCAGTACTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTGCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAAACGTGAGTCTTTTCCTTACCCATGGTTGTTTATGTTCGGATGTGATGTGAGAACTGTATCCTAGCAAGATTTTAAAAGGAAGTATATGAAAGAAGAACCTCAGTGGCAAATCCTAACCTTTTATATTTCTCTACAGGGGCGCGGCGTGGGGACAATTCAACGCGTCTGTGAGGGGAGCGTTTCCCTGCTCGCAGGTCTGCAGCGAGGAGCCGTAATTTTTGCTTCGCGCCGTGCGGCCATCAAAATGTATGGATGCAAATGATTATACATGGGGATGTATGGGCTAAATGTACGGGCGACAGTCACATCATGCCCCTGAGCTGCGCACGTCAAGACTGTCAAGGAGGGTATTCTGGGCCTCCATGTCGCTGGCCGGGTGACCCGGCGGGGACGAGGCAAGCTAAACAGATCTGATCTTGAAACTGAGTAAGATGCTCAGAATACCCGTCAAGATAAGAGTATAATGTAGAGTAATATACCAAGTATTCAGCATATTCTCCTCTTCTTTTGTATAAATCACGGAAGGGATGATTTATAAGAAAAATGAATACTATTACACTTCATTTACCACCCTCTGATCTAGATTTTCCAACGATATGTACGTAGTGGTATAAGGTGAGGGGGTCCACAGATATAACATCGTTTAATTTAGTACTAACAGAGACTTTTGTCACAACTACATATAAGTGTACAAATATAGTACAGATATGACACACTTGTAGCGCCAACGCGCATCCTACGGATTGCTGACAGAAAAAAAGGTCACGTGACCAGAAAAGTCACGTGTAATTTTGTAACTCACCGCATTCTAGCGGTCCCTGTCGTGCACACTGCACTCAACACCATAAACCTTAGCAACCTCCAAAGGAAATCACCGTATAACAAAGCCACAGTTTTACAACTTAGTCTCTTATGAAGTTACTTACCAATGAGAAATAGAGGCTCTTTCTCGAGAAATATGAATATGGATATATATATATATATATATATATATATATATATATGTAAACTTGGTTCTTTTTTAGCTTGTGATCTCTAGCTTGGGTCTCTCTCTGTCGTAACAGTTGTGATATCGGCTGCCTTCATCTCGACCGGATGCAATGCCAATTGTAATAGCTTTCCCATGTTAATTATACTTTATTCTT
SEQIDNO：44
GAGTGAACCTGCTGCCTGGCGTGCTCTGACTCAGTACATTTCATAGTGGATGGCGGCGTTAGTATC
SEQIDNO：45
CGTGTATACGTTTTCCGCTTCTGCTCTTCGTCTTTTCTCTTCTTCCGATATCACAACTGTTACGA
SEQIDNO：46
GGTAAGACGGTTGGGTTTTATCTTTTGCAGTTGGTACTATTAAGAACAATCACAGGAAACAGCTATGACC
SEQIDNO：47
TTGCGTTTTGTACTTTGGTTCGCTCAATTTTGCAGGTAGATAATCGAAAAGTTGTAAAACGACGGCCAGT
SEQIDNO：48
pAM491序列(不包括载体骨架)
GTTTAAACTTGCTAAATTCGAGTGAAACACAGGAAGACCAGAAAATCCTCATTTCATCCATATTAACAATAATTTCAAATGTTTATTTGCATTATTTGAAACTAGGGAAGACAAGCAACGAAACGTTTTGAAAATTTTGAGTATTTTCAATAAATTTGTAGAGGACTCAGATATTGAAAAAAAGCTACAGCAATTAATACTTGATAAGAAGAGTATTGAGAAGGGCAACGGTTCATCATCTCATGGATCTGCACATGAACAAACACCAGAGTCAAACGACGTTGAAATTGAGGCTACTGCGCCAATTGATGACAATACAGACGATGATAACAAACCGAAGTTATCTGATGTAGAAAAGGATTAAAGATGCTAAGAGATAGTGATGATATTTCATAAATAATGTAATTCTATATATGTTAATTACCTTTTTTGCGAGGCATATTTATGGTGAAGGATAAGTTTTGACCATCAAAGAAGGTTAATGTGGCTGTGGTTTCAGGGTCCATACCCGGGAGTTATGACAATTACAACAACAGAATTCTTTCTATATATGCACGAACTTGTAATATGGAAGAAATTATGACGTACAAACTATAAAGTAAATATTTTACGTAACACATGGTGCTGTTGTGCTTCTTTTTCAAGAGAATACCAATGACGTATGACTAAGTTTAGGATTTAATGCAGGTGACGGACCCATCTTTCAAACGATTTATATCAGTGGCGTCCAAATTGTTAGGTTTTGTTGGTTCAGCAGGTTTCCTGTTGTGGGTCATATGACTTTGAACCAAATGGCCGGCTGCTAGGGCAGCACATAAGGATAATTCACCTGCCAAGACGGCACAGGCAACTATTCTTGCTAATTGACGTGCGTTGGTACCAGGAGCGGTAGCATGTGGGCCTCTTACACCTAATAAGTCCAACATGGCACCTTGTGGTTCTAGAACAGTACCACCACCGATGGTACCTACTTCGATGGATGGCATGGATACGGAAATTCTCAAATCACCGTCCACTTCTTTCATCAATGTTATACAGTTGGAACTTTCGACATTTTGTGCAGGATCTTGTCCTAATGCCAAGAAAACAGCTGTCACTAAATTAGCTGCATGTGCGTTAAATCCACCAACAGACCCAGCCATTGCAGATCCAACCAAATTCTTAGCAATGTTCAACTCAACCAATGCGGAAACATCACTTTTTAACACTTTTCTGACAACATCACCAGGAATAGTAGCTTCTGCGACGACACTCTTACCACGACCTTCGATCCAGTTGATGGCAGCTGGTTTTTTGTCGGTACAGTAGTTACCAGAAACGGAGACAACCTCCATATCTTCCCAGCCATACTCTTCTACCATTTGCTTTAATGAGTATTCGACACCCTTAGAAATCATATTCATACCCATTGCGTCACCAGTAGTTGTTCTAAATCTCATGAAGAGTAAATCTCCTGCTAGACAAGTTTGAATATGTTGCAGACGTGCAAATCTTGATGTAGAGTTAAAAGCTTTTTTAATTGCGTTTTGTCCCTCTTCTGAGTCTAACCATATCTTACAGGCACCAGATCTTTTCAAAGTTGGGAAACGGACTACTGGGCCTCTTGTCATACCATCCTTAGTTAAAACAGTTGTTGCACCACCGCCAGCATTGATTGCCTTACAGCCACGCATGGCAGAAGCTACCAAACAACCCTCTGTAGTTGCCATTGGTATATGATAAGATGTACCATCGATAACCAAGGGGCCTATAACACCAACGGGCAAAGGCATGTAACCTATAACATTTTCACAACAAGCGCCAAATACGCGGTCGTAGTCATAATTTTTATATGGTAAACGATCAGATGCTAATACAGGAGCTTCTGCCAAAATTGAAAGAGCCTTCCTACGTACCGCAACCGCTCTCGTAGTATCACCTAATTTTTTCTCCAAAGCGTACAAAGGTAACTTACCGTGAATAACCAAGGCAGCGACCTCTTTGTTCTTCAATTGTTTTGTATTTCCACTACTTAATAATGCTTCTAATTCTTCTAAAGGACGTATTTTCTTATCCAAGCTTTCAATATCGCGGGAATCATCTTCCTCACTAGATGATGAAGGTCCTGATGAGCTCGATTGCGCAGATGATAAACTTTTGACTTTCGATCCAGAAATGACTGTTTTATTGGTTAAAACTGGTGTAGAAGCCTTTTGTACAGGAGCAGTAAAAGACTTCTTGGTGACTTCAGTCTTCACCAATTGGTCTGCAGCCATTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAGAGGTATATTAACAATTTTTTGTTGATACTTTTATGACATTTGAATAAGAAGTAATACAAACCGAAAATGTTGAAAGTATTAGTTAAAGTGGTTATGCAGCTTTTGCATTTATATATCTGTTAATAGATCAAAAATCATCGCTTCGCTGATTAATTACCCCAGAAATAAGGCTAAAAAACTAATCGCATTATTATCCTATGGTTGTTAATTTGATTCGTTGATTTGAAGGTTTGTGGGGCCAGGTTACTGCCAATTTTTCCTCTTCATAACCATAAAAGCTAGTATTGTAGAATCTTTATTGTTCGGAGCAGTGCGGCGCGAGGCACATCTGCGTTTCAGGAACGCGACCGGTGAAGACCAGGACGCACGGAGGAGAGTCTTCCGTCGGAGGGCTGTCGCCCGCTCGGCGGCTTCTAATCCGTACTTCAATATAGCAATGAGCAGTTAAGCGTATTACTGAAAGTTCCAAAGAGAAGGTTTTTTTAGGCTAAGATAATGGGGCTCTTTACATTTCCACAACATATAAGTAAGATTAGATATGGATATGTATATGGTGGTATTGCCATGTAATATGATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCAAAAAAAAAGTAAGAATTTTTGAAAATTCAATATAAATGAAACTCTCAACTAAACTTTGTTGGTGTGGTATTAAAGGAAGACTTAGGCCGCAAAAGCAACAACAATTACACAATACAAACTTGCAAATGACTGAACTAAAAAAACAAAAGACCGCTGAACAAAAAACCAGACCTCAAAATGTCGGTATTAAAGGTATCCAAATTTACATCCCAACTCAATGTGTCAACCAATCTGAGCTAGAGAAATTTGATGGCGTTTCTCAAGGTAAATACACAATTGGTCTGGGCCAAACCAACATGTCTTTTGTCAATGACAGAGAAGATATCTACTCGATGTCCCTAACTGTTTTGTCTAAGTTGATCAAGAGTTACAACATCGACACCAACAAAATTGGTAGATTAGAAGTCGGTACTGAAACTCTGATTGACAAGTCCAAGTCTGTCAAGTCTGTCTTGATGCAATTGTTTGGTGAAAACACTGACGTCGAAGGTATTGACACGCTTAATGCCTGTTACGGTGGTACCAACGCGTTGTTCAACTCTTTGAACTGGATTGAATCTAACGCATGGGATGGTAGAGACGCCATTGTAGTTTGCGGTGATATTGCCATCTACGATAAGGGTGCCGCAAGACCAACCGGTGGTGCCGGTACTGTTGCTATGTGGATCGGTCCTGATGCTCCAATTGTATTTGACTCTGTAAGAGCTTCTTACATGGAACACGCCTACGATTTTTACAAGCCAGATTTCACCAGCGAATATCCTTACGTCGATGGTCATTTTTCATTAACTTGTTACGTCAAGGCTCTTGATCAAGTTTACAAGAGTTATTCCAAGAAGGCTATTTCTAAAGGGTTGGTTAGCGATCCCGCTGGTTCGGATGCTTTGAACGTTTTGAAATATTTCGACTACAACGTTTTCCATGTTCCAACCTGTAAATTGGTCACAAAATCATACGGTAGATTACTATATAACGATTTCAGAGCCAATCCTCAATTGTTCCCAGAAGTTGACGCCGAATTAGCTACTCGCGATTATGACGAATCTTTAACCGATAAGAACATTGAAAAAACTTTTGTTAATGTTGCTAAGCCATTCCACAAAGAGAGAGTTGCCCAATCTTTGATTGTTCCAACAAACACAGGTAACATGTACACCGCATCTGTTTATGCCGCCTTTGCATCTCTATTAAACTATGTTGGATCTGACGACTTACAAGGCAAGCGTGTTGGTTTATTTTCTTACGGTTCCGGTTTAGCTGCATCTCTATATTCTTGCAAAATTGTTGGTGACGTCCAACATATTATCAAGGAATTAGATATTACTAACAAATTAGCCAAGAGAATCACCGAAACTCCAAAGGATTACGAAGCTGCCATCGAATTGAGAGAAAATGCCCATTTGAAGAAGAACTTCAAACCTCAAGGTTCCATTGAGCATTTGCAAAGTGGTGTTTACTACTTGACCAACATCGATGACAAATTTAGAAGATCTTACGATGTTAAAAAATAATCTTCCCCCATCGATTGCATCTTGCTGAACCCCCTTCATAAATGCTTTATTTTTTTGGCAGCCTGCTTTTTTTAGCTCTCATTTAATAGAGTAGTTTTTTAATCTATATACTAGGAAAACTCTTTATTTAATAACAATGATATATATATACCCGGGAAGCTTTTCAATTCATCTTTTTTTTTTTTGTTCTTTTTTTTGATTCCGGTTTCTTTGAAATTTTTTTGATTCGGTAATCTCCGAGCAGAAGGAAGAACGAAGGAAGGAGCACAGACTTAGATTGGTATATATACGCATATGTGGTGTTGAAGAAACATGAAATTGCCCAGTATTCTTAACCCAACTGCACAGAACAAAAACCTGCAGGAAACGAAGATAAATCATGTCGAAAGCTACATATAAGGAACGTGCTGCTACTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCCAAGCTATTTAATATCATGCACGAAAAGCAAACAAACTTGTGTGCTTCATTGGATGTTCGTACCACCAAGGAATTACTGGAGTTAGTTGAAGCATTAGGTCCCAAAATTTGTTTACTAAAAACACATGTGGATATCTTGACTGATTTTTCCATGGAGGGCACAGTT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SEQIDNO：49
pAM492序列(不包括载体骨架)
GTTTAAACTTGCTAAATTCGAGTGAAACACAGGAAGACCAGAAAATCCTCATTTCATCCATATTAACAATAATTTCAAATGTTTATTTGCATTATTTGAAACTAGGGAAGACAAGCAACGAAACGTTTTTGAAAATTTTGAGTATTTTCAATAAATTTGTAGAGGACTCAGATATTGAAAAAAAGCTACAGCAATTAATACTTGATAAGAAGAGTATTGAGAAGGGCAACGGTTCATCATCTCATGGATCTGCACATGAACAAACACCAGAGTCAAACGACGTTGAAATTGAGGCTACTGCGCCAATTGATGACAATACAGACGATGATAACAAACCGAAGTTATCTGATGTAGAAAAGGATTAAAGATGCTAAGAGATAGTGATGATATTTCATAAATAATGTAATTCTATATATGTTAATTACCTTTTTTGCGAGGCATATTTATGGTGAAGGATAAGTTTTGACCATCAAAGAAGGTTAATGTGGCTGTGGTTTCAGGGTCCATACCCGGGTATATATATATCATTGTTATTAAATAAAGAGTTTTCCTAGTATATAGATTAAAAAACTACTCTATTAAATGAGAGCTAAAAAAAGCAGGCTGCCAAAAAAATAAAGCATTTATGAAGGGGGTTCAGCAAGATGCAATCGATGGGGGAAGATTATTTTTTAACATCGTAAGATCTTCTAAATTTGTCATCGATGTTGGTCAAGTAGTAAACACCACTTTGCAAATGCTCAATGGAACCTTGAGGTTTGAAGTTCTTCTTCAAATGGGCATTTTCTCTCAATTCGATGGCAGCTTCGTAATCCTTTGGAGTTTCGGTGATTCTCTTGGCTAATTTGTTAGTAATATCTAATTCCTTGATAATATGTTGGACGTCACCAACAATTTTGCAAGAATATAGAGATGCAGCTAAACCGGAACCGTAAGAAAATAAACCAACACGCTTGCCTTGTAAGTCGTCAGATCCAACATAGTTTAATAGAGATGCAAAGGCGGCATAAACAGATGCGGTGTACATGTTACCTGTGTTTGTTGGAACAATCAAAGATTGGGCAACTCTCTCTTTGTGGAATGGCTTAGCAACATTAACAAAAGTTTTTTCAATGTTCTTATCGGTTAAAGATTCGTCATAATCGCGAGTAGCTAATTCGGCGTCAACTTCTGGGAACAATTGAGGATTGGCTCTGAAATCGTTATATAGTAATCTACCGTATGATTTTGTGACCAATTTACAGGTTGGAACATGGAAAACGTTGTAGTCGAAATATTTCAAAACGTTCAAAGCATCCGAACCAGCGGGATCGCTAACCAACCCTTTAGAAATAGCCTTCTTGGAATAACTCTTGTAAACTTGATCAAGAGCCTTGACGTAACAAGTTAATGAAAAATGACCATCGACGTAAGGATATTCGCTGGTGAAATCTGGCTTGTAAAAATCGTAGGCGTGTTCCATGTAAGAAGCTCTTACAGAGTCAAATACAATTGGAGCATCAGGACCGATCCACATAGCAACAGTACCGGCACCACCGGTTGGTCTTGCGGCACCCTTATCGTAGATGGCAATATCACCGCAAACTACAATGGCGTCTCTACCATCCCATGCGTTAGATTCAATCCAGTTCAAAGAGTTGAACAACGCGTTGGTACCACCGTAACAGGCATTAAGCGTGTCAATACCTTCGACGTCAGTGTTTTCACCAAACAATTGCATCAAGACAGACTTGACAGACTTGGACTTGTCAATCAGAGTTTCAGTACCGACTTCTAATCTACCAATTTTGTTGGTGTCGATGTTGTAACTCTTGATCAACTTAGACAAAACAGTTAGGGACATCGAGTAGATATCTTCTCTGTCATTGACAAAAGACATGTTGGTTTGGCCCAGACCAATTGTGTATTTACCTTGAGAAACGCCATCAAATTTCTCTAGCTCAGATTGGTTGACACATTGAGTTGGGATGTAAATTTGGATACCTTTAATACCGACATTTTGAGGTCTGGTTTTTTGTTCAGCGGTCTTTTGTTTTTTTAGTTCAGTCATTTGCAAGTTTGTATTGTGTAATTGTTGTTGCTTTTGCGGCCTAAGTCTTCCTTTAATACCACACCAACAAAGTTTAGTTGAGAGTTTCATTTTATGTGATGATTGATTGATTGATTGTACAGTTTGTTTTTCTTAATATCTATTTCGATGACTTCTATATGATATTGCACTAACAAGAAGATATTATAATGCAATTGATACAAGACAAGGAGTTATTTGCTTCTCTTTTATATGATTCTGACAATCCATATTGCGTTGGTAGTCTTTTTTGCTGGAACGGTTCAGCGGAAAAGACGCATCGCTCTTTTTGCTTCTAGAAGAAATGCCAGCAAAAGAATCTCTTGACAGTGACTGACAGCAAAAATGTCTTTTTCTAACTAGTAACAAGGCTAAGATATCAGCCTGAAATAAAGGGTGGTGAAGTAATAATTAAATCATCCGTATAAACCTATACACATATATGAGGAAAAATAATACAAAAGTGTTTTAAATACAGATACATACATGAACATATGCACGTATAGCGCCCAAATGTCGGTAATGGGATCGGCTTACTAATTATAAAATGCATCATAGAAATCGTTGAAGTTGACGCAGCGACTCGAGATCCATAGGAGCAACTCATGTCTGAACTTCAACGATTTCTATGATGCATTTTATAATTAGTAAGCCGATCCCATTACCGACATTTGGGCGCTATACGTGCATATGTTCATGTATGTATCTGTATTTAAAACACTTTTGTATTATTTTTCCTCATATATGTGTATAGGTTTATACGGATGATTTAATTATTACTTCACCACCCTTTATTTCAGGCTGATATCTTAGCCTTGTTACTAGTTAGAAAAAGACATTTTTGCTGTCAGTCACTGTCAAGAGATTCTTTTGCTGGCATTTCTTCTAGAAGCAAAAAGAGCGATGCGTCTTTTCCGCTGAACCGTTCCAGCAAAAAAGACTACCAACGCAATATGGATTGTCAGAATCATATAAAAGAGAAGCAAATAACTCCTTGTCTTGTATCAATTGCATTATAATATCTTCTTGTTAGTGCAATATCATATAGAAGTCATCGAAATAGATATTAAGAAAAACAAACTGTACAATCAATCAATCAATCATCACATAAAATGGCTGCAGACCAATTGGTGAAGACTGAAGTCACCAAGAAGTCTTTTACTGCTCCTGTACAAAAGGCTTCTACACCAGTTTTAACCAATAAAACAGTCATTTCTGGATCGAAAGTCAAAAGTTTATCATCTGCGCAATCGAGCTCATCAGGACCTTCATCATCTAGTGAGGAAGATGATTCCCGCGATATTGAAAGCTTGGATAAGAAAATACGTCCTTTAGAAGAATTAGAAGCATTATTAAGTAGTGGAAATACAAAACAATTGAAGAACAAAGAGGTCGCTGCCTTGGTTATTCACGGTAAGTTACCTTTGTACGCTTTGGAGAAAAAATTAGGTGATACTACGAGAGCGGTTGCGGTACGTAGGAAGGCTCTTTCAATTTTGGCAGAAGCTCCTGTATTAGCATCTGATCGTTTACCATATAAAAATTATGACTACGACCGCGTATTTGGCGCTTGTTGTGAAAATGTTATAGGTTACATGCCTTTGCCCGTTGGTGTTATAGGCCCCTTGGTTATCGATGGTACATCTTATCATATACCAATGGCAACTACAGAGGGTTGTTTGGTAGCTTCTGCCATGCGTGGCTGTAAGGCAATCAATGCTGGCGGTGGTGCAACAACTGTTTTAACTAAGGATGGTATGACAAGAGGCCCAGTAGTCCGTTTCCCAACTTTGAAAAGATCTGGTGCCTGTAAGATATGGTTAGACTCAGAAGAGGGACAAAACGCAATTAAAAAAGCTTTTAACTCTACATCAAGATTTGCACGTCTGCAACATATTCAAACTTGTCTAGCAGGAGATTTACTCTTCATGAGATTTAGAACAACTACTGGTGACGCAATGGGTATGAATATGATTTCTAAGGGTGTCGAATACTCATTAAAGCAAATGGTAGAAGAGTATGGCTGGGAAGATATGGAGGTTGTCTCCGTTTCTGGTAACTACTGTACCGACAAAAAACCAGCTGCCATCAACTGGATCGAAGGTCGTGGTAAGAGTGTCGTCGCAGAAGCTACTATTCCTGGTGATGTTGTCAGAAAAGTGTTAAAAAGTGATGTTTCCGCATTGGTTGAGTTGAACATTGCTAAGAATTTGGTTGGATCTGCAATGGCTGGGTCTGTTGGTGGATTTAACGCACATGCAGCTAATTTAGTGACAGCTGTTTTCTTGGCATTAGGACAAGATCCTGCACAAAATGTCGAAAGTTCCAACTGTATAACATTGATGAAAGAAGTGGACGGTGATTTGAGAATTTCCGTATCCATGCCATCCATCGAAGTAGGTACCATCGGTGGTGGTACTGTTCTAGAACCACAAGGTGCCATGTTGGACTTATTAGGTGTAAGAGGCCCACATGCTACCGCTCCTGGTACCAACGCACGTCAATTAGCAAGAATAGTTGCCTGTGCCGTCTTGGCAGGTGAATTATCCTTATGTGCTGCCCTAGCAGCCGGCCATTTGGTTCAAAGTCATATGACCCACAACAGGAAACCTGCTGAACCAACAAAACCTAACAATTTGGACGCCACTGATATAAATCGTTTGAAAGATGGGTCCGTCACCTGCATTAAATCCTAAACTTAGTCATACGTCATTGGTATTCTCTTGAAAAAGAAGCACAACAGCACCATGTGTTACGTAAAATATTTACTTTATAGTTTGTACGTCATAATTTCTTCCATATTACAAGTTCGTGCATATATAGAAAGAATTCTGTTGTTGTAATTGTCATAACTCCCGGGAAGCTTTTCAATTCATCTTTTTTTTTTTTGTTCTTTTTTTTGATTCCGGTTTCTTTGAAATTTTTTTGATTCGGTAATCTCCGAGCAGAAGGAAGAACGAAGGAAGGAGCACAGACTTAGATTGGTATATATACGCATATGTGGTGTTGAAGAAACATGAAATTGCCCAGTATTCTTAACCCAACTGCACAGAACAAAAACCTGCAGGAAACGAAGATAAATCATGTCGAAAGCTACATATAAGGAACGTGCTGCTACTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCCAAGCTATTTAATATCATGCACGAAAAGCAAACAAACTTGTGTGCTTCATTGGATGTTCGTACCACCAAGGAATTACTGGAGTTAGTTGAAGCATTAGGTCCCAAAATTTGTTTACTAAAAACACATGTGGATATCTTGACTGATTTTTCCATGGAGGGCACAGTTAAGCCGCTAAAGGCATTATCCGCCAAGTACAATTTTTTACTCTTCGAAGACAGAAAATTTGCTGACATTGGTAATACAGTCAAATTGCAGTACTCTGCGGGTGTATACAGAATAGCAGAATGGGCAGACATTACGAATGCACACGGTGTGGTGGGCCCAGGTATTGTTAGCGGTTTGAAGCAGGCGGCGGAAGAAGTAACAAAGGAACCTAGAGGCCTTTTGATGTTAGCAGAATTGTCATGCAAGGGCTCCCTAGCTACTGGAGAATATACTAAGGGTACTGTTGACATTGCGAAGAGCGACAAAGATTTTGTTATCGGCTTTATTGCTCAAAGAGACATGGGTGGAAGAGATGAAGGTTACGATTGGTTGATTATGACACCCGGTGTGGGTTTAGATGACAAGGGAGACGCATTGGGTCAACAGTATAGAACCGTGGATGATGTGGTCTCTACAGGATCTGACATTATTATTGTTGGGTTTAAAC
SEQIDNO：50
pAM489序列(不包括载体骨架)
GTTTAAACTACTATTAGCTGAATTGCCACTGCTATCGTTGTTAGTGGCGTTAGTGCTTGCATTCAAAGACATGGAGGGCGTTATTACGCCGGAGCTCCTCGACAGCAGATCTGATGACTGGTCAATATATTTTTGCATTGAGGCTCTGTTTGGAATTATATTTTGAGATGACCCATCTAATGTACTGGTATCACCAGATTTCATGTCGTTTTTTAAAGCGGCTGCTTGAGTCTTAGCAATAGCGTCACCATCTGGTGAATCCTTTGAAGGAACCACTGACGAAGGTTTGGACAGTGACGAAGAGGATCTTTCCTGCTTTGAATTAGTCGCGCTGGGAGCAGATGACGAGTTGGTGGAGCTGGGGGCAGGATTGCTGGCCGTCGTGGGTCCTGAATGGGTCCTTGGCTGGTCCATCTCTATTCTGAAAACGGAAGAGGAGTAGGGAATATTACTGGCTGAAAATAAGTCTTGAATGAACGTATACGCGTATATTTCTACCAATCTCTCAACACTGAGTAATGGTAGTTATAAGAAAGAGACCGAGTTAGGGACAGTTAGAGGCGGTGGAGATATTCCTTATGGCATGTCTGGCGATGATAAAACTTTTCAAACGGCAGCCCCGATCTAAAAGAGCTGACACCCGGGAGTTATGACAATTACAACAACAGAATTCTTTCTATATATGCACGAACTTGTAATATGGAAGAAATTATGACGTACAAACTATAAAGTAAATATTTTACGTAACACATGGTGCTGTTGTGCTTCTTTTTCAAGAGAATACCAATGACGTATGACTAAGTTTAGGATTTAATGCAGGTGACGGACCCATCTTTCAAACGATTTATATCAGTGGCGTCCAAATTGTTAGGTTTTGTTGGTTCAGCAGGTTTCCTGTTGTGGGTCATATGACTTTGAACCAAATGGCCGGCTGCTAGGGCAGCACATAAGGATAATTCACCTGCCAAGACGGCACAGGCAACTATTCTTGCTAATTGACGTGCGTTGGTACCAGGAGCGGTAGCATGTGGGCCTCTTACACCTAATAAGTCCAACATGGCACCTTGTGGTTCTAGAACAGTACCACCACCGATGGTACCTACTTCGATGGATGGCATGGATACGGAAATTCTCAAATCACCGTCCACTTCTTTCATCAATGTTATACAGTTGGAACTTTCGACATTTTGTGCAGGATCTTGTCCTAATGCCAAGAAAACAGCTGTCACTAAATTAGCTGCATGTGCGTTAAATCCACCAACAGACCCAGCCATTGCAGATCCAACCAAATTCTTAGCAATGTTCAACTCAACCAATGCGGAAACATCACTTTTTAACACTTTTCTGACAACATCACCAGGAATAGTAGCTTCTGCGACGACACTCTTACCACGACCTTCGATCCAGTTGATGGCAGCTGGTTTTTTGTCGGTACAGTAGTTACCAGAAACGGAGACAACCTCCATATCTTCCCAGCCATACTCTTCTACCATTTGCTTTAATGAGTATTCGACACCCTTAGAAATCATATTCATACCCATTGCGTCACCAGTAGTTGTTCTAAATCTCATGAAGAGTAAATCTCCTGCTAGACAAGTTTGAATATGTTGCAGACGTGCAAATCTTGATGTAGAGTTAAAAGCTTTTTTAATTGCGTTTTGTCCCTCTTCTGAGTCTAACCATATCTTACAGGCACCAGATCTTTTCAAAGTTGGGAAACGGACTACTGGGCCTCTTGTCATACCATCCTTAGTTAAAACAGTTGTTGCACCACCGCCAGCATTGATTGCCTTACAGCCACGCATGGCAGAAGCTACCAAACAACCCTCTGTAGTTGCCATTGGTATATGATAAGATGTACCATCGATAACCAAGGGGCCTATAACACCAACGGGCAAAGGCATGTAACCTATAACATTTTCACAACAAGCGCCAAATACGCGGTCGTAGTCATAATTTTTATATGGTAAACGATCAGATGCTAATACAGGAGCTTCTGCCAAAATTGAAAGAGCCTTCCTACGTACCGCAACCGCTCTCGTAGTATCACCTAATTTTTTCTCCAAAGCGTACAAAGGTAACTTACCGTGAATAACCAAGGCAGCGACCTCTTTGTTCTTCAATTGTTTTGTATTTCCACTACTTAATAATGCTTCTAATTCTTCTAAAGGACGTATTTTCTTATCCAAGCTTTCAATATCGCGGGAATCATCTTCCTCACTAGATGATGAAGGTCCTGATGAGCTCGATTGCGCAGATGATAAACTTTTGACTTTCGATCCAGAAATGACTGTTTTATTGGTTAAAACTGGTGTAGAAGCCTTTTGTACAGGAGCAGTAAAAGACTTCTTGGTGACTTCAGTCTTCACCAATTGGTCTGCAGCCATTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAGAGGTATATTAACAATTTTTTGTTGATACTTTTATGACATTTGAATAAGAAGTAATACAAACCGAAAATGTTGAAAGTATTAGTTAAAGTGGTTATGCAGCTTTTGCATTTATATATCTGTTAATAGATCAAAAATCATCGCTTCGCTGATTAATTACCCCAGAAATAAGGCTAAAAAACTAATCGCATTATTATCCTATGGTTGTTAATTTGATTCGTTGATTTGAAGGTTTGTGGGGCCAGGTTACTGCCAATTTTTCCTCTTCATAACCATAAAAGCTAGTATTGTAGAATCTTTATTGTTCGGAGCAGTGCGGCGCGAGGCACATCTGCGTTTCAGGAACGCGACCGGTGAAGACCAGGACGCACGGAGGAGAGTCTTCCGTCGGAGGGCTGTCGCCCGCTCGGCGGCTTCTAATCCGTACTTCAATATAGCAATGAGCAGTTAAGCGTATTACTGAAAGTTCCAAAGAGAAGGTTTTTTTAGGCTAAGATAATGGGGCTCTTTACATTTCCACAACATATAAGTAAGATTAGATATGGATATGTATATGGTGGTATTGCCATGTAATATGATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCAAAAAAAAAGTAAGAATTTTTGAAAATTCAATATAAATGGCTTCAGAAAAAGAAATTAGGAGAGAGAGATTCTTGAACGTTTTCCCTAAATTAGTAGAGGAATTGAACGCATCGCTTTTGGCTTACGGTATGCCTAAGGAAGCATGTGACTGGTATGCCCACTCATTGAACTACAACACTCCAGGCGGTAAGCTAAATAGAGGTTTGTCCGTTGTGGACACGTATGCTATTCTCTCCAACAAGACCGTTGAACAATTGGGGCAAGAAGAATACGAAAAGGTTGCCATTCTAGGTTGGTGCATTGAGTTGTTGCAGGCTTACTTCTTGGTCGCCGATGATATGATGGACAAGTCCATTACCAGAAGAGGCCAACCATGTTGGTACAAGGTTCCTGAAGTTGGGGAAATTGCCATCAATGACGCATTCATGTTAGAGGCTGCTATCTACAAGCTTTTGAAATCTCACTTCAGAAACGAAAAATACTACATAGATATCACCGAATTGTTCCATGAGGTCACCTTCCAAACCGAATTGGGCCAATTGATGGACTTAATCACTGCACCTGAAGACAAAGTCGACTTGAGTAAGTTCTCCCTAAAGAAGCACTCCTTCATAGTTACTTTCAAGACTGCTTACTATTCTTTCTACTTGCCTGTCGCATTGGCCATGTACGTTGCCGGTATCACGGATGAAAAGGATTTGAAACAAGCCAGAGATGTCTTGATTCCATTGGGTGAATACTTCCAAATTCAAGATGACTACTTAGACTGCTTCGGTACCCCAGAACAGATCGGTAAGATCGGTACAGATATCCAAGATAACAAATGTTCTTGGGTAATCAACAAGGCATTGGAACTTGCTTCCGCAGAACAAAGAAAGACTTTAGACGAAAATTACGGTAAGAAGGACTCAGTCGCAGAAGCCAAATGCAAAAAGATTTTCAATGACTTGAAAATTGAACAGCTATACCACGAATATGAAGAGTCTATTGCCAAGGATTTGAAGGCCAAAATTTCTCAGGTCGATGAGTCTCGTGGCTTCAAAGCTGATGTCTTAACTGCGTTCTTGAACAAAGTTTACAAGAGAAGCAAATAGAACTAACGCTAATCGATAAAACATTAGATTTCAAACTAGATAAGGACCATGTATAAGAACTATATACTTCCAATATAATATAGTATAAGCTTTAAGATAGTATCTCTCGATCTACCGTTCCACGTGACTAGTCCAAGGATTTTTTTTAACCCGGGATATATGTGTACTTTGCAGTTATGACGCCAGATGGCAGTAGTGGAAGATATTCTTTATTGAAAAATAGCTTGTCACCTTACGTACAATCTTGATCCGGAGCTTTTCTTTTTTTGCCGATTAAGAATTCGGTCGAAAAAAGAAAAGGAGAGGGCCAAGAGGGAGGGCATTGGTGACTATTGAGCACGTGAGTATACGTGATTAAGCACACAAAGGCAGCTTGGAGTATGTCTGTTATTAATTTCACAGGTAGTTCTGGTCCATTGGTGAAAGTTTGCGGCTTGCAGAGCACAGAGGCCGCAGAATGTGCTCTAGATTCCGATGCTGACTTGCTGGGTATTATATGTGTGCCCAATAGAAAGAGAACAATTGACCCGGTTATTGCAAGGAAAATTTCAAGTCTTGTAAAAGCATATAAAAATAGTTCAGGCACTCCGAAATACTTGGTTGGCGTGTTTCGTAATCAACCTAAGGAGGATGTTTTGGCTCTGGTCAATGATTACGGCATTGATATCGTCCAACTGCATGGAGATGAGTCGTGGCAAGAATACCAAGAGTTCCTCGGTTTGCCAGTTATTAAAAGACTCGTATTTCCAAAAGACTGCAACATACTACTCAGTGCAGCTTCACAGAAACCTCATTCGTTTATTCCCTTGTTTGATTCAGAAGCAGGTGGGACAGGTGAACTTTTGGATTGGAACTCGATTTCTGACTGGGTTGGAAGGCAAGAGAGCCCCGAAAGCTTACATTTTATGTTAGCTGGTGGACTGACGCCGTTTAAAC
SEQIDNO：51
pAM497序列(不包括载体骨架)
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Claims (48)

1.生物有机化合物的生产系统，包含：
a.容量至少100升的容器；
b.该容器内形成第一相的水性培养基；
c.水性培养基内的大量宿主细胞，所述宿主细胞能够制造至少一种生物有机化合物；和，
d.与第一相接触的液体有机第二相，所述第二相包含所述至少一种生物有机化合物。
2.如权利要求2的系统，其中所述至少一种生物有机化合物是C5生物有机化合物。
3.如权利要求2的系统，其中所述至少一种生物有机化合物是C10生物有机化合物。
4.如权利要求2的系统，其中所述至少一种生物有机化合物是C15生物有机化合物。
5.如权利要求2的系统，其中所述至少一种生物有机化合物是C20生物有机化合物。
6.如权利要求2的系统，其中所述至少一种生物有机化合物是C20+生物有机化合物。
7.如权利要求1的系统，其中所述至少一种生物有机化合物是类异戊二烯化合物。
8.如权利要求1的系统，其中所述容器的容量是至少1000升。
9.如权利要求1的系统，其中所述容器的容量是至少10,000升。
10.如权利要求1的系统，其中所述容器的容量是至少50,000升。
11.如权利要求1的系统，其中所述容器的容量是至少100,000升。
12.如权利要求1的系统，其中所述容器的容量是至少500,000升。
13.如权利要求1的系统，其中所述容器的容量是至少1,000,000升。
14.如权利要求1的系统，其中所述有机第二相包含所述生物有机化合物。
15.如权利要求1的系统，其中所述有机第二相包含至少90％的生物有机化合物。
16.制造C5-C20类异戊二烯化合物的系统，包含：
a.容量至少100升的容器；
b.该容器内组成第一相的水性培养基；
c.水性培养基内的大量宿主细胞，所述宿主细胞能够从碳水化合物碳源中制造至少一种类异戊二烯；和，
d.与第一相接触的液体有机第二相，包含所述至少一种类异戊二烯。
17.权利要求16中的系统，其中所述类异戊二烯化合物是半萜。
18.权利要求16中的系统，其中所述类异戊二烯化合物是单萜。
19.权利要求16中的系统，其中所述类异戊二烯化合物是倍半萜。
20.权利要求16中的系统，其中所述类异戊二烯化合物是二萜。
21.生产生物有机化合物的方法，包含：
a.在水性培养基中培养大量宿主细胞，所述宿主细胞产生至少一种生物有机化合物，其中该水性培养基和宿主细胞组成第一相；
b.形成与第一相接触的液体有机第二相，所述第二相包含所述至少一种生物有机化合物；
c.从第一相中分离第二相的至少一部分；和，
d.从第二相中分离所述至少一种生物有机化合物。
22.权利要求21的方法，其中所述有机第二相是诱导形成的。
23.权利要求21的方法，其中所述有机第二相通过从第一相中移出第二相来分离。
24.如权利要求21的方法，其中所述至少一种生物有机化合物是C5生物有机化合物。
25.如权利要求21的方法，其中所述至少一种生物有机化合物是C10生物有机化合物。
26.如权利要求21的方法，其中所述至少一种生物有机化合物是C15生物有机化合物。
27.如权利要求21的方法，其中所述至少一种生物有机化合物是C20生物有机化合物。
28.如权利要求21的方法，其中所述至少一种生物有机化合物是C20+生物有机化合物。
29.权利要求21的方法，其中所述分离步骤包含吸附。
30.权利要求21的方法，其中所述分离步骤包含蒸馏。
31.权利要求21的方法，其中所述分离步骤包含气-液萃取。
32.权利要求21的方法，其中所述分离步骤包含液-液萃取。
33.权利要求21的方法，其中所述分离步骤包含超滤。
34.权利要求21的方法，其中所述至少一种生物有机化合物是类异戊二烯化合物。
35.生产C5-C20类异戊二烯化合物的方法，包含：
a.在水性培养基中培养大量宿主细胞，所述宿主细胞在容量至少100升的容器中从碳水化合物碳源中生产至少一种C5-C20类异戊二烯化合物；
b.形成包含所述至少一种C5-C20类异戊二烯化合物的有机相；
c.从水性培养基中分离所述有机相的至少一部分；和，
d.从所述有机相中分离所述至少一种C5-C20类异戊二烯化合物。
36.权利要求35的方法，其中所述至少一种类异戊二烯化合物是半萜。
37.权利要求35的方法，其中所述至少一种类异戊二烯化合物是单萜。
38.权利要求35的方法，其中所述至少一种类异戊二烯化合物是倍半萜。
39.权利要求35的方法，其中所述至少一种类异戊二烯化合物是二萜。
40.权利要求35的方法，其中所述有机相是诱导形成的。
41.权利要求35的方法，其中所述有机相通过从水相中移出有机相来分离。
42.权利要求35的方法，其中所述分离步骤包含吸附。
43.权利要求35的方法，其中所述分离步骤包含蒸馏。
44.权利要求35的方法，其中所述分离步骤包含气-液萃取。
45.权利要求35的方法，其中所述分离步骤包含液-液萃取。
46.权利要求35的方法，其中所述分离步骤包含超滤。
47.燃料组合物生产系统，包含：
a.一个或多个发酵系统，包含：
i)至少一个容量至少100升的容器；
ii)在所述至少一个容器内组成第一相的水性培养基；
iii)水性培养基内的大量宿主细胞，所述宿主细胞能够制造、生产或者合成至少一种生物有机化合物；和，
iv)与第一相接触的液体有机第二相，其包含所述至少一种生物有机化合物；
b.一个或多个第一相分离系统，从而将第一相与第二有机相或者第二有机相的一种或多种组分分离；
c.可选择地一个或多个第二相分离系统，从而从第二有机相中分离所述至少一种生物有机化合物；
d.可选择地一个或多个反应器或容器，其中所述至少一种生物有机化合物被化学地或生物地修饰；
e.可选择地一个或多个纯化系统，从而纯化或者进一步纯化所述生物有机化合物或者修饰的生物有机化合物；
f.可选择地一个或多个混合容器或者系统，用于混合所述至少一种生物有机化合物和一种或多种附加的燃料组分；和
g.可选择地一个或多个进一步纯化的系统，从而纯化或者进一步纯化所述至少一种生物有机化合物和所述一种或多种附加的燃料组分的混合物。
48.制造燃料组合物的方法，包含：
a.在水性培养基中培养大量宿主细胞，所述宿主细胞生产、制造或者合成至少一种生物有机化合物，其中所述水性培养基组成第一相；
b.形成与第一相接触的液体有机第二相，其包括所述至少一种生物有机化合物；
c.从第一相中分离第二相的至少一部分；
d.从第二相中分离所述至少一种生物有机化合物；
e.可选择地化学地或生物地修饰所述至少一种生物有机化合物；
f.可选择地纯化所述生物有机化合物或者修饰的生物有机化合物；
g.可选择地混合所述至少一种生物有机化合物和一种或多种附加的燃料组分；和
h.可选择地纯化所述一种或多种生物有机化合物和所述一种或多种附加的燃料组分的混合物。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108034575A (zh) * 2018-01-25 2018-05-15 吉林冠界生物技术有限公司 微泡通气装置及系统

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8609385B2 (en) 2007-05-01 2013-12-17 Zuvachem, Inc. Methods for the direct conversion of carbon dioxide into a hydrocarbon using a metabolically engineered photosynthetic microorganism
US8106247B2 (en) 2008-05-02 2012-01-31 Amyris, Inc. Jet fuel compositions and methods of making and using same
JP5624986B2 (ja) 2008-09-04 2014-11-12 アムイリス，インコーポレイテッド ポリファルネセンを含む接着剤組成物
ES2400542T3 (es) * 2008-09-17 2013-04-10 Amyris, Inc. Composiciones de combustible para motores a reacción
ES2908334T3 (es) * 2008-12-15 2022-04-28 Delft Advanced Biofuels B V Procedimiento para la producción biológica continua de lípidos, hidrocarburos o mezclas de los mismos
DK2414311T3 (en) 2009-04-02 2017-09-18 Amyris Inc PROCEDURES FOR STABILIZATION AND HYDROGENATION OF OLEFINES OF MICROBIAL ORIGIN
WO2010115074A1 (en) 2009-04-02 2010-10-07 Amyris Biotechnologies, Inc. Purification methods for bio-organic compounds
CN101597620B (zh) * 2009-05-07 2011-07-27 芬美意香料(中国)有限公司 利用pts基因和RNA干扰ads基因提高青蒿广藿香醇含量的方法
US8636402B2 (en) 2009-05-20 2014-01-28 Xyleco, Inc. Processing biomass
WO2010135365A2 (en) * 2009-05-20 2010-11-25 Xyleco, Inc. Processing biomass
US8986965B2 (en) 2010-03-31 2015-03-24 Codexis, Inc. Production of monoterpenes
ES2442184T3 (es) 2010-08-02 2014-02-10 Amyris, Inc. Copolímeros de injerto de polifarnesenos con polímeros de condensación
US20120040396A1 (en) 2010-08-16 2012-02-16 Amyris, Inc. Methods for purifying bio-organic compounds
WO2012103156A1 (en) 2011-01-25 2012-08-02 Amyris, Inc. Surfactants
BR112013026416B1 (pt) 2011-04-13 2021-11-09 Amyris, Inc Óleos de base e métodos para produção destes
WO2012158250A1 (en) 2011-05-13 2012-11-22 Amyris, Inc. Plasticizers
EP2748084B1 (en) 2011-08-24 2019-06-12 APG Polytech, LLC Articles containing oxygen-scavenging materials
WO2013028307A1 (en) 2011-08-24 2013-02-28 Amyris, Inc. Derivatives of hydrocarbon terpenes
US9663440B2 (en) 2013-04-09 2017-05-30 Materia, Inc. Cross metathesis of poly-branched poly-olefins
CA2958996A1 (en) 2013-08-22 2015-02-26 Kiverdi, Inc. Microorganisms for biosynthesis of limonene on gaseous substrates
SI3110930T1 (sl) 2014-02-28 2020-07-31 Delft Advanced Biofuels B.V. Postopek za ponovno pridobivanje lipidov ali ogljikovodikov
CN106456471A (zh) 2014-05-02 2017-02-22 爱美瑞公司 基于二氢法呢烯的溶剂组合物
CA2950992A1 (en) * 2014-06-13 2015-12-17 Deinove Method of producing terpenes or terpenoids
CN108138167B (zh) 2015-09-25 2022-05-17 味之素株式会社 芳樟醇的制造方法
JP6750630B2 (ja) * 2015-09-25 2020-09-02 味の素株式会社 リナロール組成物の製造方法
US11085046B2 (en) 2015-10-29 2021-08-10 Amyris, Inc. Compositions and methods for production of myrcene
CN109689857A (zh) * 2016-10-28 2019-04-26 积水化学工业株式会社 重组细胞、以及异戊二烯或萜的生产方法
US11261450B2 (en) * 2017-02-27 2022-03-01 Sekisui Chemical Co., Ltd. Recombinant cell, method for producing recombinant cell, and method for producing isoprene or terpene
US20180359149A1 (en) * 2017-06-08 2018-12-13 Sharp Laboratories Of America, Inc. Systems and methods for adding and modifying signaling radio bearers and data radio bearers that include numerology (sub-carrier spacing) information
CA3084263A1 (en) 2017-12-07 2019-06-13 Zymergen Inc. Engineered biosynthetic pathways for production of (6e)-8-hydroxygeraniol by fermentation
CA3086490A1 (en) 2017-12-21 2019-06-27 Zymergen Inc. Nepetalactol oxidoreductases, nepetalactol synthases, and microbes capable of producing nepetalactone
EP3744851A4 (en) * 2018-01-22 2021-11-10 Ajinomoto Co., Inc. TARGET COMPONENT EXTRACTION METHOD, EXTRACTION DEVICE, MANUFACTURING METHOD, AND MANUFACTURING DEVICE
US20210395664A1 (en) * 2018-09-21 2021-12-23 Cytiva Sweden Ab Perfusion Bioprocessing System and Method of Operating the Same
CN110964678B (zh) * 2018-09-29 2022-11-11 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种合成法尼烯的基因工程菌及其构建方法与应用
CN111500431A (zh) * 2019-04-28 2020-08-07 四川图拉香实业有限公司 一种可回调发酵温度的香椿发酵机
WO2020264400A2 (en) * 2019-06-26 2020-12-30 Zymergen Inc. Compositions and methods for synthesis of terpenoids
EP3766982A1 (en) 2019-07-18 2021-01-20 Delft Advanced Biofuels B.V. Integrated system for biocatalytically producing and recovering an organic substance
FR3113068A1 (fr) 2020-07-31 2022-02-04 Suez Groupe Procede de production d’un sirop de sucres a partir d’une biomasse lignocellulosique residuaire
EP4198062A1 (en) 2021-12-14 2023-06-21 Henkel AG & Co. KGaA Polythiol compounds and process for preparation thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4865973A (en) * 1985-09-13 1989-09-12 Queen's University At Kingston Process for extractive fermentation
US5763237A (en) * 1996-05-21 1998-06-09 Board Of Trustees Operating Michigan State University Method for production of monoterpene derivatives of limonene
CN1630718A (zh) * 2001-06-06 2005-06-22 Dsmip资产公司 改进的类异戊二烯生产

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2945059A (en) 1958-03-31 1960-07-12 Merck & Co Inc Mevalonic acid
DE3138493A1 (de) * 1981-09-28 1983-04-07 Rolf 6902 Sandhausen Beiderbeck Ein verfahren zur gewinnung lipophiler stoffwechselprodukte aus suspensionskulturen lebender pflanzenzellen
CA1280705C (en) * 1985-09-13 1991-02-26 Finn Kollerup Solvents and process for extractive fermentation
CH677791A5 (en) * 1989-04-13 1991-06-28 Firmenich & Cie Prepn. of omega-hydroxy-(or carboxy)-2-methyl-allyl terpene(s) - by bacteria of fungus fermentation in presence of cpds. contg. terminal isoprenyl gp.
US5510247A (en) * 1993-03-29 1996-04-23 University Of Pittsburgh Centrifugal multiphase systems and method for using the same
DE19821009A1 (de) 1998-05-11 1999-11-18 Siegfried Peter Verfahren zur Extraktion von Carotinen aus Fetten und Ölen biologischen Ursprungs
GB9901902D0 (en) 1999-01-28 1999-03-17 New Royal Holloway & Bedford Manipulating isoprenoid expression
US6576449B2 (en) 2001-03-12 2003-06-10 Bechtel Bwxt Idaho, Llc Microbial production of epoxides
WO2004092344A2 (en) 2003-04-14 2004-10-28 E. I. Du Pont De Nemours And Company A method for preparing para-hydroxystyrene by biocatalytic decarboxylation of para-hydroxycinnamic acid in a biphasic reaction medium
US7927794B2 (en) 2003-09-29 2011-04-19 The Regents Of The University Of California Methods for identifying a biosynthetic pathway gene product
DE102004006825A1 (de) * 2004-02-11 2005-09-01 Maxens Gmbh Verfahren zur Herstellung von aromaaktiven Terpenen
WO2006085899A2 (en) * 2004-05-21 2006-08-17 The Regents Of The University Of California Method for enhancing production of isoprenoid compounds
BRPI0513837B1 (pt) * 2004-07-27 2021-10-13 The Regents Of The University Of California Célula hospedeira saccharomyces cerevisiae geneticamente modificada; composição compreendendo a mesma e método para aumentar a produção de isoprenoides
EP1789567A2 (en) 2004-09-01 2007-05-30 Agrotechnology and Food Innovations B.V. Enhanced substrate conversion efficiency of fermentation processes
JP2006109784A (ja) * 2004-10-15 2006-04-27 Mitsubishi Gas Chem Co Inc パクリタキセルの製造方法
DE102005018256B3 (de) * 2005-04-20 2006-08-31 Dechema Gesellschaft Für Chemische Technik Und Biotechnologie E.V. Verfahren zur fermentativen Herstellung von Duft- und/oder Aromastoffen
CN101384719B (zh) 2006-02-14 2012-10-03 弗门尼舍有限公司 用于生成萜的方法和用于该方法的mep转化后的微生物

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4865973A (en) * 1985-09-13 1989-09-12 Queen's University At Kingston Process for extractive fermentation
US5763237A (en) * 1996-05-21 1998-06-09 Board Of Trustees Operating Michigan State University Method for production of monoterpene derivatives of limonene
CN1630718A (zh) * 2001-06-06 2005-06-22 Dsmip资产公司 改进的类异戊二烯生产

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108034575A (zh) * 2018-01-25 2018-05-15 吉林冠界生物技术有限公司 微泡通气装置及系统
CN108034575B (zh) * 2018-01-25 2024-02-06 吉林冠界生物技术有限公司 微泡通气装置及系统

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DK2021486T3 (en) 2014-12-15
MX293430B (es) 2011-12-09
KR101420889B1 (ko) 2014-07-17

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US10106822B2 (en) Production of isoprenoids
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