WO2019142832A1

WO2019142832A1 - 目的成分の抽出方法、抽出装置、製造方法及び製造装置

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Publication number: WO2019142832A1
Application number: PCT/JP2019/001140
Authority: WO
Inventors: 賢日置; 亜弓中島; 暢久新田
Original assignee: 味の素株式会社
Priority date: 2018-01-22
Filing date: 2019-01-16
Publication date: 2019-07-25
Also published as: US20200339940A1; EP3744851A4; EP3744851A1; JPWO2019142832A1; JP7392473B2; JP2023153878A

Abstract

合流部、流通部及び送出部を有する流路を用いて、微生物及び目的成分を含む第一液から、目的成分が移行可能であって且つ第一液と相分離可能な第二液へと、目的成分を抽出する抽出方法であって、抽出方法が、合流部に前記第一液を供給する工程と、合流部に前記第二液を供給する工程と、合流部に供給された第一液及び第二液を第一液の相と第二液の相とが分離した状態流通部に流通させる工程と、流通部を流通した第一液及び第二液を送出部から送出させる工程と、送出部から送出された第一液及び第二液を回収器に回収する工程と、を含む。

Description

目的成分の抽出方法、抽出装置、製造方法及び製造装置

　本発明は、微生物及び目的成分を含む液体からの前記目的成分の抽出方法及び抽出装置に関する。また、本発明は、微生物によって目的成分を製造する製造方法及び製造装置に関する。

　ある目的成分を製造する際、微生物を用いた製造方法が採用されることがある。このような製造方法では、一般に、微生物を含む培養液中で、微生物に目的成分を生成させる。そして、必要に応じて殺菌し、微生物を分離した後で、目的成分を培養液から取り出す。目的成分を培養液から取り出す方法としては、抽出法が用いられることがある。

　他方、非特許文献１～８のような技術は、公知である。

Ｋａｉ　Ｗａｎｇ，　Ｇｕａｎｇｓｈｅｎｇ　Ｌｕｏ　「Ｍｉｃｒｏｆｌｏｗ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ：　Ａ　ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　ｒｅｃｅｎｔ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　（２０１７）　１６９，　ｐ．１８－３３Ｍｅｒｃｅｄｅｓ　Ｃ．　Ｍｏｒａｌｅｓ，　Ｊｅｆｆｒｅｙ　Ｄ．　Ｚａｈｎ　「Ｄｒｏｐｌｅｔ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ－ｂａｓｅｄ　ＤＮＡ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｌｙｓａｔｅｓ　ｖｉａ　ｐｈｅｎｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ」　Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄ　Ｎａｎｏｆｌｕｉｄ　（２０１０）　９，　ｐ．１０４１－１０４９Ｋｉ－Ｈｗａｎ　Ｎａｍ，　Ｗｏｏ－Ｊｉｎ　Ｃｈａｎｇ，　Ｈｙｅｊｉｎ　Ｈｏｎｇ，　Ｓａｎｇ－Ｍｉｎ　Ｌｉｍ，　Ｄｏｎｇ－Ｉｌ　Ｋｉｍ，　Ｙｏｏｎ－Ｍｏ　Ｋｏｏ１　「Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ－Ｆｌｏｗ　Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ　Ｄｅｖｉｃｅ　Ｕｓｉｎｇ　Ａｑｕｅｏｕｓ　Ｔｗｏ－Ｐｈａｓｅ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ」　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ　（２００５）７：３，　ｐ．１８９－１９５Ｍａｓａｔｏｓｈｉ　Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，　Ｓｈｕ　Ｔａｉｒａ，　Ｓｈｏｈｅｉ　Ｙａｍａｍｕｒａ，　Ｙａｓｕｔａｋａ　Ｍｏｒｉｔａ，　Ｎａｏｋｉ　Ｎａｇａｔａｎｉ，　Ｙｕｚｕｒｕ　Ｔａｋａｍｕｒａ，　Ｅｉｉｃｈｉ　Ｔａｍｉｙａ　「Ｃｅｌｌ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｂｙ　ａｎ　ａｑｕｅｏｕｓ　ｔｗｏ－ｐｈａｓｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｉｎ　ａ　ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ　ｄｅｖｉｃｅ」　Ｔｈｅ　Ｒｏｙａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（２００９）　１３４，　ｐ．１９９４－１９９８Ｎａｊｌａ　Ｂｅｎ　Ａｋａｃｈａ，　Ｍｏｈａｍｅｄ　Ｇａｒｇｏｕｒｉ　「Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ａｎｄ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎａｔｕｒａｌ　ａｒｏｍａ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ：　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｍｏｄｅｌｉｎｇ，　ａｎｄ　ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｅｓ」　ｆｏｏｄ　ａｎｄ　ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　（２０１５）　９４，　ｐ．６７５－７０６Ｈｅｎｄｒｉｋ　Ｓｃｈｅｗｅ，　Ｍａｒｃｏ　Ａｎｔｏｎｉｏ　Ｍｉｒａｔａ　ａｎｄ　Ｊｅｎｓ　Ｓｃｈｒａｄｅｒ　「Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄｓ」　Ａｄｖ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｅｎｇ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　（２０１５）　１４８，　ｐ．２５１－２８６Ａｒｊａｎ　Ｓ．　Ｈｅｅｒｅｓ，　Ｃａｒｏｌｉｎａ　Ｓ．Ｆ．　Ｐｉｃｏｎｅ，　Ｌｕｕｋ　Ａ．Ｍ．　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗｉｅｌｅｎ，　Ｒｏｓｉａｎｅ　Ｌ．　Ｃｕｎｈａ，　ａｎｄ　Ｍａｒｉａ　Ｃ．　Ｃｕｅｌｌａｒ　「Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ａｄｖａｎｃｅｄ　ｂｉｏｆｕｅｌｓ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：　ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ　ｅｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ　ｆｏｒ　ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ　ｏｐｅｒａｔｉｏｎ」　Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　Ａｐｒｉｌ　２０１４，　Ｖｏｌ．　３２，　Ｎｏ．　４，　ｐ．２２１－２２９Ｊｏｖａｎ　Ｊｏｖａｎｏｖｉｃ，　Ｅｖｇｅｎｙ　Ｖ．　Ｒｅｂｒｏｖ，　Ｔ．Ａ．（Ｘａｎｄｅｒ）Ｎｉｊｈｕｉｓ，　Ｍ．Ｔ．Ｋｒｅｕｔｚｅｒ，　Ｖｏｌｋｅｒ　Ｈｅｓｓｅｌ，　ａｎｄ　Ｊａａｐ　Ｃ．　Ｓｃｈｏｕｔｅｎ　「Ｌｉｑｕｉｄ－Ｌｉｑｕｉｄ　Ｆｌｏｗ　ｉｎ　ａ　Ｃａｐｉｌｌａｒｙ　Ｍｉｃｒｏｒｅａｃｔｏｒ：　Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ　Ｆｌｏｗ　Ｐａｔｔｅｒｎｓ　ａｎｄ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ」　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　＆　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　２０１２，　５１，　ｐ．１０１５－１０２６

　培養液からの微生物の分離には、大きな手間及び時間を要する。よって、微生物の分離と目的成分の抽出とを別々の工程で行うと、コストが大きくなる傾向がある。そこで、本発明者は、微生物の分離と目的成分の抽出とを同時に行うべく、検討を行った。

　本発明者は、培養液と抽出溶媒とを容器中に入れ、撹拌することで、微生物の分離と目的成分の抽出とを同時に行うことを試みた。しかし、多くの実験においては、撹拌によって懸濁が生じ、微生物の分離を行うことができなかった。また、一部の実験では、撹拌後に容器を静置することで微生物を含む培養液と微生物を含まない抽出液とを分離することができた。しかし、この分離には数分間以上の静置を要し、短時間での実施は達成できなかった。

　本発明は、前記の課題に鑑みて創案されたもので、微生物の分離と目的成分の抽出とを、同時に行うことができる抽出方法及び抽出装置；並びに、微生物の分離と目的成分の抽出とを、同時に行いながら、目的成分を製造できる製造方法及び製造装置；を提供することを目的とする。

　〔１〕　合流部、流通部及び送出部を有する流路を用いて、微生物及び目的成分を含む第一液から、前記目的成分が移行可能であって且つ前記第一液と相分離可能な第二液へと、前記目的成分を抽出する抽出方法であって、
　前記抽出方法が、
　前記合流部に前記第一液を供給する工程と、
　前記合流部に前記第二液を供給する工程と、
　前記合流部に供給された前記第一液及び前記第二液を、前記第一液の相と前記第二液の相とが分離した状態で、前記流通部に流通させる工程と、
　前記流通部を流通した前記第一液及び前記第二液を、前記送出部から送出させる工程と、
　前記送出部から送出された前記第一液及び前記第二液を、回収器に回収する工程と、を含む、抽出方法。
　〔２〕　前記流通部において、前記第一液及び前記第二液が、流通方向において前記第一液の相及び前記第二液の相が交互に並んだスラグ流を形成する、〔１〕に記載の抽出方法。
　〔３〕　前記微生物が、前記目的成分の生成能を有する、〔１〕又は〔２〕に記載の抽出方法。
　〔４〕　前記微生物が、遺伝子組換え微生物である、〔１〕～〔３〕のいずれか一項に記載の抽出方法。
　〔５〕　前記第一液が、前記微生物及び前記目的成分を含む培養液であり、前記第二液が有機溶媒を含む、〔１〕～〔４〕のいずれか一項に記載の抽出方法。
　〔６〕　前記目的成分が、疎水性物質である、〔１〕～〔５〕のいずれか一項に記載の抽出方法。
　〔７〕　前記目的成分が、イソプレノイド化合物又はバニロイド化合物である、〔１〕～〔６〕のいずれか一項に記載の抽出方法。
　〔８〕　前記微生物が、細菌又は酵母である、〔１〕～〔７〕のいずれか一項に記載の抽出方法。
　〔９〕　前記細菌が、コリネバクテリウム属細菌、パントエア属細菌、バシラス属細菌、エシェリヒア属細菌、及びエンテロバクター属細菌からなる群より選ばれる、〔８〕に記載の抽出方法。
　〔１０〕　前記合流部に供給される前記第一液における前記目的成分の濃度が、０．１ｇ／Ｌ以上５００ｇ／Ｌ以下である、〔１〕～〔９〕のいずれか一項に記載の抽出方法。
　〔１１〕　前記合流部に供給される前記第一液の乾燥微生物重量が、０．１ｇ／Ｌ以上５００ｇ／Ｌ以下である、〔１〕～〔１０〕のいずれか一項に記載の抽出方法。
　〔１２〕　前記流通部の内径が、０．２５ｍｍ以上１０．０ｍｍ以下である、〔１〕～〔１１〕のいずれか一項に記載の抽出方法。
　〔１３〕　前記流通部における前記第一液及び前記第二液の温度が、１０℃以上９０℃以下である、〔１〕～〔１２〕のいずれか一項に記載の抽出方法。
　〔１４〕　微生物及び目的成分を含む第一液から、前記目的成分が移行可能であって且つ前記第一液と相分離可能な第二液へと、前記目的成分を抽出するための抽出装置であって、
　前記第一液を供給できる第一供給部と；
　前記第二液を供給できる第二供給部と；
　前記第一液及び前記第二液を供給されることができる合流部、前記合流部に供給された前記第一液及び前記第二液が流通できる流通部、並びに、前記流通部を流通した前記第一液及び前記第二液を送出できる送出部、を有する流路と；
　前記送出部から送出された前記第一液及び前記第二液を回収できる回収器と、を備え；
　前記第一液の相及び前記第二液の相が分離した状態で前記第一液及び前記第二液が前記流通部を流通できる、抽出装置。
　〔１５〕　微生物を含む第一液を収納した第一容器において、前記微生物に目的成分を生成させる工程と、
　前記第一容器から、合流部、流通部及び送出部を有する流路の前記合流部に、前記第一液を供給する工程と、
　前記合流部に、前記目的成分が移行可能であって且つ前記第一液と相分離可能な第二液を供給する工程と、
　前記合流部に供給された前記第一液及び前記第二液を、前記第一液の相と前記第二液の相とが分離した状態で、前記流通部に流通させる工程と、
　前記流通部を流通した前記第一液及び前記第二液を、前記送出部から送出する工程と、
　前記送出部から送出された前記第一液及び前記第二液を、回収器に回収する工程と、を含む、目的成分の製造方法。
　〔１６〕　前記回収器に回収された前記第一液を、前記第一容器に戻す工程を含む、〔１５〕に記載の目的成分の製造方法。
　〔１７〕　前記回収器に回収された前記第二液を、前記合流部に戻す工程を含む、〔１５〕又は〔１６〕に記載の目的成分の製造方法。
　〔１８〕　前記目的成分が、前記微生物による前記目的成分の生成を阻害する性質を有する、〔１５〕～〔１７〕のいずれか一項に記載の目的成分の製造方法。
　〔１９〕　微生物を含む第一液を収納し、前記微生物に目的成分を生成させることができる第一容器と、
　前記第一容器に収納された前記第一液を供給できる第一供給部と、
　前記目的成分が移行可能であって且つ前記第一液と相分離可能な第二液を供給できる第二供給部と、
　前記第一液及び前記第二液を供給されることができる合流部、前記合流部に供給された前記第一液及び前記第二液が流通できる流通部、並びに、前記流通部を流通した前記第一液及び前記第二液を送出できる送出部、を有する流路と；
　前記送出部から送出された前記第一液及び前記第二液を回収できる回収器と、を備え；
　前記第一液の相及び前記第二液の相が分離した状態で前記第一液及び前記第二液が前記流通部を流通できる、目的成分の製造装置。
　〔２０〕　前記回収器に回収された前記第一液を、前記第一容器に戻すことができる第一循環部を備える、〔１９〕記載の目的成分の製造装置。

　本発明によれば、微生物の分離と目的成分の抽出とを、同時に行うことができる抽出方法及び抽出装置；並びに、微生物の分離と目的成分の抽出とを、同時に行いながら、目的成分を製造できる製造方法及び製造装置；を提供できる。

図１は、本発明の第一実施形態に係る抽出装置を模式的に示す概要図である。図２は、本発明の第一実施形態において用いる抽出管の断面を模式的に示す断面図である。図３は、第一液及び第二液によって形成されるスラグ流の一例を示すため、流通部を模式的に示す断面図である。図４は、本発明の第二実施形態に係る製造装置を模式的に示す概要図である。図５は、本発明の実施例５９で第一液及び第二液を回収した直後の回収器を撮影した写真を示す。図６は、本発明の実施例６５で第一液及び第二液を回収した直後の回収器を撮影した写真を示す。図７は、本発明の実施例７３で第一液及び第二液を回収した直後の回収器を撮影した写真を示す。図８は、比較例４において撹拌を終えた直後の時点でのチューブ容器を撮影した写真を示す。図９は、比較例４において撹拌後２０分の時点でのチューブ容器を撮影した写真を示す。図１０は、比較例４において撹拌後１時間の時点でのチューブ容器を撮影した写真を示す。図１１は、比較例４において撹拌後２４時間の時点でのチューブ容器を撮影した写真を示す。図１２は、比較例５において撹拌後６０時間の時点でのチューブ容器を撮影した写真を示す。図１３は、本発明の実施例７４で測定されたミリスチン酸イソプロピル中のリナロール濃度を示すグラフである。図１４は、本発明の実施例７４及び比較例１３における、培養液に含まれるリナロールと、ミリスチン酸イソプロピルに含まれるリナロールとの合計生成量を示すグラフである。図１５は、本発明の実施例７４及び比較例１３における、培養開始後２４．５時間の時点での培養液中の有機酸濃度を示すグラフである。図１６は、本発明の実施例７５で測定されたミリスチン酸イソプロピル中のリナロール濃度を示すグラフである。図１７は、本発明の実施例７５及び比較例１４～１６における、培養液中のリナロール濃度を示すグラフである。図１８は、本発明の実施例７５及び比較例１４～１６における、培養液に含まれるリナロールと、ミリスチン酸イソプロピルに含まれるリナロールとの合計生成量を示すグラフである。図１９は、本発明の実施例７５及び比較例１４～１６における、培養開始後４３時間の時点での培養液中の有機酸濃度を示すグラフである。

　以下、本発明について実施形態及び例示物を示して詳細に説明する。ただし、本発明は以下に説明する実施形態及び例示物に限定されるものでは無く、本発明の請求の範囲及びその均等の範囲を逸脱しない範囲において任意に変更して実施できる。

［１．第一実施形態］
　本発明の抽出方法では、微生物及び目的成分を含む第一液から、目的成分が移行可能な第二液へと、目的成分を抽出する。また、第二液としては、適切な条件において、第一液と相分離可能な液を用いる。通常、第一液は、第一溶媒を含み、また、第二液は、第二溶媒を含む。そして、第一溶媒と第二溶媒との組み合わせが、適切な条件で相分離できる組み合わせであることにより、第一液と第二液との相分離が可能となる。通常は、第一溶媒として水を用い、第二溶媒として水と相分離可能な有機溶媒を用いることが多いが、第一溶媒と第二溶媒との組み合わせは、これに限定されない。
　以下、図面を示して、抽出方法に係る一実施形態を説明する。

　図１は、本発明の第一実施形態に係る抽出装置１００を模式的に示す概要図である。
　図１に示すように、本発明の第一実施形態に係る抽出装置１００は、第一液１０から第二液２０へと目的成分（図示せず）を抽出するための装置であって、第一容器１１０と、第一供給部１２０と、第二容器１３０と、第二供給部１４０と、内部に流路（図２参照）を有する抽出管１５０と、回収器１６０とを備える。

　第一容器１１０は、抽出管１５０内の流路に供給される第一液１０を収納した容器である。第一容器１１０に収納された第一液１０は、目的成分を抽出される前の原液である。この第一液１０は、微生物、目的成分及び第一溶媒を含む。

　第一容器１１０は、少なくとも１００リットルの容量を有してもよい。一部の実施態様において、容器は、少なくとも１０００リットル、少なくとも１０，０００リットル、少なくとも５０，０００リットル、少なくとも１００，０００リットル、少なくとも２５０，０００リットルの容量を有する。

　微生物の種類は、制限されない。また、微生物は、一種類を単独で用いてもよく、２種類以上を任意に組み合わせて用いてもよい。

　第一容器１１０に収納された第一液１０における微生物の濃度は、特段の制限は無い。好適な範囲を挙げると、この第一液１０の乾燥微生物重量は、通常０．０１ｇ／Ｌ以上、好ましくは０．１ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１ｇ／Ｌ以上、特に好ましくは５ｇ／Ｌ以上であり、通常５００ｇ／Ｌ以下、好ましくは３００ｇ／Ｌ以下、より好ましくは２００ｇ／Ｌ以下である。微生物の濃度が前記下限値以上であることにより、微生物を分離できるという効果を有効に活用できる。また、微生物の濃度が前記上限値以下であることにより、微生物の分離を円滑に行うことができる。

　第一液１０における微生物の濃度は、通常、Ｏ．Ｄ．値によっても表すことができる。例えば、第一容器１１０に収納された第一液１０のＯ．Ｄ．６００ｎｍは、好ましくは０．０２８以上、より好ましくは２．８以上、特に好ましくは２８．３以上であり、好ましくは１４１５以下、より好ましくは８４０以下、特に好ましくは５６０以下である。また、例えば、第一容器１１０に収納された第一液１０のＯ．Ｄ．５６２ｎｍは、好ましくは０．０３以上、より好ましくは３以上、特に好ましくは３０以上であり、好ましくは１５００以下、より好ましくは９００以下、特に好ましくは６００以下である。第一液１０のＯ．Ｄ．値が前記下限値以上であることにより、微生物を分離できるという効果を有効に活用できる。また、微生物の濃度が前記上限値以下であることにより、微生物の分離を円滑に行うことができる。

　Ｏ．Ｄ．６００ｎｍは、測定装置として分光光度計（例えば、日立ハイテクサイエンス社製「ＨＩＴＡＣＨＩ　Ｕ－２９００」）を用いて、測定波長６００ｎｍで測定できる。また、Ｏ．Ｄ．５６２ｎｍは、前記の測定装置を用いて、測定波長５６２ｎｍで測定できる。

　目的成分の種類は、制限されない。また、目的成分は、一種類を単独で用いてもよく、２種類以上を任意に組み合わせて用いてもよい。

　第一容器１１０に収納された第一液１０における目的成分の濃度は、特段の制限は無い。好適な範囲を挙げると、この目的成分の濃度は、通常０．１ｇ／Ｌ以上、好ましくは０．３ｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．５ｇ／Ｌ以上であり、通常５００ｇ／Ｌ以下、好ましくは５０ｇ／Ｌ以下、更に好ましくは３０ｇ／Ｌ以下、特に好ましくは２０ｇ／Ｌ以下である。目的成分の濃度が前記下限値以上であることにより、目的成分の抽出を円滑に行うことができる。また、目的成分の濃度が前記上限値以下であることによっても、目的成分の抽出を円滑に行うことができる。

　第一液１０における目的成分の濃度は、ガスクロマトグラフィー（以下、適宜「ＧＣ」ということがある。）によって測定できる。

　第一溶液１０は、通常、第一溶媒を含む。第一溶媒は、第二溶液２０に含まれる第二溶媒と相分離可能なものが好ましい。また、第一溶媒は、目的成分の溶解度が低いものが好ましい。第一溶媒の種類は、目的成分及び第二溶媒の種類に応じて、適切なものを選択することが好ましい。好適な第一溶媒の例としては、水等の水系溶媒が挙げられる。また、第一溶媒は、１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を任意に組み合わせて用いてもよい。

　第一液１０のｐＨは、適切な範囲に調整してもよい。第一液１０のｐＨを適切に調整することにより、微生物を殺菌したり、微生物を培養したりできる。また、微生物を培養した液によっては、微生物、微生物が生産する界面活性物質、培養時に使用する消泡剤等の成分が界面活性剤のように機能することで、第一液１０と第二液２０との相分離が妨げられることがあり得るが、ｐＨを適切に調整することにより、界面活性剤のような機能を抑制することができる。第一液１０の具体的なｐＨは、通常１．０以上、好ましくは２．０以上、より好ましくは２．５以上であり、通常１０．０以下、好ましくは９．０以下、より好ましくは８．０以下である。

　第一液１０は、微生物の分離と目的成分の抽出とを著しく妨げない範囲であれば、必要に応じて、微生物、目的成分及び第一溶媒以外に任意の成分を含んでいてもよい。

　第一供給部１２０は、第一容器１１０に収納された第一液１０を抽出管１５０内の流路（図２参照）に供給できるように設けられた装置である。本実施形態では、第一供給部１２０が、第一容器１１０及び抽出管１５０に接続された第一供給路としての第一供給管１２１と、この第一供給管１２１に設けられた第一流量調整部としての第一送液ポンプ１２２とを備えた例を示す。この第一供給部１２０は、第一容器１１０に収納された第一液１０を、第一供給管１２１を通して抽出管１５０内の流路へと供給できるように設けられている。また、この第一供給部１２０は、第一供給管１２１を通して供給する第一液１０の流量を、第一送液ポンプ１２２によって調整できるように設けられている。

　第二容器１３０は、抽出管１５０内の流路に供給される第二液２０を収納している容器である。第二容器１３０に収納された第二液２０としては、第一液１０に含まれる目的成分を抽出するために、目的成分が移行可能であって、且つ、第一液１０と相分離可能な液体を用いる。

　第二液２０に目的成分が移行可能である、とは、第一液１０と第二液２０とを抽出管１５０内の流路に流通させた場合に、第一液１０に含まれていた目的成分が第二液２０へと移行できることを意味する。通常は、第二液２０に含まれる第二溶媒に目的成分が溶解されることで、前記の移行が行われる。

　第二液２０が第一液１０と相分離可能である、とは、第一液１０と第二液２０とを抽出管１５０内の流路に流通させた場合に、第一液１０の相と第二液２０の相とが分離できることを意味する。第一液１０の相と第二液の相とが分離できる限り、第一液１０の相に第二溶媒の一部が混入してもよく、第二液２０の相に第一溶媒の一部が混入してもよい。ただし、微生物の分離と目的成分の抽出とを効率良く行うためには、前記のような混入は小さいことが好ましい。

　第二液２０は、通常、第二溶媒を含む。第二溶媒としては、目的成分の溶解度が高いものが好ましい。また、第二溶媒としては、第一液１０に含まれる第一溶媒と相分離可能なものが好ましい。第二溶媒の種類は、第一液１０に含まれる目的成分及び第一溶媒の種類に応じて、適切なものを選択することが好ましい。例えば、第一溶媒が水である場合、好適な第二溶媒としては、水と相分離可能な有機溶媒が挙げられる。

　前記の有機溶媒としては、例えば、メチル－ターシャリー－ブチルエーテル等のエーテル溶媒；ミリスチン酸イソプロピル、酢酸エチル等のエステル溶媒；ケトン溶媒；ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン等の炭化水素溶媒；植物油；などが挙げられる。

　第一溶媒が水である場合について、以下、好ましい第二溶媒の例を挙げる。
　例えば、目的成分がリナロール等のイソプレノイド化合物を含む場合、第二溶媒としては、ミリスチン酸イソプロピル、酢酸エチル、メチル－ターシャリー－ブチルエーテル、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン、植物油等が挙げられる。
　例えば、目的成分がバニリン等の芳香族化合物を含む場合、第二溶媒としては、トルエン、酢酸エチル、ヘキサン、ヘプタン、植物油等が挙げられる。
　また、第二溶媒は、１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を任意に組み合わせて用いてもよい。

　第二液２０は、微生物の分離と目的成分の抽出とを著しく妨げない範囲であれば、必要に応じて、第二溶媒以外に任意の成分を含んでいてもよい。

　第二供給部１４０は、第二容器１３０に収納された第二液２０を抽出管１５０内の流路（図２参照）に供給できるように設けられた装置である。本実施形態では、第二供給部１４０が、第二容器１３０及び抽出管１５０に接続された第二供給路としての第二供給管１４１と、この第二供給管１４１に設けられた第二流量調整部としての第二送液ポンプ１４２とを備えた例を示す。この第二供給部１４０は、第二容器１３０に収納された第二液２０を、第二供給管１４１を通して抽出管１５０内の流路へと供給できるように設けられている。また、この第二供給部１４０は、第二供給管１４１を通して供給する第二液２０の流量を、第二送液ポンプ１４２によって調整できるように設けられている。

　抽出管１５０は、当該抽出管１５０内に流路を有する部材である。本実施形態では、抽出管１５０の上流端部に設けられたＴ字型ミキサー部１５１と、このＴ字型ミキサー部１５１の下流に接続された管部１５２とを備えた抽出管１５０を例に挙げて説明する。

　図２は、本発明の第一実施形態において用いる抽出管１５０の断面を模式的に示す断面図である。
　図２に示すように、抽出管１５０内には、第一液１０及び第二液２０が流通するための流路１７０が形成されている。この流路１７０は、上流から順に、合流部１７１、流通部１７２及び送出部１７３を有する。本実施形態では、抽出管１５０のミキサー部１５１に合流部１７１が形成され、管部１５２に流通部１７２及び送出部１７３が形成された例を示す。

　合流部１７１は、第一供給部１２０から第一液１０を供給されることができるように設けられている。さらに、合流部１７１は、第二供給部１４０から第二液２０を供給されることができるように設けられている。よって、合流部１７１は、当該合流部１７１に供給された第一液１０及び第二液２０が合流して、共通の流通部１７２を流通できるように設けられている。通常、合流部１７１は、当該合流部１７１に供給された第一液１０及び第二液２０が直ぐ流通部１７２を流通できるように、流通部１７２の上流側端部に設けられる。

　流通部１７２は、合流部１７１に供給された第一液１０及び第二液２０が流通できるように、合流部１７１に接続して設けられている。第一液１０及び第二液２０が共通の流通部１７２を流通するので、この流通部１７２を流通する期間に、第一液１０から第二液２０への目的成分の抽出ができる。さらに、この流通部１７２は、第一液１０と第二液２０とが、第一液１０の相及び第二液２０の相が分離した状態で当該流通部１７２を流通できるように設けられている。

　流通部１７２の寸法は、第一液１０の相及び第二液２０の相が分離した状態での流通が可能となるように設定される。中でも、第一液１０の相と第二液２０の相との相界面の流量当たりの広さを大きくして、第一液１０から第二液２０への目的成分の移行を促進する観点では、流通部１７２の断面積は小さいことが好ましい。流通部１７２の断面積とは、流路１７０の流通方向に対して垂直な平面で切った断面積をいう。

　流通部１７２の具体的な断面積は、好ましくは１００ｍｍ^２以下、より好ましくは５０ｍｍ^２以下、更に好ましくは１０ｍｍ^２以下である。流通部１７２の断面積が、前記の上限以下であることにより、適切な条件において第一液１０及び第二液２０にスラグ流を形成させることができる。また、流量当たりの相界面の広さを大きくして、目的成分の抽出率を高めることができる。さらに、流通部１７２の断面積は、好ましくは０．１ｍｍ^２以上、より好ましくは０．５ｍｍ^２以上、更に好ましくは１．０ｍｍ^２以上である。流通部１７２の断面積が、前記の下限値以上であることにより、回収器１６０での第一液１０と第二液２０との分離を速やかに進行させることができる。また、流通部１７２を流通する液量を大きくできるので、目的成分の抽出量を大きくすることができる。

　流通部１７２の断面積は、流通方向において均一でもよく、不均一でもよい。例えば、流通部１７２において第一液１０及び第二液２０がスラグ流を形成する場合、断面積が不均一な流通部１７２では、断面積が変化する部分において、第一液の相（図３の相３０を参照。）同士の合一並びに第二液の相（図３の相４０を参照。）同士の合一を可能にできることがある。

　流通部１７２の内径は、好ましくは０．２５ｍｍ以上、好ましくは１．５ｍｍ以上であり、２．０ｍｍ以上であってもよい。また、流通部１７２の内径は、好ましくは１０．０ｍｍ以下、より好ましくは８．０ｍｍ以下であり、７．０ｍｍ以下であってもよい。流通部１７２の内径が前記の範囲にある場合、微生物の分離と目的成分の抽出とを円滑に行い易い。

　流通部１７２の壁面１７２Ｓの素材は、任意である。例えば、ガラス；ステンレス等の合金；などの無機材料を用いてもよい。また、例えば、樹脂等の有機材料を用いてもよい。具体的な素材は、流通部１７２を流通する第一液１０と第二液２０とが相の分離を生じることができるように、適切な種類の素材を選択して用いることが望ましい。

　流通部１７２の壁面１７２Ｓは、突起及び窪みが無い滑らかな面となっていることが好ましい。これにより、突起又は窪みによる乱流の発生を抑制できる。よって、第一液１０及び第二液２０の流れを安定にできるので、第一液１０の相と第二液２０の相とを分離させた状態を安定して維持することができる。

　送出部１７３は、流通部１７２を流通した第一液１０及び第二液２０を送出できるように設けられた出口であり、流通部１７２の下流側端部に設けられている。

　回収器１６０は、図１に示すように、抽出管１５０の送出部１７３を通って送出された第一液１０及び第二液２０を回収できるように設けられた容器である。本実施形態では、回収器１６０内に抽出管１５０の送出部１７３が設けられた例を示す。

　上述した抽出装置１００を用いることにより、抽出管１５０内の流路１７０を用いて、第一液１０から第二液２０へと目的成分を抽出する抽出方法を行うことができる。この抽出方法は、
　（１）流路１７０の合流部１７１に第一液１０を供給する工程と、
　（２）流路１７０の合流部１７１に第二液２０を供給する工程と、
　（３）合流部１７１に供給された第一液１０及び第二液２０を、第一液１０の相と第二液２０の相とが分離した状態で、流通部１７２に流通させる工程と、
　（４）流通部１７２を流通した第一液１０及び第二液２０を、送出部１７３から送出させる工程と、
　（５）送出部１７３から送出された第一液１０及び第二液２０を、回収器１６０に回収する工程と、
　を含む。

　合流部１７１に第一液１０を供給する工程では、第一供給部１２０によって、第一容器１１０に収納された第一液１０を、抽出管１５０内の流路１７０の合流部１７１に供給する。具体的には、第一送液ポンプ１２２を作動させて、第一容器１１０から第一液１０を取り出す。そして、取り出した第一液１０を、第一供給管１２１を通して、合流部１７１へと供給する。第一送液ポンプ１２２の出力は、通常、流通部１７２における第一液１０の線速、流通量、流通時間を所望の範囲に収められるように調整される。

　合流部１７１に第二液２０を供給する工程では、第二供給部１４０によって、第二容器１３０に収納された第二液２０を、抽出管１５０内の流路１７０の合流部１７１に供給する。具体的には、第二送液ポンプ１４２を作動させて、第二容器１３０から第二液２０を取り出す。そして、取り出した第二液２０を、第二供給管１４１を通して、合流部１７１へと供給する。第二送液ポンプ１４２の出力は、通常、流通部１７２における第二液２０の線速、流通量、流通時間を所望の範囲に収められるように調整される。

　合流部１７１に第一液１０及び第二液２０が供給されると、これらの第一液１０及び第二液２０は、合流する。合流した後、第一液１０及び第二液２０を、流通部１７２に流通させる工程が行われる。この工程では、第一液１０と第二液２０とを、懸濁させず、第一液１０の相と第二液２０の相とが分離した状態で、流通部１７２に流通させる。この流通の際、第一液１０の相と第二液２０の相との界面を通して、目的成分が第一液１０から第二液２０へと移行する。また、第一液１０に含まれる微生物は、第一液１０の相と第二液２０の相との界面を通ることができないので、第一液１０の相に留められる。よって、第二液２０の相は、微生物の取り込みを抑制しながら、目的成分を選択的に取り込むことができる。このように微生物の分離と目的成分の抽出とを同時に進行させられるので、流通部１７２を通る流通によって、第二溶媒及び目的成分を含む抽出液として第二液２０を得ることができる。

　回収器１６０に回収された後に第一液１０の相と第二液２０の相との分離を円滑に行うため、通常は、送出部１７３から送出される時点において、第一液１０の相と第二液２０の相とが分離していることが求められる。よって、流通部１７２の流通方向の全体において、第一液１０の相と第二液２０の相とが分離していることが望ましい。ここで、流通部１７２の流通方向の全体とは、流路１７０における合流部１７１から送出部１７３までの範囲をいう。

　第一液１０の相と第二液２０の相とが分離した状態での第一液１０及び第二液２０が形成する流れとしては、例えば、層流、環状流、スラグ流などが挙げられる。これらの流れのタイプは、ある実施形態においては、流通部１７２の長さＬ、並びに、第一液１０のウェーバー数と第二液２０のウェーバー数との関係によって決定されうる。前記のウェーバー数Ｗｅとは、式「Ｗｅ＝ｄ×Ｄ×Ｖ^２／σ」で表される無次元数である。前記の式において、「ｄ」は液体の密度を表し、「Ｄ」は流通部１７２の内径を表し、「Ｖ」は液体の線速を表し、「σ」は液体の表面張力を表す。第一液１０の相と第二液２０の相とが分離した状態であれば、第一液１０の相から第二液２０の相への目的成分の移行が可能であるので、具体的な流れのタイプは、任意である。中でも、第一液１０から第二液２０への目的成分の移行を促進する観点では、スラグ流が好ましい。

　図３は、第一液１０及び第二液２０によって形成されるスラグ流の一例を示すため、流通部１７２を模式的に示す断面図である。
　図３に示すように、スラグ流とは、矢印Ａ１で示す流通方向において第一液の相３０と第二液の相４０とが交互に並んだ流れを表す。スラグ流では、これらの相３０及び相４０が、それぞれ流通部１７２を栓のように塞ぐ程度に大きく形成されることで、第一液の相３０と第二液の相４０とが交互に並ぶことができる。

　スラグ流が形成されている場合、第一液の相３０では、通常、矢印Ａ１０で示すように循環流が生じる。また、第二液の相４０では、通常、矢印Ａ２０で示すように循環流が生じる。スラグ流においては、これらの循環流の作用により、第一液の相３０から第二液の相４０への目的成分の移行を効率的に行うことが可能である。

　流通部１７２を流通する途中で、第一液１０の複数の相３０同士が、合一してもよい。また、流通部１７２を流通する途中で、第二液２０の複数の相４０同士が、合一してもよい。例えば、流通部１７２に、当該拡径部の上流よりも大きい断面積を有する適切な拡径部（図示せず。）が形成されている場合、この拡径部において前記の合一を生じさせることができる。

　流通部１７２を流通する第一液１０及び第二液２０の流通条件は、第一液の相３０と第二液の相４０とが分離したスラグ流等の状態が得られる範囲で、設定できる。具体的な条件は、第一液１０の組成、第二液２０の組成、流通部１７２の壁面１７２Ｓの素材、流通部１７２の寸法等の要素に応じて、適切に設定することが望ましい。

　一般的には、第一液１０から第二液２０への目的成分の移行を促進して高い抽出率を達成する観点では、第一液１０及び第二液２０の線速は速いことが好ましい。ここで、線速とは、流通方向への単位時間当たりの移動距離を表す。また、同じく高い抽出率を達成する観点では、第一液１０及び第二液２０の流通時間は長いことが好ましい。ここで、流通時間とは、流通部１７２の流通開始から流通終了までにかかる時間を表す。ただし、第一液１０と第二液２０との組み合わせが、相の分離が解消され易い組み合わせである場合、線速及び流通時間の上限は適切に設定することが望ましい。上限を適切に設定することにより、第一液１０と第二液２０との乳化等による中間相の発生を、効果的に抑制できる。よって、回収器１６０で抽出液として得られる第二液２０の量を多くできるので、分離性を高めることができる。

　流通部１７２における第一液１０及び第二液２０の具体的な線速は、通常１ｍｍ／秒以上、好ましくは５ｍｍ／秒以上、より好ましくは１０ｍｍ／秒以上である。線速が前記下限値以上であることにより、目的成分の抽出率を効果的に高めることができる。線速の上限は、第一液１０の組成、第二液２０の組成、流通部１７２の壁面１７２Ｓの素材、流通部１７２の寸法等の要素によって異なるが、例えば、２０００ｍｍ／秒以下、１５００ｍｍ／秒以下、１０００ｍｍ／秒以下、６００ｍｍ／秒以下、４００ｍｍ／秒以下、２００ｍｍ／秒以下、１００ｍｍ／秒以下、５０ｍｍ／秒以下、などでありうる。

　流通部１７２における第一液１０及び第二液２０の具体的な流通時間は、通常０．１秒以上、好ましくは０．５秒以上、より好ましくは１秒以上、更に好ましくは２秒以上である。流通時間が前記下限値以上であることにより、目的成分の抽出率を効果的に高めることができる。流通時間の上限は、第一液１０の組成、第二液２０の組成、流通部１７２の壁面１７２Ｓの素材、流通部１７２の寸法等の要素によって異なるが、例えば、１０００秒以下、５００秒以下、３００秒以下、２００秒以下、１５０秒以下、１００秒以下、５０秒以下、などでありうる。

　ある実施形態において、安定したスラグ流を形成する観点では、パラメータ「（Ｌ／Ｓ）×Ｖ」は、好ましくは１．３×１０^６（ｓ^－１）以下、より好ましくは１．２×１０^６（ｓ^－１）以下である。ここで、Ｓは、流通部１７２の断面積を表し、Ｌは、流通部１７２の長さを表し、Ｖは、流通部１７２における第一液１０及び第二液２０の線速を表す。

　流通部１７２を流通する第一液１０の量と第二液２０の量とは、同じでもよく、異なっていてもよい。よって、流通部１７２へ供給される第一液１０の単位時間当たりの量と、流通部１７２へ供給される第二液２０の単位時間当たりの量とは、同じでもよく、異なっていてもよい。

　スラグ流が形成されている場合、流通部１７２における各第一液の相３０の長さＬ_３０は、通常１ｍｍ以上、好ましくは２ｍｍ以上、より好ましくは３ｍｍ以上である。第一液の相３０の長さＬ_３０が前記下限値以上であることにより、回収器１６０での第一液１０と第二液２０との分離を速やかに進行させることができる。また、第一液の相３０の長さＬ_３０の上限は、通常５ｃｍ以下、好ましくは２ｃｍ以下、より好ましくは１ｃｍ以下である。第一液の相３０の長さＬ_３０が前記上限値以下であることにより、第一液１０から第二液２０への目的成分の移行を促進できる。

　スラグ流が形成されている場合、流通部１７２における各第二液の相４０の長さＬ_４０は、第一液の相３０の長さＬ_３０の範囲として上述したのと同じ範囲に収まることが好ましい。これにより、第一液の相３０の長さＬ_３０に関して説明したのと同じ利点を得ることができる。

　流通部１７２における第一液１０及び第二液２０の温度は、限定されない。第一液１０から第二液２０への目的成分の移行速度を速めて速やかな抽出を達成する観点では、第一液１０及び第二液２０の温度は、好ましくは１０℃以上、より好ましくは２０℃以上、更に好ましくは３０℃以上、特に好ましくは４０℃以上である。また、微生物のより安定した分離を達成する観点では、第一液１０及び第二液２０の温度は、好ましくは９０℃以下、より好ましくは８０℃以下、更に好ましくは７０℃以下、中でも好ましくは６０℃以下、特に好ましくは５０℃以下である。

　第一液１０及び第二液２０が流路１７０の流通部１７２を流通した後で、それら流通部１７２を流通した第一液１０及び第二液２０を送出部１７３から送出させる工程を行う。第一液１０の相と第二液２０の相とが分離した状態で流通部１７２を流通するので、通常、送出部１７３を通って送出される際にも、第一液１０の相と第二液２０の相は分離している。

　その後、送出部１７３から送出された第一液１０及び第二液２０を、図１に示すように、回収器１６０に回収する工程を行う。共通の回収器１６０に回収された第一液１０と第二液２０とは、速やかに相分離を生じる。よって、回収器１６０内には、第一溶媒及び微生物を含む第一液１０の相と、第二溶媒及び目的成分を含む抽出液としての第二液２０の相とが得られる。相分離を生じているので、第二液２０の相を取り出すことは容易である。

　前記の回収器１６０内において、第一液１０の相には、第二溶媒が含まれることがあり得る。このように第一液１０の相に第二溶媒が含まれると、その分だけ第二液２０の相の量が少なくなり、抽出液として得られる第二液２０の量が少なくなりうる。よって、上述した抽出方法では、第一液１０の相に第二溶媒が混入し難い条件を採用することが好ましい。

　前記の抽出方法での抽出率は、通常１０％以上、好ましくは１５％以上、より好ましくは２０％以上、更に好ましくは４０％以上、特に好ましくは６０％以上である。抽出率は、下記の方法によって測定できる。
　回収器１６０に回収された第二液２０における目的成分の濃度を測定する。この濃度の測定は、ガスクロマトグラフィーによって行うことができる。この濃度に、回収器１６０に回収された第二液２０の量を掛け算して、目的成分の抽出量を得る。この抽出量を、抽出前の第一液に含まれていた目的成分の量で割算して、抽出率が求められる。

　以上のように、本実施形態に係る抽出方法によれば、微生物の分離と目的成分の抽出とを同時に行って、目的成分を含み且つ微生物を含まない第二液２０を抽出液として得ることができる。この抽出方法によれば、抽出工程の前に第一液１０から微生物を分離する工程を別途行う必要が、無い。よって、本実施形態に係る抽出方法は、短時間での実施が可能である。また、本実施形態に係る抽出方法は、微生物の分離と目的成分の抽出とを同時に行えるので、工程数を減らして操作を簡便にすることができる。

　さらに、本実施形態に係る抽出方法では、第一液１０及び第二液２０が流路１７０の流通部１７２を流通する短時間で、目的成分の抽出及び微生物の分離を行うことができる。第一液１０及び第二液２０が流通部１７２を流通する時間は、抽出のために第一液１０と第二液２０とが接触する抽出時間である。上述した実施形態に係る抽出方法では、この抽出時間を、精密にコントロールできる。例えば、流路１７０に供給する第一液１０の流量、流路１７０の流通部１７２の長さ、などの要素を調整することにより、抽出時間を精密にコントロールできる。

　上述した実施形態に係る抽出方法は、変更して実施してもよい。
　例えば、上述した抽出装置１００に、回収器１６０に回収された第一液１０を第一容器１１０へと戻すことができる第一循環部（図示せず）を設けてもよい。これにより、回収器１６０に回収された第一液１０を第一容器１１０へ戻して、再び目的成分の抽出に用いることができる。よって、抽出率を高めて、抽出できずに第一液１０に残る目的成分を減らすことができる。

　例えば、上述した抽出装置１００に、回収器１６０に回収された第二液２０を第二容器１３０へと戻すことができる第二循環部（図示せず）を設けてもよい。これにより、回収器１６０に回収された第二液２０を第二容器１３０へ戻して、再び目的成分の抽出に用いることができる。よって、抽出に用いる第二液２０の量を少なくできる。

［２．第二実施形態］
　上述した抽出方法は、微生物を用いた目的成分の製造方法に適用することができる。この製造方法では、培養液としての第一液において微生物を培養して目的成分を生成させ、その生成した目的成分を第二液によって抽出して、目的成分を含む抽出液を得る。以下、図面を示して、この目的成分の製造方法に係る一実施形態を説明する。

　図４は、本発明の第二実施形態に係る製造装置２００を模式的に示す概要図である。図４において、第一実施形態で説明した抽出装置１００と同じ部位には、第一実施形態と同じ符号を付して示す。

　図４に示すように、本発明の第二実施形態に係る製造装置２００は、第一容器１１０と、第一供給部１２０と、第二容器１３０と、第二供給部１４０と、内部に流路１７０（図２参照）を有する抽出管１５０と、回収器１６０と、第一循環部２８０と、第二循環部２９０と備える。

　第一容器１１０、第一供給部１２０、第二容器１３０、第二供給部１４０、抽出管１５０、回収器１６０、及び、抽出管１５０内の流路１７０は、第一実施形態で説明したものと同じである。

　ただし、第一容器１１０は、当該第一容器１１０に収納された第一液１０が含む微生物に目的成分を生成させることができるようにするため、温度、雰囲気等の培養条件を適切な範囲に設定可能に設けられていることが望ましい。培養によって第一容器１１０内の第一液１０の微生物及び目的成分の量は、変化しうる。この場合でも、第一液１０が第一供給部１２０によって流路１７０に供給される時点では、その供給される第一液１０における微生物及び目的成分の濃度は、第一実施形態で説明した範囲に収まることが望ましい。

　第一循環部２８０は、回収器１６０に回収された第一液１０を第一容器１１０に戻すことができるように設けられた装置である。本実施形態では、第一循環部２８０が、回収器１６０及び第一容器１１０に接続された第一循環路としての第一循環管２８１と、この第一循環管２８１に設けられた第一循環量調整部としての第一循環ポンプ２８２とを備えた例を示す。この第一循環部２８０は、回収器１６０に回収された第一液１０を、第一循環管２８１を通して第一容器１１０へと戻すことができるように設けられている。また、この第一循環部２８０は、第一循環管２８１を通して戻される第一液１０の流量を、第一循環ポンプ２８２によって調整できるように設けられている。

　第二循環部２９０は、回収器１６０に回収された第二液２０を第二容器１３０に戻すことができるように設けられた装置である。本実施形態では、第二循環部２９０が、回収器１６０及び第二容器１３０に接続された第二循環路としての第二循環管２９１と、この第二循環管２９１に設けられた第二循環量調整部としての第二循環ポンプ２９２とを備えた例を示す。この第二循環部２９０は、回収器１６０に回収された第二液２０を、第二循環管２９１を通して第二容器１３０へと戻すことができるように設けられている。また、この第二循環部２９０は、第二循環管２９１を通して戻される第二液２０の流量を、第二循環ポンプ２９２によって調整できるように設けられている。

　上述した製造装置２００を用いることにより、微生物の培養によって目的成分を製造する製造方法を行うことができる。この製造方法は、
　（６）第一容器１１０において、微生物に目的成分を生成させる工程と、
　（７）第一容器１１０から、抽出管１５０内の流路１７０の合流部１７１に、第一液１０を供給する工程と、
　（８）合流部１７１に、第二液２０を供給する工程と、
　（９）合流部１７１に供給された第一液１０及び第二液２０を、第一液１０の相と第二液２０の相とが分離した状態で、流通部１７２に流通させる工程と、
　（１０）流通部１７２を流通した第一液１０及び第二液２０を、送出部１７３から送出する工程と、
　（１１）送出部１７３から送出された第一液１０及び第二液２０を、回収器１６０に回収する工程と、
　を含む。

　上述した製造方法では、第一容器１１０に、微生物及び第一溶媒を含む培養液としての第一液１０を収納する。そして、第一容器１１０において、第一液１０に含まれる微生物を培養する。この培養により、微生物に目的成分を生成させる工程が行われて、微生物、目的成分及び第一溶媒を含む第一液１０が用意される。

　その後、第一容器１１０から、流路１７０の合流部１７１に、第一液１０を供給する工程を行う。第一実施形態と同じく、第一液１０は、第一送液ポンプ１２２によって、第一供給管１２１を通して、合流部１７１へと供給される。

　また、第二容器１３０から、流路１７０の合流部１７１に、第二溶媒を含む第二液２０を供給する工程を行う。第一実施形態と同じく、第二液２０は、第二送液ポンプ１４２によって、第二供給管１４１を通じて、合流部１７１へと供給される。

　合流部１７１に第一液１０及び第二液２０が供給されると、これらの第一液１０及び第二液２０は、合流する。そして、合流した第一液１０及び第二液２０に、第一液１０の相と第二液２０の相とが分離した状態で、流通部１７２に流通させる工程が行われる。第一液１０及び第二液２０が流通部１７２を流通する際、第一実施形態と同じく、目的成分は、第一液１０から第二液２０へと移行するが、微生物は、第一液１０の相に留められる。よって、微生物の分離と目的成分の抽出とが同時に進行して、第二溶媒及び目的成分を含む抽出液として第二液２０が得られる。第一液１０及び第二液２０を流通部１７２に流通させる際の流通条件は、第一実施形態と同じに設定することが好ましい。これにより、第一実施形態で説明した利点を得ることができる。

　第一液１０及び第二液２０が流路１７０の流通部１７２を流通した後で、第一実施形態と同じく、それら流通部１７２を流通した第一液１０及び第二液２０を送出部１７３から送出させる工程を行う。

　その後、第一実施形態と同じく、送出部１７３から送出された第一液１０及び第二液２０を、回収器１６０に回収する工程を行う。共通の回収器１６０に回収された第一液１０と第二液２０とは、速やかに、第一溶媒及び微生物を含む第一液１０の相と、第二溶媒及び目的成分を含む第二液２０の相とに分かれる。よって、第二液２０の相から、目的成分を含み且つ微生物を含まない第二液２０を抽出液として得ることができる。
　このように、本実施形態に係る製造方法では、微生物によって目的成分を生成させた後、微生物の分離と目的成分の抽出とを同時に行なうことができるので、目的成分の効率の良い製造が可能である。

　また、上述した製造方法は、必要に応じて、
　（１２）回収器１６０に回収された第一液１０を、第一容器１１０に戻す工程
　を含んでいてもよい。
　本実施形態に示す例では、第一循環ポンプ２８２を作動させて、回収器１６０から第一液１０を取り出す。そして、取り出した第一液１０を、第一循環管２８１を通して、第一容器１１０へと戻す。第一容器１１０に戻された第一液１０は、第一容器１１０において微生物の培養に用いられる。その後、その第一液１０は、第一供給部１２０によって再び流路１７０の合流部１７１に供給される。このような工程を行うことにより、微生物の培養による目的物の生成と、この目的物の抽出とを、継続的に行うことができる。この際、上述した製造方法では、短時間で目的成分の抽出を行うことができるので、培養槽として機能する第一容器１１０の外部に第一液１０が循環する時間を短くできる。したがって、酸素欠乏による微生物への負荷を小さくできる。

　また、前記のように回収器１６０に回収された第一液１０を第一容器１１０に戻す工程を行うと、微生物の培養を継続しながら目的成分の抽出を行う場合に、第一容器１１０に収納された第一液１０における目的成分の濃度を低くすることができる。このように第一液１０における目的成分の濃度を低くできることは、目的成分が、微生物による当該目的成分の生成を阻害する性質を有する場合に、有用である。例えば、目的成分が微生物の培養を阻害する性質を有する場合、第一液１０における目的成分の濃度が育成阻害濃度より高くなると、微生物の培養が停止することがある。これに対し、第一液１０における目的成分の濃度を育成阻害濃度以下に維持することで、目的成分の継続的な製造を可能にできる。

　さらに、上述した製造方法は、必要に応じて、
　（１３）回収器１６０に回収された第二液２０を、第二容器１３０に戻す工程
　を含んでいてもよい。
　本実施形態に示す例では、第二循環ポンプ２９２を作動させて、回収器１６０から第二液２０を取り出す。そして、取り出した第二液２０を、第二循環管２９１を通して、第二容器１３０へと戻す。第二容器１３０に戻された第二液２０は、第二供給部１４０によって再び流路１７０の合流部１７１に供給される。このような工程を行うことにより、回収器１６０に回収された第二液２０を、合流部１７１に戻して、再び目的成分の抽出に用いることができる。よって、抽出に用いる第二液２０の量を少なくできる。また、流路１７０への流通回数が１回で抽出率が低い流通条件であっても、流路１７０への流通回数を２回以上にすることにより、抽出率を高めることが可能である。

　以上のように、本実施形態に係る製造方法では、微生物の培養によって目的成分を生成させた後に、微生物の分離と目的成分の抽出とを、同時に行うことができる。よって、この製造方法では、微生物の分離と目的成分の抽出とを別々の工程で行う必要が無いので、目的成分の回収を短時間で実施することができる。また、工程数を減らすことができるので、装置を小型化することが可能である。

　また、従来のバッチ式の培養方法では、培養が完了した後で、第一液１０の全量に、微生物の分離及び目的成分の抽出の処理を行うことが一般的であった。これに対し、本実施形態に係る製造方法では、第一容器１１０中で微生物の培養を行いながら、第一液１０から目的成分の抽出を行うことが可能である。よって、本実施形態に係る製造方法は、第一液１０の全量に対して一度に処理を行う必要が無い。したがって、本実施形態に係る製造方法によれば、設備の小型化を達成することができる。

　さらに、本実施形態に係る製造方法では、抽出のために流路１７０内で第一液１０と第二液２０とが接触する時間を、精密にコントロールできる。よって、流路１７０内での第一液１０と第二液２０との接触時間を、短い時間に調整できる。また、本実施形態に係る製造方法では、回収器１６０に回収された第一液１０の相と第二液２０の相とは、速やかに分離できる。よって、回収器１６０内での第一液１０と第二液２０との接触時間も、短い時間に調整できる。したがって、第二液２０に含まれる成分が微生物に対して接触する時間を、短くすることが可能である。そのため、微生物に対して有害な種類の溶媒であっても、第二溶媒として使用可能である。よって、本実施形態に係る製造方法では、抽出液の溶媒の選択の幅を広げることが可能である。

　上述した実施形態に係る目的成分の製造方法は、変更して実施してもよい。
　例えば、第一液１０及び第二液２０は、必要に応じて、追加及び抜き出しを行ってもよい。具体例を挙げると、回収器１６０に回収された第二液２０を抜き出し、蒸留等の分離方法によって、第二溶媒と目的成分とを分離してもよい。また、こうして目的成分から分離された第二溶媒を、第二容器１３０に第二液２０として追加してもよい。このような分離によれば、第二溶媒の溶媒再生を行うことが可能である。よって、溶媒を繰り返し使用できるので、溶媒使用量を抑制することができる。

［３．目的成分］
　目的成分の種類は、任意である。ただし、第二実施形態で説明したように微生物の培養による目的成分の製造に適用する観点からは、目的成分は、微生物によって生成可能なものが好ましい。

　さらに、多くの種類の微生物が水を含む培養液で培養されることから、抽出を円滑に行うためには、目的成分は疎水性物質が好ましい。疎水性物質とは、水を含む第一液から第二液への抽出が可能な程度に、水に対して低い溶解度を有する物質をいう。水に対する疎水性物質の常温での溶解度は、好ましくは１０ｇ／ｋｇ以下、より好ましくは５ｇ／ｋｇ以下、１ｇ／ｋｇ以下、又は０．１ｇ／ｋｇ以下である。

　疎水性物質としては、例えば、メタン等の飽和炭化水素；エチレン、プロピレン、ブタジエン、イソブテン、イソプレン等の不飽和炭化水素；ベンズアルデヒド、シンナムアルデヒド、バニリン、オイゲノール、アネトール、トリメチルピラジン等の芳香族化合物；セラミド等の脂質化合物；ノナラクトン、デカラクトン等のラクトン化合物；酢酸イソペンチル、乳酸メンチル、コハク酸モノメンチル等の有機酸エステル化合物；キシリトール、アラビトール等の糖アルコール化合物が挙げられる。

　好ましい実施形態では、疎水性物質は、イソプレノイド化合物であってもよい。イソプレノイド化合物は、分子式（Ｃ_５Ｈ_８）_ｎを有する１以上のイソプレン単位を含む。イソプレン単位の前駆体は、イソペンテニルピロリン酸、またはジメチルアリルピロリン酸である。イソプレノイド化合物は、テルペンまたはテルペノイドとも呼ばれる。テルペンとテルペノイドとの相違は、テルペンが炭化水素であるのに対し、テルペノイドはさらなる官能基を含む点にある。テルペンは、分子中のイソプレン単位数により分類することができる〔例えば、ヘミテルペン（Ｃ５）、モノテルペン（Ｃ１０）、セスキテルペン（Ｃ１５）、ジテルペン（Ｃ２０）、セステルテルペン（Ｃ２５）、トリテルペン（Ｃ３０）、セスカルテルペン（Ｃ３５）、テトラテルペン（Ｃ４０）、ポリテルペン、ノルイソプレノイド〕。モノテルペンまたはモノテルペノイドとしては、例えば、ピネン、ネロール、シトラール、カンファー、メントール、リモネン、およびリナロールが挙げられる。セスキテルペンまたはセスキテルペノイドとしては、例えば、ヌートカトン、バレンセン、ネロリドール、およびファルネソールが挙げられる。ジテルペンまたはジテルペノイドとしては、例えば、フィトール、およびビタミンＡ１が挙げられる。スクアレンはトリテルペンの例であり、カロテン（プロビタミンＡ１）はテトラテルペンである（Ｎａｔｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　２，６７４～６８１（２００６）；Ｎａｔｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　５，２８３～２９１（２００９）；Ｎａｔｕｒｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　３，９３７～９４７（２００５）；Ａｄｖ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｅｎｇ　Ｂｉｏｔｅｃｈｍｏｌ（ＤＯＩ：１０．１００７／１０＿２０１４＿２８８）。

　別の好ましい実施形態では、疎水性物質は、バニロイド化合物であってもよい。バニロイド化合物は、バニリル基を含む化合物である。バニロイド化合物としては、例えば、バニリン、バニリン酸、カプサイシン、バニリルマンデル酸が挙げられる。

［４．微生物］
　微生物の種類は、任意である。ただし、第二実施形態で説明したように微生物の培養による目的成分の製造に適用する観点からは、微生物は、目的成分の生成能を有することが好ましい。

　微生物としては、例えば、原核生物である細菌、および真核生物である真菌（例、出芽酵母、分裂酵母等の酵母）が挙げられる。細菌は、グラム陽性菌であってもグラム陰性菌であってもよい。

　グラム陽性細菌としては、例えば、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属細菌、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌が挙げられ、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌が好ましい。バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が好ましい。コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）が好ましい。

　グラム陰性細菌としては、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属細菌、ビブリオ（Ｖｉｖｒｉｏ）属細菌、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属細菌、およびエンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌が挙げられ、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌が好ましい。エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）が好ましい。パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌としては、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ　ａｎａｎａｔｉｓ）が好ましい。エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌としては、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｇｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）が好ましい。

　真菌としては、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、およびムコール（Ｍｕｃｏｒ）属の微生物が挙げられ、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、およびヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の微生物が好ましい。サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の微生物としては、サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が好ましい。シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の微生物としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）が好ましい。ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属の微生物としては、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ　ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が好ましい。トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の微生物としては、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）が好ましい。

　微生物は、遺伝子組換え微生物であっても、または非遺伝子組換え微生物であってもよいが、多量の目的成分を得るためには、遺伝子組換え微生物が好ましい。このような遺伝子組換え微生物は、目的成分の生成に関与する１以上の遺伝子の改変を有する。このような遺伝子組換え微生物としては、例えば、目的成分の生成に関与する１以上の異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）遺伝子（すなわち、微生物に固有（ｉｎｈｅｒｅｎｔ）でない遺伝子）を含む微生物、目的成分の生成に関与する１以上の同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）遺伝子（すなわち、微生物に固有である遺伝子）の改変（例、ゲノムＤＮＡのコーディング領域または非コーディング領域における１以上のヌクレオチド残基の欠失、置換、付加、挿入）を有する微生物、および目的成分の生成に関与する１以上の異種遺伝子を含み、かつ目的成分の生成に関与する１以上の同種遺伝子の改変を有する微生物が挙げられる。このような微生物の作製は、当該分野において公知の任意の方法により行うことができる。例えば、目的成分の生成に関与する１以上の同種遺伝子を含む微生物の作製は、発現ベクター（例、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、人工染色体）を用いる方法（例、コンピテント細胞法、エレクトロポレーション法）、およびゲノム編集技術（例、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）により行うことができる。発現ベクターが微生物のゲノムＤＮＡと相同組換えを生じる組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターである場合、同種遺伝子および必要なエレメント（例、プロモーター）を含む発現単位は、形質転換により、微生物のゲノムＤＮＡに組み込まれることができる。一方、発現ベクターが微生物のゲノムＤＮＡと相同組換えを生じない非組込み型ベクターである場合、上記発現単位は、形質転換により、微生物のゲノムＤＮＡに組み込まれず、微生物内において、発現ベクターの状態のまま、ゲノムＤＮＡから独立して存在できる。目的成分の生成に関与する１以上の同種遺伝子の改変を有する微生物の作製は、例えば、ゲノム編集技術により行うことができる。

　目的成分がリナノール等のイソプレノイド化合物である場合、微生物は、イソプレノイド化合物の生合成に関与する１以上の酵素をコードする遺伝子を含む遺伝子組換え微生物であることが好ましい。実施例で用いられた遺伝子組換え微生物であるＰａｎｔｏｅａ　ａｎａｎａｔｉｓ　ＳＷＩＴＣＨ―ＰｐｈｏＣΔｇｃｄ／ＡａＬＩＮＳ－ｉｓｐＡ^＊株（Ｐａｔｅｎｔ　ＷＯ２０１７／０５１９２８）は、このような酵素をコードする遺伝子を含む。イソプレノイド化合物の生合成に関与する１以上の酵素としては、例えば、ＭＥＰ経路に関与する１以上の酵素、ＭＶＡ経路に関与する１以上の酵素、イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼ、ゲラニル二リン酸シンターゼ、ファルネシル二リン酸シンターゼ、及び目的イソプレノイド化合物の生合成に関与する１以上の酵素（例、リナロールシンターゼ、イソプレンシンターゼ、リモネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、アモルファジエンシンターゼ、ファルネセンシンターゼ）が挙げられる。ＭＥＰ経路に関与する１以上の酵素としては、例えば、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸リダクトイソメラーゼ、４－ジホスホシチジル－２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトールシンターゼ、４－ジホスホシチジル－２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトールキナーゼ、２－Ｃ－メチル―Ｄ－エリスリトール－２，４－シクロニリン酸シンターゼ、１－ヒドロキシ－２－メチル－２－（Ｅ）－ブテニル－４－ニリン酸シンターゼ、４－ヒドロキシ－３－メチル－２－ブテニル二リン酸レダクターゼが挙げられる（例、Ｋｕｚｕｙａｍａ　ＴおよびＳｅｔｏ　Ｈ，Ｐｒｏｃ　Ｊｐｎ　Ａｃａｄ　Ｓｅｒ　Ｂ　Ｐｈｙｓ　Ｂｉｏｌ　Ｓｃｉ．８８，４１－５２（２０１２）；Ｇｒaｗｅｒｔ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ．６８，３７９７－３８１４（２０１１）を参照）。ＭＶＡ経路に関与する１以上の酵素としては、例えば、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、アセチル－ＣｏＡ－Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ、ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡシンターゼ、ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡリダクターゼ、アセチル－ＣｏＡ－アセチルトランスフェラーゼ／ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡリダクターゼが挙げられる（例、Ｋｕｚｕｙａｍａ　ＴおよびＳｅｔｏ　Ｈ，　Ｐｒｏｃ　Ｊｐｎ　Ａｃａｄ　Ｓｅｒ　Ｂ　Ｐｈｙｓ　Ｂｉｏｌ　Ｓｃｉ．８８，４１－５２（２０１２）；Ｍｉｚｉｏｒｋｏ　ＨＭ，Ａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ．５０５，１３１－１４３（２０１１）を参照）。

　目的成分がバニリン等のバニロイド化合物である場合、微生物は、バニロイド化合物の生合成に関与する１以上の酵素をコードする遺伝子を含む遺伝子組換え微生物であることが好ましい。実施例で用いられた遺伝子組換えコリネバクテリウム・グルタミカムは、このような酵素をコードする遺伝子を含む。バニロイド化合物の生合成に関与する１以上の酵素としては、例えば、芳香族カルボン酸レダクターゼ（ａｒｏｍａｔｉｃ　ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）が挙げられる。

　微生物による目的成分の生成は、適切な培養液中で微生物を培養することで行うことができる。

　培養液は、微生物の増殖、および微生物による目的成分の生成に必要な成分を含む必要がある。したがって、培養液は、炭素源および窒素源を含むことが好ましい。炭素源としては、例えば、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類等の炭水化物；ショ糖を加水分解した転化糖；グリセロール；メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸塩；コーン油、パーム油、大豆油等のオイル；アセテート；動物油脂；動物オイル；飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸等の脂肪酸；脂質；リン脂質；グリセロ脂質；モノグリセライド、ジグリセライド、トリグリセライド等のグリセリン脂肪酸エステル；微生物性タンパク質、植物性タンパク質等のポリペプチド；加水分解されたバイオマス炭素源等の再生可能な炭素源；酵母エキス；又はこれらを組み合わせたものが挙げられる。窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水が挙げられる。培養液はまた、有機微量栄養源として、ビタミンＢ１、Ｌ－ホモセリンなどの要求物質または酵母エキスを適量含んでいてもよい。培養液はさらに、無機微量栄養源として、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオンを適量含んでいてもよい。

　微生物の培養条件としては、標準的な培養条件を用いることができる。培養温度としては、２０℃～４０℃であり得、ｐＨが、約４．５～約９．５であり得る。

　また、微生物の種類に応じて好気性、無酸素性、又は嫌気性条件下で培養を行ってもよい。微生物の培養期間は、適宜設定することができる。

　培養液において微生物を上記のとおり培養することで、微生物および目的成分を含む培養液を第一液として得ることができる。本発明の方法によれば、このような多種多様な成分に加えて、微生物および目的成分を含む培養液から、目的成分を効率的に抽出または製造することができる。また、炭素源および窒素源として疎水性物質を含まない培養液を用いることで、培養液から目的成分をより効率的に抽出または製造することができる。

　以下、実施例を示して、本発明について具体的に説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例には限定されない。また、以下に説明する操作は、別に断らない限り、常温常圧大気中において行った。

［製造例１：リナロールを含む培養液の用意］
　遺伝子組換え微生物であるＰａｎｔｏｅａ　ａｎａｎａｔｉｓ　ＳＷＩＴＣＨ―ＰｐｈｏＣΔｇｃｄ／ＡａＬＩＮＳ－ｉｓｐＡ^＊株（Ｐａｔｅｎｔ　ＷＯ２０１７／０５１９２８）を培養して、リナロールを生成した。培地は表１のものを用いて培養し、３０時間培養を行った。培養温度は培養７時間までは３４℃、それ以降は３０℃とし、アンモニアガスを用いて培養ｐＨを６．８に制御した。３００ｍＬ／分の条件で通気を行い、植菌前の培養開始時の溶存酸素濃度を２１％、飽和亜硫酸ナトリウム溶液中の溶存酸素濃度を０％とし、ガルバニ式センサー（エイブル株式会社）を用いて培養液中の溶存酸素が５％以上になるように撹拌制御を行った。

　Ａ区とＢ区を０．１５Ｌ調整後（ｐＨ無調整）、１２０℃、２０ｍｉｎで加熱滅菌を行った。放冷後Ａ区とＢ区を１：１で混合し、カナマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）を添加し、培地として使用した。

　培養開始後、適宜サンプリングし、Ｏ．Ｄ．値とリナロールの分析を実施した。リナロール濃度はガスクロマトグラフＧＣ－２０２５ＡＦ（株式会社島津製作所製）を用いて測定した。Ｏ．Ｄ．値は分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ　Ｕ－２９００）によって６００ｎｍで測定した。Ｐ．　ａｎａｎａｔｉｓの乾燥微生物重量（ｇ／Ｌ）はＯ．Ｄ．６００ｎｍの値に０．２８７を掛けて求めることが出来る。リナロール標準液は試薬リナロール（和光純薬工業株式会社製）を用いて調製した。測定用のサンプルは適宜エタノール（和光純薬工業株式会社製）で希釈した。

　３０時間培養し、培養を終えた。培養終了時の培養液中リナロール濃度は０．９ｇ／Ｌ、Ｏ．Ｄ．６００ｎｍは２３．５、つまり乾燥微生物重量は６．７４ｇ／Ｌであった。

［製造例２：バニリンを含むｐＨ３．０の殺菌ブロスの用意］
　バニリン酸を含む培養液を用いて、遺伝子組換え微生物である、Ｇｏｒｄｏｎｉａ　ｅｆｆｕｓａ　由来ａｒｏｍａｔｉｃ　ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子を導入したコリネバクテリウムグルタミカムを培養し、バニリン培養液を作成した。培地は表２のものを用いて培養した。

　Ａ区、Ｂ区、Ｃ区を滅菌後、８０．０：５．７：４．５の割合で混合し培地を調整した。ｐＨは７．２。

　Ｃ区の液を適宜フィードし、培養して、バニリンを含む培養液を得た。培養終了時の培養液中のバニリン濃度は９．４ｇ／Ｌ、Ｏ．Ｄ．５６２ｎｍは３．１５であった。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの乾燥微生物重量はＯ．Ｄ．５６２ｎｍに３０．１をかけて求めることが出来る。よってこの時の乾燥微生物重量は９４．９ｇ／Ｌであった。

　前記の培養液のｐＨを、９８％硫酸を用いて３．０に調整し、更に８０℃程度に加温して殺菌して、バニリンを含むｐＨ３．０の殺菌ブロスを得た。得られた殺菌ブロス中のバニリン濃度は９．３ｇ／Ｌ、Ｏ．Ｄ．５６２ｎｍは３１．０、乾燥微生物重量は９３ｇ／Ｌであった。

［製造例３：バニリンを含むｐＨ６．０の殺菌ブロスの用意］
　製造例２で製造した殺菌ブロスのｐＨを、濃度２９％のＮａＯＨ水溶液を用いて６．０に調整して、バニリンを含むｐＨ６．０の殺菌ブロスを得た。得られた殺菌ブロス中のバニリン濃度は９．１ｇ／Ｌ、Ｏ．Ｄ．５６２ｎｍは３．０４、乾燥微生物重量は９１．５ｇ／Ｌであった。

［製造例４：バニリンを含むｐＨ３．０の殺菌ブロスの用意］
　バニリン酸を含む培養液を用いて、遺伝子組換え微生物である、Ｇｏｒｄｏｎｉａ　ｅｆｆｕｓａ　由来ａｒｏｍａｔｉｃ　ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子を導入したコリネバクテリウムグルタミカムを培養し、バニリン培養液を作成した。培地は表３のものを用いて培養した。

　Ａ区、Ｂ区、Ｃ区を滅菌後、８０．８：６．３：４．６の割合で混合し培地を調整した。ｐＨは７．２。

　Ｃ区の液を適宜フィードし、培養して、バニリンを含む培養液を得た。培養終了時の培養液中のバニリン濃度は１０．０ｇ／Ｌ、Ｏ．Ｄ．５６２ｎｍは３．１１であった。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの乾燥微生物重量はＯ．Ｄ．５６２ｎｍに３０．１をかけて求めることが出来る。よってこの時の乾燥微生物重量は９３．８ｇ／Ｌであった。

　前記の培養液のｐＨを、９８％硫酸を用いて３．０に調整し、更に８０℃程度に加温して殺菌して、バニリンを含むｐＨ３．０の殺菌ブロスを得た。得られた殺菌ブロス中のバニリン濃度は９．８ｇ／Ｌ、Ｏ．Ｄ．５６２ｎｍは３．０５、乾燥微生物重量は９２ｇ／Ｌであった。

［製造例５：バニリンを含むｐＨ６．０の殺菌ブロスの用意］
　製造例４で製造した殺菌ブロスのｐＨを、濃度２９％のＮａＯＨ水溶液を用いて６．０に調整して、バニリンを含むｐＨ６．０の殺菌ブロスを得た。得られた殺菌ブロス中のバニリン濃度は９．６ｇ／Ｌ、Ｏ．Ｄ．５６２ｎｍは２．９９、乾燥微生物重量は９０ｇ／Ｌであった。

［実施例１～９］
（流路の用意）
　第一供給口（内径１．５９ｍｍ）、第二供給口（内径１．５９ｍｍ）及び送出口（内径２．１８ｍｍ）を有するＴ字型マイクロミキサを用意した。また、表４に示す長さのステンレス製チューブ（ＳＵＳ３１６製、内径２．１８ｍｍ）を用意した。マイクロミキサの送出口にチューブを接続して、図２に示すように、内部に流路１７０を有する抽出管１５０を用意した。この抽出管１５０内の流路１７０では、Ｔ型マイクロミキサ内の部分が合流部１７１に相当し、チューブ内の部分が流通部１７２に相当する。また、流通部１７２の形状は、一定の内径を有する円柱状であった。

（抽出操作）
　マイクロミキサの第一供給口に、製造例１で製造した培養液を第一液として定量で連続供給した。同時に、マイクロミキサの第二供給口に、ミリスチン酸イソプロピルを第二液として定量で連続供給した。供給された培養液とミリスチン酸イソプロピルは、マイクロミキサ内の合流部で合流し、チューブ内の流通部を流通した後、回収器に流入した。回収器に流入した第一液及び第二液は、第一液の相と第二液の相とに迅速に分離した。このように回収器において迅速な相分離が得られたことから、チューブ内の流通部において第一液の相と第二液の相とが分離していたことが確認された。近い流量を採用した後述する実施例１０～２３でスラグ流が確認されていることから、発明者は、実施例１～９でも、チューブ内の流通部でスラグ流が形成されていると判断した。前記の操作は、流路の温度は常温、実験環境の雰囲気は常圧の環境で行った。

［実施例１０～２３］
（流路の用意）
　第一供給口（内径１．５９ｍｍ）、第二供給口（内径１．５９ｍｍ）及び送出口（内径１．５９ｍｍ）を有するＴ字型マイクロミキサを用意した。また、表４に示す長さのテトラフルオロエチレン・パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体製チューブ（ＰＦＡ製、内径１．５９ｍｍ）を用意した。マイクロミキサの送出口にチューブを接続して、図２に示すように、内部に流路１７０を有する抽出管１５０を用意した。この抽出管１５０内の流路１７０では、Ｔ型マイクロミキサ内の部分が合流部１７１に相当し、チューブ内の部分が流通部１７２に相当する。また、流通部１７２の形状は、一定の内径を有する円柱状であった。

　マイクロミキサの第一供給口に、製造例２で製造したｐＨ３．０の殺菌ブロスを第一液として定量で連続供給した。同時に、マイクロミキサの第二供給口に、トルエンを第二液として定量で連続供給した。供給された殺菌ブロスとトルエンは、マイクロミキサ内の合流部で合流し、チューブ内の流通部を流通した後、回収器に流入した。チューブ内の流通部を第一液及び第二液が流通する様子を目視することで、スラグ流が形成されていることが確認した。回収器に流入した第一液及び第二液は、第一液の相と第二液の相とに迅速に分離した。前記の操作は、流路の温度は常温、実験環境の雰囲気は常圧の環境で行った。

［実施例２４～３８］
（流路の用意）
　第一供給口（内径１．５９ｍｍ）、第二供給口（内径１．５９ｍｍ）及び送出口（内径２．１８ｍｍ）を有するＴ字型マイクロミキサを用意した。また、表４に示す長さのステンレス製チューブ（ＳＵＳ３１６製、内径２．１８ｍｍ）を用意した。マイクロミキサの送出口にチューブを接続して、図２に示すように、内部に流路１７０を有する抽出管１５０を用意した。この抽出管１５０内の流路１７０では、Ｔ型マイクロミキサ内の部分が合流部１７１に相当し、チューブ内の部分が流通部１７２に相当する。また、流通部１７２の形状は、一定の内径を有する円柱状であった。

　マイクロミキサの第一供給口に、製造例３で製造したｐＨ６．０の殺菌ブロスを第一液として定量で連続供給した。同時に、マイクロミキサの第二供給口に、トルエンを第二液として定量で連続供給した。供給された殺菌ブロスとトルエンは、マイクロミキサ内の合流部で合流し、チューブ内の流通部を流通した後、回収器に流入した。回収器に流入した第一液及び第二液は、第一液の相と第二液の相とに迅速に分離した。このように回収器において迅速な相分離が得られたことから、チューブ内の流通部において第一液の相と第二液の相とが分離していたことが確認された。近い流量を採用した前記の実施例１０～２３でスラグ流が確認されていることから、発明者は、実施例２４～３８でも、チューブ内の流通部でスラグ流が形成されていると判断した。前記の操作は、流路の温度は常温、実験環境の雰囲気は常圧の環境で行った。

[実施例３９～７３]
（流路の用意）
　第一供給口（内径６．３５ｍｍ）、第二供給口（内径６．３５ｍｍ）及び送出口（内径６．３５ｍｍ）を有するＴ字型マイクロミキサを用意した。また、表５に示す長さのステンレス製チューブ（ＳＵＳ３１６製、内径６．３５ｍｍ）を用意した。マイクロミキサの送出口にチューブを接続して、図２に示すように、内部に流路１７０を有する抽出管１５０を用意した。この抽出管１５０内の流路１７０では、Ｔ型マイクロミキサ内の部分が合流部１７１に相当し、チューブ内の部分が流通部１７２に相当する。また、流通部１７２の形状は、一定の内径を有する円柱状であった。

　内部を流通する液体を加温可能な加温用配管（ＳＵＳ３１６製、内径２．１８ｍｍ）、および、加温後の配管内液温を直接測定できる測温部を備える給液管を用意した。この給液管を、マイクロミキサの第一供給口及び第二供給口にそれぞれ接続した。さらに、マイクロミキサ、及び、流通部としてのチューブを、チューブの出口付近を除いて全て恒温槽に浸した。そして、マイクロミキサに供給されてから回収器に流入するまでの期間において、第一液及び第二液の液温を表５に示す抽出温度に調整できるように、加温用配管及び恒温槽の温度を設定した。

　前記のように設定された温度条件下において、第一液及び第二液の流通を実施した。すなわち、マイクロミキサの第一供給口に、製造例５で製造したｐＨ６．０の殺菌ブロスを第一液として定量で連続供給した。同時に、マイクロミキサの第二供給口に、トルエンを第二液として定量で連続供給した。供給された殺菌ブロスとトルエンは、マイクロミキサ内の合流部で合流し、チューブ内の流通部を流通した後、回収器に流入した。回収器に流入した第一液及び第二液は、第一液の相と第二液の相とに迅速に分離した。このように回収器において迅速な相分離が得られたことから、チューブ内の流通部において第一液の相と第二液の相とが分離していたことが確認された。近い流量を採用した前記の実施例１０～２３でスラグ流が確認されていることから、発明者は、実施例３９～７３でも、チューブ内の流通部でスラグ流が形成されていると判断した。

［比較例１及び２］
　殺菌ブロス及びトルエンの抽出条件を表６に示すように変更したこと以外は、実施例１０～２３と同じ操作を行った。比較例１及び２では、回収器において第一液と第二液とが相の分離を生じなかった。回収器において相の分離が生じなかったことから、発明者は、比較例１及び２では、チューブ内の流通部において第一液の相と第二液の相との分離が損なわれていたと判断した。

［比較例３］
　殺菌ブロス及びトルエンの抽出条件を表６に示すように変更したこと以外は、実施例２４～３８と同じ操作を行った。比較例３では、回収器において第一液と第二液とが相の分離を生じなかった。回収器において相の分離が生じなかったことから、発明者は、比較例３では、チューブ内の流通部において第一液の相と第二液の相との分離が損なわれていたと判断した。

［比較例４］
　１５ｍＬ容積のポリプロピレン製のチューブ容器に、製造例１で製造したリナロールを含む培養液４ｍＬと、ミリスチン酸イソプロピル４ｍＬとを仕込んで密栓した。その後、手で激しく撹拌した。

［比較例５～８］
　１５ｍＬ容積のポリプロピレン製のチューブ容器に、製造例２で製造したバニリンを含むｐＨ３．０の殺菌ブロス３ｍＬと、表６に示す種類の第二液３ｍＬとを仕込んで密栓した。その後、手で激しく撹拌した。

［比較例９～１２］
　１５ｍＬ容積のポリプロピレン製のチューブ容器に、製造例３で製造したバニリンを含むｐＨ６．０の殺菌ブロス３ｍＬと、表６に示す種類の第二液３ｍＬとを仕込んで密栓した。その後、手で激しく撹拌した。

［実施例１～７３及び比較例１～１２の分離性の評価］
　実施例１～７３及び比較例１～３では、回収器に第一液及び第二液が流入した直後において、第一液（培養液又は殺菌ブロス）と第二液（ミリスチン酸イソプロピル又はトルエン）とがどのように分離するかを目視で観察した。そして、観察の結果を、下記の基準で評価した。
　「５」：第一液の相と第二液の相とが、迅速に分離する（図６参照）。
　「４」：第一液の相と第二液の相とが、迅速に分離する。ただし、第二液の一部が第一液の相に混入した（図７参照）。
　「３」：第一液の相と第二液の相とが、迅速に分離する。ただし、第二液の大部分が第一液の相に混入した（図５参照）。
　「２」：第一液の相と第二液の相とは、時間が経過した後で分離する。
　「１」：第一液の相と第二液の相とに、相分離を生じない。

　また、比較例４～１２では、いずれも、撹拌直後には第一液の相と第二液の相との迅速な分離は観察されなかった。そこで、チューブを静置し、観察を続けた。そして、この観察の結果を、下記の基準で判定した。
　「３’」：容器を数分間静置した後で、第一液の相と第二液の相とが、分離する。ただし、第二液の大部分が第一液の相に混入した。
　「２」：第一液の相と第二液の相とは、時間が経過した後で分離する（図８～図１１参照）。
　「１」：第一液の相と第二液の相とに、相分離を生じない（図１２参照）。

［実施例１～７３及び比較例１～１２の抽出率の測定］
　回収器又はチューブ容器内の第二液を採取し、ガスクロマトグラフィーによって第二液に含まれる目的成分（リナロール又はバニリン）の濃度を測定した。測定された濃度に、第二液の流量を掛け算して、第二液に移った目的成分の量を求め、これを抽出量とした。他方、抽出前の原液（リナロールを含む培養液、バニリンを含むｐＨ３．０の殺菌ブロス、又は、バニリンを含むｐＨ６．０の殺菌ブロス）の目的成分の濃度と流量とを掛け算して、原液に含まれていた目的成分の総量を求めた。そして、この目的成分の総量で抽出量を割算して、抽出率を計算した。

［実施例１～７３及び比較例１～１２の結果］
　実施例１～７３及び比較例１～１２の結果を、下記の表４～表６に示す。抽出率が１５％以上で、かつ、分離性の評価で「３」～「５」の結果が得られている場合に、微生物の分離と目的成分の抽出とを同時に行うという課題が解決できたと判断できる。
　表６において、比較例４～１２はバッチ方式であるので、供給量の欄の値はチューブへの仕込み量［ｍＬ］を表し、流通時間は撹拌時間を表す。また、下記の表において、略称の意味は、下記の通りである。
　ＩＰＭ：ミリスチン酸イソプロピル。
　Ｔｒ：トルエン。
　ＳＵＳ：ステンレス。
　ＰＦＡ：テトラフルオロエチレン・パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体。
　ＰＰ：ポリプロピレン。

　また、図５、図６及び図７に、実施例５９、実施例６５及び実施例７３で第一液及び第二液を回収した直後の回収器を撮影した写真を示す。
　さらに、図８、図９、図１０及び図１１に、比較例４において撹拌を終えた直後の時点、撹拌後２０分の時点、撹拌後１時間の時点、及び、撹拌後２４時間の時点それぞれでのチューブ容器を撮影した写真を示す。
　また、図１２に、比較例５において撹拌後６０時間の時点でのチューブ容器を撮影した写真を示す。
　なお、これらの図５～図１２において、破線は、第一液と第二液との間での混入が全く生じないと仮定した場合の第一液の相と第二液の相との間の界面位置を表す。

　表６から分かるように、比較例４～１２のようなバッチ方式の抽出操作では、撹拌によって第一液及び第二液が懸濁し、乳化することがあった。このように乳化した場合、乳化状態が安定して、静置しても第一液と第二液とが分離しないことが多い。また、分離する場合でも、通常は、長時間の静置が求められる。
　これに対し、表４及び表５から分かるように、実施例１～７３では、流路の流通によって第一液から第二液への目的成分（リナロール及びバニリン）の抽出が達成された。また、実施例１～７３では、回収器に回収された第一液と第二液とが、数秒程度の短時間で相分離を生じた。前記のいずれの実施例でも、相分離によって生じた上澄み相として、第二液の相が得られた。図５～図７から分かるように、この上澄み相中には、微生物は含まれていなかった。
　以上の結果から、バッチ方式の抽出操作では目的成分の抽出及び微生物の分離が難しい系であっても、本発明によれば、目的成分の抽出及び微生物の分離を同時に行うことが可能であることが確認された。

［実施例７４］
　（７４－１．発酵条件）
　Ｐａｎｔｏｅａ　ａｎａｎａｔｉｓ　ＳＷＩＴＣＨ―ＰｐｈｏＣΔｇｃｄ／ＡａＬＩＮＳ－ｉｓｐＡ^＊株（国際公開第２０１７／０５１９２８号）のジャー培養を行った。ジャー培養には１Ｌ容積の発酵槽としてのジャーファーメンター（エイブル株式会社）を使用した。グルコース培地は表７に示す組成になるように調整した。

　前培養としてカナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢプレートに株を塗布し、３４℃にて１６時間培養を実施した。続いて、以下に記載のグルコース培地（表７）３００ｍＬを１Ｌ容積のジャーファーメンターに投入後、充分に増殖したプレート１枚分の菌体を接種し、培養を開始した。培養温度は培養１１時間までは３４℃、それ以降は３０℃とし、アンモニアガスを用いて培養ｐＨを６．８に制御した。３００ｍＬ／分の条件で通気を行い、植菌前の培養開始時の溶存酸素濃度を２１％、飽和亜硫酸ナトリウム溶液中の溶存酸素濃度を０％とし、ガルバニ式センサー（エイブル株式会社）を用いて培養液中の溶存酸素が５％以上になるように撹拌制御を行った。培地中のグルコース濃度が１０－５０ｇ／Ｌの範囲になるよう１．７ｍＬ／ｈｒで表８に示すフィード培地を添加しながら３９．５時間培養を行った。

　Ａ区とＢ区を０．１５Ｌ調整後（ｐＨ無調整）、１２０℃、２０ｍｉｎで加熱滅菌を行った。放冷後Ａ区とＢ区を１：１で混合し、カナマイシン（終濃度１００ｍｇ／Ｌ）を添加した。

　培地１Ｌ調整後（ｐＨ無調整）、１２０℃、２０ｍｉｎで加熱滅菌を行った。

　培養開始後、適宜サンプリングし、リナロールのＧＣ分析を実施した。リナロール標準液は試薬リナロール（和光純薬工業株式会社製）を用いて調製した。測定用のサンプルは適宜エタノール（和光純薬工業株式会社製）で希釈した。

　ＧＣ分析は、ＨＰ－ＩＮＮＯＷＡＸカラムを用いて、注入口温度２５０℃、検出器温度２５０℃、スプリット比１０で実施した。カラムは５０℃から５℃／分で昇温し、２３０℃に到達後４分間保持した。定量は、エタノール１００％でリナロール標準液を調製し、標準液から検量線を作成して、リナロール濃度を求めた。また、各サンプルは標準液の濃度範囲に入るように１００％エタノールで適宜希釈した。

　（７４－２．製造装置の説明）
　図４に示すように、第一容器１１０と、第一供給部１２０と、第二容器１３０と、第二供給部１４０と、内部に流路１７０（図２参照）を有する抽出管１５０と、回収器１６０と、第一循環部２８０と、第二循環部２９０と備える製造装置２００を用意した。
　第一容器１１０としては、ジャーファーメンターを用いた。
　第一供給部１２０は、第一供給管１２１としてのＰＦＡチューブ（内径１．５９ｍｍ）と、第一送液ポンプ１２２としてのプランジャポンプとを用いて、第一容器１１０内の第一液１０を抽出管１５０のＴ字型ミキサ１５１に供給できるように設けた。
　第二容器１３０としては、第二液２０としてミリスチン酸イソプロピルを収納した容器を用いた。
　第二供給部１４０は、第二供給管１４１としてのＰＦＡチューブ（内径１．５９ｍｍ）と、第二送液ポンプ１４２としてのプランジャポンプとを用いて、第二容器１３０内の第二液２０を抽出管１５０のＴ字型ミキサ１５１に供給できるように設けた。
　抽出管１５０は、Ｔ字型ミキサー１５１に、管部１５２としてのＰＦＡチューブ（内径１．５９ｍｍ）を接続した部材を用いた。抽出管１５０内の流路１７０は、図２に示すように、Ｔ字型ミキサー１５１内の部分が合流部１７１に相当し、管部１５２内の部分が流通部１７２に相当する。
　回収器１６０は、管部１５２の出口に、流路１７０から送出される第一液１０及び第二液２０を回収できるように設けた。
　第一循環部２８０は、第一循環管２８１としての配管と、第一循環ポンプ２８２としてのポンプとを用いて、回収器１６０内の第一液１０を第一容器１１０としてのジャーファーメンターに戻せるように設けた。
　第二循環部２９０は、第二循環管２９１としての配管と、第二循環ポンプ２９２としてのポンプとを用いて、回収器１６０内の第二液２０を第二容器１３０に戻せるように設けた。

　（７４－３．リナロールの製造操作）
　上述した発酵条件で、ジャーファーメンター内で、微生物の培養を行った。

　リナロールが生成しはじめる培養開始後１３．５時間の時点からポンプを作動させ、培養開始後２４．５時間の時点までの１１時間、以下に説明する抽出操作を行った。
　ジャーファーメンターから第一液として培養液（ジャーファーメンター内で３０℃）を２．５ｍＬ／ｍｉｎで引き抜き、抽出管のＴ字型ミキサ内の合流部へ供給した。また、同時に、第二容器から第二液としてミリスチン酸イソプロピル（常温）を２．５ｍＬ／ｍｉｎで引き抜き、抽出管のＴ字型ミキサ内の合流部へ供給した。
　培養液及びミリスチン酸イソプロピルは、合流部で合流した後、ＰＦＡチューブ内の流通部をスラグ流を形成して流通した。流通部での培養液及びミリスチン酸イソプロピルの線速は０．０４ｍ／ｓ、流通時間は２４秒であった。また、流通部の温度は特に制御しなかった。
　その後、培養液及びミリスチン酸イソプロピルは、回収器で回収された。回収器内では、培養液が下部に、ミリスチン酸イソプロピルが上部に、迅速に相分離した。回収器では、温度は制御しなかった。
　培養液が循環できるように、回収器の下部から培養液を引き出し、ジャーファーメンターに戻した。また、ミリスチン酸イソプロピルが循環できるように、回収器の上部からミリスチン酸イソプロピルを引き出し、第二容器に戻した。

　前記の抽出操作では、回収器での滞留時間を短くして酸欠を回避するために、回収器からジャーファーメンターに戻す培養液の流量を目視にて常時微調整を実施した。培養液がジャーファーメンター外を循環する時間は、配管容積と流量から試算したところ、４分であった。

　また、前記の抽出操作において、ミリスチン酸イソプロピルの量は２００ｍＬであった。このミリスチン酸イソプロピルは、培養開始後１９時間の時点で新品２００ｍＬと交換し、合計４００ｍＬを使用した。

　（７４－４．評価）
　１．分離性の評価：
　回収器に回収された培養液及びミリスチン酸イソプロピルを目視で観察して、培養液の相とミリスチン酸イソプロピルの相とに迅速に分離するかを調べた。

　２．リナロール抽出量の測定：
　培養液及びミリスチン酸イソプロピルを、それぞれ、経時でサンプリングした。サンプリングした培養液及びミリスチン酸イソプロピルそれぞれのリナロール濃度を、ガスクロマトグラフィーによって測定した。こうして求めた濃度から、培養液及びミリスチン酸イソプロピルそれぞれに含まれるリナロールの量を算出した。

　３．有機酸濃度の測定：
　ジャーファーメンターの外部を循環している期間の酸欠状態が微生物に及ぼす影響を評価するため、抽出操作を終了した時点（培養開始後２４．５時間の時点）での培養液の有機酸濃度を測定した。有機酸濃度は、Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ有機酸分析システム（島津製作所）を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって測定した。微生物が酸欠になっている場合には、微生物の代謝経路に影響を及ぼし、酢酸及び乳酸の蓄積が増加する。

［比較例１３］
　抽出操作を行わなかったこと以外は、実施例７４と同じ操作により、培養によるリナロールの製造を行った。培養期間中、実施例７４と同じ方法により、培養液を経時でサンプリングし、培養液に含まれるリナロールの量を求めた。また、実施例７４と同じ方法により、培養開始後２４．５時間の時点での培養液の有機酸濃度を測定した。

［実施例７４及び比較例１３の結果］
　１．分離性の結果：
　実施例７４においては、微生物を含む培養液の相と、微生物を含まないミリスチン酸イソプロピルの相とが、回収器に回収後の数秒以内に分離した。よって、実施例７４では、微生物とリナロールとを短時間で分離できることが確認できた。

　２．リナロール抽出量の結果：
　実施例７４で測定されたミリスチン酸イソプロピル中のリナロール濃度を、図１３に示す。図１３に示すように、抽出操作の開始後、ミリスチン酸イソプロピルのリナロール濃度の上昇がみられる。よって、実施例７４では、培養液からミリスチン酸イソプロピルへの抽出を行いながら、培養を継続できることが確認できた。

　実施例７４及び比較例１３における、培養液に含まれるリナロールと、ミリスチン酸イソプロピルに含まれるリナロールとの合計生成量を、図１４に示す。図１４に示すように、比較例１３に比較して、実施例７４では、より多くのリナロールが生成している。培養開始後２４．５時間の時点でのリナロールの合計生成量は、実施例７４では０．４ｇ、比較例１３では０．２８ｇであった。また、分析の結果、比較例１３に比べて、実施例７４では、ジャーファーメンター中の培養液のリナロール濃度が抑制できたことが判明している。よって、実施例７４では、リナロールによる生育阻害を回避しながら、微生物にリナロールを生産させることが可能であったことが分かる。

　３．有機酸濃度の結果：
　実施例７４及び比較例１３における、培養開始後２４．５時間の時点での培養液中の有機酸濃度を、図１５に示す。図１５に示すように、実施例７４では、培養液中に酢酸及び乳酸の顕著な蓄積は見られない。よって、実施例７４では、酸欠が生じていないことが示唆された。

［実施例７５］
　（７５－１．発酵条件）
　Ｐａｎｔｏｅａ　ａｎａｎａｔｉｓ　ＳＷＩＴＣＨ―ＰｐｈｏＣΔｇｃｄ／ＡａＬＩＮＳ－ｉｓｐＡ^＊株（国際公開第２０１７／０５１９２８号）を用いてジャー培養を行った。ジャー培養には１Ｌ容積の発酵槽としてのジャーファーメンター（エイブル株式会社）を使用した。グルコース培地は表９に示す組成になるように調整した。

　前培養としてカナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢプレートにイソプレン生成微生物ＳＷＩＴＣＨ―ＰｐｈｏＣΔｇｃｄ／ＡａＬＩＮＳ－ｉｓｐＡ^＊株を塗布し、３４℃にて１６時間培養を実施した。続いて、以下に記載のグルコース培地（表９）３００ｍＬを１Ｌ容積のジャーファーメンターに投入後、充分に増殖したプレート１枚分の菌体を接種し、培養を開始した。培養温度は培養１１時間までは３４℃、それ以降は３０℃とし、アンモニアガスを用いて培養ｐＨを６．８に制御した。３００ｍＬ／分の条件で通気を行い、植菌前の培養開始時の溶存酸素濃度を２１％、飽和亜硫酸ナトリウム溶液中の溶存酸素濃度を０％とし、ガルバニ式センサー（エイブル株式会社）を用いて培養液中の溶存酸素が５％以上になるように撹拌制御を行った。培地中のグルコース濃度が１０－５０ｇ／Ｌの範囲になるよう１．９ｍＬ／ｈｒで表１０に示すフィード培地を添加した。

　Ａ区とＢ区を０．１３５Ｌ調整後（ｐＨ無調整）、１２０℃、２０ｍｉｎで加熱滅菌を行った。放冷後Ａ区とＢ区を１：１で混合し、カナマイシン（終濃度１００ｍｇ／Ｌ）を添加した。実施例７５では、培養開始直前に超純水３０ｍＬ添加し、培地として使用した。

　培養開始後、適宜サンプリングし、Ｏ．Ｄ．値とリナロールのＧＣ分析を実施した。リナロール標準液は試薬リナロール（和光純薬工業株式会社製）を用いて調製した。測定用のサンプルは適宜エタノール（和光純薬工業株式会社製）で希釈した。

　ＧＣ分析、有機酸分析は、実施例７４と同様の方法で実施した。

　（７５－２．製造装置の説明）
　実施例７４と同じ製造装置を使用した。

　（７５－３．リナロールの製造操作）
　上述した発酵条件で、ジャーファーメンター内で、微生物の培養を行った。

　リナロールが生成しはじめる培養開始後１５時間の時点からポンプを作動させ、培養開始後４３時間の時点までの２８時間、以下に説明する抽出操作を行った。
　ジャーファーメンターから第一液として培養液（ジャーファーメンター内で３０℃）を２．５ｍＬ／ｍｉｎで引き抜き、抽出管のＴ字型ミキサ内の合流部へ供給した。また、同時に、第二容器から第二液としてミリスチン酸イソプロピル（室温、制御無し）を２．５ｍＬ／ｍｉｎで引き抜き、抽出管のＴ字型ミキサ内の合流部へ供給した。
　培養液及びミリスチン酸イソプロピルは、合流部で合流した後、ＰＦＡチューブ内の流通部をスラグ流を形成して流通した。流通部での培養液及びミリスチン酸イソプロピルの線速は０．０４ｍ／ｓ、流通時間は２４秒であった。また、流通部の温度は特に制御しなかった。
　その後、培養液及びミリスチン酸イソプロピルは、回収器で回収された。回収器内では、培養液が下部に、ミリスチン酸イソプロピルが上部に、迅速に相分離した。回収器では、温度は制御しなかった。
　培養液が循環できるように、回収器の下部から培養液を引き出し、ジャーファーメンターに戻した。また、ミリスチン酸イソプロピルが循環できるように、回収器の上部からミリスチン酸イソプロピルを引き出し、第二容器に戻した。

　また、前記の抽出操作において、ミリスチン酸イソプロピルの量は１００ｍＬであった。このミリスチン酸イソプロピルは、培養開始後２１時間、２７時間、３３時間及び３９時間の時点で新品１００ｍＬと交換し、合計５００ｍＬを使用した。

　（７５－４．評価）
　実施例７４と同じ方法で、分離性の評価、リナロール抽出量の測定、及び、有機酸濃度の測定を行った。有機酸濃度は、抽出操作を終了した時点（培養開始後４３時間の時点）での培養液の有機酸濃度を測定した。

［比較例１４］
　Ａ区とＢ区とを混合して得た培地に、培養開始直前に、超純水３０ｍＬの代わりに、ミリスチン酸イソプロピル３０ｍＬ（１０ｖｏｌ％）を入れた。また、抽出操作を行わなかった。以上の事項以外は、実施例７５と同じ操作により、培養によるリナロールの製造を行った。培養期間中、実施例７５と同じ方法により、培養液を経時でサンプリングし、培養液に含まれるリナロールの量を求めた。また、実施例７５と同じ方法により、培養開始後４３時間の時点での培養液の有機酸濃度を測定した。

［比較例１５］
　Ａ区とＢ区とを混合して得た培地に、培養開始直前に、超純水３０ｍＬの代わりに、ミリスチン酸イソプロピル６ｍＬ（２ｖｏｌ％）及び超純水２４ｍＬを入れた。また、抽出操作を行わなかった。以上の事項以外は、実施例７５と同じ操作により、培養によるリナロールの製造を行った。培養期間中、実施例７５と同じ方法により、培養液を経時でサンプリングし、培養液に含まれるリナロールの量を求めた。また、実施例７５と同じ方法により、培養開始後４３時間の時点での培養液の有機酸濃度を測定した。

［比較例１６］
　Ａ区とＢ区とを混合して得た培地に、培養開始直前に、超純水３０ｍＬの代わりに、ミリスチン酸イソプロピル１．５ｍＬ（０．５ｖｏｌ％）及び超純水２８．５ｍＬを入れた。また、抽出操作を行わなかった。以上の事項以外は、実施例７５と同じ操作により、培養によるリナロールの製造を行った。しかし、培養途中に発泡が激しくなったため、培養開始後３９時間の時点で、培養を終了した。培養期間中、実施例７５と同じ方法により、培養液を経時でサンプリングし、培養液に含まれるリナロールの量を求めた。また、実施例７５と同じ方法により、培養開始後３９時間の時点での培養液の有機酸濃度を測定した。

［実施例７５及び比較例１４～１６の結果］
　１．分離性の結果：
　実施例７５においては、微生物を含む培養液の相と、微生物を含まないミリスチン酸イソプロピルの相とが、回収器に回収後の数秒以内に分離した。よって、実施例７５では、微生物とリナロールとを短時間で分離できることが確認できた。

　２．リナロール抽出量の結果：
　実施例７５で測定されたミリスチン酸イソプロピル中のリナロール濃度を、図１６に示す。図１６に示すように、抽出操作の開始後、ミリスチン酸イソプロピルのリナロール濃度の上昇がみられる。よって、実施例７５では、培養液からミリスチン酸イソプロピルへの抽出を行いながら、培養を継続できることが確認できた。

　実施例７５及び比較例１４～１６における、培養液中のリナロール濃度を、図１７に示す。図１７に示すように、実施例７５では、ジャーファーメンター中の培養液のリナロール濃度が抑制できた。図１６に示すように、ミリスチン酸イソプロピルのリナロール濃度が増加していることから考えると、実施例７５では、生育阻害を回避しながら、微生物にリナロールを生産させることが可能であったことが分かる。

　実施例７５及び比較例１４～１６における、培養液に含まれるリナロールと、ミリスチン酸イソプロピルに含まれるリナロールとの合計生成量を、図１８に示す。図１８に示すように、実施例７５では、培養終了時点までに多くのリナロールを製造できたことが分かる。培養終了時点でのリナロールの合計生産量は、実施例７５では１．１ｇ、比較例１４では１．４ｇ、比較例１５では０．９ｇ、比較例１６では０．４ｇであった。

　３．有機酸濃度の結果：
　実施例７５及び比較例１４～１５における培養開始後４３時間の時点での培養液中の有機酸濃度、並びに、比較例１６における培養開始後３９時間の時点での培養液中の有機酸濃度を、図１９に示す。図１９に示すように、実施例７５では、培養液中に乳酸及び酢酸の顕著な蓄積は見られない。よって、実施例７５では、酸欠が生じていないことが示唆された。

　４．検討：
　実施例７５において、培養開始後４３時間の時点での培養液中のミリスチン酸イソプロピル濃度を確認したところ、０．２重量％であった。これは、比較例１４～１６のバッチ二相発酵での培養液中のミリスチン酸イソプロピル濃度と比べて、低濃度である。このような低濃度では、ミリスチン酸イソプロピルによるジャーファーメンター中での生育阻害の緩和効果は期待できない。よって、実施例７５でリナロール生産が継続されたのは、ジャーファーメンター外での抽出による効果であると言える。

［参考例１］
　実施例７５において、抽出操作の停止後、更にジャーファーメンター内で培養を継続した。その結果、培養液のＯ．Ｄ．６００ｎｍは低下し、培養を終了した６８．５ｈｒでは３３．６であった。

　１０　第一液
　２０　第二液
　３０　第一液の相
　４０　第二液の相
　１００　抽出装置
　１１０　第一容器
　１２０　第一供給部
　１２１　第一供給管
　１２２　第一送液ポンプ
　１３０　第二容器
　１４０　第二供給部
　１４１　第二供給管
　１４２　第二送液ポンプ
　１５０　抽出管
　１５１　Ｔ字型ミキサー部
　１５２　管部
　１６０　回収器
　１７０　流路
　１７１　合流部
　１７２　流通部
　１７３　送出部
　２００　製造装置
　２８０　第一循環部
　２８１　第一循環管
　２８２　第一循環ポンプ
　２９０　第二循環部
　２９１　第二循環管
　２９２　第二循環ポンプ

Claims

　合流部、流通部及び送出部を有する流路を用いて、微生物及び目的成分を含む第一液から、前記目的成分が移行可能であって且つ前記第一液と相分離可能な第二液へと、前記目的成分を抽出する抽出方法であって、
　前記抽出方法が、
　前記合流部に前記第一液を供給する工程と、
　前記合流部に前記第二液を供給する工程と、
　前記合流部に供給された前記第一液及び前記第二液を、前記第一液の相と前記第二液の相とが分離した状態で、前記流通部に流通させる工程と、
　前記流通部を流通した前記第一液及び前記第二液を、前記送出部から送出させる工程と、
　前記送出部から送出された前記第一液及び前記第二液を、回収器に回収する工程と、を含む、抽出方法。
　前記流通部において、前記第一液及び前記第二液が、流通方向において前記第一液の相及び前記第二液の相が交互に並んだスラグ流を形成する、請求項１に記載の抽出方法。
　前記微生物が、前記目的成分の生成能を有する、請求項１又は２に記載の抽出方法。
　前記微生物が、遺伝子組換え微生物である、請求項１～３のいずれか一項に記載の抽出方法。
　前記第一液が、前記微生物及び前記目的成分を含む培養液であり、前記第二液が有機溶媒を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の抽出方法。
　前記目的成分が、疎水性物質である、請求項１～５のいずれか一項に記載の抽出方法。
　前記目的成分が、イソプレノイド化合物又はバニロイド化合物である、請求項１～６のいずれか一項に記載の抽出方法。
　前記微生物が、細菌又は酵母である、請求項１～７のいずれか一項に記載の抽出方法。
　前記細菌が、コリネバクテリウム属細菌、パントエア属細菌、バシラス属細菌、エシェリヒア属細菌、及びエンテロバクター属細菌からなる群より選ばれる、請求項８に記載の抽出方法。
　前記合流部に供給される前記第一液における前記目的成分の濃度が、０．１ｇ／Ｌ以上５００ｇ／Ｌ以下である、請求項１～９のいずれか一項に記載の抽出方法。
　前記合流部に供給される前記第一液の乾燥微生物重量が、０．１ｇ／Ｌ以上５００ｇ／Ｌ以下である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抽出方法。
　前記流通部の内径が、０．２５ｍｍ以上１０．０ｍｍ以下である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抽出方法。
　前記流通部における前記第一液及び前記第二液の温度が、１０℃以上９０℃以下である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抽出方法。
　微生物及び目的成分を含む第一液から、前記目的成分が移行可能であって且つ前記第一液と相分離可能な第二液へと、前記目的成分を抽出するための抽出装置であって、
　前記第一液を供給できる第一供給部と；
　前記第二液を供給できる第二供給部と；
　前記第一液及び前記第二液を供給されることができる合流部、前記合流部に供給された前記第一液及び前記第二液が流通できる流通部、並びに、前記流通部を流通した前記第一液及び前記第二液を送出できる送出部、を有する流路と；
　前記送出部から送出された前記第一液及び前記第二液を回収できる回収器と、を備え；
　前記第一液の相及び前記第二液の相が分離した状態で前記第一液及び前記第二液が前記流通部を流通できる、抽出装置。
　微生物を含む第一液を収納した第一容器において、前記微生物に目的成分を生成させる工程と、
　前記第一容器から、合流部、流通部及び送出部を有する流路の前記合流部に、前記第一液を供給する工程と、
　前記合流部に、前記目的成分が移行可能であって且つ前記第一液と相分離可能な第二液を供給する工程と、
　前記合流部に供給された前記第一液及び前記第二液を、前記第一液の相と前記第二液の相とが分離した状態で、前記流通部に流通させる工程と、
　前記流通部を流通した前記第一液及び前記第二液を、前記送出部から送出する工程と、
　前記送出部から送出された前記第一液及び前記第二液を、回収器に回収する工程と、を含む、目的成分の製造方法。
　前記回収器に回収された前記第一液を、前記第一容器に戻す工程を含む、請求項１５に記載の目的成分の製造方法。
　前記回収器に回収された前記第二液を、前記合流部に戻す工程を含む、請求項１５又は１６に記載の目的成分の製造方法。
　前記目的成分が、前記微生物による前記目的成分の生成を阻害する性質を有する、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の目的成分の製造方法。
　微生物を含む第一液を収納し、前記微生物に目的成分を生成させることができる第一容器と、
　前記第一容器に収納された前記第一液を供給できる第一供給部と、
　前記目的成分が移行可能であって且つ前記第一液と相分離可能な第二液を供給できる第二供給部と、
　前記第一液及び前記第二液を供給されることができる合流部、前記合流部に供給された前記第一液及び前記第二液が流通できる流通部、並びに、前記流通部を流通した前記第一液及び前記第二液を送出できる送出部、を有する流路と；
　前記送出部から送出された前記第一液及び前記第二液を回収できる回収器と、を備え；
　前記第一液の相及び前記第二液の相が分離した状態で前記第一液及び前記第二液が前記流通部を流通できる、目的成分の製造装置。
　前記回収器に回収された前記第一液を、前記第一容器に戻すことができる第一循環部を備える、請求項１９記載の目的成分の製造装置。