BRPI0612591A2 - detecção de um antìgeno-alvo independentemente da presença ou da ausência de um anticorpo terapêutico correspondente - Google Patents

Abstract

DETECçãO DE UM ANTìGENO-ALVO INDEPENDENTEMENTE DA PRESENçA OU DA AUSêNCIA DE UM ANTICORPO TERAPêUTICO CORRESPONDENTE. A presente invenção refere-se ao campo de anticorpos terapêuticos. A invenção refere-se especialmente a um processo de detecção do antígeno-alvo de um anticorpo terapêutico em uma amostra que compreende as etapas de a) fornecimento da amostra que será analisada, b) incubação da dita amostra com o dito anticorpo terapêutico sob condições apropriadas para a ligação do dito anticorpo terapêutico com o dito antígeno-alvo, através da qual é formado um complexo antígeno-alvo - anticorpo terapêutico e c) detecção do complexo formado em (b).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DETECÇÃODE UM ANTÍGENO-ALVO INDEPENDENTEMENTE DA PRESENÇAOU DA AUSÊNCIA DE UM ANTICORPO TERAPÊUTICO CORRESPONDENTE".

A presente invenção refere-se a um método para a detecção deum antígeno-alvo independentemente da presença ou da ausência de umanticorpo terapêutico correspondente. Refere-se especialmente à medida deum antígeno-alvo na presença de um anticorpo terapêutico correspondente.

A presente invenção descreve um método de detecção do antígeno-alvo deum anticorpo terapêutico em uma amostra que compreende as etapas de a)de fornecimento da amostra que será analisada, b) de incubação da ditaamostra com o dito anticorpo terapêutico sob condições apropriadas para aligação do dito anticorpo terapêutico ao dito antígeno-alvo, em que é forma-do um complexo de antígeno-alvo - anticorpo terapêutico e c) de detecçãodo complexo formado em (b). Refere-se ainda ao uso do dito método no a-companhamento de um paciente.

Antecedentes da Invenção

Desde o desenvolvimento dos primeiros anticorpos monoclo-nais por Kõhler e Milstein em 1974 muitos esforços foram dedicados aodesenvolvimento de anticorpos que são apropriados para terapia em sereshumanos. Os primeiros anticorpos monoclonais que se tornaram disponí-veis foram desenvolvidos em camundongos e ratos. Estes anticorposquando utilizados para terapia de seres humanos causavam efeitos colate-rais indesejados por causa de anticorpos anti-roedor. Muitos esforços fo-ram dedicados à redução ou até mesmo à eliminação de tais efeitos colate-rais indesejados.

Nos últimos dez anos um número continuamente crescente deanticorpos monoclonais humanos ou anticorpos monoclonais humanizadosatingiu o mercado. Os exemplos bem-conhecidos incluem, por exemplo,Herceptin® e MabThera® da Hoffmann-La Roche, Basel.

Um número bastante significativo de anticorpos monoclonaishumanos ou humanizados está sob investigação e precisa ser estudado emanimais experimentais, antes que a entrada em humanos possa ser conside-rada para as primeiras finalidades de teste.

Os anticorpos monoclonais terapêuticos tipicamente têm que serutilizados com níveis no soro variando de aproximadamente entre 1 nano-grama por mL até aproximadamente 100 microgramas por mL. O anticorpoterapêutico, assim pelo menos em certos pontos de tempo durante um regi-me de tratamento, está presente em uma concentração bastante alta, porexemplo, em uma concentração que é tão alta ou até mesmo mais alta que aconcentração do antígeno-alvo correspondente.

Uma medida correta do próprio antígeno-alvo é considerada mui-to importante especialmente no acompanhamento de pacientes após terapiae especialmente após terapia com um anticorpo terapêutico correspondente.

Uma vez que durante o curso de um regime de tratamento a concentraçãode um anticorpo terapêutico variará até uma grande extensão, qualquer in-terferência de tal anticorpo terapêutico em um ajuste de ensaio para a medi-da de seu antígeno-alvo correspondente pode e mais provavelmente levaráa medidas falsas para o dito antígeno-alvo.

O nível de um antígeno-alvo pode ser detectado através dequalquer método apropriado. Na rotina clínica tais métodos na maior partedos casos empregarão anticorpos para o antígeno-alvo, os assim chamadosensaios imunológicos. Uma concentração aJta e/ou variável de um anticorpoterapêutico pode interferir no ensaio imunológico utilizado para medir o nívelde seu antígeno-alvo.

Como o versado na técnica já considerará, não é possível ou pe-Io menos não é uma tarefa fácil, utilizar o próprio anticorpo terapêutico nadetecção de seu antígeno-alvo correspondente. A mesma dificuldade seráfreqüentemente encontrada se o anticorpo terapêutico e pelo menos um dosanticorpos utilizados em um ensaio imunológico se ligarem ao mesmo epito-po de um antígeno-alvo. Enquanto este fato é bem-conhecido e geralmenteaceito, foi descoberto agora de forma surpreendente que um ensaio imuno-lógico para a detecção de um antígeno-alvo também pode ser comprometidopela presença ou pela ausência de um anticorpo terapêutico mesmo se oanticorpo terapêutico se ligar a um epitopo não ligado pelo anticorpo ou pe-los anticorpos utilizados em um ensaio imunológico para o antígeno-alvocorrespondente.

Jilani e outros (Jilani, I. e outros, Blood 1032 (2003) 3514-3520)relataram que para detectar rituximab na superfície celular, foram utilizadosanticorpos que detectavam especificamente a seqüência de camundongo norituximab e não faziam reação cruzada com a Ig humana. No WO 03/024993é relatado um método de detecção e de monitoramento de um complexo deanticorpo terapêutico:antígeno, antígeno solúvel, anticorpo terapêutico livre eanticorpo terapêutico total solúvel.

Era uma tarefa da presente invenção investigar se os métodosde detecção de um antígeno-alvo de um anticorpo terapêutico em uma a-mostra podem ser melhorados. Tal método deve fornecer um valor real ecorreto para a concentração do antígeno-alvo, não importando se o anticor-po terapêutico correspondente está presente ou não e se deve ser utilizadoem medidas consecutivas, por exemplo, no acompanhamento de pacientes.

Esta tarefa foi realizada pela invenção como descrito abaixo e naseção de exemplos e como reivindicado nas reivindicações em anexo.

Sumário da Invenção

A invenção compreende um método de detecção do antígeno-alvo de um anticorpo terapêutico em uma amostra que compreende as eta-pas a) de fornecimento da amostra que será analisada, b) de incubação dadita amostra com o dito anticorpo terapêutico sob condições apropriadaspara a ligação do dito anticorpo terapêutico ao dito antígeno-alvo, em queum complexo antígeno-alvo-anticorpo terapêutico é formado com o antígeno-alvo total sendo complexado pelo anticorpo terapêutico e c) de detecção docomplexo formado em b).

Descrição Detalhada da Invenção

Em uma primeira modalidade a presente invenção refere-se aum método de detecção do antígeno-alvo de um anticorpo terapêutico emuma amostra que compreende as etapas de a) fornecimento da amostra queserá analisada, b) de incubação da dita amostra com o dito anticorpo tera-pêutico sob condições apropriadas para a ligação do dito anticorpo terapêu-tico com o dito antígeno-alvo, em que é formado um complexo de antígeno-alvo-anticorpo terapêutico e c) de detecção do complexo formado em b).

O termo "antígeno-alvo" refere-se a uma molécula biológica queé ligada por seu anticorpo terapêutico correspondente. Com a finalidade deexemplo, o antígeno-alvo de um anticorpo terapêutico para HER2 (= ErbB2ou ρ 185 neu), como Herceptin® ou Omnitarg®, é HER2, de um anticorpo te-rapêutico para CD52, como Campath®, é CD52, de um anticorpo terapêuticopara EGFr1 como Erbitux®, é EGFr, de um anticorpo terapêutico para CD33,como Mylotarg®, é CD33, de um anticorpo terapêutico para Tag-72, comoOncoScint®, é Tag-72, de um anticorpo terapêutico para 17-1 A, como Pano-rex®, é 17-1 A, de um anticorpo terapêutico para CD20, como Rituxan®,MabThera® ou Zevalin®, é CD20 e de um anticorpo terapêutico para CD25,como Zenapax®, é CD25. O antígeno-alvo pode ser um antígeno-alvo solú-vel, isto é, secretado ou expelido ou um antígeno-alvo ligado à membrana(celular).

Em uma outra modalidade o dito complexo de antígeno-alvo-anticorpo terapêutico formado na etapa b) é formado com o antígeno-alvototal sendo complexado pelo anticorpo terapêutico.

O termo "antígeno-alvo solúvel" como utilizado dentro deste pe-dido de patente significa a forma solúvel, isto é, a forma secretada ou expeli-da, de um antígeno-alvo ligado à membrana de um anticorpo terapêutico. Osanticorpos terapêuticos são principalmente direcionados contra antígenos desuperfície celular, por exemplo, de células cancerosas, aos quais se ligam.

Além da variação ligada à membrana de um antígeno de superfície celular,secretado ou expelido, isto é, solúvel, as variações de tal antígeno podemser produzidas por células. O antígeno-alvo solúvel pode ser encontrado emfluidos corporais de um indivíduo afetado. O "antígeno-alvo solúvel" é a vari-ação secretada ou expelida de um antígeno ligado à membrana, em que avariação solúvel possui a mesma seqüência de aminoácidos e a mesma es-trutura secundária que pelo menos uma parte do domínio extracelular doantígeno ligado à membrana, permitindo assim que um anticorpo direciona-do contra o domínio extraceiular de um antígeno-alvo (ligado à membrana)também se ligue ao antígeno-alvo solúvel.

Em uma outra modalidade o dito antígeno-alvo é um antígeno-alvo solúvel.

O termo "epitopo" como utilizado dentro deste pedido de patentesignifica um determinante de proteína capaz de se ligar especificamente aum anticorpo. Os epitopos consistem geralmente em grupamentos de super-fície quimicamente ativos de moléculas tais como aminoácidos ou cadeiaslaterais de açúcares e possuem geralmente características estruturais tridi-mensionais específicas, assim como características específicas de carga. Osepitopos conformacionais e não conformacionais são distinguidos pelo fatode que a ligação aos primeiros, mas não aos últimos é perdida na presençade solventes desnaturantes. Dependendo do tamanho do antígeno ao qual oepitopo pertence, mais de um epitopo por antígeno pode estar disponívelresultando similarmente na possibilidade de mais de um sítio de ligação como anticorpo (=epitopo) por antígeno.

Uma "amostra" de acordo com a presente invenção pode serqualquer amostra de tecido ou de líquido removida do animal experimental,preferencialmente de um mamífero. Preferencialmente a amostra será umaamostra líquida como saliva, urina, sangue total, plasma ou soro. Preferenci-almente a amostra será sangue total, plasma ou soro. Preferencialmente aamostra é uma amostra isenta de células, isto é, uma amostra que não con-tém células que carregam o antígeno-alvo ligado à membrana.

As condições que são apropriadas para a ligação de um antíge-no-alvo ao seu "anticorpo terapêutico" correspondente são bem-conhecidaspelo versado na técnica e podem ser facilmente determinadas. Sob estascondições, o anticorpo terapêutico se liga ao antígeno-alvo, a variação ligadaà membrana ou solúvel e é formado um complexo imunológico entre o antí-geno-alvo e o anticorpo terapêutico, resultando em um complexo de antíge-no-alvo-anticorpo terapêutico. Este complexo pode ser detectado através dequaisquer meios apropriados.

Em uma modalidade preferida um complexo de antígeno-alvo-anticorpo terapêutico é detectado com o auxílio de um ensaio imunológico. Oensaio imunológico utilizado preferencialmente é um ensaio imunológico he-terogêneo. É ainda preferido que a detecção do complexo de antígeno-alvo-anticorpo terapêutico seja realizada através do auxílio de um ensaio imuno-lógico competitivo ou através do auxílio de um assim chamado ensaio imu-nológico em sanduíche.

O versado na técnica não terá problemas em montar um ensaioimunológico, que seja capaz de detectar o antígeno-alvo como estando pre-sente no complexo de antígeno-alvo-anticorpo terapêutico. Com a finalidadede exemplo tal detecção pode ser realizada em um ensaio imunológico dotipo sanduíche em que um anticorpo é utilizado como um anticorpo de captu-ra, que se liga ao antígeno-alvo em um epitopo que não se sobrepõe ao epi-topo do anticorpo terapêutico. Para a detecção do complexo de antígeno-alvo-anticorpo terapêutico é preferido utilizar um segundo ou um anticorpode detecção para o antígeno-alvo que se liga a um epitopo que não é reco-nhecido pelo anticorpo terapêutico nem pelo anticorpo de captura.

Preferencialmente é utilizado um anticorpo de detecção capazde formar um complexo em sanduíche de anticorpo de detecção-antígeno-alvo-anticorpo terapêutico. O dito segundo ou anticorpo de detecção é prefe-rencialmente marcado de tal maneira que a detecção direta ou indireta sejafacilitada.

Para a detecção direta o grupo de marcação pode ser selecio-nado de quaisquer grupos de marcadores detectáveis conhecidos, tais comocorantes, grupos marcadores luminescentes, tais como grupos quimiolumi-nescentes, por exemplo, ésteres de acridínio ou dioxetanos ou corantes fluo-rescentes, por exemplo, fluoresceína, coumarina, rodamina, oxazina, resoru-fina, cianina e derivados dos mesmos. Outros exemplos de grupos de mar-cação são complexos metálicos luminescentes, tais como complexos de ru-tênio ou de európio, enzimas, por exemplo, como utilizado para ELISA oupara CEDIA (Ensaio Imunológico com Doador de Enzima Clonada (ClonedEnzyme Donor Immunoassay), por exemplo, EP 0 061 888) e radioisótipos.

Os sistemas de detecção indireta compreendem, por exemplo,que o reagente de detecção, por exemplo, o anticorpo de detecção, estejamarcado com um primeiro parceiro de um par de ligação "bioaffine". Os e-xemplos de pares de ligação adequados são haptenos ou antígeno/ anticor-po, biotina ou análogos da biotina tal como aminobiotina, iminobiotina oudestiobiotina/avidina ou estreptavidina, açúcar/lectina, ácido nucléico ou aná-logo de ácido nucléico/ácido nucléico complementar e receptor/ligante, porexemplo, receptor de hormônio esteróide/hormônio esteróide. Os primeirosmembros de pares de ligação preferidos compreendem hapteno, antígeno ehormônio. São especialmente preferidos os haptenos como digoxina, digoxi-genina e biotina e análogos das mesmas. O segundo parceiro de tal par deligação, por exemplo, um anticorpo, estreptavidina etc., geralmente é marca-do para permitir a detecção direta, por exemplo, através das marcações quesão mencionadas anteriormente.

Os ensaios imunológicos são bem-conhecidos pelo versado natécnica. Os métodos para a realização de tais ensaios assim como as apli-cações práticas e os procedimentos são resumidos em livros textos relacio-nados. Os exemplos de livros textos relacionados são Tijssen, P., Preparati-on of enzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates, em:Practice amd theory of enzyme immunoassays, Burdon, R.H. e v. Knippen-berg, P.H. (eds.), Elsevier, Amsterdam (1990) pp. 221-278; e vários volumesde Methods in Enzymology, Colowick, S.P. e Caplan, N.O. (eds.), AcademicPress, dealing with immunological detection methods, especialmente ps vo-lumes 70, 73, 74, 84, 92 e 121.

Em todos os métodos de detecção imunológica anteriores sãoescolhidas as condições reagentes que permitam a ligação dos reagentesempregados, por exemplo, para a ligação de um anticorpo ao seu antígenocorrespondente. O complexo de antígeno-alvo-anticorpo terapêutico detec-tado de acordo com a presente invenção é correlacionado pelos procedi-mentos do estado da técnica à concentração correspondente do antígeno-alvo, na forma ligada à membrana ou na formulação solúvel.

O anticorpo ou os anticorpos que se ligam ao antígeno-alvo emum epitopo não reconhecido pelo anticorpo terapêutico pode ser um anticor-po policlonal, um anticorpo monoclonal, fragmentos de tais anticorpos, assimcomo constructos genéticos que compreendem o domínio de ligação de talanticorpo. Fragmentos de anticorpos apropriados também podem ser utiliza-dos. Os anticorpos assim como os fragmentos de anticorpos são geradosatravés de procedimentos do estado da técnica, por exemplo, como descritoem Tijssen (Tijssen, P., Practice and theory of enzyme immunoassays 11(1990), o livro todo, especialmente pp. 43-78, Elsevier, Amsterdam).

O termo "anticorpo terapêutico" refere-se a qualquer preparaçãode anticorpo que seja pretendida para uso em um ser humano. Preferenci-almente, tal anticorpo terapêutico será um anticorpo monoclonal. Adicional-mente preferido, tal anticorpo monoclonal será obtido de um macaco degrande porte ou será um anticorpo monoclonal humano ou um anticorpohumanizado. Preferencialmente, será um anticorpo monoclonal humano.Será também preferido que tal anticorpo monoclonal terapêutico seja umanticorpo monoclonal humanizado.

O termo "monoclonal anticorpo" como utilizado aqui refere-se aum anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente ho-mogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendidos na populaçãosendo idênticos exceto por mutações que ocorrem naturalmente possíveisque podem estar presentes em quantidades mínimas. Os anticorpos mono-clonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único sítioantigênico. Além disso, em contraste às preparações de anticorpos policlo-nais, que incluem anticorpos diferentes direcionados contra determinantes(epitopos) diferentes, cada anticorpo monoclonal é direcionado contra umúnico determinante no antígeno. Em adição a sua especificidade, os anticor-pos monoclonais são vantajosos pelo fato de que podem ser sintetizados deforma não contaminada por outros anticorpos. O modificador "monoclonal"indica a característica do anticorpo como sendo obtido partindo de uma po-pulação substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser inter-pretado como requerendo a produção do anticorpo através de qualquer mé-todo particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais que serão utilizadosde acordo com a presente invenção podem ser produzidos através do méto-do de hibridoma descrito primeiro por Kõhler, G. e outros, Nature 256 (1975)495-497 ou podem ser produzidos através de métodos do DNA recombinan-te (ver, por exemplo, a US 4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" tambémpodem ser isolados de bibliotecas de anticorpos em fatos utilizando as técni-cas descritas em Clackson1 T. e outros, Nature, 352 (1991) 624-628 e Marks,J. D. e outros, J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597, por exemplo.

As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por e-xemplo, de roedores) são anticorpos quiméricos que contêm seqüênciasparciais derivadas de imunoglobulina não humana e de imunoglobulina hu-mana. Para a maior parte, os anticorpos humanizados são derivados de umaimunoglobulina humana (anticorpo receptor) em que resíduos de uma regiãohipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hiper-variável de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camun-dongo, rato, coelho ou primata não humano que possui a especificidade e aafinidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos da região estrutural (FR)da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos cor-respondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreendermodificações adicionais, por exemplo, resíduos de aminoácidos que não sãoencontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Tais modifica-ções resultam em variações de tal anticorpo receptor ou doador que sãohomólogas, mas não idênticas à seqüência original correspondente. Estasmodificações são feitas para refinar adicionalmente o desempenho do anti-corpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmentetodos de pelo menos um e tipicamente dois domínios variáveis, em que to-das ou substancialmente todas as alças hipervariáveis correspondem àque-las de um anticorpo doador que não é humano e todas ou substancialmentetodas as FRs são aquelas de um anticorpo receptor humano. O anticorpohumanizado compreenderá opcionalmente ainda pelo menos uma parte deuma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de umaimunoglobulina humana.

Os métodos para a humanização de anticorpos que não sãohumanos foram descritos na técnica. Preferencialmente, um anticorpo hu-manizado possui um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos nomesmo provenientes de uma origem que não é humana. Estes resíduos deaminoácidos que não são humanos são freqüentemente referidos como re-síduos de "importação", que são tipicamente tirados de um domínio variávelde "importação". A humanização pode ser essencialmente realizada seguin-do o método de Winter e outros (Jones, Ρ. T. e outros, Nature 321 (1986)522- 525; Riechmann, L. e outros, Nature 332 (1988) 323-327; Verhoeyen,M. e outros, Science 239 (1988) 1534-1536; e Presta, L. G., Curr. Op. Struct.Biol. 2(1992)

593-596), através da substituição das seqüências hipervariáveispelas seqüências correspondentes de um anticorpo humano. Conseqüente-mente, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (US4.816.567), em que substancialmente menos que um domínio variável hu-mano intacto foi substituído pela seqüência correspondente de uma espécieque não é humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamenteanticorpos humanos em que alguns resíduos da região hipervariável e pos-sivelmente alguns resíduos de FR são substituídos pelos resíduos de sítiosanálogos em anticorpos de roedores.

A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leves quantopesados, que serão utilizados na produção dos anticorpos humanizados émuito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o assimchamado método de "melhor ajuste", a seqüência do domínio variável de umanticorpo de roedor é verificada contra a biblioteca inteira de seqüências dedomínios variáveis humanos conhecidas. A seqüência humana que estivermais próxima à do roedor é então aceita como a região estrutural (FR) hu-mana para o anticorpo humanizado (Sims, M. J. e outros, J. Immunol. 151(1993) 2296-2308; Chothia, C e outros, J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917).

Um outro método utiliza uma região estrutural particular derivada da seqüên-cia consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular decadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode ser utilizada para váriosanticorpos humanizados diferentes (Carter, P. e outros, Proc. Natl. Acad.Sei. USA 89 (1992) 4285-4289; Presta, L. G. e outros, J. Immunol. 151(1993) 2623-2632).

Imunoglobulinas podem ser geradas contra, por exemplo, poli-peptídeos humanos, de camundongo ou de rato. As imunoglobulinas, poli-clonais ou monoclonais, que reconhecem especificamente o antígeno-alvosão abrangidas pela invenção. Tais imunoglobulinas são produzidas utilizan-do técnicas imunológicas padronizadas conhecidas por um versado na téc-nica. As imunoglobulinas podem ser policlonais ou monoclonais ou podemser produzidas de forma recombinante tal como para um anticorpo humani-zado. A determinação do fato de um anticorpo não se ligar ao mesmo epito-po como um anticorpo terapêutico conhecido pode ser facilmente realizadaem um sistema de teste competitivo.

A sobreposição possível de epitopos de dois anticorpos que seligam ao mesmo antígeno-alvo pode ser detectada com o auxílio de um sis-tema de teste competitivo. Para esta finalidade, por exemplo, com o auxíliode um ensaio imunológico enzimático, é testada a extensão até a qual o no-vo anticorpo compete com o anticorpo conhecido pela ligação a um antíge-no-alvo imobilizado. Para esta finalidade, um antígeno-alvo imobilizado a-propriadamente é incubado com o anticorpo conhecido na forma marcada eum excesso do anticorpo em questão. Através da detecção da marcaçãoligada pode ser facilmente determinada a extensão até a qual o anticorpo emquestão pode deslocar o anticorpo conhecido do sítio de ligação (= epitopo).Se houver um deslocamento de não mais que 20%, preferencialmente denão mais que 10%, na mesma concentração ou a concentrações maiores,preferencialmente no caso de excesso do anticorpo em questão, referidocomo o anticorpo conhecido, então não está presente qualquer epitopo desobreposição.

Os exemplos bem-conhecidos de anticorpos terapêuticos huma-nizados são os assim chamados anticorpos anti-ErbB2 incluindo huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6,huMAb4D5-7 e huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®) como descrito na Tabela 3 daUS 5.821.337 espressamente incorporada aqui como referência; assim co-mo os anticorpos 520C9 humanizados (descritos na WO 93/21319) e 2C4humanizado como descrito na PCT/US 03/21590.

Preferencialmente o anticorpo terapêutico utilizado em um méto-do de acordo com a presente invenção é selecionado do grupo que consisteem Campath®, Erbitux®, Herceptin®, MabThera®, Mylotarg®, OncoScint®,Omnitarg®, Panorex®, Rituxan®, Zevalin® e Zenapax®, preferencialmente dogrupo que consiste em Herceptin®, MabThera®, Omnitarg® e Zenapax®.

Zevalin® é o nome comercial para o anticorpo terapêutico tam-bém conhecido como ibritumomab. Este anticorpo terapêutico se baseia noanticorpo monoclonal que se liga a CD20 e é aprovado pela FDA para o tra-tamento de Iinfoma sem ser de Hodgkins de células B.

Rituxan® é o nome comercial para o anticorpo terapêutico tam-bém conhecido com rituximab. Este anticorpo terapêutico se baseia no anti-corpo monoclonal que se liga a CD20 e é aprovado pela FDA para o trata-mento de Iinfoma sem ser de Hodgkins de células B.

Panorex® é o nome comercial para o anticorpo terapêutico tam-bém conhecido como edrecolomab. Este anticorpo terapêutico se liga aoantígeno 17-1A (Ep-CAM) e foi aprovado para o tratamento de câncer color-retal.

OncoScint® é o nome comercial para o anticorpo terapêuticotambém conhecido como satumomab. Este anticorpo terapêutico se liga aoantígeno Tag-72 de pancarcinoma e foi aprovado para o tratamento de car-cinoma de cólon e ovariano.

Mylotarg® é o nome comercial para o anticorpo terapêutico tam-bém conhecido como gemtuzmab. Este anticorpo terapêutico se baseia noanticorpo monoclonal que se liga a CD33 e é aprovado pela FDA para o tra-tamento de leucemia mielóide.

Erbitux® é o nome comercial para o anticorpo terapêutico tam-bém conhecido como cetuximab. Este anticorpo terapêutico se liga ao recep-tor do fator de crescimento da epiderme (EGFr) e foi aprovado para câncercolorretal.

Campath® é o nome comercial para o anticorpo terapêuticotambém conhecido como alemtuzumab. Este anticorpo terapêutico se baseiano anticorpo monoclonal que se liga a CD52 e é aprovado pela FDA para otratamento de leucemia linfocítica crônica.

Herceptin® é o nome comercial para o anticorpo terapêuticotambém conhecido como trastuzumab. Este anticorpo terapêutico se baseiano anticorpo monoclonal 4D5. Se liga a HER2. HER2 é também conhecidocomo ErbB2 ou ρ 185 neu. Foi mostrado que Herceptin® possui um efeito po-sitivo sobre a sobrevivência de pacientes positivos em relação a HER2 comcâncer de mama (De Laurentiis, M. e outros, Ann. Oncol. 16 (2005) iv7-iv13).

MabThera® é o nome comercial para o anticorpo terapêuticotambém conhecido como rituximab. Este anticorpo terapêutico se baseia noanticorpo monoclonal que se liga a CD20. Foi mostrado que MabThera®possui um efeito positivo sobre a sobrevivência de pacientes sofrendo deIinfoma sem ser de Hodgkin insensível e agressivo (Di Bella1 N. e outros,Câncer 103 (2005) 978-984).

Omnitarg® é o nome comercial para um novo anticorpo terapêu-tico pertuzumab que se liga a HER2. Se baseia no anticorpo monoclonal2C4. 2C4 e 4D5 se ligam a epitopos diferentes em HER2. Omnitarg® estásendo atualmente submetido a testes clínicos. É esperado que tenha umefeito positivo sobre a sobrevivência para pacientes com superexpressão deHER2 com câncer de mama (Badache, A. e outros, Câncer Cell 5 (2004)299-301).

Zenapax® é o nome comercial para um anticorpo terapêuticoque se liga ao receptor de interleucina-2. Está associado com a menor rejei-ção e a maior sobrevivência de pacientes em receptores de transplantes re-nais (Morris, J.A. e outros, Clin. Transplant. 19 (2005) 340-345).

É também preferido que o antígeno-alvo detectado em um méto-do de acordo com a presente invenção seja selecionado do grupo que con-siste em HER2, receptor de interleucina-2, IGF-1R, EGFr, Tag-72, 17-1 A,CD52, CD25, CD33 ou CD20, preferencialmente do grupo que consiste emHER2, receptor de interleucina-2, IGF-1R e CD20, preferencialmente dogrupo que consiste em HER2, receptor de interleucina-2 ou CD20.

Como mencionado anteriormente foi descoberto pelos inventoresda presente invenção que não somente os anticorpos terapêuticos que seligam a um epitopo que é também ligado por um anticorpo utilizado em umensaio para a detecção do antígeno-alvo correspondente inteferirão em talensaio. A interferência pode também ocorrer e foi observada em métodos deensaio utilizando anticorpos para epitopos não sobrepostos no antígeno-alvo. As observações específicas apresentadas na seção de Exemplos fo-ram realizadas com ensaios para o antígeno HER2 e dois anticorpos tera-pêuticos diferentes que se ligam a este antígeno-alvo. Entretanto, tinha queser esperado que o mesmo se mantivesse verdadeiro na quantificação exatade outros antígenos-alvos. Os exemplos demonstram que o método de a-cordo com a presente invenção pode ser aplicado para ambos os anticorposdiferentes para HER2, isto é, Herceptin® e Omnitarg® e o antígeno-alvoHER2 pode ser medido de forma confiável independente da presença ou daausência do anticorpo terapêutico correspondente na amostra investigada.

Em uma modalidade o anticorpo terapêutico é Herceptin®, o an-ticorpo de captura é Omnitarg® e o anticorpo de detecção é o anticorpo anti-ErbB2 7C2.

Em uma outra modalidade o anticorpo terapêutico é Omnitarg®,o anticorpo de captura é Herceptin® e o anticorpo de detecção é o anticorpoanti-ErbB2 7C2.

Herceptin®, Omnitarg® e o anticorpo anti-ErbB2 7C2 se ligam aepitopos diferentes do antígeno HER2. O anticorpo anti-ErbB2 7C2, por e-xemplo, reconhece um epitopo na região do terminal N de ErbB2 (ver, porexemplo, o WO 98/17797).

Em uma modalidade no método da invenção é formado o com-plexo de antígeno-alvo-anticorpo terapêutico formado na etapa b) em que oantígeno-alvo total na amostra está sendo complexado pelo anticorpo tera-pêutico.

A invenção compreende um método de detecção do antígeno-alvo de um anticorpo terapêutico em uma amostra que compreende as eta-pas a) de fornecimento da amostra que será analisada, b) de incubação dadita amostra com o dito anticorpo terapêutico sob condições apropriadaspara a ligação do dito anticorpo terapêutico com o dito antígeno-alvo, emque um complexo de antígeno-alvo-anticorpo terapêutico é formado com oantígeno-alvo total sendo complexado pelo anticorpo terapêutico e c) de de-tecção do complexo formado em b).

A medida confiável de um antígeno-alvo terá vantagem significa-tiva para qualquer amostra que compreenda um anticorpo terapêutico inter-ferente. Em uma modalidade preferida a presente invenção refere-se, por-tanto, a um método de detecção do antígeno-alvo de um anticorpo terapêuti-co em uma amostra em que o dito anticorpo terapêutico está presente quecompreende as etapas de a) fornecimento da amostra que será analisada, b)incubação da dita amostra com o dito anticorpo terapêutico sob condiçõesapropriadas para a ligação do dito anticorpo terapêutico ao dito antígeno-alvo, em que um complexo de antígeno-alvo- anticorpo terapêutico é forma-do e c) detecção do complexo formado em b).

O método de acordo com a presente invenção será ainda muitoútil no acompanhamento de pacientes que recebem um anticorpo terapêuti-co. Em uma modalidade preferida a presente invenção refere-se, portanto, aum método de detecção do antígeno-alvo de um anticorpo terapêutico emuma amostra obtida de um paciente sob terapia com o dito anticorpo tera-pêutico que compreende as etapas de a) fornecimento da amostra que seráanalisada, b) incubação da dita amostra com o dito anticorpo terapêutico sobcondições apropriadas para a ligação do dito anticorpo terapêutico com odito antígeno-alvo, em que um complexo de antígeno-alvo-anticorpo terapêu-tico é formado e c) detecção do complexo formado em b).

A determinação correta do antígeno-alvo correspondente será,em uma modalidade preferida, útil para avaliar a eficiência da terapia. Emuma modalidade adicionalmente preferida o método de acordo com esta in-venção irá auxiliar na avaliação de uma reincidência à doença oculta.

Em geral o médico pode descobrir uma informação valiosa noacompanhamento de pacientes sob terapia com um anticorpo terapêuticoatravés do uso do método apresentado aqui. A presente invenção refere-seainda ao uso de um método como apresentado anteriormente no acompa-nhamento de pacientes.

Sem desejar ficar ligado à explicação sugerida pode ser que a li-gação de um anticorpo terapêutico ao seu antígeno-alvo tenha, por exemplo,alguma influência sobre a conformação de outros epitopos e/ou as proprie-dades de ligação de outros anticorpos a estes epitopos quando apresenta-dos em um complexo de antígeno-alvo-anticorpo terapêutico. Preferencial-mente o método de acordo com a presente invenção é utilizado mesmo seos epitopos em um antígeno-alvo para os anticorpos que são utilizados emum ensaio imunológico e para o anticorpo terapêutico, respectivamente, nãose sobreponham.

Em uma modalidade o método da invenção é realizado em umchip.

Um "chip" é um material não poroso sólido, tal como metal, vidroou plástico. O material pode ser opcionalmente revestido, inteiramente ouem certas áreas. Na superfície do material qualquer arranjo de pontos podeestar/está presente, visível ou em coordenadas. Em cada ponto pode estarimobilizado um polipeptídeo definido, com ou sem Iigante ou espaçador nasuperfície do material. Preferencialmente os polipeptídeos imobilizados sãopelo menos fragmentos de anticorpos que são capazes de se ligar ao antí-geno-alvo.

Os exemplos e as figuras a seguir são fornecidos para auxiliar oentendimento da presente invenção, cujo âmbito real é apresentado nas rei-vindicações em anexo. É entendido que podem ser feitas modificações nosprocedimentos apresentados sem sair do espírito da invenção.

Descrição das Figuras

Figura 1 - interferência de dois anticorpos terapêuticos diferentesna detecção de HER2 utilizando o ensaio comercial vendido pela OncogeneSciences.

Figura 2 - interferência de dois anticorpos terapêuticos diferentesna detecção de HER2 utilizando o ensaio comercial vendido pela Bender.

Figura 3 - determinação da interferência máxima para o anticor-po terapêutico Omnitarg®.Figura 4 - determinação da interferência máxima para o anticor-po terapêutico Herceptin®.

Figura 5 - curvas de calibração de detecção de HER2 utilizandoensaios isentos de interferência por Omnitarg® e Herceptin®, respectivamente.

Abreviações

Bi Biotina

EDTA Ácido etilenodiaminatetraacético

ELISA Ensaio imunoabsorvente ligado à enzima

Fcy (=Fcy) Fragmento de Fc gama de uma imunoglobulina

DIG (Dig) Digoxigenina

hu, H Humano

IgG Imunoglobulina G

n.d. não definido

NSCLC Câncer pulmonar sem ser de células pequenas

DO Densidade óptica

MAK (=Mab) Anticorpo monoclonal

PAK (=Pab) Anticorpopoliclonal

R Vaca (Rind)

RPLA Plasmaalbumina Bovina

RT Temperatura ambiente

TAPS Ácido N-tris(hidroximetil)metil-3-aminopropanossulfônico

VEGF Fator de crescimento endotelial vascular

Exemplo 1

Ensaios Comerciais para HER2

a) HER-2/neu ELISA produzido pela Oncogene Science/Bayer HealthCare LLC (N2 dé Cat. DAKO Cytomation EL5011)

Incubações e etapas de lavagem foram realizadas de acordocom as instruções fornecidas pelo fabricante. Padrões de 35, 25, 15, 7,5, 2,5e O ng/mL de HER2 foram salpicados com 500, 250, O pg/mL de Herceptin®ou foram salpicados com 500, 250, O pg/mL de Omnitarg®, respectivamente.

Estas amostras foram incubadas na placa para microtitulação revestida. A-pós a adição e a incubação do anticorpo de detecção, o substrato foi adicio-nado e absorbância foi lida em 492 nm. Os resultados são fornecidos na Tabela 1.

Tabela 1

Densidades ópticas (DOs) que são medidas com ou sem o anticorpointerferente na amostra

<table>table see original document page 19</column></row><table><table>table see original document page 20</column></row><table>

A diferença na recuperação do anticorpo HER2 causada pelosalpico do anticorpo terapêutico Omnitarg® é de até 38,1% e a causada pelosalpico de Herceptin® é de atè 25,6%, respectivamente. A interferência porOmnitarg® e Herceptin® é também evidente partindo da Figura 1.

b) sp1 85her"2 Module Set (Ajuste de Módulo) fabrigado pela BenderMedSystems (N2 de Cat. Biozol BMS207MST)

As incubações e as etapas de lavagem foram realizadas de a-cordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. Padrões de 20, 10, 5,2,5 e 0 ng/mL de HER2 foram salpicados com 500, 250, 0 pg/mL de Hercep-tin® ou foram salpicados com 500, 250, 0 Mg/mL de Omnitarg®, respectiva-mente. Estas amostras foram incubadas na placa para microtitulação reves-tida. Após a adição e a incubação do anticorpo de detecção, o substrato foiadicionado e a absorbância foi lida em 405 nm. Os resultados são fornecidosna Tabela 2.

Tabela 2

Densidades ópticas (DQs) que são medidas com e sem o anticorpoterapêutico interferente na amostra

<table>table see original document page 20</column></row><table><table>table see original document page 21</column></row><table>

A diferença na recuperação do antígeno HER2 causada pelosalpico com o anticorpo terapêutico Herceptin® é de até 98,6% e a causadapor Omnitarg® de até 28,6%. Isto é também representado na Figura 2.

Exemplo 2

Ensaio para a detecção de HER2 na presença de Omnitarg®

O ensaio foi realizado em chips de poliestireno revestidos comestreptavidina. O anticorpo para HER2 foi aplicado no chipe na forma de li-nhas ed aproximadamente dez gotículas de 250 pL. MAK<Her2>H-4D5-lgG-Bi (= monoclonal anticorpo biotinilado do clone 4D5 contra HER2) foi utiliza-do como um anticorpo de captura para estabelecer um ensaio sem a interfe-rência por Omnitarg®. A concentração dos anticorpos biotinilados era de 100pg/rnL. Os chips foram armazenados a 4°C.

MAK<Her2>M-7C2-lgG-Dig (monoclonal anticorpo digoxigenila-do do clone 7C2) foi utilizado como o anticorpo conjugado. A solução esto-que deste conjugado foi armazenada a -20°C.

A proteína padronizada de HER2 sp185 (HER-2) (sHER2), eraum produto disponível comercialmente (Biozol Ng BMS207MST S) e foi ar-mazenada a -20°C em uma concentração de 10OO ng/mL.

Foram utilizados como a amostra básica e o tampão do conjuga-do uma solução salina tamponada com fosfato (50 mM de dihidrogênio fosfa-to de sódio monohidratado, 150 mM de NaCI a pH 7), compreendendo azidasódica (0,09% de Na-azida) como um conservante e aditivos adicionais(0,035% de EDTA1 0,05% de Tween 20®, 2,00% de RPLA4 (Roche Nr.1726544001), 0,10% de PAK<->R-lgG (Roche Nr. 1108750001), 100 pg/mLde camundongo-MAK-33-lgG-Poly (Roche Nr. 1939661001)). A amostra e otampão do conjugado foram filtrados (tamanho de poro de 0,2 pm) e arma-zenados a 4°C antes do uso.

A solução estoque do anticorpo terapêutico Omnitarg® rhuMAb2C4 G186 CP R9805AX - produzido pela Genentech, Inc. - tinha uma con-centração de 25 mg/mL e foi armazenada a 4°C.

Foi utilizado como o anticorpo de detecção MAK<Dig>M19-11-IgG conjugado com partículas de látex marcadas com fluorescência a 110nm. A detecção do conjugado de anticorpo foi armazenada a 4°C.

Foi utilizado como o tampão de detecção um tampão de 50 mMde TAPS e 1 M de NaCI em pH 8,5, compreendendo azida sódica (0,09% deNa-azida) como um conservante e aditivos adicionais (0,05% de Tween 20®,0,50% de RPLA4 (Roche Nr. 1726544001), 10 Mg/ml_ de camundongo-MAK-33-lgG-Poly (Roche Nr. 1939661001)). O tampão de detecção foi filtrado(tamanho de poro de 0,2 pm) e armazenado a 4°C antes do uso.

O tampão de lavagem era um tampão de 10 mM de Tris/HCIcom pH 8,0 compreendendo 0,001% de Oxypyrion, 0,001% de MIT e 0,01%de Thesit. O tampão de lavagem foi filtrado (tamanho de poro de 0,2 pm) earmazenado a 4°C antes do uso.

a) Detecção de uma interferência potencial por Omnitarg®

O ensaio foi realizado à temperatura ambiente. Todos os reagen-tes foram levados a esta temperatura antes do ensaio ser realmente realizado.

Uma amostra contendo 20 ng/mL de HER2 foi incubada com vá-rias quantidades de Omnitarg® para resultar nas concentrações fornecidasna Figura 3. Estas amostras foram diluídas 1:5 em tampão de amostra. Du-plicatas de 40 μΙ_ de cada amostra diluída são adicionadas nos chips e incu-badas à temperatura ambiente durante 10 min. Depois disso, os chips sãolavados através de uma etapa de lavagem automatizada. O anticorpo conju-gado MAK<Her2>M-7C2-lgG-Dig foi diluído até 3 pg/mL em tampão do con-jugado. 40 μΙ_ dos anticorpos conjugados diluídos foram adicionados em ca-da chip e incubados durante 5 min seguidos por uma etapa de lavagem au-tomatizada. O anticorpo de detecção marcado foi diluído 1:5 em tampão demarcação (= detecção). 40 μΙ_ do anticorpo de detecção diluído são adicio-nados em cada chip e incubados durante 5 min. Após uma etapa de Iava-gem final a marcação ligada é quantificada utilizando um laser com uma ex-citação de 633 nm. Uma fotografia digital é convertida em contagens atravésde um software apropriado. Como pode ser observado partindo da Figura 3o Omnitarg® (acima de uma concentração final de 25 pg/mL) interferia a umaextensão constante no ensaio acima.

b) Medida de HER2 na presença de Omnitarg®

Para a medida de amostras que poderiam exibir interferência porOmnitarg® o ingrediente ativo deste fármaco (rhu Mab 2C4 G186 CPR9805AX) foi adicionado no tampão de amostra em uma concentração finalde 6,25 pg/mL (= tampão de amostra (A)).

Para a preparação de amostras artificiais o material padronizadode HER2 foi diluído até 500, 200, 100, 50, 20, 10, 5, 2,5, 1 e 0 ng/mL, res-pectivamente, em soro de camundongo. Estas amostras foram diluídas 1:5em tampão de amostra (A). Duplicatas de 40 μί_ de cada amostra diluída sãoadicionadas nos chips e incubadas à temperatura ambiente durante 10 min.Depois disso, os chips foram lavados através de uma etapa de lavagem au-tomatizada. O anticorpo conjugado MAK<Her2>M-7C2-lgG-Dig foi diluídoaté 3 μ g/m L no tampão do conjugado. 40 μΐ_ dos anticorpos conjugados dilu-idos foram adicionados em cada chip e incubados durante 5 min seguidospor uma etapa de lavagem automatizada. O anticorpo de detecção marcadofoi diluído 1:5 em tampão de detecção. 40 μΙ_ do anticorpo de detecção diluí-do são adicionados em cada chip e incubados durante 5 min. Após uma eta-pa de lavagem final a marcação ligada é quantificada utilizando um lasercom uma excitação de 633 nm. Uma fotografia digital é convertida em con-tagens através de um software apropriado. As contagens são fornecidas naTabela 3.

Tabela 3

Contagens obtidas com salpicos de MAK<Her2>H-4D5-lqG-Bi(curva de calibracão no tampão de amostra amostra (A))

<table>table see original document page 20</column></row><table>

Como pode ser observado partindo da Tabela 3, é facilmentepossível estabelecer uma curva de calibração na presença de um nível bási-co de Omnitarg®.

Exemplo 3

Ensaio para a detecção de HER2 na presença de Herceptin®

O ensaio foi realizado em chips de poliestireno revestidos comestreptavidina. O anticorpo para HER2 foi aplicado no chip na forma de li-nhas de aproximadamente dez gotículas de 250 pL. MAK<Her2>H-2C4-lgG-Bi (= monoclonal anticorpo biotinilado do clone 2C4 contra HER2) foi utiliza-do para estabelecer um ensaio isento de interferência de Herceptin®. A con-centração dos anticorpos biotinilados era de 100 pg/mL. Os chips foram ar-mazenados a 4°C.

MAK<Her2>M-7C2-lgG-Dig (monoclonal anticorpo digoxigenila-do do clone 7C2) foi utilizado como o anticorpo conjugado. A solução esto-que deste conjugado foi armazenada a -20°C.

A proteína padronizada de HER2 sp185 (HER-2) (sHER2), eraum produto disponível comercialmente (Biozol Nq BMS207MST S) e foi ar-mazenada a -20°C em uma concentração de 1000 ng/mL.

Foram utilizados como a amostra básica e o tampão do conjuga-do uma solução salina tamponada com fosfato (50 mM de dihidrogênio fosfa-to de sódio monohidritado, 150 mM de NaCI em pH 7), compreendendo azi-da sódica (0,09% de Na-azida) como um conservante e aditivos adicionais(0,035% de EDTA1 0,05% ed Tween 20®, 2,00% de RPLA4 (Roche Nr.1726544001), 0,10% de PAK<->R-lgG (Roche Nr. 1108750001), 100 Mg/mLde camundongo-MAK-33-lgG-Poly (Roche Nr. 1939661001)). A amostra e otampão do conjugado foram filtrados (tamanho de poro de 0,2 μηη) e arma-zenados a 4°C antes do uso.

A solução estoque da variação Mab4D5 humana do anticorpo te-rapêutico Herceptin - produzida pela Roche Diagnostics GmbH - tinha umaconcentração de 25 mg/mL e foi armazenada a -20°C.

Foi utilizado como o anticorpo de detecção MAK<Dig>M19-11-IgG conjugado a partículas de látex marcadas com fluorescência em 110nm. O conjugado do anticorpo de detecção foi armazenado a 4°C.

Foi utilizado como o tampão de detecção um tampão de 50 mMde TAPS e 1 M de NaCI em pH 8,5, compreendendo azida sódica (0,09% deNa-azida) como um conservante e aditivos adicionais (0,05% de Tween 20®,0,50% de RPLA4 (Roche Nr. 1726544001), 10 Mg/mL de camundongo-MAK-33-lgG-Poly (Roche Nr. 1939661001)). O tampão de detecção foi filtrado(tamanho de poro de 0,2 μηη) e armazenado a 4°C antes do uso.

O tampão de lavagem era um tampão de 10 mM de Tris/HCIcom pH 8,0 compreendendo 0,001% de Oxypyrion, 0,001% de MIT e 0,01%de Thesit. O tampão de lavagem foi filtrado (tamanho de poro de 0,2 pm) earmazenado a 4°C antes do uso.

a) Detecção de uma interferência potencial por Herceptin®

O ensaio foi realizado à temperatura ambiente. Todos os reagen-tes foram levados a esta temperatura antes do ensaio se realmente realizado.

Uma amostra contendo 20 ng/mL de HER2 foi incubada com vá-rias quantidades de Herceptin® para resultar nas concentrações fornecidasna Figura 4. Estas amostras foram diluídas 1:5 em tampão de amostra. Du-plicatas de 40 μΙ_ de cada amostra diluída são adicionadas nos chips e incu-badas à temperatura ambiente durante 10 min. Depois disso, os chips sãolavados através de uma etapa de lavagem automatizada. O anticorpo conju-gado MAK<Her2>M-7C2-lgG-Dig foi diluído até 3 pg/mL no tampão do con-jugado. 40 μΙ_ dos anticorpos conjugados diluídos foram adicionados em ca-da chip e incubados durante 5 min seguidos por uma etapa de lavagem au-tomatizada. O anticorpo de detecção marcado foi diluído 1:5 no tampão dedetecção. 40 μΙ_ do anticorpo de detecção diluído são adicionados em cadachip e incubados durante 5 min. Após uma etapa de lavagem final a marca-ção ligada é quantificada utilizando um laser com uma excitação de 633 nm.Uma fotografia digital é convertida em contagens através de um softwareapropriado. Como pode ser observado partindo da Figura 4 o Herceptin®(acima de uma concentração de 25 pg/mL) interferia a uma extensão cons-tante no ensaio anterior.

b) Medida de HER2 na presença de Herceptin®

Para a medida de amostras que poderiam exibir interferência pe-lo Herceptin® o ingrediente ativo deste fármaco (MAK<Herceptin> 7.4.04) foiadicionado no tampão de amostra em uma concentração final de 6,25 pg/mL(= tampão de amostra (B)). O tampão de amostra (B) foi filtrado (tamanho deporo de 0,2 pm) e armazenado a 4°C antes do uso.

Para a preparação de amostras artificiais o material padronizadode HER2 foi diluído até 500, 200, 100, 50, 20, 10, 5, 2,5, 1 e 0 ng/mL, res-pectivamente, em soro de camundongo. Estas amostras foram diluídas 1:5no tampão de amostra (B). Duplicatas de 40 μΙ_ de cada amostra diluída sãoadicionadas nos chips e incubadas à temperatura ambiente durante 10 min.Depois disso, os chips são lavados através de uma etapa de lavagem auto-matizada. O anticorpo conjugado MAK<Her2>M-7C2-lgG-Dig foi diluído atéμg/m L no tampão do conjugado. 40 μΙ_ dos anticorpos conjugados diluídosforam adicionados em cada chip e incubados durante 5 min seguidospor uma etapa de lavagem automatizada. O anticorpo de detecção marcadofoi diluído 1:5 no tampão de detecção. 40 pL do anticorpo de detecção diluí-do são adicionados em cada chip e incubados durante 5 min. Após uma eta-pa de lavagem final a marcação ligada é quantificada utilizando um lasercom uma excitação de 633 nm. Uma fotografia digital é convertida em con-tagens através de um software apropriado. As contagens são fornecidas naTabela 4.

Tabela 4

Contagens obtidas com salpicos de MAK<Her2>H-2C4-laG-Bi (curva de ca-libracão no tampão de amostra (B))

<table>table see original document page 27</column></row><table>

Como pode ser observado partindo da Tabela 4, é facilmentepossível estabelecer uma curva de calibração para HER2 na presença deum nível básico de Herceptin®.

Exemplo 4

Medida de HER2 em uma amostra com e sem anticorpo terapêu-tico, respectivamenteUm grupo de soro de camundongos carregando o tumor KPL-4(que é conhecido por produzir HER2) foi preparado e dividido em quatro alí-quotas.

As alíquotas 1 e 2 foram diluídas 1:5 em tampão de amostra (B)e (A), respectivamente (= amostras não tratadas).

À alíquota 3 foi adicionado mais Herceptin® de forma que a con-centração final fosse de 2000 pg/mL. Então esta foi diluída com o tampão deamostra (B) para também resultar no final em uma diluição de 1:5 como aalíquota 1 (= amostra tratada 3).

À alíquota 4 foi adicionado mais Omnitarg® de forma que a con-centração final fosse de 2000 pg/mL. Então essa foi diluída com tampão deamostra (A) para também resultar no final em uma diluição de 1:5 como aalíquota 2 (= amostra tratada 4).

As amostras foram medidas como descrito nos exemplos 2b) e3b), respectivamente. Os resultados são mostrados na Tabela 5.

Tabela 5

<table>table see original document page 28</column></row><table>

Apesar das enormes quantidades de anticorpo terapêutico adi-cionadas, as diferenças entre as amostras não tratadas e tratadas não sãomaiores que 10%. Assim para ambos os fármacos Omnitarg® e Herceptin®poderia ser estabelecido um ensaio que funcionaria na presença de altasquantidades do anticorpo terapêutico correspondente.

Claims (10)

1. Processo de detecção do antígeno-alvo de um anticorpo tera-pêutico em uma amostra que compreende as etapas dea) fornecimento da amostra que será analisada,b) incubação da dita amostra com o dito anticorpo terapêuticosob condições apropriadas para a ligação do dito anticorpo terapêutico aodito antígeno-alvo, através da qual é formado um complexo antígeno-alvo -anticorpo terapêutico ec) detecção do complexo formado em (b).

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a dita de-tecção é realizada através de um ensaio imunológico.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado adi-cionalmente pelo fato de que o dito ensaio imunológico é um ensaio imuno-lógico em sanduíche.

4. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 até 3, ca-racterizado adicionalmente pelo fato de que o dito anticorpo terapêutico é umanticorpo humano ou um humanizado.

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado adi-cionalmente pelo fato de que o dito anticorpo humano ou humanizado é umanticorpo monoclonal.

6. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 até 5, emque o dito anticorpo terapêutico é selecionado do grupo que consiste emAvastin®, Herceptin®, MabThera®, Omnitarg® e Zenapax®.

7. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 até 5, emque o dito antígeno-alvo é selecionado do grupo que consiste em HER2,CD20 e do receptor da interleucina-2.

8. Processo de detecção do antígeno-alvo de um anticorpo tera-pêutico em uma amostra em que o dito anticorpo terapêutico está presentecompreendendo as etapas dea) fornecimento da amostra que será analisada,b) incubação da dita amostra com o dito anticorpo terapêuticosob condições apropriadas para a ligação do dito anticorpo terapêutico aodito antígeno-alvo, através da qual é formado um complexo antígeno-alvo -anticorpo terapêutico ec) detecção do complexo formado em (b).

9. Processo de detecção do antígeno-alvo de um anticorpo tera-pêutico em uma amostra obtida de um paciente sob terapia com o dito anti-corpo terapêutico que compreende as etapas dea) fornecimento da amostra que será analisada,b) incubação da dita amostra com o dito anticorpo terapêuticosob condições apropriadas para a ligação do dito anticorpo terapêutico como dito antígeno-alvo, através da qual é formado um complexo antígeno-alvo -anticorpo terapêutico ec) detecção do complexo formado em (b).

10. Uso de um processo como definido em qualquer uma dasreivindicações anteriores, no acompanhamento de pacientes.