KR20080016939A - 대응하는 치료 항체의 존부에 관계없는 표적 항원의 검출방법 - Google Patents

대응하는 치료 항체의 존부에 관계없는 표적 항원의 검출방법

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KR20080016939A
KR20080016939A KR1020087000259A KR20087000259A KR20080016939A KR 20080016939 A KR20080016939 A KR 20080016939A KR 1020087000259 A KR1020087000259 A KR 1020087000259A KR 20087000259 A KR20087000259 A KR 20087000259A KR 20080016939 A KR20080016939 A KR 20080016939A
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헬무트 렌츠
베르너 쉐어
마르티나 티어
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본 발명은 치료 항체 분야에 관한 것이다. 본 발명은 특히 하기 단계를 포함하는, 시료 내에서 치료 항체의 표적 항원 검출 방법에 관한 것이다: a) 분석 대상 시료를 제공함, b) 상기 치료 항체와 상기 표적 항원의 결합에 적절한 조건 하에서 상기 시료를 상기 치료 항체와 인큐베이션함으로써, 표적 항원-치료 항체-복합체를 생성함, 및 c) (b) 에서 생성된 복합체를 검출함.

Description

대응하는 치료 항체의 존부에 관계없는 표적 항원의 검출 방법 {DETECTION OF A TARGET ANTIGEN IRRESPECTIVE OF THE PRESENCE OR ABSENCE OF A CORRESPONDING THERAPEUTIC ANTIBODY}
본 발명은 대응하는 치료 항체의 존부에 관계없이 표적 항원을 검출하는 방법에 관한 것이다. 특히, 대응 치료 항체의 존재 하에서의 표적 항원의 측정에 관계된다. 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 시료 내에서 치료 항체의 표적 항원 검출 방법을 개시하고 있다: a) 분석 대상 시료를 제공함, b) 상기 치료 항체와 상기 표적 항원의 결합에 적절한 조건 하에서 상기 시료를 상기 치료 항체와 함께 인큐베이션하여, 표적 항원-치료 항체-복합체를 생성함, 및 c) (b) 에서 생성된 복합체를 검출함. 또한, 환자의 후속 치료에 있어서 상기 방법의 용도에 관한 것이다.
1974년 Kohler 와 Milstein 이 최초로 단일클론 항체를 개발한 이래로 인간 치료에 적합한 항체의 개발에 많은 노력이 있었다. 사용가능하게 된 최초 단일클론 항체는 마우스 및 래트에서 개발되었다. 이러한 항체를 인간 치료에 사용할 경우 항-설치류 항체로 인하여 원치않는 부작용을 유발하였다. 그러한 원치않는 부작용을 축소 또는 심지어 제거하기 위하여 많은 노력이 있었다.
과거 10년간 더욱 많은 수의 인간 단일클론 항체 또는 인간화된(humanized) 단일클론 항체가 시판되었다. 잘 알려진 예로는, 예를 들어 Hoffmann-La Roche, Basel 의 Herceptin® 및 MabThera® 가 포함된다.
상당히 많은 수의 인간 또는 인간화된 단일클론 항체가 검토되고 있고 인간에의 도입 이전에 실험 동물에 대하여 연구할 필요가 있으며, 이를 첫 번째 시험 목적상 고려할 수 있다.
치료용 단일클론 항체는 통상적으로 ml 당 약 1 나노그램 내지 ml 당 약 100 마이크로그램 범위 수준의 혈청과 함께 사용해야 한다. 따라서 치료 항체는 치료 계획 과정의 일정 시점 중 하나 이상에서, 상당히 높은 농도, 예컨대 대응 표적 항원 농도만큼 높거나 혹은 그보다도 높은 농도로 존재한다.
표적 항원 자체의 정확한 측정은, 치료 후, 특히 대응하는 치료 항체를 이용한 치료 후 환자의 후속 치료에 있어서 특히 매우 중요한 것으로 여겨진다. 치료 계획 과정 중에 치료 항체의 농도가 광범위하게 변화하게 되므로, 그 대응 표적 항원의 측정을 위해 설정된 어세이(assay)에 있어서 상기 치료 항체의 어떠한 방해도 상기 표적 항원의 잘못된 측정을 유발할 수 있으며 그러할 가능성이 매우 높다.
표적 항원의 수준은 임의의 적절한 방법으로 검출가능하다. 일상적 임상에서 대부분의 경우 상기 방법은 표적 항원에 대한 항체를 이용하는데 이른바 면역 어세이라 불리는 방법이다. 그 표적 항원의 수준을 측정하는 데 이용되는 면역 어세이에 있어서 치료 항체의 높고/거나 가변적인 농도가 방해가 될 수 있다.
당업자라면 치료 항체 자체를 그 대응하는 표적 항원의 검출에 사용하는 것이 가능하지 않음을 혹은 최소한 용이한 작업이 아님을 쉽게 인지할 수 있다. 치료 항체 및 면역 어세이에 이용되는 항체 중 하나 이상이 표적 항원의 동일한 에피토프에 결합하는 경우, 동일한 어려움에 빈번하게 봉착하게 된다. 한편 이러한 사실이 잘 알려져 있고 일반적으로 받아들여지나, 현재 놀랍게도 표적 항원의 검출을 위한 면역 어세이가, 치료 항체가 비록 대응 표적 항원을 위한 면역 어세이에 사용되는 항체 또는 항체들에 의해 결합되지 않는 에피토프에 결합하더라도, 상기 치료 항체의 존재 또는 부재에 의해서도 훼손될 수 있음이 발견되었다.
Jilani 등은 (Jilani, L, 등, Blood 1032 (2003) 3514-3520), 세포 표면 상에서 리툭시맙을 검출하기 위하여 리툭시맙 내 마우스 서열을 특이적으로 탐지하고 인간 Ig 과 교차 반응하지 않는 항체를 이용하였음을 보고하였다. WO 03/024993 에는 치료 항체:항원 복합체, 가용성 항원, 자유 치료 항체 및 가용성 총 치료 항체의 검출 및 모니터링 방법이 보고되어 있다.
본 발명의 목적은 시료 내에서 치료 항체의 표적 항원 검출 방법이 개선될 수 있는지 여부를 조사하는 것이었다. 그러한 방법은 해당 치료 항체가 존재하는지 여부에 관계없이 표적 항원의 농도에 대한 정확하고 진실한 값을 제공해야하며, 예컨대 환자의 후속 치료와 같은 연속적인 측정에 있어서 이용가능해야 한다.
이 목적은 하기 상세 설명 및 실시예 및 첨부된 청구의 범위에 설명된 본 발명에 의해 달성되었다.
본 발명의 요약
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 시료 내에서 치료 항체의 표적 항원 검출 방법을 포함한다:
a) 분석 대상 시료를 제공함,
b) 상기 치료 항체와 상기 표적 항원의 결합에 적절한 조건 하에서 상기 시료를 상기 치료 항체와 인큐베이션하여, 총 표적 항원이 치료 항체에 의해 복합체화된 표적 항원-치료 항체-복합체를 생성함, 및
c) b) 에서 생성된 복합체를 검출함.
발명의 상세한 설명
제 1 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 시료 내에서 치료 항체의 표적 항원 검출 방법에 관한 것이다: a) 분석 대상 시료를 제공함, b) 상기 치료 항체와 상기 표적 항원의 결합에 적절한 조건 하에서 상기 시료를 상기 치료 항체와 인큐베이션하여, 표적 항원-치료 항체-복합체를 생성함, 및 c) b) 에서 생성된 복합체를 검출함.
"표적 항원" 이란 용어는 그 대응하는 치료 항체에 의해 결합되는 생분자에 관계된다. 예를 들어, HER2 (= ErbB2 또는 p 185 neu) 에 대한 Herceptin® 또는 Omnitarg® 등의 치료 항체의 표적 항원은 HER2, CD52 에 대한 Campath® 등의 치료 항체의 표적 항원은 CD52, EGFr 에 대한 Erbitux® 등의 치료 항체의 표적 항원은 EGFr, CD33 에 대한 Mylotarg® 등의 치료 항체의 표적 항원은 CD33, Tag-72 에 대한 OncoScint® 등의 치료 항체의 표적 항원은 Tag-72, 17-1A 에 대한 Panorex® 등의 치료 항체의 표적 항원은 17-1A, CD20 에 대한 Rituxan®, MabThera®, 또는 Zevalin® 등의 치료 항체의 표적 항원은 CD20, 및 CD25 에 대한 Zenapax® 등의 치료 항체의 표적 항원은 CD25 이다. 표적 항원은 가용성, 즉 분비되거나 흐르는 표적 항원 또는 (세포-)막 결합 표적 항원일 수 있다.
다른 구현예에서, 단계 b) 에서 형성된 상기 표적 항원-치료 항체-복합체는 총 표적 항원이 치료 항원에 의해 복합체화되도록 형성된다.
본원에서 사용되는 "가용성 표적 항원" 이란 용어는 치료 항체의 막-결합 표적 항원의 가용성 형태, 즉 분비되거나 흐르는 형태를 나타낸다. 치료 항체는 대부분, 이들이 결합하는 예컨대 암세포의 세포 표면 항원을 표적으로 한다. 분비되거나 흐르는, 즉 가용성인 세포 표면 항원의 막-결합 변형체 외에도, 그러한 항원의 변형체가 세포에 의해 생성될 수 있다. 가용성 표적 항원은 감염된 개체의 체액에서 발견가능하다. "가용성 표적 항원" 은 막-결합 항원의 분비되거나 흐르는 변형체로서, 상기 가용성 변형체는 막-결합 항원의 세포외 도메인의 최소한 일부와 동일한 아미노산 서열 및 동일한 2차 구조를 보유함으로써 (막-결합) 표적 항원의 세포외 도메인에 대한 항체 또한 가용성 표적 항원에 결합할 수 있게 한다.
다른 구현예에서, 상기 표적 항원은 가용성 표적 항원이다.
본원에서 "에피토프" 란 용어는 항체에 특이적으로 결합가능한 단백질 결정인자를 가리킨다. 에피토프는 통상 아미노산 또는 당 곁사슬과 같은 화학적 활성 표면 분자 그룹으로 이루어지고 특이적인 3차원 구조 특성과 특이적인 전하 특성을 통상 가진다. 입체배열(conformational) 및 비(非)-입체배열 에피토프는, 전자에 대한 결합이 변성 용매의 존재 하에서는 손실되지만 후자는 그렇지 않다는 점에서 구분된다. 에피토프가 속하는 항원의 크기에 따라, 항원 당 2 이상의 에피토프가 가능할 수 있고, 이에 따라 마찬가지로 항원 당 2 이상의 항체 결합 부위 (=에피토프) 가 가능하게 된다.
본 발명에 따른 "시료" 는 실험 동물, 바람직하게는 포유류로부터 채취한 임의의 조직 또는 액체 시료일 수 있다. 바람직하게, 상기 시료는 타액, 소변, 전혈, 혈장 또는 혈청 등의 액체 시료이다. 바람직하게, 상기 시료는 전혈, 혈장 또는 혈청이다. 바람직하게, 상기 시료는 무세포 시료, 즉 막-결합 표적 항원을 지닌 세포를 함유하지 않은 시료이다.
표적 항원이 그 대응하는 "치료 항체" 에 결합하기 위한 적절한 조건은 당업계에 잘 알려져 있거나 용이하게 정할 수 있다. 이러한 조건 하에, 치료 항체가 막-결합 또는 가용성 변형체인 표적 항원에 결합하여, 표적 항원과 치료 항체 사이의 면역학적 복합체가 형성됨으로써, 표적 항원-치료 항체-복합체가 생성된다. 상기 복합체는 임의의 적절한 수단에 의해 탐지가능하다.
바람직한 구현예에서, 표적 항원-치료 항체-복합체는 면역 어세이의 도움으로 검출된다. 이용되는 면역 어세이는 바람직하게는 이종 면역 어세이이다. 경쟁적 면역 어세이 또는 이른바 샌드위치 면역 어세이의 도움으로 표적 항원-치료 항체-복합체의 검출을 실시하는 것 또한 바람직하다.
당업자라면 표적 항원-치료 항체-복합체에 존재하는 표적 항원을 검출할 수 있는 면역 어세이를 준비하는 데 아무 문제가 없다. 예를 들어서, 항체가 치료 항체의 에피토프와 중복되지 않는 에피토프에서 표적 항원과 결합하는 포획 항체(capture antibody)로서 사용되는 샌드위치 타입 면역 어세이에서 상기 검출을 수행할 수 있다. 표적 항원-치료 항체-복합체의 검출을 위하여, 치료 항체 및 포획 항체에 의해 인지되지 않는 에피토프에 결합하는 표적 항원에 대한 2차 또는 검출 항체를 사용하는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 검출 항체-표적 항원-치료 항체-복합체 샌드위치를 형성할 수 있는 검출 항체를 사용한다. 상기 2차 또는 검출 항체를, 바람직하게는 직접 또는 간접 검출을 용이하게 하는 방식으로 표지한다.
직접 검출을 위해, 표지 군은 임의의 공지된 검출가능한 마커 군, 예컨대 염료, 발광 표지 군, 예컨대 아크리디늄 에스테르 또는 디옥세탄 등의 화학발광 군, 또는 형광 염료, 예컨대 플루오레세인, 쿠마린, 로다민, 옥사진, 레소루핀, 시아닌 및 이의 유도체 중에서 선택가능하다. 다른 표지 군의 예로는 발광 금속 착물, 예컨대 루테늄 또는 유로퓸 착물, 효소, 예컨대 ELISA 또는 CEDIA (Cloned Enzyme Donor Immunoassay, 예 EP 0 061 888) 에 사용되는 것, 및 방사성동위원소가 있다.
간접 검출 시스템은, 예컨대 검출 항체와 같은 검출 시약이 바이오아핀(bioaffine) 결합 쌍의 첫 번째 파트너로 표지되어 있는 것을 포함한다. 적당한 결합 쌍의 예로는, 합텐 또는 항원/항체, 비오틴 또는 비오틴 유사체, 예컨대 아미노비오틴, 이미노비오틴 또는 데스티오비오틴/아비딘 또는 스트렙타비딘, 당/렉틴, 핵산 또는 핵산 유사체/상보성 핵산, 및 수용체/리간드, 예컨대 스테로이드 호르몬 수용체/스테로이드 호르몬이 있다. 바람직한 첫 번째 결합 쌍 멤버는 합텐, 항원 및 호르몬을 포함한다. 특히 바람직한 것은 디곡신, 디곡시게닌 및 비오틴과 같은 합텐류 및 이의 유사체이다. 상기 결합 쌍의 두 번째 파트너, 예컨대 항체, 스트렙타비딘 등은 보통, 예컨대 상술한 표지에 의해 직접 검출되도록 표지된다.
면역어세이는 당업자에 공지되어 있다. 상기 어세이의 수행 방법 및 실질적 적용 및 절차는 관련 교재에 정리되어 있다. 관련 교재의 예로는, [Tijssen, P., Preparation of enzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates; Practice and theory of enzyme immunoassays, Burdon, R.H. and v. Knippenberg, P.H. (eds.), Elsevier, Amsterdam (1990) pp. 221-278; 및 various volumes of Methods in Enzymology, Colowick, S.P. and Caplan, N.O. (eds.), Academic Press, 면역학적 검출법을 다루는 부분, 특히 70, 73, 74, 84, 92 및 121 권] 이 있다.
상기 모든 면역학적 검출 방법에 있어서, 사용하는 시약의 결합, 예컨대 항체의 그 대응 항원에 대한 결합을 허용하는 시약 조건을 선택한다. 본 발명에 따라 검출되는 표적 항원-치료 항체-복합체는 당업계 기술 수준에 의해 막-결합 형태 또는 가용성 형태를 불문하고 표적 항원의 대응하는 농도와 서로 관련이 있다.
치료 항체에 의해 인지되지 않는 에피토프에서 표적 항원에 결합하는 항체 또는 항체들은 다클론 항체, 단일클론 항체, 상기 항체의 절편, 및 상기 항체의 결합 도메인을 갖는 유전적 구축물일 수 있다. 적당한 항체 절편 또한 사용할 수 있다. 항체 및 항체 절편은 당업계 기술 수준에 의해, 예컨대 Tijssen 에 기재된 바와 같이 제작된다 (Tijssen, P., Practice and theory of enzyme immunoassays 11 (1990), 전체, 특히 pp. 43-78, Elsevier, Amsterdam).
"치료 항체" 란 용어는 인간에의 사용을 목적으로 하는 임의의 항체 제조물과 관계된다. 바람직하게, 상기 치료 항체는 단일클론 항체이다. 더욱 바람직하게, 상기 단일클론 항체는 유인원으로부터 수득된 것 또는 인간 단일클론 항체 또는 인간화된 항체이다. 바람직하게, 이는 인간 단일클론 항체이다. 또한 바람직하게는, 상기 치료용 단일클론 항체는 인간화된 단일클론 항체이다.
본원에서 "단일클론 항체" 란 용어는 실질적으로 동질적인 항체 집단으로부터 수득된 항체, 즉 집단을 이루는 개별 항체가, 소량으로 존재할 수 있는 자연적으로 발생할 가능성이 있는 돌변연이를 제외하고는 동일한 항체를 말한다. 단일클론 항체는 매우 특이적이어서 단일한 항원성 부위를 표적으로 한다. 게다가 상이한 결정인자 (에피토프) 를 표적으로 하는 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체와는 달리, 각 단일클론 항체는 항원 상의 단일한 결정인자를 표적으로 한다. 그 특이성 외에도, 단일클론 항체는 다른 항체에 의해 오염됨이 없이 합성가능하다는 점에서 유리하다. 수식어구인 "단일클론" 은 실질적으로 동질적인 항체 집단으로부터 수득되는 항체의 성격을 가리키는 것이지 어떠한 특정 방법에 의해 항체를 제조해야 하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단일클론 항체는 [Kohler, G., 등, Nature 256 (1975) 495-497] 에서 최초 기재한 하이브리도마 방법에 의해, 또는 재조합 DNA 방법 (예, US 4,816,567 참조) 에 의해 제작가능하다. "단일클론 항체" 는 또한, 예컨대 [Clackson, T., 등, Nature, 352 (1991) 624-628 및 Marks, J. D., 등, J. MoI. Biol. 222 (1991) 581-597] 에 기재된 기술을 이용한 파지 항체 라이브러리로부터 분리할 수도 있다.
비인간 (예, 설치류) 항체의 "인간화된" 형태는 비인간 면역글로불린 및 인간 면역글로불린으로부터 유래된 일부 서열을 함유한 키메라성 항체이다. 대부분, 인간화된 항체는 그 과가변 영역의 잔기가 원하는 특이성 및 친화성을 갖는 마우스, 래트, 래빗 또는 비인간 영장류 등의 비인간 종 (공여체 항체) 의 과가변 영역의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수용체 항체) 으로부터 유도된다. 일부의 경우, 인간 면역글로불린의 골격 영역 (FR) 잔기가 대응하는 비인간 잔기로 대체된다. 나아가, 인간화된 항체는, 예컨대 수용체 항체 또는 공여체 항체에서 발견할 수 없는 아미노산 잔기와 같은 추가적인 개질을 포함할 수 있다. 그러한 개질은 대응하는 모 서열과 유사하나 동일하지는 않은 수용체 또는 공여체 항체의 변형체를 낳는다. 이러한 개질은 항체 성능을 더욱 개량하기 위해 행해진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 과가변 루프가 비인간 공여체 항체의 것에 해당하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 이 인간 수용체 항체의 것인 하나 이상, 통상적으로는 두 개 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함한다. 또한 인간화된 항체는 임의로, 면역글로불린 불변 영역 (Fc) 중 최소한 일부 (통상적으로는 인간 면역글로불린의 것) 를 포함한다.
비인간 항체의 인간화 방법은 당업계에 공개되어 있다. 바람직하게, 인간화된 항체는 비인간에서 유래된 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입되어 있다. 이러한 비인간 아미노산 잔기를 종종 "수입" 잔기라 부르는데, 이는 통상적으로 "수입" 가변 도메인으로부터 유래된 것이다. 인간화는 본질적으로 Winter 및 공동 연구자들의 방법에 따라 (Jones, P. T., 등, Nature 321 (1986) 522- 525; Riechmann, L., 등, Nature 332 (1988) 323-327; Verhoeyen, M., 등, Science 239 (1988) 1534-1536; and Presta, L. G., Curr. Op. Struct. Biol. 2 (1992) 593-596), 인간 항체의 대응 서열을 과가변 영역 서열로 대체함으로써 수행할 수 있다. 따라서, 상기 "인간화된" 항체는 실질적으로 인간 가변 도메인의 전체보다 작은 부분이 비인간 종의 대응 서열로 치환되어 있는 키메라성 항체이다 (US 4,816,567). 실제상, 인간화된 항체는 통상적으로, 일부 과가변 영역 잔기 및 가능한 일부 FR 잔기가 설치류 항체 내 유사 부위의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
인간화된 항체를 제작하는 데 사용되는 경쇄 및 중쇄의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키는 데 매우 중요하다. 이른바 "최적 적합(best-fit)" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 그 후, 설치류 서열과 가장 가까운 인간 서열을 인간화된 항체의 인간 골격 영역 (FR) 으로 삼는다 (Sims, M. J., 등, J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308; Chothia, C, 등, J. MoI. Biol. 196 (1987) 901-917). 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위 군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 골격 영역을 이용한다. 동일한 골격을 몇 가지 상이한 인간화된 항체에 사용할 수 있다 (Carter, P., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; Presta, L. G., 등, J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632).
면역글로불린은, 예컨대 인간, 마우스, 또는 래트 폴리펩티드에 대해 생성할 수 있다. 표적 항원을 특이적으로 인지하는 다클론 또는 단일클론의 면역글로불린이 본 발명에 포함된다. 그러한 면역글로불린은 당업자에 공지된 표준 면역학적 기술로써 제작된다. 면역글로불린은 다클론 또는 단일클론이거나 또는 인간화된 항체 등의 경우처럼 재조합적으로 제조된 것일 수 있다. 항체가 공지된 치료 항체와 동일한 에피토프에 결합하지 않는지 여부는 경쟁 시험 시스템으로 용이하게 확인할 수 있다.
동일한 표적 항원에 결합하는 두 항체의 가능한 에피토프 중복은 경쟁 시험험 시스템의 도움으로 탐지가능하다. 이를 위해, 예컨대 효소 면역어세이의 도움으로 새로운 항체가 고정된 표적 항원에의 결합에 대해 공지 항체와 경쟁하는 정도를 시험한다. 이를 위해, 적당히 고정된 표적 항원을 표지된 형태의 공지 항체 및 시험 대상인 과량의 항체와 인큐베이션한다. 결합된 표지를 검출함으로써, 시험 대상 항체가 결합 부위 (= 에피토프) 로부터 공지 항체를 대체할 수 있는 정도를 쉽게 확인할 수 있다 공지 항체에 대하여, 동일 농도 또는 더 높은 농도, 바람직하게는 시험 대상 항체가 105 배 과량인 경우에 대체율이 20% 이하, 바람직하게는 10% 이하라면, 에피토프 중복이 존재하지 않는 것이다.
인간화된 치료 항체의 주지된 예는 US 5,821,337 의 표 3 에 기재된 huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 및 huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®) 을 포함하는 이른바 항-ErbB2 항체 (본원에 명백히 참조 병합됨); 및 인간화된 520C9 (WO 93/21319 에 기재됨) 및 PCT/US 03/21590 에 기재된 인간화된 2C4 항체이다.
바람직하게, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 치료 항체는 Campath®, Erbitux®, Herceptin®, MabThera®, Mylotarg®, OncoScint®, Omnitarg®, Panorex®, Rituxan®, Zevalin® 및 Zenapax® 로 이루어진 군, 바람직하게는 Herceptin®, MabThera®, Omnitarg® 및 Zenapax® 로 이루어진 군에서 선택된다.
Zevalin® 은 이브리투모맙으로도 알려진 치료 항체의 상표명이다. 상기 치료 항체는 CD20 에 결합하는 단일클론 항체를 기초로 한 것이며 B-세포 비호지킨 림프종의 치료용으로 FDA 로부터 승인되었다.
Rituxan® 은 리툭시맙으로도 알려진 치료 항체의 상표명이다. 상기 치료 항체는 CD20 에 결합하는 단일클론 항체를 기초로 한 것이며 B-세포 비호지킨 림프종의 치료용으로 FDA 로부터 승인되었다.
Panorex® 은 에드레콜로맙으로도 알려진 치료 항체의 상표명이다. 상기 치료 항체는 17-1A 항원 (Ep-CAM) 에 결합하고 결장직장암의 치료용으로 승인되었다.
OncoScint® 은 사투모맙으로도 알려진 치료 항체의 상표명이다. 상기 치료 항체는 팬카르시노마(pancarcinoma) 항원 Tag-72 에 결합하며 결장 및 난소 암종의 치료용으로 승인되었다.
Mylotarg® 은 겜투즈맙으로도 알려진 치료 항체의 상표명이다. 상기 치료 항체는 CD33 에 결합하는 단일클론 항체를 기초로 한 것이며 골수 백혈병의 치료용으로 FDA 로부터 승인되었다.
Erbitux® 은 세툭시맙으로도 알려진 치료 항체의 상표명이다. 상기 치료 항체는 표피 성장 인자 수용체 (EGFr) 에 결합하며 결장직장암의 치료용으로 승인되었다.
Campath® 은 알렘투주맙으로도 알려진 치료 항체의 상표명이다. 상기 치료 항체는 CD52 에 결합하는 단일클론 항체를 기초로 한 것이며 만성 림프성 백혈병의 치료용으로 FDA 로부터 승인되었다.
Herceptin® 은 트라스투주맙으로도 알려진 치료 항체의 상표명이다. 상기 치료 항체는 단일클론 항체 4D5 를 기초로 한 것이다. 이는 HER2 에 결합한다. HER2 는 ErbB2 또는 p 185 neu 로도 알려져 있다. Herceptin® 은 유방암을 갖는 HER2-양성 환자의 생존에 긍정적인 효과를 갖는 것으로 나타났다 (De Laurentiis, M., 등, Ann. Oncol. 16 (2005) iv7-iv13).
MabThera® 은 리툭시맙으로도 알려진 치료 항체의 상표명이다. 상기 치료 항체는 CD20 에 결합하는 단일클론 항체를 기초로 한 것이다. MabThera® 은 지연성 및 공격성 비호지킨 림프종 환자의 생존에 긍정적인 효과를 갖는 것으로 나타났다 (DiBella, N., 등, Cancer 103 (2005) 978-984).
Omnitarg® 은 HER2 에 결합하는 신규한 치료 항체 퍼투주맙의 상표명이다. 이는 단일클론 항체 2C4 를 기초로 한 것이다. 2C4 및 4D5 는 HER2 상의 상이한 에피토프에 결합한다. Omnitarg® 은 현재 임상 시험 중이다. 이는 유방암을 가진 HER2-과발현-음성 환자의 생존에 긍정적 효과를 가질 것으로 기대된다 (Badache, A., 등, Cancer Cell 5 (2004) 299-301).
Zenapax® 은 인터루킨-2 수용체에 결합하는 치료 항체의 상표명이다. 이는 신장 이식자의 거부반응 감소 및 환자 생존율 향상과 관계 있다 (Morris, J.A., 등, Clin. Transplant. 19 (2005) 340- 345).
또한, 본 발명에 따른 방법에서 검출되는 표적 항원이 HER2, 인터루킨-2 수용체, IGF-IR, EGFr, Tag-72, 17-1A, CD52, CD25, CD33 또는 CD20 로 이루어진 군, 바람직하게는 HER2, 인터루킨-2 수용체, IGF-IR, 및 CD20 로 이루어진 군, 바람직하게는 HER2, 인터루킨-2 수용체, 또는 CD20 로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 발명자들은 대응 표적 항원을 검출하기 위한 어세이에서 사용되는 항체에 의해서도 결합되는 에피토프에 결합하는 치료 항체만이 상기 어세이를 방해하는 것은 아님을 발견하였다. 방해는 표적 항원 상의 중복되지 않는 에피토프에 대한 항체를 이용한 어세이 방법에서도 발생할 수 있으며 관찰되었다. 실시예에 제시된 구체적인 관찰은 HER2 항원 및 이 표적 항원에 결합하는 두 가지 상이한 치료 항체에 대한 어세이에 관한 것이다. 그러나 다른 표적 항원의 정확한 정량에 있어서도 동일한 결과를 얻을 것으로 예상된다. 실시예는 HER2 에 대한 두 상이한 항체, 즉 Herceptin® 및 Omnitarg® 에 대해, 본 발명에 따른 방법을 적용할 수 있으며, 조사 대상 시료 내의 대응 치료 항체의 존부에 관계없이 표적 항원 HER2 가 신뢰할만하게 측정될 수 있음을 증명한다.
일 구현예에서, 치료 항체는 Herceptin®, 포획 항체는 Omnitarg®, 및 검출 항체는 항-ErbB2 항체 7C2 이다.
다른 구현예에서, 치료 항체는 Omnitarg®, 포획 항체는 Herceptin®, 및 검출 항체는 항-ErbB2 항체 7C2 이다.
Herceptin®, Omnitarg®, 및 항-ErbB2 항체 7C2 는 HER2 항원의 상이한 에피토프에 결합한다. 항-ErbB2 항체 7C2 는 예컨대 ErbB2 의 N-말단 영역 내 에피토프를 인지한다 (예컨대 WO 98/17797 참조).
본 방법 발명의 일 구현예에서, 단계 b) 에서 형성된 표적 항원-치료 항체-복합체는 시료 내 총 표적 항원이 치료 항체에 의해 복합체화되도록 생성된다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 시료 내에서 치료 항체의 표적 항원 검출 방법을 포함한다:
a) 분석 대상 시료를 제공함,
b) 상기 치료 항체와 상기 표적 항원의 결합에 적절한 조건 하에서 상기 시료를 상기 치료 항체와 인큐베이션하여, 총 표적 항원이 치료 항체에 의해 복합체화되도록 표적 항원-치료 항체-복합체를 생성함, 및
c) b) 에서 생성된 복합체를 검출함.
표적 항원의 신뢰할만한 측정법은, 방해되는 치료 항체를 포함하는 임의의 시료에 있어서 상당히 유리하다. 따라서 바람직한 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 치료 항체가 존재하는 시료 내에서 상기 치료 항체의 표적 항원 검출 방법에 관한 것이다: a) 분석 대상 시료를 제공함, b) 상기 치료 항체와 상기 표적 항원의 결합에 적절한 조건 하에서 상기 시료를 상기 치료 항체와 인큐베이션하여, 표적 항원-치료 항체-복합체를 생성함, 및 c) b) 에서 생성된 복합체를 검출함.
본 발명에 따른 방법은 또한 치료 항체를 투여받은 환자의 후속 치료에 있어서 매우 유용하다. 따라서 바람직한 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 치료 항체를 이용한 치료 중인 환자로부터 얻은 시료 내의 상기 치료 항체의 표적 항원 검출 방법에 관한 것이다: a) 분석 대상 시료를 제공함, b) 상기 치료 항체와 상기 표적 항원의 결합에 적절한 조건 하에서 상기 시료를 상기 치료 항체와 인큐베이션하여, 표적 항원-치료 항체-복합체를 생성함, 및 c) b) 에서 생성된 복합체를 검출함.
대응하는 표적 항원의 정확한 측정은 치료법의 효능을 평가하는 데 유용한 바람직한 구현예이다. 더욱 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 잠재 질병으로의 재발을 평가하는 데 도움을 준다.
일반적으로 임상의는 본원에 제시된 방법을 이용함으로써, 치료 항체를 이용한 치료 중인 환자의 후속 치료에서 유용한 정보를 이끌어낼 수 있다. 따라서 본 발명은 또한 환자의 후속 치료에 있어서 상기 제시된 방법의 용도에 관한 것이다.
제시된 설명에 얽매이지 않고, 치료 항체의 그 표적 항원에 대한 결합이, 예컨대 다른 에피토프의 입체배열 및/또는 표적 항원-치료 항체-복합체에 존재하는 이들 에피토프에 대한 다른 항체의 결합 특성에 일부 영향을 줄 수도 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 방법은 면역 어세이에 사용되는 항체 및 치료 항체에 대한 표적 항원 상의 에피토프 각각이 중복되지 않더라도 이용된다.
일 구현예에서, 본 방법 발명을 칩 상에서 실시한다.
"칩" 이란 금속, 유리 또는 플라스틱 등의 비다공성 고체 물질이다. 상기 물질은 전체가 혹은 특정 영역이 임의로 코팅될 수 있다. 상기 물질 표면 상에 임의의 스팟(spot) 정렬이 가시적으로 혹은 좌표로 존재할 수 있다. 각 스팟 상에, 물질 표면으로의 링커(linker) 또는 스페이서(spacer)를 포함 혹은 포함하지 않는 일정한 폴리펩티드를 고정시킬 수 있다. 바람직하게, 상기 고정된 폴리펩티드는 적어도 표적 항원에 결합할 수 있는 항체의 절편이다.
하기 실시예 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것이며, 발명의 진정한 범위는 첨부된 청구항에 제시되어 있다. 본 발명의 요지를 벗어남이 없이, 제시된 방법에 변형을 가할 수 있는 것으로 이해된다.
[도면의 간단한 설명]
도 1 Oncogene Sciences 사제의 시판 어세이를 이용한 HER2-검출에서 두 상이한 치료 항체의 방해율.
도 2 Bender 사제의 시판 어세이를 이용한 HER2-검출에서 두 상이한 치료 항체의 방해율.
도 3 치료 항체 Omnitarg® 의 최대 방해율 측정.
도 4 치료 항체 Herceptin® 의 최대 방해율 측정.
도 5 Omnitarg® 및 Herceptin® 각각에 의한 방해없는 어세이를 이용한 HER2-검출의 보정 곡선.
약어
Bi 비오틴
EDTA 에틸렌디아민테트라아세트산
ELISA 효소-결합 면역흡착 어세이
Fcy (=Fcγ) 면역글로불린의 Fc 감마-절편
DIG (Dig) 디곡시게닌
hu, H 인간
IgG 면역글로불린 G
n.d. 정의되지 않음
NSCLC 비소세포폐암
OD 광학 밀도
MAK (=Mab) 단일클론 항체
PAK (=Pab) 다클론 항체
R 카우 (Rind)
RPLA 소-혈장알부민
RT 실온
TAPS N-트리스(히드록시메틸)메틸-3-아미노프로판술폰산
VEGF 혈관 내피 성장인자
실시예 1
HER2 에 대한 시판 어세이
a) Oncogene Science/Bayer Health Care LLC 에서 제작한 HER-2/neu ELISA (Cat. No. DAKO Cytomation EL5011)
인큐베이션 및 세정 단계를 제조업자의 안내에 따라 수행하였다. 35, 25, 15, 7.5, 2.5, 및 0 ng/ml HER2 표준을 각각 500, 250, 0 μg/ml Herceptin® 으로 스파이킹(spike)하거나 또는 500, 250, 0 μg/ml Omnitarg® 으로 스파이킹하였다. 상기 시료를 코팅된 마이크로타이터-플레이트 상에서 인큐베이션하였다. 검출 항체를 첨가 및 인큐베이션한 후, 기질을 가하고 492 nm 에서 흡광도를 읽었다. 그 결과를 표 1 에 나타내었다.
[표 1]
시료 내에 방해되는 치료 항체를 포함 및 불포함하여 측정된 광학 밀도 (OD)
각각 치료 항체 Omnitarg® 의 스파이킹으로 인한 HER2 항원의 회복의 차이는 38.1% 이하이고 Herceptin® 의 스파이킹으로 인한 경우는 25.6% 이하였다. 또한 Omnitarg® 및 Herceptin® 에 의한 방해는 도 1 로부터도 명백하다.
b) Bender MedSystems 에서 제작한 sp185 HER -2 Module Set (Cat. No. Biozol BMS207MST)
인큐베이션 및 세정 단계를 제조업자의 안내에 따라 수행하였다. 20, 10, 5, 2.5, 및 0 ng/ml HER2 표준을 각각 500, 250, 0 μg/ml Herceptin® 으로 스파이킹하거나 또는 500, 250, 0 μg/ml Omnitarg® 으로 스파이킹하였다. 상기 시료를 코팅된 마이크로타이터-플레이트 상에서 인큐베이션하였다. 검출 항체를 첨가 및 인큐베이션한 후, 기질을 가하고 405 nm 에서 흡광도를 읽었다. 그 결과를 표 2 에 나타내었다.
[표 2]
시료 내에 방해되는 치료 항체를 포함 및 불포함하여 측정된 광학 밀도 (OD)
치료 항체 Herceptin® 의 스파이킹으로 인한 HER2 항원의 회복의 차이는 98.6% 이하이고 Omnitarg® 의 스파이킹으로 인한 경우는 28.6% 이하였다. 이를 또한 도 2 에 나타내었다.
실시예 2
Omnitarg® 존재 하의 HER2 검출 어세이
상기 어세이를 스트렙타비딘 코팅된 폴리스티렌 칩 상에서 실시하였다. HER2 에 대한 항체를 칩 상에 약 열 개의 250 pL 액적 줄로서 적용하였다. MAK<Her2>H-4D5-IgG-Bi (=HER2 에 대한 클론 4D5 로부터의 비오티닐화된 단일클론 항체) 를 Omnitarg® 에 의한 방해없이 어세이를 성립시키기 위한 포획 항체로 사용하였다. 비오티닐화된 항체의 농도는 100 μg/ml 였다. 상기 칩을 4℃ 에서 보관하였다.
MAK<Her2>M-7C2-IgG-Dig (클론 7C2 로부터의 디곡시게닐화된 단일클론 항체) 를 콘쥬게이트(conjugate) 항체로 이용하였다. 상기 콘쥬게이트의 원액을 -20℃ 에서 보관하였다.
HER2 표준 단백질 sp185 (HER-2) (sHER2) 는 시판 제품 (Biozol #BMS207MST S) 이었고, 이를 1000 ng/ml 농도로 -20℃ 에서 보관하였다.
보존제로서 소듐 아지드 (0.09% Na-azide), 및 추가 첨가제 (0.035% EDTA, 0.05% Tween 20®, 2.00% RPLA4 (Roche Nr. 1726544001), 0.10% PAK<->R-IgG (Roche Nr. 1108750001), lOOμg/ml 마우스-MAK-33-IgG-Poly (Roche Nr. 1939661001)) 를 포함한 인산염 완충 식염수 (5OmM 소듐 디히드로겐포스페이트-모노히드레이트, 15OmM NaCl, pH 7) 를 기본 시료 및 콘쥬게이트 완충제로서 사용하였다. 상기 시료 및 콘쥬게이트 완충제를 사용 전에 여과하고 (공극 크기 0.2μm) 4℃ 에서 보관하였다.
치료 항체 Omnitarg® rhuMAb 2C4 G 186 CP R9805AX 원액 (Genentech, Inc.제조) 의 농도는 25 mg/ml 이고 4℃ 에서 보관하였다.
검출 항체로서, 110 nm 형광 표지 라텍스 입자에 콘쥬게이트된 MAK<Dig>M19-11-IgG 를 사용하였다. 상기 검출 항체 콘쥬게이트를 4℃ 에서 보관하였다.
검출 완충제로서, 보존제로서 소듐 아지드 (0.09% Na-azide), 및 추가 첨가제 (0.05% Tween 20®, 0.50% RPLA4 (Roche Nr. 1726544001), 1Oμg/ml 마우스-MAK-33-IgG-Poly (Roche Nr. 1939661001)) 를 포함한 50 mM TAPS 및 1M NaCl 완충제 (pH 8.5) 를 사용하였다. 상기 검출 완충제를 사용 전에 여과하고 (공극 크기 0.2μm) 4℃ 에서 보관하였다.
세정 완충제는 0.001% Oxypyrion, 0.001% MIT, 및 0.01% Thesit 을 함유한 1OmM Tris/HCl 완충제 (pH 8.0) 였다. 상기 세정 완충제를 사용 전에 여과하고 (공극 크기 0.2μm) 4℃ 에서 보관하였다.
a) Omnitarg® 에 의한 잠재적 방해의 탐지
본 어세이를 실온에서 수행하였다. 어세이를 실제로 수행하기 전에 모든 시약을 실온으로 맞췄다.
20 ng/ml 의 HER2 를 함유한 시료를 다양한 양의 Omnitarg® 와 인큐베이션하여 도 3 에 표시한 농도를 얻었다. 상기 시료를 시료 완충제에 1:5 로 희석하였다. 각 40 μl 의 희석 시료를 이중으로 칩에 가하고 RT 에서 10 분간 인큐베이션하였다. 그 후, 칩을 자동 세정 단계에 의해 세정하였다. 콘쥬게이트 항체 MAK<Her2>M-7C2-IgG-Dig 를 콘쥬게이트 완충제에 3 μg/ml 로 희석하였다. 40 μl 의 희석된 콘쥬게이트 항체를 각 칩에 가하고 5 분간 인큐베이션한 다음 자동 세정 단계를 수행하였다. 표지된 검출 항체를 표지 (= 검출) 완충제에 1:5 로 희석하였다. 40 μl 의 희석된 검출 항체를 각 칩에 가하고 5 분간 인큐베이션하였다. 최종 세정 단계 후, 여기 파장 633 nm 인 레이저를 이용하여 결합된 표지를 정량하였다. 디지털 사진을 적당한 소프트웨어를 이용하여 계수로 전환하였다. 도 3 에서 알 수 있듯이, Omnitarg® 는 (최종 농도 25 μg/ml 초과시) 상기 어세이에 있어서 계속적으로 방해하였다.
b) Omnitarg® 존재 하에서 HER2 의 측정
Omnitarg® 에 의한 방해를 나타낼 수 있는 시료의 측정을 위해, 상기 약제의 활성 성분 (rhu Mab 2C4 G 186 CP R9805AX) 을 시료 완충제에 최종 농도 6.25 μg/ml 로 첨가하였다 (= 시료 완충제 (A)).
인공 시료의 제조를 위해, HER2 표준 물질을 마우스 혈청에 각각 500, 200, 100, 50, 20, 10, 5, 2.5, 1 및 0 ng/ml 로 희석하였다. 상기 시료들을 시료 완충제 (A) 에 1:5 로 희석하였다. 각 40 μl 의 희석 시료를 이중으로 칩에 가하고 RT 에서 10 분간 인큐베이션하였다. 그 후, 칩을 자동 세정 단계에 의해 세정하였다. 콘쥬게이트 항체 MAK<Her2>M-7C2-IgG-Dig 를 콘쥬게이트 완충제에 3 μg/ml 로 희석하였다. 40 μl 의 희석된 콘쥬게이트 항체를 각 칩에 가하고 5 분간 인큐베이션한 다음 자동 세정 단계를 수행하였다. 표지된 검출 항체를 검출 완충제에 1:5 로 희석하였다. 40 μl 의 희석된 검출 항체를 각 칩에 가하고 5 분간 인큐베이션하였다. 최종 세정 단계 후, 여기 파장 633 nm 인 레이저를 이용하여 결합된 표지를 정량하였다. 디지털 사진을 적당한 소프트웨어를 이용하여 계수로 전환하였다. 그 계수를 표 3 에 나타내었다.
[표 3]
MAK<Her2>H-4D5-IgG-Bi 스팟으로부터 얻은 계수 (시료 완충제 (A) 에서의 보정 곡선)
표 3 에서 알 수 있듯이, 기본 수준의 Omnitarg® 존재 하에 보정 곡선을 용이하게 성립시킬 수 있었다.
실시예 3
Herceptin® 의 존재 하에서 HER2 의 검출을 위한 어세이
본 어세이를 스트렙타비딘 코팅된 폴리스티렌 칩 상에서 실시하였다. HER2 에 대한 항체를 칩 상에 약 열 개의 250 pL 액적 줄로서 적용하였다. MAK<Her2>H-2C4-IgG-Bi (=HER2 에 대한 클론 2C4 로부터의 비오티닐화된 단일클론 항체) 를 Herceptin® 에 의한 방해없는 어세이를 성립시키기 위해 사용하였다. 비오티닐화된 항체의 농도는 100 μg/ml 였다. 상기 칩을 4℃ 에서 보관하였다.
MAK<Her2>M-7C2-IgG-Dig (클론 7C2 로부터의 디곡시게닐화된 단일클론 항체) 를 콘쥬게이트 항체로 이용하였다. 상기 콘쥬게이트의 원액을 -20℃ 에서 보관하였다.
HER2 표준 단백질 sp185 (HER-2) (sHER2) 는 시판 제품 (Biozol #BMS207MST S) 이었고, 이를 1000 ng/ml 농도로 -20℃ 에서 보관하였다.
보존제로서 소듐 아지드 (0.09% Na-azide), 및 추가 첨가제 (0.035% EDTA, 0.05% Tween 20®, 2.00% RPLA4 (Roche Nr. 1726544001), 0.10% PAK<->R-IgG (Roche Nr. 1108750001), lOOμg/ml 마우스-MAK-33-IgG-Poly (Roche Nr. 1939661001)) 를 포함한 인산염 완충 식염수 (5OmM 소듐 디히드로겐포스페이트-모노히드레이트, 15OmM NaCl, pH 7) 를 기본 시료 및 콘쥬게이트 완충제로서 사용하였다. 상기 시료 및 콘쥬게이트 완충제를 사용 전에 여과하고 (공극 크기 0.2μm) 4℃ 에서 보관하였다.
치료 항체 Herceptin 인간 변형체 Mab4D5 원액 (Roche Diagnostics GmbH 제조) 의 농도는 25 mg/ml 이었고 -20℃ 에서 보관하였다.
검출 항체로서, 110 nm 형광 표지 라텍스 입자에 콘쥬게이트된 MAK<Dig>M19-11-IgG 를 사용하였다. 상기 검출 항체 콘쥬게이트를 4℃ 에서 보관하였다.
검출 완충제로서, 보존제로서 소듐 아지드 (0.09% Na-azide), 및 추가 첨가제 (0.05% Tween 20®, 0.50% RPLA4 (Roche Nr. 1726544001), 1Oμg/ml 마우스-MAK-33-IgG-Poly (Roche Nr. 1939661001)) 를 포함한 50 mM TAPS 및 1M NaCl 완충제 (pH 8.5) 를 사용하였다. 상기 검출 완충제를 사용 전에 여과하고 (공극 크기 0.2μm) 4℃ 에서 보관하였다.
세정 완충제는 0.001% Oxypyrion, 0.001% MIT, 및 0.01% Thesit 을 함유한 1OmM Tris/HCl 완충제 (pH 8.0) 였다. 상기 세정 완충제를 사용 전에 여과하고 (공극 크기 0.2μm) 4℃ 에서 보관하였다.
a) Herceptin® 에 의한 잠재적 방해의 탐지
본 어세이를 실온에서 수행하였다. 어세이를 실제로 수행하기 전에 모든 시약을 실온으로 맞췄다.
20 ng/ml 의 HER2 를 함유한 시료를 다양한 양의 Herceptin® 과 인큐베이션하여 도 4 에 표시한 농도를 얻었다. 상기 시료를 시료 완충제에 1:5 로 희석하였다. 각 40 μl 의 희석 시료를 이중으로 칩에 가하고 RT 에서 10 분간 인큐베이션하였다. 그 후, 칩을 자동 세정 단계에 의해 세정하였다. 콘쥬게이트 항체 MAK<Her2>M-7C2-IgG-Dig 를 콘쥬게이트 완충제에 3 μg/ml 로 희석하였다. 40 μl 의 희석된 콘쥬게이트 항체를 각 칩에 가하고 5 분간 인큐베이션한 다음 자동 세정 단계를 수행하였다. 표지된 검출 항체를 검출 완충제에 1:5 로 희석하였다. 40 μl 의 희석된 검출 항체를 각 칩에 가하고 5 분간 인큐베이션하였다. 최종 세정 단계 후, 여기 파장 633 nm 인 레이저를 이용하여 결합된 표지를 정량하였다. 디지털 사진을 적당한 소프트웨어를 이용하여 계수로 전환하였다. 도 4 에서 알 수 있듯이, Herceptin® 은 (농도 25 μg/ml 초과시) 상기 어세이에 있어서 계속적으로 방해하였다.
b) Herceptin® 존재 하에서 HER2 의 측정
Herceptin® 에 의한 방해를 나타낼 수 있는 시료의 측정을 위해, 상기 약제의 활성 성분 (MAK<Herceptin> 7.4.04) 을 시료 완충제에 최종 농도 6.25 μg/ml 로 첨가하였다 (= 시료 완충제 (B)). 시료 완충제 (B) 를 사용 전에 여과하고 (공극 크기 0.2㎛) 4℃ 에서 보관하였다.
인공 시료의 제조를 위해, HER2 표준 물질을 마우스 혈청에 각각 500, 200, 100, 50, 20, 10, 5, 2.5, 1 및 0 ng/ml 로 희석하였다. 상기 시료들을 시료 완충제 (B) 에 1:5 로 희석하였다. 각 40 μl 의 희석 시료를 이중으로 칩에 가하고 RT 에서 10 분간 인큐베이션하였다. 그 후, 칩을 자동 세정 단계에 의해 세정하였다. 콘쥬게이트 항체 MAK<Her2>M-7C2-IgG-Dig 를 콘쥬게이트 완충제에 3 μg/ml 로 희석하였다. 40 μl 의 희석된 콘쥬게이트 항체를 각 칩에 가하고 5 분간 인큐베이션한 다음 자동 세정 단계를 수행하였다. 표지된 검출 항체를 검출 완충제에 1:5 로 희석하였다. 40 μl 의 희석된 검출 항체를 각 칩에 가하고 5 분간 인큐베이션하였다. 최종 세정 단계 후, 여기 파장 633 nm 인 레이저를 이용하여 결합된 표지를 정량하였다. 디지털 사진을 적당한 소프트웨어를 이용하여 계수로 전환하였다. 그 계수를 표 4 에 나타내었다.
[표 4]
MAK<Her2>H-2C4-IgG-Bi 스팟으로부터 얻은 계수 (시료 완충제 (B) 에서의 보정 곡선)
표 4 에서 알 수 있듯이, 기본 수준의 Herceptin® 존재 하에 HER2에 대한 보정 곡선을 용이하게 성립시킬 수 있었다.
실시예 4
치료 항체를 각각 포함 및 포함하지 않는 시료에서 HER2 의 측정
종양 KPL-4 (HER2 를 생성한다고 알려짐) 를 보유한 마우스의 혈청 풀(pool)을 제조하고 네 개의 분취액으로 나누었다.
분취액 1 및 2 를 각각 시료 완충제 (B) 및 (A) 에 1:5 로 희석하였다 (= 미처리 시료)
분취액 3 에 추가로 Herceptin® 을 가하여 최종 농도를 2000μg/ml 로 하였다. 이어서 이를 시료 완충제 (B) 로 희석하여 역시 분취액 1 과 같이 최종적으로 1:5 희석물을 수득하였다 (= 처리 시료 3).
분취액 4 에 추가로 Omnitarg® 을 가하여 최종 농도를 2000μg/ml 로 하였다. 이어서 이를 시료 완충제 (A) 로 희석하여 역시 분취액 2 와 같이 최종적으로 1:5 희석물을 수득하였다 (= 처리 시료 4).
상기 시료들을 각각 실시예 2b) 및 3b) 에 기재한 바와 같이 측정하였다. 그 결과를 표 5 에 나타내었다.
[표 5]
높은 수준의 치료 항체 존재 하에서 시료의 측정
시료/"처리" 시료 완충제 2C4 스팟에 대한 계수 4D5 스팟에 대한 계수 "미처리" (1) 및 (2) 각각 및 "처리" 시료 (3) 및 (4) 각각 간의 차이
1/없음 B 23613 100%
2/없음 A 22758 100%
3/Herceptin® B 21383 90% = -10% 차이
4/Omnitarg® A 21238 93% = -7% 차이
막대한 양의 치료 항체를 첨가하였음에도, 미처리 및 처리 시료 간의 차이는 10% 이하였다. 따라서 Omnitarg® 및 Herceptin® 두 약제에 있어서, 대응하는 치료 항체가 다량으로 존재함에도 불구하고 작동하는 어세이를 구축할 수 있었다.

Claims (10)

  1. 하기 단계를 포함하는 시료 내에서 치료 항체의 표적 항원 검출 방법:
    a) 분석 대상 시료를 제공함,
    b) 상기 치료 항체와 상기 표적 항원의 결합에 적절한 조건 하에서 상기 시료를 상기 치료 항체와 인큐베이션하여, 표적 항원-치료 항체-복합체를 생성함, 및
    c) b) 에서 생성된 복합체를 검출함.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 검출을 면역 어세이에 의해 실시하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 면역 어세이가 샌드위치 면역 어세이임을 추가 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료 항체가 인간 또는 인간화된 항체임을 추가 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 인간 또는 인간화된 항체가 단일클론 항체임을 추가 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료 항체가 Avastin®, Herceptin®, MabThera®, Omnitarg®, 및 Zenapax® 로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 항원이 HER2, CD20, 및 인터루킨-2 수용체로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  8. 하기 단계를 포함하는, 치료 항체가 존재하는 시료 내에서 상기 치료 항체의 표적 항원 검출 방법:
    a) 분석 대상 시료를 제공함,
    b) 상기 치료 항체와 상기 표적 항원의 결합에 적절한 조건 하에서 상기 시료를 상기 치료 항체와 인큐베이션하여, 표적 항원-치료 항체-복합체를 생성함, 및
    c) b) 에서 생성된 복합체를 검출함.
  9. 하기 단계를 포함하는, 치료 항체로 치료 중인 환자로부터 얻은 시료 내에서 상기 치료 항체의 표적 항원 검출 방법:
    a) 분석 대상 시료를 제공함,
    b) 상기 치료 항체와 상기 표적 항원의 결합에 적절한 조건 하에서 상기 시료를 상기 치료 항체와 인큐베이션하여, 표적 항원-치료 항체-복합체를 생성함, 및
    c) b) 에서 생성된 복합체를 검출함.
  10. 환자의 후속 치료에 있어서 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 방법의 용도.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101327542B1 (ko) * 2012-03-15 2013-11-08 광주과학기술원 양자점 기반의 경쟁 면역분석법 및 다중 유세포 분석법을 이용한 시료 중 오염물질의 검출 방법

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030007640A (ko) 2000-05-19 2003-01-23 제넨테크, 인크. ＥｒｂＢ 길항제에 의한 암 치료요법에 대한 효과적인반응의 가능성을 개선시키기 위한 유전자 검출 분석
BRPI0513681A (pt) * 2004-07-22 2008-05-13 Genentech Inc composição que compreendem anticorpo her2, método, formulações farmacêuticas, polipeptìdeo, anticorpo e método de tratamento de cáncer
WO2006039486A2 (en) 2004-10-01 2006-04-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Imaging arrangements and methods therefor
JO3000B1 (ar) * 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
RU2404806C2 (ru) 2005-02-23 2010-11-27 Дженентек, Инк. Продление времени до прогрессирования заболевания или продолжительности жизни у онкологических больных с применением ингибиторов димеризации her
PE20070207A1 (es) * 2005-07-22 2007-03-09 Genentech Inc Tratamiento combinado de los tumores que expresan el her
US8248515B2 (en) 2006-02-07 2012-08-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Variable imaging arrangements and methods therefor
US8358354B2 (en) 2009-01-26 2013-01-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Correction of optical abberations
CL2008000614A1 (es) 2007-03-02 2008-09-05 Genentech Inc F Hoffmann La Ro Metodo para tratar un paciente con un tipo de cancer que expresa el receptor her3 a un nivel bajo mediante la administracion de un inhibidor de la dimerizacion de her.
TWI472339B (zh) 2008-01-30 2015-02-11 Genentech Inc 包含結合至ｈｅｒ２結構域ii之抗體及其酸性變異體的組合物
BRPI0812682A2 (pt) 2008-06-16 2010-06-22 Genentech Inc tratamento de cáncer de mama metastático
CN117018187A (zh) 2011-10-14 2023-11-10 霍夫曼-拉罗奇有限公司 Her2二聚化抑制剂帕妥珠单抗的用途和包含her2二聚化抑制剂帕妥珠单抗的制品
AU2012232949B2 (en) * 2012-09-28 2014-07-03 Willowtree Holdings Pty Ltd Temporary bulkhead
BR112015024926A2 (pt) 2013-04-16 2017-10-10 Genentech Inc composições, artigo de fabricação, métodos para tratar um paciente com câncer, para avaliar uma composição, para avaliar a atividade biológica, para produzir uma composição e para avaliar a fragmentação de uma composição e variante de pertuzumabe
CN106163558A (zh) 2014-04-25 2016-11-23 豪夫迈·罗氏有限公司 用曲妥珠单抗‑mcc‑dm1和帕妥珠单抗治疗早期乳腺癌的方法
WO2016196373A2 (en) 2015-05-30 2016-12-08 Genentech, Inc. Methods of treating her2-positive metastatic breast cancer
WO2017087280A1 (en) 2015-11-16 2017-05-26 Genentech, Inc. Methods of treating her2-positive cancer
CA3046092A1 (en) 2016-12-28 2018-07-05 Genentech, Inc. Treatment of advanced her2 expressing cancer
KR20200113292A (ko) 2017-01-17 2020-10-06 제넨테크, 인크. 피하 her2 항체 제형
US11077189B2 (en) 2017-03-02 2021-08-03 Genentech Inc. Adjuvant treatment of HER2-positive breast cancer
CN110536969A (zh) 2017-04-24 2019-12-03 豪夫迈·罗氏有限公司 跨膜或近膜域中的erbb2/her2突变

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2095818B (en) 1981-03-27 1985-10-02 Exxon Research Engineering Co Staged adsorption/resorption heat pump
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
ATE255131T1 (de) * 1991-06-14 2003-12-15 Genentech Inc Humanisierter heregulin antikörper
AU4025193A (en) 1992-04-08 1993-11-18 Cetus Oncology Corporation Humanized C-erbB-2 specific antibodies
IL129354A0 (en) 1996-10-18 2000-02-17 Genentech Inc Anti-ErbB2 antibodies
EP2131198B1 (en) 2001-09-20 2013-03-27 Board of Regents, The University of Texas System Measuring circulating therapeutic antibody, antigen and antigen/antibody complexes using ELISA assays
PT1585966E (pt) * 2002-07-15 2012-02-20 Hoffmann La Roche Tratamento de cancro com o anticorpo anti-erbb2 rhumab 2c4

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101327542B1 (ko) * 2012-03-15 2013-11-08 광주과학기술원 양자점 기반의 경쟁 면역분석법 및 다중 유세포 분석법을 이용한 시료 중 오염물질의 검출 방법

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