CN105209486B - 含有受体的经稳定的液体配制物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于制备受体的液体溶液的方法和试剂。所述方法包括在液体介质中将所述受体、螯合剂和C2‑C6多元醇组合。所述螯合剂和所述C2‑C6多元醇的量足以获得在所述液体溶液中稳定和活性的受体，将所述液体溶液保持在约2℃至约40℃的温度下。可以将所述组合物用于确定包括受体结合分析物的分析物的测定中。

Description

含有受体的经稳定的液体配制物
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年5月14日提交的美国临时申请序列号61/823,116的优先权，其通过引用全部并入本文。
发明背景
本发明涉及用于确定样品(例如患者样品)中的分析物(例如抗体)的组合物、方法和试剂盒，已知或疑似该样品包含一种或多种这样的分析物。在一些实施例中，本发明更具体地涉及保持受体试剂作为液体配制物在高于冷冻的温度下的储存期间的稳定性。在一些实施例中，本发明更具体地涉及提高用于测定分析物的受体试剂的灵敏度。
临床诊断领域在过去的35年或更长的时间内已经出现了广泛的扩展，既关于可以被容易且准确地确定的所关注的材料的多样性，还关于用于确定的方法。用于检测液体中的低浓度的材料的存在的方便、可靠且不危险的手段是期望的。在临床化学中，这些材料可以按低于10-12摩尔的浓度存在于体液中。检测低浓度的这些材料的困难由于可以利用的相对小的样本容量而增大。
对确定血液和其它生物流体中的许多分析物的需要已经在医学的许多分支中变得越来越明显。在内分泌学中，经常需要许多不同激素的血浆浓度的知识，以针对其中比值可帮助确定疾病进展的给定的诊断来解析(resolve)诊断问题或一组标志物。诸如激素受体的受体通常用于许多体外应用中。在诊断测定中，例如，受体(例如，激素受体)被用于检测指示一种或多种疾病状态的患者抗体。在具体实施例中，促甲状腺激素(也称为促甲状腺激素或TSH)受体被用在用于检测作为格雷夫斯氏病的鉴别诊断的辅助手段的TSH受体抗体的诊断测定中。
由于它们在液体形式中的不稳定性，许多受体在表面上变干或冻干。这些方法是不理想的，因为它们增加制造成本，并且对于使用该试剂的那些人是不便的。此外，重构(reconstitution)使用时，许多这样的受体仍具有非常短的半衰期。
因此，持续需要开发包含受体的组合物，所述组合物在液体形式中表现出良好的稳定性并在采用该受体以测量患者中的抗体和其它分析物的水平的测定中表现出良好的灵敏度。
概述
根据本文所述的原理的一些实施例涉及制备受体的液体溶液的方法。所述方法包括在液体介质中将受体、螯合剂和C2-C6多元醇组合。所述螯合剂和所述C2-C6多元醇的量足以获得在所述液体溶液中稳定和灵敏的受体，在储存期间将所述液体溶液保持在约2℃至约40℃的温度。
根据本文所述的原理的一些实施例涉及使促甲状腺激素受体的液体溶液稳定的方法。所述方法包括将包含促甲状腺激素受体的液体溶液与稳定量的(i)选自三乙酸螯合剂和四乙酸螯合剂的螯合剂和(ii)C3-C5多元醇两者组合。
根据本文所述的原理的一些实施例涉及包含水性介质、受体嵌合体、约0.1 mM至约20 mM的量的螯合剂和按重量计约5%至约50%的量的C2-C6多元醇的组合物。
根据本文所述的原理的一些实施例涉及检测样品中的促甲状腺激素受体抗体的方法。在测定介质中提供组合，其中所述组合包含疑似含有促甲状腺激素受体抗体的样品、结合至载体的第一促甲状腺激素受体和结合至标记物的第二促甲状腺激素受体。所述第一和所述第二促甲状腺激素受体中的一个或两个来自根据本文所述的原理储存的组合物。对所述组合检查包含所述促甲状腺激素受体抗体的复合物的形成。所述复合物的存在与所述样品中的所述促甲状腺激素受体抗体的存在和量的其中之一或两者关联。
附图简述
本文提供的附图不是按比例的并出于促进根据本文所述的原理理解某些实施例的目的而提供，并通过举例说明且不限制所附的权利要求书的范围的方式提供。
图1是描述当溶解于根据本文所述的原理的方法的实施例中的柠檬酸盐缓冲剂中时，以及出于比较的目的当所述缀合物分别溶解在MES和PIPES缓冲剂中时，缀合到碱性磷酸酶的受体嵌合体(“缀合物”)的信号对pH的曲线的图。
图2是描述图1的缀合物溶液在37℃下储存一天之后的保留的百分数信号对pH的曲线的图。
详细说明
一般讨论
根据本文所述的原理的公开内容提供了制备受体的液体配制物的方法，所述液体配制物可储存延长的时间段，同时保持所述受体的稳定性。另外，本发明人已经发现，相比于经过干燥或冻干以及随后的重构的受体的灵敏度，根据本文所述的原理制备的受体的灵敏度提高。如上所述，根据本文所述的原理的一些实施例涉及制备受体的液体溶液、这样的液体溶液的储存的方法和这样的液体溶液在用于检测所关注的分析物的测定中的用途。
详细讨论
如本文所使用的术语“受体”是指与物质结合的化合物(有时称为配体)，所述化合物对于该物质在结构上是特异性的。所述受体具有在表面上或在腔室中的面积，所述面积特异性地结合至有时被称为配体的另一分子，并由此被定义为与所述有时被称为配体的另一分子的特定的空间和极性排列组织(organization)互补。配体可以是小的分子，包括但不限于，例如药物、小肽或甾族化合物，或大的分子例如大的肽，蛋白质，包括例如抗体、激素、DNA、RNA，碳水化合物，并包括其部分或区域(region)。通过举例说明而不是限制的方式，受体包括例如激素受体、药物受体和抗原受体。所述受体可以是完整或完全的受体或其片段或链段。片段或链段可以通过使完整的受体经过片段化技术来制备。另一方面，可以合成制备受体的片段或链段以及完整或完全的受体。因此，所述受体可以是天然存在且从来源分离出来的，或所述受体可以是合成的且通过包括但不限于例如重组技术和嵌合技术的合成技术制备。
在一些实施例中，所述受体是对抗体特异性的那些，所述抗体例如，与某些疾病状态相关的自身抗体，所述疾病状态包括但不限于，例如皮肌炎、糖尿病、癫痫病、川崎氏病、肾小球性肾炎、格雷夫斯氏病、古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture’s syndrome)、格林-巴利综合症、炎症性肠病、狼疮性肾炎、多发性硬化、重症肌无力、心肌炎、帕金森病、天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征(sjogren’s syndrome)、系统性红斑狼疮、甲状腺炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、白癜风、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener’s granulomatosis)和威尔逊病。
在根据本文所述的原理的实施例中，通过举例说明而不是限制的方式，所述受体是TSH受体并且所述自身抗体是TSH自身抗体。在根据本文所述的原理的另一个实施例中，通过举例说明而不是限制的方式，所述受体是TSH受体嵌合体并且所述自身抗体是TSH自身抗体。在根据本文所述的原理的另一个实施例中，通过举例说明而不是限制的方式，所述受体是TSH受体嵌合体，其实例公开在2009年12月31日公布的美国专利申请公布号2009/0325310 A1(Loos)中并且所述自身抗体是TSH自身抗体。
术语“受体”还包括结合或连接到缀合部分的受体。受体缀合物包含受体和任选地通过连接基团结合在一起以形成单一结构的缀合部分。所述结合可以是共价连接或非共价连接的结果。共价连接包括直接连接，例如，受体和缀合部分之间的化学键或者受体和缀合部分之间通过中间性连接基团直接连接。非共价连接包括连接到所述缀合物的受体和缀合部分的互补特异性结合对(sbp)成员之间的特异性结合。
所述缀合部分是可缀合到受体以形成在用于检测所述受体或所述受体所结合的实体(entity)(受体结合分析物)的测定中采用的试剂的任意实体。缀合部分包括，通过举例说明而不是限制的方式，例如载体、信号产生系统的成员、结合对的成员，例如配体和受体(例如，生物素-抗生蛋白链菌素或荧光素-抗荧光素抗体)，和对药物类似物提供锚的大分子。
载体可以由有机或无机、固体或流体、水不溶性的材料组成，其可以是透明的或部分透明的。所述载体可以是合成的或天然存在的。所述载体可具有许多形状中的任一种，例如颗粒(包括珠粒)、薄膜(film)、膜(membrane)、管、孔(well)、条、棒、平坦的表面(例如板、纸等)、纤维等等。根据测定的类型，所述载体可悬浮是或不可悬浮在采用所述载体的介质中。可悬浮的载体的实例是例如聚合材料，例如胶乳、脂质双层或脂质体，油滴、细胞和水凝胶、金属颗粒和磁性颗粒。其它载体组合物包括例如聚合物，例如交联的多糖，包括琼脂糖和葡聚糖，纤维素、硝基纤维素、乙酸纤维素、聚乙烯醇、聚(氯乙烯)、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、尼龙和聚(丁酸乙烯酯)，可以单独使用或与其它材料组合使用。
所述载体可以是颗粒。所述颗粒可具有至少约0.02微米且不大于约100微米的平均直径。在一些实施方案中，所述颗粒具有约0.05微米至约20微米或约0.3微米至约10微米的平均直径。所述颗粒可以是有机或无机的、可溶胀的或不溶胀的、多孔的或无孔的，优选具有近似水的密度，通常为约0.7 g/mL到约1.5g/mL，并且由可以是透明的、部分透明的或不透明的材料组成。所述颗粒可以是生物材料，例如细胞和微生物，例如红细胞、白细胞、淋巴细胞、杂交瘤、链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌(E. coli)和病毒。所述颗粒也可以由例如有机和无机聚合物、脂质体、胶乳颗粒、金属颗粒、磁性或非磁性颗粒、磷脂囊泡、乳糜微粒和脂蛋白组成。在一些实施例中，所述颗粒是胶乳颗粒或二氧化铬(铬(chrome))颗粒。在一些实施例中，所述颗粒容易分散在水性介质中，并且可以是吸附的或可官能化的，从而允许直接或通过连接基团间接地缀合到受体。
在下文中，在各种测定系统的讨论中更详细地讨论了特异性信号产生系统和标记物，根据本文所述的原理的实施例可被应用于所述测定系统。简要地说，信号产生系统(sps)可以具有一种或多种组分或成员，至少一种组分或成员是标记物，其能够直接被检测或可通过产生可检测信号的特异性结合反应可检测。所述信号产生系统生成与样品中的受体或受体结合分析物的存在相关的信号。所述信号产生系统包含产生可测量的信号所需的所有试剂。所述信号产生系统的其它组分可包含在显影剂溶液中，并且可以包括例如底物、增强子、活化剂、化学发光化合物、辅因子、抑制剂、清除剂、金属离子和对于信号产生物质的结合所需的特异性结合物质。所述信号产生系统的其它组分可以是例如辅酶、与酶产物反应的物质、其它酶和催化剂。所述信号产生系统提供通过外部装置，通过使用电磁辐射，理想的是通过目视检查可检测的信号。示例性的信号产生系统描述在美国专利号5,508,178(Rose等人)和Ullman等人，美国专利号5,185,243第11-13栏中，其相关公开内容通过引用并入本文。
对于缀合物的组分(即受体和缀合部分)的共价连接，一种或多种组分包含适于连接到一种或多种其它组分的官能团。适于连接所述组分的官能团可以是羰基官能团，氧代羰基(例如，醛)和非氧代羰基(包括氮和硫类似物)，例如羧基、脒，酰胺化物、硫代羧基和硫羰羧基(thiocarboxy)两者。氧代的替代官能团包括活性卤素、重氮基、巯基、烯烃，特别是活化的烯烃、氨基、偶磷等。特别关注的是活化的酯或烷基化剂。用于使分子彼此连接的技术细节可以参见，例如，Matthews等人，Anal. Biochem. (1985) 151:205-209；Engelhardt等人；欧洲专利申请号0302175和美国专利号3,817,837，其相关公开内容通过引用以其全部引入本文。
如上所述，共价连接可以通过中间性连接基团来实现。所述连接基团可以是具有1至约50或更多个原子，或1至约30或更多个原子，约1至约20个原子，1至约10个原子的链，每个原子独立地选自通常由碳、氧、硫、氮和磷，通常是碳和氧组成的组。所述连接基团中的杂原子的数目可以是0至约10个或更多，或0至约8，1至约6，2至约4。所述链中的原子的数目通过对沿被连接的子结构之间的最短路线的非氢原子或其它一价原子数目进行计数来确定。所述连接基团的原子可以被非氢原子，例如碳、氧等，以例如烷基、芳基、芳烷基、羟基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基的形式取代。作为一般规则，可任意选择具体的连接基团的长度，以提供合成的便利性，其条件是存在由具有将所述化合物连接在一起的能力的连接基团引起的最小干扰。所述连接基团可以是脂族或芳族的。存在于所述连接基团中的官能团可以包括酯、硫酯、酰胺、硫代酰胺、醚、脲、硫脲、胍、偶氮基、硫醚、羧酸酯等等。
如上所述，受体-部分缀合物的组分(即受体和缀合部分)可以非共价地连接在一起。例如，小的有机分子，例如但不限于生物素，包括双生物素和荧光素，可以并入一种所述组分并且其它组分可以连接到小的有机分子的结合伴侣，例如，分别为抗生物素蛋白 (抗生蛋白链菌素)或抗荧光素。所述结合伴侣的结合导致所述组分非共价地彼此连接。
根据本文所述的原理的方法包括在液体介质中将所述受体和有效量的螯合剂和C2-C6多元醇组合。在根据本文所述的原理的一些实施例中，所述螯合剂可以是，但不限于，例如N-(2-羟乙基)-乙二胺-N,N',N'-三乙酸(HEDTA)、乙二胺-四乙酸(EDTA)、反式-1,2-二氨基环己烷-N,N,N',N'-四乙酸(CDTA)、乙二醇-O,O'-双-(2-氨基乙基)-N,N-,N',N'-四乙酸(EGTA)、二亚乙基三胺-五乙酸(DTPA)、次氮基三乙酸(NTA)、次氮基-2,2',2''-三乙酸、二亚乙基三胺-N,N,N',N',N''-五乙酸、三亚乙基四胺-N,N,N',N'',N''',N'''-六乙酸(TTHA)、甲胺、组氨酸、苹果酸酯和植物螯合肽、血红蛋白、叶绿素、铁载体、脓青素、萤光素(pyoverdin)、肠菌素、肽和糖、腐殖酸、柠檬酸、水软化剂、膦酸酯、四环素、钆、有机磷化合物2,2'-双(二苯基膦)-1,1'-联萘、喷替酸；N,N-双(2-(双-(羧甲基)氨基)乙基)-甘氨酸、N,N-双(羧甲基)甘氨酸、次氮基三乙酸(triglycollamic acid)；[(羧甲基)亚氨基]双-(亚乙基次氮基)]-四乙酸)、Trilone A、α,α',α''-三甲胺三羧酸、三(羧甲基)胺、氨基三乙酸、Titriplex i和Hampshire NTA酸以及与上述中任一种的适当的盐。
在根据本文所述的原理的一些实施例中，所述螯合剂包括三乙酸部分或其盐、四乙酸部分或其盐、五乙酸部分或其盐或六乙酸基部分或其盐。在一些实施例中，所述螯合剂选自N-(2-羟乙基)-乙二胺-N,N',N'-三乙酸及其盐、乙二胺四乙酸及其盐和乙二醇四乙酸及其盐。在一些实施例中，所述螯合剂为柠檬酸或其盐。
在根据本文所述的原理的一些实施例中，所述多元醇中的碳原子的数目为例如2至8、或2至7、或2至6个、或2至5个、或2至4个、或2至3、或3至8个、或3至7个、或3至6、或3至5、或3至4个、或4至8个、或4至7、或4至6、或4至5，并且羟基基团的数目为例如每个碳原子约1个、或每2个碳原子1个、或每3个碳原子1个、或每2个碳原子2个、或每3个碳原子2个，其中所述多元醇中的羟基总数为例如约2、或约3、或约4、或约5、或约6、或约7、或约8。在一些实施例中，通过举例说明而不是限制的方式，所述多元醇是含有2个羟基或3个羟基、或4个羟基、或5个羟基、或6个羟基的C2、或C3、或C4、或C5、或C6多元醇，例如，通过举例说明而不是限制的方式，例如乙二醇、丙二醇、甘油、赤藓醇、木糖醇、核糖醇和山梨糖醇。所述多元醇可以是单一化合物或两种或更多种具有上述特性的多元醇的组合。在根据本文所述的原理的一些实施例中，所述多元醇是甘油。
所述螯合剂和所述多元醇按有效地稳定所述受体和/或增强所述受体的灵敏度的量在组合中存在。所述螯合剂的量和所述多元醇的量取决于例如所述受体的性质和量、所述螯合剂的性质、所述多元醇的性质和所述液体配制物的性质中的一个或多个。在根据本文所述的原理的一些实施例中，所述螯合剂在所述组合中的有效量可以是，例如约0.1 mM至约20 mM、或约1 mM至约20 mM、或约5 mM至约20 mM、或约10 mM至约20 mM、或约10 mM至约15 mM、或约15 mM至约20 mM或约1至约5 mM。
在根据本文所述的原理的一些实施例中，所述多元醇在所述组合中的有效量可以是，例如约5%至约50%、或约5%至约40%、或约5%至约30%、或约5%至约20%、或约5%至约10%、或约10%至约50%、或约10%至约40%、或约10%至约30%、或约10%至约20%。上述百分数按所述多元醇在液体介质中的重量计。
根据本文所述的原理的一些实施例涉及包含水性介质、受体、约0.1 mM至约20 mM的量的螯合剂和按重量计约5%至约50%的C2-C6多元醇的组合物。
在一些实施例中，所述液体介质或液体溶液是水性介质，其可以仅仅是水或可以包含例如约0.1%至约80%、或0.1%至约60%、或约0.1至约40%、或约0.1%至约30%、或约0.1%至约20%、或约0.1%至约10%、或约0.1%至约5%、或约1%至约80%、或1%至约60%、或约1%至约40%、或约1%至约30%、或约1%至约20%、或约1%至约10%、或约1%至约5%、或约5%至约80%、或5%至约60%、或约5%至约40%、或约5%至约30%、或约5%至约20%、或约5%至约10%的助溶剂。以上百分数按所述介质的体积计。所述助溶剂可以是，例如但不限于，有机溶剂，例如，醇、酯、醚、酰胺或胺。
所述介质的pH通常将为例如约4至约11、或约5至约10、或约6.5至约9.5、或约6.5至约7.5、或约7。各种缓冲剂可以用于达到所需的pH并保持介质的pH。说明性的缓冲剂包括例如硼酸盐、磷酸盐、碳酸盐、Tris和巴比妥。采用的具体缓冲剂不是至关重要的，但在单独的组合物中，可以优选一种或另一种缓冲剂。各种辅助材料也可以包含在所述介质中。例如，除了缓冲剂之外所述介质可以含有例如防腐剂、用以防止错误结果的非特异性结合阻断剂和嗜异性干扰阻断剂和表面活性剂。
所述受体、所述螯合剂和所述C2-C6多元醇的液体溶液可以保持在例如约2℃至约40℃、或约2℃至约30℃、或约2℃至约20℃、或约5℃至约40℃、或约5℃至约30℃、或约5℃至约20℃、或约5℃至约10℃、或约10℃至约40℃、或约10℃至约30℃、或约10℃至约20℃、或约15℃至约40℃、或约15℃至约30℃、或约15℃至约20℃、或约20℃至约25℃、或约环境温度的温度。所述受体的液体溶液在例如至少约1周、或至少约1个月、或至少约6个月、或至少约1年、或至少约1.5年、或至少约2年保持良好的稳定性。如本文所使用的短语“良好稳定性”意味着所述受体在12个月的期间内不丧失超过约40%、或超过约30%、或超过约20%、或超过约10%、或超过约5%的它的活性，或所述受体在约2℃至约10℃的温度的储存期间具有至少约12个月、或至少约15个月、或至少约20个月的半衰期。
根据本文所述的原理的组合物可用在检测样品中的受体结合分析物的方法，所述分析物是指结合至受体的分子。待分析的样品是疑似含有一种或多种受体结合分析物的样品。所述样品优选来自人或动物，并且包括但不限于，例如生物流体例如全血、血清、血浆、痰、淋巴液、精液、阴道粘液、排泄物、尿、脊髓液、唾液、粪便、脑脊髓液、泪液和粘液，以及生物组织，例如毛发、皮肤、部分或来自器官或其它身体部位的切片或离体组织。在许多情况下，所述样品是全血、血浆或血清，并且在具体实施例中，所述样品是血清。样品可以或可以不进行预处理来除去结合至所述受体结合分析物的内源结合部分或从内源结合物质释放出所述受体结合分析物。
可以在不干扰测定的任何方便的介质中制备所述样品；通常采用水性介质。下面更详细地讨论所述介质的性质。根据所述样品的性质，可以对样品进行一种或多种预处理，例如，通过举例说明而不是限制的方式，例如采用溶血剂的预处理，采用释放剂的预处理，采用从它的内源结合伴侣(例如蛋白质)置换出结合的受体-结合分析物的置换剂(displacer)，和协助溶解血细胞以从血细胞释放出受体结合分析物的一种或多种溶血清洁剂(hemolytic detergent)的预处理。上述试剂的任一种都按足以达到所需的效果或功能 (例如，溶血或从内源结合物质释放出受体结合分析物)的浓度或量存在。
根据上述的预处理，如果有的话，将用于确定所述样品中的所述受体结合分析物的存在和量的其中之一或两者的试剂添加到介质中。所述试剂的性质取决于待实施的测定的具体类型。通常，所述测定是用于确定或测量受体结合分析物的存在和量的其中之一或两者的方法。下面通过举例说明而不是限制的方式讨论各种测定方法。
在根据本文所述的原理的一些实施例中，所述测定试剂包含所述受体结合分析物的至少一种受体。所述受体存在于根据本文所述的原理的液体组合物或液体溶液中并且所述液体组合物的一部分在所述测定介质中结合。如上所述，采用根据本文所述的原理的多元醇与螯合剂的组合处理的受体相对于未以这种方式处理的受体还表现出增强的灵敏度。术语“增强的灵敏度”是指在采用根据本文所述的原理处理的受体的受体结合分析物的测定中获得的灵敏度比使用未根据本文所述的原理处理的受体的测定的灵敏度大至少约10%、或大至少约25%、或大至少约50%、或大至少约75%。
除了一种或多种受体之外，测定试剂可以包含例如对受体、或对受体结合分析物特异性的一种或多种抗体、另一种抗体、或小分子。抗体可以是单克隆或多克隆的。这样的抗体可以通过本领域公知的技术，例如宿主的免疫和血清的收集(多克隆)，或通过制备连续的杂交细胞系并收集分泌的蛋白质(单克隆)或通过克隆和表达至少编码自然抗体的特异性结合所需的氨基酸序列的核苷酸序列或其诱变形式来制备。抗体可包括完全的免疫球蛋白或其片段，其中免疫球蛋白包括多种类别和同种型，例如IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3和IgM。其片段可包括例如Fab、Fv和F(ab')2和Fab'。此外，在适当情况下可以使用免疫球蛋白或它们的片段的聚集体、聚合物以及缀合物，只要保持对特定分子的结合亲和力。
测定介质中包含其它试剂，这取决于待进行的测定的性质。这样的测定通常包括结合伴侣(例如受体)和受体结合分析物之间的反应，并且还可以包括抗体和相应的结合伴侣(例如受体)之间的结合，这取决于选择的具体测定形式。
如以上所讨论的，相比于其它分子的显著较少的识别，特异性结合涉及两个不同的分子之一对另一个的特异性识别。另一方面，非特异性结合涉及相对独立于特定表面结构的分子之间的非共价结合。非特异性结合可以由于几个因素，包括分子之间的疏水性相互作用。在一些实施例中，所述结合伴侣是抗体。
测定的一般讨论
本公开内容对许多类型的测定具有应用，所述测定可用于确定疑似含有这样的分析物的样品中的一种或多种分析物(其包括例如受体结合分析物)的存在和量的其中之一或两者。可以在许多设计用于抗体试剂的测定形式中采用根据本文所述的原理的受体试剂。所述测定可以包括标记或非标记试剂。包括非标记试剂的测定通常包括形成包含一种或多种受体的相对大的复合物。这样的测定包括，例如，用于检测受体复合物的免疫沉淀素和凝集法以及相应的光散射技术，例如，散射比浊法(nephelometry)和透射比浊法(turbidimetry)。对于非标记测定，可以采用根据本文所述的原理的组合物，其中所述组合物包含受体结合分析物和载体，例如颗粒的缀合物。在一个实施例中，样品中的所述受体结合分析物与受体结合分析物-载体缀合物竞争，从而使得样品中的受体结合分析物的量越多，由于凝集形成的沉淀物的量则将越少。在一些实施例中，所述受体结合分析物是抗体，例如，可以存在于样品中的自身抗体，并且采用根据本文所述的原理的具有结合至粒状载体的受体结合分析物的缀合物。所述抗体在样品中的存在导致缀合物试剂的凝集。
标记免疫测定包括例如酶免疫测定、荧光偏振免疫测定、放射免疫测定、抑制测定和诱导发光、荧光氧通道测定。在标记测定方法的一个实施例中，具有结合至标记物(例如，酶)的受体结合分析物的缀合物可以与样品中的受体结合分析物竞争，从而使得样品中的受体结合分析物的量越大，来自所述标记物的信号的量则将越少。在标记测定方法的另一实施例中，具有结合至标记物(例如，酶)的受体的缀合物可用于与样品中的受体结合分析物结合，并且使用受体结合分析物的第二受体以形成夹心复合物。检测来自所述标记物的信号的量，并且将其与所述样品中的受体结合分析物的量关联，从而使得样品中的受体结合分析物的量越大，来自所述标记物的信号的量则将越大。
如上所述，在本文所讨论的许多测定中，采用标记物，而且在许多实施例中，所述标记物是受体结合分析物缀合物的一部分。另一方面，所述标记物可以是独立于受体结合分析物缀合物的试剂的一部分。所述标记物通常是信号产生系统(“sps”)的一部分。所述标记物的性质取决于具体的测定形式。如上所讨论的，所述信号产生系统通常包括一一种或多种组分，至少一种组分是可检测的标记物，其生成与结合和/或未结合的标记物的量，即结合或未结合至被检测的所述受体结合分析物或结合或未结合至反映待检测的所述受体结合分析物的量的试剂的标记物的量相关的可检测信号。
所述标记物是产生或可被诱导产生信号的任何分子。所述标记物可以是聚(氨基酸)、或蛋白质或非聚(氨基酸)、同位素或非同位素，通常是非同位素，并且可以是催化剂，例如酶，编码催化剂的多核苷酸、启动子、染料、荧光分子、化学发光分子、辅酶、酶底物、放射性基团、小的有机分子、可扩增的多核苷酸序列、颗粒如乳胶或碳颗粒、金属溶胶、微晶、脂质体、细胞等，其可以或可以不被例如染料、催化剂或其它可检测基团进一步标记。在一些实施例中，所述标记物是放射性同位素、发光物、粒子或酶，并且可以是，例如荧光剂、放射性标记物、酶、化学发光剂或光敏剂。因此，例如，对于以上的标记物，视具体情况而定，通过检测酶活性、发光度、吸光度、或放射性来检测和/或测量所述信号。
术语“非聚(氨基酸)标记物”是指不是蛋白质的那些标记物。非聚(氨基酸)标记物可以是信号产生系统的成员。所述非聚(氨基酸)标记物能够直接被检测或通过产生可检测信号的特异性结合反应可检测。所述非聚(氨基酸)标记物通常是例如放射性同位素、发光物(例如，吖啶酯)、粒子(例如，可与未结合的胶乳颗粒分离的可以通过浊度和散射比浊法测量的磁性颗粒和化学发光珠粒(例如，LOCI化学珠粒))。所述标记物可以是同位素或非同位素，通常是非同位素，并且可以是编码催化剂的多核苷酸、启动子、染料、荧光分子、化学发光分子、辅酶、酶底物、放射性基团、小的有机分子、可扩增的多核苷酸序列、颗粒如乳胶或碳颗粒、金属溶胶、微晶、脂质体或细胞，其可以或可以不被例如染料、催化剂或其它可检测基团进一步标记。聚(氨基酸)标记物包括(通过举例说明而不是限制的方式)肽和蛋白质，例如酶。
标记物的实例包括，通过举例说明而不是限制的方式，酶如碱性磷酸酶(“AP”)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(“G6PDH”)和辣根过氧化物酶；核酶；诸如QB复制酶的复制酶的底物；启动子；染料；荧光剂，如荧光素、异硫氰酸酯、罗丹明化合物、藻红蛋白、藻青蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺；复合物，例如由存在于被称为量子点的半导体纳米晶体中的CdSe和ZnS制备的那些；化学发光剂，例如异鲁米诺(isoluminol)；敏化剂；辅酶；酶底物；放射性标记物如125l、131l、14C、3H、57Co和75Se；颗粒，例如胶乳颗粒、碳颗粒、金属颗粒，包括磁性颗粒，例如，二氧化铬(CrO2)颗粒等；金属溶胶；微晶；脂质体；细胞等，其可以被染料、催化剂或其它可检测基团进一步标记。合适的酶和辅酶公开在Litman等人，美国专利号4,275,149第19-28栏，和Boguslaski等人，美国专利号4,318,980第10-14栏中；合适的荧光剂和化学发光剂公开在Litman等人，美国专利号4,275,149第30和31栏中；其通过引用并入本文。
所述标记物可以直接产生信号，并且因此，无需另外的组分来产生信号。众多的有机分子，例如荧光剂，能吸收紫外线和可见光，其中，光吸收将能量传递到这些分子并将它们提升到激发能态。然后通过在第二波长的光的发射耗散此吸收的能量。其它直接产生信号的标记物包括放射性同位素和染料。
或者，所述标记物可以需要其它组分来产生信号，并且所述信号产生系统从而将包括产生可测量信号所需的所有组分。这样的其它组分可以包括底物、辅酶、增强子、附加的酶、与酶产物反应的物质、催化剂、活化剂、辅因子、抑制剂、清除剂、金属离子以及信号产生物质的结合所需的特异性结合物质。
在一些实施例中，作为标记物蛋白质的所关注的酶是氧化还原酶，特别是脱氢酶，例如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、乳酸脱氢酶等，以及涉及产生过氧化氢和使用过氧化氢将染料前体氧化成染料的酶。具体的组合包括糖氧化酶，例如，葡萄糖和半乳糖氧化酶或杂环氧化酶，例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，加上其采用过氧化氢氧化染料前体的酶，即，过氧化物酶如辣根过氧化物酶、乳过氧化物酶或微过氧化物酶。其它的酶组合是本领域已知的。当单个酶被用作标记物时，可以使用其它酶，例如水解酶、转移酶和氧化还原酶，优选水解酶如碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶。或者，可以使用萤光素酶，例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶。可以采用的说明性的辅酶包括NAD[H]、NADP[H]、磷酸吡哆醛、FAD[H]、FMN[H]等，通常是涉及循环反应的辅酶。参见，例如，美国专利号4,318,980，其公开内容通过引用并入本文。
可以使用的一组一般测定包括使用有限浓度的受体的测定。另一组测定包括使用过量的一种或多种主要试剂，例如，受体结合分析物的过量的受体。另一组测定是无分离的均相测定，其中所述标记的试剂调节当发生受体结合分析物-受体的结合反应时的标记物信号。另一组测定包括受体结合分析物的标记的受体试剂的有限竞争性测定。在这种类型的测定中，根据本文所述的原理的受体-载体缀合物按恒定的有限量存在。固定化的受体结合分析物和游离的受体结合分析物之间的标记物的分配取决于所述样品中的受体结合分析物的浓度。
可以在不分离(均相)或分离(非均相非均相)任何测定组分或产物下进行所述测定。根据本文所述的原理的受体可用于许多免疫测定形式中。在均相测定中，在已经将所有试剂组合之后，确定所述信号并且将其与所述样品中的受体结合分析物的量关联。均相免疫测定列举为如下：公开在Rubenstein等人，美国专利号3,817,837第3栏第6行至第6栏第64行中的EMIT®测定(Syva Company, San Jose, CA)；免疫荧光方法，例如公开在Ullman等人，美国专利号3,996,345第17栏第59行至第23栏第25行中的那些；酶通道免疫测定(“ECIA”)，例如公开在Maggio等人，美国专利号4,233,402第6栏第25行至第9栏第63行中的那些；荧光偏振免疫测定(“FPIA”)，例如，尤其在美国专利号5,354,693中公开的那些；等等。
其它的酶免疫测定是由Ngo和Lenhoff，FEBS Lett.(1980)116：285-288讨论的酶调节介导免疫测定(enzyme modulate mediated immunoassay)(“EMMIA”)；由Oellerich,J. Clin. Chem. Clin. Biochem.(1984年)22：895-904公开的底物标记荧光免疫测定(“SLFIA”)；由Khanna等人，Clin. Chem. Acta (1989) 185:231-240公开的联酶供体免疫测定(combined enzyme donor immunoassay)(“CEDIA”)；均相颗粒标记免疫测定，例如颗粒增强透射比浊抑制免疫测定(“PETINIA”)、颗粒增强透射比浊免疫测定(“PETIA”)等；等等。
其它测定包括溶胶颗粒免疫测定(“SPIA”)、分散染料免疫测定(“DIA”)、金属免疫测定(“MIA”)；酶膜免疫测定(“EMIA”)；发光免疫测定 (“LIA”)；等等。其它类型的测定包括涉及监测当发生受体结合分析物的结合时的抗体固定化表面的光学、声学和电特性的变化的免疫测定。这样的测定包括，例如光学免疫传感器测定、声学免疫传感器测定、半导体免疫传感器测定、电化学传感器免疫传感器测定、电位免疫传感器测定和安培电极测定。
在受体结合分析物的酶测定的一个实施例中，将疑似含有所述受体结合分析物的样品在水性介质中同时或相继地与能够识别所述受体结合分析物的受体和包含所述受体结合分析物和酶的缀合物的试剂结合。所述受体添加自根据本文所述的原理经稳定的受体的液体溶液。添加所述酶的底物，其导致当发生酶催化反应时形成发色或荧光产物。酶的实例(通过举例说明而不是限制的方式)是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和碱性磷酸酶，但也可以使用其它酶。所述受体结合分析物和所述酶缀合物的受体结合分析物部分竞争所述受体上的结合位点。然后，通常通过分光光度装置来确定所述介质中的酶活性，并将其与在测试其中存在已知量的所述受体结合分析物的校准品(calibrator)或参考样品时确定的酶活性进行比较。典型地，以类似于测试疑似含有所述受体结合分析物的样品的方式对所述校准品进行测试。所述校准品包含不同的但是已知浓度的待确定的受体结合分析物。在多数实施例中，存在于所述校准品中的浓度范围跨越未知样品中的疑似的受体结合分析物浓度的范围。
非均相测定通常涉及一个或多个分离步骤，并且可以是竞争性的或非竞争性的。各种竞争性和非竞争性测定形式公开在Davalian等人，美国专利号5,089,390第14栏第25行至15栏9行中，其公开内容通过引用并入本文。在一类竞争性测定中，使如本文中所讨论的具有所述受体结合分析物结合至其的受体的载体与含有所述疑似含有受体结合分析物的样品的介质和是受体结合分析物和酶的缀合物的试剂接触。具有附着的受体的所述载体试剂在根据本文所述的原理的液体溶液中。在将所述载体和所述介质分离后，通过常规技术确定所述载体或所述介质的酶活性，并且将其与所述样品中的受体结合分析物的存在和量的其中之一或两者关联。在某些实施例中，除了酶缀合物的酶之外还可以采用第二酶。所述酶对的酶是相关的，因为所述第一酶的产物用作所述第二酶的底物。
测定形式的另一个实施例是捕获测定。在这种测定形式中，受体结合分析物的受体共价结合至颗粒，例如磁性颗粒。或者，所述受体可以例如通过受体的抗体(其中所述抗体共价连接到所述颗粒)非共价地结合至所述颗粒。在将它用于测定之前，将此受体-颗粒试剂储存在根据本文描述的原理的液体溶液中。培养样品与受体-颗粒试剂以允许所述样品中的受体结合分析物结合至所述受体结合分析物的受体。任选地，将颗粒与测定介质分离并洗涤。将包含所述受体结合分析物的第二受体(所述受体结合至酶)的缀合物的试剂与颗粒进行培养。在将它用于测定之前，可以将所述第二受体-颗粒试剂储存在本文描述的原理的液体溶液中。在洗涤后，测量结合至分离的颗粒的酶的量，并将其直接与所述样品中的受体结合分析物的存在和量的其中之一或两者关联。
在一些实施方案中，可以使用多分析物测定，其中所述受体结合分析物可以与例如一种或多种其它分析物(例如其它受体结合分析物)一起是检测的对象。这样的多分析物系统描述于例如Loor等人，J. Anal. Toxicol. 12: 299 (1988)中。
以上讨论的测定通常在水性缓冲介质中在通常提供最佳的测定灵敏度的中等的pH下进行。所述测定介质的pH可以为例如约4至约11、或约5至约10、或约6.5至约9.5。所述pH通常将是任何特异性结合对的结合成员的最佳结合、对所述测定的其它试剂(例如，信号产生系统的成员)最佳的pH的折衷。
各种缓冲剂可用于达到需要的pH并在确定期间维持pH。说明性的缓冲剂包括硼酸盐、磷酸盐、碳酸盐、Tris、巴比妥等。采用的具体缓冲剂不是至关重要的，但在单独测定中，可以优选一种或另一种缓冲剂。各种辅助材料可以用于上述方法中。例如，除了缓冲剂之外，所述介质可以包含所用的介质和试剂的稳定剂。通常，除了这些添加剂之外还可包含蛋白质，例如白蛋白；季铵盐；聚阴离子如葡聚糖硫酸酯；和结合增强剂。
可以在一个或多个间隔，包括添加上述各种试剂的任意间隔对测定介质应用一个或多个培养时段。通常在足以发生试剂的各种组分的结合的温度和时间下培养所述介质。，中等温度通常用于进行该方法，并且在所述测量期间通常为恒温，优选室温。培养温度通常为例如约5℃至约99℃或约15℃至约70℃或约20℃至约45℃。培养的时段为约0.2秒至约24小时，或约1秒至约6小时，或约2秒到约1小时，或约1至约15分钟。所述时段取决于介质的温度和各种试剂的结合速率，其通过结合速率常数、浓度、结合常数和解离速率常数确定。测量期间的温度将通常为例如约10℃至约50℃或约15℃至约40℃。
可以测定的受体结合分析物的浓度通常从约10-5变化至约10-7M，更通常为约10-6至约10-14M。诸如所述测定是定性的、半-定量的或定量的(相对于存在于所述样品中的受体结合分析物的量)、具体的检测技术和分析物的浓度的考虑通常决定了各种试剂的浓度。
所述检测介质中的各种试剂的浓度将通常由例如所关注的受体结合分析物的浓度范围和测定的性质确定。然而，每种试剂的最终浓度通常根据经验确定，以最优化测定在整个范围内的灵敏度。即，具有重要性的受体结合分析物的浓度变化应提供可精确测量的信号差。诸如所述信号产生系统的性质和所述受体结合分析物的性质的考虑通常决定了各种试剂的浓度。
虽然添加的顺序可以广泛地变化，但是将存在取决于测定的性质的某些优选。添加的最简单的顺序是同时添加所有的材料并且确定所述分析介质在均相测定中对信号的影响。或者，可以将所述试剂顺序结合。在一些实施例中，在如上所讨论的每次添加之后，可以包括培养步骤。
检查步骤
在测定方法的下一步骤中，对所述介质检查包含所述受体结合分析物和所述受体结合分析物的受体的复合物的存在。所述复合物的存在和/或量指示样品中的受体结合分析物的存在和/或量。
短语“测量受体结合分析物的量”是指定量地、半定量地和定性地确定受体结合分析物。用于确定所述受体结合分析物的定量的、半定量和定性的方法以及所有其它方法被认为是测量所述受体结合分析物的量的方法。例如，其中仅检测疑似含有所述受体结合分析物的样品中的所述受体结合分析物的存在或不存在的方法被认为包括在本发明的范围之内。用于测量的术语“检测”和“确定”以及其它常用的同义词被认为包括在本发明的范围内。
在许多实施方案中，所述介质的检查包括检测来自所述介质的信号。所述信号的存在和量的其中之一或两者都与所述样品中的所述受体结合分析物的存在和/或量关联。检测的具体模式取决于信号产生系统的性质。如上所讨论的，存在许多方法，通过这些方法，信号产生系统的标记物可以产生通过外部装置，理想的是通过目视检查，并包括例如电磁辐射、电化学、热量、放射性检测和化学试剂可检测的信号。
信号产生系统的活化取决于所述信号产生系统的成员的性质。对于用光活化的信号产生系统的那些成员，将所述成员用光照射。鉴于本文中的公开内容，对本领域技术人员将建议其它活化方法。对于一些信号产生系统，无需用于活化的试剂，例如包括诸如放射性标记物或酶的标记物的那些系统。对于酶系统，添加底物和/或辅因子可能是必需的。
对于所述信号存在和/或量的检查还包括检测信号，这通常仅为其中该信号被读取的步骤。所述信号通常采用仪器读取，所述仪器的性质取决于所述信号的性质。所述仪器可以是例如分光光度计、荧光计、吸收光谱仪、光度计、化学发光计、光能测定仪、或照相仪器。检测的信号的存在和量与存在于样品中的所述受体结合分析物的存在和量关联。测量期间的温度通常为例如约10℃至约70℃、或约20℃至约45℃、或约20℃至约25℃。在一种方法中，使用已知浓度的待筛选的受体结合分析物形成标准曲线。如上所讨论的，也可以使用校准品和其它对照。
测定的具体实施方案
以下实施例通过举例说明而不是限制的方式描述了根据本文所述的原理的具体实施例，并且意在仅描述而不是限制本公开内容和所附的权利要求书的范围。TSH自身抗体作为所述受体结合分析物以及第一和第二TSH受体嵌合体的选择也是通过举例说明而不是限制的方式，因为根据本文所述的原理的实施例普遍适用于通常的受体结合分析物的检测以及如上所述的所有不同类型的受体的使用。
在根据本文所述的原理的一个实施例中，所用的测定是诱导发光测定，其描述在美国专利号5,340,716中(Ullman等人)并且该公开内容通过引用并入本文。所述试剂包含两种乳胶珠粒试剂和TSH自身抗体的生物素化的第二TSH受体嵌合体。所述第一珠粒试剂是缀合物，其中包含化学发光染料的一种胶乳珠粒共价或非共价地结合至TSH自身抗体的第一TSH受体嵌合体。在一些实施例中，所述第一TSH受体嵌合体试剂和所述第二TSH受体嵌合体试剂两者分别储存在根据本文所述的原理的液体溶液中。所述第二珠粒试剂涂覆有抗生蛋白链菌素并包含光敏剂染料。在第一步骤中，将疑似含有TSH自身抗体的样品与TSH自身抗体的生物素化的第二TSH受体嵌合体进行培养，这允许来自所述样品的TSH自身抗体饱和所述生物素化的TSH第二受体嵌合体的片段，其中所述片段直接与所述测定介质中的TSH自身抗体浓度关联。在第二步骤中，添加所述第一珠粒试剂，其如上所述连接到TSH自身抗体的第一TSH受体嵌合体并导致与生物素化的第二TSH受体嵌合体的非饱和片段形成珠粒-生物素化的TSH第二受体嵌合体复合物。然后添加所述第二珠粒试剂，并结合至生物素，以形成珠粒对复合物。当被在680nm下的光照射时，所述第二珠粒试剂将溶解在反应溶液中的氧转化为能量更大的单线态氧形式。在珠粒对中，所述单线态氧扩散到所述第一珠粒试剂，由此触发化学发光反应。在612nm处测量所得的化学发光信号，并是所述样品中的TSH自身抗体的浓度的函数。将信号的量与所述样品中的TSH自身抗体的存在和或量关联。
在根据本公开内容的另一实施例中，将疑似含有TSH自身抗体的测试样品与试剂(试剂A)和具有连接到所述珠粒的TSH受体嵌合体的抗体以及结合至所述珠粒的抗体的第一TSH受体嵌合体的干珠粒混合。在足以使所述样品中的一些TSH自身抗体变得结合至TSH受体嵌合体的条件下将所述样品、珠粒和试剂A培养一段时间。通过离心将所述液体试剂与珠粒分离，然后洗涤。在将检测受体结合至被结合至所述珠粒的第一TSH受体嵌合体的TSH自身抗体的条件下，将经洗涤的珠粒与含有结合至碱性磷酸酶(检测受体)的第二TSH受体嵌合体的试剂B培养一段时间。将珠粒与所述测定介质分离并洗涤。然后，将珠粒与含有碱性磷酸酶的底物的底物溶液进行培养，然后检查所述介质的信号的存在和量的其中之一或两者，使用光度计在一定时间测量所述信号。信号的存在和/或量与原始样品中的TSH自身抗体的存在和/或量相关。
试剂盒
用于进行具体测定的试剂可存在于用于方便地实施用于确定受体结合分析物的测定的试剂盒中。在根据本文所述的原理的一个实施例中，试剂盒以包装的组合形式包含受体结合分析物的受体和用于实施用于检测所述受体结合分析物的测定的其它试剂，其中这样的试剂的性质取决于具体的测定形式。所述受体试剂存在于根据本文所述的原理的包含螯合剂和多元醇的液体溶液中。所述试剂盒还可以包含含有标记物的检测受体试剂。检测受体试剂存在于根据本文所述的原理的包含螯合剂和多元醇的液体溶液中。所述试剂可以各自在独立的容器中或各种试剂可以在一个或多个容器中组合，这取决于试剂的交叉反应性和稳定性。所述试剂盒还可以包含用于进行测定的其它单独包装的试剂，例如附加的结合试剂和辅助试剂，例如酶底物试剂。
试剂盒中的各种试剂的相对量可以广泛地变化以提供所述试剂的浓度，所述试剂基本上最优化在测定方法期间需要发生的反应以及进一步基本上最优化所述测定的灵敏度。可以在适当情况下作为干粉末(其通常是冻干的，包含赋形剂)提供除含有根据本文所述的原理的受体的那些之外的试剂，所述粉末溶解时将提供具有适当浓度的用于实施根据本发明的方法或测定的试剂溶液。所述试剂盒还可以包含如上所述的根据本发明的方法的书面描述。
定义
如本文所用的短语“至少”是指具体项目的数目可以等于或大于所列举的数目。
如本文所用的短语“约”是指所列举的数目可以正负相差10%；例如，“约5”是指4.5至5.5的范围。
名称“第一”和“第二”仅用于两个项目之间的区分，例如，“第一受体”和“第二受体”并不意味着暗示一个项目相比于另一个项目的任何顺序或次序或重要性。
实施例
以下实施例是通过举例说明而不是对本公开内容和所附的权利要求书的范围进行限制的方式。可以设计许多修改和替代组合物、方法和系统而不违背本公开内容的精神和范围。除非另有说明，在下面的实验中的材料可以购自Sigma-Aldrich ChemicalCompany，St. Louis MO。除非另有说明，份数和百分数按重量计。
进行的实施例描述了测定并利用试剂盒用于定量检测促甲状腺免疫球蛋白(TSI)(其是TSH受体的自身抗体)。TSI在血清样品中的测量用作在疑似患有格雷夫斯氏病的患者的评估中的辅助手段。所述试剂盒由干珠粒、样品培养缓冲剂(试剂A)和含有缀合到AP的TSH受体嵌合体的检测缓冲剂(试剂B)(如在2009年12月31日公布的美国专利申请公布号2009/0325310 A1中公开的)组成。
缩写：
L =升
IU =国际单位
KCPS = 千计数每秒
柠檬酸盐缓冲剂= 100 mM柠檬酸钠、100 mM NaCl、10 mM乙酸镁、1 mM氯化锌、0.5%BSA、0.1%小鼠IgG、0.2%PLURONIC®F68、10%甘油、pH6.0-6.8
BSA =牛血清清蛋白
IgG=免疫球蛋白
MES：2-(N-吗啉代)乙磺酸
MES缓冲剂= 100 mM MES、100 mM NaCl、10 mM乙酸镁、1 mM氯化锌、0.5%BSA、0.1%小鼠IgG、0.2%PLURONIC®F68、10%甘油，pH6.0-6.8
PIPES缓冲剂= 100 mM PIPES、100 mM NaCl、10 mM乙酸镁、1 mM氯化锌、0.5%BSA、0.1%小鼠IgG、0.2%PLURONIC®F68、10%甘油，pH6.0-6.8。
实施例1
将TSH受体涂布在珠粒上
将聚苯乙烯珠粒与TSH受体的单克隆抗体(MAb)的缓冲溶液 (100 mM碳酸钠、150mM氯化钠、0.1%叠氮化钠，pH 9)培养过夜。在采用相同缓冲剂洗涤以除去过量的MAb之后，将珠粒与TSH受体嵌合体的缓冲溶液(100 mM PIPES、2 mg/mLBSA，pH 6.8)培养两小时。在采用相同缓冲剂洗涤以去除过量的TSH受体之后，将珠粒与100 mM PIPES、25 mg/mL BSA、5%蔗糖、pH 6.8培养一小时，然后在真空烘箱中干燥。
实施例2
TSH受体缓冲剂中的HEDTA的影响
将具有不同量的天然TSI的血清样品与如实施例1所述的具有固定在其上的人类TSH受体嵌合体的聚苯乙烯珠粒培养30分钟。在将所述珠粒离心洗涤之后，将不含HEDTA(对照)或含有1 mM的HEDTA的检测缓冲剂(100 mM PIPES、100 mM KCl、1 mg/mL小鼠IgG、5 mg/mLBSA、20%甘油，pH6.8)中的缀合到碱性磷酸酶(AP)的第二TSH受体嵌合体添加到珠粒。在30分钟的培养后，再次洗涤珠粒，添加AP的底物溶液并用光度计检测信号。当检测缓冲剂最初被制备时以及在37℃下储存2天之后测量信号。表1示出了在第0天和第2天的各种样品的信号百分数(%)。
Figure 660824DEST_PATH_IMAGE001
具有1 mM HEDTA的试剂显示几乎低一个数量级的非特异性结合(对于零TSI样品的信号)，以及对于具有最高TSI浓度的样品，在第0天时，具有1 mM HEDTA的试剂显示比对照试剂高两倍的信号。相比于对照试剂的仅16%，含HEDTA的试剂保留了它的活性的66%。对于两种试剂，AP酶活性在91%和104%之间略微变化，这表明了增强的活性保留是由于根据本文所述的原理的在HEDTA的存在下TSH受体的提高的稳定性而不是由于AP的提高的稳定性。
实施例3
TSH受体缓冲剂中的甘油的影响
将缀合到AP的TSH受体嵌合体(如上所述制备的)溶解在含有不同浓度的甘油的检测缓冲剂(0.1M PIPES、5 mM乙酸镁、0.5 mM氯化锌、1 mM HEDTA、5 mg/mLBSA、10 mg/mL酪蛋白、2.5μg/mL两性霉素B、0.2 mg/mL硫酸庆大霉素)中。当最初被制备时以及在37℃下储存7天之后，评估检测缓冲剂。表2示出各种试剂在7天后保留的初始信号的百分数(%)。
Figure 537513DEST_PATH_IMAGE002
如由保留信号表示的，当所述试剂的甘油含量从20%提高到50%时，所述检测受体的稳定性从66%提高到近100%。
实施例4
TSH受体缓冲剂中的HEDTA浓度的影响
将缀合到AP的TSH受体嵌合体(如上所述制备的)溶解在含有不同浓度的HEDTA的缓冲剂(0.1 M PIPES、5 mM乙酸镁、0.5 mM氯化锌、5 mg/mLBSA、10 mg/mL酪蛋白、30%甘油、2.5μg/mL两性霉素B、0.2 mg/mL硫酸庆大霉素)中。表3示出了在不同HEDTA浓度下获得的各种样品的信号(KCPS)。
Figure 359976DEST_PATH_IMAGE003
最高TSI样品的信号随着HEDTA浓度增加而显著增加。在较高HEDTA浓度下碱性磷酸酶(AP)活性略微下降，这表明在较高HEDTA浓度下增加的信号是由于受体的较高的保留活性而不是由于AP活性。
实施例5
螯合缓冲剂中的TSH受体的影响
将缀合到碱性磷酸酶的TSH受体嵌合体 (如上所述制备)溶解在不同pH水平下的各种缓冲剂(MES、PIPES、柠檬酸盐)中。所有的缓冲剂配制物都含有如上所述的10%的甘油。图1示出了具有33 IU/L的TSI的样品的信号。对于不同pH水平下的各种缓冲剂，所述信号从2000 KCPS变化到4000 KCPS。
图2示出了在将具有受体的检测缓冲剂在37℃下储存一天之后保留的信号百分数。无论pH如何，不根据本文所述的原理的MES和PIPES缓冲剂保留25%或更少的初始信号。根据本文所述的原理的柠檬酸盐缓冲剂保留65%至80%的初始信号。
虽然为了清楚理解的目的，已经通过举例说明和实施例的方式对上述发明进行了相当详细的描述，但是对于考虑到根据本文中所述原理的教导的本领域普通技术人员而言非常明显的是可以做出某些变化和修改而不违背所附权利要求书的精神或范围。另外，上述说明书出于解释的目的使用了特定的术语来提供对实施例的透彻理解。对于本领域技术人员将明显的是不需要具体细节以实践本文所述的实施例。因此，出于举例说明和描述的目的呈现根据本文所述的原理的具体实施例的上述说明；它们不意图是穷举的或将该实施例限制于所公开的确切形式。鉴于上述教导，许多修改和变化是可能的。选择实施例被以解释本文所述的原理和它们的实际应用，并由此使本领域技术人员能够利用该教导。

Claims (17)

1.制备促甲状腺激素受体的经稳定的且有活性的液体溶液的方法，所述方法包括：
在液体介质中将所述受体、螯合剂和C2-C6多元醇组合，其中所述螯合剂和所述C2-C6多元醇的量足以获得在所述液体溶液中稳定和活性的受体，以及
将所述液体溶液保持在2℃至40℃的温度下，
其中所述螯合剂的量为0.1 mM至2 mM，且所述C2-C6多元醇的量为按重量计20%至50%。
2.根据权利要求1的方法，其中使所述受体结合至部分。
3.根据权利要求1的方法，其中所述螯合剂包括N-(2-羟乙基)-乙二胺-N,N',N'-三乙酸(HEDTA)、乙二胺-四乙酸(EDTA)、反式-1,2-二氨基环己烷-N,N,N',N'-四乙酸(CDTA)、乙二醇-O,O'-双-(2-氨基乙基)-N,N-,N',N'-四乙酸(EGTA)、二亚乙基三胺-五乙酸(DTPA)、次氮基三乙酸(NTA)、次氮基-2,2',2''-三乙酸、二亚乙基三胺-N,N,N',N',N''-五乙酸、三亚乙基四胺-N,N,N',N'',N''',N'''-六乙酸(TTHA)、甲胺、组氨酸、苹果酸酯和植物螯合肽、血红蛋白、叶绿素、铁载体、脓青素、萤光素、肠菌素、肽和糖、腐殖酸、柠檬酸、水软化剂、膦酸酯、四环素、钆、有机磷化合物2,2'-双(二苯基膦)-1,1'-联萘、喷替酸；N,N-双(2-(双-(羧甲基)氨基)乙基)-甘氨酸、N,N-双(羧甲基)甘氨酸、次氮基三乙酸；[(羧甲基)亚氨基]双-(亚乙基次氮基)]-四乙酸)、Trilone A、α,α',α''-三甲胺三羧酸、三(羧甲基)胺、氨基三乙酸、Titriplex i和Hampshire NTA酸或其盐。
4.根据权利要求1的方法，其中所述C2-C6多元醇选自甘油、丙二醇、乙二醇、赤藓醇、木糖醇、核糖醇和山梨糖醇。
5.根据权利要求1的方法，其中所述螯合剂在所述液体溶液中的量为1 mM。
6.根据权利要求1的方法，其中所述C2-C6多元醇的量为按重量计30%至50%。
7.使促甲状腺激素受体的液体溶液稳定的方法，所述方法包括：
将包含促甲状腺激素受体的液体溶液与稳定量的以下两者组合：(i)选自三乙酸螯合剂和四乙酸螯合剂的螯合剂和(ii)C3-C5多元醇，
其中所述螯合剂的稳定量为0.1 mM至2 mM，且所述C3-C5多元醇的稳定量为按重量计20%至50%，所述促甲状腺激素受体的经稳定化的液体溶液在2℃至40℃的温度的储存期间具有至少20个月的半衰期。
8.根据权利要求7的方法，其中使促甲状腺激素受体嵌合体结合至载体或标记物。
9.根据权利要求7的方法，其中所述螯合剂选自N-(2-羟乙基)-乙二胺-N,N',N'-三乙酸及其盐、乙二胺四乙酸及其盐、以及乙二醇四乙酸及其盐。
10.根据权利要求7的方法，其中所述螯合剂在所述液体溶液中的量为1 mM。
11.根据权利要求7的方法，其中所述C3-C5多元醇的量为按重量计30%至50%。
12.促甲状腺激素受体嵌合体的经稳定的且有活性的组合物，其包含：
水性介质，
受体，
0.1 mM至2 mM的量的螯合剂，和
按重量计20%至50%的量的C2-C6多元醇。
13.根据权利要求12的组合物，其中使所述受体结合至部分。
14.根据权利要求12的组合物，其中所述螯合剂包括N-(2-羟乙基)-乙二胺-N,N',N'-三乙酸(HEDTA)、乙二胺-四乙酸(EDTA)、反式-1,2-二氨基环己烷-N,N,N',N'-四乙酸(CDTA)、乙二醇-O,O'-双-(2-氨基乙基)-N,N-,N',N'-四乙酸(EGTA)、二亚乙基三胺-五乙酸(DTPA)、次氮基三乙酸(NTA)、次氮基-2,2',2''-三乙酸、二亚乙基三胺-N,N,N',N',N''-五乙酸、三亚乙基四胺-N,N,N',N'',N''',N'''-六乙酸(TTHA)、甲胺、组氨酸、苹果酸酯和植物螯合肽、血红蛋白、叶绿素、铁载体、脓青素、萤光素、肠菌素、肽和糖、腐殖酸、柠檬酸、水软化剂、膦酸酯、四环素、钆、有机磷化合物2,2'-双(二苯基膦)-1,1'-联萘、喷替酸；N,N-双(2-(双-(羧甲基)氨基)乙基)-甘氨酸、N,N-双(羧甲基)甘氨酸、次氮基三乙酸；[(羧甲基)亚氨基]双-(亚乙基次氮基)]-四乙酸)、Trilone A、α,α',α''-三甲胺三羧酸、三(羧甲基)胺、氨基三乙酸、Titriplex i和Hampshire NTA酸或其盐。
15.根据权利要求12的组合物，其中所述螯合剂选自N-(2-羟乙基)-乙二胺-N,N',N'-三乙酸及其盐、乙二胺四乙酸及其盐、以及乙二醇四乙酸及其盐。
16.根据权利要求12的组合物，其中所述C2-C6多元醇选自甘油、丙二醇、乙二醇、赤藓醇、木糖醇、核糖醇和山梨糖醇。
17.根据权利要求12-16任一项的组合物在制备用于检测样品中的促甲状腺激素受体抗体的方法中的试剂盒的用途。
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