CN101322033A

CN101322033A - 用于检测针对tsh受体的自身免疫抗体的方法和新型tsh受体嵌合体

Info

Publication number: CN101322033A
Application number: CN200680044029.3A
Authority: CN
Inventors: 乌尔里希·洛斯
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2005-09-26
Filing date: 2006-09-25
Publication date: 2008-12-10
Anticipated expiration: 2026-09-25
Also published as: US8999727B2; JP2013231736A; EP1929311A1; EP1929311B1; JP2009510397A; DE502006006593D1; WO2007036511A1; CN101322033B; US20090325310A1; JP5405111B2; ATE462977T1; HK1117595A1

Abstract

本发明描述了使用TSH受体嵌合体来检测针对TSH受体的自身免疫抗体的方法，所述TSH受体嵌合体优选地仅含有被修饰为嵌合体的TSH野生型受体的胞外部分，并且通过高度免疫原性的肽残基或通过适于检测的酶进行修饰，其中所描述的测定方法使得能够简单地检测刺激性、阻断性和中性自身免疫抗体。

Description

用于检测针对TSH受体的自身免疫抗体的方法和新型TSH受体嵌合体

发明领域

本发明涉及用于高度特异性地测定不同类型的针对促甲状腺激素受体(TSH受体)的自身抗体的方法，以及在该方法中可用作结合剂的新型TSH受体嵌合体。

发明背景

TSH受体(TSH-R)在甲状腺细胞的功能和生长中起关键作用。这种受体是G蛋白偶联糖蛋白受体亚家族的一个成员，该亚家族此外特别还包括促黄体生成素/绒毛膜促性腺激素受体(LH/CGR)和促卵泡激素受体(FSHR)。该亚家族的受体具有一个大的N-末端胞外结构域，其对于配体结合相当重要，因而对于其来说显示其参与信号传递。TSHR信号的传递主要是通过激活腺苷酸环化酶来介导，激活腺苷酸环化酶导致细胞内cAMP水平的增加。

TSH受体受到大量关注部分归因于其在甲状腺自身免疫疾病中作为主要自身抗原的作用，甲状腺自身免疫疾病伴随着出现针对TSH受体的自身抗体。特别地，巴泽多病属于此类甲状腺自身免疫疾病，该疾病是一种导致甲状腺功能亢进的自身免疫疾病，其根本上属于最常见的人自身免疫疾病。巴泽多病由于腺苷酸环化酶的激活以及结果出现的cAMP增加而引起。这导致了甲状腺功能亢进、甲状腺肿形成，并可能导致眼的变化。针对TSH受体的自身抗体也可以有阻断性特征，从而抑制腺苷酸环化酶和cAMP。在该情况中，甲状腺机能减退。在受影响的患者中同时出现刺激性和阻断性自身抗体也是可能的，其中刺激性抗体的部分通常占优势。

对于这种自身免疫抗体的检测，存在一种生物测定法已经较长一段时间了，在该生物测定法中测量cAMP的增加。这种测量方法是十分耗时。此外，该生物测定法是不可靠的，因为其可能提供假阳性的结果。在本说明书的范围内，这类测量方法将被称为生物测定法以将其与用于测定针对TSH受体的自身免疫抗体的体外方法相区分。在市场上可获得的对于自身免疫抗体的体外检测方法中，使用了从猪甲状腺膜中提取的TSH受体(第一代体外方法)。在另一种用于检测针对TSH受体的自身免疫抗体的测定法中，在竞争测定法中使用完整的人重组TSH受体蛋白(野生型)(第二代体外方法)。

Thyroid，Vol.7(1997)867-877描述了TSH受体上用于刺激性和阻断性抗体的表位。用于刺激性抗体的大部分功能性表位位于氨基酸8-168的范围内，而用于阻断性抗体的那些表位在该受体蛋白质的氨基酸261-370的范围内。对于活性测量，使用了上述的生物测定法。

WO 01/27634A1第一次提供了用于同时检测不同特异性的自身免疫抗体的定量方法，该方法是可快速重复的并且可以以高度精确度来施行。为了该目的，使用TSH受体嵌合体，该嵌合体不同于野生型受体之处是：将自身免疫抗体所结合的个体序列替换为来自该类G蛋白偶联受体的另一种受体的相应序列。TSH受体嵌合体基于完整的TSH受体蛋白。然而，测量耗费高。离心分离使得该方法太麻烦而不能用于常规使用。该测定法还必须在冰浴或在4℃下进行，因为TSH受体嵌合体不是十分稳定。一种相应的技术教导可以在WO 01/63296A1中找到，其中建议使用夹心技术来进行检测。然而发现，通常在使用其中建议的测试材料时，非特异性的结合太高。基于上述两个专利申请的知识的用于检测自身免疫抗体的测定法在市场上还不能得到。

为了本说明书的目的，将已有一段时间在市场上可获得的用于检测自身免疫抗体的测量方法称为第二代检测方法，其在竞争测定法中使用完整的未改变的TSH受体。该测定法适合用于检测巴泽多病。然而，缺点是不能区分刺激性、阻断性和中性自身免疫抗体。此外，不能鉴定所有亚型，因为该经置换的TSH仅以30-40％结合至用于刺激性和阻断性自身抗体的表位。

发明概述

根据本领域的这种状态，本发明的根本目标是改进从WO 01/27634A1中获知的方法以进一步增加该测定法的精确度和效力，并且使得这样的方法可用于自动化装置。

这个目标通过用于区别性地测定患者样品中不同类型的针对TSH受体的自身抗体的方法而达到，该方法使用TSH受体嵌合体作为所述自身抗体的结合剂，其中将对于结合刺激性和/或阻断性自身抗体来说重要的受体序列用另一种受体的相应的、不导致各类型的自身抗体的结合的序列替代，在该方法中

(a)将述患者样品与结合在固相上的第一种TSH受体嵌合体接触，其中自身免疫抗体以抗原结合片段结合至所述第一种TSH受体嵌合体，

(b)加入第二种C-末端经修饰的受体嵌合体，其中所述自身免疫抗体的另一个抗原结合片段结合至所述第二种C-末端经修饰的TSH受体嵌合体，并且最后

(c)添加针对所述第二种受体嵌合体的经修饰的C-末端表位的经标记的二抗，其中该抗体结合至所述第二种TSH受体嵌合体的经修饰的C-末端表位，并引发可检测的事件，或者

使用以这样的方式进行标记的第二种受体嵌合体，即所述第二种受体嵌合体可以通过已知的检测方法进行检测。

根据进一步的实施方案，本发明的根本目标也可以通过以下方法而达到：

(a)将所述患者样品与吸附于固相上的选自蛋白A、蛋白G和抗-IgG的结合试剂接触，以使得来自所述患者样品的自身免疫抗体结合至所述结合试剂。

(b)向由吸附于固相上的结合试剂和患者样品组成的混合物中添加TSH受体嵌合体，以使得自身免疫抗体结合至所述TSH受体嵌合体，

(c)向得到的反应混合物中添加经标记的二抗(F(ab)s)，以使得所述二抗在所述受体嵌合体的与所述自身免疫抗体所结合的表位不同的表位处结合至所述受体嵌合体，并且其中所述二抗以这样的方式进行修饰，即其不结合至吸附于固相上的结合试剂(仅Fab区)，或者

在阶段(b)中，使用为了实施常规检测而进行标记的TSH受体嵌合体。

进一步地，本发明的目标是TSH受体嵌合体，其中将对于结合刺激性和/或阻断性自身抗体来说重要的受体序列用另一种受体的相应的、不导致各类型的自身抗体的结合的序列替代，并且所述TSH受体嵌合体被截短并因而既不包含TSH受体蛋白的膜部分也不包含TSH受体蛋白的细胞内部分。

优选实施方案的描述

图1示意性地显示了根据本发明的方法形式。

图2示意性地显示了另外一种根据本发明的方法形式。

图3示意性地显示了另外一种根据本发明的方法形式。

图4示意性地显示了另外一种根据本发明的方法形式。

图5示意性地显示了另外一种根据本发明的方法形式。

图6显示了根据本发明的方法使用TSH自身免疫抗体的NIBSC(WHO)-标准溶液获得的标准曲线。

图7显示了测定间精确度概览图(Interassay-

)，该图从3次测定/测试中在n＝5的情况下使用WHO-标准90/672而制成。

图8显示了采用根据本发明的方法和采用所谓的第二代的测定法，使用患者血清而获得的测量结果的比较。

序列号1显示了与分泌型碱性磷酸酶融合的截短的TSH受体嵌合体B(胞外部分)的核苷酸序列。

序列号2显示了与分泌型碱性磷酸酶融合的截短的TSH受体嵌合体B(胞外部分)的氨基酸序列。

序列号3显示了由与免疫原性表位融合的截短的TSH受体嵌合体B(胞外部分)组成的融合蛋白的核苷酸序列。

序列号4显示了由与免疫原性表位融合的截短的TSH受体嵌合体B(胞外部分)组成的融合蛋白的氨基酸序列。

序列号5显示了由与分泌型碱性磷酸酶(SEAP)的分泌信号肽以及SEAP融合的截短的TSH受体嵌合体A(胞外部分)组成的融合蛋白的核苷酸序列。

序列号6显示了由与SEAP的分泌信号肽以及SEAP融合的截短的TSH受体嵌合体A(胞外部分)组成的融合蛋白的氨基酸序列。

序列号7显示了由与关于多克隆抗体的高度免疫原性表位融合的截短的TSH受体嵌合体A(胞外部分)组成的融合蛋白的核苷酸序列。

序列号8显示了由与关于多克隆抗体的高度免疫原性表位融合的截短的TSH受体嵌合体A(胞外部分)组成的融合蛋白的氨基酸序列。

序列号9显示了由与gLUC信号肽序列和Gaussia萤光素酶序列融合的截短的TSH受体嵌合体B(胞外部分)组成的融合蛋白的核苷酸序列。

序列号10显示了由与gLUC信号肽序列和Gaussia萤光素酶序列融合的截短的TSH受体嵌合体B(胞外部分)组成的融合蛋白的氨基酸序列。

根据本发明使用的TSH受体嵌合体是这样的：在其中部分氨基酸序列被对TSH受体自身免疫抗体具有不同结合行为的另一种受体的相当序列，特别是非结合性序列替代。这种相当的序列例如可以是大鼠LG-CG受体的序列。因此，在根据本发明使用的受体嵌合体中刺激性和/或阻断性自身免疫抗体所结合的那些表位得以替换。因而，在中性自身免疫抗体所结合的TSH受体嵌合体的情况下，用于刺激性和阻断性自身免疫抗体的表位被替换。这些受体嵌合体可以根据Biochem.Biophys.Res.Comun.(1991)，179：70-77或WO 01/27634来构建。为了本发明的公开目的，将这两篇文献引入作为参考。

因而，根据本发明，TSH受体嵌合体可以分为A、B和C。在嵌合体A的情况下，优选地可用基本上相当的LH-CGR的氨基酸10至166替代TSH受体氨基酸8至165。在嵌合体B的情况下，优选可用基本上相应的大鼠LH-CGR的氨基酸261至329替代TSH受体氨基酸261至370。在嵌合体C的情况下，TSH受体的氨基酸8至165以及氨基酸261至370可以用相应的LH-CGR氨基酸替代。

使用TSH受体嵌合体A可以从患者样品中检测阻断性自身免疫抗体，使用嵌合体B可以检测刺激性自身免疫抗体，和使用嵌合体C可以检测中性自身免疫抗体。

TSH受体从胞质中穿过细胞膜而延伸入细胞外空间中。该受体蛋白的胞外部分具有用于TSH和自身免疫抗体的结合位点。令人惊奇地发现，基本上仅具有TSH受体蛋白的胞外部分的截短的TSH受体肽可以稳定地保存而不会丧失结合TSH的能力。其结合自身免疫抗体的能力也是如此。

优选地，根据本发明使用的TSH受体嵌合体A、B或C仅为各自TSH受体嵌合体的胞外部分(截短的TSH受体嵌合体)。这适用于在根据本发明的方法中使用的所谓的第一种TSH受体嵌合体以及所谓的第二种另外使用的TSH受体嵌合体。TSH受体嵌合体的这种胞外部分可以基本上包含具有1-418个氨基酸的肽。这相应野生型TSH受体的胞外部分的氨基酸1-418。因此，优选使用的截短的TSH受体嵌合体A、B和C基本上缺失已知的TSH受体嵌合体的胞质和细胞膜部分。截短的TSH受体嵌合体能够比迄今已知的完整TSH受体嵌合体明显更简单地在根据本发明的检测方法中使用。

优选地，根据本发明的TSH受体嵌合体A、B和C是这样的，即其缺失TSH野生型受体的胞质部分以及基本上缺失细胞膜部分。在这些情形中，野生型TSH受体的胞外部分形成为嵌合体A、B或C，如上描述的。

对于这些截短的TSH受体嵌合体来说特别有利的是，在它们在重组细胞中产生的情况下，当将例如碱性磷酸酶或运甲状腺素蛋白的信号肽或相应的核苷酸序列插入TSH受体嵌合体核苷酸序列之前时，截短的TSH受体嵌合体A、B和C被分泌入胞外空间中。那么不需要分解细胞就可获得TSH受体嵌合体A、B或C。特别优选的是酶运甲状腺素蛋白的信号肽。在本发明说明书中，信号肽指至少具有对于从细胞中分泌截短的受体嵌合体来说所必需的氨基酸的肽残基。

根据进一步的优选实施方案，信号肽是TSH受体嵌合体的组成部分，并且此外，可以在TSH受体嵌合体中包含具有其分泌信号肽序列的可用于检测目的的酶。

在本发明的一个实施方案中，结合于固相上的第一种TSH受体嵌合体可以在其C-末端与肽融合。此类肽例如为甲状腺刺激素(Thyrostimulin)这种肽的高度免疫原性子序列或来自TSH受体C-末端的高度免疫原性子序列。在这种情形中，将第一种TSH受体嵌合体固定在固相上的抗体是针对该肽的单克隆抗体或多克隆抗体，例如针对甲状腺刺激素的抗体。

在本发明的进一步实施方案中，可以如此在C-末端修饰所谓的第二种TSH受体嵌合体，即避免该第二种TSH受体嵌合体特异性地结合至第一种TSH受体嵌合体已经在C-末端与之结合的固定的抗体。因而，抑制了诸如可以在桥联测定法中出现的非特异性结合之类的问题。使用经如此修饰的该第二种受体嵌合体进一步增加了该方法的特异性和灵敏度。

根据进一步的实施方案，上面描述的经修饰的第二种TSH受体嵌合体可以在其C-末端与高度免疫原性的肽相融合。此类肽可以选自甲状腺刺激素的子序列或TSH受体C-末端的子序列。此类子序列可以从TSH受体的胞质部分获得，所述胞质部分例如由TSH受体的核苷酸743-763编码。如此获得的第二种TSH受体嵌合体还具有这样的优点，即避免了第二种TSH受体嵌合体结合至第一种TSH受体嵌合体已经在C-末端与之结合的固定的抗体。由于高度免疫原性肽残基的存在，第二种经标记的抗体可以简单且特异性地结合。与甲状腺刺激素这种肽的子序列的融合得到了相同的优点。针对高度免疫原性肽序列的抗体显示了高度结合亲和力。因此，获得了高度的结合特异性，而非特异性结合大大减少。

可以修饰根据本发明使用的第一种或第二种TSH受体嵌合体以用于检测。这种修饰可以是用于检测的标记或通过免疫原性肽序列进行的标记，该免疫原性肽序列被适合于检测的二抗识别。

在根据本发明的方法中，所谓的第一种TSH受体嵌合体A、B和C可以结合于固相上。在该情形中，TSH受体嵌合体与固相的结合可以通过固定性抗体发生，该固定性抗体例如针对TSH受体嵌合体的C-末端表位。此类抗体可以是多克隆或单克隆抗体。

为了检测自身免疫抗体与TSH受体嵌合体A、B或C之一的结合，可以使用二抗。除了固定性抗体，还可以存在二抗。其可以是单克隆或多克隆抗体。在其中自身免疫抗体结合至蛋白A、G或结合至抗-IgG的根据本发明的方法的这种实施方案中，除去二抗的Fc部分以增加该测定法的特异性和灵敏度。因而，避免该二抗结合至蛋白A、G或抗-IgG。这种抗体的制备是已知的，并且例如描述于Journal ofImmunological Methods，138(1991)，111-119中。在市场上可获得ImmunoPure

F(ab’)s制备试剂盒(Pierce Biotechnology Inc.，Rockfort，I1.61105/US)，其作为用于分离抗体的Fc部分的工具。在该方法的情况下，固定的胃蛋白酶用于分离抗体的FC部分。随后与5，5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)反应，接着与既不结合蛋白A也不结合蛋白G的肽融合。这种融合例如在Science 241(1988)，1353中描述。为了本发明的描述目的，将上述文献引入作为参考。

取决于所期望的测定法设计，可以标记根据本发明使用的TSH受体嵌合体即第一种或第二种TSH受体嵌合体。在本发明的范围内，直接标记是指标记TSH受体嵌合体。在本发明的范围内，间接标记是指使用经标记的二抗。标记过程可以以其直接或间接提供可检测信号的方式进行。

标记试剂可以通过融合或化学键合与TSH受体嵌合体或二抗连接。优选地，标记试剂以N-末端朝向TSH受体嵌合体的方式与后者融合。

合适的标记例如用酶如碱性磷酸酶(AP)、分泌型碱性磷酸酶(SEAP)、萤火虫萤光素酶和过氧化物酶或者染料如吖啶染料、荧光物质或生物/化学发光物质来进行。在上述酶的情形中，编码它们的核苷酸序列优选与TSH受体嵌合体的核苷酸序列相融合。合适的标记进一步例如通过FITC、生物素化和链霉抗生物素蛋白来进行。

依据本发明方法的进一步实施方案，蛋白A、G或抗-IgG可以固定于固相上以用于结合自身免疫抗体。

合适的固相包括塑料体，例如塑料管、塑料板以及磁性和非磁性塑料颗粒。适用于根据本发明使用的固相的塑料是这样的塑料，即其允许蛋白质通过化学或物理反应结合。这些包括珠、微量滴定板和管，其可以由聚苯乙烯、聚乙烯或其他已知的聚合物材料组成。这种固相是本领域技术人员已知的，并且可商业获得。

根据本发明的截短的TSH受体嵌合体可以冻干贮存。它们可以以通过单克隆抗体或多克隆抗体结合在固相上的冻干形式进行贮存。对于检测反应，可以通过溶解于测定缓冲液中而将冻干的成分进行重构。

根据本发明的截短的TSH受体嵌合体在溶解形式的情况下具有高度的稳定性。它们在4℃保持稳定4-7天，在24℃下保持稳定3-6天，和在37℃下保持稳定24小时。这些条件也适于在自动装置上施行根据本发明的检测方法，在所述自动装置上成分在4℃下保存，而测试反应可以在37℃下毫无问题地发生。与此相反，完整的TSH受体嵌合体在4℃下保持稳定3-6天，在24℃下保持稳定24-48小时，和在37℃下仅保持稳定3小时。

在根据本发明方法来测定患有巴泽多病的患者的血清中的TSH自身免疫抗体的情况下，可以获得4-12％的测定间变异系数(Interassay-Variationskoeffizient)这样好的值。测定间精确度明显低于10％。根据本发明的方法极其适合用于自动化地检测患者样品中的自身免疫抗体。为了施行根据本发明的方法，将患者样品各与三种TSH受体嵌合体之一进行反应，并就相应的自身免疫抗体对所述样品进行研究。

在下面通过参考附图描述了根据本发明的方法的示例性实施方案。

图1显示了根据本发明的方法的一个实施方案，其中使结合于固相上的截短的TSH受体嵌合体与患者样品接触。自身免疫抗体结合至TSH受体嵌合体的相应表位。然后将在C-末端通过高度免疫原性肽进行修饰的第二种受体嵌合体加入该反应混合物中。那么，在患者的自身免疫抗体的Fab部分中第二个仍游离的表位结合至第二种受体嵌合体。用经标记的二抗检测自身免疫抗体，所述二抗结合至第二种TSH受体嵌合体C-末端的高度免疫原性肽。

在图2的实施方案中，使用了这样的TSH受体嵌合体作为第二种截短的TSH受体嵌合体，该嵌合体在其C-末端用标记试剂进行修饰。在这种情形中，可以不需要经标记的二抗。

图3显示了这样一种方法形式，在该方法形式中固定性抗体是针甲状腺刺激素这种肽的抗体。第一种TSH受体嵌合体是截短的受体嵌合体，该嵌合体在其C-末端与甲状腺刺激素这种肽相融合。第二种TSH受体嵌合体同样仅包含受体嵌合体的胞外部分，并且在其C-末端进行标记。自身免疫抗体结合至第一种以及第二种TSH受体嵌合体。

图4显示了一种根据本发明的方法形式，其中将蛋白A、G或抗-IgG固定在固相上，并且与患者样品进行接触。患者的自身免疫抗体以其Fc部分结合至蛋白A、G或抗-IgG。在加入TSH受体嵌合体后，患者的自身免疫抗体以其Fab部分结合至TSH受体嵌合体的相应表位。为了检测结合，使用经标记的二抗，该抗体不具有Fc区，从而与蛋白A、G或抗-IgG的结合受到抑制。

备选地，如图5中所显示的，标记可以在TSH受体嵌合体的C-末端处进行。因而，可以通过与TSH受体嵌合体的相应检测反应来检测自身免疫抗体。

还可能从患者样品中检测多种TSH自身免疫抗体的存在。为此，可以例如首先用嵌合体A或C来检测阻断性或中性TSH自身免疫抗体。在进一步的测试过程中，将嵌合体B加入同一个患者样品中，并执行根据本发明的方法。

示例性的根据本发明的TSH受体嵌合体B和A在下面解释。

分别在序列号1和2(TSH受体嵌合体B)中

-核苷酸1-51(氨基酸1-17)代表SEAP信号肽序列，

-核苷酸52-1557(氨基酸18-519)代表SEAP序列，

-核苷酸1558-2280(氨基酸520-760)代表该嵌合体的氨基酸21-261的TSHR序列，

-核苷酸2281-2298(氨基酸760-766)代表该嵌合体的氨基酸261-266的LHR序列，

-核苷酸2299-2316(氨基酸767-772)代表6组氨酸和TAA终止密码子。

分别在序列号3和4(TSH受体嵌合体B)中

-核苷酸1-60(氨基酸1-20)代表TSHR信号肽序列，

-核苷酸61-783(氨基酸21-261)代表该嵌合体的氨基酸21-261的TSHR序列，

-核苷酸784-846(氨基酸262-283)代表高度免疫原性表位。

分别在序列号5和6(TSH受体嵌合体A)中

-核苷酸1-51(氨基酸1-17)代表SEAP信号肽序列，

-核苷酸52-1557(氨基酸18-519)代表SEAP序列，

-核苷酸1561-1998(氨基酸521-686)代表该嵌合体的LHR序列的氨基酸21-166，

-核苷酸1999-2283(氨基酸687-781)代表TSHR序列的氨基酸166-370(在表位A和B之间)，

-核苷酸2284-2553(氨基酸782-891)代表该嵌合体的表位的氨基酸261-370，阻断性TSH自身免疫抗体在此结合。

分别在序列号7和8中

-核苷酸1-60(氨基酸1-20)代表TSHR/LHR信号肽序列，

-核苷酸61-498(氨基酸21-166)代表LHR序列的氨基酸21-166，

-核苷酸499-783(氨基酸167-261)代表TSH受体的氨基酸166-370，

-核苷酸784-1113(氨基酸262-371)代表该嵌合体的表位的氨基酸261-370，阻断性TSH自身免疫抗体在此结合，

-核苷酸1114-1176(氨基酸372-392)代表来自TSH受体的胞质部分的高度免疫原性表位(由TSH受体的核苷酸743-763编码)。

分别在序列号9和10中

-核苷酸1-53(氨基酸1-18)代表gLUC信号肽序列，

-核苷酸54-561(氨基酸19-187)代表Gaussia萤光素酶序列，

-核苷酸562-1281(氨基酸188-427)代表TSH受体的氨基酸21-261，

-核苷酸1282-1302(氨基酸428-434)代表受体嵌合体中的LHR序列的氨基酸261-266，剩下的核苷酸代表6组氨酸和终止密码子。

本发明将通过下列实施例来进一步说明。

实施例

材料

质粒pcDNA3-rLHR(B9)由D.L.Segaloff博士(The Universityof Iowa，USA)提供。质粒pSP-luc-NF从Promega GmbH(Heidelberg，Deutschland)获得。将Amersham GmbH(Braunschweig，Deutschland)的试剂盒用作ECL Western印迹法试剂盒和cAMP RIA试剂盒。

使用了CLONTECH Laboratories，Inc(Palo Alto，CA，USA)的pIRESneo(表达载体)、pSEAP2-Basic，P.J.K.GmbH(Kleinbittersdorf，Deutschland)的Gaussia萤光素酶，Laboratory voor MonoklonaleAntistoffen(LMA)(Wageningen，Niederlande)的碱性磷酸酶大肠杆菌，SYNTHETIC GENE，British Bio-Technology Ltd(UK)的辣根(Armoracia rustician)的辣根过氧化物酶，人甲状腺刺激素(Nakabayashi等人，“Thyrostimulin，a heterodimer of two newhuman glycoprotein hormone subunits，activates thethyroid-stimulating hormone receptor”，J.Clin.109(11)，1445-1452)。

DNA引物

P1(5’-GTCATGCATCAGCTGCTGGTGCTGGCAGTG-3’)

P2(5’-GTCGACGTCGTTATGTGTAAGTTATCACAG-3’)

P3(5’-GTCCTTAAGAAAACACTGCCCTCCAAAGAAAAA-3’)

P4(5’-ATCGAGCTCTTCATTCTCCTCAAAGATGGC-3’)

P5(5’-TACGATATCGGAATGGGGTGTTCGTCT-3’)

P6(5’-TATGGATCCTTATTTGGAGGGCAGTGTTTT-3’)

P7(5’-TACGATATCATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGGC-3’)

P8(5’-TACAGCGCTTGTCTGCTCGAAGCGGCC-3’)

从Interactiva公司(Ulm，Deutschland)获得。

细胞培养

将HEK293细胞在补充有10％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中培养。细胞在于37℃在5％CO₂气氛中培养。

TSHR/LH-CGR嵌合体的构建

根据Biochem.Biophys.Res.Commun.(1991)，179：70-77中的描述来构建三种不同的人TSHR嵌合体，其中部分序列用大鼠LH-CGR的相应序列替代。在下文中称为“嵌合体A”的所述嵌合体之一的情况下，将TSHR氨基酸8-165用相当的LH-CGR的氨基酸10-166替代；在“嵌合体B”的情况下，将TSHR氨基酸261-370用相当的大鼠LH-CGR的氨基酸261-329替代；而在“嵌合体C”的情况下，氨基酸8-165以及氨基酸261-370用相当的LH-CGR氨基酸替代。

具体地，在此从含有大鼠LH-CGR受体的序列的质粒pcDNA3-rLHR(B9)开始。编码氨基酸10-165以及261-329的DNA序列分别用引物对P1-P2和P3-P4根据PCR技术进行扩增，所述引物对分别含有NsiI、AatII、BfrI或SacI限制性位点，从而分别获得NsiI/AatII或BfrI/SacI PCR片段。与此同时，将根据DE 19645729或Exp.Clin.Endocrinol.Diabetes 5：282-290(1997)获得的pTM1-TSHR-FLAG-6HIS质粒用PstI-AatII或BfrI-SacI限制性核酸内切酶消化。除去由此产生的片段，并用从大鼠LH-CG受体获得的PCR片段替代，从而获得不同的TSHR/LH-CGR嵌合体A、B和C的cDNA序列。

将载体pTM1-TSHR-FLAG-6HIS或从其获得的具有TSHR/LH-CGRDNA的新载体(PTM1-TSHR/LH-CGR)用Ava I线性化并用Klenow聚合酶补满“粘性”末端。载体pIRESneo用Cla I线性化并用Klenow聚合酶补满“粘性”末端。用Bam HI分别切出确定用于表达的TSHR或TSHR/LH-CGR片段，并亚克隆进表达载体pIRESneo的Cla I(经补满的位点)/Bam I位点中。因而分别得到表达载体pIRESneo-TSHR或pIRESneo-TSHR/LH-CGR，以用于细胞转染和不同的TSH受体嵌合体的表达，并且也用于嵌合体的修饰。

TSH受体嵌合体的胞外部分的制备

将被克隆进表达载体pIRESneo中的TSH受体嵌合体B(野生型)用作模板以用于使用聚合酶链式反应(PCR)来制备和扩增TSH受体嵌合体B的胞外部分的核苷酸序列。PCR所需的两种引物包含以下核苷酸序列：引物V含有关于限制性酶EcoR V的6核苷酸序列和关于在无信号肽的嵌合体B中的N-末端肽序列的18核苷酸序列。引物6含有氨基酸261-266的核苷酸序列以及关于Bam HI的6核苷酸序列。

将TSH受体嵌合体B核苷酸序列(仅胞外部分)插入表达载体中

获得的PCR产物含有编码氨基酸21-266的核苷酸。将该序列通过EcoR V和Bam I切割位点插入pI RESneo中。

胞外TSH受体嵌合体B和酶SEAP的核苷酸序列的融合

首先，制备下面的两种引物作为随后与pSEAP-2融合的前提。引物7含有SEAP的N-末端氨基酸序列的核苷酸和关于EcoR V的核苷酸。引物8含有关于SEAP的C-末端氨基酸序列的核苷酸以及Eco 47III的核苷酸。以此，通过聚合酶链式反应来进行该模板的扩增。

插入

然后，在EcoR V切割位点处切开pIRESneo-嵌合体B后将融合的核苷酸序列插入pIRESneo-嵌合体B中。通过用酶EcoR V和Bam HI进行限制性分析，选择出具有融合的核苷酸序列的克隆(根据概率，将会含有50％的错误方向的克隆SEAP，其随后在限制性分析中由于较短的长度而与正确的融合核苷酸序列相区别)。

分泌信号肽序列的整合

该过程用与上面在融合和插入部分中所给出的同样的基因工程方法来进行。在此，特别是使用了运甲状腺素蛋白的信号肽序列，因为其导致高分子量球蛋白运甲状腺素蛋白的高分泌效率。

表达融合蛋白TSHR-SEAP或TSHR/LH-CGR-SEAP并作为细胞提取物而获得之

将汇合的稳定HEK293细胞在10-20个75cm²板中培养(大约20×10⁶细胞)。在刮落后，将细胞转移入磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)中并通过于2500rpm离心用PBS洗涤四次。将获得的细胞在冻融下于0.3ml缓冲液A(20mM Hepes-KOH；pH 7.5；50mM NaCl；1％TritonX100；10％甘油)中裂解。将获得的悬浮液在30,000G下离心1小时，收集上清液(大约8mg/ml总蛋白)，并在-70℃下保存。

如此获得的上清液(提取物)可以分别作为TSHR-SEAP或TSHR/LH-CGR-SEAP用于测定方法中。

细胞级分的制备

将HEIK193细胞通过在1,200rpm下离心而形成粒状沉淀。将获得的细胞沉淀重悬浮于0.3ml缓冲液中，该缓冲液含有10mMTris-HCl，pH 7.6，50mM NaCl，10％甘油以及蛋白酶抑制剂混合物。然后在4℃下通过在玻璃/特氟隆匀浆器中的20次提升运动来匀化悬浮液，并然后在800G下离心15分钟，随后在30,000G下离心1小时。收集上清液(细胞质级分)。通过下述方式来处理细胞膜沉淀：在4℃下在0.3ml于相同缓冲液中的1％Triton X100之中通过在玻璃/特氟隆匀浆器中的20次提升运动来对其进行匀化，并然后在30,000G下离心1小时。收集上清液(Triton X100细胞膜提取物)并在-70℃下保存。

获得分泌的胞外融合-TSHR嵌合体

融合-TSH-R嵌合体的截短的胞外结构域由表达它们的细胞分泌进培养物上清液中。分泌的受体蛋白以在测定缓冲液中的确定的稀释度的形式直接用于实验中。例如，来自5ml培养物上清液的10μl胞外SEAP-TSH-R嵌合体B以1∶10的最终稀释度/测定进行使用。

标准校准曲线的产生

为了产生标准曲线，使用具有标准化浓度的自身免疫抗体的标准溶液WHO 90/672。该标准品的初始溶液含有100IU/l，将其稀释以用于产生标准曲线。作为0值，使用在TXBW缓冲液中的无自身免疫抗体的受试者的血清。

将使用的TSH受体嵌合体B以通过抗体固定在微量滴定板上的形式冻干保存，并在使用前在具有蛋白质稳定剂的缓冲液中重构。TritonX100洗涤缓冲液(TXWB)含有0.1％TX-100、50mM Tris/HCl pH 8.0、100mM NaCl。血清稀释缓冲液含有在TXWB中的5％葡萄糖和5％奶粉。

每孔50μl的样品溶液(标准品的稀释物和空白样品)用稀释缓冲液以1∶2进行稀释，并在室温(约22℃)下在微量滴定板上孵育90分钟。进行四次洗涤，每次300μl TXWB。然后将10μl胞外TSH受体嵌合体(与酶SEAP相融合)的1∶100稀释物加至90μl TXWB中，所述稀释物来自直径10cm的培养皿的5ml培养物上清液。随后，在37℃下搅动(300-400rpm)孵育30分钟。然后用300μl TXWB进行4次洗涤。使用Applied Biosystems(Foster City，CA，USA)的Tropix

(用于ECL(增强化学发光)的试剂)，采用Berthold GmbH(Bad Wildbad，Schwarzwald，Deutschland)的Centrol

IA LB 296微量滴定板测量设备来测量生物/化学发光。

检测极限是大约0.2IU/1。在相对光单位(RLU)和达到至少40IU/1的范围内的刺激性自身抗体标准品的浓度之间存在多项式函数。

在图6中，在Y-轴上作为B/B0显示了在TSH受体自身抗体标准品的系列稀释样品中测量的RLU的相对光单位(RLU)(B＝结合的)分别相对于无自身免疫抗体的受试者的空白值(B0)的比例。在X-轴上，标明了标准品的稀释度。测量值(两次测定的平均值)在下表中显示。

IU/L	稀释倍数NIBSC(100IU/L)	RLU平均值n＝3	B/B0	测定间变异系数
IU/L	稀释倍数NIBSC(100IU/L)	RLU平均值n＝3	B/B0	测定间变异系数	0.0	---	6，882.3	1.00	0.0
0.1	1000	28，847.7	4.19	4.6	0.0	---	6，882.3	1.00	0.0
0.1	1000	28，847.7	4.19	4.6	0.2	500	46，607.0	6.77	3.4
0.3	333.3	65，848.3	9.57	5.7	0.2	500	46，607.0	6.77	3.4
0.3	333.3	65，848.3	9.57	5.7	0.4	250	81，488.0	11.84	3.7
0.5	200	98，427.3	14.30	3.8	0.4	250	81，488.0	11.84	3.7
0.5	200	98，427.3	14.30	3.8	0.6	166.7	116，567.7	16.94	3.7
0.7	142.9	135，783.7	19.73	2.6	0.6	166.7	116，567.7	16.94	3.7
0.7	142.9	135，783.7	19.73	2.6	0.8	125	165，778.3	24.09	4.9
0.9	111.1	192，274.7	27.94	2.0	0.8	125	165，778.3	24.09	4.9
0.9	111.1	192，274.7	27.94	2.0	1.0	100	182，910.3	26.58	0.0

2.0	50	382，131.7	55.52	3.3
2.0	50	382，131.7	55.52	3.3	5.0	20	938，959.7	136.43	0.8
15.0	6.7	2，483，045.7	360.79	0.9	5.0	20	938，959.7	136.43	0.8
15.0	6.7	2，483，045.7	360.79	0.9	30.0	3.3	3，772，245.0	548.11	2.6
50.0	2	4，845，780.7	704.09	0.2	30.0	3.3	3，772，245.0	548.11	2.6

根据本发明的测定法与“第二代”的竞争性测定法之间的比较

在3小时内从静脉血中提取血清或血浆样品。可以在4℃下贮存7天或在-20℃下贮存1-2年。二抗(见上面)在-20℃下保存，并在用于测定法前在室温下融化。TSH受体嵌合体在微量滴定板上冻干保存，并在使用前在具有蛋白质稳定剂的缓冲液中重构。Triton X100洗涤缓冲液(TXWB)含有0.1％TX-100、50mM Tris/HCl pH 8.0、100mlNaCl。血清稀释缓冲液含有在TXWB中的5％葡萄糖和5％奶粉。

每孔50μl血清或血浆用缓冲液TXWB以1∶2进行稀释，并在室温(约22℃)下在微量滴定板上孵育90分钟。然后将10μl胞外TSH受体嵌合体(与酶SEAP相融合)的1∶10稀释物加至90μl TXWB中，所述稀释物来自直径10cm的培养皿的5ml培养物上清液。随后，在37℃下搅动(300-400rpm)孵育30分钟。然后用300μl TXWB进行4次洗涤。使用Tropix

并采用Centrol

IA LB 296微量滴定板测量设备来测量生物/化学发光。

图8以比较的方式显示了用根据本发明的方法和用所谓的第二代的测试在患者血清上获得的测量结果。在第二代的测试中，在竞争测试中使用完整的TSH受体进行工作，而没有受体嵌合体。在此，将TSH受体固定在固相上，并与样品血清和经标记的TSH相接触。改变使用的TSH的浓度。自身免疫抗体从受体上排挤掉TSH。将由该排挤导致的信号改变用作测量值。

根据本发明的测试的测定法设计是图2中显示的。竞争性测定法根据所使用的B.R.A.H.M.S.AG(16761 Hennigsdorf，Deutschland)的测试试剂盒TRAK的说明书来进行。

在图8中，根据本发明测得的每升的国际单位显示在该图的Y-轴上，而根据第二代的方法测得的每升的国际单位显示在该图的X轴上。分析显示，在总共41份患者血清的情况下，sTRAb值在14份中比TRAK值低，而在19份中比TRAK值高。

尽管在上面参考某些实施方案描述了本发明，但改变和修饰是可能的，这对于本领域技术人员来说是明显的并且不超出由权利要求书确定的保护范围。

序列表

<110>Loos，Ulrich

<120>用于检测针对TSH受体的自身免疫抗体的方法和新型TSH受体嵌合体

<130>051314WO

<150>102005046022.4

<151>2005-09-26

<160>10

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>2319

<212>DNA

<213>智人

<400>1

atgctgctgc tgctgctgct gctgggcctg aggctacagc tctccctggg catcatccca 60

gttgaggagg agaacccgga cttctggaac cgcgaggcag ccgaggccct gggtgccgcc 120

aagaagctgc agcctgcaca gacagccgcc aagaacctca tcatcttcct gggcgatggg 180

atgggggtgt ctacggtgac agctgccagg atcctaaaag ggcagaagaa ggacaaactg 240

gggcctgaga tacccctggc catggaccgc ttcccatatg tggctctgtc caagacatac 300

aatgtagaca aacatgtgcc agacagtgga gccacagcca cggcctacct gtgcggggtc 360

aagggcaact tccagaccat tggcttgagt gcagccgccc gctttaacca gtgcaacacg 420

acacgcggca acgaggtcat ctccgtgatg aatcgggcca agaaagcagg gaagtcagtg 480

ggagtggtaa ccaccacacg agtgcagcac gcctcgccag ccggcaccta cgcccacacg 540

gtgaaccgca actggtactc ggacgccgac gtgcctgcct cggcccgcca ggaggggtgc 600

caggacatcg ctacgcagct catctccaac atggacattg acgtgatcct aggtggaggc 660

cgaaagtaca tgtttcgcat gggaacccca gaccctgagt acccagatga ctacagccaa 720

ggtgggacca ggctggacgg gaagaatctg gtgcaggaat ggctggcgaa gcgccagggt 780

gcccggtatg tgtggaaccg cactgagctc atgcaggctt ccctggaccc gtctgtgacc 840

catctcatgg gtctctttga gcctggagac atgaaatacg agatccaccg agactccaca 900

ctggacccct ccctgatgga gatgacagag gctgccctgc gcctgctgag caggaacccc 960

cgcggcttct tcctcttcgt ggagggtggt cgcatcgacc atggtcatca tgaaagcagg 1020

gcttaccggg cactgactga gacgatcatg ttcgacgacg ccattgagag ggcgggccag 1080

ctcaccagcg aggaggacac gctgagcctc gtcactgccg accactccca cgtcttctcc 1140

ttcggaggct accccctgcg agggagctcc atcttcgggc tggcccctgg caaggcccgg 1200

gacaggaagg cctacacggt cctcctatac ggaaacggtc caggctatgt gctcaaggac 1260

ggcgcccggc cggatgttac cgagagcgag agcgggagcc ccgagtatcg gcagcagtca 1320

gcagtgcccc tggacgaaga gacccacgca ggcgaggacg tggcggtgtt cgcgcgcggc 1380

ccgcaggcgc acctggttca cggcgtgcag gagcagacct tcatagcgca cgtcatggcc 1440

ttcgccgcct gcctggagcc ctacaccgcc tgcgacctgg cgccccccgc cggcaccacc 1500

gacgccgcgc acccgggtta ctctagagtc ggggcggccg gccgcttcga gcagacagga 1560

atggggtgtt cgtctccacc ctgcgagtgc catcaggagg aggacttcag agtcacctgc 1620

aaggatattc aacgcatccc cagcttaccg cccagtacgc agactctgaa gcttattgag 1680

actcacctga gaactattcc aagtcatgca ttttctaatc tgcccaatat ttccagaatc 1740

tacgtatcta tagatgtgac tctgcagcag ctggaatcac actccttcta caatttgagt 1800

aaagtgactc acatagaaat tcggaatacc aggaacttaa cttacataga ccctgatgcc 1860

ctcaaagagc tccccctcct aaagttcctt ggcattttca acactggact taaaatgttc 1920

cctgacctga ccaaagttta ttccactgat atattcttta tacttgaaat tacagacaac 1980

ccttacatga cgtcaatccc tgtgaatgct tttcagggac tatgcaatga aaccttgaca 2040

ctgaagctgt acaacaatgg ctttacttca gtccaaggat atgctttcaa tgggacaaag 2100

ctggatgctg tttacctaaa caagaataaa tacctgacag ttattgacaa agatgcattt 2160

ggaggagtat acagtggacc aagcttgctg gacgtgtctc aaaccagtgt cactgccctt 2220

ccatccaaag gcctggagca cctgaaggaa ctgatagcaa gaaacacctg gactcttaag 2280

aaaacactgc cctccaaaca tcaccatcac catcactaa 2319

<210>2

<211>772

<212>PRT

<213>智人

<400>2

Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Arg Leu Gln Leu Ser Leu

1 5 10 15

Gly Ile Ile Pro Val Glu Glu Glu Asn Pro Asp Phe Trp Asn Arg Glu

20 25 30

Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ala Ala Lys Lys Leu Gln Pro Ala Gln Thr

35 40 45

Ala Ala Lys Asn Leu Ile Ile Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val Ser

50 55 60

Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Lys Lys Asp Lys Leu

65 70 75 80

Gly Pro Glu Ile Pro Leu Ala Met Asp Arg Phe Pro Tyr Val Ala Leu

85 90 95

Ser Lys Thr Tyr Asn Val Asp Lys His Val Pro Asp Ser Gly Ala Thr

100 105 110

Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Gly Asn Phe Gln Thr Ile Gly

115 120 125

Leu Ser Ala Ala Ala Arg Phe Asn Gln Cys Asn Thr Thr Arg Gly Asn

130 135 140

Glu Val Ile Ser Val Met Asn Arg Ala Lys Lys Ala Gly Lys Ser Val

145 150 155 160

Gly Val Val Thr Thr Thr Arg Val Gln Hi s Ala Ser Pro Ala Gly Thr

165 170 175

Tyr Ala His Thr Val Asn Arg Asn Trp Tyr Ser Asp Ala Asp Val Pro

180 185 190

Ala Ser Ala Arg Gln Glu Gly Cys Gln Asp Ile Ala Thr Gln Leu Ile

195 200 205

Ser Asn Met Asp Ile Asp Val Ile Leu Gly Gly Gly Arg Lys Tyr Met

210 215 220

Phe Arg Met Gly Thr Pro Asp Pro Glu Tyr Pro Asp Asp Tyr Ser Gln

225 230 235 240

Gly Gly Thr Arg Leu Asp Gly Lys Asn Leu Val Gln Glu Trp Leu Ala

245 250 255

Lys Arg Gln Gly Ala Arg Tyr Val Trp Asn Arg Thr Glu Leu Met Gln

260 265 270

Ala Ser Leu Asp Pro Ser Val Thr His Leu Met Gly Leu Phe Glu Pro

275 280 285

Gly Asp Met Lys Tyr Glu Ile His Arg Asp Ser Thr Leu Asp Pro Ser

290 295 300

Leu Met Glu Met Thr Glu Ala Ala Leu Arg Leu Leu Ser Arg Asn Pro

305 310 315 320

Arg Gly Phe Phe Leu Phe Val Glu Gly Gly Arg Ile Asp His Gly His

325 330 335

His Glu Ser Arg Ala Tyr Arg Ala Leu Thr Glu Thr Ile Met Phe Asp

340 345 350

Asp Ala Ile Glu Arg Ala Gly Gln Leu Thr Ser Glu Glu Asp Thr Leu

355 360 365

Ser Leu Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Ser Phe Gly Gly Tyr

370 375 380

Pro Leu Arg Gly Ser Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro Gly Lys Ala Arg

385 390 395 400

Asp Arg Lys Ala Tyr Thr Val Leu Leu Tyr Gly Asn Gly Pro Gly Tyr

405 410 415

Val Leu Lys Asp Gly Ala Arg Pro Asp Val Thr Glu Ser Glu Ser Gly

420 425 430

Ser Pro Glu Tyr Arg Gln Gln Ser Ala Val Pro Leu Asp Glu Glu Thr

435 440 445

His Ala Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Arg Gly Pro Gln Ala His

450 455 460

Leu Val His Gly Val Gln Glu Gln Thr Phe Ile Ala His Val Met Ala

465 470 475 480

Phe Ala Ala Cys Leu Glu Pro Tyr Thr Ala Cys Asp Leu Ala Pro Pro

485 490 495

Ala Gly Thr Thr Asp Ala Ala His Pro Gly Tyr Ser Arg Val Gly Ala

500 505 510

Ala Gly Arg Phe Glu Gln Thr Gly Met Gly Cys Ser Ser Pro Pro Cys

515 520 525

Glu Cys His Gln Glu Glu Asp Phe Arg Val Thr Cys Lys Asp Ile Gln

530 535 540

Arg Ile Pro Ser Leu Pro Pro Ser Thr Gln Thr Leu Lys Leu Ile Glu

545 550 555 560

Thr His Leu Arg Thr Ile Pro Ser His Ala Phe Ser Asn Leu Pro Asn

565 570 575

Ile Ser Arg Ile Tyr Val Ser Ile Asp Val Thr Leu Gln Gln Leu Glu

580 585 590

Ser His Ser Phe Tyr Asn Leu Ser Lys Val Thr His Ile Glu Ile Arg

595 600 605

Asn Thr Arg Asn Leu Thr Tyr Ile Asp Pro Asp Ala Leu Lys Glu Leu

610 615 620

Pro Leu Leu Lys Phe Leu Gly Ile Phe Asn Thr Gly Leu Lys Met Phe

625 630 635 640

Pro Asp Leu Thr Lys Val Tyr Ser Thr Asp Ile Phe Phe Ile Leu Glu

645 650 655

Ile Thr Asp Asn Pro Tyr Met Thr Ser Ile Pro Val Asn Ala Phe Gln

660 665 670

Gly Leu Cys Asn Glu Thr Leu Thr Leu Lys Leu Tyr Asn Asn Gly Phe

675 680 685

Thr Ser Val Gln Gly Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Lys Leu Asp Ala Val

690 695 700

Tyr Leu Asn Lys Asn Lys Tyr Leu Thr Val Ile Asp Lys Asp Ala Phe

705 710 715 720

Gly Gly Val Tyr Ser Gly Pro Ser Leu Leu Asp Val Ser Gln Thr Ser

725 730 735

Val Thr Ala Leu Pro Ser Lys Gly Leu Glu His Leu Lys Glu Leu Ile

740 745 750

Ala Arg Asn Thr Trp Thr Leu Lys Lys Thr Leu Pro Ser Lys His His

755 760 765

His His His His

770

<210>3

<211>849

<212>DNA

<213>智人

<400>3

atgaggccgg cggacttgct gcagctggtg ctgctgctcg acctgcccag ggacctgggc 60

ggaatggggt gttcgtctcc accctgcgag tgccatcagg aggaggactt cagagtcacc 120

tgcaaggata ttcaacgcat ccccagctta ccgcccagta cgcagactct gaagcttatt 180

gagactcacc tgagaactat tccaagtcat gcattttcta atctgcccaa tatttccaga 240

atctacgtat ctatagatgt gactctgcag cagctggaat cacactcctt ctacaatttg 300

agtaaagtga ctcacataga aattcggaat accaggaact taacttacat agaccctgat 360

gccctcaaag agctccccct cctaaagttc cttggcattt tcaacactgg acttaaaatg 420

ttccctgacc tgaccaaagt ttattccact gatatattct ttatacttga aattacagac 480

aacccttaca tgacgtcaat ccctgtgaat gcttttcagg gactatgcaa tgaaaccttg 540

acactgaagc tgtacaacaa tggctttact tcagtccaag gatatgcttt caatgggaca 600

aagctggatg ctgtttacct aaacaagaat aaatacctga cagttattga caaagatgca 660

tttggaggag tatacagtgg accaagcttg ctggacgtgt ctcaaaccag tgtcactgcc 720

cttccatcca aaggcctgga gcacctgaag gaactgatag caagaaacac ctggactctt 780

aaggaaaaat cccatctaac cccaaagaag caaggccaaa tctcagaaga gtatatgcaa 840

acggtttaa 849

<210>4

<211>282

<212>PRT

<213>智人

<400>4

Met Arg Pro Ala Asp Leu Leu Gln Leu Val Leu Leu Leu Asp Leu Pro

1 5 10 15

Arg Asp Leu Gly Gly Met Gly Cys Ser Ser Pro Pro Cys Glu Cys His

20 25 30

Gln Glu Glu Asp Phe Arg Val Thr Cys Lys Asp Ile Gln Arg Ile Pro

35 40 45

Ser Leu Pro Pro Ser Thr Gln Thr Leu Lys Leu Ile Glu Thr His Leu

50 55 60

Arg Thr Ile Pro Ser His Ala Phe Ser Asn Leu Pro Asn Ile Ser Arg

65 70 75 80

Ile Tyr Val Ser Ile Asp Val Thr Leu Gln Gln Leu Glu Ser His Ser

85 90 95

Phe Tyr Asn Leu Ser Lys Val Thr His Ile Glu Ile Arg Asn Thr Arg

100 105 110

Asn Leu Thr Tyr Ile Asp Pro Asp Ala Leu Lys Glu Leu Pro Leu Leu

115 120 125

Lys Phe Leu Gly Ile Phe Asn Thr Gly Leu Lys Met Phe Pro Asp Leu

130 135 140

Thr Lys Val Tyr Ser Thr Asp Ile Phe Phe Ile Leu Glu Ile Thr Asp

145 150 155 160

Asn Pro Tyr Met Thr Ser Ile Pro Val Asn Ala Phe Gln Gly Leu Cys

165 170 175

Asn Glu Thr Leu Thr Leu Lys Leu Tyr Asn Asn Gly Phe Thr Ser Val

180 185 190

Gln Gly Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Lys Leu Asp Ala Val Tyr Leu Asn

195 200 205

Lys Asn Lys Tyr Leu Thr Val Ile Asp Lys Asp Ala Phe Gly Gly Val

210 215 220

Tyr Ser Gly Pro Ser Leu Leu Asp Val Ser Gln Thr Ser Val Thr Ala

225 230 235 240

Leu Pro Ser Lys Gly Leu Glu His Leu Lys Glu Leu Ile Ala Arg Asn

245 250 255

Thr Trp Thr Leu Lys Glu Lys Ser His Leu Thr Pro Lys Lys Gln Gly

260 265 270

Gln Ile Ser Glu Glu Tyr Met Gln Thr Val

275 280

<210>5

<211>2615

<212>DNA

<213>智人

<400>5

atgctgctgc tgctgctgct gctgggcctg aggctacagc tctccctggg catcatccca 60

gttgaggagg agaacccgga cttctggaac cgcgaggcag ccgaggccct gggtgccgcc 120

aagaagctgc agcctgcaca gacagccgcc aagaacctca tcatcttcct gggcgatggg 180

atgggggtgt ctacggtgac agctgccagg atcctaaaag ggcagaagaa ggacaaactg 240

gggcctgaga tacccctggc catggaccgc ttcccatatg tggctctgtc caagacatac 300

aatgtagaca aacatgtgcc agacagtgga gccacagcca cggcctacct gtgcggggtc 360

aagggcaact tccagaccat tggcttgagt gcagccgccc gctttaacca gtgcaacacg 420

acacgcggca acgaggtcat ctccgtgatg aatcgggcca agaaagcagg gaagtcagtg 480

ggagtggtaa ccaccacacg agtgcagcac gcctcgccag ccggcaccta cgcccacacg 540

gtgaaccgca actggtactc ggacgccgac gtgcctgcct cggcccgcca ggaggggtgc 600

aggacatcgc tacgcagctc atctccaaca tggacattga cgtgatccta ggtggaggcc 660

gaaagtacat gtttcgcatg ggaaccccag accctgagta cccagatgac tacagccaag 720

gtgggaccag gctggacggg aagaatctgg tgcaggaatg gctggcgaag cgccagggtg 780

cccggtatgt gtggaaccgc actgagctca tgcaggcttc cctggacccg tctgtgaccc 840

atctcatggg tctctttgag cctggagaca tgaaatacga gatccaccga gactccacac 900

tggacccctc cctgatggag atgacagagg ctgccctgcg cctgctgagc aggaaccccc 960

gcggcttctt cctcttcgtg gagggtggtc gcatcgacca tggtcatcat gaaagcaggg 1020

cttaccgggc actgactgag acgatcatgt tcgacgacgc cattgagagg gcgggccagc 1080

tcaccagcga ggaggacacg ctgagcctcg tcactgccga ccactcccac gtcttctcct 1140

tcggaggcta ccccctgcga gggagctcca tcttcgggct ggcccctggc aaggcccggg 1200

acaggaaggc ctacacggtc ctcctatacg gaaacggtcc aggctatgtg ctcaaggacg 1260

gcgcccggcc ggatgttacc gagagcgaga gcgggagccc cgagtatcgg cagcagtcag 1320

cagtgcccct ggacgaagag acccacgcag gcgaggacgt ggcggtgttc gcgcgcggcc 1380

cgcaggcgca cctggttcac ggcgtgcagg agcagacctt catagcgcac gtcatggcct 1440

tcgccgcctg cctggagccc tacaccgcct gcgacctggc gccccccgcc ggcaccaccg 1500

acgccgcgca cccgggttac tctagagtcg gggcggccgg ccgcttcgag cagacaaagc 1560

cttcacagct gcagtcccga gagctgtcag ggtcgcgctg ccccgagccc tgcgactgcg 1620

caccggatgg cgccctgcgc tgtcctggcc ctcgagccgg cctcgccaga ctatctctca 1680

cctatctccc tgtcaaagta attccatcac aagctttcag gggacttaat gaggtcgtaa 1740

aaattgaaat ctctcagagt gattccctgg aaaggataga agctaatgcc tttgacaacc 1800

tcctcaattt gtctgaacta ctgatccaga acaccaaaaa cctgctatac attgaacctg 1860

gtgcttttac aaacctccct cggttaaaat acctgagcat ctgtaacaca ggcatccgaa 1920

cccttccaga tgttacgaag atctcctcct ctgaatttaa tttcattctg gaaatctgtg 1980

ataacttaca cataacctca atccctgtga atgcttttca gggactatgc aatgaaacct 2040

tgacactgaa gctgtacaac aacggcttta cttcagtcca aggatatgct ttcaatggga 2100

caaagctgga tgctgtttac ctaaacaaga ataaatacct gacagttatt gacaaagatg 2160

catttggagg agtatacagt ggaccaagct tgctggacgt gtctcaaacc agtgtcactg 2220

cccttccatc caaaggcctg gagcacctga aggaactgat agcaagaaac acctggactc 2280

ttaagaaact tccactttcc ttgagtttcc ttcacctcac acgggctgac ctttcttacc 2340

caagccactg ctgtgccttt aagaatcaga agaaaatcag aggaatcctt gagtccttga 2400

tgtgtaatga gagcagtatg cagagcttgc gccagagaaa atctgtgaat gccttgaata 2460

gccccctcca ccaggaatat gaagagaatc tgggtgacag cattgttggg tacaaggaaa 2520

agtccaagtt ccaggatact cataacaacg ctcattatta cgtcttcttt gaagaacaag 2580

aggatgagat cattggtttt ggccaggagc tctaa 2615

<210>6

<211>871

<212>PRT

<213>智人

<400>6

Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Arg Leu Gln Leu Ser Leu

1 5 10 15

Gly Ile Ile Pro Val Glu Glu Glu Asn Pro Asp Phe Trp Asn Arg Glu

20 25 30

Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ala Ala Lys Lys Leu Gln Pro Ala Gln Thr

35 40 45

Ala Ala Lys Asn Leu Ile Ile Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val Ser

50 55 60

Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Lys Lys Asp Lys Leu

65 70 75 80

Gly Pro Glu Ile Pro Leu Ala Met Asp Arg Phe Pro Tyr Val Ala Leu

85 90 95

Ser Lys Thr Tyr Asn Val Asp Lys His Val Pro Asp Ser Gly Ala Thr

100 105 110

Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Gly Asn Phe Gln Thr Ile Gly

115 120 125

Leu Ser Ala Ala Ala Arg Phe Asn Gln Cys Asn Thr Thr Arg Gly Asn

130 135 140

Glu Val Ile Ser Val Met Asn Arg Ala Lys Lys Ala Gly Lys Ser Val

145 150 155 160

Gly Val Val Thr Thr Thr Arg Val Gln His Ala Ser Pro Ala Gly Thr

165 170 175

Tyr Ala His Thr Val Asn Arg Asn Trp Tyr Ser Asp Ala Asp Val Pro

180 185 190

Ala Ser Ala Arg Gln Glu Gly Cys Gln Asp Ile Ala Thr Gln Leu Ile

195 200 205

Ser Asn Met Asp Ile Asp Val Ile Leu Gly Gly Gly Arg Lys Tyr Met

210 215 220

Phe Arg Met Gly Thr Pro Asp Pro Glu Tyr Pro Asp Asp Tyr Ser Gln

225 230 235 240

Gly Gly Thr Arg Leu Asp Gly Lys Asn Leu Val Gln Glu Trp Leu Ala

245 250 255

Lys Arg Gln Gly Ala Arg Tyr Val Trp Asn Arg Thr Glu Leu Met Gln

260 265 270

Ala Ser Leu Asp Pro Ser Val Thr His Leu Met Gly Leu Phe Glu Pro

275 280 285

Gly Asp Met Lys Tyr Glu Ile His Arg Asp Ser Thr Leu Asp Pro Ser

290 295 300

Leu Met Glu Met Thr Glu Ala Ala Leu Arg Leu Leu Ser Arg Asn Pro

305 310 315 320

Arg Gly Phe Phe Leu Phe Val Glu Gly Gly Arg Ile Asp His Gly His

325 330 335

His Glu Ser Arg Ala Tyr Arg Ala Leu Thr Glu Thr Ile Met Phe Asp

340 345 350

Asp Ala Ile Glu Arg Ala Gly Gln Leu Thr Ser Glu Glu Asp Thr Leu

355 360 365

Ser Leu Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Ser Phe Gly Gly Tyr

370 375 380

Pro Leu Arg Gly Ser Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro Gly Lys Ala Arg

385 390 395 400

Asp Arg Lys Ala Tyr Thr Val Leu Leu Tyr Gly Asn Gly Pro Gly Tyr

405 410 415

Val Leu Lys Asp Gly Ala Arg Pro Asp Val Thr Glu Ser Glu Ser Gly

420 425 430

Ser Pro Glu Tyr Arg Gln Gln Ser Ala Val Pro Leu Asp Glu Glu Thr

435 440 445

His Ala Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Arg Gly Pro Gln Ala His

450 455 460

Leu Val His Gly Val Gln Glu Gln Thr Phe Ile Ala His Val Met Ala

465 470 475 480

Phe Ala Ala Cys Leu Glu Pro Tyr Thr Ala Cys Asp Leu Ala Pro Pro

485 490 495

Ala Gly Thr Thr Asp Ala Ala His Pro Gly Tyr Ser Arg Val Gly Ala

500 505 510

Ala Gly Arg Phe Glu Gln Thr Lys Pro Ser Gln Leu Gln Ser Arg Glu

515 520 525

Leu Ser Gly Ser Arg Cys Pro Glu Pro Cys Asp Cys Ala Pro Asp Gly

530 535 540

Ala Leu Arg Cys Pro Gly Pro Arg Ala Gly Leu Ala Arg Leu Ser Leu

545 550 555 560

Thr Tyr Leu Pro Val Lys Val Ile Pro Ser Gln Ala Phe Arg Gly Leu

565 570 575

Asn Glu Val Val Lys Ile Glu Ile Ser Gln Ser Asp Ser Leu Glu Arg

580 585 590

Ile Glu Ala Asn Ala Phe Asp Asn Leu Leu Asn Leu Ser Glu Leu Leu

595 600 605

Ile Gln Asn Thr Lys Asn Leu Leu Tyr Ile Glu Pro Gly Ala Phe Thr

610 615 620

Asn Leu Pro Arg Leu Lys Tyr Leu Ser Ile Cys Asn Thr Gly Ile Arg

625 630 635 640

Thr Leu Pro Asp Val Thr Lys Ile Ser Ser Ser Glu Phe Asn Phe Ile

645 650 655

Leu Glu Ile Cys Asp Asn Leu His Ile Thr Ser Ile Pro Val Asn Ala

660 665 670

Phe Gln Gly Leu Cys Asn Glu Thr Leu Thr Leu Lys Leu Tyr Asn Asn

675 680 685

Gly Phe Thr Ser Val Gln Gly Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Lys Leu Asp

690 695 700

Ala Val Tyr Leu Asn Lys Asn Lys Tyr Leu Thr Val Ile Asp Lys Asp

705 710 715 720

Ala Phe Gly Gly Val Tyr Ser Gly Pro Ser Leu Leu Asp Val Ser Gln

725 730 735

Thr Ser Val Thr Ala Leu Pro Ser Lys Gly Leu Glu His Leu Lys Glu

740 745 750

Leu Ile Ala Arg Asn Thr Trp Thr Leu Lys Lys Leu Pro Leu Ser Leu

755 760 765

Ser Phe Leu His Leu Thr Arg Ala Asp Leu Ser Tyr Pro Ser His Cys

770 775 780

Cys Ala Phe Lys Asn Gln Lys Lys Ile Arg Gly Ile Leu Glu Ser Leu

785 790 795 800

Met Cys Asn Glu Ser Ser Met Gln Ser Leu Arg Gln Arg Lys Ser Val

805 810 815

Asn Ala Leu Asn Ser Pro Leu His Gln Glu Tyr Glu Glu Asn Leu Gly

820 825 830

Asp Ser Ile Val Gly Tyr Lys Glu Lys Ser Lys Phe Gln Asp Thr His

835 840 845

Asn Asn Ala His Tyr Tyr Val Phe Phe Glu Glu Gln Glu Asp Glu Ile

850 855 860

Ile Gly Phe Gly Gln Glu Leu

865 870

<210>7

<211>1179

<212>DNA

<213>智人

<400>7

atgaggccgg cggacttgct gcagctgcag ctgctggtgc tggcagtgct gctgctgaag 60

ccttcacagc tgcagtcccg agagctgtca gggtcgcgct gccccgagcc ctgcgactgc 120

gcaccggatg gcgccctgcg ctgtcctggc cctcgagccg gcctcgccag actatctctc 180

acctatctcc ctgtcaaagt aattccatca caagctttca ggggacttaa tgaggtcgta 240

aaaattgaaa tctctcagag tgattccctg gaaaggatag aagctaatgc ctttgacaac 300

ctcctcaatt tgtctgaact actgatccag aacaccaaaa acctgctata cattgaacct 360

ggtgctttta caaacctccc tcggttaaaa tacctgagca tctgtaacac aggcatccga 420

acccttccag atgttacgaa gatctcctcc tctgaattta atttcattct ggaaatctgt 480

gataacttac acataacctc aatccctgtg aatgcttttc agggactatg caatgaaacc 540

ttgacactga agctgtacaa caacggcttt acttcagtcc aaggatatgc tttcaatggg 600

acaaagctgg atgctgttta cctaaacaag aataaatacc tgacagttat tgaeaaagat 660

gcatttggag gagtatacag tggaccaagc ttgctggacg tgtctcaaac cagtgtcact 720

gcccttccat ccaaaggcct ggagcacctg aaggaactga tagcaagaaa cacctggact 780

cttaagaaac ttccactttc cttgagtttc cttcacctca cacgggctga cctttcttac 840

ccaagccact gctgtgcctt taagaatcag aagaaaatca gaggaatcct tgagtccttg 900

atgtgtaatg agagcagtat gcagagcttg cgccagagaa aatctgtgaa tgccttgaat 960

agccccctcc accaggaata tgaagagaat ctgggtgaca gcattgttgg gtacaaggaa 1020

aagtccaagt tccaggatac tcataacaac gctcattatt acgtcttctt tgaagaacaa 1080

gaggatgaga tcattggttt tggccaggag ctcgaaaaat cccatctaac cccaaagaag 1140

caaggccaaa tctcagaaga gtatatgcaa acggtttaa 1179

<210>8

<211>392

<212>PRT

<213>智人

<400>8

Met Arg Pro Ala Asp Leu Leu Gln Leu Gln Leu Leu Val Leu Ala Val

1 5 10 15

Leu Leu Leu Lys Pro Ser Gln Leu Gln Ser Arg Glu Leu Ser Gly Ser

20 25 30

Arg Cys Pro Glu Pro Cys Asp Cys Ala Pro Asp Gly Ala Leu Arg Cys

35 40 45

Pro Gly Pro Arg Ala Gly Leu Ala Arg Leu Ser Leu Thr Tyr Leu Pro

50 55 60

Val Lys Val Ile Pro Ser Gln Ala Phe Arg Gly Leu Asn Glu Val Val

65 70 75 80

Lys Ile Glu Ile Ser Gln Ser Asp Ser Leu Glu Arg Ile Glu Ala Asn

85 90 95

Ala Phe Asp Asn Leu Leu Asn Leu Ser Glu Leu LeuIle Gln Asn Thr

100 105 110

Lys Asn Leu Leu Tyr Ile Glu Pro Gly Ala Phe Thr Asn Leu Pro Arg

115 120 125

Leu Lys Tyr Leu Ser Ile Cys Asn Thr Gly Ile Arg Thr Leu Pro Asp

130 135 140

Val Thr Lys Ile Ser Ser Ser Glu Phe Asn Phe Ile Leu Glu Ile Cys

145 150 155 160

Asp Asn Leu His Ile Thr Ser Ile Pro Val Asn Ala Phe Gln Gly Leu

165 170 175

Cys Asn Glu Thr Leu Thr Leu Lys Leu Tyr Asn Asn Gly Phe Thr Ser

180 185 190

Val Gln Gly Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Lys Leu Asp Ala Val Tyr Leu

195 200 205

Asn Lys Asn Lys Tyr Leu Thr Val Ile Asp Lys Asp Ala Phe Gly Gly

210 215 220

Val Tyr Ser Gly Pro Ser Leu Leu Asp Val Ser Gln Thr Ser Val Thr

225 230 235 240

Ala Leu Pro Ser Lys Gly Leu Glu His Leu Lys Glu Leu Ile Ala Arg

245 250 255

Asn Thr Trp Thr Leu Lys Lys Leu Pro Leu Ser Leu Ser Phe Leu His

260 265 270

Leu Thr Arg Ala Asp Leu Ser Tyr Pro Ser His Cys Cys Ala Phe Lys

275 280 285

Asn Gln Lys Lys Ile Arg Gly Ile Leu Glu Ser Leu Met Cys Asn Glu

290 295 300

Ser Ser Met Gln Ser Leu Arg Gln Arg Lys Ser Val Asn Ala Leu Asn

305 310 315 320

Ser Pro Leu His Gln Glu Tyr Glu Glu Asn Leu Gly Asp Ser Ile Val

325 330 335

Gly Tyr Lys Glu Lys Ser Lys Phe Gln Asp Thr His Asn Asn Ala His

340 345 350

Tyr Tyr Val Phe Phe Glu Glu Gln Glu Asp Glu Ile Ile Gly Phe Gly

355 360 365

Gln Glu Leu Glu Lys Ser His Leu Thr Pro Lys Lys Gln Gly Gln Ile

370 375 380

Ser Glu Glu Tyr Met Gln Thr Val

385 390

<210>9

<211>1323

<212>DNA

<213>智人

<400>9

atgggagtca aagttctgtt tgccctgatc tgcatcgctg tggccgaggc caagcccacc 60

gagaacaacg aagacttcaa catcgtggcc gtggccagca acttcgcgac cacggatctc 120

gatgctgacc gcgggaagtt gcccggcaag aagctgccgc tggaggtgct caaagagatg 180

gaagccaatg cccggaaagc tggctgcacc aggggctgtc tgatctgcct gtcccacatc 240

aagtgcacgc ccaagatgaa gaagttcatc ccaggacgct gccacaccta cgaaggcgac 300

aaagagtccg cacagggcgg cataggcgag gcgatcgtcg acattcctga gattcctggg 360

ttcaaggact tggagcccat ggagcagttc atcgcacagg tcgatctgtg tgtggactgc 420

acaactggct gcctcaaagg gcttgccaac gtgcagtgtt ctgacctgct caagaagtgg 480

ctgccgcaac gctgtgcgac ctttgccagc aagatccagg gccaggtgga caagatcaag 540

ggggccggtg gtgacagcat cggaatgggg tgttcgtctc caccctgcga gtgccatcag 600

gaggaggact tcagagtcac ctgcaaggat attcaacgca tccccagctt accgcccagt 660

acgcagactc tgaagcttat tgagactcac ctgagaacta ttccaagtca tgcattttct 720

aatctgccca atatttccag aatctacgta tctatagatg tgactctgca gcagctggaa 780

tcacactcct tctacaattt gagtaaagtg actcacatag aaattcggaa taccaggaac 840

ttaacttaca tagaccctga tgccctcaaa gagctccccc tcctaaagtt ccttggcatt 900

ttcaacactg gacttaaaat gttccctgac ctgaccaaag tttattccac tgatatattc 960

tttatacttg aaattacaga caacccttac atgacgtcaa tccctgtgaa tgcttttcag 1020

ggactatgca atgaaacctt gacactgaag ctgtacaaca atggctttac ttcagtccaa 1080

ggatatgctt tcaatgggac aaagctggat gctgtttacc taaacaagaa taaatacctg 1140

acagttattg acaaagatgc atttggagga gtatacagtg gaccaagctt gctggacgtg 1200

tctcaaacca gtgtcactgc ccttccatcc aaaggcctgg agcacctgaa ggaactgata 1260

gcaagaaaca cctggactct taagaaaaca ctgccctcca aacatcacca tcaccatcac 1320

taa 1323

<210>10

<211>440

<212>PRT

<213>智人

<400>10

Met Gly Val Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu

1 5 10 15

Ala Lys Pro Thr Glu Asn Asn Glu Asp Phe Asn Ile Val Ala Val Ala

20 25 30

Ser Asn Phe Ala Thr Thr Asp Leu Asp Ala Asp Arg Gly Lys Leu Pro

35 40 45

Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu Lys Glu Met Glu Ala Asn Ala

50 55 60

Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly Cys Leu Ile Cys Leu Ser His Ile

65 70 75 80

Lys Cys Thr Pro Lys Met Lys Lys Phe Ile Pro Gly Arg Cys His Thr

85 90 95

Tyr Glu Gly Asp Lys Glu Ser Ala Gln Gly Gly Ile Gly Glu Ala Ile

100 105 110

Val Asp Ile Pro Glu Ile Pro Gly Phe Lys Asp Leu Glu Pro Met Glu

115 120 125

Gln Phe Ile Ala Gln Val Asp Leu Cys Val Asp Cys Thr Thr Gly Cys

130 135 140

Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Gln Cys Ser Asp Leu Leu Lys Lys Trp

145 150 155 160

Leu Pro Gln Arg Cys Ala Thr Phe Ala Ser Lys Ile Gln Gly Gln Val

165 170 175

Asp Lys Ile Lys Gly Ala Gly Gly Asp Ser Ile Gly Met Gly Cys Ser

180 185 190

Ser Pro Pro Cys Glu Cys His Gln Glu Glu Asp Phe Arg Val Thr Cys

195 200 205

Lys Asp Ile Gln Arg Ile Pro Ser Leu Pro Pro Ser Thr Gln Thr Leu

210 215 220

Lys Leu Ile Glu Thr His Leu Arg Thr Ile Pro Ser His Ala Phe Ser

225 230 235 240

Asn Leu Pro Asn Ile Ser Arg Ile Tyr Val Ser Ile Asp Val Thr Leu

245 250 255

Gln Gln Leu Glu Ser His Ser Phe Tyr Asn Leu Ser Lys Val Thr His

260 265 270

Ile Glu Ile Arg Asn Thr Arg Asn Leu Thr Tyr Ile Asp Pro Asp Ala

275 280 285

Leu Lys Glu Leu Pro Leu Leu Lys Phe Leu Gly Ile Phe Asn Thr Gly

290 295 300

Leu Lys Met Phe Pro Asp Leu Thr Lys Val Tyr Ser Thr Asp Ile Phe

305 310 315 320

Phe Ile Leu Glu Ile Thr Asp Asn Pro Tyr Met Thr Ser Ile Pro Val

325 330 335

Asn Ala Phe Gln Gly Leu Cys Asn Glu Thr Leu Thr Leu Lys Leu Tyr

340 345 350

Asn Asn Gly Phe Thr Ser Val Gln Gly Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Lys

355 360 365

Leu Asp Ala Val Tyr Leu Asn Lys Asn Lys Tyr Leu Thr Val Ile Asp

370 375 380

Lys Asp Ala Phe Gly Gly Val Tyr Ser Gly Pro Ser Leu Leu Asp Val

385 390 395 400

Ser Gln Thr Ser Val Thr Ala Leu Pro Ser Lys Gly Leu Glu His Leu

405 410 415

Lys Glu Leu Ile Ala Arg Asn Thr Trp Thr Leu Lys Lys Thr Leu Pro

420 425 430

Ser Lys His His His His His His

435 440

Claims

1.用于区别性地测定患者样品中不同类型的针对TSH受体(TSH-R)的自身抗体的方法，该方法使用TSH受体嵌合体作为所述自身抗体的结合剂，其中将对于结合刺激性和/或阻断性自身抗体来说重要的受体序列用另一种受体的相应的、不导致各类型的自身抗体的结合的序列替代，

其特征在于

使用以这样的方式进行配置的第二种受体嵌合体，即所述第二种受体嵌合体可以通过已知的检测方法进行检测。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于，将在其C-末端以这样的方式进行修饰的受体嵌合体用作所述第二种受体嵌合体，即排除与导致固定所述第一种TSH受体嵌合体的抗体的结合。

3.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述修饰通过肽残基来实现。

4.根据权利要求3的方法，其特征在于，所述肽残基是来自甲状腺刺激素这种肽或所述TSH受体的C-末端的高度免疫原性的子序列。

5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其特征在于，所述第二种受体嵌合体在C-末端进行修饰，并且为了通过常规检测方法实施检测而进行标记。

6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其特征在于，所述结合至固相的第一种TSH受体嵌合体在其C-末端与肽相融合。

7.根据权利要求5的方法，其特征在于，所述第一种TSH受体嵌合体在其C-末端与来自甲状腺刺激素这种肽或所述TSH受体的C-末端的高度免疫原性肽序列相融合。

8.用于区别性地测定患者样品中不同类型的针对TSH受体(TSH-R)的自身抗体的方法，该方法使用TSH受体嵌合体作为所述自身抗体的结合剂，其中将对于结合刺激性和/或阻断性自身抗体来说重要的受体序列用另一种受体的相应的、不导致各类型的自身抗体的结合的序列替代，

其特征在于

(b)向由吸附于固相上的结合剂和患者样品组成的混合物中添加TSH受体嵌合体，以使得自身免疫抗体结合至所述受体嵌合体，

(c)向得到的反应混合物中添加经标记的二抗，以使得所述二抗在所述受体嵌合体的与所述自身免疫抗体所结合的表位不同的表位处结合至所述受体嵌合体，并且其中所述二抗以这样的方式进行修饰，即其不结合至吸附于固相上的结合剂，或者

在阶段(b)中，使用为了实施常规检测而进行标记的TSH受体嵌合体，并且放弃在阶段(c)中的步骤。

9.根据权利要求1-8中任一项的方法，其特征在于，将仅包含受体嵌合体A、B或C的胞外部分的截短的受体嵌合体A、B或C用作TSH受体嵌合体。

10.TSH受体嵌合体，其中将对于结合刺激性和/或阻断性自身抗体来说重要的受体序列用另一种受体的相应的、不导致各类型的自身抗体的结合的序列替代，其特征在于，所述TSH受体嵌合体被截短并且基本上不包含天然TSH受体蛋白的膜部分和胞质部分。

11.根据权利要求10的TSH受体嵌合体，其特征在于，所述截短的TSH受体嵌合体含有刺激性或阻断性TSH受体自身免疫抗体所结合的表位，或者不含有这两种表位。

12.根据权利要求10的TSH受体嵌合体，其特征在于，所述TSH受体嵌合体在N-末端或C-末端具有酶或其他产生信号的试剂以用于检测反应。

13.根据权利要求12的TSH受体嵌合体，其特征在于，所述其他产生信号的试剂是吖啶化合物或钌化合物或异硫氰酸荧光素。

14.根据权利要求12的TSH受体嵌合体，其特征在于，所述酶是分泌型碱性磷酸酶、萤火虫或Gaussia萤光素酶或者过氧化物酶。

15.根据权利要求10的TSH受体嵌合体，其特征在于，所述TSH受体嵌合体在其C-末端与免疫原性肽序列相融合。

16.根据权利要求15的TSH受体嵌合体，其特征在于，所述TSH受体嵌合体在其C-末端与甲状腺刺激素这种肽的肽序列或来自所述TSH受体的胞质部分的肽序列相融合。

17.根据权利要求10的TSH受体嵌合体，其特征在于，为了提高它们从细胞中的分泌，所述TSH受体嵌合体在其N-末端与运甲状腺素蛋白的信号肽或至少这些信号肽的对于从细胞中分泌来说必需的肽残基相融合。