BRPI0516243B1 - Uso de um precursor de esteróide sexual selecionado do grupo que consiste em dehidroepiandrosterona, sulfato de dehidroepiandrosterona, androst-5-eno-3?,17?-diol e 4-androsten-3,17-diona, uso do referido precursor em 5 associação com um modulador de receptor de estrogênio seletivo para proteção uterina e da glândula mamária contra câncer, composição farmacêutica e kit - Google Patents

Abstract

precursores de esteróide sexual isolados ou em combinação com um modulador de receptor estrogênio seletivo e/ou com estrogênios e/ou inibidor de fosfodiesterase de cgmp tipo 5 para a prevenção e tratamento de secura vaginal e disfunção sexual em mulheres na pós-menopausa. novos métodos para o tratamento ou redução da probabilidade de adquirir disfunção vaginal, mais particularmente secura vaginal e dispareunia, levando a disfunção sexual e baixo desejo e performance sexual, em animais de sangue quente suscetíveis incluindo humanos que envolve a administração de um precursor de esteróide sexual. a administração adicional de estrogênio ou modulador de receptor estrogênio seletivo, particularmente aqueles selecionados do grupo que consiste em raloxifeno, arzoxifeno, tamoxifeno, droloxifeno, toremifeno, iodoxifeno, gw 5638, tse-424, era-923 e lasofoxifeno, e mais particularmente compostos que têm a estrutura geral são especificamente revelados para o tratamento médico e/ou inibição do desenvolvimento de algumas das doenças acima mencionadas. composições farmacêuticas para liberação de ingrediente(s) ativo(s) e kit(s) úteis para a invenção também são revelados.

Description

Campo da invenção

A presente invenção relaciona-se a um método para tratamento ou redução da probabilidade de adquirir problemas que afetam a camada lâmina própria ou a camada muscular da vagina que usa precursores de esteróide sexual isoladamente ou em uma nova terapia de combinação em animais de sangue quente suscetíveis, incluindo humanos. Em particular, as combinações incluem a administração de um modulador de receptor de estrogênio seletivo (SERM) e a elevação dos niveis dos precursores de esteroides sexuais do paciente, o referido precursor sendo selecionado do grupo que consiste em dehidroepiandrosterona (DHEA), sulfato de dehidroepiandrosterona (DHEA-S) e androst-5-eno- 3β,17β-diol(5-diol). Estrogênios também podem ser administrados para contrabalançar os efeitos potenciais de alguns SERMs sobre fogachos e outros sintomas da menopausa. Inibidor tipo 5 de cGMP fosfodiesterase também pode ser administrado para melhorar a atividade sexual. A invenção também se relaciona a kits e composições farmacêuticas para a prática da combinação anterior.

Em US 5.843.932, foi relatado o efeito sobre a atrofia vaginal de um, três ou seis meses de tratamento com DHEA administrada em uma dose de 30 mg duas vezes ao dia em uma solução de 50% etanol-50% propileno glicol sobre uma área de 2 cm2 da pele dorsal em rato ooforectomizado. Exame histopatológico mostrou proliferação e murification do epitélio vaginal e reversão da atrofia da mucosa vaginal em ratos tratados com DHEA.

O estudo foi realizado com o rato quando DHEA foi aplicado na pele dorsal por 1, 3 e 6 meses examinando apenas o efeito sobre o epitélio vaginal (Sourla e cols., 1998, J. Steroid Biochem Mol Biol., 66(3) : 137-149) e não sobre as duas outras camadas, ou seja, a lâmina própria e a muscular. Foi então observado que DHEA era cerca de 10 vezes mais eficiente sobre o epitélio vaginal quando aplicado topicamente do que quando administrado sobre a pele em um local distante da vagina, assim necessitando de absorção sistêmica para exercer sua função.

Em um estudo prévio sobre o efeito de DHEA administrado sobre a pele em mulheres na pós-menopausa por 12 meses em um creme a 10% de DHEA, apenas a atividade estrogênica de DHEA foi avaliada (Labrie e cols., 1997, J. Clin. Endocrinol. Metab., 82: 3498-3505). Foi indicado (página 3.500) "Vaginal cytology was examined as specific parameter of the estrogenic action of DHEA". Isso ocorre pelo método de avaliação, ou seja, esfregaço vaginal que é limitado à superfície e removeu facilmente as células do epitélio.

A presente invenção descreve os efeitos de DHEA e outros componentes sobre as três camadas da vagina, ou seja, a muscular, a lâmina própria e o epitélio com novos benefícios nos três niveis. Os efeitos benéficos de DHEA sobre a lâmina própria e muscular são de grande importância para a ação positiva de inibidores de tipo 5 GMPc fosfo- diesterase, como viagra e outros compostos ou prostaglandina El.

Fundamento da técnica relacionada

A secura vaginal afeta cerca de 50% das mulheres na pós-menopausa em idades de 50 a 60 anos e 72% depois dos 70 anos (Rossin-Amar, 2000, Gynecol Obstet Fértil, 28(3): 245- 249) . Nessas mulheres, cerca de 80% experimentaram distúrbios urogenitais, especialmente vaginite e dispareunia (Pandit and Ouslander, 1997, Am J Med Sci, 314(4) : 22831) . Uma vez que esses problemas são, pelo menos parcialmente, relacionados a uma deprivação de esteróides sexuais, a terapia de substituição hormonal local adequada deve ser considerada na menopausa. Foi reconhecido recentemente que mulheres na pós-menopausa não são apenas deprivadas de todos estrogênios ovarianos, mas elas também são progressivamente deprivadas dos androgênios que se originam da transformação intracrine periférica de dehidroepiandrosterona (DHEA) em andrógenos e estrógenos (Labrie e cols., 1991, Mol Cell Endocrinol,'78: C113-C118; Labrie e cols., 1995, Ann NY Acad Sci, 774: 16-28; Labrie e cols., 2003, End Rev, 24(2): 152-182). De fato, DHEA sérico e DHEAS diminuem progressivamente da idade de 30 a 40 anos (Labrie e cols., 2003, End Rev, 24(2): 152-182; Orentreich e cols., 1984, J Clin Endocrinol Metab, 59: 551-555; Labrie e cols., 1997, J Clin Endocrinol Metab, 82: 2396-2402). Uma série de estudos indica que baixos niveis de DHEA e DHEA-S estão associados com uma série de doenças e morbidade relacionadas à idade (Labrie e cols., 1997, J. Clin. Endocrinol. Metab., 82: 3498-3505; Helzlsouer e cols., 1992, Cancer Res, 52(1) : 1-4; Szathmari e cols., 1994, Osteoporos Int, 4(2): 84-88; Thoman and Weigle, 1989, Adv Immununol, 46: 221-261; Barrett-Connor e cols., 1999, J Reprod Med, 44(12): 1012-1020; Barrett-Connor e cols., 1999, J Am Geriatr Soc, 47 (6) : 685-691) .

Uma abordagem eficiente para aliviar a secura vaginal e outros sintomas da menopausa é o uso de terapia de reposição hormonal (HRT) (Greendale and Judd, 1993, J Am Geriatr Soc, 41(4) : 426-436; Studd e cols., 1980, Pasetto, Paleotti and Arnbrus Eds, MT Press, Lancaster, p: 127-139) . Estudos clínicos recentes, no entanto, indicaram que a combinação de estrogênios e progesteronas aumenta a incidência de câncer de mama com um impacto negativo potencial sobre eventos cardiovasculares (Colditz e cols., 1995, N Engl J Med, 332: 15891593; Ross e cols., 2000, J Natl Cancer Inst, 92(4): 328-332; Rossouw e cols., 2002, JAMA, 288(3) : 321-333) . Por enquanto, há um interesse crescente no potencial da terapia de reposição combinada de estrogênio-androgênio (Rosenberg e cols., 1997, J Reprod Med, 42(7): 394-404; Burd e cols., 2001, Curr Women Health Rep,1(3):202-205), embora o uso do componente estrogênico seja limitado pelas potenciais complicações acima mencionadas. Baseado em recentes avanços na nossa compreensão da fisiologia de esteróide sexual humano, especialmente em mulheres na pós-menopausa (Labrie e cols., 1991, Mol Cell Endocrinol, 78: C113-C118; Labrie e cols., 2003, End Rev, 24(2): 152-182), o uso de DHEA torna-se uma possibilidade para suprir mulheres na pós-menopausa com os niveis adequados de andrógenos e estrógenos sintetizados em tecidos específicos por mecanismos intracrine, sem efeitos sistêmicos (Labrie e cols., 1997, J. Clin. Endocrinol. Metab., 82: 3498-3505: 16-28; Labrie e cols., 2003, End Rev, 24(2): 152-182; Labrie, 2001, Ref Gyn Obstet, 8: 317- 322; Lasco e cols., 2002, 145: 457-461) . A restauração dos elementos sensíveis a andrógenos da função vaginal também deve ajudar a ação de inibidores de tipo 5 de GMPc fosfodiesterase ou prostaglandina El.

O modulador de receptor de estrogênio seletivo (SERM) Acolbifeno (EM-652) é um derivado de benzopirano originalmente desenvolvido para prevenção e tratamento de câncer de mama (Gauthier e cols., 1997, J Med Chem, 40: 2117-2122) . Acolbifeno é o composto que tem a mais alta afinidade de todos os compostos conhecidos para o ER (Gauthier e cols., 1997, J Med Chem, 40: 2117-2122; Labrie e cols., 1999, J Steroid Biochem Mol Biol, 69 (1-6): 51-84; Tremblay e cols., 1997, Mol. Endocrinol., 11: 353-365) e ele exerce sua atividade sobre ERα e ERβ (Tremblay e cols., 1998, Endocrinology, 139: 111-118). Esse composto apresenta uma atividade antiestrogênica pura e altamente potente na glândula mamária e endométrio diminuindo o colesterol sérico e triglicerideos e evitando a perda óssea, pelo menos no rato (Labrie e cols., 1999, J Steroid Biochem Mol Biol, 69 (1-6) : 51-84) . Além disso, foi demonstrado que a administração de DHEA não apenas não interfere, mas exerce um efeito inibidor aditivo com o antiestrogênio puro Acolbifeno sobre o crescimento de tumor de mama humano no camundongo nude mouse (Dauvois e cols., 1991, Cancer Res, 51: 3131-3135; Luo e cols., 1997, Endocrinology, 138: 4435- 4444) . O tratamento combinado de DHEA e Acolbifeno foi proposto como uma abordagem benéfica quimiopreventiva e terapêutica em câncer de mama (Labrie, 2001, Ref Gynecol Obstet, 8: 317-322). De fato, o efeito inibidor de DHEA sobre o crescimento de xenoenxertos de câncer de mama humano em nude mice sustenta seu uso como terapia de reposição hormonal (Dauvois e cols., 1991, Cancer Res, 51: 3131-3135; Couillard e cols., 1998, J Natl Cancer Inst, 90: 772-778) .

WO 99/63974 revela usos médicos de um modulador de receptor de estrogênio seletivo em combinação com precursores de esteróide sexual.

Sumário da invenção

Portanto, é um objeto da presente invenção o fornecimento de métodos eficazes de tratamento para problemas vaginais, mais particularmente secura vaginal, dispareunia, e disfunção sexual que podem levar a uma diminuição no desejo e atividade sexual enquanto minimiza efeitos colaterais indesejáveis.

É um outro objetivo o fornecimento de métodos de redução do risco de se adquirir os problemas acima.

Em uma modalidade, a invenção pertence a um método de tratamento ou redução do risco de adquirir secura vaginal que compreende o aumento nos niveis de um precursor de esteróide sexual selecionado do grupo que consiste em dehidroepiandrosterona (DHEA), sulfato de dehidroepiandrosterona (DHEA-S) e androst-5-eno-3β,17β- diol(5-diol) em uma pessoa ou paciente em necessidade do referido tratamento ou referido precursor de esteróide, e também que compreende a administração ao referido paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um modulador de receptor de estrogênio seletivo (SERM) como parte de uma terapia de combinação.

Em uma outra modalidade, a invenção inclui administração adicional de estrogênios para contrabalançar os efeitos de SERMs sobre fogachos e outros sintomas da menopausa.

Em uma outra modalidade, a invenção inclui administração adicional de um inibidor de tipo 5 de GMPc fosfodiesterase ou prostaglandina El para melhorar a atividade sexual.

Como aqui usado, um modulador de receptor de estrogênio seletivo (SERM) é um composto que funciona diretamente ou através de seu metabólito ativo como um antagonista de receptor de estrogênio ("antiestrogênio") em tecido mamário, embora forneça efeito estrogênico ou semelhante a estrogênio sobre tecido ósseo e sobre os niveis séricos de colesterol (ou seja, por redução do colesterol sérico). Compostos não esteróides que funcionam como antagonistas de receptor de estrogênio in vitroou em tecido humano ou de mama de rato (especialmente se o composto age como um antiestrogênio sobre células humanas de câncer de mama) provavelmente funcionam como um SERM. De modo inverso, antiestrogênios esteróides tendem a não funcionar como SERMs porque eles tendem a não apresentar qualquer efeito benéfico sobre o colesterol sérico. Antiestrogênios não esteróides que nós testamos e agem como SERMs incluem EM-800, EM-01538, Raloxifeno, Tamoxifeno, Droloxifeno, Toremifeno, Idoxifeno, TSE-424, ERA-923, Lasoxifeno (CP 336156), Arzoxifeno (LY 353 381) e GW-5638. Nós testamos o antiestrogênio esteróide ICI 182,780 e ele não age como SERM. SERMs, de acordo com a invenção, podem ser administrados na mesma dosagem como conhecido na técnica quando esses compostos são usados como antiestrogênios.

Sem desejar estar atado por teoria, acredita-se que SERMs, vários dos quais, preferivelmente, têm dois anéis aromáticos ligados por um ou dois átomos de carbono, interagem com o receptor de estrogênio em virtude da porção anterior da molécula que é melhor reconhecida pelo receptor. SERMs preferidos têm cadeias laterais que podem causar seletivamente propriedades antagonistas em tecido mamário sem ter propriedades antagonistas significativas em outros tecidos. Portanto, os SERMs podem agir, de modo desejável, como antiestrogênios na mama embora funcionem, de modo surpreendente e desejável, como estrogênios (ou fornecendo atividade semelhante a estrogênio) em osso e nos componentes do sangue (onde concentrações de lipídeos e/ou colesterol são afetadas de modo favorável). O efeito favorável sobre colesterol e/ou lipideos se traduz potencialmente a um efeito favorável contra aterosclerose que é conhecida por ser afetada negativamente pelos niveis inadequados de colesterol e lipideos.

Em uma outra modalidade, a invenção inclui método, composição farmacêutica e kit onde o modulador de receptor de estrogênio seletivo tem uma fórmula molecular com as seguintes características: a) dois anéis aromáticos espaçados por 1 a 2 átomos de carbono, ambos anéis aromáticos sendo não substituídos ou substituídos por um grupo hidroxil ou um grupo convertido in vivo a hidroxil; b) uma cadeia lateral que possui um anel aromático e  uma função de amina terciária ou sal desta.

É preferível que a cadeia lateral seja selecionada do grupo que consiste em:

Também é preferível que os dois anéis aromáticos sejam fenil e que a cadeia lateral possua uma porção selecionada do grupo que consiste em um metino, um metileno, -CO, -O-, e -S-, um anel aromático, e uma função de amina terciária ou sal desta.

Em uma outra modalidade, o modulador de receptor de estrogênio seletivo é selecionado do grupo que consiste em um derivado de benzotiofeno, derivado de trifeniletileno, derivado de indol, derivado de benzopirano, derivado de 5,6, 7,8-tetrahidronaftaleno e derivado de centcromano.

Em uma modalidade, é preferível que o modulador de receptor de estrogênio seletivo seja um composto derivado de benzotiofeno com a seguinte fórmula:

onde Ri θ Ra são independentemente selecionados do grupo que consiste em: hidrogênio, hidroxil, e uma porção convertida an vivo em hidroxil; onde Ra e Rj são independentemente selecionados do grupo que consiste em: Ci-Cj alquil, ou onde Ra, RJ e nitrogênio ao qual eles são ligados, juntos são qualquer estrutura selecionada do grupo que consiste em pirrolidino, dimetil-l-pirrolidino, metil-l-pirrolidinil, piperidino, hexametilenoimino e morfolino; onde A é selecionado do grupo que consiste em -CO-, - CHOH, e -CHa-; onde B é selecionado do grupo que consiste em fenileno, piridilideno, e -cicloCjHaNa-. Particularmente, o modulador de receptor de estrogênio seletivo é selecionado do grupo que consiste em Raloxifeno, Arzoxifeno (LY 353381) e LY 335563.

Em uma outra modalidade, é preferível que o modulador de receptor de estrogênio seletivo seja um composto derivado de trifeniletileno com a seguinte fórmula:

onde D é -OCH2CH2N (R3) R4 ou -CH=CH-COOH (R3 e R4 sendo independentemente selecionados do grupo que consiste em Ci- Cj alquil, ou Ra, RJ, e o átomo de nitrogênio ao qual eles são ligados, juntos sendo uma estrutura em anel selecionada do grupo que consiste em pirrolidino, dimetil-1- pirrolidino, metil-l-pirrolidinil, piperidino, hexametilenoimino e morfolino); onde E e K são independentemente hidrogênio ou hidroxil; onde J é hidrogênio ou halogênio.

Particularmente, o modulador de receptor de estrogênio seletivo é Tamoxifen, OH-tamoxifen, Droloxifeno, Toremifeno, lodoxifeno e GW 5638.

Em uma outra modalidade, é preferível que o modulador de receptor de estrogênio seletivo seja um composto derivado de indol com a seguinte fórmula:

onde D é selecionado dos grupos que consistem em - OCH2CH2N (R7) Rs, -CH=CH-CON (R7) Rs, -CG-(CH2) n-N (R7) Rs (Rv e Rs sendo independentemente selecionados do grupo que consiste em Ci-Ce alquil, ou R7, Rs e o átomo de nitrogênio ao qual eles são ligados, juntos sendo uma estrutura em anel selecionada do grupo que consiste em pirrolidino, dimetil- 1-pirrolidino, metil-l-pirrolidinil, piperidino, hexametilenoimino, morfolino, anel); onde X é selecionado do grupo que consiste em:  hidrogênio e Ci-Ce alquil, onde R1, R2 R3, R4, R5, e R6 são independentemente selecionados do grupo que consiste em: hidrogênio, hidroxil, C1-C6 alquil, e uma porção convertida in vivo em 5 hidroxil.

Particularmente, o modulador de receptor de estrogênio seletivo é TSE-424 e ERA-923.

Em uma outra modalidade, é preferível que o modulador de receptor de estrogênio seletivo seja um composto com a seguinte fórmula:

onde Ri e R são independentemente selecionados do grupo que consiste em: hidrogênio, hidroxil, e uma porção convertida in vivo em hidroxil; onde Rs e Re são independentemente hidrogênio ou Ci-Cs alquil ; onde D é -OCH2CH2N (R3) R4 (R3 e R4 sendo independentemente selecionados do grupo que consiste em Ci- Cj alquil, ou Rs, Ri e o átomo de nitrogênio ao qual eles são ligados, juntos sendo uma estrutura em anel selecionada do grupo que consiste em pirrolidino, dimetil-1- pirrolidino, metil_l-pirrolidinil, piperidino, hexametilenoimino, morfolino). Onde X é selecionado do grupo que consiste em -O- e - CH2- .

Particularmente, o composto é selecionado do grupo que consiste em: (-)-cis-(5R,6S)-6-fenil-5-[4-(2-pirrolidin-l- iletoxi)fenil]-5,6,7,8-tetrahidronaphthalen-2-ol, sal de D- (-)-tartrato (lasofoxifeno) e (3,4- trans-2,2-dimetil-3- fenil-4-[4-(2-(2-(pirrolidin-1-il)etoxi)fenil]-7- metoxicroman).

Em uma outra modalidade, é preferível que o modulador de receptor de estrogênio seletivo tenha a seguinte fórmula:

onde Ri e Ri são independentemente hidrogênio, hidroxil ou uma porção que é convertida a hidroxil in vivo; onde Z é uma porção de fechamento bivalente, particularmente, Z é selecionado do grupo que consiste em - O-, -NH-, — S —, e -CHi ; onde o Rioo é uma porção bivalente que distancia L do anel-B em 4-10 átomos; onde L é uma porção polar bivalente ou trivalente selecionada do grupo que consiste em -SO-, -CON-, -N< e - SON<; onde Gi é selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, um hidrocarboneto Ci a Cs ou uma porção bivalente que une Gi e L para formar um anel heterociclico de 5 a 7 membros e halo ou derivados insaturados dos antecedentes ; onde G. é ausente ou selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, um hidrocarboneto Ci a C5 ou uma porção bivalente que une Gi e L para formar um anel heterocíclico de 5 a 7 membros e halo ou derivados insaturados dos antecedentes; onde G3 é selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, metil e etil.

Mais particularmente, derivados de benzopirano da seguinte estrutura geral são preferidos:

onde D é -OCH2CH2N (R3) R4 (R3 e Rj sendo independentemente selecionados do grupo que consiste em Ci- C4 alquil, ou R3, Rj e o átomo de nitrogênio ao qual eles são ligados, juntos sendo uma estrutura em anel selecionada do grupo que consiste em anel pirrolidino, dimetil-1- pirrolidino, metil-l-pirrolidinil, piperidino, hexametilenoimino, morfolino. onde Ri e Ri são independentemente selecionados do grupo que consiste em: hidrogênio, hidroxil, e uma porção convertida in vivo em hidroxil.

Também é preferível que derivados de benzopirano sejam compostos oticamente ativos que têm uma configuração absoluta S no carbono 2 ou sais f armaceuticamente aceitáveis destes, os referidos compostos tendo a estrutura molecular:

onde Ri e R2 são independentemente selecionados do grupo que consiste em hidroxil e uma porção que pode ser convertida in vivo a hidroxil; onde Rs é uma espécie selecionada do grupo que consiste em pirrolidinil saturado, insaturado ou substituido, piperidino saturado, insaturado ou substituido, piperidinil saturado, insaturado ou substituido, morfolino saturado, insaturado ou substituido, porção ciclica contendo nitrogênio, porção policiclica contendo nitrogênio, e NRaRb (Ra e Rb sendo independentemente hidrogênio, Ci-Ce alquil linear ou ramificado, Ct-Ce alquenil linear ou ramificado e C2-C6 alquinil linear ou ramificado).

Em uma modalidade, o derivado de benzopirano é um sal de um ácido selecionado do grupo que consiste em ácido acético, ácido adipico, ácido benzenossulfônico, ácido benzóico, ácido canforsulfônico, ácido citrico, ácido fumárico, ácido hidroiódico, ácido hidrobrômico, ácido hidroclorotiazida, ácido hidroxi-naftóico, ácido lático, ácido maleico, ácido metanossulfônico, ácido metilsulfúrico, ácido 1,5-naftalenodissulfônico, ácido nitrico, ácido palmítico, ácido piválico, ácido fosfórico, ácido propiônico, ácido succinico, ácido sulfúrico, ácido tartárico, ácido tereftálico, ácido p-toluenossulfônico e ácido valérico.

Os moduladores de receptor de estrogênio seletivos preferidos são: Acolbifeno

Raloxifeno, Arzoxifeno, Tamoxifeno, Droloxifeno, Toremifeno, lodoxifene, GW 5638, TSE-424, ERA-923, e lasofoxifeno.

Breve descrição dos desenhos

Figura 1 mostra a Divisão junto ao eixo longitudinal da vagina do rato em vários segmentos transversais, do orificio externo (ostium) (segmento 1) ao nível do cérvix (segmento 7) (portio vaginalis uteri) .

Figura 2 mostra a histomorfologia do epitélio vaginal do segmento 5 nos nove grupos de ratos. Bar in (J) , 40/um. (A) como representativo do efeito estrogênico, o epitélio escamoso estratificado de ratos em ciclo em estrous consiste em quatro camadas principais: uma camada celular de stratum basale (b), 6 a 7 camadas celulares de stratum spinosum (s) e um stratum granulosum de 5 a 6 camadas (g) sobrepostas pelo stratum corneum (c) feito de células cornifiçadas planas firmemente reunidas. (B) . ratos em ciclo em proestrus que estão sob uma influência estrogênica-progesterônica são usados para ilustrar a mucificação. Na maior parte dos segmentos 2 a 7, uma camada de células basais (b) foi sobreposta por 5 a 6 camadas de células de stratum spinosum (s), e uma mucificação de stratum(m) que consiste em 3-4 camadas de células mucosas. (C) no controle OVX, uma camada de células basais (b) foi sobreposta por uma camada de células cúbicas atróficas (a). (D) O epitélio vaginal de ratos OVX tratados com uma dose diária oral de Acolbifeno (2,5 mg/kg) mostra atrofia, mas com uma camada externa de células mucosas colunares inferiores (m) sobrepondo a camada de células basais (b). (E) Epitélio vaginal de ratos OVX tratados com uma dose diária oral de Premarin (0,5 mg/kg). A atrofia induzida por OVX foi substituída por um padrão estrogênico comparável àquele encontrado em estrus. (F) em animais OVX que receberam Premarin + Acolbifeno, a atrofia predominou com uma morfologia similar àquela de animais tratados com Acolbifeno, embora células mucosas maiores fossem observadas. (G) após tratamento de animais OVX com uma aplicação cutânea diária de DHEA (80 mg/kg) em uma área de 2x2 cm da pele dorsal, um epitélio hipertrófico feito de 3-5 camadas de células mucosas (m) foi observado sobrepondo a camada basal (b). Várias invaginações caracterizaram esse epitélio (setas). (H) na maioria das áreas do epitélio vaginal de animais tratados com DHEA + Acolbifeno, a camada de células mucosas (m) está sobre uma camada de células basais (b) , enquanto em algumas áreas, várias camadas de células mucosas sobrepõem a camada de células basais. Várias invaginações, caracterizaram esse epitélio (setas). (I) Tratamento com DHEA + Premarin levou a um epitélio misto composto de um epitélio escamoso estratificado espesso de três a sete camadas de células sobreposto por 3- 5 camadas de células mucosas (m) em 3 animais. Em 2 animais, áreas de epitélio escamoso estratificado eram predominantes (inserção) . Barra em inserção, 30 pm. (J) quando DHEA, Premarin e Acolbifeno foram combinados, o epitélio foi similar àquele do grupo DHEA + Acolbifeno.

Figura 3 mostra a mucosa vaginal de animais OVX que mostra, em (A) , severas mudanças inflamatórias caracterizada por infiltração focal leucocitária com microabscesso intraepitelial (M) e, em (B), erosão focal (E) caracterizada por espessura epitelial reduzida e ulceração (U) visualizada como um desaparecimento completo do epitélio.

Figura 4 para ilustrar o efeito semelhante a estrogênio de Acolbifeno sobre o segmento 1 do forro do epitélio vaginal (abertura externa), são feitas comparações com grupos relevantes. Em ratos intactos em estrus (A) e em animais tratados com Premarin (D) , o epitélio tem 10-15 camadas de espessura e é queratinizado. Em controles OVX (B) , a espessura do epitélio é reduzida a 4-6 camadas e geralmente não é queratinizada (veja a ausência de stratum granulosum), enquanto em animais tratados com Acolbifeno (C) a espessura é restabelecida a 9-11 camadas e queratinizada.

Figura 5 mostra a espessura (pm) dos três diferentes compartimentos vaginais no nivel do quinto segmento da vagina de rato: a) epitélio, b) lâmina própria, c) muscular e d) espessura total, depois de 36 semanas de tratamento de animais OVX com DHEA, Premarin e Acolbifeno, isoladamente ou em combinação. Animais intactos em estrus e proestrus são adicionados como controles de referência. Grupos que partilham a mesma letra não são estatisticamente diferentes em p < 0,05.

Figura 6 mostra a firmeza das fibras de colágeno da lâmina própria ilustrada no segmento 5 como baixa (A) , moderada (B) ou alta, (0).

Figura 7 mostra microfotografias dos três compartimentos vaginais: (E) epitélio, (L) lâmina própria e (M) muscular, no nivel do quinto segmento da vagina do rato com ênfase na espessura relativa muscular nos diferentes grupos. A separação das 3 camadas da parede vaginal com barras é indicada para melhor estimar a distribuição de espessura entre os diferentes grupos. A) Intacto, B) OVX, e OVX tratados com C) Acolbifeno, D) Premarin, E) Premarin + Acolbifeno, F) DHEA; G) DHEA + Acolbifeno, H) DHEA + Premarin, I) DHEA + Premarin + Acolbifeno.

Figura 8 mostra o peso vaginal medido 36 semanas depois de OVX e tratamento de animais OVX com Acolbifeno, Premarin e DHEA isoladamente ou em combinação. Animais intactos são adicionados como controles.

Figura 9 mostra a localização imunohistoquimica de AR, ERa e PR no (E) epitélio, (L) lâmina própria e (M) muscular no nivel do quinto segmento vaginal dos diferentes grupos. As barras indicam a separação entre os três compartimentos vaginais.

Figuras 10 e 11 mostram a comparação entre diferentes SERMs: morfologia epitelial vaginal, em ratos.

Figura 12 mostra o retrato de uma lâmina de microscópio para apresentar o posicionamento dos 8 segmentos vaginais (toda a fileira superior e a seção no canto inferior direito), seguida pelos 4 segmentos uterinos (1 segmento do corpo uterino e 3 segmentos dos dois cornos uterinos - 2 seções por corno) em uma següência que corresponde à sua posição anatômica original. Segmento 8 inclui as dobras laterais vaginais que são vizinhas do inicio do cérvix uterino.

Figura 13 mostra o efeito em rato intacto em estrus (coluna esquerda), o epitélio vaginal tem 12 -18 camadas de espessura no segmento 4 e 12-15 camadas de espessura no segmento 6. Em metestrus (coluna direita) , o epitélio vaginal apresenta 6 a 10 camadas de células no segmento 4, e 5 a 7 camadas no segmento 6.

Figura 14 mostra o efeito em ratos ooforectomizados intocados. No segmento 4, a vagina é alinhada por um epitélio escamoso estratificado de 2 a 6 camadas de células. No segmento 6, é observada atrofia completa, com 2 a 3 camadas de células planas. Alguns focos raros de pequenas células mucosas cilíndricas podem ser observados por toda a vagina.

Figura 15 mostra o efeito de placebo/supositório. Em comparação com o grupo intocado OVX, o epitélio escamoso estratificado vaginal do grupo placebo foi levemente mais espesso, com segmento 4 apresentando 4 a 8 camadas de células. No segmento 6, a mesma morfologia que aquela do grupo OVX intocado foi observada, com 2-3 camadas de células epiteliais. Focos de pequenas células mucosas cilíndricas podem ser encontrados por toda a vagina, um pouco mais quando comparados com os animais OVX intocados.

Figura 16 mostra o efeito de DHEA 0,33 mg/ supositório. No segmento 4, o epitélio vaginal é escamoso estratificado com 3 a 7 camadas de células. Cerca de 20 a 60% do forro vaginal consiste em células mucosas bem alinhadas em alternância com 15 a 50% de células mucosas hipertrofiadas, sobrepondo uma ou mais camadas de epitélio escamoso estratificado, e com áreas não mucifiçadas. No segmento 6, a espessura do epitélio é reduzida a quase a espessura encontrada em animais OVX intocados: 2-5 camadas de células sobrepostas por células mucosas cilíndricas. Uma grande variação na ocorrência de células mucosas foi observada, essas células cobrem de 5 a 75% da superficie vaginal, em alternância com áreas não mucificadas.

Figura 17 mostra o efeito de DHEA 0,66 mg/supositório. No segmento 4, o epitélio escamoso estratificado tem 3 a 6 camadas de espessura. Cerca de 5 a 20% do forro vaginal consiste em células mucosas bem alinhadas em alternância com 10 a 75% de células mucosas hipertrofiadas, sobrepondo uma ou mais camadas de epitélio escamoso estratificado. Áreas epiteliais não mucificadas são também presentes. No segmento 6, a espessura do epitélio é reduzida e consiste em um epitélio escamoso estratificado de 2 a 4 camadas de células, sobrepostas por uma camada de células mucosas bem alinhadas. Áreas mucificadas variaram de 20 a 80% da superficie vaginal, em alternância com áreas não mucificadas.

Figura 18 mostra o efeito de DHEA 1 mg/supositório no segmento 4, o epitélio escamoso estratificado apresenta 3 a 9 camadas de células. Células mucosas hipertrofiadas sobrepondo 3 a 4 camadas de células escamosas cobrem 50 a 70% da superficie vaginal, embora células mucosas bem alinhadas forrem 5 a 30% da superficie vaginal. Áreas não mucifiçadas são entrepostas entre células mucifiçadas. No segmento 6, a espessura do epitélio é também reduzida e consiste em 2 a 4 camadas de células. Células mucosas hipertrofiadas que sobrepõem 1 a 3 camadas de células escamosas cobrem cerca de 30 a 100% da superficie vaginal enquanto células mucosas bem alinhadas cobrem 0 a 70%. Poucas áreas não mucificadas entrepostas são também observadas.

Figura 19 é um gráfico do efeito sobre o peso corporal de 14 dias de tratamento com DHEA (supositório) aplicado por via intravaginal em ratos OVX. Comparado com o grupo placebo, o peso corporal dos grupos que receberam DHEA em doses de 0,33 mg e 0,66 mg diminui levemente, embora a diminuição não fosse mais pronunciada no grupo de 1 mg.

Figura 20 é um gráfico da concentração sérica de DHEA após aplicação intravaginal de 0,33 mg, 0,66 mg ou 1 mg a ratos OVX. Os valores da área sob a curva (AUC) sete horas após o tratamento com DHEA foram 32 ± 4 ng.h/ml, 50 ± 7 ng.h/ml e 131 ± 23 ng.h/rril quando DHEA foi administrado nas doses de 0,33 mg, 0,66 mg ou 1 mg, respectivamente.

Descrição detalhada da invenção

Após a cessação da secreção de estrogênio pelos ovários na menopausa, praticamente todos os androgênios e estrogênios são sintetizados em tecidos periféricos por mecanismos intracrine de dehidroepiandrosterona (DHEA) de origem adrenal. De fato, na ausência de estrogênios ovarianos, a gradual diminuição de DHEA sérica tem provavelmente um importante papel na secura vaginal, inflamação, dispareunia e disfunção sexual freqüentemente associada à menopausa. Para avaliar os efeitos específicos estrogênicos e/ou androgênicos de uma nova terapia de reposição hormonal potencial que pode, entre outros efeitos benéficos, aliviar a secura vaginal, nós examinamos a morfologia da vagina do rato oito meses após ooforectomia (OVX) e tratamento de animais OVX com DHEA, estrogênios conjugados (Premarin) e o modulador de receptor de estrogênio seletivo Acolbifeno, administrado isoladamente ou em combinação. Em animais intactos em estrus e em ratos OVX tratados com Premarin, o padrão tipico estrogênico vaginal é um epitélio escamoso estratificado queratinizado. OVX levou a uma atrofia geral associada a mudanças inflamatórias enquanto Acolbifeno reduziu a incidência de inflamação e aumentou o número e tamanho das células mucosas no epitélio vaginal. Nas doses usadas, Premarin reverteu completamente a atrofia epitelial induzida por OVX, enquanto DHEA reverteu parcialmente a atrofia. De fato, o epitélio vaginal de animais OVX tratados com DHEA tornou-se hiperplásico com 3-5 camadas de columnar mucous e goblet células tipicas de um efeito androgênico. A adição de Premarin a DHEA levou a um epitélio mais espesso que em animais intactos. Além disso, a firmeza das fibras de colágeno na lâmina própria foi aumentada por DHEA. Por outro lado, tratamento com Acolbifeno isoladamente mostrou uma tendência para um aumento na espessura da lâmina própria, que atingiu valores intactos quando combinado com DHEA.

Depois de OVX, a camada muscular vaginal foi diminuída em 46%, um efeito que foi 41% e 100% revertido por DHEA e Premarin, respectivamente. Por outro lado, a diminuição de 50% ba espessura total da parede vaginal após OVX foi de 42% e 93% revertida por DHEA e Premarin, respectivamente, enquanto a combinação de DHEA e Acolbifeno reverter a espessura total da parede vaginal a um valor não significativamente diferente dos animais de controle intactos.

A imunohistoquimica revelou um forte receptor androgênico (AR) marcado em todos os grupos tratados com DHEA. Por outro lado, a marcação de receptor estrogênico alfa (ERa) e receptor de progesterona (PR) não foi detectada em qualquer um dos grupos tratados com Acolbifeno.

Como uma conclusão, o tratamento com DHEA ou a combinação de DHEA e Acolbifeno evita parcialmente ou completamente as mudanças atróficas induzidas por OVX observadas em várias camadas da parede vaginal através de um efeito androgênico predominante, como revelado por mucificação epitelial e supra-regulação de AR. Os presentes dados também mostram efeitos particularmente interessantes de DHEA sobre as três camadas da parede vaginal, ou seja, um epitélio altamente mucificado, uma firmeza aumentada das fibras de colágeno na lâmina própria bem como um aumento da espessura da camada muscular. DHEA exerce assim efeitos tanto androgênicos quanto estrogênicos sobre a mucosa vaginal, assim fornecendo uma terapia de reposição mais fisiológica. Embora cada um dos compostos examinados tenha potenciais efeitos benéficos sobre a função vaginal, DHEA isoladamente ou em combinação pode aliviar, de forma ótima, a secura vaginal e restaurar a fisiologia vaginal global e ajudar, corrigindo a disfunção sexual associada à menopausa. DHEA e outros componentes podem ser administrados por via local ou sistêmica.

Um modulador de receptor de estrogênio seletivo da invenção tem uma fórmula molecular com as seguintes características: a) dois anéis aromáticos espaçados em 1 a 2 átomos de carbono, ambos anéis aromáticos sendo não substituídos ou substituídos por um grupo hidroxil ou um grupo convertido in vivo a hidroxil; e b) uma cadeia lateral que possui um anel aromático e uma função de amina terciária ou sal dessa.

Um SERM preferido da invenção é EM-800 relatado em PCT/CA96/ 00097 (WO 96/26201). A estrutura molecular de EM- 800 é:

Um outro SERM preferido da invenção é acolbifeno (EM- 1538, também chamado EM-652.HC1) relatado em US 6.710.059 B1

É o sal cloridrato do potente antiestrogênio EM-652. Comparado a EM-800, EM-1538 é um sal mais seguro, simples e fácil de sintetizar. Acredita-se que a administração de EM- 800 ou EM-1538 resulte no mesmo composto ativo in vivo.

Um outro SERM preferido é Lasoxifeno (CP-336.156; (+cis(5R,6S)-6-fenil-5-[4-(2-pirrolidin-l-iletoxi)fenil]- 5,6,7,8-tetrahidronaftalen-2-ol, sal D-(-)-tartrato) (disponível por Pfizer Inc., USA).

Outros SERMs preferidos da invenção incluem Tamoxifeno ( (Z)-2-[4-(l,2-difenil-1-butenil) ]-N,N-dimetiletanamina (disponível por Zeneca, UK) , Toremifeno (disponível por Orion-Farmos Pharmaceutica, Finland, ou Schering-Plough), Droloxifeno, e Raloxifeno (Eli Lilly e Co., USA), Arzoxifeno (LY 335563) e LY 353381 (Eli Lilly e Co., USA), Ospemifeno (FC 1271) (disponível por Orion-Farmos Pharmaceutica,, Finland) , lodoxifeno (SmithKline Beecham, USA), Levormeloxifeno (3,4-trans-2,2-dimetil-3-fenil-4-[4- (2-(2-(pirrolidin-l-il)etoxi)fenil]-7-metoxicroman) (Novo Nordisk, A/S, Denmark) que é revelado em Shalmi e cols. WO 97/25034, WO 97/ 25035, WO 97/ 25037,WO 97/ 25038_Land Korsgaard e cols. WO 97/25036), GW5638 (descrito por Willson e cols., 1997, Endocrinol, 138(9): 3901-3911), SERM 3339 em desenvolvimento por Aventis (France) e derivados de indol (revelados por Miller e cols. EP 0802183A1) e TSE-424 e ERA-923 desenvolvido por Wyeth Ayers (USA) e revelado em JP10036347 ("American home products corporation') e derivados de estrogênio não esteróides descritos em WO 97/32837.

Qualquer SERM usado como necessário para eficácia, como recomendado pelo fabricante, pode ser usado. Dosagens adequadas são conhecidas na técnica. Qualquer outro antiestrogênio não esteróide comercialmente disponível pode ser usado de acordo com a invenção. Qualquer composto que tenha atividade similar a SERMs (exemplo: Raloxifeno pode ser usado).

SERMs administrados de acordo com a invenção são preferivelmente administrados em uma faixa de dosagem entre 0,01 a 10 mg/kg de peso corporal por dia (preferivelmente 0,05 a 1,0 mg/kg), com 10 mg por dia, especialmente 20 mg por dia, em duas doses igualmente divididas sendo preferidas para uma pessoa de peso corporal médio quando administrado por via oral, ou em uma faixa de dosagem entre 0,003 a 3,0 mg/kg de peso corporal por dia (preferivelmente 0,015 a 0,3 mg/ml), com 1,5 mg por dia, especialmente 3,0 mg por dia, em duas doses igualmente divididas sendo preferidas para uma pessoa de peso corporal médio quando administrado por via parenteral (ou seja, intramuscular, subcutânea ou percutânea). Preferivelmente os SERMs são administrados junto com um diluente ou veiculo farmaceuticamente aceitável como abaixo descrito.

Inibidores preferidos de GMPc-fosfodiesterase tipo 5 são Sildenafil comercializado sob o nome comercial "Viagra"por Pfizer USA, Tadalafil comercializado sob o nome comercial "Cialis"por Eli Lilly USA, vardenafil comercializado sob o nome comercial "Levitra"por Bayer (Germany). Também são inibidores preferidos de cGMP- fosfodiesterase tipo 5 atualmente em desenvolvimento: DA- 8159 por Dong-A Pharm Tech (Coréia do Sul), EMR-62203 por Merck (Alemenha), TA-1790 por Tanabe Seiyaku (Japão), SCH- 446132 por Schering-Plough (U.S.A.), e UK-371800 por Pfizer (U.S.A.).

Uma prostaglandina preferida é alprostadil comercializado sob o nome comercial "Alprox-TD por NexMed (USA) .

Com relação a todas as dosagens aqui recomendadas, o profissional médico deve monitorar a resposta individual do paciente e ajustar a dosagem de acordo.

Exemplo de eficácia da invenção Exemplo 1 Materiais e métodos Animais e tratamentos

Ratos Sprague-Dawley fêmeas de dez a doze semanas de idade (Cri:CD®(SD)Br VAF/PIus™) (Charles River Laboratory, St-Constant, Canadá) pesando aproximadamente 220-270g no inicio do experimento foram usados. Os animais foram aclimatizados às condições ambientais (temperatura: 22 ± 3°C; umidade: 50 ± 20%; ciclos de 12-h de luz-12-h de escuridão, luzes as 07:15h) por pelo menos uma semana antes do inicio do experimento. Os animais foram abrigados individualmente e tiveram livre acesso a água e ração para roedores (Lab Diet 5002, Ralston Purina, St-Louis, MO). O experimento foi conduzido de acordo com o Guia CCAC para Cuidados e Uso de Animais Experimentais em uma instalação de animais aprovada pelo "Canadian Council on Animal Care"(CCAC) e a "Association for Assessment e Accreditation of Laboratory Animal Care" (AAALAC).

Um total de 126 ratos fêmeas foi distribuído aleatoriamente em 9 grupos de 14 animais cada um como se segue: 1) controle intacto; 2) controle ooforectomizado (OVX); 3) OVX + Acolbifeno (2,5 mg/kg); 4) OVX + Premarin (0,5 mg/kg); 5) OVX + Premarin + Acolbifeno; 6) OVX + DHEA (80 mg/kg); 7) OVX + DHEA + Acolbifeno; 8) OVX + DHEA + Premarin; 9) OVX + DHEA + Acolbifeno + Premarin. No primeiro dia do estudo, os animais de todos os grupos (exceto grupo um) foram ooforectomizados bilateralmente (OVX) sob anestesia induzida por isoflurano. Premarin e Acolbifeno foram administrados por ingestão oral (0,5 ml/rato) como suspensões em 0,4% metilcelulose enquanto DHEA em 50% etanol-50% propileno glicol (0,5 ml/rat), foi topicamente aplicado em uma área raspada de 2 x 2 cm da pele dorsal. A seleção da dosagem para Premarin corresponde à dose minima suficiente para reverter a atrofia uterina induzida por OVX, enquanto Acolbifeno foi administrado em uma dose suficiente para causar atrofia uterina similar a OVX após sua administração a animais OVX tratados com Premarin. A dose de DHEA usada gerou niveis sangüineos de DHEA a 70-100 nmol/L. Os tratamentos foram iniciados no dia 2 do estudo e os compostos foram administrados uma vez ao dia por 36 semanas. Animais dos grupos intacto e de controle OVX receberam o veiculo isoladamente.

Vinte e quatro horas depois da última dose, os animais em jejum de um dia para o outro foram sacrificados sob anestesia com isoflurano por exsanguinação na aorta abdominal (9 animais por grupo) ou por perfusão intracardiaca com 10% de formalina neutra tamponada (5 animais por grupo). As vaginas de animais não perfundidos foram coletadas e pesadas, enquanto as vaginas coletadas de animais perfundidos foram marcadas com tinta preta no lado ventral e então cortadas como abaixo descrito.

Procedimentos histológicos

A vagina inteira de cada animal perfundido foi pós- fixada em 10% de formalina neutra tamponada. Cada vagina foi então dividida em sete segmentos transversos iguais como ilustrado na Figura 1, rotineiramente processadas e incrustadas todas no mesmo bloco de parafina. No bloco de parafina, os sete segmentos vaginais cilíndricos foram posicionados em uma seqüência que corresponde a sua posição anatômica original e orientados perpendicular à superfície do bloco, assim permitindo que os segmentos sejam cortados transversalmente. Para cada animal, uma seção de parafina de 4 pm de espessura foi cortada e corada com hematoxilina- eosina para exame morfológico.

Histomorfometria

Medições das diferentes camadas vaginais foram realizadas no quinto segmento (Fig.l), que é aproximadamente a metade entre a região média e a porção portio vaginalis uteri(segmento 7) . Este quinto segmento apresenta uma superfície epitelial representativa e uma espessura suficiente de músculo liso. Imagens foram capturadas com uma câmara colorida DC-330 3CCD (Dage-MTI, Michigan City, IN, USA) e quantificado usando programa Image-Pro Plus 3.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA) . Portanto, o uso de uma objetiva de 5 vezes (Leica Microsystems, Willowdale, Ont., Canada), 3 a 4 medidas de espessura por camada foram obtidas a partir de áreas representativas do epitélio e muscular, e para as três camadas vaginais juntas. A espessura total vaginal, a espessura do epitélio e a espessura da muscular foram assim medidas. A espessura da lâmina própria foi obtida por subtração da espessura do epitélio e muscular da espessura vaginal total.

Imunohi s toquimi ca

Imuno-coloração foi realizada usando kits Zymed SP (San Francisco, CA) . Seções de parafina (4 pm) foram desparafinizadas em tolueno e reidratadas através de etanol. A atividade endógena de peroxidase foi eliminada por pré-incubação com 3% H2O2 em metanol por 30 minutos. Uma técnica de recuperação de microondas que usa tampão de citrato (Tacha e Chen, 1994) foi aplicada. Após resfriamento das lâminas, ligação não especifica foi bloqueada com o uso de 10% de soro de cabra por 20 minutos. Seções foram então incubadas por 1,5 hora em temperatura ambiente com anticorpos ERoc (AB-1, Calbiochem, California) , AR (N-20, Santa Cruz Biotechnology, California) ou PR (Ab- 4, NeoMarkers, California), a 1:200, 1:250 e 1:250 respectivamente. Depois de lavagem com tampão PBS, as seções foram incubadas com anticorpo secundário anticoelho biotinilatado por 10 minutos e logo depois com estreptavidina-peroxidase por mais 10 minutos. Diaminobenzidina foi usada como o cromógeno para visualizar o complexo biotina/estreptavidina-peroxidase, sob monitoramento microscópico. Contra-coloração foi realizada usando hematoxilina #2 de Gill por 30 segundos. Para controles, imunoabsorção com um excesso do peptideo usado para despertar o anticorpo, ou substituição com IgG não imune de coelho, foi realizada. Avaliação semiquantitativa do número e intensidade dos núcleos imunocorados foi realizada como indicado na Tabela 2. Tabela 1. avaliação histológica do epitélio, lâmina própria e muscular nos sete segmentos vaginais de rato.

E = morfologia do epitélio: KS (escamoso estratificado queratinizado), LHM (grandes células mucosas hipertrofiadas),

SCM (pequenas células mucosas alinhadas colunares ou cubóides), MSM (escamoso estratificado misto sobreposto por células mucosas),

A (atrofia: pequenas células cubóides).

Duas diferentes abreviações para um dado segmento indicam dois padrões diferentes e que o primeiro é o predominante.

'L = espessura da lâmina própria: T (espessa), MT (moderadamente espessa), t (fina);

2firmeza das fibras de colágeno: H (alta),M (moderada), L (baixa);

M = espessura da muscular: T (espesso), MT (moderadamente espessa), t (fina), s (escassa).

Tabela 2. Avaliação semiquantitativa do número e intensidade de núcleos imunocorados para AR, ER alfa e PR no epitélio, lâmina própria e muscular no quinto segmento da vagina de rato.

-- receptor de Androgênio (AR), receptor estrogênico alfa (ERoc) receptor de progesterone (PR) , epitélio (E) , lâmina própria (L), muscular (M). — os números representam a avaliação semiquantitativa de núcleo marcado: 0= nenhum, 1= baixa, 2= moderada, 3= alta --intensidade da rotulagem é indicada como baixa: +, moderada: ++ e alta: +++

Análise estatística

Os dados são apresentados como médias ± SEM de 8-9 animais por grupo para peso vaginal ou 5 animais por grupo para determinações da espessura da camada vaginal. Significância estatística foi determinada de acordo com o teste de faixa múltipla de Duncan-Kramer (Kramer, 1956, Biometrics, 12: 307-310).

Resultados Morfologia e espessura das diferentes camadas da vagina de rato

Para examinar com precisão e detalhe as três camadas da parede vaginal do rato, ou seja, o epitélio, lâmina própria e muscular, sete segmentos obtidos ao longo do eixo longitudinal (Fig. 1) foram primeiramente examinados. Embora importantes diferenças morfológicas fossem observadas entre os grupos, em geral, as diferenças foram uniformes em todos os animais do mesmo grupo e segmentos 2, 3, 4, 5, 6 e 7 mostram uma morfologia epitelial similar. Umas poucas exceções observadas serão mencionadas posteriormente. Segmento 5 foi assim usado para ilustrar o efeito dos vários tratamentos sobre o epitélio vaginal.

No grupo OVX, a ausência de estimulação ovariana levou a uma atrofia do epitélio vaginal que caracterizou todos os segmentos (Tabela 1 e Fig 20) com a presença de algumas pequenas áreas de células mucosas. Mais importante, inflamação moderada a severa com vários focos de microabcessos intraepiteliais (pequenas áreas de leucócitos aglomerados no epitélio) foram um achado freqüente. Essas mudanças foram freqüentemente acompanhadas por uma erosão focal (zonas nas quais a camada epitelial desaparece parcialmente) e ulceração (completo desaparecimento da camada epitelial) (Fig 3) .

Em animais OVX tratados com Acolbifeno, segmento 1 mostrou um epitélio escamoso estratificado queratinizados similar àquele do grupo intacto, exceto por incluir 9-11 camadas de células comparadas às 10-15 camadas encontradas nos animais em estrus ou quando animais OVX receberam Premarin (Fig 4). A espessura do epitélio de animais tratados com Acolbifeno no segmento 1 era, portanto, maior que aquela de ratos OVX, que compreendia apenas only 4-6 camadas de células. Nos outros segmentos (Tabela 1), a camada basal foi coberta por uma camada de células mucosas colunares inferiores (Fig 2D), que eram mais desenvolvidas que em animais OVX. No grupo OVX + Acolbifeno, apenas três de cinco animais mostraram sinais de inflamação minima embora mudanças inflamatórias moderadas a severas fossem geralmente achadas em todos os animais OVX.

Em todos os grupos, segmento 1 mostrou um epitélio escamoso estratificado comparável, exceto nos animais do grupo OVX onde a atrofia foi uma característica predominante (Fig 4) . Além disso, nos grupos OVX + DHEA e OVX + DHEA + Acolbifeno, as células mucosas freqüentemente acompanhavam o epitélio escamoso estratificado dominante do segmento 1 (não mostrado).

Os sete segmentos do epitélio vaginal dos animais OVX que receberam DHEA eram compostos de multicamadas de grandes células mucosas colunares com vacúolos citoplasmáticos distendidos, uma característica tipica de um efeito androgênico (Tabela 1, Fig 2G) . Várias grandes invaginações caracterizaram o epitélio após o tratamento com DHEA. Uma morfologia epitelial similar foi encontrada em todos os segmentos do grupo OVX + DHEA + Acolbifeno, exceto pelo fato do tamanho das células mucosas e o número de suas camadas ser diminuído (Tabela 1, Figura 2H) . Nos animais tratados com DHEA + PREMARIN, um epitélio estratificado espesso de um tipo "misto" composto de diferentes proporções de epitélio escamoso coberto por camadas de células mucosas (Tabela 1, Figura 21) foi observado a partir do quinto segmento, assim revelando efeitos combinados estrogênico e androgênico. Nesse grupo, três animais apresentaram mucificação sobre os segmentos acima mencionados, enquanto nos outros dois animais, um epitélio escamoso estratificado foi observado em todos os segmentos (Tabela 1) . Quando PREMARIN foi combinado com DHEA e Acolbifeno, o epitélio foi similar aquele do grupo DHEA + Acolbifeno, assim indicando um bloqueio da proliferação de células escamosas induzida por estrogênio por Acolbifeno (Tabela 1 e Fig. 2J) .

A administração de DHEA a animais OVX aumentou a espessura do epitélio vaginal para 38 ± 4 pm, enquanto a adição de Acolbifeno a DHEA não modificou a espessura do epitélio que permaneceu a 37 ± 5 pm. Quando Premarin e DHEA foram coadministrados a animais OVX, uma alta espessura de 84 ± 6 pm foi observada, um valor não significativamente diferente daquele do grupo de animais que recebeu Premarin isoladamente. Finalmente, a combinação de Premarin, DHEA e Acolbifeno resultou em um epitélio de 32 ± 3 pm de espessura, um valor similar aquele dos grupos que receberam DHEA isoladamente ou DHEA combinado com Acolbifeno.

Lâmina própria

O grau de firmeza das fibras de colágeno na vagina foi categorizado como baixo, moderado e alto (Fig. 6), como observado na área próxima ao epitélio. "Firmeza baixa" e "moderada" estavam associadas com a presença de fibras grosseiras de colágeno frouxamente ou menos frouxamente agregadas juntas, respectivamente, enquanto "alta firmeza" foi o termo usado para descrever finas fibras de colágeno altamente compactadas, apresentando uma textura lisa. Em todos os animais, havia relativamente poucos fibrócitos em proporção à quantidade de colágeno, e eles pareciam predominantemente achatados e encolhidos.

Um exame cuidadoso de cada animal (Tabela 1) revela que, em geral, a firmeza das fibras de colágeno no segmento 1 é moderado (baixo em ratos em estrus e em animais OVX tratados com Premarin, ou alto em OVX e ratos OVX tratados com DHEA), enquanto o aumento na firmeza nos segmentos 2 e 3 atinge um platô que permanece geralmente constante até o segmento 7. Portanto, junto ao eixo longitudinal da vagina em ratos intactos em estrus, a firmeza das fibras de colágeno foi baixa nos segmentos 1 a 3 e moderada nos segmentos 4 a 7. Atrofia foi freqüentemente associada a firmeza aumentada das fibras de colágeno nos grupos OVX e OVX + Acolbifeno (Tabela 1) . Em animais OVX tratados com Premarin, a firmeza no segmento 1 foi baixa e moderada nos segmentos 2 e 3, enquanto nos outros segmentos, a firmeza das fibras de colágeno aumentou gradualmente para tornar-se alta nos segmentos 6 e 7.

Exame visual em microscópico ótico da espessura da lâmina própria ao longo da vagina geralmente revelou que ela era moderadamente espessa no segmento 1 e mais fina nos segmentos 2 a 4. Nos segmentos 5 a 7, a espessura aumentou progressivamente a um nivel similar ao segmento 1. os valores médios correspondentes da espessura da lâmina própria medida no segmento 5 (Fig 5B) indicaram que OVX levou a uma diminuição significativa na espessura da lâmina própria (76 ± 2 pm versus 135 ± 28 pm no grupo intacto) com uma diminuição não significante induzida por Acolbifeno (60 ± 8 pim) . O aumento observado após administração de Premarin ou Premarin + Acolbifeno em animais OVX permaneceu baixo no grupo intacto (100 ± 9 pm e 90 ± 3 pim, respectivamente versus 135 ± 28 pim) . A administração de DHEA também levou a um aumento estatisticamente não significativo na espessura da lâmina própria (96 ± 20 pim) , e a adição de Acolbifeno levou a espessura aumentada (136 ± 17 pim), atingindo aquela de animais intactos. Tratamento de animais OVX com Premarin + DHEA aumentou significativamente a espessura, (144 ± 14 pim) quando comparado a DHEA isoladamente. Finalmente, os animais tratados com Premarin + DHEA + Acolbifeno apresentaram uma espessura (99 ± 9 pim) similar aquela do grupo tratado com DHEA isoladamente, e menor que aquela do grupo Premarin + DHEA, embora a diferença não fosse estatisticamente significativa.

DHEA induziu um moderado aumento na espessura da muscular (50 ± 2 pm) , que foi levemente diminuída pela adição de Acolbifeno (41 ± 3 pm) . Finalmente, tratamento com Premarin e DHEA combinados resultou em um aumento notável na espessura (62 ± 3 pm) , quando comparado aos animais tratados com DHEA isoladamente. Quando Acolbifeno foi adicionado a Premarin e DHEA, a espessura da muscular diminuiu (46 ± 5 pg) a um valor comparável a DHEA e Acolbifeno.

Quando a espessura total da parede vaginal foi medida (Fig 5D) , a camada externa fina de tecido conjuntivo que compõe a adventitianão foi incluida. OVX levou a uma atrofia marcante da parede vaginal (51%) (128 ± 3 pm, versus 262 ± 39 pm no intacto) e a adição de Acolbifeno a OVX não teve efeito (108 ± 8 pm) (Fig 7 A, B e 0) . O tratamento com Premarin manteve a espessura total a um valor de (253 ± 10 pm) similar aquele de animais intactos enquanto a adição de Acolbifeno a Premarin reverteu o efeito de Premarin (150 ± 4 pm) (Fig 7D e E, respectivamente). Espessura total vaginal atingida pelo tratamento com DHEA (184 ± 21 pm) foi cerca de 25% menor que aquela do grupo tratado com Premarin isoladamente (Fig 7F). Por outro lado, a adição de Acolbifeno a DHEA levou a um aumento não significante na espessura (213 ± 20 pm) , que tornou-se não significativamente diferente do grupo intacto (Fig 7G). Finalmente, a coadministração de Premarin e DHEA a animais OVX aumentou marcadamente a espessura (290 ± 13 |xm) a um valor similar aquele de animais intactos (Fig 7H). A adição de Acolbifeno a DHEA e Premarin reverteu o efeito a um valor (176 ± 11 pm) não significativamente diferente de DHEA isoladamente (Fig 71) .

Peso Vaginal

Depois de oito meses de tratamento, as mudanças observadas no peso vaginal entre os diferentes grupos (Fig 8) geralmente seguiram as observações morfológicas acima descritas. De fato, o peso vaginal após OVX diminuiu em cerca de 50% (101 ± 5 mg) comparado ao grupo intacto (205 ± 11 mg) enquanto o tratamento de animais OVX com Acolbifeno isoladamente não tinha efeito sobre o peso vaginal. Por outro lado, a administração de Premarin levou a um aumento do peso vaginal que não atingiu ainda o valor de animais intactos (170 ± 9 mg) enquanto a adição de Acolbifeno a Premarin reverteu o ganho de peso induzido por estrogênio a um valor similar aquele de animais OVX (96 ± 4 mg). De modo inverso, quando DHEA foi dado a animais OVX, o peso vaginal aumentou a um valor (171 ± 12 mg), similar aquele do grupo tratado com Premarin, e a combinação de Acolbifeno e DHEA resultou em uma diminuição no peso (135 ± 9 mg), que permaneceu acima daquela do grupo OVX. Finalmente, a coadministração de Premarin e DHEA em animais OVX resultou em um ganho de peso vaginal (179 ± 10 mg) atingindo um valor similar aquele dos grupos OVX + DHEA e OVX + Premarin. A adição de Acolbifeno a essa combinação não tinha efeito significante (194 ± 12 mg).

Tratamento de animais OVX com DHEA levou a forte rotulagem ou AR de vários núcleos nas três camadas vaginais, os mesmo padrão sendo encontrado quando as combinações de DHEA + Acolbifeno e DHEA + Premarin foram usadas, com a exceção de um menor número de núcleos rotulados nas camadas superficiais do epitélio no último grupo. A combinação de DHEA, Premarin e Acolbifeno também resultou em uma forte coloração da maioria dos núcleos nas três camadas da parede vaginal.

Discussão

Secura vaginal ou vaginite atrófica, também referida como atrofia urogenital, com disfunção sexual é um problema comum em mulheres na pós-menopausa (Notelovitz, 2000, Menopause, 7(3) : 140-142) . Os sintomas mais comuns são secura, prurido com queimação, prurido, irritação e dispareunia, que levam a uma libido e qualidade de vida diminuídas (Berman e cols., 1999, Curr Opin Urol, 9(6): 563-568) . Uma vez que sabe-se que a perda de estrogênio está envolvida, a terapia de reposição estrogênica (ERT) e HRT são os tratamentos de escolha. Entretanto, uma vez que nova informação sobre a fisiologia de esteróide sexual em mulheres sugere um importante papel dos andrógenos (Labrie e cols., 2003, End Rev, 24(2): 152-182), o presente estudo compara os efeitos hormonais totais de uma alternativa a HRT ou ERT, ou seja, DHEA isoladamente ou em associação com o antiestrogênio puro Acolbifeno e também com Premarin sobre a morfologia vaginal do rato e expressão de receptor de esteróide sexual. DHEA foi administrado por via percutânea para evitar a primeira passagem pelo figado (Labrie e cols., 1996, Endocrinol, 150: S107-S118).

Finalmente, nossos resultados mostraram um significante aumento do peso vaginal com tratamento com Premarin, quando comparado a animais OVX, o valor sendo similar aquele observado no grupo tratado com DHEA. É adequado relembrar que, embora o aumento de peso vaginal e uterino em roedores seja comumente usado como medidas de estrogenicidade, esses órgãos também podem responder à progesterona e testosterona, entre outros compostos (Emmens e Martin, 1964, Dorfman Ed, Ed Academic Press NY: 1).

Na potencial combinação tripla, o estrogênio eqüino Premarin deve agir no cérebro para aliviar os sintomas vasomotores. De fato, os benefícios da co-administração do antiestrogênio seletivo puro Acolbifeno com um estrogênio para neutralizar os efeitos periféricos indesejados do estrogênio têm sido bem descritos por Labrie e cols. (Labrie e cols., 2003, Endocrinol, 144 (11) : 4700-4706) . No presente estudo, quando Acolbifeno foi dado a animais OVX, a característica morfológica mais tipica induzida pelo SERM foi o aparecimento de uma camada superficial de células mucosas pequenas bem alinhadas que sobrepõem a camada de células basais, um padrão que foi levemente mais pronunciado no grupo de Premarin + Acolbifeno e que permaneceu preponderante em todos os grupos tratados com Acolbifeno, incluindo quando o SERM foi adicionado a DHEA. A mucificação do epitélio vaginal sob tratamento com um antiestrogênio foi relatada em ratos imaturos (Anderson e Kang, 1975, Am J anat, 144(2): 197-207) e adultos (Yoshida e cols., 1998, Cancer Lett, 134(1): 43-51). Embora esse padrão morfológico tenha sido comparado à mucificação induzida por progesterona (Anderson e Kang, 1975, Am J anat, 144(2): 197-207), o mecanismo molecular pelo qual um antiestrogênio induz a mucificação epitelial permanece desconhecido.

Vários efeitos benéficos de DHEA foram relatados em mulheres na pós-menopausa (Labrie e cols., 1997, J. Clin. Endocrinol. Metab., 82: 3498-3505; Labrie e cols., 1991, Mol Cell Endocrinol, 78: C113-C118) . Uma vez que nenhum receptor especifico para DHEA foi caracterizado, as mudanças morfológicas observadas na vagina do rato após tratamento com DHEA refletiram sua conversão intrácrina em esteróides sexuais ativos tendo ação androgênica e/ou estrogênica através de mecanismos intrácrinos (Labrie e cols., 1991, Mol Cell Endocrinol, 78: C113-C118). Aquelas mudanças compreendem intensa mucificação epitelial, alta firmeza das fibras de colágeno delicadas, finamente trançadas da lâmina própria e moderado aumento da espessura da muscular quando comparada a animais OVX. As duas primeiras mudanças morfológicas são tipicas de efeitos androgênicos enquanto a terceira mostra uma atividade semelhante a estrogênio, que é também sustentada por um concomitante aumento na expressão do receptor de progesterona na camada muscular.

Uma vez que DHEA é transformado em, um ou ambos, androgênios e estrogênios em tecidos periféricos, o epitélio de multicamadas espesso mucificado observado no presente estudo após tratamento de animais OVX com DHEA, sugere um efeito androgênico predominante de mucificação na vagina do rato, um efeito que pode mascarar qualquer efeito estrogênico potencial coexistente menor no nivel epitelial. Um estudo prévio mostrou o mesmo efeito de mucificação na vagina do rato (Sourla e cols., 1998, J Steroid Biochem. Mol. Biol., 66(3): 137149); no estudo prévio, a aplicação intravaginal de DHEA atingiu um efeito significante em uma dose dez vezes menor que aquela encontrada como sendo ativa após aplicação de DHEA na pele dorsal.

Os presentes dados indicam ações co-existentes androgenicas principais e estrogênicas menores de DHEA na vagina do rato. Além disso, os presentes resultados são bem sustentados pela observação do epitélio vaginal de animais OVX que receberam a mesma aplicação tópica de DHEA que aquela usada em nosso estudo, mais uma dose subcutânea do antiandrogênio Flutamida (FLU) (resultados não publicados). De fato, o efeito androgênico da mucificação produzido pelo componente androgênico de DHEA foi completamente revertido por FLU e resultou em um epitélio escamoso estratificado, tipico de um efeito estrogênico (dados não mostrados). Se DHEA tivesse um efeito exclusivo androgênico (mucificação) na vagina do rato, esse efeito deve ser revertido por FLU e um epitélio atrófico similar aquele de animais OVX deve ser então observado. Estudos prévios em ratos machos e fêmeas gonadectomizados estabeleceram claramente que o tratamento com DHEA levou a efeitos androgênicos e/ou estrogênicos estimulatórios sobre a próstata, vesícula seminal e útero, dependendo do tecido alvo sob investigação (Labrie e cols., 1988, Endocrinol, 123: 1412-1417).

A combinação de DHEA + Acolbifeno, por outro lado, mostra uma redução na extensão da mucificação epitelial, assim apresentando a alternância de uma camada celular mucosa bem alinhada, um efeito de Acolbifeno e invaginações das células mucosas hipertrofiadas de multicamadas, que correspondem ao efeito androgênico de DHEA. Portanto, Acolbifeno inibe o efeito estrogênico parcial de DHEA, enquanto a contraparte principal androgênica de DHEA é mantida e um pequeno efeito semelhante a estrogênio de Acolbifeno é adicionado, o último sendo melhor observado no nivel do óstio. A diminuição do peso vaginal observada após a adição de Acolbifeno a DHEA é menor que aquela obtida após a adição de Acolbifeno a Premarin, assim ilustrando o menor componente estrogênico de DHEA que é revertido pelo componente antiestrogênio, enquanto o componente principal androgênico não é afetado. Em adição, o aumento na espessura da lâmina própria e na firmeza das fibras de colágeno, quando comparadas aquelas de OVX e animais intactos respectivamente, no grupo de DHEA + Acolbifeno, sugere, novamente, um papel potencial dos andrógenos no aumento da firmeza do colágeno e espessura, uma vez que o componente estrogênico do DHEA é bloqueado por Acolbifeno.

Outros estudos demonstraram que a ação de DHEA na glândula mamária do rato (Sourla e cols., 1998, Endocrinol, 139: 753-764), glândulas sebáceas da pele (Sourla e cols., 2000, J Endocrinol, 166(2): 455462) e densidade mineral óssea (Martel e cols., 1998, J Endocrinol, 157: 433-442) é quase exclusivamente androgênica. Contudo, a presença de uma ação estrogênica de DHEA na vagina do rato foi previamente demonstrada através da indução da abertura vaginal e ovulação precoce em ratos imaturos tratados com esse composto, enquanto DHT, um androgênio não aromatizável a estrogênios, não produz tais efeitos (Knudsen e Mahesh, 1975, Endocrinol, 97(2): 458-468). A capacidade do tecido da vaginal do rato de aromatizar androgênios, especialmente Testo, é capaz de responder pela maior parte do efeito estrogênico de DHEA nesse órgão (Lephart e cols., 1989, Biol Reprod, 40(2) : 259-267) . Androst-5-ene-3β,17β-diol (5- diol) , um metabólito de DHEA conhecido por se ligar ao receptor estrogênico (Shao e cols., 1950, J Biol Chem, 250: 3095-3100; Poortman e cols., 1975, J Clin Endocrinol Metab, 40(3) : 373-379; Van Doorn e cols., 1981, Endocrinol, 108: 15871594; Adams e cols., 1981, Cancer Res, 41: 4720-4726), também pode contribuir para o efeito estrogênico (Poulin e Labrie, 1986, Cancer Res, 46: 4933-4937). A combinação proposta do antiestrogênio Acolbifeno com DHEA deve evitar, assim, qualquer efeito estimulante indesejado de 5-diol. Por outro lado, acolbifeno deve mostrar benefícios adicionais por prevenção da perda óssea (Martel e cols., 2000, J Steroid Biochem Mol Biol, 74 (1-2): 45-56).

Para o melhor dos nossos conhecimentos, nenhum estudo prévio mostrou os efeitos estimulantes de DHEA sobre a firmeza e morfologia das fibras de colágeno da lâmina própria e, em uma menor extensão, sobre a muscular. Tais ações de androgênios e estrogênios derivados de DHEA devem ter efeitos benéficos sobre a função vaginal em mulheres na pós-menopausa e devem fornecer os substratos necessários para a ação de inibidores de tipo 5 fosfodiesterase como sildenafil ou tadalafil, possivelmente via facilitação mediada por oxido nitrico sintase endotelial (eNOS) induzida por androgênio ou estrogênio do relaxamento da musculatura lisa vaginal (revisto em Munarriz e cols., 2003, J Urol, 170 (2 Pt 2) : S40-S44, Discussion S44-S45) . De fato, Acolbifeno induz eNOS em células endoteliais humanas e de rato (Simoncini e cols., 2002, Endocrinol, 143 (6) : 2052-2061) .

Os resultados obtidos em todos os grupos que envolvem o tratamento com DHEA revelaram que a expressão de AR é supra-regulada pelos androgênios derivados da transformação intrácrina de DHEA na vagina do rato, em um modo similar nos três compartimentos de tecido.

As mudanças morfológicas benéficas, observadas concomitantemente com a forte modulação de AR vaginal de rato por androgênios, sugerem que niveis séricos diminuídos de androgênios derivados de DHEA em mulheres na pós- menopausa podem contribuir para a saúde vaginal diminuída e eventualmente para a perda da libido e prazer sexual observada nesse grupo de idade. Texto total sérico diminuído, Testo livre e DHEA-S foram, de fato, encontrados em mulheres que se consultaram com queixa de desejo sexual diminuído (Guay e Jacobson, 2002, J Sex Marital Ther, 28 Suppl 1: 129-142).

No atual estudo, nós mostramos que o tratamento de ratos fêmeas OVX com DHEA ou a combinação de DHEA com Acolbifeno e de DHEA com Acolbifeno e Premarin reverteu as mudanças atróficas induzidas por OVX encontradas na vagina por um efeito androgênico predominante, via AR, que foi refletido por intensa mucificação epitelial e firmeza aumentada das fibras de colágeno na lâmina própria. O tratamento com DHEA isoladamente também aumentou moderadamente a espessura da muscular. Tais dados confirmam a importância de esteróides sexuais sintetizados localmente de DHEA e DHEA-S em tecidos periféricos alvo. Além desses efeitos benéficos, Acolbifeno reduziu a incidência de inflamação, possivelmente através de uma indução semelhante a estrogênio de um epitélio escamoso queratinizados protetor no nivel do óstio e um efeito antiestrogênico de mucificação no nivel interno.

Foram feitas várias tentativas de resolver o problema de secura vaginal, freqüentemente ligada a dispareunia e perda do prazer sexual. Com um exemplo, preparações locais de estrogênio vaginal são comumente prescritas para fornecer alivio mas o endométrio pode ser estimulado pelo estrogênio não oposto (Mattson e cols., 1989, Maturitas, 11: 217-222) . Em mulheres na pós-menopausa histerectomizadas, ERT é ainda usado mas com o risco sabidamente aumentado de desemvolvimento de câncer de mama. Além disso, ERT diminui os niveis de androgênio sérico por aumento da globulina de ligação de hormônio sexual, que pode induzir uma deficiência relativa ovariana e adrenal androgênica, assim criando u, criando uma justificativa adicional para a reposição concomitante de androgênio fisiológico (Casson e cols., 1997, Obstet Gynecol, 90(6) : 995-998) .

Exemplo 2 Métodos Animais e tratamento

Ratos Sprague-Dawley fêmeas de dez a doze semanas de idade (Cri:CD®(SD)Br) (Charles River Laboratory, St- Constant, Canadá) pesando aproximadamente 215-265g no momento da ooforectomia foram usados. Os animais foram abrigados individualmente em uma sala ambientalmente controlada (temperatura: 22 ± 3°C; umidade: 50 ± 20%; ciclos de 12-h de luz-12-h de escuridão, luzes as 07:15h). Os animais tiveram livre acesso a água e ração para roedores (Lab Diet 5002, Ralston Purina, St-Louis, MO) . O experimento foi conduzido de acordo com o Guia CCAC para Cuidados e Uso de Animais Experimentais em uma instalação de animais aprovada pelo "Canadian Council on Animal Care"(CCAC) e a "Association for Assessment e Accreditation of Laboratory Animal Care" (AAALAC) de acordo com o "CCAC Guide for Care e Use of Experimental Animals".

Diferentes experimentos foram realizados: dois estudos de 20-dias e dois de 8 meses. Em cada um dos dois primeiros experimentos, os animais foram aleatoriamente distribuídos entre 3 grupos de 13 ou 14 animais como se segue: 1) controle intacto; 2) controle ooforectomizado (OVX3) OVX + Raloxifeno (0,5 mg/kg), or, 3) OVX + LY 363381 (0,5 mg/kg). Em um estudo de 8 meses, os animais foram aleatoriamente distribuídos entre 5 grupos de 7-8 animais como se segue: 1) controle intacto; 2) controle ooforectomizado (OVX3) OVX + Acolbifeno (0,5 mg/kg); 4) OVX + ERA-923 (0,5 mg/kg); 5) OVX + TSE-424 (0,5 mg/kg). No outro estudo de 8 meses, os animais foram aleatoriamente distribuídos entre 3 grupos de 10-11 animais como se segue: 1) controle intacto; 2) controle ooforectomizado (OVX3) OVX + lasofoxifeno (0,5 mg/kg) . No primeiro dia do estudo, os animais dos grupos adequados foram ooforectomizados bilateralmente (OVX) sob anestesia induzida por isoflurano. Os compostos testados foram então dados uma vez ao dia por ingestão oral como uma suspensão em 0,4% metilcelulose (0,5 ml/rato) do dia 1 ao dia 20 do estudo ou do dia 1 à semana 32 do estudo.

Vinte e quatro horas depois da última dose, os animais foram sacrificados sob anestesia com isoflurano por exsanguinação. As vaginas foram coletadas e imersas em 10% de formalina tamponada neutra imediatamente após a ressecção. As vaginas foram então cortadas em 7 segmentos transversos (para Acolbifeno, ERA-923 e TSE-424) ou cortadas apenas no segmento transverso médio. (Raloxifeno, lasofoxifeno ou LY 363381) . Os segmentos foram então processados e incrustados em blocos de parafina. Quando adequado, todos os segmentos foram posicionados no bloco de parafina em uma seqüência que corresponde a sua posição anatômica original e orientados perpendicular à superfície do bloco, assim permitindo que os segmentos fossem cortados em secções transversas. Para cada animal, uma seção de parafina de 4 pm de espessura foi feita e corada com hematoxilina-eosina para exame morfológico.

Nas Figuras 10 e 11 é mostrada uma comparação entre diferentes SERMs: morfologia epitelial vaginal, em ratos OVX, com aumento de 200X. Os retratos A a D mostram a morfologia epitelial do primeiro segmento da vagina (óstio) . Embora o epitélio dos animais OVX seja fino (4-6 camadas de células), atrófico e na apresente uma camada granular visivel em A, o mesmo epitélio é mais espesso nos 3 SERMs (8-11 camadas de células) e apresenta um compartimento granular de multicamadas, em B, Ce D. Em E a K, um segmento situado no meio da vagina é ilustrado. Nos animais, o epitélio vaginal é fino e atrófico (2-3 camadas de células), em E, embora a espessura seja aumentada em todos os grupos tratados (F a K), devido à presença de uma (Acolbifeno, ERA-923 e TSE-424) ou várias (Raloxifeno, lasofoxifeno ou LY 363381) camadas celulares mucosas sobrepondo a camada de células basais.

Exemplo 3 Materiais e métodos

Ratos Sprague-Dawley fêmeas de dez a doze semanas de idade (Cri:CD®(SD)Br VAF/PIus™) (Charles River Laboratory, St-Constant, Canadá) pesando aproximadamente 250-275g no inicio do experimento foram usados. Os animais foram aclimatizados às condições ambientais (temperatura: 22 ± 3°C; umidade: 50 ± 20%; ciclos de 12-h de luz-12-h de escuridão, luzes as 07:15h) por pelo menos uma semana antes do inicio do experimento. Os animais foram abrigados individualmente e tiveram livre acesso a água e ração para roedores (Lab Diet 5002, Ralston Purina, St-Louis, MO) . O experimento foi conduzido de acordo com o Guia CCAC para Cuidados e Uso de Animais Experimentais em uma instalação de animais aprovada pelo "Canadian Council on Animal Care"(CCAC) e a "Association for Assessment e Accreditation of Laboratory Animal Care" (AAALAC).

Um total de 25 ratos fêmeas foi distribuído aleatoriamente em 5 grupos como se segue: 1) três ooforectomizados de controle intocados (OVX); 2) quatro OVX + supositório de placebo; 3) seis OVX + supositório de 0,33 mg DHEA; 4) seis OVX + supositório de 0,66 mg DHEA; 5) seis OVX + supositório de 1,00 mg DHEA. No primeiro dia do estudo, os animais de todos os grupos foram ooforectomizados bilateralmente (OVX) sob anestesia induzida por isoflurano. A inserção de um supositório na vagina começou no dia 5 do estudo e foi continuada uma vez ao dia até o dia 18 do estudo, por um total de 14 dias de tratamento. O supositório foi colocado na abertura vaginal e então delicadamente empurrado cerca de 2-3 mm dentro da vagina com a ajuda de um pequeno bastão liso de vidro, desinfetado em 70% álcool e seco entre cada animal.

Vinte e quatro horas depois da última dose, os animais foram sacrificados sob anestesia com isoflurano por exsanguinação. As vaginas, incluido uretra, foram coletadas e então cortadas como descrito abaixo. Para análise posterior, dois pedaços da glândula mamária inguinal foram retirados, bem como um pedaço quadrado de cerca de 2 x 2 cm de pele dorsal raspada, a última sendo colocada e delicadamente alisada sobre um pedaço de cartão.

Preparação dos supositórios

Os supositórios de DHEA foram preparados usando base Whitepsol H-15 (Medisca, Montreal, Canada). Qualquer outra base lipofilica como Fattibase, Wecobee, manteiga de cacau, óleo de teobroma ou outras combinações de bases de Whitepsol podem ser também usadas. As quantidades adequadas de DHEA foram pesadas para chegar às concentrações finais de 0,33 mg ou 0,66 mg ou 1,00 mg por supositório de uma volume final de 50 p.1 ± 3 p.1. A quantidade adequada de péletes de base de supositório para se obter um volume final necessário foi calculada baseado na densidade previamente medida da base do supositório, que foi de 47,5 mg por 50 p.1. A base do supositório foi colocada em uma pequena proveta, derretida em microondas em 50% de força por cerca de 3 minutos e 30 segundos e então transferidas em uma placa de aquecimento, que foi ajustada na menor força possível para manter a base do supositório em uma temperatura de 50 ± 3°C. O pó micronizado de DHEA (obtido de Scheweizerhall Inc. em uma pureza de 100%) foi então adicionado na base, tudo de uma vez, o todo foi deixado imerso e para umedecer por 3 minutos antes de ser meticulosamente e lentamente esmagado e dissolvido com uma vara de vidro de ponta arredondada lisa. Finalmente, a base com o DHEA dissolvido (o placebo era a base sem DHEA) foi despejada usando uma pipeta de 1.000 pl-Gilson com uma ponta pré-aquecida, em estantes de tubo contendo uma série de moldes de 50 pl. Esses moldes foram feitos de tubos de microcentrifuga, cada um deles previamente calibrado com 50 |_il de água e cortado ao nivel da linha desenhada na superfície da água. Depois de 30 minutos de resfriamento em temperatura ambiente, os supositórios foram colocados a 4°C por mais 30 minutos. Finalmente, o excesso de base foi aparado com uma lâmina e os supositórios foram removidos de seus moldes e estocados em frascos de vidro fechados a 4 °C até o uso. Eles atingiram a temperatura ambiente antes de serem aplicados aos animais.

Procedimentos histológicos

Os órgãos foram imersos em 10% de formalina tamponada neutra imediatamente após a ressecção. Cada vagina e útero foi dividido em 8 segmentos transversos iguais e 4 segmentos transversos incluindo dois do cérvix e dois de cada um dos dois cornos proximal e distai, respectivamente. Os segmentos foram então processados e incrustados no mesmo bloco de parafina. No bloco de parafina, todos os segmentos foram posicionados em uma seqüência que corresponde a sua posição anatômica original e orientados perpendicular à superfície do bloco, assim permitindo que os segmentos fossem cortados em secções transversas. Para cada animal, uma seção de parafina de 4 pm de espessura foi feita e corada com hematoxilina-eosina para exame morfológico,

resultados Morfologia do epitélio

Após exame de todos os segmentos vaginais, constatou- se que segmentos 4 e 6 são representativos para comparação entre tratamentos. Segmento 4 era o mais proximal ao óstio que não apresenta características da pele externa, e não foi afetado pelas leves a moderadas mudanças inflamatórias usualmente encontradas na área externa da mucosa vaginal em animais de controle. Segmento 6 representou a mucosa vaginal mais profunda e é separada da cérvix uterina apenas por um segmento. Em geral, o lado ventral da vagina apresenta um epitélio mais espesso e mais mucificado quando comparado ao lado dorsal.

Intacto

Como mostrado na Figura 13, em estrus, que é sob a influência estrogênica principal, o epitélio vaginal é espesso e queratinizado. Ele apresenta de 12 a 18 camadas de células no segmento 4, e 12 a 15 camadas no segmento 6. Contrário ao epitélio escamoso estratificado espesso observado no óstio, as camadas granulares não são óbvias no epitélio vaginal interno. Em metestrus, sob influência hormonal minima, o epitélio vaginal é mais fino. Ele apresenta 6 a 10 camadas de células no segmento 4, e 5 a 7 camadas no segmento 6.

Ooforectomizado Intocado

Como mostrado na Figura 14, no segmento 4, a vagina é forrada por um epitélio escamoso estratificado de 2 a 6 camadas de células. A espessura desse segmento é bem variável entre animais. No segmento 6, completa atrofia é observada, com 2 a 3 camadas de células de células planas. Alguns raros focos de pequenas células mucosas cilíndricas podem ser observados por toda a vagina desses animais. Dos três animais desse grupo, dois apresentaram leves mudanças inflamatórias nos três segmentos externos.

Placebo

Como mostrado na Figura 15, em comparação com o grupo OVX intocado, o epitélio escamoso estratificado vaginal do grupo placebo foi levemente mais espesso, com segmento 4 apresentando 4 a 8 camadas de células. No entanto, no segmento 6, a mesma morfologia encontrada no grupo OVX intocado foi observada, com 2-3 camadas de células epiteliais. Como nos animais OVX intocados, os focos de pequenas células mucosas cilíndricas podem ser encontrados por toda a vagina, levemente mais quando comparada como os animais OVX intocados. Desses quatro animais desse grupo, três apresentaram leves mudanças inflamatórias nos três segmentos externos.

0,33 mg de DHEA/supositório

Como mostrado na Figura 16, em geral, em baixas doses, o efeito morfológico de DHEA é caracterizado por células mucosas bem alinhadas cilíndricas, enquanto em doses maiores, as células mucosas aumentam (hipertrofia) , formam vacúolos e se empilham. No presente grupo, o efeito de DHEA é levemente perceptível no segmento 2 e gradualmente aumenta nos segmentos 3-4, quando há uma alternância de células mucosas hipertrofiadas e bem alinhadas. O efeito de DHEA diminui lentamente nos segmentos 5 e 6 quando quase apenas células mucosas bem alinhadas podem ser observadas. O efeito torna-se muito pouco no segmento 7 e desaparece na dobra lateral vaginal do segmento 8 (que inclui o inicio do cérvix). Assim, no segmento 4, o epitélio vaginal é escamoso estratificado com 3 a 7 camadas de células. Cerca de 20 a 60% do forro vaginal consiste em células mucosas bem alinhadas em alternância com 15 a 50% células mucosas hipertrofiadas, sobrepondo uma ou mais camadas de epitélio escamoso estratificado, e com áreas não mucifiçadas. No segmento 6, a espessura do epitélio é reduzida a quase a espessura encontrada em animais OVX intocados. Ela consiste em um epitélio escamoso estratificado de 2 a 5 camadas de células, cobertas por uma camada de células mucosas bem alinhadas. Uma grande variação na ocorrência de células mucosas foi observada, essas células cobrindo de 5 a 75% da superfície vaginal, em alternância com áreas não mucificadas. Dos seis animais tratados, quatro deles apresentaram leve inflamação, distribuída irregularmente por toda a vagina.

0,66 mg de DHEA/supositório

Como mostrado na Figura 17, nesse grupo, o efeito de DHEA é perceptível no segmento 2 e aumenta significativamente nos segmentos 3, 4 e 5 onde uma maioria de células mucosas hipertrofiadas é observada. O número de células mucosas hipertrofiadas diminui nos segmentos 6 e 7 onde a maioria das células são células mucosas bem alinhadas. Assim, no segmento 4, o epitélio escamoso estratificado tem 3 a 6 camadas de células de espessura. Cerca de 5 a 20% de um forro vaginal consiste em células mucosas bem alinhadas em alternância com 10 a 75% de células mucosas hipertrofiadas, sobrepondo uma ou mais camadas de epitélio escamoso estratificado. Áreas epiteliais não mucificadas são também presentes. No segmento 6, a espessura do epitélio é reduzida e consiste em um epitélio escamoso estratificado de 2 a 4 camadas de células, transpostas por uma camada de células mucosas bem alinhadas. A quantidade de áreas mucificadas varia de 20 a 80% da superficie vaginal, em alternância com áreas não mucificadas. Dos seis animais tratados, dois apresentaram leve inflamação nos três segmentos externos.

1,00 mg de DHEA/supositório

Como mostrado na Figura 18, nesse grupo, o efeito de DHEA é também perceptível no segmento 2, mas ele aumenta significativamente nos segmentos 3-4 e 5 onde a ampla maioria das células mucosas hipertrofiadas é observada, e muito pouca diminuição nos segmentos 6, 7 e 8, onde a ampla maioria das células mucosas bem alinhadas é observada. Assim, no segmento 4, o epitélio escamoso estratificado apresenta 3 a 9 camadas de células. Células mucosas hipertrofiadas sobrepondo 3 a 4 camadas de células escamosas cobrem 50 a 70% da superfície vaginal, enquanto células mucosas bem alinhadas cobrem 5 a 30% da superfície vaginal. Áreas não mucificadas são entrepostas entre células mucificadas. No segmento 6, a espessura do epitélio é também reduzida e consiste em 2 a 4 camadas de células. Células mucosas hipertrofiadas sobrepondo 1 a 3 camadas de células escamosas cobrem cerca de 30 a 100% da superfície vaginal enquanto células mucosas bem alinhadas cobrem 0 a 70%. Poucas áreas não mucificadas são também observadas. Dos seis animais tratados, quatro deles apresentaram leve inflamação nos quatro segmentos externos.

Conclusões

1. O veículo usados para tratamento intravaginal do rato tem características desejáveis:

a. facilmente preparados em molde calibrado;

b. Excelente capacidade de dissolver completamente o pó micronizado de DHEA, assim assegurando uma dosagem padronizada;

c. Nenhuma reação tecidual e alterações morfológicas significantes de uma mucosa vaginal: apenas um leve aumento na espessura do epitélio foi observado nos primeiros 3 a 4 segmentos, possivelmente devido a manipulações que acompanham a inserção do supositório.

2. DHEA produziu um efeito sobre a morfologia do epitélio vaginal na dose mais baixa testada (0,33 mg/ supositório). O efeito é máximo do terceiro ao quinto segmento, então diminui gradualmente para desaparecer no nivel do sétimo segmento.

3. na dose de DHEA de 0,66 mg/supositório, o efeito também é presente no terceiro segmento e permanece bem forte no sexto segmento.

4. na dose de DHEA de 1,00 mg/supositório; o efeito é forte do segmento 2-3 até as dobras profundas da vagina ao lado do cérvix uterino.

Exemplos de Composição Farmacêutica

Abaixo são apresentados, por via de exemplo e não de limitação, várias composições farmacêuticas que utilizam SERM ativo preferido Acolbifeno, precursor de esteróide sexual ativo preferido DHEA, estrogênio preferido 17β- estradiol ou premarin, inibidor de tipo 5 cGMP fosfodiesterase preferido Sildenafil ou Tadalafil. A concentração de Ingrediente ativo pode ser variada em uma ampla escala como aqui discutido. As quantidades e tipos de outros ingredientes que podem ser incluídos são bem conhecidos na técnica.

Exemplo A Comprimido

Exemplo B Cápsula de gelatine

Exemplo C Comprimido

Exemplo D Cápsula de gelatine

Exemplo E Comprimido

Exemplo F Cápsula de gelatine

Exemplo G Comprimido

Exemplo H Cápsula de gelatine

Exemplo I Comprimido

Exemplo J Cápsula de gelatine

Exemplo K Creme Vaginal

Exemplo L Supositório Vaginal

Os supositórios de DHEA foram preparados usando base Whitepsol H-15 (Medisca, Montreal, Canada). Qualquer outra base lipofilica como Fattibase, Wecobee, manteiga de cacau, óleo de teobroma ou outras combinações de bases de Whitepsol podem ser também usadas.

Exemplos de KIT

São apresentados abaixo, por via de exemplo e não de limitação, vários kits que utilizam SREM preferido ativo Acolbifeno, precursor de esteróide sexual ativo preferido DHEA, estrogênio preferido 17β-estradiol ou estrogênios conjugados, inibidor de tipo 5 cGMP fosfodiesterase preferido Sildenafil ou Tadalafil. A concentração de Ingrediente ativo pode ser variada em uma ampla escala como aqui discutido. As quantidades e tipos de outros ingredientes que podem ser incluídos são bem conhecidos na técnica.

Exemplo A

O SERM, estrogênios e inibidor de tipo 5 GMPc fosfodiesterase são oralmente administrados enquanto o precursor de esteróide sexual é aplicado localmente ou administrado por via percutânea.

Composição de SERM para administração oral (cápsulas)

SERM + composição de estrogênios para administração oral (cápsulas)

Composição de SERM + estrogênios + inibidor de tipo 5 GMPc fosfodiesterase para administração oral (cápsulas)

Composição de precursor de esteróide sexual para administração tópica (gel)

Exemplo B

O SERM e o precursor de esteróide sexual são administrados por via oral.

Composição não esteróide antiestrogênio para administração oral (cápsu1as)

Composição de precursor de esteróide sexual para administração oral (Cápsula de gelatina)

Outros SERMs (Toremifeno, Ospemifeno, Raloxifene, Arzoxifeno, Lasofoxifeno , TSE- 4 2 4 , ERA-923, EM-800, SERM 3339, GW5638) podem ser substituídos por Acolbifeno nas formulações acima, bem como outros inibidores de esteroides sexuais podem ser substituídos por DHEA, outros estrogênios podem ser substituídos por Premarin e outros inibidores de tipo 5 cGMP fosfodiesterase podem ser substituídos por Sildenafil ou Tadalafil ou por prostaglandina El. Mais de um SERM ou mais de um precursor ou estrogênios ou inibidores de tipo 5 cGMP fosfodiesterase podem ser incluídos em cujo caso a percentagem em peso combinada é preferivelmente aquela da percentagem em peso para o precursor único ou SERM único dado nos exemplos acima.

Claims (51)

1. Uso de um precursor de esteróide sexual selecionado do grupo consistindo em dehidroepiandrosterona, sulfato de dehidroepiandrosterona, androst-5-eno-3β,17β-diol e 4- androsten-3,17-diona caracterizadopelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou redução da probabilidade de adquirir uma doença ou condição vaginal causada pela atrofia de cada ou ambas as camadas lâmina própria e a camada muscular da vagina em mulheres na pós- menopausa, a referida doença ou condição selecionada do grupo consistindo em vaginite atrófica, estreitamento da cavidade vaginal, diminuição da parede vaginal, dispareunia, e disfunção sexual.

2. Uso de um precursor de esteróide sexual selecionado do grupo consistindo em dehidroepiandrosterona, sulfato de dehidroepiandrosterona, androst-5-eno-3β,17β-diol e 4- androsten-3,17-diona em associação com um modulador de receptor de estrogênio seletivo para proteção uterina e da glândula mamária contra câncer, caracterizadopelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou redução da probabilidade de adquirir uma doença ou condição vaginal causada pela atrofia de cada ou ambas as camadas lâmina própria e a camada muscular da vagina em mulheres na pós-menopausa, a referida doença ou condição selecionada do grupo consistindo em atrofia vaginal, vaginite atrófica, estreitamento da cavidade vaginal, diminuição da parede vaginal, dispareunia, e disfunção sexual.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o modulador de receptor de estrogênio seletivo é acolbifeno.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as doenças ou condições vaginais são selecionadas do grupo consistindo em vaginite atrófica, dispareunia, disfunção sexual, estreitamento da cavidade vaginal, e encurtamento da parede vaginal.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as doenças ou condições vaginais são selecionados do grupo consistindo em atrofia vaginal, vaginite atrófica, dispareunia, disfunção sexual, estreitamento da cavidade vaginal, e encurtamento da parede vaginal.

6. Uso de um precursor de esteróide sexual selecionado do grupo consistindo em dehidroepiandrosterona, sulfato de dehidroepiandrosterona, androst-5-eno-3β,17β-diol e 4- androsten-3,17-diona caracterizadopelo fato de ser para a fabricaçao de um medicamento para o tratamento ou redução da probabilidade de adquirir uma doença ou condição vaginal causada pela atrofia de cada ou ambas as camadas lâmina própria e a camada muscular da vagina em mulheres na pós- menopausa, ou causada pela solidez insuficiente das fibras de colágeno na camada lâmina própria da vagina, a referida doença ou condição selecionada do grupo consistindo em atrofia vaginal, vaginite atrófica, estreitamento da cavidade vaginal, diminuição da parede vaginal, dispareunia, e disfunção sexual, por aumentar a solidez das fibras de colágeno na lâmina própria da parede vaginal em mulheres na pós-menopausa.

7. Uso de um precursor de esteróide sexual selecionado do grupo consistindo em dehidroepiandrosterona, sulfato de dehidroepiandrosterona, androst-5-eno-3β,17β-diol e 4- androsten-3,17-diona em associação com um modulador de receptor de estrogênio seletivo para proteção uterina e da glândula mamária contra câncer caracterizadopelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou redução da probabilidade de adquirir uma doença ou condição vaginal causada pela atrofia de cada ou ambas as camadas lâmina própria e a camada muscular da vagina em mulheres na pós-menopausa, ou causada pela solidez insuficiente das fibras de colágeno na camada lâmina própria da vagina, a referida doença ou condição selecionada do grupo consistindo em atrofia vaginal, vaginite atrófica, estreitamento da cavidade vaginal, diminuição da parede vaginal, dispareunia, e disfunção sexual, por aumentar a solidez das fibras de colágeno da parede vaginal.

8. Uso de um precursor de esteróide sexual selecionado do grupo consistindo em dehidroepiandrosterona, sulfato de dehidroepiandrosterona, androst-5-eno-3β,17β-diol e 4- androsten-3,17-diona, caracterizadopelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou redução da probabilidade de adquirir uma doença ou condição vaginal causada pela atrofia da camada muscular da vagina em mulheres na pós-menopausa, a referida doença ou condição selecionada do grupo consistindo em atrofia vaginal, vaginite atrófica, estreitamento da cavidade vaginal, diminuição da parede vaginal, dispareunia, e disfunção sexual, por aumentar a espessura da musculatura da parede vaginal.

9. Uso de um precursor de esteróide sexual selecionado do grupo consistindo em dehidroepiandrosterona, sulfato de dehidroepiandrosterona, androst-5-eno-3β,17β-diol e 4- androsten-3,17-diona em associação com um modulador de receptor de estrogênio seletivo para proteção uterina e da glândula mamária contra câncer, caracterizadopelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou redução da probabilidade de adquirir uma doença ou condição vaginal causada pela atrofia da camada muscular da vagina em mulheres na pós-menopausa, a referida doença ou condição selecionada do grupo consistindo em atrofia vaginal, vaginite atrófica, estreitamento da cavidade vaginal, diminuição da parede vaginal, dispareunia, e disfunção sexual, por aumentar a espessura da musculatura da parede vaginal.

10. Uso de um precursor de esteróide sexual selecionado do grupo consistindo em dehidroepiandrosterona, sulfato de dehidroepiandrosterona em associação com um modulador de receptor de estrogênio seletivo para proteção uterina e da glândula mamária contra câncer, androst-5-eno- 3β,17β-diol e 4-androsten-3,17-diona, caracterizadopelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou redução da probabilidade de adquirir uma disfunção sexual causada pela atrofia de um ou ambos a camada lâmina própria e/ou a camada muscular da vagina em mulheres na pós-menopausa.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o precursor de esteróide sexual é dehidroepiandrosterona.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o precursor de esteróide sexual é sulfato de dehidroepiandrosterona.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o precursor de esteróide sexual é androst-5-eno-3β,17β-diol.

14. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou 6 a 10, caracterizadopelo fato de que o precursor de esteróide sexual é administrado por via intravaginal.

15. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou 6 a 10 caracterizadopelo fato de que o precursor de esteróide sexual é administrado por via oral ou percutânea.

16. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 3, 7, 9 ou 10, caracterizadopelo fato de que o modulador de receptor de estrogênio seletivo é administrado por via oral, percutânea ou intravaginal.

17. Uso de um precursor de esteróide sexual selecionado do grupo consistindo em dehidroepiandrosterona, sulfato de dehidroepiandrosterona, androst-5-eno-3β, 17β- diol e 4-androsten-3,17-diona em associação com um modulador de receptor de estrogênio seletivo para proteção uterina e da glândula mamária contra câncer caracterizado pelo fato de ser para a fabricaçao de um medicamento para o tratamento de vaginite atrófica ou atrofia vaginal causada pela atrofia de um ou ambas a camada lâmina própria e a camada muscular da vagina em mulheres na pós-menopausa.

18. Uso, de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que o precursor de esteróide sexual e o modulador de receptor de estrogênio seletivo são administrados por via intravaginal, oral ou percutânea.

19. Uso, de qualquer uma das reivindicações 2, 3, 7, 9, 10 ou 16 a 18, caracterizadopelo fato de que o modulador de receptor de estrogênio seletivo tem uma fórmula molecular com as seguintes características: a) dois anéis aromáticos espaçados por 1 a 2 átomos de carbono intervenientes, ambos anéis aromáticos sendo não substituídos ou substituídos por um grupo hidroxil ou um grupo convertido in vivo a hidroxil; b) cadeia lateral possuindo um anel aromático e uma função de amina terciária ou sal dessa.

20. Uso, de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que o modulador de receptor de estrogênio seletivo tem a seguinte fórmula:

em que Ri e R- são independentemente hidrogênio, hidroxil ou uma porção que é convertida a hidroxil in vivo; em que Z é uma porção de fechamento bivalente; em que o Rioo é uma porção bivalente que distancia L do anel-B em 4-10 átomos intervenientes; em que L é uma porção polar bivalente ou trivalente selecionada do grupo consistindo em -SO-, -CON-, -N< e - SON<; em que Gi é selecionado do grupo consistindo em hidrogênio, um hidrocarboneto Ci a C5 ou uma porção bivalente que une G2 e L para formar de 5 a 7 membros, e halo ou derivados insaturados dos antecedentes; em que Go é tanto ausente ou selecionado do grupo consistindo em hidrogênio, um hidrocarboneto Ci a Cs ou uma porção bivalente que une Gi e L para formar um anel heterocíclico de 5 a 7 membros, e halo ou derivados insaturados dos antecedentes; em que Gs é selecionado do grupo consistindo em hidrogênio, metil e etil.

21. Uso, de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que o modulador de receptor de estrogênio seletivo é um composto oticamente ativo tendo uma configuração S absoluta no carbono 2 ou sal farmaceuticamente aceitável desse, o referido composto tendo a estrutura molecular:

em que Ri e R- são independentemente selecionados do grupo consistindo em hidroxil e uma porção que pode ser convertida in vivo a hidroxil; R3 é uma espécie selecionada do grupo consistindo em pirrolidinil saturado, substituído, morfolino saturado, insaturado ou substituído, porção cíclica contendo nitrogênio, porção policíclica contendo nitrogênio, e NRaRb (Ra e Rb sendo independentemente hidrogênio, Ci-e alquil linear ou ramificado, C2-6 alquenil linear ou ramificado e C2-6 alquinil linear ou ramificado).

22. Uso, de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que o referido composto ou sal é substancialmente desprovido de (2R)-enantiómero.

23. Uso, de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que o derivado de benzopirano é um sal de um ácido selecionado do grupo consistindo em ácido acético, ácido adípico, ácido benzenossulfônico, ácido benzóico, ácido canforsulfônico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido hidroiódico, ácido hidrobrômico, ácido clorídrico, ácido hidroclorotiazida, ácido hidroxi- naftóico, ácido lático, ácido maleico, ácido metanossulfônico, ácido metilsulfúrico, ácido 1,5- naftalenodissulfônico, ácido nítrico, ácido palmítico, ácido piválico, ácido fosfórico, ácido propiônico, ácido succínico, ácido sulfúrico, ácido tartárico, ácido tereftálico, ácido p-toluenossulfônico e ácido valérico.

24. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 7, 9, 10 ou 16 a 18, caracterizadopelo fato de que o modulador de receptor de estrogênio seletivo é:

25. Uso, de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que o composto é selecionado do grupo consistindo em: sal de (-)-cis-(5R,6S)-6-fenil-5[4- (2-pirrolidin-l-iletoxi)fenil]-5,6,7,8-tetrahidronaftalen- 2-ol,D-(-)tartarato (lasofoxifeno).

26. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, 6 a 10 ou 14 a 17, caracterizadopelo fato de que o precursor de esteróide sexual é dehidroepiandrosterona.

27. Composição farmacêutica, quando empregada nos usos como definidos em qualquer uma das reivindicações 1, 6 ou 8, para aplicação vaginal, caracterizadapelo fato de compreender: a) um excipiente, diluente ou veiculo farmaceuticamente aceitável; b) uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um precursor de esteróide sexual selecionado do grupo consistindo em dehidroepiandrosterona, sulfato de dehidroepiandrosterona, e androst-5-eno-3β, 17β-diol.

28. Composição farmacêutica para aplicação vaginal caracterizadapelo fato de compreender: a) um excipiente, diluente ou veiculo farmaceuticamente aceitável; b) uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um precursor de esteróide sexual selecionado do grupo consistindo em dehidroepiandrosterona, sulfato de dehidroepiandrosterona, e androst-5-eno-3β,17β-diol; e c) uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um modulador de receptor de estrogênio seletivo para proteção uterina e da glândula mamária contra câncer.

29. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 28, caracterizadapelo fato de ser empregada no uso como definido em qualquer uma das reivindicações 2, 7, 9, 10 ou 17.

30. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 29, caracterizadapelo fato de que o excipiente, diluente ou veiculo é um gel.

31. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 29, caracterizadapelo fato de que essa composição farmacêutica é um supositório ou um óvulo.

32. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 28, caracterizadapelo fato de que o modulador de receptor de estrogênio seletivo tem uma fórmula molecular com as seguintes características: a) dois anéis aromáticos espaçados por 1 a 2 átomos de carbono intervenientes, ambos anéis aromáticos sendo não substituídos ou substituídos por um grupo hidroxil ou um grupo convertido in vivo a hidroxil; b) uma cadeia lateral que possui um anel aromático e uma função de amina terciária ou sal dessa.

33. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 32, caracterizadapelo fato de que o modulador de receptor de estrogênio seletivo tem a seguinte fórmula:

em que Ri e Re são independentemente hidrogênio, hidroxil ou uma porção que é convertida a hidroxil in vivo; em que Z é uma porção de fechamento bivalente; em que o Rim é uma porção bivalente que distancia L do anel-B em 4-10 átomos intervenientes; em que L é uma porção polar bivalente ou trivalente selecionada do grupo consistindo em -S0-, -CON-, -N< e - SON<; em que Gi é selecionado do grupo consistindo em hidrogênio, um hidrocarboneto Ci a C5 ou uma porção bivalente que une Ga e L para formar um anel heterocíclico de 5 a 7 membros, e halo ou derivados insaturados dos antecedentes ; em que Ga é tanto ausente ou selecionado do grupo consistindo em hidrogênio, um hidrocarboneto Ci a Cs ou uma porção bivalente que une Gi e L para formar um anel heterocíclico de 5 a 7 membros, e halo ou derivados insaturados dos antecedentes; em que Ga é selecionado do grupo consistindo em hidrogênio, metil e etil.

34. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 32, caracterizadapelo fato de que o modulador de receptor de estrogênio seletivo é um composto oticamente ativo tendo uma configuração S absoluta no carbono 2 ou sal farmaceuticamente aceitável desse, o referido composto tendo a estrutura molecular:

em que Ri θ R- são independentemente selecionados do grupo consistindo em hidroxil e uma porção que pode ser convertida in vivo a hidroxil; em que Ra é uma espécie selecionada do grupo consistindo em pirrolidinil saturado, insaturado ou substituido, piperidino saturado, insaturado ou substituido, piperidinil saturado, insaturado ou substituido, morfolino saturado, insaturado ou substituido, porção ciclica contendo nitrogênio, porção policiclica contendo nitrogênio, e NRaRb (Ra e Rb sendo independentemente hidrogênio, Ci-Ce alquil linear ou ramificado, C2-C6 alquenil linear ou ramificado e C2-C6 alquinil linear ou ramificado).

35. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 34, caracterizadapelo fato de que o referido composto ou sal é substancialmente desprovido de (2R)- enantiômero.

36. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 34, caracterizadapelo fato de que o derivado de benzopirano é um sal de um ácido selecionado do grupo consistindo em ácido acético, ácido adipico, ácido benzenossulfônico, ácido benzóico, ácido canforsulfônico, ácido citrico, ácido fumárico, ácido hidroiódico, ácido hidrobrômico, ácido clorídrico, ácido hidroclorotiazida, ácido hidroxi-naftóico, ácido lático, ácido maleico, ácido metanossulfônico, ácido metilsulfúrico, ácido 1,5- naftalenodissulfônico, ácido nitrico, ácido palmitico, ácido piválico, ácido fosfórico, ácido propiônico, ácido succinico, ácido sulfúrico, ácido tartárico, ácido tereftálico, ácido p-toluenossulfônico e ácido valérico.

37. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 28, caracterizadapelo fato de que o referido modulador de receptor de estrogênio seletivo é:

38. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 28, caracterizadapelo fato de que o composto é: sal de (-)-cis-(5R,6S)-6-fenil-5-[4-(2-pirrolidin-l- iletoxi)fenil]-5,6,7,8-tetrahidronaftalen-2-ol,D-(- )tartarato (lasofoxifeno).

39. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27, 28 ou 30 a 38, caracterizada pelo fato de que o precursor de esteróide sexual é dehidroepiandrosterona.

40. Kit, quando empregado nos usos como definidos em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 6a 10 ou 17 caracterizadopelo fato de que compreende um primeiro recipiente para aplicação vaginal que contém uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um precursor de esteróide sexual selecionado do grupo consistindo em dehidroepiandrosterona, sulfato de dehidroepiandrosterona e androst-5-eno-3β,17β-diol e ainda compreende um segundo recipiente que contém uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um modulador de receptor de estrogênio seletivo para proteção uterina e da glândula mamária contra câncer.

41. Kit, de acordo com a reivindicação 40, caracterizadopelo fato de que o modulador de receptor de estrogênio seletivo tem uma fórmula molecular com as seguintes características: a) dois anéis aromáticos espaçados por 1 a 2 átomos de carbono intervenientes, ambos anéis aromáticos sendo ou não substituídos ou substituídos por um grupo hidroxil ou um grupo convertido in vivo a hidroxil; b) uma cadeia lateral possuindo um anel aromático e uma função de amina terciária ou sal dessa.

42. Kit, de acordo com a reivindicação 41, caracterizadapelo fato de que o modulador de receptor de estrogênio seletivo tem a seguinte fórmula:

em que Ri e R2 são independentemente hidrogênio, hidroxil ou uma porção que é convertida a hidroxil in vivo; em que Z é uma porção de fechamento bivalente; em que o Rioo é uma porção bivalente que distancia L do anel-B em 4-10 átomos intervenientes; em que L é uma porção polar bivalente ou trivalente selecionada do grupo consistindo em -SO-, -CON-, -N< e - SON<; em que Gi é selecionado do grupo consistindo em hidrogênio, um hidrocarboneto Ci a C5 ou uma porção bivalente que une G2 e L para formar um anel heterociclico de 5 a 7 membros, e halo ou derivados insaturados dos antecedentes; em que G2 é tanto ausente ou selecionado do grupo consistindo em hidrogênio, um hidrocarboneto Ci a C5 ou uma porção bivalente que une Gi e L para formar um anel heterociclico de 5 a 7 membros, e halo ou derivados insaturados dos antecedentes; em que G3 é selecionado do grupo consistindo em hidrogênio, metil e etil.

43. Kit, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o modulador de receptor de estrogênio seletivo é um composto oticamente ativo tendo uma configuração S absoluta no carbono 2 ou sal farmaceuticamente aceitável desse, o referido composto tendo a estrutura molecular:

em que Ri e R2 sãoindθPθndentemente selecionados do grupo consistindo em hidroxil e uma porção conversível in vivo a hidroxil; em que R3 é uma espécie selecionada do grupo consistindo em pirrolidinil saturado, insaturado ou substituido, piperidino saturado, insaturado ou substituido, piperidinil saturado, insaturado ou substituido, morfolino saturado, insaturado ou substituido, porção ciclica contendo nitrogênio, porção policiclica contendo nitrogênio, e NRaRb (Ra e Rb sendo independentemente hidrogênio, Ci-Ce alquil linear ou ramificado, C2-C6 alquenil linear ou ramificado, e C2-C6 alquinil linear ou ramificado).

44. Kit, de acordo com a reivindicação 43, caracterizadopelo fato de que o referido composto ou sal é substancialmente desprovido de (2R)-enantiômero.

45. Kit, de acordo com a reivindicação 43, caracterizadopelo fato de que o derivado de benzopirano é um sal de um ácido selecionado do grupo consistindo em ácido acético, ácido adipico, ácido benzenossulfônico, ácido benzóico, ácido canforsulfônico, ácido citrico, ácido fumárico, ácido hidroiódico, ácido hidrobrômico, ácido clorídrico, ácido hidroclorotiazida, ácido hidroxi- naftóico, ácido lático, ácido maleico, ácido metanossulfônico, ácido metilsulfúrico, ácido 1,5- naftalenodissulfônico, ácido nitrico, ácido palmitico, ácido piválico, ácido fosfórico, ácido propiônico, ácido succinico, ácido sulfúrico, ácido tartárico, ácido tereftálico, ácido p-toluenossulfônico e ácido valérico.

46. Kit, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o referido modulador de receptor de estrogênio seletivo é:

47. Kit, de acordo com a reivindicação 40, caracterizadopelo fato de que o composto é selecionado do grupo que consiste em: sal de (-)-cis-(5R,6S)-6-fenil-5-[4- (2-pirrolidin-l-iletoxi)fenil]-5,6,7,8-tetrahidronaftalen- 2-ol,D-(-)tartarato (lasofoxifeno).

48. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 47, caracterizadopelo fato de que o precursor de esteróide sexual é dehidroepiandrosterona.

49. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizadopelo fato de que o precursor de esteróide sexual é dehidroepiandrosterona.

50. Kit, de acordo com a reivindicação 40, caracterizadopelo fato de que contém uma quantidade terapeuticamente eficaz do referido precursor de esteróide sexual para atrofia vaginal.

51. Uso de um precursor de esteróide sexual selecionado do grupo consistindo em dehidroepiandrosterona, sulfato de dehidroepiandrosterona, androst-5-eno-3β,17β- diol e 4-androsten-3,17-diona caracterizadopelo fato de ser na fabricação de um medicamento para: o tratamento ou redução da probabilidade de adquirir problemas afetando a camada lâmina própria e/ou a camada muscular da vagina em mulheres na pós-menopausa, referidos problemas sendo causados por uma condição ou mudança indesejável em uma ou ambas camada lâmina própria e/ou camada muscular da vagina; o tratamento ou redução da probabilidade de adquirir uma doença ou condição vaginal, em mulheres na pós- menopausa, causada pela solidez insuficiente das fibras de colágeno na parede da camada lâmina própria da vagina por aumentar a solidez das fibras de colágeno da parede vaginal; o tratamento ou redução da probabilidade de adquirir uma doença ou condição vaginal, em mulheres na pós- menopausa, causada pela espessura insuficiente da parede muscular da vagina por aumentar a espessura da musculatura da parede vaginal; o tratamento ou redução da probabilidade de adquirir disfunção sexual em mulheres na pós-menopausa causada pela condição ou mudança indesejada em uma ou ambas camada lâmina própria e/ou camada muscular da vagina, em que o medicamento é para administração como parte de uma terapia de combinação com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um modelador de receptor de estrogênio seletivo para proteção uterina e da glândula mamária contra câncer; ou o tratamento de vaginite atrófica ou atrofia vaginal em mulheres pós-menopausa causada por uma mudança ou condição indesejada em uma ou ambas as camadas lâmina própria e/ou camada muscular da vagina, em que o medicamento é para administração em associação com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um modulador de um receptor de estrogênio seletivo para proteção uterina e da glândula mamária contra câncer; o tratamento ou redução da probabilidade de adquirir uma doença vaginal ou condição causada pela atrofia de uma ou ambas camadas lâmina própria e a camada muscular da vagina em mulheres pós-menopausa, a referida doença ou condição selecionada do grupo consistindo em vaginite atrófica, estreitamento da cavidade vaginal, encurtamento da parede vaginal, dispareunia, e disfunção sexual; o tratamento ou redução da probabilidade de adquirir uma doença ou condição vaginal causada pela atrofia de uma ou ambas as camadas lâmina própria e camada muscular da vagina em mulheres pós-menopausa, a referida doença ou condição selecionada do grupo consistindo em atrofia vaginal, vaginite atrófica, estreitamento da cavidade vaginal, encurtamento da parede vaginal, dispareunia, e disfunção sexual, em que o medicamento é para administração como parte de uma terapia de combinação com uma quantidade eficaz de um modulador de receptor de estrogênio seletivo para proteção uterina e da glândula mamária contra câncer; o tratamento ou redução da probabilidade de adquirir uma doença ou condição vaginal causada pela atrofia de uma ou ambas as camadas lâmina própria e camada muscular da vagina em mulheres na pós-menopausa, ou causada por solidez insuficiente das fibras de colágeno na camada lâmina própria da vagina, referida doença ou condição selecionada do grupo consistindo em atrofia vaginal, vaginite atrófica, estreitamento da cavidade vaginal, encurtamento da parede vaginal, dispareunia, e disfunção sexual, pelo aumento da solidez das fibras de colágeno da camada lâmina própria da parede da vagina; o tratamento ou redução da probabilidade de adquirir uma doença ou condição vaginal causada pela atrofia de uma ou ambas as camadas lâmina própria e camada muscular da vagina em mulheres na pós-menopausa, ou causadas pela solidez insuficiente das fibras de colágeno na camada lâmina própria da vagina, a referida doença ou condição selecionada do grupo consistindo em atrofia vaginal, vaginite atrófica, estreitamento da cavidade vaginal, encurtamento da parede vaginal, dispareunia, e disfunção sexual, pelo aumento da solidez das fibras de colágeno da parede vaginal, em que o medicamento é para administração como parte de uma terapia de combinação com uma quantidade eficaz de um modulador de receptor de estrogênio seletivo para proteção uterina e da glândula mamária contra câncer; o tratamento ou redução da probabilidade de adquirir uma doença ou condição vaginal causada pela atrofia da camada muscular da vagina em mulheres na pós-menopausa, a referida doenção ou condição selecionada do grupo consistindo em atrofia vaginal, vaginite atrófica, estreitamento da cavidade vaginal, encurtamento da parede vaginal, dispareunia, e disfunção sexual, pelo aumento da espessura da musculatura da parede vaginal; o tratamento ou redução da probabilidade de adquirir uma doença ou condição vaginal causada pela atrofia da camada muscular da vagina em mulheres pós-menopausa, a referida doença ou condição selecionada do grupo consistindo em atrofia vaginal, vaginite atrófica, estreitamento da cavidade vaginal, encurtamento da parede vaginal, dispareunia, e disfunção sexual, pelo aumento da espessura da musculatura da parede vaginal, em que o medicamento é para administração como parte de uma terapia de combinação com uma quantidade eficaz de um modulador de receptor de estrogênio seletivo para proteção uterina e da glândula mamária contra câncer; o tratamento ou redução da probabilidade de adquirir disfunção sexual causada pela atrofia de uma ou ambas as 5 camadas lâmina própria e/ou camada muscular da vagina em mulheres na pós-menopausa, em que o medicamento é para administração como parte de uma terapia de combinação com uma quantidade eficaz de um modulador de receptor de estrogênio seletivo para proteção uterina e da glândula 10 mamária contra câncer; ou o tratamento de vaginite atrófica e atrofia vaginal causada pela atrofia de uma ou ambas as camadas lâmina própria e camada muscular da vagina em mulheres na pós- menopausa, em que o medicamento é para administração de uma 15 quantidade eficaz de um modulador de receptor de estrogênio seletivo para proteção uterina e da glândula mamária contra câncer.

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