HRP20070169B1

HRP20070169B1 - Pojedinačni prekursori seksualnih steroida ili u kombinaciji sa selektivnim modulatorom estrogenskih receptora i/ili s estrogenima i/ili inhibitorima tipa 5 cgmp fosfodiesteraze za prevenciju ili tretiranje vaginalne suhoće i seksualne disfunkcije kod žena u postmenopauzi

Info

Publication number: HRP20070169B1
Application number: HRP20070169AA
Authority: HR
Inventors: Louise Berger; Mohamed El-Alfy; Fernand Labrie
Original assignee: Endorecherche, Inc., a corporation of Canada
Priority date: 2004-10-20
Filing date: 2007-04-20
Publication date: 2020-07-10
Also published as: CA2749235C; UA93985C2; EP1802312A4; CN106038572A; JP2012162579A; TNSN07147A1; HRP20070169A2; MX2007004830A; JP5653965B2; CA2584524A1; EP1802312B1; ZA200703198B; JP2012162578A; JP2008516995A; DK1802312T3; KR20070067235A; GEP20105066B; IL182633A0; EA014878B1; CN101106999B

Abstract

Opisane su nove metode za tretiranje ili smanjenje vjerojatnosti pojave vaginalnih disfunkcija, konkretno vaginalne suhoće i dispareunije, što dovodi do seksualne disfunkcije i slabe seksualne želje i sposobnosti, u osjetljivih toplokrvnih životinja i ljudi, koje uključuju primjenu spolnog steroidnog prekursora. Zatim, specifično je opisana primjena estrogenskog ili selektivnog estrogenskog receptorskog modulatora, konkretno onih koji su odabrani iz skupa kojega sačinjavaju Raloxifene, Arzoxifene, Tamoxifen, Droloxifene, Toremifene, Iodoxifene, GW 5638, TSE-424, ERA-923 i lazofoksifen, te konkretnije spojevi koji su opće formule:<BR/><IMAGE NAME="20070169_01" TYPE="jpg" CENTER=TRUE/><BR/>\nza medicinski tretman i/ili inhibiranje razvoja nekih od gore navedenih bolesti. Također su opisane farmaceutske smjese za unošenje aktivnih sastojaka i pribori koji su korisni za ovaj izum.\n

Description

Područje izuma

Izum je iz područja farmakologije.

Izum se odnosi na metodu za tretiranje ili smanjenje vjerojatnosti pojave poteškoća u svezi s vaginalnim slojem lamina propria ili slojem muscularis, korištenjem seksualnih steroidnih prekursora - samih ili u obliku nove kombinacijske terapije koja djeluje na toplokrvne životinje, te ljude.

Stanje tehnike

Konkretno, kombinacije uključuju primjenu selektivnog estrogenskog receptorskog modulatora (SERM) i povećanje razine prekursora spolnih steroida u bolesnika, pri čemu su navedeni prekursori odabrani iz skupa kojega sečinjavaju dehidroepiandrosteron (DHEA), dehidroepiandrosteron sulfat (DHEA-S) i androst-5-en-3β,17β-diol (5-diol). Estrogeni se mogu također primijeniti da bi se poništili potencijalni učinci nekih SERM-ova na 'valunge' i druge simptome menopauze. cGMP fosfodiesterazni inhibitor tipa 5 može se također primijeniti da se poboljša seksualna aktivnost. Izum se također odnosi na pribore i farmaceutske smjese koji omogućuju primjenu gore navedene kombinacije.

U američkom patentu br. 5,843, 932, navedeno je izvješće o vaginalnoj atrofiji jedan, tri i šest mjeseci nakon tretiranja s DHEA uz dozu od 30 mg dva puta dnevno u otopini 50% etanol-50% propilen glikol na površinu 2 cm2 kože na leđima u ovarijektomiziranih štakora. Histopatološko ispitivanje pokazuje proliferaciju i mucificiranje (pretvaranje u sluz) vaginalnog epitela te obrnuti tijek vaginalne mukozne atrofije u štakora koji su tretirani s DHEA.

Ispitivanje je provedeno u štakora pri čemu je DHEA primijenjen na kožu leđa tijekom 1, 3 i 6 mjeseci i ispitan je učinak samo na vaginalni epitel (Sourla et al., 1998, J. Steroid Biochem Mol Biol., 66(3): 137-149) a ne na druga dva sloja, dakle na lamina propria i muscularis. Uočeno je da je DHEA oko 10 puta učinkovitiji na vaginalni epitel ako se primjenjuje lokalno na kožu na mjestu koje je udaljeno od vagine, što dakle zahtijeva sistemsku apsorpciju da bi se iskazalo djelovanje.

U prethodnom istraživanju o utjecaju DHEA primijenjenom na kožu u žena u postmenopauzi tijekom 12 mjeseci u 10% DHEA kremi, ispitana je samo estrogenska aktivnost DHEA (Labrie et al., 1997, J. Clin. Endocrinol. Metab., 82: 3498-3505). Navedeno je (str. 3500) “Vaginalna citologija je ispitana kao specifičan parametar estrogenskog djelovanja DHEA”. To je posljedica metode ispitivanja, dakle radi se o vaginalnom razmazu koji je ograničen na površinu i stanice epitela koje se lako mogu ukloniti.

Ovaj izum opisuje djelovanje DHEA i drugih spojeva na tri sloja vagine, dotično na muscularis, lamina propria i epitel, pri čemu se postiže blagotvorno djelovanje na sva tri sloja. Blagotvorno djelovanje DHEA na slojeve lamina propria i muscularis, pretpostavlja se, od velikog je značaja za pozitivno djelovanje inhibitora tipa 5 cGMP fosfo-diesteraze, kao što je viagra i drugi spojevi prostaglandina E1.

Stanje tehnike

Suhoća vagine pogađa oko 50% žena u postmenopauzi starosti od 50 do 60 godina i 72% žena nakon 70 godina (Rossin-Amar, 2000, Gynecol Obstet Fertil, 28(3): 245-249). Od navedenih žena, oko 80% njih doživljava urogenitalne poremećaje, posebice vaginitis i dispareuniju (Pandit and Ouslander, 1997, Am J Med Sci, 314(4): 228-31). Budući da se vjeruje da se ove poteškoće mogu povezati s gubitkom spolnih steroida, u menopauzi valja razmotriti lokalnu hormonalnu nadomjesnu terapiju. Nedavno je nađeno da žene u postmenopauzi nisu lišene svih estrogena jajnika već njima također kronično izostaju androgeni koji potječu od periferne intrakrine transformacije dehidroepiandrosterona (DHEA) u androgene i estrogene (Labrie et al, 1991, Mol Cell Endocrinol, 78: C113-C118; Labrie et al, 1995, Ann NY Acad Sci, 774:16-28; Labrie et al., 2003, End Rev, 24(2): 152-182). Ustvari, serumski DHEA i DHEA-S progresivno se smanjuju od dobi 30 do 40 godina (Labrie et al., 2003, End Rev, 24(2): 152-182; Orentreich et al., 1984, J Clin Endocrinol Metab, 59: 551-555; Labrie et al., 1997, J Clin Endocrinol Metab, 82: 2396-2402). Niz istraživanja ukazuje da je niska razina DHEA i DHEA-S povezana s nizom bolesti i smrtnih slučajeva koji su ovisni o dobi (Labrie et al., 1997, J. Clin. Endocrinol. Metab., 82: 3498-3505; Helzlsouer et al., 1992, Cancer Res, 52(1): 1-4; Szathmari et al., 1994, Osteoporos Int, 4(2): 84-88; Thoman and Weigle, 1989, Adv Immununol, 46: 221-261; Barrett-Connor et al., 1999, J Reprod Med, 44(12): 1012-1020; Barrett-Connor et al., 1999, J Am Geriatr Soc, 47(6): 685-691).

Učinkoviti pristup da se izbjegne suhoća vagine i drugi simptomi menopauze je korištenje hormonske nadomjesne terapije (HRT) (Greendale and Judd, 1993, J Am Geriatr Soc, 41(4): 426-436; Studd et al., 1980, Pasetto, Paleotti and Ambrus Eds, MT Press, Lancaster, p: 127-139). Novija klinička istraživanja, međutim, pokazuju da kombiniranje estrogena i progestina povećaja incidenciju karcinoma dojke s potencijalno negativnim utjecajem na kardiovaskularne pojave (Colditz et al, 1995, N Engl J Med, 332: 1589-1593; Ross et al., 2000, J Natl Cancer Inst, 92(4): 328-332; Rossouw et al, 2002, JAMA, 288(3): 321-333). Povećano je zanimanje za kombiniranu estrogen-androgen nadomjesnu terapiju (Rosenberg et al., 1997, J Reprod Med, 42(7): 394-404; Burd et al., 2001, Curr Women Health Rep,l(3):202-205), premda je upotreba estrogenske komponente ograničena mogućim komplikacijama koje su prije navedene. Temeljem novijeg napretka u razumijevanju fiziologije humanih spolnih sterioda, posebice u žena u postmenopauzi (Labrie et al, 1991, Mol Cell Endocrinol, 78: C113-C118; Labrie et aL, 2003, End Rev, 24(2): 152-182), upotreba DHEA postaje mogućnost da se omogući ženama u postmenopauzi odgovarajuće razine androgena i estrogena koji su sintetizirani u specifičnim tkivima pomoću intrakrinog mehanizma, bez sistemskih učinaka (Labrie et al, 1997, J. Clin. Endocrinol. Metab., 82: 3498-3505: 16-28; Labrie et al., 2003, End Rev, 24(2): 152-182; Labrie, 2001, Ref Gyn Obstet, 8: 317-322; Lasco et al., 2002, 145: 457-461). Obnavljanju androgen-osjetljivih elemenata vaginalne funkcije također pomaže djelovanje cGMP fosfodiesteraznog inhibitora tipa 5 ili prostaglandina E1.

Selektivni estrogenski receptorski modulator (SERM) Acolbifene (EM-652) je benzopiranski derivat koji je izvorno razvijen za sprječavanje i tretiranje karcinoma dojke (Gauthier et al., 1997, J Med Chem, 40: 2117-2122). Acolbifene je spoj koji ima najveći afinitet prema ER od svih poznatih spojeva (Gauthier et al., 1997, J Med Chem, 40: 2117-2122; Labrie et al., 1999, J Steroid Biochem Mol Biol, 69 (1-6): 51-84; Tremblay et al, 1997, Mol. Endocrinol., 11: 353-365) te iskazuje aktivnost i prema ERα i ERβ (Tremblay et al., 1998, Endocrinology, 139: 111-118). Ovaj spoj pokazuje čistu i vrlo jaku antiestrogenu aktivnost u mliječnoj žlijezdi i endometriju uz smanjenje serumskog kolesterola i triglicerida te sprječava koštanu eroziju, bar u štakora (Labrie et al., 1999, J Steroid Biochem Mol Biol, 69 (1-6): 51-84). Štoviše, pokazalo se da primjena DHEA, ne vrši i ne interferira, već također pokazuje dodatni inhibitorski učinak s čistim antistrogenom Acolbifene-om na rast humanog tumora dojke u golih miševa (Dauvois et al., 1991, Cancer Res, 51: 3131-3135; Luo et al, 1997, Endocrinology, 138: 4435-4444). Kombinirano tretiranje DHEA i Acolbifena predloženo je kao blagotvorna kemijska preventiva i terapijski pristup karcinomu dojke (Labrie, 2001, Ref Gynecol Obstet, 8: 317-322). Zapravo, inhibitorski učinak DHEA na rast ksenografta humanog karcinoma dojke u bijelih miševa potkrepljuje njegovu upotrebu kao hormonske zamjenske terapije (Dauvois et al., 1991, Cancer Res, 51: 3131-3135; Couillard et al., 1998, J Natl Cancer Inst, 90: 772-778).

U patentu WO 99/63974 opisana je medicinska upotreba selektivnih estrogenskih receptorskih modulatora u kombinaciji sa spolnim steroidnim prekursorima.

Sažetak izuma

Sukladno tome, cilj ovog izuma je definirati učinkovite metode za tretranje vaginalnih problema, konkretno vaginalne suhoće, dispareunije i seksualne disfunkcije što može dovesti do smanjenja seksualne želje i aktivnosti uz minimiziranje nepoželjnih usputnih učinaka.

Sljedeći cilj je definiranje metoda za smanjenje rizika pojave gore navedenih problema.

U jednoj realizaciji, izum se odnosi na metodu za tretiranje ili smanjenje rizika pojave suhoće vagine što obuhvaća povećanje razine spolnih steroidnih prekursora koji su odabrani iz skupa kojega sačinjavaju dehidroepiandrosteron (DHEA), dehidroepiandrosteron-sulfat (DHEA-S) i androst-5-en-3β,17β-diol (5-diol), u subjekta ili bolesnika kojemu je potreban takav tretman ili navedeni steroidni precursor, te nadalje obuhvaća primjenu navedenom bolesniku terapijski učinkovite količine estrogenskog receptorskog modulatora (SERM) kao dio kombinacijske terapije.

U sljedećoj realizaciji, ovaj izum obuhvaća dodatnu primjenu estrogena da se ponište učinci SERM-ova na ‘valunge’ i druge simptome menopauze.

U sljedećoj realizaciji, ovaj izum obuhvaća dodatnu primjenu cGMP fosfodiesteraznog inhibitora tipa 5 ili prostaglandina E1 da se poboljša seksualna aktivnost.

Kako se ovdje rabi, selektivni estrogenski receptorski modulator (SERM) je spoj koji bilo izravno ili putem aktivnog metabolita djeluje kao estrogenski receptorski antagonist (“antiestrogen”) u tkivu dojke, pri čemu ipak proizvodi estrogenski ili estrogenu sličan učinak na koštano tkivo i na razinu serumskog kolesterola (tj. smanjenje serumskog kolesterola). Nesteroidni spojevi koji djeluju kao estrogenski receptorski antagonisti in vitro ili u tkivu dojke čovjeka ili štakora (posebice ako spoj djeluje kao antiestrogen na stanice karcinoma dojke u čovjeka) vjerojatno djeluju kao SERM. Obrnuto, steroidni antiestrogeni nastoje ne djelovati kao SERM-ovi jer oni ne nastoje pokazati bilo kakav blagotvoran učinak na serumski kolesterol. Nesteroidni antiestrogeni koje smo ispitali i za koje smo našli da djeluju kao SERM obuhvaćaju EM-800, EM-01538, Raloxifene, Tamoxifen, Droloxifene, Toremifene, Idoxifene, TSE-424, ERA-923, Lasoxifene (CP 336156), Arzoxifene (LY 353 381) i GW-5638. Ispitali smo steroidni antiestrogen ICI 182,780 i našli da ne djeluje kao SERM. SERM-ovi, sukladno ovom izumu, mogu se primijeniti u identičnoj dozi kao što je poznato u tehnici kada se ovi spojevi koriste kao antiestrogeni.

Bez namjere da se vežemo za teoriju, vjeruje se da SERM-ovi, od kojih većina poželjno ima dva aromatska prstena koji su povezani jednim ili s dva atoma ugljika, očekivano stupaju u interakciju s estrogenskim receptorom zbog gore navedenog dijela molecule kojega receptor najbolje prepoznaje. Poželjni SERM-ovi imaju bočne lance koji mogu selektivno izazvati antagonistička svojstva u tkivu dojke pri čemu ne iskazuju značajna antagonistička svojstva u drugim tkivima. Dakle, SERM-ovi mogu poželjno djelovati kao antiestrogeni u dojci uz iznenađujuće i poželjno funkcioniranje kao estrogeni (ili djelovanje poput estrogena) u kosti i na krvne komponente (koncentracije lipida i/ili kolesterola). Povoljan učinak na kolesterol i/ili lipide potencijalno se prevodi u blagotvoran učinak protiv ateroskleroze za koju se zna da je povezana s neodgovarajućim razinama kolesterola i lipida.

U sljedećoj realizaciji, ovaj izum obuhvaća metodu, farmaceutsku smjesu i pribor pri čemu selektivni estrogenski receptorski modulator ima molekulsku formula sljedećih svojstava:

a) dva aromatska prstena odvojena su s 1 ili 2 atoma ugljika, a oba aromatska prstena su bilo nesupstituirana ili supstituirana hidroksilnom skupinom ili skupinom koja je prevedena in vivo u hidroksil;

b) bočni lanac posjeduje aromatski prsten i funkcionalnu skupinu tercijarnog amina ili njegovu sol.

Poželjno je da bočni lanac bude odabran iz skupa kojega sačinjavaju:

[image]

i[image]

Također je poželjno da oba aromatska prstena oba budu fenil i da bočni lanac sadrži vrstu koja je odabrana iz skupa kojega sačinjavaju metin, metilen, -CO, -O- i -S-, aromatski prsten i funkcionalnu skupinu tercijarnog amina ili njihovu sol.

U sljedećoj realizaciji, selektivni estrogenski receptorski modulator odabran je iz skupa kojega sačinjavaju benzotiofenski derivat, trifeniletilenski derivat, indolski derivat, benzopiranski derivat, 5,6,7,8-tetrahidronaftalenski i centkromanski derivat.

U jednoj realizaciji, poželjno je da je selektivni estrogenski receptorski modulator benzotiofenski derivat sljedeće formule:

[image]

gdje su R1 i R2 neovisno odabrani iz skupa kojega sačinjavaju: vodik, hidroksil, te vrsta koja je prevedena in vivo u hidroksil;

gdje su R3 i R4 bilo neovisno odabrani iz skupa kojega sačinjavaju: C1-C4 alkil ili gdje su R3, R4 i dušik za kojega su vezani, zajedno bilo koja struktura koja je odabrana iz skupa kojega sačinjavaju pirolidino, dimetil-1-pirolidino, metil-1-pirolidinil, piperidino, heksametilenimino i morfolino;

gdje su A odabran je iz skupa kojega sačinjavaju -CO-, -CHOH i -CH2-;

gdje su B odabran je iz skupa kojega sačinjavaju fenilen, piridiliden i -cikloC4H2N2-.

Konkretno, selektivni estrogenski receptorski modulator odabran je iz skupa kojega sačinjavaju of Raloxifene, Arzoxifene (LY 353381) i LY 335563.

U sljedećoj realizaciji, poželjno je da je selektivni estrogenski receptorski modulator trifeniletilenski derivatni spoj sljedeće formule:

[image]

gdje su D je -OCH2CH2N(R3)R4 ili -CH=CH-COOH (R3 i R4 bilo neovisno odabrani iz skupa kojega sačinjavaju: C1-C4 alkil ili gdje su R3, R4 i dušik za kojega su vezani, zajedno bilo koja struktura koja je odabrana iz skupa kojega sačinjavaju pirolidino, dimetil-1-pirolidino, metil-1-pirolidinil, piperidino, heksametilenimino i morfolino);

gdje su E i K neovisno vodik ili hidroksil;

gdje je J vodik ili halogen. Konkretno, selektivni estrogenski receptorski modulator je Tamoxifen, OH-tamoksifen, Droloxifene, Toremifene, Iodoxifene i GW 5638.

U sljedećoj realizaciji, poželjno je da je selektivni estrogenski receptorski modulator derivatni spoj indola sljedeće formule:

[image]

gdje je D odabran iz skupa kojega sačinjavaju -OCH2CH2N(R7)R8, -CH=CH-CON(R7)R8, -CC-(CH2)n-N(R7)R8 (R7 i R8 su bilo neovisno odabrani iz skupa kojega sačinjavaju C1-C6 alkil, ili R7, R8 i atom dušika za kojega su vezani zajedno sačinjavaju prstenastu strukturu koja je odabrana iz skupa kojega sačinjavaju pirolidino, dimetil-1-pirolidino, metil-1-pirolidinil, piperidino, heksametilenimino, morfolino, prsten);

gdje je X odabran iz skupa kojega sačinjavaju: vodik i C1-C6 alkil;

gdje su R1, R2 R3, R4, R5 i R6 neovisno odabrani iz skupa kojega sačinjavaju: vodik, hidroksil, C1-C6 alkil, te specija koja je prevedena in vivo u hidroksil.

Konkretno, selektivni estrogenski receptorski modulator su TSE-424 i ERA-923.

U sljedećoj realizaciji, poželjno je da selektivni estrogenski receptorski modulator bude spoj sljedeće formule:

[image]

gdje su R1 i R2 neovisno odabrani iz skupa kojega sačinjavaju: vodik, hidroksil, te specija koja se prevodi in vivo u hidroksil;

gdje su R5 i R6 neovisno vodik ili C1-C6 alkil;

gdje je D -OCH2CH2N(R3)R4 (R3 i R4 su bilo neovisno odabrani iz skupa kojega sačinjavaju: C1-C4 alkil ili gdje su R3, R4 i dušik za kojega su vezani, zajedno bilo koja struktura koja je odabrana iz skupa kojega sačinjavaju pirolidino, dimetil-1-pirolidino, metil-1-pirolidinil, piperidino, heksametilenimino i morfolino).

gdje je X odabran iz skupa kojega sačinjavaju -O- i -CH2-.

Konkretno, spoj je odabran iz skupa kojega sačinjavaju: (-)-cis-(5R,6S)-6-fenil-5-[4-(2-pirolidin-1-iletoksi)fenil]-5,6,7,8-tetrahidronaftalen-2-ol, D-(-)-tartratna sol (lazofoksifen) i (3,4-trans-2,2-dimetil-3-fenil-4-[4-(2-(2-(pirolidin-1-il)etoksi)fenil]-7-metoksikroman).

U sljedećoj realizaciji, poželjno je da selektivni estrogenski receptorski modulator ima sljedeću formulu:

[image]

gdje su R1 i R2 neovisno vodik, hidroksil ili specija koja se prevodi u hidroksil in vivo;

gdje je Z dvovalentna specija za zatvaranje, konkretno, Z odabran je iz skupa kojega sačinjavaju of -O-, -NH-, -S- i -CH2-;

gdje je R100 dvovalentna specija koja razdvaja L od B-prstena za 4-10 odjeljujućih atoma;

gdje je L dvovalentna ili trovalentna specija koja je odabrana iz skupa -SO-, -CON-, -N< i -SON<;

gdje je G1 odabran iz skupa kojega sačinjavaju vodik, C1 do C5 ugljikovodik ili dvovalentna specija koja povezuje G2 i L tako da nastaje 5- do 7-člani heterociklički prsten, te halogeni ili nezasićeni derivati gore navedenog.

gdje G2 bilo izostaje ili je odabran iz skupa kojega sačinjavaju vodik, C1 do C5 ugljikovodik ili dvovalentna specija koja povezuje G1 i L tako da nastaje 5- do 7-člani heterociklički prsten, te halogeni ili nezasićeni derivati gore navedenog;

gdje je G3 odabran iz skupa kojega sačinjavaju vodik, metil i etil.

Konkretnije, poželjni su benzopiranski derivati sljedeće opće strukture:

[image]

gdje je D -OCH2CH2N(R3)R4 (R3 id R4 su bilo neovisno odabrani iz skupa kojega sačinjavaju C1-C4 alkil, ili R3, R4 i atom dušika za kojega su vezani zajedno sačinjavaju prstenastu strukturu koja je odabrana iz skupa kojega sačinjavaju pirolidino, dimetil-1-pirolidino, metil-1-pirolidinil, piperidino, heksametilen-imino, morfolino, prsten).

gdje su R1 i R2 neovisno odabrani iz skupa kojega sačinjavaju: vodik, hidroksil, te specija koja se prevodi in vivo u hidroksil.

Također je poželjno da benzopiranski derivati budu optički aktivni spojevi koji imaju apsolutnu konfiguraciju S na ugljiku 2 ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, pri čemu navednei spojevi imaju molekulsku strukturu:

[image]

gdje su R1 i R2 neovisno odabrani iz skupa kojega sačinjavaju hidroksil i specija koja se prevodi in vivo u hidroksil;

gdje je R3 specija koja je odabrana iz skupa kojega sačinjavaju zasićeni, nezasićeni ili supstituirani pirolidinil, zasićeni, nezasićeni ili supstituirani piperidino, zasićeni, nezasićeni ili supstituirani piperidinil, zasićeni, nezasićeni ili supstituirani morfolino, prstenasta specija koja sadrži dušik, te NRaRb (Ra i Rb su neovisno vodik, lančasti ili razgranati C1-C6 alkil, lančasti ili razgranati C2-C6 alkenil, te lančasti ili razgranati C2-C6 alkinil).

U jednoj realizaciji, benzopiranski derivat je sol kiseline koja je odabrana iz skupa kojega sačinjavaju octena kiselina, adipinska kiselina benzenesulfonska kiselina, benzojeva kiselina, kamforsulfonska kiselina, limunska kiselina, fumarna kiselina, jodovodična kiselina, bromovodična kiselina, klorovodična kiselina, hidroklortiazidna kiselina, hidroksi-naftolna kiselina, mliječna kiselina, jabučna kiselina, metansulfonska kiselina, metilsumporna kiselina, 1,5-naftalendisulfonska kiselina, dušična kiselina, palmitinska kiselina, trimetiloctena kiselina, fosforna kiselina, propionska kiselina, jantarna kiselina, sumporna kiselina, vinska kiselina, tereftalna kiselina; p-toluensulfonska kiselina i valerijanska kiselina.

Poželjni selektivni estrogenski receptorski modulatori su:

[image]

Raloxifene, Arzoxifene, Tamoxifen, Droloxifene, Toremifene, Iodoxifene, GW 5638, TSE-424, ERA-923 i lazofoksifen.

Kratak opis crteža

Slika 1 prikazuje podjelu duž uzdužne osi vagine štakora u sedam poprečnih segmenata, od velikih usana (ostium) (segment 1) do razine grlića maternice (cervix) (segment 7) (portio vaginalis uteri).

Slika 2 prikazuje histomorfologiju vaginalnog epitela segmenta 5 u 9 skupina štakora. Stupci u (J), 40 µm.

(A) Kao reprezentant estrogenog učinka, slojeviti ljuskavi epitel u štakora u estrusu sastoji se od 4 glavna sloja: jedan stanični sloj stratum basale (b), 6 do 7 staničnih slojeva stratum spinosum (s) te stratum granulosum od 5 do 6 slojeva (g) prekriven sa stratum corneum (c) koji se sastoji od gusto pakiranih pločastih rožnatih stanica.

(B) Štakori u proestrusu koji su pod djelovanjem estrogena-progesterona, korišteni su za ilustraciju mucifikacije. U većini segmenata 2 do 7, jedan bazalni stanični sloj (b) prekriven je s 5 do 6 staničnih slojeva stratum spinosum (s), dok se stratum mucifikacija (m) sastoji od 3-4 sloja mukoznih stanica.

(C) U OVX kontrola, bazalni stanični sloj (b) prekriven je slojem atrofnih kuboidnih stanica (a).

(D) Vaginalni epitel OVX štakora koji su tretirani dnevnom oralnom dozom Acolbifene-a, (2.5 mg/kg) pokazuje atrofiju, ali s vanjskim slojem slabo stupčastih mukoznih stanica (m) koje su prekrivaju bazalni stanični sloj (b).

(E) Vaginalni epitel OVX štakora koji su tretirani s dnevnom oralnom dozom Premarina (0.5 mg/kg). Atrofija koja je izazvana s OVX zamijenjena je estrogenskom slikom koja se može usporediti s onom u estrusu.

(F) U OVX životinja koje su primile kombinaciju Premarin + Acolbifene, dominira atrofija s morfologijom koja je slična onoj životinja koje su tretirane s Acolbifene-om, premda su uočene veće mukozne stanice.

(G) Nakon tretiranja OVX životinja jednom dnevno potkožnom primjenom DHEA (80 mg/kg) na površini 2×2 cm kože leđa, uočen je hipertrofni epitel koji je načinjen od 3-5 slojeva mukoznih stanica (m) koji je položen na bazalni sloj (b). Nekoliko invaginacija karakterizira ovaj epitel (strjelice).

(H) U većini područja vaginalnog epitela životinja koje su tretirane kombinacijom DHEA + Acolbifene, sloj mukoznih stanica (m) počiva na bazalnom staničnom sloju (b), dok u nekim područjima, mnogi slojevi mukoznih stanica prekrivaju bazalni stanični sloj. Nekoliko invaginacija karakterizira ovaj epitel (strjelice).

(I) Tretiranje smjesom DHEA + Premarin rezultira miješanim epitelom koji je sastavljen od tri do sedam staničnih slojeva – debeli slojeviti ljuskasti epitel koji je prekriven s 3-5 slojeva mukoznih stanica (m) u 3 životinje. U 2 životinje, područja slojevitog ljuskastog epitela bila su dominantna (umetnuto). Umetnuti stupci, 30 µm.

(J) Kada se kombiniraju DHEA, Premarin i Acolbifene, epitel je bio sličan onom za skupinu DHEA + Acolbifene.

Slika 3 prikazuje vaginalnu sluznicu OVX životinja koja pokazuje, u (A), uznapredovale upalne promjene koje su karakterizirane žarišnom leukocitnom infiltracijom s intraepitelnim mikroapscesom (M) te, u (B), žarišnom erozijom (E) koja je karakterizirana smanjenom debljinom epitela i ulceracijom (U) koja se iskazuje kao potpuni izostanak epitela.

Slika 4. Da se ilustrira estrogenu sličan učinak Acolbifena na vaginalni epitel segmenta 1 (vanjski otvor), načinjene su usporedbe s relevantnim skupinama. U instaktnih štakora u estrusu (A) i u Premarinom tretiranih (D) životinja, epitel je debeo 10-15 slojeva i keratiniziran. U OVX kontrola (B), debljina epitela smanjena je na 4-6 slojeva i općenito nije keratiniziran (vidi odsutnost stratum granulosum) dok u životinja tretiranih Acolbifene-om (C), debljina se vratila na 9-11 slojeva i epitel je keratiniziran.

Slika 5 prikazuje debljinu (µm) triju vaginalnih odjeljaka na razini petog segmenta vagine štakora: a) epitel, b) lamina propria, c) muscularis i d) ukupna debljina, nakon 36 tjedana tretiranja OVX životinja s DHEA, Premarinom i Acolbifene-om, samih ili u kombinaciji. Intaktne životinje u estrusu i proestrusu dodane su kao referentne kontrole. Skupine koje dijele isto slovo nisu statistički različite ako je p < 0.05.

Slika 6 prikazuje kompaktnost kolagenskih niti sloja lamina propria u segmentu 5 kao slabu (A), umjerenu (B) ili visoku (C).

Slika 7 prikazuje mikrofotografije triju vaginalnih odjeljaka: (E) epitel, (L) lamina propria i (M) muscularis, na razini petog segmenta vagine štakora s naglaskom na relativnoj debljini sloja muscularis u različitim skupinama. Naznačeno je odvajanje triju vaginalnih slojeva stijenke stupcima da se najbolje procijeni raspodjela debljine između različitih skupina. A) intaktna, B) OVX, te OVX tretiran s: C) Acolbifene, D) Premarin, E) Premarin + Acolbifene, F) DHEA, G) DHEA + Acolbifene, H) DHEA + Premarin, I) DHEA + Premarin + Acolbifene.

Slika 8 prikazuje težinu vagine mjerenjem 36 tjedana nakon OVX i tretiranja OVX životinja s Acolbifene-om, Premarinom i DHEA, samih ili u kombinaciji. Intaktne životinje su dodane kao kontrole.

Slika 9 prikazuje imunohistokemijsku lokalizaciju AR, ERoc i PR u (E) epitelu, (L) lamina propria i (M) muscularisu na razini petog vaginalnog segmenta različitih skupina. Stupci naznačuju odvajanje između triju vaginalnih odjeljaka.

Slike 10 i 11 prikazuju usporedbu između različitih SERM-ova: vaginalna epitelna morfologija, u štakora.

Slika 12 prikazuje sliku mikroskopske fotografije da se prikaže pozicioniranje 8 vaginalnih segmenata (cijeli gornji red i dio desnog donjeg kuta), nakon čega slijede 4 materična segmenta (1 segment grlića maternice i 3 segmenta dviju materičnih rogova - 2 sekcije po rogu) u sekvenciji koja odgovara njihovu izvornom anatomskom položaju. Segment 8 uključuju bočni vaginalni prijevoj koji je u blizini početka grlića maternice.

Slika 13 prikazuje učinak za intaktne štakore:

U estrusu (lijevi stupac), vaginalni epitel je 12 -18 slojeva debeo u segmentu 4 i 12-15 slojeva debeo u segmentu 6.

U metestrusu (desni stupac), vaginalni epitel prikazuje 6 do 10 staničnih slojeva u segmentu 4, te 5 do 7 slojeva u segmentu 6.

Slika 14 prikazuje učinak u ovarijektomiziranih nedirnutih štakora. U segmentu 4, vagina je pokrivena ljuskavim slojevitim epitelom od 2 do 6 staničnih slojeva. U segmentu 6, uočena je potpuna atrofija, s ravna 2 do 3 stanična sloja. Mogu se vidjeti rijetka žarišta malenih valjkastih mukoznih stanica cijelom vaginom.

Slika 15 prikazuje učinak placebo/supozitorija. U usporedbi s OVX nedirnutom skupinom, vaginalni ljuskavi slojeviti epitel placebo skupine je nešto deblji, sa segmentom 4 koji ima 4 do 8 staničnih slojeva. U segmentu 6, uočena je identična morfologija kao ona za OVX nedirnutu skupinu, s 2-3 epitelna stanična sloja. Žarišta malenih valjkastih mukoznih stanica mogu se naći cijelom vaginom, nešto više u usporedbi s OVX nedirnutim životinjama.

Slika 16 prikazuje učinak DHEA 0.33 mg /supozitorij. U segmentu 4, vaginalni epitel je slojevito ljuskast s 3 do 7 staničnih slojeva. Oko 20 do 60% vaginalnog pokrova sastoji se od dobro uređenih mukoznih stanica u alternaciji s 15 do 50% hipertrofiranih mukoznih stanica, koje prekrivaju jedan ili više ljuskavih epitelnih slojeva, te s područjima bez sluzi. U segmentu 6, epitelna debljina je smanjena gotovo do debljine koja je nađena u OVX nedirnutih životinja: 2-5 staničnih slojeva prekriveno je valjkastim mukoznim stanicama. Uočena je velika varijacija u pojavnosti mukoznih stanica. Ove stanice pokrivaju od 5 do 75% vaginalne površine, u alternaciji s površinama bez sluzi.

Slika 17 prikazuje učinak DHEA 0.66 mg /supozitorij. U segmentu 4, slojeviti ljuskavi epitel je debljine 3 do 6 stanica. Oko 5 do 20% vaginalnog pokrova sastoji se od dobro uređenih mukoznih stanica u alternaciji s 10 do 75% hipertrofnih mukoznih stanica, koje prekrivaju jedan ili više ljuskavih epitelnih slojeva. Ne-mukozna epitelna područja također su prisutna. U segmentu 6, epitelna debljina je smanjena i sastoji se od ljuskavog slojevitog epitela s 2 do 4 stanična sloja, koji je okružen slojem dobro uređenih mukoznih stanica. Mukozna područja variraju od 20 do 80% vaginalne površine, u alternaciji s ne-mukoznim područjima.

Slika 18 prikazuje učinak DHEA 1 mg /supozitorij. U segmentu 4, slojeviti ljuskavi epitel pokazuje 3 do 9 staničnih slojeva. Hipertrofne mukozne stanice prekrivaju 3 do 4 ljuskavih staničnih slojeva koji pokrivaju 50 do 70% vaginalne površine, dok dobro uređene mukozne stanične linije 5 do 30% vaginalne površine. Površine bez sluzi su raspoređene između sluznih stanica. U segmentu 6, epitelna debljina je također smanjena i sastoji se od 2 do 4 stanična sloja. Hipertrofne mukozne stanice prekrivaju 1 do 3 ljuskava stanična sloja koji pokrivaju oko 30 do 100% vaginalne površine dok dobro uređene mukozne stanice pokrivaju 0 do 70%. Također je uočeno nekoliko raspršenih ne-mukoznih površina.

Slika 19 je grafikon učinka na tjelesnu težinu 14-dnevnog tretmana s DHEA (supozitorij) primijenjenom intravaginalno u OVX štakora. Uspoređujući s placebo skupinom, tjelesna težina skupina kojima je dan DHEA uz doze 0.33 mg i 0.66 mg malo je smanjena, pri čemu je smanjenje izraženije u skupini od 1 mg.

Slika 20 je grafikon serumske koncentracije DHEA nakon intravaginalne primjene 0.33 mg, 0.66 mg ili 1 mg OVX štakorima. Površine pod krivuljom (AUC) sedam sati nakon DHEA tretmana bile su 32 ± 4 ng∙h/ml, 50 ± 7 ng.h/ml i 131 ± 23 ng∙h/ml pri čemu je DHEA primijenjen s dozama 0.33 mg, 0.66 mg, odnosno 1 mg.

Detaljni opis izuma s primjerima realizacije

Nakon prestanka izlučivanja estrogena iz jajnika u menopauzi, praktički svi androgeni i estrogeni su sintetizirani u perifernim tkivima intakrinim mehanizmima iz dehidroepiandrosterona (DHEA) nadbubrežnog porijekla. Ustvari, kada izostaju estrogeni jajnika, postepeno smanjenje serumskog DHEA vjerojatno ima značajnu ulogu u svezi s vaginalnom suhoćom, upalom, dispareunijom i seksualnom disfunkcijom što se dovodi u svezu s menopauzom. Da bi se procijenili specifični estrogeni i/ili androgeni učinci potencijalne nove zamjenske terapije koja bi trebala, između ostalih blagotvornih učinaka, sanirati vaginalnu suhoću, ispitali smo morfologiju vagine štakora osam mjeseci nakon ovarijektomije (OVX) i tretmana OVX životinja s DHEA, konjugiranim estrogenima (Premarin) i selektivnim estrogenim receptorskim modulatorom Acolbifene-om, koji su primijenjeni sami ili u kombinaciji. U intaktnih životinja u estrusu i u OVX štakora koji su tretirani Premarinom, tipična vaginalna estrogena slika je keratinizirani slojeviti ljuskavi epitel. OVX dovodi do opće atrofije koja je povezana s upalnim promjenama dok je Acolbifene smanjio upalnu incidenciju i povećao broj i veličinu mukoznih stanica u vaginalnom epitelu. Unutar raspona korištenih doza, Premarin je u potpunosti obrnuo OVX-izazvanu epitelnu atrofiju, dok je DHEA djelomično obrnuo atrofiju. Ustvari, vaginalni epitel OVX životinja tretiranih s DHEA postao je hiperplastičan s 3-5 slojeva stupčaste mukoze i stanicama poput čaše koje su tipične za androgeni učinak. Dodatak Premarina uz DHEA rezultira epitelom koji je deblji nego što je u intaktnih životinja. Štoviše, kompaktnost kolagenskih vlakana u sloju lamina propria povećana je djelovanjem DHEA. S druge strane, tretiranje samo s Acolbifenom pokazuje tendenciju povećanja debljine sloja lamina propria, što je doseglo intaktne vrijednosti kada je kombinirano s DHEA.

Nakon OVX, vaginalni mišićni sloj smanjio se za 46%, a učinak koji je bio 41% i 100% obrnut je pomoću DHEA, odnosno Premarinom. S druge strane, smanjenje 50% ukupne debljine vaginalne stijenke nakon OVX bilo je obrnuto za 42% i 93% pomoću DHEA, odnosno Premarina, dok je kombinacija DHEA i Acolbifena obrnula ukupnu debljinu vaginalne stijenke do vrijednosti koja se nije statistički značajno razlikovala od one u intaktnih kontrolnih životinja.

Immunohistokemija je pokazala snažno androgensko receptorsko (AR) obilježavanje u svim DHEA-tretiranim skupinama. S druge strane, estrogensko receptorsko alfa (ERα) i progesteronsko receptorsko (PR) obilježavanje nije bilo uočeno ni u jednoj Acolbifene-tretiranoj skupini.

Kao zaključak, tretiranje s DHEA ili kombinacijom DHEA i Acolbifena djelomično ili u cijelosti sprječava OVX-izazvane atrofične promjene koje se uočavaju u različitim slojevima vaginalne stijenke pomoću predominantnog androgenog učinka, što se iskazalo epitelnim mucificiranjem i AR doreguliranjem. Ovi podaci također pokazuju konkretno zanimljive učinke DHEA na tri sloja vaginalne stijenke, dakle na jako mucificirani epitel, povećanu kompaktnost kolagenih vlakana u sloju lamina propria kao i na povećanje debljine sloja muscularis. DHEA također pokazuje i androgene i estrogene učinke na vaginalnu sluznicu, čime se postiže fiziološkija zamjenska terapija. Premda svaki od ispitanih slojeva ima potencijalni povoljan učinak na vaginalnu funkciju, DHEA sam ili u kombinaciji mogao bi regulirati suhoću vagine i vratiti globalnu vaginalnu fiziologiju te pomoći korekciji seksualne disfunkcije koja je povezana s menopauzom. DHEA i druge komponente mogu se primijeniti lokalno ili sistemski.

Selektivni estrogenski receptorski modulator ovog izuma ima molekulsku formulu sljedećih svojstava: a) dva aromatska prstena koji su odvojeni 2 1 ili 2 atoma ugljika, a oba aromatska prstena su bilo nesupstituirana ili supstituirana hidroksilnim skupinama ili skupinom koja je prevedena in vivo u hidroksil; i b) bočni lanac ima aromatski prsten i funkcionalnu skupinu tercijarnog amina ili njihovu sol.

Jedan poželjan SERM ovog izuma je EM-800 koji je naveden u PCT/CA96/00097 (WO 96/26201) Molekulska struktura EM-800 je:

[image]

Sljedeći poželjni SERM ovog izuma je akolbifen (EM-1538, također nazvan EM-652.HCl), koji je opisan u patentu US 6,710,059 B1:

[image]

koji je hidrokloridna sol jakog antiestrogena EM-652. U usporedbi s EM-800, EM-1538 je sigurnija, jednostavnija i za sintezu lakša sol. Kada se primjenjuje bilo EM-800 ili EM-1538, vjeruje se da je rezultat isti aktivni spoj in vivo.

Sljedeći poželjni SERM je Lasoxifene (CP-336,156; (-)-cis-(5R,6S)-6-fenil-5-[4-(2-pirolidin-1-iletoksi)fenil]-5,6,7,8-tetrahidronaftalen-2-ol, D-(-)-tartratna sol) (raspoloživ od Pfizer Inc., USA).

Drugi poželjni SERM-ovi ovog izuma uključuju Tamoxifen ((Z)-2-[4-(l,2-difenil-1-butenil)]-N,N-dimetiletanamin) (raspoloživ od Zeneca, UK), Toremifene (raspoloživ od Orion-Farmos Pharmaceutica, Finland, ili Schering-Plough), Droloxifene i Raloxifene (Eli Lilly and Co., USA), Arzoxifene (LY 335563) i LY 353381 (Eli Lilly and Co., USA), Ospemifene (FC 1271) (raspoloživ od Orion-Farmos Pharmaceutica,, Finland), Iodoxifene (SmithKline Beecham, USA), Levormeloxifene (3,4-trans-2,2-dimetil-3-fenil-4-[4-(2-(2-(pirolidin-1-il)etoksi)fenil]-7-metoksikroman) (Novo Nordisk, A/S, Denmark) koji je opisan u Shalmi et al. WO 97/25034, WO 97/25035, WO 97/25037,WO 97/25038; i Korsgaard et al. WO 97/25036), GW-5638 (opisano u Willson et al., 1997, Endocrinol, 138(9): 3901-3911), SERM 3339 razvijen od Aventis (France) te indolni derivati (opisano od Miller et al. EP 0802183A1) i TSE-424 te ERA-923 razvijeno od Wyeth Ayers (USA) te opisano u JP10036347 (American home products corporation) te nesteroidni estrogenski derivati opisani u WO 97/32837.

Može se koristiti bilo koji SERM koji je preporučen od proizvođača. Odgovarajuće doziranje je poznato u tehnici. Sukladno ovom izumu, može se koristiti bilo koji drugi nesteroidni antiestrogen. Može se koristiti bilo koji spoj koji posjeduje aktivnost sličnu SERM-ovima (primjerice: Raloxifene).

SERMovi koji se primjenjuju sukladno ovom izumu se poželjno primjenjuju s dozom u rasponu između 0.01 do 10 mg/kg tjelesne težine dnevno (poželjno 0.05 do 1.0 mg/kg), s 10 mg dnevno, osobito 20 mg dnevno, u dvije jednako podijeljene doze što je poželjno za osobu prosječne tjelesne težine kada se primjenjujem oralno, ili s doziranjem u rasponu između 0.003 do 3.0 mg/kg tjelesne težine dnevno (poželjno 0.015 do 0.3 mg/ml), s 1.5 mg dnevno, osobito 3.0 mg dnevno, u dvije jednako podijeljene doze što je poželjno za osobu prosječne tjelesne težine kada se primjenjuje parenteralno (tj. intramuskularno, supkutano ili perkutano). Poželjno se SERM-ovi primjenjuju zajedno s farmaceutski prihvatljivim razrjeđivačem ili nosačem kao što je opisano niže.

Poželjni cGMP fosfodiesterazni inhibitori tipa 5 su Sildenafil koji je na tržištu pod imenom “Viagra” od Pfizer USA, Tadalafil koji je na tržištu pod imenom “Cialis” od Eli Lilly USA, vardenafil koji je na tržištu pod imenom “Levitra” od Bayer (Germany). Također je poželjan cGMP fosfodiesterazni inhibitor tipa 5 koji je trenutačno u razvoju: DA-8159 od Dong-A Pharm Tech (South Korean), EMR-62203 od Merck (Germany), TA-1790 od Tanabe Seiyaku (Japan), SCH-446132 od Schering-Plough (U.S.A.), te UK-371800 od Pfizer (U.S.A.).

Jedan poželjan prostaglandin je alprostadil koji se nalazi pod komercijalnim imenom Alprox-TD od NexMed (USA).

U odnosu na doze koje su ovdje preporučene, kliničar koji ih propisuje treba pratiti individualni odgovor pacijenta i sukladno tome uskladiti doziranje.

Primjeri učinkovitosti ovog izuma

Primjer 1

MATERIJAL I METODE

Životinje i tretmani

Korištene su deset do dvanaest tjedana stare ženke Sprague-Dawley štakora (Crl:CD®(SD)Br VAF/Plus™) (Charles River Laboratory, St-Constant, Canada) težine približno 220-270 g na početku eksperimenta. Životinje su aklimatizirane na uvjete okoline (temperatura: 22 ± 3°C; vlažnost: 50 ± 20%; ciklusi 12-h svjetlo-12-h mrak, uključivanje svjetla od 07:15 h) bar jedan tjedan prije početka eksperimenta. Životinje su u nastambe bile smještene pojedinačno i omogućen im se slobodan pristup do hrane i vode (Lab Diet 5002, Ralston Purina, St-Louis, MO). Eksperiment je proveden sukladno naputku CCAC Guide for Care and Use of Experimental Animals u nastambama za životinje koji je odobren od strane Canadian Council on Animal Care (CCAC) i udruge Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC).

Ukupno 126 ženki štakora podijeljeno je u 9 skupina po 14 životinja na sljedeći način: 1) intaktne kontrole; 2) ovarijektomizirane kontrole (OVX); 3) OVX + Acolbifene (2.5 mg/kg); 4) OVX + Premarin (0.5 mg/kg); 5) OVX + Premarin + Acolbifene; 6) OVX + DHEA (80 mg/kg); 7) OVX + DHEA + Acolbifene; 8) OVX + DHEA + Premarin; 9) OVX + DHEA + Acolbifene + Premarin. Prvog dana istraživanja, životinje u svim skupinama (osim u skupini jedan) su obostrano ovarijektomizirane (OVX) pod izofluranom izazvanom anestezijom. Premarin i Acolbifene primijenjeni su oralno (0.5 ml/štakor) kao suspenzije u 0.4% metilcelulozi dok je DHEA u 50% etanol-50% propilen glikolu (0.5 ml/štakor), lokalno primijenjen na izbrijano mjesto površine 2×2 cm kože leđa. Izbor doziranja za Premarin odgovara minimalnoj dozi koja je dovoljna da obrne OVX-izazvanu materičnu atrofiju, dok je Acolbifene primijenjen s dozom koja je dovoljna da izazove materičnu atrofiju koja je slična onoj OVX nakon primjene životinjama koje su tretirane Premarinom. Korištena doza DHEA dala je krvnu razinu DHEA od 70-100 nmol/L. Tretmani su započeti drugog dana istraživanja i spojevi su primijenjeni jednom dnevno tijekom 36 tjedana. Životinje koji su u intaktnoj skupini i u OVX kontrolnoj skupini primile su samo nosač.

Dvadeset i četiri sata nakon posljednjeg doziranja, životinje koje su bile natašte su žrtvovane pod anestezijom izofluranom eksangvinacijom abdominalne aorte (9 životinja po skupini) ili intrakardijalnom perfuzijom 10% neutralno puferiranog formalina (5 životinja po skupini). Vagine neperfudiranih životinja su sakupljene i izvagane, dok su vagine sakupljene od perfudiranih životinja označene crnilom na trbušnoj strani, te su zatim rezane kao što je opisano niže.

Histološki postupci

Cjelokupna vagina svake perfudirane životinje je naknadno obrađena u 10% neutralnom puferiranom formalinu. Svaka vagina je zatim podijeljena u sedam jednakih poprečnih segmenata kao što je prikazano na slici 1, rutinski je obrađena i sve su ureonjene u isti parafinski blok. U parafinskom bloku, sedam vaginalnih valjkastih segmenata je poredano u nizu koji odgovara njihovu izvornom anatomskom položaju te orijentirano okomito na površinu bloka, tako da je omogućeno rezanje segmenata u presjeku. Za svaku životinju, rezane su parafinaske sekcije debljine 4 µm i zatim su obojene hematoksilin-eozinom za morfološko ispitivanje.

Histomofometrija

Mjerenja različitih vaginalnih slojeva izvršeno je na petom segmentu (Slika l), koji je približno na pola puta između srednjeg područja i portio vaginalis uteri (segment 7). Za peti segment je utvrđeno da predstavlja reprezentativnu površinu epitela i dovoljnu debljinu glatkog mišića. Slike su snimljene s DC-330 3CCD kolor fotoaparatom (Dage-MTI, Michigan City, IN, USA) i kvantificirane pomoću Image-Pro Plus 3.0 programske podrške (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA). Prema tome, korištenjem ×5 objektiva (Leica Microsystems, Willowdale, Ont, Canada), 3 do 4 mjerenja debljine po sloju su načinjena za reprezentativne površine epitela i muscularisa, te za tri vaginalna sloja zajedno. Tako su izmjerene debljina vagine, debljina epitela i debljina muscularisa.

Debljina lamina propria dobivena je oduzimanjem debljine epitela i muscularisa od ukupne debljine vagine.

Imunohistokemija

Imunobojenje je izvršeno korištenjem Zymed SP pribora (San Francisco, CA). Parafinske sekcije (4 µm) su deparafinizirane u toluenu i rehidrirane etanolom. Endogena ektivnost peroksidaze uklonjena je preinkubiranjem s 3% H2O2 u metanolu tijekom 30 min. Primijenjena je mikrovalna tehnika korištenjem citratnog pufera (Tacha and Chen, 1994). Nakon hlađenja slajdova, nespecifično vezanje je blokirano korištenjem 10% kozjeg seruma tijekom 20 min. Sekcije su zatim inkubirane tijekom 1.5 h na sobnoj temperaturi s ERα (AB-1, Calbiochem, California), AR (N-20, Santa Cruz Biotechnology, California) ili PR (Ab-4, NeoMarkers, California) antitijelima, pri 1:200, 1:250, odnosno 1:250. Nakon ispiranja u PBS puferu, sekcije su inkubirane s biotiniliranim anti-kunić sekundarnim antitijelom tijekom 10 min i nakon toga sa streptavidin-peroksidazom tijekom daljnjih 10 min. Diaminobenzidin je korišten kao kromogen za vizualizaciju kompleksa biotin/streptavidin-peroksidaza, uz praćenje mikroskopom. Komplementarno bojanje (counterstaining) izvršeno je pomoću #2 Gillova hematoksilina tijekom 30 s. Za kontrole, izvršeno je imunoapsorbiranje sa suviškom peptida koji je korišten za povećanje antitijela ili supstitucija s neimunim IgG kunića. Semikvantitativna evaluacija broja i intenziteta imunobojenih jezgri je provedena kao što je navedeno u Tablici 2.

Tablica 1. Histološka evaluacija epitela, lamina propria i muscularis u vaginalnim segemntima sedam štakora.

[image]

E = epitelna morfologija: KS (keratinizirane slojevite ljuske), LHM (velike hipertrofirane mukozne stanice),

SCM (malene usklađene stupčaste ili kockaste mukozne stanice), MSM (miješane slojevite ljuske prevučene mukoznim stanicama),

A (atrofija: malene kockaste stanice).

Dvije različite kratice za dani segment označuju dvije različite slike i prva je ona dominantna.

L = debljina lamina propria: T (debeo). MT (umjereno debeo), t (tanak); kompaktnost kolagenih vlakana: H (visoka), M (umjerena), L (slaba);

M = debljina muscularisa: T (debeo), MT (umjereno debeo), t (tanak), s (vrlo tanak).

Tablica 2. Semikvantitativna evaluacija broja i intenziteta imunoobojenih jezgri za AR, ER alfa i PR za epitel, lamina propria and muscularis u petom segmentu vagine štakora.

[image]

- Androgenski receptor (AR), estrogenski receptor alfa (ERa), progesteronski receptor (PR), epitel (E), lamina propria (L), muscularis (M).

- Brojevi označuju semikvantitativnu evaluaciju obilježenih jezgara: 0=nema, 1=slabo, 2= umjereno, 3=jako.

- intenzitet obilježavanja je naznačen niže: slab: +, umjren: ++ i jak: +++

Statistička analiza

Podaci su prikazani kao prosjek ± SEM od 8-9 životinja po skupini za težinu vagine ili 5 životinja po skupini za određivanje debljine vaginalnog sloja. Statistička značajnost je određena sukladno testu višestrukog raspona Duncan-Kramera (Kramer, 1956, Biometrics, 12: 307-310).

REZULTATI

Morfologija i debljina različitih slojeva vagine štakora

Da bi se precizno i detaljno ispitala tri sloja stijenke vagine štakora, dakle epitel, lamina propria i muscularis, prvo je ispitano sedam slojeva koji su dobiveni duž uzdužne osi (Slika 1). Premda su među skupinama uočene značajne morfološke razlike, općenito – razlike su uniformne u svih životinja iste skupine i segmenti 2, 3, 4, 5, 6 i 7, pokazalo se, imaju sličnu morfologiju epitela. Kasnije će biti navedeno nekoliko uočenih izuzetaka. Segment 5 je dakle korišten da se prikaže učinak različitih tretmana na vaginalni epitel.

U OVX skupini, odustnost stimulacije jajnika dovodi do etrofije vaginalnog epitela što je svojstveno svim segmentima (Tablica 1 i Slika 2C) uz prisutnost malenih površina mukoznih stanica. Najvažnije, čest nalaz je bio umjerena do značajna upala s mnogo upalnih žarišta intraepitelnih mikropascesa (malena područja aglomeriranih leukocita unutar epitela). Ove promjene su često praćene žarišnom erozijom (zone gdje epitelni spoj djelomično iščezava) i ulceracijom (potpuni nestanak epitelnog sloja) (Slika 3).

U OVX životinja koje su tretirane s Acolbifene-om, segment 1 pokazao je keratizirani slojeviti ljuskavi epitel koji je sličan onome za intaktnu skupinu, osim što je sadržavao 9-11 stanične slojeve usporedive s 10-15 sloejvima koji su nađeni u životinja u estrusu ili kada su OVX životinje primile Premarin (Slika 4). Epitelna debljina u životinja tretiranih s Acolbifene-om u segmentu 1 bila je dakle veća od one u OVX štakora, koji su imali samo 4-6 staničnih slojeva. U drugim segmentima (Tablica 1), bazalni sloj bio je pokriven slojem slabo stupčastih mukoznih stanica (Slika 2D), koje su bile razvijenije od onih u OVX životinja. U skupini OVX + Acolbifene, samo tri od pet životinja pokazale su znakove minimalne upale dok su srednje do uznapredovale upalne promjene bile općeniti nalaz u svih OVX životinja.

U svim skupinama, segment 1 pokazao je usporedivo slojeviti ljuskasti epitel, osim u životinja OVX skupine gdje je atrofija dominantno svojstvo (Slika 4). Štoviše, u OVX + DHEA i OVX + DHEA + Acolbifene skupinama, mukozne stanice često prate dominantni slojeviti ljuskavi epitel segmenta 1 (nije prikazano).

Sedam segmenata vaginalnog epitela OVX životinja koje su primile DHEA bilo je sastavljeno od velikih višeslojnih stupčastih mukoznih stanica s razvučenim citoplazmatskim vakuolama, a to je svojstvo tipično za androgeni učinak (Tablica 1, Slika 2G). Nekoliko velikih invaginacija karakteriziralo je epitel nakon tretmana s DHEA. Slična epitelna morfologija nađena je u svim segmentima skupine OVX + DHEA + Acolbifene, osim što je smanjen broj mukoznih stanica i broj slojeva (Tablica 1, Slika 2H). U životinja koje su tretirane s DHEA + Premarin, uočen je debeli slojeviti epitel “miješanog” tipa koji je sastavljen od različitih odnosa ljuskavog epitela koji je pokriven slojevima mukoznih stanica (Tablica 1, Slika 2I) od drugog do petog segmenta, što ukazuje na kombinirane estrogene i androgene učinke. U ovoj skupini, tri životinje su pokazale mucificiranje iznad gore navedenih segmenata, dok su druge dvije životinje slojeviti ljuskavi epitel uočen u svim segmentima (Tablica 1). Kada je Premarin kombiniran s DHEA i Acolbifene-om, epitel je bio sličan onom za skupinu DHEA + Acolbifene, što ukazuje na blokadu proliferacije estrogenom izazvanih ljuskavih stanica (Acolbifene) (Tablica 1 i Slika 2J).

Primjena DHEA OVX životinjama povećala je debljinu vaginalnog epitela na 38 ± 4 µm, dok dodavanje Acolbifene-a uz DHEA nije promijenilo debljinu epitela koji je ostao na vrijednosti 37 ± 5 µm. Kada su Premarin i DHEA primijenjeni zajedno OVX životinjama, uočena je velika debljina od 84 ± 6 µm, vrijednost koja se ne razlikuje značajno od skupine životinja koje su primile samo Premarin. Najzad, kombinacija Premarin, DHEA i Acolbifene rezultirala je epitelom debljine 32 ± 3 µm, što je vrijednost slična onoj skupina koje su primile samo DHEA ili DHEA kombiniran s Acolbifene-om.

Lamina propria

Stupanj kompaktnosti kolagenih vlakana u vagini je kategoriziran kao slab, umjeren i visok (Slika 6), koji je uočen u području proksimalno uz epitel. “Slaba” i “umjerena kompaktnost” povezani su s prisutnošću grubih kolagenih niti koje su slabo ili slabije zajedno povezane, dok je “visoka kompaktnost” pojam kojim se opisuju gusto pakirane fine kolagene niti, glatkog izgleda. U svih životinja bilo je razmjerno malo fibrocita u odnosu na količinu kolagena, i on izgleda pretežno jednoličan i skvrčen.

Pozorno ispitivanje svake životinje (Tablica 1) pokazuje da, općenito, kompaktnost kolagenskih niti u segmentu 1 je umjerena (slaba je u štakora u estrusu i u Premarinom tretiranih OVX životinja, dok je visoka u OVX i DHEA-tretiranih OVX štakora), uz povećanje kompaktnosti u segmentima 2 i 3 da bi se dosegao plato koji općenito ostaje konstantan sve do segmenta 7. Prema tome, duž uzdužne osi vagine u intaktnih štakora u estrusu, kompaktnost kolagenih niti bila je slaba u segmentima 1 do 3 te umjerena u segmentima 4 do 7. Atrofija je često povezana s povećanom kompaktnošću kolagenih niti u OVX skupini i OVX + Acolbifene skupini (Tablica 1). U OVX životinja koje su tretirane Premarinom, kompaktnost u segmentu 1 bila je slaba i umjerena u segmentima 2 i 3, dok se u ostalim segmentima kompaktnost kolagenih niti postupno povećavala do visoke kompaktnosti u segmentima 6 i 7.

Ispitivanje svjetlosnim mikroskopom debljine sloja lamina propria duž vagine općenito pokazuje da je umjerene debljine u segmentu 1 dok je tanji u segmentima 2 do 4. U segmentima 5 do 7, debljina se povećava progresivno do razine koja je slična segmentu 1. Odgovarajuće prosječne vrijednosti debljine sloja lamina propria izmjerene u segmentu 5 (Slika 5B) pokazuju da OVX dovodi do značajnog smanjenja debljine u sloju lamina propria (76 ± 2 µm vs. 135 ± 28 µm u intaktnoj skupini) s beznačajnim smanjenjem koje je izazvao Acolbifene (60 ± 8 µm). Povećanje koje je uočeno nakon primjene Premarina ili kombinacije Premarin + Acolbifene u OVX životinja ostaje ispod one intaktne skupine (100 ± 9 µm i 90 ± 3 µm, u odnosu na 135 ± 28 µm). Primjena DHEA dovodi također do statistički ne-značajnog povećanja debljine u sloju lamina propria (96 ± 20 pm), dok dodavanje Acolbifena dovodi do daljnjeg povećanja debljine (136. ± 17 µm), tako da se doseže ona intaktnih životinja. Tretiranje OVX životinja kombinacijom Premarin + DHEA značajno povećava debljinu, (144 ± 14 µm) uspoređujući samo s DHEA. Najzad, životinje koje su tretirane s kombinacijom Premarin + DHEA + Acolbifene pokazuju debljinu (99 ± 9 µm) koja je slična onoj skupine koja je tretirana samo s DHEA, a koja je manja od one za skupinu Premarin + DHEA, premda razlika nije bila statistički značajna.

DHEA je izazvao umjereno povećanje debljine sloja muscularis (50 ± 2 µm), koja je malo smanjena dodatkom Acolbifena (41 ± 3 µm). Najzad, tretiranje kombinacijom Premarina i DHEA rezultiralo je zamjetnim povećanjem debljine (62 ± 3 µm), u usporedbi sa životinjama koje su tretirane samo s DHEA. Kada je Acolbifene dodan uz Premarin i DHEA, debljina sloja muscularis je smanjena (46 ± 5 µg) do vrijednosti koja je usporediva s DHEA i Acolbifene-om.

Kada je mjerena ukupna debljina vaginalne stijenke (Slika 5D), vanjski tanki sloj veznog tkiva koje čini adventiciju nije bio uključen. OVX dovodi do značajne (51%) atrofije vaginalne stijenke (128 ± 3 µm, vs. 262 ± 39 µm u intaktnih) dok dodatak Acolbifena na OVX nije imalo učinka (108 ± 8 µm) (Slike 7 A, B i C). Tretiranje Premarinom zadržava ukupnu debljinu na vrijednosti (253 ± 10 µm) koja je slična onoj intaktnih životinja dok dodatak Acolbifena Premarinu obrće smjer učinka Premarina (150 ± 4 µm) (Slika 7D i E). Ukupna debljina vagine koja je postignuta tretmanom s DHEA (184 ± 21 µm) bila je oko 25% manja od one u skupini koja je tretirana samo Premarinom (Slika 7F). S druge strane, dodatak Acolbifena uz DHEA dovodi do ne-značajnog povećanja debljine (213 ± 20 µm), koja se ne-značajno razlikuje od intaktne skupine (Slika 7G). Konačno, istovremena primjena Premarina i DHEA OVX životinjama značajno povećava debljinu (290 ± 13 µm) do vrijednosti koja je slična onoj za intaktne životinje (Slika 7H). Dodatak Acolbifena uz DHEA i Premarin obrće smjer učinka do vrijednosti (176 ± 11 µm) koja se ne razlikuje značajno od one kada se rabi samo DHEA (Slika 7I).

Težina vagine

Nakon osam mjeseci tretiranja, promjene koje su uočene u težini vagine između različitih skupina (Slika 8) općenito slijede gore opisana morfološka opažanja. Zaista, vaginalna težina nakon OVX smanjila se za oko 50% (101 ± 5 mg) u usporedbi s intaktnom skupinom (205 ± 11 mg) dok tretiranje OVX životinja samo s Acolbifene-om nije imalo učinka na težinu vagine. S druge strane, primjena Premarina dovodi do povećanja vaginalne težine koje ne doseže vrijednost u intaktnih životinja (170 ± 9 mg) dok dodatak Acolbifena Premarinu obrće estrogenom izazvano povećanje težine do vrijednosti koja je slična onoj za OVX životinje (96 ± 4 mg). Obrnuto, kada se DHEA daje OVX životinjama, povećanje vaginalne težine ide do vrijednosti (171 ± 12 mg), koja je slična onoj za skupinu koja je tretirana Premarinom, a kombinacija Acolbifena i DHEA rezultira smanjenjem težine (135 ± 9 mg), koja ostaje iznad one za OVX skupinu. Najzad, istovremena primjena Premarina i DHEA u OVX životinja rezutlira povećanjem težine vagine (179 ± 10 mg) koja doseže vrijednost koja je slična onoj za OVX + DHEA i OVX + Premarin skupinu. Dodatak Acolbifena ovoj kombinaciji nema značajnog učinka (194 ± 12 mg).

DHEA tretiranje OVX životinja dovodi do jakog obilježavanja ili AR mnogih jezgara u tri vaginalna sloja, a ista slika se nalazi kada se rabe kombinacije DHEA + Acolbifene i DHEA + Premarin, pri čemu je izuzetak manji broj obilježenih jezgara u površinskim slojevima ove posljednje skupine. Kombinacija DHEA, Premarina i Acolbifena također rezultira jakim obojenjem većine jezgara u tri sloja vaginalne stijenke.

Razmatranje rezultata

Vaginalna suhoća ili atrofični vaginitis, koja se također navodi kao urogenitalna atrofija, uz seksualnu disfunkciju je opći problem u žena u postmenopauzi (Notelovitz, 2000, Menopause, 7(3): 140-142). Opći zajednički simptomi su suhoća, upaljenost, pruritus, nadraženost i dispareunija, što dovodi do smanjenog libida i kvalitete života (Berman et al., 1999, Curr Opin Urol, 9(6): 563-568). Budući da je poznato da u svemu sudjeluje gubitak estrogena, tretiranje izbora su estrogenska zamjenska terapija (ERT) i hormonska zamjenska terapija (HRT). Međutim, nove spoznaje o fiziologiji spolnih steroida u žena sugerira na vrlo značajnu ulogu androgena (Labrie et al., 2003, End Rev, 24(2): 152-182). Ovo istraživanje uspoređuje ukupne hormonske učinke alternative u odnosu na HRT i ERT, dakle sam DHEA ili u sprezi s čistim antiestrogenom Acolbifene-om i također s Premarinom na morfologiju vagine i ekspresiju spolnih steroidnih receptora. DHEA je primijenjen potkožno da se izbjegne prvi prolaz kroz jetru (Labrie et al., 1996, Endocrinol, 150: S107-S118).

Najzad, naši su rezultati pokazali značajno povećanje težine vagine uz tretiranje Premarinom, uspoređujući s OVX životinjama, a ta vrijednost je slična onoj koja je nađena za skupinu koja je tretirana s DHEA. Valja se prisjetiti da, premda se povećanje težine vagine i maternice u štakora općenito uzima kao mjera estrogenosti, ovi organi također odgovaraju na progesteron i testosteron, među ostalim spojevima (Emmens and Martin, 1964, Dorfman Ed, Ed Academic Press NY: 1).

U mogućoj trostrukoj kombinaciji, svinjski estrogen Premarin namijenjen je djelovanju u mozgu da razriješi vazomotoričke simptome. Ustvari, boljitak istovremene primjene čistog antiestrogena Acolbifena s estrogenom da se neutraliziraju neželjeni periferni učinci već je dobro opisana - Labrie et al. (Labrie et al., 2003, Endocrinol, 144 (11): 4700-4706). U ovom istraživanju, kada je OVX životinjama dan Acolbifene, najtipičnije morfološko obilježje koje je izazvao SERM je pojava površinskog sloja dobro uređenih malenih mukoznih stanica koje prekrivaju bazalni stanični sloj, što je slika koja je još izraženija u skupini Premarin + Acolbifene i koja je pretežita u svim skupinama koje su tretirane s Acolbifene-om, uključivo kada je SERM dodan uz DHEA. Mucifikacija vaginalnog epitela uz tretiranje antiestrogenom uočena je u nedoraslih (Anderson and Kang, 1975, Am J anat, 144(2): 197-207) i odraslih štakora (Yoshida et al., 1998, Cancer Lett, 134(1): 43-51). Mada se ova morfološka slika uspoređuje s mucificiranjem koje je izazvano progesteronom (Anderson and Kang, 1975, Am J Anat, 144(2): 197-207), ovaj molekularni mehanizam, kojim antiestrogen izaziva epitelno mucificiranje, ostaje nepoznat.

U žena u postmenopauzi uočeno je mnogo blagotvornih učinaka DHEA (Labrie et al., 1997, J. Clin. Endocrinol. Metab., 82: 3498-3505; Labrie et al., 1991, Mol Cell Endocrinol, 78: C113-C118). Budući da nije karakteriziran specifični receptor za DHEA, morfološke promjene koje su uočene u vagini štakora nakon tretiranja s DHEA odražavaju njegovo intakrino prevođenje u aktivne spolne steroide koji djeluju androgeno i/ili estrogeno putem intakrinih mehanizama (Labrie et al., 1991, Mol Cell Endocrinol, 78: C113-C118). Ove promjene obuhvaćaju intenzivno epitelno mucificiranje, visoku kompaktnost fino povezanih lamina propria kolagenih niti i umjereno povećanje debljine sloja muscularis, uspoređujući s OVX životinjama. Prve dvije morfološke promjene svojstvene su androgenim učincima dok treća pokazuje aktivnost sličnu estrogenu. što je dodatno potkrijepljeno dodatnim povećanjem ekspresije progesteronskog receptora u sloju muscularis.

Budući da se DHEA transformira bilo u androgene ili estrogene (ili oboje) u perifernim tkivima, debeo mucificirani višeslojni epitel koji je uočen u ovom istraživanju nakon tretiranja OVX životinja s DHEA, sugerira dominantno androgeni učinak mucifikacije u vagini štakora, što je učinak koji može zasjeniti bilo kakav potencijalni istovremeni manji estrogeni učinak na epitelnoj razini. Prethodno istraživanje je pokazalo identičan učinak mucifikacije u vagini štakora (Sourla et al., 1998, J Steroid Biochem. Mol. Biol, 66(3): 137-149). U tom prethodnom istraživanju, intravaginalna primjena DHEA postigla je značajan učinak uz dozu koja je deset puta manja od one za koju je nađeno da je aktivna nakon primjene DHEA na koži leđa.

Ovi podaci ukazuju na istovremeno veće androgeno i manje estrogeno djelovanje DHEA u vagini štakora. Štoviše, ovi rezultati su dobro potkrijepljeni promatranjem vaginalnog epitela OVX životinja koje su primile istu lokalnu primjenu DHEA nego što je ona koja se rabi u našem istraživanju, plus potkožnu dozu antiandrogen Flutamida (FLU) (nepublicirani rezultati). Zaista, androgeni učinak mucifikacije koji je rezultat androgene komponente DHEA bio je u potpunosti obrnut djelovanjem FLU i rezultirao je slojevitim ljuskavim epitelom, što je tipično za estrogeni učinak (podaci nisu prikazani). Kad bi DHEA imao isključivo androgeni učinak (mucifikacija) u vagini štakora, ovaj učinak mogao bi se obrnuti djelovanjem FLU i atrofnim epitelom koji je sličan onom OVX životinja što bi se moglo uočiti. Prethodna istraživanja u gonadoktomiziranih mužjaka i ženki štakora su jasno pokazala da tretiranje s DHEA dovodi do stimulirajućih androgenih i/ili estrogenih učinaka na prostatu, testise i maternicu, ovisno o tome koje je ciljno tkivo predmet istraživanja (Labrie et al, 1988, Endocrinol, 123:1412-1417).

Kombinacija DHEA + Acolbifene, s druge strane, pokazuje smanjenje opsega mucifikacije epitela, čime se iskazuje alternacija dobro uređenog sloja mukoznih stanica – što je učinak Acolbifena – te invaginacija višeslojnih hipertrofnih mukoznih stanica, što odgovara androgenom učinku DHEA. Sukladno tome, Acolbifene inhibira djelomični estrogeni učinak DHEA, dok se zadržava pretežni androgeni suprotni dio DHEA čemu se dodaje maleni esterogeni učinak is Acolbifena, pri čemu se ovaj posljednji najbolje može uočiti na razini ostiuma. Uočeno je smanjenje težine vagine nakon dodatka Acolbifena uz DHEA koje je manje od onog koje se postiže nakon dodatka Acolbifena Premarinu, što ilustrira smanjenu estrogenu komponentu DHEA koja se obrće pomoću antiestrogena, dok se pretežna nadrogena komponenta ne mijenja. Nadalje, povećanje u sloju lamina propria i kompaktnost kolagenih niti, uspoređujući s onima OVX i intaktnim životinjama, u skupini DHEA + Acolbifene, sugerira opet moguću ulogu androgena u povećanju kompaktnosti kolagena i debljini, jer se estrogena komponenta DHEA blokira Acolbifene-om.

Ostala istraživanja su pokazala da je djelovanje DHEA u mliječnoj žlijezdi štakora (Sourla et al, 1998, Endocrinol, 139: 753-764), kožnim žlijezdama lojnicama (Sourla et al., 2000, J Endocrinol, 166(2): 455-462) te mineralnoj gustoći kostiju (Martel et al., 1998, J Endocrinol, 157: 433-442) gotovo isključivo androgeno. Štoviše, prisutnost androgenog djelovanja DHEA u vagini štakora prethodno je pokazana izazivanjem vaginalnog otvaranja i prijevremene ovulacije u nedoraslih štakora koji su tretirani ovim spojem, dok DHT, androgen koji nije aromatizirajući prema estrogenima, nije proizveo takve učinke (Knudsen and Mahesh, 1975, Endocrinol, 97(2): 458-468). Kapacitet vaginalnog tkiva štakora da aromatizira androgene, posebice testosteron, vjerojatno se može pripisati pretežnom dijelu estrogenog učinka DHEA u ovom organu (Lephart et al., 1989, Biol Reprod, 40(2): 259-267). Androst-5-en-3β,17β-diol (5-diol), metabolit DHEA za kojega je poznato da veže estrogenski receptor (Shao et al., 1950, J Biol Chem, 250: 3095-3100; Poortman et al, 1975, J Clin Endocrinol Metab, 40(3): 373-379; Van Doom et al, 1981, Endocrinol, 108: 1587-1594; Adams et al., 1981, Cancer Res, 41: 4720-4726), može također sudjelovati u estrogenom učinku (Poulin and Labrie, 1986, Cancer Res, 46: 4933-4937). Predložena kombinacija antiestrogena Acolbifena s DHEA mogla bi dakle spriječiti bilo kakav neželjeni stimulirajući učinak 5-diola. S druge strane, Acolbifene bi trebao pokazati dodatne povoljne učinke sprječavanjem erozije kostiju (Martel et al., 2000, J Steroid Biochem Mol Biol, 74 (1-2): 45-56).

Koliko nam je poznato, nisu načinjena ranija istraživanja koja bi pokazala stimulirajuće učinke DHEA na kompaktnost i morfologiju kolagenih niti u sloju lamina propria te, u manjem opsegu, na sloj muscularis. Takvo djelovanje androgena i estrogena koji su izvedeni iz DHEA moglo bi imati povoljne učinke na funkciju vagine u žena u postmenopauzi i moglo bi dati supstrate koji su neophodni za djelovanje fosfodiesteraznog inhibitora tipa 5 kao što su sildenafil ili tadalafil, moguće putem androgenom ili estrogenom izazvanom endotelijalnom dušik-oksid sintaza (eNOS)-upravljanom olakšanju relaksacije vaginalnih glatkih mišića (prikazano u: Munarriz et al., 2003, J Urol, 170 (2 Pt 2): S40-S44, Discussion S44-S45). Ustvari, Acolbifene, kako je utvrđeno, izaziva eNOS u endotelijalnim stanicama čovjeka i štakora (Simoncini et al., 2002, Endocrinol, 143(6): 2052-2061).

Rezultati koji su dobiveni u svim skupinama koje uključuju DHEA tretiranje pokazuju da je AR ekspresija doregulirana pomoću androgena koji su izvedeni iz intakrine transformacije DHEA u vagini štakora, na sličan način kao u tri tkivna odjeljka.

Povoljne morfološke promjene, koje su uočene uz jako moduliranje vaginalnog AR štakora pomoću androgena ukazuje na to da smanjena serumska razina DHEA-izvedenih androgena u žena u postmenopauzi doprinosi smanjenom zdravlju vagine i eventualno gubitku libida i seksualnog zadovoljstva u ovoj starosnoj skupini. Smanjena razina serumskog testosterona, slobodnog testosterona i DHEA-S je zaista nađena u žena koje su se žalile na smanjenu seksualnu želju (Guay and Jacobson, 2002, J Sex Marital Ther, 28 Suppl 1:129-142).

U ovom istraživanju, pokazali smo da tretiranje OVX ženki štakora s DHEA ili kombinacijom DHEA s Acolbifene-om te of DHEA s Acolbifene-om i Premarinom obrće tijek OVX-izazvanih atrofičnih promjena koje su nađene u vagini putem dominirajućeg androgenog učinka, putem AR, koji je odražavao intenzivno epitelno mucificiranje i smanjenu kompaktnost kolagenih niti u sloju lamina propria. Tretiranje samo s DHEA također umjereno povećava debljinu sloja muscularis. Takvi podaci naglašavaju značaj spolnih steroida koji su sintetizirani lokalno iz DHEA i DHEA-S u perifernim ciljanim tkivima. Uz navedene blagotvorne učinke, Acolbifene smanjuje upalnu incidenciju, vjerojatno putem estrogenom izazvanim zaštitinim keratiniziranim ljuskavim epitelom na razini ostiuma i antiestrogenim djelovanjem mucifikacije na internoj razini.

Načinjeni su različiti pokušaji da se riješi problem vaginalne suhoće, što je često povezano s dispareunijom i gubitkom seksualnog užitka. Kao primjer, lokalni vaginalni estrogeni pripravci se često propisuju da se postigne olakšanje ali endometrij može biti stimuliran pomoću nesuprostavljenih estrogena (Mattson et al, 1989, Maturitas, 11: 217-222). U histerektomiziranih žena u postmenopauzi, ERT se još uvijek koristi ali s već poznatim povećanim rizikom od razvoja karcinoma dojke. Štoviše, ERT smanjuje razinu serumskog ndrogena povećanjem vezujućeg globulina spolnih hormona, što može izazvati relativni nedostatak androgena u jajnicima i nadbubrežnoj žlijezdi, što je još jedan dodatni razlog za konkurentnu fiziološku zamjenu androgena (Casson et al., 1997, Obstet Gynecol, 90(6): 995-998).

Primjer 2

Metode

Životinje i tretman

Za eksperiment korištene su ženke Sprague-Dawley štakora starosti 10-12 tjedana (Crl:CD(SD)Br) (Charles River Laboratory, St-Constant, Canada) težine 215-265 g u vrijeme ovarijektomije.Životinje su smještene u pojedinačne nastambe u prostoriji s kontroliranim uvjetima (temperatura: 22 ± 3°C; vlažnost: 50 ± 20%; ciklusi 12-h svjetlo-12-h tama, uključivanje svjetla u 07:15h). Životinjama je omogućen slobodan pristup do vode i hrane koja ima odgovarajući certifikat (Lab Diet 5002 (pellet), Ralston Purina, St-Louis, MO). Eksperiment je proveden u nastambi za životinje koja je odobrena od strane Canadian Council on Animal Care (CCAC) te od udruge Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) sukladno naputku CCAC Guide for Care and Use of Experimental Animals.

Provedeni su različiti eksperimenti: dva istraživanja od 20 dana i dva istraživanja od 8 mjeseci. U prvom eksperimentu svakog istraživanja, životinje su raspodijeljene slučajnim odabirom između 3 skupina od 13 ili 14 životinja, na sljedeći način: 1) intaktna kontrola; 2) ovarijektomizirane (OVX) kontrole; 3) OVX + raloksifen (0.5 mg/kg), ili, 3) OVX + LY 363381 (0.5 mg/kg). U jednom 8-mjesečnom istraživanju, životinje su raspodijeljene slučajnim odabirom između 5 skupina od 7-8 životinja, na sljedeći način: 1) intaktna kontrola; 2) ovarijektomizirane (OVX) kontrole; 3) OVX + Acolbifene (0.5 mg/kg); 4) OVX + ERA-923 (0.5 mg/kg); 5) OVX + TSE-424 (0.5 mg/kg). U drugom 8-mjesečnom istraživanju, životinje su raspodijeljene slučajnim odabirom između 3 skupina od 10-11 životinja, na sljedeći način: 1) intaktna kontrola; 2) ovarijektomizirane (OVX) kontrole; 3) OVX + lazofoksifen (0.5 mg/kg). Na prvi dan istraživanja, životinje u odgovarajućim skupinama su obostrano ovarijektomizirane (OVX) uz anesteziju izofluranom. Ispitivani spojevi su zatim davani jednom dnevno oralnom sondom kao suspenzija u 0.4% metilcelulozi (0.5 ml/štakor) od dana 1 do dana 20 ovog istraživanja ili od dana 1 do tjedna 32 ovog istraživanja.

Dvadeset i četiri sata nakon posljednjeg doziranja, životinje su žrtvovane uz anesteziju izofluranom eksangvinacijom. Vagine su sakupljene i uronjene u 10% neutralni puferirani formalin neposredno nakon resekcije. Vagine su zatim bilo rezane u 7 poprečnih segmenata (za Acolbifene, ERA-923 i TSE-424) ili je za uzorak samo srednji poprečni egment (raloksifen, lazofoksifen ili LY 363381). Segmenti su zatim rutinski brađeni i uronjeni u parafinske blokove. Svi su segmenti bili smješteni u parafinskom bloku u sekvenciji koja odgovara njihovu izvornom anatomskom položaju i usmjerene okomito na površinu bloka, što omogućuje segmentima da budu rezani u presjeku.

Za svaku životinju, 4 μm-debela parafinska sekcija je rezana i obojena hematoksilin-eozinom za morfološko ispitivanje.

Na slikama 10 i 11 prikazana je usporedba između različitih SERM-ova: morfologija vaginalnog epitela, u OVX štakora, uz povećanje 200×. Slike A do D pokazuju morfologiju epitela prvog segmenta vagine (ostium). Dok je epitel u OVX životinja tanak (4-6 staničnih slojeva), atrofičan i ne pokazuje vidljivi granularni sloj u A, isti epitel je deblji u 3 SERM-a (8-11 staničnih slojeva) i pokazuje višeslojni granularni odjeljak, u B, C i D. U E do K, prikazan je segment koji je smješten u sredini vagine. U OVX životinja, vaginalni epitel je tanak i atrofičan (2-3 staničnih slojeva), u E, dok je debljina povećana u svim tretiranim skupinama (F do K), zbog prisutnosti jednog (Acolbifene, ERA-923 i TSE-424) ili više (raloxifene, lazofoksifen ili LY 363381) mukoznih staničnih slojeva koji prekrivaju bazalni stanični sloj.

Primjer 3

Materijal i metode

Za eksperiment korištene su ženke Sprague-Dawley štakora starosti 10-12 tjedana (Crl:CD®(SD)Br VAF/Plus™) (Charles River Laboratory, St-Constant, Canada) težine približno 250-275g na početku eksperimenta. Životinje su aklimatizirane na okolne uvjete (temperatura: 22 ± 3°C; vlažnost: 50 ± 20%; ciklusi 12-h svjetlo-12-h tama, uključivanje svjetla u 07:15h) bar jedan tjedan prije početka eksperimenta. Životinje su smještene u pojedinačne nastambe i omogućen im je slobodan pristup do hrane i vode (Lab Diet 5002, Ralston Purina, St-Louis, MO). Eksperiment je proveden sukladno naputku CCAC Guide for Care and Use of Experimental Animals u nastambama za životinje koje su odobrene od Canadian Council on Animal Care (CCAC) te udruge Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC).

25 ženki štakora je raspodijeljeno sučajnim odabirom u 5 skupina, na sljedeći način: 1) tri ovarijektomizirane nedirnute kontrole (OVX); 2) četiri OVX + placebo supozitorij; 3) šest OVX + 0.33 mg DHEA supozitorij; 4) šest OVX + 0.66 mg DHEA supozitorij; 5) šest OVX + 1.00 mg DHEA supozitorij. Na prvi dan ovog istraživanja, životinje u svim skupinama su dvostrano ovarijektomizirane (OVX) uz anesteziju izofluranom. Stavljanje supozitorija u vaginu započelo je 5. dana ovog istraživanja i nastavljeno je sve do 18. dana ovog istraživanja, ukupno u trajanju 14 dana. Supozitorij je nježno stavljen u vaginalni otvor i zatim pažljivo gurnut 2-3 mm unutar vagine pomoću malenog, glatkog staklenog štapića, koji je dezinficiran u 70% alkoholu i osušen između upotrebe.

Dvadeset i četiri sata nakon poslednjeg doziranja, životinje su žrtvovane uz anesteziju izofluranom eksangvinacijom. Vagina – uključujući uretru i maternicu – sakupljena je i zatim rezana kao što je prije opisano. Za daljnju analizu, dva komadića ingvinalne mliječne žlijezde su uzorkovana, kao i komadić 2×2 cm obrijane kože na leđima, koja je stavljena i poravnata na komadiću kartona.

Priređivanje supozitorija

DHEA supozitoriji priređeni su korištenjem Witepsol H-15 osnove (Medisca, Montreal, Canada). Može se koristiti bilo koja druga lipofilna baza kao što je Fattibase, Wecobee, kakao maslac, teobromno ulje ili druge kombinacije Witepsol baza. Odgovarajuća količina DHEA je odvagnut da se dobije konačna koncentracija od 0.33 mg ili 0.66 mg ili 1.00 mg po supozitoriju u ukupnom volumenu 50 µl ± 3 µl. Izračunata je odgovarajuća količina supozitorijskih baznih tableta koje treba odvagnuti da se postigne konačni volumen temeljem prethodno određene gustoće supozitorijske, koja je bila 47.5 mg po 50 μl. Supozitorijska baza je stavljena u malenu čašu, rastaljena u mikrovalnoj pećnici uz snagu 50% tijekom cca 3 min i 30 s i zatim je prenesena na grijaću ploču, koja je postavljena na najnižu snagu da bi se supozitorijska baza mogla držati na temperaturi 50 ± 3 °C. Zatim je u bazu dodan DHEA mikronizirani prah (nabavljeno od Scheweizerhall Inc., čistoće 100%), odjednom, pa je cijela grudica ostavljena da se moči i vlaži tijekom 3 min prije nego je polako razmrvljen i otopljen uz pomoć glatkog staklenog štapića. Najzad, baza s otopljenim DHEA (placebo je bio baza bez DHEA) je stavljena, pomoću 1000 μl-Gilson pipete s prethodnom zagrijanim nastavkom pipete, u stalak koji sadrži niz 50 μl-kalupa. Ovi kalupi su načinjeni od epruveta za mikrocentrifugu, a svaki je prethodno kalibriran s 50 µl vode i rezan na razini oznake koja je načinjena uz površinu vode.

Nakon 30 min hlađenja na sobnu temperaturu, supozitoriji su stavljeni na 4°C daljnjih 30 min. Najzad, suvišak baze je odrezan britvicom i supozitorije su uklonjene iz kalupa te pohranjene na u staklenu posudu na 4°C do upotrebe.

Prije nego su primijenjene životinjama, supoziriji su ostavljeni da dosegnu sobnu temperaturu.

Histološki postupci

Organi su uronjeni u 10% neutralni puferirani formalin neposredno nakon resekcije. Svaka vagina i maternica su podijeljene u 8 jednakih poprečnih segmenata i 4 poprečna segmenta uključujući 2 od cerviksa i dva od svakog od dviju proksimalnih i distalnih rogova. Segmenti su zatim rutinski obrađeni i uronjeni svi zajedno u isti parafinski blok. Unutar parafinskog bloka, svi segmenti su smješteni u sekvenciji koja odgovara njihovu izvornom anatomskom položaju i orijentirani okomito na površinu blok, što omogućuje da se segmenti režu u presjeku. Za svaku životinju, 4 μm-debela parafinska sekcija je rezana i obojena hematoksilin-eozinom za morfološko ispitivanje.

Rezultati

Morfologija epitela

Nakon ispitivanja svih vaginalnih segmenata, utvrđeno je da su segmenti 4 i 6 reprezentativni za uspoređivanje pojedinih tretiranja. Segment 4 je najbliže ostiumu koji je pokazuje svojstva vanjske kože, te nije ili bar nije u značajnijoj mjeri obuhvaćen blagim do umjerenim upalnim promjenama koje se mogu naći u vanjskom području vaginalne sluzi u kontrolnih životinja. Segment 6 reprezentira dublju vaginalnu sluz i odvojen je od grlića maternice samo jednim segmentom. Općenito, trbušna strana vagine pokazuje deblji i sluzi bogatiji epitel u usporedbi s leđnom stranom.

Intaktni

Kao što je prikazano na slici 13, u estrusu, koji je pod pretežnim estrogenim utjecajem, vaginalni epitel je debeo i keratiniziran. On prikzuje od 12 do 18 staničnih slojeva u segmentu 4, te 12 do 15 slojeva u segmentu 6. Nasuprot debelom slojevitom ljuskavom epitelu kakav se može vidjeti u ostiumu, granularni slojevi nisu očigledni u unutrašnjem vaginalnom epitelu. U metestrusu, uz minimalni hormonski utjecaj, vaginalni epitel je tanji. On prikazuje 6 do 10 staničnih slojeva u segmentu 4, te 5 do 7 slojeva u segmentu 6.

Ovarijektomizirani nedirnuti

Kao što je pokazano na slici 14, u segmentu 4, vagina je omeđena ljuskavim slojevitim epitelom od 2 do 6 staničnih slojeva. Debljina ovog sloja vrlo varira između životinja. U segmentu 6, uočena je potpuna atrofija, s 2 do 3 staničnih slojeva zgusnutih stanica. Neka rijetka žarišta malenih valjkastih mukoznih stanica mogu se vidjeti cjelinom vagine u ovih životinja. Od tri životinje u ovoj skupini, dvije pokazuju blage upalne promjene u vanjska tri segmenta.

Placebo

Kao što je pokazano na slici 15, u usporedbi s OVX nedirnutom skupinom, vaginalni ljuskavi slojeviti epitel placebo skupine je nešto deblji, pri čemu segment 4 prikazuje 4 do 8 staničnih slojeva. Međutim, u segmentu 6, uočena je ista morfologija kakva je nađena u OVX nedirnutoj skupini, s 2-3 epitelna stanična sloja. Kao i u OVX nedirnutih životinja, žarišta malenih valjkastih mukoznih stanica mogu se naći cijelom vaginom, nešto više ako se usporedi s OVX nedirnutim životinjama. Od četiri skupine u ovoj skupini, tri pokazuju blage upalne promjene u vanjska tri segmenta.

DHEA 0.33 mg / supozitorij

Kao što je pokazano na slici 16, općenito, uz niske doze, morfološko djelovanje DHEA karakterizirano je dobro uređenim valjkastim mukoznim stanicama, dok pri višim dozama, mukozne stanice se povećavaju (hipertrofija), vakuoliziraju i ljušte. U ovoj skupini, djelovanje DHEA je slabo uočljivo u segmentu 2 i postepeno se povećava u segmentima 3-4, gdje postoji alternacija dobro uređenih i hipertrofiranih mukoznih stanica. Učinak DHEA polako se smanjuje u segmentima 5 i 6 gdje se mogu očiti gotovo isključivo dobro uređene mukozne stanice. Ovaj efekt postaje vrlo slab u segmentu 7 i prestaje u lateralnom vaginalnom prijevoju segmenta 8 (što uključuje početak grlića maternice). Dakle, u segmentu 4, vaginalni epitel je ljuskav i slojevit s 3 do 7 staničnih slojeva. Oko 20 do 60% vaginalnog omeđenja sastoji se od dobro uređenih stanica mukoznih stanica u alternaciji s 15 do 50% hipertrofiranih mukoznih stanica, koje pokrivaju jedan ili više ljuskavih slojevitih slojeva epitela, te s ne-mucificiranim područjima. U segmentu 6, debljina epitela je smanjena gotovo do debljine kakva se nalazi u OVX nedirnutih životinja. On se sastoji od ljuskavog epitela s 2 do 5 staničnih slojeva, koji su pokriveni slojem dobro uređenih mukoznih stanica. Uočena je velika varijacija u svezi s pojavnošću mukoznih stanica, a ove stanice pokrivaju od 5 do 75% površine vagine, u alternaciji s ne-mucificiranim područjima. Od šest tretiranih životinja, njih četiri pokazuju blagu upalu, koja je nejednoliko raspoređena cijelom vaginom.

DHEA 0.66 mg / supozitorij

Kao što je pokazano na slici 17, u ovoj skupini, djelovanje DHEA je vidljivo u segmentu 2 i postepeno se povećava značajno u segmentima 3-4 i 5 gdje je uočena većima hipetrofiranih mukoznih stanica. Broj hipertrofiranih mukoznih stanica smanjuje se u segmentima 6 i 7 gdje većina stanica pripada dobro uređenim mukoznim stanicama. Dakle, u segmentu 4, slojeviti ljuskavi epitel je debeo 3 do 6 staničnih slojeva. Oko 5 do 20% vaginalnog omeđenja sastoji se od dobro uređenih mukoznih stanica u alternaciji s 10 do 75% hipertrofiranih mukoznih stanica, koje prekrivaju jedan ili više ljuskavih slojevitih epitelnih slojeva. Također su nađena ne-mucificirana epitelan područja. U segmentu 6, debljina epitela je smanjena i sastoji se od ljuskavog slojevitog epitela od 2 do 4 stanična sloja, koji je okružen slojem dobro uređenih mukoznih stanica. Opseg mucificiranih područja varira od 20 do 80% površine vagine, u alternaciji s ne-mucificiranim područjima. Od šest tretiranih životinja, dvije pokazuju blagu uplu u tri vanjska segmenta.

DHEA 1.00 mg / supozitorij

Kao što je prikazano na slici 18, u ovoj skupini učinak DHEA je također zanemariv u segmentu 2, ali se značajno povećava u segmentima 3-4 i 5 gdje je uočena velika većina hipertrofiranih mukoznih stanica, te se vrlo polako smanjuje u segmentima 6-7 i 8, gdje je uočena velika većina dobro uređenih mukoznih stanica. Prema tome, u segmentu 4, slojeviti ljuskavi epitel prikazuje 3 do 9 staničnih slojeva. Hipertrofirane mukozne stanice pokrivaju 3 do 4 ljuskava stanična sloja koji pokrivaju 50 do 70% vaginalne površine, dok dobro uređene mukozne stanice pokrivaju 5 do 30% vaginalne površine. Ne-mucificirana područja su raspršena unutar mucificiranih stanica. U segmentu 6, epitelna debljina je također smanjena i sastoji se od 2 do 4 stanična sloja. Hipertrofirane mukozne stanice prekrivaju 1 do 3 ljuskava stanična sloja koji pokrivaju oko 30 do 100% vaginalne površine dok dobro uređene mukozne stanice pokrivaju od 0 do 70%. Uočeno je također nekoliko raspršenih ne-mucificiranih područja. Od šest tretiranih životinja, njih čestiri pokazuju blagu upalu u četiri vanjska segmenta.

Zaključci

1. Nosač koji se koristi za intravaginalni tretman ima poželjna svojstva:

a. Lako se priređuje u kalibriranom kalupu;

b. Posjeduje odlično svojstvo da potpuno otapa DHEA mikronizirani prah, čime se postiže standardizirano doziranje;

c. Nema značajne reakcije tkiva i morfoloških promjena vaginalne sluznice: samo je uočeno slabo povećanje debljine epitela u prvih 3-4 segmenta, vjerojatno zbog manipuliranja koje prati postavljanje supozitorija.

2. DHEA proizvodi efekt na morfologiju vaginalnog epitela pri najnižoj ispitanoj dozi (0.33 mg / supozitorij). Djelovanje je najveće od 3. do 5. segmenta a zatim se smanjuje tako da prestaje na razini 7. segmenta.

3. Uz DHEA dozu od 0.66 mg / supozitorij, učinak je također prisutan na 3. segmentu i ostaje prilično jak u 6. segmentu.

4. Uz DHEA dozu od 1.00 mg / supozitorij; učinak je jak od segmenata 2-3 do dubine vagine uz grlić maternice.

Primjeri farmaceutskih smjesa

U nastavku, kao primjer i bez ograničenja, navedeno je nekoliko farmaceutskih smjesa koje koriste poželjan aktivan SERM Acolbifene, poželjan aktivan spolni steroidni prekursor DHEA, poželjan estrogen 17β-estradiol ili premarin, poželjan cGMP fosfodiesterazni inhibitor tipa 5 Sildenafil ili Tadalafil. Koncentracija aktivnog sastojka može varirati u širokom rasponu kao što je ovdje razmotreno. Količine i tipovi ostalih sastojaka koji se mogu uključiti su dobro poznati u tehnici.

Primjer A

Tablete

[image]

Primjer B

Želatinske kapsule

[image]

Primjer C

Tablete

[image]

Primjer D

Želatinske kapsule

[image]

Primjer E

Tablete

[image]

Primjer F

Želatinske kapsule

[image]

Primjer G

Tablete

[image]

Želatina H

Želatinske kapsule

[image]

Primjer I

Tablete

[image]

Primjer J

Želatinske kapsule

[image]

Primjer K

Vaginalna krema

[image]

Primjer L

Vaginalni supzitorij

[image]

DHEA supozitorije priređene su korištenjem Witepsol H-15 baze (Medisca, Montreal, Canada). Može se također koristiti druga lipofilna baza kao što je Fattibase, Wecobee, kakao maslac, teobromno ulje ili druge kombinacije Witepsol baza.

Primjeri pribora

Kao što je navedeno niže, kao primjer i bez ograničenja, korišteno je nekoliko pribora s poželjnim aktivnim SERM Acolbifene-om, poželjnim spolnim steroidnim prekursorom DHEA, poželjnim estrogenima 17β-estradiola ili konjugiranih estrogena, poželjnog cGMP fosfodiesteraznog inhibitora tipa 5 Sildenafila ili Tadalafila. Koncentracija aktivnog sastojka može varirati u širokom rasponu, kao što je prije razmotreno. Količine i tipovi drugih sastojaka koji se mogu uključiti je dobro poznata u tehnici.

Primjer A

SERM, estrogeni i cGMP fosfodiesterazni inhibitor tipa 5 su oralno primijenjeni dok se spolni steroidni prekursor primjenjuje lokalno ili potkožno.

SERM smjesa

Za oralnu primjenu (kapsule)

[image]

SERM + estrogeni smjesa

Za oralnu primjenu (kapsule)

[image]

SERM + estrogeni + cGMP fosfodiesterazni inhibitor tipa 5 smjesa

Za oralnu primjenu (kapsule)

[image]

Sastav spolnog steroidnog prekursora za lokalnu primjenu (gel)

[image]

Primjer B

SERM i spolni steroidni precursor primjenjuju se oralno

Ne-steroidna antiestrogenska smjesa za oralnu primjenu

(kapsule)

[image]

Smjesa spolnog steroidnog prekursora za oralnu primjenu

(želatinska kapsula)

[image]

Ostali SERM-ovi (Toremifene, Ospemifene, Raloxifene, Arzoxifene, Lazofoksifen, TSE-424, ERA-923, EM-800, SERM 3339, GW-5638) mogu se zamijeniti s Acolbifen-om u gore navedenim formulacijama, kao što se i drugi spolni steroidni inhibitori mogu supstituirati s DHEA, drugi estrogeni mogu se zamijeniti s Premarin-om dok se cGMP fosfodiesterazni inhibitor tipa 5 može zamijeniti sa Sildenafil-om ili

Tadalafil-om ili prostaglandinom E1. Može se uključiti više nego jedan SERM ili više nego jedan prekursor ili estrogen ili cGMP fosfodiesterazni inhibitor tipa 5, pri čemu kombinirani težinski postotak je poželjno onaj jednog prekursora ili jednog SERM-a koji je dan u gore navedenim primjerima.

Claims

1. Uporaba spolnog steroidnog prekursora dehidroepiandrosterona, naznačena time što se koristi za proizvodnju lijeka za liječenje ili smanjenje vjerojatnosti nastanka problema koji utječu na vaginalni sloj lamina propria i/ili sloj muscularis, pri čemu su problemi odabrani iz skupine koja se sastoji od vaginalne suhoće, vaginalne atrofije, atrofičnog vaginitisa, vaginalnog pruritusa, dispareunije, te seksualne disfunkcije kod žena u postmenopauzi, pri čemu je navedeni spolni steroidni prekursor intravaginalno primijenjen.

2. Uporaba prema zahtjevu 1 naznačena time što su problemi odabrani iz skupa koji čine vaginalna suhoća, vaginalna atrofija, atrofični vaginitis, dispareunija i seksualna disfunkcija.

3. Uporaba prema zahtjevu 1, naznačena time što se spolni steroidni prekursor dehidroepiandrosteron kombinira sa selektivnim modulatorom receptora estrogena acolbifenom.

4. Farmaceutska smjesa za vaginalnu primjenu, koja sadrži, a) farmaceutski prihvatljivi lipofilni ekscipijent, razrjeđivač ili nosač; b) terapijski učinkovitu količinu spolnog steroidnog prekursora dehidroepiandrosterona; naznačena time da je za uporabu u liječenju ili smanjenju vjerojatnosti nastanka problema koji utječu na sloj lamina propria i/ili sloj muscularis vagine, pri čemu su problemi izabrani iz skupine koja se sastoji od vaginalne suhoće, vaginalne atrofije, atrofičnog vaginitisa, vaginalnog svrbeža, dispareunije, te seksualne disfunkcije, kod žena u postmenopauzi.

5. Farmaceutska smjesa prema zahtjevu 4, naznačena time što je ekscipijent, razrjeđivač ili nosač - gel.

6. Farmaceutska smjesa prema zahtjevu 4, naznačena time što je farmaceutska smjesa supozitorij ili jajašce.

7. Farmaceutska smjesa prema zahtjevu 4, naznačena time što nadalje sadrži terapijski učinkovitu količinu selektivnog modulatora receptora estrogena, acolbifena.

8. Vaginalni supozitorij koji sadrži spolni steroidni prekursor dehidroepiandrosteron i farmaceutski prihvatljiv lipofilni ekscipijent, razrjeđivač ili nosač naznačen time što je za uporabu u liječenju ili smanjenju vjerojatnosti nastanka problema koji utječu na sloj lamina propria i/ili sloj muscularis vagine, pri čemu su problemi izabrani iz skupine koja se sastoji od vaginalne suhoće, vaginalne atrofije, atrofičnog vaginitisa, vaginalnog svrbeža, dispareunije, te seksualne disfunkcije, kod žena u postmenopauzi.

9. Vaginalni supozitorij u skladu s patentnim zahtjevom 8, naznačen time što farmaceutski prihvatljiv lipofilni ekscipijent, razrjeđivač ili nosač je odabran iz skupine koju čine mono-, di- i tri-gliceridi zasićenih masnih kiselina u smjesi (uključujući Witepsol baze kao što je Witepsol H-15), trigliceridi izvedene iz palme, palminog zrna i kokosovih ulja (uključujući Fattibase), trigliceride iz kokosovog ulja (uključujući Wecobee), kakao maslac, ulje Theobroma i njihove kombinacije.

10. Vaginalni supozitorij prema zahtjevu 9, naznačen time da ekscipijens, razrjeđivač ili nosač je Witepsol H-15.

11. Vaginalni supozitorij prema zahtjevu 8, naznačen time što nadalje sadrži terapijski učinkovitu količinu selektivnog modulatora receptora estrogena, acolbifena.