BRPI0508559B1 - ácido nucleico recombinante, sintético ou isolado, cassete de expressão, vetor ou um veículo de clonagem, célula transformada, polipeptídeos recombinantes, método de produzir um polipeptídeo recombinante, método de desengomação de uma gordura ou um óleo e processo para reduzir a massa de goma e aumentar o ganho de óleo - Google Patents

ácido nucleico recombinante, sintético ou isolado, cassete de expressão, vetor ou um veículo de clonagem, célula transformada, polipeptídeos recombinantes, método de produzir um polipeptídeo recombinante, método de desengomação de uma gordura ou um óleo e processo para reduzir a massa de goma e aumentar o ganho de óleo Download PDF

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Abstract

fosfolipases, ácidos nucléicos codificando-os e métodos para preparar e empregá-los.a invenção fornece novos polipeptídeos que tem atividade de fosfolipase, incluindo, por exemplo, atividade de fosfolipase a, b, c e d, atividade de patatin, fosfatases de ácido fosfatídico (pap) e/ou atividade de acil hidrolase de lipídio (lah), ácidos nucléicos codificando-os e anticorpos que ligam-se a eles. métodos industriais, por exemplo, desengomamento de óleo e produtos compreendendo uso destas fosfolipases são da mesma forma fornecidos.

Description

ÁCIDO NUCLEICO RECOMBINANTE, SINTÉTICO OU ISOLADO, CASSETE DE EXPRESSÃO, VETOR OU UM VEÍCULO DE CLONAGEM, CÉLULA TRANSFORMADA, POLIPEPTÍDEOS RECOMBINANTES, MÉTODO DE PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO RECOMBINANTE, MÉTODO DE DE-SENGOMAÇÃO DE UMA GORDURA OU UM ÓLEO E PROCESSO PARA REDUZIR A MASSA DE GOMA E AUMENTAR O GANHO DE ÓLEO
Campo da Invenção A presente invenção refere-se geralmente a enzimas de fosfoli-pase, polinucleotídeos codificando as enzimas, métodos de preparar e empregar estes polinucleotídeos polipeptídeos. Em particular, a invenção fornece novos polipeptídeos tendo atividade de fosfolipase, ácidos nucléicos codificando-os e anticorpos que ligam-se a eles. Os métodos industriais e produtos compreendendo o uso destas fosfolipases são também fornecidos. Antecedentes As fosfolipases são enzimas que hidrolizam as ligações de éster de fosfolipídeos. Correspondendo à sua importância no metabolismo de fos-folipídeos, estas enzimas são muito difundidas entre os procariotes e eucari-otes. As fosfolipases afetam o metabolismo, construção e reorganização de membranas biológicas e estão envolvidas em cascatas sinal. Diversos tipos de fosfolipases são conhecidos que se diferenciam em sua especificidade de acordo com a posição da ligação ligada na molécula de fosfolipídeo. A fosfolipase A1 (PLA1) remove o ácido graxo de posição 1 para produzir ácido graxo livre e 1-liso2-acilfosfolipídeo. A fosfolipase A2 (PLA2) remove o ácido graxo de posição 2 para produzir o ácido graxo livre e 1-acil-2-lisofos-folipídeo. As enzimas PLA1 e PLA2 podem ser intra- ou extra-celular, ligadas à membrana ou solúveis. A PLA2 intracelular é encontradas em quase toda célula mamífera. A fosfolipase C (PLC) remove a porção de fosfato para produzir éster de fosfato e 1,2 diacilglicerol. A fosfolipase D (PLD) produz 1,2-diacilglicerofosfato e grupo de base. PLC e PLD são importantes em fusão e sinalização celular. PLD tem sido a fosfolipase dominante em biocatá-lise (veja, por exemplo, Godfrey, T. e West S. (1996) Industrial enzymology, 299-300, Stockton Press, Nova Iorque). Patatinas são outro tipo de fosfoli- pase, pensados trabalharem como um PLA (veja, por exemplo, Hirschberg HJ, e outro, (2001), Eur J Biochem 268(19):5037-44).
Sementes oleosas comuns, tais como sojas, semente de colza, girassol, óleo de farelo de arroz, gergelim e amendoim, são empregados como fontes de óleos e carga de alimentação. No processo de extração de óleo, as sementes são mecanicamente e termicamente tratadas. O óleo é separado e dividido da farinha por um solvente. Empregando-se destilação, o solvente é então separador do óleo e recuperado. O óleo é "desengoma-do" e refinado. O teor de solvente na farinha pode ser evaporado por tratamento térmico em uma "torradeira dessolventizadora," seguido por secagem e resfriamento da farinha. Após um solvente ter sido separado por destilação, o óleo bruto produzido é processado em óleo comestível, empregando procedimentos de desengomamento especial e refinamento físico. Ele pode ser utilizado como carga de alimentação para a produção de ácidos graxos e éster de metila. A farinha pode ser empregada para rações animais. O desengomamento é a primeira etapa em refinamento de óleo vegetal e é designado para remover os fosfatídeos contaminantes que são extraídos com o óleo, porém interferem com o subseqüente processamento de óleo. Estes fosfatídeos são solúveis no óleo vegetal apenas em uma forma anidra e podem ser precipitados e removidos se eles foram simplesmente hidratados. A hidratação é usualmente realizada misturando-se uma pequena proporção de água continuação com óleo substancialmente seco. Tipicamente, a quantidade de água é de 75% do teor de fosfatídeos, o que é tipicamente 1 a 1,5 %. A temperatura não é altamente crítica, embora a separação das gomas hidratadas seja melhor quando a viscosidade do óleo é reduzida a 50°C a 80°C.
Muitos métodos para desengomamento de óleo são atualmente empregados. O processo de desengomamento de óleo pode ser enzimati-camente auxiliado empregando-se enzimas de fosfolipases. As fosfolipases A1 e A2 têm sido empregadas para desengomamento de óleo em vários processos comerciais, por exemplo, "desengomamento ENZYMAX®" (Lurgi Life Science Technologies GmbH, Alemanha). A fosfolipase C (PLC) tam- bém tem sido considerada para desengomamento de óleo por que a porção de fosfato gerada por sua ação sobre os fosfolipídeos é muito solúvel em água e fácil de remover e o diglicerídeo permanecería com o óleo e reduziria as perdas; veja, por exemplo, Godfrey, T. e West S. (1996) Industrial Enzymology, pp. 299-300, Stockton Press, Nova Iorque; Dahlke (1998) "An enzymatic process for the physical refining of seed oils," Chem. Eng. Tech-nol. 21:278-281; Clausen (2001) "Enzymatic oil degumming by a novel microbial fosfolipase," Eur. J. Lipid Sci. Technol. 103:333-340.
Os óleos de alto teor de fosfatídeo tais como soja, canola e girassol são processados de modo diferente de outros óleos tal como palma. Ao contrário do processo de vapor ou "refinamento físico" para óleos de baixo teor de fosfatídeo, estes óleos de alto teor de fósforo requerem tratamentos químico e mecânico especiais para remover os fosfolipídeos contendo fósforo. Estes óleos são tipicamente refinados quimicamente em um processo que vincula a neutralização dos ácidos graxos livres para formar sabão e uma fração insolúvel de goma. O processo de neutralização é altamente eficaz na remoção de ácidos graxos livres e fosfolipídeos, porém este processo também resulta em perdas significantes de produção e sacrifícios em qualidade. Em alguns casos, o óleo bruto, de alto teor de fosfatídeo é desengo-mado em uma etapa que precede a neutralização cáustica. Este é o caso de óleo de soja utilizado para lecitina, onde o óleo é primeiro desengomado por água ou ácido.
Os fitosteróis (esteróis de planta) são membros da família de "tri-terpeno" de produtos naturais, que incluem mais do que 100 fitosteróis diferentes e mais do que 4000 outros tipos de triterpenos. Em geral, fitosteróis são pensados estabilizar membranas de planta, com um aumento na ração de esterol/fosfolipídeo levando a rigidez da membrana. Quimicamente, fitos-teróis intimamente se parecem com colesterol na estrutura e são pensados regular a fluidez de membrana em membranas de planta, como o colesterol em membranas de animal. Os fitosteróis principais são β-sitosterol, campes-terol e estigmasterol. Outros incluem estigmastanol (β-sitostanol), sitostanol, desmosterol, diidrobrassicasterol, calinasterol, poriferasterol, clionasterol e brassicasterol.
Esteróis de planta são produtos agrícolas importantes para indústrias nutricionais e de saúde. Eles são emulsificadores úteis para fabricantes de cosméticos e fornecem a maioria dos intermediários de esteróides e precursores para a produção de hormônio farmacêutico. Análogos saturados de fitosteróis e seus ésteres foram sugeridos como agentes redutores de colesterol eficazes com benefícios de saúde cardiológica. Os esteróis de planta reduzem níveis de colesterol de soro inibindo-se a absorção de coles-terol no lúmen intestinal e têm propriedades imunomoduladoras em concentrações extremamente baixas, incluindo resposta celular realçada de linfóci-tos T e capacidade citotóxica de células exterminadoras naturais contra uma cepa celular de câncer. Além disso, seu efeito terapêutico foi demonstrado em estudos clínicos para o tratamento de tuberculose pulmonar, artrite reu-matóide, controle dos pacientes infestados por HIV e inibição de tensão imune em corredores de maratona. Ésteres de esterol de planta, também referidos como ésteres de fitosterol, foram aprovados como GRAS (Geralmente Reconhecido Como Seguro) pela Administração de Fármaco e Alimento dos Estados Unidos (FDA) para uso em margarinas e pastas em 1999. Em setembro de 2000, o FDA da mesma forma emitiu uma regra interina que permite rotulagem de reivindicações de saúde de alimentos contendo éster de fitosterol. Conse-qüentemente, o enriquecimento de alimentos com ésteres de fitosterol é altamente desejado para aceitação do consumidor. Óleo de soja é amplamente empregado e é um gênero alimentício importante, sendo responsável por ~ 30% da produção de óleo a partir de sementes e frutas. Sojas contêm apenas 20% de óleo e a extração é normalmente terminada empregando-se um solvente tal como hexano em uma escala comercial. A qualidade reconhecida de seu óleo e o valor nutritivo da proteína de farinha torna a soja uma semente oleaginosa primária. Antes da extração, as sojas devem ser limpas, quebradas e lascadas como extração de solvente eficiente de óleo requer que toda célula de óleo seja quebrada para melhorar a transferência de massa. Paredes celulares princi- palmente compostas de celulose, associadas com hemiceluloses, substâncias pécticas e lignina), podem da mesma forma ser quebradas por meio de enzimas, para obter uma melhoria significante em taxas e rendimentos de extração. Óleo de diacilglicerol (DAG) é um óleo comestível contendo 80% ou maior quantidade de DAG do que ácidos graxos naturais. Foi mostrado em seres humanos que elevação pós-prandial de triglicerídeo em quilomí-crons é notadamente menor depois da ingestão de uma emulsão de óleo de DAG comparado a um óleo de TAG com uma composição de ácido graxo similar. Em estudos empregando mulheres e homens Americanos e homens Japoneses, o consumo de óleo de DAG a longo prazo promoveu perda de peso e redução de gordura corporal. Um estudo mostrou que a substituição de óleo de DAG por óleo de arte culinária ordinário reduz a incidência de obesidade e similares fatores de risco.
Sumário da Invenção A invenção fornece ácidos nucléicos recombinantes ou isolados compreendendo uma seqüência de ácido nucléico tendo pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou identidade de seqüência completa (100%) para um ácido nucléico exemplar da invenção, por exemplo, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171 ou SEQ ID NO: 173, sobre uma região de pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, ou mais resíduos, e em um aspecto o ácido nucléico codifica um polipeptí-deo tendo pelo menos uma atividade de fosfolipase (PL), por exemplo, uma atividade de fosfolipase A, C ou D, ou qualquer combinação de atividade de fosfolipase, por exemplo, uma atividade de PL A, PL C e/ou PL D como uma atividade multifuncional. Em um aspecto, as identidades de seqüência são determinadas por análise com um algoritmo de comparação de seqüência ou por uma inspeção visual. A invenção fornece ácidos nucléicos recombinantes ou isolados compreendendo uma seqüência de ácido nucléico tendo pelo menos 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%, ou mais, ou identidade de seqüência completa (100%) para SEQ ID NO: 1 sobre uma região de pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 resíduos mais consecutivos, e em um aspecto o ácido nucléico codifica pelo menos um polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase (PL), por exemplo, uma atividade de fosfolipase A, C ou D, ou qualquer combinação de atividade de fosfolipase, por exemplo, uma atividade de PL A, PL C e/ou PL D como uma atividade multifuncional. Em um aspecto, as identidades de seqüência são determinadas por análise com um algoritmo de comparação de seqüência ou por uma inspeção visual. A invenção fornece ácidos nucléicos recombinantes ou isolados compreendendo uma seqüência de ácido nucléico tendo pelo menos 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou identidade de se-qüência completa (100%) para SEQ ID NO: 3 sobre uma região de pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 ou mais resíduos, e em um aspecto o ácido nucléico codifica pelo menos um polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase (PL), por exemplo, uma atividade de fosfolipase A, C ou D, ou qualquer combinação de atividade de fosfolipase, por exemplo, uma atividade de PL A, PL C e/ou PL D como uma atividade multifuncional. Em um aspecto, as identidades de seqüência são determinadas por análise com um algoritmo de comparação de seqüência ou por uma inspeção visual. A invenção fornece ácidos nucléicos recombinantes ou isolados compreendendo uma seqüência de ácido nucléico tendo pelo menos 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou identidade de se-qüência completa (100%) para SEQ ID NO: 5 sobre uma região de pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 ou mais resíduos, e em um aspecto o ácido nucléico codifica pelo menos um polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase (PL), por exemplo, uma atividade de fosfolipase A, C ou D, ou qualquer combinação de atividade de fosfolipase, por exemplo, uma atividade de PL A, PL C e/ou PL D como uma atividade multifuncional. Em um aspecto, as identidades de seqüência são determinadas por análise com um algoritmo de comparação de seqüência ou por uma inspeção visual. A invenção fornece ácidos nucléicos recombinantes ou isolados compreendendo uma seqüência de ácido nucléico tendo pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou identi- dade de seqüência completa (100%) para SEQ ID NO: 7 sobre uma região de pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 ou mais resíduos, e em um aspecto o ácido nucléico codifica pelo menos um polipeptí-deo tendo uma atividade de fosfolipase (PL), por exemplo, uma atividade de fosfolipase A, C ou D, ou qualquer combinação de atividade de fosfolipase, por exemplo, uma atividade de PL A, PL C e/ou PL D como uma atividade multifuncional. Em um aspecto, as identidades de seqüência são determinadas por análise com um algoritmo de comparação de seqüência ou por uma inspeção visual.
Em aspectos alternativos, o ácido nucléico recombinante ou isolado codifica um polipeptídeo compreendendo uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108 SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138; SEQ ID NO: 140; SEQ ID NO: 142; SEQ ID NO: 144; NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, ou SEQ ID NO: 174. Em um aspecto, estes polipeptídeos têm uma fosfolipase, por exemplo, uma atividade de fosfolipase A, B, C ou D, ou qualquer combinação de atividade de fosfolipase, por exemplo, uma atividade de PL A, PL C e/ou PL D como uma atividade multifuncional.
Em um aspecto, o algoritmo de comparação de seqüência é um algoritmo de BLAST, tal como um algoritmo de BLAST versão 2.2.2. Em um aspecto, o ajuste da filtração é fixado para blastall -p blastp -d "nr pataa" - F F e todas as outras opções são fixadas para o padrão.
Em um aspecto, a atividade de fosfolipase compreende catalisar hidrólise de uma ligação de éster de glicerolfosfato (isto é, clivagem de ligações de éster de glicerolfosfato). A atividade de fosfolipase pode compreender hidrólise de catalisação de uma ligação de éster em um fosfolipídeo em um óleo vegetal. O fosfolipídeo de óleo vegetal pode compreender um fosfolipídeo de semente de óleo. A atividade de fosfolipase pode compreender uma atividade de fosfolipase C (PLC); uma atividade de fosfolipase A (PLA), tal como uma atividade de fosfolipase A1 ou fosfolipase A2; uma atividade de fosfolipase D (PLD), tal como uma atividade de fosfolipase D1 ou uma fosfolipase D2; uma atividade de fosfolipase B (PLB), por exemplo, uma atividade de fosfolipase e uma de lisofosfolipase (LPL) ou uma atividade de fosfolipase e uma de lisofosfolipase-transacilase (LPTA) ou uma atividade de fosfolipase e uma de lisofosfolipase (LPL) e atividade de lisofosfolipase-transacilase (LPTA); ou atividade de patatina, ou uma combinação destas. A atividade de fosfolipase pode compreender hidrólise de uma glicoproteína, por exemplo, como uma glicoproteína encontrada em um tubérculo de batata. A atividade de fosfolipase pode compreender uma atividade enzimática de patatina. A atividade de fosfolipase pode compreender uma atividade de lipídio acil hidrolase (LAH). Em um aspecto, uma fosfolipase da invenção pode ter atividade multifuncional, por exemplo, uma combinação de uma ou mais das atividades de enzima descritas aqui, por exemplo, uma fosfolipase da invenção pode ter atividade de PLC e PLA; atividade de PLB e de PLA; atividade de PLC e de PLD; atividade de PLC e de PLB; atividade de PLB e de patatina; atividade de PLC e de patatina; PLD e PLA; atividade de PLD, PLA, PLB e PLC; ou atividade de PLD, PLA, PLB, PLC e de patatina; ou, uma atividade de fosfolipase e uma de lisofosfolipase (LPL) ou uma atividade de fosfolipase e uma de lisofosfolipase-transacilase (LPTA) ou uma atividade de fosfolipase e uma de lisofosfolipase (LPL) e atividade de lisofosfolipase-transacilase (LPTA), ou qualquer combinação destas.
Por exemplo, em um aspecto, um polipeptídeo da invenção é enzimaticamente ativo, porém precisa de uma atividade de lipase, por exemplo, precisa de qualquer atividade enzimática que afeta uma fração de óleo neutra (triglicerídeo). Pode ser desejável usar um tal polipeptídeo em um processo particular, por exemplo, em um processo de desengomação onde é importante que a fração de óleo neutra não seja prejudicada (diminuída, por exemplo, hidrolisada). Desse modo, em um aspecto, a invenção fornece um processo de desengomação compreendendo o uso de um polipep-tídeo da invenção tendo uma atividade de fosfolipase, porém não uma atividade de lipase.
Em um aspecto, o ácido nucléico recombinante ou isolado codifica um polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase que é termoestável. O polipeptídeo pode manter uma atividade de fosfolipase sob condições compreendendo uma faixa de temperatura dentre cerca de 20 °C a cerca de 30 °C, entre cerca de 25 °C a cerca de 40 °C, entre cerca de 37 °C a cerca de 95 °C; entre cerca de 55 °C a cerca de 85 °C, entre cerca de 70 °C a cerca de 95 °C, ou, entre cerca de 90 °C a cerca de 95 °C. Em outro aspecto, o ácido nucléico recombinante ou isolado codifica um polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase que é termotolerante. O polipeptídeo pode manter uma atividade de fosfolipase depois da exposição em uma temperatura na faixa maior do que 37 °C a cerca de 95 °C ou em qualquer lugar na faixa maior do que 55 °C a cerca de 85 °C. Em um aspecto, o polipeptídeo man- tém uma atividade de fosfolipase depois da exposição a uma temperatura na faixa maior do que 90 °C a cerca de 95 °C em pH 4,5. O polipeptídeo pode manter uma atividade de fosfolipase sob condições compreendendo cerca de pH 8, pH 7,5, pH 7, pH 6,5, pH 6,0, pH 5,5, pH 5, ou pH 4,5. O polipeptídeo pode manter uma atividade de fosfolipase sob condições compreendendo uma faixa de temperatura dentre cerca de 40 oC a cerca de 70 oC.
Em um aspecto, o ácido nucléico recombinante ou isolado compreende uma seqüência que hibridiza sob condições rigorosas em uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171 ou SEQ ID NO: 173, em que o ácido nucléico codifica um polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase. O ácido nucléico pode ser pelo menos cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 ou resíduos no comprimento ou o comprimento total do gene ou cópia, com ou sem uma seqüência de sinal, como descrito aqui. As condições rigorosas podem ser altamente severas, moderadamente severas ou de baixa severidade, como descrito aqui. As condições severas podem incluir uma etapa de lavagem, por exemplo, uma etapa de lavagem compreendendo uma lavagem em 0,2X SSC em uma temperatura de cerca de 65 oC durante cerca de 15 minutos. A invenção fornece uma sonda de ácido nucléico para identificar um ácido nucléico codificando um polipeptídeo com uma fosfolipase, por exemplo, uma atividade de fosfolipase, em que a sonda compreende pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, ou mais, bases consecutivas de uma seqüência da invenção, por exemplo, uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 7, e a sonda identifica o ácido nucléico por ligação ou hibridização. A sonda pode compreender um oligonucleotídeo compreendendo pelo menos cerca de 10 a 50, cerca de 20 a 60, cerca de 30 a 70, cerca de 40 a 80, ou cerca de 60 a 100 bases consecutivas de uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 e/ou SEQ ID NO: 7. A invenção fornece uma sonda de ácido nucléico para identificar um ácido nucléico codificando um polipeptídeo com uma fosfolipase, por exemplo, uma atividade de fosfolipase, em que a sonda compreende um ácido nucléico da invenção, por exemplo, um ácido nucléico tendo 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 ou mais resíduos consecutivos; e, em um aspecto, as identidades de seqüência são determinadas por análise com um algoritmo de comparação de seqüência ou por inspeção visual. A invenção fornece um par de seqüência de iniciador de amplificação para amplificar um ácido nucléico codificando um polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase, em que o par de iniciador é capaz de amplificar um ácido nucléico compreendendo uma seqüência da invenção, ou fragmentos ou subseqüências destes. Um ou cada membro do par de seqüência de iniciador de amplificação pode compreender um oligonucleotídeo compreen- dendo pelo menos cerca de 10 a 50 bases consecutivas da seqüência, ou cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 ou mais bases consecutivas da seqüência. A invenção fornece pares de iniciador de amplificação, em que o par de iniciador compreende um primeiro membro tendo uma seqüência mencionada por cerca da primeira (a 5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 ou mais resíduos de um ácido nucléico da invenção, e um segundo membro tendo uma seqüência mencionada em torno da primeira (a 5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 ou mais resíduos do filamento complementar do primeiro membro. A invenção fornece fosfolipases geradas por amplificação, por exemplo, reação em cadeia da polimerase (PCR), empregando um par de iniciador de amplificação da invenção. A invenção fornece métodos para preparar uma fosfolipase por amplificação, por exemplo, reação em cadeia da polimerase (PCR), empregando um par de iniciador de amplificação da invenção. Em um aspecto, o par de iniciador de amplificação amplifica um ácido nucléico a partir de uma biblioteca, por exemplo, uma biblioteca de genes, tal como uma biblioteca ambiental. A invenção fornece métodos de amplificar um ácido nucléico codificando um polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase compreendendo amplificação de um ácido nucléico padrão com um par de seqüência de iniciador de amplificação capaz de amplificar uma seqüência de ácido nu-cléico da invenção, ou fragmentos ou subseqüências destes. O par de inici-ador de amplificação pode ser um par de iniciador de amplificação da invenção. A invenção fornece cassetes de expressão compreendendo um ácido nucléico da invenção ou uma subseqüência destes. Em um aspecto, o cassete de expressão pode compreender o ácido nucléico que é operavel-mente ligado a um promotor. O promotor pode ser um promotor virótico, bac-teriano, mamífero ou de planta. Em um aspecto, o promotor de planta pode ser um promotor de batata, arroz, milho, trigo, tabaco ou cevada. O promotor pode ser um promotor constitutivo. O promotor constitutivo pode compreen- der CaMV35S. Em outro aspecto, o promotor pode ser um promotor induzí-vel. Em um aspecto, o promotor pode ser um promotor específico de tecido ou um promotor desenvolvimentalmente regulado ou um ambientalmente regulado. Desse modo, o promotor pode ser, por exemplo, um promotor específico de semente, um específico de folha, um específico de raiz, um específico de tronco ou um induzido por abscisão. Em um aspecto, o cassete de expressão pode também compreender um vetor de expressão de vírus de planta ou planta. A invenção fornece veículos de clonagem compreendendo um cassete de expressão (por exemplo, um vetor) da invenção ou um ácido nu-cléico da invenção. O veículo de clonagem pode ser um vetor viral, um plasmídeo, um fago, um fagomídeo, um cosmídio, um fosmídeo, um bacte-riófago ou um cromossomo artificial. O vetor viral pode compreender um vetor de adenovírus, um vetor retroviral ou um vetor viral adeno associado. O veículo de clonagem pode compreender um cromossomo artificial bacteriano (BAC), um plamídeo, um vetor derivado de bacteriófago P1 (PAC), um cromossomo artificial de levedura (YAC), ou um cromossomo artificial de mamífero (MAC). A invenção fornece célula transformada compreendendo um ácido nucléico da invenção ou um cassete de expressão (por exemplo, um vetor) da invenção, ou um veículo de clonagem da invenção. Em um aspecto, a célula transformada pode ser uma célula bacteriana, uma célula de mamífero, uma célula fúngica, uma célula de levedura, uma célula de inseto ou uma célula de planta. Em um aspecto, a célula de planta pode ser uma célula de batata, trigo, arroz, milho, tabaco ou cevada. A invenção fornece animais não-humanos transgênicos compreendendo um ácido nucléico da invenção ou um cassete de expressão (por exemplo, um vetor) da invenção. Em um aspecto, o animal é um camundongo, um rato, uma vaca, uma ovelha ou outro mamífero. A invenção fornece plantas transgênicas compreendendo um ácido nucléico da invenção ou um cassete de expressão (por exemplo, um vetor) da invenção. A planta transgênica pode ser uma planta de milho, uma planta de batata, uma planta de tomate, uma planta de trigo, uma planta de semente oleaginosa, uma planta de semente de colza, uma planta de soja, uma planta de arroz, uma planta de cevada ou uma planta de tabaco. A invenção fornece sementes transgênicas compreendendo um ácido nucléico da invenção ou um cassete de expressão (por exemplo, um vetor) da invenção. A semente transgênica pode ser uma semente de milho, uma semente de trigo, uma semente oleaginosa, uma semente de colza (uma planta de canola), uma semente de soja, uma semente de palma, uma semente de girassol, uma semente de gergelim, uma semente de planta de amendoim, arroz ou tabaco. A invenção fornece um oligonucleotídeo anti-sentido compreendendo uma seqüência de ácido nucléico complementar a ou capaz de hibri-dizar sob condições rigorosas em um ácido nucléico da invenção. A invenção fornece métodos de inibir a tradução de uma mensagem de fosfolipase uma célula compreendendo administrar à célula ou expressar na célula um oligonucleotídeo anti-sentido compreendendo uma seqüência de ácido nu-cléico complementar a ou capaz de hibridizar sob condições rigorosas para um ácido nucléico da invenção. A invenção fornece um oligonucleotídeo anti-sentido compreendendo uma seqüência de ácido nucléico complementar a ou capaz de hibri-dizar sob condições rigorosas para um ácido nucléico da invenção. A invenção fornece métodos de inibir a translação de uma mensagem de fosfolipase em uma célula compreendendo administrar à célula ou expressar na célula um oligonucleotídeo anti-sentido compreendendo uma seqüência de ácido nucléico complementar a ou capaz de hibridizar sob condições rigorosas para um ácido nucléico da invenção. O oligonucleotídeo anti-sentido pode estar entre cerca de 10 a 50, cerca de 20 a 60, cerca de 30 a 70, cerca de 40 a 80, cerca de 60 a 100, cerca de 70 a 110, ou cerca de 80 a 120 bases no comprimento. A invenção fornece métodos de inibir a tradução de uma fosfolipase, por exemplo, uma mensagem de fosfolipase em uma célula compreendendo administrar à célula ou expressar na célula um oligonucleotídeo anti-sentido compreendendo uma seqüência de ácido nucléico complementar a ou capaz de hibridizar sob condições rigorosas para um ácido nucléico da invenção. A invenção fornece moléculas de RNA inibidoras de filamento duplo (RNAi) compreendendo uma subseqüência de uma seqüência da invenção. Em um aspecto, o RNAi é cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos dúplexes no comprimento. A invenção fornece métodos de inibir a expressão de uma fosfolipase, por exemplo, uma fosfolipase, em uma célula compreendendo administrar à célula ou expressar na célula um RNA inibidor de filamento duplo (iRNA), em que o RNA compreende uma subseqüência de uma seqüência da invenção. A invenção fornece um polipeptídeo recombinante ou isolado compreendendo uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%, ou mais, ou identidade de seqüência completa (100%) para um polipeptídeo exemplar ou peptídeo da invenção (por exemplo, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID
NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108 SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120 ou SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138; SEQ ID NO: 140; SEQ ID NO: 142; SEQ ID NO: 144; NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, ou SEQ ID NO: 174) sobre uma região de pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 400, 450, 500, 550 ou 600 ou mais resíduos, ou sobre o tamanho natural do polipeptídeo; e, em um aspecto, as identidades de seqüência são determinadas por análise com um algoritmo de comparação de seqüência ou por uma inspeção visual.
Em um aspecto, a invenção fornece um polipeptídeo recombi-nante ou isolado compreendendo uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou identidade de seqüência completa (100%) para SEQ ID NO: 2. Em um aspecto, a invenção fornece um polipeptídeo recombinante ou isolado compreendendo uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou identidade de seqüência completa (100%) para SEQ ID NO: 4. Em um aspecto, a invenção fornece um polipeptídeo recombinante ou isolado compreendendo uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou identidade de seqüência completa (100%) para SEQ ID NO: 6. Em um aspecto, a invenção fornece um polipeptídeo recom-binante ou isolado compreendendo uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou identidade de seqüência completa (100%) para SEQ ID NO: 8.
A invenção fornece polipeptídeos recombinantes ou isolados codificados por um ácido nucléico da invenção. Em aspectos alternativos, o polipeptídeo pode ter uma seqüência mencionada em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108 SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138; SEQ ID NO: 140; SEQ ID NO: 142; SEQ ID NO: 144; NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, ou SEQ ID NO: 174. O polipeptídeo pode ter uma atividade de fos-folipase, por exemplo, uma atividade de fosfolipase A, B, C ou D, ou qualquer combinação de atividade de fosfolipase, por exemplo, uma atividade de PL A, PL C e/ou PL D como uma atividade multifuncional. Por exemplo, em um aspecto, um polipeptídeo da invenção é enzimaticamente ativo, porém necessita de uma atividade de lipase, por exemplo, necessita de qualquer atividade enzimática que afeta uma fração de óleo neutra (triglicerídeo). Em um aspecto, a invenção fornece um processo de desengomação compreendendo uso de um polipeptídeo da invenção tendo uma atividade de fosfoli- pase, porém não uma atividade de lipase, tal que no processo de desengo-mamento de qualquer fração de óleo neutra não é prejudicada (diminuída, alterada, degradada, por exemplo, hidrolisada). A invenção fornece polipeptídeos recombinantes ou isolados compreendendo um polipeptídeo da invenção necessitando de uma seqüên-cia de sinal. Em um aspecto, o polipeptídeo necessitando de uma seqüência de sinal tem pelo menos 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de seqüência para resíduos 30 a 287 de SEQ ID NO: 2, uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais identidade de seqüência para resíduos 25 a 283 de SEQ ID NO: 4, uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais identidade de seqüência a resíduos 26 a 280 de SEQ ID NO: 6, ou, uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais identidade de seqüência para resíduos 40 a 330 de SEQ ID NO: 8. As identidades de seqüência podem ser determinadas por análise com um algoritmo de comparação de seqüência ou por inspeção visual.
Outro aspecto da invenção fornece um polipeptídeo recombinan-te ou isolado ou peptídeo incluindo pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 ou mais bases consecutivas de um polipeptídeo ou seqüência de peptídeo da invenção, seqüências substancialmente idênticas a isso, e as seqüências complementares a isso. O peptídeo pode ser, por exemplo, um fragmento imunogênico, um motivo (por exemplo, um sítio de ligação) ou um sítio ativo.
Em um aspecto, o polipeptídeo recombinante ou isolado da invenção (com ou sem uma seqüência de sinal) tem uma atividade de fosfoli- pase. Em um aspecto, a atividade de fosfolipase compreende catalisar hidrólise de uma ligação de éster de glicerolfosfato (isto é, clivagem de ligações de éster de glicerolfosfato). A atividade de fosfolipase pode compreender catalisar hidrólise de uma ligação de éster em um fosfolipídeo em um óleo vegetal. O fosfolipídeo de óleo vegetal pode compreender um fosfolipídeo de semente oleaginosa. A atividade de fosfolipase pode compreender uma atividade de fosfolipase C (PLC); uma atividade de fosfolipase A (PLA), tal como uma atividade de fosfolipase A1 ou fosfolipase A2; uma atividade de fosfolipase D (PLD), tal como uma atividade de fosfolipase D1 ou uma fosfolipase D2; uma atividade de fosfolipase B (PLB), por exemplo, uma atividade de fosfolipase e uma de lisofosfolipase (LPL) ou uma atividade de fosfolipase e uma de lisofosfolipase-transacilase (LPTA) ou uma atividade de fosfolipase e uma de lisofosfolipase (LPL) e atividade de lisofosfolipase-transacilase (LPTA); ou atividade de patatina, ou uma combinação destas. Por exemplo, em um aspecto uma fosfolipase compreende uma combinação de uma ou mais das atividades de enzima descritas aqui, por exemplo, uma fosfolipase pode ter atividade de PLC e PLA; atividade de PLB e PLA; atividade de PLC e PLD; atividade de PLC e PLB; atividade de PLB e patatina; atividade de PLC e patatina; atividade de PLD e PLA; atividade de PLD, PLA, PLB e PLC; ou atividade de PLD, PLA, PLB, PLC e patatina; ou, uma atividade de fosfolipase e uma de lisofosfolipase (LPL) ou uma atividade de fosfolipase e uma de lisofosfolipase-transacilase (LPTA) ou uma atividade de fosfolipase e uma de lisofosfolipase (LPL) e atividade de lisofosfolipase-transacilase (LPTA), ou qualquer combinação destas. A atividade de fosfolipase pode compreender hidrólise de uma glicoproteína, por exemplo, como uma glicoproteína encontrada em um tubérculo de batata. A atividade de fosfolipase pode compreender uma atividade enzimática de patatina. A atividade de fosfolipase pode compreender uma atividade de lipídio acil hidrolase (LAH).
Em um aspecto, a atividade de fosfolipase é termoestável. O polipeptídeo pode manter uma atividade de fosfolipase sob condições compreendendo uma faixa de temperatura dentre cerca de 20 a cerca de 30 °C, en- tre cerca de 25 °C a cerca de 40 °C, entre cerca de 37 °C a cerca de 95 °C, entre cerca de 55 °C a cerca de 85 °C, entre cerca de 70 °C a cerca de 95 °C, ou entre cerca de 90 °C a cerca de 95 °C. Em outro aspecto, a atividade de fosfolipase pode ser termotolerante. O polipeptídeo pode manter uma atividade de fosfolipase depois da exposição a uma temperatura na faixa maior do que 37 °C a cerca de 95 °C, ou na faixa maior do que 55 °C a cerca de 85 °C. Em um aspecto, o polipeptídeo pode manter uma atividade de fosfolipase depois da exposição a uma temperatura na faixa maior do que 90 °C a cerca de 95 °C em pH 4,5.
Em um aspecto, o polipeptídeo pode manter uma atividade de fosfolipase sob condições compreendendo cerca de pH 6,5, pH 6, pH 5,5, pH 5, pH 4,5 ou pH 4 ou menos (mais acídico). Em um aspecto, o polipeptídeo pode manter uma atividade de fosfolipase sob condições compreendendo cerca de pH 7, pH 7,5 pH 8,0, pH 8,5, pH 9, pH 9,5, pH 10, pH 10,5 ou pH 11 ou mais (mais básico).
Em um aspecto, o polipeptídeo recombinante ou isolado pode compreender o polipeptídeo da invenção necessitando de uma seqüência de sinal. Em um aspecto, o polipeptídeo recombinante ou isolado pode compreender o polipeptídeo da invenção compreendendo uma seqüência de sinal heteróloga, tal como uma seqüência de sinal de não fosfolipase ou fosfoli-pase heteróloga. A invenção fornece peptídeos recombinantes ou isolados compreendendo uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais identidade de seqüência para resíduos 1 a 29 de SEQ ID NO: 2, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais identidade de seqüência para resíduos 1 a 24 de SEQ ID NO: 4, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais identidade de seqüência para resíduos 1 a 25 de SEQ ID NO: 6, ou pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais identidade de seqüência para resíduos 1 a 39 de SEQ ID NO: 8, e para outras seqüências de sinal como mencionado na listagem de SEQ ID, em que as identidades de seqüência são determinadas por análise com um algoritmo de comparação de seqüência ou por inspeção visual. Estes peptídeos po- dem agir como seqüências de sinal em sua fosfolipase endógena, em outra fosfolipase, ou uma proteína heteróloga (uma enzima de não-fosfolipase ou outra proteína). Em um aspecto, a invenção fornece proteínas quiméricas compreendendo um primeiro domínio compreendendo uma seqüência de sinal da invenção e pelo menos um segundo domínio. A proteína pode ser uma proteína de fusão. O segundo domínio pode compreender uma enzima. A enzima pode ser uma fosfolipase. A invenção fornece polipeptídeos quiméricos compreendendo pelo menos um primeiro domínio compreendendo peptídeo de sinal (SP) da invenção ou um domínio catalítico (CD), ou sítio ativo, de uma fosfolipase da invenção e pelo menos um segundo domínio compreendendo um polipeptí-deo ou peptídeo heterólogo, em que o polipeptídeo ou peptídeo heterólogo não está naturalmente associado com o peptídeo de sinal (SP) ou domínio catalítico (CD). Em um aspecto, o polipeptídeo ou peptídeo heterólogo não é uma fosfolipase. O polipeptídeo ou peptídeo heterólogo pode ser terminal de amino para, terminal de carbóxi para ou em ambas as extremidades do pep-tídeo de sinal (SP) ou domínio catalítico (CD). A invenção fornece ácidos nucléicos recombinantes ou isolados codificando um polipeptídeo quimérico, em que o polipeptídeo quimérico compreende pelo menos um primeiro domínio compreendendo peptídeo de sinal (SP) ou um domínio catalítico (CD), ou sítio ativo, de um polipeptídeo da invenção, e pelo menos um segundo domínio compreendendo um poli-peptídeo ou peptídeo heterólogo, em que o polipeptídeo ou peptídeo heteró-logo não está naturalmente associado com o peptídeo de sinal (SP) ou domínio catalítico (CD).
Em um aspecto, a atividade de fosfolipase compreende uma atividade específica a cerca de 37 °C na faixa de cerca de 10 unidades por miligrama a cerca de 100 unidades por miligrama de proteína. Em outro aspecto, a atividade de fosfolipase compreende uma atividade específica de cerca de 100 unidades por miligrama a cerca de 1000 unidades por miligrama, de cerca de 500 unidades por miligrama a cerca de 750 unidades por miligrama de proteína. Alternativamente, a atividade de fosfolipase compreende uma atividade específica a 37°C na faixa de cerca de 100 a cerca de 500 unidades por miligrama de proteína. Em um aspecto, a atividade de fosfolipase compreende uma atividade específica a 37°C na faixa de cerca de 500 a cerca de 1200 unidades por miligrama de proteína. Em outro aspecto, a atividade de fosfolipase compreende uma atividade específica a 37 °C na faixa de cerca de 750 a cerca de 1000 unidades por miligrama de proteína. Em outro aspecto, a termotolerância compreende a retenção de pelo menos a metade da atividade específica da fosfolipase a 37 °C depois ser aquecida em temperatura elevada. Alternativamente, a termotolerância pode compreender a retenção de atividade específica a 37 °C na faixa de cerca de 500 a cerca de 1200 unidades por miligrama de proteína depois de ser aquecida em temperatura elevada. A invenção fornece um polipeptídeo recombinante ou isolado da invenção, em que o polipeptídeo compreende pelo menos um sítio de glico-silação. Em um aspecto, a glicosilação pode ser uma glicosilação ligada por N. Em um aspecto, o polipeptídeo pode ser glicosilado depois de ser expressado em um P. pastoris ou um S. pombe. A invenção fornece enzimas de fosfolipase e os ácidos nucléicos que as codificam, tendo uma seqüência de qualquer das fosfolipases exemplares da invenção com um ou mais ou todos os sítios de glicosilação alterados, como descrito acima. Desse modo, a invenção fornece métodos de preparar fosfolipase variante codificando seqüências tendo expressão aumentada em uma célula hospedeira, onde o método compreende modificar uma seqüência de codificação de fosfolipase da invenção tal que um, vários ou todos os motivos de codificação de sítio de glicosilação ligados por N são modificados em um motivo não-glicosilado. A invenção da mesma forma fornece seqüência de codificação de fosfolipase feita por este processo, e as enzimas que elas codificam. A invenção fornece métodos para preparar uma seqüência de codificação de fosfolipase variante codificando uma fosfolipase tendo resistência aumentada a uma protease compreendendo modificar um aminoácido equivalente a posição 131 de SEQ ID NO: 2 em um, vários ou todos os se- guintes resíduos: Lisina (K); Serina (S); Glicina (G); Arginina (R); Glutamina (Q); Alanina (A); Isoleucina (I); Histidina (H); Fenilalanina (F); Treonina (T); Metionina (M) Leucina (L), incluindo variantes para SEQ ID NO: 2 (e o ácido nucléico que os codifica) tendo estas modificações exemplares. A invenção da mesma forma fornece fosfolipases recombinantes ou sintéticas isoladas codificadas por uma seqüência feita por este método. A invenção fornece métodos para preparar uma seqüência de codificação de fosfolipase variante codificando uma fosfolipase tendo resistência diminuída em uma protease compreendendo modificar um aminoácido equivalente a posição 131 de SEQ ID NO: 2 em um, vários ou todos os seguintes resíduos: Triptofano (W); Glutamato (E); Tirosina (Y), incluindo variantes para SEQ ID NO: 2 (e o ácido nucléico que os codifica) tendo estas modificações exemplares. A invenção da mesma forma fornece fosfolipases recombinantes ou sintéticas isoladas codificadas por uma seqüência feita por este método. A invenção fornece preparações de proteína compreendendo um polipeptídeo da invenção, em que a preparação de proteína compreende um líquido, um sólido ou um gel. A invenção fornece heterodímeros compreendendo um polipep-tídeo da invenção e uma segunda proteína ou domínio. O segundo membro do heterodímero pode ser uma fosfolipase diferente, uma enzima diferente ou outra proteína. Em um aspecto, o segundo domínio pode ser um polipep-tídeo e o heterodímero pode ser uma proteína de fusão. Em um aspecto, o segundo domínio pode ser um epítopo ou um rótulo. Em um aspecto, a invenção fornece homodímeros compreendendo um polipeptídeo da invenção. A invenção fornece polipeptídeos imobilizados tendo uma atividade de fosfolipase, em que o polipeptídeo compreende um polipeptídeo da invenção, um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção, ou um polipeptídeo compreendendo um polipeptídeo da invenção e um segundo domínio (por exemplo, uma proteína de fusão). Em um aspecto, um polipeptídeo da invenção é imobilizado em uma célula, uma vesícula, um lipos-soma, uma película, uma membrana, um metal, uma resina, um polímero, uma cerâmica, um vidro, um microeletrodo, uma partícula grafítica, uma conta, um gel, uma placa, cristais, um comprimido, uma pílula, uma cápsula, um pó, um aglomerado, uma superfície, uma estrutura porosa, uma disposição ou um tubo capilar. Em um aspecto, um polipeptídeo da invenção é imobilizado em materiais tais como grãos, cascas secas, casca, pele, cabelo, esmalte, osso, concha e materiais derivados deles, ou materiais de alimento de animais ou uma combinação destes.
Polipeptídeos da invenção (por exemplo, fosfolipases) podem estar da mesma forma presentes sozinhos ou como mistura de fosfolipases ou fosfolipases e outras enzimas hidrolíticas tais como celulases, xilanases, protease, lipases, amilases ou enzimas de oxirredução tais como lacases, peroxidases, catalases, oxidases ou redutases. Elas podem ser formuladas em uma forma sólida tal como um pó, preparações liofilizadas, grânulos, comprimidos, barras, cristais, cápsulas, pílulas, péletes, ou em uma forma líquida tal como uma solução aquosa, um aerossol, um gel, uma pasta, uma suspensão, uma emulsão aquosa/óleo, um creme, uma cápsula, suspensão micelar ou vesicular. Em um aspecto, estas formulações da invenção podem compreender qualquer ou uma combinação dos seguintes ingredientes: po-lióis tais como polietileno glicóis, polivinilálcoois, glicerol, açúcares tais como sacarose, sorbitol, trealose, glicose, frutose, maltose, agentes de gelação tais como goma guar, carrageninas, alginatos, dextranas, derivados celulósi-cos, pectinas, sais tais como cloreto de sódio, sulfato de sódio, sulfato de amônio, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, cloreto de zinco, sulfato de zinco, sais de ácidos graxos e seus derivados, quelantes de metal tais como EDTA, EGTA, citrato de sódio, agentes antimicrobianos tais como ácidos graxos, derivados destes, parabenos, sorbatos, benzoatos, adicionalmente compostos para bloquear o impacto de protease tais como proteínas encorpadas, tais como BSA, hidrolisados de trigo, compostos de borato, emulsifi-cadores tais como detergentes não-iônicos e iônicos podem ser empregados sozinhos ou em combinação, fitosteróis, vitaminas, aminoácidos, agentes de redução, tais como compostos de cisteína ou antioxidante tal como ácido ascórbico pode ser incluído bem como dispersantes.
Em um aspecto, a reticulação e modificação de proteína tal como peguilação, modificação de ácido graxo e glicosilação são empregados para melhorar a estabilidade de um polipeptídeo da invenção (por exemplo, estabilidade de enzima). Em um aspecto, os polióis e/ou açúcares compreendem de cerca de 5% a cerca de 60%, ou mais, da formulação, de cerca de 10% a cerca de 50% da formulação, de cerca de 20% a cerca de 40% da formulação, ou de cerca de 5% a cerca de 20% da formulação. Em outro aspecto, os agentes de gelação compreendem de cerca de 0,5% a cerca de 10% da formulação, de cerca de 1% a cerca de 8% da formulação, de cerca de 2% a cerca de 5% da formulação, ou de cerca de 0,5% a cerca de 3% da formulação. Em outro aspecto, os sais tais como cloreto de sódio, sulfato de sódio, sulfato de amônio, cloreto de cálcio e/ou cloreto de magnésio compreendem de cerca de 1% a cerca de 30% da formulação, de cerca de 2% a cerca de 20% da formulação, de cerca de 5% a cerca de 15% da formulação, ou de cerca de 1% a cerca de 10% da formulação. Em outro aspecto, cloreto de zinco estão presentes na formulação em concentrações compreendendo de cerca de 0,1 mM a cerca de 20 mM, de cerca de 0,5 mM a cerca de 10 mM, de cerca de 1 mM a cerca de 5 mM, ou de cerca de 0,1 mM a cerca de 5 mM). Em ainda outro aspecto, sulfato de zinco está presente na formulação em concentrações compreendendo de cerca de 0,1 mM a cerca de 20 mM, de cerca de 0,5 mM a cerca de 10 mM, de cerca de 1 mM a cerca de 5 mM, ou de cerca de 0,1 mM a cerca de 5 mM). Em outro aspecto, sais de ácidos graxo e/ou seus derivados compreendem de cerca de 5% a cerca de 40% da formulação, de cerca de 10% a cerca de 30% da formulação, de cerca de 15% a cerca de 25% da formulação, ou de cerca de 5% a cerca de 20% da formulação. Em outro aspecto, queladores de metal tal como EDTA, EGTA, e/ou citrato de sódio está presente na formulação em concentrações compreendendo de 0,1 mM a cerca de 10 mM), de cerca de 0,5 mM a cerca de 8 mM, de cerca de 1 mM a cerca de 5 mM, ou de cerca de 0,1 mM a cerca de 1 mm. Em outro aspecto, antimicrobianos tais como parabenos, sorbatos e/ou benzoatos compreendem de cerca de 0,01% a cerca de 10% da formulação, de cerca de 0,05% a cerca de 5% da formulação, de cerca de 0,1% a cerca de 1% da formulação, ou de cerca de 0,05% a cerca de 0,5% da formulação. Em ainda outro aspecto, proteínas encorpadas tal como BSA e/ou hidrolisados de trigo compreendem de cerca de 1% a cerca de 20% da formulação, de cerca de 5% a cerca de 15% da formulação, de cerca de 2,5% a cerca de 7,5% da formulação, ou de cerca de 1 % a cerca de 5% da formulação. Em outro aspecto, emulsificadores tais como detergentes iônicos e/ou não-iônicos estão presentes na formulação em concentrações compreendendo de cerca de 1X de concentração de micela crítica (CMC) a cerca de 10X de CMC, de cerca de 2,5X de CMC a cerca de 7,5X de CMC, de cerca de 1X de CMC a cerca de 5X de CMC, ou de cerca de 3X de CMC a cerca de 6X de CMC. Em outro aspecto, vitaminas, aminoácidos, agentes de redução e/ou compostos antioxidantes compreendem de cerca de 0,1% a cerca de 5% da formulação, de cerca de 0,5% a cerca de 4% da formulação, de cerca de 1% a cerca de 2,5% da formulação, ou de cerca de 0,1% a cerca de 1% da formulação. A invenção fornece disposições compreendendo um polipeptídeo imobilizado, em que o polipeptídeo é uma fosfolipase da invenção ou é um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção. A invenção fornece disposições compreendendo um ácido nucléico imobilizado da invenção. A invenção fornece uma disposição compreendendo um anticorpo imobilizado da invenção. A invenção fornece anticorpos recombinantes ou isolados que especificamente ligam-se a um polipeptídeo da invenção ou a um polipeptí-deo codificado por um ácido nucléico da invenção. O anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal ou um policlonal. A invenção fornece hibridomas compreendendo um anticorpo da invenção. A invenção fornece métodos de isolar ou identificar um polipeptí-deo com uma atividade de fosfolipase compreendendo as etapas de: (a) fornecer um anticorpo da invenção; (b) fornecer uma amostra compreendendo polipeptídeos; e, (c) contatar a amostra da etapa (b) com o anticorpo da etapa (a) sob condições em que o anticorpo pode especificamente ligar-se ao polipeptídeo, desse modo isolando ou identificando uma fosfolipase. A in- venção fornece métodos de preparar um anticorpo antifosfolipase compreendendo administrar a um animal não-humano um ácido nucléico da invenção, ou um polipeptídeo da invenção, em uma quantidade suficiente para gerar uma resposta imune humoral, desse modo preparando um anticorpo antifosfolipase. A invenção fornece métodos de produzir um polipeptídeo recom-binante compreendendo as etapas de: (a) fornecer um ácido nucléico da invenção operalvelmente ligada a um promotor; e, (b) expressar o ácido nucléico de etapa (a) sob condições que permitem expressão do polipeptídeo, desse modo produzindo um polipeptídeo recombinante. O ácido nucléico pode compreender uma seqüência tendo pelo menos 85% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 1 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 3 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 5 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, ou tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 7 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, em que as identidades de seqüência são determinadas por análise com um algoritmo de comparação de seqüência ou por inspeção visual. O ácido nucléico pode compreender um ácido nucléico que hibridiza sob condições rigorosas para um ácido nucléico como mencionado em SEQ ID NO: 1, ou um subseqüência destes; uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 3, ou uma subseqüência destes; uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 5, ou uma subseqüência destes; ou, uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 7, ou uma subseqüência destes. O método pode também compreender transformar uma célula hospedeira com o ácido nucléico da etapa (a) seguido expressando-se o ácido nucléico de etapa (a), desse modo produzindo um polipeptídeo recombinante em uma célula transformada. O método pode também compreender inserir em um animal não-humano hospedeiro o ácido nucléico da etapa (a) seguido expressando-se o ácido nucléico da etapa (a), desse modo produzindo um polipeptídeo recombinante no animal não-humano hospedeiro. A invenção fornece métodos para identificar um polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer um polipeptídeo da invenção ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção ou um fragmento ou variante deste, (b) fornecer um substrato de fosfolipase; e, (c) contatar o polipeptídeo ou um fragmento ou variante destes da etapa (a) com o substrato da etapa (b) e detectar um aumento na quantidade de substrato ou uma diminuição na quantidade de produto de reação, em que uma diminuição na quantidade do substrato ou um aumento na quantidade do produto de reação detecta um polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase. Em aspectos alternativos, o ácido nucléico compreende uma seqüência tendo pelo menos 85% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 1 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 3 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 5 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, ou tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 7 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, em que as identidades de seqüência são determinadas por análise com um algoritmo de comparação de seqüência ou por inspeção visual. Em aspectos alternativos o ácido nucléico hibridiza sob condições rigorosas uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 1, ou uma subseqüência desta; uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 3, ou uma subseqüência desta; uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 5, ou uma subseqüência desta; ou, uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 7, ou uma subseqüência desta. A invenção fornece métodos para identificar um substrato de fosfolipase compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer um polipeptídeo da invenção ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer um substrato teste; e, (c) contatar o polipeptídeo da etapa (a) com o substrato teste da etapa (b) e detectar um aumento na quantidade de substrato ou uma diminuição na quantidade de produto de reação, em que uma diminuição na quantidade do substrato ou um aumento na quanti- dade do produto de reação identifica o substrato teste como um substrato de fosfolipase. Em aspectos alternativos, o ácido nucléico pode ter pelo menos 85% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 1 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, pelo menos 80% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 3 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, pelo menos 80% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 5 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, ou, pelo menos 70% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 7 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, em que as identidades de seqüência são determinadas por análise com um algoritmo de comparação de seqüência ou por inspeção visual. Em aspectos alternativos, o ácido nucléico hibridiza sob condições rigorosas para uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 1, ou uma subseqüência desta; uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 3, ou uma subseqüência desta; uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 5, ou uma subseqüência desta; ou, uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 7, ou uma subseqüência desta. A invenção fornece métodos de determinar se um composto especificamente liga-se a uma fosfolipase compreendendo as seguintes etapas: (a) expressar um ácido nucléico ou um vetor compreendendo o ácido nucléico sob condições permissivas para translação do ácido nucléico para um polipeptídeo, em que o ácido nucléico e vetor compreendem um ácido nucléico ou vetor da invenção; ou, fornecer um polipeptídeo da invenção (b) contatar o polipeptídeo com o composto teste; e, (c) determinar se o composto teste especificamente liga-se ao polipeptídeo, desse modo determinando que o composto especificamente liga-se a fosfolipase. Em aspectos alternativos, a seqüência de ácido nucléico tem pelo menos 85% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 1 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, pelo menos 80% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 3 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, pelo menos 80% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 5 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, ou, pelo menos 70% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 7 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, em que as identidades de seqüência são determinadas por análise com um algoritmo de comparação de seqüência ou por inspeção visual. Em aspectos alternativos, o ácido nucléico hibridiza sob condições rigorosas para uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 1, ou uma subseqüencia desta; uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 3, ou uma subseqüencia desta; uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 5, ou uma subseqüencia desta; ou, uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 7, ou uma subseqüencia desta. A invenção fornece métodos para identificar um modulador de uma atividade de fosfolipase compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer um polipeptídeo da invenção ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer um composto teste; (c) contatar o polipeptídeo de etapa (a) com o composto teste de etapa (b); e, medir uma atividade do fosfolipase, em que uma mudança na atividade de fosfolipase medida na presença do composto teste comparada à atividade na ausência do composto teste fornece uma determinação que o composto teste modula a atividade de fosfolipase. Em aspectos alternativos, o ácido nucléico pode ter pelo menos 85% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 1 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, pelo menos 80% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 3 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, pelo menos 80% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 5 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, ou, pelo menos 70% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 7 sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, em que as identidades de seqüência são determinadas por análise com um algoritmo de comparação de seqüên-cia ou por inspeção visual. Em aspectos alternativos, o ácido nucléico pode hibridizar sob condições rigorosas para uma seqüência de ácido nucléico selecionado a partir do grupo consistindo em uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 1, ou uma subseqüência desta; uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 3, ou uma subseqüência desta; uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 5, ou uma subseqüência desta; e, uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 7, ou uma subseqüência des- ta.
Em um aspecto, a atividade de fosfolipase é medida fornecendo-se um substrato de fosfolipase e detectando-se um aumento na quantidade do substrato ou uma diminuição na quantidade de um produto de reação. A diminuição na quantidade do substrato ou o aumento na quantidade do produto de reação com o composto teste quando comparado à quantidade de substrato ou produto de reação sem o composto teste identifica o composto teste como um ativador de atividade de fosfolipase. O aumento na quantidade do substrato ou a diminuição na quantidade do produto de reação com o composto teste quando comparado à quantidade de substrato ou produto de reação sem o composto teste identifica o composto teste como um inibidor de atividade de fosfolipase. A invenção fornece sistemas de computador compreendendo um processador e um dispositivo de armazenamento de dados em que o referido dispositivo de armazenamento de dados tem armazenado nele uma seqüência de polipeptídeo da invenção ou uma seqüência de ácido nucléico da invenção.
Em um aspecto, o sistema de computador pode também compreender um algoritmo de comparação de seqüência e um dispositivo de armazenamento de dados tendo pelo menos uma seqüência de referência armazenada nele. O algoritmo de comparação de seqüência pode compreender um programa de computador que indica polimorfismos. O sistema de computador pode também compreender um identificador que identifica uma ou mais características na referida seqüência. A invenção fornece meios legíveis de computador tendo armazenado nele uma seqüência compreendendo uma seqüência de polipeptídeo da invenção ou uma seqüência de ácido nucléico da invenção. A invenção fornece métodos para identificar uma característica em uma seqüência compreendendo as etapas de: (a) ler a seqüência empregando um programa de computador que identifica uma ou mais características em uma seqüência, em que a seqüência compreende uma seqüên-cia de polipeptídeo da invenção ou uma seqüência de ácido nucléico da in- venção; e, (b) identificar uma ou mais características na seqüência com o programa de computador. A invenção fornece métodos para comparar uma primeira seqüência a uma segunda seqüência compreendendo as etapas de: (a) ler a primeira seqüência e a segunda seqüência através do uso de um programa de computador que compara seqüências, em que a primeira seqüência compreende uma seqüência de polipeptídeo da invenção ou uma seqüência de ácido nucléico da invenção; e, (b) determinar diferenças entre a primeira seqüência e a segunda seqüência com o programa de computador. Em um aspecto, a etapa de determinar diferenças entre a primeira seqüência e a segunda seqüência também compreende a etapa de identificar polimorfis-mos. Em um aspecto, o método também compreende um identificador (e uso do identificador) que identifica uma ou mais características em uma seqüên-cia. Em um aspecto, o método compreende ler a primeira seqüência empregando um programa de computador e identificar uma ou mais características na seqüência. A invenção fornece métodos para isolar ou recuperar um ácido nucléico codificando um polipeptídeo com uma atividade de fosfolipase a partir de uma amostra ambiental compreendendo as etapas de: (a) fornecer um par de seqüência de iniciador de amplificação para amplificar um ácido nucléico codificando um polipeptídeo com uma atividade de fosfolipase, em que o par de iniciador é capaz de amplificar um ácido nucléico da invenção (por exemplo, SEQ ID NO: 1, ou uma subseqüência desta; SEQ ID NO: 3, ou uma subseqüência desta; SEQ ID NO: 5, ou uma subseqüência desta; ou SEQ ID NO: 7, ou uma subseqüência desta, etc.); (b) isolar um ácido nucléico a partir da amostra ambiental ou tratar a amostra ambiental tal que o ácido nucléico na amostra é acessível para hibridização ao par de iniciador de amplificação; e, (c) combinar o ácido nucléico de etapa (b) com o par de iniciador de amplificação da etapa (a) e amplificar o ácido nucléico a partir da amostra ambiental, desse modo isolando ou recuperando um ácido nucléico codificando um polipeptídeo com uma atividade de fosfolipase a partir de uma amostra ambiental. Em um aspecto, cada membro do par de iniciador de seqüência de amplificação compreende um oligonucleotídeo compreendendo pelo menos cerca de 10 a 50 bases consecutivas de uma seqüência de ácido nucléico da invenção. Em um aspecto, o par de iniciador da se-qüência de amplificação é um par de amplificação da invenção. A invenção fornece métodos para isolar ou recuperar um ácido nucléico codificando um polipeptídeo com uma atividade de fosfolipase a partir de uma amostra ambiental compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma sonda de polinucleotídeo compreendendo uma seqüência de ácido nu-cléico da invenção, ou uma subseqüência desta; (b) isolar um ácido nucléico a partir da amostra ambiental ou tratar a amostra ambiental tal que o ácido nucléico na amostra está acessível para hibridização em uma sonda de poli-nucleotídeo da etapa (a); (c) combinar o ácido nucléico isolado ou a amostra ambiental tratada da etapa (b) com a sonda de polinucleotídeo da etapa (a); e, (d) isolar um ácido nucléico que especificamente hibridiza com a sonda de polinucleotídeo da etapa (a), desse modo isolando ou recuperando um ácido nucléico codificando um polipeptídeo com uma atividade de fosfolipase a partir da amostra ambiental. Em aspectos alternativos, a amostra ambiental compreende uma amostra de água, uma amostra líquida, uma amostra de solo, uma amostra de ar ou uma amostra biológica. Em aspectos alternativos, a amostra biológica é derivada a partir de uma célula bacteriana, uma célula de protozoário, uma célula de inseto, uma célula de levedura, uma célula de planta, uma célula fúngica, uma célula algal (algas), um líquen, ou uma célula de mamífero. A invenção fornece métodos de gerar uma variante de um ácido nucléico codificando uma fosfolipase compreendendo as etapas de: (a) fornecer um ácido nucléico padrão compreendendo um ácido nucléico da invenção; (b) modificar, deletar ou somar um ou mais nucleotídeos na seqüên-cia padrão, ou uma combinação destes, para gerar uma variante do ácido nucléico padrão.
Em um aspecto, o método também compreende expressar o ácido nucléico variante para gerar um polipeptídeo de fosfolipase variante. Em aspectos alternativos, as modificações, adições ou deleções são introduzi- dos por PCR propensa ao erro, embaralhamento, mutagênese direcionada ao oligonucleotídeo, PCR de reunião, mutagênese de PCR sexual, mutagênese in vivo, mutagênese de cassete, mutagênese de conjunto recursiva, mutagênese de conjunto exponencial, mutagênese sítio específica, reagru-pamento de gene, Gene Site Saturation Mutagenesis® (GSSM®), reagrupa-mento de ligação sintética (SLR) e/ou uma combinação destes. Em aspectos alternativos, as modificações, adições ou deleções são introduzidos por um método selecionado a partir do grupo consistindo em recombinação, recom-binação de seqüência recursiva, mutagênese de DNA modificada por fosfoti-oato, mutagênese padrão contendo uracila, mutagênese de dúplex com espaço, mutagênese de reparo de ligação imperfeita pontual, mutagênese de cepa hospedeira deficiente de reparo, mutagênese química, mutagênese radiogênica, mutagênese de deleção, mutagênese de restrição-seleção, mu-tagênese de restrição-purificação, síntese de gene artificial, mutagênese de conjunto, criação de multímero de ácido nucléico quimérico e/ou uma combinação destes.
Em um aspecto, o método é iterativamente repetido até que uma fosfolipase tendo uma atividade diferente ou alterada ou estabilidade diferente do que de uma fosfolipase codificada pelo ácido nucléico padrão seja produzida. Em um aspecto, a atividade diferente ou alterada é uma atividade de fosfolipase sob uma condição acídica, em que a fosfolipase codificada pelo ácido nucléico padrão não é ativa sob a condição acídica. Em um aspecto, atividade diferente ou alterada é uma atividade de fosfolipase sob uma temperatura alta, em que a fosfolipase codificada pelo ácido nucléico padrão não é ativa sob temperatura alta. Em um aspecto, o método é iterativamente repetido até que uma seqüência de codificação de fosfolipase tendo um uso de códon alterado a partir de que do ácido nucléico padrão seja produzida. O método pode ser iterativamente repetido até que um gene de fosfolipase tendo nível mais alto ou mais baixo de expressão de mensagem ou estabilidade do que do ácido nucléico padrão seja produzido. A invenção fornece métodos para modificar códons em um ácido nucléico codificando uma fosfolipase para aumentar sua expressão em uma célula hospedeira, o método compreendendo (a) fornecer um ácido nucléico da invenção codificando uma fosfolipase; e, (b) identificar um códon menos preferido ou não preferido no ácido nucléico da etapa (a) e substituí-lo com um códon neutralmente empregado ou preferido codificando o mesmo ami-noácido como o códon substituído, em que um códon preferido é um códon supra-representado codificando seqüências em genes na célula hospedeira e um códon menos preferido ou não-preferido é um códon sub-representado codificando seqüências em genes na célula hospedeira, desse modo modificando o ácido nucléico para aumentar sua expressão em uma célula hospedeira. A invenção fornece métodos para modificar códons em um ácido nucléico codificando uma fosfolipase, o método compreendendo (a) fornecer um ácido nucléico da invenção codificando uma fosfolipase; e, (b) identificar um códon no ácido nucléico da etapa (a) e substituí-lo com um códon diferente codificando o mesmo aminoácido como o códon substituído, desse modo modificando códons em um ácido nucléico codificando uma fosfoli-pase. A invenção fornece métodos para modificar códons em um ácido nucléico codificando uma fosfolipase para aumentar sua expressão em uma célula hospedeira, o método compreendendo (a) fornecer um ácido nucléico da invenção codificando uma fosfolipase; e, (b) identificar um códon menos preferido ou não preferido no ácido nucléico de etapa (a) e substituí-lo com um códon neutralmente preferido ou preferido codificando o mesmo aminoá-cido como o códon substituído, em que um códon preferido é um códon su-pra-representado na codificação das seqüências em genes na célula hospedeira e um códon menos preferido ou não preferido é um códon sub-representado em seqüências de codificação em genes na célula hospedeira, desse modo modificando o ácido nucléico para aumentar sua expressão em uma célula hospedeira. A invenção fornece métodos para modificar um códon em um ácido nucléico codificando uma fosfolipase para diminuir sua expressão em uma célula hospedeira, o método compreendendo (a) fornecer um ácido nu- cléico da invenção codificando uma fosfolipase; e, (b) identificar pelo menos um códon preferido no ácido nucléico da etapa (a) e substituí-lo com um có-don menos preferido ou não preferido codificando o mesmo aminoácido como o códon substituído, em que um códon preferido é um códon supra-representado em seqüências de codificação em genes em uma célula hospedeira e um códon menos preferido ou não preferido é um códon sub-representado em seqüências de codificação em genes na célula hospedeira, desse modo modificando o ácido nucléico para diminuir sua expressão em uma célula hospedeira. Em aspectos alternativos, a célula hospedeira é uma célula bacteriana, uma célula fúngica, uma célula de inseto, uma célula de levedura, uma célula de planta, uma célula de alga (algas), um líquen ou uma célula mamífero. A invenção fornece métodos para produzir uma biblioteca de ácidos nucléicos que codificam uma pluralidade de sítios ativos de fosfolipase modificados ou sítios de ligação de substrato, em que os locais ativos modificados ou sítios de ligação de substrato são derivados de um primeiro ácido nucléico compreendendo uma seqüência que codifica um primeiro sítio ativo ou um primeiro sítio de ligação de substrato, o método compreendendo: (a) fornecer um primeiro ácido nucléico codificando um primeiro sítio ativo ou primeiro sítio de ligação de substrato, em que a primeira seqüência de ácido nucléico compreende um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer um conjunto de oligonucleotídeos mutagênicos que codificam variantes de aminoácido de ocorrência natural em uma pluralidade de códons alvejados no primeiro ácido nucléico; e, (c) empregar o conjunto de oligonucleotídeos mu-tagênicos para gerar um conjunto de ácidos nucléicos variantes de codificação de sítio de ligação de substrato ou codificação de sítio ativo codificando uma faixa de variações de aminoácido em cada códon de aminoácido que foi mutagenizado, desse modo produzindo uma biblioteca de ácidos nucléicos codificando uma pluralidade de sítios ativos de fosfolipase modificados ou sítios de ligação de substrato. Em aspectos alternativos, o método compreende mutagenizar o primeiro ácido nucléico da etapa (a) por um método compreendendo um sistema de evolução direcionado otimizado, Gene Site Saturation Mutagenesis® (GSSM®), e reagrupamento de ligação sintética (SLR). O método pode também compreender mutagenizar o primeiro ácido nucléico da etapa (a) ou variantes por um método compreendendo PCR propensa ao erro, embaralhamento, mutagênese direcionada ao oligonucleotí-deo, PCR de reunião, mutagênese de PCR sexual, mutagênese in vivo, mutagênese de cassete, mutagênese de conjunto recursiva, mutagênese de conjunto exponencial, mutagênese sítio específica, reagrupamento de gene, Gene Site Saturation Mutagenesis® (GSSM®), reagrupamento de ligação sintética (SLR) e uma combinação destes. O método pode também compreender mutagenizar o primeiro ácido nucléico da etapa (a) ou variantes por um método compreendendo recombinação, recombinação de seqüência re-cursiva, mutagênese de DNA modificada por fosfotioato, mutagênese padrão contendo uracila, mutagênese de dúplex com espaço, mutagênese de reparo de ligação imperfeita pontual, mutagênese de cepa hospedeira deficiente de reparo, mutagênese química, mutagênese radiogênica, mutagênese de deleção, mutagênese de restrição-seleção, mutagênese de restrição-purificação, síntese de gene artificial, mutagênese de conjunto, criação de multímero de ácido nucléico quimérico e uma combinação destes. A invenção fornece métodos para preparar uma molécula pequena compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma pluralidade de enzimas biossintéticas capazes de sintetizar ou modificar uma molécula pequena, em que uma das enzimas compreende uma enzima de fosfolipase codificada por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer um substrato para pelo menos uma das enzimas da etapa (a); e, (c) reagir o substrato da etapa (b) com as enzimas sob as condições que facilitam uma pluralidade de reações biocatalíticas para gerar uma molécula pequena por uma série de reações biocatalíticas. A invenção fornece métodos para modificar uma molécula pequena compreendendo as etapas: (a) fornecer uma enzima de fosfolipase codificada por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer uma molécula pequena; e, (c) reagir a enzima da etapa (a) com a molécula pequena da etapa (b) sob as condições que facilitam uma reação enzimática catalisada pela enzima de fosfolipase, desse modo modificando uma molécula pequena por uma reação enzimática de fosfolipase. Em um aspecto, o método compreende fornecer uma pluralidade de substratos de molécula pequena para a enzima da etapa (a), desse modo gerando uma biblioteca de moléculas pequenas modificadas produzidas por pelo menos uma reação enzimática catalisada pela enzima de fosfolipase. Em um aspecto, o método também compreende uma pluralidade de enzimas adicionais sob as condições que facilitam uma pluralidade de reações biocatalíticas pelas enzimas para formar uma biblioteca de moléculas pequenas modificadas produzidas pela pluralidade de reações enzimáticas. Em um aspecto, o método também compreende a etapa de testar a biblioteca para determinar se uma molécula pequena modificada particular que exibe uma atividade desejada está presente dentro da biblioteca. A etapa de testar a biblioteca pode também compreender as etapas de sistemicamente eliminar todas menos uma das reações biocatalíticas empregadas para produzir uma porção da pluralidade das moléculas pequenas modificadas dentro da biblioteca testando-se a porção da molécula pequena modificada quanto a presença ou ausência da molécula pequena modificada particular com uma atividade desejada, e identificando-se pelo menos uma reação biocatalítica específica que produz a molécula pequena modificada particular da atividade desejada. A invenção fornece métodos para determinar um fragmento funcional de uma enzima de fosfolipase compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma enzima de fosfolipase compreendendo uma seqüência de aminoácido da invenção; e, (b) deletar uma pluralidade de resíduos de aminoácido a partir da seqüência da etapa (a) e testar a subseqüência restante para uma atividade de fosfolipase, desse modo determinando um fragmento funcional de uma enzima de fosfolipase. Em um aspecto, a atividade de fosfolipase é medida fornecendo-se um substrato de fosfolipase e detectando-se um aumento na quantidade do substrato ou uma diminuição na quantidade de um produto de reação. Em um aspecto, uma diminuição na quantidade de um substrato de enzima ou um aumento na quantidade do produto de reação com o composto teste quando comparado à quantidade de substrato ou produto de reação sem o composto teste identifica o composto teste como um ativador de atividade de fosfolipase. A invenção fornece métodos para clivar uma ligação de éster de glicerolfosfato compreendendo as etapas seguintes: (a) fornecer um polipeptídeo que tem uma atividade de fosfolipase, em que o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido da invenção, ou o polipeptídeo é codificado por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer uma composição compreendendo uma ligação de éster de glicerolfosfato; e, (c) contatar o polipeptídeo da etapa (a) com a composição da etapa (b) sob as condições em que o polipeptídeo cliva a ligação de éster de glicerolfosfato. Em um aspecto, as condições compreendem entre cerca pH 5 a cerca 8,5, ou, entre cerca de pH 4,5 (ou mais acídico, isto é, pH < 4,5) a cerca 9,0 (ou mais alcalino (isto é, pH > 9). Em um aspecto, as condições compreendem uma temperatura dentre cerca de 40oC e cerca de 70oC. Em um aspecto, a composição compreende um óleo vegetal. Em um aspecto, a composição compreende um fosfo-lipídeo de semente oleaginosa. Em um aspecto, a reação de clivagem pode gerar uma base fosforilada extraível de água e um diglicerídeo. A invenção fornece métodos de hidrolisar, separando ou rompendo uma composição compreendendo fosfolipídeo compreendendo fornecer pelo menos um polipeptídeo da invenção tendo uma atividade de fosfolipase ou um polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase codificada por pelo menos um ácido nucléico da invenção; fornecer uma composição compreendendo um fosfolipídeo; e contatar o polipeptídeo com a composição sob as condições em que a fosfolipase hidrolisa, separa ou rompe a composição compreendendo fosfolipídeo. Em um aspecto, o método compreende uso de mistura de alto cisalhamento da composição, seguido por nenhuma ou uma mistura de baixo cisalhamento com o pelo menos um polipeptídeo da invenção que tem uma atividade de fosfolipase para permitir "contato" adequado do substrato de fosfolipídeo com a fosfolipase. O pelo menos um polipeptídeo que tem uma atividade de fosfolipase pode da mesma forma estar presente na etapa de mistura de alto cisalhamento. O processo pode ser praticado em qualquer escala, por exemplo, em uma escala compreen- dendo cerca de 1 grama (g) a cerca 500, 1000, 2000, 2500, 5000 g, ou mais, ou qualquer quantidade nesta faixa. A invenção fornece métodos para desengomar óleo compreendendo as etapas seguintes: (a) fornecer pelo menos um polipeptídeo que tem uma atividade de fosfolipase, em que o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido da invenção, ou o polipeptídeo é codificado por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer uma composição compreendendo um óleo vegetal; e, (c) contatar o polipeptídeo da etapa (a) e o óleo vegetal da etapa (b) sob as condições em que o polipeptídeo pode clivar ligações de éster no óleo vegetal, desse modo desengomando o óleo. Em um aspecto, o óleo vegetal compreende semente oleaginosa. O óleo vegetal pode compreender óleos de farelo de arroz, óleo de palma, óleo de semente de colza, óleo de milho, óleo de soja, óleo de canola, óleo de gergelim, óleo de amendoim ou óleo de girassol. Em um aspecto, o método também compreende adição de uma fosfolipase da invenção, outra fosfolipase ou uma combinação destes. Em um aspecto, mais que um polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase é adicionado ao processo, em que pelo menos um polipeptí-deo é uma enzima da invenção. Em um aspecto, as enzimas são adicionadas em uma ordem específica, por exemplo, PLCs com especificidades diferentes são adicionados em uma ordem específica, por exemplo, uma enzima com atividade de PC e PE é adicionada primeiro (ou duas enzimas são adicionadas, uma com PC e a outra com atividade de PE), em seguida uma enzima com atividade de PLC de PI é adicionada, ou qualquer combinação destes.
Em um aspecto do processo de desengomamento de óleo, a composição compreendendo óleo compreende uma planta, um animal, uma alga ou um óleo de peixe ou gordura. O óleo de planta pode compreender um óleo de farelo de arroz, um óleo de soja, um óleo de semente de colza, um óleo de milho, um óleo de uma semente de palma, um óleo de canola, um óleo de girassol, um óleo de gergelim ou um óleo de amendoim. O poli-peptídeo pode hidrolisar um fosfatídeo a partir de um um fosfolipídeo hidra-tável e/ou um não-hidratável na composição compreendendo óleo. Em um aspecto, o polipeptídeo hidrolisa um fosfatídeo em uma ligação de fosfoéster de glicerila para gerar um diglicerídeo e composto de fosfato solúvel em água. Em um aspecto, o polipeptídeo tem uma atividade de fosfolipase C. Em um aspecto, o polipeptídeo é uma fosfolipase D e uma enzima de fosfa-tase é adicionada da mesma forma.
Em um aspecto do processo de desengomamento de óleo, o contato compreende hidrólise de um fosfolipídeo hidratado em um óleo. As condições de hidrólise podem compreender condições alcalinas, por exemplo, em um aspecto, as condições compreendem uma temperatura de cerca de 20°C a 40°C no pH alcalino. As condições alcalinas podem compreender um pH de cerca de pH 8 a pH 10, ou mais. As condições de hidrólise podem ser tornadas alcalinas em qualquer momento no processo, por exemplo, em um aspecto, uma fosfolipase, tal como uma PLC, é adicionada antes que as condições sejam tornadas alcalinas (por exemplo, uma "neutralização cáustica" de um óleo compreendendo ácido, tal como ácido fosfatídico).
Em um aspecto do processo de desengomamento de óleo, a base causa a isomerização de 1,2-DAG, produzida por PLC, em 1,3-DAG que fornece um benefício a saúde nutricional sobre 1,2-DAG, por exemplo, as 1,3-DAG são queimadas como energia em vez de ser armazenadas como gordura (como é 1,2-DAG). Desse modo, a invenção fornece um processo de refinamento de óleo cáustico em que uma fosfolipase, por exemplo, uma enzima da invenção, incluindo uma PLC, é adicionada "na extremidade frontal", isto é, antes de adicionar qualquer ácido e cáustico, por exemplo, como ilustrado no processo exemplar da figura 13. Um das conseqüências de adicionar a PLC na extremidade frontal de um processo de refinamento cáustico da invenção (veja também discussão, abaixo), e adicionando o ácido e cáustico subseqüentemente, é a geração de um nível elevado de 1,3-DAG (não 1,2-DAG). Isto pode ser uma conseqüência de migração de acila catalisada de base ou ácido. Nutricionalmente, 1,3-DAG são melhores que 1,2-DAG. Desse modo, a invenção compreende um processo de desengoma-mento de óleo empregando uma PLC da invenção, por meio da qual o produto de óleo desengomado final não contém menos que cerca de 0,5%, 1,0%, 2,0%, 3,0%, 4,0% ou 5,0% de 1,3-DAG.
Em um aspecto do processo de desengomamento de óleo, as condições de hidrólise podem compreender um tempo de reação de cerca de 3 a 10 ou mais minutos. As condições de hidrólise podem compreender hidrólise de fosfolipídeos não-hidratáveis e hidratáveis em óleo em uma temperatura dentre cerca de 50°C a 60°C, em um pH dentre cerca de pH 5 a pH 6,5, ou entre cerca de pH 5 a pH 7,5, ou entre cerca de pH 5 a pH 8,0, empregando um tempo de reação de cerca de 30 a 60 minutos.
Em um aspecto do processo de desengomamento de óleo, o po-lipeptídeo é ligado a um filtro e o óleo ou gordura contendo fosfolipídeo é passado pelo filtro. O polipeptídeo podem ser adicionado a uma solução compreendendo o óleo ou gordura contendo fosfolipídeo e em seguida a solução é passada por um filtro.
Em um aspecto, o método de desengomamento de óleo também compreende a remoção física de goma produzida pelo processo de desengomamento por adição de uma substância de endurecimento, por exemplo, um talco ou equivalente. Em um aspecto, isto aumenta o ganho de óleo. A invenção da mesma forma fornece métodos para converter um fosfolipídeo não-hidratável em uma forma hidratável compreendendo as etapas seguintes: (a) fornecer um polipeptídeo que tem uma atividade de fosfolipase, em que o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido da invenção, ou o polipeptídeo é codificado por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer uma composição compreendendo um fosfolipídeo não-hidratável; e, (c) contatar o polipeptídeo da etapa (a) e o fosfolipídeo não-hidratável da etapa (b) sob as condições em que o polipeptídeo pode clivar ligações de éster no fosfolipídeo não-hidratável, desse modo convertendo um fosfolipídeo não-hidratável em uma forma hidratável. A invenção fornece métodos para desengomar um óleo compreendendo as etapas seguintes: (a) fornecer uma composição compreendendo um polipeptídeo da invenção que tem uma atividade de fosfolipase ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer uma composição compreendendo uma gordura ou um óleo compreendendo um fosfolipídeo; e (c) contatar o polipeptídeo da etapa (a) e a composição da etapa (b) sob as condições em que o polipeptídeo pode desengomar a composição compreendendo fosfolipídeo (sob as condições em que o polipeptídeo da invenção pode catalisar a hidrólise de um fosfolipídeo). Em um aspecto, a composição compreendendo óleo compreende um óleo de planta, um de animal, um de alga ou um de peixe. O óleo de planta pode compreender um óleo de farelo de arroz, um óleo de soja, um óleo de semente de colza, um óleo de milho, um óleo de uma semente de palma, um óleo de canola, um óleo de girassol, um óleo de gergelim ou um óleo de amendoim. O polipeptídeo pode hidrolisar um fosfatídeo a partir de um fosfolipídeo hi-dratável e/ou um não-hidratável na composição compreendendo óleo. O polipeptídeo pode hidrolisar um fosfatídeo em uma ligação de fosfoéster de glicerila para gerar um composto de fosfato solúvel em água e diglicerídeo. O polipeptídeo pode ter uma atividade de fosfolipase C, B, A ou D. Em um aspecto, uma atividade de fosfolipase D e uma enzima de fosfatase são adicionadas. O contato pode compreender hidrólise de um fosfolipídeo hidratado em um óleo. As condições de hidrólise podem compreender uma temperatura de cerca de 20oC a 40oC em um pH alcalino. As condições alcalinas podem compreender um pH de cerca de pH 8 a pH 10. As condições de hidrólise podem compreender um tempo de reação de cerca de 3 a 10 minutos. As condições de hidrólise podem compreender hidrólise de fosfolipídeos não-hidratáveis e hidratáveis em óleo em uma temperatura de cerca de 50°C a 60°C, em um pH de cerca de pH 5 a pH 6,5 empregando um tempo de reação de cerca de 30 a 60 minutos. O polipeptídeo pode ser ligado a um filtro e o óleo ou gordura contendo fosfolipídeo é passado pelo filtro. O polipeptí-deo pode ser adicionado a uma solução compreendendo o óleo ou gordura contendo fosfolipídeo e em seguida a solução é passada por um filtro. A invenção fornece métodos para converter um fosfolipídeo não-hidratável em uma forma hidratável compreendendo as etapas seguintes: (a) fornecer uma composição compreendendo um polipeptídeo que tem uma atividade de fosfolipase da invenção, ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer uma composição compreendendo um fosfolipídeo não-hidratável; e (c) contatar o polipeptídeo da etapa (a) e a composição da etapa (b) sob as condições em que o polipeptídeo converte o fosfolipídeo não-hidratável em uma forma hidratável. O polipeptídeo pode ter uma atividade de fosfolipase C. O polipeptídeo pode ter uma atividade de fosfolipase D e uma enzima de fosfatase é da mesma forma adicionada. A invenção fornece métodos para refinamento cáustico de uma composição contendo fosfolipídeo compreendendo as etapas seguintes: (a) fornecer uma composição compreendendo uma fosfolipase que pode ser um polipeptídeo da invenção que tem uma atividade de fosfolipase ou um poli-peptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer uma composição compreendendo um fosfolipídeo; e (c) contatar o polipeptídeo da etapa (a) com a composição da etapa (b) antes, durante ou depois do refinamento cáustico. O polipeptídeo pode ter uma atividade de fosfolipase, por exemplo, atividade de PLC, PLB, PLD e/ou PLA. O polipeptídeo pode ser adicionado antes do refinamento cáustico, isto é, na "extremidade frontal" do processo, antes de adicionar ácido ou cáustico, como ilustrado na figura 13. O polipeptídeo (que pode ser uma enzima, por exemplo, uma PLC, da invenção) pode ser adicionado durante o refinamento cáustico e níveis variados de ácido e cáustico podem ser adicionados dependendo de níveis de fósforo e níveis de ácidos graxos livres. O polipeptídeo (que pode ser uma enzima da invenção) pode ser adicionado antes do refinamento cáustico, ou, depois do refinamento cáustico: em um misturador intenso ou misturador de retenção antes da separação; seguindo uma etapa de aquecimento; em uma centrífuga; em uma matéria-prima de sabão; em uma água de lavagem; e/ou, durante as etapas de alvejamento ou desodorização. O método pode compreender uso de soluções concentradas de cáustico, por exemplo, mais concentrado que o padrão industrial de 11%, para diminuir a massa de goma. Em aspectos alternativos, a solução concentrada de cáustico está entre cerca de 12% e 50% concentrada, por exemplo, cerca de 20%, 30%, 40%, 50% ou 60%, ou mais, concentrada. A composição compreendendo o fosfolipídeo pode compreender uma planta. O polipeptídeo pode ser expresso transgenicamente na planta. O polipeptídeo que tem uma atividade de fosfolipase pode ser adicionado durante o esmagamento de uma semente ou outra parte de planta, ou, o polipeptídeo que tem uma atividade de fosfolipase é adicionado seguindo esmagamento ou antes do refinamento.
Da mesma forma é fornecido um processo de refinamento cáustico para hidrolisar fosfolipídeos em óleo (por exemplo, óleo de planta) empregando um polipeptídeo da invenção para gerar diacilglicerol (DAG) e és-ter de fosfato solúvel em água. Em um aspecto, a enzima da invenção deve que operar em um processo de refinamento cáustico, incluindo, opcionalmente água reduzida e/ou em uma faixa de temperatura de cerca de 55°C a cerca 70°C. Uso de um processo de refinamento cáustico com água reduzida nesta faixa de temperatura maximizará o rendimento aumentando-se DAG e reduzindo-se o óleo capturado. Em um aspecto, a enzima empregada neste processo de refinamento cáustico da invenção tem igualmente atividade muito boa em fosfatidilcolina (PC) e fosfatidiletanolamina (PE), é ativa entre um pH de cerca de pH 6 a pH 9, é ativa até 75°C, e é ativa em água reduzida em óleo, por exemplo, cerca de 2% a 5% de água, por exemplo, a enzima codificada pela seqüência de SEQ ID NO: 2, codificado por exemplo, por SEQ ID NO: 1.
Em outro aspecto do processo de refinamento cáustico da invenção para hidrolisar fosfolipídeos em óleos, duas enzimas são empregadas: uma PLC específica de PI (hidrolisa PI), e um PC-PLC que hidrolisa a PC, PE e PA. Esta modalidade gera óleo adequado para refinamento químico ou físico e maximiza o aumento de rendimento de DAG e menos óleo capturado. A invenção fornece métodos para purificação de um fitosterol ou um triterpeno compreendendo as etapas seguintes: (a) fornecer uma composição compreendendo um polipeptídeo da invenção que tem uma atividade de fosfolipase, ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer uma composição compreendendo um fitosterol ou um triterpeno; e (c) contatar o polipeptídeo da etapa (a) com a composição da etapa (b) sob as condições em que o polipeptídeo pode catalisar a hidrólise de um fosfolipídeo na composição. O polipeptídeo pode ter uma atividade de fosfolipase C. O fitosterol ou um triterpeno pode compreender um esterol de planta. O esterol de planta pode ser derivado a partir de um óleo vegetal. O óleo vegetal pode compreender um óleo de farelo de arroz, um óleo de coco, óleo canola, óleo de manteiga de cacau, óleo de milho, óleo de caroço de algodão, óleo de linhaça, azeite de oliva, óleo de palma, óleo de amendoim, óleo derivado de um farelo de arroz, óleo de açafroa, óleo de gergelim, óleo de soja ou um óleo de girassol. O método pode compreender uso de solventes não polares para quantitativamente extrair fitosteróis livres e ésteres de ácido graxo de fitosterila. O fitosterol ou um triterpeno pode compreender um β-sitosterol, um campesterol, um estigmasterol, um estigmastanol, um β-sitostanol, um sitostanol, um desmosterol, um calinasterol, um poriferasterol, um clionasterol ou um brassicasterol. A invenção fornece métodos para refinar um óleo bruto compreendendo as etapas seguintes: (a) fornecer uma composição compreendendo um polipeptídeo da invenção que tem uma atividade de fosfolipase, ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer uma composição compreendendo um óleo compreendendo um fosfolipídeo; e (c) contatar o polipeptídeo da etapa (a) com a composição da etapa (b) sob as condições em que o polipeptídeo pode catalisar a hidrólise de um fosfolipí-deo na composição. O polipeptídeo pode ter uma atividade de fosfolipase C. O polipeptídeo pode ter uma atividade de fosfolipase que está em uma solução de água que é adicionada à composição. O nível de água pode estar entre cerca de 0,5 a 5%. O tempo de processo pode ser menor que cerca de 2 horas, menor que cerca de 60 minutos, menor que cerca de 30 minutos, menor que 15 minutos, ou menor que 5 minutos. As condições de hidrólise podem compreender uma temperatura de entre cerca de 25oC -70oC. As condições de hidrólise podem compreender uso de cáusticos. Soluções concentradas de cáustico, por exemplo, mais concentradas que o padrão industrial de 11%, para diminuir a massa de goma podem ser empregadas. Em aspectos alternativos, a solução concentrada de cáustico está entre cerca de 12% e 50% concentrada, por exemplo, cerca de 20%, 30%, 40%, 50%, ou 60% ou mais concentrada.
As condições de hidrólise podem compreender um pH dentre cerca de pH 3 e pH 10, entre cerca de pH 4 e pH 9, ou entre cerca de pH 5 e pH 8. As condições de hidrólise podem compreender adição de emulsifica-dores e/ou mistura depois do contato da etapa (c). Os métodos podem compreender adição de um desmembrador de emulsão e/ou aquecimento ou resfriamento (por exemplo, entre cerca de 4°C a cerca -20°C, ou menos) para promover a separação de uma fase aquosa. Os métodos podem compreender o desengomamento antes da etapa de contato para coletar lecitina por centrifugação e em seguida adicionar uma PLC, uma PLC e/ou uma PLA para remover fosfolipídeos não-hidratáveis. Os métodos podem compreender o desengomamento de água de óleo bruto a menos do que 10 ppm de fósforo para óleos comestíveis e refinamento físico subseqüente a menos de cerca de 50 ppm de fósforo para óleos de biodiesel. Os métodos podem compreender adição de ácido para promover a hidratação de fosfolipídeos não-hidratáveis. Em um aspecto, a adição de ácido promove a diminuição do teor de metal de magnésio e cálcio. A invenção fornece um método para melhorar ou prevenir a toxicidade mediada por lipopolissacarídeo compreendendo administrar a um paciente uma composição farmacêutica compreendendo um polipeptídeo da invenção. A invenção fornece um método para desintoxicar uma endotoxina compreendendo contatar a endotoxina com um polipeptídeo da invenção. A invenção fornece um método para desacilar uma cadeia de ácido graxo de 2' ou uma de 3' de um lipídio A compreendendo contatar o lipídio A com um polipeptídeo da invenção. A invenção fornece um método para refinar um lubrificante compreendendo as etapas seguintes: (a) fornecer uma composição compreendendo uma enzima da invenção; (b) fornecer um lubrificante; e (c) tratar o lubrificante com uma enzima sob as condições em que a enzima pode seletivamente hidrolisar óleos no lubrificante, desse modo refinando-os. O lubrificante pode ser um óleo hidráulico. A invenção fornece um método de tratar um tecido compreen- dendo as etapas seguintes: (a) fornecer uma composição compreendendo uma enzima da invenção, (b) fornecer um tecido; e (c) tratar o tecido com a enzima. O tratamento do tecido pode compreender melhoria do manuseio e queda do tecido final, corante, obtendo retardância da chama, obtendo repe-lência da água, obtendo abrilhantador ótico ou obtendo acabamento da resina. O tecido pode compreender algodão, viscose, raiom, lyocell, fibra de linho, linho, ramie, todas as misturas destes, ou mistura destes com poliéste-res, lã, acrílicos de poliamidas ou poliacrílicos. A invenção fornece um tecido, fio ou fibra compreendendo uma enzima da invenção. A enzima pode ser adsorvida, absorvido ou imobilizada na superfície do tecido, fio ou fibra. A invenção fornece métodos para expressar fosfolipase C compreendendo fornecer uma cepa de Pichia com um fenótipo de Mut+; inserindo um ácido nucléico codificando fosfolipase C heteróloga; e, cultivando a cepa de Pichia sob as condições por meio das quais a fosfolipase C é expressa. O método pode também compreender suplementar as condições de cultura com zinco. A invenção da mesma forma fornece sistemas de célula, células isoladas e cepas de célula para expressar fosfolipase C compreendendo uma cepa de Pichia de fenótipo de Mut+ compreendendo um ácido nucléico codificando fosfolipase C heteróloga operavelmente ligado a um promotor operável na cepa de Pichia. A invenção fornece sistemas de célula de levedura resistentes à zeocina (por exemplo, células de levedura, cepas de célula, células individuais) para expressar uma proteína heteróloga compreendendo as etapas de fornecer uma célula de Pichia sp. (por exemplo, P. pastoris) compreendendo um ácido nucléico heterólogo capaz de expressar uma proteína heteróloga; cultivar a célula sob as condições compreendendo zeocina em uma concentração inicial; selecionar células resistentes à concentração inicial de zeoci-na, e recultivar sob as condições compreendendo uma concentração mais alta de zeocina; e selecionar as células cultivadas na etapa (c) resistente à concentração mais alta de zeocina. Em um aspecto, a proteína heteróloga é uma enzima, ou opcionalmente, uma fosfolipase, ou opcionalmente uma fosfolipase C (PLC), por exemplo, qualquer enzima da invenção.
Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção são mencionados nos desenhos acompanhantes e na descrição abaixo. Outras características, objetivos e vantagens da invenção ficarão evidentes a partir da descrição e desenhos, e a partir das reivindicações.
Todas as publicações, patentes, pedidos de patente, seqüências de GenBank e depósitos de ATCC, citados aqui são aqui incorporados por referência para todos os propósitos.
Breve Descrição dos Desenhos Os desenhos seguintes são ilustrativos das modalidades da invenção e não são significados para limitar o escopo da invenção quando abrangidos pelas reivindicações. figura 1 é um diagrama de bloco de um sistema de computador, como descrito em detalhe, abaixo. figura 2 é um diagrama de fluxo que ilustra um aspecto de um processo 200 para comparar um novo nucleotídeo ou seqüência de proteína com um banco de dados de seqüências a fim de determinar os níveis de homologia entre a nova seqüência e as seqüências no banco de dados, como descrito em detalhes, abaixo. figura 3 é um diagrama de fluxo que ilustra uma modalidade de um processo em um computador para determinar se duas seqüências são homólogas, como descrito em detalhes, abaixo. figura 4 é um diagrama de fluxo que ilustra um aspecto de um processo identificador para detectar a presença de uma característica em uma seqüência, como descrito em detalhes, abaixo.
Figuras 5A, 5B e 5C esquematicamente ilustram um sistema bi-fásico modelo para simulação de desengomamento mediada por PLC, como descrito em detalhes no Exemplo 2, abaixo. figura 6 esquematicamente ilustra um processo de refinamento de óleo vegetal exemplar empregando as fosfolipases da invenção. figura 7 esquematicamente ilustra um processo de desengomamento exemplar da invenção para óleos fisicamente refinados, como discutido em detalhes, abaixo. figura 8 esquematicamente ilustra hidrólise de fosfatídeo com uma fosfolipase C da invenção, como discutido em detalhes, abaixo. figura 9 esquematicamente ilustra um processo de refinamento cáustico exemplar da invenção, e ilustra uma modalidade alternativa compreendendo aplicação de uma fosfolipase C da invenção como um "Auxiliar de Refinamento Cáustico" (Refinamento Cáustico de Mistura Longo), como discutido em detalhes, abaixo. figura 10 esquematicamente ilustra a aplicação de uma fosfoli-pase C da invenção como um auxiliar de desengomamento, como discutido em detalhes, abaixo. figura 11 é um diagrama que descreve características selecionadas de ácidos nucléicos exemplares e polipeptídeos da invenção, como descrito em maiores detalhes, abaixo. figura 12 esquematicamente ilustra dados de um sistema de duas enzimas da invenção, como descrito no Exemplo 3, abaixo. figura 13 esquematicamente ilustra um processo de refinamento cáustico exemplar da invenção, e ilustra uma modalidade alternativa compreendendo aplicação de uma fosfolipase C da invenção como um "Auxiliar de Refinamento Cáustica" (Refinamento Cáustico de Mistura Longa), como discutido em detalhes, abaixo. figura 14 ilustra outra variação de métodos da invenção onde duas etapas de centrifugação são empregadas no processo, como discutido em detalhes, abaixo. figura 15 ilustra outra variação de métodos da invenção onde três etapas de centrifugação são empregadas no processo, como discutido em detalhes, abaixo. figura 16 ilustra outra variação exemplar deste processo empregando tratamento ácido e tendo uma etapa de centrifugação antes de uma etapa de desengomamento, como discutido em detalhes, abaixo. figura 17 ilustra os resultados das experiências de digestão in vitro em que as variantes de fosfolipase C da invenção, como discutido em detalhes no Exemplo 4, abaixo. figura 18 ilustra os resultados de uma cultura de fermentador de batelada empregando uma enzima exemplar da invenção, como discutido em detalhes no Exemplo 5, abaixo. figura 19 ilustra os resultados de comparações da Taxa de Captação de Oxigênio ("TCO") de culturas de cepas MutS de P. pastoris da invenção, como discutido em detalhes no Exemplo 5, abaixo. figura 20 ilustra uma comparação de perfil de consumo de metanol em cepas de MutS de P. pastoris da invenção, como discutido em detalhes no Exemplo 5, abaixo. figura 21 ilustra um perfil de "TCO" de uma cultura de uma forma recombinante da enzima de PLC exemplar da SEQ ID NO: 2 da invenção, como discutido em detalhes no Exemplo 5, abaixo. figura 22 ilustra resultados partir de uma SDS-PAGE mostrando a qualidade de proteína de PLC produzida em uma cultura e um perfil de TCO correspondente, de uma cultura de uma forma recombinante da enzima de PLC exemplar da SEQ ID NO: 2 da invenção, como discutido em detalhes no Exemplo 5, abaixo. figura 23 ilustra resultados de uma SDS-PAGE mostrando a quantidade de PLC ativa localizada intracelularmente em uma cultura de uma forma recombinante da enzima de PLC exemplar da SEQ ID NO: 2 da invenção, como discutido em detalhes no Exemplo 5, abaixo. figura 24 ilustra uma visualização das mudanças morfológicas em células de levedura associadas com PLC ativo - uma forma recombinante da enzima de PLC exemplar da SEQ ID NO: 2 da invenção, como discutido em detalhes no Exemplo 5, abaixo. figura 25 graficamente resume dados mostrando o estado de um desempenho de produção de PLC em TFT de 95 h (tempo de fermentação total) em Pichia empregando uma enzima de PLC exemplar da SEQ ID NO: 2 da invenção, como discutido em detalhes no Exemplo 5, abaixo. figura 26 é um resumo da tabela de dados de avaliação de expressão de colônias de célula adaptadas de zeocina da invenção, como discutido em detalhes no Exemplo 5, abaixo. figura 27 ilustra dados mostrando que níveis de proteína de PLC foram mais altos em culturas compreendendo colônias de célula adaptadas de zeocina exemplares da invenção, como discutido em detalhes no Exemplo 5, abaixo. figura 28 ilustra dados mostrando uma comparação de crescimento de colônias adaptadas de zeo da invenção vs controle, como discutido em detalhes no Exemplo 5, abaixo. figura 29 ilustra os resultados de uma experiência de aquecimento demonstrando a termoestabilidade da enzima exemplar da SEQ ID NO: 2 da invenção, com as condições indicadas na figura, como discutido em detalhes no Exemplo 6, abaixo. figura 30 ilustra dados de RMN resumindo a experiência de aquecimento demonstrando a termoestabilidade da enzima exemplar da SEQ ID NO: 2 da invenção, como discutido em detalhes no Exemplo 6, abaixo.
Figuras 31, 32 e 33 ilustram dados demonstrando a estabilidade térmica de SEQ ID NO: 2 empregando p-NPPC, nas condições mostradas na figura, como discutido em detalhes no Exemplo 6, abaixo. figura 34 ilustra dados demonstrando a estabilidade térmica de SEQ ID NO: 2 empregando a análise de DSC, como discutido em detalhes no Exemplo 6, abaixo. Símbolos de referência similares nos vários desenhos indicam elementos semelhantes.
Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção fornece fosfolipases, por exemplo, polipeptídeos que tem fosfolipase A, B, C, D, patatina, fosfatases de ácido fosfatídi-co (PAP) e/ou lipídio acil hidrolase (LAH) ou atividade equivalente, polinucle-otídeos codificando-os e métodos para prepará-los e usá-los. A invenção fornece enzimas que eficazmente clivam a ligação de éster de glicerolfosfato em óleos, tais como óleos vegetais, por exemplo, fosfolipídeos de semente oleaginosa, para gerar uma base fosforilada extraível de água e um diglice-rídeo. Em um aspecto, as fosfolipases da invenção têm uma atividade de lipídio acil hidrolase (LAH). Em aspectos alternativos, as fosfolipases da invenção podem clivar ligações de éster de glicerolfosfato em fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilserina (PS), fosfatidilinositol (PI), ácido fosfatídico e/ou esfingomielina ou uma combinação destes. Por exemplo, em um aspecto uma fosfolipase da invenção é específica para um ou mais substratos específico, por exemplo, uma enzima da invenção pode ter uma especificidade de ação para PE e PC; PE e PI; PE e PS; PS e PE; PS e PI; PI e PE; PS, PI e PC; PE, PI e PC; ou PE, PS, PI e PC.
Uma fosfolipase da invenção (por exemplo, polipeptídeos que tem fosfolipase A, B, C, D, patatina, fosfatases de ácido fosfatídico (PAP) e/ou lipídio acil hidrolase (LAH) ou atividade equivalente) pode ser empregado para desengomamento enzimático de óleos vegetais porque a parte do fosfato é solúvel em água e fácil de remover. O produto de diglicerídeo permanecerá no óleo e então reduzirá as perdas. As PLCs da invenção podem ser empregadas além de ou no lugar de PLA1s e PLA2s no desengomamento de óleo comercial, tal como no processo de ENZYMAX® onde os fosfolipídeos são hidrolisados por PLA1 e PLA2.
Em um aspecto, as fosfolipases da invenção são ativas em uma temperatura alta e/ou em uma baixa, ou, sobre uma ampla faixa de temperatura, por exemplo, elas podem ser ativas nas temperaturas variando entre 20oC a 90oC, entre 30oC a 80oC, ou entre 40oC a 70oC. A invenção fornece da mesma forma fosfolipases da invenção que têm atividade em pHs alcalinos ou em pHs acídicos, por exemplo, baixa acidez em água. Em aspectos alternativos, as fosfolipases da invenção podem ter atividade em pHs acídicos tão baixos quanto pH 6,5, pH 6,0, pH 5,5, pH 5,0, pH 4,5, pH 4,0 e pH 3,5 ou mais ácido (isto é, < pH 3,5). Em aspectos alternativos, as fosfolipa-ses da invenção podem ter atividade em pHs alcalinos tão altos quanto pH 7,5, pH 8,0, pH 8,5, pH 9,0, pH 9,5, pH 10 ou mais alcalino (isto é, > pH 10). As fosfolipases da invenção são ativas na faixa de temperatura dentre cerca de 40oC em um aspecto, a cerca 70oC, 75oC, ou 80oC, ou mais, sob as condições de baixa atividade em água (baixo teor em água). A invenção da mesma forma fornece métodos para modificar as fosfolipases exemplares da invenção para gerar enzimas com propriedades desejáveis. Por exemplo, as fosfolipases geradas pelos métodos da invenção podem ter especificidades de substrato alteradas, especificidades de ligação de substrato, padrões de clivagem de substrato, estabilidade térmica, perfil de pH/atividade, perfil de pH/estabilidade (tal como estabilidade aumentada em baixos, por exemplo, valores de pH, PH< 6 ou pH < 5, ou altos, por exemplo, pH>9), estabilidade para oxidação, dependência de Ca2+, atividade específica e similares. A invenção fornece alteração de qualquer propriedade de interesse. Por exemplo, a alteração pode resultar em uma variante que, quando comparada a uma fosfolipase origem, tem perfil de atividade de temperatura e pH alterado.
Em um aspecto, as fosfolipases da invenção são empregadas em várias etapas de processo de óleo vegetal, tal como em extração de óleo vegetal, particularmente, na remoção de "gomas de fosfolipídeo" em um processo chamado "desengomamento de óleo", como descrito aqui. A invenção fornece composições (por exemplo, compreendendo enzimas da invenção) e processos para a produção de óleos vegetais a partir de várias fontes, tal como óleo de farelo de arroz, sojas, semente de colza, amendoim, gergelim, girassol e milho. As enzimas de fosfolipase da invenção podem ser empregadas no lugar de PLA, por exemplo, fosfolipase A2, em qualquer etapa de processamento de óleo vegetal.
Definições O termo "fosfolipase" abrange enzimas que têm alguma atividade de fosfolipase, por exemplo, clivando uma ligação de éster de glicerolfosfato (catalisando hidrólise de uma ligação de éster de glicerolfosfato), por exemplo, em um óleo, tal como um óleo vegetal. A atividade de fosfolipase da invenção pode gerar uma base fosforilada extraível em água e um diglicerídeo. A atividade de fosfolipase da invenção da mesma forma inclui hidrólise de ligações de éster de glicerolfosfato em temperaturas altas, temperaturas baixas, pHs alcalinos e em pHs acídicos. O termo "uma atividade de fosfolipase" da mesma forma inclui a clivagem de um éster de glicerolfosfato para gerar uma base fosforilada extraível de água e um diglicerídeo. O termo "uma atividade de fosfolipase" da mesma forma inclui o corte de ligações de éster de glicerina e ácido fosfórico em fosfolipídeos. O termo "uma atividade de fosfolipase" da mesma forma inclui outras atividades, tal como a capacidade de ligar e hidrolisar um substrato, tal como um óleo, por exemplo, um óleo vegetal, substrato da mesma forma incluindo fosfatidilcolinas de animal e planta, fosfatidil-etanolaminas, fosfatidilserinas e esfingomielinas. A atividade de fosfolipase pode compreender uma atividade de fosfolipase C (PLC); uma atividade de fosfolipase A (PLA), tal como uma atividade de fos-folipase A1 ou fosfolipase A2; uma atividade de fosfolipase B (PLB) atividade, tal como uma atividade de fosfolipase B1 ou fosfolipase B2, incluindo atividade de lisofosfolipase (LPL) e/ou atividade de lisofosfolipase-transacilase (LPTA); uma atividade de fosfolipase D (PLD), tal como uma atividade de fosfolipase D1 ou uma de fosfolipase D2; e/ou uma atividade de patatina ou qualquer combinação deste. A atividade de fosfolipase pode compreender hidrólise de uma glicoproteína, por exemplo, como uma glico-proteína encontrada em um tubérculo de batata ou qualquer planta do gênero Solanum, por exemplo, Tuberosum solanum. A atividade de fosfolipase pode compreender uma atividade de patatina enzimática, tal como uma atividade de patatina esterase (veja, por exemplo, Jimenez (2002) Biotechnol. Prog. 18:635-640). A atividade de fosfolipase pode compreender uma atividade de lipídio acil hidrolase (LAH). A atividade de fosfolipase pode compreender o fato de ser específica para um ou mais substratos específicos, por exemplo, uma enzima da invenção pode ter uma especificidade de ação para PE e PC; PE e PI; PE e PS; PS e PE; PS e PI; PI e PE; PS, PI e PC; PE, PI e PC; ou, PE, PS, PI e PC, ou qualquer combinação destas.
Em um aspecto, uma fosfolipase da invenção pode ter atividade de multifuncional, por exemplo, uma combinação de um ou mais das atividades de enzima descritas aqui. Por exemplo, em um aspecto, um polipeptídeo da invenção é enzimaticamente ativo, porém necessita de uma atividade de lipase ou necessita de qualquer atividade enzimática que afeta uma fração de óleo neutro (triglicerídeo). Pode ser desejável empregar um tal polipeptí-deo em um processo particular, por exemplo, em um processo de desengo- mamento onde é importante que a fração de óleo neutro não seja prejudicada (diminuída, degradada, por exemplo, hidrolisada). Desse modo, em um aspecto, a invenção fornece um processo de desengomamento compreendendo uso de um polipeptídeo da invenção que tem uma atividade de fosfo-lipase, mas não uma atividade de lipase.
Em um aspecto, fosfolipases de PLC da invenção utilizam (por exemplo, catalisa hidrólise de) uma variedade de substratos de fosfolipídeo incluindo fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilserina (PS), fosfatidilinositol (PI) e/ou ácido fosfatídico ou uma combinação destes. Além disso, estas enzimas podem ter graus variados de atividade nas formas de lisofosfolipídio destes fosfolipídeos. Em vários aspectos, enzimas de PLC da invenção podem mostrar uma preferência para fosfatidilcolina e fos-fatidiletanolamina como substratos.
Em um aspecto, fosfatidilinositol PLC fosfolipases da invenção utilizam uma variedade de substratos de fosfolipídeo incluindo fosfatidilcoli-na, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol e ácido fosfatídico ou uma combinação destes. Além disso, estas enzimas podem ter graus variados de atividade nas formas de lisofosfolipídio destes fosfolipídeos. Em vários aspectos, enzimas fosfatidilinositol PLC da invenção podem mostrar para uma preferência para fosfatidilinositol como um substrato.
Em um aspecto, as enzimas de patatina da invenção utilizam uma variedade de substratos de fosfolipídeo incluindo fosfatidilcolina, fosfati-diletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol e ácido fosfatídico, ou uma combinação destes. Além disso, estas enzimas podem ter graus variados de atividade nas formas de lisofosfolipídio destes fosfolipídeos. Em vários aspectos, as patatinas da invenção são baseadas em uma conservação de similaridade de seqüência de aminoácido. Em vários aspectos, estas enzimas exibem um grupo diverso de propriedades bioquímicas e podem realizar características reações das classes de enzima PLA1, PLA2, PLC ou PLD. Em um aspecto, as fosfolipases de PLD da invenção utilizam uma variedade de substratos de fosfolipídeo incluindo fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol e ácido fosfatídico ou uma combinação des- tes. Além disso, estas enzimas podem ter graus variados de atividade nas formas de lisofosfolipídio destes fosfolipídeos. Em um aspecto, estas enzimas são úteis para realizar reações de transesterificação para produzir fos-folipídeos estruturados. O termo "anticorpo" inclui um peptídeo ou polipeptídeo derivado de, modelado depois ou substancialmente codificado por um gene de imu-noglobulina ou genes de imunoglobulina ou fragmentos destes, capazes de especificamente ligar um antígeno ou epítopo, veja, por exemplo, Fundamental Immunology, Terceira Edição, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993); Wilson (1994) J. Immunol. Methods 175:267-273; Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys. Methods 25:85-97. O termo anticorpo inclui porções de ligação de antígeno, isto é, "sítios de ligação de antígeno", (por exemplo, fragmentos, subseqüências, regiões de determinação de complementaridade (CDRs)) que mantêm capacidade de ligar antígeno, incluindo (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo nos domínios de VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligado por uma ponte de dissulfeto na região de articulação; (iii) um fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv consistindo nos domínios de VL e VH de uma única subdivisão de um anticorpo, (v) um fragmento de dAb (Ward e similares, (1989) Nature 341:544-546), que consiste em um domínio de VH; e (vi) uma região de determinação de complementaridade isolada (CDR). Anticorpos de cadeia simples são da mesma forma incluídos por referência no termo "anticorpo".
Os termos "disposição" ou "microdisposição" ou "biochip" ou "chip" quando empregado aqui é uma pluralidade de elementos alvo, cada elemento alvo compreendendo uma quantidade definida de um ou mais polipeptídeos (incluindo anticorpos) ou ácidos nucléicos imobilizados sobre uma área definida de uma superfície de substrato, como discutido em mais detalhes, abaixo.
Quando empregado aqui, os termos "computador," "programa de computação" e "processador" são empregados em seus contextos gerais mais amplos e incorporam todos os tais dispositivos, como descrito em deta- lhes, abaixo.
Uma "seqüência de codificação de" ou uma "seqüência codifica" um polipeptídeo ou proteína particular, é uma seqüência de ácido nucléico que é transcrita e trasladada em um polipeptídeo ou proteína quando colocado sob o controle de seqüências reguladoras apropriadas. O termo "cassete de expressão" quando empregado aqui se refere a uma seqüência de nucleotídeo que é capaz de afetar a expressão de um gene estrutural (isto é, uma seqüência de codificação de proteína, tal como uma fosfolipase da invenção) em um hospedeiro compatível com tais seqüências. Cassetes de expressão incluem pelo menos um promotor ope-ravelmente ligado com a seqüência de codificação de polipeptídeo; e, opcionalmente, com outras seqüências, por exemplo, sinais de terminação de transcrição. Fatores adicionais necessários ou úteis na realização da expressão podem ser da mesma forma empregados, por exemplo, realçado-res. "Operavelmente ligado" quando empregado aqui se refere à ligação de um promotor a montante a partir de uma seqüência de DNA tal que o promotor medeia transcrição da seqüência de DNA. Desse modo, cassetes de expressão da mesma forma incluem plasmídeos, vetores de expressão, vírus recombinante, qualquer forma de vetor de "DNA nu" recombinante, e similares. Um "vetor" compreende um ácido nucléico que pode infectar, transfec-tar, transitoriamente ou permanentemente transduzir uma célula. Será reconhecido que um vetor pode ser um ácido nucléico nu ou um ácido nucléico complexado com proteína ou lipídio. O vetor opcionalmente compreende proteínas e/ou ácidos nucléicos viróticos ou bacterianos, e/ou membranas (por exemplo, uma membrana de célula, um envelope de lipídio virótico, etc.). Vetores incluem, porém não são limitados a réplicons (por exemplo, réplicons de RNA, bacteriófagos) aos quais os fragmentos de DNA podem ser ligados e tornam-se replicados. Vetores desse modo incluem, porém não são limitados ao RNA, auto-replicação autônoma, DNA ou RNA linear ou circular (por exemplo, plasmídeos, vírus e similares, veja, por exemplo, Patente U.S. No. 5.217.879), e inclui igualmente os plasmídeos de expressão e não expressão. Onde um microorganismo recombinante ou cultura de célula é descrito como sendo hospedeiro de um "vetor de expressão" isto inclui igualmente DNA linear e circular extra-cromossômico e DNA que foi incorporado no(s) cromossomo(s) hospedeiro. Onde um vetor está sendo mantido por uma célula hospedeira, o vetor pode ser estavelmente replicado pelas células durante mitose como uma estrutura autônoma, ou ser incorporado dentro do genoma do hospedeiro. "Plasmídeos" são designados por uma letra minúscula "p" precedida e/ou seguida por letras maiúsculas e/ou números. Os plasmídeos de partida aqui são comercialmente disponíveis, publicamente disponíveis em uma base irrestrita ou podem ser construído a partir de plasmídeos disponíveis de acordo com procedimentos publicados. Além disso, plasmídeos equivalente aqueles descritos aqui são conhecidos na técnica e ficarão evidentes pelo técnico ordinariamente versado. O termo "gene" significa o segmento de DNA envolvido na produção de uma cadeia de polipeptídeo, incluindo, entre outras coisas, regiões precedendo e seguindo a região de codificação, tal como líder e trailer, promotores e realçadores, bem como, onde aplicáveis, seqüências de intermédio (íntrons) entre segmentos de codificação individuais (exons).
As frases "ácido nucléico" ou "seqüência de ácido nucléico" quando empregadas aqui se refere a um oligonucleotídeo, nucleotídeo, poli-nucleotídeo ou a um fragmento de quaisquer destes, para DNA ou RNA (por exemplo, mRNA, rRNA, tRNA, iRNA) de origem genômica ou sintética que pode ser de filamento único ou filamento duplo e pode representar um filamento de sentido ou anti-sentido, para ácido nucléico de peptídeo (PNA), ou para qualquer material tipo DNA ou tipo RNA, natural ou sintético na origem, incluindo, por exemplo, iRNA, ribonucleoproteínas (por exemplo, iRNAs de filamento duplo, por exemplo, iRNPs). O termo abrange ácidos nucléicos, isto é, oligonucleotídeos, contendo análogos conhecidos de nucleotídeos naturais. O termo da mesma forma abrange estruturas tipo ácido nucléico com cadeias principais sintéticas, veja por exemplo, Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197; Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692-8698; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156. "Aminoácido" ou "seqüência de aminoácido" quando empregado aqui se refere a um oligopeptídeo, peptídeo, polipeptídeo ou seqüência de proteína, ou em um fragmento, porção ou sub-unidade de quaisquer destes, e em moléculas sintéticas ou de ocorrência natural.
Os termos "polipeptídeo" e "proteína" quando empregados aqui, se referem aos aminoácidos ligados um ao outro por ligações de peptídeo ou ligações de peptídeo modificado, isto é, isósteres de peptídeo, e podem conter aminoácidos modificados diferente dos 20 aminoácidos codificados por gene. O termo "polipeptídeo" da mesma forma inclui peptídeos e fragmentos de polipeptídeo, motivos e similares. O termo da mesma forma inclui polipeptídeos glicosilados. Os peptídeos e polipeptídeos da invenção da mesma forma incluem todas as formas "miméticas" e "peptidomiméticas", como descrito em mais detalhes, abaixo.
Quando empregado aqui, o termo "isolado" significa que o material é removido de seu ambiente original (por exemplo, ambiente natural se for de ocorrência natural). Por exemplo, um polipeptídeo ou polinucleotídeo de ocorrência natural presente em um animal vivo não é isolado, mas o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo, separado de alguns ou todos os materiais coexistentes no sistema natural, é isolado. Tais polinucleotídeos podem fazer parte de um vetor e/ou tais polinucleotídeos ou polipeptídeos podem fazer parte de uma composição, e ainda ser isolados nesse tal vetor ou composição não faz parte de seu ambiente natural. Quando empregado aqui, uma composição ou material isolado pode da mesma forma ser uma composição "purificada", isto é, não requer pureza absoluta; de preferência, é destinado como uma definição relativa. Ácidos nucléicos individuais obtidos de uma biblioteca podem ser purificados convencionalmente em homogeneidade eletroforética. Em aspectos alternativos, a invenção fornece ácidos nucléicos que foram purificados de DNA genômico ou de outras seqüências em uma biblioteca ou outro ambiente por pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou mais ordens de magnitude.
Quando empregado aqui, o termo "recombinante" significa que o ácido nucléico é adjacente a um ácido nucléico de "cadeia principal" ao qual não é adjacente em seu ambiente natural. Em um aspecto, ácidos nucléicos representam 5% ou mais do número de inserções de ácido nucléico em uma população de "moléculas de cadeia principal" de ácido nucléico. "Moléculas de cadeia principal" de acordo com a invenção incluem ácidos nucléicos tais como vetores de expressão, ácidos nucléicos de auto-replicação, vírus, ácidos nucléicos de integração e similares vetores ou ácidos nucléicos empregados para manter ou manipular uma inserção de ácido nucléico de interesse. Em um aspecto, os ácidos nucléicos enriquecidos representam 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais do número de inserções de ácido nucléico na população de moléculas de cadeia principal re-combinante. Proteínas ou polipeptídeos "recombinantes" se referem aos po-lipeptídeos ou proteínas produzidas por técnicas de DNA recombinante; por exemplo, produzidos de células transformadas por um constructo de DNA exógeno codificando a proteína ou polipeptídeo desejado. Proteína ou poli-peptídeos "sintéticos" são aqueles preparados por síntese química, como descrito em mais detalhes, abaixo.
Uma seqüência promotora é "operavelmente ligada a" uma se-qüência de codificação quando RNA polimerase que inicia a transcrição no promotor transcreverá a seqüência de codificação em mRNA, como discutido mais adiante, abaixo. "Oligonucleotídeo" se refere a um polidesoxinucleotídeo de filamento único ou dois filamentos de polidesoxinucleotídeo complementares que pode ser quimicamente sintetizado. Tais oligonucleotídeos sintéticos não têm 5' fosfato e desse modo não ligarão a outro oligonucleotídeo sem adicionar um fosfato com um ATP na presença de uma cinase. Um oligonu-cleotídeo sintético ligará a um fragmento que não foi desfosforilado. A frase "substancialmente idêntica" no contexto de dois ácidos nucléicos ou polipeptídeos, refere-se a duas ou mais seqüências que têm pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade de resíduo (seqüência) de aminoácido ou nucleotídeo, quando comparada e alinhada para correspondência máxima, quando medida empregando um qualquer algoritmo de comparação de seqüência conhecido, como discutido em detalhes abaixo, ou por inspeção visual. Em aspectos alternativos, a invenção fornece seqüências de polipeptídeo e ácido nucléico tendo identidade significativa a uma seqüência exemplar da invenção, por exemplo, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, etc., sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, 150 resíduos, 200 resíduos, 300 resíduos, 400 resíduos, ou uma região variando dentre cerca de 50 resíduos para o tamanho natural do ácido nucléico ou polipeptídeo. Seqüências de ácido nucléico da invenção podem ser substancialmente idênticas sobre o tamanho natural de uma região de codificação de polipeptídeo.
Adicionalmente uma seqüência de aminoácido "substancialmente idêntica" é uma seqüência que difere de uma seqüência de referência por uma ou mais substituições de aminoácido conservadoras ou não conservadoras, deleções ou inserções, particularmente quando uma tal substituição ocorre em um sítio que não é sítio ativo da molécula, e contanto que o poli-peptídeo essencialmente mantenha suas propriedades funcionais. Uma substituição de aminoácido conservadora, por exemplo, substitui um amino-ácido para outra da mesma classe (por exemplo, substituição de um amino-ácido hidrofóbico, tal como isoleucina, valina, leucina ou metionina, para outro, ou substituição de um aminoácido polar para outro, tal como substituição de arginina para lisina, ácido glutâmico para ácido aspártico ou glutamina para asparagina). Um ou mais aminoácidos, podem ser deletados, por exemplo, de um polipeptídeo de fosfolipase, resultando na modificação da estrutura do polipeptídeo, sem significativamente alterar sua atividade biológica. Por exemplo, aminoácidos de terminal de carboxila ou amino que não são requeridos para atividade biológica podem ser removidos. Seqüências de polipeptídeo modificadas da invenção podem ser analisadas para atividade biológica de fosfolipase por qualquer número de métodos, incluindo contatar a seqüência de polipeptídeo modificada com um substrato de fosfoli-pase e determinar se o polipeptídeo modificado diminui a quantidade de substrato específico no ensaio ou aumentos os bioprodutos da reação enzi-mática de uma fosfolipase funcional com o substrato, como discutido tam- bém, abaixo. "Hibridização" refere-se ao processo pelo qual um filamento de ácido nucléico se une com um filamento complementar por emparelhar de base. Reações de hibridização podem ser sensíveis e seletivas de forma que uma seqüência particular de interesse possa ser identificada até mesmo em amostras nas quais está presente em baixas concentrações. Condições apropriadamente severas podem ser definidas, por exemplo, pelas concentrações de sal ou formamida nas soluções de pré-hibridização e hibridização, ou pela temperatura de hibridização, e são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, a severidade pode ser aumentada reduzindo-se a concentração de sal, aumentando-se a concentração de formamida ou elevando-se a temperatura de hibridização, alterando o tempo de hibridização, como descrito em detalhes, abaixo. Em aspectos alternativos, ácidos nucléicos da invenção são definidos por sua capacidade de hibridizar sob várias condições de severidade (por exemplo, alta, média e baixa), como mencionado aqui. O termo "variante" se refere a polinucleotídeos ou polipeptídeos da invenção modificados em um ou mais pares de base, códons, íntrons, exons ou resíduos de aminoácido (respectivamente) contudo ainda mantém a atividade biológica de uma fosfolipase da invenção. As variantes podem ser produzidas por qualquer número de meios incluindo métodos tais como, por exemplo, PCR propensa ao erro, embaralhamento, mutagênese direcionada ao oligonucleotídeo, PCR de reunião, mutagênese de PCR sexual, mutagênese in vivo, mutagênese de cassete, mutagênese de conjunto recursiva, mutagênese de conjunto exponencial, mutagênese sítio específica, rea-grupamento de gene, GSSM® e qualquer combinação destes. Técnicas para produzir fosfolipases variantes tendo atividade em um pH ou temperatura, por exemplo, que é diferente de uma fosfolipase tipo selvagem, são incluídos aqui. O termo "mutagênese de saturação", Gene Site Saturation Mu-tagenesis® (GSSM®) ou "GSSM®" inclui um método que usa degradar iniciadores de oligonucleotídeo para introduzir mutações pontuais em um polinu-cleotídeo, como descrito em detalhes, abaixo. O termo "sistema de evolução direcionada otimizada" ou "evolução direcionada otimizada" inclui um método para reagrupar fragmentos de seqüências de ácido nucléico relacionadas, por exemplo, genes relacionados e esclarecidas em detalhes, abaixo. O termo "reagrupamento de ligação sintética" ou "SLR" inclui um método de ligar fragmentos de oligonucleotídeo de uma maneira não esto-cástica, e esclarecido em detalhes, abaixo.
Geração e Manipulação dos Ácidos nucléicos A invenção fornece ácidos nucléicos isolados e recombinantes (por exemplo, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171 ou SEQ ID NO: 173 exemplar), incluindo cassetes de expressão tais como vetores de expressão, codificando os polipeptídeos e fosfolipases da invenção. A invenção da mesma forma inclui métodos para descobrir seqüências de fosfolipase novas empregando os ácidos nucléicos da invenção. Da mesma forma são fornecidos métodos para modificar os ácidos nucléicos da invenção por, por exemplo, reagrupamento de ligação sintética, sistema de evolução direcionada otimizada e/ou mutagênese de saturação.
Os ácidos nucléicos da invenção podem ser feitos, isolados e/ou manipulados por, por exemplo, clonagem e expressão de bibliotecas de cDNA, amplificação de mensagem ou DNA genômico por PCR, e similares. Praticando-se os métodos da invenção, genes homólogos podem ser modificados manipulando-se um ácido nucléico padrão, como descrito aqui. A invenção pode ser praticada junto com qualquer método ou protocolo ou dispositivo conhecido na técnica, que é bem descrita na literatura científica e de patente. Técnicas Gerais Os ácidos nucléicos empregados para praticar esta invenção, seja RNA, iRNA, ácido nucléico anti-sentido, cDNA, DNA genômico, vetores, vírus ou híbridos destes, podem ser isolados a partir de uma variedade de fontes, geneticamente construídas, amplificadas e/ou expressas/geradas recombinantemente. Polipeptídeos recombinantes gerados a partir destes ácidos nucléicos podem ser individualmente isolados ou clonados e testados quanto a uma atividade desejada. Qualquer sistema de expressão recombi-nante pode ser empregado, incluindo sistemas de expressão bacterianos, de mamíferos, levedura, inseto ou célula de planta.
Alternativamente, estes ácidos nucléicos podem ser sintetizados in vitro por técnicas de síntese química conhecidas, como descrito em, por exemplo, Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic.Biol. Med. 19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979) Meth. En-zymol. 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859; Patente U.S. No. 4.458.066. Técnicas para a manipulação de ácidos nucléicos, tais como, por exemplo, subclonagem, sondas de rotulagem (por exemplo, rotulagem de iniciador aleatório empregando polimerase de Klenow, translação de entalhe, amplificação), seqüenciamento, hibridização e similares são bem descritas na literatura científica e de patente, veja, por exemplo, Sambrook, ed., molecular Cloning: A Laboratory Manual (2° ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); LABORATORY techniques in biochemistry and molecular BIOLOGY: hybridIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Parte I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993).
Outros meios úteis de obter e manipular ácidos nucléicos empregados para praticar os métodos da invenção é clonar a partir de amostras genômicas, e, se desejado, avaliar e reclonar inserções isoladas ou amplificadas de, por exemplo, clones genômicos ou clones de cDNA. Fontes de ácido nucléico empregadas nos métodos da invenção incluem bibliotecas de cDNA ou genômicas contidas em, por exemplo, cromossomos artificiais mamíferos (MACs), veja, por exemplo, Patente U.S. Nos. 5.721.118; 6.025.155; cromossomos artificiais humanos, veja, por exemplo, Rosenfeld (1997) Nat. Genet. 15:333-335; cromossomos artificiais de levedura (YAC); cromossomos artificiais bacterianos (BAC); cromossomos artificiais de P1, veja, por exemplo, Woon (1998) Genomics 50:306-316; vetores derivados de P1 (PACs), veja, por exemplo, Kern (1997) Biotechniques 23:120-124; cos-mídios, vírus recombinantes, fagos ou plasmídeos.
Em um aspecto, um ácido nucléico codificando um polipeptídeo da invenção é reunido em fase apropriada com uma seqüência líder capaz de direcionar a segregação do polipeptídeo trasladado ou fragmento deste. A invenção fornece proteínas de fusão e ácidos nucléicos codificando-os. Um polipeptídeo da invenção pode ser fundido a um polipeptídeo ou peptídeo heterólogo, tal como peptídeos de identificação de N-terminal que dão características desejadas, tal como estabilidade aumentada ou purificação simplificada. Peptídeos e polipeptídeos da invenção podem da mesma ser sintetizados e expressados como proteínas de fusão com um ou mais domínios adicionais ligados a isso para, por exemplo, produzir um peptídeo mais imunogênico, para mais facilmente isolar um peptídeo recombi- nantemente sintetizado, para identificar e isolar anticorpos e células B expressando anticorpo, e similares. Domínios de facilitação de purificação e detecção incluem, por exemplo, peptídeos de quelação de metal tais como tratos de poliistidina e módulos de histidina-triptofano que permitem purificação em metais imobilizados, domínios de proteína A que permitem a purificação em imunoglobulina imobilizada e o domínio utilizado no sistema de purificação de afinidade/extensão de FLAGS (Immunex Corp, Seattle WA). A inclusão de uma seqüência ligadora clivável tal como Fator Xa ou enteroci-nase (Invitrogen, San Diego CA) entre um domínio de purificação e o poli-peptídeo ou peptídeo compreendendo motivo para facilitar a purificação. Por exemplo, um vetor de expressão pode incluir uma seqüência de ácido nu-cléico codificando epítopo ligado aos seis resíduos de histidina seguidos por uma tiorredoxina e um sítio de clivagem de enterocinase (veja, por exemplo, Williams (1995) Biochemistry 34:1787-1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Pu-rif. 12:404-414). Os resíduos de histidina facilitam a detecção e purificação enquanto o sítio de clivagem de enterocinase fornece um meio de purificar o epítopo do restante da proteína de fusão. Tecnologia que pertence aos vetores codificando proteínas de fusão e aplicação de proteínas de fusão é bem descrita na literatura científica e de patente, veja por exemplo, Kroll (1993) DNA Cell. Biol., 12:441-53.
Seqüências de controle de translacional e transcricional A invenção fornece seqüências de ácido nucléico (por exemplo, DNA) da invenção operativamente ligadas à(s) seqüência(s) de controle de expressão (por exemplo, transcricional ou translacional), por exemplo, promotores ou realçadores, para direcionar ou modular síntese / expressão de RNA. A seqüência de controle de expressão pode estar em um vetor de expressão. Promotores bacterianos exemplares incluem lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR, PL e trp. Promotores eucarióticos exemplares incluem CMV imediato precoce, HSV timidina cinase, SV40 precoce e atrasado, LTRs de retrovírus, e metalotioneína de camundongo I.
Promotores adequados para expressar um polipeptídeo em bactérias incluem os promotores de E. coli lac ou trp, o promotor de lacI, o pro- motor de lacZ, o promotor de T3, o promotor de T7, o promotor de gpt, o promotor de lambda PR, o promotor de lambda PL, promotores de opérons codificando enzimas glicolíticas tal como 3-fosfoglicerato cinase (PGK), e o promotor de fosfatase ácida. Promotores eucarióticos incluem o promotor precoce imediato de CMV, promotor de HSV timidina cinase, promotores de choque térmico, o promotor de SV40 precoce e atrasado, LTRs de retrovírus e o promotor de metalotioneína-I de camundongo. Outros promotores conhecidos para controlar a expressão de genes em células procarióticas ou eucarióticas ou seus vírus podem da mesma forma ser empregados.
Vetores de expressão e veículos de clonagem A invenção fornece vetores de expressão e veículos de clonagem compreendendo ácidos nucléicos da invenção, por exemplo, seqüências codificando as fosfolipases da invenção. Vetores de expressão e veículos de clonagem da invenção podem compreender partículas viróticas, bacu-lovírus, fago, plasmídeos, fagomídios, cosmídios, fosmídios, cromossomos artificiais bacterianos, DNA virótico (por exemplo, vacínia, adenovírus, vírus do epitelioma contagioso, pseudo-raivas e derivado de SV40), cromossomos artificiais com base em P1, plasmídeos de levedura, cromossomos artificiais de levedura e quaisquer outros vetores específicos para hospedeiros específicos de interesse (tais como, Bacillus, Aspergillus e levedura). Vetores da invenção podem incluir seqüências de DNA cromossômico, não cromossô-mico e sintético. Números grandes de vetores adequados são conhecidos por aqueles versados na técnica e estão comercialmente disponíveis. Vetores exemplares incluem: bacterianos: vetores de pQE (Qiagen), plasmídeos de pBluescript, vetores de pNH, (vetores de lambda-ZAP (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T (Pharmacia); Eucarióticos: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40 (Pharmacia). Entretanto, qualquer outro plasmídeo ou outro vetor pode ser empregado contanto que eles sejam replicáveis e viáveis no hospedeiro. Vetores de número de cópia baixo ou número de cópia alto podem ser empregados com a presente invenção. O vetor de expressão pode compreender um promotor, um sítio de ligação de ribossoma para iniciação de translação e um terminador de transcrição. O vetor pode também incluir seqüências apropriadas para amplificar a expressão. Vetores de expressão de mamífero podem compreender uma origem de replicação, quaisquer sítios de ligação de ribossoma necessários, um sítio de poliadenilação, sítios doador e aceptores de junção, se-qüências de terminação transcricional e seqüências não transcritas de flan-queamento de 5'. Em alguns aspectos, seqüências de DNA derivadas da junção de SV40 e sítios de poliadenilação podem ser empregadas para fornecer os elementos genéticos não transcritos requeridos.
Em um aspecto, os vetores de expressão contêm um ou mais genes marcadores selecionáveis para permitir a seleção de células hospedeiras contendo o vetor. Tais marcadores selecionáveis incluem genes codificando diidrofolato redutase ou genes que conferem resistência à neomicina para cultura de célula eucariótica, genes que conferem resistência à tetraci-clina ou amplicilina em E. coli e o gene de TRP1 de S. cerevisiae. Regiões promotoras podem ser selecionadas de qualquer gene desejado empregando vetores de cloranfenicol transferase (GATO) ou outros vetores com marcadores selecionáveis.
Vetores para expressar o polipeptídeo ou fragmento deste em células eucarióticas podem conter realçadores para aumentar níveis de expressão. Realçadores são elementos de ação de cis de DNA, normalmente de cerca de 10 a cerca 300 bp no comprimento que age em um promotor para aumentar sua transcrição. Exemplos incluem o realçador de SV40 no lado tardio de 100 a 270 pares de base de origem de replicação, o realçador de promotor precoce de citomegalovírus, o realçador de polioma no lado atrasado da origem de replicação e os realçadores de adenovírus.
Uma seqüência de DNA pode ser inserida em um vetor por uma variedade de procedimentos. Em geral, a seqüência de DNA é ligada à posição desejada no vetor seguindo digestão da inserção e do vetor com endonucleases de restrição apropriadas. Alternativamente, extremidades obtusas tanto na inserção quanto no vetor podem ser ligadas. Uma variedade de técnicas de clonagem é conhecida na técnica, por exemplo, como descrito em Ausubel e Sambrook. Tais procedimentos e similares são considerados estar dentro do escopo daqueles versados na técnica. O vetor pode estar na forma de um plasmídeo, uma partícula vi-rótica ou um fago. Outros vetores incluem seqüências de DNA cromossômi-co, não cromossômico e sintético, derivados de SV40; plasmídeos bacterianos, DNA de fago, baculovírus, plasmídeos de levedura, vetores derivados de combinações de plasmídeos e DNA de fago, DNA virótico tal como vací-nia, adenovírus, pox vírus de ave e pseudo-raivas. Uma variedade de vetores de expressão e clonagem para uso com hospedeiros procarióticos e eucarióticos é descrita por, por exemplo, Sambrook.
Vetores bacterianos particulares que podem ser empregados incluem os plasmídeos comercialmente disponíveis compreendendo elementos genéticos do vetor de clonagem bem conhecido pBR322 (ATCC 37017), pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden), GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA) pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pD10, psiX174 pBluescript II KS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene), ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia), pKK232-8 e pCM7. Vetores eucarióticos particulares incluem pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stra-tagene) pSVK3, pBPV, pMSG e pSVL (Pharmacia). Entretanto, qualquer outro vetor pode ser empregado contanto que seja replicável e viável na célula hospedeira. Células hospedeiras e células transformadas A invenção da mesma forma fornece uma célula transformada compreendendo uma seqüência de ácido nucléico da invenção, por exemplo, uma seqüência codificando uma fosfolipase da invenção, um vetor da invenção. A célula hospedeira pode ser quaisquer das células hospedeiras familiares àqueles versados na técnica, incluindo células procarióticas, células eucarióticas, tais como células bacterianas, células fúngicas, células de levedura, células de mamífero, células de inseto ou células de planta. Enzimas da invenção podem ser expressas em qualquer célula hospedeira, por exemplo, qualquer célula bacteriana, qualquer célula de levedura, por exemplo, Pichia Pastoris, Saccharomyces cerevisiae ou Schizosaccharomyces pombe. As células bacterianas exemplares incluem E. coli, Lactococcus lac-tis, Streptomyces, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Salmonela typhimurium ou quaisquer espécies dentro dos gêneros Bacillus, Streptomyces e Staphylococcus. Células de inseto exemplares incluem Drosophila S2 e Spodoptera Sf9. Células de animais exemplares incluem CHO, COS ou melanoma de Bowes ou qualquer cepa de célula de camundongo ou humano. A seleção de um hospedeiro apropriado está dentro das capacidades daqueles versados na técnica. O vetor pode ser introduzido nas células hospedeiras empregando qualquer dentre uma variedade de técnicas, incluindo transformação, transfecção, transdução, infecção virótica, pistolas de gene ou transferência de gene mediada por Ti. Métodos particulares incluem transfecção de fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-Dextrana, lipofecção ou eletropo-ração (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).
Onde apropriado, as células hospedeiras construídas podem ser cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados quando apropriado para ativar os promotores, selecionando transformantes ou ampliando os genes da invenção. Seguindo a transformação de uma cepa hospedeira adequada e crescimento da cepa hospedeiro em uma densidade de célula apropriada, o promotor selecionado pode ser induzido por meios apropriados (por exemplo, mudança de temperatura ou indução química) e as células podem ser cultivadas durante um período adicional para permiti-las produzir o polipeptídeo desejado ou fragmento deste.
As células podem ser colhidas por centrifugação, rompidas por meios físicos ou químicos e o extrato bruto resultante é mantido para outra purificação. As células microbianas empregadas para expressão de proteínas podem ser rompidas por qualquer método conveniente, enquanto incluindo ciclagem de congelamento-descongelamento, sonicação, rompimento mecânico ou uso de agentes de lise de célula. Tais métodos são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. O polipeptídeo expresso ou fragmento deste podem ser recuperados e purificados a partir de culturas de célula recombinante por métodos incluindo sulfato de amônio ou precipitação de etanol, extração de ácido, cromatografia de troca de ânion ou cátion, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia por afinidade, cromatografia de hidroxilapatita e cromatografia de lectina. Etapas de reduplicação de proteína podem ser empregadas, quando necessário, na conclusão da configuração do polipeptídeo. Se desejado, cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) pode ser empregada para etapas de purificação finais. Vários sistemas de cultura de célula de mamífero podem também ser empregados para expressar proteína recombinante. Exemplos de sistemas de expressão de mamífero incluem as cepas de COS-7 de fi-broblastos de rim de macaco e outras cepas celulares capazes de expressar proteínas de um vetor compatível, tal como as cepas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa e BHK. O constructo em células hospedeiras podem ser empregada de uma maneira convencional para produzir o produto de gene codificado pela seqüência recombinante. Dependendo do hospedeiro empregado em um procedimento de produção recombinante, os polipeptídeos produzidos por células hospedeiras contendo o vetor podem ser glicosilados ou podem ser não glicosilados. Polipeptídeos da invenção podem ou não podem da mesma forma incluir um resíduo de aminoácido de metionina inicial.
Sistemas de translação livres de célula podem da mesma forma ser empregados para produzir um polipeptídeo da invenção. Sistemas de translação livres de célula podem usar mRNAs transcritos a partir de um constructo de DNA compreendendo um promotor operavelmente ligado a um ácido nucléico codificando o polipeptídeo ou fragmento deste. Em alguns aspectos, o constructo de DNA pode ser linearizado antes de conduzir uma reação de transcrição in vitro. O mRNA transcrito é em seguida incubado com um extrato de translação livre de célula apropriado, tal como um extrato de reticulócito de coelho, para produzir o polipeptídeo desejado ou fragmento deste.
Os vetores de expressão podem conter um ou mais genes mar- cadores selecionáveis para fornecer uma característica fenotípica para seleção de células hospedeiras transformadas tal como diidrofolato redutase ou resistência à neomicina para cultura de célula eucariótica ou tal como resistência à tetraciclina ou ampicilina em E. coli.
Uma enzima fosfolipase C exemplar (tendo uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 2) foi super-expressa em forma ativa em uma variedade de sistemas hospedeiros incluindo bactérias gram negativas, tal como E. coli, bactérias gram positivas, tal como qualquer Bacillus sp. (por exemplo, Bacillus subtilis, Bacillus cereus), células hospedeiras de levedura (incluindo, por exemplo, Pichia pastoris, Saccharomyces sp., tal como S. cerevisiae e S. pombe) e Lactococcus lactis, ou células de mamífero, fungos, planta ou inseto. A enzima ativa é expressa a partir de uma variedade de constructos em cada sistema hospedeiro. Estes constructos de expressão de ácido nucléico podem compreender nucleotídeos codificando a estrutura de leitura aberta de tamanho natural (composto da seqüência de sinal, a pró-seqüência e a seqüência de codificação de proteína madura) ou elas podem compreender um sub-grupo destes elementos genéticos sozinhos ou em combinação com elementos genéticos heterológos que servem como a seqüência de sinal e/ou a pró-seqüência da estrutura de leitura aberta madura. Cada destes sistemas pode servir como um hospedeiro de produção comercial para a expressão de PLC para uso nos processos de desengomamento de óleo enzimáticos previamente descritos.
Amplificação de Ácidos nucléicos Na prática da invenção, ácidos nucléicos codificando os polipeptídeos da invenção, ou ácidos nucléicos modificados, podem ser reproduzidos por, por exemplo, amplificação. A invenção fornece pares de seqüência de iniciador de amplificação para amplificar ácidos nucléicos codificando polipeptídeos com uma atividade de fosfolipase. Em um aspecto, os pares de iniciador são capazes de ampliar seqüências de ácido nucléico da invenção, por exemplo, incluindo a SEQ ID NO: 1 exemplar, ou uma subseqüência desta; uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 3, ou uma subseqüência desta; uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 5, ou uma subseqüência desta; e, uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 7, ou uma subseqüência desta, etc. Alguém versado na técnica pode projetar pares de seqüência de iniciador de amplificação para qualquer parte de ou o tamanho natural destas seqüências. A invenção fornece um par de seqüência de iniciador de amplificação para amplificar um ácido nucléico codificando um polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase, em que o par de iniciador é capaz de amplificar um ácido nucléico compreendendo uma seqüência da invenção, ou fragmentos ou subseqüências destes. Um ou cada membro do par de seqüência de iniciador de amplificação pode compreender um oligonucleotídeo compreendendo pelo menos cerca de 10 a 50 bases consecutivas da seqüência, ou cerca de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 bases consecutivas da seqüência. A invenção fornece pares de iniciador de amplificação, em que o par de iniciador compreende um primeiro membro tendo uma seqüência como mencionada por cerca dos primeiros (o 5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 resíduos de um ácido nucléico da invenção e um segundo membro tendo uma seqüência como mencionada por cerca dos primeiros (o 5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 resíduos do filamento complementar do primeiro membro. A invenção fornece fosfolipases geradas por amplificação, por exemplo, reação em cadeia da polimerase (PCR), empregando um par de iniciador de amplificação da invenção. A invenção fornece métodos de preparar uma fosfolipase por amplificação, por exemplo, reação em cadeia da polimerase (PCR), empregando um par de iniciador de amplificação da invenção. Em um aspecto, o par de iniciador de amplificação amplifica um ácido nucléico a partir de uma biblioteca, por exemplo, uma biblioteca de gene, tal como uma biblioteca ambiental.
Reações de amplificação podem também ser empregadas para quantificar a quantidade de ácido nucléico em uma amostra (tal como a quantidade de mensagem em uma amostra de célula), rotular o ácido nucléi-co (por exemplo, aplicá-lo em uma disposição ou uma mancha), detectar o ácido nucléico ou quantificar a quantidade de um ácido nucléico específico em uma amostra. Em um aspecto da invenção, mensagem isolada de uma célula ou uma biblioteca de cDNA é amplificada. O técnico experiente pode selecionar e projetar iniciadores de amplificação de oligonucleotídeo adequados. Métodos de amplificação são da mesma forma bem conhecidos na técnica, e incluem, por exemplo, reação em cadeia da polimerase, PCR (veja, por exemplo, PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS ed. Innis, Academic Press, N.Y. (1990) and PCR STRATEGIES (1995), ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y., ligase chain reaction (LCR) (veja, por exemplo, Wu (1989) Genomics 4:560; Landegren (1988) Science 241:1077; Barringer (1990) Gene 89:117); amplificação de transcrição (veja, por exemplo, Kwoh (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173); e, replicação de seqüência auto-sustentada (veja, por exemplo, Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874); amplificação de Q Beta replicase (veja, por exemplo, Smith (1997) J. Clin. Microbiol. 35:1477-1491), ensaio de amplificação de Q-beta replicase automático (veja, por exemplo, Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10:257-271) e outras técnicas mediadas por RNA polimerase (por exemplo, NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario); veja também Berger (1987) Methods Enzymol. 152:307-316; Sambrook; Ausubel; Patente U.S. Nos. 4.683.195 e 4.683.202; Sooknanan (1995) Biotechnology 13:563-564. Determinação do grau de identidade de seqüência A invenção fornece ácidos nucléicos isolados e recombinantes compreendendo seqüências tendo pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou identidade de se-qüência completa (100%) para um ácido nucléico exemplar da invenção (por exemplo, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171 ou SEQ ID NO: 173, e ácidos nucléicos codificando SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108 SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138; SEQ ID NO: 140; SEQ ID NO: 142; SEQ ID NO: 144; NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, ou SEQ ID NO: 174) sobre uma região de pelo menos cerca de 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 ou mais resíduos. A invenção fornece polipeptídeos compreendendo seqüências tendo pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou identidade de seqüência completa (100%) para um polipeptídeo exemplar da invenção. A extensão da identidade de seqüência (homologia) pode ser determinada empregando qualquer programa de computação e parâmetros associados, incluindo aqueles aqui descritos, tal como BLAST 2.2.2. ou FASTA versão 3.0t78, com os parâmetros básicos. Em modalidades alternativas, a identificação da seqüência pode estar sobre uma região de pelo menos cerca de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 resíduos consecutivos, ou o tamanho natural do ácido nucléico ou polipeptídeo. A extensão da identidade de seqüência (homologia) pode ser determinada empregando qualquer programa de computação e parâmetros associados, incluindo aqueles aqui descritos, tal como BLAST 2.2.2. ou FASTA versão 3.0t78, com os parâmetros básicos. figura 11 é um diagrama que descreve características selecionadas de ácidos nucléicos e polipeptídeos exemplares da invenção, incluindo comparação de identidade das seqüências das seqüências exemplares das bases de dados públicos. Todas as seqüências descritas na figura 11 foram submetidas a uma pesquisa de BLAST (como descrito em detalhes, abaixo) junto a dois grupos de bases de dados. O primeiro grupo de banco de dados está disponível por NCBI (Centro Nacional para Informação de Biotecnologia). Todos os resultados das pesquisas junto a estas bases de dados são encontrados nas colunas intituladas "Descrição de NR", "Código de Acessão NR", "valor E de NR" ou "Organismo de NR". "NR" se refere ao banco de dados de nucleotídeo Não-redundante mantido por NCBI. Este banco de dados é uma combinação de GenBank, atualizações de GenBank e atualizações de EMBL. As entradas na coluna "Descrição de NR" se referem à linha de definição em qualquer determinado registro de NCBI, que inclui uma descrição da seqüência, tal como o organismo de fonte, nome de gene /nome da proteína ou alguma descrição da função da seqüência. As entradas na coluna "Código de Acessão de NR" se referem ao único identificador determinado em um registro de seqüência. As entradas na coluna "valor E de NR" se referem ao valor Esperado (valor E), que representa a probabilidade que um escore de alinhamento tão bom quanto aquele encontrado entre a seqüência em questão (as seqüências da invenção) e uma seqüência do banco de dados seria encontrado no mesmo número de comparações entre as seqüências aleatórias como foi feito na pesquisa de BLAST presente. As entradas na coluna "Organismo de NR" se referem ao organismo de fonte da seqüência identificada como o golpe de BLAST mais próximo. O segundo grupo de bases de dados é coletivamente conhecido como o banco de dados de Geneseq®, que está disponível por Thomson Derwent (Phila-delphia, PA). Todos os resultados das pesquisas junto a esta base de dados são encontrados nas colunas intituladas "Descrição de Proteína de Ge-neseq", "Código de Acessão de Proteína de Geneseq", "Valor E de Proteína de Geneseq", "Descrição de DNA Geneseq", "Código de Acessão DNA de Geneseq" ou "valor E de DNA de Geneseq". A informação encontrada nestas colunas é comparável à informação encontrada nas colunas de NR descritas acima, a não ser que tenha sido derivada de pesquisas de BLAST junto a base de dados de GeneseqTM em vez das bases de dados de NCBI. Além disso, esta tabela inclui a coluna "No. de EC Predito". Um número de EC é o número designado a um tipo de enzima de acordo com um esquema da nomenclatura de enzima padronizada desenvolvida pela Comissão de Enzima do Comitê de Nomenclatura da União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (IUBMB). Os resultados na coluna de "No. de EC Predito" são determinados por uma pesquisa de BLAST junto a contra a base de dados de Kegg (Enciclopédia de Kyoto de Genes e Genômas). Se a comparação de BLAST de topo tiver um valor E igual a ou menor que e-6, o número de EC designado para o par de topo é ingressado na tabela. O número de EC do golpe de topo é empregado como um guia em que o número de EC da seqüência da invenção pôde estar. As colunas "Comprimento de DNA em Questão" e "Comprimento de Proteína em Questão" se referem ao número de nucleotídeos ou ao número de aminoácidos, respectivamente, na se-qüência da invenção que foi pesquisada ou interrogada junto as bases de dados de Geneseq ou NCBI. As colunas "Comprimento de DNA de NR ou Geneseq" e "Comprimento de proteína de NR ou Geneseq" se referem ao número de nucleotídeos ou o número de aminoácidos, respectivamente, na seqüência do par de topo da procura pesquisa de BLAST. Os resultados fornecidos nestas colunas são da pesquisa que declarou o valor E mais baixo, das bases de dados de NCBI ou da base de dados de Geneseq. As colunas "Geneseq ou NR %ID Proteína" e "Geneseq ou NR %ID DNA" se referem ao percentual da identidade de seqüência entre a seqüência da invenção e a seqüência do par de BLAST de topo. Os resultados fornecidos nestas colunas são da pesquisa que declarou o valor E mais baixo, ou das bases de dados de NCBI ou a base de dados de Geneseq.
Seqüências homólogas da mesma forma incluem seqüências de RNA nas quais uridinas substituem as timinas nas seqüências de ácido nu-cléico. As seqüências homólogas podem ser obtidas empregando quaisquer dos procedimentos descritos aqui ou podem resultar da correção de um erro de seqüenciamento. Será apreciado que as seqüências de ácido nucléico como mencionadas aqui podem ser representadas no único formato de caráter tradicional (veja, por exemplo, Stryer, Lubert. Biochemistry, 3a Ed., W. H Freeman & Co., New York) ou em qualquer outro formato que registra a identidade dos nucleotídeos em uma seqüência. Vários programas de comparação de seqüência identificados aqui são empregados neste aspecto da invenção. Identidades (homologias) de seqüência de ácido nucléico e/ou proteína podem ser avaliadas empre- gando qualquer dentre a variedade de programas e algoritmos de comparação de seqüência conhecidos na técnica. Tais algoritmos e programas incluem, porém não são limitados a, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA e CLUSTALW (Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8):2444 -2448, 1988; Altschul e similares, J. Mol. Biol. 215(3):403-410, 1990; Thompson e similares, Nucleic Acids Res. 22(2):4673-4680, 1994; Higgins e similares, Methods Enzymol. 266:383-402, 1996; Altschul e similares, J. Mol. Biol. 215(3):403-410, 1990; Altschul e similares, Nature Genetics 3: 266-272, 1993).
Homologia ou identidade pode ser medida empregando o software de análise de seqüência (por exemplo, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Tal software compara seqüências similares designando-se graus de homologia em várias deleções, substituições e outras modificações. Os termos "homologia" e "identidade" no contexto de dois ou mais ácidos nucléicos ou seqüências de polipeptídeo, se refere a duas ou mais seqüências ou subseqüências que são as mesmas ou têm uma porcentagem especificada de resíduos de ami-noácido ou nucleotídeos que são os mesmos quando comparados e alinhados quanto à correspondência máxima sobre uma janela de comparação ou região designada quando medida empregando qualquer número de algoritmos de comparação de seqüência ou por alinhamento manual e inspeção visual. Para comparação de seqüência, uma seqüência pode agir como uma seqüência de referência (uma seqüência exemplar SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, etc.) em que seqüências teste são comparadas. Quando empregando um algoritmo de comparação de seqüência, seqüên-cias de referência e teste são registradas em um computador, coordenadas de subseqüência são designadas, se necessário, e parâmetros de programa de algoritmo de seqüência são designados. Parâmetros de programa default podem ser empregados, ou parâmetros alternativos podem ser designados. O algoritmo de comparação de seqüência em seguida calcula as identidades de seqüência percentuais para as seqüências teste relativa a seqüência de referência, com base nos parâmetros de programa.
Uma "janela de comparação", quando aqui empregada, inclui referência a um segmento de qualquer um do número de resíduos contíguos. Por exemplo, em aspectos alternativos da invenção, resíduos contíguos variando em parte de 20 ao tamanho natural de uma seqüência exemplar da invenção, por exemplo, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, etc., são comparados a uma seqüência de referência do mesmo número de posições contíguas depois que as duas seqüências estiverem otimamente alinhadas. Se a seqüência de referência tem a identidade de seqüência requerida para uma seqüência exemplar da invenção, por exemplo, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais identidade de seqüência para uma seqüência da invenção, por exemplo, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, etc., essa seqüência está dentro do escopo da invenção. Em modalidades alternativas, sub-seqüências variando de cerca de 20 a 600, cerca de 50 a 200, e cerca de 100 a 150 são comparadas a uma seqüência de referência do mesmo número de posições contíguas depois que as duas seqüências estiverem otimamente alinhadas. Métodos de alinhamento de seqüência para comparação são bem conhecidos na técnica. O alinhamento ideal de seqüências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981, pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970, pela pesquisa quanto ao método de similaridade de person & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988, por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Pa-chage, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por alinhamento manual e inspeção visual. Outros algoritmos para determinar homologia ou identidade incluem, por exemplo, além de um programa de BLAST (Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Informatrion), ALIGN, AMAS (Analysis of Multiply Aligned Sequences), AMPS (Protein Multiple Sequence Alignment), ASSET (Aligned Segment Statistical Evaluation Tool), BANDS, BESTSCOR, BIOSCAN (Biological Sequence Comparative Analysis Node), BLIMPS (BLocks IMProve Searcher), FASTA, Intervals & Points, BMB, CLUSTAL V, CLUSTAL W, CONSENSUS, LCONSENSUS, WCONSENSUS, algoritmo de Smith-Waterman, DARWIN, algoritmo de Las Vegas, FNAT (Forced Nucleotide Alignment Tool), Framealign, Framesearch, DINAMIC, FILTER, FSAP (Fristensky Sequence Analysis Package), GAP (Global Alignment Program), GENAL, GIBBS, GenQuest, ISSC (Sensitive Sequence Comparison), LALIGN (Local Sequence Alignment), LCP (Local Content Program), MACAW (Multiple Alignment Construction & Analysis Workbench), MAP (Multiple Alignment Pro-gram), MBLKP, MBLKN, PIMA (Pattern-Induced Multi-Sequence Alignment), SAGA (Sequence Alignment by Genetic Algorithm) e WHAT-IF. Tais programas de alinhamento podem da mesma forma ser empregados para avaliar bases de dados de genoma para identificar seqüências de polinucleotídeo tendo seqüências substancialmente idênticas. Várias bases de dados de genoma estão disponíveis, por exemplo, uma porção substancial do genoma humano está disponível como parte do Human Genome Sequencing Project (Gibbs, 1995). Vários genomas foram seqüenciados, por exemplo, M. genita-lium (Fraser e similares, 1995), M. jannaschii (Bult e similares, 1996), H. influenzae (Fleischmann e similares, 1995), E. coli (Blattner e similares, 1997), e levedura (S. cerevisiae) (Mewes e similares, 1997), e D. melanogaster (Adams e similares, 2000). Progresso significante foi da mesma forma feito seqüenciando-se os genomas de organismo modelo, tal como camundongo, C. elegans, e Arabadopsis sp. Bases de dados contendo informação genô-mica anotadas com alguma informação funcional são mantidas por organização diferente, e são acessíveis pela internet.
Algoritmos de BLAST, BLAST 2,0 e BLAST 2,2,2 são da mesma forma empregados para praticar a invenção. Eles são descritos, por exemplo, em Altschul (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. O software para realizar análises de BLAST está publicamente disponível através do Centro Nacional para Informação de Biotecnologia.
Este algoritmo envolve primeiro identificar pares de seqüência de escore alto (HSPs) identificando-se palavras curtas de comprimento W na seqüência em questão, que compara ou satisfaz algum escore limiar de valor positivo T quando alinhado com uma palavra do mesmo comprimento em uma seqüência de base de dados. T é referido como o limiar de escore de palavra vizinha (Altschul (1990) supra). Estes golpes de palavra de vizinhança inicial age como famílias para iniciar pesquisas para encontrar HSPs mais longo contendo-os. Estes golpes de palavra são prolongados em ambas as direções ao longo de cada seqüência para até o escore de alinhamento cumulativo puder ser aumentado. Escores cumulativos são calculados empregando, para seqüências de nucleotídeo, os parâmetros M (escore de recompensa para um par de resíduos de comparação; sempre >0). Para seqüên-cias de aminoácido, uma matriz de escore é empregada para calcular o escore cumulativo. A extensão dos golpes de palavra em cada direção é parada quando: o escore de alinhamento cumulativo cai pela quantidade X de seu valor máximo obtido; o escore cumulativo parte de zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo de escore negativo; ou no final de cada seqüência é alcançado. Os parâmetros de algoritmo de BLAST W, T, e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa de BLAST (para seqüências de nucleotídeo) usa como defaults um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M=5, N= -4 e uma comparação de ambos os filamentos. Para seqüências de aminoá-cido, programa de BLASTP usa como defaults um comprimento de palavra de 3, e expectativas (E) de 10, e a matriz de escore de BLOSUM62 (veja Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N = -4, e uma comparação de ambos os filamentos. O algoritmo de BLAST da mesma forma realiza uma análise estatística da similaridade entre duas seqüências (veja, por exemplo, Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873). Uma medida de similaridade fornecida por algoritmo de BLAST é a probabilidade de soma menor (P(N)) que fornece uma indicação da probabilidade pela qual um par entre duas seqüências de nucleo-tídeo ou aminoácido ocorreria por mudança. Por exemplo, um ácido nucléico é considerado similar a uma seqüência de referência se a probabilidade de soma menor em uma comparação do ácido nucléico teste ao ácido nucléico de referência for menor do que cerca de 0,2, mais preferivelmente menor do que cerca de 0,01, e mais preferivelmente menor do que cerca de 0,001. Em um aspecto, homologias de seqüência de ácido nucléico e proteína são avaliadas empregando o Basic Local Alignment Search Tool ("BLAST"). Por exemplo, cinco programas de BLAST específicos podem ser empregados para realizar as seguintes tarefas: (1) BLASTP e BLAST3 comparam uma seqüência em questão de aminoácido junto a uma base de dados de se-qüência de proteína; (2) BLASTN compara uma seqüência em questão de nucleotídeo junto a uma base de dados de seqüência de nucleotídeo; (3) BLASTX compara os produtos de translação conceituais de seis estruturas de uma seqüência de nucleotídeo em questão (ambos os filamentos) junto a uma base de dados de seqüência de proteína; (4) TBLASTN compara uma seqüência de proteína em questão junto a uma base de dados de seqüência de nucleotídeo transladada em todas as seis estruturas de leitura (ambos os filamentos); e, (5) TBLASTX compara as translações de seis estruturas de uma seqüência em questão de nucleotídeo junto as translações de seis estruturas de uma base de dados de seqüência de nucleotídeo. Os programas BLAST identificam seqüências homólogas identificando-se segmentos similares, que são referidos aqui como "pares de segmento de alto escore," entre uma seqüência de ácido nucléico ou amino em questão e uma seqüência teste que é preferivelmente obtida a partir de uma base de dados de se-qüência de ácido nucléico ou proteína. Pares de segmento de escore alto são preferivelmente identificados (isto é, alinhados) por meio de uma matriz de escore, muitos dos quais são conhecidos na técnica. Preferivelmente, a matriz de escore empregada é a matriz BLOSUM62 (Gonnet e similares, Science 256:1443-1445, 1992; Henikoff e Henikoff, Proteins 17:49-61, 1993). Menos preferivelmente, as matrizes PAM ou PAM250 podem da mesma forma ser empregadas (veja, por exemplo, Schwartz e Dayhoff, eds., 1978, Matrices for Detections Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundation).
Em um aspecto da invenção, para determinar se um ácido nu-cléico tem a identidade de seqüência requerida para estar dentro do escopo da invenção, os programas NCBI BLAST 2.2.2 são empregados. Opções de default para blastp. Há cerca de 38 opções de colocação no programa BLAST 2.2.2. Neste aspecto exemplar da invenção, todos os valores de default são empregados exceto para a colocação de filtração default (isto é, todos os parâmetros definem-se em default exceto filtração que é definido em OFF); em seu lugar uma colocação "-F F" é empregada, que incapacita a filtração. Uso de filtração default freqüentemente resulta em violações de Karlin-Altschul devido ao comprimento curto da seqüência.
Os valores default empregados neste aspecto exemplar da invenção, e para determinar os valores na figura 11, como discutido acima, incluem: "Filtro para baixa complexidade: ON > Tamanho da Palavra: 3 > Matriz: Blosum62 > Custos de Espaço: Existência: 11 > Extensão: 1" Outras colocações default são: filtro para baixa complexidade OFF, tamanho de palavra de 3 para proteína, matriz de BLOSUM62, penalidade de existência de espaço de -11 e uma penalidade de extensão de espaço de -1.
Uma colocação de programa NCBI BLAST 2.2.2 exemplar é mencionada no Exemplo 1, abaixo. Nota-se que a opção "-W" falta para 0. Isto significa que, se não fixado, o tamanho da palavra falta em 3 para proteínas e 11 para nucleotídeos.
Sistemas de computador e produtos de programa de computador Para determinar e identificar identidades de seqüência, homolo-gias estruturais, motivos e similares in silico, uma seqüência de ácido nucléico ou polipeptídeo da invenção pode ser armazenada, registrada e manipulada em qualquer meio que pode ser lido e acessado por um computador. Desta maneira, a invenção fornece computadores, sistemas de computador, meios legíveis de computador, produtos de programas de computador e similares registrados ou armazenados nessas seqüências de polipeptídeo e ácido nucléico da invenção, por exemplo, uma seqüência exemplar da invenção, por exemplo, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, etc. Quando aqui empregado, as palavras "registradas" e "armazenadas" se referem a um processo para armazenar informação em um meio de computador. Um técnico versado pode facilmente adotar quaisquer métodos conhecidos para informação de registro em um meio legível de computador para gerar fabricações compreendendo uma ou mais das seqüências de polipeptídeo e/ou ácido nucléicos da invenção.
Outro aspecto da invenção é um meio legível de computador tendo registrado nele pelo menos uma seqüência de ácido nucléico e/ou po-lipeptídeo da invenção. Meios legíveis de computador incluem meios magneticamente legíveis, meios oticamente legíveis, meios eletronicamente legíveis, meios magnéticos/óticos, memórias instantânea. Por exemplo, os meios legíveis de computador podem ser um disco rígido, um disquete, uma fita magnética, uma memória instantânea, CD-ROM, Disco Versátil Digital (DVD), Memória de Acesso Aleatório (RAM), Memória Exclusiva de Leitura (ROM), ou qualquer tipo de meios conhecidos por aqueles versados na técnica.
Aspectos da invenção incluem sistemas (por exemplo, sistemas com base em internet), particularmente sistemas de computador, que armazenam e manipulam as seqüências e informações de seqüência descritas aqui. Um exemplo de um sistema de computador 100 é ilustrado em forma de diagrama de bloco na figura 1. Quando aqui empregado, "um sistema de computador" se refere aos componentes de hardware, componentes de software, e componentes de armazenagem de dados empregados para analisar uma seqüência de polipeptídeo ou nucleotídeo da invenção. O sistema de computador 100 pode incluir um processador para processar, acessar e manipular os dados de seqüência. O processador 105 pode ser qualquer tipo bem conhecido de unidade de processamento central, tal como, por exemplo, o Pentium III de Intel Corporation, ou processador similar de Sun, Motorola, Compaq, AMD ou International Business Machines. O sistema de computador 100 é um sistema de propósito geral que compreende o processador 105 e um ou mais componentes de armazenagem de dados internos 110 para armazenar dados, e um ou mais dispositivos de recuperação de dados para recuperar os dados armazenados nos componentes de armazenagem de dados. Um técnico versado pode facilmente apreciar que qualquer um dos sistemas de computador atualmente disponíveis são adequados.
Em um aspecto, o sistema de computador 100 inclui um processador 105 conectado a um barramento que é conectado a uma memória principal 115 (preferivelmente implementada como RAM) e um ou mais dispositivos de armazenamento de dados internos 110, tal como um unidade rígida e/ou outros meios legíveis de computador tendo dados registrados nesse. O sistema de computador 100 pode também incluir um ou mais dispositivos de recuperação de dados 118 para ler os dados armazenados nos dispositivos de armazenamento de dados internos 110. O dispositivo de recuperação de dados 118 pode representar, por exemplo, um drive de disquete, um drive de disco compacto, um drive de fita magnética, ou um modem capaz de conexão a um sistema de armazenamento de dados remoto (por exemplo, pela internet) etc. Em algumas modalidades, o dispositivo de armazenamento de dados interno 110 é um meio legível de computador removível tal como um disquete, um disco compacto, uma fita magnética, etc. contendo lógica de controle e/ou dados registrados nesses. O sistema de computador 100 pode vantajosamente incluir ou ser programado por software apropriado para ler a lógica de controle e/ou os dados do componente de armazenamento de dados logo que inseridos no dispositivo de recuperação de dados. O sistema de computador 100 inclui uma tela de exibição 120 que é empregado para exibir a saída para um usuário de computador. Deve-se também observar que o sistema de computador 100 pode ser ligado a outros sistemas de computador 125a-c em uma rede ou rede de área extensa para fornecer acesso centralizado ao sistema de computador 100. Software para acessar e processar as seqüências de aminoácido ou nucleotídeo da invenção pode residir em memória principal 115 durante a execução.
Em alguns aspectos, o sistema de computador 100 pode também compreender um algoritmo de comparação de seqüência para comparar uma seqüência de ácido nucléico da invenção. O algoritmo e seqüên-cia(s) pode(m) ser armazenado(s) em um meio legível de computador. Um "algoritmo de comparação de seqüência" se refere a um ou mais programas que são implementados (localmente ou remotamente) no sistema de computador 100 para comparar uma seqüência de nucleotídeo com outras seqüên-cias de nucleotídeo e/ou compostos armazenados dentro de um meio de armazenamento de dados. Por exemplo, o algoritmo de comparação de se-qüência pode comparar as seqüências de nucleotídeo de uma seqüência exemplar, por exemplo, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, etc. armazenadas em um meio legível de computador as seqüências de referência armazenadas em um meio legível de computador para identificar homo-logias ou motivos estruturais.
Os parâmetros empregados com os algoritmos acima podem ser adaptados dependendo do comprimento da seqüência e grau de homologia estudado. Em alguns aspectos, os parâmetros podem ser os parâmetros default empregados pelos algoritmos na ausência de instruções do usuário. A figura 2 é um diagrama de fluxo ilustrando um aspecto de um processo 200 para comparar uma nova seqüência de proteína ou nucleotídeo com uma base de dados de seqüências a fim de determinar os níveis de homolo-gia entre a nova seqüência e as seqüências na base de dados. A base de dados das seqüências pode ser uma base de dados privada armazenada dentro do sistema de computador 100, ou uma base de dados pública tal como GENBANK que está disponível pela Internet. O processo 200 começa em um estado de origem 201 e em seguida move-se para um estado 202 em que a nova seqüência a ser comparada é armazenada em uma memória em um sistema de computador 100. Como discutido acima, a memória poderia ser qualquer tipo de memória, incluindo RAM ou um dispositivo de armazenamento interno. O processo 200 em seguida move-se para um estado 204 em que uma base de dados de seqüências é aberta para análise e comparação. O processo 200 em seguida move-se para um estado 206 em que a primeira seqüência armazenada na base de dados é lida em uma memória no computador. Uma comparação é em seguida realizada em um estado 210 para determinar se a primeira seqüência é a mesma que a segunda seqüência. É importante notar que esta etapa não está limitada a realizar uma comparação exata entre a nova seqüência e a primeira seqüência na base de dados. Métodos bem conhecidos são conhecidos por aqueles versados na técnica para comparar duas seqüências de proteína ou nucleotídeo, mesmo que elas não sejam idênticas. Por exemplo, espaços podem ser introduzidos em uma seqüência a fim de aumentar o nível de homologia entre as duas seqüências testadas. Os parâmetros que controlam se os espaços ou outras características são introduzidos em uma seqüência durante a comparação são normalmente ingressados pelo usuário do sistema de computador.
Logo que uma comparação das duas seqüências foi realizada no estado 210, uma determinação é feita em um estado de decisão 210 se as duas seqüências forem as mesmas. Evidente, o termo "mesmo" não está limitado a seqüências que são absolutamente idênticas. Seqüências que estão dentro dos parâmetros de homologia ingressados pelo usuário serão marcadas como "mesmas" no processo 200. Se uma determinação é feita que as duas seqüências são as mesmas, o processo 200 move-se para um estado 214 em que o nome da seqüência da base de dados é exibido ao usuário. Este estado notifica o usuário que a seqüência com o nome exibido cumpre os constrangimentos de homologia que foram ingressados. Logo que o nome da seqüência armazenada é exibido ao usuário, o processo 200 move-se para um estado de decisão 218 em que uma determinação é feita se mais seqüências existirem na base de dados. Se mais nenhuma seqüência existir na base de dados, em seguida o processo 200 termina em um estado final 220. Entretanto, se mais seqüências existirem na base de dados, em seguida o processo 200 move-se para um estado 224 em que um indicador é movido para a próxima seqüência na base de dados de forma que possa ser comparado à nova seqüência. Desta maneira, a nova seqüência está alinhada e comparada com toda seqüência na base de dados.
Deveria ser notado que se uma determinação fosse feita no estado de decisão 212 que as seqüências não foram homólogas, em seguida o processo 200 se moveria imediatamente para o estado de decisão 218 a fim de determinar se quaisquer outras seqüências estão disponíveis na base de dados para comparação. Desta maneira, um aspecto da invenção é um sistema de computador compreendendo um processador, um dispositivo de armazenamento de dados tendo armazenado nele uma seqüência de ácido nucléico da invenção e um comparador de seqüência para conduzir a comparação. O comparador de seqüência pode indicar um nível de homologia entre as seqüências comparadas ou identificar motivos estruturais, ou pode identificar motivos estruturais em seqüências que são comparadas aqueles códigos de ácido nucléico e códigos de polipeptídeo. A figura 3 é um diagrama de fluxo ilustrando uma modalidade de um processo 250 em um computador para determinar se duas seqüências são homólogas. O processo 250 começa em um estado de origem 252 e em seguida move-se para um estado 254 em que uma primeira seqüência a ser comparada é armazenada em uma memória. A segunda seqüência a ser comparada é em seguida armazenada em uma memória em um eatado 256. O processo 250 em seguida move-se para um estado 260 em que o primeiro caracter na primeira seqüência é lido e em seguida para um estado 262 em que o primeiro caracter da segunda seqüência é lido. Deveria ser entendido que se a seqüência for uma seqüência de nucleotídeo, em seguida o caracter normalmente seria A, T, C, G ou U. Se a seqüência for uma seqüência de proteína, em seguida pode ser um código de aminoácido de letra única de forma que a primeira e segunda seqüências possam ser facilmente comparadas. Uma determinação é em seguida feita em um estado de decisão 264 se os dois caracteres são os mesmos. Se eles são os mesmos, em seguida o processo 250 move-se para um estado 268 em que os próximos caracteres na primeira e segunda seqüências são lidas. Uma determinação é em seguida feita se os próximos caracteres forem os mesmos. Se eles forem, em seguida o processo 250 continua esta volta até que os dois caracteres não sejam os mesmos. Se uma determinação é feita que os próximos dois caracteres não são os mesmos, o processo 250 move-se para um estado de decisão 274 para determinar se há quaisquer mais caracteres em cada se-qüência a ler. Se não há quaisquer mais caracteres a ler, em seguida o processo 250 move-se para um estado 276 em que o nível de homologia entre a primeira e segunda seqüências é exibido ao usuário. O nível de homologia é determinado calculando-se a proporção de caracter entre as seqüências que foram as mesmas fora do número total de seqüências na primeira se-qüência. Desse modo, se todo caracter em uma primeira seqüência de nu-cleotídeo 100 alinhada com todos caracteres em uma segunda seqüência, o nível de homologia seria 100%.
Alternativamente, o programa de computador pode comparar uma seqüência de referência a uma seqüência da invenção para determinar se as seqüências diferem-se em uma ou mais posições. O programa pode registrar o comprimento e identidade de resíduos de aminoácido ou nucleo-tídeos substituídos, deletados ou inseridos, com respeito à seqüência da referência ou da invenção. O programa de computador pode ser um programa que determina se uma seqüência de referência contém um único polimorfis-mo de nucleotídeo (SNP) com respeito a uma seqüência da invenção, ou, se uma seqüência da invenção compreende um SNP de uma seqüência conhecida. Desse modo, em alguns aspectos, o programa de computador é um programa que identifica SNPs. O método pode ser implementado pelos sistemas de computador descritos acima e o método ilustrado na figura 3. O método pode ser realizado lendo-se uma seqüência da invenção e as se- qüências de referência através do uso do programa de computador e identificando diferenças com o programa de computador.
Em outros aspectos o sistema com base em computador compreende um identificador para identificar características dentro de um ácido nucléico ou polipeptídeo da invenção. Um "identificador" se refere a um ou mais programas que identificam certas características dentro de uma seqüência de ácido nucléico. Por exemplo, um identificador pode compreender um programa que identifica uma estrutura de leitura aberta (ORF) em uma seqüência de ácido nucléico. A figura 4 é um diagrama de fluxo ilustrando um aspecto de um processo de identificador 300 para detectar a presença de uma característica em uma seqüência. O processo 300 começa em um estado de origem 302 e em seguida move-se para um estado 304 em que uma primeira seqüência que será verificada para características é armazenada a uma memória 115 no sistema de computador 100. O processo 300 em seguida move-se para um estado 306 em que uma base de dados de características de seqüência é aberta. Uma tal base de dados incluiria uma lista de cada atributo de característica juntamente com o nome da característica. Por exemplo, um nome de característica poderia ser "Códon Iniciação" e o atributo seria "ATG." Outro exemplo seria o nome de característica "Caixa TAATAA". e o atributo de característica seria "TAATAA". Um exemplo de uma tal base de dados é produzido pela Universidade de Wisconsin Genetics Computer Group. Alternativamente, as características podem ser motivos de polipeptídeo estruturais tais como alfa hélices, lâminas beta, ou motivos de polipeptídeo funcionais tais como sítios ativos enzimáticos, motivos de hélice-volta-hélice ou outros motivos conhecidos por aqueles versados na técnica. Logo que a base de dados de características é aberta ao estado 306, o processo 300 move-se para um estado 308 em que a primeira característica é lida a partir da base de dados. Uma comparação do atributo da primeira característica com a primeira seqüência é em seguida feita em um estado 310. Uma determinação é em seguida feita em um estado de decisão 316 se o atributo da característica foi encontrado na primeira seqüência. Se o atributo foi encontrado, em seguida o processo 300 move-se para um es- tado 318 em que o nome da característica encontrado é exibido ao usuário. O processo 300 em seguida move-se para um estado de decisão 320 em que uma determinação é feita se o movimento da características existe na base de dados. Se mais nenhuma característica existir, em seguida o processo 300 termina em um estado final 324. Entretanto, se mais características existirem na base de dados, em seguida o processo 300 lê a próxima característica de seqüência em um estado 326 e retorna para o estado 310 em que o atributo da próxima característica é comparado junto a primeira seqüência. Se o atributo de característica não é encontrado na primeira se-qüência no estado de decisão 316, o processo 300 move-se diretamente para o estado de decisão 320 a fim de determinar se quaisquer mais características existem na base de dados. Desse modo, em um aspecto, a invenção fornece um programa de computador que identifica estruturas de leitura aberta (ORFs).
Uma seqüência de polipeptídeo ou ácido nucléico da invenção pode ser armazenada e manipulado em uma variedade de programas de processador de dados em uma variedade de formatos. Por exemplo, uma seqüência pode ser armazenada como texto em um arquivo de processamento de texto, tal como MicrosoftWORD ou WORDPERFECT ou como um arquivo ASCII em uma variedade de programas de base de dados familiares àqueles versado na técnica, tal como DB2, SYBASE, ou ORACLE. Além disso, muitos programas de computador e base de dados podem ser empregados como algoritmos de comparação de seqüência, identificadores ou fontes de seqüências de nucleotídeo de referência ou seqüências de polipeptídeo a ser comparadas a uma seqüência de ácido nucléico da invenção. Os programas e base de dados empregados para praticar a invenção incluem, porém não são limitados a: MacPattern (EMBL), DiscoveryBase (Molecular Applications Group), GeneMine (Molecular Applications Group), Look (Molecular Applications Group), MacLook (Molecular Applications Group), BLAST e BLAST2 (NCBI), BLASTN e BLASTX (Altschul e similares, J., Mol. Biol. 215: 403, 1990), FASTA (Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444, 1988), FASTDB (Brutlag e similares Comp. App. Biosci. 6:237-245, 1990), Catalyst (Molecular Simulations Inc.), Catalyst/SHAPE (Molecular Simulations Inc.), Cerius2.DBAccess (Molecular Simulations Inc.), HypoGen (Molecular Simulations Inc.), Insight II, (Molecular Simulations Inc.), Discover (Molecular Simulations Inc.), CHARMm (Molecular Simulations Inc.), Felix (Molecular Simulations Inc.), DelPhi, (Molecular Simulations Inc.), QuanteMM, (Molecular Simulations Inc.), Homology (Molecular Simulations Inc.), Modeler (Molecular Simulations Inc.), ISIS (Molecular Simulations Inc.), Quan-ta/Protein Design (Molecular Simulations Inc.), WebLab (Molecular Simulations Inc.), WebLab Diversity Explorer (Molecular Simulations Inc.), Gene Explorer (Molecular Simulations Inc.), SeqFold (Molecular Simulations Inc.), a base de dados de MDL Available Chemicals Directory, a base de dados de MDL Drug Data Report data base, a base de dados de Comprehensive Medicinal Chemistry, a base de dados de Derwent's World Drug Index, a base de dados de BioByteMasterFile, a base de dados de Genbank e a base de dados de Genseqn. Muitos outros programas e base de dados ficariam evidentes por alguém versado na técnica dada a presente descrição.
Motivos que podem ser detectados empregando os programas acima incluem seqüências codificando zíperes de leucina, motivos de hélice-volta-hélice, sítios de glicosilação, sítios de ubiquitinação, alfa hélices, e lâminas beta, seqüências de sinal codificando peptídeos de sinal que direcionam a secreção das proteínas codificadas, seqüências implicadas no regulamento de transcrição tal como homeocaixas, estiramentos acídicos, sítios ativos enzimáticos, sítios de ligação de substratos e sítios de clivagem enzi-máticos.
Hibridização de ácidos nucléicos A invenção fornece ácidos nucléicos recombinantes ou isolados que hibridizam sob condições severas em uma seqüência exemplar da invenção, por exemplo, a seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ
ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171 ou SEQ ID NO: 173, ou um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo compreendendo a seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108 SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138; SEQ ID NO: 140; SEQ ID NO: 142; SEQ ID NO: 144; NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, ou SEQ ID NO: 174. As condições severas podem ser condições altamente severas, condições severas médias, condições severas baixas, incluindo as condições de severidade altas e reduzidas descritas aqui. Em modalidades alternativas, ácidos nucléicos da invenção como definido pela sua capacidade de hibridizar sob condições severas podem estar entre cerca de cinco resíduos e o tamanho natural da molécula, por exemplo, um ácido nucléico exemplar da invenção. Por exemplo, eles podem ser pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 ou mais resíduos no comprimento. Ácidos nucléicos mais curtos do que o tamanho natural são da mesma forma incluídos. Estes ácidos nucléicos são úteis como, por exemplo, sondas de hibridização, sondas de rotulagem, sondas de oligonucleotídeo de PCR, iR-NA (filamento único ou duplo), anti-sentido ou seqüências codificando peptí-deos de ligação de anticorpo (epítopos), motivos, sítios ativos, domínios de ligação, domínios reguladores e similares.
Em um aspecto, ácidos nucléicos da invenção que são definidos por sua capacidade de hibridizar sob alta severidade compreende condições de cerca de 50% de formamida a cerca de 37°C a 42°C. Em um aspecto, ácidos nucléicos da invenção são definidos por sua capacidade de hibridizar sob severidade reduzida compreendendo condições em cerca de 35% a 25% de formamida a cerca de 30°C a 35°C. Alternativamente, ácidos nucléicos da invenção são definidos por sua capacidade de hibridizar sob alta severidade compreendendo condições a 42°C em 50% de formamida, 5X de SSPE, 0,3% de SDS, e uma seqüência repetitiva bloqueando ácido nucléico, tal como DNA de esperma de salmão ou cot-1 (por exemplo, 200 n/ml de esperma de salmão desnaturado ou cisalhado). Em um aspecto, ácidos nu-cléicos da invenção são definidos por sua capacidade de hibridizar sob condições de severidade reduzidas compreendendo 35% de formamida em uma temperatura reduzida de 35°C.
Seguindo hibridização, o filtro pode ser lavado com 6X de SSC, 0,5% de SDS a 50°C. Estas condições são consideradas ser condições "moderadas" acima de 25% de formamida e condições "baixas" abaixo de 25% de formamida. Um exemplo específico de condições de hibridização "moderadas" é quando a hibridização acima é conduzida em 30% de formamida. Um exemplo específico de condições de hibridização de "baixa severidade" é quando a hibridização acima é conduzida em 10% de formamida. A faixa de temperatura correspondendo em um nível particular de severidade pode ser também reduzida calculando-se a relação de purina para pirimidina do ácido nucléico de interesse e ajustando-se a temperatura desta maneira. Ácidos nucléicos da invenção são da mesma forma definidos por sua capacidade de hibridizar sob condições de severidade altas, médias, e baixas como mencionado em Ausubel e Sambrook. As variações das faixas e condições acima podem ser empregadas para praticar a invenção e são bem conhecidas na técnica. Condições de hibridização são discutidas também, abaixo.
Sondas de oligonucleotídeos e métodos para empregá-las A invenção da mesma forma fornece sondas de ácido nucléico para identificar ácidos nucléicos codificando um polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase. Em um aspecto, a sonda compreende pelo menos 10 bases consecutivas de uma seqüência como mencionado em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171 ou SEQ ID NO: 173. Alternativamente, uma sonda da invenção pode ser pelo menos cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, ou 150, ou mais, ou cerca de 10 a 50, cerca de 20 a 60 cerca de 30 a 70, bases consecutivas de uma seqüência como mencionado em uma se-qüência da invenção. As sondas identificam um ácido nucléico por ligação ou hibridização. As sondas podem ser empregadas em disposições da invenção, veja a discussão abaixo, incluindo, por exemplo, disposições capilares. As sondas da invenção podem da mesma forma ser empregadas para isolar outros ácidos nucléicos ou polipeptídeos.
As sondas da invenção podem ser empregadas para determinar se uma amostra biológica, tal como uma amostra de solo, contém um organismo tendo uma seqüência de ácido nucléico da invenção ou um organismo a partir do qual o ácido nucléico foi obtido. Em tais procedimentos, uma amostra biológica potencialmente abrigando o organismo do qual o ácido nucléico foi isolado é obtida e ácidos nucléicos são obtidos a partir da amostra. Os ácidos nucléicos são contatados com a sonda sob condições que permitem a sonda especificamente hibridizar em qualquer seqüência complementar presente na amostra. Onde necessário, as condições que permitem a sonda especificamente hibridizar para seqüências complementares podem ser determinadas colocando-se a sonda em contato com seqüências complementares a partir de amostras conhecidas para conter a seqüência complementar, bem como seqüências de controle que não contêm a se- qüência complementar. As condições de hibridização, tal como a concentração de sal do tampão de hibridização, a concentração de formamida do tampão de hibridização ou a temperatura de hibridização, podem ser variadas para identificar condições que permitem a sonda especificamente hibridizar para ácidos nucléicos complementares (veja a discussão em condições de hibridização específicas).
Se a amostra contém que o organismo do qual o ácido nucléico foi isolado, hibridização específica da sonda é em seguida detectada. A hi-bridização pode ser detectada rotulando-se a sonda com um agente detec-tável tal como um isótopo radioativo, uma tintura fluorescente ou uma enzima capaz de catalisar a formação de um produto detectável. Muitos métodos para usar as sondas rotuladas para detectar a presença de ácidos nucléicos complementares em uma amostra são familiares para aqueles versados na técnica. Estes incluem Southern blots, Northern blots, procedimentos de hibridização de colônia, e manchas pontos. Protocolos para cada destes procedimentos são fornecidos em Ausubel e Sambrook.
Alternativamente, mais do que uma sonda (pelo menos uma que é capaz de especificamente hibridizar para quaisquer seqüências complementares que estão presentes na amostra de ácido nucléico), pode ser empregada em uma reação de amplificação para determinar se a amostra contém um organismo contendo uma seqüência de ácido nucléico da invenção (por exemplo, um organismo do qual o ácido nucléico foi isolado). Em um aspecto, as sondas compreendem oligonucleotídeos. Em um aspecto, a reação de amplificação pode compreender uma reação de PCR. Protocolos de PCR são descritos em Ausubel e Sambrook (veja discussão em reações de amplificação). Em tais procedimentos, os ácidos nucléicos são contatados na amostra com as sondas, a reação de amplificação é realizada e qualquer produto de amplificação resultante é detectado. O produto de amplificação pode ser detectado realizando-se eletroforese em gel nos produtos de reação e manchando-se o gel com um intercalador tal como brometo de etídio. Alternativamente, uma ou mais sondas podem ser rotuladas com um isótopo radioativo e a presença de um produto de amplificação radioativo pode ser detectada por auto-radiografia depois da eletroforese em gel.
Sondas derivadas de seqüências perto das extremidades 3' ou 5' de uma seqüência de ácido nucléico da invenção podem da mesma forma ser derivadas em procedimentos de caminhada de cromossomo para identificar clones contendo seqüências adicionais, por exemplo, genômicas. Tais métodos permitem o isolamento de genes que codificam proteínas adicionais de interesse do organismo hospedeiro.
Em um aspecto, as seqüências de ácido nucléico da invenção são empregadas como sondas para identificar e isolar ácidos nucléicos relacionados. Em alguns aspectos, os ácidos nucléicos relacionados da mesma forma identificados podem ser cDNAs ou DNAs genômicos de organismos diferentes daqueles dos quais o ácido nucléico da invenção foi primeiro isolado. Em tais procedimentos, uma amostra de ácido nucléico é contatada com a sonda sob condições que permitem a sonda especificamente hibridizar para seqüências relacionadas. A hibridização da sonda para ácidos nucléicos do organismo relacionado é em seguida detectada empregando quaisquer dos métodos descritos acima.
Em reações de hibridização de ácido nucléico, as condições empregadas para obter um nível particular de severidade variarão, dependendo da natureza dos ácidos nucléicos a ser hibridizados. Por exemplo, o comprimento, grau de complementaridade, composição de seqüência de nucleo-tídeo (por exemplo, teor de GC v. AT), e tipo de ácido nucléico (por exemplo, RNA v. DNA) das regiões de hibridização dos ácidos nucléicos podem ser considerados selecionando-se condições de hibridização. Uma consideração adicional é se um dos ácidos nucléicos é imobilizado, por exemplo, em um filtro. A hibridização pode ser realizada sob condições de baixa severidade, moderada severidade ou alta severidade. Como um exemplo de hibridização de ácido nucléico, uma membrana de polímero contendo ácidos nucléicos desnaturados imobilizados é primeiro pré-hibridizada durante 30 minutos a 45°C em uma solução consistindo em 0,9 M de NaCl, 50 mM de NaH2PO4, pH 7,0, 5,0 mM de Na2EDTA, 0,5% de SDS, 10X de Denhardt, e 0,5 mg/ml de ácido polirriboadenílico. Aproximadamente 2 X 107 cpm (atividade espe- cífica 4-9 X 108 cpm/ug) de sonda de oligonucleotídeo rotulada por extremidade de 32P são em seguida adicionados à solução. Depois de 12-16 horas de incubação, a membrana é lavada durante 30 minutos em temperatura ambiente (RT) em 1X de SET (150 mM de NaCl, 20 mM de hidrocloreto de Tris, pH 7,8, 1 mM de Na2EDTA) contendo 0,5% de SDS, seguido por uma lavagem de 30 minutos em 1X de SET fresco em Tm-10°C para a sonda de oligonucleotídeo. A membrana é em seguida exposta à película auto-radiográfica para detecção de sinais de hibridização.
Variando-se a severidade das condições de hibridização empregadas para identificar ácidos nucléicos, tal como cDNAs ou DNAs genômi-cos, que hibridizam para sonda detectável, ácidos nucléicos tendo níveis diferentes de homologia para a sonda podem ser identificados e isolados. A severidade pode ser variada conduzindo-se a hibridização em temperaturas variadas sob as temperaturas de fusão das sondas. A temperatura de fusão, Tm, é a temperatura (sob resistência iônica definida e pH) em que 50% da seqüência alvo hibridizam para uma sonda perfeitamente complementar. Condições muito severas são selecionadas para ser iguais a ou cerca de 5°C mais baixas do que a Tm para uma sonda particular. A temperatura de fusão da sonda pode ser calculada empregando as seguintes fórmulas exemplares. Para sondas entre 14 e 70 nucleotídeos no comprimento, a temperatura de fusão (Tm) é calculada empregando a fórmula: Tm=81,5+16,6 (log [Na+])+0,41(fração G+C)-(600/N) onde N é o comprimento da sonda. Se a hibridização for realizada em uma solução contendo for-mamida, a temperatura de fusão pode ser calculada empregando a equação: Tm=81,5+16,6 (log [Na+])+0,41(fração G+C)-(0,63% de formamida)-(600/N) onde N é o comprimento da sonda. A pré-hibridização pode realizada em 6X de SSC, 5X de reagente de Denhardt, 0,5% de SDS, 100pg de DNA de es-perma de salmão fragmentado desnaturado ou 6X de SSC, 5X de reagente de Denhardt, 0,5% de SDS, 100pg de DNA de esperma de salmão fragmentado desnaturado, 50% de formamida. As fórmulas para SSC e Denhardt e outras soluções são listadas, por exemplo, em Sambrook. A hibridização é conduzida adicionando-se a sonda detectável às soluções de pré-hibridização listadas acima. Onde a sonda compreende DNA de filamento duplo, ela é desnaturada antes da adição à solução de hibridização. O filtro é contatado com a solução de hibridização durante um período suficiente de tempo para permitir a sonda hibridizar para cDNAs ou DNAs genômicos contendo seqüências complementares a isso ou homólogas a isso. Para sondas acima de 200 nucleotídeos no comprimento, a hibridização pode ser realizada a 15-25°C abaixo da Tm. Para sondas mais curtas, tais como sondas de oligonucleotídeo, a hibridização pode ser conduzida a 5-10°C abaixo da Tm. Em um aspecto, as hibridizações em 6X de SSC são conduzidas em aproximadamente 68°C. Em um aspecto, as hibridizações em 50% de formamida contendo soluções são conduzidas em aproximadamente 42°C. Todas as hibridizações anteriores seriam consideradas estar sob condições de alta severidade.
Seguindo a hibridização, o filtro é lavado para remover qualquer sonda detectável não especificamente ligada. A severidade empregada para lavar os filtros pode da mesma forma ser variada dependendo da natureza dos ácidos nucléicos a ser hibridizados, do comprimento dos ácidos nucléi-cos a ser hibridizados, do grau de complementaridade, da composição de seqüência de nucleotídeo (por exemplo, teor de GC v. AT), e do tipo de ácido nucléico (por exemplo, RNA v. DNA). Exemplos de lavagens de condição de severidade progressivamente mais alta são como segue: 2X de SSC, 0,1% de SDS em temperatura ambiente durante 15 minutos (baixa severidade); 0,1X de SSC, 0,5% de SDS em temperatura ambiente durante 30 minutos em 1 hora (severidade moderada); 0,1X de SSC, 0,5% de SDS durante 15 a 30 minutos entre a temperatura de hibridização e 68°C (alta severidade); e 0,15M de NaCl durante 15 minutos a 72°C (severidade muito alta). Uma lavagem de baixa severidade final pode ser conduzida em 0,1X de SSC em temperatura ambiente. Os exemplos acima são meramente ilustrativos de um grupo de condições que podem ser empregadas para praticar a invenção, por exemplo, para lavar filtros. Alguém versado na técnica saberia que há numerosas receitas para lavagens de severidade diferente, todas das quais podem ser empregadas para praticar a invenção. Ácidos nucléicos que hibridizam para sonda podem ser identificados por auto-radiografia ou outras técnicas convencionais. O procedimento acima pode ser modificado para identificar ácidos nucléicos tendo níveis decrescentes de homologia à seqüência de sonda. Por exemplo, para obter ácidos nucléicos de homologia decrescente à sonda detectável, condições menos severas podem ser empregadas. Por exemplo, a temperatura de hibridização pode ser diminuída em incrementos de 5°C de 68°C a 42°C em um tampão de hibridização tendo uma concentração de Na+ de aproximadamente 1M. Seguindo a hibridização, o filtro pode ser lavado com 2X de SSC, 0,5% de SDS na temperatura de hibridização. Estas condições são consideradas ser condições "moderadas" acima de 50°C e condições "baixas" abaixo de 50°C. Um exemplo de condições de hibridização "moderadas" é quando a hibridização acima é conduzida a 55°C. Um exemplo de condições de hibridização de "baixa severidade" é quando a hibridização acima é conduzida a 45°C.
Alternativamente, a hibridização pode ser realizada em tampões, tal como 6X de SSC, contendo formamida em uma temperatura de 42°C. Neste caso, a concentração de formamida no tampão de hibridização pode ser reduzida em 5% de incrementos a partir de 50% a 0% para identificar clones tendo níveis decrescentes de homologia para a sonda. Seguindo a hibridização, o filtro pode ser lavado com 6X de SSC, 0,5% de SDS a 50°C. Estas condições são consideradas ser condições "moderadas" acima de 25% de formamida e condições "baixas" abaixo de 25% de formamida. Um exemplo específico de condições de hibridização "moderadas" é quando a hibridização acima é conduzida a 30% de formamida. Um exemplo específico de condições de hibridização de "baixa severidade" é quando a hibridização acima é conduzida em 10% de formamida.
Estas sondas e métodos da invenção podem ser empregadas para isolar ácidos nucléicos tendo uma seqüência com pelo menos cerca de 99%, pelo menos 98%, pelo menos 97%, pelo menos 96%, pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos 65%, pelo menos 60%, pelo menos 55%, ou pelo menos 50% de homologia para uma seqüência de ácido nucléico da invenção compreendendo pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, ou 500 bases consecutivas desta, e as seqüências complementares a isso. Homologia pode ser medida empregando um algoritmo de alinhamento, como discutido aqui. Por exemplo, os polinucleotídeos homólogos podem ter uma seqüência de codificação que é uma variante alélica de ocorrência natural de uma das se-qüências de codificação descritas aqui. Tais variantes alélicas podem ter uma substituição, deleção ou adição de um ou mais nucleotídeos quando comparadas aos ácidos nucléicos da invenção.
Adicionalmente, as sondas e métodos da invenção podem ser empregados para isolar ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos tendo pelo menos cerca de 99%, pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos 65%, pelo menos 60%, pelo menos 55%, ou pelo menos 50% de identidade de seqüência (homologia) para um polipeptídeo da invenção compreendendo pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos desta como determinado empregando um algoritmo de alinhamento de seqüência (por exemplo, tal como o algoritmo FASTA versão 3,0t78 com os parâmetros default, ou um programa BLAST 2.2.2 com colocações exemplares como mencionado aqui).
Expressão de Inibição de Fosfolipases A invenção também fornece ácidos nucléicos complementares para (por exemplo, seqüências anti-sentido) os ácidos nucléicos da invenção, por exemplo, ácidos nucléicos codificando fosfolipase. Seqüências anti-sentido são capazes de inibir o transporte, entrançamento ou transcrição de genes codificando fosfolipase. A inibição pode ser realizada através do alve-jamento de DNA genômico ou RNA mensageiro. A transcrição ou função de ácido nucléico alvejado pode ser inibida, por exemplo, por hibridização e/ou clivagem. Um grupo particularmente útil de inibidores fornecidos pela presente invenção inclui oligonucleotídeos que são capazes de ligar gene de fosfolipase ou mensagem, em cada caso prevenindo-se ou inibindo-se a produção ou função de enzima fosfolipase. A associação pode ser através da hibridização específica de seqüência. Outra classe útil de inibidores inclui oligonucleotídeos que causam inativação ou clivagem de mensagem de fosfolipase. O oligonucleotídeo pode ter atividade enzimática que causa tal cli-vagem, tal como ribozimas. O oligonucleotídeo pode ser quimicamente modificado ou conjugado em uma enzima ou composição capaz de clivar o ácido nucléico complementar. Alguém pode avaliar um lago de muitos tais oligonucleotídeos diferentes para aqueles com a atividade desejada. A inibição de expressão de fosfolipase pode ter uma variedade de aplicações industriais. Por exemplo, a inibição de expressão de fosfoli-pase pode reduzir ou prevenir a deterioração. A deterioração pode ocorrer quando lipídios ou polipeptídeos, por exemplo, lipídios estruturais ou polipeptídeos, são enzimaticamente degradados. Isto pode levar à deterioração, ou podridão, de frutas e vegetais. Em um aspecto, o uso de composições da invenção que inibem a expressão e/ou atividade de fosfolipase, por exemplo, anticorpos, oligonucleotídeos anti-sentido, ribozimas e RNAi, são empregados para reduzir ou prevenir a deterioração. Desse modo, em um aspecto, a invenção fornece métodos e composições compreendendo aplicação em uma planta ou produto de planta (por exemplo, uma fruta, semente, raiz, folha, etc.) anticorpos, oligonucleotídeos anti-sentido, ribozimas e RNAi da invenção para reduzir ou prevenir a deterioração. Estas composições da mesma forma podem ser expressas pela planta (por exemplo, uma planta transgênica) ou outro organismo (por exemplo, uma bactéria ou outro microorganismo transformado com um gene de fosfolipase da invenção).
As composições da invenção para a inibição de expressão de fosfolipase (por exemplo, anti-sentido, iRNA, ribozimas, anticorpos) podem ser empregadas como composições farmacêuticas.
Oligonucleotídeos Anti-sentido A invenção fornece oligonucleotídeos anti-sentido capazes de ligar mensagem de fosfolipase que pode inibir atividade de fosfolipase alvejando-se mRNA. Estratégias para planejar oligonucleotídeos anti-sentido são bem descritas na literatura da patente e científica, e o técnico versado pode planejar tais oligonucleotídeos de fosfolipase empregando os novos reagentes da invenção. Por exemplo, protocolos de mapeamento de RNA / caminhada de gene para avaliar quanto aos oligonucleotídeos anti-sentido eficazes são bem conhecidos na técnica, veja, por exemplo, Ho (2000) Methods Enzymol. 314:168-183, descrevendo um ensaio de mapeamento de RNA, que é baseado em técnicas moleculares padrões para fornecer um método fácil e seguro para seleção de seqüência anti-sentido potente. Veja da mesma forma Smith (2000) Eur. J. Pharm. Sci. 11:191-198. Ácidos nucléicos de ocorrência natural são empregados como oligonucleotídeos anti-sentido. Os oligonucleotídeos anti-sentido podem ser de qualquer comprimento; por exemplo, em aspectos alternativos, os oligo-nucleotídeos anti-sentido estão entre cerca de 5 a 100, cerca de 10 a 80, cerca de 15 a 60, cerca de 18 a 40. O comprimento ideal pode ser determinado por avaliação de rotina. Os oligonucleotídeos anti-sentido podem estar presentes em qualquer concentração. A concentração ideal pode ser determinada por avaliação de rotina. Uma ampla variedade de análogos de ácido nucléico e nucleotídeo de ocorrência não-natural sintéticos é conhecida, que pode tratar este problema potencial. Por exemplo, ácidos nucléicos de peptí-deo (PNAs) contendo cadeias principais não-iônicas, tais como unidades de glicina de N-(2-aminoetila) podem ser empregados. Oligonucleotídeos anti-sentido tendo ligações de fosforotioato podem da mesma forma ser empregados, como descrito em WO 97/03211; WO 96/39154; Mata (1997) Toxicol Appl Pharmacol 144:189 197; Antisense Therapeutics, ed. Agrawal (Humana Press, Totowa, N.J., 1996). Oligonucleotídeos anti-sentido tendo análogos de cadeia principal de DNA sintético fornecidos pela invenção podem da mesma forma incluir fosforo-ditioato, metilfosfonato, fosforamidato, fosfotriés-ter de alquila, sulfamato, 3'-tioacetal, metileno(metilimino), 3'-N-carbamato, e ácidos nucléicos de carbamato de morfolina, como descrito acima.
Metodologia química combinatorial pode ser empregada para criar números vastos de oligonucleotídeos que podem ser facilmente avaliados para oligonucleotídeos específicos que têm afinidades de ligação apropriadas e especificidades para qualquer alvo, tal como as seqüências de fos- folipase anti-sentido e sentido da invenção (veja, por exemplo, Gold (1995) J. of Biol. Chem. 270:13581-13584).
Ribozimas Inibidoras A invenção fornece ribozimas capazes de ligar mensagem de fosfolipase que pode inibir atividade enzimática de fosfolipase alvejando-se mRNA. Estratégias para projetar ribozimas e selecionar a seqüência anti-sentido específica de fosfolipase para alvejamento são bem descritas na literatura da patente e científica, e o técnico versado pode projetar tais ribozi-mas empregando os novos reagentes da invenção. As ribozimas agem ligando-se a um RNA alvo pela porção de ligação de RNA alvo de uma ribo-zima que é sustentada em proximidade exata em uma porção enzimática do RNA que cliva o RNA alvo. Desse modo, a ribozima reconhece e liga um RNA alvo através do emparelhamento de base complementar, e logo que ligado ao sítio correto, age enzimaticamente para clivar e inativar o RNA alvo. A clivagem de um RNA alvo de uma tal maneira destruirá sua capacidade de direcionar a síntese de uma proteína codificada se a clivagem ocorre na seqüência de codificação. Depois que uma ribozima tem ligado e clivado seu RNA alvo, ela é liberado tipicamente desse RNA e desse modo ligar e clivar novos alvos repetidamente.
Em algumas circunstâncias, a natureza enzimática de uma ribo-zima pode ser vantajosa sobre outras tecnologias, tal como tecnologia anti-sentido (onde uma molécula de ácido nucléico simplesmente liga-se a um alvo de ácido nucléico para bloquear sua transcrição, translação ou associação com outra molécula) quando a concentração eficaz de ribozima necessária para realizar um tratamento terapêutico pode ser mais baixa do que aquela de um oligonucleotídeo anti-sentido. Esta vantagem potencial reflete a capacidade da ribozima agir enzimaticamente. Desse modo, uma única molécula de ribozima é capaz de clivar muitas moléculas de RNA alvo. Além disso, uma ribozima é tipicamente um inibidor altamente específico, com a especificidade de inibição não dependendo apenas do mecanismo de empa-relhamento de base de ligação, porém da mesma forma no mecanismo pelo qual a molécula inibe a expressão do RNA ao qual ele liga-se. Isto é, a inibi- ção é causada por clivagem do alvo de RNA e desse modo a especificidade é definida como a relação da taxa de clivagem do RNA alvejado sobre a taxa de clivagem de RNA não alvejado. Este mecanismo de clivagem é dependente dos fatores adicionais daqueles envolvidos no emparelhamento de base. Desse modo, a especificidade de ação de uma ribozima pode ser maior do que aquela do oligonucleotídeo anti-sentido ligando o mesmo sítio de RNA. A molécula de RNA de ribozima enzimática pode ser formada em um motivo cabeça de martelo, porém pode da mesma forma ser formada no motivo de um grampo de cabelo, vírus da hepatite delta, íntron de grupo I ou RNA tipo RNaseP (em associação com uma seqüência guia de RNA). Exemplos de tais motivos cabeça de martelo são descritos por Rossi (1992) Aids Research and Human Retroviruses 8:183; motivos grampo de cabelo por Hampel (1989) Biochemistry 28:4929, e Hampel (1990) Nuc. Acids Res. 18:299; o motivo do vírus da hepatite delta por Perrotta (1992) Biochemistry 31:16; o motivo de RNaseP por Guerrier-Takada (1983) Cell 35:849; e o íntron de grupo I por Cech Patente dos Estados Unidos n° 4.987.071. A recitação destes motivos específicos não está destinada a ser limitante; aqueles versados na técnica reconhecerão que uma molécula de RNA enzimática desta invenção tem um sítio de ligação de substrato específico complementar a uma ou mais das regiões de RNA de gene alvo, e tem seqüência de nucleotídeo dentro ou circundando esse sítio de ligação de substrato que comunica uma atividade de clivagem de RNA à molécula.
Interferência de RNA (RNAi) Em um aspecto, a invenção fornece uma molécula inibidora de RNA, uma desse modo denominada molécula de "RNAi", compreendendo uma seqüência de fosfolipase da invenção. A molécula de RNAi compreende uma molécula de RNA de filamento duplo (dsRNA). O RNAi pode inibir expressão de um gene de fosfolipase. Em um aspecto, o RNAi é cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos dúplex no comprimento. Enquanto a invenção não estiver limitada por qualquer mecanismo particular de ação, o RNAi pode entrar em uma célula e causar a degrada- ção de um RNA de filamento único (ssRNA) de seqüências similares ou idênticas, incluindo mRNAs endógenos. Quando uma célula é exposta a RNA de filamento duplo (dsRNA), mRNA do gene homólogo é seletivamente degradado por um processo chamado interferência de RNA (RNAi). Um possível mecanismo básico atrás do RNAi é a ruptura de um RNA de filamento duplo (dsRNA) comparando uma seqüência de gene específico em pedaços curtos chamados RNA de interferência curto, que dispara a degradação de mRNA que compara emparelha sua seqüência. Em um aspecto, os RNAi's da invenção são empregados em terapêuticos de silenciamento de gene, veja, por exemplo, Shuey (2002) Drug Discov. Today 7:1040-1046. Em um aspecto, a invenção fornece métodos para seletivamente degradar RNA empregando os RNAi's da invenção. O processo pode ser praticado in vitro, ex vivo ou in vivo. Em um aspecto, as moléculas de RNAi da invenção podem ser empregadas para gerar uma mutação de perda de função em uma célula, um órgão ou um animal. Métodos para preparar e usar moléculas de RNAi para seletivamente degradar RNA são bem conhecidas na técnica, veja, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos n°s 6.506.559, 6.511.824, 6.515.109, 6.489.127.
Modificação de Ácidos Nucléicos A invenção fornece métodos de gerar variantes dos ácidos nu- cléicos da invenção, por exemplo, aqueles codificando uma enzima de fosfolipase. Em modalidade alternativa, a invenção fornece métodos para modificar uma enzima da invenção, por exemplo, por mutação de sua seqüência de codificação por métodos estocásticos ou aleatórios, ou, não-estocásticos, ou "evolução direcionada," tal como Gene Site Saturation Mutagenesis® (GSSM®), para alterar a faixa de pH de enzimas de atividade ou faixa de atividade ideal, a faixa de temperatura de atividade ou faixa de atividade ideal, especificidade, atividade (cinéticas); o uso da enzima de glicosilação, fosfori-lação ou metais (por exemplo, Ca, Mg, Zn, Fe, Na), por exemplo, para im-pactar a estabilidade de pH/temperatura. A invenção fornece métodos para modificar uma enzima da invenção, por exemplo, por mutação de sua seqüência de codificação, por exemplo, por GSSM®, para aumentar sua resis- tência à atividade de protease. A invenção fornece métodos para modificar uma enzima da invenção, por exemplo, por mutação de sua seqüência de codificação, por exemplo, por GSSM®, para modificar o uso da enzima de quelantes de metal específicos para Ca, Mg, Na que não quelaria Zn. A invenção fornece métodos para modificar uma enzima da invenção, por exemplo, por mutação de sua seqüência de codificação, por exemplo, por GSSM® que teria uma combinação desejada de atividades, por exemplo, PI, PA e PLCs específicos de PC/PE.
Estes métodos podem ser repetidos ou empregados em várias combinações para gerar enzimas de fosfolipase tendo uma atividade alterada ou diferente ou uma estabilidade alterada ou diferente daquela de uma fosfolipase codificada pelo ácido nucléico padrão. Estes métodos da mesma forma podem ser repetidos ou empregados em várias combinações, por exemplo, para gerar variações na expressão de gene / mensagem, transla-ção de mensagem ou estabilidade de mensagem. Em outro aspecto, a composição genética de uma célula é alterada por, por exemplo, modificação de um gene homólogo ex vivo, seguida por sua re-inserção na célula.
Um ácido nucléico da invenção pode ser alterado por quaisquer meios. Por exemplo, métodos estocásticos ou aleatórios, ou, não- estocásti-cos, ou métodos de "evolução direcionada". Métodos para mutação aleatória de genes são bem conhecidos na técnica, veja, por exemplo, Patente U.S. No. 5.830.696. Por exemplo, mutagênicos podem ser empregados para aleatoriamente mutar um gene. Mutagênicos incluem, por exemplo, luz ultravioleta ou gama irradiação, ou um mutagênico químico, por exemplo, mitomicina, ácido nitroso, psoralenos fotoativados, sozinhos ou em combinação, para induzir rupturas de DNA amenas para reparar por recombinação. Outros mutagênicos químicos incluem, por exemplo, bissulfito de sódio, ácido nitroso, hidroxilamina, hidrazi-na ou ácido fórmico. Outros mutagênicos são análogos de precursores de nucleotídeo, por exemplo, nitrosoguanidina, 5-bromouracil, 2-aminopurina ou acridina. Estes agentes podem ser adicionados em uma reação de PCR no lugar do precursor de nucleotídeo desse modo mutando a seqüência. Agen- tes de intercalação tal como proflavina, acriflavina, quinacrina e similares podem da mesma forma ser empregados.
Qualquer técnica na biologia molecular pode ser empregada, por exemplo, mutagênese de PCR aleatória, veja, por exemplo, Rice (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5467-5471; ou, mutagênese de cassete múltiplo combinatorial, veja, por exemplo, Crameri (1995) Biotechniques 18:194196. Alternativamente, ácidos nucléicos, por exemplo, genes, podem ser reagrupados depois de aleatório, ou fragmentação, "estocástica" veja, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos n°s 6.291.242, 6.287.862, 6.287.861, 5.955.358, 5.830.721, 5.824.514, 5.811.238, 5.605.793. Em aspectos alternativos, modificações, adições ou deleções são introduzidos por PCR propensa ao erro, embaralhamento, mutagênese dirigida ao oligonucleotídeo, PCR por agrupamento, mutagênese de PCR sexual, mutagênese in vivo, mutagênese de cassete, mutagênese de conjunto recursiva, mutagênese de conjunto exponencial, mutagênese específica do sítio, reagrupamento de gene, Mutagênese de Saturação de local de Gene® (GSSM®), reagrupamen-to de ligação sintética (SLR), recombinação, recombinação de seqüência recursiva, mutagênese do DNA modificado por fosfotioato, mutagênese padrão contendo uracila, mutagênese dúplex espaçado, mutagênese de reparo de pareamento incorreto pontual, mutagênese de cepa hospedeira deficiente de reparo, mutagênese química, mutagênese radiogênica, mutagênese de deleção, mutagênese de seleção restrita, mutagênese de purificação restrita, síntese de gene artificial, mutagênese de conjunto, criação de multímero de ácido nucléico quimérico, e/ou uma combinação destes e similares métodos.
As seguintes publicações descrevem uma variedade de métodos e/ou procedimentos de recombinação recursiva que podem ser incorporados nos métodos da invenção: Stemmer (1999) "Molecular breeding of viruses for targeting and other clinical properties" Tumor Targeting 4:1-4; Ness (1999) Nature Biotechnology 17:893 - 896; Chang (1999) "Evolution of a cytokine using DNA family shuffling" Nature Biotechnology 17:793 - 797; Minshull (1999) "Protein evolution by molecular breeding" Current Opinion in Chemical Biology 3:284 - 290; Christians (1999) "Directed evolution of thymi- dine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling" Nature Biotechnology 17:259 - 264; Crameri (1998) "DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution" Nature 391:288-291; Crameri (1997) "Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling", Nature Biotechnology 15:436 - 438; Zhang (1997) "Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Patten e similares (1997) "Applications of DNA Shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines" Current Opinion in Biotechnology 8:724 - 733; Crameri e similares (1996) "Con-struction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling" Nature Medicine 2:100-103; Crameri e similares (1996) "Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling" Nature Biotechnology 14:315 - 319; Gates e similares (1996) "Affinity selective isolation of ligands from peptide libraries through display on a lac repressor 'headpiece dimer'" Journal of Molecular Biology 255:373-386; Stemmer (1996) "Sexual PCR and Assembly PCR" In: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, New York. pp. 447 - 457; Crameri e Stemmer (1995) "Combinatorial multiple cassette mutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtype cassettes" BioTechniques 18:194 - 195; Stemmer e similares (1995) "Single-step assembly of a gene and entire plasmid form large numbers of oligodeoxyribonucleotides" Gene, 164:49-53; Stemmer (1995) "The Evolution of Molecular Computation" Science 270: 1510; Stemmer (1995) "Searching Sequence Space" Bio/Technology 13:549 - 553; Stemmer (1994) "Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling" Nature 370:389 - 391; e Stemmer (1994) "DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751.
Os métodos mutacionais de gerar diversidade incluem, por exemplo, mutagênese sítio-dirigida (Ling e similares (1997) "Approaches to DNA mutagenesis: an overview" Anal Biochem. 254(2): 157-178; Dale e similares (1996) "Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method" Methods Mol. Biol. 57:369 - 374; Smith (1985) "In vitro mutagenesis" Ann. Rev. Genet. 19:423-462; Botstein & Shortle (1985) "Strategies and applications of in vitro mutagenesis" Science 229:1193 -1201; Carter (1986) "Site-directed mutagenesis" Biochem. J. 237:1-7; and Kunkel (1987) "The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis" in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlin)); mutagênese empregando-se padrões contendo uracil (Kunkel (1985) "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488 - 492; Kunkel e similares (1987) "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection" Methods in Enzymol. 154, 367-382; e Bass e similares (1988) "Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities" Science 242:240 - 245); mutagênese dirigida ao oligonucleotídeo (Methods in Enzymol. 100: 468 - 500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329 - 350 (1987); Zoller & Smith (1982) "Oligonucleotide - directed mutagenesis using M13 - derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment" Nucleic Acids Res. 10:6487 - 6500; Zoller & Smith (1983) "Oligonucleotide - directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors" Methods in Enzymol. 100:468 - 500; e Zoller & Smith (1987) "Oligo-nucleotide - directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single - stranded DNA template" Methods in Enzymol. 154:329 - 350); mutagênese do DNA modificado por fosfotioato (Taylor e similares (1985) "The use of phosphorothioate - modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA" Nucl. Acids Res. 13: 8749 - 8764; Taylor e similares (1985) "The rapid generation of oligonucleotide - directed mutations at high frequency using phosphorothioate - modified DNA" Nucl. Acids Res. 13: 8765 - 8787 (1985); Nakamaye (1986) "Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide - directed mutagenesis" Nucl. Acids Res. 14: 9679 - 9698; Sayers e similares (1988) "Y - T Exonucleases in phosphorothioate - based oligonucleotide - directed mutagenesis" Nucl. Acids Res. 16:791 - 802; e Sayers e similares (1988) "Strand specific cleavage of phosphorothioate -containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide" Nucl. Acids Res. 16: 803 - 814); mutagênese empregando-se DNA dúplex com espaço (Kramer e similares (1984) "The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide - directed mutation construction" Nucl. Acids Res. 12: 9441 - 9456; Kramer & Fritz (1987) Methods in Enzymol. "Oli-gonucleotide - directed construction of mutations via gapped duplex DNA" 154:350 - 367; Kramer e similares (1988) "Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide - directed construction of mutations" Nucl. Acids Res. 16: 7207; e Fritz e similares (1988) "Oligonucleotide - directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro" Nucl. Acids Res. 16: 6987 -6999).
Os protocolos adicionais empregados nos métodos da invenção incluem reparo de pareamento imperfeito pontual (Kramer (1984) "Point Mismatch Repair" Cell 38:879 - 887), mutagênese empregando-se cepas hospedeiras deficientes de reparo (Carter e similares (1985) "Improved oligonucleotide site - directed mutagenesis using M13 vectors" Nucl. Acids Res. 13: 4431 - 4443; e Carter (1987) "Improved oligonucleotide - directed mutagenesis using M13 vectors" Methods in Enzymol. 154: 382 - 403), mu-tagênese de deleção (Eghtedarzadeh (1986) "Use of oligonucleotides to generate large deletions" Nucl. Acids Res. 14: 5115), restrito-seleção e re-strito-seleção e restrito-purificação (Wells e similares (1986) "Importance of hydrogen - bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin" Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415 - 423), mutagênese por síntese de gene total (Nambiar e similares (1984) "Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein" Science 223: 1299 - 1301; Sakamar e Khorana (1988) "Total synthesis and expression of a gene for the a - subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide - binding protein (trans-ducin)" Nucl. Acids Res. 14: 6361 - 6372; Wells e similares (1985) "Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites" Gene 34:315 - 323; e Grundstrom e similares (1985) "Oligonu-cleotide - directed mutagenesis by microscale 'shot - guri gene synthesis" Nucl. Acids Res. 13: 3305 - 3316), reparo de ruptura de filamento duplo (Mandecki (1986); Arnold (1993) "Protein engineering for unusual environ-ments" Current Opinion in Biotechnology 4:450 - 455. "Oligonucleotide - directed double - strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site - specific mutagenesis" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177 - 7181). Os detalhes adicionais sobre muitos dos métodos acima, podem ser constatados em Methods in Enzymology Volume 154, que da mesma forma descreve controles úteis para diagnosticar e solucionar problemas com vários métodos de mutagênese.
Veja da mesma forma a Patente dos Estados Unidos n° 5.605.793 por Stemmer (25 de fevereiro, 1997), "Methods for In Vitro Re-combination"; Patente dos Estados Unidos n° 5.811.238 por Stemmer e similares (22 de Setembro, 1998) "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination"; Patente dos Estados Unidos n° 5.830.721 por Stemmer e similares (3 de Novembro, 1998), "DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reas-sembly"; Patente U.S. No. 5.834.252 por Stemmer, e similares (10 de Novembro, 1998) "End - Complementary Polymerase Reaction"; Patente dos Estados Unidos n° 5.837,458 por Minshull, e similares (17 de Novembro, 1998), "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering"; WO 95/22625, Stemmer e Crameri, "Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly"; WO 96/33207 por Stemmer e Lipschutz "End Complementary Polymerase Chain Reaction"; WO 97/20078 por Stemmer e Crameri "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination"; WO 97/35966 por Minshull e Stem-mer, "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering"; WO 99/41402 por Punnonen e similares "Targeting of Genetic Vaccine Vec-tors"; WO 99/41383 por Punnonen e similares "Antigen Library Immuniza-tion"; WO 99/41369 por Punnonen e similares "Genetic Vaccine Vector Engi-neering"; WO 99/41368 por Punnonen e similares "Optimization of Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines"; EP 752008 por Stemmer e Crameri, "DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly"; EP 0932670 por Stemmer "Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Se- quence Recombination"; WO 99/23107 por Stemmer e similares, "Modifica-tion of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling"; WO 99/21979 por Apt e similares, "Human Papillomavirus Vectors"; WO 98/31837 por del Cardayre e similares "Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination"; WO 98/27230 por Patten e Stemmer, "Methods and Compositions for Polypeptide Engineering"; WO 98/27230 por Stemmer e similares, "Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling and Selection", WO 00/00632, "Meth-ods for Generating Highly Diverse Libraries", WO 00/09679, "Methods for Obtaining in Vitro Recombined Polynucleotide Sequence Banks and Resulting Sequences", WO 98/42832 por Arnold e similares, "Recombination of Polynucleotide Sequences Using Random or Defined Primers", WO 99/29902 por Arnold e similares, "Method for Creating Polynucleotide and Polypeptide Sequences", WO 98/41653 por Vind, "An in vitro Method for Construction of a DNA Library", WO 98/41622 por Borchert e similares, "Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling", e WO 98/42727 por Pati e Zarling, "Sequence Alterations using Homologous Recombination".
Certos pedidos U.S. fornecem detalhes adicionais com respeitos aos vários métodos de geração de diversidade, incluindo "SHUFFLING OF CODON ALTERED GENES" por Patten e similares depositado em 28 de Setembro, 1999, (U.S. No. Ser. 09/407.800); "EVOLUTION OF WHOLE CELLS AND ORGANISMS BY RECURSIVE SEQUENCE RECOMBINA-TION" por del Cardayre e similares, depositado em 15 de Julho, 1998 (U.S. No. Ser. 09/166.188), e 15 de Julho, 1999 (U.S. No. Ser. 09/354.922); "OLI-GONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION" por Crameri e similares, depositado em 28 de Setembro, 1999 (U.S. No. Ser. 09/408,392), e "OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOM-BINATION" por Crameri e similares, depositado em 18 de Janeiro, 2000 (PCT/US00/01203); "USE OF CODON - VARIED OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS FOR SYNTHETIC SHUFFLING" por Welch e similares, depositado em 28 de Setembro, 1999 (U.S. No. Ser. 09/408.393); "METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTI- DES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS" por Selifonov e similares, depositado em 18 de Janeiro, 2000, (PCT/US00/01202) e, por exemplo, "METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS" por Selifonov e similares, depositado em 18 de Julho, 2000 (U.S. No. Ser. 09/618.579); "METHODS OF POPULATING DATA STRUCTURES FOR USE IN EVOLUTIONARY SIMULATIONS" por Selifonov e Stemmer, depositado em 18 de Janeiro, 2000 (PCT/US00/01138); e "SINGLE - STRANDED NUCLEIC ACID TEMPLATE - MEDIATED RECOMBINATION AND NUCLEIC ACID FRAGMENT ISOLATION" por Affholter, depositado em 6 de Setembro, 2000 (U.S. No. Ser. 09/656,549).
Os métodos não estocásticos ou de "evolução dirigida" incluem, por exemplo, mutagênese de saturação (por exemplo, GSSM®), reagrupa-mento de ligação sintético (SLR), ou uma combinação destes, são empregados para modificar os ácidos nucléicos da invenção para gerar fosfolipases com propriedades novas ou alteradas (por exemplo, atividade sob condições altamente acídicas ou alcalinas, altas temperaturas, e similares). Polipeptí-deos codificados pelos ácidos nucléicos modificados podem ser avaliados quanto à uma atividade antes de testar quanto à uma fosfolipase ou outra atividade. Qualquer modalidade de teste ou protocolo pode ser empregada, por exemplo, empregando-se uma plataforma de disposição capilar. Veja, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos n°s 6.280.926 e 5.939.250. Mutagênese de Saturação, ou, GSSM® Em um aspecto da invenção, modificação de gene não estocás-tica, um "processo de evolução dirigida", é empregada para gerar fosfolipases com propriedades novas ou alteradas. As variações deste método foram denominadas "mutagênese de sítio do gene", "mutagênese de saturação de sítio", "Mutagênese de Saturação de sítio do Gene®" ou simplesmente "GSSM®". Podem ser empregadas em combinação com outros processos de mutagenização. Veja, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos n°s 6.171.820 e 6.238.884. Em um aspecto, GSSM® compreende fornecer um polinucleotídeo padrão e uma pluralidade de oligonucleotídeos, em que cada oligonucleotídeo compreende uma seqüência homóloga ao polinucleotídeo padrão, pelo qual alvejar uma seqüência específica do polinucleotídeo padrão, e uma seqüência que é uma variante do gene homólogo; gerar polinu-cleotídeos descendentes compreende variações de seqüência não estocás-ticas replicando-se o polinucleotídeo padrão com os oligonucleotídeos, pelos quais gerar polinucleotídeos compreende variações de seqüência de gene homólogas.
Em um aspecto, iniciadores de códon contendo uma seqüência de N,N,G/T degenerada são empregados para introduzir mutações pontuais em um polinucleotídeo, para gerar um grupo de polipeptídeos descendentes em que uma faixa total de substituições de aminoácido simples é representada em cada posição de aminoácido, por exemplo, um resíduo de aminoácido em um sítio ativo de enzima ou sítio de ligação do ligante alvejado a ser modificado. Estes oligonucleotídeos podem compreender uma primeira seqüência homóloga contígua, uma seqüência de N,N,G/T degenerada, e, opcionalmente, uma segunda seqüência homóloga. Os produtos translacionais descendentes a jusantes a partir do uso de tais oligonucleotídeos incluem todas as alterações de aminoácido possíveis em cada sítio de aminoácido ao longo do polipeptídeo, porque a degeneração da seqüência de N,N,G/T inclui códons para todos os 20 aminoácidos. Em um aspecto, um tal oligonucleotídeo degenerado (compreendido de, por exemplo, um cassete de N,N,G/T degenerado) é empregado para submeter cada códon original em um padrão de polinucleotídeo parental em uma faixa total de substituições de códon. Em outro aspecto, pelo menos dois cassetes degenerados são empregados - ou no mesmo oligonucleotídeo ou não, por submeter pelo menos dois códons originais em um padrão de polinucleotídeo parental em uma faixa total de substituições de códon. Por exemplo, mais do que uma se-qüência de N,N,G/T podem estar contidas em um oligonucleotídeo para introduzir mutações de aminoácido em mais do que um sítio. Esta pluralidade de seqüências de N,N,G/T pode ser diretamente contígua, ou separada por uma ou mais seqüência(s) de nucleotídeo adicional(is). Em outro aspecto, oligonucleotídeos úteis para introduzir adições e deleções podem ser em- pregados sozinhos ou em combinação com o códons que contém uma seqüência de N,N,G/T, para introduzir qualquer combinação ou permutação de substituições, deleções e/ou adições de aminoácido.
Em um aspecto, mutagênese simultânea de dois ou mais posições de aminoácido contíguas é feita empregando-se um oligonucleotídeo que contém tripletos de N,N,G/T contíguos, isto é, uma seqüência de (N,N,G/T)n degenerada. Em outro aspecto, os cassetes degenerados tendo menos degeneração do que a seqüência de N,N,G/T são empregados. Por exemplo, pode ser desejável em alguns exemplos usar (por exemplo em um oligonucleotídeo) uma seqüência de tripleto degenerado compreendida de apenas um N onde o referido N pode estar no primeira, segunda ou terceira posição do tripleto. Quaisquer outras bases que incluem quaisquer combinações e permutações destas pode ser empregadas nas duas posições restantes do tripleto. Alternativamente, pode ser desejável em alguns exemplos usar (por exemplo em um oligo) uma seqüência de tripleto N,N,N degenerado.
Em um aspecto, o uso de tripletos degenerados (por exemplo, tripletos N,N,G/T) permite a geração sistemática e fácil de uma faixa total de aminoácidos naturais possíveis (para um total de 20 aminoácidos) em cada qual e todas as posições de aminoácido em um polipeptídeo (em aspectos alternativos, os métodos da mesma forma incluem geração de menos do que todas as possíveis substituições por resíduo de aminoácido, ou códon, posição). Por exemplo, para um polipeptídeo de 100 aminoácidos, 2000 espécies distintas (isto é, 20 possíveis aminoácidos por posição X 100 posições de aminoácido) podem ser geradas. Pelo uso de um oligonucleotídeo ou grupo de oligonucleotídeos contendo um tripleto N,N,G/T degenerado, 32 seqüências individuais podem codificar para todos os 20 possíveis aminoá-cidos naturais. Desta maneira, em um vaso de reação no qual uma seqüên-cia de polinucleotídeo parental é submetida a mutagênese de saturação empregando-se pelo menos um tal oligonucleotídeo, são gerados 32 polinucleo-tídeos descendentes distintos codificando 20 polipeptídeos distintos. Em contraste, o uso de um oligonucleotídeo não degenerado em mutagênese sítio-dirigida leva a apenas um produto de polipeptídeo descendente por vaso de reação. Os oligonucleotídeos não degenerados podem opcionalmente ser empregados em combinação com iniciadores degenerados descritos; por exemplo, oligonucleotídeos não degenerados podem ser empregados para gerar mutações pontuais específicas em um polinucleotídeo de processamento. Isto fornece um meio de gerar mutações pontuais silenciosas específicas, mutações pontuais que levam a alterações de aminoácido correspondentes, e mutações pontuais que causam a geração de códons de ineterrup-ção e a expressão correspondente de fragmentos de polipeptídeo.
Em um aspecto, cada vaso de reação de mutagênese de saturação contém polinucleotídeos que codificam pelo menos 20 moléculas de polipeptídeo descendente (por exemplo, fosfolipase) tal que todos os 20 ami-noácidos naturais são representados em uma posição de aminoácido específica correspondente à posição de códon mutagenizada no polinucleotídeo parental (outros aspectos usam menos do que todas as 20 combinações naturais). Os polipeptídeos descendentes degenerados de 32 duplicações geradas a partir de cada vaso de reação de mutagênese de saturação podem ser submetidos a amplificação clonal (por exemplo, clonados de em um hospedeiro adequado, por exemplo, hospedeiro de E. coli, empregando-se, por exemplo, um vetor de expressão) e submetidos a avaliação de expressão. Quando um polipeptídeo descendente individual é identificado avaliando-se para exibir uma alteração favorável na propriedade (quando comparado ao polipeptídeo parental, tal como atividade de fosfolipase aumentada sob condições alcalinas ou acídicas), pode ser seqüenciado para identificar a substituição de aminoácido correspondentemente favorável contida nele.
Em um aspecto, na mutagenização cada qual e todas as posições de aminoácido em um polipeptídeo parental empregando-se mutagê-nese de saturação como aqui descrito, alterações de aminoácido favoráveis podem ser identificadas em mais do que uma posição de aminoácido. Um ou mais novas moléculas descendentes podem ser geradas, as quais contêm uma combinação de todas ou parte destas substituições de aminoácido favoráveis. Por exemplo, se 2 alterações de aminoácido favoráveis específicas são identificadas em cada uma das 3 posições de aminoácido em um polipeptídeo, as permutações incluem 3 possibilidades em cada posição (nenhuma alteração a partir do aminoácido original, e cada uma das duas alterações favoráveis) e 3 posições. Desta maneira, existem 3 x 3 x 3 ou 27 possibilidades totais, incluindo 7 que foram previamente examinadas - 6 mutações pontuais simples (isto é, 2 em cada uma das três posições) e nenhuma alteração a qualquer posição.
Em outro aspecto, mutagênese de saturação de sítio podem ser empregada junto com outros meios estocásticos ou não estocásticos para variar a seqüência, por exemplo, reagrupamento de ligação sintética (veja abaixo), embaralhamento, quimerização, recombinação e similares processos de mutagenização e agentes de mutagenização. Esta invenção fornece o uso de qualquer(quaisquer) processo(s) de mutagenização, incluindo mu-tagênese de saturação, de uma maneira de iterativa.
Reagrupamento de Ligação Sintética (SLR) A invenção fornece um sistema de modificação de gene não es-tocástico denominado "reagrupamento de ligação sintética", ou simplesmente "SLR", um "processo de evolução dirigida", para gerar fosfolipases com propriedades novas ou alteradas. SLR é um método de ligação de fragmentos de oligonucleotídeo juntos não estocasticamente. Este método difere a partir de embaralhamento de oligonucleotídeo estocástico em que os blocos de construção de ácido nucléico não são embaralhados, concatenado ou quimerizado aleatoriamente, porém de preferência são agrupados não estocasticamente. Veja, por exemplo, Pedido de Patente U.S. No. Serial (USSN) 09/332,835 intitulado "Synthetic Ligation Reassembly in Directed Evolution" e depositado no dia 14 de Junho de 1999 ("USSN 09/332.835"). Em um aspecto, SLR compreende as seguintes etapas: (a) fornecer um polinucleotí-deo padrão, em que o polinucleotídeo padrão compreende seqüência que codifica um gene homólogo; (b) fornecer uma pluralidade de polinucleotídeos de bloco de construção, em que os polinucleotídeos de bloco de construção são destinados a reagrupar por cruzamento com o polinucleotídeo padrão em uma seqüência predeterminada, e um polinucleotídeo de bloco de cons- trução compreende uma seqüência que é uma variante do gene homólogo e uma seqüência homóloga ao polinucleotídeo padrão que flanqueia a se-qüência variante; (c) combinar um polinucleotídeo de bloco de construção com um polinucleotídeo padrão tal que o polinucleotídeo de bloco de construção reagrupa-se por cruzamento com o polinucleotídeo padrão para gerar polinucleotídeos que compreendem variações de seqüência de gene homólogas. SLR não depende da presença de altos níveis de homologia entre polinucleotídeos para ser reagrupado. Desta maneira, este método pode ser empregado para não estocasticamente gerar bibliotecas (ou grupos) de moléculas descendentes compreendidas de mais de 10100 quimeras diferentes. SLR pode ser empregado para gerar bibliotecas compreendidas de mais de 101000 quimeras descendentes diferentes. Desta maneira, os aspectos da presente invenção incluem métodos não estocásticos de produzir um grupo de molécula de ácido nucléico quimérica finalizada raspando uma ordem de agrupamento total que é selecionada por projeto. Este método inclui as etapas de gerar por projeto uma pluralidade de blocos de construção de ácido nucléico específicos tendo extremidades ligáveis mutuamente compatíveis úteis, e agrupar estes blocos de construção de ácido nucléico, tal que uma ordem de agrupamento total designada é obtida.
As extremidades ligáveis mutuamente compatíveis dos blocos de construção de ácido nucléico a serem agrupados são consideradas "úteis" para este tipo de agrupamento ordenado, se elas permitem os blocos de construção ser agrupados em ordens predeterminadas. Desta maneira, a ordem de agrupamento total em que os blocos de construção de ácido nu-cléico podem ser acoplados é especificada pelo projeto das extremidades ligáveis. Se mais do que uma etapa de agrupamento deve ser empregada, em seguida a ordem de agrupamento total na qual os blocos de construção de ácido nucléico podem ser agrupados é da mesma forma especificada pela ordem seqüencial da(s) etapa(s) de agrupamento. Em um aspecto, os pedaços de construção anelados são tratados com uma enzima, tal como uma ligase (por exemplo T4 DNA ligase), para obter ligação covalente dos peda- ços de construção.
Em um aspecto, o projeto do blocos de construção de oligonucleotídeo é obtido analisando-se um grupo de padrões de seqüência de ácido nucléico progenitor que serve como uma base para produzir um grupo descendente de polinucleotídeos quiméricos finalizados. Estes padrões de oligonucleotídeo parentais desta maneira servem como uma fonte de informação de seqüência que ajuda no projeto dos blocos de construção de ácido nucléico que devem ser mutagenizados, por exemplo, quimerizados ou embaralhados.
Em um aspecto deste método, as seqüências de uma pluralidade de padrões de ácido nucléico parentais são alinhadas a fim de selecionar um ou mais pontos de demarcação. Os pontos de demarcação podem ser localizados em uma área de homologia, e são compreendidos de um ou mais nucleotídeos. Estes pontos de demarcação são preferivelmente compartilhados por pelo menos dois dos padrões progenitores. Os pontos de demarcação podem ser empregados para delinear os limites dos blocos de construção de oligonucleotídeo a serem gerados a fim de reagrupar os polinucleotídeos parentais. Os pontos de demarcação identificados e selecionados nas moléculas progenitoras servem como pontos de quimerização potenciais no agrupamento das moléculas descendentes quiméricas finais. Um ponto de demarcação pode ser uma área de homologia (compreendida de pelo menos uma base de nucleotídeo homóloga) compartilhada por pelo menos duas seqüências de polinucleotídeo parentais. Alternativamente, um ponto de demarcação pode ser uma área de homologia que é compartilhada por pelo menos metade das seqüências de polinucleotídeo parentais, ou, pode ser uma área de homologia que é compartilhada por pelo menos dois terços das seqüências de polinucleotídeo parentais. Até mesmo mais preferivelmente os pontos de demarcação úteis é uma área de homologia que é compartilhada por pelo menos três quartos das seqüências de polinucleotídeo paren-tais, ou, pode ser compartilhada por quase todas as seqüências de polinu-cleotídeo parentais. Em um aspecto, um ponto de demarcação é uma área de homologia que é compartilhada por todas as seqüências de polinucleotí- deo parentais.
Em um aspecto, um processo de reagrupamento de ligação é realizado exaustivamente a fim de gerar uma biblioteca exaustiva de polinucleotídeos quiméricos descendentes. Em outras palavras, todas as combinações ordenadas possíveis dos blocos de construção de ácido nucléico estão representadas no grupo de moléculas de ácido nucléico quimérico finalizadas. Ao mesmo tempo, em outra modalidade, a ordem de agrupamento (isto é, a ordem de agrupamento de cada bloco de construção na seqüência de 5' a 3 de cada ácido nucléico quimérico finalizado) em cada combinação é por projeto (ou não estocástica) como descrito acima. Por causa da natureza não estocástica desta invenção, a possibilidade de produtos laterais indese-jados é muito reduzida.
Em outro aspecto, o método de reagrupamento de ligação é realizada sistematicamente. Por exemplo, o método é realizado a fim de gerar uma biblioteca sistematicamente compartimentalizada de moléculas descendentes, com compartimentos que podem ser avaliados sistematicamente, por exemplo um por um. Em outras palavras, esta invenção fornece que, através do uso seletivo e judicioso de blocos de construção de ácido nucléi-co específicos, junto com o uso seletivo e judicioso de reações de agrupamento seqüencialmente escalonadas, um projeto pode ser obtido onde os grupos específicos de produtos descendentes são feitos em cada um dos vários vasos de reação. Isto permite um exame sistemático e procedimento de avaliação ser realizados. Desta maneira, estes métodos permitem um número potencialmente muito grande de moléculas descendentes ser examinado sistematicamente em grupos menores. Por causa de sua capacidade de realizar quimerizações de uma maneira que seja altamente flexível, contudo, igualmente exaustiva e sistemática, particularmente quando houver um baixo nível de homologia entre as moléculas progenitoras, estes métodos fornecem a geração de uma biblioteca (ou grupo) compreendida de um grande número de moléculas descendentes. Por causa da natureza não es-tocástica da presente invenção de reagrupamento de ligação, as moléculas descendentes geradas preferivelmente compreendem uma biblioteca de mo- léculas de ácido nucléico quimérico finalizadas tendo uma ordem de agrupamento total que é selecionada por projeto. A mutagênese de saturação e métodos de evolução dirigida otimizados da mesma forma podem ser empregados para gerar espécies moleculares descendentes diferentes. É apreciado que a invenção fornece liberdade de escolha e controle com respeito à seleção pontos de demarcação, o tamanho e número dos blocos de construção de ácido nucléico, e o tamanho e projeto dos acoplamentos. Além disso, é apreciado que o requerimento quanto à homologia intermolecular é altamente relaxado quanto à operabilidade desta invenção. Na realidade, os pontos de demarcação podem ainda ser selecionados em áreas de pequena ou nenhuma homologia intermolecular. Por exemplo, por causa das variações das pontes de hidrogênio do códon, isto é, da degeneração dos có-dons, substituições de nucleotídeo podem ser introduzidas em blocos de construção de ácido nucléico sem alterar o aminoácido originalmente codificado no padrão progenitor correspondente. Alternativamente, um códon pode ser alterado tal que a codificação para um originalmente aminoácido é alterada. Esta invenção fornece que tais substituições podem ser introduzidas no bloco de construção de ácido nucléico a fim de aumentar a incidência de pontos de demarcação intermolecularmente homóloga e desta maneira permitir um número aumentado de acoplamentos a serem obtidos entre os blocos de construção, que sucessivamente permitem um maior número de moléculas quiméricas descendentes ser geradas.
Em outro aspecto, a natureza sintética da etapa na qual os blocos de construção são gerados, permite o projeto e introdução de nucleotí-deos (por exemplo, um ou mais nucleotídeos, que podem ser, por exemplo, códons ou íntrons ou seqüências reguladoras) que pode ser depois opcionalmente removidos dentro um processo in vitro (por exemplo por mutagênese) ou em um processo in vivo (por exemplo utilizando a capacidade de entrançamento de gene de um organismo hospedeiro). É apreciado que em muitos exemplos a introdução destes nucleotídeos pode ser da mesma forma desejável por muitas outras razões além do benefício potencial de criar um ponto de demarcação útil.
Em um aspecto, um bloco de construção de ácido nucléico é empregado para introduzir um íntron. Desta maneira, os íntrons funcionais são introduzidos em um gene artificial fabricado de acordo com os métodos aqui descritos. O(s) íntron(s) artificialmente introduzido(s) pode(m) ser funcionais) em uma célula hospedeira para entrançamento de gene aproximadamente do modo que os íntrons de ocorrência natural servem funcionalmente no entrançamento de gene.
Sistema de Evolução Direcionada Otimizado A invenção fornece um sistema de modificação de gene não es-tocástica denominado "sistema de evolução dirigida otimizada" para gerar fosfolipases com propriedades novas ou alteradas. A evolução dirigida otimizada é direcionada ao uso de ciclos repetidos de reclassificação redutiva, recombinação e seleção que permitem a evolução molecular dirigida de ácidos nucléicos através de recombinação. A evolução dirigida otimizada permite a geração de uma grande população seqüências quiméricas evoluídas, em que a população gerada é significativamente enriquecida para seqüências que têm um número predeterminado de eventos de cruzamento.
Um evento de cruzamento é um ponto em uma seqüência qui-mérica onde uma mudança na seqüência ocorre a partir de uma variante parental para outra variante parental. Um tal ponto normalmente está na junção de onde os oligonucleotídeos a partir de duas origens são ligados juntos para formar uma única seqüência. Este método permite o cálculo das concentrações corretas de seqüências de oligonucleotídeo de forma que a população quimérica final de seqüências seja enriquecida para o número selecionado de eventos de cruzamento. Isto fornece mais controle sobre a escolha das variantes quiméricas que têm um número predeterminado de eventos de cruzamento.
Além disso, este método fornece um meio conveniente para explorar uma tremenda quantidade do espaço variante de proteína possível em comparação a outros sistemas. Previamente, se alguém gerasse, por exemplo, 1013 moléculas quiméricas durante uma reação, seria extremamente difícil de testar um tal número alto de variantes quiméricas para uma ativida- de particular. Além disso, uma porção significante da população descendente teria um número muito alto de eventos de cruzamento que resultariam em proteínas, que menos provavelmente teriam níveis aumentados de uma atividade particular. Empregando-se estes métodos, a população de moléculas quiméricas pode ser enriquecida para essas variantes que têm um número particular de eventos de cruzamento. Desta maneira, embora alguém ainda possa gerar 1013 moléculas quiméricas durante uma reação, cada uma das moléculas selecionadas para outra análise mais provavelmente tem, por exemplo, apenas três eventos de cruzamento. Porque a população descendente resultante pode estar propensa a ter um número predeterminado de eventos de cruzamento, os limites na variedade funcional entre as moléculas quiméricas estão reduzidos. Isto fornece um número mais manejável de variáveis ao calcular qual oligonucleotídeo a partir do polinucleotídeos paren-tais originais poderia ser responsável por afetar uma característica particular.
Um método para criar uma seqüência de polinucleotídeo descendente quimérica é criar oligonucleotídeos correspondentes aos fragmentos ou porções de cada seqüência parental. Cada oligonucleotídeo preferivelmente inclui uma única região de superposição a fim de que misturar os oligonucleotídeos juntos resulte em uma nova variante que tem cada fragmento de oligonucleotídeo agrupado na ordem correta. As informações adicionais podem da mesma forma ser constatadas em USSN 09/332.835. O número de oligonucleotídeos gerados para cada variante parental tem uma ligação com o número total de cruzamentos resultantes na molécula quimé-rica que é finalmente criada. Por exemplo, três variantes de seqüência de nucleotídeo parentais poderiam ser fornecidas para passar por uma reação de ligação a fim de encontrar uma variante quimérica tendo, por exemplo, maior atividade a alta temperatura. Como um exemplo, um grupo de 50 se-qüências de oligonucleotídeo pode ser gerado correspondente a cada uma das porções de cada variante parental. Conseqüentemente, durante o processo de reagrupamento de ligação poderia haver até 50 eventos de cruzamento dentro de cada uma das seqüências quiméricas. A probabilidade de que cada um dos polinucleotídeos quiméricos gerados conterá oligonucleotí- deos de cada variante parental em ordem alternada é muito baixa. Se cada fragmento de oligonucleotídeo está presente na reação de ligação na mesma quantidade molar, é provável que em algumas posições, os oligonucleotídeos do mesmo polinucleotídeo parental se ligarão a seguir a outros e desta maneira não resultarão em um evento de cruzamento. Se a concentração de cada oligonucleotídeo de cada origem é mantida constante durante qualquer etapa de ligação neste exemplo, há uma chance de 1/3 (assumindo 3 origens) que um oligonucleotídeo da mesma variante parental vai se ligar dentro da seqüência quimérica e não produzirá cruzamento.
Conseqüentemente, uma função de densidade de probabilidade (PDF) pode ser determinada para prognosticar a população de eventos de cruzamento que estão provavelmente a acorrer durante cada etapa em uma reação de ligação, determinado um número fixo de variantes parentais, vários oligonucleotídeos que correspondem a cada variante, e as concentrações de cada variante durante cada etapa na reação de ligação. As estatísticas e matemáticas após determinar a PDF são descritas abaixo. Utilizando-se estes métodos, a pessoa pode calcular uma tal função de densidade de probabilidade, e desta maneira enriquece a população descendente quimérica para um número predeterminado de eventos de cruzamento que são o resultado de uma reação de ligação particular. Além disso, um número alvo de eventos de cruzamento pode ser predeterminado, e o sistema em seguida programado para calcular as quantidades de partida de cada oligonucleo-tídeo parental durante cada etapa na reação de ligação para resultar em uma função de densidade de probabilidade que centra-se no número predeterminado de eventos de cruzamento. Estes métodos são dirigidos ao uso de ciclos repetidos de reclassificação redutiva, recombinação e seleção que permitem a evolução molecular dirigida de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo através de recombinação. Este sistema permite a geração de uma grande população de seqüências quiméricas evoluídas, em que a população gerada é significativamente enriquecida para seqüências que têm um número predeterminado de eventos de cruzamento. Um evento de cruzamento é um ponto em uma seqüência quimérica onde uma mudança na seqüência acontece de uma variante parental para outra variante parental. Um tal ponto está normalmente na junção de onde os oligonucleotídeos de duas origens estão ligados juntos para formar uma única seqüência. O método permite o cálculo das concentrações corretas de seqüências de oligonucleotídeo de forma que a população quimérica final de seqüências seja enriquecida para o número selecionado de eventos de cruzamento. Isto fornece mais controle sobre a escolha de variantes quiméricas que têm um número predeterminado de eventos de cruzamento.
Além disso, estes métodos fornecem um meio conveniente para explorar tremenda quantidade do espaço variante de proteína possível em comparação a outros sistemas. Empregando-se os métodos aqui descritos, a população de moléculas quiméricas pode ser enriquecida para essas variantes que têm um número particular de eventos de cruzamento. Desta maneira, embora alguém possa ainda gerar 1013 moléculas quiméricas durante uma reação, cada uma das moléculas selecionadas para outra análise mais provavelmente tem, por exemplo, apenas três eventos de cruzamento. Porque a população descendente resultante pode estar propensa a ter um número predeterminado de eventos de cruzamento, os limites na variedade funcional entre as moléculas quiméricas são reduzidos. Isto fornece um número mais manejável de variáveis ao calcular qual oligonucleotídeo a partir dos polinucleotídeos parentais originais poderia ser responsável por afetar uma característica particular.
Em um aspecto, o método cria uma seqüência de polinucleotídeo descendente quimérica criando-se oligonucleotídeos que correspondem aos fragmentos ou porções de cada seqüência parental. Cada oligonucleotídeo preferivelmente inclui uma única região de superposição a fim de que a mistura dos oligonucleotídeos juntos resulte em uma nova variante que tem cada fragmento de oligonucleotídeo agrupado na ordem correta. Veja da mesma forma USSN 09/332.835. O número de oligonucleotídeos gerado para cada variante parental tem uma ligação com o número total de cruzamentos resultantes na molécula quimérica que é finalmente criada. Por exemplo, três variantes de se- qüência de nucleotídeo parentais poderiam ser fornecidas para passar por uma reação de ligação a fim de encontrar uma variante quimérica tendo, por exemplo, maior atividade a alta temperatura. Como um exemplo, um grupo de 50 seqüências de oligonucleotídeo pode ser gerado correspondente a cada uma das porções de cada variante parental. Conseqüentemente, durante o processo de reagrupamento de ligação poderia haver até 50 eventos de cruzamento dentro de cada uma das seqüências quiméricas. A probabilidade de que cada um dos polinucleotídeos quiméricos gerados conterá oli-gonucleotídeos de cada variante parental em ordem alternada é muito baixa. Se cada fragmento de oligonucleotídeo está presente na reação de ligação na mesma quantidade molar, é provável que em algumas posições, os oligo-nucleotídeos do mesmo polinucleotídeo parental se ligarão a seguir a outros e desta maneira não resultarão em um evento de cruzamento. Se a concentração de cada oligonucleotídeo de cada origem é mantida constante durante qualquer etapa de ligação neste exemplo, há uma chance de 1/3 (assumindo 3 origens) que um oligonucleotídeo da mesma variante parental vai se ligar dentro da seqüência quimérica e não produzirá cruzamento.
Conseqüentemente, uma função de densidade de probabilidade (PDF) pode ser determinada para prognosticar a população de eventos de cruzamento que estão provavelmente a acorrer durante cada etapa em uma reação de ligação, determinado um número fixo de variantes parentais, vários oligonucleotídeos que correspondem a cada variante, e as concentrações de cada variante durante cada etapa na reação de ligação. As estatísticas e matemáticas após determinar a PDF são descritas abaixo. Alguém pode calcular uma tal função de densidade de probabilidade, e desta maneira enriquecer a população descendente quimérica para um número predeterminado de eventos de cruzamento que são o resultado de uma reação de ligação particular. Além disso, um número alvo de eventos de cruzamento pode ser predeterminado, e o sistema em seguida programado para calcular as quantidades de partida de cada oligonucleotídeo parental durante cada etapa na reação de ligação para resultar em uma função de densidade de probabilidade que centra-se no número predeterminado de eventos de cru- zamento.
Eventos de Cruzamento Determinantes As modalidades da invenção incluem um sistema e software que recebem uma função de densidade de probabilidade de cruzamento desejada (PDF), o número de genes de origem a ser reagrupado, e o número de fragmentos no reagrupamento como consumos. A produção deste programa é um "PDF de fragmento" que pode ser empregado para determinar uma receita para produzir genes reagrupados, e a PDF de cruzamento estimado desses genes. O processo aqui descrito é preferivelmente realizado em MA-TLAB® (The Mathworks, Natick, Massachusetts) uma linguagem de programação e ambiente de desenvolvimento para computação técnica.
Processos Iterativos Praticando-se a invenção, estes processos podem ser iterativa-mente repetidos. Por exemplo, um ácido nucléico (ou, o ácido nucléico) responsável por um fenótipo de fosfolipase alterado é identificado, reisolado, novamente modificado, retestado quanto a atividade. Este processo pode ser iterativamente repetido até que um fenótipo desejado seja construído. Por exemplo, uma trilha anabólica ou catabólica bioquímica inteira pode ser construída em uma célula, incluindo atividade de fosfolipase.
Similarmente, se é determinado que um oligonucleotídeo particular não afeta de modo algum na característica desejada (por exemplo, um novo fenótipo de fosfolipase), ele pode ser removido como uma variável sintetizando-se oligonucleotídeos parentais maiores que incluem a seqüência a ser removida. Uma vez que a incorporação da seqüência dentro de uma seqüência maior previne quaisquer eventos de cruzamento, já não haverá qualquer variação desta seqüência nos polinucleotídeos descendentes. Esta pratica iterativa de determinar quais oligonucleotídeos estão mais relacionados à característica desejada, e quais não estão relacionados, permite exploração mais eficiente de todas as possíveis variantes de proteína que po-deriam ser fornecidas a uma atividade ou característica particular. Embaralhamento in vivo O embaralhamento in vivo de moléculas é empregado em méto- dos da invenção que fornecem variantes de polipeptídeos da invenção, por exemplo, anticorpos, enzimas fosfolipase, e similares. O embaralhamento in vivo pode ser realizado utilizando a propriedade natural de células para re-combinar multímeros. Ao mesmo tempo que, a recombinação in vivo tem fornecido a rotina natural principal para diversidade molecular, a recombinação genética permanece um processo relativamente complexo que envolve 1) o reconhecimento de homologias; 2) clivagem de filamento, invasão de filamento e etapas metabólicas que levam à produção de quiasma recombi-nante; e finalmente 3) a resolução de quiasma em moléculas de recombina-das discretas. A formação do quiasma requer o reconhecimento de seqüên-cias homólogas.
Em um aspecto, a invenção fornece um método para produzir um polinucleotídeo híbrido a partir de pelo menos um primeiro polinucleotí-deo e um segundo polinucleotídeo. A invenção pode ser empregada para produzir um polinucleotídeo híbrido introduzindo-se pelo menos um primeiro polinucleotídeo e um segundo polinucleotídeo que compartilham pelo menos uma região de homologia de seqüência parcial em uma célula hospedeira adequada. As regiões de homologia de seqüência parcial promovem processos que resultam em reorganização de seqüência produzindo um polinucleo-tídeo híbrido. O termo "polinucleotídeo híbrido", quando aqui empregado, é qualquer seqüência de nucleotídeo que resulte do método da presente invenção e contenha seqüência de pelo menos duas seqüências de polinucle-otídeo originais. Tais polinucleotídeos híbridos podem resultar de eventos de recombinação intermolecular que promovem integração de seqüência entre moléculas de DNA. Além disso, tais polinucleotídeos híbridos podem resultar de processos de reclassificação redutiva intramolecular que utilizam seqüên-cias repetidas para alterar uma seqüência de nucleotídeo dentro de uma molécula de DNA.
Produção de variantes de seqüência A invenção da mesma forma fornece métodos de preparar variantes de seqüência do ácido nucléico e seqüências de fosfolipase da invenção ou isolar enzima de fosfolipase, por exemplo, fosfolipase, variantes de seqüência empregando-se os ácidos nucléico e polipeptídeos da invenção. Em um aspecto, a invenção fornece variantes de um gene de fosfolipase da invenção, que pode ser alteradas por quaisquer meios enquanto incluindo, por exemplo, métodos de estocástico ou aleatórios, ou, "evolução dirigida" ou não estocástica, métodos, como descrito acima.
As variantes isoladas podem ser de ocorrência natural. As variante podem da mesma forma ser criadas in vitro. As variantes podem ser criadas empregando-se técnicas de engenharia genética tal como mutagênese sítio-dirigida, mutagênese químico aleatória, procedimentos de deleção de Exonuclease III, e técnicas de clonagem padrões. Alternativamente, tais variantes, fragmentos, análogos ou derivados podem ser criados empregando-se procedimentos de modificação ou síntese química. Outros métodos de preparar variantes são da mesma forma familiares para aqueles versados na técnica. Estes incluem procedimentos nos quais as seqüências de ácido nucléico obtidas a partir de isolados naturais são modificadas para gerar ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos que tem características que aumentam o seu valor nas aplicações laboratoriais e industriais. Em tais procedimentos, um grande número de seqüências variantes que têm um ou mais diferenças de nucleotídeo com respeito à seqüência obtida a partir do isolado natural é gerado e caracterizado. Estas diferenças de nucleotídeo podem resultar em alterações de aminoácido com respeito aos polipeptídeos codificados pelos ácidos nucléico a partir do isolado natural.
Por exemplo, as variantes podem ser criadas empregando-se PCR propensa ao erro. Na PCR propensa ao erro, a PCR é realizada sob condições onde a fidelidade de cópia do DNA polimerase é baixa, tal que uma alta taxa de mutações pontuais é obtida ao longo do comprimento inteiro do produto de PCR. A PCR propensa ao erro é descrita, por exemplo, em Leung, D.W., e similares, Technique, 1:11 - 15, 1989) e Caldwell, R. C. & Joyce G.F., PCR Methods Applic., 2:28 - 33, 1992. Resumidamente, em tais procedimentos, os ácidos nucléicos a serem mutageneizados são misturados com iniciadores de PCR, tampão de reação, MgCl2, MnCl2, Taq polime-rase e uma concentração apropriada de dNTPs por obter uma taxa alta de mutação pontual ao longo do comprimento inteiro do produto de PCR. Por exemplo, a reação podem ser realizada empregando-se 20 fmoles de ácido nucléico a ser mutagenizado pode ser realizada, 30 pmoles de cada iniciador de PCR, um tampão de reação que compreende 50mM de KCl, 10mM de Tris HCl (pH 8,3) e 0,01% de gelatina, 7mM de MgCl2, 0,5mM de MnCl2, 5 unidades de Taq polimerase, 0,2mM de dGTP, 0,2mM de dATP, 1mM de dCTP e 1mM de dTTP. A PCR pode ser realizada durante 30 ciclos de 94°C durante 1 minuto, 45°C durante 1 minuto e 72°C durante 1 minuto. Entretanto, será apreciado que estes parâmetros podem ser variados como apropriado. Os ácidos nucléicos de mutageneizados são clonados em um vetor apropriado e as atividades do polipeptídeos codificadas pelos ácidos nucléi-cos de mutageneizados são avaliadas.
As variantes podem da mesma forma ser criadas empregando-se mutagênese dirigida ao oligonucleotídeo para gerar mutações específicas do sítio em qualquer DNA clonado de interesse. A mutagênese de oligonu-cleotídeo é descrita, por exemplo, em Reidhaar-Olson (1988) Science 241:53 - 57. Resumidamente, em tais procedimentos uma pluralidade de oligonucleotídeos de filamento duplo que passam por uma ou mais mutações a ser introduzida no DNA clonado é sintetizada e inserida no DNA clo-nado a ser mutagenizado. Os clones contendo o DNA mutagenizado são recuperados e as atividades do polipeptídeos que eles codificam são avaliadas.
Outro método para gerar variantes é PCR por agrupamento. A PCR de agrupamento envolve o agrupamento de um produto de PCR a partir de uma mistura de fragmentos de DNA pequenos. Um número grande de reações de PCR diferentes ocorre em paralelo no mesmo frasconete, com os produtos de uma reação preparando os produtos de outra reação. A PCR por agrupamento é descrita em, por exemplo, Patente U.S. No. 5.965.408.
Ainda outro método de gerar variantes é a mutagênese de PCR sexual. Na mutagênese de PCR sexual, a recombinação homóloga forçada ocorre entre as moléculas de DNA de seqüência de DNA diferente, porém altamente relacionada in vitro, como resultado da fragmentação aleatória da molécula de DNA com base na homologia de seqüência, seguido por fixação do cruzamento por extensão iniciadora em uma reação PCR. A mutagênese de PCR sexual é descrita, por exemplo, em Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 91:10747 - 10751. Resumidamente, em tais procedimentos uma pluralidade de ácidos nucléicos a serem recombinados é digerida com DNase para gerar fragmentos tendo um tamanho médio de 50 - 200 nucleotídeos. Os fragmentos do tamanho médio desejado são purificados e res-suspensos em uma mistura de PCR. PCR é conduzida sob condições que facilitam a recombinação entre os fragmentos de ácido nucléico. Por exemplo, a PCR pode ser realizada por resuspensão dos fragmentos purificados em uma concentração de 10 - 30ng/pl em uma solução de 0,2mM de de cada dNTP, 2,2mM de MgCl2, 50mM de KCL, 10mM de Tris HCl, pH 9,0 e 0.1% de Triton X - 100. 2,5 Unidades de Taq polimerase por 100:l de mistura de reação são adicionadas e a PCR é realizada empregando-se o seguinte regime: 94°C durante 60 segundos, 94°C durante 30 segundos, 50 - 55°C durante 30 segundos, 72°C durante 30 segundos (30 - 45 vezes) e 72°C durante 5 minutos. Entretanto, será apreciado que estes parâmetros podem ser variados como apropriado. Em alguns aspectos, oligonucleotídeos podem ser incluídos nas reações PCR. Em outros aspectos, os fragmentos de Kle-now de DNA polimerase I pode ser empregado em um primeiro grupo de reações PCR e Taq polimerase pode ser empregada em um grupo subse-qüente de reações PCR. As seqüências recombinantes são isoladas e as atividades dos polipeptídeos que eles codificam são avaliadas.
As variantes podem da mesma forma ser criadas por mutagênese in vivo. Em algumas modalidades, as mutações aleatórias em uma se-qüência de interesse são geradas propagando-se a seqüência de interesse em uma cepa bacteriana, tal como uma cepa de E. coli, que transporta mutações em uma ou mais trilhas de reparo de DNA. Tais cepas "mutadoras" têm uma taxa de mutação aleatória mais alta do que aquela de uma origem tipo-selvagem. A propagação do DNA em uma destas cepas gerarão eventualmente mutações aleatórias dentro do DNA. A cepas mutadoras adequadas para uso para mutagênese in vivo são descritas, por exemplo, em Publi- cação PCT No. WO 91/16427.
As variantes podem da mesma forma ser geradas empregando-se mutagênese de cassete. Na mutagênese de cassete, uma pequena região de uma molécula de DNA de filamento duplo é substituída com um "cassete" de oligonucleotídeo sintético qie difere da seqüência nativa. O oligonucleotídeo freqüentemente contém seqüência nativa completamente e/ou parcialmente aleatorizada. A mutagênese de conjunto recursiva pode da mesma forma ser empregada para gerar variantes. A mutagênese de conjunto recursiva é um algoritmo para construção de proteína (mutagênese de proteína) desenvolvida para produzir diversas populações de mutantes fenotipicamente relacionados, cujos os membros diferem em seqüência de aminoácido. Este método emprega um mecanismo de realimentação para controlar círculos sucessivos de mutagênese de cassete combinatorial. A mutagênese de conjunto recursiva é descrito em, por exemplo, Arkin (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:7811 - 7815.
Em algumas modalidades, as variantes são criadas empregando-se mutagênese de conjunto exponencial. A mutagênese de conjunto ex-ponencial é um processo para gerar bibliotecas combinatoriais com uma alta porcentagem de mutantes funcionais e únicos, em que pequenos grupos de resíduos são aleatorizados em paralelo para identificar, em cada posição alterada, aminoácidos que levam às proteínas funcionais. A mutagênese de conjunto exponencial é descrita, por exemplo, em Delegrave (1993) Biotechnology Res. 11:1548-1552. Mutagênese sitio dirigida e aleatória são descritas, por exemplo, em Arnold (1993) Current Opinion in Biotechnology 4:450-455.
Em algumas modalidades, as variantes são criadas empregando procedimentos de embaralhamento em que as porções de uma pluralidade de ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos distinto são fundidas juntas para criar seqüências de ácido nucléico quiméricas que codificam polipeptí-deos quiméricos como descrito em, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos n°s 5.965.408, 5.939.250. A invenção da mesma forma fornece variantes de polipeptídeos da invenção que compreende seqüências em que um ou mais dos resíduos de aminoácido (por exemplo, de um polipeptídeo exemplar da invenção) são substituídos com um resíduo de aminoácido conservado ou não conservado (por exemplo, um resíduo de aminoácido conservado) e tal resíduo de ami-noácido substituído pode ou não pode ser aquele codificado pelo código genético. Substituições conservadoras são aquelas que substituem um determinado aminoácido em um polipeptídeo por outro aminoácido de características similares. Desse modo, os polipeptídeos da invenção incluem aqueles com substituições conservadoras de seqüências da invenção, incluindo, porém não limitados às seguintes substituições: substituições de um aminoáci-do alifático tal como Alanina, Valina, Leucina e Isoleucina com outro aminoá-cido alifático; substituição de uma Serina com uma Treonina ou vice-versa; substituição de um resíduo acídico tal como ácido Aspártico e ácido Glutâ-mico com outro resíduo acídico; substituição de um resíduo que suporta um grupo de amida, tal como Asparagina e Glutamina, com outro resíduo suportando um grupo de amida; troca de um resíduo básico tal como Lisina e Ar-ginina com outro resíduo básico; e substituição de um resíduo aromático tal como Fenilalanina, Tirosina com outro resíduo aromático. Outras variantes são aquelas em que um ou mais dos resíduos de aminoácido dos polipeptí-deos da invenção incluem um grupo substituinte.
Outras variantes dentro do escopo da invenção são aquelas em que o polipeptídeo está associado com outro composto, tal como um composto para aumentar a meia-vida do polipeptídeo, por exemplo, polietileno glicol.
Variantes adicionais dentro do escopo da invenção são aquelas em que aminoácidos adicionais são fundidos ao polipeptídeo, tal como uma seqüência líder, uma seqüência segregadora, uma seqüência de pró-proteína ou uma seqüência que facilita a purificação, enriquecimento ou estabilização do polipeptídeo.
Em alguns aspectos, as variantes, fragmentos, derivado e análogos dos polipeptídeos da invenção mantém a mesma função biológica ou atividade como os polipeptídeos exemplares, por exemplo, uma atividade de fosfolipase, como descrito aqui. Em outros aspectos, a variante, fragmento, derivado, ou análogo inclui uma pró-proteína, tal que a variante, fragmento, derivado ou análogo pode ser ativado por clivagem da porção de pró-proteína para produzir um polipeptídeo ativo.
Otimização de códons para obter níveis altos de expressão de proteína em células hospedeiras. A invenção fornece métodos para modificar ácidos nucléicos de codificação de fosfolipase para modificar o uso de códon. Em um aspecto, a invenção fornece métodos para modificar códons em um ácido nucléico codificando uma fosfolipase para aumentar ou diminuir sua expressão em uma célula hospedeira. A invenção da mesma forma fornece ácidos nucléicos codificando uma fosfolipase modificada para aumentar sua expressão em uma célula hospedeira, enzimas de fosfolipase desse modo modificadas e métodos de preparar as enzimas de fosfolipase modificadas. O método compreende identificar um códon "não preferido" ou um "menos preferido" em ácido nucléico codificando fosfolipase e substituindo um ou mais destes códons não preferidos ou menos preferidos com um "códon preferido" codificando o mesmo aminoácido como o códon substituído e pelo menos um có-don não preferido ou menos preferido no ácido nucléico foi substituído por um códon preferido codificando o mesmo aminoácido. Um códon preferido é um códon super-representado na codificação de seqüências em genes na célula hospedeira e um códon não preferido ou menos preferido é um sub-representado na codificação de seqüências em genes na célula hospedeira. Células hospedeiras para expressar os ácidos nucléicos, cassetes de expressão e vetores da invenção incluem bactérias, levedura, fungos, células de planta, células de inseto e células de mamífero. Desse modo, a invenção fornece métodos para otimizar o uso de códon em todas estas células, ácidos nucléicos alterados por códon e polipeptídeos feitos pelos ácidos nucléicos alterados por códon. Células hospedeiras exemplares incluem bactérias gram negativas, tal como Escherichia coli; bactérias gram positivas, tal como qualquer Baccillus (por exemplo, B. cereus) ou Streptomyces, Lactobacillus gasseri, Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris, Baccillus subtilis. Células hospedeiras exemplares da mesma forma incluem organismos eucarióticos, por exemplo, várias leveduras, tais como Saccharomyces sp., incluindo Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, e Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Aspergillus niger, e células de mamífero e cepas celulares e células de inseto e cepas celulares. Desse modo, a invenção da mesma forma inclui ácidos nucléicos e polipeptídeos otimizados para expressão nestes organismos e espécies.
Por exemplo, os códons de um ácido nucléico codificando uma fosfolipase isolada de uma célula bacteriana são modificados tal que o ácido nucléico é otimamente expresso em uma célula bacteriana diferente das bactérias das quais a fosfolipase foi derivada, uma levedura, um fungo, uma célula de planta, uma célula de inseto ou uma célula de mamífero. Métodos para otimizar códons são bem conhecidos na técnica, veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos n° 5.795.737; Baca (2000) Int. J. Parasitol. 30:113-118; Hale (1998) Protein Expr. Purif. 12:185-188; Narum (2001) Infect. Immun. 69:7250-7253. Veja da mesma forma Narum (2001) Infect. Immun. 69:7250-7253, descrevendo códons de otimização em sistemas de camundongo; Outchkourov (2002) Protein Expr. Purif. 24:18-24, descrevendo códons de otimização em levedura; Feng (2000) Biochemistry 39:15399-15409, descrevendo códons de otimização em E. coli; Humphreys (2000) Protein Expr. Purif. 20:252-264, descrevendo uso de códon de otimização que afeta a segregação em E. coli.
Animais não-humanos transgênicos A invenção fornece animais não-humanos transgênicos compreendendo um ácido nucléico, um polipeptídeo, um vetor ou cassete de expressão ou uma célula transfectada ou transformada da invenção. Os animais não-humanos transgênicos podem ser, por exemplo, cabras, coelhos, ovelhas, porcos, vacas, ratos e camundongos, compreendendo os ácidos nucléicos da invenção. Estes animais podem ser empregados, por exemplo, como modelos in vivo para estudar a atividade de fosfolipase, ou, como modelos para avaliar moduladores de atividade de fosfolipase in vivo. As se- qüências de codificação para os polipeptídeos a ser expressos nos animais não-humanos transgênicos podem ser projetadas para ser constitutivas, ou, sob o controle de fatores transcricionais induzíveis ou específicos desenvol-ventes, específicos de tecido. Animais não-humanos transgênicos podem ser projetados e gerados empregando qualquer método conhecido na técnica; veja, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos n°s 6.211.428, 6.187.992, 6.156.952, 6.118.044, 6.111.166, 6.107.541, 5.959.171, 5.922.854, 5.892.070, 5.880.327, 5.891.698, 5.639.940, 5.573.933, 5.387.742, 5.087.571, descrevendo a preparação e uso de células transformadas e ovos e camundongos transgênicos, ratos, coelhos, ovelhas, porcos e vacas. Veja, da mesma forma, por exemplo, Pollock (1999) J. Immunol. Methods 231:147-157, descrevendo a produção de proteínas recombinantes no leite de animais de leiteria transgênicos; Baguisi (1999) Nat. Biotechnol. 17: 456461, demonstrando a produção de cabras transgênicas. Patente U.S. No. 6.211.428, descreve a preparação e uso de mamíferos não-humanos trans-gênicos que expressam em seus cérebros uma construção de ácido nucléico compreendendo uma seqüência de DNA. Patente U.S. No. 5.387.742, descreve a injeção de seqüências de DNA sintético e recombinante clonado em ovos de camundongo fertilizado, implantando os ovos injetados em fêmeas pseudo-grávidas e desenvolvendo para chamar camundongos transgênicos cujas células expressam proteínas relacionadas à patologia da doença de Alzheimer. Patente dos Estados Unidos n° 6.187.992, descreve a preparação e uso de um camundongo transgênico cujo genoma compreende um rompimento do gene codificando a proteína precursora amilóide (APP). "Animais de nocaute" podem da mesma forma ser empregados para praticar os métodos da invenção. Por exemplo, em um aspecto, os animais transgênicos ou modificados da invenção compreendem um "animal de nocaute", por exemplo, um "camundongo de nocaute", não construído para expressar ou ser incapaz de expressar uma fosfolipase.
Plantas e Sementes Transgênicas A invenção fornece plantas e sementes transgênicas compreendendo um ácido nucléico, um polipeptídeo (por exemplo, uma fosfolipase), um vetor ou cassete de expressão ou uma célula transfectada ou transformada da invenção. A invenção da mesma forma fornece produtos de planta, por exemplo, óleos, sementes, folhas, extratos e similares, compreendendo um ácido nucléico e/ou um polipeptídeo (por exemplo, uma fosfolipase) da invenção. A planta transgênica pode ser dicotiledônea (uma dicot) ou mono-cotiledônea (uma monocot). A invenção da mesma forma fornece métodos de preparar e usar estas plantas e sementes transgênicas. A célula de planta ou planta transgênica expressando um polipeptídeo da invenção pode ser construída de acordo com qualquer método conhecido na técnica. Veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos n° 6.309.872. Ácidos nucléicos e construções de expressão da invenção podem ser introduzidos em uma célula de planta por quaisquer meios. Por exemplo, ácidos nucléicos ou construções de expressão podem ser introduzidos no genoma de um hospedeiro de planta desejado, ou, os ácidos nu-cléicos ou construções de expressão podem ser epissomas. A introdução no genoma de uma planta desejada pode ser tal que a produção de fosfolipase do hospedeiro é regulada por elementos de controle transcricionais ou trans-lacionais endógenos. A invenção da mesma forma fornece "plantas de nocaute" onde a inserção da seqüência de gene por, por exemplo, recombinação homóloga, rompeu a expressão do gene endógeno. Meios para gerar plantas de "nocaute" são bem conhecidos na técnica, veja, por exemplo, Strepp (1998) Proc Natl. Acad. Sci. USA 95:4368-4373; Miao (1995) Plant J 7:359-365. Veja discussão sobre plantas transgênicas, abaixo.
Os ácidos nucléicos da invenção podem ser empregados para conferir características desejadas essencialmente em qualquer planta, por exemplo, em plantas contendo semente oleaginosa, tais como, arroz, soja, semente de colza, sementes de girassol, gergelim e amendoins. Ácidos nu-cléicos da invenção podem ser empregados para manipular as trilhas meta-bólicas de uma planta a fim de otimizar ou alterar a expressão do hospedeiro da fosfolipase. Pode-se mudar a atividade de fosfolipase em uma planta. Alternativamente, uma fosfolipase da invenção pode ser empregada na produção de uma planta transgênica para produzir um composto não natural- mente produzido por essa planta. Isto pode diminuir os custos de produção ou criar um novo produto.
Em um aspecto, a primeira etapa na produção de uma planta transgênica envolve a preparação de uma construção de expressão para expressão em uma célula de planta. Estas técnicas são bem conhecidas na arte. Elas podem incluir a seleção e clonagem de um promotor, uma seqüência de codificação para facilitar a ligação eficiente de ribossomas ao mRNA e selecionar as seqüências terminadoras de gene apropriadas. Um promotor constitutivo exemplar é CaMV35S, do vírus mosaico da couve-flor, que geralmente resulta em um alto grau de expressão em plantas. Outros promotores são mais específicos e respondem a sugestões no ambiente interno ou externo da planta. Um promotor induzível por luz exemplar é o promotor do gene cab, enquanto codificando a proteína de ligação de a/b de clorofila principal.
Em um aspecto, o ácido nucléico é modificado para obter maior expressão em uma célula de planta. Por exemplo, uma seqüência da invenção é provável ter uma porcentagem mais alta de pares de nucleotídeo A-T comparados aqueles vistos em uma planta, alguns dos quais preferem pares de nucleotídeo G-C. Portanto, nucleotídeos de A-T na seqüência de codificação podem ser substituídos com nucleotídeos de G-C sem alterar significativamente a seqüência de aminoácido para realçar a produção do produto de gene em células de planta.
Gene marcador selecionável pode ser adicionado à construção de gene a fim de identificar tecidos ou células de planta que têm bem suce-didamente integrado o transgene. Isto pode ser necessário porque obter a incorporação e expressão de genes em células de planta é um evento raro, ocorrendo em apenas alguns por cento das células ou tecidos alvejados. Genes marcadores selecionávéis codificam proteínas que forneceem resistência aos agentes que são normalmente tóxicos as plantas, tal como antibióticos ou herbicidas. Apenas as células de planta que têm integrado o gene marcador selecionável sobreviverão quando desenvolvidas em um meio contendo o antibiótico ou herbicida apropriado. Quanto aos outros genes inseridos, genes marcadores da mesma forma requerem seqüências de terminação e promotoras para própria função.
Em um aspecto, a preparação de plantas ou sementes transgê-nicas compreende a incorporação das seqüências da invenção e, opcionalmente, genes marcadores em uma constução de expressão alvo (por exemplo, um plasmídeo), junto com o posicionamento do promotor e sas seqüências terminadoras. Isto pode envolver a transferência do gene modificado na planta por um método adequado. Por exemplo, uma construção pode ser introduzida diretamente no DNA genômico da célula de planta empregando técnicas tais como eletroporação e microinjeção de protoplastos de célula de planta, ou as construções podem ser introduzidas diretamente ao tecido da planta empregando métodos balísticos, tais como bombardeio de partícula de DNA. Por exemplo, veja, por exemplo, Christou (1997) Plant Mol. Biol. 35:197-203; Pawlowski (1996) Mol. Biotechnol. 6:17-30; Klein (1987) Nature 327:70-73; Takumi (1997) Genes Genet. Syst. 72:63-69, discutindo o uso de bombardeio de partícula para introduzir transgenes em trigo; Adam (1997) supra, para uso de bombardeio de partícula para introduzir YACs em células de planta. Por exemplo, Rinehart (1997) supra, usou bombardeio de partícula para gerar plantas de algodão transgênicas. Mecanismos para acelerar as partículas são descrito em Patente U.S. No. 5.015.580; e, o instrumento de aceleração de partícula PDS-2000 (Biolistics) de BioRad comercialmente disponível; veja da mesma forma, John, Patente dos Estados Unidos n° 5.608.148; e Ellis, Patente dos Estados Unidos n° 5.681.730, descrevendo transformação mediada por partícula de gimnospermas Em um aspecto, os protoplastos podem ser imobilizados e injetados com ácidos nucléicos, por exemplo, uma construção de expressão. Embora a regeneração da planta a partir de protoplastos não seja fácil com cereais, a regeneração da planta é possível em legumes empregando em-briogênese somática a partir de calo derivado de protoplasto. Tecidos organizados podem ser transformados com DNA desnudo empregando técnica de pistola de gene, onde o DNA é revestido em microprojéteis de tungstênio, dispara 1/100° o tamanho das células, que carrega a DNA intensamente nas células e organelas. O tecido transformado é em seguida induzido para regenerar, normalmente por embriogênese somática. Esta técnica teve êxito em várias espécies de cereal incluindo milho e arroz. Ácidos nucléicos, por exemplo, construções de expressão, podem ser introduzidos da mesma forma nas células de planta empregando vírus recombinantes. As células de planta podem ser transformadas empregando vetores viróticos, tais como, por exemplo, vetores derivads do vírus mosaico do tabaco (Rouwendal (1997) Plant Mol. Biol. 33:989-999), veja Porta (1996) "Use of replicons viral for the expression of genes in plants," Mol. Biotechnol. 5:209-221.
Alternativamente, ácidos nucléicos, por exemplo, uma construção de expressão, pode ser combinada com regiões de flanquamento de T-DNA adequadas e introduzida em um vetor hospedeiro de Agrobacterium tumefaciens convencional. As funções de virulência do hospedeiro de Agrobacterium tumefaciens direcionarão a inserção da construção e marcador adjacente no DNA de célula de planta quando a célula é infectada pelas bactérias. Técnicas de transformação mediadas por Agrobacterium tumefa-ciens, incluindo o desaparelhamento e uso de vetores binários, são bem descritas na literatura científica. Veja, por exemplo, Horsch (1984) Science 233:496-498; Fraley (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803 (1983); Gene Transfer to Plants, Potrykus, ed. (Springer-Verlag, Berlim 1995). O DNA em uma célula de A. tumefaciens está contido no cromossomo bacteriano bem como em outra estrutura conhecida como um plasmídeo de Ti (indução de tumor). O plasmídeo de Ti contém uma extensão de DNA denominada T-DNA (~20 kb de comprimento) que isso é transferida para a célula de planta no processo de infecção e uma série de genes vir (virulência) que direcionam o processo de infecção. A. tumefaciens pode infectar apenas uma planta através dos ferimentos: quando uma raiz de planta ou caule é ferido, ele emite certos sinais químicos, com respeito aos quais, os genes vir de A. tu-mefaciens tornam-se ativados e direcionam uma série de eventos necessários para a transferência do T-DNA do plasmídeo de Ti ao cromossomo da planta. O T-DNA entra na célula da planta através do ferimento. Uma espe- culação é que o T-DNA espera até que o DNA da planta esteja sendo replicado ou transcrito, em seguida insere em si mesmo no DNA de planta exposta. A fim de empregar A. tumefaciens como um vetor de transgene, a seção de indução de tumor de T-DNA tem que ser removida, enquanto mantendo as regiões da borda do T-DNA e os genes vir. O transgene é em seguida inserido entre as regiões da borda do T-DNA, onde é transferido para a célula da planta e é integrado nos cromossomos da planta. A invenção fornece a transformação de plantas monocotiledô-neas empregando os ácidos nucléicos da invenção, incluindo cereais importantes, veja Hiei (1997) Plant Mol. Biol. 35:205-218. Veja, da mesma forma, por exemplo, Horsch, Science (1984) 233:496; Fraley (1983) Proc. Natl. Acad. Sci USA. 80:4803; Thykjaer (1997) supra; Park (1996) Plant Mol. Biol. 32:1135 1148, discutindo integração de T -DNA em DNA genômico. Veja da mesma forma, D'Halluin, Patente dos Estados Unidos n° 5.712.135, descrevendo um processo para a integração estável de um DNA compreendendo um gene que é funcional em uma célula de um cereal, ou outra planta mo-nocotiledônea.
Em um aspecto, a terceira etapa pode envolver a seleção e regeneração de plantas inteiras capazes de transmitir o gene alvo incorporado à próxima geração. Tais técnicas de regeneração contam com a manipulação de certos fitoormônios em um meio de crescimento de cultura de tecido, tipicamente contando com um marcador de herbicida e/ou biocida que foi introduzido junto com as seqüências de nucleotídeo desejadas. A regeneração da planta de protoplastos cultivados é descrita em Evans e similares, Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983; e Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. A regeneração pode da mesma forma ser obtida de calo de planta, explantes, órgãos ou partes destes. Tais técnicas de regeneração são descritas geralmente em Klee (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486. Para obter as plantas inteiras de tecidos transgênicos tais como embriões imaturos, elas podem ser desenvolvidas sob condições ambientais controladas em uma série de meios contendo nutrientes e hormônios, um processo conhecido como cultura de tecido. Logo que as plantas inteiras são geradas e produzem semente, a avaliação da descendência começa.
Depois que o cassete de expressão é estavelmente incorporado em plantas transgênicas, elas podem ser introduzidas em outras plantas por cruzamento sexual. Qualquer dentre várias técnicas de reprodução padrões pode ser empregada, dependendo das espécies a ser cruzadas. Visto que a expressão transgênica dos ácidos nucléicos da invenção leva às alterações fenotípicas, as plantas compreendendo os ácidos nucléicos recombinantes da invenção podem ser cruzadas sexualmente com uma segunda planta para obter um produto final. Desse modo, a semente da invenção pode ser derivada de um cruzamente entre duas plantas transgênicas da invenção, ou um cruzamente entre uma planta da invenção e outra planta. Os efeitos desejados (por exemplo, expressão dos polipeptídeos da invenção para produzir uma planta na qual o comportamento florescente é alterado) podem ser realçados quando ambas as plantas origem expressarem o polipeptídeo (por exemplo, uma fosfolipase) da invenção. Os efeitos desejados podem ser passados para gerações de planta futuras por meios de propagação padrões.
Os ácidos nucléicos e polipeptídeos da invenção são expressos em ou inseridos em qualquer planta ou semente. Plantas transgênicas da invenção podem ser dicotiledôneas ou monocotiledôneas. Exemplos de plantas transgênicas monocot da invenção são gramas, tal como grama de prado (grama azul, Poa), grama de forragem tal como festuca, lolium, grama temperada, tal como Agrostis, e cereais, por exemplo, trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, sorgo e milho (grão). Exemplos de plantas transgênicas dicot da invenção são tabaco, legumes, tais como tremoços, batata, beterraba açucareira, ervilha, feijão e soja, e plantas crucíferas (familia Brassicaceae), tal como couve-flor, semente de colza e o organismo modelo intimamente relacionado Arabidopsis thaliana. Desse modo, as plantas e sementes transgênicas da invenção incluem uma ampla faixa de plantas, incluindo, porém não limitadas a, espécies dos gêneros Anacardium, Arachis, Aspargos, Atro- pa, Avena, Brassica, Cítrico, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glicina, Gossypium, Helian-thus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannisetum, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Ricinus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorgo, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna, e Zea.
Em modalidades alternativas, os ácidos nucléicos da invenção são expressos em plantas (por exemplo, como plantas transgênicas), tais como plantas contendo semente oleaginosa, por exemplo, arroz, soja, semente de colza, sementes de girassol, gergelim e amendoins. Os ácidos nu-cléicos da invenção podem ser expressos em plantas que contêm células de fibra, incluindo, por exemplo, algodão, seda, árvore de algodão (Kapok, Ceiba pentandra), salgueiro do deserto, arbusto de creosoto, (krasheninnikovia lanata), balsa, rami, kenaf, cânhamo, vinaquira, juta, abacá de sisal e linho. Em modalidades alternativas, a planta transgênica da invenção pode ser os membros do gênero Gossypium, incluindo membros de qualquer espécie Gossypium, tal como G., arboreum; G. herbaceum, G., barbadense, e G. hirsutum. A invenção da mesma forma fornece plantas transgênicas a serem empregadas para produzir grandes quantidades dos polipeptídeos (por exemplo, uma fosfolipase ou anticorpo) da invenção. Por exemplo, veja Pal-mgren (1997) Trends Genet. 13:348; Chong (1997) Transgenic Res. 6:289 296 (produção de proteína beta-caseína do leite humano em plantas de batata transgênicas empregando-se um promotor de manopina sintase bidire-cional, indizível por auxina (mas1',2') com métodos de transformação de disco de folha mediado por Agrobacterium tumefaciens).
Empregando-se procedimentos conhecidos, alguém versado pode avaliar plantas da invenção detectando-se o aumento ou diminuição de mRNA transgene ou proteína em plantas transgênicas. Os meios para detec-tação e quantificação de mRNAs ou proteínas são bem conhecidos na técnica.
Polipeptídeos e peptídeos A invenção fornece polipeptídeos recombinantes ou isolados tendo uma identidade de seqüência (por exemplo, pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou completa (100%) identidade de seqüência) para uma seqüência exemplar da invenção, por exemplo, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108 SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138; SEQ ID NO: 140; SEQ ID NO: 142; SEQ ID NO: 144; NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172 ou SEQ ID NO: 174. Como discutido acima, a identidade pode estar sobre o comprimento total do polipep-tídeo, ou, a identidade pode estar sobre uma seqüência deste, por exemplo, uma região de pelo menos cerca de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 ou mais resíduos. Os polipeptí- deos da invenção podem ser da mesma forma mais curtos do que o comprimento total dos polipeptídeos exemplares (por exemplo, SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 8, etc.). Em modalidade alternativa, a invenção fornece polipeptídeos (peptídeos, fragmentos) variando no tamanho entre cerca de 5 e o comprimento total de um polipeptídeo, por exemplo, uma enzima, tal como uma fosfolipase, por exemplo, fosfolipase; tamanhos exemplares de cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400 ou mais resíduos, por exemplo, resíduos contíguos das fosfolipases exemplar de SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 8, etc.. Os peptídeos da invenção podem ser úteis como, por exemplo, sondas de rotu-lação, antígenos, toleragens, motivos, sítios ativos de fosfolipase, domínios de ligação, domínios reguladores, e similares.
Em um aspecto, o polipeptídeo tem uma atividade de fosfolipase, por exemplo, clivagem de uma ligação de éster de glicerolfosfato, a capacidade de hidrolizar ligação éster de fosfato, incluindo atividade de patatin, lipídio acil hidrolase (LAH), fosfolipase A, B, C e/ou fosfolipase D, ou qualquer combinação destas.
Em aspectos alternativos, polipeptídeos exemplares da invenção têm uma atividade de fosfolipase, Localização de Seqüência de Sinal, e uma fonte inicial, como mencionado na seguinte Tabela 1, abaixo. Para auxiliar na leitura da tabela, por exemplo, na primeira fila onde a SEQ ID NO: 143, 144, significa o polipeptídeo tendo uma seqüência como mencionado na SEQ ID NO: 144, e codificado por, por exemplo, SEQ ID NO: 143, tendo uma atividade de PLA específica de PLA, inicialmente isolada a partir de uma fonte desconhecida; outro exemplo na SEQ ID NO: 167, 168 fila onde 167, 168 significa o polipeptídeo tendo a seqüência como mencionado na SEQ ID NO: 168, e codificado por, por exemplo, SEQ ID NO: 167, tendo uma atividade de fosfatase de ácido fosfatídico, uma seqüência de sinal em resíduos de 1 a 30 ("AA1 - 30" significa resíduos de aminoácido de 1 a 30, etc.), isto é, MARSWKWRPLLSSFLLVSLAPFSTSVPCFK, e inicialmente isolada a partir de uma fonte desconhecida. A invenção da mesma forma fornece peptídeos compreendendo seqüências de sinal, e polipeptídeos quiméricos, onde os peptídeos ou quiméricos compreendem seqüências de sinal como mencionado na Tabela 1, e como descrito abaixo.
Tabela 1 Localização da Seqüência de Sinal (AA SEQ ID Tipo de enzi- = Amino- NO: ma ácido) Sinal (AA) Fonte PLA específi- Desconheci- 143,144 ca de PA da Desconheci- 25,26 Patatina da Desconheci- 77,78 Patatina da Desconheci- 35,36 Patatina da Desconheci- 125, 126 Patatina da Desconheci- 135, 136 Patatina da Desconheci- 99, 100 Patatina da Desconheci- 65,66 Patatina da Desconheci- 87,88 Patatina da Desconheci- 86,87 Patatina da Desconheci- 45,46 Patatina da Desconheci- 59,60 Patatina da Desconheci- 13, 14 Patatina da Desconheci- 71,72 Patatina da Desconheci- 55,56 Patatina da Desconheci- 33,34 Patatina da Desconheci- 91,92 Patatina da Desconheci- 103, 104 Patatina da Desconheci- 11, 12 Patatina da Desconheci- 17, 18 Patatina da Desconheci- 95,96 Patatina da Desconheci- 43,44 Patatina da Desconheci- 27,28 Patatina da Desconheci- 131, 132 Patatina da Desconheci- 127, 128 Patatina da Desconheci- 133, 134 Patatina da Desconheci- 137, 138 Patatina da Desconheci- 165, 166 Patatina da Fosfatases de ácido fosfatí- MARSWKWRPLLSS- Desconheci- 167,168 dico AA1 - 30 FLLVSLAPFSTSVPCFK da Fosfatases de ácido fosfatí- Desconheci- 169, 170 dico da Fosfatases de ácido fosfatí- Desconheci- 171, 172 dico da Fosfatases de ácido fosfatí- Desconheci- 173, 174 dico da PLC de fosfa- 111,112 tidilinositol AA1 - 16 MGAGAILLTGAPTASA Bactérias PLCdefosfa- MSNKKFILKLFICS- Desconheci- 107,108 tidilinositol AA1 - 23 TILSTFVFA da PLCdefosfa- MSNKKFILKLFICS- Desconheci- 109,110 tidilinositol AA1 - 23 TILSTFVFA da Fosfatidilinosi- MSNKKFILKLFICS- Desconheci- 113,114 tol PLC AA1 - 23 TILSTFVFA da PLCdefosfa- MNNKKFILKL- Desconheci- 117,118 tidilinositol AA1 - 23 FICSMVLSAFVFA da PLC de fosfa- tidilinositol MNNKKFILKL- Desconheci- 119,120 PLC AA1-23 FICSMVLSAFVFA da PLCdefosfa- MNNKKFILKL- Desconheci- 115,116 tidilinositol AA1 - 23 FICSMVLSAFVFA da PLCdefosfa- MRNKKFIL- Desconheci- 121,122 tidilinositol AA1 - 23 KLLICSTVLSTFVFA da Desconheci- 141, 142 Fosfolipase da MRTTTTNWRQIVKSL- KLFLMGLCLFISAS- Desconheci- 155,156 Fosfolipase AA1 - 36 FASSAYA da Desconheci- 159, 160 Fosfolipase da Desconheci- 145, 146 PLA da Desconheci- 147, 148 PLA da Desconheci- 149, 150 PLA da Desconheci- 151, 152 PLA da Desconheci- 153, 154 PLA da Desconheci- 157, 158 PLA da Desconheci- 163, 164 PLA da LSLVASLRRAPGAA- LALALAAA- TLAVTAQGA- 101,102 PLC AA1-39 TAAPAAAAA Bactérias MKKKVLALAAMVA- Desconheci-1,2 PLC AA1-24 LAAPVQSVVFAQ da MKRKILAIASVIALTA- Desconheci-3, 4 PLC AA1 - 24 PIQSVAFAH da MKRKILAIASVIALTA- Desconheci-5, 6 PLC AA1 - 24 PIQSVAFAH da MKRKLCTWALVTAIAS Desconheci-97,98 PLC AA1-25 STAVIPTAAE da MITLIKKCLLVLTM- Desconheci-7, 8 PLC AA1 - 29 TLLLGVFVPLQPSHAT da MKKKLCTWALVTAIS- Desconheci-31,32 PLC AA1-20 SGVVAI da MKKKLCTMALVTAIS- Desconheci-81,82 PLC AA1-25 SGVVTIPTEAQ da MITLIKKCLLVLTM- Desconheci- 93, 94 PLC AA1 - 29 TLLSGVFVPLQPSYAT da MKKKLCTLAFVTAIS- Desconheci-89,90 PLC AA1-25 SIAITIPTEAQ da MKKKVLALAAMVA- Desconheci- 123,124 PLC AA1 - 24 LAAPVQSVVFA da MKKKIC- TLALVSAITSGVVTIP- Desconheci- 129,130 PLC AA1-27 TVASA da MKIKPLTFSF- Desconheci- 139,140 PLC AA1-20 GLAVTSSVQA da MNRCRNSLNLQLRA- Desconheci- 105,106 PLC AA1-30 VTVAALVWASSAALAW da MKLLRVFVCVFALL- Desconheci- 9,10 PLC AA1-20 SAHSKAD da Desconheci- 47,48 PLD da Desconheci- 15, 16 PLD da Desconheci- 41,42 PLD da Desconheci- 23,24 PLD da Desconheci- 51,52 PLD da Desconheci- 53, 54 PLD da MKKTTLVLALLMPF- Desconheci-19,20 PLD AA1-19 GAASAQ da Desconheci- 75, 76 PLD da Desconheci- 57, 58 PLD da MKNTLILAGCILAAPA- Desconheci- 63,64 PLD AA1-18 VAD da MRNFSKGLTSILL- Desconheci- 79, 80 PLD AA1 - 23 SIATSTSAMAF da MRNFSKGLTSILL- Desconheci- 37, 38 PLD AA1 - 23 SIATSTSAMAF da MTLKLSLLIASL- Desconheci- 61,62 PLD AA1-21 SAVSPAVLAN da Desconheci- 67,68 PLD No da MKKMYSFVAGVM- Desconheci-83, 84 PLD AA1 - 21 TSGGVFAA da MNFWSFLLSITLPM- Desconheci-49, 50 PLD AA1 - 23 GVGVAHAQPD da Desconheci- 39,40 PLD da Desconheci- 73, 74 PLD da Desconheci- 29, 30 PLD da MQQHKLRN- FNKGLTGVVLSVLTST Desconheci-21,22 PLD AA1-28 SAMAF da Desconheci- 71,72 PLD da MNRKLLSLCLGATS- Desconheci-161,162 PLD AA1 - 24 CIALSLPVHA da Em um aspecto, a invenção fornece polipeptídeos que tem seqüências mencionadas em SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171 e/ou SEQ ID NO: 173, e subseqüências destas, por exemplo, seus sítios ativos ("domínios catalíticos") tendo uma atividade de fosfolipase, por exemplo, uma atividade de fosfolipase C (PLC). Em um aspecto, o polipeptídeo tem uma atividade de fosfolipase, porém necessita de atividade de hi-drólise em óleo neutro (triglicerídeo). Por exemplo, em um aspecto, o poli-peptídeo tem uma atividade de fosfolipase, porém necessita de qualquer atividade que afete uma fração de óleo neutro (triglicerídeo). Em um aspecto, a invenção fornece um processo de desgrumadura que compreende uso de um polipeptídeo da invenção que tem uma atividade de fosfolipase, porém não uma atividade de lipase.
Os polipeptídeos e peptídeos da invenção podem ser sintéticos, ou ser polipeptídeos recombinantemente gerados. Os peptídeos e proteínas podem ser recombinantemente expressos in vitro ou in vivo. Os peptídeos e polipeptídeos da invenção podem ser feitos e isolados empregando-se qualquer método conhecido na técnica. Os polipeptídeos e peptídeos da invenção podem da mesma forma ser sintetizados, inteiros ou em parte, empregando-se métodos químicos bem conhecidos na técnica. Veja por exemplo, Caruters (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser 215 - 223; Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225 - 232; Banga, A.K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PA. Por exemplo, a síntese de peptídeo podem ser realizada empregando-se várias técnicas de fase sólida (veja, por exemplo, Roberge (1995) Science 269:202; Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289:3 - 13) e a síntese automatizada pode ser obtida, por exemplo, empregando-se o Sintetizador de Peptídeo ABI 431A (Perkin Elmer) de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante.
Os peptídeos e polipeptídeos da invenção podem ser da mesma forma glicosilados. A glicosilação pode ser adicionada pós-translacional-mente, quimicamente ou por mecanismos biossintéticos celulares, em que os últimos oncorporam o uso de motivos de glicosilação conhecidos, que podem ser nativos à seqüência ou podem ser adicionados como um peptí-deo ou adicionados na seqüência de codificação de ácido nucléico. A glicosi-lação pode ser ligada ao O ou ligada ao N.
Os peptídeos e polipeptídeos da invenção, como aqui definido, incluem todos as formas "miméticas" e "peptidomiméticas". Os termos "mi-mético" e "peptidomimético" se referem a um composto químico sintético que tem substancialmente as mesmas características estruturais e/ou funcionais dos polipeptídeos da invenção. O mimético pode ser composto completamente de análogos sintéticos, análogos não naturais de aminoácidos, ou, ser uma molécula quimérica de aminoácidos de peptídeo parcialmente naturais e análogos parcialmente não naturais de aminoácidos. O mimético pode da mesma forma incorporar qualquer quantidade de substituições conservadoras aminoácido natural contanto que tais substituições da mesma forma não alterem substancialmente a atividade e/ou estrutura mimética. Assim como com os polipeptídeos da invenção que são variantes conservadoras, a experimentação de rotina determinará se um mimético está dentro do escopo da invenção, isto é, que sua estrutura e/ou função não está substancialmente alterada. Desta maneira, em um aspecto, uma composição mimética está dentro do escopo da invenção se tiver uma atividade de fosfolipase.
As composições miméticas de polipeptídeo da invenção podem conter qualquer combinação de componentes estruturais não naturais. Em aspecto alternativo, as composições miméticas da invenção incluem um ou todos os seguintes três grupos estruturais: a) grupos de ligação de resíduo diferentes das ligações de ligação de amida natural ("ligação de peptídeo"); b) resíduos não naturais no lugar de resíduos de aminoácido de ocorrência natural; ou c) resíduos que induzem ao mimetismo estrutural secundário, isto é, induzem ou estabilizam uma estrutura secundária, por exemplo, uma rotação beta, rotação gama, lâmina beta, conformação de hélice alfa, e similares. Por exemplo, um polipeptídeo da invenção pode ser caracterizado como um mimético quando todos ou alguns de seus resíduos estão unidos por meios de químicos diferentes de ligações de peptídeo naturais. Os resíduos peptidomiméticos individuais podem ser unidos por ligações de peptídeo, outras ligações químicas ou meios de acoplamento, tais como, por exemplo, glutaraldeído, ésteres de N-hidroxissuccinimida, maleimidas bifuncionais, N,N'-dicicloexilcarbodiimida (DCC) ou N,N'-di-isopropilcarbodiimida (DIC). Os grupos de ligação que podem ser uma alternativa para as ligações de liga- ção de amida tradicional ("ligação de peptídeo") incluem, por exemplo, ce-tometileno (por exemplo, -C(=O)-CH2- para -C(=O)-NH-), aminometileno (CH2-NH), etileno, olefina (CH=CH), éter (CH2-O), tioéter (CH2-S), tetrazol (CN4-), tiazol, retroamida, tiomida, ou éster (veja, por exemplo, Spatola (1983) em Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Pro-teins, Vol. 7. pp 267-357, "Peptide Backbone Modifications", Marcell Dekker, NY).
Um polipeptídeo da invenção pode ser caracterizado da mesma forma como um mimético por conter todos ou alguns resíduos não naturais no lugar de resíduos de aminoácido de ocorrência natural. Os resíduos não naturais são bem descritos na bibliografia científica e de patente; algumas composições não naturais exemplares úteis como miméticos de resíduos de aminoácido naturais e normas são descritos abaixo. Os miméticos de ami-noácidos aromáticos podem ser gerados substituindo-se por, por exemplo, D- ou L-nafilalanina; D- ou L-fenilglicina; D- ou L-2 tieneilalanina; D- ou L-1, -2, 3-, ou 4-pireneilalanina; D- ou L-3 tieneilalanina; D- ou L-(2-piridinil)-alanina; D- ou L-(3-piridinil)-alanina; D- ou L-(2-pirazinil)-alanina; D- ou L-(4-isopropil)-fenilglicina; D-(trifluorometil)-fenilglicina; D-(trifluorometil)-fenilal-anina; D-p-fluoro-fenilalanina; D- ou L-p-bifenil-fenilalanina; K- ou L-p-metóxi-bifenilfenilalanina; D- ou L-2-indol-(alquil)alaninas; e, D- ou L-alquilaininas onde alquila pode ser metila, etila, propila, hexila, butila, pentila, isopropila, isobutila, sec-isotila, isopentila substituída ou não substituída, ou um amino-ácido não acídico. Os anéis aromáticos de um aminoácido não natural incluem, por exemplo, anéis aromáticos de tiazolila, tiofenila, pirazolila, benzimi-dazolila, naftila, furanila, pirrolila e piridila.
Os miméticos de aminoácidos acídicos podem ser gerados por substituição, por exemplo, por aminoácidos de não carboxilato ao mesmo tempo que mantendo uma carga negativa; (fosfono)alanina; treonina sulfatada. Os grupos laterais de carboxila (por exemplo, aspartila ou glutamila) podem ser da mesma forma seletivamente modificados por reação com carbo-diimidas (R'-N-C-N-R') tal como, por exemplo, 1-cicloexil-3(2-morfolinil-(4-etila)carbodiimida ou 1-etil-3(4-azonia-4,4-dimetolpentil)carbodiimida. Aspar- tila ou glutamila pode da mesma forma ser convertida para resíduos de glu-taminila ou asparaginila por reação com íons de amônio. Os miméticos de aminoácidos básicos podem ser gerados por substituição com, por exemplo, (além de lisina e arginina) a ornitina de aminoácidos, citrulina, ou (guanidi-no)-ácido acético ou (guanidino)alquil-ácido acético onde alquila é definida acima. O derivado de nitrila (por exemplo, contendo a porção de CN no lugar de COOH) pode ser substituído por asparagina ou glutamina. Os resíduos de asparaginila e glutaminila podem ser desaminados para os resíduos de glutamila ou aspartila correspondentes. Os miméticos de resíduo de arginina podem ser gerados reagindo-se arginila com, por exemplo, um ou mais rea-gentes convencionais, incluindo, por exemplo, fenilglioxal, 2,3-butanedione, 1,2-ciclo-hexanodiona ou ninidrina, preferivelmente sob condições alcalinas. Os miméticos de resíduo de tirosina podem ser gerados reagindo-se tirosila com, por exemplo, compostos de diazônio aromáticos ou tetranitrometano. N-Acetilimidizol e tetranitrometano podem ser empregados para formar espécies de O-acetiltirosila e derivados de 3-nitro, respectivamente. Os mimé-ticos de resíduo de cisteína podem ser gerados reagindo-se resíduos de cis-teinila com, por exemplo, alfa-haloacetatos tal como ácido 2-cloroacético ou cloroacetamida e aminas correspondentes; para produzir derivados de car-boximetila ou carboxiamidometila. Os miméticos de resíduo de cisteína podem ser gerados da mesma forma reagindo-se resíduos de cisteinila com, por exemplo, bromo-trifluoroacetona, ácido alfa-bromo-beta-(5-imidozoil) propiónico; cloroacetilfosfato, N-alquilmaleimidas, dissulfeto de 3-nitro-2-piridila; dissulfeto de 2-piridila de metila; p-cloromercuribenzoato; 2-cloromercuri-4 nitrofenol; ou cloro-7-nitrobenzo-oxa-1,3-diazol. Os miméticos de lisina podem ser gerados (e os resíduos amino-terminais podem ser alterados) reagindo-se lisinila com, por exemplo, anidridos de ácido sucínico ou outro carboxílico. Lisina e similares miméticos de resíduo contendo alfa-amino podem ser da mesma forma gerados por reação com imidoésteres, tais como picolinimidato de metila, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroboroi-dreto, ácido trinitro-benzenossulfônico, O-metilisouréia, 2,4, pentanodiona e reações catalisadas por transamidase com glioxilato. Os miméticos de meti- onina podem ser gerados por reação com, por exemplo, sulfóxido de metio-nina. Os miméticos de prolina incluem, por exemplo, ácido pipecólico, ácido carboxílico de tiazolidina, 3- ou 4-hidroxiprolina, desidroprolina, 3- ou 4-metilprolina ou 3,3,-dimetilprolina. Os miméticos de resíduo de histidina podem ser gerados reagindo-se histidila com, por exemplo, dietilprocarbonato ou brometo de para-bromofenacila. Outros miméticos incluem, por exemplo, aqueles gerados por hidroxilação de prolina e lisina; fosforilação dos grupos de hidroxila de resíduos de serila ou treonila; metilação dos grupos de alfa-amino de lisina, arginina e histidina; acetilação da amina de N-terminal; meti-lação de resíduos de amida de cadeia principal ou substituição com aminoá-cidos de N-metila; ou amidação de grupos de carboxila de C-terminal.
Um resíduo, por exemplo, um aminoácido, de um polipeptídeo da invenção pode da mesma forma ser substituído por um aminoácido (ou resíduo peptidomimético) da quiralidade oposta. Desta maneira, qualquer ami-noácido de ocorrência natural na configuração L (que pode da mesma forma ser referida como o R ou S, dependendo da estrutura da entidade química) pode ser substituído com o aminoácido do mesmo tipo de estrutura química ou um peptidomimético, porém da quiralidade oposta, referido como o D-aminoácido, porém da mesma forma pode ser referido como a forma de R ou S. A invenção também fornece métodos para a modificação de polipeptídeos da invenção ou por processos naturais, tal como processamento pós-translacional (por exemplo, fosforilação, acilação, etc), ou por técnicas de modificação química, e os polipeptídeos modificados resultantes. As modificações podem ocorrer em qualquer parte no polipeptídeo, incluindo a cadeia principal do peptídeo, as cadeias laterais de aminoácido e a terminação de amino ou carboxila. Será apreciado que o mesmo tipo de modificação possa estar presente no mesmo grau ou grau variante em vários sítios em um determinado polipeptídeo. Além disso, um determinado polipeptídeo pode ter muitos tipos de modificação. As modificações incluem acetilação, aci-lação, ADP-ribosilação, amidação, ligação covalente de flavina, ligação co-valente de uma porção de heme, ligação covalente de um nucleotídeo ou derivado de nucleotídeo, ligação covalente de um lipídeo ou derivado de lipí-deo, ligação covalente de um fosfatidilinositol, ciclização de reticulação, formação de ligação de dissulfeto, desmetilação, formação de reticulações co-valentes, formação e cisteína, formação de piroglutamato, formilação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de âncora de GPI, hidroxilação, iodina-ção, metilação, miristoliação, oxidação, pegilação, processamento proteolíti-co, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfação, e adição mediada por transferência de RNA de aminoácidos a proteína tal como ar-ginilação. Veja, por exemplo, Creighton, T.E., Proteins - Structure and Molecular Properties 2nd Ed., W.H. Freeman e Company, New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, Nova Iorque, pp. 1-12 (1983).
Os métodos de síntese de peptídeo químico de fase sólida podem também ser empregados para sintetizar o polipeptídeo ou fragmentos da invenção. Tal método tem sido conhecido na técnica desde o início de 1960 (Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154, 1963) (Veja também Stewart, J. M. e Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2a Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, Ill., pp. 11-12) e tem recentemente sido empregado em kits de síntese e projeto de peptídeo de laboratório comercialmente disponível (Cambridge Research Biochemicals). Tais kits de laboratório comercialmente disponíveis geralmente utilizaram os ensinamentos de H. M. Geysen e similares, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:3998 (1984) e forneceram a sintetização de peptídeos nas pontas de uma multidão de "bastões" ou "grampos" todos dos quais estão conectados a uma única placa. Quando um tal sistema é utilizado, uma placa de bastão e grampo é invertida e inserida dentro de uma segunda placa de cavidades ou reservatórios correspondentes, que contém soluções para ligar ou ancorar um aminoácido apropriado às pontas do bastão ou do grampo. Repetindo-se uma tal etapa do processo, isto é, invertendo-se e inserindo-se as pontas do bastão e do grampo dentro de soluções apropriadas, os aminoácidos são embutidos dentro dos peptídeos desejados. Além disso, vários sistemas de síntese de peptídeo FMOC estão disponíveis. Por exemplo, a montagem de um polipeptídeo ou fragmento, pode ser realizada em um suporte empregando um Applied Biosystems, Inc. Model 431A® sintetizador de peptídeo automatizado. Tal equipamento fornece acesso rápido aos peptídeos da invenção, ou por síntese direta ou por síntese de uma série de fragmentos que podem ser acoplados empregando outras técnicas conhecidas.
Enzimas de Fosfolipase A invenção fornece novas fosfolipases, ácidos nucléicos as codificando, anticorpos que as ligam, peptídeos representando os sítios antigêni-cos da enzima (epítopos) e sítios ativos, domínios de ligação e reguladores, e métodos para a preparação e uso delas. Em um aspecto, os polipeptídeos da invenção têm uma atividade de fosfolipase, ou qualquer combinação de atividades de fosfolipase, como descrito aqui (por exemplo, clivagem de uma ligação de éster de glicerolfosfato, necessidade da atividade de lipase, etc.). Em aspectos alternativos, as fosfolipases da invenção têm atividades que foram modificadas daquelas das fosfolipases exemplares descritas aqui. A invenção inclui as fosfolipases com e sem seqüências de sinal e as seqüências de sinal por si próprias. A invenção inclui fragmentos ou subseqüências de enzimas da invenção, por exemplo, os peptídeos ou polipeptídeos compreendendo ou consistindo em domínios catalíticos ("sítios ativos"), sítios de ligação, domínios reguladores, epítopos, seqüências de sinal, domínios prepro, e similares. A invenção também inclui fosfolipases imobilizadas, anticorpos antifosfolipases e fragmentos destes. A invenção inclui heterocomplexos, por exemplo, proteínas de fusão, heterodímeros, etc., compreendendo as fosfolipases da invenção. A determinação de peptí-deos representado os sítios antigênicos da enzima (epítopos), sítios ativos, sítios de ligação, seqüências de sinal, e similares pode ser feita por protocolos de avaliação de rotina.
Essas enzimas e processos da invenção podem ser empregados para obter um desengomamento mais completo dos óleos de fósforo elevados, em particular, óleos de arroz, soja, milho, canola, e girassol. Por exemplo, em um aspecto, sob clivagem por PI-PLC, o fosfatidilinositol é convertido para diacilglicerol e fosfoinositol. O diaglicerol de divide na fase aquosa (me- Ihora da produção de óleo) e o fosfoinositol se divide na fase aquosa de onde é removido como um componente da fase pesada durante a centrifugação. Uma enzima da invenção, por exemplo, uma PI-PLC da invenção, pode ser incorporada em um processo de refinamento químico ou físico.
Em aspectos alternativos, as enzimas da invenção têm atividade de fosfolipase C específica de fosfatidilinositol (PI-PLC), atividade de fosfolipase C específica de fosfatidilcolina, atividade de fosfatase de ácido fosfatí-dico, atividade de fosfolipase A e/ou atividade de fosfolipase relacionada com patatina. Essas enzimas podem ser empregadas sozinhas ou em combinação com cada outra ou com outras enzimas da invenção, ou outras enzimas. Em um aspecto, a invenção fornece métodos onde essas enzimas (incluindo fosfolipase C específica de fosfatidilinositol (PIPLC), fosfolipase D e/ou fosfolipase C específica de fosfatidilcolina (em conjunto com uma fosfatase), fosfatase de ácido fosfatídico, fosfolipase A, fosfolipases relacionada com patatina da invenção) são empregadas sozinhas ou em combinação no desengomamento de óleo, por exemplo, óleos vegetais, por exemplo, óleos de fósforo elevados, tal como óleos de soja, milho, canola, farelo de arroz e girassol. Essas enzimas e processos da invenção podem ser empregados para obter um desengomamento mais completo de óleos de fósforo elevados, em particular, óleos de soja, canola, farelo de arroz e girassol. Sob clivagem por PI-PLC, o fosfatidilinositol é convertido para diacilglicerol e fosfoinositol. O diacilglicerol se divide na fase aquosa (melhorando a produção de óleo) e o fosfoinositol se divide na fase aquosa de onde é removido como um componente da fase pesada durante a centrifugação. Uma enzima da invenção, por exemplo, uma PI-PLC da invenção, pode ser incorporada no processo de refinamento químico ou físico.
Em um aspecto, a invenção fornece composições, por exemplo, soluções, compreendendo citrato de sódio em pH neutro para hidratar não-hidratáveis. Por exemplo, a invenção fornece soluções de citrato de sódio em uma faixa de pH dentre cerca de 4 a 9, ou, 5 a 8, ou, 6 a 7, que podem ser empregadas para hidratar fosfolipídeos não-hidratáveis (incluindo enzimas da invenção) em óleos de fósforo elevados. Em um aspecto, a hidrata- ção de fosfolipídeos não-hidratáveis é por quelação do cálcio e magnésio associados com os fosfolipídeos, desse modo permitindo que os sais de fosfolipídeo anteriormente insolúveis se dividam mais facilmente na fase aquosa. Em um aspecto, uma vez que os fosfolipídeos se movem para a interface de água /óleo ou para dentro da fase aquosa, uma fosfolipase da invenção (por exemplo, uma fosfoidrolase específica de fosfolipase da invenção), ou outra fosfolipase, converterão o fosfolipídeo para diacilglicerol e um fosfato-éster. Em um aspecto, o conteúdo de metal de magnésio e cálcio é reduzido sob adição de ácido e cáustico (veja a descrição em processos cáusticos).
As enzimas da invenção são catalisadores altamente seletivos. Como com outras enzimas, elas catalisam reações com estereo-, regio-, e quimiosseletividades esquisitas que são não paralelos em produtos químicos sintéticos convencionais. Além disso, as enzimas da invenção são notavelmente versáteis. Elas podem ser adaptadas para funcionar em solventes orgânicos, operar em pHs extremos (por exemplo, pHs elevados e pHs baixos), temperaturas extremas (por exemplo, temperaturas elevadas e temperaturas baixas), níveis extremos de salinidade (por exemplo, salinidade elevada e salinidade baixa), e catalisar reações com compostos que estejam estruturalmente não relacionados com os seus substratos fisiológicos naturais. As enzimas da invenção podem ser designadas serem reativas com respeito a uma ampla faixa de substratos naturais e não naturais, desse modo permitindo a modificação de virtualmente qualquer composto de chumbo orgânico. As enzimas da invenção podem também ser designada por serem altamente enantio- e regiosseletivas. O grau elevado de especificidade de grupo funcional exibido por essas enzimas possibilita alguém manter o rastro de cada reação em uma seqüência sintética induzindo a um novo composto ativo. As enzimas da invenção podem também ser designada para catalisar muitas reações diversas não relacionadas com sua função fisiológica nativa em natura. A presente invenção explora as propriedades catalíticas únicas das enzimas. Ao mesmo tempo em que o uso de biocatalisadores (isto é, enzimas brutas ou purificadas, células vivas ou não vivas) em transforma- ções químicas normalmente requer a identificação de um biocatalisador particular que reage com um composto de partida específico. A presente invenção usa biocatalisadores selecionados, isto é, as enzimas da invenção, e as condições de reação que são específicas para grupos funcionais que estão presentes em muitos compostos de partida. Cada biocatalisador é específico pra um grupo funcional, ou vários grupos funcionais relacionados, e pode reagir com muitos compostos de partida contendo este grupo funcional. As reações biocatalíticas produzem uma população de derivados de um único composto de partida. Esses derivados podem er submetidos à outra rodada de reações biocatalíticas para produzir uma segunda população e compostos derivados. Milhares de variações do composto original podem ser produzidas com cada interação de derivação biocatalítica.
As enzimas reagem em sítios específicos de um composto de partida sem afetar o resto da molécula, um processo que é muito difícil de se obter empregando métodos químicos tradicionais. Este grau elevado de especificidade biocatalítica fornece o meio para identificar uma única enzima ativa em uma biblioteca. A biblioteca é caracterizada pela série de reações biocatalíticas empregadas para produzir, uma então chamada "história bios-sintética". A avaliação da biblioteca quanto às atividades biológicas e representação da história biossintética identifica a seqüência de reação específica produzindo o composto ativo. A seqüência de reação é repetida e a estrutura do composto sintetizado é determinada. Este modo de identificação, diferentes de outros métodos de síntese e avaliação, não requer tecnologias de imobilização, e os compostos podem ser sintetizados e testados livres na solução empregando virtualmente qualquer tipo de ensaio de avaliação. É importante observar, que o grau elevado de especificidade de reações de enzima em grupo funcionais permite o "rastreamento" de reações enzimáti-cas específicas que compõem a biblioteca biocataliticamente produzida. A invenção também fornece métodos para descobrir novas fosfo-lipases empregando os ácidos nucléicos, polipeptídeos e anticorpos da invenção. Em um aspecto, as bibliotecas lambda fago são avaliadas para descoberta com base na expressão de fosfolipases. O uso de bibliotecas lamb- da fago na avaliação permite a detecção de clones tóxicos; acesso melhorado ao substrato; necessidade reduzida de construir um hospedeiro, fuga do potencial de qualquer tendência resultante da excisão da massa da biblioteca; e, crescimento mais rápido em densidades baixas de clone. A avaliação de bibliotecas lambda fago pode estar na fase líquida ou na fase sólida. A avaliação na fase líquida determina maior flexibilidade nas condições de ensaio; flexibilidade de substrato adicional; sensibilidade maior para clones fracos; e facilidade de automação na avaliação de fase sólida.
Muitas das etapas procedimentais são realizadas empregando automação robótica possibilitando a execução de muitos milhares de reações biocatalíticas e ensaios de avaliação por dia bem como garantindo um nível elevado de exatidão e reproducibilidade (veja a descrição de disposições, abaixo). Como um resultado, uma biblioteca de compostos derivados pode ser produzida em uma questão de semanas. Pa outros ensinamentos na modificação de moléculas, incluindo moléculas pequenas, veja PCT/US94/09174.
Seqüências de Sinal de Fosfolipase A invenção fornece seqüências de sinal de fosfolipase (por exemplo, peptídeos de sinal (SPs)), por exemplo, peptídeos compreendendo seqüências de sinal e/ou polipeptídeos quiméricos, onde os peptídeos ou quiméricos têm uma seqüência e sinal como apresentado na Tabela 1, ou como apresentado abaixo. A invenção fornece ácidos nucléicos codificando essas seqüências de sinal (SPs, por exemplo, um peptídeo tendo uma se-qüência compreendendo/ consistindo em resíduos de amino terminais de um polipeptídeo da invenção). Em um aspecto, a invenção fornece uma seqüên-cia de sinal compreendendo um peptídeo compreendendo/ consistindo em uma seqüência como apresentado nos resíduos 1 a 20, 1 a 21, 1 a 22, 1 a 23, 1 a 24, 1 a 25, 1 a 26, 1 a 27, 1 a 28, 1 a 28, 1 a 30, 1 a 31, 1 a 32 ou 1 a 33 de um polipeptídeo da invenção, por exemplo, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108 SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138; SEQ ID NO: 140; SEQ ID NO: 142; SEQ ID NO: 144; NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, ou SEQ ID NO: 174. Qualquer desses peptídeos pode ser parte de uma proteína quimérica, por exemplo, uma proteína recombinante. Um peptídeo de seqüência de sinal pode ser combinado com outra enzima da invenção (por exemplo, uma fosfolipase da invenção da qual não foi derivada), ou, com outra fosfolipase, ou com qualquer polipeptídeo, como descrito também, abaixo.
As seqüências de sinal exemplares são apresentadas na Tabela 1 e a listagem da SEQ ID, por exemplo, resíduos 1 a 24 da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6; resíduos 1 a 29 da SEQ ID NO: 8; resíduos 1 a 20 da SEQ ID NO: 10; resíduos 1 a 19 da SEQ ID NO: 20; resíduos 1 a 28 da SEQ ID NO: 22; resíduos 1 a 20 da SEQ ID NO: 32; resíduos 1 a 23 da SEQ ID NO: 38; veja a Tabela 1 e a listagem de SEQ ID para outras se-qüências de sinal exemplares da invenção.
Em alguns aspectos, as fosfolipases da invenção não têm se-qüências de sinal. Em um aspecto, a invenção fornece as fosfolipases da invenção necessitando de toda ou parte de uma seqüência de sinal. Em um aspecto, a invenção fornece uma seqüência de ácido nucléico codificando uma seqüência de sinal de uma fosfolipase operavelmente ligada a uma seqüência de ácido nucléico de uma fosfolipase diferente ou, opcionalmente, uma seqüência de sinal de ma proteína de não fosfolipase pode ser desejada.
Domínios prepro de fosfolipase, domínios de ligação e domínios catalíticos Além das seqüências de sinal (por exemplo, peptídeos de sinal (SPs)), como descrito acima, a invenção fornece domínios prepro, domínios de ligação (por exemplo, domínio de ligação de substrato) e domínios catalíticos (CDs). Os domínios SP, domínios de ligação, domínios prepro e/ou CDs da invenção podem ser peptídeos recombinantes ou isolados ou podem ser parte de uma proteína de fusão, por exemplo, como um domínio heteró-logo em uma proteína quimérica. A invenção fornece ácidos nucléicos codificando esses domínios catalíticos (CDs) (por exemplo, "sítios ativos"), domínios prepro, domínios de ligação e seqüências de sinal (SPs, por exemplo, um peptídeo tendo uma seqüência compreendendo/ consistindo em resíduos amino terminais de um polipeptídeo da invenção).
As seqüências de sinal de fosfolipase (SPs), domínios de ligação, domínios de catalíticos (CDs) e/ou seqüências prepro da invenção podem ser peptídeos isolados, ou, seqüências unidas a outras fosfolipase ou um polipeptídeo de não fosfolipase, por exemplo, como uma proteína de fusão (quimérica). Em um aspecto, os polipeptídeos compreendendo seqüências de sinal de fosfolipase SPs e/ou prepro da invenção compreendem seqüências heterólogas para fosfolipases da invenção (por exemplo, uma proteína de fusão compreendendo uma SP e/ou prepro da invenção e seqüências de outra fosfolipase ou uma proteína de não fosfolipase). Em um aspecto, a invenção fornece fosfolipases da invenção com seqüências CDs, SPs e/ou prepro heterólogas, por exemplo, seqüências com uma seqüência de sinal de levedura. Uma fosfolipase da invenção pode compreender uma CD, SP e/ou prepro heteróloga em um vetor, por exemplo, um vetor da série pPIC (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Em um aspecto, as seqüências SPs, CDs, e/ou prepro da invenção são identificadas seguinte à identificação de novos polipeptídeos de fosfolipase. As vias pelas quais as proteínas são classificadas e transportadas para sua própria localização celular são geralmente referidas como vias de rotulação de proteína. Um dos elementos mais importantes em todos esses sistemas de rotulação é uma seqüência de aminoácido, curta na terminação de amino de um polipeptídeo recentemente sintetizado chamada seqüência de sinal. Esta seqüência de sinal direciona uma proteína para sua localização apropriada na célula e é removida durante o transporte ou quando a proteína alcança seu destino final. A maioria das proteínas secretadas lisossô-micas ou membrana, têm uma seqüência de sinal amino-terminal que as marca para a translocação no lúmen do retículo endoplásmico. As seqüên-cias de sinal podem variar no comprimento de 13 a 45 ou mais resíduos de aminoácido. Vários métodos de reconhecimento das seqüências de sinal são conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, em um aspecto, novos peptídeos de sinal de hidrolase são identificados por um método referido como SignalP. SignalP usa uma rede neural combinada que reconhece ambos pptídeos de sinal e seus sítios de clivagem. (Nielsen, e similares, "Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites." Protein Engineering, vol. 10, no. 1, p. 1-6 (1997)).
Em alguns aspectos, uma fosfolipase da invenção não pode ter seqüências SPs e/ou prepro, e/ou domínios catalíticos (CDs). Em um aspecto, a invenção fornece fosfolipases necessitando de todos ou parte de um domínio SP, CD e/ou a prepro. Em um aspecto, a invenção fornece uma se-qüência de ácido nucléico codificando uma seqüência de sinal (SP), CD e/ou prepro de uma fosfolipase operavelmente ligada a uma seqüência de ácido nucléico de uma fosfolipase diferente ou, opcionalmente, uma seqüência de sinal (SPs), um domínio CD e/ou prepro de uma proteína de não fosfolipase pode ser desejada. A invenção também fornece polipeptídeos isolados ou recombi-nantes compreendendo seqüências de sinal (SPs), domínio prepro e/ou domínios catalíticos (CDs) da invenção e seqüências heterólogas. As seqüên- cias heterólogas são seqüências não naturalmente associadas (por exemplo, a uma fosfolipase) com uma SP, domínio prepro e/ou CD. A seqüência a qual a SP, domínios prepro e/ou CD não estão naturalmente associados pode estar na terminação carbóxi terminal, terminação amino terminal de SP, domínio prepro e/ou de CD, e/ou em abas terminações da SP e/ou CD. Em um aspecto, a invenção fornece um polipeptídeo isolado ou recombinante compreendendo (ou consistindo em) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de sinal (SP), domínio prepro e/ou domínio catalítico (CD) da invenção com a condição de que ele não esteja associado com qualquer se-qüência a qual ela esteja naturalmente associada (por exemplo, seqüência de fosfolipase). Similarmente, em um aspecto, a invenção fornece ácidos nucléicos isolados ou recombinantes codificando esses polipeptídeos. Desse modo, em um aspecto, o ácido nucléico isolado ou recombinante da invenção compreende codificar a seqüência para uma seqüência de sinal (SP), domínio prepro e/ou domínio catalítico (CD) da invenção e seqüência heteró-loga (isto é, uma seqüência não naturalmente associada com a seqüência de sinal (SP), domínio prepro e/ou domínio catalítico (CD) da invenção). A seqüência heteróloga pode estar na terminação 3' terminal, terminação 5' terminal, e/ou em ambas as terminações da SP, domínio prepro e/ou se-qüência de codificação CD.
Os polipeptídeos da invenção incluem fosfolipases em uma forma ativa ou inativa. Por exemplo, os polipeptídeos da invenção incluem pró-proteínas antes da "maturação" ou processamento de seqüências prepro, por exemplo, por uma enzima de processamento de pro-proteína, tal como uma pro-proteína convertase para gerar uma proteína madura "ativa". Os polipeptídeos da invenção incluem fosfolipases inativas por outras razões, por exemplo, antes da "ativação" por um evento de processamento pós-translacional, por exemplo, uma ação de endo- ou exo-peptidase ou protei-nase, um evento de fosforilação, uma amidação, uma glicosilação, uma des-glicosilação, uma sulfação, um evento de dimerização, e/ou outros. Os métodos para identificar as seqüências de domínio "prepro", CDs, domínios de ligação e seqüências de sinal são rotineiros e bem conhecidos na técnica, veja, por exemplo, Van de Ven (1993) Crit. Rev. Oncog. 4(2):115-136; yeast two-hybrid screenings for identifying protein-protein interactions, descrito, por exemplo, por Miller (2004) Methods Mol. Biol. 261:247-62; Heyninck (2004) Methods Mol. Biol. 282:223-41, USPN 6,617,122; 6,190,874. Por exemplo, para identificar uma seqüência prepro, a proteína é purificada do espaço ex-tracelular e a seqüência de proteína N-terminal é determinada e comparada com a forma não processada.
Os polipeptídeos da invenção podem ser formulados como uma preparação de proteína em qualquer forma líquida, sólida, semi-sólida ou gel. Por exemplo, uma preparação de proteína da invenção pode compreender uma formulação compreendendo uma composição líquida não aquosa, um sólido fundido, um pó, um pó liofilizado, uma forma granular, uma forma em partícula, um comprimido prensado, um pélete, uma pílula, uma forma de gel, um hidrogel, uma pasta, um aerossol, um spray, uma loção ou uma formulação de lama.
Os polipeptídeos da invenção incluem todas as formas ativas, por exemplo, domínios catalíticos (CDs) ou sítios ativos, de uma enzima da invenção. Em um aspecto, a invenção fornece domínios catalíticos ou sítios ativos como apresentados abaixo. Em um aspecto, a invenção fornece um peptídeo ou polipeptídeo compreendendo ou consiste em um domínio de sítio ativo como predito através do uso de uma base de dados tal como Pfam (que é uma grande coleção de múltiplos alinhamentos de seqüência e modelos de Markov ocultos cobrindo muitas famílias de proteína comum, The Pfam protein families database, A. Bateman, E. Birney, L. Cerruti, R. Durbin, L. Etwiller, S.R. Eddy, S. Griffiths-Jones, K.L. Howe, M. Marshall, e E.L.L. Sonnhammer, Nucleic Acids Research, 30(1):276-280, 2002) ou equivalentes. A invenção fornece a fusão de subseqüências N-terminais ou C-terminais de enzimas da invenção (por exemplo, seqüências de sina, se-qüências prepro) com outros polipeptídeos, proteínas ativas ou fragmentos de proteína. A produção de uma enzima da invenção (por exemplo, uma enzima de fosfolipase C) pode também ser concluída expressando-se a enzima como uma proteína de fusão inativa que é mais tarde ativada por um evento de clivagem proteolítica (empregando ou uma atividade de protease endógena ou exógena, por exemplo, tripsina) que resulta na separação do par da proteína de fusão e da enzima madura, por exemplo, enzima de fosfolipase C. Em um aspecto, a proteína de fusão da invenção é expressada de um constructo de nucleotídeo híbrido que codifica uma estrutura de leitura aberta única contendo os seguintes elementos: a seqüência de nucleotídeo para a proteína de fusão, uma seqüência ligadora (definida como uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma seqüência de aminoácido flexível que une dois domínios de proteína menos flexíveis), sítio de reconhecimento de clivagem de protease, e a seqüência enzima madura (por exemplo, qualquer enzima da invenção, por exemplo, uma fosfolipase). Em aspectos alternativos, a proteína de fusão pode compreender uma seqüência de pectato liase, uma seqüência de xilanase, uma seqüência de fosfatase de ácido fosfatídico, ou outra seqüência, por exemplo, uma seqüência que tenha sido anteriormente mostrada ser superexpressa em um sistema hospedeiro de interesse.
Qualquer sistema hospedeiro pode ser empregado (veja a descrição, acima), por exemplo, qualquer bactéria, por exemplo, uma bactéria gram-positiva, tal como Bacillus, ou uma bactéria gram-negativa, tal como E. coli, ou qualquer levedura, por exemplo, Pichia pastoris. A disposição das seqüências de nucleotídeo na construção de nucleotídeo quiméria pode ser determinada com base nos níveis de expressão de proteína obtidos com cada construção de fusão. Prosseguindo da terminação 5' do constructo de nucleotídeo para a terminação principal 3'do constructo, em um aspecto, a seqüência de nucleotídeo é montada como segue: Seqüência de sinal /proteína de fusão /seqüência ligadora /sítio de reconhecimento de clivagem de protease / enzima madura (por exemplo, qualquer enzima da invenção, por exemplo, uma fosfolipase) ou seqüência de sinal /seqüência pro /enzima madura/seqüência ligadora /proteína de fusão. A expressão de enzima (por exemplo, qualquer enzima da invenção, por exemplo, uma fosfolipase) como uma proteína e fusão inativa, pode melhorar a expressão total da seqüência da enzima, pode reduzir qualquer toxicidade potencial associada com a su-perexpressão da enzima ativa e/ou pode aumentar a vida útil da enzima antes do uso por que a enzima seria inativa até que a proteína de fusão, por exemplo, pectato liase, seja separada da enzima, por exemplo, proteína de fosfolipase.
Em vários aspectos, a invenção fornece formulações específicas para ativação de fosfolipase da invenção expressada como uma proteína de fusão. Em um aspecto, a ativação da atividade de fosfolipase inicialmente expressada como uma proteína de fusão inativa é concluída empregando uma atividade proteolítica ou potencialmente uma atividade proteolítica em combinação com uma peptidase amino-terminal ou carboxil-terminal. Este evento de ativação pode ser concluído em uma variedade de modos e em uma variedade de pontos no processo de a preparação/ armazenamento antes da aplicação no desengomamento de óleo. Os processos exemplares da invenção incluem: Clivagem por uma atividade endógena expressada pela preparação do hospedeiro sob secreção da construção de fusão no meio de fermentação; Clivagem por uma atividade de protease endógena que é ativada ou entra em contato com o contructo de fusão intracelularmente expressada sob ruptura das células hospedeiras; Passagem da construção de fusão bruta ou purificada em uma coluna de atividade de protease imobilizada para concluir a clivagem e ativação da enzima (por exemplo, fos-folipase da invenção, por exemplo, uma fosfolipase C) antes da formulação da enzima; Tratamento do constructo de fusão purificada ou bruta com uma fonte solúvel de atividade proteolítica; Ativação de uma fosfolipase (por exemplo, uma fosfolipase da invenção, por exemplo, uma fosfolipase C) na refinaria de óleo empregando uma fonte ou solúvel ou insolúvel da atividade proteolítica imediatamente antes do uso no processo; e/ou, Ativação da atividade de fosfolipase (por exemplo, uma fosfolipase da invenção, por exemplo, uma fosfolipase C) continuamente circulando-se a formulação de construção de fusão através de uma coluna de atividade de protease imobilizada em temperatura reduzida (por exemplo, qualquer entre cerca de 4°C e 20°C). Este evento de ativação pode ser concluído antes da liberação para o sítio de uso ou pode ocorrer no sítio na refinaria de óleo.
Glicosilação Os peptídeos e polipeptídeos da invenção (por exemplo, hidrola-ses, anticorpos) podem também ser glicosilados, por exemplo, em um aspecto, compreendendo pelo menos um sítio de glicosilação, por exemplo, uma glicosilação N-ligada ou O-ligada. Em um aspecto, o polipeptídeo pode ser glicosilado após ser expressado em um P. pastoris ou um S. pombe. A glicosilação pode ser adicionada pós-translacionalmente ou quimicamente ou por mecanismos biossintéticos celulares, onde o último incorpora o uso de motivos de glicosilação conhecidos, que podem ser nativos à seqüência ou podem ser adicionados como um peptídeo ou adicionado na seqüência de codificação de ácido nucléico.
Em um aspecto, a invenção fornece um polipeptídeo compreendendo uma SEQ ID NO: 2 glicosilada N-ligada, como descrito, por exemplo, na seguinte tabela: A estrutura de leitura aberta da SEQ ID NO: 2 de tamanho natural (que em um aspecto é codificado pela SEQ ID NO: 1) codifica sete (7) sítios de glicosilação ligados a asparagina potencial (N-ligada). A expressão da estrutura de leitura aberta da SEQ ID NO: 2 tipo selvagem em um hospedeiro de glicosilação (por exemplo, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, ou uma célula de mamífero) resulta na produção de uma enzima de fosfolipase da SEQ ID NO: 2 glicosilada que é essencialmente inativa devido à presença de glicosilação N-ligada. A desgli- cosilação enzimática da SEQ ID NO: 2 tipo selvagem, glicosilada com PNGase F ou Endoglicosidase H resulta na ativação da atividade da SEQ ID NO: 2. Além disso, a modificação de um ou mais sítios de glicosilação N-ligados através de mutagênese (a fim de que o sítio não seja mais reconhecido como um sítio de glicosilação N-ligado e a glicosilação não mais ocorra naquele sítio) resulta na produção de SEQ ID NO: 2 com graus variantes de atividade aumentada. A mutagênese do códon de nucleotídeo codificando a asparagi-na nos sítios de glicosilação da SEQ ID NO: 2 4,5, e/ou 6 (por exemplo, convertendo a asparagina para um ácido aspártico) resulta na produção de uma enzima com atividade de PLC aumentada comparado com a estrutura de leitura aberta tipo selvagem expressada no mesmo hospedeiro (o mutante triplo expressado em Pichia pastoris possui uma atividade específica e uma atividade funcional que é essencialmente idêntica àquela da seqüência tipo selvagem expressada em um hospedeiro de não glicosilação tipo E. coli. É também possível abolir o sítio de glicosilação N-ligado por mutagênese do resíduo de serina ou treonina na seqüência de consenso de glicosilação N-ligada (NXS/T), por exemplo, convertendo-se esses códons de nucleotídeo para produzir valina ou isoleucina nessas posições ao invés de serina ou treonina. O uso desta estratégia para remover os sítios de glicosilação N-ligados também resulta na produção de fosfolipase de SEQ ID NO: 2 ativo na glicosilação dos sistemas de expressão de hospedeiro.
Ensaios para atividade de fosfolipase A invenção fornece polipeptídeos isolados, sintéticos ou recombinantes (por exemplo, enzimas, anticorpos) tendo uma atividade de fosfolipase, ou qualquer combinação de atividade de fosfolipase, e ácido nucléicos codificando-as. Qualquer dos muitos ensaios de atividade de fosfolipase conhecidos na técnica pode ser empregado para determinar se um polipeptí-deo tem uma atividade de fosfolipase e está dentro do escopo da invenção. Os protocolos rotineiros para determinar a fosfolipase A, B, D e C, atividades de acil hidrolase de patatina e lipídeo, ou atividade de lipase, são bem conhecidos na técnica.
Os ensaios de atividade exemplar incluem ensaios de turvamen-to, ensaios de fosfocolina de metilumbeliferila (fluorescente), ensaios de fosfolipase vermelho Amplex (fluorescente), ensaios de cromatografia de camada fina (TLC), ensaios citolíticos e ensaios de p-nitrofenilfosforilcolina. Empregando esses ensaios, os polipeptídeos, peptídeos ou anticorpos podem ser rapidamente avaliados quanto à atividade de fosfolipase. A atividade de fosfolipase pode compreender uma atividade de acil hidrolase de lipídeo (LAH). Veja, por exemplo, Jimenez (2001) Lipids 36:1169-1174, descrevendo um ensaio micelar misturado com base em éter de monododecila de octaetileno glicol para determinar a atividade de acil hidrolase de lipídeo de uma patatina. Pinsirodom (2000) J. Agric. Food Chem. 48:155-160, descreve uma atividade de patatina de acil hidrolase de lipídeo exemplar (LAH).
Os ensaios de turvamento para determinar a atividade de fosfoli-pase são descritos, por exemplo, em Kauffmann (2001) "Conversion of Bacillus thermocatenulatus lipase into an efficient fosfolipase with increased activity towards long-chain fatty acyl substrates by directed evolution and rational design," Protein Engineering 14:919-928; Ibrahim (1995) "Evidence implicating fosfolipase as a virulence factor of Candida albicans," Infect. Immun. 63:1993-1998.
Os ensaios de fosfocolina de metilumbeliferila (fluorescente) para determinar a atividade de fosfolipase são descritos, por exemplo, em Goode (1997) "Evidence for cell surface and internal phospholipase activity in ascidian eggs," Develop. Growth Differ. 39:655-660; Diaz (1999) "Direct fluorescence-based lipase activity assay," BioTechniques 27:696-700.
Os ensaios de fosfolipase vermelho Amplex (fluorescente) para determinar a atividade de fosfolipase estão disponíveis como kits, por exemplo, a detecção de fosfolipase específica de fosfatidilcolina empregando um kit de ensaio de fosfolipase específica de fosfatidilcolina vermelha Amplex de Molecular Probes Inc. (Eugene, OR), de acordo com as instruções do fabricante. A fluorescência é medida em um leitor de microplaca de fluorescência empregando excitação em 560 ± 10 nm e detecção de fluorescência em 590 ± 10 nm. O ensaio é sensível em concentrações de muito baixas.
Os ensaios de cromatografía de camada fina (TLC) para determinar a atividade de fosfolipase são descritos, por exemplo, em Reynolds (1991) Methods in Enzymol. 197:3-13; Taguchi (1975) "Fosfolipase from Clostridium novyi type A.I," Biochim. Biophys. Acta 409:75-85. A cromatogra-fia de camada fina (TLC) é amplamente empregada em técnicas para detecção de atividade de fosfolipase. Várias modificações deste método têm sido empregadas para extrair os fosfolipídeos das misturas de ensaio aquoso. Em alguns ensaios de PLC a hidrólise é interrompida por adição de clorofórmio /metanol (2:1) à mistura de reação. O material de partida não reagido e o diacilglicerol são extraídos na fase orgânica e pode se fracionado por TLC, ao mesmo tempo em que o produto do grupo de cabeceira permanece na fase aquosa. Para medição mais precisa da digestão de fosfolipídeo, os substratos radiorrotulados podem ser empregados (veja, por exemplo, Reynolds (1991) Methods in Enzymol. 197:3-13). As razões de produtos e rea-gentes podem ser empregadas para calcular o número atual de móis do substrato hidrolisado por tempo de unidade. Se todos os componentes são extraídos igualmente, qualquer perda na extração afetará todos os componentes igualmente. A separação dos produtos de digestão de fosfolipídeo pode ser obtida por TLC de sílica gel com clorofórmio /metanol/ água (65:25:4) empregada como um sistema de solvente (veja, por exemplo, Taguchi (1975) Biochim. Biophys. Acta 409:75-85).
Os ensaios de p-nitrofenilfosforilcolina para determinar a atividade de fosfolipase são descritos, por exemplo, em Korbsrisate (1999) J. Clin. Microbiol. 37:3742-3745; Berka (1981) Infect. Immun. 34:1071-1074. Este ensaio é com base na hidrólise enzimática da p-nitrofenilfosforilcolina de análogo de substrato para liberar um p-nitrofenol de composto cromogênico amarelo, detectável em 405 nm. Este substrato é conveniente para avaliação de alta produção.
Um ensaio citolítico pode detectar as fosfolipases com atividade citolítica com base na lise de eritrócitos. As fosfolipases tóxicas podem interagir com membranas de célula eucarióticas e hidrolisar fosfatidilcolina e es- fingomielina, induzindo a lise de célula. Veja, por exemplo, Titball (1993) Microbiol. Rev. 57:347-366.
Bibliotecas de peptídeo e fosfolipases híbridas (quimérica) Em um aspecto, a invenção fornece proteínas de fusão fosfolipases híbridas, incluindo bibliotecas de peptídeo, compreendendo seqüências da invenção. As bibliotecas de peptídeo da invenção podem ser empregadas para isolar os moduladores de peptídeo (por exemplo, ativadores e inibidores) de alvos, tal como substratos, receptores, enzimas de fosfolipase. As bibliotecas de peptídeo da invenção podem ser empregadas para identificar os pares de ligação formais dos alvos, tal como ligandos, por exemplo, cito-cinas, hormônios e similares. Em um aspecto, a invenção fornece proteínas quiméricas compreendendo uma seqüência de sinal (SP) e/ou domínio catalítico (CD) da invenção e uma seqüência heteróloga (veja acima). A invenção também fornece métodos para gerar fosfolipases "melhoradas" e híbridas empregando os polipeptídeos e ácidos nucléicos da invenção. Por exemplo, a invenção fornece métodos para gerar enzimas que tenham atividade, por exemplo, atividade de fosfolipase (tal como, por exemplo, atividade de fosfolipase A, B, C ou D, atividade de esterase patati-na, clivagem de uma ligação de éster de glicerolfosfato, clivagem de uma ligação de éster em um fosfolipídeo em um óleo vegetal) em pHs alcalinos extremos e/ou pHs ácidos, temperaturas altas e baixas, condições osmóticas e similares. A invenção fornece métodos para gerar enzimas híbridas (por exemplo, fosfolipases híbridas).
Em um aspecto, os métodos da invenção produzem novos poli-peptídeos híbridos utilizando-se processos celulares que integram a seqüên-cia de um primeiro polinucleotídeo tal que os polinucleotídeos híbridos resultantes codifiquem os polipeptídeos demonstrando atividades derivadas dos primeiros polipeptídeos biologicamente ativos. Por exemplo, os primeiros polinucleotídeos podem ser uma seqüência de ácido nucléico exemplar (por exemplo, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, etc.) codificando uma fosfolipase exemplar da invenção (por exemplo, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, etc.). O primeiro ácido nucléico pode codificar uma enzima de m organismo que funciona efetivamente sob uma condição ambiental particular, por exemplo, salinidade elevada. Ele pode ser "integrado" com uma enzima codificada por um segundo polinucleotídeo de m organismo diferente que funciona efetivamente sob uma condição ambiental diferente, tal como temperaturas extremamente elevadas. Por exemplo, quando os dois ácidos nucléicos podem produzir uma molécula híbrida por, por exemplo, recombinação e/ou reclassificação redutiva. Um polinucleotídeo híbrido contendo seqüências do primeiro e segundo polinucleotídeos originais pode codificar uma enzima que exibe características de ambas enzimas codificadas pelos polinucleotídeos originais. Desse modo, a enzima codificada pelo polinucleotídeo híbrido pode funcionar efetivamente sob condições ambientais compartilhadas por cada das enzimas codificadas pelo primeiro e segundo polinucleotídeos, por exemplo, salinidade elevada e temperaturas extremas.
Alternativamente, um polipeptídeo híbrido resultante deste método da invenção pode exibir a atividade de enzima especializada não exibida nas enzimas originais. Por exemplo, a seguinte recombinação e/ou reclassificação redutiva de polinucleotídeos codificando atividades de fosfolipase, o polipeptídeo híbrido resultante codificado por um polinucleotídeo híbrido pode ser avaliado quanto às atividades especializadas obtidas de cada das enzimas originais, isto é, o tipo de ligação na qual a fosfolipase atua e a temperatura na qual a fosfolipase funciona. Desse modo, por exemplo, a fosfolipase pode ser avaliada para verificar aquelas funcionalidades químicas que distinguem a fosfolipase híbrida das fosfolipases originais, tal como: (a) amida (ligações de peptídeos), isto é, fosfolipases; (b) ligações de éster, isto é, fosfolipases e lipases; (c) acetais, isto é, glicosida-ses e, por exemplo, a temperatura, pH ou concentração de sal na qual os polipeptídeos híbridos funcionam.
As fontes dos polinucleotídeos a serem "integrados" com ácidos nucléicos da invenção podem ser isoladas de organismos individuais ("isolados"), coleções de organismos que foram desenvolvidos em meios definidos ("culturas de enriquecimento"), ou, organismos não cultivados ("amostras ambientais"). O uso de um método independente da cultura para derivar os polinucleotídeos codificando novas bioatividades das amostras ambientais é mais preferível uma vez que permite alguém acessar aos recursos sem derivação de biodiversidade. As "bibliotecas ambientais" são geradas de amostras ambientais e representam os genomas coletivos de organismos de ocorrência natural arquivados em vetores de clonagem que podem ser propagados em hospedeiros procarióticos adequados. Por que o DNA clonado é inicialmente extraído diretamente das amostras ambientais, as bibliotecas não são limitadas a pequenas frações de procariotas que podem ser desenvolvidas em cultura pura. Adicionalmente, uma normalização do DNA ambiental presente nessas amostras poderia permitir representação mais igual do DNA de todas as espécies presentes na amostra original. Isto pode dramaticamente aumentar a eficiência de genes interessantes da invenção de constituintes menores da amostra que pode ser sub-representada por várias ordens de magnitude comparada com as espécies dominantes.
Por exemplo, as bibliotecas de genes de um ou mais microorganismos não cultivados são avaliadas quanto a uma atividade de interesse. As vias potenciais codificando as moléculas bioativas de interesse são inicialmente capturadas em células procarióticas na forma de bibliotecas de expressão de gene. Os polinucleotídeos codificando as atividades de interesse são isolados de tais bibliotecas e introduzidos em uma célula hospedeira. A célula hospedeira é desenvolvida sob condições que promovam a recombinação e/ou reclassificação redutiva criando biomoléculas potencialmente ativas com atividades novas ou realçadas.
Os microorganismos dos quais os polinucleotídeos híbridos podem ser preparados incluem microorganismos procarióticos, tal como Eubacteria e Archaebacteria, e microorganismos eucarióticos inferiores tal como fungos, algumas algas e protozoários. Os polinucleotídeos podem ser isolados de amostras ambientais. O ácido nucléico pode ser recuperado sem cultivo de um organismo ou recuperado de um ou mais organismos de cultura. Em um aspecto, tais microorganismos podem ser extremófilos, tal como hipertermófilos, psicrófilos, psicrótrofos, halófilos, barófilos e acidófilos. Em um aspecto, os polinucleotídeos codificando as enzimas de fosfolipase isoladas de microorganismos extremofílicos são empregados para preparar as enzimas híbridas. Tais enzimas podem funcionar em temperaturas acima 100°C em, por exemplo, ventos térmicos de alto-mar e fontes de água quente terrestre, em temperaturas abaixo de 0°C em, por exemplo, águas árticas, no ambiente de sal saturado, por exemplo, do Mar Morto, em valores de pH em cerca de 0 em, por exemplo, depósitos de carvão e fontes de água quente ricas em enxofre geotérmico, ou em valores de pH maiores do que 11 em, por exemplo, lodo de despejo. Por exemplo, as fosfolipases clonadas e expressadas de organismos extremofílicos podem mostrar atividade elevada em toda uma ampla faixa de temperaturas e pHs.
Os polinucleotídeos selecionados e isolados como descrito aqui, incluindo pelo menos um ácido nucléico da invenção, são introduzidos em uma célula hospedeira adequada. Uma célula hospedeira adequada é qualquer célula que seja capaz de promover recombinações e/ou reclassificação redutiva. Os polinucleotídeos selecionados podem estar em um vetor que inclui seqüências de controle apropriadas. A célula hospedeira pode ser uma célula eucariótica mais elevada, tal como uma célula de mamífero, ou uma célula eucariótica inferior, tal como uma célula de levedura, ou preferivelmente, a célula hospedeira pode ser uma célula procariótica, tal como uma célula bacteriana. A introdução da constructo na célula hospedeira pode ser efetuada por transfecção de fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-Dextrano, ou eletroporação (Davis e similares, 1986).
Os hospedeiros apropriados exemplares incluem células bacteri-anas, tal como E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; células fúngi-cas, tal como levedura; células de inseto tal como Drosophila S2 e Spodop-tera Sf9; células de animais tal como CHO, COS ou Bowes melanoma; ade-novírus; e células de planta (veja, também, a descrição acima). A seleção de um hospedeiro apropriado para combinação e/ou reclassificação redutiva ou exatamente para expressão de proteína recombinante é suposta estar dentro do escopo daqueles versados na técnica dos ensinamentos nesta. Os sistemas de cultura de célula de mamífero que podem se empregados para recombinação e/ou reclassificação redutiva ou exatamente para expressão de proteína recombinante incluem, por exemplo, as cepas de COS-7 de fi-broblastos de rim de macaco, descrito em "SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants" (Gluzman, 1981), as cepas de célula C127, 3T3, CHO, HeLa e BHK. Os vetores de expressão de mamífero podem compreender uma origem de replicação, um realçador e promotor adequado, sítios de ligação de ribossoma necessários, sítio de poliadenila-ção, sítios doadores e receptores de união, seqüências de terminação trans-cricional, e seqüências não transcritas de flanqueação 5'. As seqüências de DNA derivadas da união SV40, e os sítios de poliadenilação podem ser empregados para fornecer os elementos genéticos não transcritos requeridos.
As células hospedeiras contendo os polinucleotídeos de interesse (para recombinação e/ou reclassificação redutiva ou exatamente para expressão de proteína recombinante) podem ser cultivadas em meios de nutrientes convencionais modificados quando apropriado para ativar os promotores, selecionar os transformantes ou amplificar os genes. As condições de cultura, tal como temperatura, pH e similares, são aqueles anteriormente empregados com a célula hospedeira selecionada para expressão, e serão evidentes aos técnicos ordinariamente versados. Os clones que são identificados como tendo a atividade de enzima especificada podem então ser se-qüenciados para identificar a seqüência de polinucleotídeo codificando uma enzima tendo a atividade realçada.
Em ouro aspecto, os métodos e ácidos nucléicos da presente invenção podem ser empregados para gerar novos polinucleotídeos para vias bioquímicas, por exemplo, vias de um ou mais óperons ou feixes de gene ou porções destes. Por exemplo, bactérias e muitos eucariotas têm um mecanismo coordenado para regular os genes cujos produtos estão envolvidos nos processos relacionados. Os genes são agrupados, em estruturas referidas como "feixes de gene", em um único cromossoma e são transcritos juntos sob o controle de uma única seqüência reguladora, incluindo um único promotor que inicia a transcrição do feixe completo. Desse modo, um feixe de gene é um grupo de genes adjacentes que são ou idênticos ou relaciona- dos, geralmente quanto a sua função. O DNA de feixe de gene pode ser isolado de organismos diferentes e ligado em vetores, particularmente vetores contendo as seqüências reguladoras de expressão que podem controlar e regular a produção de uma proteína detectável ou atividade de disposição relacionada com a proteína dos feixes de gene ligados. O uso de vetores que têm uma capacidade excepcionalmente grande para introdução de DNA exógeno é particularmente apropriado para uso com tais feixes de gene e é descrito através de exemplo aqui para incluir o f-fator (ou fator de fertilidade) de E. coli. Este f-fator de E. coli é um plasmídeo que afeta a transferência de alta freqüência dele mesmo durante a conjugação e é ideal para obter e estavelmente propagar fragmentos de DNA grandes, tal como feixes de gene de amostras microbianas misturadas. Os "fosmídeos", cosmídeos ou vetores de cromossomas artificiais bacterianos (BAC) podem ser empregados como vetores de clonagem. Esses são derivados de f-fator de E. coli que é capaz de estavelmente integrar grandes segmentos de DNA genômico. Quando integrado com DNA de uma amostra ambiental não cultivada misturada, isto torna possível obter grandes fragmentos genômicos na forma de uma "biblioteca de DNA ambiental" estável. Os vetores de cosmídeo foram originalmente designados para clonar e propagar os grandes segmentos de DNA genômico. A clonagem em vetores de cosmídeo é descrita em detalhes em Sambrook e similares, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Uma vez ligado em um vetor apropriado, dois ou mais vetores contendo feixes de gene de policetídeo sintase diferentes podem ser introduzidos em uma célula hospedeira adequada. As regiões de homologia de se-qüência parcial, divididas pelos feixes de gene promoverão processos que resultam em reorganização de seqüência resultando em um feixe de gene híbrido. O novo feixe de gene híbrido pode então ser avaliado para atividades realçadas não encontradas nos feixes de gene original.
Desse modo, em um aspecto, a invenção se refere a um método para produzir um polipeptídeo híbrido biologicamente ativo empregando um ácido nucléico da invenção e avaliando o polipeptídeo para uma atividade (por exemplo, atividade realçada) por: (1) introdução de pelo menos um primeiro polinucleotídeo (por exemplo, um ácido nucléico da invenção) em ligação operável e um segundo polinucleotídeo em ligação operável, o referido pelo menos primeiro polinucleotídeo e segundo polinucleotídeo dividindo pelo menos uma região da homologia de seqüência parcial, em uma célula hospedeira adequada; (2) desenvolvimento da célula hospedeira sob condições que promovam a reorganização da seqüência resultando em um polinucleotídeo híbrido em uma ligação operável; (3) expressar um polipeptídeo híbrido codificado pelo polinucleo-tídeo híbrido; (4) avaliação do polipeptídeo híbrido sob condições que promovem a identificação da atividade biológica desejada (por exemplo, atividade de fosfolipase realçada); e (5) isolamento de um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo híbrido.
Os métodos para avaliar para várias atividades de enzima são conhecidos por aqueles versado na técnica e são descritos em todo presente relatório descritivo. Tais métodos podem ser empregados quando isolando os polipeptídeos e polinucleotídeos da invenção. A reclassificação in vivo pode estar focada em processos "inter-moleculares" coletivamente referidos como "recombinação". Em bactérias, é geralmente observado como um fenômeno "dependente de RecA". A invenção pode contar com processo de recombinação de uma célula hospedeira para recombinar e reclassificar as seqüências, ou a capacidade da célula para mediar processos redutivos para diminuir a complexidade de seqüências quasi-repetidas na célula por deleção. Este processo de "reclassificação redutiva" ocorre em processo independente de RecA "intra-molecular". Desse modo, em um aspecto da invenção, empregando os ácidos nucléicos, os novos polinucleotídeos da invenção são gerados pelo processo de reclassificação redutiva. O método envolve a geração de constructos contendo seqüências consecutivas (seqüências de codificação originais), sua inserção em um vetor apropriado, e sua introdução subseqüente em uma célula hospedeira apropriada. A reclassificação das identidades moleculares individuais ocorre por processos combinatórios entre as seqüências consecutivas nas regiões de processamento de constructo de homologia, ou entre as unidades quasi-repetidas. O processo de reclassificação recombina e/ou reduz a complexidade e se estende das seqüências repetidas, e resulta na produção de novas espécies moleculares. Vários tratamentos podem ser aplicados para realçar a taxa de reclassificação. Esses podem incluir tratamento com luz ultra-violeta, ou produtos químicos de danificação de DNA, e/ou o uso de cepas de célula hospedeira exibindo níveis realçados de "instabilidade genética". Desse modo, o processo de reclassificação pode envolver recombinação homóloga ou a propriedade natural de seqüências quase-repetidas para direcionar sua própria evolução.
As seqüências repetidas ou "quasi-repetidas" desempenam um papel na instabilidade genética. As "quasi-repetições" são repetições que não estão restritas à sua estrutura de unidade original. As unidades quasi-repetidas podem estar presentes como uma disposição de seqüências em um construção; unidades consecutivas de seqüências similares. Uma vez ligadas, as junções entre as seqüências consecutivas se tornam essencialmente invisíveis, e a natureza quasi-repetitiva do constructo resultante é agora contínua no nível molecular. O processo de deleção que a célula realiza para reduzir a complexidade do construção resultante opera entre as se-qüências quasi-repetidas. As unidades quais-repetidas fornecem um repertório praticamente sem limite de modelos sob o quais os eventos de deslizamento podem ocorrer. Os constructos contendo as quasi-repetições desse modo efetivamente fornecem elasticidade molecular suficiente para que os eventos de deleção (e potencialmente inserção) possam ocorrer virtualmente em qualquer lugar nas unidades quasi-repetitivas. Quando as seqüências quasi-repetidas são todas ligadas na mesma orientação, por exemplo, da cabeça para a cauda ou vice-versa, a célula não pode distinguir unidades individuais. Conseqüentemente, o processo redutivo pode ocorrer em toda a seqüência. Em contraste, quando, por exemplo, as unidades são apresentadas da cabeça para cabeça, em vez da cabeça para cauda, a inversão esboça os pontos finais da unidade adjacente a fim de que a formação de de-leção favoreça a perda de unidades discretas. Desse modo, em um aspecto da invenção, as seqüêcias a serem reclassificadas estão na mesma orientação. A orientação aleatória de seqüências quasi-repetidas resultará na perda da eficiência de reclassificação, ao mesmo tempo em que a orientação consistente das seqüências oferecerá a eficiência superior. Entretanto, ao mesmo tempo em que ter poucas das seqüências contíguas na mesma orientação diminui a eficiência, ela pode ainda fornecer elasticidade suficiente para a recuperação efetiva de novas moléculas. Os constructos podem ser feitos com as seqüências quasi-repetidas na mesma orientação para permitir eficiência mais elevada.
As seqüências podem ser montadas em uma orientação da cabeça para cauda empregando qualquer de uma variedade de métodos, incluindo os seguintes: a) Iniciadores que incluem uma cabeça poli-A e uma cauda poli-T que, quando feitos de filamento único forneceríam orientação, podem ser utilizados. Isto é concluído tendo-se as primeiras poucas bases dos iniciadores feitos de RNA e em conseqüência RNase H facilmente removidos. b) Iniciadores que incluem os sítios de clivagem de restrição única podem ser utilizados. Os sítios múltiplos, uma bateria de seqüências únicas, e etapas de ligação e síntese repetidas seriam requeridos. c) As poucas bases internas do iniciador podem ser tioladas e uma exonuclease empregada para produzir moléculas apropriadamente caudadas. A recuperação das seqüências reclassificadas com a identificação dos vetores de clonagem com um índice repetitivo reduzido (RI). As seqüências de codificação reclassificadas podem então ser recuperadas por amplificação. Os produtos são reclonados e expressados. A recuperação dos vetores de clonagem com RI reduzido pode ser afetada por: 1) O uso de vetores somente de estavelmente mantidos quando o constructo é reduzido na complexidade. 2) A recuperação física dos vetores encurtados por procedimentos físicos. Neste caso, o vetor de clonagem seria recuperado empre- gando procedimentos de isolação de plasmídeo padrão e tamanho fraciona-do ou em gel de agarose, ou coluna com um corte de peso molecular baixo utilizando procedimentos padrão. 3) A recuperação de vetores contendo genes interrompidos que podem ser selecionados quando o tamanho de inserção diminui. 4) O uso de técnicas de seleção direta com um vetor de expressão e a seleção apropriada.
As seqüências de codificação (por exemplo, genes) de organismos relacionados podem demonstrar um grau elevado de homologia e codificar produtos de proteína muito diversos. Esses tipos de seqüências são particularmente úteis na presente invenção como quasi-repetições. Entretanto, este processo não está limitado a tais repetições quase idênticas. O seguinte é um método exemplar da invenção. As seqüências de ácido nucléico de codificação (quasi-repetições) são derivadas de três espécies (3), incluindo um ácido nucléico da invenção. Cada seqüência codifica uma proteína com um grupo distinto de propriedades, incluindo uma enzima da invenção. Cada das seqüências difere por um único ou alguns pares de base em uma única posição na seqüência. As seqüências quasi-repetidas são separadamente ou coletivamente amplificadas e ligadas em montagens aleatórias tal que todas permutações e combinações possíveis sejam disponíveis na população de moléculas ligadas. O número de unidade de quasi-repetição pode ser controlado pelas condições da montagem. O número médio das unidades de quasi-repetição em uma construção é definido como o índice repetitivo (RI). Uma vez formadas, as construções podem, ou não podem ser de tamanho fracionado em um gel de agarose de acordo com os protocolos publicados, inseridos em um vetor de clonagem, e transfectados em uma célula hospedeira apropriada. As células são então propagadas e "reclassificação redutiva" é efetuada. A taxa do processo de reclassificação redutiva pode ser estimulada pela introdução de danificação de DNA se desejado. Ou a redução em RI seja mediada pela formação de deleção entre as seqüências repetidas por um mecanismo "intra-molecular", ou mediada por eventos tipo recombinação através dos mecanismos "inter-molecular" é imaterial. O resultado final é uma reclassificação das moléculas em todas as combinações possíveis. Em um aspecto, o método compreende a etapa adicional de avaliação dos membros da biblioteca do grupo embaralhado para identificar os membros da biblioteca embaralhados individuais tendo a capacidade de ligar ou de outra forma interagir, ou catalisar uma reação particular (por exemplo, tal como domínio catalítico de uma enzima) com uma macro-molécula predeterminada, tal como por exemplo um receptor proteináceo, um oligossacarídeo, virion, ou outra estrutura ou composto predeterminado. Os polipeptídeos, por exemplo, fosfolipases, que são identificados de tais bibliotecas podem ser empregados para vários propósitos, por exemplo, os processos industriais descritos aqui e/ou podem ser submetidos a um ou mais ciclos adicionais de embaralhamento e/ou seleção.
Em outro aspecto, é suposto que antes ou durante a recombina-ção ou reclassificação, os polinucleotídeos gerados pelo método da invenção possam ser submetidos aos agentes ou processos que promovem a introdução de mutações nos polinucleotídeos originais. A introdução de tais mutações aumentaria a diversidade de polinucleotídeos e polipeptídeos híbridos resultantes codificados destes. Os agentes ou processos que promovem a mutagênese podem incluir, porém não estão limitados a: (+)-CC-1065, ou um análogo sintético tal como (+)-CC-1065-(N3-Adenina (Veja Sun e Hurley, (1992); uma adução de 4'-fluoro-4-aminobifenila N-acetilada ou desacetilada capaz de inibir a síntese de DNA (Veja, por exemplo, van de Poll e similares (1992)); ou uma adução de 4-aminobifenila N-acetilada ou desacetilada capaz de inibir a síntese de DNA (Veja, também, van de Poll e similares (1992), pp. 751-758); cromo trivalente, um sal de cromo trivalente, um hidrocarboneto aromático policíclico (PAH) adução de DNA capaz de inibir a replicação de DNA, tal como 7-bromometil-benz[a]antraceno ("BMA"), tris(2,3-dibromopropil)fosfato ("Tris-BP"), 1,2-dibromo-3-cloropropano ("DBCP"), 2-bromoacroleína (2BA), benzo[a]pireno-7,8-diidrodiol-9-10-epóxido ("BPDE"), um sal de halogênio de platino (II), N-hidróxi-2-amino-3-metilimidazo[4,5-f]-quinolina ("N-hidróxi-IQ"), e N-hidróxi-2-amino-1-metil-6-fenilimidazo[4,5-f]-piridina ("N-hidróxi-PhIP"). Os meios especialmente preferidos para retardar ou deter a amplificação de PCR consiste em luz UV (+)- CC-1065 e (+)-CC-1065-(N3-Adenina). Os meios particularmente abrangidos são aduções de DNA ou polinucleotídeos compreendendo as aduções de DNA dos polinucleotídeos ou grupo de polinucleotídeo, que pode ser liberado ou removido por um processo incluindo o aquecimento da solução compreendendo os polinucleotídeos antes do outro processamento.
Metodologias de Avaliação e Dispositivos de Monitoramento ''On-line'' Na prática dos métodos da invenção, uma variedade de aparelhos e metodologias pode ser empregada em conjunto com os polipeptídeos e ácidos nucléicos da invenção, por exemplo, avaliar os polipeptídeos para atividade de fosfolipase, avaliar os compostos como moduladores potenciais de atividade (por exemplo, potenciação ou inibição da atividade da enzima), para anticorpos que se ligam a um polipeptídeo da invenção, para ácidos nucléicos que hibridisam para um ácido nucléico da invenção, e similares. Suportes Sólidos de Enzima Imobilizada As enzimas de fosfolipase, fragmentos destes e ácidos nucléicos que codificam as enzimas e fragmentos podem ser unidos a um suporte sólido. Isto é geralmente econômico e eficiente no uso das fosfolipases em processos industriais. Por exemplo, uma associação ou coquetel de enzimas de fosfolipase (ou fragmentos ativos destes), que são empregadas em uma reação química específica, podem ser ligadas a um suporte sólido e embebidas em uma cuba do processo. A reação enzimática pode ocorrer. Em seguida, o suporte sólido pode ser absorvido da cuba, junto com as enzimas unidas a este, para uso repetido. Em uma modalidade da invenção, um ácido nucléico isolado da invenção é unido a um suporte sólido. Em outra modalidade da invenção, o suporte sólido é selecionado do grupo de um gel, uma resina, um polímero, uma cerâmica, um vidro, um microeletrodo e qualquer combinação destes.
Por exemplo, os suportes sólidos úteis nesta invenção incluem géis. Alguns exemplos dos géis incluem Sefarose, gelatina, glutaraldeído, glutaraldeído tratado com quitosana, albumina-glutaraldeído, quitosana-Xantano, gel toyopearl (polímero gel), alginato, alginato-polilisina, carragina, agarose, glioxil agarose, agarose magnética, dextran-agarose, hidrogel de poli(Sulfonato de Carbamoíla), hidrogel de BSA-PEG, polivinil álcool fosfori-lado (PVA), monoaminoetil-N-aminoetila (MANA), amino, ou qualquer combinação destes.
Outro suporte sólido útil da presente invenção são as resinas ou polímeros. Alguns exemplos de resinas ou polímeros incluem celulose, acri-lamida, náilon, raiom, poliéster, resina de permuta de ânion, AMBERLITE® XAD-7, AMBERLITE® XAD-8, AMBERLITE® IRA-94, AMBERLITE® IRC-50, polivinila, poliacrílico, polimetacrilato, ou qualquer combinação destes.
Outro tipo de suporte sólido útil na presente invenção é a cerâmica. Alguns exemplos incluem cerâmica não porosa, cerâmica porosa, SiO2, Al2O3. Outro tipo de suporte sólido útil na presente invenção é o vidro. Alguns exemplos incluem vidro não poroso, vidro poroso, vidro de aminopro-pila ou qualquer combinação destes. Outro tipo de suporte sólido que pode ser empregado é um microeletrodo. Um exemplo é uma magnetita revestida por polietilenoimina. As partículas grafíticas podem ser empregadas como um suporte sólido.
Outros suportes sólidos exemplares empregados para praticar a invenção compreendem os silicatos e produtos de terra diatomácea. Alguns exemplos incluem silicatos de magnésio e cálcio sintético CELITE® KENI-TE®, DIACTIV®, PRIMISIL®, DIAFIL® diatomitas e MICRO-CEL®, CALFLO®, SILASORB™, e CELKATE®. Outro exemplo de um suporte sólido é uma célula, tal como um eritrócito. Métodos de imobilização Existem muitos métodos que seriam conhecidos por alguém versado na técnica para imobilizar as enzimas e fragmentos destes, ou ácidos nucléicos, sobre um suporte sólido. Alguns exemplos de tais métodos incluem, por exemplo, geração de gotículas eletrostáticas, meios eletroquímicos, através de absorção, através de ligação covalente, através de reticulação, através de um processo ou reação química, através de encapsulação, através de captura, através de alginato de cálcio, ou através de poli (metacrilato de 2-hidroxietila). Outros métodos são descritos em Methods in Enzymology, Immobilized Enzimas and Cells, Part C. 1987. Academic Press. Edited by S. P. Colowick e N. O. Kaplan. Volume 136; e Immobilization of Enzimas and Cells. 1997. Humana Press. Edited by G. F. Bickerstaff. Series: Methods in Biotechnology, Edited by J. M. Walker.
Disposições Capilares As disposições capilares, tal como a GIGAMATRIX®, Diversa Corporation, San Diego, CA, podem ser empregadas nos métodos da invenção. Os polipeptídeos ou ácidos nucléicos da invenção podem ser imobilizados ou aplicados a uma disposição, incluindo disposições capilares. As disposições podem ser empregadas para avaliar ou monitorar bibliotecas de composições (por exemplo, moléculas pequenas, anticorpos, ácidos nucléi-cos, etc.) quanto a sua capacidade de ligar ou modular a atividade de um ácido nucléico ou um polipeptídeo da invenção. As disposições capilares fornecem outro sistema para contenção e avaliação das amostras. Por exemplo, um aparelho de avaliação de amostra pode incluir uma pluralidade de capilares formados em uma disposição de capilares adjacentes, onde cada capilar compreende pelo menos uma parede definindo um lúmen para reter uma amostra. O aparelho pode também incluir o material intersticial disposto entre os capilares adjacentes na disposição, e um ou mais indícios de referência formados no material intersticial. Um capilar para avaliar uma amostra, onde o capilar é adaptado para ser ligado em uma disposição de capilares, pode incluir uma primeira parede definindo um lúmen para reter a amostra, e uma segunda parede formada de um material de filtração, para filtrar a energia de excitação fornecida para o lúmen excitar a amostra.
Um polipeptídeo ou ácido nucléico, por exemplo, um ligando, pode ser introduzido em um primeiro componente em pelo menos uma porção de um capilar de uma disposição de capilar. Cada capilar da disposição capilar pode compreender pelo menos uma parede definindo o lúmen para reter o primeiro componente. Uma bolha de ar pode ser introduzida no capilar atrás do primeiro componente. Um segundo componente pode ser introduzido no capilar, onde o segundo componente é separado do primeiro componente pela bolha de ar. Uma amostra de interesse pode ser introduzida como um primeiro líquido rotulado com uma partícula detectável em um capilar de uma disposição de capilar, onde cada capilar da disposição capilar compreende pelo menos uma parede definindo um lúmen para reter o primeiro líquido e a partícula detectável, e onde a pelo menos uma parede é revestida com um material de ligação para ligar a partícula detectável a pelo menos uma parede. O método pode também incluir a remoção do primeiro líquido do tubo de capilar, onde a partícula detectável ligada é mantida no capilar, e introduzir um segundo líquido no tubo de capilar. A disposição de capilar pode incluir uma pluralidade de capilares individuais compreendendo pelo menos uma parede externa definindo o lúmen. A parede externa do capilar pode ser uma ou mais paredes fundidas entre si. Similarmente, a parede pode definir um lúmen que é cilíndrico, quadrado, hexagonal ou qualquer outra forma geométrica contanto que as paredes formem um lúmen para retenção de m líquido ou amostra. Os capilares da disposição capilar podem ser mantidos juntos em proximidade imediata para formar uma estrutura planar. Os capilares podem ser ligados juntos, sendo-se fundidos (por exemplo, onde os capilares são feitos de vidro), colado, ligados, ou pregados lado a lado. A disposição de capilar pode ser formada de qualquer número de capilares individuais, por exemplo, uma faixa de 100 a 4.000.000 capilares. Uma disposição de capilar pode formar uma placa de microtitulação tendo cerca de 100.000 ou mais capilares individuais ligados juntos.
Disposições, ou "BioChips" Os ácidos nucléicos ou polipeptídeos da invenção podem ser imobilizados ou aplicados a uma disposição. As disposições podem ser empregadas para avaliar ou monitorar as bibliotecas de composições (por exemplo, moléculas pequenas, anticorpos, ácidos nucléicos, etc.) quanto a sua capacidade de ligar ou modular a atividade de um ácido nucléico ou um polipeptídeo da invenção. Por exemplo, em um aspecto da invenção, um parâmetro monitorado é a expressão de transcrição de um gene de fosfolipase. Uma ou mais, ou todas as transcrições, de uma célula podem ser medidas por hibridização de uma amostra compreendendo transcrições da célula, ou, ácidos nucléicos representativos de ou complementares às transcri- ções de uma célula, por hibridização para ácidos nucléicos imobilizados em uma disposição, ou "biochip". Empregando-se uma "disposição" de ácidos nucléicos em um microchip, algumas ou todas as transcrições de uma célula podem ser simultaneamente quantificadas. Alternativamente, as disposições compreendendo ácido nucléico genômico podem também ser empregada para determinar a genótipo de um filamento recentemente construído feito pelos métodos da invenção. As "disposições de polipeptídeos" podem também ser empregado para simultaneamente quantificar uma pluralidade de proteínas. A presente invenção pode ser praticada com qualquer "disposição" conhecida, também referida como uma "microdisposição" ou "disposição de ácido nucléico" ou "disposição de polipeptídeo" ou "disposição de anticorpo" ou "biochip", ou variação destes. As disposições são genericamente uma pluralidade de "pontos" ou "elementos alvos", cada elemento alvo compreendendo uma quantidade definida de uma ou mais moléculas biológicas, por exemplo, oligonucleotídeos, imobilizados em uma área definida de uma superfície do substrato para ligação específica a uma molécula da amostra, por exemplo, transcrições de mRNA.
Na prática dos métodos da invenção, qualquer disposição conhecida e/ou método de preparação e uso de disposições pode ser incorporado em toda ou parte ou variações desta, como descrito, por exemplo, nas Patentes dos Estados Unidos Nos 6.277.628, 6.277.489, 6.261.776, 6.258.606, 6.054.270, 6.048.695, 6.045.996, 6.022.963, 6.013.440, 5.965.452, 5.959.098, 5.856.174, 5.830.645, 5.770.456, 5.632.957, 5.556.752, 5.143.854, 5.807.522, 5.800.992, 5.744.305, 5.700.637, 5.556.752, 5.434.049, veja também, por exemplo, WO 99/51773, WO 99/09217, WO 97/46313, WO 96/17958, veja também, por exemplo, Johnston (1998) Curr. Biol. 8:R171-R174; Schummer (1997) Biotechniques 23:1087-1092; Kern (1997) Biotechniques 23:120-124; Solinas-Toldo (1997) Genes, Chromosomes & Cancer 20:399-407; Bowtell (1999) Nature Genetics Supp. 21:25-32. Veja também os pedidos de patente dos Estados Unidos publicados Nos 20010018642; 20010019827; 20010016322; 20010014449; 20010014448; 20010012537; 20010008765.
Anticorpos e métodos de avaliação com base em anticorpo A invenção fornece anticorpos isolados e recombinantes que especificamente se ligam a uma fosfolipase da invenção. Esses anticorpos podem ser empregados para isolar, identificar, ou quantificar as fosfolipases da invenção ou polipeptídeos relacionados. Esses anticorpos podem ser empregados para inibir a atividade de uma enzima da invenção. Esses anticorpos podem ser empregados para isolar os polipeptídeos relacionados com aqueles da invenção, por exemplo, enzimas de fosfolipase relacionadas.
Os anticorpos podem ser empregados em imunoprecipitação, manchamento (por exemplo, FACS), colunas de imunoafinidade e similares. Se desejado, as seqüências de ácido nucléico codificando para antígenos específicos podem ser geradas por imunização seguida por isolação de polipeptídeo ou ácido nucléico, amplificação ou clonagem e imobilização de polipeptídeo em uma disposição da invenção.
Alternativamente, os métodos da invenção podem ser empregados para modificar a estrutura de um anticorpo produzido por uma célula a ser modificada, por exemplo, uma afinidade do anticorpo pode ser aumentada ou diminuída. Além disso, a capacidade de preparar ou modificar os anticorpos pode ser um fenótipo construído em uma célula pelos métodos da invenção.
Os métodos de imunização, produção e isolamento de anticorpos (policlonal e monoclonal) são conhecidos por aqueles versados na técnica e descritos na literatura de patente e científica, veja, por exemplo, Coli-gan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY (1991); Stites (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (7a ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA ("Stites"); Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (2a ed.) Academic Press, Nova Iorque, NY (1986); Kohler (1975) Nature 256:495; Harlow (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, New York. Os anticorpos também podem ser gerados in vitro, por exemplo, empregando sítio de ligação de anticorpo recombinante expressando as bibliotecas de tela de exibição de fago, além dos métodos in vivo tradicionais empregando animais. Veja, por exemplo, Hoogenboom (1997) Trends Biotechnol. 15:62-70; Katz (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:27-45.
Os polipeptídeos podem ser empregados para gerar anticorpos que se ligam especificamente aos polipeptídeos da invenção. Os anticorpos resultantes podem ser empregados em procedimentos de cromatografia de imunoafinidade para isolar ou purificar o polipeptídeo ou para determinar se o polipeptídeo está presente em uma amostra biológica. Em tais procedimentos, uma preparação de proteína, tal como um extrato, ou uma amostra biológica é contatado com um anticorpo capaz de especificamente se ligar a um dos polipeptídeos da invenção.
Em procedimentos de imunoafinidade, o anticorpo está ligado a um suporte sólido, tal como uma conta ou outra matriz de coluna. A preparação de proteína é colocada em contato com o anticorpo sob condições nas quais o anticorpo especificamente se ligue a um dos polipeptídeos da invenção. Após uma lavagem para remover as proteínas de ligação não especificamente, os polipeptídeos especificamente ligados são eluídos. A capacidade das proteínas em uma amostra biológica de se ligarem ao anticorpo pode ser determinada empregando qualquer de uma variedade de procedimentos familiares àqueles versados na técnica. Por exemplo, a ligação pode ser determinada por rotulação do anticorpo tal como um agente fluorescente, um rótulo enzimático, ou um radioisótopo. Alternativamente, a ligação do anticorpo à amostra pode ser detectada empregando um anticorpo secundário tendo um tal rótulo detectável neste. Os ensaios particulares incluem ensaios de ELISA, ensaios sanduíches, radioimu-noensaios, e Manchas do Oeste.
Os anticorpos policlonais gerados contra os polipeptídeos da invenção podem ser obtidos por injeção direta dos polipeptídeos em um animal ou administrando-se os polipeptídeos a um animal, por exemplo, um não-humano. O anticorpo desse modo obtido então ligará o polipeptídeo propriamente dito. Desta maneira, mesmo uma seqüência codificando somente um fragmento do polipeptídeo pode ser empregada para gerar anti- corpos que podem ser ligar ao polipeptídeo nativo inteiro. Tais anticorpos podem então ser empregados para isolar o polipeptídeo de células expressando aquele polipeptídeo.
Para preparação de anticorpos monoclonais, qualquer técnica que forneça anticorpos produzidos por culturas de cepa de célula contínua pode ser empregada. Os exemplos incluem a técnica de hibridoma, a técnica de trioma, a técnica de hibridoma de célula B humana, e a técnica de hibri-doma EBV (veja, por exemplo, Cole (1985) em Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96).
As técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia única (veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. 4.946.778) podem ser adaptadas para produzir anticorpos de cadeia única para os poli-peptídeos da invenção. Alternativamente, os camundongos transgênicos podem ser empregados para expressar anticorpos humanizados para esses polipeptídeos ou fragmentos destes.
Os anticorpos gerados contra os polipeptídeos da invenção podem ser empregados na avaliação de polipeptídeos similares de outros organismos e amostras. Em tais técnicas, os polipeptídeos do organismo são contatados com o anticorpo e aqueles polipeptídeos que especificamente se ligam ao anticorpo são detectados. Qualquer dos procedimentos descritos acima pode ser empregado para detectar a ligação do anticorpo.
Kits A invenção fornece kits compreendendo as composições, por exemplo, ácidos nucléicos, cassetes de expressão, vetores, células, polipep-tídeos (por exemplo, um kit tendo pelo menos uma fosfolipase da invenção) e/ou anticorpos (por exemplo, um kit tendo pelo menos um anticorpo da invenção). Os kits também podem conter material instrucional ensinando as metodologias e usos industriais da invenção, como descrito aqui.
Uso Médico e Industrial das Enzimas da Invenção A invenção fornece muitos usos industriais e aplicações médicas empregando polipeptídeos da invenção, por exemplo, uma fosfolipase e outras enzimas da invenção, por exemplo, fosfolipases A, B, C e D, patatinas, incluindo converter um fosfolipídeo não-hidratável para uma forma hidratável, desengomamento de óleo, processamento de óleos de plantas, peixe, algas, e similares, para designar exatamente algumas aplicações. Em qualquer desses usos industriais e aplicações médicas alternativas, uma enzima pode ser adicionada em uma ordem específica, por exemplo, fosfolipases com especificidades diferentes são adicionadas em uma ordem específica, por exemplo, uma enzima com atividade de hidrólise de PC e PE, é adicionada primeiramente (ou duas enzimas são adicionadas, uma com atividade de hidrólise de PC e a outra com atividade de hidrólise de PE), em seguida uma enzima com atividade de hidrólise de PI (por exemplo, atividade de PLC) é adicionada, ou qualquer combinação destes.
Qualquer ou todos os métodos da invenção podem ser empregados em uma "escala de processo", por exemplo, um refinamento ou processo de óleo em uma escala de cerca de 15.000; 25.000; 50.000; 75.000; ou 100.000 lbs de óleo refinado l/ dia até cerca de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ou mais milhões de lbs de óleo refinado/ dia.
Os métodos de uso de enzimas de fosfolipase em aplicações industriais são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a fosfolipase e métodos da invenção podem ser empregados para o processamento de gorduras e óleos como descrito, por exemplo, na Publicação do Pedido de Patente JP H6-306386, descrevendo a conversão de fosfolipídeos presentes nos óleos e gorduras em substâncias solúveis em água contendo grupos de ácido fos-fórico. A fosfolipase da invenção pode ser empregada para processar óleos de planta e fosfolipídeos tal como aqueles derivados de ou isolados de farelo de arroz, soja, canola, palma, caroço de algodão, milho, semente de palma, coco, amendoim, sésamo, açafroa. As fosfolipases da invenção podem ser empregadas para processar óleos essenciais, por exemplo, aqueles de óleos de semente de fruta, por exemplo, semente de uva, damasco, bor-ragem, etc. As fosfolipases da invenção podem ser empregadas para processar óleos e fosfolipídeos em diferentes formas, incluindo formas brutas, desengomadas, gomas, água de lavagem, argila, sílica, estoque de sabão, e similares. Os fosfolipídeos da invenção podem também ser empregados para processar óleos de fósforo elevados, óleos de peixe, óleos de animais, óleos de planta, óleos de algas, e similares. Em qualquer aspecto da invenção, a qualquer momento a fosfolipase C pode ser empregada, uma alternativa compreende o uso de uma fosfolipase D da invenção e uma fosfatase (por exemplo, empregando uma combinação de PLD/ fosfatase pra melhorar a produção em um óleo de fósforo elevado, tal como óleo de grão de soja).
As fosfolipases da invenção podem ser empregadas para processar e preparar óleos comestíveis, óleos de biodiesel, lipossomas para farmacêuticos e cosméticos, fosfolipídeos estruturados e lipídeos. As fosfolipases da invenção podem ser empregadas em uma extração de óleo. As fosfolipases da invenção podem ser empregadas para processar e preparar vários sabões.
Processamento de Óleos Comestíveis: Geração de 1,3-diacilglicerol (1,3 DAG) A invenção fornece processos empregando enzima(s) da invenção para preparar 1,3-diacilglicerol (1,3 DAG). Em um aspecto, uma fosfolipase C ou fosfolipase D mais uma fosfatase gera 1,2-diacilglicerol; isto melhora a produção de óleo durante o refinamento de óleo comestível. Quando empregado em um processo que inclui uma etapa de neutralização cáustica, por exemplo, como um auxiliar de refinamento cáustico, tanto quanto 70% do 1,2-diacilglicerídeo (1,2-DAG) passam por migração de acila e é convertido para 1,3-DAG. O 1,3-DAG possui benefícios à saúde aumentados e, portanto, o uso de PLC como um auxiliar de refinamento cáustico produz um óleo com valor nutricional aumentado. A invenção fornece processos empregando enzima(s) da invenção para preparar e processar óleos comestíveis, incluindo a geração de óleos comestíveis com quantidades aumentadas de 1,3-DAG. Os diacilglice-róis são compostos de ocorrência natural encontrados em muitos óleos comestíveis. Em um aspecto de um método da invenção, por exemplo, o processo de desengomamento de óleo, uma base (cáustica) causa a isomeriza-ção de 1,2-DAG, produzido por PLC, em 1,3-DAG que fornece um benefício à saúde nutricional em 1,2-DAG, por exemplo, o 1,3-DAG é queimado como energia ao invés de ser armazenado como gordura (como é 1,2-DAG). Adicionando-se o PLC na extremidade frontal do processo de refinamento cáustico (e o ácido e cáustico subseqüentemente), os métodos da invenção geram um nível elevado de 1,3-DAG (diminuindo 1,2-DAG). Nutricionalmente, 1.3- DAG é melhor para você do que 1,2-DAG. Em aspectos alternativos, a invenção compreende um processo de desengomamento de óleo empregando uma PLC da invenção, por meio da qual o produto de óleo desengo-mado final contém não menos do que 0,5%, 1,0%, 2,0% ou 3,0% ou mais 1.3- DAG.
Desse modo, a invenção fornece um processo para a preparação (através de interesterificação) um óleo refinado (por exemplo, um óleo de diacilglicerol), incluindo óleos comestíveis, contendo níveis aumentados de 1,3-diacilglicerol (1,3-DAG), por exemplo, como ilustrado no Exemplo 13, onde uma fosfolipase, tal como uma enzima da invenção, é "carregada frontalmente" ou adicionada antes da adição de ácido ou cáustico. A geração por hidrólise enzimática de um DAG de um triglicerídeo gera por interesterifi-cação 1,3 DAG de 1,2 DAG. O óleo comestível compreendendo 1,3 DAG mostra efeitos metabólicos diferentes comparados com os óleos comestíveis convencionais. As diferenças nas vias metabólicas entre 1,3 DAG e ou 1,2 DAG ou triglicerídeos permite que uma maior porção de ácidos graxos de 1,3 diacilglicerol seja queimada como energia ao invés de ser armazenada como gordura. Estudos clínicos têm mostrado que o consumo regular de óleo DAG como parte de uma dieta sensível pode ajudar os indivíduos a manter seu peso corporal e gordura do corpo. Além disso, o metabolismo de 1,3 DAG reduz a circulação dos triglicerídeos pós-refeição na corrente san-güínea. Uma vez que a obesidade e os lipídeos no sangue elevados estão associados como fatores de risco para doenças crônicas incluindo doença cardiovascular e diabete Tipo II, essas condições saudáveis relacionadas com o estilo de vida podem ser confrontadas de uma maneira benéfica com o consumo regular de óleos DAG. O consumo de óleo compreendendo DAG pode ocorrer através de uma variedade de meios. Desse modo, em um aspecto, a invenção fornece um processo empregando uma enzima da invenção para preparar um alimento, por exemplo, uma mercadoria assada tendo níveis aumentados de 1,3-DAG diacilglicerol e mercadorias assadas compreendendo óleos de dia-cilglicerila. Em um aspecto, as mercadorias assadas são biscoitos, bolos e mercadorias assadas similares.
Em modalidades alternativas, a combinação de enzimas que pode ser empregada nos métodos da invenção, incluindo o processamento de óleos comestíveis, inclui (onde uma, várias, ou todas as enzimas na combinação compreendem uma enzima da presente invenção): o PLC + PI-PLC + PLA (PLA adicionado após a conclusão de reações de PLC); o PLD + fosfatase + PI-PLC seguido por PLA; ou, o PLC ou (PLC + PI-PLC) + PLA específico para ácido fosfatídico (todas as enzimas adicionadas juntas ou seqüencialmente).
Desengomamento de óleo e processamento de óleo vegetal As enzimas da invenção (por exemplo, polipeptídeos da invenção tendo lipase, fosfolipase, esterase e/ou glicosidase ou atividade equivalente) podem ser empregadas em várias etapas do processamento do óleo vegetal, tal como na extração de óleo vegetal, particularmente, na remoção de "gomas de fosfolipídeo" em um processo chamado "desengomagem de óleo".
Os processos da invenção podem ser empregados em uma "escala de processo", por exemplo, em uma escala de cerca de 15.000; 25.000; 50.000; 75.000; ou 100.000 lbs de óleo refinado/ dia até cerca de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ou mais milhões de lbs de óleo refinado/ dia.
Em um aspecto, a invenção fornece o processo de desengoma-mento do óleo compreendendo o uso de uma fosfolipase da invenção, por exemplo, uma PLC da invenção. Em um aspecto, o processo também compreende a adição de outra fosfolipase (que pode também ser uma fosfolipase da invenção), por exemplo, outra PLC, uma PLA, uma PLB, uma PLB ou uma patatina da invenção, ou uma enzima (que pode também ser uma enzima da invenção) tendo uma atividade de lisofosfolipase-transacilase (LPTA) ou atividade de lisofosfolipase (LPL) e lisofosfolipase-transacilase (LPTA), ou uma combinação destes, e/ou uma fosfolipase tipo patatina (que pode também ser uma enzima da invenção). Em um aspecto, todas as enzimas são adicionadas juntas, ou, alternativamente, as enzimas são adicionadas em uma ordem específica, por exemplo, a adição de PLC é seguida por adição de PLA e/ou patatina; ou, uma enzima ou enzimas da invenção tendo atividade de PC e PE adicionada primeiro, em seguida PI PLC adicionado segundo.
Em um aspecto, este processo fornece uma melhora na produção como um resultado do tratamento de fosfolipase (por exemplo, PLC da invenção). Em um aspecto, este processo fornece uma diminuição adicional do conteúdo de fósforo do óleo como um resultado do tratamento de fosfoli-pase (por exemplo, PLA da invenção).
Em um aspecto, a invenção fornece processos compreendendo o uso de uma fosfolipase da invenção, por exemplo, uma PLC da invenção, para reduzir a massa de goma e aumentar o ganho de óleo neutro (triglicerí-deo) através da captura de óleo reduzida. Em um aspecto, a invenção fornece processos compreendendo o uso de uma fosfolipase da invenção, por exemplo, uma PLC da invenção, para aumentar os óleos neutros e produção de diacilglicerol (DAG) para contribuir com a fase de óleo. Em aspectos alternativos, os processos da invenção (por exemplo, processos de desengomamento) podem compreender uma ou mais outras enzimas tal como uma protease, uma amilase, uma lipase, uma cutinase, outras fosfolipase (incluindo, por exemplo, uma enzima da invenção), uma carboidrase, uma celulase, uma pectinase, uma mananase, uma arabinase, uma galactanase, uma xilanase, uma oxidase, por exemplo, uma lactase, e/ou uma peroxidase, ou polipeptídeos com atividade equivalente, ou uma combinação destes.
As fosfolipases da invenção podem ser empregadas em várias etapas de processamento de óleo vegetal, tal como em extração de óleo vegetal, particularmente, na remoção de "gomas de fosfolipídeo" em um processo chamado "desengomamento de óleo" como descrito acima. A inven- ção fornece método para o processamento de óleos vegetais de várias fontes, tal como farelo de arroz, soja, semente de colza, amendoim e outras nozes, sésamo, açafroa, palma e milho. Os métodos podem ser empregados em conjunto com processos com base na extração com hexano, com refinamento subseqüente dos extratos brutos para os óleos comestíveis, incluindo o uso dos métodos e enzimas da invenção. A primeira etapa na seqüência de refinamento é o então chamado processo de "desengomamen-to", que serve pra separar os fosfatídeos pela adição de água. O material precipitado por desengomamento é separado e ainda processado para misturas de lecitinas. As lecitinas comerciais, tal como lecitina de soja e lecitina de açafroa, são materiais semi-sólidos ou muito viscosos. Elas consistem em uma mistura de lipídeos polares, principalmente fosfolipídeos, e óleo, principalmente triglicerídeos.
As fosfolipases da invenção podem ser empregadas em qualquer procedimento de "desengomamento", incluindo desengomamento com água, desengomamento de óleo ALCON (por exemplo, para soja), desengomamento de safinco, "super desengomamento", desengomamento de UF, desengomamento de TOP, uni- desengomamento, desengomamento seco e desengomamento de ENZYMAX®. Veja, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos Nos. 6.355.693; 6.162.623; 6.103.505; 6.001.640; 5.558.781; 5.264.367. Vários procedimentos de "desengomamento" incorporados pelos métodos da invenção são descritos em Bockisch, M. (1998) In Fats and Oils Handbook, The extraction of Vegetable Oils (Chapter 5), 345-445, AOCS Press, Champaign, Illinois. As fosfolipases da invenção podem ser empregadas na aplicação industrial de desengomamento enzimático de óleos de triglicerídeo como descrito, por exemplo, em EP 513 709.
Em um aspecto, as fosfolipases da invenção são empregadas para tratar óleos vegetais, por exemplo, óleos brutos, tal como farelo de arroz, soja, canola, flor e similares. Em um aspecto, isto melhora a eficiência do processo de desengomamento. Em um aspecto, a invenção fornece métodos para o desengomamento enzimático sob condições de água reduzida, por exemplo, na faixa dentre cerca de 0,1 % a 20 % de água, ou, 0,5% a 10% de água. Em um aspecto, isto resulta na separação melhorada de uma fase pesada da fase de óleo durante a centrifugação. A separação melhorada dessas fases pode resultar na remoção mais eficiente de fosfolipídeos do óleo, incluindo igualmente óleos hidratáveis e não-hidratáveis. Em um aspecto, isto pode produzir uma fração de goma que contenha menos óleo neutro capturado (triglicerídeos), desse modo melhorando a produção total de óleo durante o processo de desengomamento.
Em um aspecto, as fosfolipases da invenção, por exemplo, um polipeptídeo tendo atividade de PLC, são empregadas para tratar óleos (por exemplo, óleos vegetais, incluindo óleos brutos, tal como farelo de arroz, soja, canola, flor e similares), por exemplo, em processos de desengoma-mento, para reduzir a massa de goma e aumentar o ganho de óleo neutro através da captura de óleo reduzida. Em um aspecto, as fosfolipases da invenção, por exemplo, um polipeptídeo tendo atividade de PLC, são empregadas para produção de diacilglicerol (DAG) e para contribuir com a fase de óleo.
As fosfolipases da invenção podem ser empregadas na aplicação industrial de desengomamento enzimático como descrito, por exemplo, em CA 1102795, que descreve um método para isolar os lipídeos polares de lipídeos de cereal pela adição de pelo menos 50% em peso de água. Este método é um desengomamento modificado no sentido que utiliza o princípio de adicionar água a uma mistura de óleo bruto.
Em um aspecto, a invenção fornece processos enzimáticos compreendendo o uso de fosfolipases da invenção (por exemplo, uma PLC) compreendendo hidrólise de fosfolipídeos hidratados em óleo em uma temperatura de cerca de 20oC a 40oC, em um pH alcalino, por exemplo, um pH de cerca de pH 8 a pH 10, empregando um tempo de reação de cerca de 3 a 10 minutos. Isto pode resultar em menos do que 10 ppm de níveis de fósforo de óleo final. A invenção também fornece processos enzimáticos compreendendo o uso de fosfolipases da invenção (por exemplo, uma PLC) compreendendo hidrólise de fosfolipídeos hidratáveis e não-hidratáveis em óleo em uma temperatura de cerca de 50oC a 60oC, em um pH levemente abaixo do neutro, por exemplo, de cerca de pH 5 a pH 6,5, empregando um tempo de reação de cerca de 30 a 60 minutos. Isto pode resultar em menos do que 10 ppm de níveis de fósforo finais.
Em um aspecto, a invenção fornece processos enzimáticos que utilizam uma enzima de fosfolipase C para hidrolisar uma ligação de fosfoés-ter de glicerila e desse modo possibilitar o retorno da porção de diacilglicerí-deo do fosfolipídeos de volta para o óleo, por exemplo, um óleo vegetal, peixe ou algas (um "auxiliar de refinamento cáustico de fosfolipase C (PLC)"); e, reduz o conteúdo de fosfolipídeo em uma etapa de desengomamento para níveis baixos o suficiente para óleos de fósforo elevados para serem fisicamente refinados (um "auxiliar de desengomamento de fosfolipase C (PLC)"). Os dois métodos podem gerar valores diferentes e têm aplicações alvo diferentes.
Em vários processos exemplares da invenção, várias etapas distintas compõem o processo de desengomamento precedendo os processos de refinamento de desodorização e branqueamento do núcleo. Essas etapas incluem aquecimento, mistura, conservação, separação e secagem. Seguinte a etapa de aquecimento, a água e muitas vezes o ácido são adicionados e misturados para permitir que a "goma" de fosfolipídeo insolúvel aglomere em partículas que possam ser separadas. Ao mesmo tempo em que a água separa muito dos fosfatídeos no desengomamento, as porções dos fosfolipídeos são fosfatídeos não-hidratáveis (NHPs) presentes como sais de cálcio ou magnésio. Os processos de desengomamento direcionam essas NHPs pela adição de ácido. Seguinte a hidratação de fosfolipídeos, o óleo é misturado, mantido, e separado por centrifugação. Finalmente, o óleo é secado e armazenado, embarcado ou refinado, como ilustrado, por exemplo, na figura 6. As gomas resultantes são ou processadas também para produtos de lecitina ou adicionadas de volta na refeição.
Em vários processos exemplares da invenção os níveis de fósforo são reduzidos baixos o suficiente para o refinamento físico. O processo de separação pode resultar em perdas de produção potencialmente mais elevadas do que o refinamento cáustico. Adicionalmente, os processos de de- sengomamento podem gerar produtos residuais que não podem ser vendidos como lecitina comercial, veja, por exemplo, figura 7 para um processo de desengomamento exemplar para óleos fisicamente refinados. Portanto, esses processos não têm alcançado uma parte significante do mercado e os processos de refinamento cáustico continuam a dominar a indústria para farelo de arroz, soja, canola, e açafroa. Nota-se, entretanto, que a enzima de fosfolipase C empregada em um processo de desengomamento especial diminuiria a formação de goma e retornaria a porção de diglicerídeo do fosfo-lipídeo de volta para o óleo.
Em um aspecto, a invenção fornece métodos empregando uma PLC da invenção na fração da goma. Em um aspecto deste método, o óleo é adicionado ao óleo bruto para criar uma emulsão que resulta no movimento da fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina e fosfatidilinositol na fase aquosa (desengomamento com água). Seguinte a centrifugação, esses fosfolipídeos são os componentes principais da fração de goma aquosa. Os fosfolipídeos na fração de goma podem ser tratados com fosfolipase C ou fosfolipase D mais fosfatase (ou outras combinações, observadas abaixo) para gerar diacilglicerol (DAG) e um éster de fosfato. Neste ponto, o DAG pode ser extraído dos outros componentes da goma e tratados com uma lipase sob condições adequadas para a transesterificação da DAG para produzir um triacil-glicerol desejado (lipídeo estruturado).
Em outro aspecto, a maioria do 1,2-DAG pode ser convertida para 1,3-DAG aumentando-se o pH da goma seguinte à reação de PLC, por exemplo, por adição cáustica. O 1,3-DAG pode então ser extraído da goma e reagido com uma lipase sob as condições apropriadas para transesterificar o 1,3-DAG na posição sn2 para criar o triacilglicerol estruturado desejado.
Em aspectos alternativos, os ácidos graxos empregados na reação de transesterificação podem vir de uma variedade de fontes incluindo ácidos graxos livres encontrados no óleo bruto.
Em um aspecto, os fosfolipídeos de desengomamento com água são empregados em combinação com uma PLC da invenção para criar os lipídeos estruturados. O óleo de desengomamento por água pode ser expos- to a uma PLC e/ou PLD (ou ambas podem ser enzimas da invenção) mais fosfatase ou uma dessas combinações seguido por PLA (pode ser uma enzima da invenção) para reduzir o fósforo ao nível adequado para refinamento físico ou cáustico.
Nas modalidades alternativas, a combinação de enzimas que podem ser empregadas nos métodos da invenção, incluindo esses processos de desengomamento, incluem (onde uma, várias ou todas as enzimas na combinação compreendem uma enzima da presente invenção): o PLC + PI-PLC + PLA (PLA adicionado após a conclusão das reações de PLC); o PLD + fosfatase + PI-PLC seguido por PLA; ou, o PLC ou (PLC + PI-PLC) + PLA específico para ácido fosfatídico (todas as enzimas adicionadas juntas ou seqüencialmente).
Refinamento Cáustico A invenção fornece processos empregando fosfolipases (incluindo enzimas da invenção) em refinamento cáustico, onde as enzimas são empregadas como auxiliares de refinamento cáustico. Em aspectos alternativos, uma PLC ou PLD e/ou a fosfatase são empregados nos processos como em gotas, ou antes, durante ou após um processo de refinamento de neutralização cáustica (refinamento ou contínuo ou de batelada). A quantidade de enzima adicionada pode variar de acordo com o processo. O nível de água empregado no processo pode ser baixo, por exemplo, cerca de 0,5 a 5%. Alternativamente, cáustico é para ser adicionado ao processo múltiplas vezes. Além disso, os processos podem ser realizados em diferentes temperaturas (25oC a 70oC), com diferentes ácidos ou cáusticos, e em pH variante (4-12). As soluções concentradas de cáustico, por exemplo, mais concentradas do que o padrão industrial de 11%, para diminuir a massa da goma, podem ser empregadas. Em aspectos alternativos, a solução concentrada de cáustico é entre cerca de 12% e 50% concentrada, por exemplo, cerca de 20%, 30%, 40%, 50%, ou 60% ou mais concentrada.
Em um aspecto, uma enzima de fosfolipase C da invenção hidrolisa um fosfatídeo em uma ligação de fosfoéster de glicerila para gerar um composto de fosfato solúvel em água e diglicerídeo. O fosfatídeo hidrolisado se move para a faz aquosa, deixando o diglicerídeo na fase de óleo, como ilustrado na figura 8. Um objetivo do "Auxiliar de Refinamento Cáustico" de PLC é converter as gomas de fosfolipídeo formadas durante a neutralização em um diacilglicerídeo que migrará de volta para dentro da fase de óleo. Em contraste, um objetivo do "Auxiliar de Desengomamento de PLC" é reduzir os fosfolipídeos no óleo bruto para um equivalente de fósforo de menos do que 10 partes por milhão (ppm).
Os ácidos que podem ser empregados em um processo de refinamento cáustico incluem, porém não estão limitados a, ácido fosfórico, as-córbico, sulfúrico, maléico, clorídrico e/ou acético. Os ácidos são empregados para hidratar os fosfolipídeos não-hidratáveis. Os cáusticos são empregados para neutralizar os ácidos graxos livres. Alternativamente, as fosfolipases, ou mais particularmente uma PLC ou uma PLD e uma fosfatase, são empregadas para purificação de fitoesteróis da goma / estoque de sabão.
Uma modalidade alternativa da invenção para adicionar fosfolipase antes do refinamento cáustico é expressar a fosfolipase em uma planta. Em outra modalidade, a fosfolipase é adicionada durante o esmagamento da planta, sementes ou outras partes da planta. Alternativamente, a fosfolipase é adicionada seguinte ao esmagamento, porém antes do refinamento (isto é, em recipientes de conservação). Além disso, a fosfolipase é adicionada como um pré-tratamento de refinamento, com ou sem ácido.
Outra modalidade da invenção, já descrita, é para adicionar a fosfolipase durante um processo de refinamento cáustico. Neste processo, os níveis de ácido e cáustico são variados dependendo do nível de fósforo e do nível de ácido graxos livres. Além disso, as amplas faixas de temperatura e pH são empregadas no processo, dependendo do tipo de enzima empregado.
Em outra modalidade da invenção, a fosfolipase é adicionada após o refinamento cáustico (Fig. 9). Em um caso, a fosfolipase é adicionada em um misturador intenso ou em um misturador de retenção, antes da separação. Alternativamente, a fosfolipase é adicionada seguinte à etapa de aquecimento. Em outra modalidade, a fosfolipase é adicionada na etapa de centrifugação. Em uma modalidade adicional, a fosfolipase é adicionada ao estoque de sabão. Alternativamente, a fosfolipase é adicionada à água de lavagem. Em outro caso, a fosfolipase é adicionada às etapas e desodorização e/ou branqueamento.
Em um aspecto, uma fosfolipase, por exemplo, uma enzima de fosfolipase C da invenção hidrolisará o fosfatídeo de ambos fosfolipídeos hidratáveis e não-hidratáveis em óleos desengomados e brutos neutralizados antes do branqueamento e desodorização. Os processos de "refinamento cáustico" da invenção são ilustrados na figura 9 e figura 13. A figura 9 inclui tempos, temperatura e pHs exemplares para o misturador estático (30 a 60 minutos, 50 a 60oC, pH 5 a 6,5) e misturador de retenção (3 a 10 minutos, 20 a 40oC). A enzima alvo pode ser aplicada como um produto em gotas no processo de neutralização cáustica existente, como ilustrado na figura 9. Neste aspecto, a enzima não será requerida suportar níveis de pH extremos se ela for adicionada após a adição de cáustico. Como ilustrado na figura 13 (um processo exemplar de "carregamento frontal" da enzima), qualquer fosfolipase, incluindo, por exemplo, uma fosfolipase da invenção, tal como uma PLC, PLB, PLA e/ou PLC, pode ser empregada em um processo de desen-gomamento de óleo bruto, como descrito, por exemplo, em Bailey's Industrial Oil & Fat Products v.4 (ed. Y. H. Hui). A figura 14 e figura 15 ilustram as variações do método da invenção onde duas ou três tapas de centrifugação, respectivamente, são empregadas no processo, que pode ser empregado para processar qualquer óleo, por exemplo, um óleo vegetal tal como óleo de soja bruto, como mostrado na figura. O método exemplar da figura 15 tem uma etapa de centrifugação antes do refinamento cáustico (além de uma etapa de centrifugação após o refinamento cáustico e antes da lavagem com água, e, após a lavagem com água), ao mesmo tempo em que o método exemplar da figura 14 não tem uma etapa de centrifugação antes do refinamento cáustico. figura 16 ilustra outra variação exemplar deste processo empregando tratamento com ácido e tendo uma etapa de centrifugação antes de uma etapa de desengomamento; este processo exemplar pode ser empregado para processar qualquer óleo, por exemplo, um óleo vegetal, tal como um óleo de soja bruto, como mostrado na figura.
Em um aspecto, uma fosfolipase da invenção possibilita o fósforo ser removido aos níveis baixos aceitáveis n refinamento físico. Em um aspecto, uma PLC da invenção hidrolisará o fosfatídeo de ambos fosfolipídeos hidratáveis e não-hidratáveis em óleos brutos antes do branqueamento e desodorização. A enzima alvo pode ser aplicada como um produto em gotas em uma operação de desengomamento existente, veja, por exemplo, figura 10. Determinada a mistura sub-ideal no equipamento comercial, é provável que o ácido seja requerido para levar os fosfolipídeos não-hidratáveis em contato com a enzima na interface de óleo/ água. Portanto, em um aspecto, uma PLC estável por ácido da invenção é empregada.
Em um aspecto, um processo Auxiliar de Desengomamento de PLC da invenção pode eliminar a perda em uma, ou todas as três, áreas observadas na Tabela 2. As perdas associadas em um processo de PLC podem ser estimadas ser cerca de 0,8% versus 5,2% em uma base de massa devido à remoção do fosfatídeo.
Tabela 2: Perdas Designadas por Produtos PLC
Os benefícios potenciais adicionais deste processo da invenção incluem os seguintes: ♦ Absorventes reduzidos - menos absorvente requerido com fósforo mais reduzido (< 5 ppm) ♦ Uso menor de produto químico - menos custos de processamento e produto químico associado com a hidratação de fosfolipídeos não- hidratáveis ♦ Menor geração de resíduos - menos água requerida para remo- ver o fósforo do óleo.
Os óleos processados (por exemplo, "desengomado") pelos métodos da invenção incluem óleos de sementes de plantas, por exemplo, óleo de soja, óleo de semente de colza, óleo de farelo de arroz, e óleo de açafroa. Em um aspecto, o "Auxiliar de Refinamento Cáustico de PLC" da invenção pode economizar 1,2% sobre os processos de refinamento cáustico existentes. A aplicação do auxiliar de refinamento trata o óleo de soja que foi desengomado para lecitina e essas são também excluídas dos cálculos de valor/ carga.
Os rótulos de desempenho dos processos da invenção podem variar de acordo com as aplicações e mais especificamente com o ponto da adição de enzima, veja Tabela 3.
Tabela 3: Alvos de Desempenho por Aplicação Outros processos que podem ser empregados com uma fosfolipase da invenção, por exemplo, uma fosfolipase Ai pode converter os fosfolipídeos nativos não-hidratáveis para uma forma hidratável. Em um aspecto, a enzima é sensível ao calor. Isto pode ser desejável, uma vez que aquecendo o óleo pode destruir a enzima. Entretanto, a reação de desengomamento deve ser ajustada para pH 4-5 e 60°C para acomodar esta enzima. Em 300 Unidades/kg de dosagem de saturação de óleo, este processo exemplar é bem-sucedido em tomar o conteúdo de fósforo de óleo desen-gomado com água anteriormente até <10 ppm P. As vantagens podem ser conteúdo H2O diminuído e economias resultantes no uso, manipulação e resíduos. A Tabela 4 lista aplicações exemplares para usos industriais para enzimas da invenção: Tabela 4: Aplicação Exemplar Além desses vários processos de "desengomamento", as fosfoli-pases da invenção podem ser empregadas em qualquer etapa de processamento de óleo vegetal. Por exemplo, as enzimas de fosfolipase da invenção podem ser empregadas no lugar de PLA, por exemplo, fosfolipase A2, em qualquer etapa de processamento de óleo vegetal. Os óleos que são "processados" ou "desengomados" nos métodos da invenção incluem óleos de soja, óleos de semente de colza, óleos de milho, óleos de semente de palma, óleos de canola, óleos e açafroa, óleos de sésamo, óleos de amendoim, óleo de farelo de arroz, e similares. Os produtos principais deste processo, incluem triglicerídeos.
Em um processo exemplar, quando a enzima é adicionada e reagida com um óleo bruto, a quantidade de fosfolipase empregada é de cerca de 10 -10,000 unidades, ou, alternativamente, cerca de, 100-2,000 unidades, por 1 kg de óleo bruto. O tratamento de enzima é conduzido durante 5 minutos a 10 horas em uma temperatura de 30°C a 90°C, ou, alternativamente, cerca de 40°C a 70°C. As condições podem variar dependendo da temperatura ideal da enzima. A quantidade de água adicionada para dissolver a enzima é 5 -1.000 partes em peso por 100 partes em peso de óleo bruto, ou alternativamente, cerca de, 10 a 200 partes em peso por 100 partes em peso de óleo bruto.
Na conclusão de tal tratamento de enzima, o líquido da enzima é separado com um meio apropriado tal como um separador centrífugo, e o óleo processado é obtido. Os compostos contendo fósforo produzido por decomposição de enzima de substâncias gomosas e um tal processo, são praticamente todos transferidos na fase aquosa e removidos da fase de óleo. Na conclusão do tratamento de enzima, se necessário, o óleo processado pode ser adicionalmente lavado com água e ácido orgânico ou inorgânico tal como, por exemplo, ácido acético, ácido cítrico, ácido fosfórico ácido sucíni-co e ácidos equivalentes, ou com soluções de sal.
Em um processo exemplar para desengomamento por ultra-filtração, a enzima é ligada a um filtro ou a enzima é adicionada a um óleo antes da filtração ou a enzima é empregada para periodicamente limpar os filtros.
Em um processo exemplar para um auxiliar de refinamento mediado por fosfolipase, a água e a enzima são adicionadas ao óleo bruto (por exemplo, óleo vegetal brutol). Em um aspecto, uma PLC ou uma PLD da invenção e uma fosfatase são empregadas no processo. Em refinamento físico mediado por fosfolipase, o nível e água pode ser baixo, isto é, 0,5 - 5% e o tempo do processo deve ser curto (menos do que 2 horas, ou, menos do que 60 minutos, ou, menos do que 30 minutos, ou, menos do que 15 minutos, ou, menos do que 5 minutos). O processo pode ser executado em diferentes temperaturas (25oC a 70oC), empregando diferentes ácidos e/ou cáusticos, em diferentes pHs (por exemplo, 3-10).
Em aspectos alternativos, o desengomamento com água é realizado primeiro para coletar a lecitina por centrifugação e em seguida PLC ou PLC e PLA da invenção é adicionada para remover os fosfolipídeos não-hidratáveis (o processo deve ser realizado em baixas concentrações de água). Em outro aspecto o desengomamento com água, do óleo bruto para menos do que 10 ppm (óleos comestíveis) e refinamento físico subseqüente (menos do que 50 ppm para biodiesel), é realizado. Em um aspecto, um emulsificante é adicionado e/ou o óleo bruto é submetido a um misturador intenso para promover a mistura. Alternativamente, um desmembrador de emulsão é adicionado e/ou o óleo bruto é aquecido para promover a separação da fase aquosa. Em outro aspecto, um ácido é adicionado para promover a hidratação de fosfolipídeos não-hidratáveis. Adicionalmente, as fosfoli-pases podem ser empregadas para mediar a purificação de fitosteróis da goma/estoque de sabão.
Em um aspecto, a invenção fornece composições e métodos (que podem compreender o uso de fosfolipases da invenção) para o desen-gomamento de óleo compreendendo empregar quantidades variantes de ácido e base sem preparar estoque de sabão. Empregando este aspecto da invenção para desengomamento de óleo, o ácido (incluindo fosfórico e/ou cítrico) pode ser empregado para hidratar os fosfolipídeos não-hidratáveis em óleos de fósforo elevado (incluindo, soja, canola, e açafroa). Uma vez que os fosfolipídeos são hidratados, o pH da fase aquosa pode ser aumentado empregando adição de cáustico: a quantidade de cáustico adicionada pode criar um pH favorável para a atividade da enzima porém não resultará na formação de uma fração de estoque de sabão significante no óleo. Devi- do a um estoque de sabão não ser formado, os ácidos graxos livres no óleo podem ser removidos a jusante, seguinte a etapa de desengomamento, durante o branqueamento e desodorização.
As enzimas da invenção são empregadas para melhorar a extração de óleo e desengomamento de óleo (por exemplo, óleos vegetais). Em um aspecto, uma PLC da invenção e pelo menos um degradante da parede celular da planta (por exemplo, uma celulase, uma hemicelulase ou outros, para paredes macias e aumento da produção na extração) é empregado em um processo da invenção. Neste método exemplar para usar enzimas da invenção para melhorar a extração de óleo e desengomamento de óleo, uma fosfolipase C da invenção bem como outras hidrolases (por exemplo, uma celulase, uma hemicelulase, uma esterase, uma protease e/ou uma fosfa-tase) são empregadas durante as etapas de esmagamento associadas com a produção de óleo (incluindo porém não limitado a, óleo de soja, canola, açafroa, farelo de arroz). Empregando-se as enzimas antes ou no lugar de extração de solvente, é possível aumentar a produção de óleo e reduzir a quantidade de fosfolipídeos hidratáveis e não-hidratáveis no óleo bruto. A redução em um fosfolipídeo não-hidratável pode resultar da conversão de fosfolipídeos potencialmente não-hidratáveis para diacilglicerol e fosfato-éster correspondente antes da complexação com cálcio ou magnésio. A redução total de fosfolipídeos no óleo bruto resultará em produções melhoradas durante o refinamento com o potencial de eliminar a exigência de uma etapa de desengomamento separada ante do branqueamento e desodoriza-ção.
Em um aspecto, a invenção fornece processos empregando uma fosfolipase da invenção (por exemplo, uma fosfoidrolase específica de fosfo-lipase da invenção), ou outra fosfolipase, em um "processo de refinamento orgânico" modificado, que pode compreender adição da enzima (por exemplo, uma PLC) em um tanque de conservação de ácido cítrico.
As enzimas da invenção podem ser empregadas em qualquer método de processamento de óleo, por exemplo, desengomamento ou processos equivalentes. Por exemplo, as enzimas da invenção podem ser em- pregadas em processos como descritos nas Patentes dos Estados Unidos Nos 5.558.781, 5.264.367, 6.001.640. O processo descrito em USPN 5,558,781 usa qualquer das fosfolipases A1, A2 ou B, essencialmente decompondo-se a lecitina no óleo que se comporta como um emulsificante. A enzimas e métodos da invenção podem ser empregadas nos processos para a redução de componentes contendo fósforo em óleos comestíveis compreendendo uma quantidade elevada de fósforo não-hidratável empregando-se uma fosfolipase da invenção, por exemplo, um polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase A e/ou B, como descrito, por exemplo, na Patente EP Número: EP 0869167. Em um aspecto, o óleo comestível é um óleo bruto, um então chamado "óleo não desengomado". Em um aspecto, o método trata um óleo não desengomado, incluindo óleos prensados ou óleos extraídos, ou uma mistura destes, por exemplo, de semente de colza, soja, sésamo, amendoim, milho, farelo de arroz ou açafroa. O conteúdo de fosfatídeo em um óleo bruto pode variar de 0,5 a 3% em pe-so/ peso correspondendo a um conteúdo de fósforo na faixa de 200 a 1200 ppm, ou, na faixa de 250 a 1200 ppm. À parte dos fosfatídeos, o óleo bruto pode também conter pequenas concentrações de carboidrato, compostos de açúcar e complexos de metal/ ácido de fosfatídeo de Ca, Mg e Fe. Em um aspecto, o processo compreende o tratamento de um fosfolipídeo ou lisofos-folipídeo com a fosfolipase da invenção a fim de hidrolisar os grupos de acila graxos. Em um aspecto, o fosfolipídeo ou lisofosfolipídeo compreende leciti-na ou lisolecitina. Em um aspecto do processo o óleo comestível tem um conteúdo de fósforo dentre cerca de 50 a 250 ppm, e o processo compreende tratar o óleo com uma fosfolipase da invenção a fim de hidrolisar uma parte maior do fosfolipídeo e separar uma fase aquosa contendo o fosfolipí-deo hidrolisado do óleo. Em um aspecto, antes do processo de desengo-mamento enzimático o óleo é desengomado com água. Em um aspecto, os métodos fornecem a produção de um alimento animal compreendendo misturar a fosfolipase da invenção com substâncias alimentícias e pelo menos um fosfolipídeo.
As enzimas e métodos da invenção podem ser empregados nos processos de desengomamento de óleo como descrito, por exemplo, no WO 98/18912. As fosfolipases da invenção podem ser empregadas para reduzir o conteúdo de fosfolipídeo em um óleo comestível. O processo pode compreender tratar o óleo com uma fosfolipase da invenção para hidrolisar uma parte maior dos fosfolipídeo e separar uma fase aquosa contendo o fosfolipídeo hidrolisado do óleo. Este processo é aplicável para a purificação de qualquer óleo comestível, que contenha um fosfolipídeo, por exemplo, óleos vegetais, tal como óleo de soja, óleo de farelo de arroz, óleo de semente de colza, e óleo de açafroa, óleos de peixe, óleos animais e de algas e similares. Antes do tratamento enzimático, o óleo vegetal é preferivelmente pré-tratado para remover o limo (mucilagem), por exemplo, por refinamento úmido. O óleo pode conter entre cerca de 50 a 250 ppm, ou entre 50 a cerca de 1500 ppm, ou mais, de fósforo, como fosfolipídeo no início do tratamento com fosfolipase, e o processo da invenção ode reduzir este valor para mais baixo que entre cerca de 5 a 10 ppm.
As enzimas da invenção podem ser empregadas nos processos como descrito no Pedido JP NO: H5-132283, depositado em 25 e abril de 1993, que compreende um processo para a purificação de óleos e gorduras compreendendo uma etapa de conversão dos fosfolipídeos presentes nos óleos e gorduras em substâncias solúveis em água contendo grupos de ácido fosfórico e remoção deles como substâncias solúveis em água. Uma ação de enzima é empregada para a conversão em substâncias solúveis em água. Uma enzima tendo uma atividade de fosfolipase C é preferivelmente empregada como a enzima.
As enzimas da invenção podem ser empregadas em processos como descrito no "Processo de Refinamento Orgânico", (ORP) (IPH, Omaha, NE) que é m método de refinamento de óleos de semente. O ORP pode ter vantagens sobre o refinamento de produtos químicos tradicionais, incluindo a produção e óleo refinado melhorada, co-produtos adicionados de valor, custos de capital reduzidos e custos ambientais reduzidos.
As enzimas da invenção podem ser empregadas nos processos para o tratamento de um óleo ou gordura, animal ou vegetal, bruto, semi- processado ou refinado, compreendendo adição a tal óleo ou gordura de pelo menos uma enzima da invenção que permite hidrólise e/ou despolimerização dos compostos não glicerídicos contidos no óleo, como descrito, por exemplo, no Pedido EP número: 82870032.8. Métodos exemplares da invenção para hidrólise e/ou despolimerização de compostos não glicerídicos em óleos são: 1) A adição e mistura em óleos e gorduras de uma enzima da invenção ou complexos de enzima previamente dissolvidos em uma pequena quantidade de solvente apropriado (por exemplo, água). Um certo número de solventes é possível, porém um solvente adequado e não tóxico para a enzima é escolhido. Esta adição pode ser feita em processos com cargas sucessivas, bem como em processos contínuos. A quantidade de enzima(s) necessária para ser adicionada aos óleos e gorduras, de acordo com este processo, pode variar, dependendo das enzimas e dos produtos a serem processados, entre cerca de 5 a 400 ppm, ou entre cerca de 20 a 400 ppm; por exemplo, 0,005 kg a 0,4 kg de enzima para 1000 kg de óleo ou gordura, e preferivelmente de 5 a 100 ppm, isto é, de 0,005 a 0,1 kg de enzima para 1000 kg de óleo, entendendo-se que esses valores sejam para enzimas concentradas, isto é, sem diluente ou solvente. 2) Passagem do óleo ou gordura através de um leito de filtração fixo ou insolúvel de enzima(s) da invenção sobre suportes sólidos ou semi-sólidos, preferivelmente apresentando uma estrutura porosa ou fibrosa. Nesta técnica, as enzimas são retidas nas micro-cavidades da estrutura porosa ou fibrosa dos suportes. Estes consistem, por exemplo, em resinas ou polímeros sintéticos, carbonatos de celulose, géis tais como agarose, filamentos de polímeros ou copolímeros com estrutura porosa, retendo pequenas gotí-culas de enzima em solução em suas cavidades. Com respeito a concentração de enzima, é possível subir para a saturação dos suportes. 3) Dispersão dos óleos e gorduras na forma de gotículas finas, em uma solução enzimática diluída, em aspectos alternativos contendo entre cerca de 0,05 a 4%, ou contendo entre cerca de 0,2 a 4%, em volume de uma enzima da invenção. Esta técnica é descrita, por exemplo, na Patente Belga No. 595.219. Uma coluna cilíndrica com uma altura de diversos metros, com tampa cônica, é carregada com uma solução enzimática diluída. Para este propósito, um solvente que é não tóxico e não miscível no óleo ou gordura a ser processado, preferivelmente água, é escolhida. A base da coluna é equipada com um sistema de distribuição no qual o óleo ou gordura é continuamente injetado em uma forma extremamente dividida (aproximadamente 10.000 fluxo por m2). Desse modo um número infinito de gotículas de óleo ou gordura é formado, que lentamente aumenta na solução de enzimas e alcança a superfície, para ser retirado continuamente no topo da tampa cônica do reator. Óleo de palma pode ser pré-tratado antes do tratamento com uma enzima da invenção. Por exemplo, cerca de 30 kg de óleo de palma bruto é aquecido para + 50oC. Soluções a 1% foram preparadas em água destilada com celulases e pectinases. 600 g de cada dessas foram adicionados às soluções aquosas do óleo sob forte agitação durante poucos minutos. O óleo é em seguida mantido a + 50oC sob agitação moderada, durante um tempo de reação total de duas horas. Em seguida, a temperatura é elevada para + 90oC para desativar as enzimas e preparar a mistura para filtração e outro processamento. O óleo é secado sob vácuo e filtrado com um auxiliar de filtragem.
As enzimas da invenção podem ser empregadas em processos como descritos na Patente EP 0 513 709 B2. Por exemplo, a invenção fornece um processo para a redução do conteúdo de componentes contendo fósforo em óleos animais e vegetais por decomposição enzimática empregando-se uma fosfolipase da invenção. Em aspectos alternativos, óleo animal e vegetal pré-desmucilaginado com um conteúdo de fósforo entre cerca de 50 a 1500 ppm, ou, entre cerca de 50 a 250 ppm, é agitado com um ácido carboxílico orgânico e o valor do pH da mistura resultante estabelecido entre cerca de pH 4 a pH 6, uma solução de enzima que contém fosfolipase A1, A2, ou B da invenção é adicionada à mistura em um vaso de mistura sob agitação turbulenta e com a formação de gotículas finas, onde uma emulsão com 0,5 a 5 % em peso com relação ao óleo é formada, a referida emulsão sendo conduzida através de pelo menos um vaso de reação subseqüente sob movimento turbulento durante um tempo de reação de 0,1 a 10 horas em temperaturas na faixa de 20 a 80°C e onde o óleo tratado, após separação da solução aquosa, tem um conteúdo de fósforo sob 5 ppm. O processo de refinamento orgânico é aplicável a ambos os óleos bruto e desengomado. O processo usa adição em linha de um ácido orgânico sob condições de processo controladas, em conjunto com separação centrífuga convencional. A água separada naturalmente dos fosfolipídios de óleo vegetal ("VOP") é reciclada e reutilizada. O uso de água total pode ser substancialmente reduzido como um resultado do Processo de Refinamento Orgânico.
As fosfolipases e métodos da invenção podem também ser empregados no tratamento enzimático de óleos comestíveis, como descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos No 6.162.623. Nestes métodos exemplares, a invenção fornece uma enzima anfifílica. Ela pode ser imobilizada, por exemplo, por preparação de uma emulsão contendo uma fase hi-drofóbica contínua e uma fase aquosa dispersa contendo a enzima e um veículo para a enzima e removendo a água da fase dispersa até essa fase transformar-se em partículas revestidas por enzima sólida. A enzima pode ser uma lipase. A lipase imobilizada pode ser empregada para reações catalisadas por lipase tais como interesterificação de mono-, di- ou triglicerídeos, desacidificação de um óleo de triglicerídeo, ou remoção de fosfolipídios de um óleo de triglicerídeo quando a lipase é uma fosfolipase. A fase aquosa pode conter um líquido de fermentação, um óleo de triglicerídeo comestível pode ser a fase hidrofóbica, e veículos incluem açúcares, amido, dextrano, derivados de celulose solúveis em água e resíduos de fermentação. Este método exemplar pode ser empregado para processar triglicerídeos, diglice-rídeos, monoglicerídeos, glicerol, fosfolipídios, glicolipídios ou ácidos graxos, que podem estar na fase hidrofóbica. Em um aspecto, o processo para a remoção de fosfolipídios de óleo de triglicerídeo compreendendo misturar um óleo de triglicerídeo contendo fosfolipídios com uma preparação contendo uma fosfolipase da invenção; hidrolisar os fosfolipídios para lisofosfolipí- dio; separar os fosfolipídios hidrolisados do óleo, em que a fosfolipase é uma fosfolipase imobilizada.
As fosfolipases e métodos da invenção podem também ser empregados no tratamento enzimático de óleos comestíveis, como descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos n° 6.127.137. Este método exemplar hidrolisa ambos os grupos de acila graxa em fosfolipídio intacto. A fosfo-lipase da invenção empregada neste método exemplar não tem nenhuma atividade de lipase e é ativa em pH muito baixo. Essas propriedades tornam-na muito adequada para uso em desengomamento de óleo, como hidrólise alcalina e enzimática (saponificação) do óleo podem ambas ser suprimidas. Em um aspecto, a invenção fornece um processo para hidrolisar grupos de acila graxa em um fosfolipídio ou lisofosfolipídio compreendendo tratar o fosfolipídio ou lisofosfolipídio com a fosfolipase que hidrolisa ambos os grupos de acila graxa em um fosfolipídio e é essencialmente livre de atividade de lipase. Em um aspecto, a fosfolipase da invenção tem uma temperatura ideal de cerca de 50oC, medida em pH 3 a pH 4 durante 10 minutos, e um pH ideal de cerca de pH 3, medido em 40oC durante cerca de 10 minutos. Em um aspecto, o fosfolipídio ou lisofosfolipídio compreende lecitina ou lisolecitina. Em um aspecto, após hidrolisar uma maior parte do fosfolipídio, uma fase aquosa contendo o fosfolipídio hidrolisado é separada do óleo. Em um aspecto, a invenção fornece um processo para remover o fosfolipídio de um óleo comestível, compreendendo tratar o óleo em pH 1,5 a 3 com uma dispersão de uma solução aquosa da fosfolipase da invenção, e separar uma fase aquosa contendo o fosfolipídio hidrolisado do óleo. Em um aspecto, o óleo é tratado para remover a mucilagem antes do tratamento com a fosfolipase. Em um aspecto, o óleo antes do tratamento com a fosfolipase contém o fosfolipídio em uma quantidade correspondente a 50 a 250 ppm de fósforo. Em um aspecto, o tratamento com fosfolipase é feito em 30oC a 45oC durante 1 a 12 horas em uma dosagem de fosfolipase de 0,1 a 10 mg/l na presença de 0,5 a 5% de água.
As fosfolipases e métodos da invenção podem também ser empregados no tratamento enzimático de óleos comestíveis, como descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos n° 6.025.171. Nestes métodos exemplares, as enzimas da invenção são imobilizadas por preparação de uma emulsão contendo uma fase hidrofóbica contínua, tal como um óleo de triglicerídeo, e uma fase aquosa dispersa contendo uma enzima anfifílica, tal como lipase ou uma fosfolipase da invenção, e material veículo que é parcialmente dissolvido e parcialmente não dissolvido na fase aquosa, e remoção de água da fase aquosa até a fase converter-se em partículas veículos revestidas por enzima sólida. A parte não dissolvida do material veículo pode ser um material que é insolúvel em água e óleo, ou um material solúvel em água em forma não dissolvida pois a fase aquosa já é saturada com o material solúvel em água. A fase aquosa pode ser formada com um líquido de fermentação de lipase bruto contendo resíduos de fermentação e biomassa que pode servir como materiais veículo. Lipase imobilizada é útil para re-disposição de éster e desacidificação em óleos. Após uma reação, a enzima imobilizada pode ser regenerada para uma reação subseqüente por adição de água para obter dissolução parcial do veículo, e com a enzima resultante e fase aquosa contendo o veículo dispersa em uma fase hidrofóbica evaporando água para novamente formar partículas veículos revestidas por enzima.
As fosfolipases e métodos da invenção podem também ser empregados no tratamento enzimático de óleos comestíveis, como descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos n° 6.143.545. Este método exemplar é empregado para reduzir o conteúdo de fósforo contendo componentes em um óleo comestível compreendendo uma quantidade elevada de conteúdo de fósforo não-hidratável empregando-se uma fosfolipase da invenção. Em um aspecto, o método é empregado para reduzir o conteúdo de fósforo contendo componentes em um óleo comestível tendo um conteúdo de fósforo não-hidratável de pelo menos 50 ppm avaliado por pré-tratamento do óleo comestível, a 60oC, por adição de uma solução compreendendo monoidrato de ácido cítrico em água (água adicionada vs. óleo igual a 4,8% peso/peso (ácido cítrico) em fase de água = 106 mM, em emulsão de água/óleo = 4,6 mM) durante 30 minutos; transferir 10 ml da água pré-tratada em emulsão de óleo para um tubo; aquecer a emulsão em um banho de água de ebulição durante 30 minutos; centrifugar a 5000 rpm durante 10 minutos, transferir cerca de 8 ml da fase superior (óleo) para um novo tubo e deixando-a assentar durante 24 horas; e extrair 2 g da fase clara superior para medição do conteúdo de fósforo não-hidratável (ppm) no óleo comestível. O método também pode compreender contatar um óleo em um pH de cerca de pH 5 a 8 com uma solução aquosa de uma fosfolipase A ou B da invenção (por exemplo, PLA1, PLA2, ou uma PLB), cuja solução é emulsificada no óleo até o conteúdo de fósforo do óleo ser reduzido para menos do que 11 ppm, e em seguida separar a fase aquosa do óleo tratado.
As fosfolipases e métodos da invenção podem também ser empregados no tratamento enzimático de óleos comestíveis, como descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos n° 5.532.163. A invenção fornece processos para o refinamento de óleo e gordura pelo qual fosfolipídios no óleo e gordura a serem tratados podem ser decompostos e removidos eficientemente. Em um aspecto, a invenção fornece um processo para o refinamento de óleo e gordura o qual compreende reagir, em uma emulsão, o óleo e a gordura com uma enzima da invenção, por exemplo, uma enzima tendo uma atividade para decompor as ligações de éster de ácido graxo-glicerol em glicerofosfolipídios (por exemplo, uma PLA2 da invenção); e outro processo no qual a gordura e óleo tratado por enzima são lavados com água ou uma solução aquosa acídica. Em um aspecto, a solução aquosa acídica a ser empregada na etapa de lavagem é uma solução de pelo menos um ácido, por exemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido fosfórico e sais destes. Em um aspecto, a condição emulsificada é formada empregando-se 30 partes em peso ou mais de água por 100 partes em peso do óleo e gordura. Uma vez que o óleo e a gordura podem ser purificados sem empregar a etapa de refinamento de álcali convencional, a geração de água de resíduo de lavagem e resíduo industrial pode ser reduzida. Além disso, a produção de recuperação de óleo é melhorada por causa da perda de gordura e óleo neutro devido à sua inclusão nesses resíduos não ocorrer no processo inventivo. Em um aspecto, a invenção fornece um processo para refinamento de óleo e gordura contendo cerca de 100 a 10.000 ppm de fosfolipídios que compreende: reagir, em uma condição emulsificada, o referido óleo e gordura com uma enzima da invenção tendo atividade para decompor as ligações de éster de ácido graxo-glicerol em glicerofosfolipídios. Em um aspecto, a invenção fornece processos para o refinamento de óleo e gordura contendo cerca de 100 a 10.000 ppm de fosfolipídios que compreendem reagir, em uma condição emulsificada, o óleo e a gordura com uma enzima da invenção tendo atividade para decompor as ligações de éster de ácido graxo-glicerol em glicerofosfolipídios; e subseqüentemente lavar o óleo e a gordura tratada com uma água de lavagem.
As fosfolipases e métodos da invenção podem também ser empregados no tratamento enzimático de óleos comestíveis, como descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos n° 5.264.367. O conteúdo de componentes contendo fósforo e o conteúdo de ferro de um óleo animal ou vegetal comestível, tal como um óleo, por exemplo, óleo de soja, que foi refinado úmido para remover a mucilagem, são reduzidos por decomposição enzimática contatando-se o óleo com uma solução aquosa de uma enzima da invenção, por exemplo, uma fosfolipase A1, A2, ou B, e em seguida separar a fase aquosa do óleo tratado. Em um aspecto, a invenção fornece um método enzimático para diminuir o conteúdo de componentes contendo fósforo e ferro em óleos, que foram refinados para remover a mucilagem. Um óleo, que foi refinado para remover a mucilagem, pode ser tratado com uma enzima da invenção, por exemplo, fosfolipase C, A1, A2, ou B. Conteúdos de fósforo abaixo de 5 ppm e conteúdos de ferro abaixo de 1 ppm podem ser obtidos. O conteúdo de ferro baixo pode ser vantajoso para a estabilidade do óleo.
As fosfolipases e métodos da invenção podem também ser empregados para preparação de óleos transesterificados, como descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos n° 5.288.619. A invenção fornece métodos para transesterificação enzimática para a preparação de um óleo de margarina tendo ambos os conteúdos de ácido graxo de cadeia intermediária baixo e ácido trans baixo. O método inclui as etapas de fornecimento de uma mistura de reação de transesterificação contendo um material de fonte de ácido esteárico e um óleo vegetal líquido comestível, transesterificação do material de fonte de ácido esteárico e o óleo vegetal empregando-se uma lipase específica de posição 1-, 3-, e em seguida finalmente hidro-genação da mistura de ácido graxo para fornecer um material de fonte de ácido esteárico de reciclo para uma reação recíclica com o óleo vegetal. A invenção também fornece um método de contra-corrente para preparação de um óleo transesterificado. O método inclui as etapas de fornecer uma zona de reação de transesterificação contendo uma lipase específica de posição 1-, 3-, introduzir um óleo vegetal na zona de transesterificação, introduzir um material de fonte de ácido esteárico, conduzir um fluido de contra-corrente de gás liquefeito sub-crítico ou gás supercrítico, realizar uma reação de tran-sesterificação da corrente de triglicerídeo com a corrente de monoéster de ácido esteárico ou ácido esteárico na zona de reação, retirar uma corrente de óleo de margarina de triglicerídeo transesterificado, retirar uma fase de fluido de contra-corrente, hidrogenar o ácido esteárico transesterificado ou monoéster de ácido esteárico para fornecer um material de fonte de ácido esteárico de reciclo hidrogenado, e introduzir o material de fonte de ácido esteárico de reciclo hidrogenado na zona de reação.
Em um aspecto, o composto de fosfolipídio altamente insaturado pode ser convertido em um triglicerídeo por uso apropriado de uma fosfoli-pase C da invenção para remover o grupo de fosfato na posição sn-3, seguido por síntese de éster de acila de 1,3 lipase. O fosfolipídio 2-substituído pode ser empregado como um ingrediente de alimentação funcional diretamente, ou pode ser subseqüentemente seletivamente hidrolisado em reator 160 empregando-se uma fosfolipase C imobilizada da invenção para produzir um 1-diglicerídeo, seguido por esterificação enzimática como descrito aqui para produzir um produto de triglicerídeo tendo um componente de ácido graxo poli-insaturado 2-substituído.
As fosfolipases e métodos da invenção podem também ser empregados em um processo de desengomamento enzimático de óleo vegetal como descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos No 6.001.640.
Este método da invenção compreende uma etapa de desengomamento na produção de óleos comestíveis. Óleos vegetais dos quais fosfatídeos hidratáveis foram eliminados por um processo de desengomamento aquoso prévio são liberados de fosfatídeos não-hidratáveis por tratamento enzimático empregando-se uma fosfolipase da invenção. O processo pode ser suave, econômico e ambientalmente agradável. As fosfolipases que somente hidrolisam lisolecitina, porém não lecitina, são empregadas neste processo de desengomamento.
Em um aspecto, para permitir a enzima da invenção agir, ambas as fases, a fase de óleo e a fase aquosa que contêm a enzima, devem ser intimamente misturadas. Pode não ser suficiente meramente agitá-las. Boa dispersão da enzima no óleo é auxiliada se ela for dissolvida em uma pequena quantidade de água, por exemplo, 0,5 a 5 % em peso (relativa ao óleo), e emulsificada no óleo desta forma, para formar gotículas menores do que 10 micrômetros em diâmetro (média de peso). As gotículas podem ser menores do que 1 micrômetro. Agitação turbulenta pode ser feita com velocidades radiais acima de 100 cm/segundo. O óleo também pode ser circulado no reator empregando-se uma bomba rotatória externa. A fase aquosa contendo a enzima pode também ser finamente dispersa por meio de ação de ultra-som. Um aparelho de dispersão pode ser empregado. A reação enzimática provavelmente ocorre na superfície de borda entre a fase de óleo e a fase aquosa. É o objetivo de todas essas medidas para mistura criar a maior superfície possível para a fase aquosa que contém a enzima. A adição de tensoativos aumenta a microdispersão da fase aquosa. Em alguns casos, portanto, tensoativos com valores de HLB acima de 9, tal como sulfato de Na-dodecila, são adicionados à solução de enzima, como descrito, por exemplo, na EP-A 0 513 709. Um método eficaz similar para melhorar a emulsificação é a adição de lisolecitina. As quantidades adicionadas podem situar-se na faixa de 0,001% a 1%, com referência ao óleo. A temperatura durante o tratamento da enzima não é crítica. As temperaturas entre 20oC e 80oC podem ser usadas, porém a última pode somente ser aplicada durante um tempo curto. Neste aspecto, a fosfolipase da invenção tendo uma boa temperatura e/ou tolerância ao pH baixa é empregada. Temperaturas de aplicação entre 30oC e 50oC são ideais. O período de tratamento depende da temperatura e pode ser mantido mais curto com um aumento da temperatura. Tempos de 0,1 a 10 horas, ou, 1 a 5 horas são geralmente suficientes. A reação ocorre em um reator de desengomamento, que pode ser dividido em estágios, como descrito, por exemplo, na DE-A 43 39 556. Portanto a operação contínua é possível, juntamente com a operação em batelada. A reação pode ser realizada em diferentes estágios de temperatura. Por exemplo, a incubação pode ocorrer durante 3 horas a 40oC, em seguida durante 1 hora a 60oC. Se a reação prossegue em estágio, isto também abre a possibilidade de ajustar diferentes valores de pH nos estágios individuais. Por exemplo, no primeiro estágio o pH da solução pode ser ajustado para 7, por exemplo, e em um segundo estágio para 2,5, por adição de ácido cítrico. Em pelo menos um estágio, entretanto, o pH da solução de enzima deve ser abaixo de 4, ou, abaixo 3. Se o pH foi subseqüentemente ajustado abaixo deste nível, uma deterioração do efeito pode ser encontrada. Portanto o ácido cítrico pode ser adicionado à solução da enzima antes da última ser misturada no óleo.
Após conclusão do tratamento da enzima, a solução de enzima, juntamente com os produtos de decomposição do NHP contidos nela, pode ser separada da fase de óleo, em bateladas ou continuamente, por exemplo, por meio de centrifugação. Uma vez que as enzimas são caracterizadas por um nível elevado de estabilidade e a quantidade dos produtos de decomposição contida na solução é insignificante (elas podem precipitar como lama), a mesma fase de enzima aquosa pode ser empregada diversas vezes. Existe também a possibilidade de liberar a enzima da lama, ver, por exemplo, DE-A 43 39 556, a fim de que uma solução de enzima que é essencialmente livre de lama possa ser empregada novamente. Em um aspecto deste processo de desengomamento, os óleos que contêm menos do que 15 ppm de fósforo são obtidos. Um objetivo é o conteúdo de fósforo menor do que 10 ppm; ou, menor do que 5 ppm. Com conteúdos de fósforo abaixo de 10 ppm, outro processamento do óleo de acordo com o processo de desacidificação destilativa é facilmente possível. Diversos outros íons, tais como magnésio, cálcio, zinco, bem como ferro, podem ser removidos do óleo, por exemplo, abaixo de 0,1 ppm. Desse modo, este produto possui pré-requisitos ideais para uma boa resistência à oxidação durante outro processamento e armazenagem.
As fosfolipases e métodos da invenção podem também ser empregados para reduzir a quantidade de componentes contendo fósforo em óleos animais e vegetais como descrito, por exemplo, na Patente EP 0513709. Neste método, o conteúdo de componentes contendo fósforo, especialmente fosfatídeos, tal como lecitina, e o conteúdo de ferro em óleos animais e vegetais, que foram previamente desenlameados, por exemplo, óleo de soja, são reduzidos por interrupção enzimática empregando-se uma fosfolipase A1, A2 ou B da invenção.
As fosfolipases e métodos da invenção podem também ser empregados para refinar a gordura ou óleos como descrito, por exemplo, na JP 06306386. A invenção fornece processos para refinar uma gordura ou óleo compreendendo uma etapa de conversão de um fosfolipídio em uma gordura ou um óleo em uma substância contendo um grupo fosfórico solúvel em água e remoção desta substância. A ação de uma enzima da invenção (por exemplo, uma PLC) é utilizada para converter o fosfolipídio na substância. Desse modo, é possível refinar uma gordura ou óleo sem realizar uma etapa de refinamento de álcali da qual resíduos industriais contendo água de resíduo alcalino e uma maior quantidade de óleo são produzidos. O desenvolvimento de produções pode ser realizado pois a perda de óleo ou gordura neutra de escape com os resíduos pode ser reduzida para zero. Em um aspecto, substâncias gomosas são convertidas em substâncias solúveis em água e removidas como substâncias solúveis em água por adição de uma enzima da invenção tendo uma atividade de fosfolipase C no estágio de desengomamento do óleo bruto e condução do tratamento enzimático. Em um aspecto, a fosfolipase C da invenção tem uma atividade que corta as ligações de éster de glicerina e ácido fosfórico em fosfolipídios. Se necessário, o método pode compreender lavagem do óleo tratado com enzima com água ou uma solução aquosa acídica. Em um aspecto, a enzima da invenção é adicionada a e reagida com o óleo bruto. A quantidade de fosfolipase C empregada pode ser 10 a 10.000 unidades, ou, cerca de 100 a 2.000 unidades, por 1 kg de óleo bruto.
As fosfolipases e métodos da invenção podem também ser empregados para processo de desengomamento por água como descrito, por exemplo, em Dijkstra, Albert J., e similares, Oleagineux, Corps Gras, Lipides (1998), 5(5), 367-370. Neste método exemplar, o processo de desengoma-mento por água é empregado para a produção de lecitina e para processos de desengomamento a seco empregando-se um ácido de desengomamento e terra de branqueamento. Este método pode ser economicamente praticável somente para óleos com um conteúdo de fosfatídeo baixo, por exemplo, óleo de palma, óleos láuricos, etc. Para óleos de semente tendo um conteúdo de NHP elevado, o processo de refinamento de ácido é empregado, desse modo este processo é realizado no moinho de óleo para permitir remoção da goma por meio da farinha. Em um aspecto, este óleo refinado por ácido é uma possível operação de "polimento" a ser realizada antes do refinamento físico.
As fosfolipases e métodos da invenção podem também ser empregados para processos de desengomamento como descrito, por exemplo, em Dijkstra, e similares, Res. Dev. Dep., N.V. Vandemoortele Coord. Cent., Izegem, Belg. JAOCS, J. Am. Oil Chem. Soc. (1989), 66:1002-1009. Neste método exemplar, o processo de desengomamento total envolve dispersão de um ácido tal como H3PO4 ou ácido cítrico em óleo de soja, permitindo um tempo de contato, e em seguida misturando uma base tal como soda cáustica ou silicato de Na na emulsão de ácido-em-óleo. Isto mantém o grau de neutralização baixo o suficiente para evitar a formação de sabão, porque aquilo induziria a perda de óleo aumentada. Subseqüentemente, o óleo passado para uma separadora centrífuga onde a maior parte das gomas é removida da corrente de óleo para produzir uma fase de goma com conteúdo de óleo mínimo. A corrente de óleo é em seguida passada para uma segunda separadora centrífuga para remover todas as gomas restantes para pro- duzir uma fase de goma diluída, que é reciclada. Lavagem e secagem ou refinamento de álcali em linha completam o processo. Após a adoção do processo de desengomamento total, em comparação com o processo de refinamento de álcali clássico, uma melhora de produção total de cerca de 0,5% é realizada. O óleo totalmente desengomado pode ser subseqüentemente refinado por álcali, branqueado e desodorizado, ou branqueado e fisicamente refinado.
As fosfolipases e métodos da invenção podem também ser empregados para a remoção de fosfolipídios não-hidratáveis de um óleo de planta, por exemplo, óleo de soja, como descrito, por exemplo, em Hvolby, e similares, Sojakagefabr., Copenhagen, Den., J. Amer. Oil Chem. Soc. (1971) 48:503-509. Neste método exemplar, óleo desengomado por água é misturado em diferentes valores de pH fixados com soluções tampão com e sem Ca++, reagentes de ligação de Mg/Ca, e tensoativos. Os fosfolipídios não-hidratáveis podem ser removidos em um estado não convertido como um componente de micelas ou de emulsificantes misturados. Além disso, os fosfolipídios não-hidratáveis são removíveis por conversão em formas dissociadas, por exemplo, por remoção de Mg e Ca dos fosfatidatos, que podem ser realizados por acidulação ou por tratamento com reagentes de precipitação de Mg/Ca ou complexação de Mg/Ca. Remoção ou conversão química dos fosfolipídios não-hidratáveis pode resultar em formação de emulsão reduzida e em separação melhorada do óleo desacidifícado da camada de emulsão e da matéria-prima de sabão.
As fosfolipases e métodos da invenção podem também ser empregados para o desengomamento de óleos vegetais como descrito, por exemplo, Buchold, e similares, Frankfurt/Main, Germany. Fett Wissenschaft Technologie (1993), 95(8), 300-304. Neste processo exemplar da invenção para o desengomamento de óleos vegetais comestíveis, suspensões aquo-sas de uma enzima da invenção, por exemplo, fosfolipase A2, são empregadas para hidrolisar a ligação de ácido graxo na posição sn2 do fosfolipídio, resultando em 1-acil-lisofosfolipídios que são insolúveis em óleo e então mais tratáveis por separação física. Mesmo a adição de pequenas quantida- des correspondentes a cerca de 700 unidades de lecitase/kg de óleo resulta em uma concentração P residual de menos do que 10 ppm, a fim de que o refinamento químico seja substituível por refinamento físico, eliminando a necessidade de neutralização, fenda de matéria-prima de sabão, e tratamento de água de resíduo.
As fosfolipases e métodos da invenção podem também ser empregados para o desengomamento de óleos vegetais como descrito, por exemplo, por EnzyMax, Dahlke, Klaus, Dept. G-PDO, Lurgi Ol-Gas, Chemie, GmbH, Frankfurt, Germany. Oleagineux, Corps Gras, Lipides (1997), 4(1), 55-57. Este processo exemplar é um processo de desengomamento para o refinamento físico de quase todo tipo de óleo. Por uma hidrólise catalisada enzimática, fosfatídeos são convertidos em lisofosfatídeos solúveis em água que são separados do óleo por centrifugação. O conteúdo de fósforo residual no óleo enzimaticamente desengomado pode ser tão baixo quanto 2 ppm de P.
As fosfolipases e métodos da invenção podem também ser empregados para o desengomamento de óleos vegetais como descrito, por exemplo, por Cleenewerck, e similares, N.V. Vamo Mills, Izegem, Belg. Fett Wissenschaft Technologie (1992), 94:317-22; e, Clausen, Kim; Nielsen, Munk. Novozymes A/S, Den. Dansk Kemi (2002) 83(2):24-27. As fosfolipa-ses e métodos da invenção podem incorporar o pré-refinamento de óleos vegetais com ácidos como descrito, por exemplo, por Nilsson-Johansson, e similares, Fats Oils Div., Alfa-Laval Food Eng. AB, Tumba, Swed. Fett Wis-senschaft Technologie (1988), 90(11), 447-51; e, Munch, Ernst W. Cereol Deutschland GmbH, Mannheim, Alemanha. Editor(es): Wilson, Richard F. Proceedings of the World Conference on Oilseed Processing Utilization, Cancun, MX, Nov. 12-17, (2001), Meeting Date 2000, 17-20.
As fosfolipases e métodos da invenção podem também ser empregados para o desengomamento de óleos vegetais como descrito, por exemplo, por Jerzewska, e similares, Inst. Przemyslu Miesnego i Tluszczo-wego, Warsaw, Pol., Tluszcze Jadalne (2001), 36(3/4), 97-110. Neste processo da invenção, o desengomamento enzimático de óleo de semente de colza com baixo teor de ácido erúcico hidratado é por uso de uma fosfolipase A2 da invenção. A enzima pode catalisar a hidrólise de ligações de és-ter de ácido graxo para o átomo de carbono central da porção de glicerol em fosfolipídios. Ela pode hidrolisar fosfolipídios não-hidratáveis para seus liso-compostos hidratáveis correspondentes. Com uma preparação de enzima não purificada, melhores resultados podem ser obtidos com a adição de 2% de preparação durante 4 horas (87% de remoção de P).
Em outro processo exemplar da invenção para desengomamento de óleo (ou um processo de desengomamento de óleo empregando-se uma enzima da invenção), um polímero acídico, por exemplo, um alginato ou pec-tina, é adicionado. Neste processo de desengomamento de óleo da invenção, um polímero acídico (por exemplo, ácido algínico ou pectina ou uma forma de sal mais solúvel) é adicionado ao óleo bruto com uma pequena quantidade de água (por exemplo, em uma faixa entre cerca de 0,5 a 5%). Neste aspecto, os polímeros acídicos podem reduzir e/ou romper os complexos de fosfolipídio-metal por ligação de cálcio e/ou magnésio no óleo bruto, desse modo melhorar a solubilidade de fosfolipídios não-hidratáveis. Em aspectos alternativos, esses fosfolipídios moverão para a interface óleo/água ou entrarão na fase aquosa e serão convertidos para diacilglicerol e para a cadeia colateral correspondente ou o fosfolipídio intacto será removido por centrifugação subseqüente como um componente da fase pesada. A presença do polímero acídico na fase aquosa pode também aumentar a densidade da fase aquosa e resultar em uma separação melhorada da fase pesada da fase de óleo (leve).
Um processo exemplar da invenção para desengomamento de óleo (ou um processo de desengomamento de óleo empregando-se uma enzima da invenção) altera o procedimento de desodorização para obter uma fração de diacilglicerol (DAG). Em aspecto alternativo, se necessário ou desejado, seguindo o desengomamento auxiliado por enzima, as condições de desodorização (temperatura, pressão, configuração do aparelho de destilação) podem ser modificadas com o objetivo de melhorar a separação dos ácidos graxos livres (FFA) da fração de diacilglicerol/triacilglicerol ou também modificadas para separar o diacilglicerol da fração de triacilglicerol. Como um resultado dessas modificações, empregando-se este método da invenção, é possível obter FFA de grau alimentar e diacilglicerol se uma enzima da invenção (por exemplo, uma fosfatase, ou, uma PLC ou uma combinação de PLC e fosfatases) for empregada para desengomar o óleo comestível em um processo de refinamento físico.
Em vários aspectos, a prática dos métodos da invenção como descrito aqui (ou empregando-se as enzimas da invenção), tem vantagens tais como: diminuir ou eliminar o solvente e recuperação do solvente; reduzir custos de capital; diminuir os custos de refinamento a jusante, diminuir o uso químico, equipamento, tempo de processo, geração de energia (calor) e de água de resíduo/ uso de água; produzir o óleo de qualidade superior; expelir o óleo prensado pode ser empregado sem refinamento em algumas aplicações de cozimento e fritura rápida (este óleo prensado pode ter estabilidade superior, características de cor e odor e conteúdo de tocoferol elevado); produzir refeição de qualidade superior; produzir um conteúdo de gordura inferior em refeição (atualmente, a refeição que resulta de prensa mecânica causa problemas de digestão em ruminantes); produzir atributos nutricionais melhorados - níveis reduzidos de glucosinolatos, taninas, sinapina, ácido fítico (como descrito, por exemplo, em Technology and Solvents for Extracting Oilseeds and Nonpetroleum Oils, AOCS 1997).
Em um aspecto, a invenção fornece métodos para refinamento de óleos vegetais (por exemplo, óleo de soja, óleo de milho, óleo de algodão, óleo de palma, óleo de amendoim, óleo de semente de colza, óleo de açafroa, óleo de semente de girassol, óleo de semente de gergelim, óleo de farelo de arroz, óleo de coco ou óleo de canola) e seus subprodutos, e processos para desodorização de lecitina, por exemplo, como descrito na Patente dos Estados Unidos n° 6.172.248, ou 6.172.247, onde os métodos compreendem o uso de pelo menos uma enzima da invenção, por exemplo, uma fosfolipase C da invenção. Desse modo, a invenção fornece lecitina e óleos vegetais compreendendo pelo menos uma enzima da invenção. Em um processo de refinamento de ácido orgânico exemplar, óleo vegetal é combinado com uma solução de ácido orgânico aquoso diluído e submetido a cisalhamento elevado para finamente dispersar a solução de ácido no óleo. A mistura de ácido e óleo resultante é misturada em cisalhamento baixo durante um tempo suficiente para seqüestrar contaminantes em uma fase de impurezas hidratadas, produzindo uma fase de óleo vegetal purificada. Neste processo exemplar, um sistema de reciclo ou misturador (por exemplo, tanque de água de reciclo) e/ou um tanque de armazenamento de fosfa-tídeo ou lecitina podem ser empregados, por exemplo, como descrito na Patente dos Estados Unidos Nos. 4.240.972, 4.049.686, 6.172.247 ou 6.172.248. Esses processos podem ser conduzidos como uma batelada ou processo contínuo. Óleo vegetal desengomado ou bruto pode ser fornecido de um tanque de armazenagem (por exemplo, através de uma bomba) e pode ser aquecido. O óleo vegetal a ser purificado pode ser bruto ou óleo "desengomado".
Em um aspecto, enzimas de fosfatidilinositol-PLC (PI-PLC) da invenção são empregadas para desengomamento vegetal de óleo. Enzimas de PI-PLC da invenção podem ser empregadas sozinhas ou em combinação com outras enzimas (por exemplo enzimas de PLC, PLD, fosfatase da invenção) para melhorar a produção de óleo durante o desengomamento de óleos vegetais (incluindo soja, canola, e girassol). As PI-PLC podem preferencialmente converter fosfatidilinositol para 1,2-diacilglicerol (DAG) e fosfoinositol porém podem também demonstrar atividade sobre outros fosfolipídios incluindo fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, ou ácido fosfatídico, ou uma combinação destes. A melhora na produção será realizada como um aumento na quantidade de DAG no óleo vegetal tratado por enzima e um aumento em óleo neutro, devido a uma diminuição na quantidade de óleo carreada na fração de goma menor que resulta em tratamento de enzima do óleo vegetal.
Processamento Enzimático de sementes de óleo A invenção fornece composições (por exemplo, enzimas) e métodos para processamento enzimático de sementes de óleo, incluindo soja, canola, coco, abacate e pasta de azeitona. Em um aspecto, estes processos da invenção podem aumentar a nutricional das farinhas obtidas. zimático de sementes de óleo ei fornecerá benefícios econômico: 5 nativas para extração de óleo e humano e animal. Em aspectos preendem o uso de fosfolipases fosfatases, fitases, xilanases, am ses (por exemplo, D-glicanases 10 ses, hemicelulases, pectinases celular de planta, bem como pre res.
Em aspectos alterna praticados em conjunto com oul com os métodos da invenção. C e atividade de enzima de protea óleo e proteína combinadas cor concentração de enzima, tempo 5 de sólido-para-líquido foi avaliac dos com uma enzima da inve Enzyme and Microb. Tech. 28:4 pode resultar em produções sig sobre o controle quando farinha 10 Em um aspecto, extr celulose é empregada em combi la de planta consiste em uma sé ciados com ou substituídos por destes carboidratos é digerida ; hidrolisar material celular em fa pode ser recuperado por centr McGlone (1986) J. of Food Sci. 5 também compreender a incorpo 5 celulases em diferentes combina da invenção) para resultar em s melhor caso) durante a extração crito, por exemplo, por Buenrosl processos da invenção para ex 10 com celulase, hemicelulase, pol tease e suas combinações (entr ção), como descrito, por exem Enzymol. (Milano) 30:13. Purificação de fitosteróis de 6 de células exterminadoras naturais contra uma cepa de célula de câncer. As fosfolipases e métodos da invenção são empregados para purificar esteróis de planta para o tratamento de tuberculose pulmonar, artrite reumatóide, controle de pacientes infestados por HIV e inibição de estresse imune, por exemplo, em corredores de maratona.
As fosfolipases e métodos da invenção são empregados para purificar componentes de esterol presentes nas frações de esterol de óleos vegetais de mercadorias (por exemplo, óleos de coco, canola, manteiga de cacau, milho, semente de algodão, linhaça, azeitona, palma, amendoim, farelo de arroz, açafroa, gergelim, soja, girassol), tal como sitosterol (40,2-92,3 %), campesterol (2,6-38,6 %), estigmasterol (0-31 %) e 5-avenasterol (1,5 -29 %).
Os métodos da invenção podem incorporar o isolamento de este-róis derivados de planta em sementes oleosas por extração de solvente com clorofórmio-metanol, hexano, cloreto de metileno, ou acetona, seguido por saponificação e purificação cromatográfica para obter esteróis totais enriquecidos. Alternativamente, as amostras de planta podem ser extraídas por extração de fluído supercrítica com dióxido de carbono supercrítico para obter extratos de lipídeo total dos quais os esteróis podem ser enriquecidos e isolados. Para subseqüente caracterização e quantificação de compostos de esterol, o isolado bruto pode ser purificado e separado por uma ampla variedade de técnicas cromatográficas incluindo cromatografia de coluna (CC), cromatografia de gás, cromatografia de camada fina (TLC), cromatografia líquida de desempenho elevado de fase normal (HPLC), fase reversa HPLC e eletrocromatografia capilar. De todas as técnicas cromatográficas de isolamento e separação, os procedimentos de CC e TLC empregam as mais acessíveis, proporcionáveis e adequadas para ensaios qualitativos, de purificação e de limpeza de amostra e estimativas preliminares dos esteróis em amostras de teste.
Os fitosteróis são perdidos em óleos vegetais perdidos como subprodutos durante os processos de refinamento de óleo comestível. As fosfolipases e métodos da invenção empregam fitosteróis isolados de tais subprodutos para fabricar produtos enriquecidos por fitosterol isolados de tais subprodutos. Os métodos de isolamento e purificação de fitosterol da invenção podem incorporar subprodutos de indústria de processamento de óleo e podem compreender operações tais como destilação molecular, extração líquido-líquido e cristalização. Métodos da invenção podem incorporar processos para a extração de lipídeos para extrair fitosteróis. Por exemplo, os métodos da invenção podem empregar solventes não polares como hexano (comumente empregado para extrair a maioria dos tipos de óleos vegetais) quantitativamente para extrair ésteres de ácido graxo de fitosterila e fitosteróis livres. Os glico-sídeos de esterila e glicosídeos de esterila acilada graxo são apenas parcialmente extraídos com hexano, e aumentando a polaridade do solvente fornecem maior percentagem de extração. Um procedimento que pode ser empregado é o método de clorofórmio-metanol Bligh and Dyer para extração de todas as classes de lipídeo de esterol, incluindo fosfolipídeos. Um método exemplar tanto para separar qualitativamente quanto analisar quantitativamente as classes de lipídeo de fitosterol compreende a injeção do extrato de lipídeo no sistema de HPLC.
As fosfolipases e métodos da invenção podem ser empregados para remover esteróis de gorduras e óleos, como descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos n° 6.303.803. Este é um método para reduzir o teor de esterol de gorduras e óleos que contêm esterol. Ele é um processo eficiente e barato com base na afinidade de colesterol e similares esteróis para moléculas anfipáticas que formam bicamadas fluídas, hidrofóbicas, tais como bicamadas de fosfolipídeo. Os agregados de fosfolipídeos são contatados com, por exemplo, uma gordura ou óleo contendo esterol em um ambiente aquoso e em seguida misturados. A estrutura molecular desta mistura de agregados de fosfolipídeo tem uma afinidade elevada para colesterol e similares esteróis, e pode seletivamente remover tais moléculas de gorduras e óleos. A mistura de separação aquosa é misturada durante um tempo suficiente para seletivamente reduzir o teor de esterol do produto de gordu-ra/óleo através da divisão do esterol na porção de agregados de fosfolipídeo. A gordura ou óleo com teor reduzido de esterol é separado da mistura de separação aquosa. Alternativamente, a correspondente fração enriquecida por esterol também pode ser isolada da mistura de separação aquosa. Estas etapas podem ser realizadas em temperaturas ambiente, custos envolvidos em aquecimento são minimizados, como é a possibilidade de degradação térmica do produto. Adicionalmente, uma quantidade mínima de equipamento é requerida, e uma vez que todos os materiais requeridos são de grau alimentar, os métodos não requerem nenhuma precaução especial com respeito a manuseio, descarte de lixo, ou contaminação do(s) produto(s) fi-nal(is).
As fosfolipases e métodos da invenção podem ser empregados para remover esteróis de gorduras e óleos, como descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos n° 5.880.300. Os agregados de fosfolipídeos são contatados com, por exemplo, uma gordura ou óleo contendo esterol em um ambiente aquoso, em seguida misturados. Seguindo misturação adequada, a gordura ou óleo com teor de esterol reduzido é separado da mistura de separação aquosa. Alternativamente, de modo correspondente o fosfo-lipídeo enriquecido por esterol também pode ser isolado da mistura de separação aquosa. Os óleos de planta (por exemplo, vegetal) contêm esteróis de planta (fitosteróis) que também podem ser removidos empregando-se os métodos da presente invenção. Este método é aplicável a um produto de gordura/óleo em qualquer estágio de um ciclo de processamento comercial. Por exemplo, o processo da invenção pode ser aplicado a óleos refinados, branqueados e desodorizados ("óleos RBD"), ou a qualquer estágio de processamento antes de atingir o estado de RBD. Embora o óleo RBD possa ter uma densidade alterada em comparação ao óleo pré-RBD, os processos deles são facilmente adaptados a óleos RBD ou pré-RBD, ou a vários outros produtos de gordura/óleo, por variação de teor de fosfolipídeo, composição de fosfolipídeo, relações de fosfolipídeo: água, temperatura, pressão, condições de mistura, e condições de separação como abaixo descrito.
Alternativamente, as enzimas e métodos da invenção podem ser empregados para isolar fitosteróis ou outros esteróis em etapas intermediá- rias em processamento de óleo. Por exemplo, sabe-se que os fitosteróis são perdidos durante a desodorização de óleos de planta. Uma fração destilada contendo esterol de, por exemplo, um estágio intermediário de processamento pode ser submetida a procedimentos de extração de esterol acima descritos. Isto fornece uma lecitina enriquecida por esterol ou outro material de fosfolipídeos que pode ser também processado a fim de recuperar os es-teróis extraídos.
Composições Detergente A invenção fornece composições detergentes compreendendo uma ou mais fosfolipases da invenção, e métodos de preparação e emprego destas composições. A invenção incorpora todos os métodos de preparação e emprego de composições detergente, veja, por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos n°s 6.413.928, 6.399.561, 6.365.561, 6.380.147. As composições detergentes podem ser uma composição aquosa de uma ou duas partes, uma composição líquida não aquosa, um sólido de fusão, uma forma granular, uma forma em partículas, um comprimido prensado, um gel e/ou uma pasta e uma forma de suspensão. A invenção também fornece métodos capazes de uma rápida remoção de sujeiras alimentares brutas, películas de resíduo alimentar e outras composições alimentares menores empregando estas composições detergentes. As fosfolipases da invenção podem facilitar a remoção de cepas por meio de hidrólise catalítica de fosfolipídeos. As fos-folipases da invenção podem ser empregadas em detergentes de lavagem de louça e em detergentes de lavanderia têxtil. O teor de enzima ativa real depende do método de fabricação de uma composição detergente e não é crítico, assumindo que a solução detergente tem a atividade enzimática desejada. Em um aspecto, a quantidade de fosfolipase presente na solução final varia de cerca de 0,001 mg a 0,5 mg por grama da composição detergente. A enzima particular escolhida para uso no processo e produtos desta invenção depende das condições de utilidade final, incluindo a forma física do produto, pH de uso, temperatura de uso, e tipos de sujeiras a serem degradadas ou alteradas. A enzima pode ser escolhida para fornecer atividade e estabilidade ideal para qualquer dado grupo de condições de utilidade. Em um aspecto, os polipeptídeos da presente invenção são ativos nas faixas de pH de cerca de 4 a cerca de 12 e na faixa de temperatura de cerca de 20oC a cerca de 95oC. Os detergentes da invenção podem compreender tensoativos catiônicos, não iônicos semipola-res ou híbridos; ou, misturas destes.
As fosfolipases da presente invenção podem ser formuladas em detergentes em pó e líquidos tendo pH entre 4,0 e 12,0 em níveis de cerca de 0,01 a cerca de 5% (preferivelmente 0,1% a 0,5%) por peso. Estas composições detergentes podem também incluir outras enzimas tais como as conhecidas proteases, celulases, lípases ou endoglicosidases, bem como builders e estabilizantes. A adição de fosfolipases da invenção à composições de limpeza convencionais não cria qualquer limitação de uso especial. Em outras palavras, qualquer temperatura e pH adequados para o detergente é também adequado para as presentes composições, contanto que o pH inclua-se na faixa acima, e a temperatura esteja abaixo da temperatura de desnaturação da enzima descrita. Além disso, os polipeptídeos da invenção podem ser empregados em uma composição de limpeza sem detergentes, novamente ou sozinho ou em combinação com reforçadores e estabilizan-tes. A presente invenção fornece composições de limpeza ou desinfetantes incluindo composições detergentes e/ou desinfetantes para limpeza e/ou desinfecção de superfícies duras, composições detergentes para limpeza e/ou desinfecção de tecidos, composições de lavagem de louça, composições de limpeza oral, composições de limpeza de dentadura, e/ou soluções de limpeza de lente de contato.
Em um aspecto, a invenção fornece um método para lavagem de um objeto compreendendo contatar o objeto com uma fosfolipase da invenção sob condições suficientes para lavagem. Uma fosfolipase da invenção pode ser incluída como um aditivo detergente. A composição detergentes da invenção pode, por exemplo, ser formulada como uma composição detergente de lavanderia manual ou à máquina compreendendo uma fosfolipase da invenção. Um aditivo de lavanderia adequado para pré-tratamento de te- cidos manchados pode compreender uma fosfolipase da invenção. Uma composição amaciante de tecido pode compreender uma fosfolipase da invenção. Alternativamente, uma fosfolipase da invenção pode ser formulada como uma composição detergente para uso em operações de limpeza de superfície dura doméstica. Em aspectos alternativos, aditivos detergentes e composições detergente da invenção podem compreender uma ou mais outras enzimas tais como uma protease, uma lipase, uma cutinase, outra fosfolipase, uma carboidrase, uma celulase, uma pectinase, uma mananase, uma arabinase, uma galactanase, uma xilanase, uma oxidase, por exemplo, uma lactase, e/ou uma peroxidase. As propriedades da(s) enzima(s) da invenção são escolhidas serem compatíveis com o detergente selecionado (isto é, pH-ideal, compatibilidade com outros ingredientes enzimáticos e não-enzimáticos, etc.) e a(s) enzima(s) está(ão) presente(s) em quantidades eficazes. Em um aspecto, as enzimas de fosfolipase da invenção são empregadas para remover materiais malcheirosos de tecidos. Várias composições detergentes e métodos de prepará-las que podem ser empregados na prática da invenção são descritos em, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos n°s 6.333.301, 6.329.333, 6.326.341, 6.297.038, 6.309.871, 6.204.232, 6.197.070, 5.856.164.
Tratamento de Lixo As fosfolipases da invenção podem ser empregadas em tratamento de lixo. Em um aspecto, a invenção fornece um processo de digestão de lixo sólido empregando fosfolipases da invenção. Os métodos podem compreender reduzir a massa e o volume de lixo sólido substancialmente não tratado. O lixo sólido pode ser tratado com um processo digestivo enzi-mático na presença de uma solução enzimática (incluindo fosfolipases da invenção) em uma temperatura controlada. O lixo sólido pode ser convertido em um lixo liquefeito e qualquer lixo sólido residual. O lixo liquefeito resultante pode ser separado do referido qualquer lixo solidificado residual. Veja por exemplo, Patente dos Estados Unidos n° 5.709.796.
Destoxificação As fosfolipases (por exemplo, PLCs, patatinas da invenção) po- dem ser empregadas em processos de destoxificação, por exemplo, para a destoxificação de endotoxinas, por exemplo, composições compreendendo lipopolissacarídeos (LPS), e, a invenção fornece processos de destoxificação empregando pelo menos uma enzima da invenção, por exemplo, uma patatina tendo uma seqüência como mencionado na SEQ ID NO: 12 (codificada por SEQ ID NO: 11), SEQ ID NO: 14 (codificada por SEQ ID NO: 13), SEQ ID NO: 18 (codificada por SEQ ID NO: 17), SEQ ID NO: 26 (codificada por SEQ ID NO: 25), SEQ ID NO: 28 (codificada por SEQ ID NO: 27), SEQ ID NO: 34 (codificada por SEQ ID NO: 33), SEQ ID NO: 36 (codificada por SEQ ID NO: 35), SEQ ID NO: 44 (codificada por SEQ ID NO: 43), SEQ ID NO: 46 (codificada por SEQ ID NO: 45), SEQ ID NO: 56 (codificada por SEQ ID NO: 55), SEQ ID NO: 60 (codificada por SEQ ID NO: 59), SEQ ID NO: 66 (codificada por SEQ ID NO: 65), SEQ ID NO: 72 (codificada por SEQ ID NO: 71), SEQ ID NO: 78 (codificada por SEQ ID NO: 77), SEQ ID NO: 87 (codificada por SEQ ID NO: 86), SEQ ID NO: 88 (codificada por SEQ ID NO: 87), SEQ ID NO: 92 (codificada por SEQ ID NO: 91), SEQ ID NO: 96 (codificada por SEQ ID NO: 95), SEQ ID NO: 100 (codificada por SEQ ID NO: 99), SEQ ID NO: 104 (codificada por SEQ ID NO: 103), SEQ ID NO: 126 (codificada por SEQ ID NO: 125), SEQ ID NO: 128 (codificada por SEQ ID NO: 127), SEQ ID NO: 132 (codificada por SEQ ID NO: 131), SEQ ID NO: 134 (codificada por SEQ ID NO: 133), SEQ ID NO: 136 (codificada por SEQ ID NO: 135), ou SEQ ID NO: 138 (codificada por SEQ ID NO: 137). Em um aspecto, uma fosfolipase da invenção é empregada para destoxificar um lipopolissa-carídeo (LPS). Em um aspecto, esta destoxificação é por desacilação de cadeias de ácido graxo 2' e/ou 3' de lipídeo A. Em um aspecto, uma fosfoli-pase (por exemplo, um PLC, uma patatina) da invenção é empregada para hidrolisar uma cadeia de 2'-lauroíla e/ou 3'-miristoíla de um lipídeo, por exemplo, um lipídeo A (por exemplo, de uma endotoxina bacteriana). Em um aspecto, o processo da invenção é empregado para destruir uma endotoxi-na, por exemplo, uma toxina de uma bactéria gram-negativa, como de E. coli. Em um aspecto, a fosfolipase (por exemplo, um PLC, uma patatina) da presente invenção é empregada para melhorar os efeitos de envenenamento de toxina (por exemplo, de uma infecção gram-negativa em desenvolvimento), ou, para profilaticamente prevenir os efeitos de endotoxina durante uma infecção (por exemplo, uma infecção em um animal ou um humano). Conseqüentemente, a invenção fornece uma composição farmacêuticas que compreende uma fosfolipase (por exemplo, um PLC, uma patatina) da invenção, e método empregando uma hidrolase da invenção, para a melhora ou prevenção de efeitos tóxicos de lipopolissacarídeo (LPS), por exemplo, durante sepse.
Processamento de alimento As fosfolipases da invenção podem ser empregadas para processar alimentos, por exemplo, para alterar sua estabilidade, vida de prateleira, sabor, textura, melhorar seu estado nutricional, e os similares. Por exemplo, em um aspecto, as fosfolipases da invenção são empregadas para gerar fosfolipídeos acídicos para controlar sabor amargo em alimentos.
Em um aspecto, a invenção fornece processos de fabricação de queijo empregando fosfolipases da invenção (e, desse modo, a invenção também fornece queijos compreendendo fosfolipases da invenção). Em um aspecto, as enzimas da invenção (por exemplo, fosfolipase A, lisofosfolipase ou uma combinação destas) são empregadas para processar queijos para realce do sabor, para aumentar a produção e/ou para "estabilizar" queijos, por exemplo, reduzindo a tendência para "sem-óleo", ou, em um aspecto, as enzimas da invenção são empregadas para produzir queijo de leite de queijo. Estes processos da invenção podem incorporar qualquer método ou protocolo, por exemplo, como descrito, por exemplo, nas Patentes dos Estados Unidos n°s 6.551.635, e 6.399.121, WO 03/070013, WO 00/054601. Por exemplo, em um aspecto, as fosfolipases da invenção são empregadas para estabilizar emulsão de gordura em leite ou composições compreendendo leite, por exemplo, creme, e são empregadas para estabilizar composições de leite, por exemplo, para fabricação de cremes ou líquidos de creme. Em um aspecto, a invenção fornece um processo para realçar o sabor de um queijo empregando pelo menos uma enzima da invenção, o processo compreendendo incubar uma proteína, uma gordura, e uma protease e uma lípa- se em um meio aquoso sob condições que produzem um sabor de queijo realçado (por exemplo, amargor reduzido), por exemplo, como descrito no WO 99/66805. Em um aspecto, fosfolipases da invenção são empregadas para realçar o sabor em um queijo (por exemplo, um coágulo) misturando-se com água, uma protease, e uma lipase (da invenção) em uma temperatura elevada, por exemplo, entre cerca de 75oC a 95oC, como descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos n° 4.752.483. Em um aspecto, fos-folipases da invenção são empregadas para acelerar o envelhecimento do queijo adicionando-se uma enzima da invenção (por exemplo, uma lipase ou uma fosfolipase) a um queijo (por exemplo, um leite de queijo) antes de adicionar um coagulante ao leite, ou, adicionando-se uma enzima da invenção a um coágulo com sal antes de prensar, por exemplo, como descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos n° 4.707.364. Em um aspecto, a lipase da invenção é empregada para degradar um triglicerídeo em gordura de leite para liberar ácidos graxos livres, resultando em realce do sabor. Uma protease também pode ser empregada em qualquer destes processos da invenção, veja, por exemplo, Brindisi (2001) J. of Food Sci. 66:1100-1107. Em outro aspecto, uma combinação de esterases, lipases, fosfolipases e/ou proteases pode ser empregada nestes ou qualquer processo da invenção.
Em um aspecto, uma fosfolipase da invenção é empregada para reduzir o teor de componentes de fósforo em um alimento, por exemplo, um óleo, tal como um óleo vegetal tendo um teor de fósforo não-hidratável elevado, por exemplo, como descrito no WO 98/26057.
Outros usos para as fosfolipases da invenção As fosfolipases da invenção podem também ser empregadas para estudar o sistema de sinalização de fosfoinositídeo (PI); no diagnóstico, prognóstico e desenvolvimento de tratamentos para distúrbios bipolares (veja, por exemplo, Pandey (2002) Neuropsychopharmacology 26:216-228); como antioxidantes; como fosfolipídeos modificados; como agentes de es-pumação e gelação; para gerar lipídeos angiogênicos para vascularização de tecidos; para identificar fosfolipase, por exemplo, PLA, PLB, PLC, PLD e/ou moduladores de patatina (agonistas ou antagonistas), por exemplo, ini- bidores para uso como antineoplásicos, antiinflamatórios e como agentes analgésicos. Eles podem ser empregados para gerar fosfolipídeos acídicos para controlar o sabor amargo em alimento e produtos farmacêuticos. Eles podem ser empregados em purificação de gordura. Eles podem ser empregados para identificar os inibidores de peptídeos para o tratamento de doenças virais, inflamatórias, alérgicas e cardiovasculares. Eles podem ser empregados para preparar vacinas. Eles podem ser empregados para preparar os glicerídeos de ácido graxo poliinsaturados e fosfatidilgliceróis.
As fosfolipases da invenção, por exemplo, enzimas PLA e PLC, são empregadas para gerar imunotoxinas e vários produtos terapêuticos para tratamentos anticâncer.
As fosfolipases da invenção podem ser empregadas em conjunto com outras enzimas para descolorir (isto é, remoção de clorofila) e em detergentes (veja acima), por exemplo, em conjunto com outras enzimas (por exemplo, lipases, proteases, esterases, fosfatases). Por exemplo, em qualquer caso onde um PLC é empregado, um PLD e uma fosfatase pode ser empregada em combinação, para produzir o mesmo resultado como um PLC sozinho. A seguinte tabela resume diversos processos exemplares e formulações da invenção: Processo Exemplar da Invenção Propósito Uso Químico em desengomamento de óleo PLC
Nenhum uso de ácido Eliminação química Nenhum uso de cáustico Eliminação química Faixa de uso de ácido e cáustico (ne- Modalidade alternativa de processo nhum excesso para excesso) de desengomamento/redução química Modalidades alternativas de processo Outros tipos de ácido e cáustico de desengomamento Impacto de água em desengoma-mento de óleo PLC
Substituição de etapa de lavagem de Uso de sílica gel água Uso de agente de secagem de água Eliminação de água em produto final Impacto de menos água durante tratamento cústico Eliminação de água em produto final Teor mínimo de água (< 5%) Eliminação de água em produto final Teor máximo de água (> 5%) Processo alternativo Perfis de umidade em desengoma- Modalidade alternativa de processo mento de PLC. de desengomamento Dependência de óleo em teor de água Modalidade alternativa de processo para desengomamento PLC de desengomamento Remoção In situ de ácidos graxos livres, FFAs Modalidade alternativa de processo de desengomamento; melhora as condições em óleo de feijões debu- Adição de agente de quelação de FFA lhado.
Impacto de regime de mistura em desengomamento de óleo PLC
Proteção de enzima de desnaturação Desengomamento PLC com mistura- induzida por misturação, economia de ção mínima. energia.
Desengomamento PLC com misturação de cisalhamento inicial, seguido Modalidade alternativa de processo por misturação por batedeira de desengomamento Ordem de adição de produtos químicos Permite o PLC de trabalhar antes da exposição a ácido e/ou cáustico, cau- Ordem de adição: enzima-água se- sando inativação de PLC por pH po-guido por ácido em seguida cáustico. tencial ou quelação de metal.
Modalidades alternativas de processo de desengomamento de óleo PLC para temperatura e tempo Etapa de tratamento de enzima (tempo): <60 minutos, preferivelmente < Modalidade alternativa de processo 30 minutos. de desengomamento Etapa de tratamento de enzima (temperatura): 50-70°C, possivelmente Modalidade alternativa de processo <50°C (por exemplo, RT) de desengomamento Benefícios de desengomamento de óleo PLC
Produção de matéria-prima de sabão com teor de PL minimizado e enrique- Modalidade alternativa de processo cido em ésteres de fosfato solúveis de desengomamento em água. Óleo neutro reduzido em goma atra- Modalidade alternativa de processo vés do uso de PLC de desengomamento Processo de geração de aumentou de DAG em óleos vegetais (por ex, 1,3- Modalidade alternativa de processo DAG) de desengomamento Benefídios de emprego de óleos vegetais DAG aumentado com outros óleos para benefício à saúde. Benefício de Produto Exemplar Investigar processo de desengoma- Modalidade alternativa de processo mento que não deixa nenhua ativida- de desengomamento / melhora regu- de de PLC em óleo ladora.
Investigar processo de desengoma- Modalidade alternativa de processo mento que não deixa nenhuma prote- de desengomamento / melhora regu- ína PLC detectável em óleo. ladora.
Uso de uma enzima para produzir DAG de massa de goma de lecitina Benefício de Produto Exemplar Uso de PLC com óleos de especialidade (PA, PI enriquecidos) Benefício de Produto Exemplar Uso de enzimas específicas de PA/PI Modalidade alternativa de processo (por exemplo, 596ES2/PI específico) de desengomamento Uso de enzimas específicas de PA/PI (por exemplo, 596ES2/PI específico)+ enzimas específicas de PC/PE; im- Modalidade alternativa de processo pacto de ordem de adição de desengomamento.
Modalidade alternativa de processo Processo em batelada ou contínuo. de desengomamento Uso de goma tratada por PLC ressus- penso para outras operações de de- Modalidade alternativa de processo sengomamento de óleo de desengomamento.
Equilíbrio de Massa para DAG, FFA, Modalidade alternativa de processo P, metais, óleo neutro em goma. de desengomamento Heterogêneos Adição de PLC aos grãos de semente de óleo em flocos antes da extrusão. Modalidade alternativa de processo.
Ensaio de desengomamento em pe- Modalidade alternativa de processo quena escala. de desengomamento Uso de outras enzimas para reduzir a massa de goma (por exemplo, enzima PYROLASETM, clorofillase, peroxida- Modalidade alternativa de processo se, lipase, lacase, mananase, pro- de desengomamento. tease, lactase, amilase, etc. ou combinações destas).
Uso de composto para melhor facilitar Modalidade alternativa de processo separação de óleo/goma. de desengomamento Goma endurecida de óleo tratado por Modalidade alternativa de processo PLC de desengomamento Variantes glicosiladas/desglicosiladas Modalidade alternativa de processo de fosfolipase de desengomamento Formulações Exemplares da invenção Propósito Formulação Líquida Exemplar para estabilidade.
Estabilização de enzima para produ-Uso de compostos para aumentar a ção máxima de DAG, possivelmente estabilidade de PLC em diferentes pH para alterar a especificidade de subs-e faixas de temp. (polióis, sais, me- trato ou controlar a formação de pro- tais...) duto para o tipo 1,3-DAG.
Estabilização de enzima para produ-Uso de um sistema de liberação hidro- ção máxima de DAG, possivelmente fóbico para PLC (lipossomas, enzima para alterar a especificidade de subs-hidratada em gotículas de óleo refina- trato ou controlar a formação de pro- do). duto para o tipo 1,3-DAG.
Formulação sólida para estabilidade Uso de diferente PLC, sistemas Veí- Estabilização da(s) enzima(s) e facili-culos de fosfolipase (resinas de imobi- dade de separação da enzima da fase lização, matrizes porosas, géis, grânu- de goma ou óleo após desengoma- los, pós, comprimidos, vesícu- mento; reciclabilidade da preparação las/micelas, encapsulados, líquidos da enzima; separação física da fase estruturados, etc) para estabilizar fos- de enzima durante o processamento folipase e co-enzimas do óleo; ataque de PI/PA por PLC
Uso de materiais de lixo de desengo- Redução de custo de ingrediente de mamento (componentes de goma, formulação, melhor miscibilidade de cascas de semente) para formulação enzima com óleo, termoestabilização de PLC. da enzima.
Formulação exemplar e processos para reforçar a atividade.
Uso de produto químico ou enzima para ajudar a dispersar a enzima me- Tempo de reação mais rápido lhor em óleo (por exemplo, matriz /processo de desengomamen- efervescente, etc). to/redução de uso químico.
Re-utilização de gomas/enzima para outras reações de desengomamento. Reciclabilidade da enzima.
Uso de formulações que realçam a Tempo de reação mais rápido segregação ou captura da enzima de /processo de desengomamen- PLs para hidrólise. to/redução de uso químico.
Versatilidade de processo; diferentes enzimas podem requerer diferentes Uso de formulações múltiplas para formulações ou podem ser adiciona-acomodar PLCs com diferentes espe- das em diferentes estágios no pro- cificidades de PL. cesso.
Use de múltiplas formulações para prevenir a inativação de um PLC por um componente na prep de outro PLC Proteção de atividades de PLC em com diferente especificidade de subs- uma modalidade de formato de multi- trato. enzima.
Uso de múltiplas formulações para prevenir a inativação de um PLC por Proteção de atividade de PLC em um componente na prep de outra en- uma modalidade de formato de multi- zima (hidrolase, oxidase). enzima.
Uso de adições cáustica intermitente Proteção de enzima a partir de desna-como em formulação de adição cáus- turação induzida por misturação, eco- tica de liberação controlada. nomia de energia.
Atividade de Inativação e Modulação de Enzimas por Glicosilação Esta invenção fornece métodos que compreendem o uso de tecnologia recombinante para preparar e expressar enzimas ou outras proteínas com atividade biológica, por exemplo, enzimas nocivas ou tóxicas, (onde as enzimas ou outras proteínas não são normalmente glicosiladas) em uma forma inativa ou menos ativa, porém re-ativável. O método compreende adicionar um ou mais sítios de glicosilação (por exemplo, glicosilação ligada por N ou ligada por O) dentro das enzimas ou outras proteínas com atividade biológica (por exemplo, uma enzima da presente invenção) por construção de uma seqüência de codificação incorporando o(s) novo(s) sítio(s) de glicosilação; expressando as seqüências de codificação de variante em células eucarióticas ou um equivalente construído ou sistema in vitro capaz de glicosilação pós-translacional. Por exemplo, a seqüência de aminoácido 3 NXS/T é o sítio para glicosilação em células eucarióticas, as células procarióticas não fazem isto. Desse modo, a invenção compreende adicionar pelo menos uma seqüência de aminoácido 3 NXS/T à proteína tal que sua atividade seja diminuída ou inativada por causa de glicosilação pós- translacional. A glicosilação pode resultar em 2 moléculas de N-acetila gluco- samina de (NGlucNac) sendo adicionadas ao resíduo de N. As adições sub-seqüentes podem ser específicas de organismo. Na maioria das espécies açúcares de manose (Mann) são então adicionados sobre o NGlucNac, com o número de resíduos de Mann variando de 10 a 100. O ácido siálico pode também ser adicionado em algumas espécies. Em Pichia após o NGlucNac ser adicionado, 10 a 25 resíduos de Mann podem ser adicionados.
Estes métodos compreendem qualquer enzima ou grupo de enzimas de desglicosilação, muitas das quais podem ter sido identificadas e/ou são comercialmente disponíveis. Por exemplo, a enzima H de endoglicosidase cliva no último NGlucNac deixando um NClucNac ainda ligado ao resíduo de N. A enzima de PNGaseF separa-se de todos açúcares e converte a cadeia lateral de amino do resíduo N em um grupo de hidroxila resultando no aminoácido de N tornando-se um aminoácido de aspartato (D) na enzima. Desse modo, os métodos compreendem empregar endoglicosidase H e/ou PNGaseF ou enzimas equivalentes in vivo ou in vitro para re-ativar parcialmente ou completamente as proteínas "temporariamente inativadas" construídas. O método compreende rotular as enzimas ou outros polipeptí-deos para a trilha secretora hospedeira de modo que as enzimas sejam gli-cosiladas. Os novos sítios de glicosilação são designados de modo que a glicosilação inative a enzima ou modifique sua atividade, por exemplo, diminua sua atividade ou de outro modo modifique a atividade, tal como bloqueie um sítio de ligação de substrato. Por que a enzima é inativa ou menos ativa, enzimas nocivas ou tóxicas podem ser expressas em níveis mais elevados uma vez que os efeitos negativos de sua atividade são não mais uma limitação de como muito da proteína pode acumular-se nas células hospedeiras. A enzima glicosilada, inativa, pode ser reativada (parcialmente ou completamente) por remoção dos açúcares, por exemplo, empregando enzimas de desglicosilação comercialmente disponíveis, por exemplo, removendo os açúcares in vitro, ou removendo os açúcares in vivo empregando métodos de construção de célula inteira.
Em um aspecto, um sítio alvo de glicosilação eucariótica tal co- mo NXS/T é adicionado a qualquer proteína, por exemplo, uma enzima da invenção. Isto possibilita alguém versado na técnica adicionar sítios de glicosilação a uma proteína de interesse com a expectativa de converter aquela proteína em uma que seja temporariamente inativa quando aquela proteína é glicosilada expressando aquela proteína em uma célula hospedeira euca-riótica e rotlando a proteína para a trilha secretora de célula hospedeira.
Desse modo, a invenção fornece métodos para a produção de enzimas que normalmente são bastante nocivas ou tóxicas para serem toleradas em grandes quantidades por uma célula hospedeira. O efeito pode temporariamente quando for possível regenerar a enzima ativa (por desgli-cosilação, por exemplo, por modificação pós-translacional/desglicosilação) para futuro trabalho requerendo uma enzima ativa.
Em um aspecto, a invenção fornece métodos para preparar e expressar uma proteína tendo uma atividade biológica cuja atividade é temporariamente inativada por glicosilação compreendendo: (a) fornecer um ácido nucléico codificando uma proteína tendo uma atividade biológica, onde a proteína não é naturalmente glicosilada; (b) inserir pelo menos uma se-qüência de codificação de motivo de glicosilação, no ácido nucléico codificando proteína, onde a forma glicosilada da proteína é inativa; (c) inserir uma seqüência de rotulação na proteína de modo que ela seja direcionada para um para uma trilha secretora de célula hospedeira, onde a célula hospedeira é capaz de reconhecer o motivo de glicosilação e glicosilar a proteína; e (d) expressar o ácido nucléico modificado na célula hospedeira. Em um aspecto, o método também compreende desglicosilar a proteína expressa, desse modo reativando a atividade da proteína, por exemplo, uma enzima, tal como uma enzima da invenção. Em um aspecto, a célula hospedeira é uma célula eucariótica. Em um aspecto, a proteína recombinante expressa inativado é re-ativada in vitro por desglicosilação, ou química ou enzimática. A determinação da colocação de um ou mais motivos de glicosilação para temporariamente inativar uma proteína envolve apenas métodos de rotina de preparação de ácidos nucléicos codificando proteína variante, por exemplo, por GSSM®, e protocolos de avaliação de rotina, por exemplo, ensaios de atividade ou ligação.
Uma enzima cuja atividade foi prejudicial à célula hospedeira foi tornada inativa por causa da glicosilação. Por que ela estava inativa ela pôde acumular-se em níveis muito mais elevados nas células hospedeira eucarióticas. Por que ela não estava mais ativa ela não pôde mais ser capaz de exercer seus efeitos negativos. A inativação da enzima tóxica foi temporária por que a desglicosilação da enzima empregando EndoH ou PNGase F resultou em uma completa restauração de atividade normal para a enzima. Uma grande quantidade da enzima inativa glicosilada acumulou-se no meio sugerindo que ela foi bem tolerada pelo hospedeiro como forma inativa. A invenção será também descrita com referência aos seguintes exemplos; entretanto, deve-se entender que a invenção não está limitada a tais exemplos.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1: PROGRAMA BLAST EMPREGADO PARA PERFIL DE IDENTIDADE DE SEQÜÊNCIA
Este exemplo descreve um programa de identidade de seqüên-cia exemplar para determinar se um ácido nucléico inclui-se no escopo da invenção. Um programa NCBI BLAST 2.2.2 é empregado, opções de default para blastp. Todos os valores de default foram empregados exceto para o default de fixação de filtragem (isto é, todos os parâmetros estabelecidos para default exceto filtragem que é estabelecida para OFF); em seu lugar uma fixação "-F F" é empregada, que incapacita a filtragem. O uso de default de filtragem freqüentemente resulta em violações Karlin-Altschul devido a comprimento curto de seqüência. Os valores de default empregados neste exemplo: "Filtro para baixa complexidade: ON > Tamanho de Palavra: 3 > Matriz: Blosum62 > Custos de Espaço: Existência:11 > Extensão:1" Outras fixações de default foram: filtro para baixa complexidade OFF, tamanho de palavra de 3 para proteína, matriz BLOSUM62, penalidade de existência de espaço de -11 e uma penalidade de extensão de espaço de -1. A opção "-W" foi estabelecida para default para 0. Isto significa que, se não estabelecido, o tamanho de palavra padroniza em 3 para as proteínas e 11 para nucleotídeos. As leituras de fixação: <<README.bls.txt>> > ----------------------------------------------------- > argumentos blastall: > > -p Nome do Programa [String] > -d Base de Dados [String] > default = nr > -i Arquivo Query [Arquivo In] > default = stdin > -e Valor de expectativa (E) [Real] > default = 10.0 > -m opções de vista de alinhamento: > 0 = em pares, > 1 = query-ancorada mostrando identidades, > 2 = query-ancorada, nenhuma identidade, > 3 = query uniforme-ancorada, mostra identidades, > 4 = query uniforme-ancorada, nenhuma identidade, > 5 = query-ancorada, nenhuma identidade e extremidade embotadas, > 6 = query uniforme-ancorada, nenhuma identidade e extremidades embotadas, > 7 = saída XML Blast, > 8 = tabular, > 9 tabular com linhas de comentário [Número inteiro] > default = 0 > -o BLAST report Output File [Arquivo de Saída] Opcional > default = stdout > -F Seqüência query de filtro (DUST com blastn, SEG com outros) [String] > default = T > -G Custo para abrir um espaço (zero evoca comportamento de default) [Número inteiro] > default = 0 > -E Custo para estender um espaço (zero evoca comportamento de default) [Número inteiro] > default = 0 > -X X valor de queda para alinhamento aberto (em bits) (zero evoca comportamento de default) [Número inteiro] > default = 0 > -I Mostra GI's em deflines [T/F] > default = F > -q Penalidade para um emparelhamento imperfeito de nucleotídeo (blastn apenas) [Número inteiro] > default = -3 > -r Prêmio para um emparelhamento de nucleotídeo (blastn apenas) [Número inteiro] > default = 1 > -v Número de seqüências de base de dados para mostrar descrições de uma linha para (V) > [Número inteiro] > default = 500 > -b Número de seqüência de base de dados para mostrar alinhamentos para (B) [Número inteiro] > default = 250 > -f Princípio para extensão de hits, default se zero [Número inteiro] > default = 0 > -g Realizar alinhamento aberto (não disponível com tblastx) [T/F] > default = T > -Q Código genético query para uso [Número inteiro] > default = 1 > -D DB Código genético (para tblast[nx] apenas) [Número inteiro] > default = 1 > -a Número de processadores para uso [Número inteiro] > default = 1 > -O Arquivo SeqAlign [Arquivo de Saída] Opcional > -J Acredite a defline query [T/F] > default = F > -M Matriz [String] > default = BLOSUM62 > -W Tamanho de palavra, default se zero [Número inteiro] > default = 0 > -z Comprimento efetivo da base de dados (use zero para o tamanho real) > [String] > default = 0 > -K Número de melhores hits de uma região para manter (desligado por default, se usado um > valor de 100 é recomendado) [Número inteiro] > default = 0 > -P 0 para múltiplos hits 1-passagem, 1 para único hit 1-passagem, 2 para 2-passagens > [Número inteiro] > default = 0 > -Y Comprimento efetivo do espaço de pesquisa (use zero para o tamanho real) > [Real] > default = 0 > -S Filamento Query para pesquisar a base de dados (para blast[nx], e > tblastx). 3 é ambos, 1 é o topo, 2 é a base [Número inteiro] > default = 3 > -T Produz saída de HTML [T/F] > default = F > -l Pesquisa restrita de base de dados para lista de GI's [String] Opcional > -U Use filtragem de letra minúscula de seqüência FASTA [T/F] Opcional > default = F > -y Queda (X) para extensões blast em bits (0.0 evoca comportamento de > default) [Real] > default = 0.0 > -Z X valor de queda para alinhamento aberto final (em bits) [Número inteiro] > default = 0 > -R PSI-TBLASTN arquivo barreira [Arquivo incluso] Opcional > -n pesquisa MegaBlast [T/F] > default = F > -L Localização sobre a seqüência query [String] Opcional > -A Tamanho de janela de múltiplos Hits (zero para algoritmo de único hit) [Número inteiro] > default = 40 EXEMPLO 2: SIMULAÇÃO DE DESENGOMAMENTO MEDIADO POR PLC
Este exemplo descreve a simulação de desengomamento mediado por fosfolipase C (PLC).
Devido a sua má solubilidade em fosfatidilcolina de água (PC) foi originalmente dissolvido em etanol (100 mg/ml). Para teste inicial, uma solução de matéria-prima de PC em 50 mM de ácido 3-morfolinopropanossul-fólico ou 60 mM de ácido cítrico/NaOH em pH 6 foi preparada. A solução de matéria-prima de PC (10pl, 1 pg/pl) foi adicionada a 500 pl de óleo de soja refinado (2% de água) em um tubo Eppendorf. Para gerar uma emulsão o conteúdo do tubo foi misturado durante 3 minutos vortexando (veja a Fig. 5A). A fase de água e óleo foi separada por centrifugação durante 1 minuto a 13.000 rpm (Fig. 5B). Os tubos de reação foram pré-incubados na temperatura desejada (37°C, 50°C, ou 60°C) e 3 pl de PLC de Bacillus cereus (0,9 U/pl) foram adicionados à fase de água (Fig. 5C). O desaparecimento de PC foi analisado por TLC empregando clorofórmio/ metanol/ água (65:25:4) como um sistema solvente (veja, por exemplo, Taguchi (1975) supra) e foi visualizado após exposição a vapor de I2. A figura 5 esquematicamente ilustra um sistema modelo de duas fazes para simulação de desengomamento mediado por PLC. Fig. 5A: Geração de emulsão misturando-se óleo bruto com água a 2% para hidratar os fosfatídeos contaminantes (P). Fig. 5B: As fases de óleo e água são separadas após a centrifugação e PLC é adicionado à fase de água, que contém os fosfatídeos precipitados ("gomas"). A hidrólise de PLC ocorre na fase de água. Fig. 5C: O curso de tempo da reação é monitorada por retirada das alíquotas da fase de água e analisando-as por TLC.
EXEMPLO 3: EXPRESSÃO DE FOSFOLIPASES
Este exemplo descreve a construção de uma cepa de produção comercial da invenção que pode expressar fosfolipases múltiplas (incluindo enzimas da invenção). A fim de produzir uma formulação de múltiplas enzimas adequada para uso no desengomamento de óleos vegetais de grau alimentar (incluindo soja, canola, e girassol), uma cepa de expressão re-combinante pode ser gerada que expressa duas diferentes seqüências de fosfolipase no mesmo hospedeiro de expressão. Por exemplo, esta cepa pode ser construída para conter uma ou mais cópias de um gene PLC e uma ou mais cópias de um gene de PLC de fosfatidilinositol. Estes genes podem existir em um plasmídeo, múltiplos plasmídeos, ou os genes podem ser inseridos no genoma do hospedeiro de expressão por recombinação homóloga. Quando os genes são introduzidos por recombinação homóloga, os genes podem ser introduzidos em um único sítio no genoma hospedeiro como um cassete de expressão de DNA que contém uma ou mais cópias de ambos os genes. Alternativamente, uma ou mais cópias de cada gene podem ser introduzidas em sítios distintos no cromossoma hospedeiro. A expressão destas duas seqüências pode ser controlada por um tipo de promotor ou cada seqüência de gene pode ser controlada por um promotor independente. Dependendo do número de cópias de caga gene e o tipo de promotor, a cepa final expressará relações variáveis de cada tipo de enzima ativa. As cepas de expressão podem ser construídas empregando-se qualquer Bacillus (por exemplo, B. cereus) ou Streptomyces, E. coli, S. pombe, P. pastoris, ou outros sistemas de expressão gram-negativos, gram-positivos, ou de levedura.
Em um aspecto, a invenção fornece um sistema de duas enzi- mas para desengomamento de óleo de soja, onde pelo menos uma enzima é uma enzima da invenção. PLC mais PI-PLC produz mais DAG do que qualquer das enzimas sozinha. Entretanto, ambas as enzimas produzem mais DAG do que uma amostra de controle de nenhuma enzima. Em um aspecto, as condições de reação compreendem 1 mililitro de óleo de soja, ~ 0,4% de umidade inicial no óleo antes de quaisquer adições, 50°C, ácido cítrico a 0,2% neutralizado com 2,75M de NaOH, 10U de PLC, 15 pL de PI-PLC (0,45 mg de proteína total), 1 hora de tempo de reação total. A figura 12 ilustra uma Tabela que resume dados deste sistema de desengomamento de duas enzimas da invenção.
Em outro aspecto, uma enzima PI-PLC da invenção pode ser empregada sob as mesmas condições descritas para PLC. Estas incluem refinamento químico de óleos vegetais e desengomamento de água de óleos vegetais.
EXEMPLO 4: FOSFOLIPASES COM EXPRESSÃO MELHORADA E RESISTÊNCIA DE PROTEASE ALTERADA A invenção fornece métodos para selecionar variantes de Fosfolipase C (mutantes) tendo expressão melhorada em um hospedeiro de glicosilação e resistência alterada para proteases secretadas.
Expressão melhorada em um hospedeiro de glicosilação.
Sítios de glicosilação ligados por asparaginas potenciais com a seqüência de consenso de aminoácido, asparagina-qualquer aminoácido-serina ou treonina (NXS/T no código de aminoácido de uma letra), foram nocauteados empregando-se métodos de mutagênese para mudar as aspa-raginas ou a serina ou a treonina no motivo de reconhecimento de glicosilação para um diferente aminoácido, então a seqüência não mais codifica um sítio de glicosilação potencial. A eliminação dos sítios de glicosilação foi realizada como indicado abaixo: posições de aminoácido, de aminoácido 63, aminoácido 131, e aminoácido 134, da enzima de fosfolipase C da invenção tendo uma seqüência de aminoácido como mencionado na SEQ ID NO: 2, codificada, por exemplo, por SEQ ID NO: 1. Esta eliminação dos sítios de glicosilação melhorou a expressão desta variante, enzima de fosfolipase C ativa (PLC, SEQ ID NO: 2) quando a proteína foi heterologamente expressa na levedura Pichia pastoris. Esta estratégia de reduzir ou eliminar os sítios de glicosilação potencial na enzima de PLC pode melhorar a expressão de PLC ativo em qualquer hospedeiro de glicosilação. Desse modo, a invenção fornece enzimas de fosfolipase (e os ácidos nucléicos que as codificam) tendo uma seqüência de qualquer das fosfolipases exemplares da invenção com um ou mais ou todos os sítios de glicosilação alterados, como descrito acima. Desse modo, a invenção fornece métodos de preparar seqüências de codificação de fosfolipase variantes tendo expressão aumentada em uma célula hospedeira, onde o método compreende modificar uma seqüência de codificação de fosfolipase da invenção tal que um, diversos ou todos os motivos de codificação de sítio de glicosilação ligados por N são modificados para um motivo não glicosilado. A invenção também fornece seqüência de codificação de fosfolipase feita por este processo, e as enzimas que eles codificam.
Resistência alterada à protease A invenção fornece métodos para preparar uma seqüência de codificação de fosfolipase variante codificando uma fosfolipase tendo resistência aumentada a uma protease compreendendo modificar um equivalente de aminoácido para a posição 131 de SEQ ID NO: 2 para um, diversos ou todos os seguintes resíduos: Lisina (K); Serina (S); Glicina (G); Arginina (R); Glutamina (Q); Alanina (A); Isoleucina (I); Histidina (H); Fenilalanina (F); Treonina (T); Meti-onina (M) Leucina (L), incluindo variantes para SEQ ID NO: 2 (e o ácido nucléico que os codifica) tendo estas modificações exemplares. A invenção também fornece fosfolipases isoladas, sintéticas ou recombinantes codificadas por uma seqüência feita por este método. A invenção também fornece métodos para preparar uma seqüência de codificação de fosfolipase variante codificando uma fosfolipase tendo resistência diminuída para uma protease compreendendo modificar um equivalente de aminoácido para a posição 131 de SEQ ID NO: 2 para um, diversos ou todos os seguintes resíduos: Tripto-fano (W); Glutamato (E); Tirosina (Y), incluindo variantes para SEQ ID NO: 2 (e o ácido nucléico que os codifica) tendo estas modificações exemplares. A invenção também fornece fosfolipases isoladas, sintéticas ou recombinantes codificadas por uma seqüência feita por este método. O sobrenadante contendo uma mistura de proteases Pichia pastoris secretadas nativas é misturado e incubado com preparações de enzima PLC tipo selvagem e mutante. As reações são saciadas e a degradação visualizada por SDS-PAGE versus o controle negativo de nenhuma protease. A degradação pode também ser determinada por avaliação da atividade de PLC residual. Novidade foi derivada da observação de que certas mutações para nocautear a glicosilação significantemente alteram a suscetibilidade da fosfolipase expressa à degradação durante a fermentação. Uma vantagem para o métodos é a seleção direta de mutantes com resistência aumentada ou diminuída às proteases secretadas pelo organismo hospedeiro durante a produção.
Este processo da invenção pode empregar mutagênese direcionada ao sítio (por exemplo, GSSM®) para mudar a seqüência de aminoácido de uma enzima de fosfolipase C da invenção, por exemplo, como mostrado abaixo - uma subseqüência de SEQ ID NO: 2 codificada por SEQ ID NO: 1. Cada dos aminoácidos realçados em vermelho (abaixo em SEQ ID NO:175) foi alterado de asparagina (N em código de uma letra) para Aspartato (D), serina (S), ou outro aminoácido como abaixo descrito. Estes aminoácidos são designados como aminoácido 63, aminoácido 131, e aminoácido 134 da seqüência abaixo onde o triptofano (W) é designado aminoácido 1. Estas mutações foram feitas para aumentar a expressão de proteína de fosfolipase C ativa (SEQ ID NO:176) reduzindo a glicosilação da proteína expressa no sistema de expressão de Pichia pastoris. Estas mesmas mutações podem aumentar a expressão de qualquer fosfolipase C ativa da invenção em qualquer outro sistema de expressão que glicosila asparaginas (glicosilação ligada por N) de acordo com o sistema NXS/T onde N é asparagina, X é qualquer aminoácido, e S/T é serina ou treonina. Desse modo, a invenção também fornece um processo para mudar a suscetibilidade da fosfolipase C expressa mudando o aminoácido na posição 131.
Aminoácidos 38-286 de SEQ ID NO: 2: Incorporar essas três modificações neste resíduo 245 longo de proteína (todo o resíduo 282 longo completo da seqüência de aminoácidos de fosfolipase de proteína C, com todas três modificações, é SEQ ID NO:176) NOTA: Para contar as posições alteradas, contra os primeiros aminoácidos (W) como posição 1. WSAEDKHNEGINSHLWIVNRAIDIMSRNTTIVNPNETALL-NEWRADLENGIYSADYENPYYDSTYASHFYDPDTGTTYIPFAKH-AKETGAKYFNLAGQAYQNQDMQQAFFYLGLSLHYLGDVNQPMHAAF-TLSYPMGFHSKYENFVDTIKNNYIVSDSNGYWNWKGANPEDWIEGAA-VAAKQDYPGVVNDTTKDWFVKAAVSQEYADKWRAEVTPVTGKRLMEA-QRVTAGYIHLWFDTYVNR- (SEQ ID NO:175) As variantes de fosfolipase C expressas foram incubadas na presença de P. pastoris proteases como descrito abaixo e os seguintes resultados foram obtidos: Os seguintes aminoácidos em posição de aminoácido 131 de SEQ ID NO: 2 aumentaram a resistência da fosfolipase C expressa para degradação por P. pastoris proteases: Lisina (K); Serina (S); Glicina (G); Argi-nina (R); Glutamina (Q); Alanina (A); Isoleucina (I); Histidina (H); Fenilalanina (F); Treonina (T); Metionina (M) Leucina (L). Os seguintes aminoácidos em posição de aminoácido 131 de SEQ ID NO: 2 diminuiram a resistência da fosfolipase C expressa à degradação por P. pastoris proteases: Triptofano (W); Glutamato (E); Tirosina (Y). Desse modo, a invenção fornece fosfolipa-ses variantes tendo qualquer uma de, ou diversas ou todas estas modificações, dependendo de se foi desejado aumentar ou diminuir a resistência da fosfolipase C expressa à degradação por protease. A invenção fornece fos-folipases variantes tendo qualquer uma de, ou diversas ou todas estas modificações em posições equivalentes à posição 131 de SEQ ID NO: 2. Cujo resíduo é equivalente à posição 131 de SEQ ID NO: 2, e se qualquer modificação de resíduo de aminoácido particular pode aumentar ou diminuir a resistência da enzima à degradação por uma protease, pode ser rotineiramente e previsivelmente verificado por protocolos bem conhecidos na técnica, por exemplo, o ensaio exemplar empregado para avaliar a suscetibilidade da protease da (SEQ ID NO: 2, codificada pela SEQ ID NO: 1) fosfolipase C descrita abaixo: Tampões: o 1.0 M MES, pH 6.2 o 0,7 M de acetato de sódio ("NaAc"), pH 5,2 Desafio: o Usar separado tubos micrófugos de 1,5 mL o À amostra de enzima PLC de 25 μL adicionar 5 μL de NaAc ou 7 μL de tampão de MES e misturar o Adicionar 25 μL de sobrenadante de Pichia pastoris contendo protease e misturar o Adicionar 2 μL de azida de sódio a 5% e misturar o Colocar tudos em prateleira flutuante em béquer de água prea- quecido em um incubador umidificado o Controles incluem PLC + tampão + dH2O e Pichia SN + tampão + dH2O o Incubar de 0 a 24 horas, amostrando múltiplos pontos do tempo se desejado.
Detecção: oVisualizar sobre SDS-PAGE manchando amostras 1:2 com tampão de amostra contendo 5 mM de EDTA, aquecer 100°C, 4 minutos, resfriar, centrifugar, misturar, carregar 5 μL de amostra por série, manchar com Coomassie. o As amostras e pontos do tempo podem também ser tomados diretamente para padronizar o ensaio de atividade de PLC.
Resultados: Os géis de SDS-PAGE foram desenvolvidos e os resultados são ilustrados na figura 17; que mostra os resultados dos experimentos de digestão in vitro onde as variantes de fosfolipase C foram incubadas em extratos de protease bruta durante até 22 horas a 37°C. Cada mutante de PLC é denominado de acordo com o aminoácido encontrado na posição "X" da seqüência "DXD" (Aspartato na posição de aminoácido 63-qualquer aminoácido na posição de aminoácido 131-Aspartato na posição de aminoácido 134). Os géis mostram a estabilidade ou sensibilidade da proteína mutante de PLC expressa seguindo a incubação com protease bruta. Um mutante estável mostra uma faixa de PLC de intensidade de manchamento similar no "-"(reação de controle de nenhuma protease) e o "+" (reação contém protease). Um mutante mais sensível à protease mostrará uma redução em intensidade de manchamento de faixa de proteína de PLC na série "=" comparada à série "-". EXEMPLO 5: PROCESSO PARA PLC DE EXPRESSÃO DE NÍVEL ELEVADO ESTÁVEL. A invenção fornece um processo de fermentação para expressão de nível elevado estável e atividade específica elevada de enzimas de fosfo-lipase, por exemplo, PLC, em culturas de levedura, por exemplo, culturas de Pichia pastoris. As enzimas produzidas por este método podem ser usadas, por exemplo, em refinamento de óleo vegetal, tal como, óleo de soja, canola, girassol ou outros óleos. A invenção fornece um processo de produção que compreende características que possibilitam a produção de fosfolipase ativa, por exemplo, PLC, em uma cultura de célula de levedura, por exemplo, Pichia pastoris, como culturas em bateladas-alimentadas em uma escala de g/l. A expressão de proteína de PLC ativa em culturas microbianas tem ocasionalmente sido descrita na literatura única na escala de mg/l. O processo da presente invenção é baseada, entre outras coisas, na descoberta de que a expressão de proteína de PLC em culturas de Pichia prejudicam a capacidade de absorção de MeOH, porém nenhuma outra característica de desenvolvimento fisiológica estudada. Ao contrário da expressão de proteína heteró-loga convencional em culturas de Pichia, as taxas de co-alimentação elevadas (glicose/ou glicerol) são requeridas. Além disso, para melhorar as características de produção de enzimas, a co-alimentação elevada também elimina a expressão de atividade de protease geral com degradação de PLC. Além disso, as más características de utilização de MeOH podem ser superadas, desse modo, melhorando também, as características de produção, para produzir PLC em cepas de Pichia com um fenótipo Mut+, sem compro- meter os desafios de escalabilidade normalmente associadas com um fenótipo (e não são portanto, empregadas em escala industrial). Desse modo, este processo da invenção melhora a produção de PLC ativa por >50-vezes (de 100 U/ml empregando métodos convencionais para >5000 U/ml de caldo total; > 5 g/l de proteína) comparada a condições que são normalmente aplicadas em sistemas de Pichia de escala industrial. Além disso, devido à PLC ser uma metalo-enzima requerendo a ligação de zinco para a atividade e duplicação apropriada, em um aspecto, a invenção compreende a suplemen-tação de zinco. Esta estratégia de suplementação de zinco para as culturas da invenção torna a atividade de PLC quase completamente estável (< 5% de perda em atividade) como um caldo total, por exemplo, a 4°C durante > 5 dias. Isto significantemente ajuda o processo de recuperação, uma vez que, 1) a produção de atividade de proteína instável continua a piorar durante o processo de recuperação, e 2) ela provê mais flexibilidade de processamento, especialmente em grande escala.
Ensaio de Microplacas de Triptofanil Aminopeptidase: A invenção fornece um ensaio de Microplacas de Triptofanil Aminopeptidase, que foi desenvolvida por determinação de atividades de triptofanil aminopeptidase relativas em amostras de momento de fermentação de Pichias. A capacidade de produtividade deste ensaio é suficiente para amostragem de momentos múltiplos de fermentações numerosas. Materiais e Métodos Tampão: • 15 mM de NaPO4, 2 mM de MnCl2, pH 7,5, aquoso.
Substrato: • HTrp-AMC (Bachem, I1670) Solução de substrato: • Dissolver o substrato para 10 mM em metanol • Adicionar 100 μL de 10 mM de substrato a 6 mL de tampão. Amostras: • Momentos de fermentação de Pichia • Centrifugar para remover as células Preparação de microplacas: • Alíquota de 90 μΙ de solução de substrato por cavidade de 96 cavidades pretas para cada réplica, intervalos e referências. • Colocar a microplaca sobre estágio de leitora de microplaca fluorescente (por exemplo, SpectraMax, Molecular Dynamics) Amostra de adição e reação sinética. • Configurações da leitora de microplaca fluorescente: o Ex. 350 nm/Em. 460 nm; autodesligamento (455 nm); meio PMT; 3 leituras por cavidade; autocalibração "ligação". o RT. o 0 - 30 minutos de curso de tempo; ler a cada 30 segundos. o Inicializar a função de mistura da placa de instrumento durante 5 segundos antes da primeira leitura. • Alíquota de amostra em um formato de 96 cavidades e empregar uma pipeta de múltiplos canais para transferir a amostra a 10 μL por cavidade. • Com a tampa removida, substituir a microplaca em leitora de mi-croplaca. • Começar leitura.
Dependendo da atividade inerente da amostra desconhecida, ela pode ser desejável variar a diluição da amostra, a duração do ensaio e a amostragem sinética, todas as variáveis que podem ser determinadas por avaliação de rotina. O substrato tem sido mostrado ser muito estável sob estas condições e um intervalo de controle negativo e não deve mostrar nenhum crescimento de absorvência de tempo prolongado.
Ensaio de Microplaca de Bodipy BSA Protease. A invenção fornece um ensaio de Microplaca de Bodipy BSA Protease para ajudar na determinação de atividade de protease geral em amostras de momento de fermentação de Pichia. A capacidade de produtividade deste ensaio é suficiente para amostragem de momentos múltiplos de fermentações numerosas.
Materiais e Métodos Substrato: • DQ BSA verde (Molecular Probes, D12050) Solução de substrato: • Dissolver o conteúdo de um frasconete de substrato (1 mg) em 1 mL de água contendo 0,1 % de azida de sódio.
Amostras: • Momentos de fermentação de Pichia • Centrifugar para remover células Controle positivo: • 0,2 mg/mL de subtilisina (Sigma, P5380) em 50 mM de NaPO4, pH 7,5 • Diluir serialmente em água.
Preparação de microplacas: • Alíquota de 90 pl De solução de substrato por cavidade de 96 cavidades pretas para cada réplicas, intervalos e referências.
Adição e reação da amostra: • Alíquota de amostras em um formato de 96 cavidades e empregar uma pipeta de múltiplos canais para transferir as amostras a 10 pL por cavidade. • Substituir a cobertura da microplaca, embrulhar com uma lâmina de metal e colocar em incubadora umidificada a 37 °C e deixar incubar 3 a 4 horas ou durante a noite.
Medição de fluorescência. • Configurações da leitora de microplaca fluorescente (Spectra-Max): o Ex. 495 nm/Em. 525 nm; autodesligamento (515 nm); baixo PMT; 3 leituras por cavidade; autocalibração "ligação". o RT
Bodipy BSA foi selecionado como um substrato de protease geral. A falta de hidrólise de bodipy BSA não indica a ausência de protease(s) porém, ela tem mostrado correlacionar-se com a hidrólise de enzima de PLC e a perda de atividade de PLC. Tem sido demostrado que BSA pode ser substituído por caseína ou ovalbumina de bodipy.
Em um aspecto, é útil caracterizar a atividade de protease através de um curso de tempo de fermentação uma vez que a atividade pode ser temporária ou transitória. O substrato tem sido mostrado para ser muito estável sob estas condições e um intervalo de controle negativo deve ser mostrado o crescimento em absorvência de tempo prolongado.
Avaliação de atividade de PLC em caldo de cultura total ou sobrenadante: A invenção fornece um ensaio de avaliação de atividade de PLC em um caldo de cultura total ou sobrenadante; esta é uma modificação de um método descrito, por exemplo, por Edward A. Dennis (1973) Kinetic dependence of phospholipase A2 activity on the detergent Triton X-100. J. Lipid Res. 14:152-159, USP 24/NF 19, Pancrealipase-Assay for lipase activity. Páginas 1256 - 1257. O ensaio de avaliação de atividade da invenção compreende: Soluções; 100 mM de Solução de Sulfato de Zinco, 100 mM de Solução de Cloreto de cálcio, Solução de substrato (20 mM de Fosfatidil Colina, 40 mM de Triton X-100, 5 mM de Cloreto de Cálcio), Tampão de diluição (0,1 % de Triton X-100, 1 mM de Sulfato de Zinco, 1 % de Goma Arábica) Procedimento de Ensaio: - Preparar as diluições das amostrar para serem ensaiadas empregando o tampão de diluição (1,0% de Goma Arábica, 1,0% de Triton X-100, 1 mM de sulfato de zinco). Preparar as diluições imediatamente antes do ensaio, empregando um tampão gelado e armazenar em um banho até ser usado. - Transferir 20 mL da solução de substrato em um vaso de vidro encamisado de cerca de 50 mL de capacidade, a câmara externa do qual é conectada a um banho de água termostaticamente controlada. Cobrir a mistura, e agitar continuamente com um dispositivo de agitação mecânica. Com a mistura mantida em uma temperatura de 37 ± 0,1 °C pré-titular o substrato com 0,01 N KOH VS, de um microbireta inserido através de uma abertura na cobertura, par ajustar o pH para 7,3. Adicionar 50 μL de diluição de enzima, e em seguida, continuar automaticamente a adicionar o 0,01 N KOH VS durante 6 minutos para manter o pH em 7.
Além disso, eletroforese de gel PAGE padrão, análise de mancha do Oeste e de Norte em culturas de fermentador, bem como as técnicas de análise padrão para parâmetros de fermentação em linha/fora de linha (níveis de biomassa e análise de gás, etc.) Geração da cepas de Pichia de fenótipo Mut+. A invenção fornece sistemas celulares, células e métodos para expressar fosfolipase C que compreende usar uma cepa de Pichia com um fenótipo Mut+. O método compreende inserir um ácido nucléico codificando PLC heterólogo na cepa de Pichia. A célula é em seguida, cultivada sob condições, por meio do qual, o PLC é expresso. O método pode também compreender a suplementação das condições de cultura com zinco.
Em um aspecto, estes métodos, células e sistemas celulares empregam SEQ ID NO: 2, que é uma metaloenzima que requer zinco. Em um aspecto, ela é empregada em 3 moles/mol. Ela tem um MW de aproximadamente 28 kDa e um pI de aproximadamente 5,2, e tem uma tolerância de substrato ampla: PC > PE> PS >> PI. A enzima não processada tem um seqüência sinal de 24 aminoácidos, uma pró-seqüência de 13 aminoácidos, e uma enzima "madura" de 245 resíduos de aminoácidos.
Em um aspecto, a cepa de Pichia Mut+ da invenção tem duas cópias de genes álcool oxidase (AOX), AOX1 e AOX2, afetadas durante a transformação ("Mut" significa a "Utilização de Metanol"), como segue: • Mut+ • Evento de cruzamento único, genes AOX1 e AOX2 intactos. • Crescimento e expressão de metanol sozinho. Co=-alimentação possível.
• MutS • Evento de cruzamento duplo rompe o gene AOX1. • Crescimento e expressão melhorada com co-alimentação. • Mut- • Evento de recombinação rompe os genes AOX1 e 2. • Não pode metabolizar metanol, requer co-alimentação. • Em resumo: Mut- < Mutspic < Muts/Mut+pic < Mut+ Existem diferenças de fermentações entre Mut+ e Muts, incluindo: • Concentração de Indução Ideal de Metanol. • Taxa de Consumo de Oxigênio. • Mut+ desenvolve-se mais rápido do que Muts em Metanol devido à capacidade de captação. • Facilidade de período de transição após a indução. • Mut+ não empregado para expressão em grande escala. • Capacidade de aeração/resfriamento, sensibilidade de MeOH. A trilha de utilização de metanol em Pichia pastoris é bem conhecida na técnica. O álcool oxidase (AOX) catalisa a conversão de metanol para formaldeído; desse modo, se o AOX for superexpresso, resulta em uma célula de levedura "capturada".
Um exemplo de protocolo de fermentação para Pichia pastoris empregado em um aspecto da invenção que compreende: • Cultura de semente (frasco ou tanque) • Fermentação em batelada em meio rico para realçar a biomas-sa. • Cultura fermentadora em batelada-alimentada. • Fase de batelada (Glicerol) • Biomassa desenvolve-se quando uma fonte de carbono inicial é consumida. • Fase de alimentação de Glicose ou Glicerol. • Adição de alimentação de alimentação disparada por conteúdo de D.O. ou alimentação linear/exponencial. • Crescimento para biomassa suficiente para indução e expressão (ausência de Etanol, limitada por C) • Indução de Metanol. • Adição de alimentação regulada (D.O.%, MeOH sensor, RQ) ou perfis preestabelecidos. • Co-alimentação com glicose ou glicerol dependendo de fenóti-pos e parâmetros de expressão. • Indução de Mut+ a 1 -3 g/L de MeOH. • Indução de Muts a 4-7 g/L de MeOH. A figura 18 ilustra os resultados de uma cultura fermentadora em batelada, como descrita acima, empregando-se apenas glicerol. A atividade de Protease é de uma protease endógena em Pichia. A fermentação em batelada pode ser em meio rico para realçar a biomassa. Como observado na figura 18, o aumento progressivo na atividade protease começando em torno de 69 horas corresponde a um descréscimo progressivo na atividade de PLC. Uma taxa de co-alimentação maior de glicerol (glyc) melhora a expressão de PLC ativa e diminui (elimina) a produção de protease, Como a seguinte tabela de sumário de dados ilustra: Taxa de co- Fonte de O.D de Atividade MeOH Bodipy O.D alimentação carbona indução de PLC consumida Protease final (ml/min) antes e (U/ml (L) após a sup) indução 0,5 Glyc/Glyc 100 1 Sim 460 1.5 Glyc/Glyc 1100 1,7 Não 680 2 Glyc/Glyc 250-300 1550 1,3 Não 860 2.5 Glyc/Glyc 1550 1,4 Não 900 3 Glyc/Glyc 1715 1,4 Não 820 Estes estudos foram feitos em 30 L de fermentadores de BB com DSD-PLC. A OUR, ou Vol. Oxygen Uptake Rate ("OUR"), como um indicador de "saúde de cultura total" ou biomarcador para boa expressão, foi avaliado. A figura 19 ilustra os resultados de um tal estudo ou a comparação de perfil OUR de culturas de P. pastoris MutS, 30 L de culturas produzindo DSD-PLC, empregando 1700 U/ml, 1100 U/ml e 100 U/ml PLC, 30oC, co-alimentação de glicerol, como descrito acima. A figura 20 ilustra uma comparação de perfil de consumo de metanol em P. pastoris MutS, 30 L de culturas produzindo DSD-PLC, pH 6,2 (1100 U/ml e 100 U/ml PLC), ou uma proteína heteróloga, com uma co-alimentação de glicerol, como descrito acima. Isto foi uma alimentação de MeOH controlada pela demanda e o nível de MeOH residual foi controlada a 4 g/l.
Além disso, o fenótipo de Mut+ fornece a expressão de PLC ativa e realça a absorção de MeOH, como esta tabela de dados sumaria: Mut Taxa de co- O.D de Atividade MeOH Bodipy O.D alimentação indução de PLC consumado protease final (ml/min) (U/ml (L) _________________________________sup)___________________________________ 0,5 250-300 100 1 Sim 450 1,5 1100 1,7 Não 680 2 1550 1,3 Não 860 S 2,5 1550 1,4 Não 900 3 1715 1,4 Não 820 0,5 1001 5,6 Sim 871 0,5 1200 7 Não 908 1 1786 5,9 Não 988 1 2010 6,8 Não 930 1 250-300 1768 7,9 Não 700 + 1,5 2669 10 Não 701 1,5 2693 7,1 Não 818 1,5 2597 8,1 Não 804 2 2154 8,3 Não 752 PLC não parece afetar as características de crescimento fisiológico desta cepa de fenótipo de Mut+- que expressa SEQ ID NO: 2 de PLC recombinante, em um número de cópias de 6X, o dado ilustrado na figura 21, um perfil OUR, como mencionado na descrição da figura. Isto é uma alimentação de MeOH controlada pelo abastecimento, com nehuma glicose ou MeOH residual em culturas Mut+.
Adicionalmente, a qualidade de proteína de PLC produzida é variável não prevista, por exemplo, << ou >> 50 % de proteína de PLC total é ativa, como ilustrado pela representação dos resultados de SDS-PAGE, na figura 22. O sumário gráfico de dados do perfil OUR (descrito acima) é inserido na sessão superior da ilustração SDS-PAGE. O controle é designado JG= 0,5pl 1,6 mg ml-1. Não houve nenhuma correlação com protease ou atividade de aminopeptidase. Uma quantidade significante de PLC ativa foi localizada intracelularmente, como ilustrado na figura 23 (também mostrando o protocolo de estudo), onde >700 U/ml PLC foi detectado intracelularmente (na figura 23, PLC (SEQ ID NO: 2) + um peptídeo de sinal alfa (de Saccharomyces) + glicosilação). Mudanças morfológicas foram correlacionadas com concentração de PLC ativa, como ilustrada na figura 24. A magnitude da mudança morfológica foi dependente da cepa e da fonte de C. O Zn aumentado não reforçou a expressão em uma cepa de Pichia tendo o número de cópias de 2X de SEQ ID NO: 2 de Mut+ com mutação de DSD, como sumaria nos gráficos de dados, abaixo (excesso acima de 1X o fornecido por meio de co-alimentação) (primeiro, a série superior é controle de vetor vazio). O Zn aumentado não forneceu estabilidade de armazenagem como caldo total (nível de atividade similar após >100 horas a 4°C) e robustez total de processo.
Zn MeOH (L) Base (L) 70% (v/v) OD600 PLC
Glicerol (L) (U/ml) 1X (2,2 7,1 2,3 9,6 765 0 mM) 0,2X 7,4 2,1 8,6 731 392 1X 7,1 2,8 9,0 776 2700 4X 6,1 2,2 10 780 2448 12X 6,4 2,3 9,8 776 2498 A figura 25 sumaria graficamente os dados mostrando o estado do desempenho de produção de PLC a 95 horas TFT (tempo de fermentação total) em Pichia. As cinco barras do lado direito do gráfico mostram os resultados da "cepa Zeo", ou adaptação de Zeocina da cepa de Pichia pastoris produtores de PLC. Esta cepa é uma cepa sem marcador resistente a antibiótico expressando como um gene heterólogo um PLC da invenção (SEQ ID NO: 2) em uma cepa de Pichia pastoris. Foi demonstrado que adaptando-se a cepa com zeocina, um antibiótico, alguém pode obter uma nova cepa estável com nível de expressão enormemente melhorado para a proteína de interesse. A cepa sem marcador resistente a antibiótico original, cepa # 1 (contendo SEQ ID NO: 2), foi desenvolvida em uma série de etapas de diluição, cada vez com uma concentração crescente de zeocina, que é um antibiótico. Em cada etapa, uma porção da cultura de etapa anterior foi diluída para uma densidade ótica a 600 nm (OD600) de 1,0 com meio de cultura fresco e uma quantidade crescente de zeocina foi adicionada a nova cultura durante outras 24 horas de crescimento. No estágio final, a concentração de zeocina de 200 ug/ml foi empregada e a cultura final foi estriada para uma placa de MD/YPD para permitir a colônia individual desenvolver-se. Descobriu-se que as colônias de da cultura de estágio final, mostra tolerância elevada à zeocina, enquanto que a cepa origem exibe tolerância muito pequena. Uma das colônias, cepa #2 (contendo SEQ ID NO: 2),mostrou melhora dramática (cerca de 70% maior) em expressão de PLC comparada à cepa de PLC original, cepa #1. Foi também demonstrado que a cepa #2 passagem de geração, indicando que a nova cepa adiquiriu estabilidade tanto em zeocina quanto em expressão de PLC após um traço de 40- "permanente" de expressão de PLC e tolerância à zeocina.
Um nível elevado de atividade de PLC foi obtido empregado-se a "cepa Zeo" (adaptação de Zeocin Pichia) da invenção: 4100 u/ml obtido em minitanques. Este resultado origina-se da cepa Pichia compreendendo 6x DSD SEQ ID NO: 2. Em síntese, esta cepa expressando SEQ ID NO: 2- foi "adaptada" desenvolvendo-a em uma série de etapas, cada com concentração crescente de zeocina. Aparentemente, este processo de adaptação forçou algumas mudanças (em nível molecular ou genético) da cepa/construto e resultou em significante melhora de nível de atividade de PLC.
Resultados exemplares são: • Tanques 1, 2, e 4 (cada representando colônias diferentes) to- dos auto-realizaram a cepa de expressão de SEQ ID NO: 2 pré-adaptada original, com os tanques 1 & 4 ambos foram para 4100 u/ml e o tanque 2 foi para 3500 u/ml. • Tanques 1 & 4 foram acima de 3000 u/ml o quanto antes em 75 horas, representando um acúmulo de atividade muito mais rápido comparado à cepa de expressão de SEQ ID NO: 2 pré-adaptada original (que é normalmente bem abaixo de 2000 u/ml no momento).
Detalhes de projeto experimental e resultados são: Racional de adaptação de zeocina: O estágio anterior de trabalho sobreexpressão de PLC foi feito no vetor pPICZa de Pichia, que contém o marcador de resistente à zeocina. A zeocina foi desse modo, empregada para a seleção de transformação. Por último, mudou-se para o construto de versão de menos AMR para desenvolver candidatos de produto comercial. Enquanto fazendo fermentações de minitanque, observa-se uma queda significante de nível de atividade de PLC obtida empregando-se os constructos de menos AMR: atividade de sobrenadante alcançou 4000 u/ml em constructos de pPICZa-DSD, ao passo que, apenas aproximadamente 2000 u/ml foram obtidas em 2x DSD. Diferenças fisiológicas significantes, por exemplo, taxas de consumo de metanol menores e um lote de mais lise celular, foram também observados com os constructos de menos AMR, especialmente quando testando constructos de números de cópias elevadas (5x, 6x) empregando alguns protocolo de fermentação.
Com uma das aparentes diferenças entre constructo de pPIZa e constructo de menos AMR sendo o uso de zeocina em transformação, a questão foi levantada sobre o que as células sofreram com a seleção de ze-ocina. A invenção fornece o crescimento de construção de menos AMR na presença de zeocina - as células sofrem algumas alterações benéficas à expressão de PLC.
Experimento de adaptação de zeocina em 2x DSD: O experimento foi primeiro empregado com o 2x DSD (como estava a molécula de transferência no momento). O estudo iniciou-se com uma concentração de zeocina de ug/ml ("zeo 1") e desenvolveu a cultura durante ~24 horas. A partir daí, aumento da etapa de concentração de zeocina para zeo 5, zeo 10, zeo 15, zeo 20, zeo 40, zeo 60, zeo 80, zeo 100 e finalmente para zeo 200 foi realizado (zeo 100 é normalmente empregado para seleção de transformação). Cada etapa de meio de cultura fresco foi empregada e a cultura de estágio anterior foi empregada para inocular a cultura de estágio seguinte com OD de 1,0 e desenvolvida durante ~24 horas. A cultura de cada estágio foi também, estriada para placas de YPD para a preservação e para obter colônias individuais.
Resultados de fermentação de mini tanques de colônias zeo-adaptadas: Para testar os efeitos de adaptação de zeocina, uma dúzia de colônias de culturas de zeo 200 e zeo 100 (que foram estriadas para placas de YPD) foi colhida e analisada com mini-taques. Os resultados são sumariados no slide 6. Habilitou-se para verificar diversas colônias que auto-realizaram significantemente o constructo original (cepa de Pichia que compreende SEQ ID NO: 2). Entre elas, a colônia de cultura zeo 200 mostrou cerca de 50 % de melhora no nível de atividade de PLC. Observações sobre a análise: • Não houve nenhuma diferença aparente sobre os perfis de crescimento entre as culturas de zeo-adaptadas e a cepa de expressão de SEQ ID NO: 2 original. • Embora a estabilidade das culturas adaptadas não tenham sido extensivamente testadas, elas foram re-estriadas diversas vezes em placas de YPD e/ou MD sem a presença zeocina. Toda fermentação também foi feita sem a presença de zeocina. • Houveram colônias aparentes para variações de colônias, ambos em crescimento e em expressão de PLC. • Alguns problemas técnicos com a fermentação pode ser parcialmente responsável pelas variações.
Experimento de adaptação em 6x DSD: Encorajados pelos resultados de 2x de DSD de zeo-adaptado, então realizou-se a mesma experiência no 6x DSD (que no momento foi determinado como sendo superior ao 2x DSD). Iniciou-se com a concentração de zeocina de 5 ug/ml ("zeo 5") e desenvolveu-se a cultura durante ~24 ho- ras. A partir daí, a etapa aumenta de concentração de zeocina para zeo 15, zeo 30, zeo 50, zeo 100 e finalmente para zeo 200 foi realizada. Igualmente com o 2x DSD, cada etapa de meio de cultura fresco foi empregada e a cultura de estágio anterior foi empregada para ocular a cultura de estágio seguinte cm OD de 1,0 e desenvolvida durante ~24 horas. As culturas de cada estágio foram também estriadas para as placas de YPD para preservação e para obter colônias individuais.
Resultados de minitanques de colônias de 6x de zeo-adaptadas: Seis colônias da cultura de zeo 200 (que foi estriada para placa de MD) foram colhidas e testadas juntas com a cepa de expressão de SEQ ID NO: 2 em minitanques.
Observações chaves são como abaixo: • Todas três colônias (tanques 1, 2, e 4) auto-realizaram a cepa de expressão de SEQ ID NO: 2 original, com os tanques 1 & 4, ambos foram para 4100 u/ml e o tanque 2 foi para 3500 u/ml. • Tanques 1 & 4 foram acima de 3000 u/ml o quanto antes em 75 horas, representando um acúmulo de atividade muito mais rápido comparado à cepa de expressão SEQ ID NO: 2- (que é normalmente bem abaixo de 2000 u/ml no momento). • O nível de proteína de PLC também parece ser maior em tanques 1, 2, & 4 comparando as 3000 u/ml desenvolvidas em tanques de 10-L (veja slide 4). Não está desse modo claro se, a atividade específica aparente é maior nos tanques 1, 2, & 4, isto é, se a PLC sendo produzida é diferente daquela de sua cepa de expressão de SEQ ID NO: 2. • O controle, tanques 7 & 8, não atingiram a 3000 u/ml neste momento. Não está claro se, os tanques 1, 2, & 4 podem ser capazes de atingir até o nível mais elevado. Nota-se que o aumento percentual (35%, 4100 u/ml vs 3000 u/ml) é menor que a cultura 2x adaptada. • Um sumário de avaliação de expressão das colônias adaptadas de zeocina de 6x de DSD é encontrada na figura 26. O nível de atividade mais elevado observado com a cepa original foi de ~3000 u/ml (minitanque & 10-L); o nível obtido com 6x DSD adaptado de zeocina foi de 4100 u/ml (~35 % de crescimento). A figura 27 ilustra dados mostrando que o nível de proteína de PLC foi mais elevado nos tanques 1, 2, & 4 comparando as 3000 u/ml desenvolvidas em tanque de 10-L (e condições de tanque), como descrito acima (a carga de gel estava a 1,0 ul de 5x de caldo diluído, 0,2 de caldo total). A figura 28 mostra a comparação de crescimento de colônias adaptadas de zeo vs controle. As colônias de DSD 6x adaptadas de zeocina têm o perfil de crescimento similar comparando à cepa de expressão de SEQ ID NO: 2 original (6x DSD). O Qp de proteína secretada em culturas de levedura aeróbicas limitadas por C é geralmente de 0,5 - 2,5 mg/g.h-1 a μ = 0,10h-1. Baseado no conteúdo de proteína de 400 mg/g DW, a 'carga metabólica' é < 10% de taxa de produção de proteína total. O nível de mRNA de PLC permanece elevado durante toda a fermentação e não correlacionado com a expressão. Baseado em 5 g/l de (150 g) proteína de PLC, menor que 0,1 mol C/h de 5 moles C/h total (~2% de C total consumido) foram para carbono de PLC e ~25% foram para biomassa. A atividade de PLC não parece impactar as características fisiológicas de crescimento geral sob estas condições de produção (exceto que, a capacidade de utilização de MeOH é afetada).
Em síntese, a invenção fornece sistemas de células de leveduras resistentes à zeocina, tais como, células de levedura, cepas celulares e/ou células individuais, para expressar uma proteína heteróloga (por exemplo, uma enzima, tal como, uma PLC) preparada por um processo compreendendo as etapas de fornecimento de uma célula de Pichia sp. (por exemplo, P. pastoris) compreendendo um ácido nucléico heterólogo (por exemplo, um vetor compreendendo uma enzima codificando seqüência; uma ORF operavelmente ligada a um promotor) capaz de expressar uma proteína heterólo-ga; cultivando as células sob condições compreendendo zeocina a uma concentração inicial (uma condição baixa o suficiente para que algumas células sobrevivam, porém, elevada suficiente para selecionar células resistentes a antibiótico); selecionar células resistentes à concentração inicial de zeocina; e selecionar as células resistentes à concentração eleveda de zeocina. A invenção também fornece células de levedura, cepas celulares e/ou células individuais preparadas por este processo. A avaliação de rotina pode determinar qual a concentração inicial de antibiótico para uso, quantos ciclos de seleção são necessários, ou desejados, e a rapidez para aumentar as concentrações de antibiótico entre os ciclos de seleção.
EXEMPLO 6: PLC TERMOESTÁVEL A invenção fornece enzimas de fosfolipase termoestáveis. A ter-moestabilidade para a enzima exemplar tendo uma seqüência como mencionado na SEQ ID NO: 2 foi demonstrada. A termoestabilidade de fosfolipídeos comparáveis da invenção foi demonstrada empregando-se SEQ ID NO: 2. A atividade de SEQ ID NO: 2 foi testada em dois diferentes sistemas: aquoso e em óleo. No sistema aquoso, um substrato substituto (p-nppc) foi usado para avaliar a atividade; a enzima começou a perder a atividade a 86°C. Entretanto, nos ensaios de óleo, a enzima mostrou boa atividade em hidrólise de substratos de PC e PE presentes em óleo de soja a 85°C. O Tm da mesma enzima foi checado e descoberto que ele foi de 86°C @15mg/mL, e não reversível. A figura 29 ilustra os resultados de um experimento de aquecimento a 85°C com 10U de SEQ ID NO: 2, com as condições indicadas na figura. A figura 30 ilustra dados de RMN resumindo este experimento de aquecimento.
As figuras 31, 32 e 33 ilustram dados sumariando a estabilidade térmica de SEQ ID NO: 2 empregando p-NPPC, nas condições mostradas na figura. A figura 34 ilustra dados de análise de DSD mostrando a termoestabilidade de SEQ ID NO: 2, com a enzima em uma concentração de 15 mg/mL e o Tm a 86oC.
REIVINDICAÇÕES

Claims (10)

1. Ácido nucleico recombinante, sintético ou isolado, caracterizado pelo fato de que codifica um polipeptídeo tendo atividade fosfolipase compreendendo: (a) um ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 1, em que a SEQ ID NO: 1 compreende pelo menos uma mutação de ácido nucleico que codifica as modificações de aminoácidos N63D, N131S e N134D, em que as modificações de aminoácidos são definidas com referência à SEQ ID NO: 2 e em que o aminoácido na posição 38 da SEQ ID NO: 2 é contado como posição 1, (b) o ácido nucleico de (a), compreende ainda uma sequência de ácido nucleico heteróloga ou peptídeo sinal, (c) o ácido nucleico de (b), em que a sequência de ácido nucleico heteróloga compreende ou consiste em uma sequência de ácido nucleico que codifica: (i) uma sequência (líder) de sinal heteróloga, uma sequência sinal (líder) de fosfolipase heteróloga ou uma sequência sinal (líder) de não fosfolipase heteróloga, ou (ii) um domínio catalítico, uma sequência ligante, um sítio de reconhecimento de clivagem de protease, uma sequência de enzima de não fosfolipase ou uma sequência de enzima de fosfolipase, ou (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência completamente (totalmente) complementar a sequência de ácido nucleico de qualquer um de (a) a (c).
2. Ácido nucleico recombinante, sintético ou isolado, caracterizado pelo fato de que codifica um polipeptídeo tendo atividade fosfolipase compreendendo (a) um ácido nucleico, de acordo com a SEQ ID NO: 1, em que a SEQ ID NO: 1 compreende pelo menos uma mutação de ácido nucleico que codifica as modificações de aminoácidos N63D e N134D, e em que (i) o aminoácido da posição 131 é modificado para um dos seguintes resíduos: Lisina (K); Glicina (G); Arginina (R); Glutamina (Q); Alanina (A); Isoleucina (I); Histidina (H); Fenilalanina (F); Treonina (T); Metionina; (M); Leucina (L), em que a fosfolipase variante possui resistência aumentada a uma protease, ou (ii) o aminoácido da posição 131 é modificado para um dos seguintes resíduos: Triptofano (W); Glutamato (E); Tirosina (Y), em que as modificações do aminoácido são definidas com referência a SEQ ID NO: 2 e em que o aminoácido W na posição 38 da SEQ ID NO: 2 é contado como posição 1, (b) o ácido nucleico de (a), compreendendo ainda uma sequência de ácido nucleico heteróloga ou um peptídeo sinal, (c) o ácido nucleico de (b), em que a sequência de ácido nucleico heteróloga compreende ou consiste em uma sequência de ácido nucleico que codifica: (i) uma sequência sinal (líder) heteróloga, uma sequência sinal (líder) de fosfolipase heteróloga ou uma sequência sinal (líder) de não fosfolipase heteróloga, ou (ii) um domínio catalítico, uma sequência ligante, um sítio de reconhecimento de clivagem de protease, uma sequência de enzima de não fosfolipase ou uma sequência de enzima de fosfolipase, ou (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência completamente (totalmente) complementar a sequência de ácido nucleico de qualquer um de (a) a (c).
3. Cassete de expressão, vetor ou um veículo de clonagem caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico compreendendo: (a) um ácido nucleico compreendendo a sequência, como definida na reivindicação 1 ou 2; ou (b) o cassete de expressão, vetor ou veículo de clonagem de (a), em que o veículo de clonagem compreende um vetor viral, um plasmídeo, um fago, um fagomídeo, um cosmídeo, um fosmídeo, um bacteriófago ou um cromossoma artificial, ou o vetor viral compreende um vetor de adenovírus, um vetor retroviral ou um vetor viral adenoassociado, ou o vetor ou um veículo de clonagem que compreende ou está contido em um cromossoma artificial bacteriano (BAC), um plasmídeo, um vetor derivado de bacteriófago P1 (PAC), um cromossoma artificial de levedura (YAC), ou um cromossoma artificial de mamífero (MAC).
4. Célula transformada, caracterizada pelo fato de que compreende: um ácido nucleico compreendendo a sequência, como definida na reivindicação 1 ou 2, ou o cassete de expressão, vetor ou veículo de clonagem, como definido na reivindicação 3, em que a célula transformada é uma célula bacteriana, uma célula fúngica ou uma célula de levedura.
5. Polipeptídeo recombinante, sintético ou isolado, caracterizado pelo fato de ter atividade de fosfolipase compreendendo a sequência de amino ácidos de acordo com a SEQ ID NO: 175 ou SEQ ID NO: 176.
6. Polipeptídeo recombinante, sintético ou isolado, caracterizado pelo fato de ter atividade de fosfolipase compreendendo: um polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 2, em que o aminoácido da posição 63 é D (ácido aspártico), e o aminoácido da posição 134 é D (ácido aspártico), e em que (i) o aminoácido da posição 131 é modificado para um dos seguintes resíduos: Lisina (K); Glicina (G); Arginina (R); Glutamina (Q); Alanina (A); Isoleucina (I); Histidina (H); Fenilalanina (F); Treonina (T); Metionina (M); Leucina (L), em que a fosfolipase variante possui resistência aumentada a uma protease, ou (ii) o aminoácido da posição 131 é modificado para um dos seguintes resíduos: Triptofano (W), Glutamato (E); Tirosina (Y), em que a fosfolipase variante possui resistência diminuída a uma protease, em que o aminoácido W na posição 38 da SEQ ID NO: 2 é contado como posição 1.
7. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de: (a) o polipeptídeo compreender ainda uma sequência de aminoácidos heteróloga ou um peptídeo sinal heterólogo, (b) o polipeptídeo de (b), em que o polipeptídeo heterólogo compreende ou consiste em: (i) uma sequência sinal (líder) heteróloga, uma sequência sinal (líder) de fosfolipase heteróloga ou uma sequência sinal (líder) de não fosfolipase heteróloga, ou (ii) um domínio catalítico, uma sequência ligante, um sítio de reconhecimento de clivagem de protease, uma sequência de enzima de não fosfolipase ou uma sequência de enzima de fosfolipase, (c) o polipeptídeo de qualquer uma de (a) ou (b), em que o polipeptídeo compreende pelo menos um sítio de glicosilação, ou a glicosilação é uma glicosilação ligada a N, ou o polipeptídeo é glicosilado após ser expresso em uma P. pastoris ou uma S. pombe, ou (d) o polipeptídeo de qualquer uma de (a) a (c), em que o polipeptídeo compreende pelo menos uma modificação compreendendo ou consistindo em uma acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, ligação covalente de flavina, ligação covalente de uma porção heme, ligação covalente de um nucleotídeo ou derivado nucleotídeo, ligação covalente de um lipídeo ou derivado de lipídeo, ligação covalente de um fosfatidilinositol, ciclização de reticulação, formação de ligações dissulfeto, desmetilação, formação de reticulações covalentes, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de âncora de GPI, hidroxilação, iodinação, metilação, miristoilação, oxidação, pegilação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfação, adição mediada por transferência de RNA de um aminoácido ou arginilação.
8. Método de produzir um polipeptídeo recombinante caracterizado pelo fato de ter atividade de fosfolipase compreendendo: (A) (a) fornecer um ácido nucleico, em que o ácido nucleico compreende a sequência, como definida na reivindicação 1 ou 2; e (b) expressar o ácido nucleico da etapa (a) sob condições que permitem a expressão do polipeptídeo, desse modo produzindo um polipeptídeo recombinante, ou (B) o método de (A), em que o método ainda compreende transformar uma célula hospedeira com o ácido nucleico da etapa (a) seguido pela expressão do ácido nucleico da etapa (a), desse modo produzindo um polipeptídeo recombinante em uma célula transformada, ou (C) o método de (B), em que a célula hospedeira é uma cepa de Pichia com um fenótipo Mut+, ou (D) o método de (C), em que o método compreende ainda suplementar as condições de cultura com zinco.
9. Método de desengomação de uma gordura ou um óleo caracterizado pelo fato de que compreende: (A) (a) fornecer uma composição compreendendo o polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase, como definida em qualquer uma das reivindicações 5 a 7, ou um polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico, como definido na reivindicação 1 ou 2; (b) fornecer uma composição compreendendo uma gordura ou óleo; e (c) colocar em contato o polipeptídeo da etapa (a) e a composição da etapa (b), ou (B) o método de (A), em que o polipeptídeo hidrolisa um fosfatídeo a partir de um fosfolipídeo hidratável e/ou não-hidratável na gordura ou óleo, ou o polipeptídeo hidrolisa um fosfatídeo em uma ligação de fosfoéster de glicerila para gerar um diglicerídeo e composto de fosfato solúvel em água, ou (C) o método de qualquer uma de (A) ou (B), em que as condições da etapa (c) compreendem uma temperatura de 20 °C a 40 °C a um pH alcalino, ou as condições alcalinas compreendem um pH de 8 a um pH de 10, ou (D) o método de qualquer uma de (A) a (C), em que as condições compreendem um pH alcalino, ou as condições de hidrólise da etapa (c) compreendem um tempo de reação de 3 a 10 minutos, ou as condições de hidrólise da etapa (c) compreendem hidrólise de fosfolipídeos hidratáveis e não-hidratáveis em óleo em uma temperatura de 50 °C a 60 °C, em um pH de 5 a um pH de 6,5, em um pH de 6,0 a pH de 7,5, ou em um pH de 5 a pH de 8,0, usando um tempo de reação de 30 a 60 minutos, ou as condições alcalinas são suficientes para causar a isomerização de um 1,2-DAG produzido por um PLC em um 1,3-DAG, ou (E) o método de qualquer uma de (A) a (D), em que o polipeptídeo é ligado a um filtro e a gordura ou óleo é passado através do filtro, ou o polipeptídeo é adicionado a uma solução compreendendo a gordura ou óleo e em seguida a solução é passada através de um filtro, ou (F) o método de (A) ou (E), em que o método compreende ainda a adição de um ou mais polipeptídeos tendo uma protease, uma amilase, uma lipase, uma cutinase, outra fosfolipase, uma carboidrase, uma celulase, uma pectinase, uma mananase, uma arabinase, uma galactanase, uma xilanase, uma oxidase, por exemplo, uma lactase e/ou uma peroxidase, ou uma combinação destas, para destruir ainda mais a massa de goma e aumentar a produções de óleo.
10. Processo para reduzir a massa de goma e aumentar o ganho de óleo (triglicerídeos) neutro através da captura de óleo reduzido, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer uma composição compreendendo o polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase, como definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 7; (b) fornecer uma composição compreendendo um óleo ou gordura contendo fosfolipídeo; e (c) colocar em contato o polipeptídeo da etapa (a) e a composição da etapa (b) sob condições, em que o polipeptídeo pode catalisar a hidrólise de um fosfolipídeo na composição durante um tempo suficiente para reduzir a massa de goma e aumentar os óleos neutros.
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