CN1638647A - 制备干酪的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用酶处理制干酪用乳以制备干酪的方法，以及所获得的干酪在作为食品成分中的应用。更具体地，本发明涉及一种用磷脂酶A和溶血磷脂酶处理制干酪用乳来制备干酪的方法。

Description

制备干酪的方法
技术领域
本发明涉及一种由酶处理干酪(cheese)用乳来制备干酪的方法，以及所获得的干酪在作为食品成分中的应用。
背景技术
在干酪产品中，脂肪相的状态对干酪的特性非常重要。脂肪相对于制作和成熟过程中干酪的稳定尤其重要，对于要使用的最终于酪也很重要，如食用或制备即食食品例如比萨饼、烤面包或夹馅包(burgers)中的应用也很重要。
同样，干酪产品的油脂析出(oiling-off)特性是重要的质量参数。油脂析出是在贮藏和熔解中形成游离油的一种趋向。过度油脂析出经常与利用干酪的加热产品如比萨饼及相关食品有关的最主要缺点(参考文献如KindstedtJ.S；Rippe J.K.1990，J Dairy Sci.73：867-873)。越来越需要控制/消除这种缺点，这是由于消费者关注食用脂肪含量的增加。产品中游离油/脂肪被认为脂肪含量高，而通常不受人们所欢迎。
因此需要对干酪的制备工艺进行改进，特别是需要干酪中的脂肪稳定性得到改善的制备工艺。
WO 00/54601公开了一种制备特性改善的干酪的方法，特别是改善了脂肪的稳定性，其中包括如下步骤：a)用磷脂酶处理制干酪用乳和b)由制干酪用乳获得干酪。磷脂酶可选自磷脂酶A1，磷脂酶A2，磷脂酶B及它们的组合，加入量达到足以降低干酪中的油脂析出效应和/或提高干酪产量。
发明概述
本发明涉及一种制备干酪的方法，包括：将磷脂酶A和溶血磷脂酶组合加入到制干酪用乳中，加入的酶量可有效降低干酪中的油脂析出效应和/或提高干酪产量，进而由制干酪用乳制得干酪。
本发明进一步涉及一种制备干酪的方法，包括：向制干酪用乳中加入选自磷脂酶A1、磷脂酶A2或其组合的磷脂酶；和溶血磷脂酶；以降低干酪中的油脂析出效应和/或提高干酪产量；和由制干酪用乳制得干酪。
因此，本发明提供一种制备改善特性的干酪的方法，特别是，干酪和制干酪用乳中的脂肪稳定性得到改善。虽然不局限于操作上的任何理论，相信在制备干酪过程中加入磷脂酶A和溶血磷脂酶于制干酪用乳可以提高由所述处理的制干酪用乳中制备成的干酪的热处理过程中的稳定性。根据本发明方法也提供一种增加干酪产品的产量的方法。
本发明进一步涉及磷脂酶A和溶血磷脂酶组合使用于干酪产品的制造过程中，其中磷脂酶A和溶血磷脂酶于干酪制备过程中对制干酪用乳进行处理。本发明也涉及能得到的干酪，具体地说是通过此处描述的任何方法获得的干酪。
本发明也涉及一种制备干酪的方法，包括向制干酪用乳中加入选自磷脂酶A1、磷脂酶A2或其组合的纯化的磷脂酶；与溶血磷脂酶；以降低干酪中的油脂析出效应和/或提高干酪产量，进而由制干酪用乳获得干酪。
发明详述
本发明涉及一种制备干酪的方法，包括将磷脂酶A和溶血磷脂酶组合加入到制干酪用乳，以降低干酪中的油脂析出效应和/或提高干酪产量，由制干酪用乳制得干酪。磷脂酶A优选地选自磷脂酶A1、磷脂酶A2或其组合。
磷脂酶A和溶血磷脂酶在干酪制作过程中加入到制干酪用乳中，在此处，术语“制干酪用乳”是指用于制备干酪的基于乳的组合物。
磷脂酶A和溶血磷脂酶可在干酪制作过程中的任何合适的阶段中加入。在本发明的一个优选实施方式中，磷脂酶A和溶血磷脂酶是在制干酪用乳的脂肪和/或蛋白质含量的标准化的时候加入，更优选地，在制干酪用乳填充到干酪槽中的同时、在起子培养物加入到制干酪用乳中的同时或干酪凝乳酶(rennet)加入制干酪用乳的同时加入所述酶。
在干酪制作过程中，将磷脂酶A和溶血磷脂酶同时或按先后顺序加入。在一个实施方式中，磷脂酶A和溶血磷脂酶在制作过程的不同阶段加入，例如磷脂酶A在溶血磷脂酶加入之前加入或溶血磷脂酶在磷脂酶A加入之前加入。在一个优选实施方式中，磷脂酶A和溶血磷脂酶在制作干酪过程中是同时加入的。
制干酪用乳和干酪制备
在本发明中，术语“干酪”是指任何形式的干酪，诸如天然的干酪、干酪类似物、融化干酪(processed cheese)。用现有技术中合适的方法获得的干酪，如用凝乳酶对制干酪用乳进行酶凝，或用食品降解酸或乳酸细菌生长过程中产生的酸对制干酪用乳进行酸凝。在一个实施方式中，本发明方法制作的干酪是凝乳酶凝乳的干酪。凝乳酶可以通过商业途径获得，如Naturen(动物凝乳酶)、Chy-max(发酵产生的凝乳酶)、Microlant(发酵产生的微生物助凝剂)、及来自Chr.Hansen A/S(Denmark)的产品。制干酪用乳可以用于常规干酪制作过程中。
融化干酪优选由天然干酪或干酪类似物经过烹饪处理和乳化干酪来获得，例如，用乳化盐(如磷酸盐和柠檬酸盐)。进一步地可包括加入香料/调味品。
术语“干酪类似物”指类干酪产品，包含脂肪如乳脂(如奶油)作为组成成分的一部分，并且进一步地包含非乳成分如植物油作为组合物成分的一部分。干酪基料(base)是干酪类似物的例子之一。
本发明方法生产的干酪包括所有种类的干酪，例如Campesino、Chester、Danbo、Drabant、Herregard、Manchego、Provolone、Saint、Paulin、Soft cheese、Svecia、Taleggio、White cheese，包括由干酪凝乳的凝乳酶凝乳制备的凝乳酶凝乳干酪；成熟干酪如Cheddar、Colby、Edam、Muenster、Gryere、Emmenthal、Camembert、Parmesan和Romano；新鲜干酪如Mozzarella和Feta；酸凝干酪如奶油干酪、Neufchatel、Quarg、Cottage Cheese和QuesoBlanco；以及pasta filata干酪。一个具体实施方式涉及本发明方法产生的牛奶软干酪(pizza cheese)产品。
在干酪制备过程中，对乳中的酪蛋白进行凝结的方式优选的有两种：称为凝乳酶酶凝干酪和酸凝干酪。这两种凝结方式的干酪产品构成两大类干酪类型。新鲜酸凝干酪指通过酸化或酸与热结合使乳、奶油或乳清凝结产生的各种类型干酪，其中在成熟过程没有完成即可消费。新鲜酸凝干酪通常与酶凝干酪种类(如Camembert、Cheddar、Emmenthal)不同，因后者凝结是通常通过凝乳酶于pH6.4-6.6下作用导致的，其中凝结通常在接近酪蛋白的等电点即pH4.6附近或当提高温度而在更高pH下发生，如Ricotta中的凝结是在pH6.0和80℃下发生。本发明的一个优选实施方式，干酪属于凝乳酶凝结干酪种类。
Mozzarella是所谓pasta filata或伸展凝乳(stretched curd)干酪中的一种，通常特点是通过独特的增塑和捏合于热水中处理新凝结的凝乳的干酪，赋予成品干酪具有纤维结构特性和融化和伸展特性，参考文献如“Mozzarellaand Pizza cheese”by Paul S.Kindstedt，Cheese：Chemistry，physics andmicrobiology，Volume 2：Major Cheese groups，second edition，page 337-341，Chapman & Hall。在此处，牛奶软干酪包括适合于制备比萨饼的干酪，且它通常是pasta filata/伸展凝乳(stretched curd)干酪。在一个实施方式中，本发明方法进一步包括正如pasta filata干酪如制备Mozzarella过程中的热/伸展处理。
本发明的进一步实施方式，制干酪用乳完全或部分由干乳部分，如全脂奶粉、脱脂奶粉、酪蛋白、酪蛋白酸盐、总乳蛋白质或酪乳粉，或它们的任何组合制备而成。
一个优选实施方式，将要用于磷脂酶A和溶血磷脂酶处理的制干酪用乳包括或由奶油组成。进一步的实施方式，将要用于磷脂酶A和溶血磷脂酶处理的制干酪用乳包括或由黄油组成。更进一步的实施方式，将加入了磷脂酶A和溶血磷脂酸的制干酪用乳包括或由酪乳组成。
由不同种类动物产生的奶均可用于生产干酪。因此，“奶”可以是通过奶牛、绵羊、山羊、水牛(buffaloe)或骆驼挤奶获得的乳分泌液。
用于生产干酪的奶可通过去除所有或部分原料乳中的成分和/或通过增加额外量的这些成分来使其达到欲期标准。这可在到达乳场时将原料乳分成奶油和脱脂乳。因此，可通过常规方法对原料乳进行分馏和将分馏馏份重新组合以获得欲期最终的制干酪用乳组合物。可通过连续离心分离得到低脂肪含量(也即例如＜0.5％)脱脂乳部分和如＞35％脂肪的奶油。制干酪用乳可通过将奶油和脱脂乳混合而得到。
加入了磷脂酶A和溶血磷脂酶的制干酪用乳包含磷脂，如卵磷脂。发现制干酪用乳含有的总脂肪含量应可适合于通过本发明方法生产干酪，如约25％的脂肪(干物质)，范围为10-50％，其中例如占总脂肪含量的约0.06％为磷脂，例如总脂肪含量范围的0.02％-5％(w/w)是磷脂。
可通过常规步骤将制干酪用乳中的细菌数控制在安全范围内。通常不优选利用巴氏灭菌法对脱脂乳进行灭菌，因为在制干酪用乳中含有热变性蛋白对奶的凝结有负作用，并延迟干酪的成熟。脱脂乳部分中的细菌数可通过其它技术如微量过滤或细菌离心法(bactofugation)来控制。奶油优选通过巴氏灭菌法来降低细菌数量。另一个优选实施方式中，制干酪用乳是未经巴氏灭菌的原料乳。
本发明的一个实施方式，制干酪用乳在用于生产干酪之前进行匀化处理，如在生产Danish Blue Cheese的过程中。
酶处理
在本发明方法中的酶处理可以是将磷脂酶A和溶血磷脂酶分散于制干酪用乳中，在合适的温度下保持合适时间以进行酶反应。用磷脂酶A和溶血磷脂酶进行处理可根据本领域熟知的原则来确定所选择的酶的反应条件。
酶处理可在任何合适的pH，如pH2-10范围内，或pH4-9或5-7范围进行。可以优选地让磷脂酶A和溶血磷脂酶在干酪制备过程中的制干酪用乳的本身pH条件进行酶处理。
按照能够使磷脂酶A和溶血磷脂酶起反应的温度条件，如25-45℃下进行酶处理(如至少反应5分钟、例如至少10分钟或至少30分钟，如反应5-60分钟)。
任选地，在磷脂酶A和溶血磷脂酶在制干酪用乳中发挥作用后，对磷脂酶A和/或溶血磷脂酶蛋白进行去除、减少、失活或其组合等操作。
加入合适量的磷脂酶A和溶血磷脂酶以产生具有期望特性的干酪。优选地，磷脂酶A和溶血磷脂酶的加入量能有效地降低干酪中的油脂析出效应和/或提高干酪产量。磷脂酶A的合适剂量通常为每克乳脂加入0.003-0.3mg酶蛋白，优选为0.01-0.3mg，更优选为0.03mg酶蛋白。
溶血磷脂酶的用量通常为每克乳脂加入0.005-0.5mg酶蛋白，优选为0.01-0.5mg，更优选为0.05mg酶蛋白。
可用于本发明方法的酶
磷脂，如卵磷脂或磷脂酰胆碱，由两个脂肪酸在外部(sn-1)和中部(sn-2)位置酯化及在第三个位由磷酸酯化的甘油所构成；磷酸也可以对氨基醇进行酯化。磷脂酶是参与磷脂水解的酶。可以区分几种类型的磷脂酶活性，包括磷脂酶A1和A2，可水解一个酯酰基团(分别在sn-1和sn-2位置)而形成溶血磷脂。溶血磷脂中残留的酯酰基团被溶血磷脂酶所水解。
在本发明方法中使用的酶包含磷脂酶A和溶血磷脂酶。术语磷脂酶A包括磷脂酶A1、磷脂酶A2和两者的结合，如将具有磷脂酶A1活性的酶与具有磷脂酶A2活性的酶结合使用或同时具磷脂酶A1和磷脂酶A2两种活性的单一酶。
磷脂酶A1根据标准酶EC分类被定义为EC3.1.1.32。
法定名称为：磷脂酶A1。
催化的反应：磷脂酰胆碱+H(2)O＜＞2-酰基甘油磷酸胆碱+脂肪酸阴离子。
备注：具有比EC3.1.1.4更广泛的特异性。
磷脂酶A2根据标准酶EC分类被定义为EC3.1.1.4。
法定名称为：磷脂酶A2。
别名：磷脂酰胆碱2-酰基水解酶、卵磷酯酶a、磷脂酶或磷脂酰脂酶(phosphatidolipase)。
催化的反应：磷脂酰胆碱+h(2)O＜＞1-酰基甘油磷酸胆碱+脂肪酸阴离子。
备注：也可作用于磷脂酰乙醇胺、胆碱缩醛磷脂和磷脂，去除第2位上的脂肪酸。
溶血磷脂酶根据标准酶EC分类被定义为EC3.1.1.5。
法定名称为：溶血磷脂酶。
别名：卵磷酯酶b、溶血卵磷脂酶、磷脂酶B或PLB。
催化的反应：2-溶血磷脂酰胆碱+h(2)O＜＞甘油磷酸胆碱+脂肪酸阴离子。
磷脂酶A活性也可能由具有其它活性的酶提供，如具有磷脂酶A活性的脂肪酶。磷脂酶A活性可以是来自于例如附带磷脂酶A活性的脂肪酶。在本发明的其它实施方式中，磷脂酶A活性是由基本上只有磷脂酶A活性的酶提供，其中磷脂酶A活性不是附带的活性。
可用任何来源的磷脂酶A，如来源于动物(如哺乳动物)，如来自胰腺(如牛或猪的胰腺)，或来源于蛇毒液或蜜蜂毒液等。可选地，磷脂酶A来源于微生物，如来自丝状真菌、酵母或细菌，如曲霉属(Aspergillus)的种类，黑曲霉(A.niger)、Dictyostelium的例如D.discoideum；毛霉属(Mucor)的例如爪哇毛霉(M.javanicus)，大毛霉(M.mucedo)，细胞毛霉(M.subtilissimus)；链孢霉属(Neurospora)的例如粗糙链孢霉(N.crassa)；Rhizomucor的例如R.pusillus；根霉属(Rhizopus)的例如无根根霉(R.arrhizus)；日本根霉(R.japonicus)和葡枝根霉(R.stolonifer)；核盘菌属(Sclerotinia)的例如大豆核盘菌(S.libertiana)；发癣菌属(Trichophyton)的深红色发癣菌(T.rubrum)；Whetzelinia的例如W.Sclerotiorum；芽孢杆菌属(Bacillus)的例如巨大芽孢杆菌(B.megaterium)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)；柠檬杆菌属(Citrobacter)的例如弗劳地氏柠檬杆菌(C.freundii)；肠杆菌属(Enterobacter)的例如产气肠杆菌(E.aerogenes)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)、爱德华氏菌属(E.dwardsiella)、迟钝爱德华氏菌(E.tarda)；欧文氏杆菌属(Erwinia)的例如草生欧文氏杆菌(Eherbicola)；埃希氏杆菌属(Escherichia)的例如大肠杆菌(E coli)；克雷白氏杆菌属(Klebsiella)的例如肺炎克雷白氏杆菌(K.Pneumoniae)；变形菌属(Proteus)的例如普通变形菌(P.vulgaris)；普罗威登斯菌属(Providencia)的例如司徒氏普罗威斯菌(P.stuartii)；沙门氏菌属(Salmonella)的例如鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)的例如解凝沙雷氏菌(S.liquefasciens)、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)；志贺氏菌属(Shigella)的例如弗氏志贺氏菌(S.flexneri)；链霉菌属(Streptomyces)的例如S.violeceoruber；耶尔森氏菌属(Yersinia)的例如小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.Enterocolitica)。因此，磷脂酶A可以来自于真菌例如核菌纲(Pyrenomycetes)，如镰孢属(Fusarium)，例如黄色镰孢(F.culmorum)，异孢镰孢(F.Heterosporum)、腐皮镰孢(F.Solani)或尖镰孢(F.Oxysporum)等菌株。磷脂酶A可以来自于曲霉属的丝状真菌菌种，如泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillusoryzae)。优选地磷脂酶来自镰孢属的菌株，具体的是描述于WO 98/26057的来自于尖镰孢(F.oxysporum)的DSM 2672菌株，尤其是可参见WO98/26057的权利要求36和SEQ ID NO.2。进一步的实施方式中，磷脂酶A是公开于WO 00/32758(Novozymes A/S，Denmark)的一种磷脂酶。
溶血磷脂酶
术语“溶血磷脂酶”此处指包括具有溶血磷脂酶活性的酶。
溶血磷脂酶活性也可能由具有其它活性酶提供，如具有溶血磷脂酶活性的脂肪酶。溶血磷脂酶活性可以是来自于例如脂肪酶附带的溶血磷脂酶活性。在本发明的其它实施方式中，溶血磷脂酶活性是由基本上只有溶血磷脂酶活性的酶提供，其中溶血磷脂酶活性不是附带的活性。本发明的一个实施方式中，溶血磷脂酶不是如WO 98/26057中定义的具有溶血磷脂酶附带活性的脂肪酶。
可用任何来源的溶血磷脂酶，如来源于动物源(如哺乳动物)，如来自肝(如大鼠肝)。可选地，溶血磷脂酶来源于微生物，如来自丝状真菌、酵母或细菌，如曲霉属的例如臭曲霉、烟曲霉(A.fumigatus)、构巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉、米曲霉；葡萄孢属(Botrytis)的例如灰色葡萄孢(B.cinerea)；假丝酵母属(Candida)的白色假丝酵母(C.albicans)；隐球酵母属(Cryptococcus)的例如新型隐球酵母(C.neoformans)；埃希氏杆菌属的例如大肠杆菌；镰孢属的例如拟分枝孢镰孢(F.sporotrichioides)、F.Venenatum、F.verticillioides；Hyphozyma；克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)的例如乳克鲁维氏酵母(K.lactis)；Magnaporte的例如M.grisea；绿僵菌属(Metarhizium)的例如金龟子绿僵菌(M.anisopliae)；球腔菌属(Mycosphaerella)的例如禾生球腔菌(M.graminicola)；镰孢霉属(Neurospora)的例如粗糙镰孢霉(N.Crassa)；青霉属(Penicillium)的例如点青霉(P.notatum)；糖酵母属(Saccharomyces)的例如啤酒糖酵母(S.cerevisiae)；裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)的例如粟酒裂殖糖酵母(S.pombe)；有孢圆酵母属(Torulaspora)的例如戴尔凯氏有孢圆酵母(T.delbrueckii)；弧菌属(Vibrio)的例如霍乱弧菌(V.Cholerae)。优选地溶血磷脂酶来自曲霉属的菌株，具体的是来自于黑曲霉的溶血磷脂酶LLPL-1或LLPL-2，它们包含在大肠杆菌DSM 13003或DSM 13004克隆中，或者来自于米曲霉的溶血磷脂酶LLPL-1 or LLPL-2，例如它们包含在大肠杆菌DSM 13082或DSM 13083中，这些均描述于WO 01/27251，具体参见其权利要求1和SEQ ID NOs.2、4、6或8。
兼有磷脂酶A和溶血磷脂酶活性的酶
本发明的优选实施方式中，磷脂酶A和溶血磷脂酶活是由兼具这两种酶活性的单酶所提供。例如，一个实施方式中使用的单酶兼有磷脂酶A1活性和溶血磷脂酶活性，另外一个实施方式中的单酶兼有磷脂酶A2活性和溶血磷脂酶活性，再有的实施方式中的单酶兼有磷脂酶A1活性、磷脂酶A2活性和溶血磷脂酶活性。
因此，本发明也涉及一种制备干酪的方法，包括向制干酪用乳中加入一种兼有磷脂酶A活性和溶血磷脂酶活性的酶，以降低干酪中的油脂析出效应和/或提高干酪产量，由制干酪用乳制得干酪。
兼有磷脂酶A活性和溶血磷脂酶活性的酶是本领域技术人员熟知的。兼有磷脂酶A活性和溶血磷脂酶活的酶的例子可见于Saito et al.，Methods inEnzymology(1991)197，446-456和Lee et al.，J.Biol.Chem.(1994)269，19725-19730。
酶源和成分(formulation)
本发明方法使用的磷脂酶A和/或溶血磷脂酶可以衍生自或可获得自此处提及的任何来源。术语“衍生”在本文中指可以从生物体中分离出的天然存在酶，即酶的氨基酸序列同一性与天然酶一致。术语“衍生”也指由宿主生物体重组产生的酶，重组酶可具有与天然酶的氨基酸序列完全相同，也可具有修饰的氨基酸序列，例如一或多个氨基酸被缺失、插入和/或取代，即重组酶是天然氨基酸序列的突变体和/或其片段。此外，术语“衍生”包括合成制备的酶如通过肽合成方法。术语“衍生”也包含在体内或体外被修饰的酶，如糖基化、磷酸化等修饰。术语“可获得的”在本文中指具有与天然酶的氨基酸一致的酶。该术语包含从生物体中分离出的天然酶，或由同一或不同的宿主生物体重组产生的酶，或如通过肽合成方法合成的酶。对于重组产生的酶而言，术语“可获得的”和“衍生”指酶的同一性，而不是重组产生其的宿主生物的同一性。
相应地，磷脂酶A和/或溶血磷脂酶可用合适的技术从微生物中获得。例如，磷脂酶A和/或溶血磷脂酶的制备可通过选择合适的微生物进行发酵，进而用已知的方法从发酵液或微生物菌体中分离出磷脂酶A和/或溶血磷脂酶。也可通过重组DNA技术来获得磷脂酶A和/或溶血磷脂酶。这种方法通常包括培养用重组DNA载体转化的宿主细胞，其中载体含有编码所研究的磷脂酶A或溶血磷脂酶的DNA序列，并且该DNA序列可操作连接于合适的表达信号以便在合适的能够表达出相应的酶培养条件下能表达磷脂酶A酶和溶血磷脂酶，进而可从培养基中收集相应的酶。DNA序列也可整合到宿主细胞的基因组中。DNA序列也可以是基因组DNA、cDNA或合成的DNA或者它们的组合，并可根据已知方法来分离或合成。
合适的磷脂酶可通过商业途径获得。实际应用的酶的典型例子，优选地使用衍生自胰腺的磷脂酶A2，如Lecitase(Novozymes A/S)。合适的溶血磷脂酶是描述于WO 01/27251的可由黑曲霉(Aspergillus niger)重组表达产生的A.niger溶血磷脂酶LLPL-2。
本发明方法所用磷脂酶A和/或溶血磷脂酶可以是纯化的。在此处使用的术语“纯化的”含盖不含有来自于生物体的其它成分的磷脂酶A或溶血磷脂酶蛋白。术语“纯化的”也含盖不含有天然生物体的其它成分的磷脂酶A或溶血磷脂酶蛋白，也称为“基本纯”的磷脂酶A或溶血磷脂酶，尤其可以是天然产生的磷脂酶A或溶血磷脂酶而没有进行遗传修饰，如缺失、取代或插入一个或多个氨基酸残基。
因此，磷脂酶A和/或溶血磷脂酶纯化至只含有极微量的其它蛋白。所述“其它蛋白”尤其指其它的酶。在此处“纯化的”指除去了来自磷脂酶A或溶血磷脂酶的细胞的其它成分，尤其是去除了其它蛋白，更尤其是去除了其它的酶。磷脂酶A或溶血磷脂酶可以“基本纯”的，即不含有来自产生其的生物体的其它成分，如不含来自重组产生磷脂酶A或溶血磷脂酶的宿主细胞的其它成分。优选地，酶至少75％(w/w)的纯度，更优选为至少80％、85％、90％，甚至至少95％的纯度。在更为优选的实施方式中，磷脂酶A或溶血磷脂酶至少98％的纯度。在其它的实施方式中，磷脂酶A和/或溶血磷脂酶不是奶中的天然存在的酶。
术语“磷脂酶”和“溶血磷脂酶”包括了对于酶的催化反应所需要的辅助物质，如适当的受体和协同因子，它们可以是也可以不是反应体系中自然存在的物质。
磷脂酶A和/或溶血磷脂酶可以是适合于所述用途的任何形式，如干粉或颗粒状、无粉尘的颗粒、液体、稳定化液体或保护酶。颗粒的制备可按如US 4106991和US 4661452中公开的方法进行，任选地用已知方法对酶进行包覆。可按公知的方法，例如通过添加稳定剂如蔗糖、糖醇或其它多元醇、乳酸或其它有机酸等使液体酶制剂稳定。可根据EP 238216披露的方法制备保护酶。
与其它类似方法但没有用此处所提及的磷脂酶A和溶血磷脂酶进行处理所得的干酪相比，通过本发明方法制备的干酪，其中的卵磷脂含量相比降低至少5％，例如至少10％，至少20％，至少50％，例如在5％-95％的范围内。
对牛奶而言，磷脂中有超过95％的是卵磷脂，而溶血卵磷脂大约只占1％。虽然在牛奶中，磷脂通常只占总脂肪含量的不到1％，但起到非常重要的作用，通常主要存在于奶脂肪球(milk fatglobue)膜。通过本发明方法，获得的干酪中卵磷脂含量低于总磷脂含量的90％、例如低于80％、例如低于60％或低于50％。卵磷脂含量可通过本领域技术人员已知的方法进行测定，如通过HPLC。
本发明进一步涉及利用按本发明方法获得的干酪在比萨饼、即食食品(ready-to-eat dishes)、融化干酪的应用或作为其它食品的成分。相应地，根据本发明方法获得的干酪可用于进一步加工的食品，如融化干酪(processedcheese)、比萨饼(pizza)、夹馅包(burgers)、烤面包(toast)、调味料(sauces)、调味品(dressing)、干酪干粉(cheese powder)或干酪调料(flavours)。
进一步的实施方式，本发明方法进一步包括对干酪进行加热处理，如加热到150-350℃。
本发明也涉及可获得的干酪(cheese obtainable)，尤其是通过本发明方法获得的干酪。
下面通过实施例进一步对本发明进行阐述，但不对本发明请求保护的范围有任何限制。
实施例1
添加磷脂酶A和溶血磷脂酶以生产干酪
酶制剂
A：0.03mg酶蛋白/g脂的磷脂酶A(Lecitase10 L，由Novozymes A/S，Denmark生产)
B：0.05mg/g乳脂的溶血磷脂酶(黑曲霉溶血磷脂酶LLPL-2，由黑曲霉重组产生，见于WO 01/27251)。
C：上述A和B酶的组合。
干酪的制备
用巴氏灭菌的非匀化奶油(North Carolina State University Dairy Plant)将巴氏灭菌的非匀化脱脂乳标准化至3.5％脂肪以生产全脂的Mozzarella干酪。
起子培养物制备是通过添加0.1g Rhodia LH100和0.3g Rhodia TA061起子培养物于50ml脱脂乳中，于35℃温和连续搅拌培养以平衡。标准化的制干酪用乳预平衡到35℃，并分成3份。1.4％起子培养物加入到每一批中，同时将上述提及的A、B和C酶制剂在温和搅拌下分别加入到一份中去。
当pH达到6.45-6.50时，将0.01％凝乳酶(Chymax，发酵产生的凝乳酶，由Chr.Hansens Lab.，Denmark制造)在剧烈搅拌下3分钟内加入到每一份中。移去搅拌器，让奶进行凝结。用刀或抹刀向下切入凝乳中来确定适当的切削时间(cutting time)。然后，将抹刀插入到凝乳的切口的下面，再垂直于切口方向进行切削，并将凝乳升高。当凝乳通过提升可分隔开，并且锋利的边缘保持在切口边缘的上表面时，认为可以进行切削。用1/2英尺刀片进行切削，并且在切削后静止5分钟。
在温和和间歇地搅拌条件下，将温度升高到41℃，并保持至pH达到5.65-5.70。然后，排除乳清，将凝乳微粒倒入到不锈钢杯中。杯于41℃水浴中漂浮以保持凝乳的温度，继续定期的排除过多乳清，直到刚刚足以覆盖凝乳以保持其热量为止。
当凝乳的pH达到5.25-5.3时，去除所有的乳清，凝乳淹没于57℃的去离子水中5分钟。用手将凝乳拉伸1分钟，并返回到57℃水中以恢复所需要的温度。拉伸的凝乳插入到室温自来水中10-15分钟，然后印干和冷藏。
油脂析出的确定
将干酪用搅拌机磨碎20秒至均匀的样品。约3.0克磨碎干酪入模到金属环中(2.2cm直径)，置于Whatman#4过滤纸的中间，再置于烤炉中90℃保持5分钟以熔化。每一个样品重复测试三次。用图像分析法测定油脂析出，因为在熔化过程中，金属环中的干酪周围形成油环和干酪圆周的面积之间的具有差值。计算油脂析出的公式如下：
油脂析出＝(总面积-干酪面积)×100/干酪的面积
结果
下表1中列出了结果(蛋白质、湿度、脂肪和油脂析出)。
表1
     A磷脂酶A      B溶血磷脂酶             C磷脂酶A和溶血磷脂酶的组合
蛋白质(％)     26.1     24.8         26.6
湿度(％)     50.9     51.2         49.7
脂肪(％)     22     22         23
油脂析出(比率)     84     105         68
从表1的结果可知，添加磷脂酶A比添加溶血磷脂酶能更好的减少油脂析出，但两种酶都添加时，油脂析出更低，表明两种酶之间有增效作用。
实施例2
奶与磷脂酶A和溶血磷脂酶反应形成长链脂肪酸
底物制备和酶处理
用脱脂乳将奶油标准化成25％的脂肪含量。用磷脂酶A(Lecitase10 L，Novozymes A/S，Denmark)、溶血磷脂酶(黑曲霉溶血磷脂酶LLPL2，由黑曲霉重组表达，见WO 01/27251)样品以及两种酶的组合处理样品，所用酶量如表3所示。如果需要，将酶预先溶解于水中，再按适当的剂量加入到奶油中。样品于35℃搅拌1.5小时。加入用于脂质抽提的有机溶剂以终止反应。
脂质提取：通过向样品混合1ml水，进而加入9ml氯仿/甲醇(2∶1)以抽提总奶脂质。样品剧烈混合均匀，于3000rpm离心5分钟。将下层的6微升氯仿(CHCl3)相去除，并真空干燥。样品在2ml氯仿中重新组合(reconstitute)。脂肪酸进一步用固相抽提(SPE)进行纯化。每一个氯仿抽提样品在真空下通过氨丙基SPE柱进行纯化。用4ml的氯仿/异戊醇(2∶1)以去除中性脂肪。脂肪酸用4ml冰醋酸(2％v/v)化的二乙醚进行洗提。醚抽提物在旋转蒸发器中干燥，并用1.0ml甲醇进行重组，以用于HPLC分析。
HPLC方法：用Phenomenex(Torrance，CA USA)生产的LunaC8(150×4.6mm，5μ，100A)柱进行反相色谱，其中流动相是含0.1％三氟乙酸的乙腈和水。表2列出所用的梯度洗脱方案。被洗提的脂肪酸的检测用蒸发光散射法(evaporative light scattering)进行。选择的HPLC脂肪酸标准(亚麻酸、棕榈酸、油酸和硬脂酸)是基于它们在牛奶的总脂肪中是优势的脂肪酸。按照常规方法用100％甲醇制成2-10mg/ml的母液(stock solution)。用100％甲醇将脂肪酸母液稀释到适当浓度制备成HPLC校准器。
表2用于HPLC脂肪酸分析的梯度洗脱方案
   步骤   时间(分钟)   ％A   ％B
    1     0     80     20
    2     2     80     20
    3     12     90     10
    4     17     90     10
    5     19     80     10
A＝100％乙腈
B＝水/0.1％三氟乙酸
磷脂酶A和/或溶血磷脂酶处理奶油样品后产生的游离长链脂肪酸的量如表3所示。从中可知，将磷脂酶A的用量由0.04mg/(g脂肪)增加到0.18mg/(g脂肪)，并没有明显增加产生游离脂肪酸的量。当溶血磷脂酶与磷脂酶A组合使用时，产生的脂肪酸量明显增加。
表3.用磷脂酶A和/或溶血磷脂酶处理奶油后产生的游离长链脂肪酸的量
  样品     Lecitase10L(mg酶蛋白/g乳脂)      LLPL2(mg酶蛋白/g乳脂)   产生的脂肪酸(mg/g乳脂)
    1     0.04     0     1.05
    2     0.18     0     1.12
    3     0.04     0.12     1.73
    4     0.18     0.12     1.74
    5     0.18     0.24     1.80
    6     0.18     0.48     1.87
    7     0.18     0.96     1.86

Claims (17)

1.一种制备干酪的方法，包括向制干酪用乳中加入选自磷脂酶A1、磷脂酶A2或其组合的磷脂酶；和溶血磷脂酶；降低干酪中的油脂析出效应和/或提高干酪产量；并由制干酪用乳制备干酪。
2.根据权利要求1的方法，其中磷脂酶A的量为0.003-0.3mg酶蛋白/g乳脂。
3.根据权利要求1的方法，其中磷脂酶A的量为0.01-0.3mg酶蛋白/g乳脂。
4.根据权利要求1的方法，其中磷脂酶A的用量为0.03mg酶蛋白/g乳脂。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中磷脂酶A和/或溶血磷脂酶在制干酪用乳的脂肪和/或蛋白质含量的标准化期间加入。
6.权利要求1-4中任一项的方法，其中磷脂酶A和/或溶血磷脂酶与起子培养物同时加入。
7.权利要求1-4中任一项的方法，其中磷脂酶A和/或溶血磷脂酶与干酪凝乳酶同时加入。
8.权利要求1-7中任一项的方法，进一步包括在磷脂酶A和/或溶血磷脂酶在制干酪用乳中已被允许发挥作用之后，去除或减少磷脂酶A和/或溶血磷脂酶蛋白含量的步骤。
9.权利要求1-8中任一项的方法，进一步包括在磷脂酶A和/或溶血磷脂酶在制干酪用乳中已被允许发挥作用之后，灭活磷脂酶A和/或溶血磷脂酶蛋白的步骤。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中干酪选自由凝乳酶凝结干酪凝乳产生的凝乳酶凝乳干酪、成熟干酪、新鲜干酪或酸凝干酪。
11.权利要求1-9中任一项的方法，其中干酪选自Campesino，Chester，Danbo，Drabant，Herregard，Manchego，Provolone，Saint Paulin，Soft cheese，Svecia，Taleggio，White cheese，Cheddar、Colby、Edam、Muenster，Gryere，Emmenthal，Camembert，Parmesan，Romano，Mozzarella，Feta；cream cheese，Neufchatel，Quarg，或Queso Blanco。
12.权利要求1-10中任一项的方法，其中制干酪用乳在制备干酪之前进行均质化处理。
13.根据权利要求12的方法，其中干酪是Danish Blue Cheese。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中磷脂酶A活性和溶血磷脂酶活性由兼具这两种酶活性的单酶所提供。
15.权利要求1-14中任一项的方法，进一步包括将干酪加工成食物产品的步骤。
16.根据权利要求15的方法，其中所述食物产品选自比萨饼、即食食品、烤面包、夹馅包、宽面条(lasagna)、调味料、调味品、干酪粉或干酪调料或融化干酪。
17.根据权利要求1-14任一项方法制备的干酪。
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