BR122020002402B1 - Proteína de ligação de antígeno isolada recombinante que liga il-23, composição farmacêutica, molécula de ácido nucleico isolada recombinante, vetor recombinante, célula hospedeira recombinante, métodos de confecção da referida proteína de ligação e uso da mesma - Google Patents

Proteína de ligação de antígeno isolada recombinante que liga il-23, composição farmacêutica, molécula de ácido nucleico isolada recombinante, vetor recombinante, célula hospedeira recombinante, métodos de confecção da referida proteína de ligação e uso da mesma Download PDF

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Abstract

são fornecidas proteínas de ligação de antígeno que se ligam a proteína de il-23 humana. ácidos nucleicos que codificam a proteína de ligação de antígeno, vetores, e células que codificam os mesmos bem como o uso de proteínas de ligação de antígeno de il-23 para objetivos diagnósticos e terapêuticos são também fornecidos.

Description

(Dividido do BR 112012009854-3, depositado em 26/10/2010) Referência cruzada a pedidos relacionados
[001] Este pedido reivindica o benefício sob 35 U.S.C. 119(e) de pedido de patente nos Estados Unidos número 61/254.982, depositado em 26 de outubro de 2009, e pedido de patente nos Estados Unidos número 61/381.287, depositado em 9 de setembro de 2010, que são aqui incorporados por referência.
Fundamento
[002] Interleucina 23 (IL-23), uma citocina heterodimérica, é um potente indutor de citocinas pró-inflamatórias. IL-23 é relacionada à citocina heterodimérica Interleucina 12 (IL-12), ambas partilhando uma subunidade p40 comum. Em IL-23, uma subunidade única p19 é covalentemente ligada à subunidade p40. Em IL-12, a subunidade única é p35 (Oppmann e cols., Immunity, 2000, 13: 713-715). A proteína heterodimérica de IL-23 é secretada. Como IL-12, IL-23 é expressa por células de apresentação de antígeno (como células dendríticas e macrófagos) em resposta a estímulos de ativação como ligação de CD40, agonistas de receptor Toll-like e patógenos. IL-23 se liga a um receptor heterodimérico que compreende uma subunidade de IL-12Rβ1 (que é partilhada com o receptor de IL-12) e uma subunidade de receptor único, IL-23R. O receptor de IL-12 consiste em IL-12Rβ1 e IL-12Rβ2. IL-23 se liga a seu receptor heterodimérico e sinais através de JAK2 e Tyk2 para ativar STAT1, 3, 4 e 5 (Parham e cols., J. Immunol. 2002, 168:5.699-708). As subunidades do receptor são predominantemente co-expressas em células T ativadas ou de memória e células natural killer e também em níveis menores em células dendríticas, monócitos, macrófagos, microglia, queratinócitos e fibroblastos sinoviais. IL-23 e IL-12 agem sobre diferentes subconjuntos de célula T e têm papéis substancialmente diferentes in vivo.
[003] IL-23 age sobre células T ativadas e de memória e promove a sobrevivência e expansão do subconjunto de célula T, Th17. As células Th17 produzem citocinas pró- inflamatórias que incluem IL-6, IL-17, TNFα, IL-22 e GM- CSF. IL-23 também age sobre células natural killer, células dendríticas e macrófagos para induzir expressão de citocina pró-inflamatória. Diferente de IL-23, IL-12 induz a diferenciação de células T CD4+ naive em células efetoras que produzem Th1 IFNy maduro, e induz a função de células NK e célula T citotóxica por estimulação da produção de IFNy. Acreditou-se previamente que as células Th1 dirigidas por IL-12 eram o subconjunto de célula T patogênica em várias doenças autoimunes, no entanto, estudos animais mais recentes em modelos de doença intestinal inflamatória, psoríase, artrite inflamatória e esclerose múltipla, em que as contribuições individuais de IL-12 versus IL-23 foram avaliadas, estabeleceram que IL-23, e não IL-12, é o controlador chave em doença autoimune/inflamatória (Ahern e cols., Immun. Rev. 2008 226:147-159; Cua e cols., Nature 2003 421:744-748; Yago e cols., Arthritis Res and Ther. 2007 9(5): R96). Acredita-se que IL-12 possua um papel crítico no desenvolvimento de respostas imunes protetoras inatas e adaptativas a vários patógenos intracelulares e vírus e em vigilância imune tumoral. Veja Kastelein, e cols., Annual Review of Immunology, 2007, 25: 221-42; Liu, e cols., Rheumatology, 2007, 46(8): 1266-73; Bowman e cols., Current Opinion in Infectious Diseases, 2006 19:24552; Fieschi and Casanova, Eur. J. Immunol. 2003 33:1.461-4; Meeran e cols., Mol. Cancer Ther. 2006 5: 825-32; Langowski e cols., Nature 2006 442: 461-5. Como tal, a inibição específica de IL-23 (poupando IL-12 ou a subunidade p40 partilhada) deve ter um perfil de segurança potencialmente superior comparado a inibição dupla de IL-12 e IL-23.
[004] Portanto, o uso de antagonistas específicos para IL-23 que inibem IL-23 humana (como anticorpos que ligam pelo menos a subunidade p19 única ou ligam tanto a subunidade p19 quanto a subunidade p40 de IL-23) que poupa IL-12 deve fornecer eficácia igual ou maior que a dos antagonistas de IL-12 ou antagonistas de p40 sem os riscos potenciais associados com a inibição de IL-12. Anticorpos de murídeo, humanizados e de apresentação de fago selecionados para inibição de IL-23 recombinante foram descritos; veja, por exemplo, Patente US 7.491.391, Publicações WIPO WO1999/05280, WO2007/0244846, WO2007/027714, WO 2007/076524, WO2007/147019, WO2008/103473, WO 2008/103432, WO2009/043933 e WO2009/082624. No entanto, há uma necessidade por agentes terapêuticos totalmente humanos que são capazes de inibir IL-23 humana nativa. Tais terapêuticos são altamente específicos para o alvo, particularmente in vivo. A inibição completa do alvo in vivo pode resultar em formulações com doses menores, menos frequentes e/ou dosagem mais eficaz que, por sua vez, resulta em custo reduzido e eficiência aumentada. A presente invenção fornece tais antagonistas de IL-23.
Sumário
[005] Proteínas de ligação de antígeno que ligam IL-23, particularmente IL-23 humana nativa, são fornecidas. As proteínas de ligação de antígeno de IL-23 humana podem reduzir, inibir, interferir com, e/ou modular pelo menos uma das respostas biológicas relacionadas a IL-23, e, como tal, são úteis para melhorar os efeitos de Doenças ou distúrbios relacionados a IL-23. As proteínas de ligação de antígeno de IL-23 podem ser usadas, por exemplo, para reduzir, inibir, interferir com e/ou modular a sinalização de IL-23, ativação de IL-23 de células Th17, ativação de IL-23 de células NK, ou indução da produção de citocinas pró-inflamatórias.
[006] Também são fornecidos sistemas de expressão, que incluem linhagens de células, para a produção de proteínas de ligação de antígeno de IL-23 e métodos de diagnóstico e tratamento de doenças relacionadas a IL-23 humana.
[007] Algumas das proteínas de ligação de antígeno que ligam IL-23 que são fornecidas compreendem pelo menos uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDRH1, uma CDRH2 e uma CDRH3 selecionada do grupo que consiste em uma CDRH1 que difere em não mais que uma substituição de aminoácido, inserção ou deleção de uma CDRH1 como mostrado na Tabela 3; uma CDRH2 que difere em não mais que três, duas ou uma substituições de aminoácido, inserções e/ou deleções de uma CDRH2 como mostrado na Tabela 3; uma CDRH3 que difere em não mais que três, duas ou uma substituições de aminoácido, inserções e/ou deleções de uma CDRH3 como mostrado na Tabela 3; e que compreende pelo menos uma região variável de cadeia leve que compreende uma CDRL1, uma CDRL2 e uma CDRL3 selecionada do grupo que consiste em: uma CDRL1 que difere em não mais que três, duas ou uma substituições de aminoácido, inserções e/ou deleções de uma CDRL1 como mostrado na Tabela 3; uma CDRL2 que difere em não mais que uma substituição de aminoácido, inserção ou deleção de uma CDRL2 como mostrado na Tabela 3; uma CDRL3 que difere em não mais que uma substituição de aminoácido, inserção ou deleção de uma CDRL3 como mostrado na Tabela 3. Em uma modalidade, é fornecida proteína de ligação de antígeno isolada que compreende: uma CDRH1 selecionada do grupo que consiste em Id. de Seq. N°: 91, 94, 97, 100 e 103; uma CDRH2 selecionada do grupo que consiste em Id. de Seq. N°: 92, 95, 98, 101, 104, 107 e 110; uma CDRH3 selecionada do grupo que consiste em Id. de Seq. N°: 93, 96, 99, 102 e 105; uma CDRL1 selecionada do grupo que consiste em Id. de Seq. N°: 62, 65, 68, 71 e 74; uma CDRL2 selecionada do grupo que consiste em Id. de Seq. N°: 63, 66, 69, 72, 75 e 78; e uma CDRL3 selecionada do grupo que consiste em Id. de Seq. N°: 64, 67, 70 e 73. Em outra modalidade, é fornecida uma proteína de ligação de antígeno isolada que compreende: uma CDRH1 selecionada do grupo que consiste em Id. de Seq. N°: 91, 106, 109, 112 e 115; uma CDRH2 selecionada do grupo que consiste em Id. de Seq. N°: 113, 116, 118, 120, 121 e 122; uma CDRH3 selecionada do grupo que consiste em Id. de Seq. N°: 108, 111, 114, 117 e 119; uma CDRL1 selecionada do grupo que consiste em Id. de Seq. N°: 77, 80, 83, 85, 86, 87, 88, 89 e 90; uma CDRL2 é Id. de Seq. N°: 81; e uma CDRL3 selecionada do grupo que consiste em Id. de Seq. N°: 76, 79, 82 e 84. Em outra modalidade, é fornecida uma proteína de ligação de antígeno isolada que compreende pelo menos uma região variável de cadeia pesada e pelo menos uma região variável de cadeia leve. Ainda em outra modalidade, é fornecida uma proteína de ligação de antígeno isolada como acima descrito que compreende pelo menos duas regiões variáveis de cadeia pesada e pelo menos duas regiões variáveis de cadeia leve. Ainda em outra modalidade, é fornecida uma proteína de ligação de antígeno isolada em que a proteína de ligação de antígeno é ligada a um grupo de rotulagem.
[008] Também são fornecidas proteínas de ligação de antígeno isoladas que ligam IL-23 selecionadas do grupo que consiste em: a) uma proteína de ligação de antígeno que possui CDRH1 de Id. de Seq. N°: 129, CDRH2 de Id. de Seq. N°: 132, CDRH3 de Id. de Seq. N°: 136, e CDRL1 de Id. de Seq. N°: 123, CDRL2 de Id. de Seq. N°: 81, e CDRL3 de Id. de Seq. N°: 76; b) uma proteína de ligação de antígeno que possui CDRH1 de Id. de Seq. N°: 131, CDRH2 de Id. de Seq. N°: 134, CDRH3 de Id. de Seq. N°: 137 e CDRL1 de Id. de Seq. N°: 124, CDRL2 de Id. de Seq. N°: 126 e CDRL3 de Id. de Seq. N°: 128; c) uma proteína de ligação de antígeno que possui CDRH1 de Id. de Seq. N°: 130, CDRH2 de Id. de Seq. N°: 133, CDRH3 de Id. de Seq. N°: 99 e CDRL1 de Id. de Seq. N°: 68, CDRL2 de Id. de Seq. N°: 69, e CDRL3 de Id. de Seq. N°: 67; e d) uma proteína de ligação de antígeno que possui CDRH1 Id. de Seq. N°: 91, CDRH2 Id. de Seq. N°: 135, CDRH3 Id. de Seq. N°: 138 e CDRL1 Id. de Seq. N°: 125, CDRL2 Id. de Seq. N°: 127 e CDRL3 Id. de Seq. N°: 64.
[009] Também são fornecidas proteínas de ligação de antígeno isoladas que ligam IL-23 que compreendem pelo menos uma região variável de cadeia pesada e pelo menos uma região variável de cadeia leve, selecionada do grupo que consiste em: uma região variável de cadeia pesada que compreende resíduos de aminoácido 31-35, 50-65 e 99-113 de Id. de Seq. N°: 31; e uma região variável de cadeia leve que compreende resíduos de aminoácido 23-36, 52-58 e 91-101 de Id. de Seq. N°: 1; uma região variável de cadeia pesada que compreende resíduos de aminoácido 31-35, 50-65 e 99-110 de Id. de Seq. N°: 34 e região variável de cadeia pesada que compreende resíduos de aminoácido 31-35, 50-66 e 99-110 de Id. de Seq. N°: 36; e uma região variável de cadeia leve que compreende resíduos de aminoácido 23-36, 52-62 e 97-105 de Id. de Seq. N°: 4; uma região variável de cadeia pesada que compreende resíduos de aminoácido 31-35, 50-66 e 99-114 de Id. de Seq. N°: 38; e uma região variável de cadeia leve que compreende resíduos de aminoácido 23-34, 50-61 e 94-106 de Id. de Seq. N°: 7; uma região variável de cadeia pesada que compreende resíduos de aminoácido 31-35, 50-66 e 99-114 de Id. de Seq. N°: 40; e uma região variável de cadeia leve que compreende resíduos de aminoácido 24-34, 50-56 e 94-106 de Id. de Seq. N°: 9; uma região variável de cadeia pesada que compreende resíduos de aminoácido 31-35, 50-66 e 99-114 de Id. de Seq. N°: 42; e uma região variável de cadeia leve que compreende resíduos de aminoácido 23-34, 50-61 e 94-106 de Id. de Seq. N°: 11; uma região variável de cadeia pesada que compreende resíduos de aminoácido 31-35, 50-65 e 98-107 de Id. de Seq. N°: 44; e uma região variável de cadeia leve que compreende resíduos de aminoácido 24-34, 50-56 e 89-97 de Id. de Seq. N°: 13; uma região variável de cadeia pesada que compreende resíduos de aminoácido 31-37, 52-67 e 100109 de Id. de Seq. N°: 46 ou Id. de Seq. N°: 153; e uma região variável de cadeia leve que compreende resíduos de aminoácido 24-34, 50-56 e 89-97 de Id. de Seq. N°: 15; uma região variável de cadeia pesada que compreende resíduos de aminoácido 31-37, 52-67 e 100-109 de Id. de Seq. N°: 48; e uma região variável de cadeia leve que compreende resíduos de aminoácido 24-34, 50-56 e 89-97 de Id. de Seq. N°: 17; uma região variável de cadeia pesada que compreende resíduos de aminoácido 31-37, 52-67 e 101-109 de Id. de Seq. N°: 50; e uma região variável de cadeia leve que compreende resíduos de aminoácido 24-34, 50-56 e 89-97 de Id. de Seq. N°: 19; uma região variável de cadeia pesada que compreende resíduos de aminoácido 31-35, 50-65 e 98-107 de Id. de Seq. N°: 52; e uma região variável de cadeia leve que compreende resíduos de aminoácido 24-34, 50-56 e 98-107 de Id. de Seq. N°: 21; uma região variável de cadeia pesada que compreende resíduos de aminoácido 31-37, 52-67 e 100109 de Id. de Seq. N°: 54; e uma região variável de cadeia leve que compreende resíduos de aminoácido 24-34, 50-56 e 89-97 de Id. de Seq. N°: 23; uma região variável de cadeia pesada que compreende resíduos de aminoácido 31-37, 52-67 e 100-109 de Id. de Seq. N°: 56; e uma região variável de cadeia leve que compreende resíduos de aminoácido 24-34, 50-56 e 89-97 de Id. de Seq. N°: 25; e uma região variável de cadeia pesada que compreende resíduos de aminoácido 3137, 52-57 e 100-109 de Id. de Seq. N°: 58; e uma região variável de cadeia leve que compreende resíduos de aminoácido 24-34, 500-56 e 89-97 de Id. de Seq. N°: 27.
[010] É aqui fornecida uma proteína de ligação de antígeno isolada que liga IL-23 que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a sequência de região variável de cadeia pesada difere em não mais que 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 substituições de aminoácido, adições e/ou deleções de uma sequência de região variável de cadeia pesada como mostrado na Tabela 2; e em que uma sequência de região variável de cadeia leve difere em não mais que 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 substituições de aminoácido, adições e/ou deleções de uma sequência de região variável de cadeia leve como mostrado na Tabela 1.
[011] Também é fornecida uma proteína de ligação de antígeno isolada que liga IL-23 selecionada do grupo que consiste em: a) uma região variável de cadeia pesada de Id. de Seq. N°: 140 e uma região variável de cadeia leve de Id. de Seq. N°: 30; b) uma região variável de cadeia pesada de Id. de Seq. N°: 141 e uma região variável de cadeia leve de Id. de Seq. N°: 61; c) uma região variável de cadeia pesada de Id. de Seq. N°: 142 e uma região variável de cadeia leve de Id. de Seq. N°: 4; e d) uma região variável de cadeia pesada de Id. de Seq. N°: 143 e uma região variável de cadeia leve de Id. de Seq. N°: 139.
[012] Também é fornecida uma proteína de ligação de antígeno isolada que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência ao Id. de Seq. N°: 31, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56 e 58; e uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 90% de identidade de sequência ao Id. de Seq. N°: 1, 4, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 e 27. Outra modalidade é uma proteína de ligação de antígeno isolada que compreende uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em Id. de Seq. N°: 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 e 153, e uma região variável de cadeia leve selecionada do grupo que consiste em Id. de Seq. N°: 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 e 27. Ainda em outra modalidade é uma proteína de ligação de antígeno isolada que compreende uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em Id. de Seq. N°: 31, 34, 36, 38, 40 e 42, e uma região variável de cadeia leve selecionada do grupo que consiste em Id. de Seq. N°: 1, 4, 7, 9 e 11.
[013] Também é fornecida uma proteína de ligação de antígeno isolada que liga IL-23 que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve selecionada do grupo que consiste em: a) uma região variável de cadeia pesada de Id. de Seq. N°: 31 e uma região variável de cadeia leve de Id. de Seq. N°: 1; b) uma região variável de cadeia pesada de Id. de Seq. N°: 34 ou 36 e uma região variável de cadeia leve de Id. de Seq. N°: 4; c) uma região variável de cadeia pesada de Id. de Seq. N°: 38 e uma região variável de cadeia leve de Id. de Seq. N°: 7; d) uma região variável de cadeia pesada de Id. de Seq. N°: 40 e uma região variável de cadeia leve de Id. de Seq. N°: 9; e) uma região variável de cadeia pesada de Id. de Seq. N°: 42 e uma região variável de cadeia leve de Id. de Seq. N°: 11; f) uma região variável de cadeia pesada de Id. de Seq. N°: 44 e uma região variável de cadeia leve de Id. de Seq. N°: 13; g) uma região variável de cadeia pesada de Id. de Seq. N°: 46 ou Id. de Seq. N°: 153 e uma região variável de cadeia leve de Id. de Seq. N°: 15; h) uma região variável de cadeia pesada de Id. de Seq. N°: 48 e uma região variável de cadeia leve de Id. de Seq. N°: 17; i) uma região variável de cadeia pesada de Id. de Seq. N°: 50 e uma região variável de cadeia leve de Id. de Seq. N°: 19; j) uma região variável de cadeia pesada de Id. de Seq. N°: 52 e uma região variável de cadeia leve de Id. de Seq. N°: 21; k) uma região variável de cadeia pesada de Id. de Seq. N°: 54 e uma região variável de cadeia leve de Id. de Seq. N°: 23; I) uma região variável de cadeia pesada de Id. de Seq. N°: 56 e uma região variável de cadeia leve de Id. de Seq. N°: 25; e m) uma região variável de cadeia pesada de Id. de Seq. N°: 58 e uma região variável de cadeia leve de Id. de Seq. N°: 27.
[014] Também é fornecida uma proteína de ligação de antígeno isolada que liga IL-23 humana, em que o remendo coberto formado quando a proteína de ligação de antígeno é ligada a IL-23 humana compreende contatos de resíduo 30, 31, 32, 49, 50, 52, 53, 56, 92 e 94 de Id. de Seq. N°: 15, em que os contatos de resíduo possuem um valor de diferença maior que ou igual a 10 A2 como determinado por área de superfície exposta ao solvente. Em uma modalidade, os contatos de resíduo compreendem os resíduos 31-35, 54, 5860, 66, e 101-105 de Id. de Seq. N°: 46.
[015] Também é fornecida uma proteína de ligação de antígeno isolada que liga IL-23 humana, em que o remendo coberto formado quando a proteína de ligação de antígeno é ligada a IL-23 humana compreende contatos de resíduo 31-34, 51, 52, 55, 68, 93 e 98 de Id. de Seq. N°: 1, em que os contatos de resíduo possuem um valor de diferença maior que ou igual a 10 A2 como determinado por área de superfície exposta ao solvente. Em uma modalidade, os contatos de resíduo compreendem os resíduos 1, 26, 28, 31, 32, 52, 53, 59, 76, 101, 102 e 104-108 de Id. de Seq. N°: 31.
[016] Também é fornecida uma proteína de ligação de antígeno isolada que liga IL-23 humana, em que, quando a proteína de ligação de antígeno é ligada a IL-23 humana, a proteína de ligação de antígeno é 5 A ou menos dos resíduos 32-35, 54, 58-60, 66 e 101-105 de Id. de Seq. N°: 46, como determinado por Cristalografia de raios X. Em uma modalidade, a proteína de ligação de antígeno é 5 A ou menos dos resíduos 31-35, 54, 56, 58-60, 66 e 101-105 de Id. de Seq. N°: 46.
[017] Também é fornecida uma proteína de ligação de antígeno isolada que liga IL-23 humana, em que, quando a proteína de ligação de antígeno é ligada a IL-23 humana, a proteína de ligação de antígeno é 5 A ou menos dos resíduos 30-32, 49, 52, 53, 91-94 e 96 de Id. de Seq. N°: 15, como determinado por Cristalografia de raios X. Em uma modalidade, a proteína de ligação de antígeno é 5 A ou menos dos resíduos 30-32, 49, 50, 52, 53, 56, 91-94 e 96 de Id. de Seq. N°: 15.
[018] Também é fornecida uma proteína de ligação de antígeno isolada que liga IL-23 humana, em que, quando a proteína de ligação de antígeno é ligada a IL-23 humana, a proteína de ligação de antígeno é 5 A ou menos dos resíduos 26-28, 31, 53, 59, 102 e 104-108 de Id. de Seq. N°: 31, como determinado por Cristalografia de raios X. Em uma modalidade, a proteína de ligação de antígeno é 5 A ou menos dos resíduos 1, 26-28, 30-32, 52, 53, 59, 100, e 102108 de Id. de Seq. N°: 31.
[019] Também é fornecida uma proteína de ligação de antígeno isolada que liga IL-23 humana, em que, quando a referida proteína de ligação de antígeno é ligada a IL-23 humana, a referida proteína de ligação de antígeno é 5 A ou menos dos resíduos 31-34, 51, 52, 55, 68 e 93 de Id. de Seq. N°: 1 como determinado por Cristalografia de raios X. Em uma modalidade, a proteína de ligação de antígeno é 5 A ou menos dos resíduos 29, 31-34, 51, 52, 55, 68, 93 e 100 de Id. de Seq. N°: 1.
[020] Também é fornecida uma proteína de ligação de antígeno isolada como acima descrito, em que a proteína de ligação de antígeno é um anticorpo. Em uma modalidade, é fornecida uma proteína de ligação de antígeno isolada em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo multiespecífico, ou um fragmento de anticorpo deste. Em outra modalidade, é fornecida uma proteína de ligação de antígeno isolada em que o fragmento de anticorpo é um fragmento Fab, um fragmento Fab’, um fragmento F(ab’)2’, um fragmento Fv, um diabody, ou uma molécula de anticorpo de cadeia única. Ainda em outra modalidade, é fornecida uma proteína de ligação de antígeno isolada em que a proteína de ligação de antígeno é um anticorpo humano. Ainda em outra modalidade, é fornecida uma proteína de ligação de antígeno isolada em que a proteína de ligação de antígeno é um anticorpo monoclonal. Em outra modalidade, é fornecida uma proteína de ligação de antígeno isolada em que a proteína de ligação de antígeno é do tipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Ainda em outra modalidade, é fornecida uma proteína de ligação de antígeno isolada em que a proteína de ligação de antígeno é do tipo IgG1 ou IgG2.
[021] Uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica uma proteína de ligação de antígeno, como acima descrito, é também fornecida. Em uma modalidade, é fornecida uma molécula de ácido nucleico isolada em que pelo menos uma região variável de cadeia pesada é codificada por uma molécula de ácido nucleico isolada selecionada do grupo que consiste em Id. de Seq. Nos: 32, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59 e 152, e pelo menos uma região variável de cadeia leve é codificada por uma molécula de ácido nucleico isolada selecionada do grupo que consiste em Id. de Seq. Nos: 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 e 28. Em outra modalidade, é fornecida uma molécula de ácido nucleico em que a molécula de ácido nucleico é operacionalmente ligada a uma sequência de controle. Em outra modalidade, é fornecido um vetor que compreende uma molécula de ácido nucleico como acima descrito. Ainda em outra modalidade, é fornecida uma célula hospedeira que compreende a molécula de ácido nucleico como acima descrito. Em outra modalidade, é fornecida uma célula hospedeira que compreende o vetor acima descrito. Ainda em outra modalidade, é fornecido um polinucleotídeo isolado suficiente para uso como um marcador de hibridização, iniciador de PCR ou iniciador de sequenciamento que é um fragmento da molécula de ácido nucleico como acima descrita ou seu complemento.
[022] Também é fornecido um método de confecção da proteína de ligação de antígeno como acima descrito, que compreende a etapa de preparação da referida proteína de ligação de antígeno a partir de uma célula hospedeira que secreta a referida proteína de ligação de antígeno.
[023] Também é fornecida uma proteína de ligação de antígeno isolada que liga IL-23 humana, em que o remendo coberto formado quando a proteína de ligação de antígeno é ligada a IL-23 humana compreende um contato de resíduo nos resíduos 46-58, um contato de resíduo nos resíduos 112-120, e um contato de resíduo nos resíduos 155-163 da subunidade p19 de IL-23 humana como descrito no Id. de Seq. N°: 145, em que o contato de resíduo tem um valor de diferença maior que ou igual a 10A2 como determinado por área de superfície exposta ao solvente. É fornecida uma modalidade em que o remendo coberto formado quando a proteína de ligação de antígeno é ligada a IL-23 humana compreende um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze ou treze contatos de resíduo nos resíduos 46-58, um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez contatos de resíduo nos resíduos 112-120, e um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou nove contatos de resíduo nos resíduos 155-163 da subunidade p19 de IL-23 humana como descrito no Id. de Seq. N°: 145. É fornecida uma modalidade em que o remendo coberto formado quando a proteína de ligação de antígeno se liga a IL-23 humana compreende um contato de resíduo nos resíduos 121-125 da subunidade p40 de IL-23 humana como descrito no Id. de Seq. N°: 147. É fornecida uma modalidade em que o remendo coberto formado quando a proteína de ligação de antígeno é ligada a IL-23 humana compreende um, dois, três, quatro ou cinco contatos de resíduo nos resíduos 121-125 da subunidade p40 de IL-23 humana como descrito no Id. de Seq. N°: 147. É fornecida uma modalidade em que o remendo coberto formado quando a proteína de ligação de antígeno é ligada a IL-23 humana compreende contatos de resíduo 46, 47, 49, 50, 53, 112-116, 118, 120, 155, 156, 159, 160 e 163 de Id. de Seq. N°: 145. É fornecida outra modalidade em que o remendo coberto formado quando a proteína de ligação de antígeno é ligada a IL-23 humana compreende contatos de resíduo 46, 47, 49, 50, 53, 112-118, 120, 155, 156, 159, 160 e 163 de Id. de Seq. N°: 145. É fornecida outra modalidade em que o remendo coberto formado quando a proteína de ligação de antígeno é ligada a IL-23 humana compreende resíduos 46, 47, 49, 50, 53-55, 57, 58, 112-116, 118-120, 155, 156, 159, 160, 162 e 163 de Id. de Seq. N°: 145. É fornecida uma modalidade relacionada em que o remendo coberto formado quando a proteína de ligação de antígeno é ligada a IL-23 humana compreende contato de resíduo 122 da subunidade p40 de IL- 23 humana como descrito no Id. de Seq. N°: 147. É fornecida outra modalidade relacionada em que o remendo coberto formado quando a proteína de ligação de antígeno é ligada a IL-23 humana compreende contatos de resíduo 122 e 124 da subunidade p40 de IL-23 humana como descrito no Id. de Seq. N°: 147. É ainda fornecida outra modalidade relacionada em que o remendo coberto formado quando a proteína de ligação de antígeno é ligada a IL-23 humana compreende contato de resíduo 121-123 e 125 da subunidade p40 de IL-23 humana como descrito no Id. de Seq. N°: 147. Uma modalidade adicional fornecida em que o remendo coberto formado quando a proteína de ligação de antígeno é ligada a IL-23 humana compreende contato de resíduo 121-123, 125 e 283 da subunidade p40 de IL-23 humana como descrito no Id. de Seq. N°: 147.
[024] Também é fornecida uma proteína de ligação de antígeno isolada que liga IL-23 humana, em que, quando a referida proteína de ligação de antígeno é ligada a IL-23 humana, a referida proteína de ligação de antígeno é 5A ou menos de um resíduo nos resíduos 46-58, de um resíduo nos resíduos 112-123, e de um resíduo nos resíduos 155-163 da subunidade p19 de IL-23 humana como descrito no Id. de Seq. N°: 145, como determinado por cristalografia de raios X. Em uma modalidade, quando a proteína de ligação de antígeno é ligada a IL-23 humana, a proteína de ligação de antígeno é 5A ou menos de um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze ou treze resíduos nos resíduos 46-58, de um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez, resíduos nos resíduos 112-123, e de um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou nove resíduos nos resíduos 155-163 da subunidade p19 de IL-23 humana como descrito no Id. de Seq. N°: 145. Em outra modalidade, quando a proteína de ligação de antígeno é ligada a IL-23 humana, a proteína de ligação de antígeno é 5A ou menos dos resíduos 46-50, 113-116, 120, 156, 159, 160 e 163 de Id. de Seq. N°: 145. Em outra modalidade, quando a proteína de ligação de antígeno é ligada a IL-23 humana, a proteína de ligação de antígeno é 5A ou menos dos resíduos 46-50, 112120, 156, 159, 160 e 163 de Id. de Seq. N°: 145. Em uma modalidade relacionada, quando a proteína de ligação de antígeno é ligada a IL-23 humana, a proteína de ligação de antígeno é 5A ou menos dos resíduos 46-50, 53, 112-120, 156, 159, 160 e 163 de Id. de Seq. N°: 145. Em outra modalidade, quando a proteína de ligação de antígeno é ligada a IL-23 humana, a proteína de ligação de antígeno é 5A ou menos dos resíduos 46-50, 53-55, 58, 113-116, 120, 121, 156, 159, 160, 162 e 163 de Id. de Seq. N°: 145. Em uma modalidade relacionada, quando a proteína de ligação de antígeno é ligada a IL-23 humana, a proteína de ligação de antígeno é 5A ou menos dos resíduos 46-51, 53-55, 57, 58, 112-116, 118-121, 123, 155, 156, 159, 160, 162 e 163 de Id. de Seq. N°: 145. Em uma modalidade adicional, quando a proteína de ligação de antígeno é ligada a IL-23 humana, a proteína de ligação de antígeno é 5A ou menos de um resíduo nos resíduos 121-125, da subunidade p40 de IL-23 humana como descrito no Id. de Seq. N°: 147, como determinado por cristalografia de raios X. Em uma modalidade relacionada, quando a proteína de ligação de antígeno é ligada a IL-23 humana, a referida proteína de ligação de antígeno é 5 A ou menos dos resíduos 122 e 124 de Id. de Seq. N°: 147. Em outra modalidade, quando a proteína de ligação de antígeno é ligada a IL-23 humana, a proteína de ligação de antígeno é 5 A ou menos dos resíduos 121-123 e 125 de Id. de Seq. N°: 147.
[025] Também é fornecida uma proteína de ligação de antígeno isolada como acima descrito, em que a proteína de ligação de antígeno tem pelo menos uma propriedade selecionada do grupo que consiste em: a) redução da atividade de IL-23 humana; b) redução da produção de uma citocina pró-inflamatória; c) ligação a IL-23 humana com uma KD <5x10-8 M; d) que possui uma taxa de Koff <5x10-6 1/s; e e) que possui uma IC50 <400 M.
[026] É fornecida uma composição farmacêutica que compreende pelo menos uma proteína de ligação de antígeno como acima descrito e excipiente farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, é fornecida uma composição farmacêutica que também compreende um grupo de rotulagem ou um grupo efetor. Ainda em outra modalidade, é fornecida uma composição farmacêutica em que o grupo de rotulagem é selecionado do grupo que consiste em rótulos isotópicos, rótulos magnéticos, porções ativas redox, corante óticos, grupos biotinilatados e epitopos de polipeptídeo predeterminados reconhecidos por um repórter secundário. Ainda em outra modalidade, é fornecida uma composição farmacêutica em que o grupo efetor é selecionado do grupo que consiste em um radioisótopo, radionuclídeo, uma toxina, um grupo terapêutico e um grupo quimioterápico.
[027] Também é fornecido um método para o tratamento ou prevenção de uma condição associada com IL-23 em um paciente, que compreende a administração a um paciente em necessidade deste de uma quantidade eficaz de pelo menos uma proteína de ligação de antígeno isolada como acima descrito. Em uma modalidade, é fornecido um método em que a condição é selecionada do grupo que consiste em um distúrbio inflamatório, um distúrbio reumático, um distúrbio autoimune, um distúrbio oncológico e um distúrbio gastrointestinal. Ainda em outra modalidade, é fornecido um método em que a condição é selecionada do grupo que consiste em esclerose múltipla, artrite reumatóide, câncer, psoríase, doença intestinal inflamatória, doença de Crohn, colite ulcerativa, lúpus eritematoso disseminado, artrite psoriática, miocardite autoimune; diabetes tipo 1 e espondilite anquilosante. Ainda em outra modalidade, é fornecido um método em que a proteína de ligação de antígeno isolada é administrada isoladamente ou como uma terapia de combinação.
[028] Também é fornecido um método de redução de atividade de IL-23 em um paciente que compreende a administração de uma quantidade eficaz de pelo menos uma proteína de ligação de antígeno como acima descrito. Em uma modalidade, é fornecido um método de redução de atividade de IL-23, em que a referida atividade de IL-23 é a indução da produção de uma citocina pró-inflamatória.
Breve descrição dos desenhos
[029] Figura 1A: Resultados de ensaio repórter de STAT-luciferase com o uso de IL-23 humana recombinante. Todos os anticorpos inibiram completamente a IL-23 humana recombinante
[030] Figura 1B: Resultados de ensaio repórter de STAT-luciferase com o uso de IL-23 humana nativa. Apenas metade daqueles anticorpos que inibiram completamente IL-23 humana recombinante foi capaz de inibir completamente IL-23 humana nativa
Descrição detalhada
[031] A presente invenção fornece composições, kits e métodos relacionados a proteínas de ligação de antígeno de IL-23, que incluem moléculas que antagonizam IL-23, como anticorpos anti-IL-23, fragmentos de anticorpo, e derivados de anticorpos, por exemplo, anticorpos antagonistas anti- IL-23, fragmentos de anticorpo, ou derivados de anticorpos. Também são fornecidos polinucleotídeos, e derivados e fragmentos destes, que compreendem uma sequência de ácidos nucleicos que codifica toda ou uma porção de um polipeptídeo que se liga a IL-23, por exemplo, um polinucleotídeo que codifica todo ou parte de um anticorpo anti-IL-23, fragmento de anticorpo, ou derivado de anticorpo, plasmídeos e vetores que compreendem tais ácidos nucleicos, e células ou linhagens de células que compreendem tais polinucleotídeos e/ou vetores e plasmídeos. Os métodos fornecidos incluem, por exemplo, métodos de confecção, identificação, ou isolação de proteínas de ligação de antígeno de IL-23, como anticorpos anti-IL-23, métodos de determinação de se a molécula se liga a IL-23, métodos de determinação de se a molécula antagoniza IL-23, métodos de confecção de composições, como composições farmacêuticas, que compreendem uma proteína de ligação de antígeno de IL-23, e métodos para a administração de uma proteína de ligação de antígeno de IL- 23 a um indivíduo, por exemplo, métodos para o tratamento de uma condição mediada por IL-23, e para antagonizar atividade biológica de IL-23, in vivo ou in vitro.
[032] A menos que definido em contrário nesta especificação, os termos científicos e técnicos usados junto à presente invenção devem possuir os significados que são comumente compreendidos por aqueles de habilidade comum na técnica. Além disso, a menos que requerido em contrário pelo contexto, os termos no singular devem incluir pluralidades e os termos no plural devem incluir o singular. Geralmente, nomenclaturas e termos técnicos usados junto à cultura de células e tecidos, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e química de proteína e ácido nucleico e hibridização aqui descritos são aqueles bem conhecidos e comumente usados na técnica. Os métodos e técnicas da presente invenção são geralmente realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e como descritos em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas por toda a presente especificação, a menos que indicado em contrário. Veja, por exemplo, Sambrook e cols., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) e Ausubel e cols., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), e Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990). As reações enzimáticas e técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante, como comumente realizado na técnica ou como aqui descrito. A terminologia usada e os procedimentos laboratoriais e técnicas de química analítica, química orgânica sintética e química medicinal e farmacêutica aqui descritos são aqueles bem conhecidos e comumente usados na técnica. Técnicas padrão podem ser usadas para síntese química, análise química, preparação farmacêutica, formulação, e liberação e tratamento de pacientes.
[033] Todas as patentes e outras publicações identificadas são expressamente aqui incorporadas por referência em suas totalidades para o objetivo de descrição e revelação, por exemplo, das metodologias descritas em tais publicações que devem ser usadas junto com informação aqui descrita.
[034] As sequências de polinucleotídeo e proteína da subunidade p19 de IL-23 humana (Id. de Seq. Nos: 144 e 145), a subunidade p40 partilhada (Id. de Seq. Nos: 146 e 147), as subunidades hererodiméricas de receptor de IL-23 humana IL-12Rβ1 (Id. de Seq. Nos: 150 e 151) e IL-23R (Id. de Seq. Nos: 148 e 149) são conhecidas na técnica; veja, por exemplo, Nos. de Acesso GenBank AB030000; M65272, NM_005535, NM_144701, como são aqueles de outras espécies de mamífero. As proteínas de receptor de IL-23 e IL-23 recombinante que incluem cadeia única e proteínas Fc, bem como células que expressam o receptor de IL-23, foram descritos ou são disponíveis por fontes comerciais (veja, por exemplo, Oppmann e cols., Immunity, 2000, 13: 713-715; R&D Systems, Minneapolis. Minnesota; United States Biological, Swampscott, Massachusetts; Publicação WIPO No. WO 2007/076524). IL-23 humana nativa pode ser obtida a partir de células humanas como células dendríticas com o uso de métodos conhecidos na técnica que incluem aqueles aqui descritos.
[035] IL-23 é uma citocina heterodimérica que compreende uma subunidade p19 única que é covalentemente ligada a uma subunidade p40 partilhada. A subunidade p19 compreende quarto a-hélices, “A”, “B”, “C” e “D” em um motivo “up-up-down-down” ligado por três alças intra-hélice entre as hélices A e B, entre as hélices B e C e entre as hélices C e D; veja Oppmann e cols., Immunity, 2000, 13: 713-715 e Beyer, e cols., J Mol Biol, 2008. 382(4): 942-55. Acredita-se que as hélices A e D de 4 citocinas de feixe helicoidal estejam envolvidas com ligação de receptor. A subunidade p40 compreende três domínios sanduíche de folha beta, D1, D2 e D3 (Lupardus and Garcia, J. Mol. Biol., 2008, 382:931-941).
[036] O termo “polinucleotídeo” inclui ácidos nucleicos de filamento único e de filamento duplo e inclui DNA genômico, RNA, mRNA, cDNA, ou origem sintética, ou alguma combinação destes que não seja associada com sequências normalmente encontradas na natureza. Os polinucleotídeos isolados que compreendem sequências especificadas podem incluir, além das sequências especificadas, sequências codificadoras para dez ou até vinte outras proteínas ou porções destas, ou podem incluir sequências reguladoras operacionalmente ligadas que controlam a expressão da região codificadora das sequências de ácidos nucleicos citadas, e/ou podem incluir sequências de vetor. Os nucleotídeos que compreendem o polinucleotídeo podem ser ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos ou uma forma modificada de cada tipo de nucleotídeo. As modificações incluem modificações de base como derivados de bromouridina e inosina, modificações de ribose como 2',3'- didesoxirribose, e modificações de ligação de internucleotídeo como fosforotioato, fosforoditioato, fosforosselenoato, fosforodisselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato e fosforoamidato.
[037] O termo “oligonucleotídeo” significa um polinucleotídeo que compreende 100 ou menos nucleotídeos. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos são de 10 a 60 bases de comprimento. Em outras modalidades, os oligonucleotídeos são de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 a 40 nucleotídeos de comprimento. Os oligonucleotídeos podem ser de filamento único ou de filamento duplo, por exemplo, para uso na construção de um gene mutante. Oligonucleotídeos podem ser oligonucleotídeos senso ou anti-senso. Um oligonucleotídeo pode incluir um rótulo detectável, como um radiomarcador, um rótulo fluorescente, um hapteno ou um rótulo antigênico, para ensaios de detecção. Os oligonucleotídeos podem ser usados, por exemplo, como iniciadores de PCR, iniciadores de clonagem ou marcadores de hibridização.
[038] O termo “polipeptídeo” ou “proteína” significa uma macromolécula que possui uma sequência de aminoácidos de uma proteína nativa, ou seja, uma proteína produzida por uma célula de ocorrência natural e não recombinante; ou ela é produzida por uma célula geneticamente construída ou recombinante, e compreende moléculas que possuem uma sequência de aminoácidos da proteína nativa, ou moléculas que possuem uma ou mais deleções, inserções, e/ou substituições dos resíduos de aminoácido da sequência nativa. O termo também inclui polímeros de aminoácido em que um ou mais aminoácidos são análogos químicos de um aminoácido correspondente de ocorrência natural e polímeros. Os termos “polipeptídeo” e “proteína” englobam proteínas de ligação de antígeno de IL-23 (como anticorpos) e sequências que possuem uma ou mais deleções, adições, e/ou substituições dos resíduos de aminoácido da sequência de proteína de ligação de antígeno. O termo “fragmento de polipeptídeo” refere-se a um polipeptídeo que possui uma deleção de terminal amino, uma deleção de terminal carboxil, e/ou uma deleção interna quando comparado à proteína nativa de comprimento total. Tais fragmentos também podem conter aminoácidos modificados quando comparados com a proteína nativa. Em certas modalidades, fragmentos possuem cerca de cinco a 500 aminoácidos de comprimento. Por exemplo, os fragmentos podem ter pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 ou 450 aminoácidos de comprimento. Fragmentos de polipeptídeo úteis incluem fragmentos imunologicamente funcionais de anticorpos, que incluem domínios de ligação. No caso de uma proteína de ligação de antígeno de IL-23, como um anticorpo, os fragmentos úteis incluem, sem limitação, uma ou mais regiões de CDR, um domínio variável de uma cadeia pesada ou cadeia leve, uma porção de uma cadeia de anticorpo, uma porção de uma região variável que inclui menos que três CDRs, e outros.
[039] “Aminoácido” inclui seu significado normal na técnica. Os vinte aminoácidos de ocorrência natural e suas abreviações seguem o uso convencional. Veja Immunology-A Synthesis, 2a Edição, (E. S. Golub and D. R. Gren, eds.), Sinauer Associates: Sunderland, Mass. (1991). Estereoisômeros (por exemplo, D-aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais, aminoácidos não naturais como aminoácidos [alfa]-,[alfa]-dissubstituídos, N-alquil aminoácidos, e outros aminoácidos não convencionais também podem ser componentes adequados para os polipeptídeos. Exemplos de aminoácidos não convencionais incluem: 4- hidroxiprolina, [gama]-carboxiglutamato, [epsilon]-N,N,N- trimetil lisina, [epsilon]-N-acetil lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5- hidroxilisina, [sigma]-N-metilarginina, e outros aminoácidos similares e imino ácidos (por exemplo, 4- hidroxiprolina). Na denominação de polipeptídeo aqui usada, a direção esquerda é a direção do terminal amino e a direção direita é a direção do terminal carboxil, de acordo com uso e convenção padrão.
[040] O termo “proteína isolada” refere-se a uma proteína, como uma proteína de ligação de antígeno (um exemplo da qual pode ser um anticorpo), que é purificada das proteínas ou polipeptídeos ou outros contaminantes que podem interferir com seu uso ou pesquisa terapêutica, diagnóstica, profilática. Como aqui usado, “substancialmente puro” significa que a espécie descrita da molécula é a espécie presente predominante, ou seja, em uma base molar ela é mais abundante que qualquer outra espécie individual na mesma mistura. Em certas modalidades, uma molécula substancialmente pura é uma composição em que a espécie compreende pelo menos 50% (em uma base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes. Em outras modalidades, uma composição substancialmente pura compreenderá pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de todas as espécies macromoleculares presentes na composição. Em certas modalidades, uma substância essencialmente homogênea foi purificada a tal grau que espécies contaminantes não podem ser detectadas na composição por métodos convencionais de detecção e assim a composição consiste em uma espécie macromolecular detectável única.
[041] Uma “variante” de um polipeptídeo (por exemplo, uma proteína de ligação de antígeno como um anticorpo) compreende uma sequência de aminoácidos em que um ou mais resíduos de aminoácido são inseridos, deletados e/ou substituídos na sequência de aminoácidos relativa a outra sequência de polipeptídeo. Variantes incluem proteínas de fusão. Um “derivado” de um polipeptídeo é um polipeptídeo que foi quimicamente modificado em alguma maneira distinta de inserção, deleção, ou variantes de substituição, por exemplo, por meio de conjugação a outra fração química.
[042] Os termos “de ocorrência natural” ou “nativo” como usados por toda a especificação junto a materiais biológicos como polipeptídeos, ácidos nucleicos, células hospedeiras, e outros, referem-se a materiais que são encontrados na natureza, como IL-23 humana nativa. Em certos aspectos, proteínas de ligação de antígeno recombinante que se ligam a IL-23 nativa são fornecidas. Neste contexto, uma “proteína recombinante” é uma proteína feita com o uso de técnicas recombinantes, ou seja, através da expressão de um ácido nucleico recombinante como aqui descrito. Métodos e técnicas para a produção de proteínas recombinantes são bem conhecidos na técnica.
[043] O termo “anticorpo” refere-se a uma imunoglobulina intacta de qualquer isotipo, ou um fragmento desta que pode competir com o anticorpo intacto para ligação específica ao antígeno alvo, e inclui, por exemplo, anticorpos quiméricos, humanizados, totalmente humanos, e biespecíficos. Um anticorpo como tal é uma espécie de uma proteína de ligação de antígeno. A menos que indicado em contrário, o termo “anticorpo” inclui, além dos anticorpos que compreendem duas cadeias pesadas de comprimento total e duas cadeias leves de comprimento total, derivados, variantes, fragmentos e muteínas destes, exemplos dos quais são descritos abaixo. Um anticorpo intacto geralmente compreenderá pelo menos duas cadeias pesadas de comprimento total e duas cadeias leves de comprimento total, mas em alguns casos pode incluir menos cadeias como anticorpos de ocorrência natural em camelídeos que podem compreender apenas cadeias pesadas. Os anticorpos podem ser derivados apenas de uma única fonte, ou podem ser “quiméricos”, ou seja, diferentes porções do anticorpo podem ser derivadas de dois diferentes anticorpos como descrito posteriormente abaixo. As proteínas de ligação de antígeno, anticorpos, ou fragmentos de ligação podem ser produzidos em hibridomas, por técnicas de DNA recombinante, ou por clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos.
[044] O termo “fragmento funcional” (ou simplesmente “fragmento”) de um anticorpo ou cadeia de imunoglobulina (cadeia pesada ou leve), como aqui usado, é uma proteína de ligação de antígeno que compreende uma porção (a despeito de como aquela porção é obtida ou sintetizada) de um anticorpo que é desprovido de pelo menos alguns dos aminoácidos presentes em uma cadeia de comprimento total, mas que é capaz de se ligar especificamente a um antígeno. Tais fragmentos são biologicamente ativos, pois eles se ligam especificamente ao antígeno alvo e podem competir com outras proteínas de ligação de antígeno, que incluem anticorpos intactos, para ligação específica a um epitopo dado. Em um aspecto, tal fragmento reterá pelo menos uma CDR presente na cadeia leve ou cadeia pesada de comprimento total, e em algumas modalidades compreenderá uma única cadeia pesada e/ou cadeia leve ou porção dessas. Esses fragmentos biologicamente ativos podem ser produzidos por técnicas de DNA recombinante, ou podem ser produzidos por clivagem enzimática ou química de proteínas de ligação de antígeno, que incluem anticorpo intactos. Fragmentos incluem, sem limitação, fragmentos imunologicamente funcionais como Fab, Fab', F(ab')2, Fv, anticorpos de domínio e anticorpos de cadeia única, e podem ser derivados de qualquer fonte de mamífero, que inclui, sem limitação, humano, camundongo, rato, camelídeo ou coelho. É contemplado adicionalmente que uma porção funcional das proteínas de ligação de antígeno aqui reveladas, por exemplo, uma ou mais CDRs, podem ser covalentemente ligadas a uma segunda proteína ou a uma pequena molécula para criar um agente terapêutico direcionado a um alvo particular no corpo, possuindo propriedades terapêuticas bifuncionais, ou que possuem uma meia-vida sérica prolongada.
[045] O termo “compete” quando usado no contexto de proteínas de ligação de antígeno (por exemplo, proteínas de ligação de antígeno de neutralização ou anticorpos de neutralização) significa competição entre proteínas de ligação de antígeno como determinado por um ensaio em que a proteína de ligação de antígeno (por exemplo, anticorpo ou fragmento imunologicamente funcional deste) sob teste previne ou inibe a ligação específica de uma proteína de ligação de antígeno de referência (por exemplo, um ligante, ou um anticorpo de referência) a um antígeno comum (por exemplo, uma proteína de IL-23 ou um fragmento desta). Numerosos tipos de ensaio de ligação competitiva podem ser usados, por exemplo: radioimunoensaio de fase sólida direto ou indireto (RIA), imunoensaio de enzima de fase sólida direto ou indireto (EIA), ensaio de competição sanduíche (veja, por exemplo, Stahli e cols., 1983, Methods in Enzymology 92:242-253); EIA de fase sólida de biotina- avidina direto (veja, por exemplo, Kirkland e cols., 1986, J. Immunol. 137:3.614-3.619) ensaio rotulado de fase sólida direto, ensaio sanduíche rotulado de fase sólida direto (veja, por exemplo, Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA rotulado de fase sólida direto com o uso de rótulo de I-125 (veja, por exemplo, Morel e cols., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15); EIA de biotina-avidina de fase sólida direto (veja, por exemplo, Cheung, e cols., 1990, Virology 176:546-552); e RIA rotulado direto (Moldenhauer e cols., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82). Tipicamente, tal ensaio envolve o uso de antígeno purificado ligado a uma superfície sólida ou células que portam qualquer um destes, uma proteína de ligação de antígeno de teste não rotulada e uma proteína de ligação de antígeno de referência rotulada.
[046] Inibição competitiva é medida por determinação da quantidade de marcador ligado à superfície sólida ou células na presença da proteína de ligação de antígeno de teste. Comumente a proteína de ligação de antígeno de teste é presente em excesso. As proteínas de ligação de antígeno identificadas por ensaio de competição (proteínas de ligação de antígeno de competição) incluem as proteínas de ligação de antígeno que se ligam ao mesmo epitopo como as proteínas de ligação de antígeno de referência e proteínas de ligação de antígeno que se ligam a um epitopo adjacente suficientemente próximo ao epitopo ligado pela proteína de ligação de antígeno de referência para que ocorra impedimento estérico. Comumente, quando uma proteína de ligação de antígeno de competição está presente em excesso, ela inibirá a ligação específica de uma proteína de ligação de antígeno de referência a um antígeno comum em pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% ou 75%. Em alguns casos,a ligação é inibida em pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98%, 99% ou mais.
[047] O termo “epitopo” ou “determinante antigênico” refere-se a um local em um antígeno ao qual uma proteína de ligação de antígeno se liga. Os epitopos podem ser formados de aminoácidos contíguos ou aminoácidos não contíguos justapostos por dobra terciária de uma proteína. Os epitopos formados a partir de aminoácidos contíguos são tipicamente retidos em exposição para desnaturar solventes, enquanto os epitopos formados por dobra terciária são tipicamente perdidos no tratamento com solventes de desnaturação. Os determinantes de epitopo podem incluir grupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, grupos fosforil ou sulfonil, e podem ter características estruturais tridimensionais específicas, e/ou características de carga específicas. Um epitopo tipicamente inclui pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35 aminoácidos em uma conformação espacial única. Os epitopos podem ser determinados com o uso de métodos conhecidos na técnica.
[048] Proteínas de ligação de antígeno de IL-23
[049] Uma “proteína de ligação de antígeno” como aqui usado significa uma proteína que se liga especificamente a um antígeno alvo específico; o antígeno como aqui fornecido é IL-23, particularmente IL-23 humana, incluindo IL-23 humana nativa. As proteínas de ligação de antígeno como aqui fornecido interagem com pelo menos uma porção da subunidade p19 única de IL-23, que se liga de modo detectável a IL-23; mas não se liga significativamente a IL-12 (por exemplo, a subunidades p40 e/ou p35 de IL-12), assim “poupando IL-12”. Como uma consequência, a proteínas de ligação de antígeno aqui fornecida são capazes de alterar a atividade de IL-23 sem os riscos potenciais que a inibição de IL-12 ou a subunidade p40 partilhada podem provocar. As proteínas de ligação de antígeno podem alterar a capacidade de IL-23 de interagir com seu receptor, por exemplo, por alteração da ligação ao receptor, como por interferência com associação do receptor. Em particular, tais proteínas de ligação de antígeno reduzem totalmente ou parcialmente, inibem, interferem ou modulam uma ou mais atividades biológicas de IL-23. Tal inibição ou neutralização rompe uma resposta biológica na presença da proteína de ligação de antígeno comparada à resposta na ausência da proteína de ligação de antígeno e pode ser determinada com o uso de ensaios conhecidos na técnica e aqui descritos. As proteínas de ligação de antígeno aqui fornecidas inibem a produção de citocina pró-inflamatória induzida por IL-23, por exemplo, produção de IL-22 induzida por IL-23 em células de sangue total e expressão de IFNy induzida por IL-23 em células NK e de sangue total. A redução da atividade biológica pode ser cerca de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98%, 99% ou mais.
[050] Uma proteína de ligação de antígeno pode compreender uma porção que se liga a um antígeno e, opcionalmente, um scaffold ou porção de framework que permite que a porção de ligação de antígeno adote uma conformação que promove a ligação da proteína de ligação de antígeno ao antígeno. Exemplos de proteínas de ligação de antígeno incluem anticorpos, fragmentos de anticorpo (por exemplo, uma porção de ligação de antígeno de um anticorpo), derivados de anticorpos, e análogos de anticorpo. A proteína de ligação de antígeno pode compreender um scaffold de proteína alternativa ou scaffold artificial com CDRs ou derivados de CDR enxertados. Tais scaffolds incluem, sem limitação, scaffolds derivados de anticorpo que compreendem mutações introduzidas, por exemplo, para estabilizar a estrutura tridimensional da proteína de ligação de antígeno, bem como scaffolds completamente sintéticos que compreendem, por exemplo, um polímero biocompatível. Veja, por exemplo, Korndorfer e cols., Proteins: Estrutura, Function, and Bioinformatics, (2003) Volume 53, Issue 1:121-129; Roque e cols., Biotechnol. Prog., 2004, 20:639-654. Em adição, miméticos de anticorpo de peptídeo (“PAMs”) podem ser usados, bem como scaffolds baseados em miméticos de anticorpo que utilizam componentes de fibronectina como um scaffold.
[051] Certas proteínas de ligação de antígeno aqui descritas são anticorpos ou são derivados de anticorpos. Tais proteínas de ligação de antígeno incluem, sem limitação, anticorpos monoclonais, anticorpos biespecíficos, minibodies, anticorpos de domínio, anticorpos sintéticos, miméticos de anticorpo, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos, fusões de anticorpo, conjugados de anticorpo, anticorpos de cadeia única, e fragmentos destes, respectivamente. Em alguns casos, a proteína de ligação de antígeno é um fragmento imunológico de um anticorpo (por exemplo, um Fab, um Fab', um F(ab')2, ou um scFv). As várias estruturas são também descritas e aqui definidas.
[052] Certas proteínas de ligação de antígeno que são fornecidas podem compreender uma ou mais CDRs como aqui descrito (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais CDRs). Em alguns casos, a proteína de ligação de antígeno compreende (a) uma estrutura de polipeptídeo e (b) uma ou mais CDRs que são inseridas e/ou unidas à estrutura do polipeptídeo. A estrutura do polipeptídeo pode tomar uma variedade de diferentes formas. Por exemplo, ela pode ser, ou compreender, a framework de um anticorpo de ocorrência natural, ou fragmento ou variante deste, ou pode ser completamente de natureza sintética. Exemplos de várias estruturas de polipeptídeo são também escritos abaixo.
[053] Diz-se que uma proteína de ligação de antígeno da invenção “se liga especificamente” a seu antígeno alvo quando a constante de equilíbrio de dissociação (KD) é < 10-8 M. A proteína de ligação de antígeno se liga especificamente ao antígeno com “alta afinidade” quando a KD é <5 x 10-9 M, e com “afinidade muito alta” quando a KD é <5 x 10-10 M. Em uma modalidade, a proteína de ligação de antígeno se ligará a IL-23 humana com uma KD de 5 x 10-12 M, e ainda em outra modalidade ela se ligará com uma KD <5 x 10-13 M. Em outra modalidade da invenção, a proteína de ligação de antígeno tem uma KD <5 x 10-12 M e uma Koff de cerca de <5x10-6 1/s. Em outra modalidade, a Koff é <5x10- 71/s.
[054] Outro aspecto fornece uma proteína de ligação de antígeno que possui uma meia vida de pelo menos um dia in vitro ou in vivo (por exemplo, quando administrada a um ser humano). Em uma modalidade, a proteína de ligação de antígeno tem uma meia-vida de pelo menos três dias. Em outra modalidade, o anticorpo ou porção deste tem uma meia- vida de quatro dias ou maior. Em outra modalidade, o anticorpo ou porção deste tem uma meia-vida de oito dias ou maior. Em outra modalidade, o anticorpo ou a porção de ligação do antígeno deste é derivatizado ou modificado de modo que ele possua uma meia-vida maior quando comparado ao anticorpo não derivatizado ou não modificado. Em outra modalidade, a proteína de ligação de antígeno contém mutações em ponto para aumentar a meia-vida sérica, como descrito em Publicação WIPO No. WO 00/09560.
[055] Em modalidades em que a proteína de ligação de antígeno é usada para aplicações terapêuticas, uma proteína de ligação de antígeno pode reduzir, inibir, interferir ou modular uma ou mais atividades biológicas de IL-23, como indução da produção de citocinas pró-inflamatórias. IL-23 tem vários efeitos biológicos distintos, que podem ser medidos em vários ensaios diferentes em diferentes tipos de células; exemplos de tais ensaios são conhecidos e são aqui fornecidos.
[056] Algumas das proteínas de ligação de antígeno que são fornecidas possuem a estrutura tipicamente associada com anticorpos de ocorrência natural. As unidades estruturais desses anticorpos compreendem tipicamente um ou mais tetrâmeros, cada um composto de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, embora algumas espécies de mamíferos também produzam anticorpos que possuem apenas uma única cadeia pesada. Em um anticorpo típico, cada par ou dupla inclui uma cadeia “leve” de comprimento total (em certas modalidades, cerca de 25 kDa) e uma cadeia “pesada” de comprimento total (em certas modalidades, cerca de 50-70 kDa). Cada cadeia de imunoglobulina individual é composta de vários “domínios de imunoglobulina”, cada um consistindo em cerca de 90 a 110 aminoácidos, e expressam um padrão de dobra característico. Esses domínios são as unidades básicas das quais os polipeptídeos do anticorpo são compostos. A porção amino-terminal de cada cadeia inclui tipicamente uma região variável que é responsável por reconhecimento de antígeno. A porção carboxi-terminal é mais conservada evolucionalmente que a outra extremidade da cadeia, e é referida como a “região constante” ou “região C”. As cadeias leves humanas são geralmente classificadas como cadeias leves kapa e lambda, e cada uma destas contém uma região variável e um domínio constante (CL1).z . As cadeias pesadas são tipicamente classificadas como cadeias mu, delta, gama, alfa ou epsilon, e estas definem o isotipo do anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. IgG tem vários subtipos, incluindo, sem limitação, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Os subtipos de IgM incluem IgM e IgM2. Os subtipos de IgA incluem IgA1 e IgA2. Em humanos, os isotipos de IgA e IgD contêm quatro cadeias pesadas e quatro cadeias leves; os isotipos de IgG e IgE contêm duas cadeias pesadas e duas cadeias leves; e o isotipo de IgM contém cinco cadeias pesadas e cinco cadeias leves. A região constante de cadeia pesada (CH) tipicamente compreende um ou mais domínios que podem ser responsáveis por função efetora. O número de domínios de região constante de cadeia pesada dependerá do isotipo. As cadeias pesadas de IgG, por exemplo, contêm, cada uma, três domínios de região CH conhecidos como CH1, CH2 e CH3. Os anticorpos que são fornecidos podem ter qualquer um desses isotipos e subtipos, por exemplo, a proteína de ligação de antígeno de IL-23 é do subtipo IgG1, IgG2 ou IgG4. Se for desejada uma IgG4, também pode ser desejável introduzir uma mutação em ponto (CPSCP->CPPCP) na região de dobradiça como descrito em Bloom e cols., 1997, Protein Science 6:407) para aliviar uma tendência de formar ligações de dissulfeto intra-cadeia H que podem levar a heterogeneidade nos anticorpos IgG4. Os anticorpos aqui fornecidos que são de um tipo podem ser alterados para um diferente tipo com o uso de métodos de troca de subclasse. Veja, por exemplo, Lantto e cols., 2002, Methods Mol. Biol. 178:303-316.
[057] Em cadeias leves e pesadas de comprimento total, as regiões variáveis e constantes são unidas por uma região “J” de cerca de doze ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada também incluindo uma região “D” de cerca de dez ou mais aminoácidos. Veja, por exemplo, Fundamental Immunology, 2a ed., C. 7 (Paul, W., ed.) 1989, New York: Raven Press. As regiões variáveis de cada par de cadeia leve/pesada tipicamente formam o sítio de ligação do antígeno.
Regiões variáveis
[058] Várias regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve (ou domínios) aqui fornecidas são mostrados nas Tabelas 1 e 2. Cada uma dessas regiões variáveis pode ser anexada, por exemplo, a regiões constantes de cadeia pesada e leve acima descritas. Além disso, cada uma das sequências de cadeia pesada e leve assim geradas pode ser combinada para formar uma estrutura de proteína de ligação de antígeno completa.
[059] São fornecidas proteínas de ligação de antígeno que contêm pelo menos uma região variável de cadeia pesada (VH) selecionada do grupo que consiste em VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, VH13, VH14,VH15 e VH16, e/ou pelo menos uma região variável de cadeia leve (VL) selecionada do grupo que consiste em VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15 e VL16, como mostrado nas Tabelas 1 e 2 abaixo.
[060] Cada uma das regiões variáveis de cadeia pesada listadas na Tabela 2 pode ser combinada com qualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve mostradas na Tabela 1 para formar uma proteína de ligação de antígeno. Em alguns casos, a proteína de ligação de antígeno inclui pelo menos uma região variável de cadeia pesada e/ou uma região variável de cadeia leve daquelas listadas nas Tabelas 1 e 2. Em alguns casos, a proteína de ligação de antígeno inclui pelo menos duas regiões variáveis de cadeia pesada diferentes e/ou regiões variáveis de cadeia leve daquelas listadas nas Tabelas 1 e 2. AS várias combinações de regiões variáveis de cadeia pesada podem ser combinadas com qualquer uma das várias combinações de regiões variáveis de cadeia leve.
[061] Em outros casos, a proteína de ligação de antígeno contém duas regiões variáveis de cadeia leve idênticas e/ou duas regiões variáveis de cadeia pesada idênticas. Como um exemplo, a proteína de ligação de antígeno pode ser um anticorpo ou fragment imunologicamente funcional que compreendes duas regiões variáveis de cadeia leve e duas regiões variáveis de cadeia pesada em combinações de pares de regiões variáveis de cadeia leve e pares de regiões variáveis de cadeia pesada como listado nas Tabelas 1 e 2. Exemplos de tais proteínas de ligação de antígeno que compreendem duas regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve idênticas incluem: Anticorpo A VH14/VL14; Anticorpo B VH9/VL9; Anticorpo C VH10/VL10; Anticorpo D VH15/VL15; Anticorpo E VH1/VL1, Anticorpo F VH11/VL11; Anticorpo G VH12/VL12; Anticorpo H VH13/VL13; Anticorpo I VH8/VL8; Anticorpo J VH3/VL3; Anticorpo K VH7/VL7; Anticorpo L VH4/VL4; Anticorpo M VH5/VL5 e Ant. N VH6/VL6.
[062] Algumas proteínas de ligação de antígeno que são fornecidas compreendem uma região variável de cadeia pesada e/ou uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que difere da sequência de uma região variável de cadeia pesada e/ou uma região variável de cadeia leve selecionada das Tabelas 1 e 2 em apenas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 resíduos de aminoácido, em que cada diferença de sequência é independentemente uma deleção, inserção ou substituição de um aminoácido. As regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve, em algumas proteínas de ligação de antígeno, compreendem sequências de aminoácidos que possuem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência às sequências de aminoácidos fornecidas na Tabela 1 e 2. Ainda outras proteínas de ligação de antígeno, por exemplo, anticorpos ou fragmentos imunologicamente funcionais, também incluem formas variantes de região de cadeia pesada e/ou de região de cadeia leve como aqui descrito.
[063] O termo “identidade” refere-se à relação entre as sequências de duas ou mais moléculas de polipeptídeo ou dois ou mais polinucleotídeos, como determinado por alinhamento e comparação das sequências. “Percentual de identidade” significa o percentual de resíduos idênticos entre aminoácidos ou nucleotídeos nas moléculas comparadas e é calculado com base no tamanho da maior das moléculas sendo comparadas.
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[064] Para esses cálculos, gaps em alinhamentos (se houver) devem ser controlados por um modelo matemático particular ou programa de computador (ou seja, um “algoritmo”). Métodos que podem ser usados para calcular a identidade dos ácidos nucleicos ou polipeptídeos alinhados incluem aqueles descritos em Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; and Carillo e cols., 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1.073.
[065] No cálculo do percentual de identidade, as sequências sendo comparadas são alinhadas em uma maneira que proporciona a maior combinação entre as sequências. O programa de computador usado para determinar o percentual de identidade é o pacote de programa GCG, que inclui GAP (Devereux e cols., 1984, Nucl Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI). O algoritmo de computador GAP é usado para alinhar os dois polipeptídeos ou polinucleotídeos para os quais o percentual de identidade de sequência deve ser determinado. As sequências são alinhadas para combinação ótima de seu respectivo aminoácido ou nucleotídeo (o “matched span”, como determinado pelo algoritmo). Uma penalidade de lacuna aberta (que é calculada como 3x a diagonal média, em que a “diagonal média” é a média da diagonal da matriz de comparação sendo usada; a “diagonal” é a pontuação ou número determinado para cada combinação perfeita de aminoácido pela matriz de comparação particular) e uma penalidade de extensão de lacuna (que é comumente 1/10 vezes a penalidade de lacuna aberta), bem como uma matriz de comparação como PAM 250 ou BLOSUM 62 é usada junto com o algoritmo. Em certas modalidades, uma matriz de comparação padrão (veja Dayhoff e cols., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 para a matriz de comparação PAM 250; Henikoff e cols., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919 para a matriz de comparação BLOSUM 62) é também usada pelo algoritmo.
[066] Os parâmetros recomendados para a determinação do percentual de identidade para sequências de polipeptídeos ou nucleotídeos com o uso do programa GAP são os seguintes: Algoritmo: Needleman e cols., 1970, J. Mol. Biol. 48:443 453; Matriz de comparação: BLOSUM 62 de Henikoff e cols., 1992, supra; Penalidade de lacuna: 12 (mas sem penalidade para lacunas de extremidade), Penalidade de comprimento de lacuna: 4, Limiar de similaridade: 0. Certos esquemas de alinhamento para alinhar duas sequências de aminoácidos podem resultar em combinação de apenas uma região curta das duas sequências e essa pequena região alinhada pode ter identidade de sequência muito alta, embora não haja relação significativa entre as duas sequências de comprimento total. Portanto, o método de alinhamento selecionado (programa GAP) pode ser ajustado se assim desejado para resultar em um alinhamento que transpõe pelo menos 50 aminoácidos contíguos do polipeptídeo alvo.
[067] As regiões variáveis de cadeia pesada e leve aqui reveladas incluem sequências de consenso derivadas de grupos de proteínas de ligação de antígeno relacionadas. As sequências de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada e leve foram analisadas para similaridades. Quatro grupos surgiram, um grupo que possui regiões variáveis de cadeia leve kapa, (VH9/ VL9, VH10/ VL10, VH11/ VL11, VH13/ VL13, VH14/ VL14 e VH15/ VL15) e três grupos que possuem regiões variáveis de cadeia leve lambda: grupo lambda 1 (VH5/ VAS, VH6/ VL6 e VH7/ VII), grupo lambda 2 (VH3/ VL3 e VH4/ VL4), e grupo lambda 3 (VH1/ VL1 e VH2/ VL2). As linhagens germinativas de cadeia leve representadas incluem VK1/A30 e VK1/L19 As linhagens germinativas lambda de cadeia leve representadas incluem VL1/1e, VL3/3p, VL5/5c e VL9/9a. As linhagens germinativas de cadeia pesada representadas incluem VH3/3-30, VH3/3-30.3, VH3/3-33, VH3/3-48, VH4/4-31 e VH4/4-59. Como aqui usado, uma “sequência de consenso” refere-se a sequências de aminoácidos que possuem aminoácidos conservados comuns entre inúmeras sequências e aminoácidos variáveis que variam com sequências de aminoácidos dadas. As sequências de consenso podem ser determinadas com o uso de análise filogenética padrão das regiões variáveis de cadeia pesada e leve que correspondem às proteínas de ligação de antígeno de IL-23 aqui reveladas.
[068] A sequência de consenso de região variável de cadeia leve para o grupo kapa é DX1QX2TQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGX3X4SX5WX6AWYQQKPGX7APX8LLIYAAS SLQSGVPSR FS GSX9SGTX10FTLTISSLQPX11DFATYX12CQQANSFPFTFGPGTKVDX13K (Id. de Seq. N°: 30), em que Xi é selecionado de I ou S; X2 é selecionado de M ou L; X3 é selecionado de G ou V e X4 é selecionado de S, F ou I; X5 é selecionado de S ou G; X6 é selecionado de F ou L; X7 é selecionado de K ou Q; X8 é selecionado de K, N ou S; X9 é selecionado de G ou V; X10 é selecionado de D ou E, X11 é selecionado de E ou A; X12 é selecionado de Y ou F; e X13 é selecionado de I, V ou F.
[069] A sequência de consenso de região variável de cadeia leve para grupo lambda 1 é
[070] QPX1 LTQPPSASASLGASVTLTCTLX2SGYS DYKVDWYQX3RPG KGPRFVMRVGTGGX4VGSKGX5G I PDRFSVLGSGLNRX6LTIKNIQEEDESDYHCGADHGSGX7NFVYVFGTGTKVTVL (Id. de Seq. N°: 61), em que Xi é selecionado de V ou E; X2 é selecionado de N ou S; X3 é selecionado de Q ou L e X4 é selecionado de I ou T; X5 é selecionado de D ou E; X6 é selecionado de Y ou S; e X7 é selecionado de S ou N.
[071] A sequência de consenso de região variável de cadeia leve para grupo lambda 3 é QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNXiGAGYDVHWYQQX2PGTAPKLLIYGSX3NR PSGVPDRF SG SKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTX4RLTVL (Id. de Seq. N°: 139), em que Xi é selecionado de T ou I; X2 é selecionado de V ou L; X3 é selecionado de G ou N; e X4 é selecionado de R ou K.
[072] A sequência de consenso da região variável de cadeia pesada para o grupo kapa é QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIXiSGGYYWX2WIRQHPGKGLEWIGX3iX4YS GX5X6YYNP SLK SRX7TX8SVDTSX9NQFSLXi0LSSVTAADTAVYYCAXiiXi2RGXi3YYGMDVWGQGTTV TVSS (Id. de Seq. N°: 140), em que Xi é selecionado de N ou S; X2 é selecionado de S ou T; X3 é selecionado de Y ou H e X4 é selecionado de Y ou H; X5 é selecionado de S ou N; X6 é selecionado de S ou T; X7 é selecionado de V ou I; X8 é selecionado de I ou M; X9 é selecionado de K ou Q; X10 é selecionado de K ou S, X11 é selecionado de R ou K; X12 é selecionado de D ou N; e X13 é selecionado de H, F ou Y.
[073] A sequência de consenso da região variável de cadeia pesada para grupo lambda 1 é EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCX1X2SGFTFSX3X4SMNWVRQAPGKGLEWVSYISSX5S STX6YX7AD SV KGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARRIAAAGX8X9X10YYYAX11DVWGQGT TVTVSS (Id. de Seq. N°: 141), em que Xi é selecionado de A ou V; X2 é selecionado de A ou V; X3 é selecionado de T ou S e X4 é selecionado de Y ou F; X5 é selecionado de S ou R; X6 é selecionado de R ou I; X7 é selecionado de H, Y ou I; X8 é selecionado de P ou G; X9 é selecionado de W ou F; X10 é selecionado de G ou H; e X11 é selecionado de M ou L.
[074] A sequência de consenso da região variável de cadeia pesada para grupo lambda 2 é QVQLVESGGGVVQPG RSLRLSCAASG FTFSSYX1M HWVRQAPG KGLEWX2X3VISX4DGSX5KYYAD SV KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARERTTLSGSYFDYWGQGTLVTVSS (Id. de Seq. N°: 142), em que Xi é selecionado de G ou A; X2 é selecionado de V ou L; X3 é selecionado de A ou S e X4 é selecionado de F ou H; e X5 é selecionado de L ou I.
[075] A sequência de consenso da região variável de cadeia pesada para grupo lambda 3 é QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNX1 YYADSV KG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGYX2SSWYPDAFDIWGQGTMVTVSS (Id. de Seq. N°: 143), em que Xi é selecionado de E ou K e X2 é selecionado de T ou S.
[076] Regiões de determinação de complementaridade
[077] As regiões de determinação de complementaridade ou “CDRs” são encaixadas em uma framework nas regiões variáveis de cadeia pesada e leve em que elas constituem as regiões responsáveis por ligação e reconhecimento do antígeno. Domínios variáveis de cadeias de imunoglobulina da mesma espécie, por exemplo, exibem geralmente uma estrutura geral similar; que compreende regiões de estrutura relativamente conservadas (FR) unidas por regiões de CDR hipervariáveis. Uma proteína de ligação de antígeno pode ter 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais CDRs. As regiões variáveis acima discutidas, por exemplo, compreendem tipicamente três CDRs. As CDRs de regiões variáveis de regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve são tipicamente alinhadas pelas regiões de estrutura para formar uma estrutura que se liga especificamente em um antígeno alvo (por exemplo, IL-23). Do terminal N ao terminal C, regiões variáveis de cadeia pesada e leve de ocorrência natural tipicamente se adequam à seguinte ordem desses elementos: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. As regiões CDR e FR de domínios variáveis de cadeia leve domínios variáveis de cadeia pesada de exemplo são apontadas nas Tabelas 1 e 2. É reconhecido que os limites das regiões de CDR e FR podem variar daqueles apontados. Foram desenvolvidos sistemas de numeração para designar números aos aminoácidos que ocupam posições em cada um desses domínios. As regiões de determinação de complementaridade e regiões de estrutura de uma proteína de ligação de antígeno dada podem ser identificadas com o uso desses sistemas. Os sistemas de numeração são definidos em Kabat e cols., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., “US Dept. of Health and Human Services”, PHS, NIH, Publicação NIH No. 91-3242, 1991, ou Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia e cols., 1989, Nature 342:878-883. Outros sistemas de numeração para os aminoácidos em cadeias de imunoglobulina incluem IMGT® (“the international ImMunoGeneTics information system”; Lefranc e cols., Dev. Comp. Immunol. 2005, 29:185-203); e AHo (Honegger and Pluckthun, J. Mol. Biol. 2001, 309(3):657-670). As CDRs aqui fornecidas podem ser usadas não apenas para definir o domínio de ligação do antígeno de uma estrutura de anticorpo tradicional, mas podem ser encaixadas em uma variedade de outras estruturas de polipeptídeo, como aqui descrito.
[078] As proteínas de ligação de antígeno aqui reveladas são polipeptídeos em que uma ou mais CDRs podem ser enxertadas, inseridas, encaixadas e/ou unidas. Uma proteína de ligação de antígeno pode ter, por exemplo, uma CDR1 de cadeia pesada (“CDRH1”), e/ou uma CDR2 de cadeia pesada (“CDRH2”), e/ou uma CDR3 de cadeia pesada (“CDRH3”), e/ou uma CDR1 de cadeia leve (“CDRL1”), e/ou uma CDR2 de cadeia leve (“CDRL2”), e/ou uma CDR3 de cadeia leve (“CDRL3”). Algumas proteínas de ligação de antígeno incluem tanto uma CDRH3 quanto uma CDRL3. Modalidades específicas geralmente utilizam combinações de CDRs que são não repetitivas, por exemplo, as proteínas de ligação de antígeno são geralmente não feitas com duas regiões de CDRH2 em uma região variável de cadeia pesada etc. As proteínas de ligação de antígeno podem compreender uma ou mais sequências de aminoácidos que são idênticas ou que diferem das sequências de aminoácidos de uma ou mais das CDRs apresentadas na Tabela 3 em apenas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 resíduos de aminoácido, em que cada uma de tais diferenças de sequência é independentemente uma deleção, inserção ou substituição de um aminoácido. As CDRs em algumas proteínas de ligação de antígeno compreendem sequências de aminoácidos que possuem pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência às sequências de CDRs listadas na Tabela 3. Em algumas proteínas de ligação de antígeno, as CDRs são encaixadas em uma região de “framework”, que orienta as CDR(s) de modo que as propriedades adequadas de ligação do antígeno das CDR(s) sejam atingidas. TABELA 3. Exemplos de Sequências de CDRH e CDRL
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[079] São aqui fornecidas regiões de CDR1 que compreendem resíduos de aminoácido 23-34 de Id. de Seq. Nos: 7 e 11; resíduos de aminoácido 24-34 de Id. de Seq. Nos: 9, 13, 15, 17, 19 21, 23, 25, 27 e 29; resíduos de aminoácido 23-36 de Id. de Seq. Nos: 1, 3 e 4; resíduos de aminoácido 31-35 de Id. de Seq. Nos:31, 33, 34, 38, 40, 44, 52 e 60; e resíduos de aminoácido 31-37 ou Id. de Seq. Nos: 46, 48, 50, 54, 56 e 58.
[080] São aqui fornecidas regiões de CDR2 que compreendem resíduos de aminoácido 50-56 de Id. de Seq. Nos: 9, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 e 29; resíduos de aminoácido 50-61 de Id. de Seq. Nos: 7 e 11; resíduos de aminoácido 52-62 de Id. de Seq. N°: 4; resíduos de aminoácido 50-65 de Id. de Seq. Nos: 31, 33, 44 e 52; resíduos de aminoácido 50-66 de Id. de Seq. Nos: 36, 38, 40, 42 e 60; resíduos de aminoácido 52-58 de Id. de Seq. Nos: 1 e 3; e resíduos de aminoácido 52-67 de Id. de Seq. Nos: 46, 48, 50, 54, 56 e 58.
[081] As regiões de CDR3 que compreendem resíduos de aminoácido 89-97 de Id. de Seq. Nos: 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 e 29; resíduos de aminoácido 91-101 de Id. de Seq. Nos: 1 e 3; resíduos de aminoácido 94-106 de Id. de Seq. Nos: 7, 9 e 11; resíduos de aminoácido 98-107 de Id. de Seq. Nos: 44 e 52; resíduos de aminoácido 97-105 de Id. de Seq. N°: 4; resíduos de aminoácido 99-110 de Id. de Seq. Nos: 34 e 36; resíduos de aminoácido 99-112 de Id. de Seq. N°: 112; resíduos de aminoácido 99-113 de Id. de Seq. Nos: 31 e 33; resíduos de aminoácido 99-114 de Id. de Seq. Nos: 38, 40 e 42; resíduos de aminoácido 100-109 de Id. de Seq. Nos: 46, 48, 54, 56 e 58; e resíduos de aminoácido 101-019 de Id. de Seq. N°: 50; são também fornecidas.
[082] As CDRs aqui reveladas incluem sequências de consenso derivadas de grupos de sequências relacionadas. Como descrito previamente, quatro grupos de sequências de região variável foram identificados, um grupo kapa e três grupos lambda. A sequência de consenso de CDRL1 do grupo kapa consiste em RASQX1X2SX3WX4A (Id. de Seq. N°: 123) em que X1 é selecionado de G ou V; X2 é selecionado de I, F ou S; X3 é selecionado de S ou G e X4 é selecionado de F ou L. A sequência de consenso de CDRL1 do grupo lambda 1 consiste em TLX1SGYSDYKVD (Id. de Seq. N°: 124) em que X1 é selecionado de N ou S. As sequências de consenso de CDRL1 do grupo lambda 3 consistem em TGSSSNX1GAGYDVH (Id. de Seq. N°: 125) em que X1 é selecionado de I ou T.
[083] A sequência de consenso de CDRL2 do grupo lambda 1 consiste em VGTGGX1VGSKGX2 (Id. de Seq. N°: 126) em que X1 é selecionado de I ou T e X2 é selecionado de D ou E. A sequência de consenso de CDRL2 do grupo lambda 3 consiste em GSX1NRPS (Id. de Seq. N°: 127) em que Xi é selecionado de N ou G.
[084] As sequências de consenso de CDRL3 incluem GADHGSGXiNFVYV (Id. de Seq. N°:128) em que Xi é S ou N.
[085] A sequência de consenso de CDRH1 do grupo kapa consiste em SGGYYWXi (Id. de Seq. N°: 129) em que Xi é selecionado de S ou T. A sequência de consenso de CDRH1 do grupo lambda 1 consiste em X1X2SMN (Id. de Seq. N°: 131) em que X1 é selecionado de S ou T e X2 é selecionado de Y ou F. A sequência de consenso de CDRH1 do grupo lambda 2 consiste em SYX1MH (Id. de Seq. N°: 130), em que X1 é selecionado de G ou A.
[086] A sequência de consenso de CDRH2 do grupo kapa consiste em X1IX2YSGX3X4YYNPSLKS (Id. de Seq. N°: 132) em que X1 é selecionado de Y ou H; X2 é selecionado de Y ou H; X3 é selecionado de S ou N e X4 é selecionado de T ou S. A sequência de consenso do grupo lambda 1 consiste em YISSX1SSTX2YX3ADSVKG (Id. de Seq. N°: 134) em que X1 é selecionado de R ou S, X2 é selecionado de I ou R, X3 é selecionado de I, H ou Y. A sequência de consenso do grupo lambda 2 consiste em VISX1DGSX2KYYADSVKG (Id. de Seq. N°: 133) em que X1 é F ou H e X2 é L ou T. A sequência de consenso de CDRH2 do grupo lambda 3 consiste em VIWYDGSNX1YYADSVKG (Id. de Seq. N°: 135) em que X1 é selecionado de K ou E.
[087] A sequência de consenso de CDRH3 do grupo kapa consiste em X1 RGX2YYGMDV (Id. de Seq. N°: 136) em que X1 é selecionado de N ou D e X2 é selecionado de H, Y ou F. A sequência de consenso de CDRH3 do grupo lambda 1 consiste em RIAAAGX1X2X3YYYAX4DV (Id. de Seq. N°: 137) em que X1 é selecionado de G ou P; X2 é selecionado de F ou W; X3 é selecionado de H ou G e X4 é selecionado de L e M. A sequência de consenso de CDRH3 do grupo lambda 3 consiste em DRGYX1SSWYPDAFDI (Id. de Seq. N°: 138) em que Xi é selecionado de S ou T.
Anticorpos monoclonais
[088] As proteínas de ligação de antígeno que são fornecidas incluem anticorpos monoclonais que se ligam a IL-23. Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos com o uso de qualquer técnica conhecida, por exemplo, por imortalização de células esplênicas coletadas do animal transgênico depois do fim do esquema de imunização. As células esplênicas podem ser imortalizadas com o uso de qualquer técnica conhecida, por exemplo, pela fusão delas com células de mieloma para produzir hibridomas. As células de mieloma para uso em procedimentos de fusão de produção de hibridoma são preferivelmente não produtoras de anticorpo, possuem alta eficiência de fusão, e deficiências de enzima que as tornam incapazes de crescer em certos meios seletivos que sustentam o crescimento apenas das células fundidas desejadas (hibridomas). Exemplos de linhagens de células adequadas para uso em fusões de camundongo incluem Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 e S194/5XXO Bul; exemplos de linhagens de células usadas em fusões de rato incluem R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F e 4B210. Outras linhagens de células úteis para fusões de células são U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 e UC729-6.
[089] Em alguns casos, uma linhagem de célula de hibridoma é produzida por imunização de um animal (por exemplo, um animal transgênico que possui sequências de imunoglobulina humana) com um imunógeno de IL-23; com coleta de células esplênicas a partir do animal imunizado; fusão das células esplênicas coletadas a uma linhagem de células de mieloma, assim gerando células de hibridoma; estabelecendo linhagens de células de hibridoma a partir de células de hibridoma, e identificação de uma célula de hibridoma que produz um anticorpo que se liga a um polipeptídeo de IL-23 enquanto poupa IL-12. Tais linhagens de células de hibridoma, e anticorpos monoclonais anti-IL- 23 produzidos por elas, são aspectos da presente aplicação.
[090] Anticorpos monoclonais secretados por uma linhagem de células de hibridoma podem ser purificados com o uso de qualquer técnica conhecida. Hibridomas ou mAbs podem ser também rastreados para identificar mAbs com propriedades particulares, como a capacidade de inibir a atividade induzida por IL-23.
Anticorpos quiméricos e humanizados
[091] Os anticorpos quiméricos e humanizados baseados nas sequências a seguir são também fornecidos. Os anticorpos monoclonais para uso como agentes terapêuticos podem ser modificados de várias formas antes do uso. Um exemplo é um anticorpo quimérico, que é um anticorpo composto de segmentos de proteína de diferentes anticorpos que são covalentemente unidos para produzir cadeias pesadas ou leves funcionais de imunoglobulina ou porções imunologicamente funcionais destes. Geralmente, uma porção da cadeia pesada e/ou cadeia leve é idêntica ou homóloga a uma sequência correspondente em anticorpos derivados de uma espécie em particular ou que pertencem a uma classe ou subclasse particular de anticorpo, enquanto o restante da cadeia é idêntico ou homólogo a uma sequência correspondente em anticorpos derivados de outra espécie ou que pertencem a outra classe ou subclasse de anticorpo. Para métodos em relação aos anticorpos quiméricos, veja, por exemplo, a Patente US No. 4.816.567; e Morrison e cols., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6.851-6.855. O enxerto de CDR é descrito, por exemplo, nas Patentes US Nos. 6.180.370, 5.693.762, 5.693.761, 5.585.089, e 5.530.101.
[092] Um tipo útil de anticorpo quimérico é um anticorpo “humanizado”. Geralmente, um anticorpo humanizado é produzido a partir de um anticorpo monoclonal que surge inicialmente em um animal não humano. Certos resíduos de aminoácido nesse anticorpo monoclonal, tipicamente de porções de não reconhecimento de antígeno do anticorpo, são modificados para serem homólogos a resíduos correspondentes em um anticorpo humano do isotipo correspondente. A humanização pode ser realizada, por exemplo, com o uso de vários métodos por substituição de pelo menos uma porção de uma região variável de roedor pelas regiões correspondentes de um anticorpo humano (veja, por exemplo, Patentes US Nos. 5.585.089, e No. 5.693.762; Jones e cols., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann e cols., 1988, Nature 332:323-27; Verhoeyen e cols., 1988, Science 239:1.534-1.536). Em certas modalidades, as regiões constantes de espécies diferentes de humanos podem ser usadas junto com a região variável humana para produzir anticorpos híbridos.
Anticorpos totalmente humanos
[093] Anticorpos totalmente humanos são também fornecidos. Métodos são disponíveis para a confecção de anticorpos totalmente humanos específicos para um dado antígeno sem expor os seres humanos ao antígeno (“anticorpos totalmente humanos”). Um meio específico fornecido para a implementação da produção de anticorpos totalmente humanos é a “humanização” do sistema imune humoral do camundongo. A introdução de lócus de imunoglobulina humana (Ig) em camundongos em que os genes de Ig endógena foram inativados é um meio de produção de anticorpos monoclonais totalmente humanos (mAbs) em camundongo, um animal que pode ser imunizado com qualquer antígeno desejável. O uso de anticorpos totalmente humanos pode minimizar as respostas imunogênicas e alérgicas que podem ser causadas algumas vezes por administração de mAbs de camundongo ou derivadas de camundongo a humanos como agentes terapêuticos.
[094] Os anticorpos totalmente humanos podem ser produzidos por imunização de animais transgênicos (comumente camundongos) que são capazes de produzir uma variedade de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Antígenos para esse objetivo têm tipicamente seis ou mais aminoácidos contíguos, e opcionalmente são conjugados a um carreador, como um hapteno. Veja, por exemplo, Jakobovits e cols., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2.551-2.555; Jakobovits e cols., 1993, Nature 362:255-258; e Bruggermann e cols., 1993, Year in Immunol. 7:33. Em um exemplo de tal método, os animais transgênicos são produzidos por incapacitação do lócus da imunoglobulina endógena de camundongo que codifica as cadeias de imunoglobulina leve e pesada de camundongo, e inserção no genoma do camundongo de grandes fragmentos de DNA de genoma humano contendo lócus que codificam proteínas de cadeia pesada e leve humana. Animais parcialmente modificados, que possuem menos que o complemento total de lócus de imunoglobulina humana, são então entrecruzados para obter um animal que possui todas as modificações desejadas do sistema imune. Quando administrado um imunógeno, esses animais transgênicos produzem anticorpos que são imuno-específicos para o imunógeno, mas possuem sequências de aminoácidos humanas em vez de murídeo, incluindo as regiões variáveis. Para detalhes adicionais de tais métodos, veja, por exemplo, Publicações de patente WIPO WO96/33735 e WO94/02602. Métodos adicionais em relação a camundongos transgênicos para a confecção de anticorpos humanos são descritos nas Patentes US Nos. 5.545.807; 6.713.610; 6.673.986; 6.162.963; 5.545.807; 6.300.129; 6.255.458; 5.877.397; 5.874.299 e 5.545.806; em Publicações de patente WIPO WO91/10741, WO90/04036, e em EP 546073B1 e EP 546073A1.
[095] Os camundongos transgênicos acima descritos contêm um minilócus de gene de imunoglobulina humana que codifica sequências de imunoglobulina de cadeia pesada ([mu] e [gamma]) e [kappa] e cadeia leve humana não rearranjada, junto com mutações de alvo que inativam os lócus de cadeia endógenos [mu] e [kappa] (Lonberg e cols., 1994, Nature 368:856-859). Portanto, os camundongos exibem expressão reduzida de IgM ou [kappa] de camundongo e em resposta a imunização, e os transgenes de cadeia pesada e leve humana introduzida sofrem troca de classe e mutação somática para gerar anticorpos monoclonais de IgG [kappa] humana de alta afinidade (Lonberg e cols., supra.; Lonberg and Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93; Harding and Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536-546). A preparação de tais camundongos é descrita em detalhes em Taylor e cols., 1992, Nucleic Acids Research 20:6.287-6.295; Chen e cols., 1993, International Immunology 5:647-656; Tuaillon e cols., 1994, J. Immunol. 152:2.912-2.920; Lonberg e cols., 1994, Nature 368:856-859; Lonberg, 1994, Handbook of Exp. Pharmacology 113:49-101; Taylor e cols., 1994, International Immunology 6:579-591; Lonberg and Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding and Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536-546; Fishwild e cols., 1996, Nature Biotechnology 14:845-85. Veja, as Patentes nos Estados Unidos adicionais No. 5.545.806; No. 5.569.825; No. 5.625.126; No. 5.633.425; No. 5.789.650; No. 5.877.397; No. 5.661.016; No. 5.814.318; No. 5.874.299; e No. 5.770.429; bem como a Patente nos Estados Unidos No. 5.545.807; Publicações WIPO Nos. WO 93/1227; WO 92/22646; e WO 92/03918. As tecnologias utilizadas para a produção de anticorpos humanos nesses camundongos transgênicos são também reveladas em Publicação WIPO No. WO 98/24893, e Mendez e cols., 1997, Nature Genetics 15:146-156. Por exemplo, as cepas de camundongos transgênicos HCo7 e HCo12 podem ser usadas para gerar anticorpos anti-IL-23.
[096] Com o uso de tecnologia de hibridoma, mAbs humanas específicas para antígeno com a especificidade desejada podem ser produzidas e selecionadas dos camundongos transgênicos como aqueles acima descritos. Tais anticorpos podem ser clonados e expressos com o uso de um vetor e célula hospedeira adequado, ou os anticorpos podem ser coletados a partir de células de hibridoma cultivadas.
[097] Os anticorpos totalmente humanos também podem ser derivados de bibliotecas de apresentação de fago (como revelado em Hoogenboom e cols., 1991, J. Mol. Biol. 227:381; Marks e cols., 1991, J. Mol. Biol. 222:581; Publicação WIPO No. WO 99/10494). As técnicas de apresentação de fago imitam a seleção imune através da apresentação de repertórios de anticorpo na superfície de bacteriófago filamentoso, e subsequente seleção de fago por sua ligação a um antígeno de escolha.
Proteínas de ligação de antígeno bi-específicas ou bifuncionais
[098] Uma proteína de ligação de antígeno bi- específica, duplamente específica ou bifuncional ou anticorpo é uma proteína de ligação de antígeno ou anticorpo híbrido, respectivamente, que possui dois diferentes sítios de ligação de antígeno, como uma ou mais CDRs ou uma ou mais regiões variáveis como acima descrito. Em alguns casos, eles são um anticorpo híbrido artificial que possui dois diferentes pares de cadeia pesada/leve e dois diferentes sítios de ligação. A proteína de ligação de antígeno multi-específica ou “anticorpo multi-específico” é uma que visa mais de um antígeno ou epitopo. As proteínas de ligação de antígeno bi-específica e anticorpos são uma espécie de anticorpo de proteína de ligação de antígeno multi-específico e pode ser produzida por vários métodos que incluem, sem limitação, fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab'. Veja, por exemplo, Songsivilai and Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny e cols., 1992, J. Immunol. 148:1.547-1.553.
Fragmentos imunológicos
[099] As proteínas de ligação de antígeno também incluem fragmentos imunológicos de um anticorpo (por exemplo, um Fab, um Fab', um F(ab')2 ou um scFv). Um “fragmento Fab” compreende uma cadeia leve (a região variável de cadeia leve (VL) e seu domínio constante correspondente (CO) e uma cadeia pesada (a região variável de cadeia pesada (VH) e primeiro domínio constante (CH1)). A cadeia pesada de uma molécula de Fab não pode formar uma ligação de dissulfeto com outra molécula de cadeia pesada. Um “fragmento Fab'” contém uma cadeia leve e uma porção de uma cadeia pesada que também contém a região entre os domínios CH1 e CH2, de modo que uma ligação de dissulfeto entre cadeias pode ser formada entre as duas cadeias pesadas dos dois fragmentos Fab' para formar uma molécula de F(ab')2. Um “fragmento F(ab')2” assim é composto de dois fragmentos Fab' que são mantidos juntos por uma ligação de dissulfeto entre as duas cadeias pesadas. Um “fragmento Fv” consiste na região variável de cadeia leve e região variável de cadeia pesada de um único braço de um anticorpo. Os anticorpos de cadeia única “scFv” são moléculas em que as regiões variáveis de cadeia pesada e leve foram conectadas por um ligante flexível para formar uma cadeia única de polipeptídeo, que forma uma região de ligação de antígeno. Anticorpos de cadeia única são discutidos em detalhes na Publicação WIPO No. WO 88/01649, Patentes U.S. Nos. 4.946.778 e No. 5.260.203; Bird, 1988, Science 242:423; Huston e cols., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5.879; Ward e cols., 1989, Nature 334:544, de Graaf e cols., 2002, Methods Mol Biol. 178:379-387; Kortt e cols., 1997, Prot. Eng. 10:423; Kortt e cols., 2001, Biomol. Eng. 18:95-108 and Kriangkum e cols., 2001, Biomol. Eng. 18:31-40. Uma região “Fc” contém dois fragmentos de cadeia pesada que compreendem os domínios CH1 e CH2 de um anticorpo. Os dois fragmentos de cadeia pesada são mantidos juntos por duas ou mais ligações de dissulfeto e por interações hidrofóbicas dos domínios CH3.
[0100] Também são incluídos anticorpos de domínio, fragmentos de imunoglobulina imunologicamente funcionais que contêm apenas a região variável de uma cadeia pesada ou a região variável de uma cadeia leve. Em alguns casos, duas ou mais regiões VH são covalentemente unidas com um ligante de peptídeo para criar um anticorpo de domínio bivalente. As duas regiões VH de um anticorpo de domínio bivalente podem visar o mesmo ou diferentes antígenos. Diabodies são anticorpos bivalentes que compreendem duas cadeias de polipeptídeo, em que cada cadeia de polipeptídeo compreende domínios VH e VL unidos por um ligante que é muito curto para permitir pareamento entre dois domínios na mesma cadeia, assim permitindo que cada domínio pareie com um domínio complementar em outra cadeia de polipeptídeo (veja, por exemplo, Holliger e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6.444-48, 1993 and Poljak e cols., Structure 2:1121-23, 1994). De modo similar, tribodies e tetrabodies são anticorpos que compreendem três e quatro cadeias de polipeptídeo, respectivamente, e que formam três e quatro sítios de ligação de antígeno, respectivamente, que podem ser o mesmo ou diferentes. Maxibodies compreendem scFvs bivalentes covalentemente anexados à região Fc de IgG1, (veja, por exemplo, Fredericks e cols., 2004, Protein Engineering, Design & Selection, 17:95-106; Powers e cols., 2001, Journal of Immunological Methods, 251:123-135; Shu e cols., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7.995-7.999; Hayden e cols., 1994, Therapeutic Immunology 1:3-15).
Várias outras Formas
[0101] Também são fornecidas formas variantes das proteínas de ligação de antígeno acima reveladas; algumas das proteínas de ligação de antígeno possuem, por exemplo, uma ou mais substituições conservadoras de aminoácido em uma ou mais das cadeias pesadas ou leves, regiões variáveis ou CDRs listadas nas Tabelas 1 e 2.
[0102] Os aminoácidos de ocorrência natural podem ser divididos em classes com base em propriedades comuns de cadeia lateral: hidrofóbicos (norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile); hidrofílicos neutros (Cys, Ser, Thr, Asn, Gln); ácidos (Asp, Glu); básicos (His, Lys, Arg); resíduos que influenciam a orientação da cadeia (Gly, Pro); e aromáticos (Trp, Tyr, Phe).
[0103] As substituições conservadoras de aminoácido podem envolver troca de um membro de uma dessas classes por outro membro da mesma classe. Substituições conservadoras de aminoácido podem englobar resíduos de aminoácido de ocorrência não natural, que são tipicamente incorporados por síntese química de peptídeo em vez de por síntese em sistemas biológicos. Estes incluem peptidomiméticos e outras formas reversas ou invertidas de porções de aminoácido. Tais modificações substanciais nas características funcionais e/ou bioquímicas das proteínas de ligação de antígeno aqui descritas podem ser atingidas por criação de substituições na sequência de aminoácidos das cadeias pesadas e leves que diferem significativamente em seu efeito sobre a manutenção (a) da estrutura do esqueleto molecular na área da substituição, por exemplo, como uma conformação em folha ou helicoidal, (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo, ou (c) do volume da cadeia lateral.
[0104] Substituições não conservadoras podem envolver a troca de um membro de uma das classes acima por um membro de outra classe. Tais resíduos substituídos podem ser introduzidos em regiões do anticorpo que são homólogas com anticorpos humanos, ou em regiões não homólogas da molécula.
[0105] Na realização de tais alterações, de acordo com certas modalidades, o índice hidropático de aminoácidos pode ser considerado. O perfil hidropático de uma proteína é calculado ao designar um valor numérico a cada aminoácido (“índice de hidropatia”) e então fazendo a média repetidamente desses valores ao longo da cadeia do peptídeo. Cada aminoácido foi designado com um índice hidropático com base em sua hidrofobicidade e características de carga. Eles são: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); e arginina (-4,5).
[0106] A importância do perfil hidropático em conferir função biológica interativa sobre uma proteína é compreendida na técnica (veja, por exemplo, Kyte e cols., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-131). É conhecido que certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos que possuem um índice hidropático similar e ainda retêm uma atividade biológica similar. Na realização de alterações baseadas em um índice hidropático, em certas modalidades, a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos estão em ±2 é incluída. Em alguns aspectos, aqueles que estão em ±1 são incluídos e, em outros aspectos, aqueles em ±0,5 são incluídos.
[0107] É também compreendido na técnica que a substituição de aminoácidos semelhantes pode ser feita de modo eficaz com base na hidrofilia, particularmente quando a proteína ou peptídeo biologicamente funcional assim criado é destinado para uso em modalidades imunológicas, como no presente caso. Em certas modalidades, a maior hidrofilia média local de uma proteína, como dirigido pela hidrofilia de seus aminoácidos adjacentes, está correlacionada com sua imunogenicidade e ligação ou imunogenicidade do antígeno, ou seja, com uma propriedade biológica da proteína.
[0108] Os seguintes valores de hidrofilia foram designados a esses resíduos de aminoácido: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0±1); glutamato (+3,0±1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5±1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5) e triptofano (-3,4). Na realização de alterações baseadas em valores similares de hidrofilia, em certas modalidades, a substituição de aminoácidos cujos valores de hidrofilia estão em ±2 é incluída; em outras modalidades, aqueles que estão em ±1 são incluídos, e, ainda em outras modalidades, aqueles que estão em ±0,5 são incluídos. Em alguns casos, uma pessoa também pode identificar epitopos a partir de sequências de aminoácidos primárias com base em hidrofilia. Essas regiões são também referidas como “regiões de núcleo epitópico”.
[0109] Exemplos de substituições conservadoras de aminoácido são apresentados na Tabela 4. TABELA 4. Substituições conservadoras de aminoácido
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Resíduo = Resíduo Original / Sub = Exemplo de substituição
[0110] Um profissional habilitado será capaz de determinar variantes adequadas de polipeptídeos como aqui apresentado com o uso de técnicas bem conhecidas. Uma pessoa habilitada na técnica pode identificar áreas adequadas da molécula que podem ser alteradas sem destruir a atividade por regiões de direcionamento que não são importantes para a atividade. O profissional habilitado também será capaz de identificar resíduos e porções das moléculas que são conservadas entre polipeptídeos similares. Em modalidades adicionais, até mesmo áreas que podem ser importantes para atividade biológica ou para estrutura podem ser sujeitas a substituições conservadoras de aminoácido sem destruir a atividade biológica ou sem afetar de modo adverso a estrutura do polipeptídeo.
[0111] Adicionalmente, uma pessoa habilitada na técnica pode rever estudo de estrutura-função que identifica resíduos em polipeptídeos similares que são importantes para a atividade ou estrutura. Em vista de tal comparação, uma pessoa pode prever a importância de resíduos de aminoácido em uma proteína que correspondem a resíduos de aminoácido importantes para a atividade ou estrutura em proteínas similares. Uma pessoa habilitada na técnica pode optar por substituições de aminoácido quimicamente similares para tais resíduos de aminoácido importantes.
[0112] Uma pessoa habilitada na técnica também pode analisar a estrutura tridimensional e sequência de aminoácidos em relação àquela estrutura em polipeptídeos similares. Em vista de tal informação, uma pessoa habilitada na técnica pode prever o alinhamento de resíduos de aminoácido de um anticorpo com relação a sua estrutura tridimensional. Uma pessoa habilitada na técnica pode escolher não fazer alterações radicais aos resíduos de aminoácido previstos para estarem na superfície da proteína, uma vez que tais resíduos podem estar envolvidos em importantes interações com outras moléculas. Além disso, uma pessoa habilitada na técnica pode gerar variantes de teste que contêm uma substituição única de aminoácido em cada resíduo de aminoácido desejado. Essas variantes podem ser então rastreadas com o uso de ensaios para atividade de IL-23, (veja os exemplos abaixo), assim produzindo informação com relação a quais aminoácidos podem ser alterados e quais não devem ser. Em outras palavras, baseado em informação coletada de tais experimentos rotineiros, uma pessoa habilitada na técnica pode determinar facilmente as posições de aminoácido em que substituições adicionais devem ser evitadas isoladamente ou em combinação com outras mutações.
[0113] Inúmeras publicações científicas foram dedicadas à previsão de estrutura secundária. Veja Moult, 1996, Curr. Op. in Biotech. 7:422-427; Chou e cols., 1974, Biochem. 13:222-245; Chou e cols., 1974, Biochemistry 113:211-222; Chou e cols., 1978, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47:45-148; Chou e cols., 1979, Ann. Rev. Biochem. 47:251-276; e Chou e cols., 1979, Biophys. J. 26:367-384. Além disso, programas de computador são atualmente disponíveis para ajudar com a previsão de estruturas secundárias. Um método de previsão de estrutura secundária distinta é baseado em modelagem de homologia. Por exemplo, dois polipeptídeos ou proteínas que possuem uma identidade de sequência maior que 30%, ou similaridade maior que 40%, frequentemente possuem topologias estruturais similares. O recente crescimento da base de dados estrutural de proteína (PDB) tem fornecido previsibilidade aumentada de estrutura secundária, incluindo o número potencial de dobras em uma estrutura do polipeptídeo ou proteína. Veja Holm e cols., 1999, Nucl. Acid. Res. 27:244-247. Foi sugerido (Brenner e cols., 1997, Curr. Op. Struct. Biol. 7:369-376) que há um número limitado de dobras em um polipeptídeo ou proteína dada e que, uma vez que um número crítico de estruturas foi resolvido, a previsão estrutural será dramaticamente mais precisa.
[0114] Métodos adicionais de previsão de estrutura secundária incluem “threading” (Jones, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-387; Sippl e cols., 1996, Structure 4:15-19), “análise de perfil” (Bowie e cols., 1991, Science 253:164-170; Gribskov e cols., 1990, Meth. Enzym. 183:146159; Gribskov e cols., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. 84:4.355-4.358) e “ligação evolucionária” (See, Holm, 1999, supra; e Brenner, 1997, supra).
[0115] Em algumas modalidades, são feitas substituições de aminoácido que: (1) reduzem a suscetibilidade à proteólise, (2) reduzem a suscetibilidade à oxidação, (3) alteram a afinidade de ligação para formar complexos de proteína, (4) alteram a afinidade de ligação do ligante ou antígeno, e/ou (4) conferem ou modificam outras propriedades fisicoquímicas ou funcionais em tais polipeptídeos, como a manutenção da estrutura do esqueleto molecular na área da substituição, por exemplo, como uma conformação em folha ou helicoidal; mantendo ou alterando a carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo, ou mantendo ou alterando o volume de uma cadeia lateral.
[0116] Por exemplo, substituições de aminoácido únicas ou múltiplas (em certas modalidades, substituições conservadoras de aminoácido) podem ser feitas na sequência de ocorrência natural. As substituições podem ser feitas naquela porção do anticorpo que repousa fora do domínio(s) formando contatos intermoleculares. Em tais modalidades, podem ser usadas substituições conservadoras de aminoácido que não alteram substancialmente as características estruturais da sequência parente (por exemplo, um ou mais aminoácidos de substituição que não rompem a estrutura secundária que caracteriza a proteína de ligação de antígeno nativa ou parente). Exemplos de estruturas secundárias e terciárias de polipeptídeo reconhecidas na técnica são descritas em Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed.), 1984, W. H. New York: Freeman and Company; Introduction to Protein Structure (Branden and Tooze, eds.), 1991, New York: Garland Publishing; and Thornton e cols., 1991, Nature 354:105.
[0117] Variantes adicionais incluem variantes de cisteína em que um ou mais resíduos de cisteína na sequência de aminoácidos parente ou nativa são deletados ou substituídos por outro aminoácido (por exemplo, serina). As variantes de cisteína são úteis, entre outros, quando anticorpos (por exemplo) devem ser redobrados em uma conformação biologicamente ativa. As variantes de cisteína podem ter menos resíduos de cisteína que a proteína nativa, e tipicamente possuem um número igual para minimizar interações que resultam de cisteínas não pareadas.
[0118] A região variável de cadeia pesada e leve e CDRs que são reveladas podem ser usadas para preparar proteínas de ligação de antígeno que contêm uma região de ligação de antígeno que pode se ligar especificamente a um polipeptídeo de IL-23. “Região de ligação de antígeno” significa uma proteína, ou uma porção de uma proteína, que se liga especificamente a um antígeno especificado, como a região que contém os resíduos de aminoácido que interagem com um antígeno e conferem sobre a proteína de ligação de antígeno sua especificidade e afinidade pelo antígeno alvo. Uma região de ligação de antígeno pode incluir uma ou mais CDRs e certas regiões de ligação de antígeno também incluem uma ou mais regiões de “framework”. Por exemplo, uma ou mais das CDRs listadas na Tabela 3 podem ser incorporadas em uma molécula (por exemplo, um polipeptídeo) covalentemente ou não covalentemente para realizar uma imunoadesão. Uma imunoadesão pode incorporar a CDR(s) como parte de uma cadeia maior de polipeptídeo, pode ligar covalentemente a CDR(s) a outra cadeia de polipeptídeo, ou pode incorporar a CDR(s) não covalentemente. A CDR(s) permite que a imunoadesão se ligue especificamente a um antígeno de interesse particular (por exemplo, um polipeptídeo de IL-23).
[0119] Outras proteínas de ligação de antigen incluem miméticos (por exemplo, “miméticos de peptídeo” ou “peptidomiméticos”) baseados nas regiões variáveis e CDRs que são aqui descritos. Esses análogos podem ser peptídeos, não peptídeos ou combinações de regiões de peptídeo e não peptídeo. Fauchere, 1986, Adv. Drug Res. 15:29; Veber and Freidinger, 1985, TINS p. 392; and Evans e cols., 1987, J. Med. Chem. 30:1229. Os miméticos de peptídeo que são estruturalmente similares a peptídeos terapeuticamente úteis podem ser usados para produzir um efeito terapêutico ou profilático similar. Tais compostos são frequentemente desenvolvidos com a ajuda de modelagem molecular computadorizada. Geralmente, peptidomiméticos são proteínas que são estruturalmente similares a uma proteína de ligação de antígeno que apresenta uma atividade biológica desejada, como a capacidade de se ligar a IL-23, porém peptidomiméticos possuem uma ou mais ligações de peptídeo opcionalmente substituídas por uma ligação selecionada de, por exemplo: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH-CH-(cis e trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- e -CH2SO-, por métodos bem conhecidos na técnica. Substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de uma sequência de consenso com um D- aminoácido do mesmo tipo (por exemplo, D-lisina no lugar de L-lisina) pode ser usada em certas modalidades para gerar proteínas mais estáveis. Em adição, peptídeos limitados que compreendem uma sequência de consenso ou uma variação de sequência de consenso substancialmente idêntica podem ser gerados por métodos conhecidos na técnica (Rizo and Gierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem. 61:387), por exemplo, por adição de resíduos de cisteína internos capazes de formar pontes de dissulfeto intramoleculares que ciclizam o peptídeo.
[0120] Derivados das proteínas de ligação de antígeno que são aqui descritas são também fornecidos. As proteínas de ligação de antígeno derivatizada podem compreender qualquer molécula ou substância que transmita uma propriedade desejada à proteína de ligação de antígeno ou fragmento, como meia-vida aumentada em um uso particular. A proteína de ligação de antígeno derivatizada pode compreender, por exemplo, uma porção detectável (ou rótulo) (por exemplo, uma molécula radioativa, colorimétrica, antigênica ou enzimática, um glóbulo detectável (como um glóbulo magnético ou eletrodenso (por exemplo, ouro)), ou uma molécula que se liga a outra molécula (por exemplo, biotina ou estreptavidina)), uma porção terapêutica ou diagnóstica (por exemplo, uma porção radioativa, citotóxica, ou farmaceuticamente ativa), ou uma molécula que aumenta a compatibilidade da proteína de ligação de antígeno para um uso em particular (por exemplo, administração a um indivíduo, como um ser humano, ou outros usos in vivo ou in vitro). Exemplos de moléculas que podem ser usadas para derivatizar uma proteína de ligação de antígeno incluem albumina (por exemplo, albumina sérica humana) e polietileno glicol (PEG). Derivados ligados a albumina e PEGuilados de proteínas de ligação de antígeno podem ser preparados com o uso de técnicas bem conhecidas na prática. Em uma modalidade, uma proteína de ligação de antígeno é conjugada ou ligada a transtiretina (TTR) ou uma variante de TTR. A TTR ou variante de TTR pode ser quimicamente modificada, por exemplo, com um agente químico selecionado do grupo que consiste em dextrana, poli(n-vinil pirrolidona), polietileno glicóis, homopolímeros de propropileno glicol, óxido de polipropileno/ copolímeros de óxido de etileno, polióis polioxietilados e álcoois polivinílico.
[0121] Outros derivados incluem conjugados covalentes ou de agregação de proteínas de ligação de antígeno de IL-23 com outras proteínas ou polipeptídeos, como por expressão de proteínas de fusão recombinantes que compreendem polipeptídeos heterólogos fundidos ao terminal N ou C de uma proteína de ligação de antígeno de IL-23. Por exemplo, o peptídeo conjugado pode ser um polipeptídeo de sinal heterólogo (ou líder), por exemplo, o líder de fator alfa de levedura, ou um peptídeo como um tag de epitopo. As proteínas de fusão que contêm proteína de ligação de antígeno de IL-23 podem compreender peptídeos adicionados para facilitar a purificação ou identificação da proteína de ligação de antígeno de IL-23 (por exemplo, poli-His). Uma proteína de ligação de antígeno de IL-23 também pode ser ligada ao peptídeo FLAG como descrito em Hopp e cols., 1988, Bio/Technology 6:1204; e Patente US No. 5.011.912. O peptídeo FLAG é altamente antigênico e fornece um epitopo reversivelmente ligado por um anticorpo monoclonal específico (mAb), permitindo uma análise rápida e purificação fácil de proteína recombinante expressa. Os reagentes úteis para a preparação de proteínas de fusão em que o peptídeo FLAG é fundido a um polipeptídeo dado são comercialmente disponíveis (Sigma, St. Louis, MO).
[0122] Oligômeros que contêm uma ou mais proteínas de ligação de antígeno de IL-23 podem ser empregados como antagonistas de IL-23. Os oligômeros podem estar na forma de dímeros, trímeros ou oligômeros superiores covalentemente ligados ou não covalentemente ligados. Os oligômeros que compreendem duas ou mais proteínas de ligação de antígeno de IL-23 são contemplados para uso, com um exemplo sendo um homodímero. Outros oligômeros incluem heterodímeros, homotrímeros, heterotrímeros, homotetrâmeros, heterotetrâmeros etc. Oligômeros que compreendem múltiplas proteínas de ligação de IL-23 unidas por meio de interações covalentes ou não covalentes entre as porções de peptídeo fundidas às proteínas de ligação de antígeno de IL-23 são também incluídos. Tais peptídeos podem ser ligantes de peptídeo (espaçadores), ou peptídeos que possuem a propriedade de promover oligomerização. Entre os ligantes adequados de peptídeo estão aqueles descritos nas Patentes US Nos. 4.751.180 e 4.935.233. Zippers de leucina e certos polipeptídeos derivados de anticorpos estão entre os peptídeos que podem promover a oligomerização de proteínas de ligação de antígeno de IL-23 anexado a elas. Exemplos de domínios de zipper de leucina adequados para a produção de proteínas oligoméricas solúveis são descritos na Publicação WIPO No. WO 94/10308; Hoppe e cols., 1994, FEBS Letters 344:191; e Fanslow e cols., 1994, Semin. Immunol. 6:267-278. Em uma abordagem, as proteínas de fusão recombinantes que compreendem um fragmento ou derivado de proteína de ligação de antígeno de IL-23 fundido a um peptídeo de zipper de leucina são expressas em células hospedeiras adequadas, e os fragmentos ou derivados de proteína de ligação de antígeno de IL-23 oligoméricos solúveis que se formam são recuperados do sobrenadante da cultura.
[0123] Tais oligômeros podem compreender de duas a quatro proteínas de ligação de antígeno de IL-23. As porções da proteína de ligação de antígeno de IL-23 do oligômero podem estar em qualquer uma das formas acima descritas, por exemplo, variantes ou fragmentos. Preferivelmente, os oligômeros compreendem as proteínas de ligação de antígeno de IL-23 que possuem atividade de ligação de IL-23. Os oligômeros podem ser preparados com o uso de polipeptídeos derivados de imunoglobulinas. A preparação de proteínas de fusão que compreendem certos polipeptídeos heterólogos fundidos a várias porções de polipeptídeos derivados de anticorpo (incluindo o domínio Fc) foi descrita, por exemplo, por Ashkenazi e cols., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10.535; Byrn e cols., 1990, Nature 344:677; e Hollenbaugh e cols., 1992 “Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins”, em Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, páginas 10.19.1-10.19.11.
[0124] Também são incluídos dímeros que compreendem duas proteínas de fusão criadas por fusão de uma proteína de ligação de antígeno de IL-23 à região Fc de um anticorpo. O dímero pode ser feito, por exemplo, por inserção de uma fusão de gene que codifica a proteína de fusão em um vetor de expressão adequado, que expressa a fusão de gene em células hospedeiras transformadas com o vetor de expressão recombinante, e permite que a proteína de fusão expressa se reúna como as moléculas de anticorpo, e portanto ligações intercadeia de dissulfeto se formam entre as porções Fc para produzir o dímero. Tais polipeptídeos Fc incluem formas nativas e de muteína de polipeptídeos derivado da região Fc de um anticorpo. As formas truncadas de tais polipeptídeos que contêm a região de dobradiça que promove dimerização também são incluídas. As proteínas de fusão que compreendem porções Fc (e oligômeros formados a partir disso) oferecem a vantagem de fácil purificação por cromatografia de afinidade em colunas de Proteína A ou Proteína G. Um polipeptídeo Fc adequado, descrito na Publicação WIPO No. WO 93/10151 e Patente US Nos. 5.426.048 e 5.262.522, é um polipeptídeo de cadeia única que se estende da região de dobra N-terminal ao C- terminal nativo da região Fc de um anticorpo IgG1 humano. Outro polipeptídeo Fc adequado é a muteína de Fc descrita na Patente US N°: 5.457.035, e em Baum e cols. , 1994, EMBO J. 13:3.992-4.001. A sequência de aminoácidos dessa muteína é idêntica àquela da sequência de Fc nativa apresentada na Publicação WIPO No. WO 93/10151, exceto pelo aminoácido 19 ter sido trocado de Leu para Ala, aminoácido 20 ter sido trocado de Leu para Glu, e o aminoácido 22 ter sido trocado de Gly para Ala. A muteína exibe afinidade reduzida por receptores Fc.
Glicosilação
[0125] A proteína de ligação de antígeno pode ter um padrão de glicosilação que é diferente ou alterado daquele encontrado nas espécies nativas. Como é conhecido na técnica, os padrões de de glicosilação podem depender da sequência da proteína (por exemplo, da presença ou ausência de resíduos de aminoácido de glicosilação particulares, discutidos abaixo), ou a célula hospedeira ou organismo em que a proteína é produzida. Sistemas de expressão particulares são discutidos abaixo.
[0126] A glicosilação de polipeptídeos é tipicamente N-ligada ou O-ligada. N-ligada refere-se à anexação da porção de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências de tri-peptídeo asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, em que X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para anexação enzimática da porção de carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Portanto, a presença de dessas sequências de tri-peptídeo em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação potencial. A glicosilação O-ligada refere-se à anexação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose, ou xilose, a um hidroxiaminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser usados.
[0127] A adição de sítios de glicosilação à proteína de ligação de antígeno é convenientemente realizada por alteração da sequência de aminoácidos de modo que ela contenha uma ou mais das sequências de tri-peptídeo acima descritas (para sítios de glicosilação N-ligada). A alteração também pode ser feita pela adição, ou substituição, de um ou mais resíduos de serina ou treonina para a sequência de partida (para sítios de glicosilação O- ligada). Para facilitar, a sequência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno pode ser alterada através de alterações no nível de DNA, particularmente por mutação do DNA que codifica o polipeptídeo alvo em bases pré- selecionadas de modo que sejam gerados códons que traduzirão nos aminoácidos desejados.
[0128] Outro meio de aumentar o número de porções de carboidrato na proteína de ligação de antígeno é por ligação química ou enzimática de glicosídeos à proteína. Esses procedimentos são vantajosos, pois eles não requerem a produção da proteína em uma célula hospedeira que possui capacidades de glicosilação para glicosilação ligada em N e O. Dependendo do modo de ligação usado, o açúcar pode ser anexado a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxil livres, (c) grupos sulfidril livres como aqueles de cisteína, (d) grupos hidroxil livres como aqueles de serina, treonina, ou hidroxiprolina, (e) resíduos aromáticos como aqueles de fenilalanina, tirosina, ou triptofano, ou (f) o grupo amida de glutamina. Esses métodos são descritos em Publicação PCT No. WO 87/05330, e em Aplin and Wriston, 1981, CRC Crit. Rev, Biochem., pp. 259-306.
[0129] A remoção de porções de carboidrato presentes na proteína de ligação de antígeno inicial pode ser realizada quimicamente ou enzimaticamente. A desglicosilação química requer a exposição da proteína ao composto ácido trifluormetanossulfônico, ou um composto equivalente. Este tratamento resulta na clivagem de maioria ou de todos os açúcares exceto o açúcar de ligação (N- acetilglicosamina ou N-acetilgalactosamina), enquanto deixa o polipeptídeo intacto. A desglicosilação química é descrita por Hakimuddin e cols., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 e por Edge e cols., 1981, Anal. Biochem. 118:131. A clivagem enzimática de porções de carboidrato em polipeptídeos pode ser realizada pelo uso de várias endo e exoglicosidases como descrito por Thotakura e cols., 1987, Meth. Enzymol. 138:350. A glicosilação em sítios de glicosilação potenciais pode ser prevenida pelo uso do composto tunicamicina como descrito por Duskin e cols., 1982, J. Biol. Chem. 257:3.105. Tunicamicina bloqueia a formação de ligacoes proteína-N-glicosídeo.
[0130] Portanto, aspectos incluem as variantes de glicosilação das proteínas de ligação de antígeno em que o número e/ou tipo de sítios de glicosilação foi alterado comparado às sequências de aminoácidos do polipeptídeo parente. Em certas modalidades, as variantes da proteína de ligação de antígeno compreendem um maior ou menor número de sítios de glicosilação N-ligada que do polipeptídeo parente. As substituições que eliminam ou alteram essa sequência evitarão a adição de uma cadeia de carboidrato N- ligada presente no polipeptídeo parente. Por exemplo, a glicosilação pode ser reduzida pela deleção de uma Asn ou por substituição da Asn com um aminoácido diferente. Os anticorpos possuem tipicamente um sítio de glicosilação N- ligada na região Fc.
Rótulos e grupos efetores
[0131] As proteínas de ligação de antígeno podem compreender um ou mais rótulos. O termo “rótulo” ou “grupo de rotulagem” refere-se a qualquer rótulo detectável. Em geral, os rótulos podem ser de várias classes, dependendo do ensaio em que eles serão detectados: a) rótulos isotópicos, que podem ser radioativos ou isótopos pesados; b) rótulos magnéticos (por exemplo, partículas magnéticas); c) porções redox ativas; d) corantes óticos; grupos enzimáticos (por exemplo, peroxidase de raiz forte, β- galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina); e) grupos biotinilatados; e f) epitopos de polipeptídeo predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, sequências de par de zipper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, tags de epitopo etc.). Em algumas modalidades, o grupo de rotulagem é ligado à proteína de ligação de antígeno por meio de braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir potencial impedimento estérico. Vários métodos para a rotulagem de proteínas são conhecidos na técnica. Exemplos de grupos de rotulagem adequados incluem, sem limitação, os seguintes: radioisótopos ou radionuclídeos (por exemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), grupos fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, lantanida fósforo), grupos enzimáticos (por exemplo, peroxidase de raiz forte, β- galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), grupos quimioluminescentes, grupos biotinil, ou epitopos predeterminados do polipeptídeo reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, sequências de par de zipper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, tags de epitopo).
[0132] Em algumas modalidades, o grupo de rotulagem é ligado à proteína de ligação de antígeno por meio de braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir potencial impedimento estérico. Vários métodos para a rotulagem de proteínas são conhecidos na técnica e podem ser usados como adequado.
[0133] O termo “grupo efetor” significa qualquer grupo ligado a uma proteína de ligação de antígeno que age como um agente citotóxico. Exemplos para grupos efetores adequados são radioisótopos ou radionuclídeos (por exemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I). Outros grupos adequados incluem toxinas, grupo terapêuticos, ou grupos quimioterápicos. Exemplos de grupos adequados incluem calicheamicina, auristatinas, geldanamicina e maitansina. Em algumas modalidades, o grupo efetor é ligado à proteína de ligação de antígeno por meio de braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir potencial impedimento estérico.
Polinucleotídeos que codificam proteínas de ligação de antígeno de IL-23
[0134] Os polinucleotídeos que codificam as proteínas de ligação de antígeno aqui descritos, ou porções desses, são também fornecidos, incluindo polinucleotídeos que codificam uma ou ambas cadeias de um anticorpo, ou um fragmento, derivado, muteína, ou variantes destes, polinucleotídeos que codificam regiões variáveis de cadeia pesada ou apenas CDRs, polinucleotídeos suficientes para uso como marcadores de hibridização, iniciadores de PCR ou iniciadores de sequenciamento para a identificação, análise, mutação ou amplificação de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo, ácidos nucleicos anti-senso para a inibição da expressão de um polinucleotídeo, e sequências de complementaridade dos anteriores. Os polinucleotídeos podem ter qualquer comprimento. Eles podem ter, por exemplo, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 85, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1.000, 1.500, 3.000, 5.000 ou mais ácidos nucleicos de comprimento, incluindo todos os valores entre estes, e/ou podem compreender uma ou mais sequências adicionais, por exemplo, sequências reguladoras, e/ou ser parte de um polinucleotídeo maior, por exemplo, um vetor. Os polinucleotídeos podem ser de filamento único ou de filamento duplo e podem compreender RNA e/ou DNA ácidos nucleicos e variantes artificiais destes (por exemplo, ácidos nucleicos de peptídeo).
[0135] Os polinucleotídeos que codificam certas proteínas de ligação de antígeno, ou porções dessas (por exemplo, anticorpo de comprimento total, cadeia pesada ou leve, domínio variável, ou uma CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, ou CDRL3) pode ser isolado de células B de camundongos que foram imunizados com IL-23 ou um fragmento imunogênico deste. O polinucleotídeo pode ser isolado por procedimentos convencionais como reação de cadeia de polimerase (PCR). Apresentação de fago é outro exemplo de uma técnica conhecida em que os derivados de anticorpos e outras proteínas de ligação de antígeno podem ser preparados. Em uma abordagem, os polipeptídeos que são componentes de uma proteína de ligação de antígeno de interesse são expressos em qualquer sistema de expressão recombinante adequado, e os polipeptídeos expressos se montam para formar moléculas da proteína de ligação de antígeno. Apresentação de fago é também usada para derivar proteínas de ligação de antígeno que possuem diferentes propriedades (ou seja, afinidades variáveis pelo antígeno ao qual elas se ligam) por meio de embaralhamento de cadeia, veja Marks e cols., 1992, BioTechnology 10:779.
[0136] Devido à degeneração do código genético, cada uma das sequências de polipeptídeos aqui mostradas são também codificadas por um grande número de outras sequências de polinucleotídeos além daquelas fornecidas. Por exemplo, domínios variáveis de cadeia pesada aqui fornecidos podem ser codificados por sequências de polinucleotídeos de Id. de Seq. Nos: 32, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, ou 59. Os domínios variáveis de cadeia levem podem ser codificados por sequências de polinucleotídeos de Id. de Seq. Nos:2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, ou 28. Uma pessoa de habilidade comum na técnica perceberá que o presente pedido fornece, portanto, descrição escrita adequada e capacitada para cada sequência de nucleotídeo degenerada que codifica cada proteína de ligação de antígeno.
[0137] Um aspecto também fornece polinucleotídeos que hibridizam a outras moléculas de polinucleotídeo sob condições particulares de hibridização. Métodos para a hibridização de ácidos nucleicos, parâmetros básicos que afetam a escolha de condições de hibridização e guia para o planejamento de condições adequado são bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Sambrook, Fritsch, and Maniatis (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. e Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel e cols., eds., John Wiley & Sons, Inc.. Como aqui definido herein, um condição de hibridização de rigor moderado usa uma solução de pré-lavagem que contém 5x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC), 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0), tampão de hibridização de cerca de 50% formamida, 6x SSC, e uma temperatura de hibridização de 55°C (ou outras soluções de hibridização similares, como uma que contenha cerca de 50% formamida, com uma temperatura de hibridização de 42°C), e condições de lavagem de 60°C, em 0,5x SSC, 0,1% SDS. Uma condição rigorosa de hibridização hibridiza em 6x SSC a 45°C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,1x SSC, 0,2% SDS a 68°C. Além disso, uma pessoa habilitada na técnica pode manipular as condições de hibridização e/ou lavagem para aumentar ou diminuir o rigor da hibridização de modo que os polinucleotídeos que compreendem sequências de ácidos nucleicos que são pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas jumas às outras, incluindo todos os valores entre esses, permaneçam tipicamente hibridizados uns aos outros.
[0138] Podem ser introduzidas alterações por mutação em um polinucleotídeo, através disso levando a alterações na sequência de aminoácidos de um polipeptídeo (por exemplo, uma proteína de ligação de antígeno ou proteína de ligação de antígeno derivado) que ele codifica. As mutações podem ser introduzidas com o uso de qualquer técnica conhecida, como mutagênese sítio-direcionada e mutagênese aleatória. Os polipeptídeos mutantes podem ser expressos e selecionados para uma propriedade desejada. As mutações podem ser introduzidas em um polinucleotídeo sem alterar significativamente a atividade biológica de a um polipeptídeo que ele codifica. Por exemplo, as substituições em resíduos de aminoácido não essenciais. Alternativamente, uma ou mais mutações podem ser introduzidas em um polinucleotídeo que altera seletivamente a atividade biológica de um polipeptídeo que ele codifica. Por exemplo, a mutação pode alterar quantitativamente ou qualitativamente a atividade biológica, como aumentando, reduzindo ou eliminando a atividade e alterando a especificidade do antígeno de uma proteína de ligação de antígeno.
[0139] Outro aspecto fornece polinucleotídeos que são adequados para uso como iniciadores ou marcadores de hibridização para a detecção de sequências de ácido nucleico. Um polinucleotídeo pode compreender apenas uma porção de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo de comprimento total, por exemplo, um fragmento que pode ser usado como um marcador ou iniciador ou um fragmento que codifica uma porção ativa (por exemplo, uma porção de ligação de IL-23) de um polipeptídeo. Marcadores baseados na sequência de um ácido nucleico podem ser usados para detectar o ácido nucleico ou ácidos nucleicos similares, por exemplo, transcritos que codificam um polipeptídeo. O marcador pode compreender um grupo de rotulagem, por exemplo, um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima, ou um co-fator de enzima. Tais marcadores podem ser usados para identificar uma célula que expressa o polipeptídeo.
Métodos de expressão de proteínas de ligação de antígeno
[0140] As proteínas de ligação de antígeno aqui fornecidas podem ser preparadas por qualquer uma de inúmeras técnicas convencionais. Por exemplo, as proteínas de ligação de antígeno de IL-23 podem ser produzidas por sistemas de expressão recombinantes, que usam qualquer técnica conhecida na prática. Veja, por exemplo, Monoclonal antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet e cols.(eds.) Plenum Press, New York (1980); e Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988).
[0141] Os sistemas de expressão e construções na forma de plasmídeos, vetores de expressão, cassetes de transcrição ou expressão que compreendem pelo menos um polinucleotídeo como acima descrito são também aqui fornecidos, bem como células hospedeiras que compreendem tais sistemas de expressão ou construções. Como aqui usado, “vetor” significa qualquer molécula ou entidade (por exemplo, ácido nucleico, plasmídeo, bacteriófago ou vírus) adequada para uso para transferir informação de codificação de proteína em uma célula hospedeira. Exemplos de vetores include, sem limitação, plasmídeos, vetores virais, vetores de mamífero não epissomais e vetores de expressão, por exemplo, vetores de expressão recombinantes. Vetores de expressão, como vetores de expressão recombinantes, são úteis para a transformação de uma célula hospedeira e contêm sequências de ácidos nucleicos que direcionam e/ou controlam (junto com a célula hospedeira) a expressão de uma ou mais regiões codificação heterólogas operacionalmente ligadas e elas. Uma construção de expressão pode incluir, sem limitação, sequências que afetam ou controlam a transcrição, tradução e, se íntrons estiverem presentes, afetam splicing de RNA de uma região codificadora operacionalmente ligada a isso. “Operacionalmente ligada” significa que os componentes aos quais o termo é aplicado estão em uma relação que permite que eles carreguem suas funções inerentes. Por exemplo, uma sequência de controle, por exemplo, um promotor, em um vetor que é “operacionalmente ligado” a uma sequência de codificação de proteína são arranjados de modo que a atividade normal da sequência de controle leve à transcrição da sequência de codificação de proteína resultando em expressão recombinante da proteína codificada.
[0142] Outro aspecto fornece células hospedeiras em que um vetor de expressão, como um vetor de expressão recombinante, foi introduzido. Uma célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica (por exemplo, E. coli) ou célula eucariótica (por exemplo, células de levedura, inseto, ou mamífero (por exemplo, células CHO)). DNA de vetor pode ser introduzido em células procariótica ou eucariótica por meio de técnicas convencionais de transformação ou transfecção. Para transfecção estável de células de mamífero, é conhecido que, dependendo do vetor de expressão e da técnica de transfecção usada, apenas uma pequena fração de células pode integrar o DNA entranho em seu genoma. Para identificar e selecionar estes integrantes, um gene que codifica um marcador selecionável (por exemplo, para resistência a antibióticos) é geralmente introduzido nas células hospedeiras junto com o gene de interesse. Marcadores selecionáveis preferidos incluem aqueles que conferem resistência a fármacos, como G418, higromicina e metotrexato. Células estavelmente transfectadas com o polinucleotídeo introduzida podem ser identificadas por seleção de fármaco (por exemplo, células que possuem incorporado o gene de marcador selecionável sobreviverão, enquanto as outras células morrerão), entre outros métodos.
[0143] As proteínas de ligação de antígeno podem ser expressas em linhagens de células de hibridoma (por exemplo, em particular anticorpos podem ser expressos em hibridomas) ou em linhagens de células diferentes de hibridomas. As construções de expressão que codificam as proteínas de ligação de antígeno podem ser usadas para transformar uma célula hospedeira de mamíferon, inseto ou microbiana. A transformação pode ser realizada com o uso de qualquer método conhecido para introduzir polinucleotídeos em uma célula hospedeira, incluindo, por exemplo, a embalagem do polinucleotídeo em um vírus ou bacteriófago e transdução de uma célula hospedeira com a construção por procedimentos de transfecção conhecidos na técnica, como exemplificados pelas Patentes US Nos. 4.399.216; 4.912.040; 4.740.461; 4.959.455. O procedimento de transformação ótimo usado dependerá de qual tipo de célula hospedeira está sendo transformada. Métodos para a introdução de polinucleotídeos heterólogos em células de mamífero são bem conhecidos na técnica e incluem, sem limitação, transfecção mediada por dextrana, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplasto, eletroporação, encapsulação do polinucleotídeo(s) em lipossomos, mistura de ácido nucleico com lipídeos positivamente carregados, e microinjeção direta do DNA nos núcleos.
[0144] As construções de expressão recombinante tipicamente compreendem um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo. O polipeptídeo pode compreender um ou mais dos seguintes: uma ou mais CDRs como aqui fornecido; uma região variável de cadeia leve; uma região variável de cadeia pesada; uma região constante de cadeia leve; uma região constante de cadeia pesada (por exemplo, CH1, CH2 e/ou CH3); e/ou outra porção de “scaffold” de uma proteína de ligação de antígeno de IL-23. Essas sequências de ácidos nucleicos são inseridas em um vetor de expressão adequado com o uso de técnicas padrão de ligação. Em uma modalidade, a região constante de cadeia pesada ou leve é anexada ao terminal C de uma região variável de cadeia pesada ou leve aqui fornecida e é ligada em um vetor de expressão. O vetor é tipicamente selecionado para ser funcional na célula hospedeira particular empregada (ou seja, o vetor é compatível com o maquinário da célula hospedeira, permitindo que ocorra a amplificação e/ou expressão do gene). Em algumas modalidades, são usados vetores que empregam ensaios de complementação de proteína-fragmento que usam repórteres de proteína, como dihidrofolato redutase (veja, por exemplo, Pat. U.S. No. 6.270.964). Vetores de expressão adequados podem ser adquiridos, por exemplo, de Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA) ou BD Biosciences (San Jose, CA). Outros vetores uteis para a clonagem e expressão do anticorpos e fragmentos incluem aqueles descritos em Bianchi e McGrew, 2003, Biotech. Biotechnol. Bioeng. 84:439-44. Vetores de expressão adequados adicionais são discutidos, por exemplo, em Methods Enzymol., vol. 185 (D. V. Goeddel, ed.), 1990, New York: Academic Press.
[0145] Tipicamente, os vetores de expressão usados em qualquer uma das células hospedeiras terão sequências para manutenção de plasmídeo e para clonagem e expressão de sequências de nucleotídeo exógenas. Tais sequências, coletivamente referidas como “sequências de flanqueamento” em certas modalidades incluirão tipicamente uma ou mais das seguintes sequências de nucleotídeos: um promotor, uma ou mais sequências intensificadoras, uma origem de replicação, uma sequência de terminação de transcrição, uma sequência de íntron completo que contém um sítio de junção doado e um aceptor, uma sequência que codifica uma sequência líder para secreção de polipeptídeo, um sítio de ligação de ribossomo, uma sequência de poliadenilação, uma região de poliligante para inserção do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo a ser expresso, e um elemento de marcador selecionável. Os vetores de expressão que são fornecidos podem ser construídos a partir de um vetor de iniciação como um vetor comercialmente disponível. Tais vetores podem conter ou não todas as sequências de flanqueamento desejadas. Quando uma ou mais das sequências de flanqueamento aqui descritas não estão já presentes no vetor, elas podem ser individualmente obtidas e ligadas no vetor. Métodos usados para a obtenção de cada uma das sequências de flanqueamento são bem conhecidos para uma pessoa habilitada na técnica.
[0146] Opcionalmente, o vetor pode conter uma sequência que codifica um “tag”, ou seja, uma molécula de oligonucleotídeo localizada na extremidade 5' ou 3' da sequência que codifica proteína de ligação de antígeno de IL-23; a sequência de oligonucleotídeos codifica poliHis (como hexaHis), ou outro “tag” copmo FLAG®, HA (vírus influenza hemaglutinina), ou myc, para os quais existem anticorpos comercialmente disponíveis. Esse tag é tipicamente fundido ao polipeptídeo sob expressão do polipeptídeo, e pode servir como um meio para purificação por afinidade ou detecção da proteína de ligação de antígeno de IL-23 a partir da célula hospedeira. A purificação por afinidade pode ser realizada, por exemplo, por cromatografia em coluna com o uso de anticorpos contra o tag como uma matriz de afinidade. Opcionalmente, o tag pode ser subsequentemente removido da proteína de ligação de antígeno de IL-23 purificada por vários meios como pelo uso de certas peptidases para clivagem.
[0147] As sequências de flanqueamento podem ser homólogas (ou seja, da mesma espécie e/ou cepa que a célula hospedeira), heterólogas (ou seja, de uma espécie diferente da espécie ou cepa da célula hospedeira), híbridas (ou seja, uma combinação de sequências de flanqueamento de mais de uma fonte), sintéticas ou nativas. Como tal, a fonte de uma sequência de flanqueamento pode ser qualquer organismo procariótico ou eucariótico, qualquer organismo vertebrado ou invertebrado, ou qualquer planta, desde que a sequência de flanqueamento seja funcional, e possa ser ativada pelo maquinário da célula hospedeira.
[0148] As sequências de flanqueamento úteis nos vetores podem ser obtidas por qualquer um de vários métodos bem conhecidos na técnica. Tipicamente, as sequências de flanqueamento úteis foram previamente identificadas por mapeamento e/ou por digestão com endonuclease de restrição e podem ser assim isoladas da fonte de tecido adequada com o uso das endonucleases de restrição adequadas. Em alguns casos, a sequência de nucleotídeos total de uma sequência de flanqueamento pode ser conhecida. Aqui, a sequência de flanqueamento pode ser sintetizada com o uso dos métodos aqui descritos para a síntese ou clonagem de ácido nucleico.
[0149] Se toda ou apenas uma porção da sequência de flanqueamento é conhecida, ela pode ser obtida com o uso da reação de cadeia de polimerase (PCR) e/ou por rastreamento de uma biblioteca genômica com um marcador adequado como um oligonucleotídeo e/ou fragmento de sequência de flanqueamento da mesma ou de outra espécie. Quando a sequência de flanqueamento não é conhecida, um fragmento de DNA que contém uma sequência de flanqueamento pode ser isolado de um grande pedaço de DNA que pode conter, por exemplo, uma sequência codificadora ou mesmo outro gene ou genes. A isolação pode ser realizada por digestão com endonuclease de restrição para produzir o fragmento adequado de DNA seguido por isolação com o uso de purificação de gel de agarose, cromatografia em coluna Qiagen® (Qiagen, Chatsworth, CA), ou outros métodos conhecidos pelo profissional experiente. A seleção de enzimas adequadas para este objetivo será facilmente aparente para uma pessoa de habilidade comum na técnica.
[0150] Uma origem de replicação é tipicamente uma parte daqueles vetores de expressão procarióticos adquiridos comercialmente, e a origem auxilia na amplificação do vetor em uma célula hospedeira. Se o vetor de escolha não contém um sítio de origem de replicação, um pode ser quimicamente sintetizado baseado em uma sequência conhecida, e ligado no vetor. Por exemplo, a origem de replicação do plasmídeo pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) é adequada para a maioria das bactérias gram- negativas, e várias origens virais (por exemplo, SV40, polioma, adenovírus, vírus da estomatite vesicular (VSV), ou papilomavírus como HPV ou BPV) são úteis para clonagem de vetores em células de mamífero. Geralmente, o componente da origem de replicação não é necessário para vetores de expressão de mamífero (por exemplo, a origem SV40 é frequentemente usada apenas porque ela também contém o promotor precoce do vírus).
[0151] Uma sequência de terminação da transcrição é tipicamente localizada 3' à extremidade de uma região codificadora de polipeptídeo e serve para terminar a transcrição. Comumente, a sequência de terminação da transcrição em células procariótica é um fragmento rico em G-C seguido por uma sequência poli-T. embora a sequência seja facilmente clonada a partir de uma biblioteca ou mesmo adquirida comercialmente como parte de um vetor, ela também pode ser facilmente sintetizada com o uso de métodos para a síntese de ácido nucleico como aqueles aqui descritos.
[0152] Um gene de marcador selecionável codifica uma proteína necessária para a sobrevivência e crescimento de uma célula hospedeira que cresce em um meio de cultura seletivo. Genes de marcador de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, tetraciclina, ou kanamicina para células hospedeiras procarióticas; (b) complementam deficiências auxotróficas da célula; ou (c) suprem nutrientes críticos não disponíveis a partir de meio complexo ou definido media. Os marcadores selecionáveis específicos são o gene de resistência à kanamicina, o gene de resistência à ampicilina, e o gene de resistência à tetraciclina. Vantajosamente, um gene de resistência à neomicina também pode ser usado para a seleção em células hospedeiras procarióticas e eucarióticas.
[0153] Outros genes selecionáveis podem ser usados para amplificar o gene que será expresso. A amplificação é o processo em que os genes que são necessários para a produção de uma proteína crítica para o crescimento ou sobrevivência da célula são reiterados em tandem nos cromossomos de gerações sucessivas de células recombinantes. Exemplos de marcadores selecionáveis adequados para células de mamífero incluem dihidrofolato redutase (DHFR) e genes de timidina quinase sem promotor. Os transformantes de celula de mamífero são colocados sob pressão de seleção em que apenas os transformantes são unicamente adaptados para sobreviver em virtude do gene selecionável presente no vetor. A pressão de seleção é imposta por cultura das células transformadas sob condições em que a concentração do agente de seleção no no meio é sucessivamente aumentada, assim levando à amplificação do gene selecionável e do DNA que codifica outro gene, como uma proteína de ligação de antígeno que liga to IL-23. Como um resultado, quantidades aumentadas de um polipeptídeo como uma proteína de ligação de antígeno são sintetizadas a partir do DNA amplificado.
[0154] Um sítio de ligação de ribossomo é comumente necessário para a iniciação da tradução de mRNA e é caracterizado por uma sequência de Shine-Dalgarno (procariontes) ou uma sequência de Kozak (eucariontes). O elemento é tipicamente localizado 3' ao promotor e 5' à sequência codificadora do polipeptídeo a ser expresso.
[0155] Em alguns casos, como quando é desejada glicosilação em um sistema de expressão de célula hospedeira eucariótica, uma pessoa pode manipular as várias pré- ou pró-sequências para melhorar a glicosilação ou rendimento. Por exemplo, uma pessoa pode alterar o sítio de clivagem de peptidase de um peptídeo de sinal particular, ou adicionar pró-sequências, que também podem afetar a glicosilação. O produto final da proteína pode ter, na posição -1 (em relação ao primeiro aminoácido da proteína madura), um ou mais aminoácidos adicionais incidentes para expressão, que podem não ter sido totalmente removidos. Por exemplo, o produto final da proteína pode ter um ou dois resíduos de aminoácido encontrado no sítio de clivagem de peptidase, anexados ao terminal amino. Alternativamente, o uso de alguns sítios de clivagem de enzima pode resultar em uma forma levemente truncada do polipeptídeo desejado, se a enzima cortar em tal área no polipeptídeo maduro.
[0156] A expressão e clonagem conterão tipicamente um promotor que é reconhecido PELO organismo hospedeiro e operacionalmente ligado à molécula que codifica uma proteína de ligação de antígeno de IL-23. Promotores são sequências não transcritas localizadas upstream (ou seja, 5') ao códon de partida de um gene estrutural (geralmente em cerca de 100 a 1.000 bp) que controlam a transcrição do gene estrutural. Promotores são convencionalmente agrupados em uma de duas classes: promotores indutíveis e promotores constitutivos. Promotores indutíveis iniciam níveis aumentados de transcrição de DNA sobv seu controle em resposta a alguma alteração nas condições de cultura, como a presença ou ausência de um nutriente ou uma alteração na temperatura. Promotores constitutivos, por outro lado, transcrevem uniformemente um gene ao qual eles são operacionalmente ligados, ou seja, com pouco ou nenhum controle sobre a expressão de gene. Um grande número de promotores, reconhecidos por uma variedade de células hospedeiras potenciais, são bem conhecidos. Um promotor adequado é operacionalmente ligado ao DNA que codifica uma região variável de cadeia pesada ou uma região variável de cadeia leve de uma proteína de ligação de antígeno de IL-23 por remoção do promotor do DNA fonte por digestão com enzima de restrição e inserção da sequência do promotor desejada no vetor.
[0157] Promotores adequados para uso com hospedeiros de levedura são também bem conhecidos na técnica. Intensificadores de levedura são vantajosamente usados com promotores de levedeura. Promotores adequados para uso com células hospedeiras de mamífero são bem conhecidos e incluem, sem limitação, aqueles obtidos dos genomas de vírus como polioma vírus, fowlpox vírus, adenovírus (como Adenovírus 2), papiloma vírus bovino, sarcoma vírus de ave, citomegalovírus, retrovírus, vírus da hepatite-B e Vírus Símio 40 (SV40). Outros promotores de mamífero adequados incluem promotores de mamífero heterólogos, por exemplo, promotores heat-shock e o promotor de actina.
[0158] Promotores adicionais que podem ser de interesse incluem, sem limitação: promotor precoce SV40 (Benoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310); promotor CMV (Thornsen e cols., 1984, Proc. Natl. Acad. U.S.A.81:659-663); o promotor contido na repetição de terminal longo 3' de vírus de sarcoma de Rous (Yamamoto e cols., 1980, Cell 22:787-797); promotor de herpes timidina quinase (Wagner e cols., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1.444-1.445); sequências de promotor e reguladoras do gene de metalotionina (Prinster e cols., 1982, Nature 296:39-42); e promotores procarióticos como o promotor de beta-lactamase (Villa-Kamaroff e cols., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3.727-3.731); ou o promotor tac (DeBoer e cols., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21 25) . Também de interesse são as seguintes regiões de controle de transcrição de animal, que exibem especificidade de tecido e foram utilizadas em animais transgênicos: a região de controle de gene de elastase I que é ativa em células acinares pancreáticas (Swift e cols., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz e cols., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); a região de controle de gene de insulina que é ativa em células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122); a região de controle de gene de imunoglobulina que é ativa em células linfóides (Grosschedl e cols., 1984, Cell 38:647-658; Adames e cols., 1985, Nature 318:533-538; Alexander e cols., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1.436-1.444); a região de controle de vírus de tumor mamariod e camundongo que é ativa em células testiculares, de mama, linfóides e mastócitos (Leder e cols., 1986, Cell 45:485-495); a região de controle de gene de albumina que é ativa em fígado (Pinkert e cols., 1987, Genes and Devel. 1 :268-276); a região de controle de gene de alfa-feto-proteína que é ativa em fígado (Krumlauf e cols., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1.639-1.648; Hammer e cols., 1987, Science 253:53-58); a região de controle de gene de alfa 1-antitripsina que é ativa em fígado (Kelsey e cols., 1987, Genes and Devel. 1:161-171); a região de controle de gene de beta-globina que é ativa emn células mielóides (Mogram e cols., 1985, Nature 315:338-340; Kollias e cols., 1986, Cell 46:89-94); a região de controle de gene de proteína básica de mielina que é ativa em células de oligodendrócito no cérebro (Readhead e cols., 1987, Cell 48:703-712); a região de controle do gene de cadeia leve-2 de miosina que é ativa em músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314:283-286); e a região de controle do gene de hormônio de liberação gonadotrópico que é ativa no hipotálamo (Mason e cols., 1986, Science 234:1372-1378).
[0159] Uma sequência intensificadora pode ser inserida no vetor para aumentar a transcrição por eucariontes superiores. Os intenificadores são elementos de ação cis de DNA, comumente de cerca de 10-300 bp de comprimento, que agem sobre o promotor para aumentar a transcrição. Os intenificadores são relativamente independentes de orientação e posição, que foram encontrados nas posições 5' e 3' à unidade de transcrição. Várias sequências intensificadoras disponíveis a partir de genes de mamífero são conhecidas (por exemplo, globina, elastase, albumina, alfa-feto-proteína e insulina). Tipicamente, no entanto, um intensificador de um vírus é usado. O intensificador de SV40, o intensificador de precoce de citomegalovírus, o intensificador de polioma, e os intensificadores de adenovírus conhecidos na técnica são exemplos de elementos de intensificação para a ativação de promotores eucarióticos. Embora um intensificador possa ser posicionado no vetor 5' ou 3' a uma sequência codificadora, ele é tipicamente localizado em um sítio 5' do promotor. Uma sequência que codifica uma sequência de sinal nativa ou heteróloga adequada (sequência líder ou peptídeo de sinal) pode ser incorporada em um vetor de expressão, para promover a secreção extracelular do anticorpo. A escolha do peptídeo de sinal ou líder depende do tipo de células hospedeiras em que o anticorpo está para ser produzido, e uma sequência de sinal heteróloga pode substituir a sequência de sinal nativa. Exemplos de peptídeos de sinal que são funcionais em células hospedeiras de mamífero incluem os seguintes: a sequência de sinal para interleucina-7 descrita na Patente US N°: 4.965.195; a sequência de sinal para receptor de interleucina-2 descrita em Cosman e cols., 1984, Nature 312:768; o peptídeo de sinal de receptor de interleucina-4 descrito em Patente EP No. 0367 566; o peptídeo de sinal de receptor de interleucina-1 tipo I descrito em Patente U.S. No. 4.968.607; o peptídeo de sinal de receptor de interleucina- 1 de tipo II descrito em Patente EP No. 0 460 846.
[0160] Depois de o vetor ter sido construído, o vetor completo pode ser inserido em uma célula hospedeira adequada para amplificação e/ou expressão do polipeptídeo. A transformação de um vetor de expressão para uma proteína de ligação de antígeno e uma célula hospedeira selecionada pode ser realizada por métodos bem conhecidos que incluem transfecção, infecção, co-precipitação de fosfato de cálcio, eletroporação, microinjeção, lipofecção, transfecção mediada por DEAE-dextrana, ou outras técnicas conhecidas. O método selecionado sera em parte uma função do tipo de célula hospedeira a ser usado. Esses métodos e outros métodos adequados são bem conhecidos pelo profissional habilitado e são apresentados, por exemplo, em Sambrook e cols., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).
[0161] Uma célula hospedeira, quando cultivada sob condições adequadas, sintetiza proteína que pode ser subsequentemente coletada do meio de cultura (se a célula hospedeira a secreta no meio) ou diretamente a partir da célula hospedeira que a produz (se ela não é secretada). A seleção de uma célula hospedeira adequada dependerá de vários fatores, como os níveis desejados de expressão, modificações de polipeptídeo que são desejáveis ou necessárias para atividade (como glicosilação ou fosforilação) e facilidade de dobra em uma molécula biologicamente ativa.
[0162] Linhagens de células de mamífero disponíveis como hospedeiros para expressão são bem conhecidas na técnica e incluem, sem limitação, linhagens de células imortalizadas disponíveis pela “American Type Culture Collection” (ATCC), incluindo, sem limitação, células de ovário de hamster chinês (CHO), células HeLa, células renais de filhote de hamster (BHK), células renais de mamcado (COS), células de carcinoma hepatocelular humanp (por exemplo, Hep G2), e inúmeras outras linhagens de células. Em certas modalidades, as linhagens de células podem ser selecionadas através de determinação de quais linhagens de células possuem altos níveis de expressão e produzem constitutivamente proteínas de ligação de antígeno com propriedades de ligação de IL-23. Em outra modalidade, uma linhagem de celulas da linhagem de célula B não produz seu próprio anticorpo, mas tem uma capacidade de produzir e secretar um anticorpo heterólogo também pode ser selecionada.
Uso de proteínas de ligação de antígeno de IL-23 humana para objetivos diagnósticos e terapêuticos
[0163] As proteínas de ligação de antígeno são úteis para a detecção de IL-23 em amostras biológicas e identificação de células ou tecidos que produzem IL-23. As proteínas de ligação de antígeno que se ligam especificamente a IL-23 podem ser usadas em diagnóstico e/ou tratamento de doenças relacionadas a IL-23 em um paciente em necessidade desse. As proteínas de ligação de antígeno de IL-23 podem ser usadas em ensaios diagnósticos, por exemplo, ensaios de ligação para detectar e/ou quantificar IL-23 expressa no sangue, soro, células ou tecido. Em adição, as proteínas de ligação de antígeno de IL-23 podem ser usadas para reduzir, inibir, interferir ou modular uma ou mais atividades biológicas de IL-23 em uma célula ou tecido. Assim, as proteínas de ligação de antígeno que se ligam a IL-23 podem ter uso terapêutico na melhoria de doenças relacionadas a IL-23.
Indicações
[0164] A presente invenção também relaciona-se ao uso de proteínas de ligação de antígeno de IL-23 para uso na prevenção ou tratamento terapêutico de distúrbios médicos, como aqueles aqui revelados. As proteínas de ligação de antígeno de IL-23 são úteis para tratar uma variedade de condições em que IL-23 é associada ou tem um papel na contribuição para a doença ou distúrbio subjacente ou contribui para um sintoma negativo.
[0165] Condições eficazmente tratadas por proteínas de ligação de antígeno de IL-23 possuem um papel na resposta inflamatória. Tais distúrbios inflamatórios incluem doença periodontal; distúrbios pulmonares como asma; distúrbios cutâneos como psoríase, dermatite atópica, dermatite de contato; distúrbios reumáticos como artrite reumatóide, esclerose sistêmica progressiva (escleroderma); lupus eritematoso disseminado; espondiloartrite incluindo espondilite anquilosante, artrite psoriática, artrite enteropática e artrite reativa. Também é contemplada uveíte que inclui a doença de Vogt-Koyanagi-Harada, uveíte anterior e posterior idiopática, e uveíte associada com espondiloartrite. O uso de proteínas de ligação de antígeno de IL-23 é também contemplado para o tratamento de distúrbios autoimunes que incluem esclerose múltipla; miocardite autoimune; diabetes tipo 1 e tireoidite autoimune.
[0166] Condições degenerativas do sistema gastrointestinal são tratáveis ou preveníveis com as proteínas de ligação de antígeno de IL-23. Tais distúrbios gastrointestinais incluem doença intestinal inflamatória: doença de Crohn, colite ulcerativa e Celiac doença.
[0167] Também são incluídos o uso de proteínas de ligação de antígeno de IL-23 no tratamentos para doença enxerto-versus- hospedeiro, e complicações como rejeição a enxerto, que resultam de implante de transplante de órgão sólido, como coração, fígado, pele, rim, pulmão ou outros transplantes, incluindo transplantes de medula óssea.
[0168] Também são aqui fornecidos métodos para o uso de proteínas de ligação de antígeno de IL-23 para tratar vários distúrbios oncológicos que incluem várias formas de câncer que incluem câncer de cólon, estômago, próstata, de célula renal, cervical e ovariano, e câncer pulmonar (SCLC e NSCLC). Também são incluídos tumores sólidos, quje incluem sarcoma, osteossarcoma, e carcinoma, como adenocarcinoma e carcinoma de célula escamosa, câncer esofageano, câncer gástrico, carcinoma da vesícula biliar, leucemia, incluindo leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crônica, leucemia mielóide, leucemia linfoblástica crônica ou aguda e leucemia de celula pilosa, e mieloma múltiplo.
Métodos diagnósticos
[0169] As proteínas de ligação de antígeno descritas podem ser usadas para fins diagnósticos para detectar, diagnosticar ou monitorar doenças e/ou condições associadas à IL-23. Exemplos de métodos úteis na detecção da presença de IL-23 incluem imunoensaios, tais como o ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) e o radioimunoensaio (RIA).
[0170] Para aplicações diagnósticas, a proteína de ligação de antígeno tipicamente será rotulada com um grupo de rotulagem detectável. Grupos de rotulagem adequados incluem, sem limitação, os seguintes: radioisótopos ou radionuclídeos (por exemplo, 3H, 14C 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), grupos fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantanida), grupos enzimáticos (por exemplo, peroxidase de raiz-forte, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), grupos quimioluminescentes, grupos de biotinil ou epitopos polipeptídicos predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, sequências de par de zíper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, tags de epitopo). Em algumas modalidades, o grupo de rotulagem é acoplado à proteína de ligação de antígeno por meio de braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir impedimento estérico potencial. Vários métodos para a rotulagem de proteínas são conhecidos na técnica e podem ser usados.
[0171] Outros métodos diagnósticos são fornecidos para a identificação de uma célula ou células que expressam IL-23. Em uma modalidade específica, a proteína de ligação de antígeno é rotulada com um grupo de rotulagem e a ligação da proteína de ligação de antígeno rotulada à IL-23 é detectada. Em uma modalidade específica adicional, a ligação da proteína de ligação de antígeno à IL-23 é detectada in vivo. Em uma modalidade específica adicional, a proteína de ligação de antígeno de IL-23 é isolada e medida com o uso de metodologias conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Harlow e Lane, 1988, “Antibodies: A Laboratory Manual”, Nova York: Cold Spring Harbor (ed. 1991 e suplementos periódicos); John E. Coligan, ed., 1993, “Current Protocols In Immunology”, Nova York: John Wiley & Sons.
[0172] Outros métodos permitem a detecção da presença de uma molécula de teste que compete pela ligação à IL-23 com as proteínas de ligação de antígeno fornecidas. Um exemplo de um ensaio desse tipo envolveria a detecção da quantidade de proteína de ligação de antígeno livre em uma solução contendo uma quantidade de IL-23 na presença ou ausência da molécula de teste. Um aumento na quantidade de proteína de ligação de antígeno livre (ou seja, da proteína de ligação de antígeno não ligada à IL-23) indicaria que a molécula de teste é capaz de competir pela ligação de IL-23 com a proteína de ligação de antígeno. Em uma modalidade, a proteína de ligação de antígeno é rotulada com um grupo de rotulagem. Alternativamente, a molécula de teste é rotulada e a quantidade de molécula de teste livre é monitorada na presença e ausência de uma proteína de ligação de antígeno.
Métodos de tratamento: formulações farmacêuticas, vias de administração
[0173] São fornecidas composições farmacêuticas que compreendem uma quantidade farmaceuticamente eficaz de uma ou diversas proteínas de ligação de antígeno e um excipiente farmaceuticamente aceitável, diluente, veículo, solubilizante, emulsificante, conservante e/ou adjuvante. Além disso, são incluídos métodos de tratamento um paciente por administração desta composição farmacêutica. O termo “paciente” inclui pacientes humanos. Os termos “tratar” e “tratamento” englobam o alívio ou a prevenção de pelo menos um sintoma ou outro aspecto de um distúrbio, ou redução da gravidade da doença, e semelhantes. O termo “quantidade farmaceuticamente eficaz” ou “quantidade eficaz” se refere à quantidade de uma proteína de ligação de antígeno de IL- 23 determinada para produzir qualquer resposta terapêutica em um mamífero. Essas quantidades farmaceuticamente eficazes são facilmente verificadas por aqueles habilitados na técnica.
[0174] Uma proteína de ligação de antígeno não precisa efetuar uma cura completa, ou erradicar todos os sintomas ou manifestações de uma doença, para constituir um agente terapêutico viável. Como é reconhecido no campo pertinente, fármacos empregados como agentes terapêuticos podem reduzir a gravidade de certo estado de doença, não precisa abolir todas as manifestações da doença para serem considerados como agentes terapêuticos úteis.
[0175] Similarmente, um tratamento administrado profilaticamente não precisa ser completamente eficaz na prevenção do surgimento de uma condição a fim de constituir um agente profilático viável. Simplesmente a redução do impacto de uma doença (por exemplo, por redução do número ou da gravidade de seis sintomas, ou por aumento da eficácia de outro tratamento, ou por produção de outro efeito benéfico), ou a redução da probabilidade de que a doença ocorrerá ou piorará em um indivíduo é suficiente. Certos métodos aqui fornecidos compreendem a administração a um paciente de um antagonista de IL-23 (por exemplo, as proteínas de ligação de antígeno aqui reveladas) em uma quantidade e por um tempo suficiente para induzir uma melhora sustentada em relação ao nível basal de um indicador que reflete a gravidade do distúrbio particular.
[0176] Como é compreendido no campo pertinente, composições farmacêuticas que compreendem as moléculas da invenção são administradas a um paciente de uma forma adequada à indicação. As composições farmacêuticas podem ser administradas por qualquer técnica adequada, incluindo, sem limitação, parenteralmente, topicamente ou por inalação. Se injetada, a composição farmacêutica pode ser administrada, por exemplo, pela via intra-articular, intravenosa, intramuscular, intralesional, intraperitoneal ou subcutânea, por injeção em bolo ou infusão contínua. A administração localizada, por exemplo, em um local de doença ou lesão, é contemplada, bom como o são liberação transdérmica e liberação sustentada por implantes. A liberação por inalação inclui, por exemplo, inalação nasal ou oral, o uso de um nebulizador, a inalação do antagonista em forma de aerossol, e semelhantes. Outras alternativas incluem colírios; preparações orais, incluindo pílulas, xaropes, losangos ou goma de mascar; e preparações tópicas como, por exemplo, loções, géis, sprays e pomadas.
[0177] O uso de proteínas de ligação de antígeno em procedimentos ex vivo também é contemplado. Por exemplo, o sangue ou outro fluido corpóreo de um paciente pode ser colocado em contato com uma proteína de ligação de antígeno que liga IL-23 ex vivo. A proteína de ligação de antígeno pode ser ligada a qualquer matriz insolúvel ou material de suporte sólido adequado.
[0178] Vantajosamente, proteínas de ligação de antígeno são administradas na forma de uma composição que compreende um ou mais componentes adicionais como, por exemplo, um veículo, excipiente ou diluente fisiologicamente aceitável. Opcionalmente, a composição adicionalmente compreende um ou mais fisiologicamente agentes ativos para terapia combinada. Uma composição farmacêutica pode compreender uma proteína de ligação de antígeno de IL-23 junto com uma ou mais substâncias selecionadas do grupo que consiste em um tampão, um antioxidante como, por exemplo, ácido ascórbico, um polipeptídeo de baixo peso molecular (tais como aqueles que possuem menos de 10 aminoácidos), uma proteína, um aminoácido, um carboidrato como, por exemplo, glicose, sacarose ou dextrinas, um agente quelante como, por exemplo, EDTA, glutationa, um estabilizante e um excipiente. Solução salina neutra tamponada ou solução salina misturada com albumina sérica conespecífica são exemplos de diluentes apropriados. De acordo com os padrões da indústria apropriados, conservantes como, por exemplo, álcool benzílico, também podem ser adicionados. A composição pode ser formulada como um liofilizado usando soluções excipientes apropriadas (por exemplo, sacarose) como diluentes. Componentes adequados são atóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas. Exemplos adicionais de componentes que podem ser empregados em formulações farmacêuticas são apresentados em qualquer edição de “Remington's Pharmaceutical Sciences”, incluindo a 2a Edição (2005), Mack Publishing Company, Easton, PA.
[0179] Kits para uso por profissionais médicos incluem uma proteína de ligação de antígeno de IL-23 e um rótulo ou outras instruções para uso no tratamento de qualquer uma das condições aqui discutidas. Em uma modalidade, o kit inclui uma preparação estéril de uma ou mais proteínas de ligação de antígeno de ligação de IL-23, que podem estar na forma de uma composição, como revelado acima, e podem estar em um ou mais frascos.
[0180] Dosagens e a frequência de administração podem variar de acordo com fatores como, por exemplo, a via de administração, as proteínas de ligação de antígeno em particular empregadas, a natureza e gravidade da doença a ser tratada, se a condição é aguda ou crônica e o tamanho e condição geral do indivíduo. Dosagens apropriadas podem ser determinadas por procedimentos conhecidos na técnica pertinente, por exemplo, em experimentos clínicos que podem envolver estudos de escalonamento de dose.
[0181] Uma dosagem típica pode variar de cerca de 0,1 μg/kg até cerca de 30 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Em modalidades específicas, a dosagem pode variar de 0,1 μg/kg até cerca de 30 mg/kg, opcionalmente de 1 μg/kg até cerca de 30 mg/kg, opcionalmente de 10 μg/kg até cerca de 10 mg/kg, opcionalmente de cerca de 0,1 mg/kg a 5 mg/kg ou, opcionalmente, de cerca de 0,3 mg/kg até 3 mg/kg.
[0182] A frequência de dosagem dependerá dos parâmetros farmacocinéticos da proteína de ligação de antígeno de IL-23 humana particular usada na formulação. Tipicamente, um médico administra a composição até que seja alcançada uma dosagem que obtém o efeito desejado. A composição pode, portanto, ser administrada como uma dose única, ou como duas ou mais doses (que podem ou não conter a mesma quantidade da molécula desejada) ao longo do tempo, ou como uma infusão contínua por meio de um dispositivo de implantação ou cateter. Dosagens apropriadas podem ser verificadas por meio do uso de dados apropriados de dose- resposta. Uma proteína de ligação de antígeno de IL-23 da invenção pode ser administrada, por exemplo, uma vez ou mais de uma vez, por exemplo, em intervalos regulares ao longo de um período de tempo. Em modalidades particulares, uma proteína de ligação de antígeno de IL-23 é administrada ao longo de um período de pelo menos um mês ou mais, por exemplo, por um, dois, ou três meses ou até mesmo indefinidamente. Para o tratamento de condições crônicas, o tratamento de longo prazo é geralmente o mais eficaz. No entanto, para o tratamento de condições agudas, a administração por períodos mais curtos, por exemplo, de um a seis semanas, pode ser suficiente. Em geral, a proteína de ligação de antígeno é administrada até que o paciente manifeste um grau medicamente relevante de melhora em relação ao nível de base para o indicador ou indicadores escolhidos.
[0183] É contemplado que uma proteína de ligação de antígeno de IL-23 pode ser administrada ao paciente em uma quantidade e por um tempo suficiente para induzir uma melhora, preferivelmente uma melhora sustentada, em pelo menos um indicador que reflete a gravidade do distúrbio que está sendo tratado. Vários indicadores que refletem a extensão da enfermidade, doença ou condição do paciente podem ser avaliados para determinar se a quantidade e o tempo do tratamento são suficientes. Esses indicadores incluem, por exemplo, indicadores clinicamente reconhecidos de gravidade da doença, sintomas ou manifestados do distúrbio em questão. Em uma modalidade, uma melhora é considerada como sendo sustentada se o indivíduo exibe a melhora em pelo menos duas ocasiões separadas por duas a quatro semanas. O grau de melhora geralmente é determinado por um médico, que faz essa determinação com base em sinais, sintomas, biópsias ou outros resultados de testes, e que também pode empregar questionários que são aplicados ao indivíduo, por exemplo, questionários de qualidade de vida desenvolvidos para certa doença.
[0184] Modalidades particulares de métodos e composições da invenção envolvem o uso de uma proteína de ligação de antígeno de IL-23 e um ou mais antagonistas de IL-23 adicionais, por exemplo, duas ou mais proteínas de ligação de antígeno da invenção, ou uma proteína de ligação de antígeno da invenção e um ou mais outros antagonistas de IL-23. Também são fornecidas proteínas de ligação de antígeno de IL-23 administradas isoladamente ou em combinação com outros agentes úteis para o tratamento da condição que o paciente sofre. Exemplos desses agentes incluem fármacos tanto proteináceos quanto não proteináceos. Esses agentes incluem porções terapêuticas que possuem propriedades antiinflamatórias (por exemplo, agentes antiinflamatórios não esteroidais, esteróides, imunomoduladores e/ou outros inibidores de citocina como, por exemplo, aqueles que antagonizam, por exemplo, IFN-y, GM-CSF, IL-6, IL-8, IL-17, IL-22 e TNFs), ou de uma proteína de ligação de antígeno de IL-23 e um ou mais outros tratamentos (por exemplo, cirurgia, ultra-som ou tratamento eficaz para reduzir inflamação). Quando múltiplas substâncias terapêuticas são co-administradas, as dosagens podem ser ajustadas de acordo, como é reconhecido ou sabido na técnica pertinente. Agentes úteis que podem ser combinados com proteínas de ligação de antígeno de IL- 23 incluem aqueles usados para tratar, por exemplo, doença de Crohn ou colite ulcerativa, por exemplo, aminossalicilato (por exemplo, mesalamina), corticosteróides (incluindo prednisona), antibióticos, por exemplo, metronidazol ou ciprofloxacina (ou outros antibióticos úteis para o tratamento, por exemplo, de pacientes que sofrem com fístulas), e imunossupressores como, por exemplo, azatioprina, 6-mercaptopurina, metotrexato, tacrolimus e ciclosporina. Esses agentes podem ser administrados oralmente ou por outra via, por exemplo, por meio de supositório ou enema. Agentes que podem ser combinados com proteínas de ligação de IL-23 no tratamento de psoríase incluem corticosteróides, calcipotrieno e outros derivados da vitamina D, acetretina e outros derivados do ácido retinóico, metotrexato, tacrolimus e ciclosporina usados tópica ou sistemicamente. Esses agentes podem ser administrados simultaneamente, consecutivamente, alternativamente ou de acordo com qualquer outro regime que permita que a evolução total da terapia seja eficaz.
[0185] Além de pacientes humanos, as proteínas de ligação de antígeno de IL-23 são úteis no tratamento de animais não humanos, por exemplo, animais de estimação (cães, gatos, pássaros, primatas etc.), animais de criação (cavalos, gado, carneiros, porcos, pássaros etc.). Nesses casos, uma dose apropriada pode ser determinada de acordo com o peso corporal do animal. Por exemplo, uma dose de 0,2-1 mg/kg pode ser usada. Alternativamente, a dose é determinada de acordo com a área de superfície do animal, com uma dose exemplar variando de 0,1-20 mg/m2, ou mais preferivelmente, de 5-12 mg/m2. Para animais pequenos, por exemplo, cães ou gatos, uma dose adequada é de 0,4 mg/kg. A proteína de ligação de antígeno de IL-23 (preferivelmente construída a partir de genes derivados da espécie receptora) é administrada por injeção ou por outra via adequada uma ou mais vezes por semana até que a condição do animal seja melhorada, ou ela pode ser administrada indefinidamente.
[0186] Os exemplos seguintes, que incluem os experimentos realizados e os resultados obtidos, são fornecidos apenas para fins ilustrativos, e não devem ser considerados como limitantes do escopo das reivindicações em anexo.
EXEMPLOS Exemplo 1 Geração de anticorpos para IL-23 humana
[0187] A tecnologia XenoMouseTM (Amgen, Thousand Oaks, CA) foi usada para desenvolver anticorpos monoclonais humanos que reconhecem e inibem atividade de IL-23 humana nativa, enquanto poupam IL-12 humana. Os anticorpos também reconhecem e inibem IL-23 de Cynomolgus recombinante, mas não reconhecem IL-23 murídea ou de rato.
[0188] Foram selecionados anticorpos para reconhecimento e inibição completa de IL-23 humana nativa obtida de células dendríticas derivadas de monócitos humanos (MoDCs), usando o ensaio de repórter de STAT-luciferase descrito abaixo. Monócitos humanos foram isolados de células mononucleares do sangue periférico de doadores saudáveis usando seleção negativa (“Monocyte Isolation Kit II”, Miltenyi Biotec, Auburn, CA). MoDCs foram geradas por cultivo de monócitos com GM-CSF humano (50 ng/ml) e IL-4 humana (100 ng/ml) por 7 dias em RPMI 1640 com meio completo de soro bovino fetal 10%. MoDCs foram então lavadas duas vezes com PBS seguido por estimulação com CD40L humano (1 μg/ml) por mais 48 horas. O sobrenadante de MoDCs estimuladas com CD40L contém IL-23, IL-12 e IL-12/23p40. ELISAs são usados para determinar a quantidade de IL-12p70 (R&D Sistema, Minneapolis, MN), IL- 23 (eBiosciences, San Diego, CA) e IL-12/23p40 (R&D Systems). O ensaio de STAT-luciferase responde à IL-23 e não à IL-12 ou à IL-12/23p40 livre e, portanto, o ensaio podia ser usado com sobrenadantes brutos para avaliar a atividade de IL-23. Para uso no ensaio de célula NK, descrito abaixo, o sobrenadante bruto de IL-23 humana nativa foi purificado usando uma coluna de afinidade por IL-23 seguido por cromatografia por exclusão de tamanho. A concentração foi determinada usando um ELISA específico para IL-23 (eBiosciences).
[0189] Os sobrenadantes purificados de anticorpo também foram testados contra IL-23 humana recombinante (rhu) e IL-23 de Cynomolgus recombinante (cyno) no ensaio de STAT-luciferase. Dos anticorpos testados que inibiram completamente IL-23 humana recombinante, apenas metade daqueles anticorpos reconheceu e inibiu completamente IL-23 humana nativa. O reconhecimento e a inibição completa de IL-23 humana recombinante não eram preditivos e nem estavam correlacionados com o reconhecimento e a inibição completa de IL-23 humana nativa. Como mostrado nas FIGURAS 1A e 1B, dos sobrenadantes de anticorpo que inibiram completamente IL-23 humana recombinante, apenas metade daqueles anticorpos inibiu completamente IL-23 humana nativa. Aqueles anticorpos que reconheceram e inibiram completamente IL-23 humana nativa foram selecionados para caracterização posterior.
EXEMPLO 2 Ensaios funcionais a) Ensaio de STAT-luciferase
[0190] Sabe-se que IL-23 se liga ao seu receptor heterodimérico e sinaliza através de JAK2 e Tyk2 para ativar STAT 1, 3, 4 e 5. Nesse ensaio, células transfectadas com um gene repórter de STAT/luciferase são usadas para avaliar a habilidade dos anticorpos de IL-23 para inibir bioatividade induzida por IL-23.
[0191] Células de ovário de hamster chinês que expressam receptor IL-23 humana são transitoriamente transfectadas com repórter de STAT-luciferase de um dia para o outro. Anticorpos de IL-23 são diluídos serialmente (12 pontos de diluições seriais de 1:4 começando a 37,5 μg/ml) em placas de 96 poços. IL-23 humana nativa (o método de preparação é descrito no Exemplo 1) é adicionada a cada poço em uma concentração de 2 ng/ml e incubada em temperatura ambiente por 15-20 minutos. As células transfectadas transitoriamente são adicionadas (8 x 103 células) até um volume final de 100 μl/poço e incubadas por 5 horas a 37°C, CO2 10%. Após incubação, as células são lisadas usando 100 μl/poço de tampão de lise Glo (1x) (Promega, Madison, Wisconsin) em temperatura ambiente por 5 minutos. Cinquenta microlitros de lisado de células são adicionados a uma placa de 96 poços juntamente com 50 μl de substrato de luciferase Bright-Glo (Promega) e lidos em um luminômetro.
[0192] A analysis estatística pode ser realizada usando o software GraphPad PRISM (GraphPad Software, La Jolla, CA). Os resultados podem ser expressos como a média ± desvio-padrão (DP).
[0193] Como observado na TABELA 5, todos os anticorpos de IL-23 inibiram potente e completamente repórter de STAT/luciferase induzido por IL-23 nativa humana de forma dose-dependente. Os anticorpos também inibiram potente e completamente IL-23 humana recombinante (rhu) e IL-23 recombinante de Cynomolgus (cyno). Todos os anticorpos tinham valores da IC50 na faixa picomolar. TABELA 5. Tabela de valores médios da IC50 (pM) para anticorpos de IL-23 no ensaio de STAT-luciferase.
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b) Ensaio de célula NK
[0194] Sabe-se que IL-23 age em células natural killer para induzir expressão de citocinas pró- inflamatórias, por exemplo, interferon y (IFNy). Nesse ensaio, células natural killer (NK) humanas primárias são usadas para avaliar a habilidade dos anticorpos de IL-23 para inibir a atividade de IFNy induzida por IL-23 in células que expressam o receptor nativo para IL-23 humana.
[0195] As células NK são isoladas de múltiplos doadores humanos por meio de seleção negativa (“NK Cell Isolation Kit”, Miltenyi Biotec, Auburn, CA). As células NK purificadas (1 x 106 células/ml) são adicionadas a placas de 6 poços em RPMI 1640 mais meio completo de soro bovino fetal 10% suplementado com IL-2 humana recombinante (10 ng/ml, R&D Systems, Minneapolis, MN), até um volume final de 10 ml/poço. As células são cultivadas por 7 dias a 37°C, CO2 5%. As células NK ativadas por IL-2 são então estimuladas com rhuIL-23 ou cyno IL-23 (10 ng/ml) e IL-18 humana recombinante (20 ng/ml, R&D Systems, Minneapolis, MN) na presença de diluições seriais (11 pontos de diluições seriais de 1:3 começando a 3 μg/ml) de anticorpos de IL-23 por 24 horas. Os níveis de IFNy são medidos no sobrenadante por ELISA para IFNy (R&D Systems, Minneapolis, MN) de acordo com as instruções do fabricante.
[0196] A análise estatística pode ser realizada usando o software GraphPad PRISM. Os resultados podem ser expressos como a média ± desvio-padrão (DP).
[0197] Como observado na TABELA 6, todos os anticorpos inibiram potentemente a expressão de IFNy induzida por rhuIL-23 e cyno IL-23 em células NK de forma dose-dependente. Todos os anticorpos tinham valores da IC50 na faixa picomolar. O ensaio foi realizado em um subconjunto de anticorpos usando IL-23 humana nativa (30 μg/ml; o método de preparação é descrito no Exemplo 1) e rhuIL-18 (40 ng/ml, R&D Systems) e gerou os resultados mostrados na TABELA 6. Consistentes com a seleção para anticorpos IL-23-específicos, esses anticorpos anti-IL-23 não tiveram nenhum efeito sobre a produção de IFNy estimulada por IL-12 em células NK usando o ensaio descrito acima, enquanto um anticorpo neutralizante IL-12p35- específico, mAb219 (R&D Systems, Minneapolis, MN), inibiu potentemente IL-12 humana recombinante.TABELA 6. Tabela de valores médios da IC50 (pM) para anticorpos de IL-23 no ensaio de célula NK.
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c) Ensaio de sangue total humano
[0198] Sangue total humano é coletado de múltiplos doadores saudáveis usando Refludan® (Bayer Pittsburgh, PA) como anticoagulante. A concentração final de Refludan® no sangue total é de 10 μg/ml. Uma mistura de estimulação de rhuIL-23 ou cyno IL-23 (concentração final de 1 ng/ml) + rhuIL-18 (concentração final de 20 ng/ml) + rhuIL-2 (concentração final de 5 ng/ml) em RPMI 1640 + FBS 10% é adicionada a uma placa de 96 poços, com volume final de 20 μl/poço. Anticorpos de IL-23 diluídos serialmente (11 pontos de diluições seriais de 1:3 começando a partir de 3 μg/ml) são adicionados a 20 μl/poço e incubados com a mistura de estimulação por 30 minutos em temperatura ambiente. Sangue total é então adicionado (120 μl/poço) e o volume final ajustado até 200 μl/poço com RPMI 1640 + FBS 10%. A concentração final de sangue total é de 60%. As placas são incubadas por 24 horas a 37°C, CO2 5%. Os sobrenadantes livres de células são coletados e os níveis de IFNy são medidos dos sobrenadantes por ELISA para IFNy (R&D Systems) de acordo com as instruções do fabricante.
[0199] A análise estatística pode ser realizada usando o software GraphPad PRISM. Os resultados podem ser expressos como a média ± desvio-padrão (DP).
[0200] Como observado na TABELA 7, todos os anticorpos inibiram potentemente a expressão de IFNy induzida por rhuIL-23 e induzida por cyno-IL-23 em células do sangue total de forma dose-dependente. Todos os anticorpos tinham valores de IC50 na faixa picomolar. TABELA 7. Tabela de valores médios da IC50 (pM) para anticorpos de IL-23 no ensaio de sangue total humano de IFNy
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d) Ensaio de IL-22
[0201] Sabe-se que IL-23 é um indutor potente de citocinas pró-inflamatórias. IL-23 age em células T ativadas e de memória e promovem a sobrevida e expansão de células Th17 que produzem citocinas pró-inflamatórias, incluindo IL-22. Nesse ensaio, sangue total humano é usado para avaliar a habilidade dos anticorpos de IL-23 para inibir a produção de IL-22 induzida por IL-23.
[0202] O ensaio de sangue total é realizado da mesma forma descrita acima, com a modificação de utilização de rhuIL-23 ou cyno IL-23 a 1 ng/ml e rhuIL-18 a 10 ng/ml para induzir a produção de IL-22. A concentração de IL-22 é determinada por ELISA para IL-22 (R&D Systems, Minneapolis, MN).
[0203] Como observado na TABELA 8, os anticorpos inibiram potentemente a produção de IL-22 induzida por rhuIL-23- e induzida por cyno IL-23 em células do sangue total de forma dose-dependente. Todos os anticorpos tinham valores da IC50 na faixa picomolar.TABELA 8. Tabela de valores médios da IC50 (pM) para anticorpos de IL-23 no ensaio de sangue total humano de IL- 22.
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Exemplo 3 Determinação da constante de dissociação de equilíbrio (KD) para anticorpos anti-IL-23 usando tecnologia KinExA
[0204] A afinidade de ligação de rhuIL-23 aos anticorpos de IL-23 é avaliada usando um ensaio de exclusão cinética (ensaio KinExA, Sapidyne Instruments, Inc., Boise, ID). Glóbulos de fluxo rápido de Sefarose 4 ativados por soro humano normal (NHS) (Amersham Biosciences, parte de GE Healthcare, Uppsala, Suécia), são pré-revestidos com rhuIL- 23 e bloqueados com 1 M de tampão Tris com 10 mg/ml de BSA. Cinquenta pM de anticorpo de IL-23 são incubados com rhuIL- 23 (12 pontos de diluições de 1:2 começando a partir de 800 pM) em temperatura ambiente por 72 horas, antes de ser processado através dos glóbulos de Sefarose revestidos com rhuIL-23. A quantidade do anticorpo ligado ao glóbulo foi quantificada por anticorpo de cabra anti-Fc humano com rotulagem fluorescente (Cy5) (Jackson Immuno Research, West Grove, PA). O sinal de ligação é proporcional à quantidade de anticorpo livre em equilíbrio.
[0205] A constante de dissociação de equilíbrio (KD) e a taxa de associação (Kon) são obtidas pelo ajuste da curva usando o software KinExA Pro. A taxa de dissociação (Koff) é derivada de: KD = Koff/Kon.
[0206] Como observado na TABELA 9, os anticorpos possuem afinidade elevada para ligação à IL-23 humana. Todos tiveram valores de KD na faixa baixa a sub-pM. TABELA 9. Tabela de KD (pM), taxas Kon (1/MS) e Koff (1/s).
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Exemplo 4 Determinação da estrutura usando cristalografia de raios X
[0207] Uma forma de determinar a estrutura de um complexo antígeno-anticorpo é pela utilização de cristalografia de raios X; veja, por exemplo, Harlow e Lane: “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), página 23. A estrutura cristal de IL-23 foi determinada (veja Lupardus e Garcia, J. Mol. Biol., 2008, 382: 931-941) e a estrutura cristal de um complexo IL-23/Fab foi revelada (veja Beyer e cols. J. Mol. Biol., 2008. 382(4): 942-55). A determinação estrutural de IL-23 com fragmentos de anticorpos Fab aqui reivindicada foi obtida usando cristalografia de raios X.
Proteína para cristalização
[0208] Um heterodímero de IL-23 humana derivado recombinantemente foi usado para os estudos de cristalização (veja Beyer e cols., supra). A sequência da subunidade p19 humana era composta pelos resíduos 20-189 do Id. de Seq. N°: 145, pela sequência sinalizadora do Id. de Seq. N°: 154 e por um tag 6-His do terminal C Id. de Seq. N°: 155. A sequência da subunidade p40 humana foi mutada de asparagina para glutamina na posição 222 do Id. de Seq. N°: 147 a fim de evitar glicosilação nesse sítio (Beyer, e cols., supra).
[0209] Fabs derivados de Anticorpo B e Anticorpo E foram expressos em um arcabouço de IgG1 que incorporava um sítio de clivagem de caspase. Os Fabs foram processados por meio de clivagem de protease.
Formação e cristalização de complexo
[0210] O complexo de IL-23-Fab de Anticorpo B foi feito por mistura de um excesso molar de 2X do Fab de anticorpo B com a IL-23 heterodimérica humana descrita acima. O complexo foi purificado por cromatografia por exclusão de tamanho para remover Fab de Anticorpo B em excesso e concentrado até aproximadamente 12 mg/ml para cristalização. O complexo de IL-23-Fab de Anticorpo B cristalizou em 0,1 M de Hepes pH 7, PEG 8000 8%.
[0211] O complexo de IL-23-Fab de Anticorpo E foi feito por mistura de um excesso molar de 2X do Fab de anticorpo E com a IL-23 heterodimérica humana descrita acima. O complexo foi metilado usando um Kit de Metilação JBS de acordo com as instruções do fabricante (Jena Bioscience, Jena, Alemanha). O complexo foi então tratado com PNGase para desglicosilar a proteína. Após esses tratamentos, o complexo foi purificado por cromatografia por exclusão de tamanho para remover Fab de Anticorpo E em excesso e concentrado até 13,5 mg/ml para cristalização. O complexo de IL-23-Fab de Anticorpo E cristalizou em 0,1 M de Tris pH 8,5, 0,2 M de cloreto de magnésio, PEG 400015%.
Coleta de dados e determinação da estrutura
[0212] Cristais de IL-23-Fab de Anticorpo B cresceram no grupo de espaço P21 com dimensões de célula unitária a = 70,93, b = 71,27, c = 107,37 Â, β = 104,98° e refratam até resolução de 2,0 Â. A estrutura de IL-23-Fab de Anticorpo B foi solucionada por substituição molecular com o programa MOLREP (“CCP4, The CCP4 suite: programs for protein crystallography”. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr., 1994. 50 (Parte 5): páginas 760-3) usando a estrutura de IL-23 (Beyer e cols. supra) como o modelo de pesquisa de partida. Mantendo a solução de IL-23 fixa, um domínio variável de anticorpo foi usado como um modelo de pesquisa. Mantendo a solução de IL-23-domínio variável de anticorpo fixa, um domínio constante de anticorpo foi usado como um modelo de pesquisa. A estrutura completa foi aprimorada com várias rodadas de construção do modelo com Quanta e refinamento com cnx (Brunger, e cols., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr., 1998, 54(Parte 5): páginas 905-21).
[0213] As distâncias entre átomos da proteína foram calculadas usando o programa PyMOL (DeLano, W.L. “The PyMOL Graphics System”. Palo Alto, 2002) (Schrodinger, LLC; Nova York, NY)). Aminoácidos eram escolhidos se pelo menos um átomo estivesse localizado dentro do limiar de distância necessário para a proteína parceira.
[0214] Os limites das hélices A, B, C e D da subunidade p19 de IL-23 quando ligada ao Fab de anticorpo B incluem resíduos 28-47 da hélice A, resíduos 86-105 da hélice B, resíduos 119-134 da hélice C e resíduos 154-187 da hélice D do Id. de Seq. N°: 145.
[0215] As regiões de interação na subunidade p19 de IL-23 quando ligada ao Fab de anticorpo B incluem resíduos dentro de Ser46-Glu58, Glu112-Glu123 e Pro155-Phe163 do Id. de Seq. N°: 145.
[0216] Resíduos de aminoácidos da subunidade p19 de IL-23 com átomos de 4 Â ou menos do Fab de anticorpo B incluem Ser46, Ala47, His48, Pro49, Leu50, His53, Met54, Asp55, Glu58, Pro113, Ser114, Leu115, Leu116, Pro120, Val121, Trp156, Leu159, Leu160, Arg162 e Phe163 do Id. de Seq. N°: 145. Resíduos de aminoácidos de p19 de IL-23 com átomos entre 4 Â e 5 Â do Fab de anticorpo B incluem Val51, Arg57, Glu112, Asp118, Ser119, Gln123, Pro155 do Id. de Seq. N°: 145.
[0217] Resíduos de aminoácidos subunidade de IL-23 p40 com átomos de 4 Â ou menos do Fab de anticorpo B incluem Glu122 e Lys 124 do Id. de Seq. N°: 147.
[0218] Os resíduos de aminoácidos da cadeia pesada do Fab de anticorpo B com átomos de 4 Â ou menos do heterodímero de IL-23 incluem Gly32, Gly33, Tyr34, Tyr35, His54, Asn58, Thr59, Tyr60, Lys66, Arg101, Gly102, Phe103, Tyr104 e Tyr105 do Id. de Seq. N°: 46. Os resíduos de aminoácidos da cadeia pesada do Fab de anticorpo B com átomos < 5 Â do heterodímero de IL-23 incluem Ser31, Gly32, Gly33, Tyr34, Tyr35, His54, Ser56, Asn58, Thr59, Tyr60, Lys66, Arg101, Gly102, Phe103, Tyr104 e Tyr105 do Id. de Seq. N°: 46.
[0219] Os resíduos de aminoácidos da cadeia leve do Fab de anticorpo B com átomos de 4 Â ou menos do heterodímero de IL-23 incluem Ser30, Ser31, Trp32, Tyr49, Ser52, Ser53, Ala91, Asn92, Ser93, Phe94 e Phe96 do Id. de Seq. N°: 15. Os resíduos de aminoácidos da cadeia leve do Fab de anticorpo B com átomos < 5 Â do heterodímero de IL- 23 incluem Ser30, Ser31, Trp32, Tyr49, Ala50, Ser52, Ser53, Ser56, Ala91, Asn92, Ser93, Phe94 e Phe96 do Id. de Seq. N°: 15
[0220] Os cristais do complexo de IL-23-Fab de Anticorpo E cresceram no grupo de espaço P2221 com dimensões de célula unitária a = 61,60, b = 97,59, c = 223,95 Â e refratam até resolução de 3,5 Â. A estrutura do complexo de IL-23-Fab de Anticorpo E foi solucionada por substituição molecular com o programa Phaser (CCP4, supra) usando a estrutura de IL-23, um domínio variável de anticorpo e um domínio constante de anticorpo como os três modelos de pesquisa de partida, como descrito acima. A estrutura completa foi aprimorada com várias rodadas de construção do modelo com Quanta e refinamento com cnx (Brunger, e cols., supra). O domínio constante do Fab de anticorpo E foi deixado fora da estrutura refinada final em função da densidade de elétrons muito baixa para aquela porção da proteína.
[0221] As regiões de interação na subunidade p19 de IL-23 identificadas quando ligada ao Fab de anticorpo E incluem resíduos dentro de Ser46-His53, Glu112-Val120 e Trp156-Phe163 do Id. de Seq. N°: 145.
[0222] Os resíduos de aminoácidos de IL-23p19 com átomos de 4 Â ou menos do Fab de anticorpo E incluem Ser46, Ala47, His48, Pro49, Leu50, Glu112, Pro113, Ser114, Leu115, Leu116, Pro117, Asp118, Ser119, Pro120, Trp156, Leu159, Leu160 e Phe163 do Id. de Seq. N°: 145. Os resíduos de aminoácidos de IL-23p19 com átomos entre 4 Â e 5 Â do Fab de anticorpo E incluem His53 do Id. de Seq. N°: 145.
[0223] Os resíduos de aminoácidos de IL-23p40 com átomos de 4 Â ou menos do Fab de anticorpo E incluem Lys121, Glu122, Pro123 e Asn 125 do Id. de Seq. N°: 147.
[0224] Os resíduos de aminoácidos da cadeia pesada do Fab de anticorpo E com átomos de 4 Â ou menos do heterodímero de IL-23 incluem Gly26, Phe27, Thr28, Ser31, Tyr53, Tyr59, Tyr102, Ser104, Ser105, Trp106, Tyr107 e Pro108 do Id. de Seq. N°: 31. Os resíduos de aminoácidos da cadeia pesada do Fab de anticorpo E com átomos < 5 Â do heterodímero de IL-23 incluem Gln1, Gly26, Phe27, Thr28, Ser30, Ser31, Tyr32, Trp52, Tyr53, Tyr59, Arg100, Tyr102, Thr103, Ser104, Ser105, Trp106, Tyr107 e Pro108 do Id. de Seq. N°: 31.
[0225] Os resíduos de aminoácidos da cadeia leve do Fab de anticorpo E com átomos de 4 Â ou menos do heterodímero de IL-23 incluem Ala31, Gly32, Tyr33, Asp34, Tyr51, Gly52, Asn55, Lys68 e Tyr93 do Id. de Seq. N°: 1. Os resíduos de aminoácidos da cadeia leve do Fab de anticorpo B com átomos < 5 Â do heterodímero de IL-23 incluem Thr29, Ala31, Gly32, Tyr33, Asp34, Tyr51, Gly52, Asn55, Lys68, Tyr93 e Trp100 do Id. de Seq. N°: 1.
Exemplo 5 Determinação dos resíduos de contato do complexo de IL-23- Anticorpo por meio de diferenças de área de superfície acessível ao solvente
[0226] Os resíduos de contato no paratopo (a porção do anticorpo que reconhece o antígeno) e na porção do antígeno que a que se liga quando ligada pelo paratopo em um complexo de IL-23 humana-Fab de Anticorpo B e em um complexo de IL-23 humana-Fab de Anticorpo E foram determinados usando diferenças da área de superfície acessível pelo solvente. Os cálculos da área de superfície acessível ao solvente foram realizados usando “Molecular Operating Environment” (Chemical Computing Grupo, Montreal, Quebec).
[0227] As diferenças da área de superfície acessível ao solvente dos resíduos do paratopo no complexo de IL-23-Fab de Anticorpo B foram calculadas por ajuste do resíduos do Fab de anticorpo B como o conjunto desejado. A informação estrutural obtida no Exemplo 4 para o complexo de IL-23-Fab de Anticorpo B foi usada e as áreas de superfície acessíveis ao solvente do resíduo dos resíduos de aminoácidos do Fab de anticorpo B na presença do heterodímero de IL-23 foram calculadas e representam as “áreas-limites” para o conjunto.
[0228] As áreas de superfície acessíveis ao solvente do resíduo de cada um dos resíduos do Fab de anticorpo B na ausência de antígeno de IL-23 foram calculadas e representam as “áreas livres” do conjunto.
[0229] As “áreas-limites” foram então subtraídas das “áreas livres” resultando na “diferença da área de superfície exposta ao solvente” para cada resíduo no conjunto. Os resíduos do Fab de anticorpo B que não tiveram alteração na área de superfície, ou uma diferença zero, não tiveram contato com os resíduos do antígeno de IL-23 quando em complexo. Os resíduos do Fab de anticorpo B que tinham um valor de diferença > 10 A2 foram considerados como estando em contato significante com resíduos no antígeno de IL-23 de tal forma que esses resíduos de Fab de Anticorpo B eram pelo menos parcial a completamente ocluídos quando o Fab de anticorpo B estava ligado à IL-23 humana. Esse conjunto de resíduos de Fab de Anticorpo B constitui o “trecho coberto”, os resíduos envolvidos na estrutura da interface quando Fab de Anticorpo B está ligado à IL-23 humana; veja as Tabelas 10 e 11. Os resíduos do Fab de anticorpo B nesse trecho coberto podem não estar envolvidos em interações de ligação com resíduos do antígeno de IL-23, mas a mutação de qualquer resíduo único dentro do trecho coberto poderia introduzir diferenças energéticas que teriam impacto sobre a ligação de Fab de Anticorpo B à IL- 23 humana. Com exceção de Tyr49, todos os resíduos estão localizados nas regiões de CDR das cadeias leves e pesadas do Fab de anticorpo B. Esses resíduos também estavam dentro de 5 Â ou menos do antígeno de IL-23 quando ligada ao Fab de anticorpo B, como descrito no Exemplo 4. TABELA 10. Diferenças na área de superfície de acessibilidade ao solvente para cadeia leve de Fab de Anticorpo B.
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TABELA 11. Diferenças na área de superfície de acessibilidade ao solvente para cadeia pesada de Fab de Anticorpo B.
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[0230] As diferenças da área de superfície acessível ao solvente dos resíduos no complexo de IL-23-Fab de Anticorpo E foram calculadas como descrito acima. Os resíduos do Fab de anticorpo E que tinham um valor de diferença > 10 Â2 foram considerados como estando em contato significante com resíduos no antígeno de IL-23 e esses resíduos de Fab de Anticorpo E eram pelo menos parcial a completamente ocluídos quando o Fab de anticorpo E estava ligado à IL-23 humana. Esse conjunto de resíduos de Fab de Anticorpo E constitui o trecho coberto, os resíduos envolvidos na estrutura da interface quando o Fab de anticorpo E está ligado à IL-23 humana; veja as Tabelas 12 e 13. Os resíduos do Fab de anticorpo E nesse trecho coberto podem não estar envolvidos em interações de ligação com resíduos do antígeno de IL-23, mas a mutação de qualquer resíduo único dentro do trecho coberto poderia introduzir diferenças energéticas que teriam impacto sobre a ligação de Fab de Anticorpo E à IL-23 humana. Para a maior parte, esses resíduos do trecho coberto estavam localizados dentro das regiões de CDR das cadeias pesadas e leves do Fab de anticorpo E. Esses resíduos também estavam dentro de 5Â ou menos do antígeno de IL-23 quando ligada ao Fab de anticorpo E, como descrito no Exemplo 4. TABELA 12. Diferenças na área de superfície de acessibilidade ao solvente para cadeia leve de Fab de Anticorpo E.
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TABELA 13. Diferenças na área de superfície de acessibilidade ao solvente para cadeia pesada de Fab de Anticorpo E.
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[0231] As diferenças da área de superfície acessível ao solvente da porção do heterodímero de IL-23 ligada pelo paratopo do Fab de anticorpo B foram calculadas por ajuste dos resíduos do heterodímero de IL-23 como o conjunto desejado. A informação estrutural obtida no Exemplo 4 para o complexo de Fab de anticorpo B-IL-23 foi usada e a área de superfície acessível ao solvente do resíduo dos resíduos de aminoácidos do heterodímero de IL- 23 na presença do Fab de anticorpo B foram calculadas e representam as áreas-limites para o conjunto.
[0232] As áreas de superfície acessíveis ao solvente do resíduo de cada um dos resíduos do heterodímero de IL-23 na ausência do Fab de anticorpo B foram calculadas e representam as áreas livres do conjunto.
[0233] Como acima descrito, as áreas-limites foram subtraídas das áreas livres, resultando na diferença da área de superfície exposta ao solvente para cada resíduo de IL-23. Os resíduos do heterodímero de IL-23 que não tiveram alteração na área de superfície, ou uma diferença zero, não tiveram contato com os resíduos do Fab de anticorpo B quando em complexo. Os resíduos do heterodímero de IL-23 que tinham um valor de diferença Â2 foram considerados como estando em contato significante com resíduos do Fab de anticorpo B e esses resíduos do heterodímero de IL-23 eram pelo menos parcial a completamente ocluídos quando o heterodímero de IL-23 humana estava ligado ao Fab de anticorpo B. Esse conjunto de resíduos do heterodímero de IL-23 constitui o trecho coberto, os resíduos envolvidos na estrutura da interface quando o heterodímero de IL-23 humana está ligado ao Fab de anticorpo E; veja a Tabela 14. Nem todos os resíduos do heterodímero de IL-23 nesse trecho coberto podem estar envolvidos em interações de ligação com resíduos on o Fab de anticorpo B, mas a mutação de qualquer resíduo único dentro do trecho coberto poderia introduzir diferenças energéticas que teriam impacto sobre a ligação de Fab de Anticorpo B à IL-23 humana. Esses resíduos também estão dentro de 4 Â ou menos do Fab de anticorpo B, como descrito no Exemplo 4. TABELA 14. Diferenças da área de superfície de acessibilidade ao solvente para resíduos do heterodímero de IL-23.
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[0234] As diferenças da área de superfície acessível ao solvente da porção do heterodímero de IL-23 ligada pelo paratopo do Fab de anticorpo E foram calculadas como descrito acima. Os resíduos do heterodímero de IL-23 que tinham um valor de diferença > 10 Â2 foram considerados como estando em contato significante com resíduos do Fab de anticorpo E, e esses resíduos do heterodímero de IL-23 eram pelo menos parcial a completamente ocluídos quando o heterodímero de IL-23 humana estava ligado ao Fab de anticorpo E. Esse conjunto de resíduos do heterodímero de IL-23 constitui o trecho coberto, os resíduos envolvidos na estrutura da interface quando o heterodímero de IL-23 humana está ligado ao Fab de anticorpo E; veja a Tabela 15. Nem todos os resíduos do heterodímero de IL-23 nesse trecho coberto podem estar envolvidos em interações de ligação com resíduos on o Fab de anticorpo E, mas a mutação de qualquer resíduo único dentro do trecho coberto poderia introduzir diferenças energéticas que teriam impacto sobre a ligação de Fab de Anticorpo E à IL-23 humana. Esses resíduos também estão dentro de 5 Â ou menos do Fab de anticorpo E, como descrito no Exemplo 4. TABELA 15. Diferenças da área de superfície de acessibilidade ao solvente para resíduos do heterodímero de IL-23.
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Claims (12)

1. Proteína de ligação de antígeno isolada recombinante que liga IL-23, caracterizada por compreender, pelo menos, uma região variável de cadeia pesada compreendendo: uma CDRH1 de Id. de Seq. N°: 109; uma CDRH2 de Id. de Seq. N°: 116; e uma CDRH3 de Id. de Seq. N°: 111; e pelo menos uma região variável de cadeia leve compreendendo: uma CDRL1 de Id. de Seq. N°: 80; uma CDRL2 de Id. de Seq. N°: 81; e uma CDRL3 de Id. de Seq. N°: 76.
2. Proteína de ligação de antígeno isolada recombinante que liga IL-23 caracterizada por compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo resíduos de aminoácidos 31-37, 52-67 e 100-109 de Id. de Seq. N°: 46; e uma região variável de cadeia leve compreendendo resíduos de aminoácidos 24-34, 50-56 e 89-97 de Id. de Seq. N°: 15.
3. Proteína de ligação de antígeno isolada recombinante que liga IL-23 caracterizada por compreender: uma região variável de cadeia pesada de Id. de Seq. N°: 46; e uma região variável de cadeia leve de Id. de Seq. N°: 15.
4. Proteína de ligação de antígeno isolada recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a referida proteína de ligação de antígeno tem pelo menos uma propriedade selecionada do grupo que consiste em: a) redução de atividade de IL-23 humana; b) redução da produção de uma citocina pró- inflamatória; c) ligação a IL-23 humana com uma KD <5x10—8 M; d) possuindo uma taxa de Koff <5 x 10-6 1/s; e e) possuindo uma IC50 <400 pM.
5. Composição farmacêutica caracterizada por compreender pelo menos uma proteína de ligação de antígeno recombinante, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, e excipiente farmaceuticamente aceitável.
6. Composição farmacêutica caracterizada por compreender pelo menos uma proteína de ligação de antígeno recombinante, conforme definida na reivindicação 4, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
7. Molécula de ácido nucleico isolada recombinante caracterizada pelo fato de que o ácido nucleio codifica a região variável de cadeia pesada de Id. de Seq. N°: 47; e o ácido nucleico codifica a região variável de cadeia leve de Id. de Seq. N°: 16.
8. Molécula de ácido nucleico isolada recombinante, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a referida molécula de ácido nucleio é operacionalmente ligada a uma sequência de controle.
9. Vetor recombinante caracterizado por compreender uma molécula de ácido nucleico conforme definida na reivindicação 7.
10. Método de confecção da proteína de ligação de antígeno recombinante que liga IL-23, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por compreender a etapa de preparar a referida a referida proteína de ligação ao antígeno recombinante a partir de uma célula hospedeira, que compreende o vetor recombinante, conforme definido na reivindicação 9, em que a referida célula hospedeira compreende ácido nucleico que codifica tanto a região variável da cadeia pesada quanto a região variável da cadeia leve da proteína de ligação ao antígeno.
11. Uso de pelo menos uma proteína de ligação de antígeno isolada recombinante, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma condição associada com IL-23 em um paciente.
12. Uso de pelo menos uma proteína de ligação de antígeno recombinante, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para redução de atividade de IL-23 em um paciente.
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