BR112021014898A2 - Derivados de desoxicitidina ou uridina para uso em terapias de câncer - Google Patents

Derivados de desoxicitidina ou uridina para uso em terapias de câncer Download PDF

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Abstract

derivados de desoxicitidina ou uridina para uso em terapias de câncer. a presente invenção se refere a um composto da fórmula (i), ou um estereoisômero, solvato, tautômero ou sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos, em que x, w1, w2, y, z, r1, r2 e r3 são como definido na revelação no presente documento, para uso em terapia, particularmente para uso no tratamento de câncer. a presente invenção também se refere a métodos para tratar câncer que compreendem a administração de um composto da fórmula (i) a um indivíduo em necessidade do mesmo e a composições farmacêuticas e kits que compreendem tais compostos.

Description

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DERIVADOS DE DESOXICITIDINA OU URIDINA PARA USO EM TERAPIAS DE CÂNCER
[001] A presente invenção se refere a compostos para uso em terapia, particularmente no tratamento ou prevenção do câncer. A invenção também se refere a formulações farmacêuticas que compreendem tais compostos e ao uso de tais formulações farmacêuticas em terapia, particularmente no tratamento ou prevenção do câncer. Esta invenção se refere também a tais compostos para tratamento combinado com agentes anticâncer conhecidos. Assim, a invenção se refere ao uso, no tratamento ou prevenção de câncer, dos compostos da invenção tanto sozinhos quanto em combinação com um ou mais agentes anticâncer adicionais. A invenção também se refere a métodos para tratamento ou prevenção de câncer usando os compostos da invenção, ou sozinhos ou em combinação com um ou mais agentes anticâncer.
[002] O câncer é uma doença distinguida pela perda de controle adequado do crescimento e da proliferação celular. A Sociedade Americana do Câncer estimou que houve mais de 1,5 milhão de novos casos de câncer dentro dos Estados Unidos da América em 2010 e aproximadamente 570.000 óbitos nesse ano estimados como atribuíveis ao câncer. A Organização Mundial da Saúde estimou que o câncer foi a causa principal de óbito globalmente em 2010, com o número de óbitos causado pelo câncer crescendo para 12 milhões por ano até 2030.
[003] Embora existam inúmeras terapias disponíveis, a resistência a fármacos anticâncer conhecidos pode ser um problema no tratamento bem- sucedido do câncer nos pacientes. Permanece a necessidade de terapias contra câncer adicionais.
[004] Em alguns contextos, agentes anticâncer capazes de exterminar uma ampla gama de tipos de células cancerosas são desejáveis.
2 / 108 Fluorouracil (5-FU) é um agente anticâncer desse tipo, administrado rotineiramente para o tratamento de uma ampla gama de cânceres.
[005] No entanto, muitos agentes anticâncer que são capazes de exterminar uma ampla gama de tipos de células cancerosas também exterminam células não cancerosas, por exemplo, células normais e saudáveis que estão se dividindo. Isso é problemático em alguns contextos, então também há a necessidade de agentes anticâncer amplamente citotóxicos que não sejam citotóxicos contra células não cancerosas. Adicionalmente, há a necessidade de agentes anticâncer com mais citotoxicidade específica, isto é, que exterminem uma gama menor de tipos de células cancerosas. Tais agentes anticâncer mais específicos têm menos probabilidade de possuírem efeitos fora do alvo indesejáveis.
[006] O glioblastoma multiforme é o câncer mais comum e agressivo do sistema nervoso central. O glioblastoma multiforme é o segundo câncer mais comum em crianças. Os adultos diagnosticados com glioblastoma multiforme têm algumas das maiores necessidades não atendidas na oncologia. Com os tratamentos disponíveis atualmente, a sobrevivência média a partir do diagnóstico é de 14,6 meses. Menos de 5% dos pacientes diagnosticados com glioblastoma multiforme sobrevivem por mais do que 5 anos. A sobrevivência a longo prazo após o diagnóstico de glioblastoma multiforme é rara e é mais comum em crianças.
[007] As terapias de hoje em dia são em grande parte paliativas e projetadas para melhorar a qualidade de vida. Após o diagnóstico, o tratamento de glioblastoma multiforme atual segue um curso similar: resseção cirúrgica da área cerebral afetada, em que se espera que o paciente sobreviva à cirurgia, seguida de radiação e quimioterapias. O glioblastoma multiforme forma estruturas semelhantes a tentáculos no cérebro afligido; portanto, mesmo quando indicada, a resseção cirúrgica completa é desafiadora e muitas
3 / 108 vezes impossível. Além de intervenção cirúrgica e radioterapia, três fármacos são aprovados para tratamento de glioblastoma multiforme:
[008] Avastin (RTM) (bevacizumabe) – um inibidor de angiogênese com múltiplas indicações oncológicas. Acredita-se que o Avastin (RTM) inibe o crescimento tumoral pela inibição do desenvolvimento de novos vasos sanguíneos dentro dos tumores, efetivamente matando o tumor de fome. O Avastin (RTM) é aprovado nos EUA e no Japão; no entanto, o Avastin (RTM) não é aprovado para o tratamento de GBM na UE. De fato, os ensaios da fase II indicaram que o Avastin (RTM) não produziu um benefício de sobrevida global (NCI 06-C-0064E). Embora o Avastin (RTM) melhore ligeiramente a sobrevida livre de progressão em alguns ensaios, o benefício do paciente é muitas vezes insignificante e não há nenhum benefício proporcionado pelo tratamento com Avastin (RTM) em pacientes com glioblastoma multiforme recorrente.
[009] Temozolomida (Temodal (RTM)/Temodar (RTM)) ( 4-metil-5-oxo- 2,3,4,6,8-pentazabiciclo[4.3.0]nona-2,7,9-trieno-9-carboxamida) – um agente alquilante de DNA mutagênico; formulações genéricas também estão disponíveis. Acredita-se que a temozolomida inibe o crescimento do glioblastoma multiforme pela mutação severa do DNA tumoral que induz à morte celular. Devido ao mecanismo de ação, as células que expressam a proteína de reparo de DNA MGMT são quase universalmente resistentes ao tratamento com temozolomida. O tratamento com temozolomida melhora a sobrevida global em 2,5 meses. Ao mesmo tempo, o tratamento com temozolomida muitas vezes causa efeitos colaterais significativos. A temozolomida é o tratamento primário para glioblastoma multiforme.
[0010] 3) Gliadel (RTM) (wafer de Carmustina) (1,3-Bis(2-cloroetil)-1- nitrosoureia) – uma mostarda nitrogenada citotóxica. É fornecido como um disco biodegradável implantado diretamente no cérebro após resseção cirúrgica. Um ensaio randomizado demonstrou que o Gliadel (RTM) melhora
4 / 108 a sobrevida média em 2,1 meses. Os pacientes tratados com Gliadel (RTM) relatam efeitos colaterais em menor quantidade e menos graves do que os pacientes tratados com temozolomida; no entanto, em comparação com a temozolomida, a sobrevida global é reduzida.
[0011] Permanece a necessidade de agentes anticâncer adicionais para o tratamento de glioblastoma multiforme e outros cânceres. Em particular, permanece a necessidade de agentes anticâncer que tratem efetivamente cânceres que sejam resistentes ao tratamento com Temozolomida.
[0012] A proteína humana citidina desaminase (CDA) catalisa a desaminação hidrolítica de citidina e desoxicitidina para formar uridina e desoxiuridina, respectivamente.Alguns agentes anticâncer conhecidos são análogos de nucleosídeo/nucleotídeo, por exemplo, gemcitabina (2,2- difluorodesoxicitidina) e citarabina (Ara-C, citosina arabinosídeo). A CDA inativa, problematicamente, tais agentes anticâncer, incluindo a gemcitabina e a citarabina. Permanece a necessidade de agentes anticâncer adicionais que não sejam inativados pela CDA.
[0013] Os presentes inventores constataram uma classe selecionada de compostos que apresentam uma atividade no tratamento de glioblastoma multiforme e uma ampla gama de outros cânceres. Tais compostos são adequados para inibir a proliferação de células tumorais em geral e, em particular, as associadas a cânceres do cérebro, particularmente o glioblastoma multiforme.
[0014] Em um primeiro aspecto, a invenção provê um composto da fórmula (I):
5 / 108
Fórmula (I) ou um estereoisômero, solvato, tautômero ou sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos para uso em terapia; em que: X é um grupo contendo de 1 a 20 átomos de não hidrogênio, que contém pelo menos um grupo funcional selecionado dentre um aldeído, um álcool, um álcool protegido, um éter, um éster e um ácido carboxílico, com a condição de que X não seja -COOH; W1 e W2 são, cada um, independentemente O, S ou NH; Y é H ou um grupo contendo de 1 a 15 átomos de não hidrogênio; Z é -OPG, -ORz ou -N(RxRy), em que Rx, Ry e Rz são independentemente H ou um grupo contendo de 1 a 10 átomos de não hidrogênio; R1 é H ou um grupo contendo de 1 a 15 átomos de não hidrogênio; R2 é H, -OH, -OPG, -F, -Cl, -Br, -I, ou -N3; e R3 é H, -F, -Cl, -Br, -I, ou -N3; em que PG é um grupo protetor de álcool, tal como acetila (Ac), benzila (Bn) ou benzoíla (Bz).
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[0015] Os compostos da invenção são particularmente para uso no tratamento ou prevenção de câncer. Assim, em um primeiro aspecto, a presente invenção provê um composto da fórmula (I): Fórmula (I) ou um estereoisômero, solvato, tautômero ou sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos para uso no tratamento ou prevenção de câncer; em que: X é um grupo contendo de 1 a 20 átomos de não hidrogênio, que contém pelo menos um grupo funcional selecionado dentre um aldeído, um álcool, um álcool protegido, um éter, um éster e um ácido carboxílico, com a condição de que X não seja -COOH; W1 e W2 são, cada um, independentemente O, S ou NH; Y é H ou um grupo contendo de 1 a 15 átomos de não hidrogênio; Z é -OPG, -ORz ou -N(RxRy), em que Rx, Ry e Rz são independentemente H ou um grupo contendo de 1 a 10 átomos de não hidrogênio; R1 é H ou um grupo contendo de 1 a 15 átomos de não hidrogênio; R2 é H, -OH, -OPG, -F, -Cl, -Br, -I, ou -N3; e
7 / 108 R3 é H, -F, -Cl, -Br, -I, ou -N3; em que PG é um grupo protetor de álcool, tal como acetila (Ac), benzila (Bn) ou benzoíla (Bz).
[0016] A presente invenção é aplicável a qualquer câncer. O câncer é definido amplamente no presente documento como incluindo qualquer afecção neoplásica e inclui, particularmente, afecções malignas ou pré- malignas. O câncer pode causar ou resultar ou se manifestar em tumores sólidos, mas não se limita a estes, e inclui também cânceres do sistema hemopoiético. Em todo o documento, os termos "câncer" e "células cancerosas" são usados de forma intercambiável. Em todo o documento, os termos "tumor" e "células tumorais" são usados de forma intercambiável. Tumores benignos e tumores malignos também estão incluídos no termo câncer conforme usado no presente documento, isto é, os termos câncer e tumor são usados de forma intercambiável. O tratamento de tumores malignos é preferido.
[0017] Assim, vista de maneira alternativa, a presente invenção provê um composto da fórmula (I) para uso no tratamento ou prevenção de um tumor.
[0018] Vista de maneira alternativa, a presente invenção provê um composto da fórmula (I) para uso como um agente anticâncer. Vista de maneira alternativa, a presente invenção provê o uso de um composto da fórmula (I) para tratamento ou prevenção de câncer.
[0019] Vista de maneira alternativa, a presente invenção provê um composto da fórmula (I) para uso como um agente antitumor. Vista de maneira alternativa, a presente invenção provê o uso de um composto da fórmula (I) para tratamento ou prevenção de um tumor.
[0020] Visto de maneira alternativa, esse aspecto da presente invenção provê o uso de um composto da fórmula (I) na fabricação de um produto terapêutico anticâncer (isto é, uma preparação ou medicamento, por exemplo,
8 / 108 uma composição farmacêutica, formulação, produto combinado, produto coformulado, ou kit), ou dito de outra forma, para a fabricação de um medicamento para uso como um agente anticâncer ou no tratamento ou prevenção de câncer.
[0021] Visto de maneira alternativa, esse aspecto da presente invenção provê o uso de um composto da fórmula (I) na fabricação de um produto terapêutico antitumor (isto é, uma preparação ou medicamento, por exemplo, uma composição farmacêutica, formulação, produto combinado, produto coformulado, ou kit), ou dito de outra forma, para a fabricação de um medicamento para uso como um agente antitumor ou no tratamento ou prevenção de um tumor.
[0022] Em um outro aspecto, a presente invenção provê também um método para tratamento ou prevenção de câncer em um indivíduo, método esse que compreende administrar um composto da fórmula (I) ao dito indivíduo.
[0023] Em um outro aspecto, a presente invenção provê também um método para tratamento ou prevenção de um tumor em um indivíduo, método esse que compreende administrar um composto da fórmula (I) ao dito indivíduo.
[0024] Em algumas modalidades preferidas da presente invenção, o composto da fórmula (I) é usado como o único agente ativo (único agente ativo no regime de tratamento). Assim, em algumas modalidades preferidas, o tratamento é uma monoterapia. A monoterapia se refere ao uso de um só fármaco para tratar uma doença ou afecção, nesse caso, câncer (isto é, um tumor). Assim, em algumas modalidades preferidas, o composto da fórmula (I) é usado sozinho. Por "único agente ativo" (ou único ingrediente ativo) quer-se dizer o único agente ou ingrediente que é terapeuticamente ativo (ou biologicamente ativo). Assim, componentes tais como conservantes ou
9 / 108 excipientes ou agentes que não sejam relevantes à doença sendo tratada não são considerados como sendo agentes ativos.
[0025] No tratamento ou prevenção de câncer (isto é, um tumor), o composto da fórmula (I) pode ser usado sozinho ou opcionalmente em combinação com um ou mais outros agentes anticâncer (isto é, um agente anticâncer adicional ou um segundo agente anticâncer).
[0026] O composto da fórmula (I), ou sozinho ou em combinação com um outro agente anticâncer, pode ser usado de acordo com a presente invenção em qualquer método de tratamento ou prevenção de câncer (isto é, de um tumor) em um indivíduo.
[0027] Como demonstrado nos Exemplos, o uso de um composto da fórmula (I) em combinação com um ou mais outros agentes anticâncer resulta em efeitos citotóxicos sinérgicos.
[0028] Por conseguinte, em um outro aspecto, a presente invenção provê um composto da fórmula (I) junto com um outro agente anticâncer para uso no tratamento ou prevenção de câncer (isto é, um tumor) ou, dito de outra forma, um composto da fórmula (I) para uso junto com um outro agente anticâncer para tratamento ou prevenção de câncer (isto é, um tumor).
[0029] Visto de maneira alternativa, esse aspecto da presente invenção provê o uso de um composto da fórmula (I) na fabricação de um produto terapêutico anticâncer (isto é, antitumor) (isto é, uma preparação ou medicamento, por exemplo, uma composição farmacêutica, formulação, produto combinado ou kit), ou dito de outra forma, para a fabricação de um medicamento para uso como um agente anticâncer (isto é, antitumor) ou no tratamento ou prevenção de câncer (isto é, de um tumor), em que o dito tratamento compreende adicionalmente a administração de um outro agente anticâncer.
[0030] Em um outro aspecto, a presente invenção provê também um método para tratamento ou prevenção de câncer (isto é, um tumor) em um
10 / 108 indivíduo, método esse que compreende administrar um composto da fórmula (I), opcionalmente junto com um outro (isto é, um segundo) agente anticâncer, ao dito indivíduo. Particularmente, nesse aspecto o método compreende administrar uma quantidade eficaz do dito composto da fórmula (I) e o outro agente anticâncer opcional.
[0031] O composto da fórmula (I) e o(s) outro(s) agente(s) anticâncer podem ser coformulados em uma só composição. No entanto, isso não é necessário. O medicamento pode ser uma preparação combinada, uma composição ou um kit, etc. e não é necessário em qualquer um dos aspectos da invenção que o composto da fórmula (I) e o(s) outro(s) agente(s) anticâncer sejam coformulados em uma só composição – eles podem ser formulados separadamente e podem ser administrados separadamente, incluindo de maneira sequencial ou simultânea.
[0032] Por conseguinte, a invenção também provê um kit que compreende um composto da fórmula (I) e outro(s) (isto é, um ou mais outros ou segundos) agente(s) anticâncer para usar no tratamento ou prevenção de câncer (isto é, de um tumor).
[0033] Mais particularmente, a invenção provê um produto (em particular um produto farmacêutico) que compreende um composto da fórmula (I) e outro(s) (isto é, um ou mais outros ou segundos) agente(s) anticâncer como uma preparação combinada para uso separado, sequencial ou simultâneo no tratamento ou prevenção de câncer. (isto é, de um tumor).
[0034] Adicionalmente, a presente invenção provê um produto (particularmente um produto farmacêutico) que compreende um composto da fórmula (I) coformulado com outro(s) (isto é, um ou mais outros ou segundos) agente(s) anticâncer.
[0035] A presente invenção provê uma composição farmacêutica que compreende um composto da fórmula (I) e um ou mais excipientes
11 / 108 farmaceuticamente aceitável, que compreende opcionalmente um outro agente anticâncer.
[0036] Em relação a todos os aspectos da invenção, o composto da invenção é o composto da fórmula (I) como descrito em outra parte do presente documento, e as modalidades preferidas e opcionais referentes ao composto descrito em relação a um aspecto da invenção se aplicam mutatis mutandis a cada outro aspecto da invenção.
[0037] Em todos os aspectos e modalidades da invenção, o tratamento de tumores malignos é preferido.
X
[0038] X é um grupo contendo de 1 a 20 átomos de não hidrogênio, que contém pelo menos um grupo funcional selecionado dentre um aldeído, um álcool, um álcool protegido, um éter, um éster e um ácido carboxílico, com a condição de que X não seja -COOH.
[0039] Preferivelmente, X é um grupo que contém de 1 a 10 átomos de não hidrogênio, mais preferivelmente de 1 a 5 átomos de não hidrogênio, ainda mais preferivelmente de 1 a 3 átomos de não hidrogênio e, o mais preferivelmente, 1 átomos de não hidrogênio.
[0040] Mais preferivelmente, X é um grupo que contém pelo menos 2 átomos de não hidrogênio, isto é, um grupo que contém de 2 a 20 átomos de não hidrogênio. Assim, preferivelmente, X é um grupo que contém de 2 a 10 átomos de não hidrogênio, ainda mais preferivelmente de 2 a 5 átomos de não hidrogênio, ainda mais preferivelmente de 2 a 3 átomos de não hidrogênio e, o mais preferivelmente, 2 átomos de não hidrogênio.
[0041] Preferivelmente, X contém pelo menos um grupo funcional selecionado dentre um aldeído, um álcool, um álcool protegido, um éter e um éster. Mais preferivelmente, X contém pelo menos um grupo funcional selecionado dentre um aldeído, um álcool, um éter e um éster. O mais preferivelmente, X contém pelo menos um grupo funcional selecionado
12 / 108 dentre um aldeído e um álcool. Por exemplo, X preferivelmente contém um grupo funcional aldeído. Por exemplo, X preferivelmente contém um grupo funcional álcool.
[0042] Preferivelmente, X contém apenas um grupo funcional.
[0043] Preferivelmente, X é um grupo como definido no presente documento, com a condição de que X não seja -COOH ou -OH.
[0044] X pode ser definido como -L-X’, em que:
[0045] L é uma ligação, alquila, alquenila, alquinila, haloalquila, alcóxi, haloalcóxi; e
[0046] X' é -CHO, -OH, -OPG, -COOH, -OR, -OC(=O)R ou -C(=O)OR, em que PG é um grupo protetor de álcool, tal como acetila (Ac), benzila (Bn) ou benzoíla (Bz), e em que R é um grupo alquila, preferivelmente metila.
[0047] O termo "alquila" se refere a cadeias de hidrocarboneto alifáticas saturadas lineares e ramificadas. Preferivelmente, alquila se refere a alquila C1-10. Grupos alquila exemplificativos incluem, mas não se limitam a, metila (Me), etila (Et), propila (por exemplo, n-propila e isopropila), butila (por exemplo, n-butila, isobutila, t-butila), e pentila (por exemplo, n-pentila, isopentila, neopentila).
[0048] R pode ser qualquer grupo alquila, tal como os exemplificados acima. Por exemplo, R pode ser -(CH2)nH, em que n é de 1 a 10, preferivelmente de 1 a 5, mais preferivelmente de 1 a 3, e o mais preferivelmente 1. Quando n é 1, R é CH3.
[0049] O termo "alquenila" se refere a cadeias de hidrocarboneto lineares ou ramificadas com uma ou mais, preferivelmente uma ou duas, ligações duplas de carbono-carbono. Preferivelmente, alquenila se refere a alquenila C2-10. Exemplos de grupos alquenila incluem, mas não se limitam a, etenila, 1-propenila, 2-propenila, 2-butenila, 3-butenila, 2-pentenila, 3-pentenila, 4-pentenila, 2-hexenila, 3-hexenila, 4-hexenila, 5-hexenila, 2-metil-2-propenila, e 4-metil-3-pentenila.
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[0050] O termo "alquinila" se refere a cadeias de hidrocarboneto lineares ou ramificadas com uma ou mais, preferivelmente uma ou duas, ligações triplas de carbono-carbono. Preferivelmente, alquinila se refere a alquinila C2-10. Exemplos de grupos alquinila incluem, mas não se limitam a, etinila, propinila e propargila.
[0051] O termo "haloalquila" se refere a cadeias de hidrocarboneto alifáticas saturadas lineares e ramificadas substituídas com 1 ou mais halogênios (fluoro (F), cloro (Cl), bromo (Br) e iodo (I)). Preferivelmente, haloalquila se refere a haloalquila C1-10. Exemplos de grupos haloalquila incluem, mas não se limitam a, fluorometila, difluorometila, trifluorometila, triclorometila, pentafluoroetila, pentacloroetila, 2,2,2 -trifluoroetila, heptafluoropropila e heptacloropropila.
[0052] O termo "alcóxi" se refere a um grupo -O-alquila.
Preferivelmente, alcóxi se refere a alcóxi C1-10. Grupos alcóxi exemplificativos incluem, mas não se limitam a, metóxi, etóxi, propóxi (por exemplo, n-propóxi e isopropóxi) e t-butóxi.
[0053] O termo "haloalcóxi" se refere a um grupo haloalquila como definido acima afixado por uma ponte de oxigênio. Preferivelmente, haloalcóxi se refere a haloalcóxi C1-10. Exemplos de grupos haloalcóxi incluem, mas não se limitam a, trifluorometóxi, 2,2,2 -trifluoroetóxi e pentafluorotóxi.
[0054] Quando X é -L-X’, o grupo X precisa ainda assim conter o número necessário de átomos de não hidrogênio.
[0055] Preferivelmente, L é uma ligação, alquila, alquenila ou alquinila, mais preferivelmente uma ligação ou alquila. Por exemplo, L pode ser uma ligação ou alquila C1-6. Mais preferivelmente, L é uma ligação ou alquila C1-4. O mais preferivelmente, L é uma ligação ou alquila C1 (-CH2-).
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[0056] X’ é preferivelmente -CHO, -OH, -OPG, -OR, -OC(=O)R ou - C(=O)OR, mais preferivelmente -CHO, -OH, -OR, -OC(=O)R ou -C(=O)OR, o mais preferivelmente -CHO, -OH, -OR ou -OC(=O)R.
[0057] Assim, preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é de 0 a 6, preferivelmente de 0 a 4 e mais preferivelmente 0 ou 1, e X' é como definido acima, preferivelmente -CHO, -OH, -OR ou -OC(=O)R, em que R é como definido acima.
[0058] Preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é de 0 a 6 e X' é –OH ou –CHO. Preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é de 0 a 6 e X' é –OH. Preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é de 0 a 6 e X' é –CHO.
[0059] Mais preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é de 0 a 4 e X' é –OH ou –CHO. Preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é de 0 a 4 e X' é – OH. Preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é de 0 a 4 e X' é –CHO.
[0060] Mais preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é de 0 a 2 e X' é –OH ou –CHO. Preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é de 0 a 2 e X' é – OH. Preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é de 0 a 2 e X' é –CHO.
[0061] Mais preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é 0 ou 1 e X' é – OH ou –CHO. Preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é 0 ou 1 e X' é –OH. Preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é 0 ou 1 e X' é –CHO.
[0062] Mais preferivelmente, X é -CHO, -CH2OH, -CH2OCH3 ou - CH2OC(=O)CH3.
[0063] Mais preferivelmente, X é a) -CHO ou -CH2OH; ou b) - CH2OCH3 ou -CH2OC(=O)CH3.
[0064] Mais preferivelmente X é -CHO ou -CH2OH, o mais preferivelmente CH2OH.
[0065] Em todas as definições acima de X, é preferível que X não seja - OH. Assim, quando X’ é -OH, é preferível que L não seja uma ligação (isto é, n não seja 0). Nesse caso, n pode ser de 1 a 6, preferivelmente de 1 a 4, mais preferivelmente de 1 a 2 e, o mais preferivelmente, 1.
15 / 108 W1 e W2
[0066] W1 e W2 são, cada um, independentemente O, S ou NH, preferivelmente O ou S, mais preferivelmente O.
[0067] Assim, preferivelmente W1 é O ou S e W2 é O, S ou NH; ou W2 é O ou S e W1 é O, S ou NH.
[0068] Mais preferivelmente, W1 e W2 são ambos O ou S e, ainda mais preferivelmente, W1 é O e W2 é O ou S; ou W2 é O, e W1 é O ou S.
[0069] O mais preferivelmente, W1 e W2 são ambos O.
[0070] Y
[0071] Y é H ou um grupo contendo de 1 a 15 átomos de não hidrogênio. Preferivelmente, Y é H ou um grupo contendo de 1 a 10 átomos de não hidrogênio. Mais preferivelmente, Y é H ou um grupo contendo de 1 a 5 átomos de não hidrogênio.
[0072] Por exemplo, Y pode ser H, -OH, -OPG, -F, -Cl, -Br, -I, ou -N3, em que PG é um grupo protetor de álcool, tal como acetila, benzila ou benzoíla.
[0073] Quando Y é H ou um grupo que contém de 1 a 5 átomos de não hidrogênio, Y pode ser H, -OH, -OAc, -F, -Cl, -Br, -I, ou -N3.
[0074] O mais preferivelmente, Y é H.
[0075] Z
[0076] Z é -OPG, -ORz ou -N(RxRy), em que Rx, Ry e Rz são independentemente H ou um grupo contendo de 1 um 10 átomos de não hidrogênio e em que PG é um grupo protetor de álcool, tal como acetila, benzila ou benzoíla.
[0077] Preferivelmente, Z é -ORz ou -N(RxRy).
[0078] Preferivelmente, Rz é H ou um grupo que contém de 1 a 5 átomos de não hidrogênio, mais preferivelmente H ou um grupo que contém de 1 a 3 átomos de não hidrogênio e, o mais preferivelmente, H.
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[0079] Preferivelmente, Rx e Ry são independentemente H ou um éster C1-8. Mais preferivelmente, Rx e Ry são independentemente H ou -C(O)O(CH2)nCH3, em que n é de 1 a 4, preferivelmente 4.
[0080] Preferivelmente, pelo menos um dentre Rx e Ry é H. Por exemplo, preferivelmente Rx é H e Ry é independentemente H ou -C(O)O(CH2)nCH3, em que n é de 1 a 4, preferivelmente 4. Mais preferivelmente, Rx e Ry são ambos H.
[0081] Z é, portanto, preferivelmente -NH2 ou -OH. Mais preferivelmente, Z é -NH2 quando X é -CHO ou -CH2OH, o mais preferivelmente -CH2OH; e Z é -OH quando X é -CH2OCH3 ou - CH2OC(=O)CH3.
[0082] Quando Z é -OH, o composto da formula (I) pode ser desenhado em uma forma tautomérica, como mostrado abaixo: Uma forma tautomérica da Fórmula (I), quando Z é -OH
[0083] De maneira alternativa, Z é preferivelmente -OPG, -ORz ou - N(RxRy), em que PG, Rx e Ry são como definido acima e em que Rz é um grupo contendo de 1 um 10 átomos de não hidrogênio.
[0084] Nesse caso, Rz é preferivelmente um grupo que contém de 1 a 5 átomos de não hidrogênio, mais preferivelmente um grupo que contém de 1 a 3 átomos de não hidrogênio.
17 / 108
[0085] Nesse caso, Z é preferivelmente -OPG ou -N(RxRy), em que PG, Rx e Ry são como definido acima.
[0086] O mais preferivelmente, Z é -N(RxRy), em que Rx e Ry são como definido acima.
[0087] Z é, portanto, preferivelmente -NH2. R1
[0088] R1 é H ou um grupo que contém de 1 a 15 átomos de não hidrogênio, preferivelmente H ou um grupo que contém de 1 a 13 átomos de não hidrogênio.
[0089] Preferivelmente, R1 é H, -OH, -OPG, -F, -Cl, -Br, -I, -N3, ou -O(P(=O)(OH)O)nH, em que n é de 1 a 3, e em que PG é um grupo protetor de álcool, tal como acetila, benzila ou benzoíla.
[0090] Preferivelmente, R1 é H, -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -N3, ou -O(P(=O)(OH)O)nH, em que n é de 1 a 3, preferivelmente 3. Mais preferivelmente, R1 é H, -OH ou -O(P(=O)(OH)O)nH, em que n é de 1 a 3, preferivelmente 3. Ainda mais preferivelmente, R1 é -OH ou -O(P(=O)(OH)O)nH, em que n é de 1 a 3, preferivelmente 3. O mais preferivelmente, R1 é -OH. R2
[0091] R2 é H, -OH, -OPG, -F, -Cl, -Br, -I, ou -N3, em que PG é um grupo protetor de álcool, tal como acetila, benzila ou benzoíla.
[0092] Preferivelmente, R2 é H, -OH, -F, -Cl, -Br, -I, ou -N3. Mais preferivelmente, R2 é H ou -OH, e, o mais preferivelmente, R2 é -OH. R3
[0093] R3 é H, -F, -Cl, -Br, -I, ou -N3, preferivelmente H.
[0094] O mais preferivelmente, R1 é -OH ou -O(P(=O)(OH)O)nH, em que n é de 1 a 3, preferivelmente 3; R2 é -OH; e R3 é H.
18 / 108 Modalidades preferidas
[0095] Preferivelmente, o composto da fórmula (I) é um composto da fórmula (IIa) ou fórmula (IIb), ou um estereoisômero, solvato, tautômero ou sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos: Fórmula (IIa) Fórmula (IIb) em que X, R1 e R2 são como definido acima.
[0096] Mais preferivelmente, o composto da fórmula (I) é um composto da fórmula (IIa), ou um estereoisômero, solvato, tautômero ou sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos
[0097] Nessas modalidades preferidas, particularmente na fórmula (IIa), preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é de 0 a 6 e X' é –OH ou –CHO. Preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é de 0 a 6 e X' é –OH. Preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é de 0 a 6 e X' é –CHO.
[0098] Mais preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é de 0 a 4 e X' é –OH ou –CHO. Preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é de 0 a 4 e X' é – OH. Preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é de 0 a 4 e X' é –CHO.
[0099] Mais preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é de 0 a 2 e X' é –OH ou –CHO. Preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é de 0 a 2 e X' é – OH. Preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é de 0 a 2 e X' é –CHO.
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[00100] Mais preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é 0 ou 1 e X' é – OH ou –CHO. Preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é 0 ou 1 e X' é –OH. Preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é 0 ou 1 e X' é –CHO.
[00101] Mais preferivelmente X é -CHO, -CH2OH, -CH2OCH3 ou -CH2OC(=O)CH3. Mais preferivelmente, X é a) -CHO ou -CH2OH; ou b) - CH2OCH3 ou -CH2OC(=O)CH3. Mais preferivelmente X é -CHO ou -CH2OH, o mais preferivelmente CH2OH
[00102] Na fórmula (IIa), preferivelmente X é -CHO ou -CH2OH, o mais preferivelmente -CH2OH. Na fórmula (IIb), preferivelmente X é -CH2OCH3 ou -CH2OC(=O)CH3.
[00103] Em todas essas modalidades preferidas, é preferível que X não seja -OH. Assim, quando X’ é -OH, é preferível que n não seja 0. Nesse caso, n pode ser de 1 a 6, preferivelmente de 1 a 4, mais preferivelmente de 1 a 2 e, o mais preferivelmente, 1.
[00104] Na fórmula (IIa) e (IIb), preferivelmente R1 é -OH ou -O(P(=O)(OH)O)nH, em que n é de 1 a 3, preferivelmente 3; e R2 é -OH.
[00105] Mais preferivelmente, o composto da fórmula (I) é um composto da fórmula (IIIa), (IIIb), (IIIc) ou (IIId) ou um estereoisômero, solvato, tautômero ou sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos: Fórmula (IIIa) Fórmula (IIIb)
20 / 108 Fórmula (IIIc) Fórmula (IIId) em que X é como definido acima.
[00106] Mais preferivelmente, o composto da fórmula (I) é um composto da fórmula (IIIa), (IIIb) ou (IIIc) ou um estereoisômero, solvato, tautômero ou sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.
[00107] Ainda mais preferivelmente, o composto da fórmula (I) é um composto da fórmula (IIIa) ou (IIIc), ou um estereoisômero, solvato, tautômero ou sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos
[00108] Na fórmula (IIIa), (IIIb), (IIIc) e (IIId), particularmente na fórmula (IIIa) e (IIIc), preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é de 0 a 6 e
21 / 108 X' é –OH ou –CHO. Preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é de 0 a 6 e X' é –OH. Preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é de 0 a 6 e X' é –CHO.
[00109] Mais preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é de 0 a 4 e X' é –OH ou –CHO. Preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é de 0 a 4 e X' é – OH. Preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é de 0 a 4 e X' é –CHO.
[00110] Mais preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é de 0 a 2 e X' é –OH ou –CHO. Preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é de 0 a 2 e X' é – OH. Preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é de 0 a 2 e X' é –CHO.
[00111] Mais preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é 0 ou 1 e X' é – OH ou –CHO. Preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é 0 ou 1 e X' é –OH. Preferivelmente X é -(CH2)n-X', em que n é 0 ou 1 e X' é –CHO.
[00112] Mais preferivelmente X é -CHO, -CH2OH, -CH2OCH3 ou -CH2OC(=O)CH3. Mais preferivelmente, X é a) -CHO ou -CH2OH; ou b) - CH2OCH3 ou -CH2OC(=O)CH3. Mais preferivelmente X é -CHO ou -CH2OH, o mais preferivelmente CH2OH
[00113] Na fórmula (IIIa) e na fórmula (IIIc), preferivelmente X é -CHO ou -CH2OH, o mais preferivelmente -CH2OH. Na fórmula (IIIb) e na fórmula (IIId), preferivelmente X é -CH2OCH3 ou -CH2OC(=O)CH3.
[00114] Em todas essas modalidades preferidas, é preferível que X não seja -OH. Assim, quando X’ é -OH, é preferível que n não seja 0. Nesse caso, n pode ser de 1 a 6, preferivelmente de 1 a 4, mais preferivelmente de 1 a 2 e, o mais preferivelmente, 1.
[00115] O mais preferivelmente, o composto da fórmula (I) é um composto da fórmula (IVa), (IVb), (IVc), (IVd), (IVe) ou (IVf) ou um estereoisômero, solvato, tautômero ou sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos:
22 / 108
Fórmula (IVa) Fórmula (IVb)
Fórmula (IVc) Fórmula (IVd)
Fórmula (IVe)
23 / 108 Fórmula (IVf)
[00116] A fórmula (IVa) é 5-formil-2’-desoxicitidina (também denominada 5f2dC, 5fdC, 2d5fC e d5fC no presente documento). A fórmula (IVb) é 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina (também denominada 5hm2dC, 5hmdC, 2d5hmC e d5hmC no presente documento). A fórmula (IVc) é 5- metoximetil-2’-desoxiuridina. A fórmula (IVd) é 5-acetoximetil-2’- desoxiuridina. A fórmula (IVe) é 5-formil-2'-desoxicitidina-5'-trifosfato. A fórmula (IVf) é 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina-5'-trifosfato.
[00117] Assim, preferivelmente, o composto de uso na invenção é selecionado dentre 5-formil-2’-desoxicitidina, 5-hidroximetil-2’- desoxicitidina, 5-metoximetil-2’-desoxiuridina,5-acetoximetil-2’- desoxiuridina, 5-formil-2'-desoxicitidina-5'-trifosfato e 5-hidroximetil-2'- desoxicitidina-5'-trifosfato ou um estereoisômero, solvato, tautômero ou sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Mais preferivelmente o composto é a) 5-formil-2’-desoxicitidina ou 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina ou um estereoisômero, solvato, tautômero ou sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos; ou b) 5-metoximetil-2’-desoxiuridina ou 5-acetoximetil-2’- desoxiuridina ou um estereoisômero, solvato, tautômero ou sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos
[00118] Alternativamente, o composto de uso na invenção é preferivelmente selecionado dentre 5-formil-2’-desoxicitidina, 5-hidroximetil-
24 / 108 2’-desoxicitidina, 5-formil-2'-desoxicitidina-5'-trifosfato e 5-hidroximetil-2'- desoxicitidina-5'-trifosfato ou um estereoisômero, solvato, tautômero ou sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.
[00119] O mais preferivelmente, o composto é 5-formil-2’-desoxicitidina ou 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina ou um estereoisômero, solvato, tautômero ou sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos, o mais preferivelmente 5- hidroximetil-2’-desoxicitidina ou um estereoisômero, solvato, tautômero ou sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.
[00120] O termo "tratamento" ou "terapia" inclui qualquer tratamento ou terapia que resulte em uma melhora na saúde ou condição de um paciente, ou de um sintoma do câncer de que ele(a) está sofrendo. "Tratamento" não é limitado a terapias curativas (por exemplo, as que resultam na eliminação de células cancerosas ou tumores ou metástases do paciente), mas inclui qualquer terapia que tenha um efeito benéfico sobre o câncer ou o paciente, por exemplo, regressão ou redução tumoral, redução de potencial metastático, sobrevida global aumentada, extensão ou prolongamento de vida ou remissão, indução de remissão, uma desaceleração ou redução da progressão da doença ou a taxa de progressão da doença, ou de desenvolvimento tumoral, melhora subjetiva na qualidade de vida, dor reduzida ou outros sintomas relacionados à doença, apetite melhorado, náusea reduzida, ou um alívio de qualquer sintoma do câncer.
[00121] Assim, como usado no presente documento, "tratamento" pode se referir à redução, alívio, melhoramento ou eliminação do câncer, ou um ou mais sintomas do mesmo, que está sendo tratado, em relação ao câncer ou sintoma antes do tratamento. Tratamento pode incluir uma redução ou exterminação de células cancerosas, por exemplo, em tumores, por exemplo em tumores sólidos. Tratamento é tratamento de um indivíduo, isto é, um indivíduo em necessidade do mesmo. Assim, tratamento pode incluir uma
25 / 108 redução no tamanho do tumor, ou a prevenção do crescimento tumoral ou crescimento tumoral adicional, isto é, a estabilização do tamanho do tumor.
[00122] "Prevenção" se refere ao adiamento ou prevenção do início dos sintomas do câncer, por exemplo, no desenvolvimento de um tumor.
[00123] Preferivelmente, os compostos da invenção têm um efeito direto sobre as células cancerosas/tumorais. Um “efeito direto” como usado no presente documento significa que os compostos da invenção interagem diretamente com as células cancerosas/tumorais a fim de exercer seus efeitos anticâncer/antitumor. Em outras palavras, preferivelmente os compostos da invenção, isto é, os compostos da fórmula (I) são citotóxicos às células cancerosas/tumorais.Preferivelmente, os compostos da invenção são administrados a um indivíduo a fim de exercer um efeito direto contra células cancerosas/tumorais.
[00124] Preferivelmente, os métodos da invenção não compreendem a administração dos compostos da invenção a fim de esgotar uma população de células que foi administrada como parte de uma terapia baseada em transplante de células. As terapias baseadas em transplante de células são bem conhecidas como terapias em que uma população de células é administrada a um indivíduo a fim de provocar um efeito terapêutico particular. Terapias baseadas em transplante de células bem conhecidas incluem terapia com células T, por exemplo, terapia com células T CAR.
[00125] Preferivelmente, os métodos da invenção não compreendem a administração dos compostos da invenção após a administração de uma população de células que foi administrada como parte de uma terapia baseada em transplante de células.
[00126] Preferivelmente, os métodos da invenção não compreendem terapia com células T CAR. Preferivelmente, os métodos da invenção não compreendem terapia com células T. Preferivelmente, os métodos da invenção não compreendem terapias baseadas em transplante de células.
26 / 108
[00127] Preferivelmente, os métodos da invenção compreendem a administração do composto da invenção a um indivíduo não submetido a terapia com células T CAR, preferivelmente terapia com células T, preferivelmente terapia baseada em transplante de células. Em outras palavras, preferivelmente o indivíduo não recebeu e não receberá terapia com células T CAR, preferivelmente terapia com células T, preferivelmente terapia baseada em transplante de células, como parte de seu tratamento.
[00128] Como referido no presente documento, um indivíduo pode ser qualquer animal humano ou não humano, preferivelmente um animal mamífero, por exemplo, uma vaca, cavalo, carneiro, porco, cabra, coelho, gato, cão, de maneira especialmente preferível, um humano. Assim, preferivelmente os cânceres referidos no presente documento são cânceres humanos, e os tumores referidos no presente documento são preferivelmente presentes em um indivíduo humano.
[00129] Em algumas modalidades, tratamentos de acordo com a presente invenção podem ser usados em indivíduos em risco de recidiva ou recorrência do câncer ou metástase. Assim, vistos de maneira alternativa, os compostos da fórmula (I) podem ser usados na prevenção de recidiva ou recorrência do câncer ou metástase.
[00130] Em modalidades particulares, a invenção pode envolver primeiro identificar ou determinar que o indivíduo a ser tratado tem câncer (isto é, um tumor) ou é suscetível ou em risco de desenvolver câncer.
[00131] Alternativa ou adicionalmente, a invenção pode envolver avaliar ou monitorar o efeito da administração do composto da fórmula (I) e/ou do(s) outro(s) agente(s) anticâncer sobre o indivíduo ou, mais particularmente, sobre o câncer (tumor), ou sobre o desenvolvimento ou progresso do câncer (tumor). Procedimentos e meios para avaliar e/ou monitorar um efeito anticâncer são bem conhecidos na técnica, por exemplo, pela determinação ou monitoramento de sintomas, condição clínica, tamanho do tumor ou
27 / 108 alastramento (por exemplo, por técnicas de imageamento) ou outros indicadores de câncer ou tumor, por exemplo, marcadores de câncer/tumor, etc.
[00132] Como mencionado acima, a presente invenção é aplicável a qualquer câncer. O câncer é definido amplamente no presente documento como incluindo qualquer afecção neoplásica e inclui, particularmente, afecções malignas ou pré-malignas. O câncer pode causar ou resultar ou se manifestar em tumores sólidos, mas não se limita a estes, e inclui também cânceres do sistema hemopoiético. Tumores benignos e tumores malignos também estão incluídos no termo câncer conforme usado no presente documento, isto é, os termos câncer e tumor são usados de forma intercambiável. O tratamento de tumores malignos é preferido.
[00133] O câncer/pode ocorrer em qualquer tecido ou órgão do corpo. Por exemplo, a presente invenção pode ser usada no tratamento ou prevenção de qualquer um dos cânceres a seguir em um paciente ou indivíduo:
[00134] câncer do sistema nervoso central, preferivelmente câncer de cérebro, preferivelmente glioma; leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia mieloide aguda (AML); carcinoma adrenocortical; câncer relacionado com a AIDS (por exemplo, sarcoma de Kaposi e linfoma); câncer anal; câncer de apêndice; carcinoma basocelular; câncer do duto biliar; câncer de bexiga extra-hepático; câncer de osso (por exemplo, sarcoma de Ewing; osteossarcoma e histiocitoma fibroso maligno); câncer de mama; tumores bronquiais; linfoma de Burkitt; tumor carcinoide; tumores cardíacos (do coração); câncer cervical (adenocarcinoma cervical); cordoma; leucemia promielocítica aguda; leucemia linfocítica crônica (CLL); leucemia mielogênica crônica (CML); transtorno mieloproliferativo crônico; câncer de cólon; câncer colorretal; linfoma cutâneo de células T; câncer do ducto biliar; carcinoma ductal extra-hepático in situ (DCIS); tumores embrionais; câncer de endométrio; câncer de esôfago; estesioneuroblastoma; sarcoma de Ewing;
28 / 108 tumor extracraniano de células germinativas; tumor extragonadal de células germinativas; câncer do ducto biliar extra-hepático; câncer de olho (incluindo melanoma intraocular e retinoblastoma); histiocitoma fibroso de osso; câncer da vesícula biliar; câncer gástrico (do estômago); tumor carcinoide gastrointestinal; tumor estromal gastrointestinal (GIST); tumor de células germinativas; doença trofoblástica gestacional; leucemia de células pilosas; câncer de cabeça e pescoço; câncer de coração; câncer hepatocelular (do fígado); histiocitose; célula de Langerhans; linfoma de Hodgkin; câncer hipofaríngeo; melanoma intraocular; tumores de células de ilhotas; tumores neuroendócrinos pancreáticos; sarcoma de Kaposi; câncer dos rins (incluindo tumor de células renais e de Wilms); histiocitose de células de Langerhans; câncer da laringe; leucemia (incluindo linfoblástica aguda (ALL); mieloide aguda (AML); linfocítica crônica (CLL); mielogênica crônica (CML); câncer de lábio e cavidade oral; câncer de fígado (primário); carcinoma lobular in situ (LCIS); câncer de pulmão; linfoma; macroglobulinemia; Waldenström; melanoma (melanoma maligno); carcinoma de célula de Merkel; mesotelioma; câncer de pescoço escamoso metastático com primário desconhecido; carcinoma do trato da linha média envolvendo o gene NUT; câncer de boca; síndromes de neoplasia endócrina múltipla; infância; mieloma múltiplo / neoplasia de plasmócitos; micose fungoide; síndromes mielodisplásicas; neoplasias mielodisplásicas/mieloproliferativas; mieloma múltiplo; transtornos mieloproliferativos; câncer de cavidade nasal e seio paranasal; câncer nasofaríngeo; neuroblastoma; linfoma não Hodgkin; câncer de pulmão de células não pequenas; câncer oral; câncer de cavidade oral; câncer orofaríngeo; osteossarcoma; câncer de ovário (adenocarcinoma de ovário); câncer de pâncreas; tumores neuroendócrinos pancreáticos (tumores de células de ilhotas); papilomatose; paraganglioma; câncer de seio paranasal e cavidade nasal; câncer de paratireoide; câncer de pênis; câncer de faringe; feocromocitoma; adenocarcinoma epitelial; neoplasia de
29 / 108 plasmócitos/mieloma múltiplo; blastoma pleuropulmonar; câncer de mama e gravidez; câncer de próstata; câncer retal; câncer de células renais (dos rins); pelve renal e ureter; câncer de células de transição; retinoblastoma; rabdomiossarcoma; câncer das glândulas salivares; sarcoma; síndrome de Sézary; câncer de pele; câncer de pulmão de células pequenas; câncer de intestino delgado; sarcoma de tecido mole; carcinoma de célula escamosa; câncer de pescoço escamoso com primário desconhecido; metastático; câncer de estômago (gástrico); linfoma de células T; câncer de testículo; câncer de garganta; timoma e carcinoma tímico; câncer da tireoide; câncer de células de transição da pelve renal e ureter; câncer de uretra; câncer do útero; endometrial; sarcoma uterino; câncer da vagina; câncer da vulva; macroglobulinemia de Waldenström; e tumor de Wilms.
[00135] As células de um embrião humano são dispostas em camadas germinativas distintas: um ectoderma externo, um endoderma interno e o mesoderma, que se desenvolve entre o ectoderma e o endoderma. Todos os órgãos do corpo se desenvolvem ou diferenciam de maneira ordenada a partir dessas três camadas germinativas primárias.
[00136] Na presente invenção, preferivelmente o câncer/tumor é um câncer/tumor de um tecido derivado do ectoderma, mesoderma paraxial, ou mesoderma da placa lateral, preferivelmente do ectoderma.
[00137] Preferivelmente, o câncer é um câncer do sistema nervoso central, preferivelmente câncer de cérebro. Para evitar dúvidas, câncer de cérebro é considerado no campo e no presente documento como sendo um câncer do sistema nervoso central. O sistema nervoso central compreende o cérebro e a medula espinhal. Assim, preferivelmente o tumor é um tumor do sistema nervoso central, preferivelmente um tumor de cérebro. Preferivelmente, os cânceres/tumor do CNS são selecionados do grupo que consiste em linfoma do CNS, tumor rabdoide, tumores embrionais, tumor de células germinativas e cordoma, ou são um câncer/tumor de cérebro.
30 / 108 Preferivelmente, o câncer/tumor de cérebro é selecionado do grupo que consiste em glioma, neuroma acústico, linfoma do CNS, craniofaringioma, meduloblastoma, meningioma, tumor de cérebro metastático, tumores pituitários, neuroectodérmico primitivo (PNET), Schwannoma, pinealoma, retinoblastoma trilateral e tumor rabdoide.
[00138] O mais preferivelmente, o câncer/tumor é câncer de cérebro/ um tumor de cérebro, mais preferivelmente glioma. O glioma pode ser qualquer tipo de glioma, por exemplo, astrocitoma, ependimoma, subependimoma, oligodendroglioma, glioma do tronco encefálico, glioma do nervo óptico ou um glioma misto.
[00139] Preferivelmente, o glioma é astrocitoma. O astrocitoma pode ser astrocitoma grau I (preferivelmente astrocitoma pilocítico ou astrocitoma subependimal de células gigantes), grau II (preferivelmente astrocitoma de baixo grau, xantoastrocitoma pleomórfico ou oligoastrocitoma misto), grau III (astrocitoma anaplásico) ou o mais preferivelmente grau IV (glioblastoma).
[00140] Os sistemas de graduação para a classificação de tumor do sistema nervoso central são bem conhecidos pela pessoa versada na técnica. Preferivelmente, o sistema de graduação da Organização Mundial da Saúde (OMS) é usado. O esquema de graduação da OMS é bem conhecido no campo e é baseado na aparição de certas características: atipia, mitose, proliferação endotelial e necrose, que refletem o potencial de malignidade do tumor em termos de invasão e taxa de crescimento.
[00141] Gliomas podem também ser classificados de acordo com se eles estão acima ou abaixo do tentório, uma membrana que separa os hemisférios cerebrais do cerebelo. Os gliomas supratentoriais são encontrados acima do tentório, nos hemisférios cerebrais, enquanto que os gliomas infratentoriais são encontrados abaixo do tentório, no cerebelo. O glioma tratado de acordo com a presente invenção pode ser glioma supratentorial ou glioma infratentorial.
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[00142] Assim, de maneira particularmente preferível no contexto da presente invenção, o câncer/tumor é glioma, o mais preferivelmente glioma grau IV, isto é, glioblastoma multiforme. Glioblastoma multiforme é um astrocitoma maligno e o tumor de cérebro primário mais comum em adultos. Glioblastoma multiforme é também conhecido como glioma grau IV, glioblastoma e GBM.
[00143] Preferivelmente, o câncer/tumor é selecionado do grupo que consiste em câncer de cérebro (como definido acima, preferivelmente glioma, mais preferivelmente glioblastoma), câncer de estômago, câncer de pâncreas, linfoma, câncer de pulmão, câncer de pele, leucemia promielocítica aguda, câncer de ovário, câncer de mama, câncer de osso e câncer de colo do útero. Mais preferivelmente, o câncer/tumor é selecionado do grupo que consiste em câncer de cérebro (como definido acima, preferivelmente glioma, mais preferivelmente glioblastoma), câncer de estômago, linfoma, câncer de mama e câncer de colo do útero.
[00144] Preferivelmente, o câncer/tumor é selecionado do grupo que consiste em câncer de cérebro (como definido acima, preferivelmente glioma, mais preferivelmente glioblastoma), câncer de estômago, câncer de pâncreas, câncer de pele, leucemia promielocítica aguda, câncer de mama e câncer de colo do útero.
[00145] Preferivelmente, o câncer/tumor é selecionado do grupo que consiste em câncer de cérebro (como definido acima, preferivelmente glioma, mais preferivelmente glioblastoma), câncer de pele e câncer de mama, mais preferivelmente câncer de cérebro (como definido acima, preferivelmente glioma, mais preferivelmente glioblastoma) e câncer de pele.
[00146] Nessas modalidades, os compostos preferidos da invenção são aqueles em que X contém um grupo funcional aldeído, preferivelmente em que X é -(CH2)n-X', em que X' é –CHO e n é de 0 a 6, mais preferivelmente de 0 a 4, mais preferivelmente de 0 a 2, mais preferivelmente 0 ou 1, o mais
32 / 108 preferivelmente em que X é –CHO e, preferivelmente, em que Z é –NH2. Como demonstrado nos presentes exemplos, tais compostos da invenção têm vantajosamente citotoxicidade ampla contra uma larga faixa de tipos de câncer, com citotoxicidade limitada contra células não cancerosas.
[00147] De maneira alternativamente preferível, o câncer/tumor é selecionado do grupo que consiste em câncer de cérebro (como definido acima, preferivelmente glioma, mais preferivelmente glioblastoma) e leucemia mielogênica crônica. Nessas modalidades, os compostos preferidos da invenção são aqueles em que X contém um grupo funcional álcool, preferivelmente em que X é -(CH2)n-X', em que X' é –OH e n é de 0 a 6, mais preferivelmente de 0 a 4, mais preferivelmente de 0 a 2, mais preferivelmente 0 ou 1, o mais preferivelmente em que X é -CH2OH e preferivelmente em que Z é –NH2. Como demonstrado nos presentes exemplos, tais compostos da invenção têm vantajosamente citotoxicidade específica contra esses tipos de câncer preferidos, com citotoxicidade limitada contra células cancerosas e não cancerosas fora do alvo.
[00148] Preferivelmente, o tumor de estômago é carcinoma gástrico. Preferivelmente, o tumor pancreático é carcinoma pancreático. Preferivelmente, o câncer de pele é melanoma maligno. Preferivelmente, o câncer de ovário é adenocarcinoma de ovário. Preferivelmente, o câncer de mama é adenocarcinoma epitelial. Preferivelmente, o câncer de osso é osteossarcoma de osso. Preferivelmente, o câncer de pulmão é adenocarcinoma metastático, preferivelmente adenocarcinoma metastático de células não pequenas. Preferivelmente, o câncer de colo do útero é adenocarcinoma de colo do útero.
[00149] No entanto, preferivelmente o câncer não é câncer de pulmão ou câncer de mama. Preferivelmente, o câncer também não é câncer de pâncreas, câncer de estômago, câncer de testículo ou câncer da vagina. Preferivelmente, o câncer também não é câncer dos rins ou câncer do intestino.
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[00150] Preferivelmente, o câncer não é câncer de pulmão. Preferivelmente, o câncer também não é câncer de próstata, câncer dos rins, câncer de fígado, câncer de mama, câncer de cólon, câncer de ovário ou câncer de colo do útero.
[00151] Preferivelmente, o câncer/tumor não é câncer de cólon, câncer de pulmão, câncer de próstata ou câncer dos rins. Preferivelmente, o câncer/tumor também não é câncer de pâncreas.
[00152] Preferivelmente, o câncer/tumor também não é leucemia mielogênica crônica e, nesse caso, os compostos preferidos da invenção (isto é, os compostos da fórmula (I), (IIa), (IIb), (IIIa), (IIIb), (IIIc), (IIId), (Iva), (IVb), (IVc), (IVd), (IVe) e (IVf)) são aqueles em que X contém um grupo funcional aldeído, preferivelmente em que X é -(CH2)n-X', em que X' é –CHO e n é de 0 a 6, mais preferivelmente de 0 a 4, mais preferivelmente de 0 a 2, mais preferivelmente 0 ou 1, o mais preferivelmente em que X é –CHO e preferivelmente em que Z é –NH2.
[00153] Ademais, preferivelmente o câncer também não é: i) câncer de mama, preferivelmente também não câncer de pâncreas, câncer de estômago, câncer de testículo ou câncer da vagina, mais preferivelmente também não câncer do intestino; e/ou ii) câncer de fígado, câncer de mama, câncer de ovário ou câncer de colo do útero.
[00154] Preferivelmente, o câncer não é um câncer selecionado do grupo que consiste em câncer de pulmão, câncer de próstata, câncer dos rins, câncer de fígado, câncer de mama, câncer de cólon, câncer de ovário, câncer de colo do útero, leucemia mielogênica crônica, câncer de pâncreas, câncer de estômago, câncer de testículo, câncer da vagina e câncer do intestino. Preferivelmente, o câncer não é nenhum desses cânceres.
[00155] Preferivelmente, o câncer de mama tratado de acordo com a presente invenção
34 / 108 i) é carcinoma ductal invasivo; e/ou ii) expressa p53 do tipo selvagem; e/ou iii) não é triplo negativo, isto é, expressa um ou mais dentre receptor de estrogênio (ER+) receptor de progesterona (PR+) e HER2 (HER2+), preferivelmente é ER+ e PR+; e/ou iv) é heterozigótico para p53.
[00156] Os cânceres de mama preferivelmente não tratados de acordo com a presente invenção são preferivelmente somente aqueles cânceres de mama que: i) são adenocarcinomas; e/ou ii) são triplo negativos, isto é, não expressam receptor de estrogênio (ER-) receptor de progesterona (PR-) ou HER2 (HER2-); e/ou iii) expressam uma variante mutante de p53; e /ou iv) são homozigóticos para p53.
[00157] A proteína humana citidina desaminase (CDA) catalisa desaminação hidrolítica de citidina e desoxicitidina para formar uridina e desoxiuridina, respectivamente. Alguns agentes anticâncer conhecidos são análogos de nucleosídeo/nucleotídeo, por exemplo, gemcitabina (2,2- difluorodesoxicitidina) e citarabina (Ara-C, citosina arabinosídeo). A CDA inativa, problematicamente, tais agentes anticâncer, incluindo a gemcitabina e a citarabina. Como demonstrado nos presentes exemplos, os compostos da invenção exercem seus efeitos citotóxicos independentemente da expressão da CDA.
[00158] Por conseguinte, em modalidades preferidas, o câncer/tumor é um em que a CDA é expressa, preferivelmente em que a CDA é: i) superexpressa; ii) não superexpressa; iii) subexpressa; iv) não subexpressa;
35 / 108 v) superexpressa ou subexpressa; ou vi) nem superexpressa nem subexpressa.
[00159] Cada um dos tipos de câncer/tumor i) a vi) acima representa uma modalidade preferida da presente invenção. Em uma modalidade particularmente preferida, o câncer/tumor tratado de acordo com a presente invenção é um em que a CDA não é superexpressa.
[00160] No contexto da expressão gênica da célula cancerosa/tumoral, os termos “superexpressa” e “subexpressa” têm um significado claro e amplamente compreendido, nomeadamente, em níveis aumentados/mais altos ou diminuídos/mais baixos, respectivamente. a. Superexpressão (ou níveis aumentados ou mais altos) ou subexpressão (ou níveis diminuídos ou mais baixos) podem ser como determinado em comparação com qualquer controle apropriado (por exemplo, nível de controle ou amostra de controle ou biópsia). Por exemplo, o nível de controle pode ser o nível em uma amostra (por exemplo, amostra de sangue ou soro ou amostra de tecido ou biópsia) de um indivíduo saudável (por exemplo, um indivíduo que não tenha câncer). Níveis de controle apropriados (ou amostras ou valores de controle) poderiam ser prontamente escolhidos por uma pessoa versada na técnica. “Valores” de controle apropriados poderiam também ser prontamente determinados sem passar uma "amostra" de controle por cada teste, por exemplo, por referência à faixa para indivíduos normais.
[00161] Preferivelmente, os termos superexpresso(a) e subexpresso(a) significam que o nível de transcrição de RNA do gene em questão nas células cancerosas é mais alto (superexpresso) ou mais baixo (subexpresso) do que o nível em células não cancerosas do mesmo tecido que as células cancerosas, como avaliado usando os mesmos método e condições em ambos os casos. Métodos e condições preferidos para avaliar o nível de expressão gênica, por exemplo, expressão de CDA, são como revelado em outra parte do presente documento.
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[00162] Preferivelmente, a superexpressão ou subexpressão são significativas. Por significativamente superexpresso/subexpresso, isto é, significativamente mais alto/mais baixo, quer-se dizer significativamente super/subexpresso em termos estatísticos (significativamente mais alto/mais baixo em termos estatísticos). Por significativo em termos estatísticos quer-se dizer que o nível aumentado ou diminuído observado é maior do que o que se pode esperar que aconteça somente por acaso. A significância estatística é determinada por qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, a significância estatística é determinada por valor de probabilidade (valor p). Os valores p são uma medida de probabilidade de que uma diferença entre grupos durante um experimento aconteceu por acaso. Por exemplo, um valor p de 0,01 significa que há uma chance de 1 em 100 de que o resultado ocorreu por acaso. Quanto mais baixo o valor p, maior a probabilidade de que a diferença entre os grupos foi causada pelo tratamento. Preferivelmente, o valor de probabilidade é <0,05 ou <0,01.
[00163] Em algumas modalidades, níveis aumentados (isto é, superexpressão) pode ser um aumento de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% (por exemplo, em comparação com um nível de controle). Em algumas modalidades, níveis diminuídos (isto é, subexpressão) pode ser uma diminuição de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% (por exemplo, em comparação com um nível de controle).
[00164] Preferivelmente, o nível de expressão gênica em uma célula de interesse é determinado por referência a um banco de dados que contém tais informações. Recursos tais como o Atlas do Genoma do Câncer (TCGA, https://cancergenome.nih.gov/), o atlas de expressão de EMBL-EBI (https://www.ebi.ac.uk/gxa/home), o atlas de proteínas humanas (https://www.proteinatlas.org/), o GENEVESTIGATOR®
37 / 108 (https://genevestigator.com/gv/ ), a Enciclopédia de Linhagem Celular do Câncer (https://portals.broadinstitute.org/ccle ) e outros contêm informações sobre os níveis de expressão gênica em uma larga faixa de tipos de células, incluindo cânceres, assim como proveem dados estatísticos sobre se o nível de expressão gênica em um tipo particular de câncer é ou não significativamente mais alto ou mais baixo do que em células não cancerosas do mesmo tecido (isto é, se o gene é superexpresso ou subexpresso no tipo de câncer). Esses bancos de dados são preferidos. Assim, tipos de câncer com super ou subexpressão significativas em termos estatísticos de um gene de interesse podem ser prontamente identificados. Está dentro das capacidades da pessoa versada na técnica utilizar tais recursos para essa finalidade.
[00165] Assim, preferivelmente, o câncer/tumor é como definido em qualquer parte do presente documento, em que a expressão de CDA dentro do dito câncer/tumor é determinada por referência a um banco de dados selecionado dentre banco de dados atlas de expressão de EMBL-EBI (https://www.ebi.ac.uk/gxa/home), o banco de dados GENEVESTIGATOR® (https://genevestigator.com/gv/ ), a Enciclopédia de Linhagem Celular do Câncer (https://portals.broadinstitute.org/ccle ) e o atlas de proteínas humanas (https://www.proteinatlas.org/).
[00166] Preferivelmente, o câncer/tumor não expressa CDA em um nível mais alto do que o nível de expressão em células não cancerosas do mesmo tecido que o câncer/tumor, em que a dita superexpressão é determinada por referência a um banco de dados selecionado dentre o banco de dados atlas de expressão de EMBL-EBI (https://www.ebi.ac.uk/gxa/home), o banco de dados GENEVESTIGATOR® (https://genevestigator.com/gv/ ), a Enciclopédia de Linhagem Celular do Câncer (https://portals.broadinstitute.org/ccle ) e o atlas de proteínas humanas (https://www.proteinatlas.org/).
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[00167] Preferivelmente, o câncer/tumor é um em que o nível de expressão de CDA não é maior do que 90% do nível de expressão de CDA em uma linhagem celular cancerosa de referência como determinado usando o mesmo método sob as mesmas condições, em que a dita linhagem celular cancerosa de referência é MDA-MB-231.
[00168] MDA-MB-231 é uma linhagem celular bem distinguida que é amplamente disponível comercialmente. A MDA-MB-231 linhagem celular é um linhagem celular humana epitelial de câncer de mama que foi estabelecida a partir de um derrame pleural de uma mulher caucasiana de 51 anos com um adenocarcinoma mamário metastático e é uma das linhagens celulares de câncer de mama mais comumente usadas em laboratórios de pesquisa médica. Ela pode ser obtida, por exemplo, na Coleção Europeia de Culturas Celulares Autenticadas (ECACC), catálogo nº 92020424. Como mostrado na Tabela 4A, o nível de expressão de CDA na linhagem celular MDA-MB-231 é 153 TPM.
[00169] A MDA-MB-231 é uma linhagem celular de câncer de mama triplo negativa (TNBC) altamente agressiva, invasiva e de diferenciação fraca visto que não tem expressão de receptor de estrogênio (ER) e receptor de progesterona (PR), assim como amplificação de HER2 (receptor de fator de crescimento epidérmico humano 2). A linhagem celular é reconhecida como pertencendo ao subtipo molecular claudin-low (pobre em claudina) visto que apresenta regulação para baixo de claudina-3 e claudinina-4, baixa expressão do marcador de proliferação Ki-67, enriquecimento para marcadores associados com a transição epitelial-mesenquimal e a expressão de atributos associados com células-tronco de câncer mamário (CSCs), tais como o fenótipo CD44+CD24-/low. Em cultura 3D, a linhagem celular exibe uma morfologia semelhante à endotelial e é distinguida por seu fenótipo invasivo, tendo projeções estelares que muitas vezes fazem a ponte entre múltiplas colônias de células. Condições padrão para a cultura dessa linhagem celular
39 / 108 são bem conhecidas. Condições de cultura preferidas são crescimento a 37◦C no meio de Leibovitz L-15 suplementado com glutamina a 2mM e soro fetal bovino (FBS) a 15%. O meio sustenta o crescimento de células em ambientes sem equilibração com CO2. As células MDA-MB-231 são preferivelmente semeadas em uma densidade entre 1-3 x 104 células/cm2 e submetidas a subcultura quando estão 70-80% confluentes.
[00170] Preferivelmente, o câncer/ tumor é um em que o nível de expressão de CDA não é maior do que 80%, preferivelmente não maior do que 70%, preferivelmente não maior do que 60%, preferivelmente não maior do que 50%, preferivelmente não maior do que 40%, preferivelmente não maior do que 30%, preferivelmente não maior 25% do nível de expressão de CDA em uma linhagem celular cancerosa de referência como determinado usando o mesmo método sob as mesmas condições, em que a dita linhagem celular cancerosa de referência é MDA-MB-231.
[00171] Preferivelmente, o câncer/ tumor é um em que o nível de expressão de CDA é pelo menos 2 vezes mais baixo, preferivelmente pelo menos 2,5 vezes mais baixo, preferivelmente pelo menos 3 vezes mais baixo, preferivelmente pelo menos 3,5 vezes mais baixo, preferivelmente pelo menos 4 vezes mais baixo, preferivelmente pelo menos 4,5 vezes mais baixo do que o nível de expressão de CDA em uma linhagem celular cancerosa de referência como determinado usando o mesmo método sob as mesmas condições, em que a dita linhagem celular cancerosa de referência é MDA- MB-231. “Pelo menos X vezes mais baixo” nesse contexto significa que o nível máximo de expressão de CDA no câncer/tumor é o valor que é exatamente X vezes mais baixo do que o nível de expressão na linhagem celular cancerosa de referência.
[00172] O método e as condições usados para determinar o nível de expressão de CDA no câncer/tumor e na linhagem celular cancerosa de referência podem ser quaisquer método e condições adequados, desde que
40 / 108 sejam usados os mesmos método e condições para determinar o nível de expressão de CDA no câncer/tumor que os usados para determinar o nível de expressão de CDA na linhagem celular cancerosa de referência. A linhagem celular cancerosa de referência é assim um controle. A pessoa versada na técnica é prontamente capaz de determinar o nível de expressão de um gene de interesse, por exemplo, CDA, igualmente em células cancerosas e não cancerosas. Tais métodos são parte do conhecimento geral comum no campo e qualquer método adequado pode ser usado no contexto da presente invenção.
[00173] Por exemplo, o nível de expressão pode ser medido no nível de proteína. Métodos para medir níveis de expressão de proteína são bem conhecidos na técnica. Esses métodos geralmente envolvem colocar uma amostra biológica de interesse em contato com um ou mais reagentes detectáveis que são adequados para medir o nível de expressão da proteína, tal como um anticorpo, e subsequentemente determinar o nível de expressão de proteína com base no nível de reagente detectado, preferivelmente após a normalização. Exemplos de métodos que geralmente envolvem o uso de um anticorpo incluem, sem limitação, Western blot, immunoblot, ensaio de imunoadsorção ligado à enzima (ELISA), ensaio de immunospot ligado à enzima (ELISPOT), radioimunoensaio (RIA), imuno-histoquímica e imunoprecipitação. Outros métodos adequados para medir um nível de expressão de proteína, que não necessariamente envolvem o uso de um anticorpo, podem ser usados, incluindo, sem limitação, separação de células ativadas por fluorescência (FACS), microscopia tal como microscopia de força atômica, citometria de fluxo, microcitometria, ensaio de ligação proteica, ensaio de ligação de ligante, microssérie, eletroforese em gel de poliacrilamida tal como SDS-PAGE, ressonância de plasmônio de superfície (SPR), transferência de energia por ressonância Forster (FRET), transferência de energia por ressonância de bioluminescência (BRET),
41 / 108 quimioluminescência, polarização fluorescente, fosforescência, espectrometria de massa tal como cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa (LC-MS) ou cromatografia líquida/ espectrometria de massa/ espectrometria de massa (LC-MS-MS), ionização/dessorção a laser assistida por matriz - tempo de voo (MALDI-TOF), ionização/dessorção a laser com superfície aumentada - tempo de voo (SELDI-TOF), e imageamento por ressonância magnética (MRI).
[00174] Preferivelmente, no entanto, o nível de expressão gênica, por exemplo, o nível de expressão de CDA, pode ser medido no nível do RNA. Métodos para medir níveis de RNA são bem conhecidos na técnica e qualquer método adequado pode ser usado no contexto da presente invenção. Por exemplo, podem ser usados métodos de microssérie, RT-PCR, PCR quantitativa em tempo real, sequenciamento de RNA, northern blotting, extensão de primer, proteção de RNase e perfilação de expressão de RNA. Preferivelmente, o método usado é RNA-seq ou microssérie. RNA-Seq é um método bem conhecido, que usa sequenciamento de nova geração (NGS) para determinar a presença e quantidade de RNA em uma amostra biológica em um determinado momento.
[00175] Preferivelmente, o método usado para determinar o nível de expressão de CDA em um câncer/tumor de interesse em comparação com o nível de expressão de CDA em uma linhagem celular cancerosa de referência, em que a dita linhagem celular cancerosa de referência é MDA-MB-231, é o “Método A de microssérie” referido abaixo.
[00176] O Método A de microssérie compreende as seguintes etapas: 1) extrair RNA de células cancerosas/tumorais de interesse, a dita extração preferivelmente sendo realizada com o uso de um kit de purificação Total RNA da Norgen (Norgen Biotek Cat. nº 17200);
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2) preparar poli(A)+ RNA a partir do RNA extraído, preferivelmente usando um kit MEGApure de acordo com as instruções do fabricante (Ambion); 3) preparar DNA complementar (cDNA) a partir do poli(A)+ RNA por tratamento com transcriptase reversa, isto é, realizar transcrição reversa; 4) fragmentar o cDNA usando TdT (desoxinucleotidiltransferase terminal); 5) biotinilar os fragmentos de cDNA usando o kit de marcação GeneChip WT Terminal (Affymetrix); 6) repetir as etapas 1 a 5 com uma linhagem celular de referência, em que a dita linhagem celular de referência é MDA-MB-231; 7) hibridizar 5,5 μg dos fragmentos de cDNA biotinilados obtidos na etapa 5 em uma primeira microssérie de DNA a 45° C por 16 horas, e hibridizar 5,5 μg dos fragmentos de cDNA biotinilados obtidos na etapa 6, em uma microssérie de DNA a 45° C por 16 horas, preferivelmente em que as ditas microsséries são as séries GeneChip Human Gene 2.0 ST da Affymetrix (Applied Biosystems); 8) lavar e colorir as microsséries hibridizadas, preferivelmente na GeneChip Fluidics Station 450 da Affymetrix (Applied Biosystems); 9) escanear as ditas microsséries coloridas com o GeneChip Scanner 3000 7G da Affymetrix utilizando o software GeneChipCommand Console® da Affymetrix para produzir dados brutos de valores de sinal na forma de arquivos CEL; 10) normalizar os arquivos CEL para produzir valores de expressão em nível gênico usando a implementação da média multiarranjo robusta (RMA) no pacote de software da Affymetrix (versão 1.36.1), preferivelmente como descrito em R.
A.
Irizarry et al., "Exploration,
43 / 108 normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data". Biostatistics 4, 249-264 (2003); 11) avaliar a qualidade das séries computando expressão relativa em log (RLE) e erro padrão normalizado não escalonado (NUSE) usando o pacote affyPLM (versão 1.34.0). A saída do pacote affyPLM é diagramas de caixa para ambos as distribuições de RLE e NUSE. As séries para as quais os diagramas de caixa de RLE não giram em torno de 0 e séries para as quais os diagramas de caixa de NUSE não giram em torno de 1 são sinalizadas como de baixa qualidade e são excluídas da análise subsequente. Se a série for excluída, então as etapas anteriores do método são repetidas.
[00177] 12) realizar análise de componente principal (PCA) usando a função Prcomp R com valores de expressão que foram normalizados em todas as amostras a uma média de zero e um desvio padrão de um. A PCA é usada como um método de redução de dimensionalidade a fim de reduzir a alta dimensionalidade do conjunto de dados de expressão gênica enquanto se retém a maior parte da variação nos dados. Assim, o desempenho de PCA alcança uma representação dimensional inferior dos dados para análise e visualização posteriores.
[00178] 13) avaliar a expressão diferencial da CDA nas células cancerosas/tumorais de interesse e na linhagem celular de referência MDA- MB-231 usando o teste t moderado (de Bayes empírico) implementado no pacote limma (versão 3.14.4, http://bioinf.wehi.edu.au/limma); em que as etapas 10 a 13 de microssérie são realizadas usando o ambiente R para computação estatística (versão 2.15.1).
[00179] Preferivelmente, o nível de expressão de CDA em um câncer/tumor de interesse em comparação com o nível de expressão de CDA em uma linhagem celular cancerosa de referência, em que a dita linhagem celular cancerosa de referência é MDA-MB-231, é determinado por referência a um banco de dados selecionado dentre o banco de dados atlas de expressão
44 / 108 de EMBL-EBI(https://www.ebi.ac.uk/gxa/home), o banco de dados GENEVESTIGATOR® (https://genevestigator.com/gv/ ), a Enciclopédia de Linhagem Celular do Câncer (https://portals.broadinstitute.org/ccle ) e o atlas de proteínas humanas (https://www.proteinatlas.org/).
[00180] O nível de expressão de um gene é tipicamente apresentado em termos da quantidade relativa de transcritos de RNA nesse gene em comparação com a quantidade total de transcritos de RNA na célula/tecido em questão. O nível de expressão é tipicamente apresentado em unidades de transcritos por milhão (TPM), isto é, para cada 1 milhão de moléculas de RNA dentro da célula/tecido de interesse, uma quantidade [x] veio do gene de interesse. Novamente, o nível de transcrito de RNA em termos de TPM pode ser obtido pela pessoa versada por métodos de rotina, tais como métodos de PCR quantitativa em tempo real ou sequenciamento de RNA, e tais informações estão disponíveis a partir de recursos tais como TCGA, o atlas de expressão de EMBL-EBI, o banco de dados GENEVESTIGATOR® (https://genevestigator.com/gv/ ), a Enciclopédia de Linhagem Celular do Câncer (https://portals.broadinstitute.org/ccle ) e o atlas de proteínas humanas(https://www.proteinatlas.org/), dentro outros. Tais métodos são preferidos no presente documento. A metodologia para a determinação de níveis de expressão gênica em TPM é descrita na literatura, por exemplo, em Wagner et al., (2012) Theory Biosci 131(4):281-285 ou Mortazavi A et al., (2008) “Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.” Nature methods 5(7):621-8.
[00181] Preferivelmente, as células cancerosas/os tumores que superexpressam CDA contêm transcritos de CDA RNA em um nível maior do que 140 TPM. Inversamente, as células cancerosas/ os tumores que não superexpressam CDA preferivelmente contêm transcritos de CDA RNA em um nível ≤140TPM (menos ou igual a 140 TPM). Visto de maneira alternativa, as células cancerosas/os tumores preferidos da invenção têm um
45 / 108 nível de expressão de CDA de ≤140 TPM. Assim, cânceres/tumores particularmente preferidos a serem tratados de acordo com a presente invenção são os que expressam CDA em um nível de ≤140 TPM, mais preferivelmente ≤100 TPM, mais preferivelmente ≤ 50 TPM.
[00182] Preferivelmente, o nível de expressão de CDA em um câncer/tumor de interesse, em unidades de TPM, é obtido por referência a um banco de dados selecionado dentre o banco de dados atlas de expressão de EMBL-EBI (https://www.ebi.ac.uk/gxa/home), o banco de dados GENEVESTIGATOR® (https://genevestigator.com/gv/ ), a Enciclopédia de Linhagem Celular do Câncer (https://portals.broadinstitute.org/ccle ) e o atlas de proteínas humanas (https://www.proteinatlas.org/).
[00183] Preferivelmente, o nível de CDA em unidades de TPM em um câncer/tumor de interesse é determinado por PCR quantitativa em tempo real, ou sequenciamento de RNA (RNA-seq) e quantificação, usando células derivadas do dito câncer/tumor. Preferivelmente, o método usado é sequenciamento de RNA. Preferivelmente, o método usado é o “Método A de RNA-seq” referido abaixo.
[00184] O nível de expressão de um gene em unidades de TPM pode ser determinado usando qualquer método conhecido mas é preferivelmente determinado usando RNA-seq. Os métodos de RNA-seq são bem conhecidos na técnica e estão amplamente disponíveis comercialmente. Qualquer método de RNA-seq adequado pode ser usado a fim de determinar o nível de expressão de CDA em unidades de TPM em um câncer de interesse. O método a seguir, denominado Método A de RNA-seq, é preferido, e compreende as seguintes etapas:
1. extrair RNA total a partir das células cancerosas/tumorais de interesse. Isso pode ser realizado usando kits de extração de RNA padrão, preferivelmente o mini kit QIAGEN AllPrep DNA/RNA (Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante.
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2. Opcionalmente, quantificar e avaliar o RNA extraído quanto à pureza, preferivelmente por uma ferramenta de eletroforese automatizada, preferivelmente um Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). O Bioanalyzer da Agilent é uma plataforma de microfluídica usada para dimensionamento, quantificação e controle de qualidade para RNA (e DNA/ proteínas) e provê um “número de integridade de RNA” (RIN), que quantifica a fragmentação da amostra de RNA. Preferivelmente, as amostras apenas são usadas posteriormente no processo se elas tiverem um RIN de pelo menos 7, preferivelmente pelo menos 8.
[00185] 3. Preparar uma biblioteca de sequenciamento de RNA, preferivelmente usando o kit de preparação de amostras de RNA Illumina TruSeq™ (Illumina, San Diego, CA, EUA) e o protocolo associado. Preferivelmente, 500 a 1.000 μg de RNA total são usados por amostra nesse processo. Esse kit e protocolo são bem conhecidos no campo. Essa etapa compreende as seguintes etapas: 3a. Tratar o RNA extraído para esgotar o RNA ribossômico bacteriano e eucariótico, preferivelmente usando o kit de remoção de rRNA Ribo-Zero (Epicentre, Madison, WI, EUA), seguindo as instruções do fabricante 3b. Tratar o RNA remanescente com transcriptase reversa e hexâmeros aleatórios para criar fragmentos de cDNA de fita única de 100 a 150 bases de comprimento, ou preferivelmente 200 a 300 bases de comprimento.
[00186] 3c. Tratar os fragmentos de cDNA de fita única com DNA Polimerase I e RNase H para produzir fragmentos de DNA complementados com fita dupla (cDNA); e 3d. Ligar adaptadores de RNA-seq aos terminais dos fragmentos de cDNA para produzir uma biblioteca de sequências de adaptador-cDNA capazes de serem analisadas por RNA-seq. Os adaptadores de RNA-seq são
47 / 108 bem conhecidos no campo e quaisquer adaptadores adequados podem ser usados. Adaptadores contêm elementos funcionais que permitem o sequenciamento; por exemplo, um elemento de amplificação e um local de sequenciamento primário. Preferivelmente, os adaptadores são adaptadores de indexação Illumina. Os adaptadores podem ser ligados a uma extremidade de cada fragmento de cDNA para produzir bibliotecas de extremidade única (que resultarão em uma “leitura” por fragmento quando sequenciadas), caso em que o comprimento do fragmento de cDNA na etapa 3b é de 100 a 150 bases. Preferivelmente, no entanto, os adaptadores são ligados a ambas as extremidades de cada fragmento de cDNA para produzir bibliotecas de extremidades emparelhadas (que resultarão em duas “leituras” por fragmento quando sequenciadas, as chamadas “leituras em par” ou “leituras emparelhadas”), caso em que o comprimento do fragmento de cDNA na etapa 3b é de 200 a 300 bases.
[00187] 4. Opcionalmente amplificar as sequências de adaptador-cDNA por PCR. Essa etapa pode ser realizada se a quantidade de DNA for insuficiente para a etapa 5 de análise de sequência a ser realizada. A quantidade de DNA requerida para análise de sequência é bem conhecida pela pessoa versada (preferivelmente 70 a 135 μl, mais preferivelmente 125 μl, de uma solução de 20pM de DNA, são carregados na célula de fluxo do sequenciador na etapa 5). Métodos para avaliar as quantidades de DNA em uma amostra são rotineiros, e qualquer método adequado pode ser usado. Preferivelmente, o método usado é fluorometria, preferivelmente um fluorômetro Qubit® é usado.
[00188] 5. Sequenciar as sequências de adaptador-cDNA, preferivelmente usando um sequenciador Illumina Flowcell, preferivelmente um sequenciador Illumina Flowcell HiSeq 2500 ou um sequenciador Illumina Flowcell NovaSeq 6000, preferivelmente usando um ciclo de sequenciamento de 100 a 150 pares de base se bibliotecas de extremidade única forem
48 / 108 produzidas na etapa 3, mais preferivelmente usando um ciclo de sequenciamento de 200 a 300 pares de base com bibliotecas de extremidades emparelhadas sendo produzidas na etapa 3. Preferivelmente, 70 a 135 μl, mais preferivelmente 125 μl, de uma solução de 20pM de DNA, são carregados na célula de fluxo. O conjunto de dados brutos obtido proverá um identificador de sequência exclusivo para cada fragmento analisado, sua sequência (uma chamada “leitura”), e uma indicação da confiança na determinação do sequenciador da sequência em cada posição de base dentro da leitura (uma chamada pontuação de qualidade Phred).
[00189] 6. Preparar um conjunto de dados de leituras com filtragem por qualidade removendo do conjunto de dados de sequências determinadas: ii) as bases dentro de uma leitura que tenham uma pontuação de qualidade Phred de menos do que 10; ii) as bases dentro de uma leitura que estejam a jusante de (isto é, subsequentes na direção de sequenciamento a) uma base na mesma leitura com uma pontuação de qualidade Phred de menos do que 10; iii) as leituras que contenham quaisquer bases indeterminadas (“sem denominação”) (“N”); iv) as leituras que mapeiem a um genoma de referência de contaminante, em que o dito genoma de referência de contaminante é o genoma de E. coli; e v) se a biblioteca de RNA-seq usada for uma biblioteca de extremidades emparelhadas, as leituras cuja “leitura em par” foi descartada em uma das etapas 6(iii) a 6(iv).
[00190] 7. Alinhar as leituras com filtragem por qualidade ao genoma da espécie do indivíduo, isto é, preferivelmente o genoma humano. Preferivelmente as leituras com filtragem por qualidade são alinhadas ao genoma de referência humano do banco de dados Ensembl versão 98, preferivelmente o genoma humano GRCh38 e o banco de dados Ensembl de
49 / 108 atributos gênicos de referência (versão Ensembl Genomes 45, GENCODE 32). As ferramentas de alinhamento adequadas para essa etapa são bem conhecidas, amplamente disponíveis e qualquer ferramenta de alinhamento adequada pode ser usada. Preferivelmente, a ferramenta de alinhamento é TopHat2 (versão 2.1.1) [Trapnell et al., (2010) Nature Biotechnology 28, 511- 515].
[00191] 8. Determinar o número de contagens de leitura para o gene de CDA e, opcionalmente, quaisquer outros genes de interesse. As ferramentas de bioinformática para essa etapa são bem conhecidas, amplamente disponíveis e qualquer ferramenta adequada pode ser usada. Preferivelmente, as contagens de leitura por gene são determinadas usando o pacote HTSeq (htseq-count). Essa etapa, assim, provê dados brutos de contagem de leitura.
[00192] 9. Converter os dados brutos de contagem de leitura obtidos na etapa 8 em unidades de transcritos por milhão (TPM). Essa é uma operação matemática padrão, usada rotineiramente no campo. Prover dados de contagem em unidades de TPM permite uma avaliação significativa de níveis de expressão gênica porque a determinação de valores de TPM envolve normalizar os dados brutos para i) comprimento do gene; e ii) profundidade de sequenciamento.
[00193] i) No que se refere à normalização do comprimento do gene, nos dados brutos, uma contagem de leitura mais alta pode ser observada em genes mais longos puramente porque os genes são mais longos e, portanto, mais fragmentos se alinham com esse gene. A normalização para o comprimento do gene compreende dividir as contagens de leitura de cada gene pelo comprimento do gene (em quilobases).
[00194] ii) a profundidade de sequenciamento é um efeito entre amostras que altera a comparação de contagens de leitura entre o mesmo gene em diferentes amostras. A fim de normalizar isso, as contagens de leitura por quilobase obtidas na etapa 9 i) são divididas por um “fator de escalonamento
50 / 108 por milhão”, que é ele próprio obtido dividindo-se o número total de leituras em uma amostra por 1 milhão.
[00195] Os dados de expressão gênica obtidos usando RNA-seq podem ser apresentados em unidades de RPKM (leituras por milhão de quilobase). Isso é calculado i. dividindo-se o número total de leituras em uma amostra por
1.000.000 para prover um “fator de escalonamento por milhão”; ii. dividindo-se as contagens de leitura por gene pelo fator de escalonamento "por milhão", o que normaliza para profundidade de sequenciamento, provendo, assim, unidades de leituras por milhão (RPM); e iii. dividindo-se os valores de RPM pelo comprimento do gene, em quilobases, o que normaliza para comprimento do gene, provendo, assim, unidades de RPKM.
[00196] Outra unidade de expressão gênica é fragmentos por milhão de quilobase (FPKM), que é muito similar à RPKM. A RPKM é aplicável quando RNA-seq de extremidade única é usado, em que cada leitura corresponde a um único fragmento que foi sequenciado. A FPKM é aplicável para RNA-seq de extremidades emparelhadas, em que duas leituras podem corresponder a um único fragmento, ou, se uma leitura no par não mapeou, uma leitura pode corresponder a um único fragmento. A única diferença entre RPKM e FPKM é que o FPKM leva em consideração que duas leituras podem mapear a um fragmento (e, portanto, não conta esse fragmento duas vezes).
[00197] O TPM é muito similar à RPKM e ao FPKM. A única diferença é a ordem das operações (i) a (iii) acima. Assim, o TPM é determinado da seguinte forma: i. dividindo-se as contagens de leitura por gene pelo comprimento do gene, em quilobases, o que normaliza para o comprimento do gene, provendo, assim, unidades de leituras por quilobase (RPK);
51 / 108 ii. dividindo-se o valor de RPK total em uma amostra por
1.000.000 para prover um “fator de escalonamento por milhão”; e iii. dividindo-se os valores de RPK obtidos na etapa (i) pelo fator de escalonamento "por milhão" obtido na etapa (ii), o que normaliza para a profundidade de sequenciamento, provendo, assim, unidades de TPM.
[00198] A única diferença ao se calcular o TPM em comparação com a RPKM ou o FPKM é que, ao se calcular o TPM, a normalização para o comprimento do gene é realizada primeiro. No entanto, o resultado é que, ao se usar unidades de TPM, a soma de todos os TPMs em cada amostra é a mesma – 1 milhão. Isso permite uma comparação mais significativa da proporção de leituras que mapearam a um gene em cada amostra.
[00199] O Método A de RNA-seq acima descrito, de determinação do nível de expressão de CDA em unidades de TPM, pode também ser usado para determinar o nível de expressão de CDA em um câncer/tumor de interesse, em unidades de TPM, em comparação com um controle, isto é, células de controle, como definido acima, ou uma linhagem celular de referência, em que a dita linhagem celular de referência é MDA-MB-231. Nessas modalidades, o Método A de RNA-seq pode ser realizado usando as células cancerosas/tumorais de interesse e repetido com as células de controle ou referência, em que os valores de TPM determinados são então comparados. Alternativamente, o Método A de RNA-seq pode ser realizado usando as células cancerosas/tumorais de interesse e o nível de expressão de CDA determinado em unidades de TPM é comparado com um valor para o nível de expressão de CDA em unidades de TPM obtido anteriormente com o uso da linhagem celular de controle ou referência usando o mesmo método.
[00200] Alternativamente, o nível de expressão de um gene pode ser determinado por meio de microssérie, que é uma técnica padrão no campo. Qualquer técnica de microssérie adequada pode ser usada no contexto da
52 / 108 presente invenção. As microsséries permitem a detecção da expressão de milhares de genes simultaneamente.
[00201] O nível de expressão gênica determinado por microssérie pode ser expresso em qualquer escala, por exemplo, uma escala linear. Os dados de microsséries podem também ser transformados, preferivelmente pela transformação de logaritmo base 2, que tem a vantagem de produzir um espectro contínuo de valores e tratar de maneira similar genes supra e hiporregulados. Um gene suprarregulado em um fator de 2 tem um valor de 1 transformado por log2.
[00202] Preferivelmente, o câncer/tumor é um em que o nível de expressão de CDA transformado por logaritmo base 2 é menor do que 11,75. Tais cânceres/ tumores são descritos como não superexpressando CDA. Preferivelmente o câncer/ tumor é um em que o nível de expressão de CDA transformado por logaritmo base 2 é menor do que 11,5, mais preferivelmente menor do que 11, mais preferivelmente menor do que 10,5, mais preferivelmente menor do que 10, mais preferivelmente menor do que 9,5.
[00203] Preferivelmente, o câncer/ tumor é um em que o nível de expressão de CDA linear é menor do que 6.500. Tais cânceres/tumores são descritos como não superexpressando CDA. Preferivelmente o câncer/tumor é um em que o nível de expressão de CDA linear é menor do que 6.000, mais preferivelmente menor do que 5.000, mais preferivelmente menor do que
4.000, mais preferivelmente menor do que 3.000, mais preferivelmente menor do que 2.000, mais preferivelmente menor do que 1.500.
[00204] Preferivelmente, o nível de expressão de CDA transformado por logaritmo base 2 ou linear em um câncer/tumor de interesse é obtido por referência a um banco de dados selecionado dentre o banco de dados atlas de expressão de EMBL-EBI (https://www.ebi.ac.uk/gxa/home), o banco de dados GENEVESTIGATOR® (https://genevestigator.com/gv/ ), a Enciclopédia de Linhagem Celular do Câncer
53 / 108 (https://portals.broadinstitute.org/ccle ) e o atlas de proteínas humanas (https://www.proteinatlas.org/).
[00205] A pessoa versada está ciente de que pode haver variação nos níveis de expressão de alguns genes entre tumores do mesmo tipo de câncer. Por exemplo, alguns cânceres de mama podem superexpressar CDA e outros podem não superexpressar CDA. Assim, preferivelmente, os cânceres/ tumores descritos em qualquer outra parte no presente documento como preferido são preferivelmente cânceres/tumores dos tipos em que CDA é expressa, preferivelmente em que CDA é: i) superexpressa; ii) não superexpressa; iii) subexpressa; iv) não subexpressa; v) superexpressa ou subexpressa; ou vi) nem superexpressa nem subexpressa.
[00206] Preferivelmente, o câncer/tumor é um em que a CDA não é superexpressa. Preferivelmente, o câncer/tumor é um em que a CDA é superexpressa. A superexpressão de CDA é como definido acima.
[00207] Inversamente, os cânceres descritos em qualquer outra parte no presente documento como não preferido são preferivelmente apenas cânceres/tumores dos tipos em que CDA é: i) superexpressa; ii) não superexpressa; iii) subexpressa; iv) não subexpressa; v) superexpressa ou subexpressa; ou vi) nem superexpressa nem subexpressa.
[00208] Preferivelmente, o câncer/tumor não é um em que a CDA é superexpressa. A superexpressão de CDA é como definido acima.
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[00209] Em uma modalidade preferida, o câncer/tumor é resistente a tratamento com gemcitabina e/ou citarabina. Assim, os cânceres/ tumores descritos em qualquer outra parte no presente documento como preferido são preferivelmente cânceres/tumores dos tipos que são resistentes a tratamento com gemcitabina e/ou citarabina. Preferivelmente, o câncer/tumor resistente a gemcitabina e/ou citarabina é câncer de cérebro, preferivelmente glioma, mais preferivelmente glioblastoma multiforme.
[00210] A proteína humana O-6-metilguanina-DNA metiltransferase (MGMT) remove danos de DNA alquilado. A expressão de MGMT torna as células cancerosas, tais como células de glioblastoma, quase completamente resistentes aos efeitos citotóxicos da temozolomida, que exerce sua atividade quimioterápica contra câncer mutando células tumorais de maneira tão severa que as células tumorais são exterminadas. A temozolomida funciona alquilando DNA, causando, assim, mutações.
[00211] Como mostrado nos presentes exemplos, os compostos da fórmula (I) não são mutágenos em um ensaio de HPRT. Por conseguinte, os compostos da fórmula (I) são de uso particular no tratamento de cânceres em que MGMT é expressa, preferivelmente superexpressa. Assim, os cânceres/ tumores descritos em qualquer outra parte no presente documento como preferido são preferivelmente cânceres/tumores dos tipos em que MGMT é expressa, preferivelmente superexpressa.
[00212] A temozolomida (4-metil-5-oxo-2,3,4,6,8- pentazabiciclo[4.3.0]nona-2,7,9-trieno-9-carboxamida) é o tratamento inicial para glioblastoma multiforme e é também usada no tratamento de alguns outros cânceres de cérebro. Como mostrado nos presentes exemplos, no entanto, a temozolomida extermina efetivamente menos da metade das linhagens celulares de glioblastoma avaliadas, e as linhagens celulares resistentes a temozolomida são efetivamente exterminadas pelos compostos
55 / 108 da invenção. Assim, em uma modalidade preferida, o câncer/tumor é câncer/tumor resistente a temozolomida.
[00213] Assim, os cânceres/ tumores descritos em qualquer outra parte no presente documento como preferido são preferivelmente cânceres/tumores dos tipos que são resistentes ao tratamento com temozolomida. Preferivelmente, o câncer/tumor resistente a temozolomida é câncer de cérebro, preferivelmente glioma, mais preferivelmente glioblastoma multiforme.
[00214] Como mostrado nos presentes exemplos, linhagens celulares resistentes a 5-fluorouracil são efetivamente exterminadas pelos compostos da invenção. Assim, em uma modalidade preferida, o câncer é câncer resistente a fluoropirimidina. Assim, os cânceres/ tumores descritos em qualquer outra parte no presente documento como preferido são preferivelmente cânceres/tumores dos tipos que são resistentes a tratamento com fluoropirimidina. Preferivelmente o câncer/tumor resistente a fluoropirimidina é câncer de cérebro, preferivelmente glioma, mais preferivelmente glioblastoma multiforme. Preferivelmente, a fluoropirimidina é 5-fluorouracil.
[00215] Preferivelmente, o câncer/tumor é resistente tanto a tratamento com temozolomida quanto a tratamento com fluoropirimidina.
[00216] O termo “resistente” no contexto de terapia contra câncer/tumor tem um significado claro e bem entendido na técnica. Por “resistente” quer-se dizer que o câncer/tumor não responde positivamente ao tratamento com o(s) agente(s) anticâncer em questão, isto é, que o tratamento com o(s) agente(s) anticâncer não reduz, alivia, melhora ou elimina o câncer, ou um ou mais sintomas do mesmo, ou reduz ou elimina células cancerosas dentro do tumor, em relação ao câncer, tumor ou sintoma antes do tratamento. Um câncer/tumor pode ser resistente no início do tratamento, ou pode se tornar resistente durante o tratamento.
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[00217] Como mencionado acima, no tratamento ou prevenção de câncer, o composto da fórmula (I) pode ser usado sozinho ou opcionalmente em combinação com um outro, isto é, um ou mais outros, agente anticâncer. Em todos os aspectos e modalidades da presente invenção, o outro agente anticâncer pode ser qualquer agente anticâncer adequado conhecido na técnica. Uma ampla faixa de diferentes tipos de agentes é conhecida ou proposta para uso no tratamento de câncer e qualquer um deles pode ser usado, independentemente da natureza química ou modo de ação.
[00218] Os agentes anticâncer, assim, incluíram moléculas químicas quer natural quer sinteticamente derivadas ou preparadas (por exemplo, moléculas químicas pequenas orgânicas) e moléculas biológicas tais como proteínas e peptídeos (por exemplo, agentes de imunoterapia como discutido abaixo). Os fármacos anticâncer, assim, incluem agentes ou fármacos quimioterápicos, que podem estar em uma ampla faixa de diferentes classes químicas ou funcionais, assim como anticorpos ou derivados de anticorpo e outras moléculas biológicas que agem, por exemplo, para estimular, ativar ou intensificar vários processos fisiológicos ou células no corpo, por exemplo, respostas ou células imunológicas e/ou anti-inflamatórias, etc.
[00219] Exemplos representativos de agentes anticâncer na classe de “quimioterapia” incluem, mas não se limitam a, fludarabina, gemcitabina, capecitabina, metotrexato, taxol, taxotere, mercaptopurina, tioguanina, hidroxiureia, citarabina, ciclofosfamida, ifosfamida, nitrosoureias, complexos de platina tais como cisplatina, carboplatina e oxaliplatina, mitomicina, dacarbazina, procarbazina, etoposídeo, teniposídeo, campatecinas, bleomicina, doxorrubicina, idarrubicina, daunorrubicina, dactinomicina, plicamicina, mitoxantrona, L-asparaginase, epimbicm, 5-fluorouracil, taxanos tais como docetaxel e paclitaxel, leucovorina, levamisol, irinotecano, estramustina, etoposídeo, mostardas nitrogenadas, BCNU, nitrosoureias tais como carmustina e lomustina, vinca alcaloides tais como vinblastina,
57 / 108 vincristina e vinorelbina, mesilato de imatinibe, hexametinelamina, ou topoteca.
[00220] Agentes anticâncer podem incluir inibidores de quinase, inibidores de fosfatase, inibidores de ATPase, tirfostinas, inibidores de protease, herbimicina A, genisteína, erbstatina, e lavendustina A.
[00221] Em uma modalidade, o agente anticâncer pode ser selecionado dentre, mas não é limitado a, um ou uma combinação da seguinte classe de agentes: agentes alquilantes, alcaloides vegetais, inibidores de DNA topoisomerase, antifolatos, análogos de pirimidina, análogos de purina, antimetabólitos de DNA, taxanos, podofilotoxina, terapias hormonais, retinoides, fotossensibilizantes ou agentes para uso em terapias fotodinâmicas, inibidores de angiogênese, agentes antimitóticos, inibidores de isoprenilação, inibidores de ciclo celular, actinomicinas, bleomicinas, antraciclinas, inibidores de MDR e inibidores de Ca2+ ATPase.
[00222] Outros agentes anticâncer podem ser selecionados dentre, mas não são limitados a, citoquinas, quimiocinas, fatores de crescimento, fatores inibitórios de crescimento, hormônios, receptores solúveis, receptores chamarizes, anticorpos monoclonais ou policlonais, anticorpos monoespecíficos, biespecíficos ou multiespecíficos, monocorpos, policorpos.
[00223] Agentes anticâncer alternativos podem ser selecionados dentre, mas não são limitados a, fatores de crescimento ou hematopoéticos tais como eritropoetina e trombopoetina, e miméticos de fator de crescimento dos mesmos.
[00224] Em uma modalidade representativa, o fármaco é uma molécula pequena e, mais particularmente, um agente quimioterápico de molécula pequena. Um agente de molécula pequena pode ser definido como tendo um peso molecular de menos do que 2.000 Da, mais particularmente menos do que 1.800, 1.500, 1.200, 1.000, 900, 800 ou 700 Da, tipicamente menos do que 1.000 Da. Por exemplo, um agente de molécula pequena pode ter um
58 / 108 tamanho na faixa de 100 a 1.000 Da, por exemplo 100 a 800 Da ou 300 a 700 Da.
[00225] Em uma modalidade alternativa, o outro agente anticâncer é um agente de imunoterapia. A indução de uma resposta imunológica para tratar câncer é conhecida como “imunoterapia” contra câncer. A imunoterapia pode envolver, por exemplo, terapias baseadas em transplante de células, terapias com anticorpo ou terapias com citoquina. Todas as três abordagens exploram o fato de que células cancerosas muitas vezes têm diferentes marcadores de superfície celular, ou antígenos de câncer, que são detectáveis pelo sistema imunológico. Esses antígenos são mais comumente proteínas, mas pode também incluir outras moléculas, tais como carboidratos. Outro exemplo de imunoterapia é por inibição de checkpoint, por meio da qual proteínas de checkpoint são inibidas. Isso é discutido mais abaixo.
[00226] A imunoterapia é, assim, usada para provocar o sistema imunológico a atacar células cancerosas e, como discutido mais abaixo, várias moléculas podem ser o alvo de abordagens baseadas em imunoterapia. Por exemplo, alvos para intervenção imunoterápica em câncer incluem proteínas de “CD” (“agrupamento de diferenciação”) tais como CD52, CD30, CD33, CD20, CD152 (também conhecida como CTLA4) e CD279 (também conhecida como proteína PD-1 de morte celular programada 1); fatores de crescimento tais como fator de crescimento endotelial vascular (VEGF); receptores de fator de crescimento tais como receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) ou receptor de fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER2); gene de ativação de linfócito 3 (LAG3); e proteínas de família B7 tais como B7-H3 e B7-H4. Esses são exemplos meramente representativos, no entanto, e outras moléculas podem ser alvos para intervenção imunoterápica em câncer.
[00227] O agente de imunoterapia pode ser um peptídeo, polipeptídeo ou proteína. O agente de imunoterapia pode ser selecionado dentre um anticorpo,
59 / 108 uma citoquina e um inibidor de checkpoint. Como observado acima, um anticorpo anticâncer terapêutico pode ter uma faixa de alvos, incluindo proteínas de checkpoint. Assim, um anticorpo pode ser um inibidor de checkpoint.
[00228] Assim, em um primeiro exemplo, o agente imunoterápico é um anticorpo. O anticorpo pode ser selecionado dentre anticorpos monoclonais ou policlonais, anticorpos monoespecíficos, biespecíficos ou multiespecíficos, monocorpos e policorpos ou de fato dentre qualquer uma das muitas moléculas semelhantes a anticorpos ou derivadas de anticorpos conhecidas na técnica hoje em dia. Por conseguinte, o termo “anticorpo” é usado de maneira ampla no presente documento e inclui qualquer tal anticorpo e qualquer fragmento, derivado ou variante de anticorpo como é conhecido na técnica. O anticorpo pode ser de qualquer espécie, classe ou subtipo convenientes ou desejados. Ademais, o anticorpo pode ser natural, derivado ou sintético.
[00229] O anticorpo pode, por conseguinte, ser: (a) qualquer uma das várias classes ou subclasses de imunoglobulina, por exemplo, IgG, IgA, IgM, IgD ou IgE, derivadas de qualquer animal, por exemplo, qualquer um dos animais convencionalmente usados, por exemplo, carneiro, coelhos, cabras, ou camundongos ou gema de ovo; (b) anticorpos monoclonais ou policlonais; (c) anticorpos intactos ou fragmentos de anticorpos, monoclonais ou policlonais, os fragmentos sendo aqueles que contêm a região de ligação do anticorpo, por exemplo, fragmentos desprovidos da porção Fc (por exemplo Fab, Fab', F(ab')2, Fv), os chamados fragmentos de "meia molécula" obtidos por clivagem redutora das ligações de dissulfeto que conectam os componentes de cadeia pesada no anticorpo intacto. Fv pode ser definido como um fragmento que contém a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada expressas como duas cadeias;
60 / 108 (d) anticorpos produzidos ou modificados por DNA recombinante ou outras técnicas sintéticas, incluindo anticorpos monoclonais, fragmentos de anticorpos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, ou estruturas semelhantes a anticorpos sinteticamente produzidas ou alteradas.
[00230] Também incluídos estão derivados funcionais ou "equivalentes" de anticorpos, por exemplo, anticorpos de cadeia única. Um anticorpo de cadeia única pode ser definido como uma molécula geneticamente modificada que contém a região variável da cadeia leve, a região variável da cadeia pesada, ligadas por um linker polipeptídico adequado como uma molécula de cadeia única fundida. Métodos para produzir anticorpos e os fragmentos e derivados dos anticorpos são bem conhecidos na técnica.
[00231] Em uma modalidade preferida, o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
[00232] Em muitos casos, anticorpos monoclonais são anticorpos sem modificação, e a maior parte dos anticorpos terapêuticos atualmente usados se enquadram nessa categoria. No entanto, em uma modalidade da presente invenção, o anticorpo, por exemplo, um anticorpo monoclonal, é conjugado ou fundido a uma outra molécula adicional, por exemplo, uma substância tóxica ou uma substância radioativa. Assim, anticorpos conjugados ou fundidos são unidos a outra molécula, que é ou tóxica a células (por exemplo, um fármaco) ou radioativa. O anticorpo se aglutina a antígenos específicos na superfície de células cancerosas e direciona a toxina ou radiação ao tumor.
[00233] Anticorpos conhecidos e aprovados incluem: Alemtuzumabe, Bevacizumabe, Brentuximabe vedotina, Cetuximabe, Gemtuzumabe ozogamicina, Ibritumomabe tiuxetano, Ipilimumabe, Ofatumumabe, Panitumumabe, Rituximabe, Tositumomabe e Trastuzumabe.
[00234] Em um segundo exemplo, o agente imunoterápico é uma citoquina. Citoquinas incluem agentes imunomoduladores, tais como interleucinas (IL) e interferons (IFN) e também fatores estimulantes de
61 / 108 colônia, fatores de necrose tumoral (TNF) e outras moléculas reguladoras. As citoquinas foram classificadas como linfocinas, interleucinas e quimiocinas, com base em sua função, célula de secreção, ou alvo de ação. Cada citoquina tem um receptor de superfície celular correspondente, que inicia cascatas de sinalização intracelular que alteram as funções celulares. No contexto de câncer, citoquinas são produzidas por muitos tipos de células presentes dentro de um tumor. As citoquinas são bem conhecidas na técnica e todas tais citoquinas são abrangidas para uso de acordo com a invenção. Assim sendo, em uma modalidade o agente imunoterápico é uma citoquina. Em uma modalidade preferida, a citoquina é uma interleucina ou um interferon.
[00235] As interleucinas são um grupo de citoquinas com uma ampla variedade de efeitos sobre o sistema imunológico. Exemplos de interleucinas (ILs) são IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL- 12, IL-13, IL-15 e IL-17.
[00236] Interferons são citoquinas produzidas pelo sistema imunológico normalmente envolvidas em resposta antiviral, mas também têm uso no tratamento de câncer. Existem três grupos de interferons (IFNs): tipo I (IFNα e IFNβ), tipo 2 (IFNγ) e o tipo III (IFNλ), encontrado há relativamente pouco tempo.
[00237] Todas as formas conhecidas das citoquinas discutidas acima podem ser usadas na presente invenção, incluindo também variantes, derivados e fragmentos funcionalmente equivalentes das mesmas. Assim, o termo "citoquina" como usado no presente documento inclui variantes de sequência de aminoácidos de polipeptídeos de citoquina conhecidos, e fragmentos de um polipeptídeo de citoquina, ou derivado do mesmo, desde que tais fragmentos, variantes ou derivados sejam ativos, ou "funcionais", isto é, retenham pelo menos uma função ou atividade (por exemplo, atividade biológica) da citoquina relevante. A citoquina pode ser um polipeptídeo recombinante, um polipeptídeo sintético ou pode ser isolada de uma fonte
62 / 108 natural. Citoquinas adequadas estão comercialmente disponíveis e seriam conhecidas à pessoa versada, por exemplo, citoquinas humanas estão disponíveis junto à GenScript (Piscataway, NJ, EUA).
[00238] Em um terceiro exemplo, o agente imunoterápico é um agente que alveja um checkpoint imunológico, ou seja, é um inibidor de checkpoint. As proteínas de checkpoint mantêm o sistema imunológico sob controle indicando ao sistema imunológico que células são saudáveis e que células devem ser destruídas. As proteínas de checkpoint agem como um “freio” sobre o sistema imunológico prevenindo a ativação de células T. Se uma célula não tiver proteínas de checkpoint suficientes em sua superfície, ela pode ser destruídas pelo sistema imunológico. No caso de células cancerosas, embora possa haver moléculas sinalizando que a célula é cancerosa, se houver proteínas de checkpoint suficientes na superfície celular, a célula pode evadir a resposta imunológica, e foi especulado que proteínas de checkpoint contribuem para a falta de sucesso em algumas imunoterapias contra câncer.
[00239] Diversos inibidores de checkpoint são conhecidos e podem ser usados na presente invenção, por exemplo, os inibidores descritos em Creelan (2014), Cancer Control 21:80-89.
[00240] Exemplos de inibidores de checkpoint incluem: Tremelimumabe (CP-675,206); Ipilimumabe (MDX-010); Nivolumabe (BMS-936558); MK- 3475 (anteriormente lambrolizumabe); Urelumabe (BMS-663513); anticorpo monoclonal antiLAG-3 (BMS-986016); e Bavituximabe (3G4 quimérico). Todos esses inibidores de checkpoint podem ser usados na presente invenção.
[00241] Uma opção alternativa para imunoterapia é relacionada a terapias de célula imunológica, e a presente invenção pode também ser usada em combinação com tais terapias, por exemplo, transferência adotiva de células. Inúmeras terapias baseadas em transplante de células T para tratar câncer foram desenvolvidas, e esses tratamentos, conhecidos como transferência adotiva de células (ACT), tornaram-se cada vez mais atrativos durante os
63 / 108 últimos anos. Três principais estratégias de ACT foram exploradas até o momento. A primeira dessas, e a mais desenvolvida, envolve o isolamento das próprias células T reativas a tumor do paciente de locais periféricos ou tumorais (conhecidos como linfócitos infiltrantes de tumor (TILs)). Essas células são expandidas ex vivo e reinjetadas em um paciente.
[00242] Estão disponíveis duas terapias alternativas, que envolvem a modificação das próprias células T de um paciente com receptores capazes de reconhecer um tumor. Em uma opção, TcRs com atividade direcionada a um antígeno de câncer podem ser isolados e distinguidos, e um gene que codifica o TcR pode ser inserido nas células T e reinjetado em um paciente. Essa terapia mostrou-se encolher tumores sólidos em alguns pacientes, mas é associada com uma desvantagem significativa: os TcRs usados precisam corresponder ao tipo imunológico de um paciente. Por conseguinte, como uma alternativa ao uso de TcRs, terapias envolvendo a expressão de receptores quiméricos de antígeno (CARs) em células T também foram sugeridas. CARs são proteínas de fusão que compreendem um anticorpo ligado ao domínio de sinalização do complexo de TcR e podem ser usados para direcionar células T contra um tumor se um anticorpo adequado for selecionado. Diferentemente de um TCR, um CAR não precisa corresponder em termos de MHC ao recebedor.
[00243] Alternativamente, a célula pode ser uma célula "natural killer" (NK), que opcionalmente pode ser modificada para expressar um CAR.
[00244] Assim sendo, de acordo com a presente invenção, o agente imunoterápico pode ser uma célula, particularmente uma célula imunológica, tal como um linfócito, particularmente uma célula T ou célula NK como descrito acima, por exemplo, a célula T pode ser um TIL ou ser modificada para expressar um TcR ou CAR. A NK pode ser modificada para expressar um CAR.
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[00245] Uma opção alternativa para o outro agente anticâncer é um microRNA (miRNA). MicroRNAs são pequenas moléculas de RNA não codificantes (que contêm cerca de 22 nucleotídeos) encontradas em plantas, animais e alguns vírus, que funcionam no silenciamento de RNA e regulação pós-transcricional de expressão gênica. miRNAs funcionam por meio de emparelhamento de base com sequências complementares dentro de moléculas de mRNA. Como resultado, essas moléculas de mRNA são silenciadas por clivagem da fita de mRNA em dois pedaços, desestabilização do mRNA através do encurtamento de sua cauda poli(A), ou tradução menos eficiente do mRNA em proteínas. miRNAs se assemelham aos siRNAs mencionados acima, exceto pelo fato de que miRNAs derivam de regiões de transcritos de RNA que se dobram sobre si mesmas para formar grampos curtos, enquanto que siRNAs derivam de regiões mais longas de RNA de fita dupla. Constatou-se que muitos miRNAs têm ligações com vários tipos de câncer e, por conseguinte, são por vezes chamados de "oncomirs".
[00246] MicroRNAs podem ser usados em terapêuticas oncológicas baseadas em microRNA no tratamento de câncer. A lógica por trás de desenvolver terapêuticas com miRNA é baseada na premissa de que miRNAs expressos de forma aberrante desempenham papéis fundamentais no desenvolvimento de cânceres e de que corrigir essas deficiências de miRNA ou antagonizando ou restaurando a função do miRNA pode prover um benefício terapêutico, por exemplo, por terapia de substituição de miRNA.
[00247] Qualquer miRNA adequado pode ser usado como o outro agente anticâncer de acordo com a presente invenção. O miRNA pode ser em forma livre, isto é, não ligado a outra molécula. Alternativamente, o miRNA pode ser conjugado ou ligado a outra molécula, por exemplo, um anticorpo como discutido no presente documento.
[00248] O mais preferivelmente, o outro agente anticâncer é selecionado do grupo que consiste em temozolomida, 5-fluorouracil, gemcitabina,
65 / 108 citarabina e gliadel (RTM). Preferivelmente, o outro agente anticâncer é temozolomida. Preferivelmente, o outro agente anticâncer é 5-fluorouracil. Preferivelmente, o outro agente anticâncer é gemcitabina. Preferivelmente, o outro agente anticâncer é citarabina. Preferivelmente, o outro agente anticâncer é gliadel (RTM).
[00249] O composto da fórmula (I) e o outro agente anticâncer podem ser usados de acordo com a presente invenção na forma de uma composição, isto é, uma composição farmacêutica. A presente invenção provê uma composição farmacêutica que compreende um composto da fórmula (I) e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitável, que compreende opcionalmente um outro agente anticâncer.
[00250] O produto (em particular um produto farmacêutico) que compreende um composto da fórmula (I) e outro(s) (isto é, um ou mais outros ou segundos) agente(s) anticâncer pode ser uma preparação combinada para uso separado, sequencial ou simultâneo no tratamento ou prevenção de câncer (isto é, de um tumor), ou pode ser um produto em que o composto da fórmula (I) é coformulado com um outro agente anticâncer.
[00251] Assim, o composto da fórmula (I) e o outro agente anticâncer podem ser formulados juntos em uma única composição ou em composições separadas para separar a administração. Isso dependerá da natureza do outro agente anticâncer e seu modo de administração selecionado ou requerido.
[00252] As composições para uso na invenção podem ser formuladas de qualquer maneira conveniente de acordo com técnicas e procedimentos conhecidos na técnica farmacêutica, por exemplo, usando um ou mais diluentes, carreadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Tais formulações podem ser para uso farmacêutico ou veterinário. Diluentes, excipientes e carreadores adequados para uso em tais formulações são conhecidos pela pessoa versada.
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[00253] "Farmaceuticamente aceitável" como referido no presente documento se refere a ingredientes que são compatíveis com outros ingredientes das composições assim como fisiologicamente aceitáveis para o recebedor. A natureza da composição e de carreadores ou materiais excipientes, dosagens etc. pode ser selecionada de maneira rotineira de acordo com a escolha e a via de administração desejada, finalidade do tratamento, etc.
[00254] Assim, "farmaceuticamente" ou "farmaceuticamente aceitável" se refere a entidades moleculares e composições que não produzam uma reação adversa, alérgica ou outra reação desfavorável quando administradas a um mamífero, especialmente um humano, conforme apropriado. Um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável se refere a uma carga, diluente, material encapsulante ou formulação auxiliar sólidos, semissólidos ou líquidos não tóxicos de qualquer tipo.
[00255] As composições farmacêuticas contêm veículos que são farmaceuticamente aceitáveis para formulação. Estes podem ser em particular soluções isotônicas, estéreis, salinas (fosfato monossódico ou dissódico, sódio, potássio, cálcio ou cloreto de magnésio e similares ou misturas de tais sais), ou composições secas, secadas por congelamento que, mediante a adição, dependendo do caso, de água esterilizada ou solução salina fisiológica, permitem a administração de soluções.
[00256] Os compostos da invenção podem ser apresentados nas formas farmacológicas de administração convencionais, tais como comprimidos, comprimidos revestidos, sprays nasais, soluções, emulsões, lipossomas, pós, cápsulas ou formas de liberação lenta. Excipientes farmacêuticos convencionais assim como os métodos usuais de produção podem ser empregados para a preparação dessas formas.
[00257] Para preparar composições farmacêuticas, uma quantidade eficaz de um composto da fórmula (I) ou outro fármaco anticâncer de acordo com a
67 / 108 invenção pode ser dissolvida ou dispersa em um carreador ou meio aquoso farmaceuticamente aceitáveis. As composições podem compreender qualquer carreador, diluente ou excipiente conhecidos. Por exemplo, formulações que são adequadas para administração parenteral convenientemente compreendem soluções e/ou suspensões aquosas estéreis de ingredientes farmaceuticamente ativos preferivelmente tornadas isotônicas com o sangue do recebedor, geralmente usando cloreto de sódio, glicerina, glicose, manitol, sorbitol e similares.
[00258] Excipientes que podem ser incluídos em qualquer composição farmacêutica incluem conservantes (tais como p-hidroxibenzoatos), agentes quelantes (tais como EDTA), agentes estabilizadores, agentes de ajuste de tonicidade, agentes antimicrobianos, agentes de floculação / suspensão, agentes umectantes, solventes e sistemas solventes, antioxidantes e agentes de tamponamento, dentre outros. Está dentro das competências da pessoa versada na técnica selecionar e otimizar tais excipientes e suas quantidades ao formular uma composição farmacêutica para uma finalidade desejada em particular.
[00259] As composições são preferivelmente na forma de soluções aquosas. Tais soluções são preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica e então preenchidas em frascos de injeção ou ampolas.
[00260] A forma das composições farmacêuticas, a via de administração, a dosagem e o regime naturalmente dependem da natureza do câncer a ser tratado, a gravidade da enfermidade, a idade, o peso e o sexo do paciente, etc., ou alternativamente da duração desejada do tratamento.
[00261] O tratamento envolve a administração de um composto da fórmula (I), opcionalmente com um outro agente anticâncer.
[00262] Os compostos da fórmula (I) para uso de acordo com a presente invenção podem ser administrados a um indivíduo por meio de qualquer via
68 / 108 apropriada. O mesmo se aplica a composições ou formulações que compreendam os compostos da fórmula (I).
[00263] Os compostos da fórmula (I) e, portanto, composições e formulações que compreendam os mesmos, podem ser apresentados, por exemplo, em uma forma adequada para administração oral, nasal, parenteral, intravenosa, tópica, retal ou intratecal. Preferivelmente, os compostos são apresentados em uma forma adequada para administração sistêmica (por exemplo, intravenosa).
[00264] Qualquer modo de administração comum ou padrão na técnica pode ser usado, por exemplo, injeção, infusão, administração tópica, inalação, administração transdérmica, em superfícies internas e externas do corpo etc. por qualquer método adequado conhecido nas técnicas medicinais. Assim, modos de administração incluem administração oral, nasal, enteral, retal, vaginal, transmucosa, tópica ou parenteral, ou por inalação. A administração pode ser direta no tumor (administração intratumoral).
[00265] Administração oral ou parenteral é preferida. Meios parenterais preferidos de administração são administração intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intracraniana e subcutânea e administração no líquido cefalorraquidiano (administração intratecal). Mais preferivelmente, a administração é administração intraperitoneal ou intravenosa, o mais preferivelmente administração intravenosa.
[00266] Preferivelmente, a administração é oral ou intravenosa.
[00267] A administração intravenosa pode ser injeção intravenosa ou infusão intravenosa, o mais preferivelmente infusão intravenosa (por exemplo, por bomba de infusão).
[00268] O composto da fórmula (I) e o outro agente anticâncer podem ser administrados pela mesma via ou por vias diferentes.
[00269] Como observado acima, o composto da fórmula (I) e o outro agente anticâncer podem ser administrados simultaneamente, separadamente
69 / 108 ou sequencialmente. Em uma modalidade preferida, o composto da fórmula (I) e o outro agente anticâncer são administrados sequencialmente, por exemplo, em momentos separados, isto é, não juntos na mesma composição. Em uma modalidade alternativa, o composto da fórmula (I) e o outro agente anticâncer são administrados juntos ao mesmo tempo, por exemplo, na mesma composição ou em composições separadas. Os momentos das administrações separadas podem ser determinados de acordo com o composto particular da fórmula (I) ou o outro agente anticâncer, formulações e/ou modos de administração particulares usados. Assim, o composto da fórmula (I) pode ser administrado antes ou após o outro agente anticâncer.
[00270] Por exemplo, o outro agente anticâncer pode ser administrado primeiro e o composto da fórmula (I) pode ser administrado em um intervalo de tempo adequado depois para se alinhar com o momento ideal da dispensação do outro agente anticâncer no local-alvo, ou vice-versa. Tais determinações estão inteiramente dentro da habilidade de rotina do clínico. Assim, por exemplo, o composto da fórmula (I) pode ser administrado, preferivelmente de modo parenteral, mais preferivelmente de modo intravenoso pelo menos ou até 20, 30, 40, 50, 60, 70, ou 90 minutos ou 2, 3, 4, 5 ou 6 horas antes ou após o outro agente anticâncer.
[00271] As doses e dosagens podem ser determinadas de forma rotineira e podem depender da natureza da molécula, finalidade do tratamento, idade de paciente, modo de administração, etc. Qualquer agente terapêutico da invenção como descrito acima pode ser combinado com excipientes farmaceuticamente aceitáveis para formar composições terapêuticas. Uma dose se refere a uma quantidade especificada de medicação tomada em um momento, isto é, os termos “dose única” e dose são usados de maneira intercambiável. Uma prescrição de tratamento pode compreender múltiplas doses, isto é, múltiplas doses únicas, ao longo de um período.
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[00272] Nos métodos e usos da invenção, preferivelmente uma quantidade eficaz do composto da fórmula (I), e do outro agente anticâncer opcional se presente, é administrada. Em outras palavras, uma dose preferivelmente compreende uma quantidade eficaz do composto da fórmula (I), e do outro agente anticâncer opcional se presente.
[00273] Como mostrado nos exemplos, os compostos da fórmula (I) são tolerados em altas doses em comparação com a dose requerida para exterminar um tumor. Essa propriedade difere de muitos compostos quimioterápicos; de fato, a maior parte dos compostos quimioterápicos tem efeitos colaterais substanciais na dose requerida para exterminar o câncer. Os presentes exemplos indicam que, vantajosamente, os compostos da fórmula (I) podem ser administrados em doses que excedem bastante a dose necessária para exterminar o tumor.
[00274] Como mostrado nos exemplos, camundongos toleraram doses únicas dos compostos da fórmula (I) de 300 mg/kg e 2.000 mg/kg, mas não toleram uma dose única de 8.000 mg/kg. Esses dados sugerem que, em camundongos, a dose máxima tolerada dos compostos da fórmula (I) é pelo menos 2.000 mg/kg, mas menos do que 8.000 mg/kg. A conversão entre uma dose de camundongo e uma dose de ser humano é um fator de 0,081 (Nair et al., (2016) Basic Clin Pharm. 7(2): 27–31. Os dados nos exemplos, portanto, indicam que em seres humanos a dose máxima tolerada dos compostos da fórmula (I) é pelo menos 162 mg/kg, mas menos do que 648 mg/kg.
[00275] Assim, preferivelmente, o composto da fórmula (I) é administrado em uma dose de ≤ 405 mg/kg, preferivelmente ≤ 324 mg/kg, mais preferivelmente ≤ 243 mg/kg, mais preferivelmente ≤162 mg/kg, mais preferivelmente ≤81 mg/kg, mais preferivelmente ≤40,5 mg/kg, mais preferivelmente ≤24,3 mg/kg. Preferivelmente, o composto da fórmula (I) é administrado em uma dose de pelo menos 10 mg/kg, mais preferivelmente pelo menos 20 mg/kg, mais preferivelmente pelo menos 30 mg/kg, mais
71 / 108 preferivelmente pelo menos 40 mg/kg, mais preferivelmente pelo menos 500 mg/kg, mais preferivelmente pelo menos 100 mg/kg.
[00276] Preferivelmente, o composto da fórmula (I) é administrado em uma dose entre 10 mg/kg e 405 mg/kg, preferivelmente entre 20 mg/kg e 324 mg/kg, mais preferivelmente entre 20 mg/kg e 243 mg/kg, mais preferivelmente entre 30 mg/kg e 162 mg/kg, mais preferivelmente entre 40 mg/kg e 81 mg/kg.
[00277] Essas doses são doses preferidas para indivíduos humanos.
[00278] As dosagens, e regimes de dosagem, podem variar com base em parâmetros tais como a idade, o peso, a condição e o sexo do indivíduo, a finalidade do tratamento, a doença sendo tratada, a idade e/ou condição do paciente, o modo de administração, etc.
[00279] As dosagens e os regimes apropriados podem ser prontamente estabelecidos. As unidades de dosagem apropriadas podem prontamente ser preparadas. Os regimes de dosagem podem ser determinados de forma rotineira.
[00280] O tratamento pode compreender uma única administração do composto da fórmula (I), opcionalmente com um outro agente anticâncer, ou pode compreender administrações repetidas do composto da fórmula (I), opcionalmente com um outro agente anticâncer. O regime de dosagem do composto da fórmula (I) e do outro agente anticâncer, se presente, não precisa ser idêntico. Alternativamente, o tratamento pode compreender uma única administração do composto da fórmula (I) e administrações repetidas do outro agente anticâncer, ou vice-versa.
[00281] Preferivelmente, o composto da fórmula (I) é administrado, preferivelmente em qualquer uma das doses descritas acima, a cada 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 dias, mais preferivelmente a cada 2, 3, ou 4 dias, mais preferivelmente a cada 3 dias por um total de 2 a 10, mais preferivelmente 3 a 8, mais preferivelmente 4 a 6, mais preferivelmente 5 administrações.
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[00282] No entanto, estará dentro das competências da pessoa versada na técnica determinar o regime de dosagem apropriado, e as doses relevantes no mesmo, com base na natureza do composto, a finalidade do tratamento, a doença sendo tratada, a idade e/ou condição do paciente, o modo de administração, etc.
[00283] A presente invenção também provê um produto ou kit que compreende um composto da fórmula (I) e um outro agente anticâncer. O kit ou produto pode ser usado em qualquer um dos usos ou métodos descritos no presente documento, isto é, para uso no tratamento ou na prevenção de câncer. Particularmente, o kit ou produto é para uso simultâneo, separado ou sequencial. Preferivelmente, o composto da fórmula (I), e opcionalmente também o outro agente anticâncer, é formulado para administração parenteral, preferivelmente administração intravenosa.
[00284] Cada componente dos kits da presente invenção (isto é, cada agente anticâncer) pode ser provido em um compartimento ou recipiente separado. Quando conveniente e prático, misturas de componentes poderiam ser providas. Os componentes podem ser providos em forma seca, por exemplo, cristalizada, secada por congelamento ou liofilizada, ou em solução, tipicamente tais composições líquidas serão aquosas e tamponadas com um tampão padrão tal como Tris, HEPES, etc.
[00285] Preferivelmente, os kits são para uso no tratamento de câncer, por exemplo, são para uso nos métodos ou usos da presente invenção como descrito no presente documento.
[00286] Os compostos da invenção (isto é, os compostos da fórmula (I), (IIa), (IIb), (IIIa), (IIIb), (IIIc), (IIId), (Iva), (IVb), (IVc), (IVd), (IVe) e (IVf)) ou estão comercialmente disponíveis, ou são conhecidos na literatura, ou podem ser obtidos por procedimentos sintéticos convencionais, de acordo com técnicas padrão, a partir de materiais de partida disponíveis usando reagentes e condições de reação apropriados. A esse respeito, a pessoa
73 / 108 versada pode consultar inter alia “Comprehensive Organic Synthesis” de B. M. Trost e I. Fleming, Pergamon Press, 1991, e “Protective Groups in Organic Synthesis”, 3ª edição, T.W. Greene e P.G.M. Wutz, Wiley- Interscience (1999).
[00287] Os compostos da invenção estão disponíveis comercialmente, por exemplo, junto à Berry and Associates, Toronto Research Chemicals, Sigma Aldrich, Carbosynth, Trilink Biotech e outros fornecedores comerciais bem conhecidos.
[00288] A invenção será adicionalmente descrita com referência aos seguintes exemplos não limitantes, em que:
[00289] A Figura 1 mostra que 5-formil-2’-desoxicitidina e 5- hidroximetilcitidina são bem toleradas em camundongos e reduzem tumores de glioblastoma multiforme humano em modelos de xenoenxerto de camundongo. Fig.1 A: protocolo de dose única máxima tolerada. Os camundongos foram receberam uma única injeção intraperitoneal na dose indicada. Se todos os camundongos no grupo relevante toleraram a dose indicada, a dose foi escalonada como indicado. Fig. 1B: o peso corporal dos camundongos foi medido no momento indicado após os camundongos serem injetados intraperitonealmente com a dose indicada e o composto indicado a cada três dias por um total de cinco doses. As Figuras 1C-H: As células U87-MG foram implantadas no flanco de 32 camundongos imunodeficientes. Após os tumores alcançarem 129 a 131 mm3, os camundongos foram divididos em quatro grupos de 8 camundongos. O grupo de controle negativo foi tratado com o veículo, o grupo de controle positivo foi tratado com 40 mg/kg de temozolomida uma vez por dia por cinco dias, os grupos de tratamento foram tratados com 2.000 mg/kg de 5-formil-2’-desoxicitidina ou 2.000 mg/kg de 5-hidroximetil-2’-
74 / 108 desoxicitidina uma vez a cada três dias por um total de cinco doses. Os volumes tumorais foram medidos a cada três dias (Fig. 1C) e o peso corporal do camundongo foi medido a cada três dias (Fig.1D). Na conclusão do estudo, o percentual de inibição de crescimento tumoral foi computado (TGI (%)) (Fig.1E), os tumores foram ressecados, fotografados (Fig.1F), medidos (Fig.1G) e seccionados e coloridos com hematoxilina e eosina (Fig.1H).
[00290] A Figura 2 mostra que 5-formil-2’-desoxicitidina e 5- hidroximetil-2’-desoxicitidina exterminam o glioblastoma multiforme por um mecanismo sem relação com os análogos de nucleotídeo atuais: Fig. 2A: citometria de fluxo de células tratadas com 5-formil-2’- desoxicitidina e 5’-hidroximetil-2’-desoxicitidina, coloridas com Anexina V e 7AAD. Fig.2B: Curvas de sobrevida das células HeLa tratadas com uma titulação de 5-formilcitosina, 5-formilcitidina, ou 5-formil-2’-desoxicitidina. Fig. 2C: Curvas de sobrevida das células U87-MG tratadas com uma titulação de 5-hidroximetilcitosina, 5-hidroximetilcitidina, ou 5- hidroximetil-2’-desoxicitidina.
[00291] A Figura 3 mostra a quantificação de mutações no gene hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HPRT) induzidas por 5-formil- 2’-desoxicitidina e 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina em células mamíferas. A 5-formil-2’-desoxicitidina e a 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina mostram não serem mutagênicas.
[00292] A Figura 4 mostra o nível de citotoxicidade (% de sobrevida) de 5-formil-2’-desoxicitidina, 5-formilcitidina e 5-cloro-2’-desoxicitidina contra células HeLa após três dias de tratamento.
[00293] A Figura 5 mostra o nível de citotoxicidade (% de sobrevida) de 5-formil-2’-desoxicitidina (d5fC), 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina (d5hmC), 5-cloro-2’-desoxicitidina (5CldC), 5-bromo-2’-desoxicitidina (5BrdC), 5- iodo-2’desoxicitidina (5IdC) e timidina vs. células U87-MG.
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[00294] A Figura 6 mostra que os efeitos citotóxicos (% de sobrevida) de 5-formil-2’-desoxicitidina e 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina não são salvos pela adição de timidina nas células U87-MG, indicando que 5-formil-2’- desoxicitidina e 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina não agem inibindo a timidina sintase.
[00295] A Figura 7 mostra os efeitos citotóxicos (% de sobrevida) de 5- formil-2’-desoxicitidina em combinação com temozolomida nas células U87- MG.
[00296] A Figura 8 mostra os efeitos citotóxicos (% de sobrevida) de 5- hidroximetil-2’-desoxicitidina em combinação com temozolomida nas células U87-MG.
[00297] A Figura 9 mostra os efeitos citotóxicos de 5-metoximetil-2’- desoxiuridina e 5-acetoximetil-2’-desoxiuridina nas células U87-MG. Tratamento por 72 horas. A sobrevida foi quantificada usando um ensaio de MTT.
[00298] A Figura 10 mostra a % de sobrevida de várias células após o tratamento com d5fCTP ou d5hmCTP Fig. 10A: % de sobrevida de HeLa após o tratamento com 5- formil-2’-desoxicitidina-5’-trifosfato (d5fCTP) por 72 horas. A sobrevida foi quantificada usando um ensaio de MTT.
[00299] Fig. 10B: % de sobrevida das células U87-MG (glioma, grau IV) após o tratamento com 5-formil-2’-desoxicitidina-5’-trifosfato ou 5- hidroximetil-2'-desoxicitidina-5’-trifosfato por 72 horas. A sobrevida foi quantificada usando um ensaio de MTT.
[00300] A Figura 11 mostra os níveis de expressão de CDA em várias linhagens celulares. Os valores são níveis de expressão de CDA Log2 normalizados. Os níveis de expressão foram determinados usando a plataforma Human Genome U133 Plus 2.0 Array da Affymetrix e o banco de dados Genevestigator (https://genevestigator.com/gv/).
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[00301] A Figura 12 mostra os níveis de expressão de CDA lineares em várias linhagens celulares. Os níveis de expressão foram determinados usando a plataforma Human Genome U133 Plus 2.0 Array da Affymetrix e o banco de dados Genevestigator (https://genevestigator.com/gv/).
[00302] As Figuras 13A e 13B mostram os níveis de expressão de CDA em vários tumores de cérebro humanos. Os valores são níveis de expressão de CDA Log2 normalizados. Os níveis de expressão foram determinados usando a plataforma Human Genome U133 Plus 2.0 Array da Affymetrix e o banco de dados Genevestigator (https://genevestigator.com/gv/).
[00303] As Figuras 14A e 14B mostram os níveis de expressão de CDA lineares em vários tumores de cérebro humanos. Os níveis de expressão foram determinados usando a plataforma Human Genome U133 Plus 2.0 Array da Affymetrix e o banco de dados GENEVESTIGATOR® (https://genevestigator.com/gv/).
[00304] A Figura 15 mostra os resultados de um ensaio PAMPA demonstrando que 2d5hmC e 2d5fC podem passar a barreira sangue-cérebro.
EXEMPLOS Materiais e métodos Animais
[00305] Todos os aspectos deste trabalho, incluindo alojamento, experimentação e descarte de animais foram realizados em conformidade geral com o Guia para o cuidado e uso de animais de laboratório: oitava edição (National Academy Press, Washington, D.C., 2011) em uma instalação de animais de laboratório credenciada pela AAALAC. O protocolo de cuidado e uso de animais foi analisado e aprovado pela IACUC na Pharmacology Discovery Services Taiwan, Ltd. Cultura celular
[00306] Células-tronco neurais de glioma primário (GNS) (G7, G14, G144, G166) foram submetidas a cultura em placas revestidas com poli-D-
77 / 108 lisina (Merck Millipore, Cat. nº A-003-E) e laminina (R&D Systems, Cat. nº 3446-005-01) em meio de célula-tronco neural (DMEM-F12 a 50% (Thermofisher, Cat. nº 21041025), meio neurobasal a 50% (Thermofisher, Cat. nº 10888-022), N2 (Life Technologies, Cat. nº A-003-E) e suplementos B27 (Life Technologies, Cat. nº 12587010), piruvato de sódio a 1 mM (Life Technologies, Cat. nº 11360-039), glutamax a 2 mM (Life Technologies, Cat. nº 35050038), HEPES a 1 mM (Fisher Scientific, Cat. nº BP299-1), β- mercaptoetanol a 0,1 mM (Life Technologies, Cat. nº 31350010), 1x aminoácidos não essenciais (Life Technologies, Cat. nº 11140-035), albumina sérica bovina a 0,006% (Sigma, Cat. nº A8577-10ML), 4 μg/ml de heparina (Sigma, Cat. nº H3149-25KU), 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina, 20ng/ml de hEGF (R&D Systems, Cat. nº 236-EG-200), 10ng/ml de bFGF (Peprotech, Cat. nº 100-18B).
[00307] As HCT116 foram cultivadas no meio 5a de McCoy modificado (Life technologies, Cat. nº 36600021) suplementado com soro fetal bovino a 10% e 100 U/ml de penicilina e 100 U/ml de estreptomicina.
[00308] As Arpe 19 foram cultivadas no meio DMEM:F12 (Life Technologies, 21331-020) suplementado com soro fetal bovino a 10% e 100 U/ml de penicilina e 100 U/ml de estreptomicina.
[00309] As HAP1 foram cultivadas em IMDM (Gibco, Cat. nº 12440-05) suplementado com soro fetal bovino a 10% e 100 U/ml de penicilina e 100 U/ml de estreptomicina.
[00310] As linhagens celulares não mencionadas acima foram cultivadas em DMEM (Sigma, Cat. nº D6429) suplementado com soro fetal bovino a 10% e 100 U/ml de penicilina e 100 U/ml de estreptomicina. Todas as células foram mantidas a 37˚C em uma incubadora com camisa de água, umidificada, com CO2 a 5%. As células foram passadas entre 70 e 90% de confluência.
78 / 108 Fármacos
[00311] Os compostos usados nos presentes exemplos foram obtidos da seguinte forma (CAT nº = número de catálogo). Composto CAS nº Fonte CAT nº 5-hidroximetil-2’- Berry and 7226-77-9 PY 7588 desoxicitidina Associates 5-formil-2’- 137017-45- Berry and PY 7589 desoxicitidina 9 Associates 5-carboxil-2’- 1009808- Berry and PY 7593 desoxicitidina 62-1 Associates 148608-53- Berry and 5-formilcitidina PY 7599 1 Associates Toronto Research 5-formilcitosina 4425-59-6 F698975 Chemicals Temozolomida 85622-93-1 Sigma Aldrich T2577 5-flurouracil 51-21-8 Sigma Aldrich F6627 Berry and 5-hidroximetilcitidina 19235-17-7 PY 7596 Associates Toronto Research 5-hidroximetilcitosina 1123-95-1 H945870 Chemicals 5-cloro-2’-desoxicitidina 32387-56-7 Carbosynth NC08279 5-bromo-2’- 1022-79-3 Carbosynth NB06450 desoxicitidina 5-iodo-2’-desoxicitidina 611-53-0 Carbosynth ND05777 Timidina 50-89-5 Sigma Aldrich T1895 5-metoximetil-2’- Toronto Research 5116-22-3 M263610 desoxiuridina Chemicals 5-acetoximetil-2’- 148380-55- Toronto Research A167180 desoxiuridina 6 Chemicals
79 / 108 5-formil-2’- desoxicitidina-5’- Trilink Biotech N-2064 trifosfato 5-hidroximetil-2’- desoxicitidina-5’- Trilink Biotech N-2060 trifosfato Ensaio de sobrevida
[00312] Em uma placa de 96 poços, foram semeadas 4.000 células em 100 μl de meio correspondente. No dia seguinte, fármacos, diluídos em DMSO, foram adicionados em 8 concentrações em triplicata. Os fármacos foram adicionados como uma série de diluição de 4 vezes partindo de 100 μM. As células foram incubadas com os fármacos por 72 horas. A proliferação celular foi avaliada por ensaio de MTT de acordo com o protocolo do fabricante (ATCC, Cat. nº 30-1010K). A sobrevida celular foi normalizada à sobrevida de células tratadas somente com DMSO. O experimento foi realizado três vezes, os dados representam a média de nove poços ± SEM. MTD (dose máxima tolerada)
[00313] A 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina e a 5-formil-2’-desoxicitidina (Berry and Associates) foram formuladas em sulfóxido de dimetila (DMSO)/ solutol (RTM) R HS15/ solução salina tamponada com fosfato (PBS) (5/5/90, v/v/v) na concentração de 30 e 200 e 400 mg/mL para administração intraperitoneal no volume de dosagem de 5 mL/kg. Um volume de dosagem em 10 ou 20 mL/kg foi aplicado.
[00314] Camundongos ICR machos pesando 23 ± 3 g foram providos pela BioLasco Taiwan (sob a licença da Charles River Laboratories). Os animais foram aclimatados por 3 dias antes do uso e sua boa saúde foi confirmada. Todos os animais foram mantidos em um ambiente higiênico com temperatura (20 – 24°C), umidade (30% - 70%) e ciclos claros/escuros
80 / 108 de 12 horas controlados. Foi concedido acesso livre a uma dieta padrão de laboratório esterilizada [MFG (Oriental Yeast Co., Ltd., Japão)] e água de torneira autoclavada.
[00315] A 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina e a 5-formil-2’-desoxicitidina foram administradas por via intraperitoneal a grupos de três camundongos ICR machos pesando 23 ± 3 g. Os animais receberam uma dose inicial de 300 mg/kg. Se os animais sobreviviam por 72 horas, a dose da próxima coorte era aumentada. Se um ou mais animais morriam, a dose da próxima coorte era diminuída. A testagem era interrompida quando todos os animais sobreviviam no limite superior, ou quando três níveis de dose haviam sido testados ou quando o limite superior ou inferior havia sido alcançado. Em cada nível de dose, os animais foram observados quanto à presença de sintomas tóxicos agudos (mortalidade, convulsões, tremores, relaxamento muscular, sedação, etc.) e efeitos autônomos (diarreia, salivação, lacrimação, vasodilatação, piloereção, etc.) durante os primeiros 30 minutos, novamente em 1, 24, 48 e 72 horas. Os pesos corporais foram registrados pré-dose e em 72 horas. Os animais foram observados e a mortalidade, anotada diariamente após a administração do composto. Uma necrópsia macroscópica foi realizada em todos os animais sem coleta de tecido, e o próximo nível de dose foi determinado com base na tabela de projeto do estudo. Múltiplas MTD
[00316] A 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina e a 5-formil-2’-desoxicitidina (Berry and Associates) foram formuladas em sulfóxido de dimetila (DMSO)/ solutol (RTM) R HS15/ solução salina tamponada com fosfato (PBS) (5/5/90, v/v/v) na concentração de 15, 50 e 100 mg/mL para administração intraperitoneal no volume de dosagem de 20 mL/kg. Os compostos de teste foram dosados a cada três dias por um total de 5 doses (q3dx5).
[00317] Camundongos ICR machos pesando 23 ± 3 g foram providos pela BioLasco Taiwan (sob a licença da Charles River Laboratories). Os
81 / 108 animais foram aclimatados por 3 dias antes do uso e sua boa saúde foi confirmada. Todos os animais foram mantidos em um ambiente higiênico com temperatura (20 – 24°C), umidade (30% - 70%) e ciclos claros/escuros de 12 horas controlados. Foi concedido acesso livre a uma dieta padrão de laboratório esterilizada [MFG (Oriental Yeast Co., Ltd., Japão)] e água de torneira autoclavada.
[00318] Os animais foram observados quanto à presença de sintomas tóxicos agudos (mortalidade, convulsões, tremores, relaxamento muscular, sedação, etc.) e efeitos autônomos (diarreia, salivação, lacrimação, vasodilatação, piloereção, etc.) durante os primeiros 30 minutos após cada tratamento (dias 1, 4, 7, 10 e 13) e novamente em 1, 24, 48 e 72 horas após a dose final (dia 13). A mortalidade foi observada no mesmo esquema. Além disso, os pesos corporais foram registrados antes de cada tratamento e em 24, 48 e 72 horas após a administração final. Uma necrópsia macroscópica foi realizada em todos os animais sem coleta de tecido. Xenoenxerto
[00319] Soluções de dosagem de 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina e a 5- formil-2’-desoxicitidina (Berry and Associates) foram preparadas frescas antes de cada administração de dose adicionando-se primeiro um volume apropriado de DMSO ao composto pré-pesado e então se adicionando volumes apropriados de solutol (RTM) e PBS (DMSO a 5%/ solutol a 5% (RTM)/ PBS a 90%). Um agente padrão, temozolomida, foi provido pelo Oslo University Hospital em forma de pó e foi formulado fresco antes de cada dose adicionando-se primeiro um volume apropriado de DMSO ao composto pré- pesado e então se adicionando volumes apropriados de solutol (RTM) e PBS (DMSO a 5%/ solutol a 5% (RTM)/ PBS a 90%). A 5-hidroximetil-2’- desoxicitidina e a 5-formil-2’-desoxicitidina foram administradas em um volume de dose de 20 mL/kg. O agente padrão, temozolomida, foi administrado em um volume de dose de 10 mL/kg.
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[00320] A linhagem celular de glioma maligno de cérebro humano, U87- MG (ATCC HTB-14, glioblastoma epitelial), foi obtida da Coleção de microorganismos norte-americana (ATCC). As células foram submetidas a cultura em meio mínimo essencial que contém soro fetal bovino a 5% (FBS) a 37°C, com CO2 a 5% em uma incubadora.
[00321] Camundongos nus fêmeos (nu/nu) com 6 a 7 semanas de idade obtidos da BioLasco Taiwan (sob a licença da Charles River Laboratories) foram usados. Os animais foram alojados em gaiolas ventiladas individualmente (IVC, 36 Mini Isolator system). A alocação para 5 animais foi 27 x 20 x 14 em cm. Todos os animais foram mantidos em um ambiente higiênico sob temperatura (20 - 24°C) e umidade (30% - 70%) controladas com ciclo claro/escuro de 12 horas. Foi concedido acesso livre a uma dieta padrão de laboratório [MFG (Oriental Yeast Co., Ltd., Japão)] e água de torneira autoclavada.
[00322] As células U87-MG viáveis (ATCC HTB-14) foram implantadas subcutaneamente (SC) (5 x 106 células/camundongo em PBS a 0,2 mL/camundongo) no flanco direito de camundongos nu/nu fêmeos. Quando os volumes tumorais médios de grupo alcançaram aproximadamente 129 mm3 a 131 mm3, os camundongos implantados com tumor foram divididos em quatro grupos de tratamento, cada grupo contendo oito animais, e as administrações de dose foram iniciadas (denotado como dia 1).
[00323] A 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina, a 5-formil-2’-desoxicitidina a
2.000 mg/kg e o veículo correspondente (DMSO a 5%/ solutol a 5% (RTM)/ PBS a 90%) foram administrados intraperitonealmente (IP) uma vez a cada três dias por um total de cinco administrações. A temozolomida a 40 mg/kg foi administrada oralmente (PO) uma vez por dia por cinco administrações no total.
[00324] O volume tumoral, peso corporal, mortalidade, e sinais de toxicidade observável foram monitorados e registrados duas vezes por semana
83 / 108 por 29 dias. O volume tumoral (mm3) foi estimado de acordo com a fórmula elipsoide como: comprimento x (largura)2 x 0,5. A inibição de crescimento tumoral (T/C) foi calculada pela seguinte fórmula: % T/C = (Tn/Cn) x 100% Cn: peso tumoral medido no dia n no grupo de controle Tn: peso tumoral medido no dia n no grupo tratado O valor de % de T/C ≤ 42% foi considerado atividade antitumor significativa (#).
[00325] O percentual de inibição de crescimento tumoral (TGI) também foi calculado pela seguinte fórmula: % TGI = (1 − (Tn/Cn)) × 100% O valor de % de TGI ≥ 58% foi considerado atividade antitumor significativa (#).
[00326] A ANOVA de duas vias (RTM) seguida do teste de Bonferroni também foi usada para averiguar a diferença estatisticamente significativa em comparação com o grupo de controle negativo durante o estudo; dia 1 até o dia 29. As diferenças são consideradas significativas em p<0,05 (*).
[00327] Mediante a conclusão do estudo, os tumores foram extirpados de todos os animais no estudo e fotografias foram tiradas. Ensaio de HPRT
[00328] O ensaio de mutagenicidade de HPRT foi realizado em células V79. 50.000 células V79 foram tratadas com três concentrações diferentes de d5hmC ou d5fC (1, 10, 100 μM) por 24 horas em uma placa de 6 poços. DMSO foi usado como um controle negativo. Após o tratamento, as células foram submetidas a subcultura conforme necessário em frascos T75 por 9 dias para permitir a expressão de mutantes de HPRT. 10.000 células foram reinoculadas em 10 réplicas de placa de Petri (100 x 15 mm) com meios seletivos (2,5 μg/ml de 6TG).
84 / 108
[00329] A sobrevida (eficiência de inoculação relativa) foi determinada pela inoculação 200 células em quatro réplicas de placa de Petri (60 x 15 mm) sem meios seletivos. As colônias foram fixadas, coloridas com Giemsa e contadas 7 dias depois. A frequência de mutantes é expressa como um número total de mutantes contados em todas as placas dividido pelo número de células semeadas corrigido pela eficiência de inoculação de ressemeio. O experimento foi realizado três vezes, os dados representam a média de triplicata ± SEM. Citometria de fluxo na apoptose
[00330] 100.000 células foram semeadas em uma placa de 6 poços e incubadas com 100 μM de temozolomida, 2'-desoxi-5-hidroximetilcitidina, 5- formil-2'-desoxicitidina ou DMSO por 72 horas. A detecção de células apoptóticas foi avaliada usando o kit de detecção apoptótica com anexina V- 7-aminoactinomicina D (7-AAD) (Nordic Biosite AS, Cat. nº 640922) de acordo com o protocolo do fabricante.
[00331] A análise por separação de células ativada com fluorescência foi realizada no LSR Fortessa (BD Biosciences) e os dados foram analisados no software FlowJo. Todos os experimentos foram realizados em triplicata. Western blots
[00332] Western blots foram realizados como anteriormente descrito (Towbin et al., 1979. Biotechnology, 24, 145-149). O antissoro antiCDA (Abcam, cat nº Ab82346) foi usado de acordo com a concentração recomendada pelo fabricante. As proteínas foram quantificadas pelo sinal gerado pela oxidação de luminol por peroxidase de raiz-forte conjugada com o anticorpo secundário. Exemplo 1: citotoxicidade para as células tumorais
[00333] As células HeLa, cultivadas como descrito acima (Materiais e métodos), foram tratadas com 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina e 5-formil-2’- desoxicitidina. Após três dias de tratamento com esses compostos, a sobrevida
85 / 108 celular foi avaliada como descrito acima (Materiais e métodos). Embora a sobrevida após o tratamento com 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina não difira das células tratadas com DMSO, constatou-se, surpreendentemente, que 5- formil-2’-desoxicitidina foi citotóxica às células HeLa.
[00334] O efeito citotóxico dessa 5-formil-2’-desoxicitidina foi comparado com dois compostos citotóxicos bem descritos, 5-flurouracil e temozolamida. A 5-formil-2’-desoxicitidina foi determinada como sendo mais citotóxica às células HeLa (IC50 = 0,76 μM) do que ambos 5-flurouracil (IC50 > 25 μM) e temozolomida (IC50 > 25 μM).
[00335] Com o conhecimento de que a 5-formil-2’-desoxicitidina é citotóxica às células de carcinoma cervical (HeLa), o estudo foi expandido em duas direções: (i) um outro composto foi avaliado: 5-carboxil-2’- desoxicitidina; e (ii) seus efeitos citotóxicos contra uma larga faixa de linhagens celulares cancerosas humanas foram avaliados (Tabela 1). Tabela 1: Avaliação de 5-formil-2’-desoxicitidina (2d5fC), 5-hidroximetil-2’- desoxicitidina (2d5hmc) e 5-carboxi-2’-desoxicitidina (2d5caC) em uma faixa de linhagens celulares cancerosas humanas e em comparação com temozolomida e 5-flurouracil (5fU). IC50 é a concentração na qual metade das células são exterminadas pelo composto relevante. Linhagem Camada IC50 (μM) Doença celular germinativa 2d5fC 2d5hmC 2d5caC Temozolomida 5fU U87-MG Glioma, grau IV Ectoderma 0,3340 3,027 > 25,00 > 25,00 > 25,00 HCT-116 Carcinoma de Endoderma 25,00 > 25,00 > 25,00 > 25,00 3,545 A549 cólon Carcinoma Endoderma >1,835 25,00 > 25,00 > 25,00 1,018 1,853 22Rv1 pulmonar Carcinoma de Endoderma > 25,00 > 25,00 > 25,00 > 25,00 > 25,00 NCI-N87 próstata Carcinoma Endoderma 0,8057 > 25,00 > 25,00 > 25,00 1,524 MIA gástrico Carcinoma Endoderma 1,143 > 25,00 > 25,00 > 25,00 8,096 PaCa-2 A-498 pancreático Carcinoma renal Mesoderma > 25,00 > 25,00 > 25,00 > 25,00 2,367 U937 Linfoma Mesoderma 0,9536 > 25,00 > 25,00 13,08 7,449 A375 Melanoma Mesoderma 3,188 > 25,00 > 25,00 > 25,00 7,867 maligno Leucemia HL-60 promielocítica Mesoderma 6,262 > 25,00 > 25,00 > 25,00 > 25,00 aguda Adenocarcinoma SK-OV-3 Mesoderma 9,690 > 25,00 > 25,00 > 25,00 3,756 de ovário Adenocarcinoma MCF-7 Mesoderma 0,8657 > 25,00 > 25,00 > 25,00 > 25,00 epitelial (de
86 / 108 mama) U2OS Osteossarcoma de Mesoderma 8,69 > 25,00 > 25,00 > 25,00 2,889 osso Adenocarcinoma HeLa Mesoderma 0,76 > 25,00 > 25,00 > 25,00 > 25,00 cervical Leucemia mielogênica HAP1 Mesoderma > 25,00 6,53 n.d. n.d. n.d. crônica (CML) Ovário de V79 Mesoderma > 25,00 > 25,00 n.d. n.d. n.d. hamster chinês (Adenocarcinoma metastático de H1437 células não Endoderma 5,65 n.d. n.d. n.d. n.d. pequenas) de pulmão (Adenocarcinoma H1573 metastático) de Endoderma 7,72 n.d. n.d. n.d. n.d. pulmão
[00336] Como mostrado na Tabela 1, a 5-carboxil-2’-desoxicitidina não tinha propriedades citotóxicas em qualquer uma das linhagens celulares cancerosas avaliadas. Curiosamente, a 5-formil-2’-desoxicitidina é citotóxica para uma larga faixa de células cancerosas humanas, indicando seu uso potencial no tratamento de uma larga faixa de cânceres. A 5-hidroximetil-2’- desoxicitidina tem um perfil de citotoxicidade mais estreito; de fato, esse derivado de citidina foi apenas citotóxico para duas linhagens celulares avaliadas: U87-MG, células de glioma grau IV (IC50 > 0,3340 μM) e HAP1 células de leucemia mielogênica crônica (IC50 > 3,027 μM). Isso sugere que esse composto pode ser bem tolerado pelos pacientes. A 5-formil-2’- desoxicitidina e a 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina foram observadas como as mais citotóxicas para as linhagens celulares de glioblastoma multiforme (U87-MG).
[00337] Visto que o maior efeito citotóxico de 5-formil-2’-desoxicitidina e 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina foi observado em células de glioma grau IV (U87-MG), a atividade citotóxica desses compostos foi avaliada em uma faixa mais larga de células de glioma grau IV derivadas de pacientes (Tabela 2). Devido à falta de atividade em ensaios anteriores, a 5-carboxil-2’- desoxicitidina não foi incluída nessa análise mais rigorosa.
87 / 108 Tabela 2: Avaliação de citotoxicidade de 5-formil-2’-desoxicitidina (2d5fC) e 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina (2d5hmc) contra linhagens celulares de glioblastoma multiforme (glioma, grau IV) derivadas de paciente e em comparação com temozolomida e 5-flurouracil (5fU). IC50 é a concentração na qual metade das células são exterminadas pelo composto relevante. Linhagem Camada IC50 (μM) Doença celular germinativa 2d5fC 2d5hmC Temozolomida 5fU U87-MG Glioma, grau IV Ectoderma 0,3340 3,027 > 25,00 > 25,00 G7 Glioma, grau IV Ectoderma 19,25 11,93 6,176 6,456 G14 Glioma, grau IV Ectoderma > 100 25,4 6,018 11,61 G26 Glioma, grau IV Ectoderma 28,12 > 100 7,338 7,125 G30 Glioma, grau IV Ectoderma 18 28,13 21,6 23,33 G144 Glioma, grau IV Ectoderma > 100 > 100 14,66 6,805 G166 Glioma, grau IV Ectoderma > 100 > 100 > 100 4,813 SF188 Glioma, grau IV Ectoderma 28,24 8,975 > 100 3,884 U3017 Glioma, grau IV Ectoderma > 100 14,12 > 100 3,921 DIPG007 Glioma, grau IV Ectoderma > 100 > 100 > 100 4,302 U3013 Glioma, grau IV Ectoderma > 100 > 100 > 100 4,138 CB152 Glioma, grau IV Ectoderma > 100 > 100 > 100 6,496
[00338] Como mostrado na Tabela 2, após o tratamento com o composto relevante, 5 de 12 linhagens celulares de glioma grau IV foram exterminadas por 5-formil-2’-desoxicitidina e 6 de 12 linhagens celulares de glioma grau IV foram exterminadas por 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina. Isso indica a capacidade desses compostos contra uma ampla faixa de gliomas. Esses resultados foram confrontados tanto com a temozolomida, o atual tratamento de linha de frente para gliomas de grau IV, quanto com o 5-flurouracil, um fármaco anticâncer de uso amplo. A temozolomida exterminou efetivamente 5 de 12 linhagens celulares de glioma grau IV e o 5-flurouracil exterminou 11 de 12 linhagens celulares de glioma grau IV. Assim, os dados demonstram que a 5-formil-2’-desoxicitidina é tão eficaz quanto o atual tratamento de linha de frente para gliomas de grau IV e que a 5-hidroximetil-2’- desoxicitidina é mais eficaz do que o atual tratamento de linha de frente para gliomas de grau IV.
[00339] Ademais, a Tabela 2 demonstra que tanto a 5-formil-2’- desoxicitidina quanto a 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina são citotóxicas para
88 / 108 linhagens celulares que são resistentes ao atual tratamento de linha de frente (temozolomida). Isso provê evidência de que esses compostos podem ter um melhor desempenho do que os tratamentos atuais para tais tumores resistentes a temozolomida. Alternativamente, a Tabela 2 indica que a temozolomida em combinação com a 5-formil-2’-desoxicitidina e/ou a 5-hidroximetil-2’- desoxicitidina seria um tratamento ideal. Exemplo 2: Citotoxicidade para células normais
[00340] Como demonstrado no exemplo 1, a 5-formil-2’-desoxicitidina e a 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina são terapêuticas úteis para o tratamento de cânceres, particularmente gliomas de grau IV, e particularmente os que são resistentes ao tratamento com temozolomida.
[00341] Os presentes inventores investigaram ainda a extensão com que esses compostos exterminam células humanas normais; baixa citotoxicidade contra células humanas normais é uma propriedade vantajosa para agentes anticâncer. A citotoxicidade desses compostos em várias linhagens celulares humanas normais foi, portanto, investigada (Tabela 3). As células foram cultivadas e o ensaio de sobrevida foi realizado como descrito acima (Materiais e métodos). Tabela 3: Avaliação da citotoxicidade de 5-formil-2’-desoxicitidina (2d5fC) e 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina (2d5hmC) para linhagens celulares humanas normais (não cancerosas) e em comparação com temozolomida e 5-flurouracil (5fU). IC50 é a concentração na qual metade das células são exterminadas pelo composto relevante. Linhagem Camada IC50 (μM) Doença celular germinativa 2d5fC 2d5hmC Temozolomida 5fU HEK293FT Normal Mesoderma, rins > 25,00 > 25,00 > 25,00 Arpe19 Normal Ectoderma, ReMna > 25,00 > 25,00 > 25,00 > 25,00 Normal Mesoderma, HaCat 0,1024 > 25,00 > 25,00 0,5228 queraMnócito MRC5 Normal Endoderma, pulmão > 25,00 > 25,00 > 25,00 > 25,00 Normal Mesoderma, medula Buffy A > 25,00 > 25,00 n.d. > 25,00 óssea Normal Mesoderma, medula Buffy C > 25,00 > 25,00 n.d. > 25,00 óssea
89 / 108 Normal Mesoderma, medula Buffy M > 25,00 > 25,00 n.d. > 25,00 óssea
[00342] Como mostrado na Tabela 3, a 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina não foi citotóxica para qualquer uma das linhagens celulares normais avaliadas. A 5-formil-2’-desoxicitidina foi citotóxica apenas para uma linhagem celular humana normal (HaCat, queratinócitos). Esses resultados indicam que esses compostos não são apenas quimioterapêuticas contra câncer eficazes, mas também podem ser bem tolerados por humanos. Exemplo 3: Dose máxima tolerada
[00343] Visto que a 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina e a 5-formil-2’- desoxicitidina têm efeitos limitados sobre células normais, os presentes inventores consideraram que os compostos poderiam ser dados em doses relativamente altas sem causar efeitos colaterais normalmente associados com quimioterapia contra câncer. A dose máxima tolerada (MTD) desses compostos em camundongos foi determinada como descrito acima (Materiais e métodos). Um esquema de MTD foi desenvolvido (Figura 1A). Embora o objetivo final do estudo fosse a sobrevida após 72 horas, a presença de sintomas tóxicos agudos (mortalidade, convulsões, tremores, relaxamento muscular, sedação, etc.) e efeitos autônomos (diarreia, salivação, lacrimação, vasodilatação, piloereção, etc.) nos animais foi monitorada durante os primeiros 30 minutos e novamente em 1, 24, 48 e 72 horas. Os pesos corporais foram registrados pré-dose e em 72 horas.
[00344] Os resultados indicaram que os camundongos podem tolerar uma dose única de 300 mg/kg e 2.000 mg/kg de 5-formil-2’-desoxicitidina e 5- hidroximetil-2’-desoxicitidina. Os camundongos foram incapazes de tolerar uma dose única de 8.000 mg/kg 5-formil-2’-desoxicitidina ou 5-hidroximetil- 2’- desoxicitidina (não mostrado). Esses resultados sugerem que em camundongos a dose única máxima tolerada tanto da 5-formil-2’- desoxicitidina quanto da 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina é pelo menos 2.000 mg/kg, mas menos do que 8.000 mg/kg.
90 / 108
[00345] A conversão entre uma dose de camundongo e uma dose de ser humano é um fator de 0,081 (Nair et al., (2016) Basic Clin Pharm. 7(2): 27–
31. Os dados, portanto, indicam que em seres humanos a dose única máxima tolerada dos compostos da fórmula (I) é pelo menos 162 mg/kg, mas menos do que 648 mg/kg.
[00346] Os fármacos quimioterápicos contra câncer que podem ser tolerados após múltiplas doses repetitivas ao longo de muitos dias são vantajosos. Portanto, os presentes inventores conduziram uma avaliação de dose máxima tolerada repetida tanto para a 5-formil-2’-desoxicitidina quanto para a 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina como descrito acima (Materiais e métodos). Visto que elas foram bem toleradas como uma dose única em ambos os grupos de tratamento, doses de 300mg/kg, 1.000 mg/kg e 2.000 mg/kg foram selecionadas para avaliação de múltiplas doses toleradas repetidas.
[00347] Os camundongos foram injetados com o composto indicado na dose indicada intraperitonealmente uma vez a cada três dias por um total de 5 doses. Embora a sobrevida fosse um objetivo final desse estudo, o objetivo final primário do estudo foi o peso corporal; a presença de sintomas tóxicos agudos (mortalidade, convulsões, tremores, relaxamento muscular, sedação, etc.) e efeitos autônomos (diarreia, salivação, lacrimação, vasodilatação, piloereção, etc.) nos animais foi também monitorada durante os primeiros 30 minutos, novamente em 1, 24, 48 e 72 horas. Os pesos corporais foram registrados pré-dose e em 72 horas.
[00348] O peso corporal em animais não tratados não foi estatisticamente diferente dos animais tratados com 5-formil-2’-desoxicitidina ou 5- hidroximetil-2’-desoxicitidina em qualquer dose avaliada (Figura 1B). Esses resultados indicam que esses compostos são bem tolerados nas doses indicadas ao longo de períodos prolongados.
91 / 108 Exemplo 4: Citotoxicidade in vivo
[00349] A 5-formil-2’desoxicitidina e a 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina foram avaliadas em um modelo de xenoenxerto de camundongo com glioblastoma multiforme como descrito acima (Materiais e métodos). As células U87-MG foram injetadas subcutaneamente no flanco de camundongos nus. Permitiu-se que os tumores se formassem como descrito acima (Materiais e métodos). Após os tumores alcançarem entre 129 mm3 e 131 mm3, os animais foram divididos em 4 grupos – dois grupos de tratamento, um grupo de controle negativo e um grupo de controle positivo. Os dois grupos de tratamento foram 5-formil-2’-desoxicitidina e 5-hidroximetil-2’- desoxicitidina. Os camundongos nos grupos de tratamento receberam uma dose de 2.000 mg/kg de 5-formil-2’-desoxicitidina ou 5-hidroximetil-2’- desoxicitidina a cada três dias por um total de 5 doses. O grupo de controle negativo foi tratado de maneira idêntica ao grupo de tratamento exceto pelo fato de que a injeção intraperitoneal continha veículo e nenhum composto. O grupo de controle positivo foi tratado com 5 doses diárias de 40 mg/kg de temozolomida.
[00350] O volume tumoral (Figura 1C), peso corporal (Figura 1D), mortalidade e sinais de toxicidade observável foram monitorados e registrados duas vezes por semana por 29 dias. O volume tumoral (mm3) foi estimado de acordo com a fórmula elipsoide como: comprimento x (largura)2 x 0,5. O percentual de inibição de crescimento tumoral (% de TGI) foi determinado usando a seguinte fórmula: % TGI = (1 −[(Tn)/(Cn)]) × 100, em que Tn = volume tumoral médio do grupo tratado no dia “n”, e Cn = volume tumoral médio do grupo de controle no dia “n”. Um valor de %T/C ≤ 42% ou um valor de percentual de TGI ≥ 58% em comparação com o do grupo de controle negativo foi considerado atividade antitumor significativa. A ANOVA de duas vias (RTM) seguida do teste de Bonferroni também foi usada para averiguar a diferença estatisticamente significativa em comparação
92 / 108 com o grupo de controle negativo durante o estudo; dia 1 até o dia 29 (*p<0,05).
[00351] A Figura 1C indica que o tratamento com 5-formil-2’- desoxicitidina ou 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina resultou em uma diminuição acentuada do volume tumoral, comparável à alcançada com temozolomida, ao longo de todos os momentos.
[00352] Ao final do estudo, tanto a 5-formil-2’-desoxicitidina quanto a 5- hidroximetil-2’-desoxicitidina mostraram atividade antitumor significativa, 83% e 93% de TGI respectivamente (Figura 1E). O grupo de controle positivo tratado com temozolomida mostrou 94% de TGI. Todos os compostos foram bem tolerados pelos camundongos e nenhuma mudança significativa no peso corporal foi observada como resultado do tratamento (Figura 1D). Na conclusão desse estudo, os tumores foram dissecados do camundongo e fotografados (Figura 1F) e medidos (Figura 1G); efeitos citotóxicos acentuados foram observados com ambos os grupos tratados.
[00353] Um camundongo no grupo de controle morreu durante esse experimento, o volume tumoral desse camundongo não foi relatado no dia 29; no entanto, os volumes tumorais desse camundongo são incluídos para os dias anteriores.
[00354] Juntos, esses resultados surpreendentes demonstram que a 5- formil-2’-desoxicitidina e a 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina exterminam eficientemente as células de glioblastoma multiforme (glioma, grau IV) e não são fortemente citotóxicas para células normais. Ademais, esses compostos são bem tolerados em camundongos e alcançaram redução acentuada do volume tumoral com efeitos colaterais mínimos em camundongos. Os resultados demonstram que os compostos da invenção podem ser usados para tratar cânceres humanos, e eles podem ser usados em doses altas para exterminar células tumorais sem exterminar células não cancerosas. Assim, há
93 / 108 uma larga janela terapêutica para o uso desses compostos como fármacos anticâncer. Exemplo 5: Efeito citotóxico vs. citostático
[00355] Os ensaios de linhagem celular acima medem a atividade metabólica e, assim sendo, não distinguem entre inibição de divisão celular e morte celular. Foi, portanto, avaliado se a 5-formil-2’desoxicitidina e a 5- hidroximetil-2’-desoxicitidina estavam exterminando células sensíveis ou fazendo com que elas atrasassem seu ciclo celular. As células SF-188 de glioma grau IV foram tratadas ou com DMSO, temozolomida, 5-formil-2’- desoxicitidina ou 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina na concentração indicada. As células foram colhidas e coloridas com anexina V (detecta células apoptóticas por sua capacidade de se ligar à fosfatidilserina) e 7AAD (um corante de DNA que não passa prontamente através de membranas celulares intactas; as células com membranas comprometidas serão, portanto, seletivamente coloridas) e analisadas por citometria de fluxo como descrito acima (Materiais e métodos). As células SF-188 tratadas com DMSO ou temozolomida produziram perfis citométricos similares com um leve aumento na quantidade de células mortas no controle tratado com temozolomida. A maior parte das células SF-188 tratadas com 5-formil-2’-desoxicitidina ou 5- hidroximetil-2’-desoxicitidina estavam mortas de acordo com o perfil de citometria de fluxo (Figura 2A). Está claro que as células SF188 expostas a 5-formil-2’-desoxicitidina ou 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina estão mortas e não presas em um checkpoint de ciclo celular. Exemplo 6: Requisito para derivados de açúcar 2’-desoxi
[00356] O 5-flurouracil, um fármaco quimioterápico contra câncer amplamente usado, tem múltiplas variantes que são citotóxicas; essas variantes incluem o 5-flurouracil de nucleosídeo (5-flurouridina e 5-fluro-2’- desoxiuridina) e nucleobase. Os presentes inventores avaliaram se as variantes
94 / 108 de ribonucleosídeo e nucleobase de 5-formil-2’-desoxicitidina e 5- hidroximetil-2’-desoxicitidina também seriam citotóxicas.
[00357] Como mostrado na Tabela I, a 5-formil-2’-desoxicitidina é citotóxica para células HeLa. A citotoxicidade de 5-formilcitidina e 5- formilcitosina em células HeLa foi avaliada em um ensaio de sobrevida como descrito acima. Surpreendentemente, e em contraste com 5-fluorouridina e 5- fluorouracil, nem a 5-formilcitidina nem a 5-formilcitosina foram citotóxicas para células HeLa (Figura 2B).
[00358] A Tabela I mostra que a 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina é citotóxica para células U87-MG. A citotoxicidade da 5-hidroximetilcitidina e da 5-hidroximetilcitosina em células U87-MG foi avaliada em um ensaio de sobrevida como descrito acima. Surpreendentemente, e em contraste com 5- fluorouridina e 5-fluorouracil, a 5-hidroximetilcitidina e a 5- hidroximetilcitosina mostraram não serem citotóxicas para células U87-MG (Figura 2C).
[00359] Esses resultados indicam que o açúcar 2’-desoxirribose é necessário para a citotoxicidade dos compostos da presente invenção. Por sua vez, esse resultado indica, surpreendentemente, que a 5-formil-2’- desoxicitidina e a 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina exploram uma via celular fundamentalmente diferente do que as fluropirimidinas. Exemplo 7: Não efeito da citidina desaminase
[00360] Os análogos de nucleosídeo e nucleotídeo mutados são muitas vezes removidos do pool de nucleotídeos por citidina desaminase (CDA). A CDA inativa a gemcitabina e a citosina arabinosídeo – dois agentes anticâncer análogos a nucleotídeo. Os agentes anticâncer que não são inativados por CDA seriam desejáveis. Visto que a 5-formil-2’-desoxicitidina e a 5- hidroximetil-2’-desoxicitidina são derivados de citidina, os presentes inventores conjecturaram que as células que expressam CDA seriam
95 / 108 resistentes ao tratamento com 5-formil-2’-desoxicitidina e 5-hidroximetil-2’- desoxicitidina.
[00361] Surpreendentemente, no entanto, não houve de fato nenhuma correlação observada entre a expressão de CDA e a resistência ou sensibilidade a 5-formil-2’-desoxicitidina ou a 5-hidroximetil-2’- desoxicitidina, como mostrado na Tabela 4A. Os dados de IC50 na Tabela 4 são idênticos aos da Tabela 1. Os níveis de expressão de CDA nas linhagens celulares especificadas foram identificados usando o atlas de expressão de EMBL (https://www.ebi.ac.uk/gxa/home, usando o termo de busca CDA). A expressão de CDA é relatada como transcritos de RNA por milhão (TPM), como descrito em Wagner et al., (2012) Theory Biosci 131(4):281-285 e Mortazavi A et al., (2008) “Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.” Nature methods 5(7):621-8. Se mais de um valor foi relatado, o valor mais baixo foi usado. Tabela 4A: Nenhuma correlação entre o nível de expressão de CDA e a sensibilidade ao tratamento com 5-formil-2’-desoxicitidina ou 5-hidroximetil- 2’-desoxicitidina. Expressão IC50 (μM) Linhagem Camada Doença de CDA celular germinativa 2d5fC 2d5hmC (TPM) U87-MG Glioma, grau IV Ectoderma 6 0,3340 3,027 HCT-116 Carcinoma de Endoderma 24 25,00 > 25,00 A549 cólon Carcinoma Endoderma 50 >1,835 25,00 > 25,00 pulmonarde Carcinoma 22Rv1 Endoderma 1 > 25,00 > 25,00 próstata NCI-N87 Carcinoma Endoderma 46 0,8057 > 25,00 MIA gástrico Carcinoma Endoderma 3 1,143 > 25,00 PaCa-2 A-498 pancreático Carcinoma renal Mesoderma 29 > 25,00 > 25,00 U937 Linfoma Mesoderma 146 0,9536 > 25,00 A375 Melanoma Mesoderma 0 3,188 > 25,00 maligno Leucemia HL-60 promielocítica Mesoderma 10 6,262 > 25,00 aguda Adenocarcinoma SK-OV-3 Mesoderma 295 9,690 > 25,00 de ovário Adenocarcinoma MCF-7 Mesoderma 0 0,8657 > 25,00 epitelial U2OS Osteossarcoma de Mesoderma 13,0 8,69 > 25,00 osso
96 / 108 Adenocarcinoma HeLa Mesoderma 42 0,76 > 25,00 cervical Leucemia mielogênica HAP1 Mesoderma N.A. > 25,00 6,53 crônica (CML) Ovário de hamster V79 Mesoderma N.A. > 25,00 > 25,00 chinês (Adenocarcinoma metastático de H1437 células não Endoderma 49 5,65 n.d. pequenas) de pulmão (Adenocarcinoma H1573 metastático) de Endoderma 67 7,72 n.d. pulmão MDA- adenocarcinoma Endoderma 153,0 --- --- MB-231 de mama, carcinoma pulmonar de HOP-92 Endoderma 321,0 --- --- células não pequenas adenocarcinoma Capan-2 Endoderma 248,0 --- --- ductal pancreático
[00362] Uma correlação linear entre citotoxicidade e exposição a fármaco mostrou um ajuste fraco (modelo linear para 2d5fc, Rz = 0,00173; modelo linear para 2d5hmC, Rz = 0,02262). Os dados, tomados juntos com os dados de EMBL, sugeriram que a expressão de CDA não é relevante para a sensibilidade ou resistência a 5-formil-2’-desoxicitidina ou 5-hidroximetil-2’- desoxicitidina.
[00363] Adicionalmente, o nível de expressão de CDA (TPM) de várias linhagens celulares de glioma foi determinado e é mostrado na Tabela 4B. Os níveis de expressão de CDA nas linhagens celulares especificadas foram identificados usando a Enciclopédia de Linhagem Celular do Câncer (https://portals.broadinstitute.org/ccle), que é descrita em Barretina, J et al. (2012) The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483:603-7. A expressão de CDA é relatada como transcritos de RNA por milhão (TPM), como descrito em Wagner et al., (2012) Theory Biosci 131(4):281-285. Se mais de um valor foi relatado, o valor mais alto foi usado.
97 / 108 Tabela 4B: Nível de expressão de CDA em várias linhagens celulares de glioma. Linhagem celular de glioma Expressão de CDA (TPM) 42-MG-BA 1,0 8-MG-BA 3,0 A172 2,0 AM-38 7,0 CAS-1 0,2 DBTRG-05MG 0,7 DK-MG 0,1 GAMG 41,0 GB-1 0,5 GMS-10 24,0 GOS-3 0,5 KALS-1 24,0 KNS-42 0,4 KNS-60 30,0 KNS-81 0,6 KS-1 7,0 LN-18 11,0 LN-229 0,3 M059K 8,0 SF-295 3,0 SF126 16,0 SNB75 0,6 SNU-1105 7,0 SNU-201 0,3 SNU-466 0,1 SNU-489 3,0 SNU-626 0,2 T98G 3,0 U-87 MG 6,0 YH-13 4,0 YKG1 0,2 Exemplo 8: Efeito não mutagênico
[00364] Um atual tratamento de linha de frente para glioblastoma multiforme – temozolomida – é um potente mutagênico. De fato, a temozolomida exerce sua atividade quimioterápica contra câncer mutando a célula tumoral de maneira tão severa que as células tumorais são exterminadas. A temozolomida funciona por alquilando DNA, causando mutações. A expressão de MGMT – uma proteína responsável por remover
98 / 108 danos de DNA alquilado – torna as células de glioblastoma quase completamente resistentes aos efeitos citotóxicos da temozolomida.
[00365] Portanto, os presentes inventores investigaram se a 5-formil-2’- desoxicitidina e a 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina tinham um mecanismo de ação similar. A mutagenicidade desses compostos foi avaliada em um ensaio de hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HPRT) como descrito acima (Materiais e métodos). Como mostrado no ensaio de HPRT, nem a 5- hidroximetil-2’-desoxicitidina nem a 5-formil-2’-desoxicitidina eram genotóxicas para células mamíferas em qualquer concentração avaliada (Figura 3). Esses resultados indicam que a 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina e a 5-formil-2’-desoxicitidina não são mutágenos, isto é, que seus efeitos citotóxicos não são devido a atividade mutagênica. Exemplo 9: Citotoxicidade de outros compostos vs. células HeLa
[00366] As células HeLa foram tratadas ou com 5-formil-2’- desoxicitidina, 5-formilcitidina ou 5-cloro-2’-desoxicitidina. Após três dias de tratamento com esses compostos em uma concentração de 100, 25, 6,25, 1,56, 0,39, 0,1, 0,02, ou 0,006 μM, a sobrevida celular foi avaliada por ensaio de MTT como descrito acima (Materiais e métodos).
[00367] Como mostrado na Figura 4. Um efeito citotóxico acentuadamente maior é observado após o tratamento com 5-formil-2’- desoxicitidina do que após o tratamento ou com 5-formilcitidina ou 5-cloro- 2’-desoxicitidina. Exemplo 10: Citotoxicidade de outros compostos vs. células de glioma
[00368] As células U87-MG (glioma, grau IV) foram tratadas ou com 5- formil-2’-desoxicitidina, 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina, 5-carboxi-2'- desoxicitidina, temozolomida, 5-flurouracil, 5-bromo-2’-desoxicitidina, 5- iodo-2’-desoxicitidina ou 5-cloro-2'-desoxicitidina em uma concentração de 100, 25, 6,25, 1,56, 0,39, 0,1, 0,02, ou 0,006 . Após três dias de tratamento
99 / 108 com esses compostos, a sobrevida celular foi avaliada por ensaio de MTT como descrito acima (Materiais e métodos). Cultura celular
[00369] As linhagens celulares U87-MG foram cultivadas em DMEM (Sigma, Cat. nº D6429) suplementadas com soro fetal bovino a 10%. Todas as células foram mantidas a 37˚C em uma incubadora com camisa de água, umidificada, com CO2 a 5%. As células foram passadas entre 70 e 90% de confluência. Ensaio de sobrevida
[00370] Em uma placa de 96 poços, foram semeadas 4.000 células em 100 μl de meio correspondente. No dia seguinte, fármacos, diluídos em DMSO, foram adicionados em triplicata em uma concentração de 100, 25, 6,25, 1,56, 0,39, 0,1, 0,02, ou 0,006 μM. As células foram incubadas com os fármacos por 72 horas. A proliferação celular foi avaliada por ensaio de MTT de acordo com o protocolo do fabricante (ATCC, Cat. nº 30-1010K). A sobrevida celular foi normalizada à sobrevida de células tratadas somente com DMSO. O experimento foi realizado três vezes, os dados representam a média de nove poços ± SEM.
[00371] Como mostrado na Tabela 5, tanto a 5-formil-2’-desoxicitidina quanto a 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina tiveram desempenho surpreendentemente melhor em termos de citotoxicidade vs. células U87-MG do que os outros compostos testados, incluindo 5-bromo-2’-desoxicitidina, 5- iodo-2’-desoxicitidina e 5-cloro-2’-desoxicitidina. Tabela 5: Avaliação de citotoxicidade de vários compostos para células U87- MG. IC50 é a concentração na qual metade das células são exterminadas pelo composto relevante. Linhagem celular: U87-MG Composto testado IC50 (μM) 5-formil-2’-desoxicitidina 0,3340 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina 3,027 5-carboxi-2'-desoxicitidina > 25,00
100 / 108 Temozolomida > 25,00 5-flurouracil > 25,00 5-bromo-2'-desoxicitidina > 25,00 5-cloro-2'-desoxicitidina > 25,00 5-iodo-2’-desoxicitidina > 25,00
[00372] Adicionalmente, as células U87-MG foram tratadas com 5- formil-2’-desoxicitidina (d5fC), 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina (d5hmC), 5- cloro-2’-desoxicitidina (5CldC),
[00373] 5-bromo-2’-desoxicitidina (5BrdC), 5-Iodo-2’desoxicitidina (5IdC) e timidina. Os resultados são mostrados na Figura 5. A d5hmC e a d5fC são acentuadamente mais citotóxicas do que 5CldC, 5BrdC, dIdC e timidina para células de glioma.
[00374] Em uma placa de 96 poços, foram semeadas 4.000 células em 100 μl de meio correspondente. No dia seguinte, fármacos, diluídos em DMSO, foram adicionados em triplicata em uma concentração de 100, 25, 6,25, 1,56, 0,39, 0,1, 0,02, ou 0,006 μM. As células foram incubadas com os fármacos por 72 horas. A proliferação celular foi avaliada por ensaio de MTT de acordo com o protocolo do fabricante (ATCC, Cat. nº 30-1010K). A sobrevida celular foi normalizada à sobrevida de células tratadas somente com DMSO. O experimento foi realizado três vezes, os dados representam média ± SD. Exemplo 11: Efeito não mediado por meio de timidina sintase Cultura celular
[00375] As linhagens celulares U87-MG foram cultivadas em DMEM (Sigma, Cat. nº D6429) suplementadas com soro fetal bovino a 10%. Todas as células foram mantidas a 37˚C em uma incubadora com camisa de água, umidificada, com CO2 a 5%. As células foram passadas entre 70 e 90% de confluência. Ensaio de sobrevida
[00376] Em uma placa de 96 poços, foram semeadas 4.000 células em 100 μl de meio correspondente. No dia seguinte, fármacos, diluídos em
101 / 108 DMSO, foram adicionados em 8 concentrações em triplicata. Os fármacos foram adicionados como uma série de diluição de 4 vezes partindo de 100 μM.
[00377] As células foram incubadas com os fármacos por 72 horas. A proliferação celular foi avaliada por ensaio de MTT de acordo com o protocolo do fabricante (ATCC, Cat. nº 30-1010K). A sobrevida celular foi normalizada à sobrevida de células tratadas somente com DMSO. O experimento foi realizado três vezes, os dados representam a média de nove poços ± SD.
[00378] Os resultados são mostrados na Figura 6. A citotoxicidade da 5- formil-2’-desoxicitidina e 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina não é salva pela adição de timidina nas células U87-MG. Esse resultado indica que a 5-formil- 2’-desoxicitidina e a 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina não agem inibindo a timidina sintase. Exemplo 12: Terapia combinada com temozolomida Cultura celular
[00379] As linhagens celulares de glioblastoma multiforme (U87-MG) foram cultivadas em DMEM (Sigma, Cat. nº D6429) suplementadas com soro fetal bovino a 10%. Todas as células foram mantidas a 37˚C em uma incubadora com camisa de água, umidificada, com CO2 a 5%. As células foram passadas entre 70 e 90% de confluência. Ensaio de sobrevida
[00380] Em uma placa de 96 poços, foram semeadas 4.000 células em 100 μl de meio correspondente. No dia seguinte, fármacos, diluídos em DMSO, foram adicionados em 8 concentrações em triplicata. Os fármacos foram adicionados como uma série de diluição de 4 vezes partindo de 100 μM.
[00381] As células foram incubadas com os fármacos por 72 horas. A proliferação celular foi avaliada por ensaio de MTT de acordo com o
102 / 108 protocolo do fabricante (ATCC, Cat. nº 30-1010K). A sobrevida celular foi normalizada à sobrevida de células tratadas somente com DMSO. O experimento foi realizado três vezes, os dados representam a média desses experimentos.
[00382] Como mostrado na Figura 7, uma linhagem celular de glioblastoma multiforme humano que é resistente a temozolomida foi tratada apenas com temozolomida, com 5-formil-2’-desoxicitidina (d5fC) ou uma combinação de d5fC e temozolomida. A combinação de temozolomida e d5fC é mais eficaz no tratamento de glioblastoma multiforme humano do que qualquer uma das duas substâncias químicas sozinha.
[00383] Como mostrado na Figura 8, uma linhagem celular de glioblastoma multiforme humano que é resistente a temozolomida foi tratada apenas com temozolomida, com 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina (d5hmC) ou uma combinação de d5hmC e temozolomida. A combinação de temozolomida e d5hmC é mais eficaz no tratamento de glioblastoma multiforme humano do que qualquer uma das duas substâncias químicas sozinha.
[00384] Assim, a 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina e a 5-formil-2’- desoxicitidina agem sinergicamente com a temozolomida. Exemplo 13: Análogos de uridina
[00385] Os efeitos citotóxicos de 5-metoximetil-2’-desoxiuridina e 5- acetoximetil-2’-desoxiuridina foram avaliados. Cultura celular a. As linhagens celulares U87-MG foram cultivadas em DMEM (Sigma, Cat. nº D6429) suplementadas com soro fetal bovino a 10%. Todas as células foram mantidas a 37˚C em uma incubadora com camisa de água, umidificada, com CO2 a 5%. As células foram passadas entre 70 e 90% de confluência. Ensaio de sobrevida
[00386] Em uma placa de 96 poços, foram semeadas 4.000 células em 100 μl de meio correspondente. No dia seguinte, fármacos, diluídos em
103 / 108 DMSO, foram adicionados em 8 concentrações em triplicata. Os fármacos foram adicionados como uma série de diluição de 4 vezes partindo de 100 μM.
[00387] As células foram incubadas com os fármacos por 72 horas. A proliferação celular foi avaliada por ensaio de MTT de acordo com o protocolo do fabricante (ATCC, Cat. nº 30-1010K). A sobrevida celular foi normalizada à sobrevida de células tratadas somente com DMSO. O experimento foi realizado três vezes, os dados representam a média de nove poços ± SEM.
[00388] Como mostrado na Figura 9, a linhagem celular U87-MG, de glioblastoma multiforme, é incapaz de sobreviver a um tratamento com concentrações crescentes de 5-metoximetil-2-desoxiuridina ou 5-acetoximetil- 2’-desoxiuridina. Portanto, a 5-metoximetil-2-desoxiuridina e a 5- acetoximetil-2’-desoxiuridina são agentes anticâncer eficazes, particularmente contra glioblastoma multiforme. Exemplo 14: Citotoxicidade do 5-formil-2’-desoxicitidina-5’-trifosfato (HeLa) Cultura celular
[00389] As linhagens celulares HeLa foram cultivadas em DMEM (Sigma, Cat. nº D6429) suplementadas com soro fetal bovino a 10%. Todas as células foram mantidas a 37˚C em uma incubadora com camisa de água, umidificada, com CO2 a 5%. As células foram passadas entre 70 e 90% de confluência. Ensaio de sobrevida
[00390] Em uma placa de 96 poços, foram semeadas 4.000 células em 100 μl de meio correspondente. No dia seguinte, fármacos, diluídos em DMSO, foram adicionados em 8 concentrações em triplicata. Os fármacos foram adicionados como uma série de diluição de 4 vezes partindo de 100 μM. As células foram incubadas com os fármacos por 72 horas. A
104 / 108 proliferação celular foi avaliada por ensaio de MTT de acordo com o protocolo do fabricante (ATCC, Cat. nº 30-1010K). A sobrevida celular foi normalizada à sobrevida de células tratadas somente com DMSO. O experimento foi realizado três vezes, os dados representam a média de nove poços ± SEM.
[00391] Como mostrado na Figura 10A, as células de carcinoma cervical HeLa são incapazes de sobreviver a um tratamento com concentrações crescentes de 5-formil-2’-desoxicitidina-5’-trifosfato. Isso demonstra a utilidade do 5-formil-2’-desoxicitidina-5’-trifosfato no tratamento de cânceres humanos, por exemplo, carcinoma cervical. Exemplo 15: Citotoxicidade de 5-formil-2’-desoxicitidina-5’-trifosfato e 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina-5’-trifosfato (glioma)
[00392] As células U87-MG (glioma, grau IV) foram tratadas ou com 5- formil-2’-desoxicitidina-5’-trifosfato ou 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina-5’- trifosfato em uma concentração de 100, 25, 6,25, 1,56, 0,39, 0,1, 0,02, ou 0,006 μM. Após três dias de tratamento com esses compostos, a sobrevida celular foi avaliada por ensaio de MTT como descrito acima (Materiais e métodos). Cultura celular
[00393] As linhagens celulares U87-MG foram cultivadas em DMEM (Sigma, Cat. nº D6429) suplementadas com soro fetal bovino a 10%. Todas as células foram mantidas a 37˚C em uma incubadora com camisa de água, umidificada, com CO2 a 5%. As células foram passadas entre 70 e 90% de confluência. Ensaio de sobrevida
[00394] Em uma placa de 96 poços, foram semeadas 4.000 células em 100 μl de meio correspondente. No dia seguinte, fármacos, diluídos em DMSO, foram adicionados em triplicata em uma concentração de 100, 25, 6,25, 1,56, 0,39, 0,1, 0,02, ou 0,006 μM. As células foram incubadas com os fármacos
105 / 108 por 72 horas. A proliferação celular foi avaliada por ensaio de MTT de acordo com o protocolo do fabricante (ATCC, Cat. nº 30-1010K). A sobrevida celular foi normalizada à sobrevida de células tratadas somente com DMSO. O experimento foi realizado três vezes, os dados representam a média de pelo menos 3 poços ± SD.
[00395] Como mostrado na Figura 10B, tanto o 5-formil-2’- desoxicitidina-5’-trifosfato quanto o 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina-5’- trifosfato foram citotóxicos para células U87-MG, de glioma. Exemplo 16: Expressão de CDA
[00396] O nível de expressão de CDA linear e transformado por logaritmo base 2 de várias linhagens celulares de glioma foi determinado. Os níveis de expressão de CDA nas linhagens celulares especificadas foram identificados usando o banco de dados GENEVESTIGATOR® (https://genevestigator.com/gv/ ), buscando-se por CDA, organismo: homo sapiens, plataforma: Human Genome U133 2.0 Array da Affymetrix. Os resultados são mostrados nas Figuras 11 a 13 e na Tabela 6.
[00397] A Figura 11 mostra os níveis de expressão de CDA Log2 normalizados determinados para vários cânceres. A Figura 12 mostra os níveis de expressão de CDA lineares determinados para vários cânceres. As Figuras 13A e 13B mostram os níveis de expressão de CDA Log2 normalizados em vários tumores de cérebro humanos. As Figuras 14A e 14B mostram os níveis de expressão de CDA lineares em vários tumores de cérebro humanos.
[00398] A Tabela 6 abaixo mostra os níveis de expressão de CDA de várias linhagens celulares e os valores de IC50 para 2d5hmC e/ou 2d5fc nessas linhagens celulares. Os valores de IC50 foram obtidos como descrito acima (Materiais e métodos e Exemplo 1). Tabela 6: Níveis de expressão de CDA (valores normalizados Log2) e valores de IC50 de 2d5hmC e/ou 2d5fc em várias linhagens celulares.
106 / 108 Log2 Log2 SD de Linhagem Log2 média mediana de IC50 2d5hmC IC50 2d5fC expressão de celular de CDA expressão de
CDA
CDA U87-MG 3,027 0,334 9,84 0,42 9,94 HCT-116 25 25 11,11 0,62 10,93 A549 25 25 12 1,01 11,93 22Rv1 25 25 8,92 0,62 9,05 NCI-N87 25 0,8057 11,6 0,56 11,37 MIA PaCa-2 25 1,143 9,68 0,49 9,79 A-498 25 25 10,52 1,06 10,32 U937 25 0,9536 13,82 0,45 13,89 A375 25 3,188 9,36 0,62 9,56 HL-60 25 6,262 10,36 0,96 10,12 SK-OV-3 25 9,69 13,35 1,59 14,07 MCF-7 25 0,8657 9,26 0,39 9,2 U2OS 25 8,69 10,14 10,14 HeLa 25 0,76 13,15 0,92 13,33 HAP1 6,53 25 Nenhum HEK293 25 25 9,59 0,4 9,53 ARPE19 25 25 9,99 0,7 9,94 MRC5 25 25 9,87 0,29 9,82 H1437 --- 5,65 13,02 1,12 12,44 H1573 --- 7,72 13,63 0,18 13,67
[00399] A Tabela 7 abaixo mostra os níveis de expressão de CDA lineares de várias linhagens celulares e os valores de IC50 para 2d5hmC e/ou 2d5fc nessas linhagens celulares. Os valores de IC50 foram obtidos como descrito acima (Materiais e métodos e Exemplo 1). Tabela 7: Níveis de expressão de CDA lineares e valores de IC50 de 2d5hmC e/ou 2d5fc em várias linhagens celulares. Mediana Linhagem Média linear SD linear de IC50 2d5hmC IC50 2d5fC linear de celular de CDA CDA
CDA U87-MG 3,027 0,334 951,65 276,02 989,44 HCT-116 25 25 2481,67 1559,27 1949,23 A549 25 25 5490,76 5549,26 3904,87 22Rv1 25 25 519,39 225,08 527,89 NCI-N87 25 0,8057 3327,03 1464,72 2654,16
107 / 108 MIA PaCa-2 25 1,143 860,01 261,17 881,38 A-498 25 25 1874,54 1443,37 1301,02 U937 25 0,9536 15148,69 4611,68 15231,25 A375 25 3,188 700,89 226,39 753,10 HL-60 25 6,262 1787,26 2129,78 1112,79 SK-OV-3 25 9,69 15500,02 11439,83 17236,82 MCF-7 25 0,8657 635,57 182,06 588,96 U2OS 25 8,69 1130,20 N/A 1130,20 HeLa 25 0,76 10915,38 6549,95 10272,63 HAP1 6,53 25 *** *** *** HEK293 25 25 800,57 225,25 738,45 ARPE19 25 25 1.133,42 515,09 981,92 MRC5 25 25 950,82 212,00 901,07 H1437 --- 5,65 11.861,95 14.192,00 5.568,28 H1573 --- 7,72 12.779,53 1.515,78 13.045,67
[00400] Juntos esses resultados demonstram que muitos cânceres, incluindo todos os cânceres testados do sistema nervoso central, não superexpressam CDA; pelo contrário, expressam baixos níveis de CDA. Os resultados também demonstram que não há correlação entre a expressão de CDA e a sensibilidade a 5-formil-2’-desoxicitidina ou 5-hidroximetil-2’- desoxicitidina Exemplo 17: Permeabilidade da barreira sangue-cérebro
[00401] A permeabilidade da barreira sangue-cérebro foi medida usando um kit de ensaio Parallel Artificial Membrane Permeability Assay (PAMPA) da BioAssay Systems. As instruções do fabricante foram seguidas para determinar a permeabilidade.
[00402] Instruções do fabricante: 1. em tubos de centrifugação separados, preparar 500 μL de 500 μM de composto de teste: misturar 25 μL de 10mM de composto de teste em DMSO + 475 μL de PBS. Se usar os controles de permeabilidade, diluí-los também em 500 μM: misturar 25 μL de controle de permeabilidade + 475 μL de PBS. 2. Em tubos separados, preparar 200 μM de padrões de equilíbrio para cada composto de teste e controle: misturar 80 μL de 500 μM de composto de teste ou controle com 120 μL de PBS. Se o
108 / 108 composto for capaz de permeabilizar a membrana e alcançar completamente o equilíbrio, 200 μM serão a concentração final da solução nos poços de doador e aceitador. Em seguida, em um tubo separado, misturar 5 μL de DMSO + 245 μL de PBS para preparar o controle em branco. Separar os padrões de equilíbrio e o controle em branco para análise no dia seguinte. 3. Adicionar 300 μL de PBS a poços na placa de aceitador. 4. Com a placa de doador ainda em sua bandeja, adicionar 5 μL de lecitina a 4% em dodecano diretamente às membranas do poço da placa de doador. Tomar cuidado para não perfurar as membranas com a ponta da pipeta. 5. Adicionar 200μL de cada 500 μM de composto de teste e 500 μM de controles de permeabilidade para duplicar os poços da placa de doador. Observação: recomenda-se rodar todas as variáveis experimentais pelo menos em duplicata 5. Colocar cuidadosamente a placa de doador nos poços da placa de aceitador. Incubar à temperatura ambiente ou 37°C por 18 horas ou o período de incubação desejado (por exemplo, 16 – 24 horas) 6. Remover cuidadosamente a placa de doador e coletar o líquido nos poços da placa de aceitador para análise. Esse será referido como solução de aceitador 7. Adicionar 100 μL de solução de aceitador e padrões de equilíbrio para cada composto de teste e controle de permeabilidade. Adicionar ainda 100 μL de controle em branco a poços de placa UV (cat. nº P96UV). 8. Ler o espectro de absorbância de 200nm a 500nm em intervalos de 10nm para determinar o pico de absorbância dos compostos de teste. O controle em branco é para confirmar que os picos são devido ao composto de teste e não ao DMSO na solução. Os picos de absorbância para os controles de alta permeabilidade, média permeabilidade e baixa permeabilidade são 280nm, 270nm, e 270nm respectivamente.
[00403] Como mostrado na Figura 15, 2d5hmC e 2d5fC passam a barreira sangue-cérebro.

Claims (26)

REIVINDICAÇÕES
1. Composto, caracterizado pelo fato de ser da fórmula (I): Fórmula (I) ou um estereoisômero, solvato, tautômero ou sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos para uso em terapia; em que: X é um grupo contendo de 1 a 20 átomos de não hidrogênio, que contém pelo menos um grupo funcional selecionado dentre um aldeído, um álcool, um álcool protegido, um éter, um éster e um ácido carboxílico, com a condição de que X não seja -COOH; W1 e W2 são, cada um, independentemente O, S ou NH; Y é H ou um grupo contendo de 1 a 15 átomos de não hidrogênio; Z é -OPG, -ORz ou -N(RxRy), em que Rx, Ry e Rz são independentemente H ou um grupo contendo de 1 a 10 átomos de não hidrogênio; R1 é H ou um grupo contendo de 1 a 15 átomos de não hidrogênio; R2 é H, -OH, -OPG, -F, -Cl, -Br, -I, ou -N3; e R3 é H, -F, -Cl, -Br, -I, ou -N3; em que PG é um grupo protetor de álcool, tal como acetila
(Ac), benzila (Bn) ou benzoíla (Bz).
2. Composto, caracterizado pelo fato de ser da fórmula (I): Fórmula (I) ou um estereoisômero, solvato, tautômero ou sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos para uso no tratamento ou prevenção de câncer; em que: X é um grupo contendo de 1 a 20 átomos de não hidrogênio, que contém pelo menos um grupo funcional selecionado dentre um aldeído, um álcool, um álcool protegido, um éter, um éster e um ácido carboxílico, com a condição de que X não seja -COOH; W1 e W2 são, cada um, independentemente O, S ou NH; Y é H ou um grupo contendo de 1 a 15 átomos de não hidrogênio; Z é -OPG, -ORz ou -N(RxRy), em que Rx, Ry e Rz são independentemente H ou um grupo contendo de 1 a 10 átomos de não hidrogênio; R1 é H ou um grupo contendo de 1 a 15 átomos de não hidrogênio; R2 é H, -OH, -OPG, -F, -Cl, -Br, -I, ou -N3; e R3 é H, -F, -Cl, -Br, -I, ou -N3; em que PG é um grupo protetor de álcool, tal como acetila
(Ac), benzila (Bn) ou benzoíla (Bz).
3. Composto para uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o composto é um composto da fórmula (IIa) ou fórmula (IIb), preferivelmente da fórmula (IIa), ou um estereoisômero, solvato, tautômero ou sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos: Fórmula (IIa) Fórmula (IIb) em que X, R1 e R2 são como definido na reivindicação 1 ou 2.
4. Composto para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o composto é um composto da fórmula (IIIa), (IIIb), (IIIc) ou (IIId), preferivelmente da fórmula (IIIa) ou (IIIc), ou um estereoisômero, solvato, tautômero ou sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos: Fórmula (IIIa) Fórmula (IIIb)
Fórmula (IIIc) Fórmula (IIId) em que X é como definido na reivindicação 1 ou 2.
5. Composto para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que X é -(CH2)n-X', em que n é de 0 a 6 e X' é -CHO, -OH, -OR ou -OC(=O)R, em que R é metila.
6. Composto para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que X é um grupo que contém de 2 a 20 átomos de não hidrogênio.
7. Composto para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que X não é -COOH ou -OH.
8. Composto para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que X é a) -CHO ou -CH2OH; ou b) -CH2OCH3 ou -CH2OC(=O)CH3.
9. Composto para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que X é -CHO ou -CH2OH.
10. Composto para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que X é CH2OH.
11. Composto para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que Z é -NH2.
12. Composto para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o composto é 5-formil-2’- desoxicitidina, 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina, 5-metoximetil-2’- desoxiuridina, 5-acetoximetil-2’-desoxiuridina, 5-formil-2'-desoxicitidina-5'- trifosfato ou 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina-5'-trifosfato, ou um estereoisômero, solvato, tautômero ou sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.
13. Composto para uso de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o composto é 5-formil-2’-desoxicitidina ou 5- hidroximetil-2’-desoxicitidina, ou um estereoisômero, solvato, tautômero ou sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos,
14. Composto para uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o composto é 5-hidroximetil-2’-desoxicitidina ou um estereoisômero, solvato, tautômero ou sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.
15. Composto para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 14, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer de um tecido derivado do ectoderma, mesoderma paraxial, ou mesoderma da placa lateral, preferivelmente do ectoderma.
16. Composto para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 15, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer do sistema nervoso central, preferivelmente um câncer de cérebro.
17. Composto para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 16, caracterizado pelo fato de que o câncer é glioma, preferivelmente glioblastoma.
18. Composto para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 17, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer em que a CDA não é superexpressa, preferivelmente em que o câncer expressa CDA em um nível de ≤140 transcritos por milhão (TPM).
19. Composto para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 18, caracterizado pelo fato de que o nível de expressão de CDA no câncer não é maior do que 90% do nível de expressão de CDA em uma linhagem celular cancerosa de referência como determinado usando o mesmo método sob as mesmas condições, em que a dita linhagem celular cancerosa de referência é MDA-MB-231.
20. Composto para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 19, caracterizado pelo fato de que o câncer é resistente ao tratamento com gemcitabina, citarabina, temozolomida ou 5-fluorouracil.
21. Composto para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 20, caracterizado pelo fato de que o dito tratamento compreende administrar o dito composto em uma dose entre 10 mg/kg e 405 mg/kg.
22. Composto para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 21, caracterizado pelo fato de que o dito tratamento compreende adicionalmente a administração de um outro agente anticâncer.
23. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14 e um outro agente anticâncer para uso no tratamento ou prevenção de câncer.
24. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14 e opcionalmente um outro agente anticâncer, junto com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
25. Composição para uso de acordo com a reivindicação 22, kit de acordo com a reivindicação 23 ou produto farmacêutico de acordo com a reivindicação 24, caracterizados pelo fato de que o outro agente anticâncer é selecionado do grupo que consiste em gemcitabina, citarabina, temozolomida, 5-fluorouracil e gliadel (RTM).
26. Método para tratamento ou prevenção de câncer em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14 ao dito indivíduo, em que o dito câncer é como definido em qualquer uma das reivindicações 2 ou 15 a 17, e em que o dito tratamento é como definido em qualquer uma das reivindicações 2, 21, 22 ou 25.
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