PT1156827E - Utilização de composições compreendendo cidc como radiossensibilizadores no tratamento de doenças neoplásicas - Google Patents

Description

ΕΡ 1 156 827 /PT

DESCRIÇÃO "Utilização de composições compreendendo CldC como radiossensibilizadores no tratamento de doenças neoplásicas"

Campo do Invento 0 presente invento refere-se a agentes úteis no tratamento de tumores por radiação pela sensibilização de células tumorais para a radiação. 0 invento também se refere à utilização de agentes como na reivindicação 1 para tratar tumores pela administração dos agentes antes e/ou durante um curso de tratamento por radiação. Os agentes podem realizar radiossensibilização selectiva de tumores. Os agentes também estão envolvidos em hipometilação dirigida a tumores. Os agentes do invento incluem 5-cloro-2'-desoxicitidina (Cytochlor ou CldC) administrada com um inibidor da citidina-desaminase (tetra-hidrouridina (H4U) ou Zebularina (Zb), por exemplo) ou CldC administrada sem um inibidor da citidina-desaminase quando combinada com novas fontes, novos programas de radiação, e/ou novas categorias de tumores. Os agentes do invento também incluem 4-N-metilamino-5-fluoro-2'- desoxicitidina (4-N-metilamino-FdC), que pode ser co- administrada com um inibidor da citidina-desaminase.

Antecedentes do Invento

Em estudos no passado com tumores de roedores (1-3), o presente inventor constatou que era necessário co-administrar N-(fosfonoacetil)-L-aspartato (PALA) e 5-fluoro-2'- desoxicitidina (FdC) mais tetra-hidrouridina (H4U) ou 5-fluoro-2'-desoxiuridina (FdU) com 5-cloro-2'-desoxicitidina (Cytochlor, CldC) para se atingir uma radiossensibilização clinicamente relevante. 0 inventor referiu e publicou (1-3) que o protocolo não era susceptível a modificações, i.e. era necessário co-administrar três drogas com Cytochlor para que uma radiossensibilização biologicamente significativa ocorresse. Além disso, Perez et al. (Int. J. Radiat, Oncol. Biol. Phys. 10 (8): 1453-1458) descreve a utilização de 5-cloro-2'-desoxicitidina com tetra-hidrouridina como um radiossensibilizador de tumores. Contudo, as condições óptimas de radiossensibilização utilizando 5-cloro-2'-desoxicitidina com tetra-hidrouridina só podiam ser obtidas quando as células tumorais eram pré-incubadas com inibidores da biossintese de 2 ΕΡ 1 156 827 /PT pirimidina, i.e. N-(fosfonacetil)-L-aspartato (PALA) e 5-fluoro-2'-desoxiuridina ou 5-fluoro-2'-desoxicitidina + tetra-hidrouridina.

Além disso, WO 85/01871 A divulga a utilização de 5-cloro-2'-desoxicitidina juntamente com tetra-hidrouridina e/ou 2'-desoxi-hidrouridina num método de sensibilização de tecidos neoplásicos para radiação.

Lawrence et al. (Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 16(5):1243-1246) divulga a utilização das desoxicitidinas halogenadas, 5-bromo-2'-desoxicitidina e 5-bromo-2'-desoxicitidina, para a radiossensibilização selectiva e citoxicidade de células de melanoma humano.

Adicionalmente, Mundinger et al. (Acta Neurochirurgica 42(1-2): 73-77) e Wollner et al. (Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. Annu. Meet. 5:46) divulgam a utilização dos radiossensibilizadores 5-bromo-2'-desoxiuridina e 5-bromo-2'-desoxicitidina em combinação com irradiação por irídio-192 e ítrio-90 no tratamento de cancro, e.g. glioblastomas multiformes.

Porém, nenhum destes documentos contém uma divulgação ou sugestão relacionada com a utilização de 5-cloro-2'-desoxicitidina em combinação com um inibidor da citidina-desaminase e/ou 4-N-metilamino-FdC no fabrico de um medicamento para administração em terapia de radiação de tumores humanos associados a hipermetilação.

Seguindo o seu protocolo utilizando PALA, FdC, H4U e CldC nos seus estudos com tumores humanos em ratinhos nus, o inventor constatou de uma forma surpreendente e inesperada, que ocorria uma radiossensibilização clinicamente relevante e biologicamente significativa com CldC sozinho no estudo de tumores humanos associados a hipermetilação.

Sumário do Invento

De uma forma surpreendente e inesperada, tendo em consideração a longa experiência do inventor durante 18 anos com tumores de roedores, o inventor constatou que, de forma imprevista, havia radiossensibilização clinicamente relevante 3

ΕΡ 1 156 827 /PT e biologicamente significativa com Cytochlor (CldC) e uma outra droga apenas, tetra-hidrouridina (H4U), quando tumores humanos eram estudados. Num primeiro aspecto, o presente invento refere-se à utilização de um agente de tratamento de tumores compreendendo: (a) 5-cloro-2'-desoxicitidina e um inibidor da citidina- desaminase, onde o agente não contém 5-fluoro-2'-desoxicitidina (FdC), 5-fluoro-2'-desoxiuridina (FdU), e N-(fosfonacetil)-L-aspartato (PALA) (b) 5-cloro-2'-desoxicitidina e 4-N-metilamino-FdC, ou (c) 5-cloro-2'-desoxicitidina, 4-N-metilamino-FdC e um inibidor da citidina-desaminase; no fabrico de um medicamento para administração em terapia de radiação de tumores humanos associados a hipermetilação seleccionados do grupo que consiste em tumores humanos da mama, pulmão, cérebro, fígado, rim, ovário, testículo, pâncreas, tracto gastrointestinal, cabeça e pescoço, nasofaringe, pele, próstata e região orofacial, e onde o agente de tratamento de tumores é para administração subsequente à exposição do indivíduo a uma quantidade de radiação suficiente para induzir actividade aumentada de desoxicitidina-quinase (dCK) e/ou de timidina-quinase (TK) em células alvo do tumor ou tumores humanos, e onde o referido agente de tratamento de tumores é para administração antes da exposição adicional do indivíduo a uma quantidade de radiação eficaz para tratamento de tumores.

Noutro aspecto, o presente invento refere-se à utilização de (A), um agente de tratamento de tumores compreendendo: (a) 5-cloro-2'-desoxicitidina e um inibidor de citidina-desaminase, onde o agente não contém 5-fluoro-2'-desoxicitidina (FdC), 5-fluoro-2'-desoxiuridina (FdU), e N- (fosfonacetil)-L-aspartato (PALA) (b) 5-cloro-2'-desoxicitidina e 4-N-metilamino-FdC, ou (c) 5-cloro-2-desoxicitidina, 4-N-metilamino-FdC e um inibidor da citidina-desaminase; 4 ΕΡ 1 156 827 /PT e (B) bissulfito no fabrico de um medicamento para administração em terapia de radiação de tumores humanos associados a hipermetilação seleccionados do grupo que consiste em tumores humanos da mama, pulmão, cérebro, fígado, rim, ovário, testículo, pâncreas, tracto gastrointestinal, cabeça e pescoço, nasofaringe, pele, próstata e região orofacial, e onde o agente de tratamento de tumores é para administração antes da exposição do indivíduo a uma quantidade de radiação eficaz para tratamento de tumores.

Ainda noutro aspecto, o presente invento refere-se à utilização de um agente de hipometilação de genes compreendendo: (a) 5-cloro-2'-desoxicitidina e um inibidor da citidina-desaminase (b) 5-cloro-2'-desoxicitidina e 4-N-metilamino-FdC, ou (c) 5-cloro-2'-desoxicitidina, 4-N-metilamino-FdC e um inibidor da citidina-desaminase; no fabrico de um medicamento para administração em terapia de radiação de um tumor humano resultante de pelo menos um gene hipermetilado seleccionado do grupo que consiste em tumores humanos da mama, pulmão, cérebro, fígado, rim, ovário, testículo, pâncreas, tracto gastrointestinal, cabeça e pescoço, nasofaringe, pele, próstata e região orofacial, numa quantidade eficaz para hipometilar o referido pelo menos um gene hipermetilado, e onde o agente de hipometilação de genes é para administração antes da exposição do indivíduo a uma quantidade de radiação eficaz para tratamento de tumores.

Ainda noutro aspecto, o presente invento refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo 5-cloro-2'- desoxicitidina e 4-N-metilamino-FdC.

No presente invento, a CldC pode ser administrada a uma dose constante durante o curso de um período de tratamento (o esquema de dose constante de CldC), administrada com um aumento gradual da dose ao longo do tempo (o esquema de 5 ΕΡ 1 156 827 /PT aumento gradual da dose de CldC), ou administrada com uma dose alta de ataque seguido por uma dose menor de manutenção (o esquema de dose de ataque de CldC). 0 teste seguinte com o esquema de aumento gradual da dose de CldC demonstra que a co-administração de Cytochlor e tetra-hidrouridina proporciona uma radiossensibilização clinicamente significativa (maior do que um reforço de dose de 3 a 4 vezes sem toxicidade). No teste, ratinhos nus tendo um tumor composto de células de tumor humano da próstata (PC-3) foram sujeitos a um curso de tratamento de 8 semanas. Co-administrou-se CldC e H4U ao ratinhos nas semanas 1-4 e 8 não havendo administração de CldC e H4U nas semanas 5-7 (as semanas de repouso). No teste, empregou-se um esquema de aumento gradual de dose de CldC, no qual a dose de CldC foi aumentada 10% em cada uma das semanas 2-4, com a mesma dose de CldC sendo administrada na semana 8 e na semana 4, mas a dose de H4U foi mantida constante nas semanas 1-4 e 8. Deu-se uma dose de radiação de 3,5 Gy aos ratinhos no fim da tarde de quarta-feira, quinta-feira e sexta-feira de cada semana. A dose total de radiação foi de 52,5 Gy administrada em 15 fracções. 0 aumento gradual da dose de CldC co-administrada somente com H4U resultou em 3/5 curas de um tumor humano da próstata irradiado (PC-3) em ratinhos nus, enquanto que houve 2/6 curas com o Protocolo Standard utilizando CldC e todos os três biomoduladores. Não houve curas com as drogas sozinhas (0/4), ou com radiação sozinha (0/5).

Para além do esquema de aumento gradual da dose de CldC descrito atrás, pode utilizar-se o esquema de ataque de CldC. No esquema de ataque de CldC, o tratamento começa inicialmente com doses de ataque de CldC seguido por doses de manutenção de CldC. Comparado com o esquema de aumento de dose de CldC, o esquema de ataque de CldC pode atingir uma frequência de curas ainda mais alta. A administração de CldC a doses de ataque relativamente altas não resultou num aumento de perda de peso dos indivíduos testados, de modo que CldC dado a doses de ataque não tem efeitos colaterais. Um estudo recente de inibição de tumores utilizando o tumor humano da próstata PC-3 revelou que a administração de doses elevadas de ataque de CldC seguida por uma dose menor de manutenção de CldC, em que uma dose constante de H4U foi co-administrada com CldC, 6 ΕΡ 1 156 827 /PT resultou numa eficácia tremenda que ultrapassou a eficácia obtida com o esquema de aumento de dose de CldC, no qual a dose de CldC foi aumentada 10% em cada semana das semanas 2-4 num tratamento de 8 semanas, com a mesma dose de CldC sendo usada nas semanas 4 e 8, onde a dose de H4U co-administrada com CldC foi mantida constante.

Um estudo de toxicidade com co-administrações de CldC e H4U a ratinhos provou que CldC mais H4U não eram tóxicos a doses extremamente elevadas, bem acima de qualquer dose terapêutica plausível. Estudos intensivos incluindo análises histopatológicas, hematológicas e bioquímicas não evidenciaram toxicidade de CldC mais H4U em ratinhos. Além disso, CldC mais H4U não eram tóxicos para cães ou macacos. Em macacos e ratinhos, o H4U aumentou a semivida da CldC. Este é um indicador muito importante da eficácia de CldC mais H4U no tratamento de doenças, em particular tumores em humanos. Esta constatação mostra que se podem empregar doses altas de ataque seguidas de doses de manutenção para se atingir eficácia terapêutica.

Os agentes do invento incluem: (a) CldC mais tetra-hidrouridina (H4U), (b) CldC mais Zebularina (Zb), (4,5,6) (c) 5-cloro-2'-desoxicitidina (CldC) mais um inibidor da citidina-desaminase, outro para além de H4U e Zb (isto é, um novo inibidor da citidina-desaminase), ou (d) CldC e 4-N-metilamino-FdC ± um inibidor da citidina-desaminase .

Os agentes do presente invento são para ser combinados com radiação no tratamento de tumores. Os agentes também podem ser utilizados com fontes novas ou programas novos de radiação para tratar tumores, incluindo novas categorias de tumores não tratáveis por métodos da arte anterior. Daqui para a frente, a não ser que de outra forma especificado, a frase "A mais B" significa (a) substância A e substância B são administradas a um indivíduo aproximadamente ao mesmo tempo ou (b) substância A e substância B são administradas ao indivíduo separadamente com um curto intervalo de tempo, onde "um curto intervalo de tempo" pode ir desde cerca de 0,1 minutos até cerca de 7

ΕΡ 1 156 827 /PT 60 minutos, preferivelmente desde cerca de 0,5 minutos até cerca de 30 minutos, e mais preferivelmente desde cerca de 0,5 minutos até cerca de 10 minutos. Da mesma maneira, a não ser que de outra maneira especificado, a frase "A ± B" significa que a substância A é administrada com ou sem a substância Be, se a substância A é administrada com a substância B, a substância A e a substância B são administradas ao indivíduo aproximadamente ao mesmo tempo, ou separadamente com um curto intervalo de tempo, onde "um curto intervalo de tempo" é como definido atrás.

Novas categorias de tumores, especialmente tumores humanos, que são exemplos de alvos para os agentes deste invento nomeadamente (a) CldC mais H4U, (b) CldC mais Zb, (c) CldC mais um inibidor da citidina-desaminase, outro para além de H4U e Zb, ou (d) CldC e 4-N-metilamino-FdC ± um inibidor da citidina-desaminase, incluem 1) tumores que não são imunogénicos devido à hipermetilação de um gene que expressa um antigénio de superfície do tumor, 2) tumores que apareceram como resultado da hipermetilação de um gene supressor de tumores, 3) tumores que são metastáticos porque o gene que codifica E-caderina e outras glicoproteínas de adesão está hipermetilado, 4) tumores que progrediram devido à perda de receptores de estrogénio causada pela hipermetilação dos genes dos receptores de estrogénio, 5) tumores que surgiram devido à hipermetilação do gene codificante da glutationa-S-transferase, uma enzima que inactiva radicais livres carcinogénicos, o que, por sua vez dá origem a subclones do tumor que são mais agressivos, metastáticos e resistentes a terapia, 6) tumores que surgiram devido ao silenciamento do gene para a O6 metilguanina-metiltransferase, uma enzima que repara lesões químicas do ADN celular, 7) tumores que originaram como resultado do silenciamento do gene para um inibidor tecidual da metaloproteinase-3, 8) tumores que são instáveis devido à metilação inapropriada de citosina, deste modo criando pontos críticos para mutação resultando em transições C para T, as 8 ΕΡ 1 156 827 /PT quais, por sua vez, dão origem a subclones do tumor que são mais agressivos, metastáticos e resistentes a terapia, e 9) tumores que se encaixam especificamente nas categorias 1 a 8 devido ao aumento da enzima 5-metilcitosina-ADN-transferase, uma enzima encontrada como estando elevada em muitos tumores malignos humanos e que é responsável pela hipermetilação de genes críticos, deste modo silenciando-os.

Uma das concretizações do presente invento é a hipometilação de um gene durante terapia de radiação pela administração de um biomodulador, 4NCH3_amino-5-fluoro-2- desoxicitidina ou 4-N-metilamino-FdC, com uma nova função. 4- N-metilamino-FdC é um inibidor de uma nova enzima alvo: 5- metilcitosina-ADN-transferase. A estrutura deste análogo com uma função nova é apresentada a seguir.

Este análogo, (4-N-metilamino-FdC) , pode servir a função nova não antecipada de agente de hipometilação dirigido a tumores, reactivando genes que estão inactivados pela hipermetilação dos dinucleótidos CG na região promotora (de controlo) do ADN. Embora a 4-N-metilamino-FdC tivesse sido sintetizada juntamente com outros derivados de FdC quando FdC foi primeiro sintetizada em Sloan Kettering em 1961 (7), 4N-metilamino-FdC foi imediatamente abandonada como agente antitumoral. A razão principal para o seu abandono foi a percepção de que não era diferente de 5-fluorouracilo ou de 5-fluorodesoxiuridina no seu modo de acção. Obviamente, a sua utilidade como agente de hipometilação não foi contemplada 9 ΕΡ 1 156 827 /PT porque o conhecimento sobre hipermetilação de genes críticos em tumores é um desenvolvimento recente.

Muitos tumores humanos possuem níveis elevados de desoxicitidina-quinase (dC-quinase), uma enzima envolvida na recuperação de purinas e pirimidinas. Tumores que possuem níveis elevados de dC-quinase e hipermetilação de genes críticos de tumores seriam mais susceptíveis a esta abordagem que utiliza o radiossensibilizador CldC ± o agente de hipometilação, 4-N-metilamino-FdC, ± um inibidor da citidina-desaminase, porque a primeira etapa na activação (anabolismo) destes análogos é a fosforilação por dC-quinase. A 4-N-metilamino-FdC é um substrato moderado para a citidina-desaminase. Quando administrada sem um inibidor da citidina-desaminase tem o potencial para formar os antimetabolitos dirigidos a tumores, 5-fluorouracilo, 5-fluoro-2'-dUMP e 5-fluoro-UMP, e os anabolitos de ADN e ARN dirigidos a tumores em estádio superior, assim como o agente de hipometilação 4-N-metilamino-5-fluoro-dCTP, de uma maneira equilibrada de modo que esta série de derivados ultrapassa a eficácia da FdC quando co-administrada com H4U.

Mais de metade dos genes supressores de tumores que se sabem estar envolvidos em formas herdadas de cancro humano como resultado de mutações da linha germinal estão bem caracterizados como sendo silenciados transcrição em associação com metilação anormal da região promotora. Nestes cancros humanos estão incluídos o gene supressor de tumores que controla o retinoblastoma, um cancro letal que afecta crianças, VHL, um supressor de tumores humanos do rim, e pl6, um supressor de uma variedade de tumores humanos, incluindo glioblastoma e linfoma maligno do cérebro. Estes tumores humanos do cérebro têm eludido o controlo por radiação. A inactivação associada a hipermetilação do supressor de tumores pl5 1NK43 também foi demonstrada no glioblastoma. 0 cancro humano da bexiga também mostra evidência de hipermetilação do gene supressor pl6. De facto, detectou-se metilação anormal de pl6 no plasma e soro de pacientes com cancro do fígado. 60% dos indivíduos com cancro do pulmão de não pequenas células exibia hipermetilação anormal em pelo menos um dos seguintes genes: pl6, o gene supressor de metástase da proteína quinase 10 ΕΡ 1 156 827 /PT 'associada à morte', o gene de desintoxicação, a glutationa-S-transferase, e o gene de reparação do ADN, 06-metilguanina-ADN-metiltransferase. Tecido normal aos pares do pulmão não evidenciou anomalias. 73% das amostras continha ADN metilado anormalmente em amostras correspondentes de soro. MLH-1, quando silenciado por metilação, resulta em instabilidade micro-satélite nos cancros do cólon, gástrico e endometrial. Isto resulta na instabilidade genética do tumor o que leva à progressão do tumor, metástase, agressividade e resistência à terapia. De extrema importância neste invento é que o gene supressor de tumores, MLH-1, codifica a reparação de erros de emparelhamentos no ADN (mismatch repair) . Quando este gene é silenciado, o tumor é resistente ao tratamento com drogas, radiação e radiossensibilização. A hipometilação deste gene pelos materiais deste invento reforçará a radiossensibilização por CldC. BRCA1, um gene supressor do tumor humano da mama, e o gene supressor de Peutz Jegher são silenciados pela actividade elevada da 5-metilcitosina-ADN-transferase em tumores humanos. A perda de expressão do gene dos receptores β do ácido retinóico em tumores da mama e tecidos adjacentes perece ser devida a hipermetilação. A perda de expressão do gene FHIT é frequente no cancro de não pequenas células do pulmão em pacientes que são fumadores crónicos; a hipermetilação parece estar envolvida. O aumento na actividade da 5-metilcitosina-ADN-transferase é um indicador precoce da progressão do tumor humano do pulmão. A inactivação de CACNAIG, um gene do canal de cálcio do tipo T, está anormalmente metilado na sua ilha 5'-CpG em muitos tumores humanos. A expressão de KAI é perdida por hipermetilação na progressão do cancro humano colorrectal. O gene supressor de tumores humanos APC suprime a formação de múltiplos pólipos adenomatosos do cólon e do recto. Constatou-se que estava inactivado por metilação em pacientes cujos pólipos progrediram até cancro colorrectal. De facto, na carcinogénese colorrectal química experimental de ratinhos há ocorrência de regulação anómala da expressão da 5-metilcitosina-ADN-transferase. A metilação do gene supressor de metástase CD44 ocorre no cancro humano da próstata. A metilação na ilha CpG do gene do receptor β endotelial é comum no cancro humano da próstata. No cancro humano do ovário, o gene CPC 3 encontra-se frequentemente silenciado. 11

ΕΡ 1 156 827 /PT A súmula atrás obriga a considerar os méritos de uma combinação de um radiossensibilizador, e.g. CldC, com um agente de hipometilação dirigido a tumores, e.g. 4-N-metilamino-FdC, como uma maneira nova de controlar os muitos tipos de cancro humano.

Muitos tumores de crianças e adultos, tais como o hepatoblastoma e o rabdomiossarcoma, são devidos à perda de impressão. Devido à sua acção de hipometilação, a 4-N-metilamino-FdC tem o potencial de inverter esta perda de impressão.

Outra vantagem inesperada da actividade de hipermetilação dos agentes deste invento é que permite a intervenção de abordagens mais eficazes de reactivação de genes supressores de tumores silenciados. Provou-se que inibidores da histona-desacetilase (tais como tricostatina, fenilbutirato e hexametileno-bisacetamida) não são activos a restaurar a expressão de genes a não ser que a desmetilação da actividade do gene promotor tenha primeiro ocorrido. A desmetilação por CldC mais um inibidor da citidina-desaminase com 4-N-metilamino-FdC ± H4U, ou outro inibidor da citidina-desaminase em combinação com inibidores da histona-desacetilase, abre novos caminhos à terapia do cancro de mamíferos, em particular, humanos.

Está dentro do âmbito do presente invento o tratamento de um tumor por radiação no qual certos genes do tumor são silenciados resultando na formação do tumor ou resultando em 1) um tumor mais agressivo, 2) um tumor metastático, 3) um tumor geneticamente instável o qual dá origem a subclones agressivos do tumor, ou 4) um tumor resistente a fármacos ou tratamento por radiação. A actividade de CldC ou 4-N-metilamino-FdC na activação destes genes por hipometilação pode deste modo restaurar a actividade dos genes que codificam a) enzimas de reparação, b) enzimas de destruição de radicais livres, c) inibidores de angiogénese, d) glicoproteínas que previnem a migração de células tumorais (metástase), e) receptores de células para hormonas ou análogos de hormonas, f) antigénios tumorais de superfície cuja perda resulta na evasão do tumor ao sistema imunitário do paciente. No presente 12

ΕΡ 1 156 827 /PT invento, a hipometilação do ADN do tumor vai restaurar a estabilidade genética através da remoção de pontos críticos de mutação pela inibição da enzima alvo, a 5-metilcitosina-ADN-transferase. 0 presente invento inclui a protecção selectiva do tecido normal, especialmente no controlo do cancro da próstata por radiação. A tecnologia nova do presente invento resulta numa intensificação dramática da dose de radiação de modo que uma dose de 70 Gy será tão eficaz como uma dose de 210 ou 280 Gy contra tumores, em particular tumores humanos, sem haver lesão do tecido subjacente. Alternativamente, o oncologista de radiação pode dar uma dose de radiação muito mais baixa, tal como 23,3 Gy, e obter a destruição de tumores que é normalmente obtida com 70 Gy ou 93 Gy (uma dose perigosamente alta), deste modo prevenindo lesões do tecido normal. O presente invento introduz uma nova maneira de proteger tecido normal durante a irradiação de tumores tais como tumores urogenitais, incluindo tumores da próstata, pela administração de bissulfito com ou sem cisteína precisamente antes do tratamento por radiação.

Breve Descrição dos Desenhos

As Figuras la-e resumem graficamente os resultados que são dados a seguir na forma de tabela. A Fig. la-d apresenta resultados dos estudos de inibição de tumores, enquanto a Fig. le apresenta resultados da perda de peso. O triângulo sólido na Fig. la-e representa o último dia de tratamento. la. O efeito de doses elevadas de 5-iodo-2'-desoxiuridina (testado à sua máxima dose tolerada). lb. Resultados com o Protocolo Standard com CldC, H4U, FdC e PALA. lc. Resultados com doses crescentes de CldC a uma dose constante de H4U como se mostra na Tabela 3. ld. Resultados com raios X apenas. le. Resultados de perda e recuperação de peso. Note-se que as doses crescentes de CldC eram bem toleradas com uma perda de peso não superior à dos raios X apenas. 13

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Descrição Detalhada do Invento I. Simplificação de um Protocolo Complexo

CldC co-administrada com um único inibidor da citidina-desaminase, tal como tetra-hidrouridina (H4U) ou Zebularina (Zb), é, de uma forma surpreendente e inesperada, suficiente para proporcionar radiossensibilização substancial de tumores, incluindo tumores humanos, ao passo que radiossensibilização e selectividade e níveis suficientes de tamanho da reserva (pool-size) de CldU e de incorporação de CldU no ADN do tumor com vários (cinco) tumores de roedores (em todos aqueles estudados) não eram alcançados a não ser que todas as quatro drogas (CldC, H4U, FdC e PALA) fossem administradas (Santos 1990; Greer 1990; Greer 1995). Assim, é inesperada esta simplificação do protocolo de quatro para duas drogas.

Um estudo (8) baseado nos resultados do inventor que foi levado a cabo para expandir a investigação do inventor com CdCl como radiossensibilizador utilizou tumores de roedores (um fibrossarcoma induzido por radiação, RIF-1). Os investigadores demonstraram que CldC ± H4U, em doses equimolares, era bastante inferior a 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU) como radiossensibilizador. Foi necessário empregar doses tóxicas de CldC para se obter uma radiossensibilização insignificativa (uma razão de intensificação de dose de 1,6 com relevância clínica duvidosa, especialmente em vista da toxicidade resultante). O sistema utilizou irradiação in vitro de suspensões de células de tumor de ratinho depois dos ratinhos terem sido perfundidos com CldC ± H4U ou BrdU durante 72 horas. Em contraste, nos estudos do inventor, os tumores são irradiados com doses fraccionadas enquanto crescem nos ratinhos - similar ao tratamento de tumores humanos na clínica.

Estes resultados com tumores de roedores (8) indicando uma intensificação de dose insignificativa combinada com a complexidade do protocolo que requer quatro drogas para se atingir uma intensificação de dose de 3 a 4 vezes com tumores de roedores, levou a que um importante oncologista de radiação concluísse que a tecnologia utilizando CldC não tinha sido submetida a testes clínicos devido a resultados 14 ΕΡ 1 156 827 /PT insignificativos e contraditórios como referido numa publicação do laboratório do oncologista em 1994 (9). As considerações atrás realçam a importância da eficácia da simplificação inovadora do protocolo desenvolvida no presente invento, demonstrada em estudos recentes do inventor com tumores humanos em ratinhos nus em vez de tumores de roedores em ratinhos convencionais, o que permite agora o desenvolvimento da tecnologia para tratar tumores humanos em pacientes com cancro. A Tabela 1 apresenta o esquema geral do programa de administração de drogas que foi seguido no passado com os tumores de roedores e com os tumores humanos antes da constatação inesperada de que dois dos moduladores, N-(fosfonoacetil)-L-aspartato (PALA) e 5-fluoro-2'-desoxicitidina (FdC) (+H4U) , eram dispensáveis. A tabela superior da Tabela 2 inclui o resumo dos resultados de testes com o Protocolo Standard utilizando CldC, H4U, FdC e PALA em 5 tumores humanos implantados em ratinhos nus. Nesta tabela estão incluídos os resultados do teste no qual os protocolos foram modificados. A tabela inferior da Tabela 2 apresenta o resumo dos resultados de um teste que incluiu a utilização de doses crescentes de CldC mais uma dose constante de H4U; PALA e FdC não foram co-administrados. A Tabela 3 indica como a dose de CldC foi aumentada nas semanas I a IV. A dose total de radiação era de 52,5 Gy administrada em 15 fracções de 3,5 Gy. Os tumores foram irradiados ao fim das tardes de quarta-feira, quinta-feira e sexta-feira. Note-se que 3/5 das curas ocorreram com doses crescentes de CldC, enquanto que 2/6 das curas ocorreram com o protocolo completo. Uma análise dos resultados de perda de peso indica que o aumento da dose de CldC para se atingir controlo do tumor não resulta em morbidade ou efeitos colaterais. A perda de peso é igual à obtida com radiação apenas e é totalmente recuperável.

CldC, quando utilizado inicialmente em doses elevadas (doses de ataque seguido de doses de manutenção) ou em doses crescentes ou doses altas constantes, com H4U ou Zb ou outro 15 ΕΡ 1 156 827 /PT inibidor da citidina-desaminase, é um radiossensibilizador eficaz de tumores, especialmente de tumores humanos. Comparado com o protocolo Standard da arte anterior, o novo protocolo é mais simples, tornando deste modo a aplicação clinica de CldC mais viável.

Sem se limitar pelo mecanismo de acção aqui proposto, o presente inventor acredita que a eficácia de CldC é baseada, em parte, nos esperados aumentos de dC-quinase e de dCMP-desaminase em tumores, especialmente tumores humanos. Em contraste com a terapia de genes onde os genes que codificam enzimas são entregues a células alvo por retrovirus, por exemplo, o presente invento é baseado em parte em enzimas que estão intrinsecamente elevadas em tumores humanos; isto é, as enzimas já lá estão. 0 presente invento explora estes aumentos de enzimas (que são importantes para o sucesso do tumor) para obter uma vantagem terapêutica. A eficácia de CldC também está baseada na capacidade de CldC, devida à electronegatividade do átomo de Cl e ao seu raio intermédio de Van der Waals, para ter alguns dos atributos bioquímicos favoráveis da FdC por um lado e de ambos, BrdUMP e IdUMP, e seus anabolitos por outro. 0 presente inventor observa que a) altas doses de CldUMP formado em tumores a partir de CldC não só excederão os níveis competitivos de TTP mas inibirão a sua formação devido à afinidade de CldUMP pela timidilato-sintetase. Um único estudo do laboratório de Santi (10) mostrou que a Ki de CldUMP era superior à de FdUMP mas bastante inferior à de BrdUMP e de IdUMP (as Ki para a inibição da timidilato-sintetase pelas seguintes substâncias são: FdUMP = 0,015, CldUMP = 0,19, BrdUMP =1,4, e IdUMP = 1,6). CldUMP, em contraste com BrdUMP e IdUMP, não é desalogenada pela timidilato-sintetase (11). b) O clorouracilo derivado de CldC em tumores induzirá reparação pela uracilo-N-glicosilase (uma propriedade do uracilo e 5-fluorouracilo). Quando seguido pela endonuclease apurínica/apirimidínica, isto deveria resultar em quebras adicionais da cadeia única de ADN em células tumorais o que deveria evitar a reparação e levar à radiossensibilização. A acumulação de dUMP por inibição da timidilato-sintetase descrita em 'a) ' atrás deveria resultar em quebras adicionais da cadeia de ADN devido à resultante acumulação de uracilo no ADN (12). c) O CldUTP formado selectivamente em tumores a partir de CldC inibirá as reservas competitivas de TTP devido 16

ΕΡ 1 156 827 /PT à inibição da nucleósido-difosfato-redutase (uma propriedade de BrdUTP), a qual é um inibidor selecto daquela enzima. Os desequilíbrios na reserva de nucleótidos causados por esta inibição, tendo em consideração estudos com outros inibidores da redutase, deveriam resultar em apoptose dirigida ao tumor e quebras de cadeia equivalentes à obtida com 20 Gy (13) . d) A CldC no ADN terá capacidade para inibir a 5-metilcitosina-ADN-transferase de uma maneira semelhante àquela pela qual a FdC inibe esta enzima (14-16). A enzima processadora 5-metilcitosina-ADN-metiltransferase, é inibida por um mecanismo similar àquele pelo qual FdUMP inibe a timidilato-sintetase (16) . Ambas as enzimas encontram normalmente um hidrogénio na posição 5 em vez de um halogéneo electronegativo, o qual elas devem extrair para substituir com um grupo metilo. Ambas as enzimas são inibidas covalentemente porque não podem extrair o grupo electronegativo de cloro ou flúor. O presente inventor deseja realçar que um aspecto importante do CldUMP formado a partir de CldC é que o CldUMP pode inibir a timidilato-sintetase (TS), uma fonte importante do metabolito normal TTP (o qual compete com C1DUTP para incorporação no ADN). Por isso, CldC em concentrações elevadas não excederá as reservas celulares de TTP, mas inibirá a sua formação. Isto poderá explicar a omissão de FdC e PALA nos métodos de tratamento do presente invento sem haver perda de eficácia de CldC mais H4U. FdC e PALA no Protocolo Standard funcionam principalmente pelo abaixamento das reservas de TTP. II. Fontes Novas de Radiação A tecnologia do presente invento é aplicável a fontes de radiação usadas na arte anterior e também a novas fontes de radiação. A. Protões

Para tumores profundos, os métodos do presente invento podem utilizar protões como fonte de radiação. Na terapia de tumores por radiação, os protões como fonte de radiação podem ser combinados com (a) CldC mais H4U, (b) CldC mais Zb, (c) CldC mais um inibidor da citidina-desaminase, outro para além 17

ΕΡ 1 156 827 /PT de H4U ou Zb, ou (d) CldC e 4-N-metilamino-FdC ± um inibidor da citidina-desaminase. A não ser que de outro modo especificado, através do pedido de patente todo, a frase "administração de CldC e 4-N-metilamino-FdC ± um inibidor da citidina-desaminase" significa que (A) CldC mais um inibidor da citidina-desaminase mais 4-N-metilamino-FdC são administrados, (B) CldC mais um primeiro inibidor da citidina-desaminase são administrados separadamente de 4-N-metilamino-FdC ± um segundo inibidor da citidina-desaminase, (C) CldC é administrada separadamente de 4-N-metilamino-FdC ± um inibidor da citidina-desaminase, ou (D) CldC é administrada separadamente de 4-N-metilamino-FdC, onde o primeiro e segundo inibidores da citidina-desaminase podem ser os mesmos ou diferentes. B. Braquiterapia

Devido à sensibilização por Cytochlor (CldC) para taxas baixas de dose de radiação, uma fonte de radiação tal como ítrio-90 ou agulhas de iridio, implantada próximo do tumor, e.g. tumor da próstata ou da mama, pode ser combinada com (a) CldC mais H4U; (b) CldC mais Zb; (c) CldC mais um inibidor da citidina-desaminase, outro para além de H4U ou Zb; ou (d) CldC e 4-N-metilamino-FdC ± um inibidor da citidina-desaminase, na terapia de tumores por radiação para se obter respostas excelentes que não são obteníveis por um feixe de radiação externo. C. Anticorpos Monoclonais Ligados a Radionuclídeos (ítrio-90, por exemplo).

Devido à sensibilização por Cytochlor para taxas baixas de radiação, na terapia de tumores por radiação, um indivíduo pode receber um tratamento sistémico de (a) CldC e H4U; (b) CldC e Zebularina; (c) CldC mais um inibidor da citidina-desaminase outro além de H4U ou Zebularina; ou (d) CldC e 4-N-metilamino-FdC ± um inibidor da citidina-desaminase, onde o tratamento sistémico é acoplado com a administração ao indivíduo de anticorpos monoclonais ligados a um radionuclídeo. Isto adiciona uma dimensão inteiramente nova à tecnologia devido ao facto de permitir tratamento de uma 18 ΕΡ 1 156 827 /PT doença metastática. 0 anticorpo monoclonal procurará os ninhos de focos metastáticos e erradicá-los-á depois deles terem migrado do sitio original. Não é necessário que o anticorpo monoclonal (mAb) esteja ligado ao radionuclideo, e.g. ítrio-90, para interagir com todas as células do clone metastático devido ao efeito circunstante; isto é, as células próximas à célula que atraiu o mAb serão de qualquer modo um alvo para a emissão β. 0 corrente invento torna viável o tratamento da metástase do cancro.

As duas desvantagens desta 'abordagem teórica' são: a) o sinal enviado pela célula tumoral é muito fraco, i.e., a maioria dos tumores esconde os seus únicos antigénios de superfície, b) o alvo não é suficientemente sensível ao 'míssil inteligente'. 0 presente invento responde a estes dois problemas através de a) acção de hipometilação de CldC quando esta é incorporada como tal no ADN ou de 4-N-metilamino-FdC o que leva à expressão de antigénios tumorais de superfície que pode servir como um sinal para atrair selectivamente o mAb conjugado a ítrio-90 e b) por um efeito de radiossensibilização de CldC. A erradicação da doença metastática em locais desconhecidos é o aspecto mais crítico e inovador deste invento. D. Radiocirurgia Gamma Knife A utilização de múltiplas fontes de radiação todas focadas numa região muito pequena de um tumor sólido, e.g. um tumor no cérebro, é uma abordagem que melhorou a perspectiva de controlo de um tumor sólido, tal como o glioblastoma e outros tumores do cérebro. Porém, existe necessidade para uma destruição dirigida a tumores mais eficaz. Os tumores humanos do cérebro têm níveis de dCMP-desaminase 125 a 130 vezes mais elevados do que o córtex do cérebro em volta. A dCMP-desaminase é a enzima responsável pela conversão da prodroga CldC ao radiossensibilizador CldUTP. A combinação de CldC e de radiação gama da Gamma Knife proporciona um potencial enorme para curas de tumores sólidos, especialmente tumores do cérebro. 19

ΕΡ 1 156 827 /PT

Um paciente pode receber, oralmente ou por infusão intravenosa, os agentes do presente invento, i.e. (a) CldC e H4U; (b) CldC e Zebularina; (c) CldC e um inibidor da citidina-desaminase, outro para além de H4U ou Zebularina; ou (d) CldC e 4-N-metilamino-FdC ± um inibidor da citidina-desaminase, e pode também receber 3 a 4 tratamentos com a Gamma Knife. A infusão dos agentes pela artéria carótida ou por uma veia com uma bomba portátil uma semana antes de tratamento com Gamma Knife, e durante uma semana de tratamento com Gamma Knife, seria um método de escolha no caso de não se obter resultados por administração oral. E. Radiação Ortomórfica 3-Dimensional A utilização de vários ângulos diferentes em vez de um plano de radiação permite o espalhamento da radiação a diversas áreas dos tecidos normais diminuindo-se assim a danificação do tecido normal. Para além desta abordagem 3D, a fonte de radiação pode ser modificada por um colimador multifolhas para se obter radiação conforme a forma do tumor, onde a forma do tumor é primeiro determinada por tomografia computorizada. A utilização dos agentes do presente invento, i.e. (a) CldC e H4U; (b) CldC e Zebularina; (c) CldC mais um inibidor da citidina-desaminase, outro para além de H4U ou Zebularina; ou (d) CldC e 4-N-metilamino-FdC ± um inibidor da citidina-desaminase, em combinação com Terapia Ortomórfica por Radiação 3D tem o potencial de proporcionar curas de tumores que de outro modo não seriam possíveis. Esta combinação pode decrescer significativamente o sangramento rectal, incontinência e impotência no controlo do cancro da próstata, ou abrandar o grau de avanço do tumor da próstata, metástase e agressividade do tumor. F. Radiocirurgia Estereotáctica

Os agentes do presente invento, i.e. (a) CldC e H4U; (b) CldC e Zebularina; (c) CldC mais um inibidor da citidina-desaminase, outro para além de H4U ou Zebularina; ou (d) CldC e 4-N-metilamino-FdC ± um inibidor da citidina-desaminase, podem também ser combinados com radiocirurgia estereotáctica para aumentar a eficácia da terapia de radiação. Isto envolve a utilização de um quadro estereotáctico e é normalmente 20 ΕΡ 1 156 827 /PT empregue para tratar tumores do cérebro. Porém, a radiocirurgia estereotáctica pode ser adaptada para tratar tecidos tumorais, outros para além do cérebro. III. Novos Métodos de Entrega A. Libertação Intratumoral Lenta e Sustida de CldC e Moduladores.

Polímeros tais como ácido bis(p-carboxifenoxi)propano-sebácico e outros agentes tais como suspensões de lecitina podem ser empregues para se obter libertação intratumoral sustida de CldC e um inibidor da citidina-desaminase, e.g. H4U, com ou sem 4-N-metilamino-FdC. Também se podem empregar outras formulações sustidas de libertação lenta conhecidas na arte. B. Perfusão do Tumor com CldC e Moduladores. IV. Novos Inibidores da Desaminase

Para além de tetra-hidrouridina (H4U) e Zebularina (1-β-ribofuranocil-1,2-di-hidropirimidin-2-ona), i.e. Zb, no presente invento contempla-se o emprego de outros inibidores da desaminase para aumentar a eficácia de CldC e/ou FdC como radiossensibilizador e modulador.

Como a tetra-hidrouridina é instável em ácido, não é prático administrar tetra-hidrouridina oralmente a não ser que se utilize uma forma revestida da droga. As outras drogas podem ser administradas oralmente. Obviamente, a administração oral é a via ideal de administração. Como a CldC, FdC e 4-N-metilamino-FdC são prodrogas, CldC, FdC e 4-N-metilamino-FdC podem ser administradas oralmente, em que a via entérica é uma via desejável de administração.

Os inibidores da citidina-desaminase, outros para além da tetra-hidrouridina e da Zebularina, podem incluir o seguinte: A. Nucleósidos de pirimidin-2-ona, tais como nucleósidos de 5-F-pirimidin-2-ona (4, 5, 6), outros para além de 1-β- ribofuranocil-1,2-di-hidropirimidin-2-ona. B. Nucleósidos de F-pirimidin-2-ona. 21

ΕΡ 1 156 827 /PT C. Diazepin-2-l-nucleósidos.

Os diazepin-2-l-nucleósidos actuam de uma maneira semelhante à dos inibidores da adenosina-desaminase, os quais são inibidores potentes. Os diazepin-2-l-nucleósidos são lábeis a ácidos mas muito potentes, sendo 10 vezes mais potentes do que a tetra-hidrouridina. Os diazepin-2-1-nucleósidos resultam numa maior eficácia de CldC e/ou FdC como radiossensibilizador e modulador, respectivamente. D. 1-(2-Desoxi-2-fluoro-p-D-arabinofuranosil)-1,2-di-hidropirimidin-2-ona. E. 2'-Desoxi-2'-F-arazebularina. F. Diazoepinona. G. Nucleósido de 4-hidrometil-2-oxopirimidin-2-ona. H. 2'-Fluoro-2'-desoxiarabinosil-tetra-hidrouracilo, o qual é pouco provável de sofrer clivagem da ligação N-glicosidica. V. O presente invento é mais eficaz contra tumores humanos que possuem níveis elevados de 5-metilcitosina-ADN-transferase. Um nivel elevado de 5-metilcitosina-ADN-transferase é uma característica de muitos tumores. A 5-metilcitosina-ADN-transferase é uma enzima alvo nova inibida por (a) FdC mais H4U, (b) 4-N-met ilamino-FdC com ou sem um inibidor, e.g. H4U ou Zb, da citidina-desaminase, ou (c) CldC com ou sem um inibidor, e.g. H4U ou Zb, da citidina-desaminase. A 5-metilcitosina-ADN-transferase é uma enzima mutagénica causadora de cancro que é responsável por metástase, progressão de tumores e resistência a terapia (17,18) . A 5-metilcitosina-ADN-transferase pode ser responsável pela origem do tumor. Os análogos clorados e fluorados de pirimidina inibem esta enzima processadora de um modo irreversível e não estequiométrico. A enzima é inibida apenas na presença de S-adenosilmetionina. O mecanismo de inibição é o seguinte: a enzima normalmente extrai um H da posição 5 da citosina no ADN e adiciona um grupo metilo da S-adenosilmetionina. Quando o CldC, FdC ou 4-N-metilamino-FdC se encontram no ADN, a enzima não pode extrair o cloro ou o 22 ΕΡ 1 156 827 /PT flúor electronegativos e fica agarrada e inactiva naquela posição. A enzima processadora não pode atravessar o ADN, interfere com a transcrição e não consegue metilar os dinucleótidos CG a jusante na cadeia filha oposta a GmeC na cadeia progenitora.

Os agentes do presente invento, i.e. (a) CldC + H4U; (b) CldC + Zb; (c) CldC mais um inibidor da citidina-desaminase, outro para além de H4U ou Zb; ou (d) CldC e 4-N-metilamino-FdC ± um inibidor da citidina-desaminase, resultam em hipomet ilação dirigida ao tumor. No passado, FdC + H4U eram adicionados para baixar as reservas competitivas de TTP as quais interferem com a incorporação de CldUTP no ADN do tumor. Quando a 4-N-metilamino-FdC é co-administrada com um inibidor da citidina-desaminase não baixa as reservas de TTP, mas, em vez disso, serve unicamente como um agente de hipometilação dirigido ao tumor. CldC em doses elevadas actuará de forma semelhante a FdC, como um agente de hipometilação, e ao mesmo tempo actuará como um radiossensibilizador e inibirá a redutase (tal como BrdU e IdU) e a timidilato-sintetase, uma enzima alvo na quimioterapia do cancro (tal como FdU ou 5-fluorouracilo). 0 que é surpreendente e inesperado no presente invento é que CldC é uma droga multifacetada tal como 5-bromo-2'-desoxiuridina ou 5-iodo-2'-desoxiuridina em alguns aspectos, e tal como 5-fluoro-2'-desoxiuridina ou FdC noutros aspectos. VI. Um dos aspectos do presente invento utiliza um análogo de nucleósido, 4-N-metilamino-5-fluoro-2'-desoxicitidina (4-N-metilamino-FdC), com uma função nova não antecipada. A estrutura da nova droga, 4-N-metilamino-FdC, está apresentada atrás. A 4-N-metilamino-FdC não requer certamente a co-administração de um inibidor da citidina-desaminase. É apenas um substrato moderado da citidina-desaminase. Quando co-administrada com H4U, a 4-N-metilamino-FdC actuará apenas como um agente de hipometilação sem gerar FdUMP, FUMP, FUra, FdU ou FUTP ou FdUTP. Não irá interferir com o processamento do ARN e não originará inibidores da timidilato-sintetase como é o caso de 5-fluorouracilo (FUra), 5-fluorodesoxiuridina (FdU) ou 5-fluorodesoxicitidina (FdC). 23

ΕΡ 1 156 827 /PT VII. Os agentes do presente invento, e.g. (a) CldC mais H4U, (b) CldC mais Zebularina, (c) CldC mais um inibidor da citidina-desaminase, outro para além de H4U ou Zb; ou (d) CldC e 4-N-metilamino-FdC ± um inibidor da citidina-desaminase, quando combinados com radiação são especialmente eficazes contra tumores, tais como tumores humanos, os quais não são imunogénicos porque não expressam antigénios tumorais de superfície, e.g. HLA. 0 presente invento é especialmente eficaz contra tumores que escondem os antigénios tumorais de superfície ou antigénios HLA, i.e. tumores não imunogénicos.

Estes tumores não imunogénicos silenciam por hipermetilação os genes que formam antigénios. Os agentes do presente invento, i.e. (a) CldC mais H4U, (b) CldC mais Zebularina, (c) CldC mais um inibidor da citidina-desaminase, outro para além de H4U ou Zb; ou (d) CldC e 4-N-metilamino-FdC ± um inibidor da citidina-desaminase, resultam na expressão de antigénios tumorais de superfície (HLA). Isto permite que o paciente prepare uma resposta imunitária contra o tumor e assegure a eficácia de utilização dos anticorpos monoclonais ligados aos radionuclídeos contra os focos metastáticos do tumor. Os agentes do presente invento têm um efeito notável contra tumores que 'escondem' os seus antigénios únicos (e muitos tumores de sucesso escondem os seus antigénios) resultando numa eficácia maior. Isto é consistente com o objectivo da radioterapia que é diminuir a carga tumoral de modo a que o sistema imunitário do paciente possa controlar as células sobreviventes que restam. VIII. Os agentes do presente invento, e.g. (a) CldC mais H4U, (b) CldC mais Zebularina, (c) CldC mais um inibidor da citidina-desaminase, outro para além de H4U ou Zb; ou (d) CldC e 4-N-metilamino-FdC ± um inibidor da citidina-desaminase, quando combinados com radiação são especialmente eficazes contra tumores, e.g. tumores humanos, que apareceram como resultado da inactivação de um gene supressor de tumores.

Os agentes do presente invento são especialmente eficazes contra tumores que surgem como resultado do silenciamento (hipermetilação) de genes supressores de tumores. Como muitos tumores aparecem como resultado da inactivação de um gene supressor de tumores - não por mutação ou deleção mas por 24 ΕΡ 1 156 827 /PT metilação que resulta no silenciamento dos genes - os agentes do presente invento, i.e. (a) CldC mais H4U, (b) CldC mais Zebularina, (c) CldC mais um inibidor da citidina-desaminase, outro para além de H4U ou Zb; ou (d) CldC e 4-N-metilamino-FdC ± um inibidor da citidina-desaminase, desempenham um papel na re-expressão do gene supressor de tumores inactivo o que resultará depois na cura de tumores. IX. Os agentes do presente invento, e.g. (a) CldC mais H4U, (b) CldC mais Zebularina, (c) CldC mais um inibidor da citidina-desaminase, outro para além de H4U ou Zb; ou (d) CldC e 4-N-metilamino-FdC ± um inibidor da citidina-desaminase, quando combinados com radiação são especialmente eficazes contra tumores de caderina os quais dão origem a subclones metastáticos devido ao silenciamento do gene da caderina.

Isto ocorre frequentemente nos tumores da mama e da próstata e no carcinoma nas células escamosas do pulmão, por exemplo.

Frequentemente, os tumores humanos tornam-se metastáticos como resultado da inactivação do gene que codifica a caderina, uma glicoproteina aderente que previne a migração de células para locais distantes. Este gene é frequentemente inactivado não por mutação ou deleção mas por metilação, o que resulta no silenciamento de genes. A maioria dos tumores metastáticos da mama são de caderina, i.e. não possuem a expressão do gene cad. X. Os agentes do presente invento, e.g. (a) CldC mais H4U, (b) CldC mais Zebularina, (c) CldC mais um inibidor da citidina-desaminase, outro para além de H4U ou Zb; ou (d) CldC e 4-N-metilamino-FdC ± um inibidor da citidina-desaminase, quando combinados com radiação são especialmente eficazes contra tumores que não podem ser tratados com análogos de estrogénio e androgénio porque os receptores de hormonas estão ausentes.

Os tumores humanos da mama e da próstata podem ser controlados por análogos de hormonas quando os seus receptores de hormonas estão intactos. Por exemplo, aproximadamente 40% dos tumores da mama são negativos para o receptor de estrogénio (ER) e por isso não podem ser tratados com 25 ΕΡ 1 156 827 /PT tamoxifeno. Mostrou-se que na grande maioria dos casos, o gene do ER está inactivado não por mutação ou deleção mas por metilação da citosina. XI. Os agentes do presente invento, e.g. (a) CldC mais H4U, (b) CldC mais Zebularina, (c) CldC mais um inibidor da citidina-desaminase, outro para além de H4U ou Zb; ou (d) CldC e 4-N-metilamino-FdC ± um inibidor da citidina-desaminase, quando combinados com radiação são especialmente eficazes contra tumores que possuem níveis baixos de glutationa-S-transferase. A glutationa-S-transferase é uma enzima antioxidante e o seu silenciamento pode dar origem ao tumores. 0 seu silenciamento pode levar a subclones do tumor que são mais agressivos, metastáticos, e resistentes a terapia. XII. Os agentes do presente invento, e.g. (a) CldC mais H4U, (b) CldC mais Zebularina, (c) CldC mais um inibidor da citidina-desaminase, outro para além de H4U ou Zb; ou (d) CldC e 4-N-metilamino-FdC ± um inibidor da citidina-desaminase, quando combinados com radiação são especialmente eficazes contra tumores que têm níveis baixos de O6 metilguanina-metiltransferase. A O6 metilguanina-metiltransferase é uma enzima de reparação que repara purinas alquiladas. 0 seu silenciamento pode levar a subclones do tumor que são mais agressivos, resistentes a terapia e metastáticos. XIII. Os agentes do presente invento, e.g. (a) CldC mais H4U, (b) CldC mais Zebularina, (c) CldC mais um inibidor da citidina-desaminase, outro para além de H4U ou Zb; ou (d) CldC e 4-N-metilamino-FdC ± um inibidor da citidina-desaminase, quando combinados com radiação são especialmente eficazes contra tumores que têm níveis baixos do inibidor tecidual da metaloproteinase-3. 0 inibidor de tecidos da metaloproteinase-3 (TIMP-3) pode suprimir o crescimento de tumores, angiogénese, invasão e metástase em muitos tumores humanos. XIV. Os agentes do presente invento, e.g. (a) CldC mais H4U, (b) CldC mais Zebularina, (c) CldC mais um inibidor da citidina-desaminase, outro para além de H4U ou Zb; ou (d) CldC e 4-N-metilamino-FdC ± um inibidor da citidina-desaminase, combinados com radiação são especialmente eficazes contra 26 ΕΡ 1 156 827 /PT tumores que surgiram devido à mutação do gene supressor de tumores p53. Os análogos mudam um tumor humano instável para um tumor mais geneticamente estável.

Muitos tumores humanos são geneticamente instáveis e dão origem a subclones metastáticos, mais agressivos que podem também ser resistentes a terapia. A razão para isto é que houve metilação inapropriada da citosina pela 5-metilcitosina-ADN-transferase. Quando meC é desaminado espontaneamente ou pela enzima tumorigénica 5-metilcitosina-ADN-transferase, resulta em mutação (uma transição C para T). Tumores tais como os da glândula da próstata progridem para uma tumorigénese maior através da acumulação de mutações no gene supressor de tumores p53. Com o gene supressor de tumores, p53, as transições C para T ocorrem frequentemente em tumores humanos do pulmão (46%), cólon (79%), bexiga (47%) ovário (36%), cérebro (75%) e mama (40%) . Estas transições são devidas à acção da 5-metilcitosina-ADN-transferase a qual não só metila a C nos dinucleót idos CG, como também desamina meCG para formar pares de bases TG e, além disso, impede a enzima de reparação de erros de emparelhamento de reparar erros de emparelhamento TG (TA e CG são pares de bases normais que emparelham). De uma maneira notável, a 5-metilcitosina-ADN-transferase também metila o uracilo no ADN que é gerado pela desaminação espontânea da citosina ou pela acção da 5-metilcitosina-ADN-transferase (17). Esta forma um par de bases TG e deste modo previne indirectamente a remoção de uracilo do ADN, o qual normalmente seria removido do ADN por uma cascata de reparação começando com uracilo-N-glicosidase. A 5-metilcitosina-ADN-transferase também inibe directamente a uracilo-N-glicosidase.

Assim, a metiltransferase é uma enzima mutagénica e tumorigénica (18) que se encontra aumentada em muitos tumores humanos (19, 20). A 5-metilcitosina-ADN-transferase é o alvo dos análogos de desoxicitidina deste invento. Por isso, a acção dos análogos de desoxicitidina na 5-metilcitosina-ADN-transferase em combinação com radiossensibilização torna o método de utilização de CldC do presente invento numa abordagem potente de controlo do cancro humano. A inactivação de p53 é de maior importância considerando que tumores e 27 ΕΡ 1 156 827 /PT linhas celulares tumorais não possuem p53 são resistentes a radiação. meC é um 'ponto critico' de mutação e os agentes do presente invento, i.e. (a) CldC mais H4U, (b) CldC mais Zebularina, (c) CldC mais um inibidor da citidina-desaminase, outro para além de H4U ou Zb; ou (d) CldC e 4-N-metilamino-FdC ± um inibidor da citidina-desaminase, podem remover estes pontos críticos através de hipometilação.

Os itens VII—IX têm como base o aumento da 5-metilcitosina-ADN-transferase em tumores humanos e a capacidade dos agentes do presente invento, i.e. (a) CldC mais H4U, (b) CldC mais Zebularina, (c) CldC mais um inibidor da citidina-desaminase, outro para além de H4U ou Zb; ou (d) CldC e 4-N-metilamino-FdC ± um inibidor da citidina-desaminase, para hipometilar genes que foram silenciados por hipermetilação.

CldC tem a vantagem de ser tanto um radiossensibilizador como um agente de hipometilação. A 4-N-metilamino-FdC não é um radiossensibilizador, mas quando co-administrada com H4U ou outro inibidor da citidina-desaminase, é um agente de hipometilação mais potente. Ao ser administrada sem um inibidor da citidina-desaminase, a 4-N-metilamino-FdC ainda não é um radiossensibilizador e continua como um agente de hipometilação, mas gera também uma série de antimetabolitos que inibem as enzimas tumorais envolvidas no metabolismo do ADN e ARN. mais assegurara A importância e novidade desta abordagem é que assegura uma cura mais moderada de tumores sem haver lesão do tecido subjacente. Em vez de se usar uma dose elevada de radiação que poderia afectar o tecido normal (apesar da selectividade elevada do radiossensibilizador deste invento), o presente invento envolve uma estratégia ou abordagem independente em relação às células remanescentes do tumor que escaparam os efeitos letais da radiação. A CldC em si e os análogos de nucleósidos tornam a CldC num radiossensibilizador mais eficaz porque desempenham o papel duplo de afectar a expressão de genes em células sobreviventes do tumor devido à sua inibição da 5-metilcitosina-ADN-transferase. Isto 28 ΕΡ 1 156 827 /PT eficazmente o controlo completo do tumor, ou pelo menos prevenirá a progressão de tumores e a metástase, por A) restauração das células tumorais a um estado normal pela reactivação dos genes supressores de tumores e B) restauração da estabilidade genética das células sobreviventes através de 1) reactivação da transcrição dos genes codificados pelo ARNm cujos produtos de proteína previnem a modificação adicional do ADN (alterações adicionais no ADN poderiam levar a progressão adicional para neoplasia), 2) reactivação da expressão de enzimas que reparam alterações no ADN das células sobreviventes, ou, mais directamente, 3) prevenção da herança epigenética por metilação de manutenção de pontos críticos de mutação no ADN das células sobreviventes. XV. 0 presente invento permite um tratamento no qual o tumor é irradiado antes de tratamento com drogas para induzir uma actividade maior da desoxicitidina-quinase (dCK) nas células alvo. A desoxicitidina-quinase converte inicialmente CldC, FdC e 4-N-metilamino-FdC aos seus anabolitos, CldCMP, FdCMP, e 4-N-metilamino-FdCMP, respectivamente. A radiação também activa a timidina-quinase (TK) o que aumenta a conversão de CldU e FdU derivados de CldC e FdC, em metabolitos superiores. dCMP-desaminase

e· CldTJMP

7K+ATP

CldCMP Λ

dCK+ATP

CldC

-;-> CldU

Citidina-desaminase XVI. No caso do cancro humano da próstata, a tecnologia utiliza um supositório de libertação lenta de uma dose baixa de bissulfito para proteger o recto através da inactivação de 5-CldC e conversão a desoxiuridina (um metabolito seguro normal e um antagonista de toxicidade e radiossensibilização). Isto protegerá o recto dos efeitos da radiação sem diminuir a radiossensibilidade do tumor da próstata. 0 bissulfito desamina e desalogena a CldC como um precursor para o ADN e desalogenará CldU ao ser incorporado no ADN do tecido rectal. 0 tecido genital não tumoral em volta também pode ser 29 ΕΡ 1 156 827 /PT protegido pela administração localizada controlada de bissulfito, um neutralizador de radicais livres. 0 paciente será administrado com um supositório rectal de libertação lenta de uma dose baixa e segura de bissulfito com ou sem cisteina (outro neutralizador de radicais livres), 1 h antes de irradiação do seu tumor na próstata. 0 paciente será primeiro testado quanto à sua sensibilidade ao bissulfito. Este curso de tratamento não será dado a asmáticos ou pacientes com deficiência de sulfito-oxidase. A sensibilidade ao bissulfito é extremamente rara.

Os agentes do presente invento incluem (a) CldC mais H4U, (b) CldC mais Zebularina, (c) CldC mais um inibidor da citidina-desaminase, outro para além de H4U ou Zb, ou (d) CldC e 4-N-metilamino-FdC ± um inibidor da citidina-desaminase. Para além de H4U ou Zb, também se pode usar 2'-desoxitetra-hidrouridina (dH4U) como inibidor da citidina-desaminase.

Alguns aspectos do invento aproveitam-se das três propriedades de CdCl de ser (1) radiossensibilizador, (2) agente de hipometilação, e (3) inibidor indirecto da formação de um metabolito competitivo. Ao tirar vantagem destas três propriedades de CldC, o presente invento simplifica os regimes de tratamento clinico conhecidos da arte anterior. Por exemplo, os agentes do presente invento podem ser administrados ao indivíduo sem a administração de um inibidor para a formação de um metabolito, i.e. TTP, que vai competir com a incorporação de um metabolito de radiossensibilização, i.e. CldUTP, de CldC em ADN, onde tais inibidores podem ser 5-fluoro-2'-desoxicitidina (FdC), 5-fluoro-2'-desoxiuridina (FdU) ou N-(fosfonacetil)-L-aspartato (PALA).

Os agentes do presente invento são eficazes para tratar tumores, preferivelmente tumores sólidos. Os tumores que podem ser tratados com os agentes do presente invento incluem tumores da mama, pulmão, cérebro, fígado, rim, ovário, útero, testículo, pâncreas, tracto gastrointestinal, cabeça e pescoço, nasofaringe, pele, e próstata, e tumores orofaciais.

No presente invento, CldC pode ser administrada a um indivíduo com sua necessidade a uma dose de cerca de 5 mg por 30 ΕΡ 1 156 827 /PT kg de peso de corpo por dia até cerca de 10 g por kg de peso de corpo por dia. A dose preferida é cerca de 50 mg por kg de peso de corpo por dia até cerca de 6 g por kg de peso de corpo por dia. Os outros agentes, i.e. H4U, Zebularina, outros inibidores da citidina-desaminase para além de H4U ou Zebularina, e 4-N-metilamino-FdC, do presente invento podem ser administrados ao indivíduo a uma dose de desde cerca de 1/50 até cerca de k2, preferivelmente cerca de 1/30 até cerca de 1/10 da dose de CldC.

Os agentes do presente invento podem ser administrados aproximadamente à mesma dose durante o período todo de tratamento, num regime de dose crescente, ou num regime de dose de ataque, no qual a dose de ataque é cerca de 2 a 5 vezes a dose de manutenção. Alternativamente, a dose dos agentes do presente invento pode variar durante o curso de um período de tratamento de acordo com a condição do indivíduo a ser tratado e/ou a severidade da doença a ser tratada conforme considerado apropriado pelo perito na especialidade.

Os agentes do presente invento podem ser administrados uma a quatro vezes por dia. O tratamento com os agentes do presente invento pode ser repetido diariamente ou interrompido temporariamente por um período de até vários dias durante o curso de tratamento do tumor. A irradiação pode ter início após a primeira administração de CldC. Alternativamente, a irradiação pode começar depois de um intervalo de cerca de 4 horas até cerca de 18 horas, preferivelmente de cerca de 6 a 14 horas após a última administração de CldC. A dose de radiação pode ser a mesma ou 1/4 a 3/4 da dose dada a pacientes que não recebem os agentes do presente invento.

As doses dos agentes do presente invento e o intervalo entre administrações, assim como a frequência de administração, podem ser determinados pelo perito na especialidade com base na condição do paciente e severidade da doença a ser tratada. O intervalo entre a terapia com drogas e o tratamento com radiação também pode variar. 31

ΕΡ 1 156 827 /PT

Os agentes do presente invento podem ser administrados parentérica ou entericamente. Porém, de forma a que a tetra-hidrouridina possa ser administrada oralmente deve estar numa formulação que a proteja de ácidos. As vias parentéricas incluem injecção intravenosa, subcutânea, intramuscular ou intraperitoneal, infusão intravenosa ou intra-arterial, ou administração dérmica. 0 tratamento de tumores ou protecção do tecido normal durante a radioterapia de tumores através da administração dos agentes do presente invento por via de formulações de libertação lenta preparadas de acordo com métodos conhecidos na arte, também está dentro do âmbito do invento.

Os agentes do presente invento podem ser administrados com ou sem um transportador farmaceuticamente aceitável numa composição farmacêutica. No âmbito do presente invento está incluída uma composição farmacêutica que compreende CldC e 4-N-metilamino-FdC, com ou sem um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Entre os indivíduos que podem ser tratados com os agentes do presente invento constam animais, tais como mamíferos, e preferivelmente humanos.

Os agentes do presente invento podem ser obtidos comercialmente ou preparados a partir de intermediários que podem ser obtidos comercialmente pelo perito na especialidade. Os processos de preparação da maioria dos agentes do presente invento estão divulgados nas Patentes U.S. Nos. 4 894 364 e 5 985 266.

Outras referências que podem ser de interesse estão também listadas a seguir (21-69).

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Tabela 1. O Protocolo Standard (StP) indicando as doses de bolus i.p. das drogas administradas e o programa de administração de drogas e radiação. Este protocolo foi seguido durante 3 a 5 semanas como indicado na Tabela 2. PALA: N-(fosfonaceril)-L-aspartato; FdC: 3-fluoro-2'-desoxicitidina; CldC: 5-cloro-2'-desoxicitidina; H4U: tetra-hidrouridina.

Tabela do Programa Horas Segunda Terça Quarta Quinta Sexta 9 am PALA FdC+H4U CldC+H4U CldC+H4U (70) * (7) (25) (150) (25) (125) (25) 1 pm FdC + H4U Radiação (7) (25) 3 pm Radiação Radiação 4 pm CldC+H4U (180) (25) 5 pm CldC+H4U (180) (25) * (mg/kg) 41

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Tabela 2 Sumário dos resultados finais obtidos em cinco testes com dois tumores humanos da próstata, um tumor humano do pulmão, um glioblastoma humano e um tumor humano da mama, para três finais diferentes. Os ratinhos foram monitorizados durante um mínimo de 7 meses. Também estão apresentados os resultados de um teste adicional que utilizou 5-iododesoxiuridina e protocolos modificados com PC3, o tumor humano da próstata.

Tumor, Condições de Irradiação Condição N° . de tumores Dias para atingir 4x 0 volume inicial Dias de retardamento do novo crescimento do tumor Fracção de curas No. Gy, Fraccões, Seman. Próstata, PC-3 Controlo 5 14 0 0 47, 11, 4 StP* 6 28 0 0 Raios X 9 72 42 0 StPaRaios X 10 116*/124** 85*/>97** 1/10 Completob, sem PALA 5 104/>142 56/>113 2/5 Próstata, H1579 Controlo 5 13 0 0 47, 11, 4 StP 4 45 2 0 Valores Raios X 8 24/>48 5/>29 1/8 combinados StPGRaios X 7 108/>134 81 / > 115 2/7 •Glioblastoma, Controlo 5 3f 0 0 SF295 StP 5 3f 0 0 44, 8, 3 Raios X 8 17 5 0 StPaRaios X 7 31/>56 21/>51 1/7 •Mama, GI101 Controlo 7 26 0 0 42, 14, 5* StP 8 31 0 0 Raios X 11 83 50 0 StPaRaios X 11 101/>106 70/>30 1/11 Pulmão, H165 Controlo 4 12 0 0 47, 12, 4 StP 3 20 0 0 Raios X 5 58 32 0 StP+Raios X 5 89/>133 72/>123 2/5 Experiência com Protocolos Modificados •Próstata, PC-3 Controlo 4 0 0 52,5, 15, 5§ Raios X 4 17 0 StP"+ RaiosX 6 68/>112 2/6 StP s PALA" 'a-RaiosX 6 29/>86 2/6 StP c IdU" 'b+RaiosX 5 38 0 PALA & FdC" 'c+RaiosX 5 25/>60 1/5 StP c (r) Cldc”'d+RaiosX 5 25/>130 3/5 * StP, Protocolo Standard (CldC, moduladores e programa como na Tabela 1) */** Cálculos excluem curas/cálculos consideram curas como > 200 dias. t Apenas para o controlo e StP do glioblastoma, dias para atingir 2 x o volume inicial. Φ 3 semanas; 1 semana repouso; 2 semanas. § 4 semanas; 3 semanas de repouso; 1 semana. " não houve retardamento no novo crescimento do tumor ou ocorrência de curas com drogas apenas (3 animais/grupo). â StP como na Tabela 1 excepto não PALA nas segundas-feiras. Em vez disso, administrou-se FdC (4 mg/kg) de manhã e ao meio-dia nas segundas-feiras e nas terças-feiras administrou-se 8mg/kg em vez de 7 mg/kg. H4U foi sempre co-administrado com FdC. b StP c IdU, CldC foi substituído por IdU. Dose total de FdC, 2,4 mg/30 g ratinho. c PALA (como em StP) com FdC + H4U administrado como no StP mas, em adição, FdC + H4U foi substituído por todas as administrações de CldC+H4U, as doses de FdC nas semanas 1-5 eram de 27, 32, 32, 37 e 37 mg/kg, isto é, uma dose total de 4,95 mg/30 g de ratinho comparado com 2,1 mg/30 g de ratinho no StP. d StP c(t) CldC, dose de CldC aumentou 9% nas semanas 2-4. Não PALA, não FdC; CldC + H4U administrado como no StP mas, além disso, CldC+H4U foi substituído por todas as administrações de FdC+H4U. (", b, d, as doses totais de CldC, IdU e (|)CldC aumentado eram de 95, 129 e 184 mg/30 g de ratinho, respectivamente.

Tabela 3

CldC + H4U apenas PC3 1998 4 semanas de teste, 3 semanas de repouso, 1 semana de teste H4U 25* sempre co-administrado SEGUNDA TERÇA QUARTA QUINTA Total Semana CldC CldC CldC CldC I AM 150* 225 180 150 PM 150 180 1035 II AM 150 225 225 180 PM 180 200 1160 III AM 150 225 250 200 PM 200 220 1245 IV AM 150 225 275 225 PM 225 250 1350 VIII AM 150 225 275 225 PM 225 250 1350 mg/kg 3,5 Gy em 15 fracções Dose Total: 52,5 Gy

6,140* CldC 184,4 mg/30 g de ratinho

Claims (20)

1. ΕΡ 1 156 827 /PT 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um agente de tratamento de tumores compreendendo: (a) 5-cloro-2'-desoxicitidina e um inibidor da citidina-desaminase, onde o agente não contém 5-fluoro-2'-desoxicitidina (FdC), 5-fluoro-2'-desoxiuridina (FdU) nem N-(fosfonacetil)-L-aspartato (PALA) (b) 5-cloro-2'-desoxicitidina e 4-N-metilamino-FdC, ou (c) 5-cloro-2'-desoxicitidina, 4-N-metilamino-FdC e um inibidor da citidina-desaminase; no fabrico de um medicamento para administração em terapia de radiação de tumores humanos associados a hipermetilação seleccionados do grupo que consiste em tumores humanos da mama, pulmão, cérebro, figado, rim, ovário, testículo, pâncreas, tracto gastrointestinal, cabeça e pescoço, nasofaringe, pele, próstata e região orofacial, e onde o agente de tratamento de tumores é para administração subsequente à exposição do indivíduo a uma quantidade de radiação suficiente para induzir actividade aumentada da desoxicitidina-quinase (dCK) e/ou da timidina-quinase (TK) em células alvo no tumor ou tumores humanos, e onde o referido agente de tratamento de tumores é para administração antes de exposição adicional do indivíduo a uma quantidade de radiação eficaz para tratamento do tumor.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, onde o agente de tratamento de tumores compreende: (a) 5-cloro-2'-desoxicitidina e 4-N-metilamino-FdC, ou (b) 5-cloro-2'desoxicitidina, 4-N-metilamino-FdC e um inibidor da citidina-desaminase; no fabrico de um medicamento para administração em terapia de radiação de tumores humanos associados a hipermetilação seleccionados do grupo que consiste em tumores humanos da mama, pulmão, cérebro, fígado, rim, ovário, útero, testículo, ΕΡ 1 156 827 /PT 2/5 pâncreas, tracto gastrointestinal, cabeça e pescoço, nasofaringe, pele, próstata e região orofacial.
3. 3. Utilização de acordo com as reivindicações 1 ou 2, onde o agente de tratamento de tumores é para administração numa formulação de libertação lenta.
4. 4. Utilização de acordo com as reivindicações 1 ou 2, onde o inibidor da citidina-desaminase é tetra-hidrouridina, desoxitetra-hidrouridina, um nucleósido de pirimidin-2-ona, um nucleósido de F-pirimidin-2-ona, um diazepin-2-l-nucleósido, 1-(2-desoxi-2-fluoro-p-D-arabinofuranosil)-1,2-di-hidropirimi-din-2-ona, 2'-desoxi-2'-F-arazebularina, diazoepinona, nucleósido de 4-hidrometil-2-oxopirimidin-2-ona ou 2'-fluoro-2'-desoxiarabinosiltetra-hidrouracilo.
5. 5. Utilização de acordo com a reivindicação 4, onde o referido nucleósido de pirimidin-2-ona é Ι-β-ribofuranocil-1,2-di-hidropirimidin-2-ona (Zebularina) ou nucleósido de 5-fluoropirimidin-2-ona.
6. 6. Utilização de acordo com a reivindicação 5, onde o inibidor da citidina-desaminase é tetra-hidrouridina ou Zebularina.
7. 7. Utilização de acordo com a reivindicação 6, onde o inibidor da citidina-desaminase é tetra-hidrouridina.
8. 8. Utilização como na reivindicação 1 ou 2, onde a radiação é seleccionada do grupo que consiste em radiação de protões como fonte de radiação, radiação de uma fonte de radiação implantada próxima do tumor humano, radiação de um radionuclideo ligado a anticorpos monoclonais, radiação num Gamma Knife, radiação ortomórfica 3D e radiação em radiocirurgia estereotáctica.
9. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 8, onde a referida fonte de radiação implantada próximo do tumor humano compreende agulhas de ítrio-90 ou agulhas de iridio.
10. 10. Utilização de acordo com a reivindicação 8, onde o referido radionuclideo é ítrio-90. ΕΡ 1 156 827 /PT 3/5
11. 11. Utilização de (A) um agente de tratamento de tumores que compreende: (a) 5-cloro-2'-desoxicitidina e um inibidor da citidina- desaminase, onde o agente não contém 5-fluoro-2'- desoxicitidina (FdC), 5-fluoro-2'-desoxiuridina (FdU) nem N-(fosfonacetil)-L-aspartato (PALA) (b) 5-cloro-2'-desoxicitidina e 4-N-metilamino-FdC, ou (c) 5-cloro-2'-desoxicitidina, 4-N-metilamino-FdC e um inibidor da citidina-desaminase; e (B) bissulfito para o fabrico de um medicamento para administração em terapia de radiação de tumores humanos associados a hipermetilação seleccionados do grupo que consiste em tumores humanos da mama, pulmão, cérebro, figado, rim, ovário, testículo, pâncreas, tracto gastrointestinal, cabeça e pescoço, nasofaringe, pele, próstata e região orofacial, e onde o agente de tratamento de tumores é para administração antes de exposição do indivíduo a uma quantidade de radiação eficaz para tratamento do tumor.
12. 12. Utilização de acordo com a reivindicação 11 e de (C) cisteína antes da exposição do indivíduo a radiação.
13. 13. Utilização de um agente de hipometilação de genes que compreende: (a) 5-cloro-2'-desoxicitidina e um inibidor da citidina-desaminase, (b) 5-cloro-2'-desoxicitidina e 4-N-metilamino-FdC, ou (c) 5-cloro-2'-desoxicitidina, 4-N-metilamino-FdC e um inibidor da citidina-desaminase; para o fabrico de um medicamento para administração em terapia de radiação de um tumor humano resultante de pelo menos um gene hipermetilado seleccionado do grupo que consiste em tumores humanos da mama, pulmão, cérebro, fígado, rim, ovário, útero, testículo, pâncreas, tracto gastrointestinal, cabeça e pescoço, nasofaringe, pele, próstata e região orofacial, numa ΕΡ 1 156 827 /PT 4/5 quantidade eficaz para hipometilar o referido pelo menos um gene hipermetilado, e onde o agente de hipometilação de genes é para administração antes da exposição do indivíduo a uma quantidade de radiação eficaz para tratamento do tumor.
14. 14. Utilização de acordo com a reivindicação 13, onde o inibidor da citidina-desaminase é tetra-hidrouridina, desoxitetra-hidrouridina, um nucleósido de pirimidin-2-ona, um nucleósido de F-pirimidin-2-ona, um diazepin-2-l-nucleósido, 1-(2-desoxi-2-fluoro-p-D-arabinofuranosil)-1,2-di-hidropirimidin-2-ona, 2'-desoxi-2'-F-arazebularina, diazoepinona, nucleósido de 4-hidrometil-2-oxopirimidin-2-ona ou 2'-fluoro-2'-desoxiarabinosil-tetra-hidrouracilo.
15. 15. Utilização de acordo com a reivindicação 14, onde o referido nucleósido de pirimidin-2-ona é Ι-β-ribofuranocil-1,2-di-hidropirimidin-2-ona (Zebularina) ou nucleósido de 5-fluoropirimidin-2-ona.
16. 16. Utilização de acordo com a reivindicação 15, onde o inibidor da citidina-desaminase é tetra-hidrouridina ou Zebularina.
17. 17. Utilização de acordo com a reivindicação 16, onde o inibidor da citidina-desaminase é tetra-hidrouridina.
18. 18. Utilização de acordo com a reivindicação 13, onde o agente de hipometilação de genes hipometila os genes silenciados num tumor humano para reduzir (A) a agressividade do tumor humano, (B) a propensão metastática do tumor humano, (C) a instabilidade genética do tumor humano, e/ou (D) a resistência do tumor humano a tratamento com drogas ou com radiação.
19. 19. Utilização de acordo com a reivindicação 13, onde o referido agente de hipometilação de genes compreende: (c) 5-cloro-2'-desoxicitidina e 4-N-metilamino-FdC, ou (d) 5-cloro-2'-desoxicitidina, 4-N-metilamino-FdC e um inibidor da citidina-desaminase. ΕΡ 1 156 827 /PT 5/5 5-cloro-2'-
20. 20. Composição farmacêutica compreendendo desoxicitidina e 4-N-metilamino-FdC. Lisboa,