WO2016088818A1 - メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ－２阻害薬に対する反応性を予測する方法 - Google Patents

メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ－２阻害薬に対する反応性を予測する方法 Download PDF

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WO2016088818A1
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mthfd2
gldc
inhibitor
cancer
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PCT/JP2015/083954
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有伸 東條
典子 後藤
忠史 土岐
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国立大学法人 東京大学
第一三共株式会社
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to methylenetetrahydrofolate dehydrogenase-2 (methylene-dehydroxylase-2) using a glycine decarboxylase (hereinafter sometimes abbreviated as GLDC) gene or its gene product in a biological sample derived from a subject as an index.
  • dehydrogenase-2 hereinafter abbreviated as MTHFD2
  • MTHFD2 glycine decarboxylase
  • MTHFD2 glycine decarboxylase
  • the present invention relates to a method for predicting reactivity to an inhibitor.
  • the present invention relates to a method for selecting a subject for treatment of a disease with an MTHFD2 inhibitor, and a method for treating a disease comprising administering an MTHFD2 inhibitor to a subject selected by the method.
  • MTHFD2 is one of the isoforms of methylenetetrahydrofolate dehydrogenase, an enzyme involved in folate metabolism, and is present in mitochondria.
  • MTHFD2 is a bifunctional enzyme and catalyzes a NAD + -dependent methylenetetrahydrofolate dehydrogenase reaction and a methenyltetrahydrofolate cyclohydrase reaction in mitochondria.
  • the NAD + -dependent methylenetetrahydrofolate dehydrogenase reaction is a reaction that generates 5,10-methenyltetrahydrofolate (5,10-methenyltetrahydrofolate) using 5,10-methylenetetrahydrofolate as a substrate.
  • the methenyltetrahydrofolate cyclohydrolase reaction is a reaction that produces 10-formyltetrahydrofolate using 5,10-methenyltetrahydrofolate as a substrate.
  • Folic acid is one of the water-soluble vitamin groups, but is not synthesized in vivo and is taken from food. Folic acid absorbed from the intestine is metabolized in vivo, and its metabolite, tetrahydrofolic acid, contributes to nucleic acid synthesis as a coenzyme. Therefore, inhibition of folate metabolism in cancer cells inhibits nucleic acid synthesis and consequently suppresses cell growth. Focusing on this point, folic acid metabolism inhibitors have been developed as anticancer agents.
  • MTHFD2 is an enzyme involved in folic acid metabolism and also related to 1-carbon metabolism in mitochondria, which is a metabolic system that has been reported to be associated with rapid cancer cell growth (Non-patent Document 1). Therefore, it can be considered that rapid cell growth of cancer cells can be suppressed by inhibiting the action of MTHFD2.
  • Non-patent Document 1 MTHFD2 may be a promising target molecule in cancer treatment. Specifically, it was observed that MTHFD2 expression was markedly increased at both mRNA and protein levels in various cancer diseases, and that a correlation between enhanced expression of MTHFD2 and poor prognosis of breast cancer was observed. It was done. On the other hand, MTHFD2 expression was observed in developing embryos, but not in most healthy adult tissues even when it was proliferating. Moreover, when the expression of MTHFD2 was inhibited by RNA interference in cancer cells, the growth of cancer cells and significant cell death were caused. Therefore, a drug that inhibits MTHFD2 is expected as a useful anticancer agent with few side effects.
  • GLDC is one of the molecules constituting the glycine cleavage system localized in mitochondria and is a glycine metabolizing enzyme.
  • Non-patent Document 2 glycine consumption and mitochondrial glycine biosynthetic pathway are strongly associated with the growth rate of cancer cells. Specifically, by antagonizing glycine intake and its biosynthesis in mitochondria, rapidly proliferating cells were preferentially impaired, and furthermore, the high expression of the biosynthetic pathway was caused by breast cancer. It has been shown to be associated with higher patient mortality.
  • Non-patent Document 3 GLDC has been shown to induce dramatic changes in glycolysis and glycine / serine metabolism, thereby causing changes in pyrimidine metabolism and controlling cancer cell growth.
  • a correlation between abnormal activation of GLDC and poor prognosis of lung cancer patients and abnormal expression of GLDC in various types of cancers have been observed.
  • molecular targeted therapeutic drugs have been developed in the therapeutic field of diseases such as cancer diseases, and the idea of selecting a patient who can reliably obtain the effect and administering the drug is becoming established. Therefore, at the time of development of molecular target drugs, it is required to develop a method for evaluating drug effects for the purpose of patient selection and side effect reduction.
  • a drug that inhibits folic acid metabolism inhibits DNA synthesis and DNA methylation in cancer cells, it can be considered to suppress the growth of cancer cells. Therefore, it is expected to develop drugs that inhibit folic acid absorption and metabolism as anticancer agents. When developing such a drug, it is possible to develop a method for evaluating a drug effect for the purpose of predicting the patient's reactivity to the drug, and thus selecting patients who can obtain the effect of the drug and reducing side effects. Desired.
  • An object of the present invention is to provide a method for predicting patient responsiveness to a drug in order to enable effective disease treatment with a drug that inhibits the action of MTHFD2, which is an enzyme involved in folate metabolism, for example, cancer disease treatment, And providing a method for selecting a patient who is predicted to be highly effective by the drug.
  • the present inventors have intensively studied to solve the above problems, and chromosome 9p21 containing a tumor suppressor gene CDKN2A (p16) gene that has been reported to be frequently defective in many types of cancer cells.
  • CDKN2A tumor suppressor gene
  • the present invention has been achieved based on the fact that there is a relationship between the reactivity of cancer cells to MTHFD2 inhibitor and the expression of the GLDC gene.
  • the present invention relates to: 1. Prediction of reactivity to an MTHFD2 inhibitor using a biological sample derived from a subject, and predicting the reactivity to the MTHFD2 inhibitor using the GLDC gene or its gene product contained in the biological sample as an index Method, 2. A reference value in which the expression of the GLDC gene or its gene product contained in the biological sample is measured, the expression of the gene or its gene product is detected, and the expression level of the gene or its gene product is preset. Said lower sample comprises predicting that the sample is from a subject having reactivity to an MTHFD2 inhibitor. the method of, 3. Measurement of GLDC gene expression is performed by quantitative measurement of GLDC mRNA. the method of, 4).
  • Measurement of GLDC gene expression is performed by quantitative measurement of GLDC protein. the method of, 5. Analyzing the genotype of the GLDC gene contained in the biological sample, and predicting that the sample in which a heterozygous deletion of the GLDC gene is detected is a sample derived from a subject having reactivity to an MTHFD2 inhibitor , 1. the method of, 6). 4. Analysis of genotype of GLDC gene is performed by measuring copy number of the gene. the method of, 7). 1 above. -6. A method for selecting a subject for disease treatment with an MTHFD2 inhibitor, comprising selecting a subject predicted to have reactivity to the MTHFD2 inhibitor by any of the methods as a subject for disease treatment with an MTHFD2 inhibitor, 8). 6.
  • the subject is a cancer disease patient and the disease treatment is a cancer disease treatment.
  • a subject who is predicted to be responsive to an MTHFD2 inhibitor by any of the above methods is selected as a target for disease treatment with the MTHFD2 inhibitor, and a therapeutically effective amount of the MTHFD2 inhibitor is administered to the selected patient
  • a disease treatment method comprising: 10. 8.
  • the subject is a cancer disease patient and the disease treatment is a cancer disease treatment. the method of, 11.
  • the present invention relates to an MTHFD2 inhibitor comprising using a biological sample derived from a subject and predicting the reactivity to the MTHFD2 inhibitor using the GLDC gene or its gene product contained in the biological sample as an index.
  • a method for predicting reactivity can be provided.
  • the method according to the present invention makes it possible to predict the therapeutic effect of an MTHFD2 inhibitor in a subject before administering the drug.
  • the method according to the present invention can be performed in vitro using a biological sample derived from a subject, the burden on the subject is small.
  • the method according to the present invention is extremely useful in the therapeutic area of diseases such as cancer diseases.
  • FIG. 1 It is a figure which shows the result of having examined the expression of the GLDC gene in five types of cancer cell lines, A549, MDA-MB-231, BxPC3, NCI-H2347, and NCI-H1975 by the quantitative analysis of GLDC mRNA.
  • shaft of a figure shows the relative expression value (relative GLDC expression) of this mRNA in each cell line with respect to the expression level of GLDC mRNA in A549.
  • GLDC mRNA expression was detected in all examined cancer cell lines, but expression in cells other than A549 was low.
  • Example 1 It is a figure which shows the result of having examined the expression of the GLDC gene in five types of cancer cell lines, A549, MDA-MB-231, BxPC3, NCI-H2347, and NCI-H1975 by the quantitative analysis of GLDC protein.
  • the protein was detected by Western blotting using an anti-GLDC antibody. Arrowheads indicate GLDC protein bands.
  • ⁇ -actin was measured as a loading control in Western blotting.
  • the position of the band of the GLDC protein was confirmed by detecting the disappearance of the band by treating A549 with a short interfering RNA of the GLDC gene (indicated as siGLDC in the figure) to inhibit the expression of the gene.
  • siCtrl means a short interfering RNA of negative control.
  • Example 1 The expression of GLDC gene in one normal cell line HEK293, seven cancer cell lines NCI-H1975, LUDLU-1, BxPC3, MDA-MB-231, NCI-H2347, AsPC-1 and HEC50B, GLDC mRNA It is a figure which shows the result examined by quantitative analysis. Quantitative analysis of GLDC mRNA was performed by polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as PCR) using three types of primer sets (primer set 1, primer set 2, and primer set 3).
  • PCR polymerase chain reaction
  • Primer set 1 is a partial base sequence (GLDC-Cter) on the 3 ′ end side of GLDC mRNA
  • both primer set 2 and primer set 3 are partial base sequences on the 5 ′ end side of GLDC mRNA (each GLDC- It is a primer set for amplifying Nter1 and GLDC-Nter2).
  • shaft of a figure shows the relative expression value (relative mRNA expression) of this mRNA in each cell strain with respect to the expression level of GLDC mRNA in HEK293.
  • Example 1 In three types of cancer cell lines, A549, MDA-MB-231, and NCI-H2347, AsPC-1, and HEC50B from the left side.
  • Example 1 In three types of cancer cell lines, A549, MDA-MB-231, and NCI-H2347, the effect of MTHFD2 gene knockdown on cell growth was observed in the presence of glycine 100 ⁇ M (Gly 100) and in the absence of glycine (Gly 0). It is a figure which shows the result examined in (). MTHFD2 gene knockdown was performed using a short interfering RNA (denoted as siM in the figure) of the MTHFD2 gene.
  • the vertical axis of the figure shows the amount of adenosine triphosphate (hereinafter abbreviated as ATP) indicating the degree of cell proliferation, and the horizontal axis of the figure shows the number of days of culture after reseeding the cells.
  • ATP adenosine triphosphate
  • siC means a short interfering RNA as a negative control.
  • Example 1 It is a figure which shows the result of having measured the expression level of MTHFD2 protein in the cancer cell line which knocked down MTHFD2 gene, A549, MDA-MB-231, and NCI-H2347 by the western blotting method.
  • MTHFD2 gene knockdown was performed using a short interfering RNA of the MTHFD2 gene (indicated as siMTHFD2 in the figure).
  • MTHFD2 protein was detected using an anti-MTHFD2 antibody
  • GLDC protein was detected using an anti-GLDC antibody.
  • ⁇ -actin was measured as a loading control in Western blotting.
  • “1” indicates cells that were not treated with the short interfering RNA
  • “2”, “3”, “4”, and “5” are the negative control short interfering RNA, 2 nM siMTHFD2, respectively. Shown are cells treated with 5 nM siMTHFD2 and 10 nM siMTHFD2.
  • Example 1 In cancer cell lines A549 and MDA-MB-231, the effect of MTHFD2 gene knockdown on cell proliferation was examined in the presence of glycine 100 ⁇ M (Gly (100)) and in the absence of glycine (Gly (0)).
  • FIG. MTHFD2 gene knockdown was performed using a short interfering RNA of the MTHFD2 gene (indicated as siMTHFD2 in the figure).
  • the vertical axis of the figure shows the ratio of cell proliferation to the number of cells on the day of reseeding (Growth (fold vs day0)), and the horizontal axis of the figure shows the number of days of culture after reseeding cells.
  • siRNA TF siRNA transfection
  • the vertical axis of the figure shows the ratio of cell proliferation to the number of cells on the day of reseeding (Growth (fold vs day0)), and the horizontal axis of the figure shows the number of days of culture after reseeding cells.
  • siCtrl indicates that the negative control short interfering RNA was not treated
  • no RNA indicates that the short interfering RNA was not treated.
  • x indicates the day of siRNA transfection (siRNA TF).
  • Example 1 It is a figure which shows the result of having measured the expression level of MTHFD2 protein in the cancer cell line which knocked down MTHFD2 gene, A549, MDA-MB-231, NCI-H2347, and NCI-H1975 by the Western blot method.
  • MTHFD2 gene knockdown was performed using a short interfering RNA (denoted as siM in the figure) of the MTHFD2 gene.
  • the detection of MTHFD2 protein was performed using an anti-MTHFD2 antibody.
  • ⁇ -actin was measured as a loading control in Western blotting.
  • Example 1 It is a figure which shows the result of having examined the influence of MTHFD2 gene knockdown on the cell growth of cancer cell lines BT474 and A549 in the presence of glycine 100 ⁇ M (Gly (100)) and in the absence of glycine (Gly (0)). . MTHFD2 gene knockdown was performed twice using a short interfering RNA of the MTHFD2 gene (indicated as siM in the figure).
  • siM was used at 10 nM and 0.1 nM or 1 nM, respectively.
  • “no RNA” indicates that treatment with a short interfering RNA was not performed
  • “siC” means a short interfering RNA as a negative control.
  • Example 1 It is a figure which shows the result of having measured the expression level of MTHFD2 protein in the cancer cell line BT474 which knocked down the MTHFD2 gene by the Western blot method.
  • MTHFD2 gene knockdown was performed using a short interfering RNA of the MTHFD2 gene (indicated as siM2 in the figure).
  • the detection of MTHFD2 protein was performed using an anti-MTHFD2 antibody.
  • ⁇ -actin was measured as a loading control in Western blotting.
  • “no RNA” indicates that treatment with a short interfering RNA was not performed, and “siCtrl” indicates a short interfering RNA as a negative control.
  • Example 1 The effect of MTHFD2 gene knockdown on cell growth of cancer cell lines HEC50B, A549, and MDA-MB-231 was examined in the presence of glycine 100 ⁇ M (Gly (100)) and in the absence of glycine (Gly (0)). It is a figure which shows the result. MTHFD2 gene knockdown was performed using a short interfering RNA of the MTHFD2 gene (indicated as siMTHFD2 in the figure). The vertical axis in the figure indicates the amount of ATP indicating the degree of cell proliferation, and the horizontal axis in the figure indicates the number of days of culture after the cells are replated.
  • Example 1 It is a figure which shows the result of having examined the influence on the cell growth of this cancer cell line by double knockdown of GLDC gene and MTHFD2 gene in cancer cell line A549 by which the high expression of the GLDC gene was recognized.
  • Cell proliferation was measured by culturing cells in RPMI medium containing 10% fetal bovine serum. This medium contains 133 ⁇ M or more of glycine.
  • Double knockdown of the GLDC gene and the MTHFD2 gene uses a short interfering RNA of the GLDC gene (indicated as siGLDC or siG in the figure) and a short interfering RNA of the MTHFD2 gene (indicated as siMTHFD2 or siM in the figure).
  • siC means a short interfering RNA as a negative control.
  • the downward arrow indicates that cell proliferation was reduced by MTHFD2 gene knockdown.
  • Example 2 It is a figure which shows the result of having analyzed the copy number (copy number) of the GLDC gene about various cell lines.
  • Example 3 Expression of MTHFD2 gene in three clones (M12, M13, and M18) of cancer cell line MDA-MB-231-luc stably expressing a short hairpin RNA (hereinafter abbreviated as shRNA) of MTHFD2 gene.
  • shRNA short hairpin RNA
  • Example 4 Three clones (M12, M13, and M18) of the cancer cell line MDA-MB-231-luc stably expressing shRNA of the MTHFD2 gene in the presence of 100 ⁇ M glycine (Gly (100)) and non-glycine It is a figure which shows the cell growth in presence (Gly (-)). MDA-MB-231-luc cron was measured for cell proliferation 3 days after reseeding. The vertical axis of the figure indicates the amount of ATP indicating the degree of cell proliferation. In the figure, “shCtrl” means control shRNA.
  • Example 4 The results of examining tumor growth in xenograft model mice transplanted with three clones (M12, M13, and M18) of the cancer cell line MDA-MB-231-luc stably expressing shRNA of the MTHFD2 gene were shown.
  • the vertical axis in the figure represents the tumor volume, and the horizontal axis represents the number of days after transplantation of cancer cell clones.
  • the present invention relates to a method for predicting reactivity to an MTHFD2 inhibitor, and the method is characterized by analyzing a GLDC gene or a gene product thereof in a biological sample derived from a subject as an index of reactivity to an MTHFD2 inhibitor. .
  • the “subject” means a human and a non-human mammal undergoing a test by a method for predicting reactivity to an MTHFD2 inhibitor.
  • it means a human and a non-human mammal suffering from a disease for which a therapeutic effect by an MTHFD2 inhibitor is expected.
  • a cancer disease can be preferably exemplified as a disease for which a therapeutic effect by an MTHFD2 inhibitor is expected.
  • Mammals other than humans may be any organisms as long as they are classified as mammals, and include, for example, monkeys, dogs, cats, cows, horses, and the like.
  • Preferred examples of “subjects” in the present invention include humans and non-human mammals suspected of having cancer diseases, and humans and non-human mammals diagnosed with cancer diseases.
  • Cancer disease means a disease in which occurrence of “tumor” or “cancer” is observed in vivo. “Tumor” or “cancer” includes those in which growth and / or metastasis has been observed. “Tumor” or “cancer” includes those that have recurred after treatment of the cancer disease.
  • tumor In the present invention, tumor, malignant tumor, cancer, malignant neoplasm, carcinoma, sarcoma, etc. are collectively referred to as “tumor” or “cancer”.
  • cancer generally means a malignant tumor in a narrow sense, and refers to a malignant tumor that develops from epithelial cells.
  • non-epithelial malignant tumors are called sarcomas.
  • Malignant tumor is a malignant tumor that is formed by the excessive proliferation of tissues and cells autonomously against the control in vivo, and is particularly malignant such as invasive and proliferating / metastasized. Means something.
  • Adenocarcinoma is a cancer derived from glandular tissue, colorectal cancer, breast cancer, stomach cancer, lung cancer, gallbladder cancer, kidney cancer, prostate cancer, duodenal cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, cervix Examples include cancer, endometrial cancer and the like.
  • Squamous cell carcinoma is a tumor formed by epithelial basal cells becoming malignant, atypical, pluripotent, and proliferating in the subepithelial connective tissue.
  • Oral cancer, tongue cancer, pharynx, and esophagus examples include cancer, bronchial cancer, and laryngeal cancer.
  • Transitional cell carcinoma is a cancer derived from transitional epithelial tissue, and can be exemplified by bladder cancer, renal pelvic cancer, ureteral cancer, and oral cancer.
  • sarcomas include fibrosarcoma, myxosarcoma, liposarcoma, chondrosarcoma, osteosarcoma, rhabdomyosarcoma, leiomyosarcoma, angiosarcoma, malignant lymphoma and the like.
  • biological sample refers to tissue, fluid, cells, and mixtures thereof isolated from an individual, eg, tumor biopsy, spinal fluid, intrathoracic fluid, intraperitoneal fluid, lymph fluid, skin
  • Examples include sections, blood, urine, feces, sputum, respiratory organs, intestinal tract, genitourinary tract, saliva, milk, digestive organs, and cells collected from these, especially as long as gene expression analysis is possible It is not limited.
  • Biological samples were collected by, for example, biopsy from a part of the excised tissue obtained at the time of surgery performed for the purpose of treating cancer diseases, from subjects suspected of having cancer diseases
  • Preferred examples include cells derived from a part of the tissue, or intrathoracic fluid or intraperitoneal fluid.
  • the biological sample may be a protein extract or a nucleic acid extract prepared from tissues, fluids, cells, and mixtures thereof isolated from individuals.
  • the protein extract or nucleic acid extract can be prepared using a protein preparation method or nucleic acid preparation method known per se.
  • the biological sample is preferably a biological sample collected before treatment with the MTHFD2 inhibitor.
  • the biological samples it is possible to predict sensitivity to an MTHFD2 inhibitor prior to performing treatment with an MTHFD2 inhibitor, so that the subject is treated with a treatment containing the MTHFD2 inhibitor.
  • a determination of whether or not a subject to be treated with a treatment containing an MTHFD2 inhibitor can be performed.
  • MTHFD2 is one of the isoforms of MTHFD, which is an enzyme involved in folic acid metabolism.
  • MTHFD2 is a bifunctional enzyme present in mitochondria that catalyzes NAD + -dependent methylenetetrahydrofolate dehydrogenase and methenyltetrahydrofolate cyclohydrase reactions in mitochondria and is associated with rapid cancer cell growth Is related to 1-carbon metabolism in mitochondria, which is a reported metabolic system (Non-patent Document 1). Therefore, it can be considered that rapid cell growth of cancer cells can be suppressed by inhibiting the action of MTHFD2.
  • MTHFD2 inhibitor refers to a drug that targets the MTHFD2 gene or its gene product, and includes expression of the MTHFD2 gene, that is, transcription of the MTHFD2 gene, translation of MTHFD2 mRNA, and action of the MTHFD2 protein. It refers to a drug that suppresses the function of the MTHFD2 gene or its gene product and its physiological action in cells and living bodies by inhibiting.
  • agents may include, but are not limited to, antisense molecules, low RNA molecules such as siRNA and shRNA, aptamers, lipozymes, antibodies, or low molecular compounds, and the function of the MTHFD2 gene or its gene product and its Any substance that suppresses physiological effects may be used.
  • reactivity to MTHFD2 inhibitor can be restated as sensitivity to MTHFD2 inhibitor.
  • reactivity to an MTHFD2 inhibitor refers to cancer cell growth suppression and cell death caused by an MTHFD2 inhibitor, and reduction or disappearance of cancer or cancer disease remission caused by the inhibitor. Means partial remission.
  • “As an index of reactivity to MTHFD2 inhibitor” means to use as a marker for evaluating reactivity to MTHFD2 inhibitor.
  • GLDC is one of the molecules constituting the glycine cleavage system localized in mitochondria and is a glycine metabolizing enzyme.
  • the nucleotide sequence of the GLDC gene and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene have already been reported.
  • the base sequence of the human GLDC gene and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene the base sequence of the mRNA registered in GenBank with accession number NM_000170 (VERSION: NM_000170.2, GI: 108773800) and the base sequence are encoded. Examples of such amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 in the sequence listing.
  • the GLDC gene is not only composed of the exemplified base sequence, but also encodes a protein having a biological function equivalent to that of GLDC, for example, homologues such as homologs and splice variants, mutants, and derivatives. Good. Further, the GLDC protein is not limited to the exemplified amino acid sequence, but may be a protein having an equivalent biological function, for example, homologues such as homologs and splice variants, mutants, and derivatives.
  • RNA ribonucleic acid
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • Nucleic acids are high molecular polymers composed of nucleotide units.
  • polynucleotide a high molecular polymer in which 100 or more nucleotides are bonded
  • oligonucleotide a high molecular polymer in which 5 to 99 nucleotides are bonded.
  • the term “gene” includes not only a protein-encoding protein but also a gene that functions as RNA or DNA.
  • RNA is not limited to single-stranded RNA, but may be single-stranded RNA having a complementary sequence thereto or double-stranded RNA composed thereof.
  • gene expression (sometimes simply expressed as “expression”) means that gene information is transcribed into mRNA and then translated into protein to act as a structure and function of a cell in vivo.
  • expression amount refers to the amount of a product generated in the process of gene expression, for example, mRNA that is a transcription product or protein that is a translation product.
  • the expression of a GLDC gene or a gene product thereof contained in a biological sample derived from a subject is measured, and the expression of the gene or the gene product is detected.
  • a sample in which the expression level of the gene or gene product thereof is lower than a preset reference value includes predicting that the sample is derived from a subject having reactivity with an MTHFD2 inhibitor.
  • the analysis of the expression of the GLDC gene in a biological sample measures the amount of mRNA that is a transcription product of the gene to be measured, or measures the amount of protein that is the gene product to be measured. Can be implemented.
  • a known gene expression detection method can be used. Numerous molecular biological techniques such as Northern blotting, dot blotting, polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription PCR (RT-PCR), quantitative RT-PCT, hybridization, and DNA array methods are used. Thus, the amount of mRNA can be measured. Further, the amount of mRNA can be measured by a known method using a polynucleotide having a DNA sequence that hybridizes under stringent conditions to the gene to be measured as a probe.
  • a label such as a fluorescent label is appropriately bound to the probe, and this is hybridized with mRNA isolated and purified from a biological sample or cDNA synthesized from the mRNA. Thereafter, the amount of mRNA of the gene to be measured can be detected by measuring the fluorescence intensity derived from the hybridized probe.
  • the probe can also be used by being immobilized on a support such as glass beads or a glass substrate. That is, the probe can be used in the form of a DNA array or a DNA chip in which a probe prepared for a gene to be measured is immobilized on a support.
  • the support is not particularly limited as long as the polynucleotide can be immobilized, and may have any shape or material.
  • the support generally include inorganic materials such as glass plates, silicon wafers, and resins, nitrocellulose as a natural polymer material, and nylon as a synthetic polymer material.
  • Commercially available DNA chips and DNA arrays can be used.
  • the polynucleotide to be immobilized on the support may be a synthetic oligonucleotide. It is also possible to introduce a nucleic acid derivative capable of fluorescent labeling on the sequence of the synthetic oligonucleotide.
  • both the Affymetrix type DNA chip technology capable of synthesizing the target oligonucleotide on the support and the Stanford type DNA chip technology for fixing the synthesized DNA fragment by spotting as a DNA probe can be used. .
  • a desired polynucleotide can be spotted and immobilized on a columnar surface of a 3D-Gene type (manufactured by Toray Industries, Inc.) having a three-dimensional support.
  • “hybridizes under stringent conditions” means, for example, 1 ⁇ SSC (0.15 M NaCl, 0.015 M sodium citrate), 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS) at 42 ° C. It means that the hybridization is maintained even by washing treatment at 42 ° C. with the buffer solution.
  • SSC sodium dodecyl sulfate
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the probe and primer set for quantitatively detecting mRNA and cDNA derived from the GLDC gene are not particularly limited as long as the mRNA and cDNA can be specifically detected, but an oligonucleotide consisting of 12 to 26 nucleotides Is preferred.
  • Such a probe and primer set can be appropriately designed based on the base sequence information of the gene to be measured, and an oligonucleotide having the determined sequence can be synthesized according to a conventional method using, for example, a DNA synthesizer. Can do.
  • a desired primer or probe for gene detection available on the market can be selected and used.
  • primer sets for quantitatively detecting GLDC mRNA include the following three types of primer sets.
  • Primer set 1 consists of a combination of an oligonucleotide consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 and an oligonucleotide consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • Primer set 2 consists of a combination of an oligonucleotide consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 and an oligonucleotide consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 6.
  • Primer set 3 consists of a combination of an oligonucleotide consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 and an oligonucleotide consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • Primer set 1 amplifies the partial base sequence on the 3 ′ end side from the 2428th position to the 2595th position of the GLDC mRNA described in SEQ ID NO: 1.
  • Primer set 2 amplifies the partial base sequence on the 5 ′ end side from the 364th to the 479th of GLDC mRNA described in SEQ ID NO: 1.
  • Primer set 3 amplifies the partial base sequence on the 5′-end side from the 635th to the 743th of the GLDC mRNA described in SEQ ID NO: 1.
  • a known protein measurement method can be used.
  • various methods using an antibody against GLDC protein can be applied. Specific examples include a Western blot method, an enzyme immunosolid phase method (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay; ELISA), and a radioimmunoassay method (Radio ImmunoAssay; RIA).
  • the antibody against GLDC protein uses GLDC protein as an antigen. As long as it specifically binds to the antigen, a human antibody, a mouse antibody, a rat antibody, a rabbit antibody, a sheep antibody, etc. may be used as appropriate. it can.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but a monoclonal antibody is preferable in that a homogeneous antibody can be stably produced.
  • Polyclonal and monoclonal antibodies can be prepared by methods well known to those skilled in the art. In addition, a desired antibody can be selected and used from commercially available antibodies.
  • a hybridoma producing a monoclonal antibody can be basically produced using a known technique as follows. That is, the target antigen or a cell expressing the target antigen is used as a sensitizing antigen, and an immune cell obtained by immunizing a desired animal according to a normal immunization method is converted into a known parent cell by a normal cell fusion method. And then the desired monoclonal antibody-producing cells (hybridoma cells) are selected by a conventional screening method.
  • the hybridoma can be prepared according to, for example, the method of Milstein et al. (“Methods of Enzymology”, 1981, Vol. 73, p. 3-46).
  • GLDC protein or a fragment thereof can be used as an antigen.
  • the GLDC protein and its fragments can be found in, for example, Sambrook et al., “Molecular Cloning a Laboratory Manual”, 2nd edition, Volume 1-3, Cold Spring Spring Harbor Laboratory Press, New York 1989, etc. According to the method described in the book, those skilled in the art can easily obtain it.
  • the protein, a fragment thereof, and an antibody can be immobilized on a support and used.
  • the support is not limited as long as it can immobilize proteins.
  • inorganic materials such as glass plates, silicon wafers, and resins, or natural polymer materials such as nitrocellulose and synthetic polymer materials such as nylon and polystyrene are used. Etc. can be illustrated.
  • the reactivity to the MTHFD2 inhibitor is predicted based on the expression level. Specifically, after measuring the expression level of the GLDC gene or its gene product by any of the methods described above, the expression level of the gene or its gene product is evaluated. When a GLDC gene or its gene product is detected in a biological sample and its expression level is very low, the subject who provided the biological sample is predicted to be responsive to an MTHFD2 inhibitor. In contrast, when the expression level of the GLDC gene or its gene product is high or low in a biological sample, it is predicted that the subject who provided the biological sample is not responsive to the MTHFD2 inhibitor. Also, if no expression of the GLDC gene or its gene product is detected, the subject who provided such a biological sample is predicted not to be responsive to the MTHFD2 inhibitor.
  • Prediction of reactivity based on the expression level of the GLDC gene or its gene product is preferably performed by setting a reference value in advance and comparing it with this reference value. If the GLDC gene or its gene product is detected in the biological sample and its expression level is low compared to the reference value, the subject who provided the biological sample is responsive to the MTHFD2 inhibitor. Predict. In contrast, if the GLDC gene or its gene product in a biological sample is high compared to a reference value, the subject who provided the biological sample is predicted to be not responsive to the MTHFD2 inhibitor. Also, if no expression of the GLDC gene or its gene product is detected, the subject who provided such a biological sample is predicted not to be responsive to the MTHFD2 inhibitor.
  • the standard value for evaluating the expression level of the GLDC gene or its gene product is a known statistic obtained by previously measuring the expression of the gene or its gene product in a cell that does not show reactivity to the MTHFD2 inhibitor and referring to the quantitative value thereof. It can be set by a technique. Preferably in cells that do not show reactivity to MTHFD2 inhibitors in the presence of glycine, for example in the presence of physiological concentrations of glycine, more specifically in the presence of 50 ⁇ M to 200 ⁇ M, preferably 100 ⁇ M glycine. It is appropriate to set a reference value based on the expression level of the GLDC gene or its gene product.
  • Cancer cell line A549 can be exemplified as a cell that does not show reactivity with MTHFD2 inhibitor and has high expression of GLDC gene or gene product thereof.
  • the cancer cell line NCI-H1975 can be exemplified as a cell that does not show reactivity with an MTHFD2 inhibitor and has a low expression of the GLDC gene or its gene product. More preferably, the expression level of the GLDC gene or its gene product in the cancer cell line NCI-H1975 is used as a reference value.
  • the method for predicting the reactivity to the MTHFD2 inhibitor according to the present invention can also be carried out by evaluating the expression of the GLDC gene contained in the biological sample derived from the subject by analyzing the genotype of the gene. It can be considered that the expression of the gene is reduced because the copy number of GLDC DNA is reduced in the biological sample in which the heterozygous defect is detected by analyzing the genotype of the GLDC gene. That is, the genotype of the GLDC gene contained in a biological sample derived from a subject is analyzed, and the biological sample in which a heterodeficiency of the gene is detected is a biological sample derived from a subject having reactivity with an MTHFD2 inhibitor. It can be predicted that it is a target sample.
  • the genotype analysis can be performed by detecting a copy number variation (CNV) of GLDC DNA.
  • CNV refers to a phenomenon in which genomic DNA extending over 1 kb or more on a chromosome is 1 copy or less, or 3 copies or more in a normal human somatic cell, that is, 2 copies in a diploid genome.
  • the gene copy number is 1 copy or less, it can be considered that the genomic DNA is deleted, and when it is 3 copies or more, the genomic DNA is duplicated.
  • MDA-MB-231 which is a cancer cell line in which the expression of the GLDC gene is very low both at the mRNA level and at the protein level, and showed a decrease in cell proliferation due to MTHFD2 gene knockdown
  • a copy of GLDC DNA The number was less than 1 copy. Therefore, it can be considered that the genomic GLDC gene of MDA-MB-231 cells is hetero-deficient, and that the expression of the gene is decreased in the hetero-deficient cell line of GLDC gene.
  • CNV of GLDC DNA is detected using a biological sample, and when the copy number of GLDC DNA is 1 or less, the subject who provided the biological sample is reactive to the MTHFD2 inhibitor. It can be evaluated as having.
  • CNV can be detected by using a known method.
  • methods include an array CGH method, a single nucleotide polymorphism (SNP) array method, a quantitative real-time PCR (Quantitative Real Time Polymer Chain Reaction; qPCR) method, multiplex ligation-dependent probe amplification method and the like.
  • the present invention also relates to a method for selecting subjects having reactivity with an MTHFD2 inhibitor, characterized by using the prediction method. Furthermore, the present invention relates to a disease treatment method comprising administering an effective amount of an MTHFD2 inhibitor to a subject selected by the prediction method.
  • a method for selecting a subject having reactivity to an MTHFD2 inhibitor according to the present invention uses a biological sample derived from a subject, measures the expression of a GLDC gene or a gene product thereof contained in the biological sample, A subject in whom expression of a gene or a gene product thereof is detected and a biological sample in which the expression level of the gene or the gene product is lower than a preset reference value is a subject for disease treatment with an MTHFD2 inhibitor Including sorting.
  • the MTHFD2 inhibitor according to the present invention uses a biological sample derived from a subject, measures the expression of the GLDC gene or its gene product contained in the biological sample, and the gene or its gene product. And a subject who has provided a biological sample in which the expression level of the gene or the gene product thereof is lower than a preset reference value is selected as a target for disease treatment with an MTHFD2 inhibitor. Administering a therapeutically effective amount of an MTHFD2 inhibitor to a treated patient.
  • the disease to which the method according to the present invention can be applied may be any disease as long as the therapeutic effect is obtained by the MTHFD2 inhibitor, and cancer diseases can be exemplified as preferable diseases.
  • the cancer disease may be any cancer disease. Specific examples of cancer diseases to which the method according to the present invention can be applied include colon cancer, liver cancer, skin cancer, lung cancer, kidney cancer, prostate cancer, duodenal cancer, ovarian cancer, and uterine body.
  • Cancer cervical cancer, gallbladder cancer, pancreatic cancer, breast cancer, stomach cancer, oral cancer, tongue cancer, pharynx, esophageal cancer, bronchial cancer, laryngeal cancer, bladder cancer, renal pelvic cancer,
  • a subject selected as having reactivity to a disease treatment with an MTHFD2 inhibitor by the method according to the present invention can obtain a therapeutic effect by administration of a therapeutically effective amount of the MTHFD2 inhibitor.
  • subjects selected as reactive to an MTHFD2 inhibitor can be treated with a therapeutically effective amount of an MTHFD2 inhibitor to induce tumor cell growth suppression or cell death, reduce tumor size, It can be considered that extinction or remission of cancer disease or partial remission occurs.
  • the MTHFD2 inhibitor is administered to the subject per se or as a composition containing it.
  • the composition comprises a filler, a filler, a binder, a moistening agent, a disintegrant, a surfactant, a lubricant, a diluent, an excipient that is usually used depending on the form of use of the preparation. It is produced as a pharmaceutical composition containing one or more pharmaceutical carriers such as a dosage form.
  • the amount of the active ingredient contained in the pharmaceutical composition is appropriately selected from a wide range, but is usually about 0.00001 to 70% by weight, preferably about 0.0001 to 5% by weight. .
  • the dose range is not particularly limited, and the effectiveness of the contained components, dosage form, administration route, type of disease, subject nature (such as body weight, age, medical condition and use of other medicines), and the physician's It is appropriately selected according to the judgment or the like.
  • a suitable dose is, for example, in the range of about 0.01 ⁇ g to 100 mg, preferably about 0.1 ⁇ g to 1 mg, per kg of the subject's body weight.
  • these doses can be varied using general routine experimentation for optimization well known in the art.
  • the above dose can be administered once to several times a day, and may be administered intermittently at a rate of once every several days or weeks.
  • the administration route can be either systemic administration or local administration.
  • an appropriate administration route is selected according to the disease, symptoms and the like.
  • the parenteral route includes normal intravenous administration, intraarterial administration, subcutaneous, intradermal, intramuscular administration and the like.
  • it can be administered by the oral route.
  • transmucosal administration or transdermal administration can also be performed. It can also be administered directly into the tumor.
  • the administration form can be selected from various forms according to the purpose. Typical examples are solid dosage forms such as tablets, pills, powders, powders, fine granules, granules, capsules, aqueous preparations, ethanol solution preparations, suspensions, fat emulsions, liposome preparations, Inclusion bodies such as cyclodextrin, and liquid dosage forms such as syrup and elixir are included. Depending on the route of administration, these may be oral, parenteral (instillation, injection), nasal, inhalation, vaginal, suppository, sublingual, eye drops, ear drops, ointments, creams And can be prepared, molded and prepared according to ordinary methods.
  • the method for predicting reactivity to an MTHFD2 inhibitor according to the present invention, gene expression analysis using a biological sample collected from a subject before treatment with an MTHFD2 inhibitor, for example, expression analysis at the mRNA level or protein level
  • the reactivity of the patient by administration of the MTHFD2 inhibitor that is, the therapeutic effect of the inhibitor can be predicted more objectively and specifically. Therefore, it is possible to prevent drug administration that is an excessive burden on a patient who is not responsive to an MTHFD2 inhibitor and cannot expect the effect of the administration, and to provide knowledge of an effective treatment policy for the patient. it can.
  • cancer cell lines having different expression levels of the GLDC gene were used, and cell proliferation by knockdown of the MTHFD2 gene was performed. The effect on was measured.
  • cancer cells with very low expression of the GLDC gene can be considered to have reactivity with drugs that inhibit MTHFD2.
  • the present embodiment will be described more specifically.
  • mRNA was extracted from each cell (A549, MDA-MB-231, BxPC3, NCI-H2347, NCI-H1975) using an RN easy mini kit (RNeasy Mini kit; manufactured by Qiagen), and high capacity was obtained.
  • cDNA was prepared using a cDNA reverse transcription kit (High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit; manufactured by Applied Biosystems).
  • TAC protein probe (Taqman probe; manufactured by Applied Biosystems) against ribosomal protein large P0 (ribosome protein, large, P0; hereinafter abbreviated as RPLP0)
  • RPLP0 ribosomal protein large P0
  • the mixture was mixed with Master Mix (Applied Biosystems), PCR was performed with Via 7 (Via7; Applied Biosystems), and mRNA was quantified by the delta-delta Ct method.
  • Tackman probe Tackman (registered trademark) Gene Expression Assays (Taqman (R) Gene Expression Assays; manufactured by Applied Biosystems) was used.
  • Taqman probes with assay ID: Hs99999902_m1 and assay ID: s01558091_m1 were used, respectively.
  • FIG. 1 shows the results obtained by examining the expression of GLDC gene in each cell line (A549, MDA-MB-231, BxPC3, NCI-H2347, NCI-H1975) by quantitative analysis of GLDC mRNA.
  • GLDC mRNA expression in each cell line was expressed as a relative expression level with respect to the GLDC mRNA expression level detected in A549.
  • expression of GLDC mRNA was observed, but the expression level was found to be lower than that of A549.
  • primer sets used were primer sets created based on the base sequence of GLDC mRNA (SEQ ID NO: 1).
  • Primer set 1 amplifies the partial base sequence on the 3 ′ end side from the 2428th position to the 2595th position of GLDC mRNA (SEQ ID NO: 1).
  • Primer set 2 amplifies the partial base sequence on the 5 ′ end side from the 364th to the 479th of GLDC mRNA (SEQ ID NO: 1).
  • Primer set 3 amplifies the partial base sequence on the 5 ′ end side from the 635th to the 743rd of GLDC mRNA (SEQ ID NO: 1).
  • each primer set is shown below: Primer-1-forward: tgagtctctgcacctaaaatcttacac (SEQ ID NO: 3) Primer-1-reverse: ctgacgggtcccacaggaca (SEQ ID NO: 4) Primer-2-forward: gccccagacacgacgactt (SEQ ID NO: 5) Primer-2-reverse: ggaccgttttctcgatcaat (SEQ ID NO: 6) Primer-3-forward: tgcgggaacttactgggaac (SEQ ID NO: 7) Primer-3-reverse: acaccatgggtctgggtgtgtgagt (SEQ ID NO: 8)
  • GLDC mRNA expression in each cell line was expressed as a relative expression level with respect to the GLDC mRNA expression level detected by HEK293.
  • GLDC mRNA expression was observed in HEK293, LUDLU-1, NCI-H2347, AsPC-1, MDA-MB-231, NCI-H1975, and BxPC3 cell lines, but GLDC mRNA was not detected in HEC50B.
  • MTHFD2 gene knockdown experiment 1 MTHFD2 gene knockdown experiments were performed using A549, MDA-MB-231, and NCI-H2347. Specifically, each cells were seeded in 6-well plates at a cell number 2x10 5 / well, using the transfection reagent siRNA the following day (Lipofectamine (TM) RNAi MAX (Lipofectamine (R) RNAiMax)) Transfected. The next day, the cells were re-seeded at a cell number of 800 / well in a 96-well plate, and the second and third transfections were performed 1 day and 4 days after re-seeding, respectively.
  • TM Lipofectamine
  • R Lipofectamine
  • the medium was changed 1 day, 4 days, and 6 days after reseeding.
  • 0 day On the day of re-seeding (hereinafter referred to as 0 day), 1 day, 4 days, 6 days, and 8 days later, using Cell titer Glo Luminescent Cell Viability Assay (manufactured by Promega)
  • the amount of intracellular ATP was measured to quantify cell proliferation.
  • fetal bovine serum manufactured by HyClone (ThermoFisher scientific) was added to the RPMI medium to a final concentration of 10%.
  • dialyzed fetal bovine serum (SAFC Bioscience) is added to the MEM medium to a final concentration of 10%, L-serine is added to a final concentration of 400 ⁇ M, and glycine is added. It was used by adding to a final concentration of 0 or 100 ⁇ M.
  • FIGS. 4-A and 4-B The results of MTHFD2 gene knockdown experiments using A549, MDA-MB-231, and NCI-H2347 are shown in FIGS. 4-A and 4-B.
  • FIGS. 4-A and 4-B The results of MTHFD2 gene knockdown experiments using A549, MDA-MB-231, and NCI-H2347 are shown in FIGS. 4-A and 4-B.
  • a decrease in cell proliferation due to MTHFD2 gene knockdown was observed (FIG. 4-A).
  • the MTHFD2 gene knockdown caused a decrease in cell proliferation with MDA-MB-231 and NCI-H2347, but A549 cell proliferation was not affected (FIG. 4-A).
  • MTHFD2 gene knockdown experiment 2 MTHFD2 gene knockdown experiments were performed using A549, MDA-MB-231, NCI-H2347, and NCI-H1975. Specifically, each cells were seeded in 6-well plates at a cell number 2x10 5 / well, using the transfection reagent siRNA the following day (Lipofectamine (TM) RNAi MAX (Lipofectamine (R) RNAiMax)) Transfected. Three days later, the cells were replated at a cell number of 800 / well in a 96-well plate, and the second, third, and fourth transfections were performed after 0, 3, and 7 days, respectively.
  • TM Lipofectamine
  • R Lipofectamine
  • the medium was changed 1 day, 5 days, and 8 days after re-seeding.
  • fetal bovine serum manufactured by HyClone (ThermoFisher scientific) was added to the RPMI medium to a final concentration of 10%.
  • dialyzed fetal bovine serum (SAFC Bioscience) is added to the MEM medium to a final concentration of 10%, L-serine is added to a final concentration of 400 ⁇ M, and glycine is added. It was used by adding to a final concentration of 0 or 100 ⁇ M.
  • FIG. 5-A and FIG. 5-B The influence of MTHFD2 gene knockdown on the cell proliferation of the examined cells is shown in FIG. 5-A and FIG. 5-B.
  • MDA-MB-231 and NCI-H2347 a decrease in cell proliferation due to MTHFD2 gene knockdown was observed both in the absence of glycine and in the presence of glycine (FIG. 5-A right panel and FIG. 5- B left panel).
  • A549 and NCI-H1975 due to MTHFD2 gene knockdown, a decrease in cell proliferation was observed in the absence of glycine, but a decrease in cell proliferation was not observed in the presence of glycine (left of FIG. 5-A). Panel and right panel of FIG. 5-B).
  • MTHFD2 gene knockdown experiment 3 MTHFD2 gene knockdown experiments were performed using A549 and BT474. Specifically, each cell was seeded in a 100 mm dish so that A549 was 5% confluent and BT474 was 25% confluent, and the next day, MTHFD2 siRNA was transfected using a transfection reagent (Lipofectamine RNAiMax). Two days later, A549 was repopulated in a 96-well plate at a cell number of 800 / well and BT474 at a cell number of 4000 / well, and a second transfection was performed simultaneously. In order to examine the influence of the glycine concentration in the medium, the medium was changed one day after the reseeding.
  • a transfection reagent Lipofectamine RNAiMax
  • the amount of intracellular ATP was measured using a cell titer Glo reagent (manufactured by Promega) to quantify cell proliferation.
  • fetal bovine serum manufactured by HyClone (ThermoFisher scientific)
  • HyClone ThermoFisher scientific
  • glycine is added. It was used by adding to a final concentration of 0 or 100 ⁇ M.
  • Figure 6-A shows the effect of MTHFD2 gene knockdown on cell growth of BT474 and A549.
  • MTHFD2 gene knockdown by siRNA showed a decrease in cell proliferation both in the absence and presence of glycine, but the effect was higher in the absence of glycine than in the presence of glycine.
  • Figure 6-B shows the expression of MTHFD2 protein was inhibited by transfection of MTHFD2 siRNA with BT474 (FIG. 6-B).
  • MTHFD2 gene knockdown experiment 4 MTHFD2 gene knockdown experiments were performed using A549, HEC50B, and MDA-MB-231. Specifically, each cell was seeded on a 6-well plate at a cell number of 1.5 ⁇ 10 5 / well, and siRNA was transfected using a transfection reagent (Lipofectamine RNAiMax) the next day. The next day, the cells were re-seeded at a cell number of 800 / well in a 96-well plate, and the second and third transfections were performed 1 day and 4 days after re-seeding, respectively. In order to examine the influence of the glycine concentration in the medium, the medium was changed 2 days and 5 days after the reseeding.
  • a transfection reagent Lipofectamine RNAiMax
  • the amount of intracellular ATP was measured using a cell titer Glo reagent (manufactured by Promega) to quantify cell proliferation.
  • fetal bovine serum manufactured by HyClone (ThermoFisher scientific)
  • HyClone ThermoFisher scientific
  • glycine is added. It was used by adding to a final concentration of 0 or 100 ⁇ M.
  • Non-patent Document 4 It has been reported that the blood concentration of glycine in healthy humans is on the order of several hundred ⁇ M (Non-patent Document 4). Further, according to metabolomic analysis data of human colon cancer and gastric cancer, it is reported that the glycine concentration in the tissue is in the order of mM when converted to density 1 (Non-patent Document 5). The present inventors have also confirmed that the blood concentration of glycine is the same level as that of human blood in mice. Furthermore, the glycine concentration in tumors formed by transplanting A549 cells into mice was estimated to be in the order of mM as in humans (converted as density 1). In addition, the intracellular glycine concentration of A549 cells cultured in vitro was estimated to be in the order of mM (the volume of one cell was estimated from the major axis).
  • cancer cells in vivo since the glycine concentration is high in the living body and in the tumor tissue, the behavior of cancer cells in vivo (in vivo) is considered to correlate with the behavior of each cell under the conditions in the presence of glycine in this example. be able to. Therefore, cancer cells with very low expression of the GLDC gene have reactivity with drugs that inhibit MTHFD2, and the reactivity is high in cell lines with high GLDC gene expression, moderately expressed cells and non-expressing cells. You can think of it not.
  • Each cell was seeded in a 25 cm 2 flask at a cell number of 3 ⁇ 10 5 / well, and siRNA was transfected using a transfection reagent (Lipofectamine RNAiMax) the next day. Three days later, the cells were re-seeded at a cell number of 1000 / well in a 96-well plate, and the second and third transfections were performed after 0 and 3 days, respectively. The medium was changed 1 day and 3 days after reseeding. After 0 days, 1 day, 3 days, 5 days, and 7 days after re-seeding, the amount of intracellular ATP was measured using a cell titer Glo reagent (manufactured by Promega) to quantify cell proliferation. The medium used was RPMI medium supplemented with fetal bovine serum (HyClone (ThermoFisher scientific)) to a final concentration of 10%. This medium contains 133 ⁇ M or more of glycine.
  • a cell lysate was prepared using RIPA buffer (manufactured by Thermo) for the cells remaining at the time of re-seeding, and MTHFD2, GLDC, and ⁇ -actin protein were detected by Western blotting.
  • RIPA buffer manufactured by Thermo
  • MTHFD2, GLDC, and ⁇ -actin protein were detected by Western blotting.
  • anti-MTHFD2 antibody manufactured by Abcam
  • anti-GLDC antibody manufactured by Cell signaling technologies, # 12794
  • anti- ⁇ -actin antibody manufactured by santa cruz
  • FIG. 8 shows the result of double knockdown of the GLDC gene and the MTHFD2 gene using A549 cells in which high expression of the GLDC gene was observed. Knocking down only the MTHFD2 gene had no effect on cell proliferation (left panel in FIG. 8). In addition, cell proliferation was reduced by knockdown of the GLDC gene. On the other hand, when the GLDC gene and the MTHFD2 gene were double-knocked down, cell proliferation was significantly reduced regardless of the conditions in the presence of glycine (right panel in FIG. 8).
  • Example 1 The results of the representative cancer cell lines shown in Example 1 and Example 2 are summarized and shown in Table 2.
  • the copy number of the GLDC genomic gene in the cancer cell line MDA-MB-231 is 1 copy or less, and it is clear that the GLDC genomic gene of the cancer cell line is heterozygous.
  • MDA-MB-231 is a cancer cell line that shows a decrease in cell proliferation due to knockdown of the MTHFD2 gene, and the expression of the GLDC gene or its gene product is very low. Therefore, a heterozygous cell line of the GLDC gene can be considered reactive to a drug that inhibits the action of MTHFD2.
  • the present embodiment will be described more specifically.
  • the examination of the GLDC gene genotype was performed by analyzing the copy number of the GLDC gene. Specifically, genomic DNA was extracted from each cell using a QIAamp DNA mini kit (QIAamp DNA Mini Kit, manufactured by Qiagen). Thereafter, the genomic DNA and the Taqman probe were mixed with Taqman Genotyping Master Mix (manufactured by Applied Biosystems), and PCR was performed with Via7 (Applied Biosystems). The obtained data was analyzed with copy caller (registered trademark) software v2.0 (CopyCaller (R) Software v2.0, manufactured by Applied Biosystems), and the number of copies of the GLDC gene in each cell was calculated.
  • copy caller registered trademark
  • CopyCaller (R) Software v2.0 manufactured by Applied Biosystems
  • Tackman probes were used: Taqman Copy Number Assays (Applied Biosystems, Assay ID: Hs06881742_cn (Intron16), Hs06825592_cn (Intron0) RNase P (Taqman Copy number reference Assay RNase P (Applied Biosystems)).
  • the results of analyzing the copy number of the GLDC gene for various cancer cell lines are shown in FIG.
  • the number of copies of the GLDC gene was 3 copies or more in A395, but NCI-H1975 was almost 1 copy, MDA-MB-231, RBE, TE-1, SNU-1079, SW1271, MDA-MB-361, NCI- H2347, BT-474, and HEC50B were 1 copy or less.
  • the number of gene copies is 2 copies. From the above results, it can be considered that the GLDC genomic gene is heterozygous in cells having a copy number of GLDC gene of 1 copy or less, such as MDA-MB-231.
  • MDA-MB-231-luc which is a GLDC genomic gene hetero-deficient cell line and has very low GLDC gene expression.
  • Stable knockdown of the MTHFD2 gene was performed by transfecting cells with a short hairpin RNA (hereinafter abbreviated as shRNA) of the MTHFD2 gene.
  • shRNA short hairpin RNA
  • MDA-MB-231-luc cells purchased from Caliper
  • pLKO 1-puro non-Mammalian shRNA control plasmid DNA
  • pLKO.1-puro Non-Mammalian shRNA Control Plasmid DNA Sigma
  • MTHFD2 shRNA-pLKO 1-puro non-Mammalian shRNA control plasmid DNA
  • MTHFD2 shRNA-pLKO. 1-puro Plasmid DNA, Sigma, Clone ID: TRCZN00000036553 was introduced using lentivirus, and the plasmid was introduced by puromycin treatment for 2 weeks or more. Cells were selected. MTHFD2 shRNA-pLKO. MDA-MB-231-luc cells into which 1-puro Plasmid DNA was introduced were subjected to cell cloning by the limiting dilution method. Among the obtained clones, cell growth for 3 days in the absence of glycine was significantly reduced compared to Non-Mammalian shRNA Control, and cell growth for 3 days in the presence of 100 ⁇ M glycine was non-Mammalian. Three clones having the same level as shRNA Control were selected. The selected clonal cells were named MDA-MB-231-luc-M12, MDA-MB-231-luc-M13, and MDA-MB-231-luc-M18.
  • the protein level expression of MTHFD2 in the clone obtained by transfection of shRNA of MTHFD2 gene or control shRNA was measured by the same method as shown in Example 1. Further, these clones were cultured in the presence or absence of glycine, and their cell proliferation was measured by the same method as described in Example 1.
  • the prepared shRNA-introduced cells were transplanted subcutaneously into the ventral part of a SCID female mouse (CLEA Japan, Inc.) at a cell number of 2 ⁇ 10 6 / mouse, to produce a xenograft model mouse (Xenograft model mouse).
  • Xenograft model mouse xenograft model mouse
  • mice transplanted with MDA-MB-231-luc cell clones a marked decrease in tumor volume was observed compared to mice transplanted with MDA-MB-231-luc cells introduced with control shRNA ( FIG. 11).
  • MTHFD2 gene knockdown significantly inhibited tumor growth in cell lines with very low GLDC gene expression.
  • the present invention provides a method for predicting responsiveness to an MTHFD2 inhibitor, and a method for selecting patients who are predicted to be highly responsive to treatment with the inhibitor. To enable proper treatment.
  • the present invention is extremely useful in the field of treatment of diseases such as cancer diseases.
  • SEQ ID NO: 1 GLDC mRNA encoding GLDC protein (SEQ ID NO: 2).
  • SEQ ID NO: 3 Forward primer for amplifying fragments from the 2428th position to the 2595th position of GLDC mRNA (SEQ ID NO: 1).
  • SEQ ID NO: 4 Reverse primer for amplifying GLDC mRNA (SEQ ID NO: 1) from fragment 2428 to fragment 2595
  • SEQ ID NO: 5 Forward primer for amplifying fragments from 364th to 479th of GLDC mRNA (SEQ ID NO: 1).
  • SEQ ID NO: 6 Reverse primer for amplifying fragments 364 to 479 of GLDC mRNA (SEQ ID NO: 1)
  • SEQ ID NO: 7 Forward primer for amplifying fragments 635 to 743 of GLDC mRNA (SEQ ID NO: 1)
  • SEQ ID NO: 8 Reverse primer for amplifying fragments 635 to 743 of GLDC mRNA (SEQ ID NO: 1)

Abstract

　被験者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中に含まれるグリシンデカルボキシラーゼ（以下、ＧＬＤＣと略称する）遺伝子またはその遺伝子産物を指標として、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ－２（以下、ＭＴＨＦＤ２と略称する）阻害薬に対する反応性を予測することを含む、ＭＴＨＦＤ２阻害薬への反応性の予測方法、前記予測方法を利用することを含む、ＭＴＨＦＤ２阻害薬による疾患治療の対象を選別する方法、並びに前記選別する方法により選別された被験者にＭＴＨＦＤ２阻害薬を投与することを含む、疾患治療方法を提供する。

Description

メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ－２阻害薬に対する反応性を予測する方法
　本発明は、被験者由来の生物学的試料中のグリシンデカルボキシラーゼ（ｇｌｙｃｉｎｅ　ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ；以下、ＧＬＤＣと略称することがある）遺伝子またはその遺伝子産物を指標にして、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ－２（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ－２；以下、ＭＴＨＦＤ２と略称することがある）阻害薬に対する反応性を予測する方法に関する。さらに本発明は、ＭＴＨＦＤ２阻害薬による疾患治療の対象を選別する方法、および該方法により選別された被験者にＭＴＨＦＤ２阻害薬を投与することを含む疾患治療方法に関する。
　ＭＴＨＦＤ２は、葉酸代謝に係る酵素であるメチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼのアイソフォームの１つであり、ミトコンドリアに存在する。ＭＴＨＦＤ２は、二機能性酵素であり、ミトコンドリア内で、ＮＡＤ＋依存性メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ反応およびメテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドラーゼ反応を触媒する。ＮＡＤ＋依存性メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ反応は、５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸（５，１０－Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ）を基質として、５，１０－メテニルテトラヒドロ葉酸（５，１０－Ｍｅｔｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ）を生成する反応である。メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ反応は、５，１０－メテニルテトラヒドロ葉酸を基質として、１０－ホルミルテトラヒドロ葉酸（１０－Ｆｏｒｍｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ）を生成する反応である。
　葉酸は、水溶性ビタミン群の１つであるが、生体内では合成されず、食品から摂取される。腸管から吸収された葉酸は生体内で代謝を受け、その代謝産物であるテトラヒドロ葉酸が補酵素として核酸合成に寄与する。そのため、がん細胞において葉酸代謝を阻害すると、核酸合成が阻害され、その結果、細胞増殖が抑制される。この点に着目し、葉酸代謝阻害剤が抗がん剤として開発されている。
　ＭＴＨＦＤ２は、葉酸代謝に関わる酵素であり、また、急速ながん細胞増殖との関連が報告された代謝系であるミトコンドリアにおける１炭素代謝に関連する（非特許文献１）。そのため、ＭＴＨＦＤ２の作用を阻害することにより、がん細胞の急速な細胞増殖を抑制し得ると考えることができる。
　最近、ＭＴＨＦＤ２ががん治療における有望な標的分子であり得ることが報告されている（非特許文献１）。具体的には、ＭＴＨＦＤ２の発現が多様ながん疾患でｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルのいずれにおいても著しく亢進していること、およびＭＴＨＦＤ２の発現増強と乳がんの予後不良との相関が認められることが観察された。一方、ＭＴＨＦＤ２の発現は、発生中の胚で認められたが、ほとんどの健常成人組織ではそれが増殖中であっても認められなかった。また、がん細胞において、ＭＴＨＦＤ２の発現をＲＮＡ干渉により阻害すると、がん細胞の増殖低下および著しい細胞死が引き起こされた。したがって、ＭＴＨＦＤ２を阻害する薬剤は、副作用の少ない有用な抗がん剤として期待される。
　ＧＬＤＣは、ミトコンドリアに局在するグリシン開裂系を構成する分子の１つであり、グリシン代謝酵素である。
　グリシン代謝酵素の欠損は高グリシン血症を引き起こす。また、グリシン消費量およびミトコンドリアのグリシン生合成経路ががん細胞の増殖速度と強く関連することが報告されている（非特許文献２）。具体的には、グリシンの摂取およびそのミトコンドリアでの生合成を拮抗することにより、急速に増殖している細胞が優先的に障害されたこと、さらには、その生合成経路の高発現が、乳がん患者のより高い死亡率に関連することが示されている。
　また、ＧＬＤＣが、非小細胞肺がんのがん幹細胞および腫瘍発生を推進することが報告されている（非特許文献３）。具体的には、ＧＬＤＣが解糖およびグリシン／セリン代謝の劇的変化を誘導し、その結果、ピリミジン代謝の変化を引き起こして、がん細胞増殖を制御することが示されている。また、臨床では、ＧＬＤＣの異常な活性化と肺がん患者の予後不良との相関、および多様な種類のがんにおけるＧＬＤＣの異常な発現が観察されている。
Nilsson R. et al., Nature Communications, 2014. 5, Article number: 3128 doi:10.1038/ncomms4128. Jain M. et al., Science, 2012. 336(6084), p.1040-1044. doi: 10.1126/science.1218595. Zhang W. C. et al., Cell, 2012. 148, p.259-272. ヒューマンメタボロームデータベース、インターネット＜URL：http://www.hmdb.ca/metabolites/HMDB00123＞ Hirayama A. et al., Cancer Research, 2009. 69(11), p.4918-4925.
　近年、がん疾患等の疾患の治療領域において分子標的治療薬の開発が盛んになり、その効果を確実に得られる患者を選別して薬剤を投与するという考えが定着しつつある。そのため、分子標的薬の開発時には、患者選別や副作用低減を目的とした薬剤効果の評価方法を開発することが求められている。
　例えば、葉酸代謝を阻害する薬剤は、がん細胞におけるＤＮＡ合成やＤＮＡメチル化を阻害するため、がん細胞の増殖を抑制すると考えることができる。そのため、葉酸の吸収やその代謝を阻害する薬剤を抗がん剤として開発することが期待される。このような薬剤を開発する際には、該薬剤に対する患者の反応性の予測、ひいては該薬剤により効果が得られる患者の選別や副作用低減等を目的とした薬剤効果の評価方法を開発することが求められる。
　本発明の課題は、葉酸代謝に係る酵素であるＭＴＨＦＤ２の作用を阻害する薬剤による有効な疾患治療、例えばがん疾患治療を可能にするために、該薬剤に対する患者の反応性を予測する方法、および該薬剤による奏功性が高いと予測される患者を選別する方法を提供することである。
　本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を行い、多種類のがん細胞で高頻度に欠損していることが報告されているがん抑制遺伝子ＣＤＫＮ２Ａ（ｐ１６）遺伝子が存在する染色体９ｐ２１領域の近傍に位置するＧＬＤＣ遺伝子に着目した。ある特定の遺伝子が欠損する際には、その近傍に位置する別の遺伝子が共欠損することが報告されている。実際、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子がホモ欠損しているがん細胞の中には、ＧＬＤＣ遺伝子もヘテロ欠損しているものがある。
　そこで、ミトコンドリアの酵素であるＭＴＨＦＤ２を阻害する薬剤に対するがん細胞の反応性と、ミトコンドリアに局在するグリシン開裂系を構成する分子の１つであり、グリシン代謝酵素として知られているＧＬＤＣの発現との関連性を検討した。その結果、ＭＴＨＦＤ２遺伝子のノックダウンにより、ＧＬＤＣ遺伝子の発現が非常に低いがん細胞株では細胞増殖が強く阻害されたが、ＧＬＤＣ遺伝子の高発現がん細胞株、中等度発現がん細胞株、および非発現がん細胞株では細胞増殖に影響は認められなかった。また、ＧＬＤＣ遺伝子高発現がん細胞株でＧＬＤＣ遺伝子をノックダウンすると、ＭＴＨＦＤ２遺伝子のノックダウンにより細胞増殖が阻害された。
　このように、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対するがん細胞の反応性とＧＬＤＣ遺伝子の発現との間に関連性があることを明らかにしたことに基づき、本発明を達成した。
　すなわち、本発明は以下に関する：
　１．被験者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中に含まれるＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物を指標としてＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を予測することを含む、ＭＴＨＦＤ２阻害薬への反応性の予測方法、
　２．前記生物学的試料中に含まれるＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物の発現を測定し、該遺伝子またはその遺伝子産物の発現が検出され、かつ、該遺伝子またはその遺伝子産物の発現量が予め設定した基準値よりも低い試料は、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を有する被験者由来の試料であると予測することを含む、前記１．の方法、
　３．ＧＬＤＣ遺伝子の発現の測定がＧＬＤＣ　ｍＲＮＡの定量測定により行われる、前記２．の方法、
　４．ＧＬＤＣ遺伝子の発現の測定がＧＬＤＣタンパク質の定量測定により行われる、前記２．の方法、
　５．前記生物学的試料中に含まれるＧＬＤＣ遺伝子の遺伝子型を解析し、ＧＬＤＣ遺伝子のヘテロ欠損が検出された試料は、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を有する被験者由来の試料であると予測することを含む、前記１．の方法、
　６．ＧＬＤＣ遺伝子の遺伝子型の解析が該遺伝子のコピー数を測定することにより行われる、前記５．の方法、
　７．前記１．－６．のいずれかの方法により、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を有すると予測された被験者を、ＭＴＨＦＤ２阻害薬による疾患治療の対象として選別することを含む、ＭＴＨＦＤ２阻害薬による疾患治療の対象を選別する方法、
　８．被験者ががん疾患患者であり、かつ疾患治療ががん疾患治療である、前記７．の方法、
　９．前記１．－６．のいずれかの方法により、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に反応性を有すると予測された被験者を、ＭＴＨＦＤ２阻害薬による疾患治療の対象として選別し、該選別された患者に、ＭＴＨＦＤ２阻害薬の治療有効量を投与することを含む、疾患治療方法、
　１０．被験者ががん疾患患者であり、かつ疾患治療ががん疾患治療である、前記９．の方法、
　１１．被験者由来の生物学的試料を用い、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性の予測のために、該生物学的試料中に含まれるＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物量を測定する方法。
　本発明により、被験者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中に含まれるＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物を指標としてＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を予測することを含む、ＭＴＨＦＤ２阻害薬への反応性の予測方法を提供することができる。
　本発明に係る方法は、被験者におけるＭＴＨＦＤ２阻害薬による治療効果の予測を、該薬剤を投与する前に実施することを可能にする。また、本発明に係る方法により、該薬剤の奏功性が高いと予測される被験者を選別することができ、該薬剤による有効な治療を実施できる。さらに本発明に係る方法は、被験者由来の生物学的試料を用いてインビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で実施できるため、被験者への負担が少ない。このように、本発明に係る方法は、がん疾患等の疾患の治療領域において極めて有用である。
５種のがん細胞株、Ａ５４９、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＢｘＰＣ３、ＮＣＩ－Ｈ２３４７、およびＮＣＩ－Ｈ１９７５におけるＧＬＤＣ遺伝子の発現を、ＧＬＤＣ　ｍＲＮＡの定量分析により検討した結果を示す図である。図の縦軸は、Ａ５４９におけるＧＬＤＣ　ｍＲＮＡの発現量に対する各細胞株での該ｍＲＮＡの相対的発現値（ｒｅｌａｔｉｖｅ　ＧＬＤＣ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を示す。検討したすべてのがん細胞株で、ＧＬＤＣ　ｍＲＮＡの発現が検出されたが、Ａ５４９以外の細胞での発現は低かった。（実施例１） ５種のがん細胞株、Ａ５４９、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＢｘＰＣ３、ＮＣＩ－Ｈ２３４７、およびＮＣＩ－Ｈ１９７５におけるＧＬＤＣ遺伝子の発現を、ＧＬＤＣタンパク質の定量分析により検討した結果を示す図である。タンパク質の検出は、抗ＧＬＤＣ抗体を用いてウエスタンブロット法により行った。矢頭は、ＧＬＤＣタンパク質のバンドを示す。β－アクチン（β－ａｃｔｉｎ）は、ウエスタンブロット法におけるローディングコントロールとして測定した。ＧＬＤＣタンパク質のバンドの位置は、Ａ５４９をＧＬＤＣ遺伝子の短鎖干渉ＲＮＡ（図中、ｓｉＧＬＤＣと表示する）で処理して該遺伝子の発現を阻害することによる該バンドの消失の検出により確認した。図中、「ｓｉＣｔｒｌ」は、陰性コントロールの短鎖干渉ＲＮＡを意味する。（実施例１） １種の正常細胞株ＨＥＫ２９３、７種のがん細胞株ＮＣＩ－Ｈ１９７５、ＬＵＤＬＵ－１、ＢｘＰＣ３、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＮＣＩ－Ｈ２３４７、ＡｓＰＣ－１、およびＨＥＣ５０ＢにおけるＧＬＤＣ遺伝子の発現を、ＧＬＤＣ　ｍＲＮＡの定量分析により検討した結果を示す図である。ＧＬＤＣ　ｍＲＮＡの定量分析は、３種類のプライマーセット（プライマーセット１、プライマーセット２、およびプライマーセット３）を使用してポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと略称する）により行った。プライマーセット１は、ＧＬＤＣ　ｍＲＮＡの３´末端側の部分塩基配列（ＧＬＤＣ－Ｃｔｅｒ）を、そして、プライマーセット２およびプライマーセット３はいずれもＧＬＤＣ　ｍＲＮＡの５´末端側の部分塩基配列（それぞれＧＬＤＣ－Ｎｔｅｒ１およびＧＬＤＣ－Ｎｔｅｒ２）を増幅するプライマーセットである。図の縦軸は、ＨＥＫ２９３におけるＧＬＤＣ　ｍＲＮＡの発現量に対する各細胞株での該ｍＲＮＡの相対的発現値（Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｍＲＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を示す。図中、結果を示すバーは、左側からＨＥＫ２９３、ＮＣＩ－Ｈ１９７５、ＬＵＤＬＵ－１、ＢｘＰＣ３、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＮＣＩ－Ｈ２３４７、ＡｓＰＣ－１、およびＨＥＣ５０Ｂを示す。（実施例１） ３種のがん細胞株、Ａ５４９、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、およびＮＣＩ－Ｈ２３４７において、ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンによる細胞増殖への影響をグリシン　１００　μＭ存在下（Ｇｌｙ　１００）およびグリシン非存在下（Ｇｌｙ　０）で検討した結果を示す図である。ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンは、ＭＴＨＦＤ２遺伝子の短鎖干渉ＲＮＡ（図中、ｓｉＭと表示する）を用いて行った。図の縦軸は、細胞増殖の程度を示すアデノシン三リン酸（以下、ＡＴＰと略称する）量を示し、図の横軸は細胞を再播種後の培養日数を示す。図中、「ｓｉＣ」は陰性コントロールの短鎖干渉ＲＮＡを意味する。（実施例１） ＭＴＨＦＤ２遺伝子をノックダウンしたがん細胞株、Ａ５４９、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、およびＮＣＩ－Ｈ２３４７におけるＭＴＨＦＤ２タンパク質の発現量をウエスタンブロット法により測定した結果を示す図である。ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンは、ＭＴＨＦＤ２遺伝子の短鎖干渉ＲＮＡ（図中、ｓｉＭＴＨＦＤ２と表示する）を用いて行った。ＭＴＨＦＤ２タンパク質の検出は、抗ＭＴＨＦＤ２抗体を用い、ＧＬＤＣタンパク質の検出は抗ＧＬＤＣ抗体を用いて行った。β－アクチン（β－ａｃｔｉｎ）は、ウエスタンブロット法におけるローディングコントロールとして測定した。図中、「１」は短鎖干渉ＲＮＡによる処理を行わなかった細胞を示し、「２」、「３」、「４」、および「５」はそれぞれ陰性コントロールの短鎖干渉ＲＮＡ、２ｎＭのｓｉＭＴＨＦＤ２、５ｎＭのｓｉＭＴＨＦＤ２、および１０ｎＭのｓｉＭＴＨＦＤ２で処理した細胞を示す。（実施例１） がん細胞株Ａ５４９およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１において、ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンによる細胞増殖への影響をグリシン　１００　μＭ存在下（Ｇｌｙ（１００））およびグリシン非存在下（Ｇｌｙ（０））で検討した結果を示す図である。ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンは、ＭＴＨＦＤ２遺伝子の短鎖干渉ＲＮＡ（図中、ｓｉＭＴＨＦＤ２と表示する）を用いて行った。図の縦軸は、再播種当日の細胞数に対する細胞増殖の割合（Ｇｒｏｗｔｈ（ｆｏｌｄ　ｖｓ　ｄａｙ０））を示し、図の横軸は細胞を再播種後の培養日数を示す。図中、「ｓｉＣｔｒｌ」は陰性コントロールの短鎖干渉ＲＮＡを、「ｎｏ　ＲＮＡ」は短鎖干渉ＲＮＡによる処理を行わなかったことを示す。また、「×」は、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした（ｓｉＲＮＡ　ＴＦ）日を示す。（実施例１） がん細胞株ＮＣＩ－Ｈ２３４７およびＮＣＩ－Ｈ１９７５において、ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンによる細胞増殖への影響をグリシン　１００　μＭ存在下（Ｇｌｙ（１００））およびグリシン非存在下（Ｇｌｙ（０））で検討した結果を示す図である。ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンは、ＭＴＨＦＤ２遺伝子の短鎖干渉ＲＮＡ（図中、ｓｉＭＴＨＦＤ２と表示する）を用いて行った。図の縦軸は、再播種当日の細胞数に対する細胞増殖の割合（Ｇｒｏｗｔｈ（ｆｏｌｄ　ｖｓ　ｄａｙ０））を示し、図の横軸は細胞を再播種後の培養日数を示す。図中、「ｓｉＣｔｒｌ」は陰性コントロールの短鎖干渉ＲＮＡを、「ｎｏ　ＲＮＡ」は短鎖干渉ＲＮＡによる処理を行わなかったことを示す。また、「×」は、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした（ｓｉＲＮＡ　ＴＦ）日を示す。（実施例１） ＭＴＨＦＤ２遺伝子をノックダウンしたがん細胞株、Ａ５４９、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＮＣＩ－Ｈ２３４７、およびＮＣＩ－Ｈ１９７５におけるＭＴＨＦＤ２タンパク質の発現量をウエスタンブロット法により測定した結果を示す図である。ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンは、ＭＴＨＦＤ２遺伝子の短鎖干渉ＲＮＡ（図中、ｓｉＭと表示する）を用いて行った。ＭＴＨＦＤ２タンパク質の検出は、抗ＭＴＨＦＤ２抗体を用いて行った。β－アクチン（β－ａｃｔｉｎ）は、ウエスタンブロット法におけるローディングコントロールとして測定した。図中、「（－）」は短鎖干渉ＲＮＡによる処理を行わなかった細胞を示し、「ｓｉＣｔｒｌ」は陰性コントロールの短鎖干渉ＲＮＡで処理した細胞を示す。（実施例１） がん細胞株ＢＴ４７４およびＡ５４９の細胞増殖へのＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンの影響をグリシン　１００　μＭ存在下（Ｇｌｙ（１００））およびグリシン非存在下（Ｇｌｙ（０））で検討した結果を示す図である。ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンは、ＭＴＨＦＤ２遺伝子の短鎖干渉ＲＮＡ（図中、ｓｉＭと表示する）を用いて２回行った。１回目および２回目のノックダウンにはｓｉＭをそれぞれ１０ｎＭおよび０．１ｎＭまたは１ｎＭ使用した。図の横軸は細胞を再播種後の培養日数を示し、図の縦軸は再播種時の細胞数に対する細胞増殖の割合（ｇｒｏｗｔｈ（ｆｏｌｄ，ｄａｙ０＝１））を示す。図中、「ｎｏ　ＲＮＡ」は短鎖干渉ＲＮＡによる処理を行わなかったことを示し、「ｓｉＣ」は陰性コントロールの短鎖干渉ＲＮＡを意味する。（実施例１） ＭＴＨＦＤ２遺伝子をノックダウンしたがん細胞株ＢＴ４７４におけるＭＴＨＦＤ２タンパク質の発現量をウエスタンブロット法により測定した結果を示す図である。ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンは、ＭＴＨＦＤ２遺伝子の短鎖干渉ＲＮＡ（図中、ｓｉＭ２と表示する）を用いて行った。ＭＴＨＦＤ２タンパク質の検出は、抗ＭＴＨＦＤ２抗体を用いて行った。β－アクチン（β－ａｃｔｉｎ）は、ウエスタンブロット法におけるローディングコントロールとして測定した。図中、「ｎｏ　ＲＮＡ」は短鎖干渉ＲＮＡによる処理を行わなかったことを、「ｓｉＣｔｒｌ」は陰性コントロールの短鎖干渉ＲＮＡを示す。（実施例１） がん細胞株ＨＥＣ５０Ｂ、Ａ５４９、およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１の細胞増殖へのＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンの影響をグリシン　１００　μＭ存在下（Ｇｌｙ（１００））およびグリシン非存在下（Ｇｌｙ（０））で検討した結果を示す図である。ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンは、ＭＴＨＦＤ２遺伝子の短鎖干渉ＲＮＡ（図中、ｓｉＭＴＨＦＤ２と表示する）を用いて行った。図の縦軸は、細胞増殖の程度を示すＡＴＰ量を示し、図の横軸は細胞を再播種後の培養日数を示す。図中、「ｎｏ　ＲＮＡ」は短鎖干渉ＲＮＡによる処理を行わなかったことを示し、「ｓｉＣｔｒｌ」は陰性コントロールの短鎖干渉ＲＮＡを意味する。（実施例１） ＧＬＤＣ遺伝子の高発現が認められたがん細胞株Ａ５４９におけるＧＬＤＣ遺伝子およびＭＴＨＦＤ２遺伝子のダブルノックダウンによる該がん細胞株の細胞増殖への影響を検討した結果を示す図である。細胞増殖の測定は、１０％　ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地で細胞を培養することにより行った。本培地はグリシンを１３３　μＭ以上含有する。ＧＬＤＣ遺伝子およびＭＴＨＦＤ２遺伝子のダブルノックダウンは、ＧＬＤＣ遺伝子の短鎖干渉ＲＮＡ（図中、ｓｉＧＬＤＣまたはｓｉＧと表示する）およびＭＴＨＦＤ２遺伝子の短鎖干渉ＲＮＡ（図中、ｓｉＭＴＨＦＤ２またはｓｉＭと表示する）を用いて行った。図中、「ｓｉＣ」は陰性コントロールの短鎖干渉ＲＮＡを意味する。また、下向き矢印は、ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンにより細胞増殖が低下したことを示す。（実施例２） 様々な細胞株についてＧＬＤＣ遺伝子のコピー数（ｃｏｐｙ　ｎｕｍｂｅｒ）を解析した結果を示す図である。（実施例３） ＭＴＨＦＤ２遺伝子のショートヘアピンＲＮＡ（以下、ｓｈＲＮＡと略称する）を安定的に発現させたがん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｌｕｃの３つのクロン（Ｍ１２、Ｍ１３、およびＭ１８）におけるＭＴＨＦＤ２遺伝子の発現を、ＭＴＨＦＤ２タンパク質の定量分析により検討した結果を示す図である。図中、「ｓｈＭＴＨＦＤ２」はＭＴＨＦＤ２遺伝子のｓｈＲＮＡを示し、「ｓｈＣｔｒｌ」はコントロールｓｈＲＮＡを示す。β－アクチン（β－ａｃｔｉｎ）をウエスタンブロット法におけるローディングコントロールとして測定した。（実施例４） ＭＴＨＦＤ２遺伝子のｓｈＲＮＡを安定的に発現させたがん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｌｕｃの３つのクロン（Ｍ１２、Ｍ１３、およびＭ１８）の、グリシン　１００　μＭ存在下（Ｇｌｙ（１００））およびグリシン非存在下（Ｇｌｙ（－））での細胞増殖を示す図である。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｌｕｃクロンは、再播種後３日目に細胞増殖を測定した。図の縦軸は、細胞増殖の程度を示すＡＴＰ量を示す。図中、「ｓｈＣｔｒｌ」はコントロールｓｈＲＮＡを意味する。（実施例４） ＭＴＨＦＤ２遺伝子のｓｈＲＮＡを安定的に発現させたがん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｌｕｃの３つのクロン（Ｍ１２、Ｍ１３、およびＭ１８）を移植したゼノグラフトモデルマウスにおいて、腫瘍増殖を検討した結果を示す図である。図中、「ｓｈＭＴＨＦＤ２」はＭＴＨＦＤ２遺伝子のｓｈＲＮＡを意味し、「ｓｈＣｔｒｌ」はコントロールｓｈＲＮＡを意味する。図の縦軸は腫瘍体積を示し、横軸はがん細胞クロン移植後の日数を示す。（実施例４）
　本発明はＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を予測する方法に関し、本方法は被験者由来の生物学的試料中のＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物をＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性の指標として解析することを特徴とする。
　本発明において「被験者」とは、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を予測する方法による検査を受けるヒトおよびヒト以外の哺乳動物を意味する。例えば、ＭＴＨＦＤ２阻害薬による治療効果が期待される疾患に罹患したヒトおよびヒト以外の哺乳動物を意味する。ＭＴＨＦＤ２阻害薬による治療効果が期待される疾患として、がん疾患を好ましく例示できる。ヒト以外の哺乳動物は、哺乳動物として類別される生物であればいかなる生物であってもよく、例えばサル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、等を含む。
　本発明における「被験者」として、がん疾患を疑われたヒトおよびヒト以外の哺乳動物、およびがん疾患と診断されたヒトおよびヒト以外の哺乳動物を好ましく例示できる。
　がん疾患とは、生体内において「腫瘍」または「がん」の発生が認められる疾患を意味する。「腫瘍」または「がん」は、増殖および／または転移が認められるものを含む。また、「腫瘍」または「がん」は、がん疾患の治療後に再発したものを含む。
　本発明において、腫瘍、悪性腫瘍、がん、悪性新生物、がん腫、肉腫等を総称して、「腫瘍」または「がん」と表現する。
　「がん」は、一般的には、狭義の悪性腫瘍を意味し、悪性腫瘍の中で上皮細胞から発生するものを指す。一方、非上皮性の悪性腫瘍を肉腫と呼ぶ。「悪性腫瘍」とは、組織や細胞が生体内の制御に反して自律的に過剰に増殖することによって形成される組織塊腫瘍の中で、特に浸潤性を有し、増殖・転移する等悪性を示すものをいう。がんは病理組織学的な分類では、腺がん、扁平上皮がん、移行上皮がんの３種類に分類できる。腺がんは、腺組織に由来するがんであり、大腸がん、乳がん、胃がん、肺がん、胆嚢がん、腎臓がん、前立腺がん、十二指腸がん、膵臓がん、卵巣がん、子宮頚部がん、子宮体部がん等を例示できる。扁平上皮がんは、上皮の基底細胞が悪性化し、異型性、多形成を増し、上皮下結合組織中で増殖して形成された腫瘍であり、口腔がん、舌がん、咽頭、食道がん、気管支がん、喉頭がん等を例示できる。移行上皮がんは、移行上皮組織に由来するがんであり、膀胱がん、腎盂がん、尿管がん、口腔がんを例示できる。一方、肉腫には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、悪性リンパ腫等がある。
　本明細書において「生物学的試料」は、個体から単離された組織、液体、細胞、およびそれらの混合物をいい、例えば腫瘍生検、髄液、胸腔内液、腹腔内液、リンパ液、皮膚切片、血液、尿、糞便、痰、呼吸器、腸管、尿生殖器管、唾液、乳、消化器官、およびこれらから採取された細胞を挙げることができるが、遺伝子発現解析が可能である限りにおいて特に限定されない。「生物学的試料」は、例えば、がん疾患の治療目的で行われた手術の際に得られた切除組織の一部、がん疾患を疑われた対象者から生検等によって採取された組織の一部、あるいは胸腔内液や腹腔内液に由来する細胞を好ましく例示できる。
　生物学的試料は、個体から単離された組織、液体、細胞、およびそれらの混合物等から調製したタンパク質抽出液や核酸抽出液であっても良い。タンパク質抽出液や核酸抽出液の調製は、自体公知のタンパク質調製法や核酸調製法を利用して実施できる。
　生物学的試料は、ＭＴＨＦＤ２阻害薬による治療を行う前に採取された生物学的試料が好ましい。このような生物学的試料を使用することにより、ＭＴＨＦＤ２阻害薬による治療を実施する前にＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する感受性予測が可能になり、その結果、被験者に対してＭＴＨＦＤ２阻害薬を含む治療を適用するか否かの判定、すなわち、ＭＴＨＦＤ２阻害薬を含む治療を適用する被験者の選別を実施することができる。
　ＭＴＨＦＤ２は、葉酸代謝に係る酵素であるＭＴＨＦＤのアイソフォームの１つである。ＭＴＨＦＤ２は、ミトコンドリアに存在する二機能性酵素であり、ミトコンドリア内で、ＮＡＤ＋依存性メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ反応およびメテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドラーゼ反応の触媒作用を有し、急速ながん細胞増殖との関連が報告された代謝系であるミトコンドリアにおける１炭素代謝に関連する（非特許文献１）。そのため、ＭＴＨＦＤ２の作用を阻害することにより、がん細胞の急速な細胞増殖を抑制し得ると考えることができる。
　本明細書において「ＭＴＨＦＤ２阻害薬」とは、ＭＴＨＦＤ２遺伝子またはその遺伝子産物を標的とする薬剤であって、ＭＴＨＦＤ２遺伝子の発現、すなわちＭＴＨＦＤ２遺伝子の転写やＭＴＨＦＤ２　ｍＲＮＡの翻訳、並びにＭＴＨＦＤ２タンパク質の作用等を阻害することにより、細胞や生体におけるＭＴＨＦＤ２遺伝子またはその遺伝子産物の機能やその生理学的作用を抑制する薬剤をいう。かかる薬剤として、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡ等の低ＲＮＡ分子、アプタマー、リポザイム、抗体、または低分子化合物を挙げることができるが、これらに限定されず、ＭＴＨＦＤ２遺伝子またはその遺伝子産物の機能やその生理学的作用を抑制する物質であればいずれの物質であってもよい。
　本明細書において「ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性」とは、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する感受性と言い換えることができる。例えば、「ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性」とは、ＭＴＨＦＤ２阻害薬によるがん細胞の増殖抑制や細胞死、並びに該阻害薬によるがん疾患治療におけるがんの縮小や消滅あるいはがん疾患の寛解や部分寛解が認められることを意味する。「ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性の指標とする」とは、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を評価するマーカーとして使用することをいう。
　ＧＬＤＣはミトコンドリアに局在するグリシン開裂系を構成する分子の１つであり、グリシン代謝酵素である。
　ＧＬＤＣ遺伝子の塩基配列および該遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列は既に報告されている。ヒトＧＬＤＣ遺伝子の塩基配列および該遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列として、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＮＭ＿０００１７０（ＶＥＲＳＩＯＮ：ＮＭ＿０００１７０．２　ＧＩ：１０８７７３８００）で登録されているｍＲＮＡの塩基配列および該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を例示でき、これら配列を配列表の配列番号１および２に記載する。ＧＬＤＣ遺伝子は、例示した塩基配列からなるものだけでなく、ＧＬＤＣと生物学的機能が同等であるタンパク質、例えばホモログやスプライスバリアント等の同族体、変異体、および誘導体をコードするものであってもよい。また、ＧＬＤＣタンパク質は、例示したアミノ酸配列からなるものだけでなく、同等の生物学的機能を有するタンパク質、例えばホモログやスプライスバリアント等の同族体、変異体、および誘導体であってもよい。
　本明細書において「遺伝子」とは、リボ核酸（ＲＮＡ）やデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）等の核酸の塩基配列によって示される遺伝情報をいう。核酸はヌクレオチド単位からなる高分子ポリマーである。本明細書において、１００以上のヌクレオチドが結合されてなる高分子ポリマーを「ポリヌクレオチド」、５～９９のヌクレオチドが結合されてなる高分子ポリマーを「オリゴヌクレオチド」という。「遺伝子」というときは、タンパク質をコードするものだけでなく、ＲＮＡやＤＮＡとして機能するものも含む。「ＲＮＡ」とは、１本鎖ＲＮＡだけでなく、これに相補的な配列を有する１本鎖ＲＮＡやこれらから構成される２本鎖ＲＮＡであってもよい。
　本明細書において「遺伝子発現」（単に発現と表記する場合もある）とは、遺伝子情報がｍＲＮＡに転写され、次いで、タンパク質に翻訳されて細胞の構造および機能として生体内で作用を示すことをいう。また、「発現量」とは、遺伝子発現の過程において生じる産物、例えば転写産物であるｍＲＮＡや翻訳産物であるタンパク質の量をいう。
　本発明に係るＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を予測する方法は、被験者由来の生物学的試料中に含まれるＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物の発現を測定し、該遺伝子またはその遺伝子産物の発現が検出され、かつ、該遺伝子またはその遺伝子産物の発現量が予め設定した基準値よりも低い試料は、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を有する被験者由来の試料であると予測することを含む。
　生物学的試料中のＧＬＤＣ遺伝子の発現の解析は、具体的には、例えば、測定対象の遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ量を測定するか、または測定対象の遺伝子産物であるタンパク質量を測定することにより実施することができる。
　ｍＲＮＡ量を測定する方法としては、公知の遺伝子発現検出方法を用いることができる。例えば、ノザンブロッティング法、ドットブロット法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、定量ＲＴ－ＰＣＴ、ハイブリダイゼーション法、およびＤＮＡアレイ法等の数々の分子生物学的手法を使用してｍＲＮＡ量の測定を実施できる。また、測定対象の遺伝子に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドをプローブとして用いて公知の方法でｍＲＮＡ量の測定を実施できる。例えば、プローブを作製する際に当該プローブに適宜蛍光標識等の標識を結合させておき、これを生物学的試料から単離・精製したｍＲＮＡまたは該ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡとハイブリダイズする。その後、ハイブリダイズしたプローブに由来する蛍光強度を測定することにより、測定対象の遺伝子のｍＲＮＡ量を検出することができる。なお、プローブは、ガラスビーズやガラス基板等の支持体に固定化して使用することもできる。すなわち、プローブは、測定対象の遺伝子について作製したプローブを支持体上に固定化したＤＮＡアレイまたはＤＮＡチップの形で用いることもできる。支持体としては、ポリヌクレオチドを固定できるものであれば特に限定されるものではなく、どのような形状や材質であっても良い。支持体として、一般的には、例えば、ガラス板、シリコンウエハ、樹脂等の無機素材、また天然高分子材料としてニトロセルロースや合成高分子材料としてナイロン等を挙げることができる。ＤＮＡチップやＤＮＡアレイは市販のものを使用することができる。支持体上に固定するポリヌクレオチドは、合成オリゴヌクレオチドであっても良い。合成オリゴヌクレオチドの配列上に蛍光標識が可能な核酸誘導体を導入することも可能である。また、支持体上で目的のオリゴヌクレオチドを合成できるアフィメトリックス型のＤＮＡチップ技術、および、合成したＤＮＡ断片をＤＮＡプローブとしてスポッティングすることにより固定するスタンフォード型のＤＮＡチップ技術のいずれも用いることができる。さらに、支持体が３次元構造をした３Ｄ－Ｇｅｎｅ型（東レ株式会社製）の柱状の面に所望のポリヌクレオチドをスポットして固定化することもできる。なお、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、４２℃で１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ　クエン酸ナトリウム）、０．１％の硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）を含む緩衝液による４２℃での洗浄処理によってもハイブリダイズを維持することを意味する。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば種々の要素を組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
　ＧＬＤＣ遺伝子に由来するｍＲＮＡやｃＤＮＡを定量的に検出するためのプローブおよびプライマーセットは、該ｍＲＮＡやｃＤＮＡを特異的に検出することができる限りにおいて特に限定されないが、１２～２６ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが好ましい。このようなプローブおよびプライマーセットは、測定対象の遺伝子の塩基配列情報に基づいて適宜設計でき、そして、決定した配列を有するオリゴヌクレオチドを、例えば、ＤＮＡ合成機等を用いて常法に従って合成することができる。また、市販されている遺伝子検出用のプライマーやプローブから所望のものを選択して利用することもできる。
　ＧＬＤＣ　ｍＲＮＡを定量的に検出するためのプライマーセットとして、下記３種類のプライマーセットを例示できる。プライマーセット１は、配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせからなる。プライマーセット２は、配列番号５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせからなる。プライマーセット３は、配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせからなる。プライマーセット１は、配列番号１に記載のＧＬＤＣ　ｍＲＮＡの第２４２８番目から第２５９５番目までの３´末端側の部分塩基配列を増幅するものである。プライマーセット２は、配列番号１に記載のＧＬＤＣ　ｍＲＮＡの第３６４番目から第４７９番目までの５´末端側の部分塩基配列を増幅するものである。プライマーセット３は、配列番号１に記載のＧＬＤＣ　ｍＲＮＡの第６３５番目から第７４３番目までの５´末端側の部分塩基配列を増幅するものである。
　ＧＬＤＣタンパク質を定量的に測定する方法としては、公知のタンパク質測定法を用いることができる。例えば、ＧＬＤＣタンパク質に対する抗体を使用した各種の方法を適用できる。具体的には、ウエスタンブロット法、酵素免疫固相法（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）、および放射免疫測定法（Ｒａｄｉｏ　ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ；ＲＩＡ）等を挙げることができる。
　なお、ＧＬＤＣタンパク質に対する抗体は、ＧＬＤＣタンパク質を抗原とするものであって、当該抗原に特異的に結合する限り、ヒト型抗体、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体等を適宜用いることができる。抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であっても良いが、均質な抗体を安定的に生産できる点で、モノクローナル抗体が好ましい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、当業者に周知の方法により作製できる。また、市販されている抗体から所望の抗体を選択して利用することもできる。
　モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、目的の抗原や目的の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用し、これを通常の免疫方法に従って所望の動物に免疫して得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって既知の親細胞と融合させた後、通常のスクリーニング方法で所望のモノクローナル抗体産生細胞（ハイブリドーマ細胞）を選別することにより作製できる。ハイブリドーマの作製は、例えば、ミルステインらの方法（「メソッズ　オブ　エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、１９８１年、第７３巻、ｐ．３－４６）等に準じて実施できる。
　ここで、モノクローナル抗体を作製する際には、ＧＬＤＣタンパク質やその断片を抗原として使用することができる。なお、ＧＬＤＣタンパク質やその断片は、例えばサムブルック等編，「モレキュラークローニング　ア　ラボラトリーマニュアル」、第２版、第１－３巻、コールド＿スプリング＿ハーバー＿ラボラトリー＿プレス出版、ニューヨーク１９８９年等の成書に記載された方法に準じて、当業者であれば容易に取得できる。
　ＧＬＤＣタンパク質の定量のために、該タンパク質、その断片および抗体を支持体に固定して使用することもできる。支持体は、タンパク質を固定化できるものであれば限定されず、一般的には、ガラス板、シリコンウエハ、樹脂等の無機材料または天然高分子材料のニトロセルロースや合成高分子材料のナイロンやポリスチレン等を例示できる。
　本発明では、以上のようにして生物学的試料におけるＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物の発現量を測定した後、当該発現量に基づいてＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を予測する。具体的には、上述したいずれかの方法によりＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物の発現量を測定した後、当該遺伝子またはその遺伝子産物の発現量を評価する。生物学的試料においてＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物が検出され、かつその発現量が非常に低いとき、該生物学的試料を提供した被験者はＭＴＨＦＤ２阻害薬に対して反応性を有すると予測する。これに対し、生物学的試料においてＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物の発現量が高いか低いとき、該生物学的試料を提供した被験者はＭＴＨＦＤ２阻害薬に対して反応性がないと予測する。また、ＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物の発現が検出されない場合、このような生物学的試料を提供した被験者はＭＴＨＦＤ２阻害薬に対して反応性がないと予測する。
　ＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物の発現量に基づく反応性の予測は、予め基準値を設定し、この基準値と比較することによって行うことが好ましい。生物学的試料においてＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物が検出され、かつその発現量が基準値と比較して低ければ、該生物学的試料を提供した被験者はＭＴＨＦＤ２阻害薬に対して反応性を有すると予測する。これに対し、生物学的試料においてＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物が基準値と比較して高ければ、該生物学的試料を提供した被験者はＭＴＨＦＤ２阻害薬に対して反応性がないと予測する。また、ＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物の発現が検出されない場合、このような生物学的試料を提供した被験者はＭＴＨＦＤ２阻害薬に対して反応性がないと予測する。
　ＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物の発現量を評価する基準値は、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を示さない細胞における該遺伝子またはその遺伝子産物の発現を予め測定し、その定量値を参照して公知の統計手法により設定することができる。好ましくは、グリシンの存在下、例えば生理学的濃度のグリシンの存在下、より具体的には５０　μＭ～２００　μＭ、好ましくは１００　μＭのグリシンの存在下でＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を示さない細胞におけるＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物の発現量に基づいて基準値を設定することが適当である。さらに好ましくは、グリシンの存在下でＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を示さない細胞であって、ＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物を低発現している細胞におけるＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物の発現量に基づいて基準値を設定することが適当である。ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を示さず、かつ、ＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物が高発現である細胞としてがん細胞株Ａ５４９を例示できる。ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を示さず、かつ、ＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物が低発現である細胞としてがん細胞株ＮＣＩ－Ｈ１９７５を例示できる。がん細胞株ＮＣＩ－Ｈ１９７５におけるＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物の発現量を基準値とすることがより好ましい。
　本発明に係るＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を予測する方法はまた、被験者由来の生物学的試料中に含まれるＧＬＤＣ遺伝子の発現を、該遺伝子の遺伝子型の解析により評価することで実施できる。ＧＬＤＣ遺伝子の遺伝子型の解析によりヘテロ欠損が検出された生物学的試料ではＧＬＤＣ　ＤＮＡのコピー数が低下するため、該遺伝子の発現が低下していると考えることができる。すなわち、被験者由来の生物学的試料中に含まれるＧＬＤＣ遺伝子の遺伝子型を解析し、該遺伝子のヘテロ欠損が検出された生物学的試料は、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に反応性を有する被験者由来の生物学的試料であると予測することができる。
　ＧＬＤＣ遺伝子の遺伝子型の解析には、公知の方法をいずれも使用できる。例えば、遺伝子型の解析は、ＧＬＤＣ　ＤＮＡのコピー数変化（ｃｏｐｙ　ｎｕｍｂｅｒ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ；ＣＮＶ）を検出することによって実施できる。ＣＮＶとは、染色体上の１ｋｂ以上にわたるゲノムＤＮＡが、正常ヒト体細胞、すなわちディプロイドゲノムでは２コピーであるものが、１コピー以下、あるいは３コピー以上となっている現象をいう。遺伝子コピー数が１コピー以下であるときには、ゲノムＤＮＡが欠失しており、３コピー以上であるときにはゲノムＤＮＡが重複していると考えることができる。一般的に、遺伝子発現量とＣＮＶの相関が認められる遺伝子は少数であることが知られているが、後述する実施例に示すように、ＧＬＤＣ遺伝子の発現とＣＮＶとの間で相関が認められた。具体的には、ＧＬＤＣ遺伝子の発現がｍＲＮＡレベルでもタンパク質レベルでも非常に低いがん細胞株であり、かつ、ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンによる細胞増殖低下を示したＭＤＡ－ＭＢ－２３１では、ＧＬＤＣ　ＤＮＡのコピー数が１コピー以下であった。したがって、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のゲノムＧＬＤＣ遺伝子はヘテロ欠損であり、また、ＧＬＤＣ遺伝子のヘテロ欠損細胞株では該遺伝子の発現が低下していると考えることができる。
　本発明において生物学的試料を用いてＧＬＤＣ　ＤＮＡのＣＮＶの検出を行い、ＧＬＤＣ　ＤＮＡのコピー数が１以下であるとき、該生物学的試料を提供した被験者はＭＴＨＦＤ２阻害薬に対して反応性を有すると評価できる。
　ＣＮＶの検出は公知の方法を利用して実施でき、このような方法として具体的には、アレイ　ＣＧＨ法、一塩基多型（ＳＮＰ）　アレイ法、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ｑＰＣＲ）法、マルチプレックス　ライゲーション－ディペンデント　プローブ　アンプリフィケーション法等を挙げることができる。
　本発明は、また、前記予測方法を使用することを特徴とする、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を有する被験者の選別方法に関する。さらに本発明は、前記予測方法により選別された被験者にＭＴＨＦＤ２阻害薬の有効量を投与することを含む疾患治療方法に関する。
　本発明に係るＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を有する被験者の選別方法は、被験者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中に含まれるＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物の発現を測定し、該遺伝子またはその遺伝子産物の発現が検出され、かつ、該遺伝子またはその遺伝子産物の発現量が予め設定した基準値よりも低い生物学的試料を提供した被験者を、ＭＴＨＦＤ２阻害薬による疾患治療の対象として選別することを含む。
　本発明に係るＭＴＨＦＤ２阻害薬に疾患治療方法は、被験者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中に含まれるＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物の発現を測定し、該遺伝子またはその遺伝子産物の発現が検出され、かつ、該遺伝子またはその遺伝子産物の発現量が予め設定した基準値よりも低い生物学的試料を提供した被験者を、ＭＴＨＦＤ２阻害薬による疾患治療の対象として選別し、該選別された患者に、ＭＴＨＦＤ２阻害薬の治療有効量を投与することを含む。
　本発明に係る方法を適用できる疾患は、ＭＴＨＦＤ２阻害薬により治療効果が得られる疾患である限りにおいていずれでもよく、がん疾患を好ましい疾患として例示できる。がん疾患は、いずれのがん疾患であってもよい。本発明に係る方法を適用できるがん疾患として、具体的には、大腸がん、肝臓がん、皮膚がん、肺がん、腎臓がん、前立腺がん、十二指腸がん、卵巣がん、子宮体がん、子宮頚がん、胆嚢がん、膵臓がん、乳がん、胃がん、口腔がん、舌がん、咽頭、食道がん、気管支がん、喉頭がん、膀胱がん、腎盂がん、尿管がん、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、悪性リンパ腫等が発生する疾患を例示できる。
　本発明に係る方法で、ＭＴＨＦＤ２阻害薬による疾患治療に反応性を有するとして選別された被験者は、ＭＴＨＦＤ２阻害薬の治療有効量の投与による治療効果が得られると考えることができる。例えば、がん疾患では、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に反応性を有するとして選別された被験者は、ＭＴＨＦＤ２阻害薬の治療有効量の投与により、腫瘍細胞の増殖の抑制や細胞死が誘導され、腫瘍の縮小や消滅あるいはがん疾患の寛解や部分寛解が生じると考えることができる。
　ＭＴＨＦＤ２阻害薬は、それ自体またはそれを含む組成物として被験者に投与される。当該組成物は、有効成分のほか、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、希釈剤、賦形剤等の医薬用担体を１種または２種以上含有する医薬組成物として製造される。医薬組成物中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択されるが、通常約０．００００１～７０重量％、好ましくは０．０００１～５重量％程度の範囲とするのが適当である。
　用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等に応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ～１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ～１ｍｇ程度の範囲である。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を使用してこれらの用量を変更できる。上記投与量は１日１回～数回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与してもよい。
　投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択できる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内等への投与が挙げられる。あるいは経口経路で投与できる。さらに、経粘膜投与または経皮投与も実施できる。また、腫瘍内への直接投与も可能である。
　投与形態は、各種の形態が目的に応じて選択できる。その代表的なものは、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リポソーム製剤、シクロデキストリン等の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらはさらに投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。
　本発明に係るＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を予測する方法によれば、ＭＴＨＦＤ２阻害薬による治療前に、被験者から採取した生物学的試料を用いた遺伝子発現解析、例えばｍＲＮＡレベルあるいはタンパク質レベルの発現解析により、ＭＴＨＦＤ２阻害薬投与による患者の反応性、すなわち該阻害薬による治療効果をより客観的、特異的に予測することができる。したがって、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性がなく、その投与効果を期待できない患者への過度の負担となるような薬剤投与を防止することができ、当該患者にとって有効な治療方針の知見を提供することができる。
　以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
　まず、実施例で用いた細胞株を表１に示す。
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　ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性とがん細胞株におけるＧＬＤＣ遺伝子の発現レベルとの関連性を検討するために、ＧＬＤＣ遺伝子の発現レベルが異なるがん細胞株を使用し、ＭＴＨＦＤ２遺伝子のノックダウンによる細胞増殖への影響を測定した。
　その結果、ＧＬＤＣ遺伝子の発現が非常に低いがん細胞株で、ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンにより細胞増殖が強く阻害された。一方、ＧＬＤＣ遺伝子の高発現細胞株、中等度発現細胞株、および非発現細胞株では、ＭＴＨＦＤ２遺伝子をノックダウンしても細胞増殖は阻害されなかった。したがって、ＧＬＤＣ遺伝子の発現が非常に低いがん細胞は、ＭＴＨＦＤ２を阻害する薬剤に対する反応性を有すると考えることができる。以下に、本実施例をより具体的に説明する。
１－１．各細胞株におけるＧＬＤＣ遺伝子のｍＲＮＡレベルでの発現解析　１
　まず、検討に使用した細胞株におけるＧＬＤＣ　ｍＲＮＡの定量分析を行った。具体的には、ＲＮイージー　ミニ　キット（ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて各細胞（Ａ５４９、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＢｘＰＣ３、ＮＣＩ－Ｈ２３４７、ＮＣＩ－Ｈ１９７５）からｍＲＮＡを抽出し、ハイキャパシティー　ｃＤＮＡ　リバース　トランスクリプション　キット（Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ　ｃＤＮＡ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔ；Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてｃＤＮＡを調製した。調製した各細胞のｃＤＮＡおよびＧＬＤＣ、リボゾーマル　プロテイン　ラージ　Ｐ０（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ｌａｒｇｅ，Ｐ０；以下、ＲＰＬＰ０と略称する）に対するタックマンプローブ（Ｔａｑｍａｎ　ｐｒｏｂｅ；Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）をタックマン　ファスト　アドバンスト　マスター　ミックス（Ｔａｑｍａｎ　Ｆａｓｔ　ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ；Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）と混合し、ヴィイア７（Ｖｉｉａ７；Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にてＰＣＲを行い、デルタデルタＣｔ法によりｍＲＮＡを定量した。タックマンプローブは、タックマン（登録商標）　ジーン　エクスプレッション　アッセイズ（Ｔａｑｍａｎ（Ｒ）　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙｓ；Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。ＲＰＬＰ０およびＧＬＤＣの解析には、それぞれアッセイＩＤ：Ｈｓ９９９９９９０２＿ｍ１およびアッセイＩＤ：ｓ０１５８０５９１＿ｍ１のタックマンプローブを用いた。
　ＧＬＤＣ遺伝子の各細胞株（Ａ５４９、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＢｘＰＣ３、ＮＣＩ－Ｈ２３４７、ＮＣＩ－Ｈ１９７５）における発現を、ＧＬＤＣ　ｍＲＮＡの定量分析により検討した結果を図１に示す。各細胞株におけるＧＬＤＣ　ｍＲＮＡ発現は、Ａ５４９で検出されたＧＬＤＣ　ｍＲＮＡ発現量に対する相対的発現量として表した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＢｘＰＣ３、ＮＣＩ－Ｈ２３４７、ＮＣＩ－Ｈ１９７５の各細胞株の全てにおいて、ＧＬＤＣ　ｍＲＮＡの発現が認められたが、その発現量はＡ５４９と比較して低いことが判明した。
１－２．各細胞株におけるＧＬＤＣ遺伝子のタンパク質レベルでの発現解析
　検討に使用した細胞株におけるＧＬＤＣタンパク質の定量分析を行った。具体的には、ＲＩＰＡ　バッファー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて各細胞（Ａ５４９、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＢｘＰＣ３、ＮＣＩ－Ｈ２３４７、ＮＣＩ－Ｈ１９７５）の細胞溶解液を調製し、ウエスタンブロット法により、ＧＬＤＣおよびβ－アクチンタンパク質を検出した。ウエスタンブロット法は、抗ＧＬＤＣ抗体（Ａｂｃａｍ社製、ａｂ９７６２５）、抗β－アクチン抗体（ｓａｎｔａ　ｃｒｕｚ社製、ｓｃ－６９８７９）を用いて、従来報告されている方法に準じて実施した。ＧＬＤＣタンパク質のバンド位置の確認は、Ａ５４９細胞をＧＬＤＣ遺伝子の短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）で処理して該遺伝子の発現を阻害することによる該バンドの消失の検出により行った。
　ＧＬＤＣ遺伝子の各細胞株（ＨＥＫ２９３、ＮＣＩ－Ｈ１９７５、ＬＵＤＬＵ－１、ＢｘＰＣ３、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＮＣＩ－Ｈ２３４７、ＡｓＰＣ－１、ＨＥＣ５０Ｂ）における発現を、ＧＬＤＣタンパク質の定量分析により検討した結果を図２に示す。検討したすべての細胞株で、ＧＬＤＣタンパク質が検出されたが、Ａ５４９における発現量と比較して、他の４種類の細胞株での発現は低かった。具体的には、ＮＣＩ－Ｈ１９７５での発現は中等度であり、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＮＣＩ－Ｈ２３４７での発現は非常に低かった。
１－３．各細胞株におけるＧＬＤＣ遺伝子のｍＲＮＡレベルでの発現解析　２
　検討に使用した細胞株におけるＧＬＤＣ　ｍＲＮＡの定量分析を行った。具体的には、ＲＮイージー　ミニ　キット（ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて各細胞（ＨＥＫ２９３、ＮＣＩ－Ｈ１９７５、ＬＵＤＬＵ－１、ＢｘＰＣ３、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＮＣＩ－Ｈ２３４７、ＡｓＰＣ－１、ＨＥＣ５０Ｂ）からｍＲＮＡを抽出し、ハイキャパシティー　ｃＤＮＡ　リバース　トランスクリプション　キット（Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ　ｃＤＮＡ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔ；Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてｃＤＮＡを調製した。その後、各細胞のｃＤＮＡ、後述の３種のプライマー　セット（ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｔ）をファスト　ＳＹＢＲＲ　グリーン　マスター　ミックス（Ｆａｓｔ　ＳＹＢＲＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）と混合し、Ｖｉｉａ７（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にてＰＣＲを行い、デルタデルタＣｔ法によりｍＲＮＡを定量した。
　使用した３種類のプライマーセットはＧＬＤＣ　ｍＲＮＡ（配列番号１）の塩基配列に基づいて作成したプライマーセットである。プライマーセット１は、ＧＬＤＣ　ｍＲＮＡ（配列番号１）の第２４２８番目から第２５９５番目までの３´末端側の部分塩基配列を増幅するものである。プライマーセット２は、ＧＬＤＣ　ｍＲＮＡ（配列番号１）の第３６４番目から第４７９番目までの５´末端側の部分塩基配列を増幅するものである。プライマーセット３は、ＧＬＤＣ　ｍＲＮＡ（配列番号１）の第６３５番目から第７４３番目までの５´末端側の部分塩基配列を増幅するものである。
　各プライマーセットの塩基配列を以下に示す：
プライマー－１－フォワード：ｔｇａｔｇｔｃｔｃｇｃａｃｃｔａａａｔｃｔｔｃａｃ（配列番号３）
　プライマー－１－リバース：ｃｔｇａｃｇｇｔｔｃｃｃａｃａｇｇａｃａ（配列番号４）
　プライマー－２－フォワード：ｇｃｃｃａｇａｃａｃｇａｃｇａｃｔｔ（配列番号５）
　プライマー－２－リバース：ｇｇａｃｃｇｔｃｔｔｃｔｃｇａｔｃａａｔ（配列番号６）
　プライマー－３－フォワード：ｔｔｇｃｇｇａａｃｔｔａｃｔｇｇａｇａａｃ（配列番号７）
　プライマー－３－リバース：ａｃａｃｃａｔｇｇｔｃｔｇｇｔａｇｔｔｇａｇｔ（配列番号８）
　ＧＬＤＣ遺伝子の各細胞株（ＨＥＫ２９３、ＮＣＩ－Ｈ１９７５、ＬＵＤＬＵ－１、ＢｘＰＣ３、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＮＣＩ－Ｈ２３４７、ＡｓＰＣ－１、ＨＥＣ５０Ｂ）における発現を、上記プライマーセットを用いてＧＬＤＣ　ｍＲＮＡを定量することにより測定した結果を図３に示す。各細胞株におけるＧＬＤＣ　ｍＲＮＡ発現は、ＨＥＫ２９３で検出されたＧＬＤＣ　ｍＲＮＡ発現量に対する相対的発現量として表した。ＨＥＫ２９３、ＬＵＤＬＵ－１、ＮＣＩ－Ｈ２３４７、ＡｓＰＣ－１、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＮＣＩ－Ｈ１９７５、ＢｘＰＣ３の各細胞株において、ＧＬＤＣ　ｍＲＮＡの発現が認められたが、ＨＥＣ５０Ｂでは、ＧＬＤＣ　ｍＲＮＡは検出されなかった（図中、ｎ．ｄ．と表示する）。また、ＧＬＤＣ　ｍＲＮＡの発現が認められた細胞株であっても、ＬＵＤＬＵ－１、ＮＣＩ－Ｈ１９７５、およびＢｘＰＣ３で検出されたＧＬＤＣ　ｍＲＮＡの発現量は中等度であり、さらにＮＣＩ－Ｈ２３４７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、およびＡｓＰＣ－１における発現は非常に低いことが判明した。
１－４．ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウン実験　１
　ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウン実験は、Ａ５４９、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、およびＮＣＩ－Ｈ２３４７を用いて行った。具体的には、各細胞を細胞数２ｘ１０５／ウェルで６ウェル　プレートに播種し、翌日にｓｉＲＮＡをトランスフェクション試薬（リポフェクトアミン（登録商標）　ＲＮＡｉマックス（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｒ）　ＲＮＡｉＭａｘ））を用いてトランスフェクションした。その翌日に細胞数８００／ウェルで９６ウェル　プレートに再播種し、再播種の１日後および４日後にそれぞれ２回目および３回目のトランスフェクションを行なった。培地中のグリシン濃度の影響を調べるため、再播種の１日後、４日後、および６日後に培地交換を行った。再播種の当日（以下、０日後と称する）、１日後、４日後、６日後、および８日後にセルタイターＧｌｏ　ルミネッセント　セル　バイアビリティ　アッセイ（Ｃｅｌｌ　ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて細胞内ＡＴＰ量の測定を行い、細胞増殖を定量した。初回播種時および再播種時にはＲＰＭＩ培地にウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ社製（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を最終濃度１０％となるように添加して使用した。また、培地交換時にはＭＥＭ培地に透析済みウシ胎児血清（ＳＡＦＣ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を最終濃度１０％となるように添加し、さらにＬ－セリンを最終濃度４００　μＭとなるように添加し、そしてグリシンを最終濃度０もしくは１００　μＭとなるように添加して使用した。
　ノックダウンレベルを確認するため、再播種時に余った細胞を６ウェル　プレートに播種し、翌日にＲＩＰＡ　バッファーを用いて細胞溶解液を調製し、ウエスタンブロット法により、ＭＴＨＦＤ２、ＧＬＤＣ、およびβ－アクチンの各タンパク質を検出した。抗体は、それぞれ抗ＭＴＨＦＤ２抗体（Ａｂｃａｍ社製、ａｂ５６７７２）、抗ＧＬＤＣ抗体（Ｃｅｌｌ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製，＃１２７９４）、抗β－アクチン抗体（ｓａｎｔａ　ｃｒｕｚ社製、ｓｃ－６９８７９）を用いた。
　ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウン実験を、Ａ５４９、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、およびＮＣＩ－Ｈ２３４７を用いて行った結果を図４－Ａおよび図４－Ｂに示す。これら３種類の細胞において、グリシン非存在下ではＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンによる細胞増殖の低下が認められた（図４－Ａ）。しかし、グリシン存在下では、ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンにより、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＮＣＩ－Ｈ２３４７では細胞増殖の低下が認められたが、Ａ５４９の細胞増殖は影響を受けなかった（図４－Ａ）。これら細胞におけるＭＴＨＦＤ２遺伝子およびＧＬＤＣ遺伝子の発現をタンパク質レベルで測定したところ、ＭＴＨＦＤ２遺伝子の発現が各細胞においてｓｉＲＮＡによるノックダウンで低下していることが確認され、Ｃｅｌｌ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社の抗ＧＬＤＣ抗体（＃１２７９４）を用いて、今回の条件でウエスタンブロットを行なった場合は、ＧＬＤＣの発現はＡ５４９で認められるが、他の２種類の細胞ではＧＬＤＣの発現が検出されないことが明らかになった（図４－Ｂ）。
１－５．ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウン実験　２
　ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウン実験を、Ａ５４９、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＮＣＩ－Ｈ２３４７、およびＮＣＩ－Ｈ１９７５を用いて行った。具体的には、各細胞を細胞数２ｘ１０５／ウェルで６ウェル　プレートに播種し、翌日にｓｉＲＮＡをトランスフェクション試薬（リポフェクトアミン（登録商標）　ＲＮＡｉマックス（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｒ）　ＲＮＡｉＭａｘ））を用いてトランスフェクションした。その３日後に細胞数８００／ウェルで９６ウェル　プレートに再播種し、再播種の０日後、３日後、および７日後にそれぞれ２回目、３回目、および４回目のトランスフェクションを行なった。培地中のグリシン濃度の影響を調べるため、再播種の１日後、５日後、および８日後に培地交換を行った。再播種の０日後、１日後、３日後、５日後、７日後、および１０日後にセルタイターＧｌｏ　ルミネッセント　セル　バイアビリティ　アッセイ（Ｃｅｌｌ　ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて細胞内ＡＴＰ量の測定を行い、細胞増殖を定量した。初回播種および再播種時にはＲＰＭＩ培地にウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ社製（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を最終濃度１０％となるように添加して使用した。また、培地交換時にはＭＥＭ培地に透析済みウシ胎児血清（ＳＡＦＣ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を最終濃度１０％となるように添加し、さらにＬ－セリンを最終濃度４００　μＭとなるように添加し、そしてグリシンを最終濃度０もしくは１００　μＭとなるように添加して使用した。
　各細胞におけるＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンレベルの確認は、上記１－４．で説明した方法と同様の方法により行った。
　検討した細胞の細胞増殖へのＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンの影響を図５－Ａおよび図５－Ｂに示す。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＮＣＩ－Ｈ２３４７では、グリシン非存在下およびグリシン存在下の両条件下で、ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンによる細胞増殖の低下が認められた（図５－Ａの右パネルおよび図５－Ｂの左パネル）。一方、Ａ５４９およびＮＣＩ－Ｈ１９７５では、ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンにより、グリシン非存在下で細胞増殖の低下が認められたが、グリシン存在下では細胞増殖の低下は認められなかった（図５－Ａの左パネルおよび図５－Ｂの右パネル）。
　検討した細胞におけるＭＴＨＦＤ２遺伝子の発現をタンパク質レベルで測定したところ、ＭＴＨＦＤ２遺伝子の発現は、Ａ５４９、ＮＣＩ－Ｈ１９７５で高く、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＮＣＩ－Ｈ２３４７では比較的低いことが確認された（図５－Ｃ）。また、ＭＴＨＦＤ２遺伝子の発現が各細胞においてｓｉＲＮＡによるノックダウンで低下していることが明らかになった（図５－Ｃ）。
１－６．ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウン実験　３
　ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウン実験を、Ａ５４９およびＢＴ４７４を用いて行った。具体的には、Ａ５４９は５％　コンフルエント、ＢＴ４７４は２５％　コンフルエントとなるよう各細胞を１００　ｍｍ　ディッシュに播種し、翌日にＭＴＨＦＤ２　ｓｉＲＮＡをトランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭａｘ）を用いてトランスフェクションした。その２日後にＡ５４９は細胞数８００／ウェル、ＢＴ４７４は細胞数４０００／ウェルで９６ウェル　プレートに再播種し、同時に２回目のトランスフェクションを行なった。培地中のグリシン濃度の影響を調べるため、再播種の１日後に培地交換を行った。再播種の０日後、１日後、３日後、５日後、および７日後にセルタイターＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて細胞内ＡＴＰ量の測定を行い、細胞増殖を定量した。初回播種および再播種時にはＲＰＭＩ培地にウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ社製（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を最終濃度１０％となるように添加して使用した。また、培地交換時にはＭＥＭ培地に透析済みウシ胎児血清（ＳＡＦＣ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を最終濃度１０％となるように添加し、さらにＬ－セリンを最終濃度４００　μＭとなるように添加し、そしてグリシンを最終濃度０もしくは１００　μＭとなるように添加して使用した。
　ノックダウンレベルを確認するため、再播種時に余った細胞を１００　ｍｍ　ディッシュに播種し、２日後にＲＩＰＡ　バッファー（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用いて細胞溶解液を調製し、ウエスタンブロット法により、ＭＴＨＦＤ２、ＧＬＤＣ、β－アクチンタンパク質を検出した。抗体は、それぞれ抗ＭＴＨＦＤ２抗体（Ａｂｃａｍ社製）、抗ＧＬＤＣ抗体（Ｃｅｌｌ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製，＃１２７９４）、抗β－アクチン抗体（ｓａｎｔａ　ｃｒｕｚ社製）を用いた。
　ＢＴ４７４およびＡ５４９の細胞増殖へのＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンの影響を図６－Ａに示す。ＢＴ４７４では、グリシン非存在下および存在下のいずれにおいてもｓｉＲＮＡによるＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンで細胞増殖の低下が認められたが、その効果はグリシン存在下と比較してグリシン非存在下の方が高かった（図６－Ａ）。また、ＢＴ４７４でＭＴＨＦＤ２　ｓｉＲＮＡのトランスフェクションにより、ＭＴＨＦＤ２タンパク質の発現が阻害されたことが確認された（図６－Ｂ）。
１－７．ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウン実験　４
　ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウン実験を、Ａ５４９、ＨＥＣ５０Ｂ、およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１を用いて行った。具体的には、各細胞を細胞数１．５ｘ１０５／ウェルで６ウェル　プレートに播種し、翌日にｓｉＲＮＡをトランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭａｘ）を用いてトランスフェクションした。その翌日に細胞数８００／ウェルで９６ウェル　プレートに再播種し、再播種の１日後と４日後にそれぞれ２回目および３回目のトランスフェクションを行なった。培地中のグリシン濃度の影響を調べるため、再播種の２日後および５日後に培地交換を行った。再播種の１日後、４日後、６日後、および８日後にセルタイターＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて細胞内ＡＴＰ量の測定を行い、細胞増殖を定量した。初回播種時および再播種時にはＲＰＭＩ培地にウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ社製（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を最終濃度１０％となるように添加して使用した。また、培地交換時にはＭＥＭ培地に透析済みウシ胎児血清（ＳＡＦＣ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を最終濃度１０％となるように添加し、さらにＬ－セリンを最終濃度４００　μＭとなるように添加し、そしてグリシンを最終濃度０もしくは１００　μＭとなるように添加して使用した。
　ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウン実験の結果、ＨＥＣ５０ＢおよびＡ５４９では、グリシン非存在下でＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンによる細胞増殖の低下が認められたが、グリシン存在下では、細胞増殖の低下は認められなかった（図７）。一方、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１では、グリシン存在下および非存在下のいずれにおいても細胞増殖の低下が認められた（図７）。
　以上、説明したように、ＧＬＤＣ遺伝子の発現とＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンによる細胞増殖低下との間に関連性があることが明らかになった。すなわち、ＧＬＤＣ遺伝子の発現が非常に低いがん細胞株、例えばＮＣＩ－Ｈ２３４７、ＢＴ４７４、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１では、ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンにより細胞増殖低下が認められたが、ＧＬＤＣ遺伝子高発現細胞株であるＡ５４９、ＧＬＤＣ遺伝子非発現細胞株であるＨＥＣ５０Ｂ、およびＧＬＤＣ遺伝子中等度発現細胞株であるＮＣＩ－Ｈ１９７５ではＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンにより細胞増殖低下は認められなかった。この結果は、いずれもグリシン存在下の条件で認められた結果であり、グリシン非存在下では、ＧＬＤＣ遺伝子の発現の有無や工程に関わらず、ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンによる細胞増殖低下が認められた。
　ヒト健常人のグリシン血中濃度は数百μＭレベルであることが報告されている（非特許文献４）。また、ヒト大腸がんおよび胃がんのメタボロ解析データによれば、密度１として換算すると、組織中のグリシン濃度はｍＭオーダーであることが報告されている（非特許文献５）。マウスについても、グリシン血中濃度がヒト血中濃度と同レベルであることを本発明者らは確認している。さらに、Ａ５４９細胞をマウスに移植して形成させた腫瘍中のグリシン濃度はヒトと同じくｍＭオーダーであると推定された（密度１として換算）。また、インビトロで培養したＡ５４９細胞についても細胞内グリシン濃度はｍＭオーダーであると推定された（細胞１個の体積を長径から見積もり換算）。
　このように、生体内や腫瘍組織内でグリシン濃度が高いことから、インビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）でのがん細胞の挙動は、本実施例のグリシン存在下の条件における各細胞の挙動と相関すると考えることができる。したがって、ＧＬＤＣ遺伝子の発現が非常に低いがん細胞は、ＭＴＨＦＤ２を阻害する薬剤に対する反応性を有し、ＧＬＤＣ遺伝子高発現細胞株、中等度発現細胞株、および非発現細胞株では該反応性を有さないと考えることができる。
　ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性とがん細胞株におけるＧＬＤＣ遺伝子の発現レベルとの関連性をさらに検討するために、ＧＬＤＣ遺伝子の高発現が認められたＡ５４９細胞を用いてＧＬＤＣ遺伝子およびＭＴＨＦＤ２遺伝子のダブルノックダウンによる細胞増殖への影響を測定した。
　その結果、ＧＬＤＣ遺伝子の高発現が認められたＡ５４９細胞でＧＬＤＣ遺伝子をノックダウンして該遺伝子の発現を低下させると、ＭＴＨＦＤ２遺伝子のノックダウンによりグリシン存在下の細胞増殖が低下した。この結果は、実施例１で観察された結果、すなわちＧＬＤＣ遺伝子の発現が非常に低いがん細胞は、ＭＴＨＦＤ２を阻害する薬剤に対する反応性を有することを強く支持するものである。以下に、本実施例をより具体的に説明する。
　各細胞を細胞数３ｘ１０５／ウェルで２５　ｃｍ２　フラスコに播種し、翌日にｓｉＲＮＡをトランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭａｘ）を用いてトランスフェクションした。その３日後に細胞数１０００／ウェルで９６ウェル　プレートに再播種し、再播種の０日後と３日後にそれぞれ２回目および３回目のトランスフェクションを行なった。再播種の１日後および３日後に培地交換を行った。再播種の０日後、１日後、３日後、５日後、および７日後にセルタイターＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて細胞内ＡＴＰ量の測定を行い、細胞増殖を定量した。培地は、ＲＰＭＩ培地にウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ社製（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を最終濃度１０％となるように添加したものを使用した。この培地には、グリシンが１３３　μＭ以上含有されている。
　ノックダウンレベルを確認するため、再播種時に余った細胞をＲＩＰＡ　バッファー（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用いて細胞溶解液を調製し、ウエスタンブロット法により、ＭＴＨＦＤ２、ＧＬＤＣ、β－アクチンタンパク質を検出した。抗体は、それぞれ抗ＭＴＨＦＤ２抗体（Ａｂｃａｍ社製）、抗ＧＬＤＣ抗体（Ｃｅｌｌ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、＃１２７９４）、抗β－アクチン抗体（ｓａｎｔａ　ｃｒｕｚ社製）を用いた。
　ＧＬＤＣ遺伝子の高発現が認められたＡ５４９細胞を用いて、ＧＬＤＣ遺伝子およびＭＴＨＦＤ２遺伝子をダブルノックダウンした結果を図８に示す。ＭＴＨＦＤ２遺伝子のみをノックダウンしても、細胞増殖には全く影響は認められなかった（図８の左パネル）。また、ＧＬＤＣ遺伝子のノックダウンにより細胞増殖が低下した。一方、ＧＬＤＣ遺伝子およびＭＴＨＦＤ２遺伝子をダブルノックダウンすると、グリシン存在下の条件にも拘らず細胞増殖が著しく低下した（図８の右パネル）。
　本結果は、ＧＬＤＣ遺伝子の非常に低い発現とＭＴＨＦＤ２を阻害する薬剤に対する反応性とが関連することを、さらに支持するものである。
　実施例１および実施例２に示した代表的ながん細胞株の結果をまとめ、表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ＧＬＤＣ遺伝子の非常に低い発現とＭＴＨＦＤ２を阻害する薬剤に対する反応性とが関連することが判明したため、次に、ＧＬＤＣ遺伝子の発現を定量的に測定することを目的として、ＧＬＤＣゲノム遺伝子のコピー数解析を行った。
　その結果、検討した細胞株のうち、がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１におけるＧＬＤＣゲノム遺伝子のコピー数が１コピー以下であり、該がん細胞株のＧＬＤＣゲノム遺伝子はヘテロ欠損であることが明らかになった。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１はＭＴＨＦＤ２遺伝子のノックダウンにより細胞増殖低下を示し、かつ、ＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物の発現が非常に低いがん細胞株である。したがって、ＧＬＤＣ遺伝子のヘテロ欠損細胞株は、ＭＴＨＦＤ２の作用を阻害する薬剤に反応性があると考えることができる。以下に、本実施例をより具体的に説明する。
　ＧＬＤＣ遺伝子の遺伝子型の検討は、ＧＬＤＣ遺伝子のコピー数を解析することにより行った。具体的には、ＱＩＡａｍｐ　ＤＮＡ　ミニ　キット（ＱＩＡａｍｐ　ＤＮＡ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて各細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。その後、該ゲノムＤＮＡとタックマンプローブをタックマン　ジェノタイピング　マスター　ミックス（Ｔａｑｍａｎ　Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）と混合し、Ｖｉｉａ７（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にてＰＣＲを行った。得られたデータをコピーコーラー（登録商標）　ソフトウエア　ｖ２．０（ＣｏｐｙＣａｌｌｅｒ（Ｒ）　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　ｖ２．０、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にて解析し、各細胞のＧＬＤＣ遺伝子のコピー数を算出した。タックマンプローブは、次のものを用いた：タックマン　コピー　ナンバー　アッセイズ（Ｔａｑｍａｎ　Ｃｏｐｙ　Ｎｕｍｂｅｒ　Ａｓｓａｙｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、Ａｓｓａｙ　ＩＤ：Ｈｓ０６８８１７４２＿ｃｎ（Ｉｎｔｒｏｎ１６），Ｈｓ０６８２５５９２＿ｃｎ（Ｉｎｔｒｏｎ８），Ｈｓ０６８３０７４８＿ｃｎ（Ｉｎｔｒｏｎ２））およびタックマン　コピー　ナンバー　レファレンス　アッセイ　ＲＮアーゼ　Ｐ（Ｔａｑｍａｎ　Ｃｏｐｙ　ｎｕｍｂｅｒ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ａｓｓａｙ　ＲＮａｓｅ　Ｐ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）。
　様々ながん細胞株についてＧＬＤＣ遺伝子のコピー数を解析した結果を図９に示す。ＧＬＤＣ遺伝子のコピー数はＡ３９５では３コピー以上であったが、ＮＣＩ－Ｈ１９７５はほぼ１コピー、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＲＢＥ、ＴＥ－１、ＳＮＵ－１０７９、ＳＷ１２７１、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１、ＮＣＩ－Ｈ２３４７、ＢＴ－４７４、およびＨＥＣ５０Ｂは１コピー以下であった。
　通常、遺伝子のコピー数は２コピーである。上記結果から、ＧＬＤＣ遺伝子のコピー数が１コピーあるいはそれ以下の細胞、例えばＭＤＡ－ＭＢ－２３１等では、ＧＬＤＣゲノム遺伝子はヘテロ欠損であると考えることができる。
　本結果、およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１がＭＴＨＦＤ２遺伝子のノックダウンにより細胞増殖低下を示すことから、ＧＬＤＣ遺伝子のヘテロ欠損細胞株は、ＭＴＨＦＤ２の作用を阻害する薬剤に反応性があると考えることができる。
　ＧＬＤＣ遺伝子発現が非常に低い細胞株において、ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンによるインビトロでの細胞増殖の低下が、グリシンの存在下および非存在下のいずれの条件においても認められた。そこで、インビボのグリシン豊富な環境における細胞増殖へのＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンの効果を検討した。
　まず、ＧＬＤＣゲノム遺伝子ヘテロ欠損細胞株であり、ＧＬＤＣ遺伝子発現が非常に低いＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｌｕｃを用いて、ＭＴＨＦＤ２遺伝子を安定的にノックダウンした細胞を作製した。ＭＴＨＦＤ２遺伝子の安定的なノックダウンは、ＭＴＨＦＤ２遺伝子のショートヘアピンＲＮＡ（以下、ｓｈＲＮＡと略称する）を細胞にトランスフェクションすることにより行った。具体的には、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｌｕｃ細胞（Ｃａｌｉｐｅｒ社より購入）にｐＬＫＯ．１－ｐｕｒｏ　ノン－マンマリアン　ｓｈＲＮＡ　コントロール　プラスミド　ＤＮＡ（ｐＬＫＯ．１－ｐｕｒｏ　Ｎｏｎ－Ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｓｈＲＮＡ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡ、Ｓｉｇｍａ社製）もしくはＭＴＨＦＤ２　ｓｈＲＮＡ－ｐＬＫＯ．１－ｐｕｒｏ　プラスミド　ＤＮＡ（ＭＴＨＦＤ２　ｓｈＲＮＡ－ｐＬＫＯ．１－ｐｕｒｏ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡ、Ｓｉｇｍａ社製、クロン　ＩＤ：ＴＲＣＺＮ０００００３６５５３）をレンチウイルスを用いて導入し、ピューロマイシン処理を２週間以上行なうことによりプラスミドが導入された細胞を選抜した。ＭＴＨＦＤ２　ｓｈＲＮＡ－ｐＬＫＯ．１－ｐｕｒｏ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡを導入したＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｌｕｃ細胞については、限界希釈法によりセルクローニングを行った。得られたクロンのうち、グリシン非存在下での３日間の細胞増殖がＮｏｎ－Ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｓｈＲＮＡ　Ｃｏｎｔｒｏｌと比べ顕著に低下しており、かつグリシン　１００　μＭ存在下での３日間の細胞増殖がＮｏｎ－Ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｓｈＲＮＡ　Ｃｏｎｔｒｏｌと同程度であるものを３クロン選抜した。選抜したクロン細胞はＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｌｕｃ－Ｍ１２、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｌｕｃ－Ｍ１３、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｌｕｃ－Ｍ１８と命名した。
　ＭＴＨＦＤ２遺伝子のｓｈＲＮＡまたはコンロトールｓｈＲＮＡをトランスフェクションすることによって得られたクロンにおけるＭＴＨＦＤ２のタンパク質レベルの発現を、実施例１に示した方法と同様の方法により測定した。また、これらクロンをグリシン存在下または非存在下で培養し、それらの細胞増殖を実施例１に記載した方法と同様の方法により測定した。
　次いで、作製したｓｈＲＮＡ導入細胞を細胞数２ｘ１０６／マウスでＳＣＩＤ雌マウス（日本クレア社）の腹側部皮下に移植し、ゼノグラフトモデルマウス（Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ　ｍｏｄｅｌ　ｍｏｕｓｅ）を作製した。移植後１０日、１４日、１８日、２１日、２５日、および２９日に腫瘍の長径（ｔｕｍｏｒ　ｌｅｎｇｔｈ）および短径（ｔｕｍｏｒ　ｗｉｄｔｈ）をディジタル　キャリーパー（ｄｉｇｉｔａｌ　ｃａｌｉｐｅｒ、Ｍｉｔｕｔｏｙｏ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製、ＣＤ－１５ＣＸ）を用いて測定し、以下の数式に従い推定腫瘍体積を算出した：推定腫瘍体積（Ｅｓｔｉｍａｔｅｄ　ｔｕｍｏｒ　ｖｏｌｕｍｅ、ｍｍ３）＝１／２　×　（腫瘍長径）　×　（腫瘍短径）２。
　ＭＴＨＦＤ２　ｓｈＲＮＡを導入したＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｌｕｃ細胞クロンでは、ＭＴＨＦＤ２遺伝子の発現低下がタンパク質レベルで確認できた（図１０－Ａ）。これらクロンは、グリシン非存在下および存在下の両条件下での細胞増殖の低下が認められたが、グリシン非存在下での細胞増殖の程度が著しかった（図１０－Ｂ）。
　ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｌｕｃ細胞クロンを移植したゼノグラフトモデルマウスでは、コントロールｓｈＲＮＡを導入したＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｌｕｃ細胞を移植したマウスと比較して、腫瘍体積の著しい減少が認められた（図１１）。
　このように、インビボのグリシン豊富な環境でも、ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンにより、ＧＬＤＣ遺伝子発現が非常に低い細胞株の腫瘍増殖が顕著に阻害された。
　本発明は、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を予測する方法、および、該阻害薬による治療の奏功性が高いと予測される患者を選別する方法を提供するものであり、ＭＴＨＦＤ２阻害薬による疾患の有効な治療を可能にする。このように、本発明は、疾患、例えばがん疾患の治療分野において極めて有用である。
配列番号１：ＧＬＤＣタンパク質（配列番号２）をコードするＧＬＤＣ　ｍＲＮＡ。
配列番号３：ＧＬＤＣ　ｍＲＮＡ（配列番号１）の第２４２８番目から第２５９５番目までの断片を増幅するためのフォワードプライマー。
配列番号４：ＧＬＤＣ　ｍＲＮＡ（配列番号１）の第２４２８番目から第２５９５番目までの断片を増幅するためのリバースプライマー。
配列番号５：ＧＬＤＣ　ｍＲＮＡ（配列番号１）の第３６４番目から第４７９番目までの断片を増幅するためのフォワードプライマー。
配列番号６：ＧＬＤＣ　ｍＲＮＡ（配列番号１）の第３６４番目から第４７９番目までの断片を増幅するためのリバースプライマー。
配列番号７：ＧＬＤＣ　ｍＲＮＡ（配列番号１）の第６３５番目から第７４３番目までの断片を増幅するためのフォワードプライマー。
配列番号８：ＧＬＤＣ　ｍＲＮＡ（配列番号１）の第６３５番目から第７４３番目までの断片を増幅するためのリバースプライマー。

Claims (11)

  1. 被験者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中に含まれるグリシンデカルボキシラーゼ（以下、ＧＬＤＣと略称する）遺伝子またはその遺伝子産物を指標としてメチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ－２ （以下、ＭＴＨＦＤ２と略称する）阻害薬に対する反応性を予測することを含む、ＭＴＨＦＤ２阻害薬への反応性の予測方法。
  2. 前記生物学的試料中に含まれるＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物の発現を測定し、該遺伝子またはその遺伝子産物の発現が検出され、かつ、該遺伝子またはその遺伝子産物の発現量が予め設定した基準値よりも低い試料は、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に反応性を有する被験者由来の試料であると予測することを含む、請求項１に記載の方法。
  3. ＧＬＤＣ遺伝子の発現の測定がＧＬＤＣ　ｍＲＮＡの定量測定により行われる、請求項２に記載の方法。
  4. ＧＬＤＣ遺伝子の発現の測定がＧＬＤＣタンパク質の定量測定により行われる、請求項２に記載の方法。
  5. 前記生物学的試料中に含まれるＧＬＤＣ遺伝子の遺伝子型を解析し、ＧＬＤＣ遺伝子のヘテロ欠損が検出された試料は、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に反応性を有する被験者由来の試料であると予測することを含む、請求項１に記載の方法。
  6. ＧＬＤＣ遺伝子の遺伝子型の解析が該遺伝子のコピー数を測定することにより行われる、請求項５に記載の方法。
  7. 請求項１－６のいずれか１項に記載の方法により、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に反応性を有すると予測された被験者を、ＭＴＨＦＤ２阻害薬による疾患治療の対象として選別することを含む、ＭＴＨＦＤ２阻害薬による疾患治療の対象を選別する方法。
  8. 被験者ががん疾患患者であり、かつ疾患治療ががん疾患治療である、請求項７に記載の方法。
  9. 請求項１－６のいずれか１項に記載の方法により、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に反応性を有すると予測された被験者を、ＭＴＨＦＤ２阻害薬による疾患治療の対象として選別し、該選別された患者に、ＭＴＨＦＤ２阻害薬の治療有効量を投与することを含む、疾患治療方法。
  10. 被験者ががん疾患患者であり、かつ疾患治療ががん疾患治療である、請求項９に記載の方法。
  11. 被験者由来の生物学的試料を用い、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性の予測のために、該生物学的試料中に含まれるＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物量を測定する方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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GO MAYBELLE KHO ET AL.: "Glycine Decarboxylase Is an Unusual Amino Acid Decarboxylase Involved in Tumorigenesis.", BIOCHEMISTRY, vol. 53, no. 5, 11 February 2014 (2014-02-11), pages 947 - 956 *
NILSSON, R. ET AL.: "Metabolic enzyme expression highlights a key role for MTHFD2 and the mitochondrial folate pathway in cancer.", NATURE COMMUNICATIONS, vol. 5, 23 January 2014 (2014-01-23) *
NISHIMURA TATSUNORI ET AL.: "MTHFD2 is a key molecule in EGF receptor tyrosine kinase and regulates lung cancer cell growth.", ANNUAL MEETING OF THE MOLECULAR BIOLOGY SOCIETY OF JAPAN PROGRAM YOSHISHU, vol. 36 th, 2013, pages 3P-0818 *
ZHANG WEN CAI ET AL.: "Glycine Decarboxylase Activity Drives Non-Small Cell Lung Cancer Tumor-Initiating Cells and Tumorigenesis.", CELL, vol. 148, no. 1-2, 2012, pages 259 - 272, XP055080934, DOI: doi:10.1016/j.cell.2011.11.050 *

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