KR20210121133A - 암 요법에 사용하기 위한 데옥시-시티딘 또는 우리딘 유도체 - Google Patents

암 요법에 사용하기 위한 데옥시-시티딘 또는 우리딘 유도체 Download PDF

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KR20210121133A
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Abstract

본 발명은 요법에 사용하기 위한, 특히 암의 치료에 사용하기 위한 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 입체이성질체, 용매화물, 호변이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한염 에 관한 것이다:
Figure pct00027

화학식 (I)
상기 식에서, X, W1, W2, Y, Z, R1, R2 및 R3는 본 개시내용에 정의된 바와 같다. 또한, 본 발명은 또한 화학식 (I)의 화합물을 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법, 및 이러한 화합물을 포함하는 약제학적 조성물 및 키트에 관한 것이다.

Description

암 요법에 사용하기 위한 데옥시-시티딘 또는 우리딘 유도체
본 발명은 요법, 특히 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 화합물을 포함하는 약제학적 제형, 및 요법, 특히 암의 치료 또는 예방에서의 이러한 약제학적 제형의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 공지된 항암제와의 병용 치료를 위한 이러한 화합물에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 화합물을 단독으로, 및 하나 이상의 추가의 항암제와 조합하여 암 치료 또는 예방에서의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 화합물을 단독으로 또는 하나 이상의 추가의 항암제와 조합하여 사용하여 암을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
암은 세포 성장 및 증식의 적절한 조절의 손실을 특징으로 하는 질환이다. 미국 암 협회(American Cancer Society)는 2010년 미국 내에 1백 5십 만명을 초과하는 새로운 암 사례가 있었고, 해마다 암에 기인하는 것으로 추정되는 대략 570,000명이 사망한 것으로 추정하였다. 세계 보건 기구(World Health Organization)는 암이 2010년 전세계적으로 사망의 주요 원인이며, 암에 의해 야기되는 사망의 수는 2030년까지 년간 1천2백만명으로 증가하는 것으로 추정되었다.
이용가능한 다수의 요법이 있지만, 공지된 항암 약물에 대한 내성은 환자에서 암의 성공적인 치료에서 문제가 될 수 있다. 추가의 암 요법이 여전히 필요하다.
일부 상황에서, 광범위한 암 세포 유형을 사멸시킬 수 있는 항암제가 바람직하다. 플루오로우라실 (5-FU)은 광범위한 암의 치료를 위해 통상적으로 투여되는 이러한 항암제 중 하나이다.
그러나, 광범위한 암 세포 유형을 사멸시킬 수 있는 많은 항암제는 또한 비-암성 세포, 예를 들어 분열 중인 정상의 건강한 세포를 사멸시킨다. 이는 일부 상황에서 문제가 되고, 따라서 비-암성 세포에 대해 세포독성이 아닌 광범위하게 세포독성 항암제가 또한 필요하다. 추가로, 보다 특이적인 세포독성을 갖는, 즉 보다 작은 범위의 암 세포 유형을 사멸시키는 항암제에 대한 필요성이 존재한다. 이러한 보다 구체적인 항암제는 바람직하지 않은 표적외 효과를 가질 가능성이 적다.
다형성 교모세포종은 중추 신경계의 가장 흔하고 공격적인 암이다. 다형성 교모세포종은 소아에서 두 번째로 가장 흔한 암이다. 다형성 교모세포종으로 진단된 성인은 종양학에서 가장 높은 충족되지 않은 요구 중 일부를 갖는다. 현재 이용가능한 치료의 경우, 진단으로부터의 평균 생존은 14.6개월이다. 다형성 교모세포종으로 진단된 환자의 5% 미만이 5년보다 더 오래 생존한다. 다형성 교모세포종 진단 후 장기 생존은 드물고, 소아에서 보다 흔하다.
현재의 요법은 대체로 완화적이며 삶의 질을 개선시키도록 설계된다. 진단 후, 현재의 다형성 교모세포종 치료는 유사한 과정을 따른다: 환자가 수술을 견뎌낼 것으로 예상되는 병든 뇌 영역의 외과적 절제, 이어서 방사선 및 화학요법. 다형성 교모세포종은 병든 뇌에서 촉수 유사 구조를 형성하고; 따라서, 심지어 지시된 완전한 외과적 절제가 도전적이고 종종 불가능한 경우이다. 외과적 개입 및 방사선 요법 이외에, 3종의 약물이 다형성 교모세포종 치료를 위해 승인되었다:
1) 아바스틴 (RTM) (베바시주맙) - 다수의 종양학 적응증을 갖는 혈관신생 억제제. 아바스틴 (RTM)은 종양 내의 새로운 혈관의 발생을 억제하여 종양을 효과적으로 지연시킴으로써 종양 성장을 억제하는 것으로 생각된다. 아바스틴 (RTM)은 미국 및 일본에서 승인되었지만; 아바스틴 (RTM)은 EU에서 GBM 치료에 대해 승인되지 않았다. 실제로, II상 시험은 아바스틴 (RTM)이 전체 생존 이익을 수득하지 않았음을 나타내었다 (NCI 06-C-0064E). 아바스틴 (RTM)은 일부 시험에서 무진행 생존을 약간 개선하지만, 환자 이익은 종종 명목상이며, 재발성 다형성 교모세포종 환자에서 아바스틴 (RTM) 치료에 의해 제공되는 이익은 없다.
2) 테모졸로마이드 (Temodal (RTM)/테모다르 (RTM))(4-메틸-5-옥소-2,3,4,6,8-펜트아자바이사이클로[4.3.0]노나-2,7,9-트리엔-9-카복사미드) - 돌연변이유발성 DNA 알킬화제; 일반 제형이 또한 이용가능하다. 테모졸로마이드는 종양 DNA를 심하게 돌연변이시켜 세포 사멸을 유도함으로써 다형성 교모세포종 성장을 억제하는 것으로 여겨진다. 작용 메카니즘으로 인해, DNA 복구 단백질 MGMT를 발현하는 세포는 테모졸로마이드 치료에 대해 거의 보편적으로 내성이다. 테모졸로마이드 치료는 2.5개월까지 전체 생존을 개선시킨다. 동시에, 테모졸로마이드 치료는 종종 유의한 부작용을 유발한다. 테모졸로마이드는 다형성 교모세포종에 대한 1차 치료이다.
3) 글리아델 (RTM) (카무스틴 웨이퍼)(1,3-비스(2-클로로에틸)-1-니트로소우레아) - 세포독성 질소 머스타드. 이는 외과적 절제술 후 뇌 내로 직접 이식된 생분해성 디스크로서 전달된다. 무작위 시험은 글리아델 (RTM)이 중앙 생존을 2.1개월 개선시킴을 입증하였다. 글리아델(RTM)로 치료된 환자는 테모졸로마이드 치료된 환자보다 더 적거나 덜 심각한 부작용을 보고하지만; 테모졸로마이드와 비교하여 전체 생존이 감소된다.
다형성 교모세포종 및 다른 암의 치료를 위한 추가의 항암제에 대한 필요성이 남아 있다. 특히, 테모졸로마이드를 사용한 치료에 내성인 암을 효과적으로 치료하는 항암제에 대한 필요성이 남아있다.
인간 단백질 시티딘 탈아미노효소 (CDA)는 시티딘 및 데옥시시티딘의 각각 우리딘 및 데옥시우리딘으로의 가수분해적 탈아미노화를 촉매한다. 일부 알려진 항암제는 뉴클레오사이드/뉴클레오타이드 유사체, 예를 들어 젬시타빈 (2,2-디플루오로데옥시시티딘) 및 사이타라빈 (Ara-C, 시토신 아라비노시드)이다. CDA는 젬시타빈 및 사이타라빈을 비롯한 이러한 항암제를 불활화시키는 문제가 있다. CDA에 의해 불활성화되지 않는 추가의 항암제에 대한 필요성이 남아있다.
본 발명자들은 다형성 교모세포종 및 광범위한 다른 암을 치료하는데 활성을 나타내는 선택된 부류의 화합물을 발견하였다. 이러한 화합물은 일반적으로 종양 세포, 특히 뇌의 암과 연관된 것들, 특히 다형성 교모세포종의 증식을 억제하는데 적합하다.
제1 양태에서, 본 발명은 요법에 사용하기 위한 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 입체이성질체, 용매화물, 호변이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
Figure pct00001
화학식 (I)
상기 식에서:
X는 알데하이드, 알코올, 보호된 알코올, 에테르, 에스테르 및 카복실산으로부터 선택된 적어도 하나의 작용기를 함유하는, 1 내지 20개의 비-수소 원자 함유 기이고, 단, X는 -COOH가 아니고;
W1 및 W2 각각은 독립적으로 O, S 또는 NH이고;
Y는 H 또는 1 내지 15개의 비-수소 원자 함유 기이고;
Z는 -OPG, -ORz 또는 -N(RxRy)이되, Rx, Ry 및 Rz는 독립적으로 H 또는 1 내지 10개의 비-수소 원자 함유 기이고;
R1는 H 또는 1 내지 15개의 비-수소 원자 함유 기이고;
R2는 H, -OH, -OPG, -F, -Cl, -Br, -I, 또는 -N3 이고; 그리고
R3는 H, -F, -Cl, -Br, -I, 또는 -N3이고;
상기 PG는 알코올 보호기, 예컨대 아세틸 (Ac), 벤질 (Bn) 또는 벤조일 (Bz)이다.
본 발명의 화합물은 특히 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다. 따라서, 추가 양태에서 본 발명은 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 입체이성질체, 용매화물, 호변이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
Figure pct00002
화학식 (I)
상기 식에서:
X는 알데하이드, 알코올, 보호된 알코올, 에테르, 에스테르 및 카복실산으로부터 선택된 적어도 하나의 작용기를 함유하는, 1 내지 20개의 비-수소 원자 함유 기이고, 단, X는 -COOH가 아니고;
W1 및 W2 각각은 독립적으로 O, S 또는 NH이고;
Y는 H 또는 1 내지 15개의 비-수소 원자 함유 기이고;
Z는 -OPG, -ORz 또는 -N(RxRy)이되, Rx, Ry 및 Rz는 독립적으로 H 또는 1 내지 10개의 비-수소 원자 함유 기이고;
R1는 H 또는 1 내지 15개의 비-수소 원자 함유 기이고;
R2는 H, -OH, -OPG, -F, -Cl, -Br, -I, 또는 -N3이고; 그리고
R3는 H, -F, -Cl, -Br, -I, 또는 -N3이고;
상기 PG는 알코올 보호기, 예컨대 아세틸 (Ac), 벤질 (Bn) 또는 벤조일 (Bz)이다.
본 발명은 임의의 암에 적용가능하다. 암은 임의의 신생물성 병태를 포함하는 것으로 본 명세서에서 광범위하게 정의되며, 특히 악성 또는 전악성 병태를 포함한다. 암은 고형 종양을 유발하거나 초래하거나 또는 고형 종양에서 나타날 수 있지만, 이에 제한되지 않고, 또한 조혈계의 암을 포함한다. 전체에 걸쳐, 용어 "암" 및 "암 세포"는 상호교환적으로 사용된다. 전체적으로, 용어 "종양" 및 "종양 세포"는 상호교환적으로 사용된다. 양성 종양 및 악성 종양은 또한 본원에 사용된 용어 암에 포함되며, 즉 용어 암 및 종양은 상호교환적으로 사용된다. 악성 종양의 치료가 바람직하다.
따라서, 대안적으로 볼 때, 본 발명은 종양의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 화학식 (I)의 화합물을 제공한다.
대안적으로 볼 때, 본 발명은 항암제로서 사용하기 위한 화학식 (I)의 화합물을 제공한다. 대안적으로 볼 때, 본 발명은 암을 치료 또는 예방하기 위한 화학식 (I)의 화합물의 용도를 제공한다.
대안적으로 볼 때, 본 발명은 항종양제로서 사용하기 위한 화학식 (I)의 화합물을 제공한다. 대안적으로 볼 때, 본 발명은 종양을 치료 또는 예방하기 위한 화학식 (I)의 화합물의 용도를 제공한다.
대안적으로 볼 때, 본 발명의 이러한 양태는 항암 치료 생성물 (즉, 제제 또는 의약, 예를 들어 약제학적 조성물, 제형, 조합 생성물, 공동제형화된 생성물, 또는 키트)의 제조에서의, 또는 대안적으로 항암제로서 또는 암의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 약제의 제조를 위한 화학식 (I)의 화합물의 용도를 제공한다.
대안적으로 볼 때, 본 발명의 이러한 양태는 항종양 치료 생성물 (즉, 제제 또는 의약, 예를 들어 약제학적 조성물, 제형, 조합 생성물, 공동제형화된 생성물, 또는 키트)의 제조, 또는 대안적으로 항종양제로서 또는 종양의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 약제의 제조를 위한 화학식 (I)의 화합물의 용도를 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 또한 대상체에서 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 대상체에게 화학식 (I)의 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 또한 대상체에서 종양을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 대상체에게 화학식 (I)의 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 화학식 (I)의 화합물은 단독 활성제 (치료 레지멘에서 단독 활성제)로서 사용된다. 따라서, 일부 바람직한 구현예에서 치료는 단독요법이다. 단일요법은 이러한 암 (즉, 종양)에서 질환 또는 병태를 치료하기 위한 단일 약물의 사용을 지칭한다. 따라서, 일부 바람직한 구현예에서, 화학식 (I)의 화합물은 단독으로 사용된다. 단독 활성제(또는 단독 활성 성분)는 치료 활성(또는 생물학적 활성)인 단독 제제 또는 성분을 의미한다. 따라서, 치료되는 질환과 관련되지 않는 성분, 예컨대 보존제 또는 부형제 또는 제제는 활성제인 것으로 간주되지 않는다.
암 (즉, 종양)의 치료 또는 예방에서, 화학식 (I)의 화합물은 단독으로 또는 선택적으로 추가의, 즉 1종 이상의 다른 항암제(들)(즉, 추가의 또는 제2 항암제)와 조합되어 사용될 수 있다.
화학식 (I)의 화합물은 단독으로 또는 추가의 항암제와 조합되어, 대상체에서 암 (즉, 종양)의 치료 또는 예방의 임의의 방법에서 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
실시예에서 입증된 바와 같이, 1종 이상의 추가의 항암제와 조합된 화학식 (I)의 화합물의 사용은 상승작용적 세포독성 효과를 초래한다.
따라서, 추가의 양태에서, 본 발명은 암(즉, 종양)의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 추가의 항암제와 함께 화학식 (I)의 화합물, 또는 대안적으로, 암 (즉, 종양)을 치료 또는 예방하기 위한 추가의 항암제와 함께 사용하기 위한 화학식 (I)의 화합물을 제공한다.
대안적으로 볼 때, 본 발명의 이러한 양태는 항암 (즉 항-종양) 치료 생성물 (즉 제제 또는 약제, 예를 들어 약제학적 조성물, 제형, 조합된 생성물 또는 키트)의 제조에서, 또는 대안적으로 항암제 (즉 항-종양제)로서 사용하기 위한 약제의 제조를 위한 또는 암 (즉 종양)의 치료 또는 예방에서의 화학식 (I)의 화합물의 용도를 제공하고, 상기 치료는 추가 항암제의 투여를 추가로 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 또한 대상체에서 암 (즉, 종양)을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 화학식 (I)의 화합물을, 선택적으로 추가 (즉 제2) 항암제와 함께, 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 특히, 이러한 양태에서 상기 방법은 유효량의 상기 화학식 (I)의 화합물 및 임의의 추가의 항암제를 투여하는 것을 포함한다.
화학식 (I)의 화합물 및 추가의 항암제(들)는 단일 조성물로 공동 제형화될 수 있다. 그러나, 이는 필요하지 않다. 약제는 조합 제제, 조성물 또는 키트 등일 수 있고, 본 발명의 임의의 양태에서 화학식 (I)의 화합물 및 추가의 항암제(들)가 단일 조성물로 공동제형화될 필요는 없으며, 이들은 개별적으로 제형화될 수 있고 순차적으로 또는 동시에 포함하여 개별적으로 투여될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 암 (즉, 종양)의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 화학식 (I)의 화합물 및 추가의 (즉 하나 이상의 추가의 또는 제2) 항암제(들)를 포함하는 키트를 제공한다.
보다 특히, 본 발명은 암 (즉, 종양)의 치료 또는 예방에서 개별, 순차적 또는 동시 사용을 위한 조합 제제로서 화학식 (I)의 화합물 및 추가의 (즉, 1종 이상의 추가의 또는 제2) 항암제(들)를 포함하는 생성물 (특히 약제학적 생성물)을 제공한다.
추가로, 본 발명은 추가의 (즉, 1종 이상의 추가의 또는 제2) 항암제(들)와 공동제형화된 화학식 (I)의 화합물을 포함하는 생성물 (특히 약제학적 생성물)을 제공한다.
본 발명은 화학식 (I)의 화합물 및 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하고, 선택적으로 추가의 항암제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 모든 양태와 관련하여, 본 발명의 화합물은 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물이고, 발명의 한 양태와 관련하여 기재된 화합물에 관한 바람직하고 임의적인 구현예는 필요한 부분만 약간 수정하여 본 발명의 각각의 및 모든 다른 양태에 적용된다.
본 발명의 모든 양태 및 구현예에서, 악성 종양의 치료가 바람직하다.
X
X는 알데하이드, 알코올, 보호된 알코올, 에테르, 에스테르 및 카복실산으로부터 선택된 적어도 하나의 작용기를 함유하는, 1 내지 20개의 비-수소 원자 함유 기이고, 단, X는 -COOH가 아니다.
바람직하게는, X는 1 내지 10개의 비-수소 원자, 더 바람직하게는 1 내지 5개의 비-수소 원자, 더욱 더 바람직하게는 1 내지 3개의 비-수소 원자, 및 가장 바람직하게는 2개의 비-수소 원자 함유 기이다.
더 바람직하게는, X는 적어도 2개의 비-수소 원자 함유 기, 즉 2 내지 20개의 비-수소 원자 함유 기이다. 따라서, 바람직하게는 X는 2 내지 10개의 비-수소 원자, 더욱 더 바람직하게는 2 내지 5개의 비-수소 원자, 더욱 더 바람직하게는 2 내지 3개의 비-수소 원자, 및 가장 바람직하게는 2개의 비-수소 원자 함유 기이다.
바람직하게는, X는 알데하이드, 알코올, 보호된 알코올, 에테르 및 에스테르로부터 선택된 적어도 하나의 작용기를 함유한다. 더 바람직하게는, X는 알데하이드, 알코올, 에테르 및 에스테르로부터 선택된 적어도 하나의 작용기를 함유한다. 가장 바람직하게는, X는 알데하이드 및 알코올로부터 선택된 적어도 하나의 작용기를 함유한다. 예를 들어 X는 바람직하게는 알데하이드 작용기를 함유한다. 예를 들어 X는 바람직하게는 알코올 작용기를 함유한다.
바람직하게는, X는 단지 하나의 작용기를 함유한다.
바람직하게는, X는 본원에서 정의된 바와 같은 기이고, 단, X는 -COOH 또는 -OH가 아니다.
X는 -L-X'로서 정의될 수 있고, 여기서:
L은 결합, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로알킬, 알콕시, 할로알콕시이고; 그리고
X'는 -CHO, -OH, -OPG, -COOH, -OR, -OC(=O)R 또는 -C(=O)OR이되, 여기서 PG는 알코올 보호기, 예컨대 아세틸 (Ac), 벤질 (Bn) 또는 벤조일 (Bz)이고, 그리고 여기서 R은 알킬 기, 바람직하게는 메틸이다.
용어 "알킬"은 직쇄 및 분지쇄 포화 지방족 탄화수소 사슬을 지칭한다. 바람직하게는, 알킬은 C1-10 알킬을 지칭한다. 알킬 기의 예는, 비제한적으로, 메틸 (Me), 에틸 (Et), 프로필 (예를 들어, n-프로필 및 이소프로필), 부틸 (예를 들어, n-부틸, 이소부틸, t-부틸), 및 펜틸 (예를 들어, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸)을 포함한다.
R은 임의의 알킬 기, 예컨대 상기에 예시된 것들일 수 있다. 예를 들어, R은 -(CH2)nH일 수 있되, 여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5, 더 바람직하게는 1 내지 3, 및 가장 바람직하게는 1이다. n이 1인 경우, R은 CH3이다.
용어 "알케닐"은 1개 이상, 바람직하게는 1 또는 2개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 직쇄 및 분지쇄 탄화수소 사슬을 지칭한다. 바람직하게는, 알케닐은 C2-10 알케닐을 지칭한다. 알케닐 기의 예는, 비제한적으로, 에테닐, 1-프로페닐, 2-프로페닐, 2-부테닐, 3-부테닐, 2-펜테닐, 3-펜테닐, 4-펜테닐, 2-헥세닐, 3-헥세닐, 4-헥세닐, 5-헥세닐, 2-메틸-2-프로페닐, 및 4-메틸-3-펜테닐을 포함한다.
용어 "알키닐"은 1개 이상, 바람직하게는 1 또는 2개의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 직쇄 및 분지쇄 탄화수소 사슬을 지칭한다. 바람직하게는, 알키닐은 C2-10 알키닐을 지칭한다. 알키닐 기의 예는, 비제한적으로, 에티닐, 프로피닐, 및 프로파르길을 포함한다.
용어 "할로알킬"은 1개 초과의 할로겐 (플루오로 (F), 클로로 (Cl), 브로모 (Br), 및 아이오도 (I))로 치환된 직쇄 및 분지쇄 포화된 지방족 탄화수소 사슬을 지칭한다. 바람직하게는, 할로알킬은 C1-10 할로알킬을 지칭한다. 할로알킬 기의 예는, 비제한적으로, 플루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 트리클로로메틸, 펜타플루오로에틸, 펜타클로로에틸, 2,2,2-트리플루오로에틸, 헵타플루오로프로필, 및 헵타클로로프로필을 포함한다.
용어 "알콕시"은 -O-알킬 기를 지칭한다. 바람직하게는, 알콕시는 C1-10 알콕시를 지칭한다. 알콕시 기의 예는, 비제한적으로, 메톡시, 에톡시, 프로폭시 (예를 들어, n-프로폭시 및 이소프로폭시), 및 t-부톡시를 포함한다.
용어 "할로알콕시"는 산소 브릿지를 통해 부착된 상기에서 정의된 바와 같은 할로알킬 기를 지칭한다. 바람직하게는, 할로알콕시는 C1-10 할로알콕시를 지칭한다. 할로알콕시 기의 예는, 비제한적으로, 트리플루오로메톡시, 2,2,2-트리플루오로에톡시, 및 펜타플루오로톡시를 포함한다.
X가 -L-X'인 경우, X 기는 필요한 수의 비-수소 원자를 여전히 함유해야 한다.
바람직하게는, L은 결합, 알킬, 알케닐 또는 알키닐, 더 바람직하게는 결합 또는 알킬이다. 예를 들어, L은 결합 또는 C1-6 알킬일 수 있다. 더 바람직하게는, L은 결합 또는 C1-4 알킬이다. 가장 바람직하게는, L은 결합 또는 C1 알킬 (-CH2-)이다.
X'는 바람직하게는 -CHO, -OH, -OPG, -OR, -OC(=O)R 또는 -C(=O)OR, 더 바람직하게는 -CHO, -OH, -OR, -OC(=O)R 또는 -C(=O)OR, 가장 바람직하게는 -CHO, -OH, -OR 또는 -OC(=O)R이다.
따라서, 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 내지 6, 바람직하게는 0 내지 4 및 더 바람직하게는 0 또는 1이고, 그리고 X'는 상기에 정의된 바와 같고, 바람직하게는 -CHO, -OH, -OR 또는 -OC(=O)R이되, 여기서 R은 상기에 정의된 바와 같다.
바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 내지 6이고, 그리고 X'는 -OH 또는 -CHO이다. 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, n은 0 내지 6이고, 그리고 X'는 -OH이다. 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 내지 6이고, 그리고 X'는 -CHO이다.
더 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 내지 4이고, 그리고 X'는 -OH 또는 -CHO이다. 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 내지 4이고, 그리고 X'는 -OH이다. 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 내지 4이고, 그리고 X'는 -CHO이다.
더 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 내지 2이고, 그리고 X'는 -OH 또는 -CHO이다. 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 내지 2이고, 그리고 X'는 -OH이다. 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 내지 2이고, 그리고 X'는 -CHO이다.
더 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 또는 1이고, 그리고 X'는 -OH 또는 -CHO이다. 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 또는 1이고, 그리고 X'는 -OH이다. 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 또는 1이고, 그리고 X'는 -CHO이다.
더 바람직하게는, X는 -CHO, -CH2OH, -CH2OCH3 또는 -CH2OC(=O)CH3이다.
더 바람직하게는, X는 a) -CHO 또는 -CH2OH; 또는 b) -CH2OCH3 또는 -CH2OC(=O)CH3이다.
더 바람직하게는 X는 -CHO 또는 -CH2OH, 가장 바람직하게는 CH2OH이다.
X의 모든 상기의 정의에서, 바람직하게는, X는 -OH가 아니다. 따라서, X'가 -OH인 경우, 바람직하게는, L은 결합이 아니다 (즉, n은 0이 아니다). 이 경우에, n은 1 내지 6, 바람직하게는 1 내지 4, 더 바람직하게는 1 내지 2, 및 가장 바람직하게는 1일 수 있다.
W 1 및 W 2
W1 및 W2 각각은 독립적으로 O, S 또는 NH, 바람직하게는 O 또는 S, 더 바람직하게는 O이다.
따라서, 바람직하게는 W1는 O 또는 S이고, 그리고 W2는 O, S 또는 NH이거나; 또는 W2는 O 또는 S이고, 그리고 W1는 O, S 또는 NH이다.
더 바람직하게는, W1 및 W2 둘 모두는 O 또는 S이고, 그리고 더욱 더 바람직하게는 W1는 O이고, 그리고 W2는 O 또는 S이거나; 또는 W2는 O이고, 그리고 W1는 O 또는 S이다.
가장 바람직하게는, W1 및 W2 둘 모두는 O이다.
Y
Y는 H 또는 1 내지 15개의 비-수소 원자 함유 기이다. 바람직하게는, Y는 H 또는 1 내지 10개의 비-수소 원자 함유 기이다. 더 바람직하게는, Y는 H 또는 1 내지 5개의 비-수소 원자 함유 기이다.
예를 들어, Y는 H, -OH, -OPG, -F, -Cl, -Br, -I, 또는 -N3일 수 있고, 여기서 PG는 알코올 보호기, 예컨대 아세틸, 벤질 또는 벤조일이다.
Y가 H 또는 1 내지 5개의 비-수소 원자 함유 기인 경우, Y는 H, -OH, -OAc, -F, -Cl, -Br, -I, 또는 -N3일 수 있다.
가장 바람직하게는, Y는 H이다.
Z
Z는 -OPG, -ORz 또는 -N(RxRy)이되, 여기서 Rx, Ry 및 Rz는 독립적으로 H 또는 1 내지 10개의 비-수소 원자 함유 기이고, 그리고 여기서 PG는 알코올 보호기, 예컨대 아세틸, 벤질 또는 벤조일이다.
바람직하게는, Z는 -ORz 또는 -N(RxRy)이다.
바람직하게는, Rz는 H 또는 1 내지 5개의 비-수소 원자 함유 기, 더 바람직하게는 H 또는 1 내지 3개의 비-수소 원자 함유 기, 및 가장 바람직하게는 H이다.
바람직하게는, Rx 및 Ry는 독립적으로 H 또는 C1-8 에스테르이다. 더 바람직하게는, Rx 및 Ry는 독립적으로 H 또는 -C(O)O(CH2)nCH3일 수 있되, 여기서 n은 1 내지 4, 바람직하게는 4이다.
바람직하게는, Rx 및 Ry 중 적어도 하나는 H이다. 예를 들어, 바람직하게는 Rx는 H이고, 그리고 Ry는 독립적으로 H 또는 -C(O)O(CH2)nCH3일 수 있되, 여기서 n은 1 내지 4, 바람직하게는 4이다. 더 바람직하게는, Rx 및 Ry 둘 모두는 H이다.
따라서 Z는 바람직하게는 -NH2 또는 -OH이다. 더 바람직하게는, Z는, X가 -CHO 또는 -CH2OH, 가장 바람직하게는 -CH2OH인 경우 -NH2이고; 그리고 Z는, X가 -CH2OCH3 또는 -CH2OC(=O)CH3인 경우 -OH이다.
Z가 -OH인 경우, 화학식 (I)의 화합물은 하기에 나타낸 바와 같이 호변이성질체 형태로 도시될 수 있다:
Figure pct00003
Z가 - OH인 경우, 화학식 (I)의 호변이성질체 형태
대안적으로, Z는 바람직하게는 -OPG, -ORz 또는 -N(RxRy)이고, 여기서 PG, Rx 및 Ry는 상기에 정의된 바와 같고, 그리고 여기서 Rz는 1 내지 10개의 비-수소 원자 함유 기이다.
이 경우에, Rz는 바람직하게는 1 내지 5개의 비-수소 원자 함유 기, 더 바람직하게는 1 내지 3개의 비-수소 원자 함유 기이다.
이 경우에, Z는 바람직하게는 -OPG 또는 -N(RxRy)이되, 여기서 PG, Rx 및 Ry는 상기에 정의된 바와 같다.
가장 바람직하게는, Z는 -N(RxRy)이되, 여기서 Rx 및 Ry는 상기에 정의된 바와 같다.
따라서 Z는 바람직하게는 -NH2이다.
R 1
R1는 H 또는 1 내지 15개의 비-수소 원자 함유 기, 바람직하게는 H 또는 1 내지 13개의 비-수소 원자 함유 기이다.
바람직하게는, R1는 H, -OH, -OPG, -F, -Cl, -Br, -I, -N3, 또는 -O(P(=O)(OH)O)nH일 수 있되, 여기서 n은 1 내지 3, 및 여기서 PG는 알코올 보호기, 예컨대 아세틸, 벤질 또는 벤조일이다.
바람직하게는, R1는 H, -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -N3, 또는 -O(P(=O)(OH)O)nH일 수 있되, 여기서 n은 1 내지 3, 바람직하게는 3이다. 더 바람직하게는, R1는 H, -OH 또는 -O(P(=O)(OH)O)nH일 수 있되, 여기서 n은 1 내지 3, 바람직하게는 3이다. 더욱 더 바람직하게는, R1는 -OH 또는 -O(P(=O)(OH)O)nH일 수 있되, 여기서 n은 1 내지 3, 바람직하게는 3이다. 가장 바람직하게는 R1는 -OH이다.
R 2
R2는 H, -OH, -OPG, -F, -Cl, -Br, -I, 또는 -N3이고, 여기서 PG는 알코올 보호기, 예컨대 아세틸, 벤질 또는 벤조일이다.
바람직하게는, R2는 H, -OH, -F, -Cl, -Br, -I, 또는 -N3이다. 더 바람직하게는, R2는 H 또는 -OH이고, 그리고 가장 바람직하게는 R2는 -OH이다.
R 3
R3는 H, -F, -Cl, -Br, -I, 또는 -N3, 바람직하게는 H이다.
가장 바람직하게는, R1는 -OH 또는 -O(P(=O)(OH)O)nH이되, 여기서 n은 1 내지 3, 바람직하게는 3이고; R2는 -OH이고; 그리고 R3는 H이다.
바람직한 구현예
바람직하게는, 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (IIa) 또는 화학식 (IIb)의 화합물, 또는 그의 입체이성질체, 용매화물, 호변이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
Figure pct00004
Figure pct00005
화학식 ( IIa) 화학식 ( IIb )
상기 식에서, X, R1 및 R2는 상기에 정의된 바와 같다.
더 바람직하게는, 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (IIa)의 화합물, 또는 그의 입체이성질체, 용매화물, 호변이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염이다.
이들 바람직한 구현예에서, 특히 화학식 (IIa)에서, 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 내지 6이고, 그리고 X'는 -OH 또는 -CHO이다. 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, n은 0 내지 6이고, 그리고 X'는 -OH이다. 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 내지 6이고, 그리고 X'는 -CHO이다.
더 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 내지 4이고, 그리고 X'는 -OH 또는 -CHO이다. 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 내지 4이고, 그리고 X'는 -OH이다. 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 내지 4이고, 그리고 X'는 -CHO이다.
더 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 내지 2이고, 그리고 X'는 -OH 또는 -CHO이다. 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 내지 2이고, 그리고 X'는 -OH이다. 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 내지 2이고, 그리고 X'는 -CHO이다.
더 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 또는 1이고, 그리고 X'는 -OH 또는 -CHO이다. 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 또는 1이고, 그리고 X'는 -OH이다. 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 또는 1이고, 그리고 X'는 -CHO이다.
더 바람직하게는 X는 -CHO, -CH2OH, -CH2OCH3 또는 -CH2OC(=O)CH3이다. 더 바람직하게는, X는 a) -CHO 또는 -CH2OH; 또는 b) -CH2OCH3 또는 -CH2OC(=O)CH3이다. 더 바람직하게는 X는 -CHO 또는 -CH2OH, 가장 바람직하게는 CH2OH이다.
화학식 (IIa)에서, 바람직하게는 X는 -CHO 또는 -CH2OH, 가장 바람직하게는 -CH2OH이다. 화학식 (IIb)에서, 바람직하게는 X는 -CH2OCH3 또는 -CH2OC(=O)CH3이다.
모든 이들 바람직한 구현예에서, 바람직하게는, X는 -OH가 아니다. 따라서, X'가 -OH인 경우, 바람직하게는 n은 0이 아니다. 이 경우에, n은 1 내지 6, 바람직하게는 1 내지 4, 더 바람직하게는 1 내지 2, 및 가장 바람직하게는 1일 수 있다.
화학식 (IIa) 및 (IIb)에서, 바람직하게는 R1는 -OH 또는 -O(P(=O)(OH)O)nH이되, 여기서 n은 1 내지 3, 바람직하게는 3이고; 그리고 R2는 -OH이다.
더 바람직하게는, 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (IIIa), (IIIb), (IIIc) 또는 (IIId)의 화합물 또는 그의 입체이성질체, 용매화물, 호변이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
Figure pct00006
Figure pct00007
상기 식에서, X는 상기에 정의된 바와 같다.
더 바람직하게는, 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (IIIa), (IIIb) 또는 (IIIc)의 화합물 또는 그의 입체이성질체, 용매화물, 호변이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염이다.
더욱 더 바람직하게는, 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (IIIa) 또는 (IIIc)의 화합물, 또는 그의 입체이성질체, 용매화물, 호변이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염이다.
화학식 (IIIa), (IIIb), (IIIc) 및 (IIId)에서, 특히 화학식 (IIIa) 및 (IIIc)에서, 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 내지 6이고, 그리고 X'는 -OH 또는 -CHO이다. 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 내지 6이고, 그리고 X'는 -OH이다. 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 내지 6이고, 그리고 X'는 -CHO이다.
더 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 내지 4이고, 그리고 X'는 -OH 또는 -CHO이다. 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 내지 4이고, 그리고 X'는 -OH이다. 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 내지 4이고, 그리고 X'는 -CHO이다.
더 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 내지 2이고, 그리고 X'는 -OH 또는 -CHO이다. 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 내지 2이고, 그리고 X'는 -OH이다. 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 내지 2이고, 그리고 X'는 -CHO이다.
더 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 또는 1이고, 그리고 X'는 -OH 또는 -CHO이다. 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 또는 1이고, 그리고 X'는 -OH이다. 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 또는 1이고, 그리고 X'는 -CHO이다.
더 바람직하게는 X는 -CHO, -CH2OH, -CH2OCH3 또는 -CH2OC(=O)CH3이다. 더 바람직하게는, X는 a) -CHO 또는 -CH2OH; 또는 b) -CH2OCH3 또는 -CH2OC(=O)CH3이다. 더 바람직하게는 X는 -CHO 또는 -CH2OH, 가장 바람직하게는 CH2OH이다.
화학식 (IIIa) 및 화학식 (IIIc)에서, 바람직하게는 X는 -CHO 또는 -CH2OH, 가장 바람직하게는 -CH2OH이다. 화학식 (IIIb) 및 화학식 (IIId)에서, 바람직하게는 X는 -CH2OCH3 또는 -CH2OC(=O)CH3이다.
모든 이들 바람직한 구현예에서, 바람직하게는, X는 -OH가 아니다. 따라서, X'가 -OH인 경우, 바람직하게는 n은 0이 아니다. 이 경우에, n은 1 내지 6, 바람직하게는 1 내지 4, 더 바람직하게는 1 내지 2, 및 가장 바람직하게는 1일 수 있다.
가장 바람직하게는, 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (IVa), (IVb), (IVc), (IVd), (IVe) 또는 (IVf)의 화합물 또는 그의 입체이성질체, 용매화물, 호변이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
Figure pct00008
Figure pct00009
화학식 (IVa)는 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 (또한 본원에서 일명 5f2dC, 5fdC, 2d5fC 및 d5fC)이다. 화학식 (IVb)는 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘 (또한 본원에서 일명 5hm2dC, 5hmdC, 2d5hmC 및 d5hmC)이다. 화학식 (IVc)는 5-메톡시메틸-2'-데옥시우리딘이다. 화학식 (IVd)는 5-아세톡시메틸-2'-데옥시우리딘이다. 화학식 (IVe)는 5-포르밀-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트이다. 화학식 (IVf)는 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트이다.
따라서, 바람직하게는, 본 발명에 사용되는 화합물은 5-포르밀-2'-데옥시시티딘, 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘, 5-메톡시메틸-2'-데옥시우리딘, 5-아세톡시메틸-2'-데옥시우리딘, 5-포르밀-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트 및 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트 또는 그의 입체이성질체, 용매화물, 호변이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염으로부터 선택된다. 더 바람직하게는 화합물은 a) 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 또는 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘 또는 그의 입체이성질체, 용매화물, 호변이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염; 또는 b) 5-메톡시메틸-2'-데옥시우리딘 또는 5-아세톡시메틸-2'-데옥시우리딘 또는 그의 입체이성질체, 용매화물, 호변이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염이다.
대안적으로, 본 발명에 사용되는 화합물은 바람직하게는 5-포르밀-2'-데옥시시티딘, 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘, 5-포르밀-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트 및 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트 또는 그의 입체이성질체, 용매화물, 호변이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염으로부터 선택된다.
가장 바람직하게는, 화합물은 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 또는 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘 또는 그의 입체이성질체, 용매화물, 호변이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염, 가장 바람직하게는 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘 또는 그의 입체이성질체, 용매화물, 호변이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염이다.
용어 "치료" 또는 "요법"은 환자의 건강 또는 상태, 또는 고통받는 암의 증상을 개선시키는 임의의 치료 또는 요법을 포함한다. "치료"는 치유 요법 (예를 들어, 환자로부터의 암 세포 또는 종양 또는 전이의 제거를 야기하는 요법)에 제한되지 않지만, 암 또는 환자에 대한 유익한 효과, 예를 들어, 종양 퇴행 또는 감소, 전이성 잠재력의 감소, 전체 생존의 증가, 삶 또는 차도의 확대 또는 연장, 차도의 유도, 질환 진행 또는 질환 진행 속도, 또는 종양 발생 속도의 둔화 또는 감소, 삶의 질의 주관적 개선, 질환과 관련된 통증 또는 기타 증상의 감소, 식욕 개선, 구역질 감소, 또는 암의 임의의 증상의 완화를 갖는 임의의 요법을 포함한다.
따라서, 본원에서 사용된 바와 같이 "치료"는 치료 전의 암 또는 증상에 비해 치료되는 암 또는 그의 하나 이상의 증상을 감소, 완화, 개선 또는 제거하는 것을 지칭할 수 있다. 치료는 예를 들어 종양, 예를 들어 고형 종양에서 암 세포의 감소 또는 제거를 포함할 수 있다. 치료는 대상체, 즉 이를 필요로 하는 대상체의 치료이다. 따라서, 치료는 종양 크기의 감소, 또는 종양 성장 또는 추가의 종양 성장의 예방, 즉 종양 크기의 안정화를 포함할 수 있다.
"예방"은 예를 들어 종양의 발생에서 암의 증상의 개시를 지연 또는 예방하는 것을 지칭한다.
바람직하게는, 본 발명의 화합물은 암/종양 세포에 직접 영향을 미친다. 본원에 사용된 "직접적인 효과"는 본 발명의 화합물이 암/종양 세포와 직접 상호작용하여 그의 항암/항종양 효과를 발휘하는 것을 의미한다. 다시 말해서, 바람직하게는 본 발명의 화합물, 즉 화학식 (I)의 화합물은 암/종양 세포에 세포독성이다. 바람직하게는, 본 발명의 화합물은 암/종양 세포에 대해 직접적인 효과를 발휘하기 위해 대상체에게 투여된다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 세포 기반 요법의 일부로서 투여된 세포 집단을 고갈시키기 위해 본 발명의 화합물의 투여를 포함하지 않는다. 세포 기반 요법은 특정 치료 효과를 유도하기 위해 세포 집단을 대상체에게 투여하는 요법으로서 잘 알려져 있다. 잘 알려진 세포 기반 요법은 T-세포 요법, 예를 들어 CAR T-세포 요법을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 세포 기반 요법의 일부로서 투여된 세포 집단의 투여 후 본 발명의 화합물의 투여를 포함하지 않는다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 CAR T-세포 요법을 포함하지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 T-세포 요법을 포함하지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 세포 기반 요법을 포함하지 않는다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 CAR T-세포 요법, 바람직하게는 T 세포 치료, 바람직하게는 세포 기반 요법을 받지 않는 대상체에게 본 발명의 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 다시 말해서, 바람직하게는 대상체는 CAR-T 세포 요법, 바람직하게는 T-세포 치료, 바람직하게는 세포 기반 요법을 그의 치료의 일부로서 제공받지 않았고 제공받지 않을 것이다.
본원에 언급된 바와 같이, 대상체는 임의의 인간 또는 비-인간 동물, 바람직하게는 포유동물 동물, 예를 들어 소, 말, 양, 돼지, 염소, 토끼, 고양이, 개, 특히 바람직하게는 인간일 수 있다. 따라서, 바람직하게는 본원에 언급된 암은 인간 암이고, 본원에 언급된 종양은 바람직하게는 인간 대상체에게 존재한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 치료는 암 재발 또는 재발 또는 전이의 위험이 있는 대상체에서 사용될 수 있다. 따라서, 대안적으로 볼 때, 화학식 (I)의 화합물은 암 재발 또는 재발 또는 전이의 예방에 사용될 수도 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 치료되는 대상체가 암 (즉, 종양)을 갖거나 또는 암에 걸리기 쉽거나 또는 암의 발병 위험이 있는지를 먼저 확인 또는 결정하는 것을 포함할 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 본 발명은 대상체에 대한, 또는 보다 특히 암 (종양), 또는 암(종양)의 발생 또는 진행에 대한 화학식 (I)의 화합물 및/또는 다른 항암제(들)의 투여의 효과를 평가 또는 모니터링하는 것을 포함할 수 있다. 항암 효과를 평가 및/또는 모니터링하기 위한 절차 및 수단은 예를 들어 증상, 임상 상태, 종양 크기 또는 퍼짐 (예를 들어 영상화 기술에 의함) 또는 다른 암 또는 종양 지표, 예를 들어 암/종양 마커 등을 결정 또는 모니터링함으로써 관련 기술분야에 잘 알려져 있다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명은 임의의 암에 적용가능하다. 암은 임의의 신생물성 병태를 포함하는 것으로 본 명세서에서 광범위하게 정의되며, 특히 악성 또는 전악성 병태를 포함한다. 암은 고형 종양을 유발하거나 초래하거나 또는 고형 종양에서 나타날 수 있지만, 이에 제한되지 않고, 또한 조혈계의 암을 포함한다. 양성 종양 및 악성 종양은 또한 본원에 사용된 용어 암에 포함되며, 즉 용어 암 및 종양은 상호교환적으로 사용된다. 악성 종양의 치료가 바람직하다.
암은 신체의 임의의 조직 또는 기관에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 환자 또는 대상체에서 하기 암 중 임의의 암의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다:
중추신경계의 암, 바람직하게는 뇌암, 바람직하게는 신경교종; 급성 림프모구성 백혈병 (ALL); 급성 골수성 백혈병 (AML); 부신피질 암종; AIDS-관련된 암 (예를 들어, 카포시 육종 및 림프종); 항문암; 맹장암; 기저 세포 암종; 담도암; 간외 방광암; 골암 (예를 들어, 유잉 육종; 골육종 및 악성 섬유 조직구종); 유방암; 기관지 종양; 버킷 림프종; 암양종 종양; 심장 (심장) 종양; 자궁경부암 (자궁경부 선암종); 척색종; 급성 전골수구성 백혈병; 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 만성 골수형성 백혈병 (CML); 만성 골수증식성 장애; 결장암; 결장직장암; 피부 T-세포 림프종; 담도암; 간외 관상피내 암종 (DCIS); 배아 종양; 자궁내막 암; 식도암; 비강신경교세포종; 유잉 육종; 두개외 생식 세포 종양; 고환외 생식 세포 종양; 간외 담도암; 안암 (안구내 흑색종 및 망막아세포종 포함); 뼈의 섬유 조직구종; 담낭암; 위 (위) 암; 위장 암양종 종양; 위장 기질 종양 (GIST); 생식 세포 종양; 임신성 융모성 질환; 모발 세포 백혈병; 두경부 암; 심장 암; 간세포 (간) 암; 조직구증; 랑게르한스 세포; 호지킨 림프종; 하인두 암; 안구내 흑색종; 소도세포 종양; 췌장 신경내분비 종양; 카포시 육종; 신장암 (신장 세포 및 윌름스 종양 포함); 랑게르한스 세포 조직구증; 후두 암; 백혈병 (급성 림프모구성 (ALL) 포함); 급성 골수성 (AML); 만성 림프구성 (CLL); 만성 골수형성 (CML); 입술 및 구강 암; 간암 (1차); 상피내 소엽 암종 (LCIS); 폐암; 림프종; 거대글로불린혈증; 발덴스트룀; 흑색종 (악성 흑색종); 머켈 세포 암종; 중피종; 잠복 원발을 갖는 전이성 편평상피 목 암; NUT 유전자을 수반하는 정중선 관 암종; 입 암; 다수의 내분비 신조직형성 증후군; 소아기; 다발성 골수종/혈장 세포 신생물; 균상식육종; 골수이형성 증후군; 골수이형성/골수증식성 신생물; 다발성 골수종; 골수증식성 장애; 비강 및 부비동 암; 비인두 암; 신경교세포종; 비-호지킨 림프종; 비-소세포 폐암; 구강암; 구강 암; 구강인두 암; 골육종; 난소암 (난소 선암종); 췌장암; 췌장 신경내분비 종양 (소도세포 종양); 유두종증; 부신경절종; 부비동 및 비강 암; 부갑상선암; 음경암; 인두 암; 크롬친화세포종; 상피 선암종; 혈장 세포 신생물/다발성 골수종; 흉막폐 아세포종; 임신 및 유방암; 전립선암; 직장암; 신장 세포 (신장) 암; 신우 및 요관; 이행 세포 암; 망막아세포종; 횡문근육종; 타액샘 암; 육종; 세자리 증후군; 피부암; 소세포 폐암; 소장 암; 연조직 육종; 편평 세포 암종; 잠복 원발을 갖는 편평상피 목 암; 전이성; 위 (위) 암; T-세포 림프종; 고환암; 인후두암; 흉선종 및 흉선 암종; 갑상선암; 신우 및 요관의 이행 세포 암; 요도 암; 자궁암; 자궁내막; 자궁 육종; 질암; 외음부암; 발덴스트룀거대글로불린혈증; 및 윌름스 종양.
인간 배아의 세포는 별개의 배엽층, 즉 외배엽, 내배엽 및 중배엽으로 배열되며, 이는 외배층과 내배층 사이에서 발생한다. 신체의 모든 기관은 이들 3개의 1차 배엽층으로부터 질서있는 방식으로 발생하거나 분화한다.
본 발명에서, 바람직하게는 암/종양은 외배엽, 축주위 중배엽 또는 측면 플레이트 중배층, 바람직하게는 외배엽으로부터 유래된 조직의 암/종양이다.
바람직하게는, 암은 중추 신경계의 암, 바람직하게는 뇌암이다. 의심의 여지를 피하기 위해, 뇌암은 당업계에서 그리고 본원에서 중추 신경계의 암으로 간주된다. 중추 신경계는 뇌 및 척수를 포함한다. 따라서, 바람직하게는 종양은 중추 신경계의 종양, 바람직하게는 뇌 종양이다. 바람직하게는, CNS의 암/종양은 CNS 림프종, 횡문근양 종양, 배아 종양, 생식 세포 종양 및 척색종으로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 뇌암/종양이다. 바람직하게는, 뇌암/종양은 신경교종, 청신경종, CNS 림프종, 두개인두종, 수모세포종, 수막종, 전이성 뇌종양, 뇌하수체 종양, 원시 신경외배엽 (PNET), 신경집종, 송과체 종양, 삼측정 망막아세포종 및 횡문근양 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
가장 바람직하게는, 암/종양은 뇌암/뇌 종양, 더 바람직하게는 신경교종이다. 신경교종은 임의의 유형의 신경교종, 예를 들어 성상세포종, 뇌실막세포종, 뇌실막밑세포종, 희소돌기아교세포종, 뇌간 신경교종, 시신경교종 또는 혼합된 신경교종일 수 있다.
바람직하게는, 신경교종은 성상세포종이다. 성상세포종은 등급 I 성상세포종 (바람직하게는 모양세포성 성상세포종 또는 뇌실막하 거대세포 성상세포종), 등급 II (바람직하게는 저-등급 성상세포종, 다형성 황색별아교세포종 또는 혼합된 희소돌기별아교세포종), 등급 III (역형성 성상세포종) 또는 가장 바람직하게는 등급 IV (교모세포종)일 수 있다.
중추 신경계의 종양 분류를 위한 등급 체계는 당업자에게 잘 알려져 있다. 바람직하게는, 세계 보건 기구 (WHO) 등급 체계가 사용된다. WHO 등급화 계획은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 특정 특성: 비정형성, 유사분열, 내피 증식, 및 괴사의 출현에 기초하고, 이는 침습 및 성장 속도의 관점에서 종양의 악성 잠재력을 반영한다.
신경교종은 또한 이들이 천막(tentorium) 위 또는 아래에 있는지의 여부; 소뇌로부터 대뇌를 분리하는 막에 따라 분류될 수 있다. 천막상 신경교종은 대뇌에서 천막 위에서 발견되는 반면, 천막하 신경교종은 소뇌에서 천막 아래에서 발견된다. 본 발명에 따라 치료되는 신경교종은 천막상 신경교종 또는 천막하 신경교종일 수 있다.
따라서, 특히 바람직하게는 본 발명의 문맥에서, 암/종양은 신경교종, 가장 바람직하게는 신경교종, 등급 IV, 즉 다형상 교모세포종이다. 다형상 교모세포종은 악성 성상세포종이고, 성인 중에서 가장 흔한 원발성 뇌 종양이다. 다형상 교모세포종은 또한 신경교종, 등급 IV, 교모세포종 및 GBM으로 공지되어 있다.
바람직하게는 암/종양은 뇌암 (상기에서 정의된 바와 같이, 바람직하게는 신경교종, 더 바람직하게는 교모세포종), 위암, 췌장암, 림프종, 폐암, 피부암, 급성 전골수구성 백혈병, 난소암, 유방암, 골암 및 자궁경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 암/종양은 뇌암 (상기에서 정의된 바와 같이, 바람직하게는 신경교종, 더 바람직하게는 교모세포종), 위암, 림프종, 유방암 및 자궁경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 암/종양은 뇌암 (상기에서 정의된 바와 같이, 바람직하게는 신경교종, 더 바람직하게는 교모세포종), 위암, 췌장암, 피부암, 급성 전골수구성 백혈병, 유방암 및 자궁경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 암/종양은 뇌암 (상기에서 정의된 바와 같이, 바람직하게는 신경교종, 더 바람직하게는 교모세포종), 피부암 및 유방암, 더 바람직하게는 뇌암 (상기에서 정의된 바와 같이, 바람직하게는 신경교종, 더 바람직하게는 교모세포종) 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
이들 구현예에서, 본 발명의 바람직한 화합물은, X는 알데하이드 작용기를 함유하고, 바람직하게는 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 X'는 -CHO이고 그리고 n은 0 내지 6, 더 바람직하게는 0 내지 4, 더 바람직하게는 0 내지 2, 더 바람직하게는 0 또는 1이고, 가장 바람직하게는 여기서 X는 -CHO이고, 그리고 바람직하게는 Z는 -NH2인 것들이다. 본 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 이러한 화합물은 유리하게는 비-암성 세포에 대해 제한된 세포독성과 함께 광범위한 암 유형에 대해 광범위한 세포독성을 갖는다.
대안적으로 바람직하게는 암/종양은 뇌암 (상기에서 정의된 바와 같이, 바람직하게는 신경교종, 더 바람직하게는 교모세포종) 및 만성 만성 골수형성 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 구현예에서, 본 발명의 바람직한 화합물은, X는 알코올 작용기를 함유하고, 바람직하게는 여기서 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 X'는 -OH이고 그리고 n은 0 내지 6, 더 바람직하게는 0 내지 4, 더 바람직하게는 0 내지 2, 더 바람직하게는 0 또는 1이고, 가장 바람직하게는 여기서 X는 -CH2OH이고 그리고 바람직하게는 여기서 Z는 -NH2인 것들이다. 본 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 이러한 화합물은 유리하게는 표적외 암성 및 비-암성 세포에 대한 제한된 세포독성과 함께 이들 바람직한 암 유형에 대한 특이적 세포독성을 갖는다.
바람직하게는 위 종양은 위 암종이다. 바람직하게는 췌장 종양은 췌장암종이다. 바람직하게는, 피부암은 악성 흑색종이다. 바람직하게는 난소암은 난소 선암종이다. 바람직하게는 유방암은 상피 선암종이다. 바람직하게는 골암은 뼈 골육종이다. 바람직하게는 폐암은 전이성 선암종, 바람직하게는 전이성 비-소세포 선암종이다. 바람직하게는 자궁경부암은 자궁경부 선암종이다.
그러나, 바람직하게는 상기 암은 폐암 또는 유방암이 아니다. 바람직하게는 상기 암은 또한 췌장암, 위암, 고환암 또는 질암이 아니다. 바람직하게는 상기 암은 또한 신장암 또는 장의 암이 아니다.
바람직하게는 상기 암은 폐암이 아니다. 바람직하게는 상기 암은 또한 전립선암, 신장암, 간암, 유방암, 결장암, 난소암 또는 자궁경부암이 아니다.
바람직하게는 암/종양은 결장암, 폐암, 전립선암 또는 신장암이 아니다. 바람직하게는 암/종양은 또한 췌장암이 아니다.
바람직하게는 암/종양은 또한 만성 골수형성 백혈병이 아니고, 그리고 이 경우에 본 발명의 바람직한 화합물 (즉 화학식 (I), (IIa), (IIb), (IIIa), (IIIb), (IIIc), (IIId), (Iva), (IVb), (IVc), (IVd), (IVe) 및 (IVf)의 화합물)은, X는 알데하이드 작용기를 함유하고, 바람직하게는 여기서 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 X'는 -CHO이고 그리고 n은 0 내지 6, 더 바람직하게는 0 내지 4, 더 바람직하게는 0 내지 2, 더 바람직하게는 0 또는 1이고, 가장 바람직하게는 여기서 X는 -CHO이고 그리고 바람직하게는 여기서 Z는 -NH2인 것들이다.
또한, 바람직하게 상기 암은 또한 하기가 아니다:
i) 유방암, 바람직하게는 또한 췌장암, 위암, 고환암 또는 질암이 아니다, 더 바람직하게는 또한 장의 암이 아니고/거나;
ii) 간암, 유방암, 난소암 또는 자궁경부암.
바람직하게는 상기 암은 폐암, 전립선암, 신장암, 간암, 유방암, 결장암, 난소암, 자궁경부암, 만성 골수형성 백혈병, 췌장암, 위암, 고환 암, 질암 및 장의 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암이 아니다. 바람직하게는 상기 암은 이들 암 중 임의의 것이 아니다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 치료되는 유방암은,
i) 침습적 관상 암종이고/거나;
ii) 야생형 p53을 발현시키고/거나;
iii) 삼중 음성이 아니고, 즉 에스트로겐 수용체 (ER+) 프로게스테론 수용체 (PR+) 및 HER2 (HER2+) 중 하나 이상을 발현시키고, 바람직하게는 ER+ 및 PR+이고/거나;
iv) p53에 대해 이형접합성이다.
바람직하게는 본 발명에 따라 치료되지 않은 유방암은 바람직하게는 단지 하기의 유방암이다:
i) 선암종이고/이거나;
ii) 삼중 음성이고, 즉 에스트로겐 수용체 (ER-) 프로게스테론 수용체 (PR-) 또는 HER2 (HER2-)를 발현시키지 않고/거나;
iii) p53의 돌연변이 변이체를 발현시키고/거나
iv) p53에 대해 동형접합성이다.
인간 단백질 시티딘 탈아미노효소 (CDA)는 시티딘 및 데옥시시티딘의 각각 우리딘 및 데옥시우리딘으로의 가수분해적 탈아미노화를 촉매한다. 일부 공지된 항암제는 뉴클레오사이드/뉴클레오타이드 유사체, 예를 들어 젬시타빈 (2,2-디플루오로데옥시시티딘) 및 사이타라빈 (Ara-C, 시토신 아라비노시드)이다. CDA는 젬시타빈 및 사이타라빈을 비롯한 이러한 항암제를 불활성화시킨다는 문제가 있다. 본 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 화합물은 CDA의 발현과 무관하게 그의 세포독성 효과를 발휘한다.
따라서, 바람직한 구현예에서, 암/종양은 CDA가 발현되는 것이고, 바람직하게는 CDA는,
i) 과발현되고;
ii) 과발현되지 않고;
iii) 저발현되고;
iv) 저발현되지 않고;
v) 과발현되거나 저발현되고; 또는
vi) 과발현되지도 저발현되지도 않는다.
상기 i) 내지 vi)의 암/종양 유형 각각은 본 발명의 바람직한 구현예를 나타낸다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따라 치료되는 암/종양은 CDA 가 과발현되지 않는 것이다.
암/종양 세포 유전자 발현의 문맥에서, 용어 "과발현된" 및 "저발현된"은 명확하고 광범위하게 이해되는 의미, 즉 각각 증가된/높은 또는 감소된/낮은 수준에서의 의미를 갖는다.
과발현(또는 증가 또는 더 높은 수준) 또는 저발현(또는 감소 또는 더 낮은 수준)은 임의의 적절한 대조군(예를 들어, 대조군 수준 또는 대조군 샘플 또는 생검)과 비교하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 대조군 수준은 건강한 대상체 (예를 들어, 암을 갖지 않는 대상체)로부터의 샘플 (예컨대, 혈액 또는 혈청 샘플 또는 조직 샘플 또는 생검) 내의 수준일 수 있다. 적절한 대조군 수준(또는 대조군 샘플 또는 값)은 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 적절한 대조군 "값"은 또한, 예를 들어 정상 대상체에 대한 범위를 참조하여, 모든 시험에서 대조군 "샘플"을 실행하지 않고 용이하게 결정될 수 있다.
바람직하게는, 용어 과발현 및 저발현은 암성 세포에서 해당 유전자로부터의 RNA 전사체의 수준이 암성 세포와 동일한 조직으로부터의 비-암성 세포에서의 수준보다 더 높거나(과발현) 더 낮다(저발현)는 것을 의미하며, 이는 두 경우에서 동일한 방법 및 조건을 사용하여 평가된다. 유전자 발현, 예를 들어 CDA 발현의 수준을 평가하기 위한 바람직한 방법 및 조건은 다른 곳에 개시된 바와 같다.
바람직하게는, 과발현 또는 저발현이 중요하다. 유의하게 과발현된/저발현된, 즉 유의하게 더 높은/낮은 것은 통계적으로 유의하게 과발현/저발현하였음 (통계적으로 유의하게 더 높은/낮은 것)을 의미한다. 통계적으로 유의하다는 것은, 관찰된 증가 또는 감소 수준이 단독으로 우연히 발생할 것으로 예상되는 것보다 더 크다는 것을 의미한다. 통계적 유의도는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 결정된다. 예를 들어, 통계적 유의도는 확률 값(p-값)에 의해 결정된다. p-값은 실험 동안 군 사이의 차이가 우연히 발생할 확률의 척도이다. 예를 들어, 0.01의 p-값은, 결과가 우연히 일어났을 가능성이 100 중의 1인 것을 의미한다. p-값이 낮을수록, 군들 사이의 차이가 치료에 의해 초래될 가능성이 높다. 바람직하게는, 확률 값은 < 0.05 또는 < 0.01이다.
일부 구현예에서, 증가된 수준 (즉 과발현)은 (예를 들어, 대조군 수준에 비해) 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%의 증가일 수 있다. 일부 구현예에서, 줄어든 수준 (즉 저발현)은 (예를 들어, 대조군 수준에 비해) 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%의 감소일 수 있다.
바람직하게는, 관심 세포에서의 유전자 발현 수준은 이러한 정보를 함유하는 데이터베이스를 참조하여 결정된다. 자원, 예컨대 암 게놈 아틀라스 (TCGA, https://cancergenome.nih.gov/), EMBL-EBI 발현 아틀라스 (https://www.ebi.ac.uk/gxa/home), 인간 단백질 아틀라스 (https://www.proteinatlas.org/), GENEVESTIGATOR® (https://genevestigator.com/gv/), 암 세포주 백과사전 (https://portals.broadinstitute.org/ccle) 및 다른 것들은 암을 포함한 광범위한 세포 유형에서 유전자 발현 수준에 대한 정보를 함유할 뿐만 아니라, 특정 암 유형에서의 유전자 발현 수준이 동일한 조직으로부터의 비-암성 세포에서보다 유의하게 더 높은지 또는 더 낮은지 (즉, 유전자가 암 유형에서 과발현 또는 저발현되는지)에 대한 통계적 데이터를 제공한다. 이들 데이터베이스가 바람직하다. 따라서, 관심 유전자의 통계적으로 유의한 과발현 또는 저발현의 암 유형이 용이하게 확인될 수 있다. 이러한 목적을 위해 이러한 자원을 이용하는 것은 당업자의 능력 내에 있다.
따라서, 바람직하게는, 암/종양은 본원의 임의의 곳에 정의된 바와 같고, 여기서 상기 암/종양 내의 CDA 발현은 EMBL-EBI 발현 아틀라스 데이터베이스 (https://www.ebi.ac.uk/gxa/home), GENEVESTIGATOR® 데이터베이스 (https://genevestigator.com/gv/), 암 세포주 백과사전 (https://portals.broadinstitute.org/ccle) 및 인간 단백질 아틀라스 (https://www.proteinatlas.org/)로부터 선택된 데이터베이스를 참조하여 결정된다.
바람직하게는, 암/종양은 암/종양과 동일한 조직으로부터의 비-암성 세포에서의 발현 수준보다 더 높은 수준으로 CDA를 발현하지 않으며, 여기서 상기 과발현은 EMBL-EBI 발현 아틀라스 데이터베이스 (https://www.ebi.ac.uk/gxa/home), GENEVESTIGATOR® 데이터베이스 (https://genevestigator.com/gv/), 암 세포주 백과사전 (https://portals.broadinstitute.org/ccle) 및 인간 단백질 아틀라스 (https://www.proteinatlas.org/)로부터 선택된 데이터베이스를 참조하여 결정된다.
바람직하게는, 암/종양은 CDA 발현 수준이 동일한 조건 하에 동일한 방법을 사용하여 결정된 바와 같은 참조 암 세포주에서의 CDA의 발현 수준의 90% 이하인 것이고, 여기서 상기 참조 암 세포주는 MDA-MB-231이다.
MDA-MB-231은 널리 시판되는 잘 특성화된 세포주이다. MDA-MB-231 세포주는 전이성 유방 선암종을 갖는 51세의 백인 여성의 늑막 삼출액으로부터 확립된 상피성 인간 유방암 세포주이고, 의학 연구 실험실에서 가장 통상적으로 사용되는 유방암 세포주 중 하나이다. 이는, 예를 들어 European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC), 카탈로그 번호 92020424로부터 수득할 수 있다. 표 4A에 나타낸 바와 같이, MDA-MB-231 세포주에서의 CDA의 발현 수준은 153 TPM이다.
MDA-MB-231은 에스트로겐 수용체 (ER) 및 프로게스테론 수용체 (PR) 발현, 뿐만 아니라 HER2 (인간 표피 성장 인자 수용체 2) 증폭이 결여되기 때문에 고도로 공격적이고, 침습적이며, 불충분하게 분화된 삼중-음성 유방암 (TNBC) 세포주이다. 세포주는 클라우딘-3 및 클라우디닌-4의 하향-조절, Ki-67 증식 마커의 낮은 발현, 상피-중간엽 전이와 연관된 마커에 대한 풍부화 및 유선암 줄기 세포 (CSC)와 연관된 특색, 예컨대 CD44+CD24-/낮은 표현형의 발현을 나타내기 때문에 클라우딘-저 분자 하위유형에 속하는 것으로 인식된다. 3D 배양에서, 세포주는 내피-유사 형태를 나타내고, 종종 다수의 세포 콜로니를 가교하는 별모양 돌출부를 갖는 그의 침습성 표현형에 의해 구별된다. 이 세포주의 배양을 위한 표준 조건은 잘 알려져 있다. 바람직한 배양 조건은 2mM 글루타민 및 15% 우태 혈청(FBS)으로 보충된 Leibovitz의 L-15 배지에서 37℃에서의 성장이다. 이 배지는 CO2 평형 없이 환경에서 세포의 성장을 지지한다. MDA-MB-231 세포를 바람직하게는 1 내지 3 x 104 세포/cm2의 밀도로 시딩하고, 70-80% 융합성이 될 때 계대배양한다.
바람직하게는, 암/종양은 CDA 발현 수준이 동일한 조건 하에 동일한 방법을 사용하여 결정된 바와 같은 참조 암 세포주의 CDA 발현 수준의 80% 이하, 바람직하게는 70% 이하, 보다 바람직하게는 60% 이하, 가장 바람직하게는 50% 이하, 더 바람직하게는 40% 이하, 더욱 바람직하게는 30% 이하, 특히 25% 이하인 것이고, 여기서 상기 참조 암 세포는 MDA-MB-231이다.
바람직하게는, 암/종양은, CDA 발현 수준이 동일한 조건 하에 동일한 방법을 사용하여 결정된 바와 같은 참조 암 세포주에서의 CDA의 발현 수준보다 적어도 2배 더 낮고, 바람직하게는 적어도 2.5배 더 낮고, 바람직하게는 적어도 3배 더 낮고, 바람직하게는 적어도 3.5배 더 낮고, 바람직하게는 적어도 4배 더 낮고, 바람직하게는 적어도 4.5배 더 낮은 것이고, 여기서 상기 참조 암 세포주는 MDA-MB-231이다. 이 문맥에서의 "적어도 X배 더 낮은"은 암/종양에서의 최대 CDA 발현 수준이 참조 암 세포주의 발현 수준보다 정확히 X배 낮은 값인 것을 의미한다.
암/종양 및 참조 암 세포주의 CDA 발현 수준을 결정하기 위해 사용되는 방법 및 조건은 임의의 적합한 방법 및 조건일 수 있되, 단 동일한 방법 및 조건을 사용하여 참조 암 세포 세포주의 CDA의 발현 수준을 결정하는데 사용되는 바와 같은 암/종양에서의 CDA 발현 수준을 결정한다. 따라서, 참조 암 세포주는 대조군이다. 당업자는 암성 및 비-암성 세포에서의 관심 유전자, 예를 들어 CDA의 발현 수준을 유사하게 용이하게 결정할 수 있다. 이러한 방법은 당업계의 일반적인 지식의 일부이며, 임의의 적합한 방법이 본 발명의 문맥에서 사용될 수 있다.
예를 들어, 발현 수준은 단백질 수준에서 측정될 수 있다. 단백질 발현 수준을 측정하는 방법은 관련 기술분야에 잘 알려져 있다. 이들 방법은 일반적으로 관심 생물학적 샘플을 단백질의 발현 수준, 예컨대 항체를 측정하는데 적합한 하나 이상의 검출가능한 시약과 접촉시키고, 후속적으로 바람직하게는 정규화 후에 검출된 시약의 수준에 기초하여 단백질 발현 수준을 결정하는 것을 포함한다. 일반적으로 항체의 사용을 수반하는 방법의 예는, 비제한적으로, 웨스턴 블랏, 면역블랏, 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA), 효소-결합 면역스팟 (ELISPOT), 방사선면역검정 (RIA), 면역조직화학 및 면역침강을 포함한다. 항체의 사용을 반드시 수반하지는 않는, 단백질 발현 수준을 측정하기에 적합한 다른 방법이 사용될 수 있으며, 이에는 형광 활성화된 세포 분류 (FACS), 현미경검사 예컨대 원자력 현미경검사, 유동 세포측정, 미세세포측정, 단백질 결합 검정, 리간드 결합 검정, 마이크로어레이, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 예컨대 SDS-PAGE, 표면 플라즈몬 공명 (SPR), 포르스터(Forster) 공명 에너지 전달 (FRET), 생물발광 공명 에너지 전달 (BRET), 화학발광, 형광 분극화, 인광, 질량 분광분석법 예컨대 액체 크로마토그래피 질량 분광분석법 (LC-MS) 또는 액체 크로마토그래피/질량 분광분석법/질량 분광분석법 (LC-MS-MS), 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 비과시간 (MALDI-TOF), 표면-향상된 레이저 탈착/이온화 비과시간 (SELDI-TOF), 및 자기 공명 영상 (MRI) 가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.
그러나, 바람직하게는, 유전자 발현 수준, 예를 들어 CDA 발현 수준은 RNA 수준에서 측정될 수 있다. RNA 수준을 측정하는 방법은 관련 기술분야에 잘 알려져 있고, 임의의 적합한 방법이 본 발명의 문맥에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 마이크로어레이, RT-PCR, 정량적 실시간 PCR, RNA 서열분석, 노던 블랏, 프라이머 연장, RNase 보호 및 RNA 발현 프로파일링 방법이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 사용되는 방법은 RNA-seq 또는 마이크로어레이이다. RNA-Seq는 주어진 순간에 생물학적 샘플 내의 RNA의 존재 및 양을 결정하기 위해 차세대 서열분석(NGS)을 사용하는 잘 알려진 방법이다.
바람직하게는, 상기 참조 암 세포주가 MDA-MB-231인 참조 암 세포 세포주의 CDA 발현 수준과 비교하여 관심 암/종양에서의 CDA 발현 수준을 결정하기 위해 사용되는 방법은 하기에 언급되는 "마이크로어레이 방법 A"이다.
마이크로어레이 방법 A는 다음의 단계들을 포함한다:
1) 관심 암/종양 세포로부터 RNA 추출, 상기 추출은 바람직하게는 노르겐(Norgen) 총 RNA 정제 키트 (Norgen Biotek Cat nr. 17200)를 사용하여 수행되고 있는 단계;
2) 바람직하게는 제조업체의 지침 (Ambion)에 따라 MEGApure 키트를 사용하여, 추출된 RNA로부터 폴리(A)+ RNA를 제조하는 단계;
3) 역전사효소로의 처리에 의해, 즉 역전사를 수행함으로써 폴리(A)+ RNA로부터 상보적 DNA (cDNA)를 제조하는 단계;
4) TdT (말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제)를 사용하여 cDNA를 단편화하는 단계;
5) GeneChip WT 말단 표지 키트(Affymetrix)를 사용하여 cDNA 단편을 바이오티닐화하는 단계;
6) 단계 1 내지 5를 참조 세포주로 반복하는 단계로서, 상기 참조 세포주는 MDA-MB-231인 단계;
7) 단계 5에서 수득된 5.5 μg의 바이오티닐화 cDNA 단편을 45℃에서 16시간 동안 제1 DNA 마이크로어레이에 혼성화시키고, 단계 6에서 수득한 5.5μg의 바이오티닐화 cDNA 단편들을 45℃에서 16시간 동안 DNA 마이크로어레이와 혼성화시키는 단계로서, 바람직하게는 상기 마이크로어레이는 Affymetrix GeneChip Human Gene 2.0 ST Arrays (Applied Biosystems)인, 단계;
8) 바람직하게는 Affymetrix GeneChip Fluidics Station 450 (Applied Biosystems)에서 혼성화된 마이크로어레이를 세정하고 염색하는 단계;
9) 상기 염색된 마이크로어레이를 Affymetrix GeneChip Command Console® 소프트웨어를 이용하여 Affymetrix GeneChip Scanner 3000 7G로 스캐닝하여 CEL 파일 형태의 원시 데이터 신호 값을 생성하는 단계;
10) 바람직하게는 하기에 기재된 바와 같이, CEL 파일을 정규화하여 Affymetrix 소프트웨어 패키지 (버전 1.36.1)에서 Robust Multiarray Average (RMA)의 구현을 사용하여 유전자-수준 발현 값을 생성하는 단계: 문헌[R. A. Irizarry 등, Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostatistics 4, 249-264 (2003)];
11) affyPLM 패키지 (버전 1.34.0)를 사용하여 상대 로그 발현 (RLE) 및 정규화된 스케일되지 않은 표준 오차 (NUSE)를 계산함으로써 어레이 품질을 평가하는 단계. affyPLM 패키지로부터의 출력은 RLE 및 NUSE 분포 둘 다에 대한 박스플롯이다. RLE 박스플롯이 약 0에 집중되지 않은 어레이, 및 NUSE 박스플론이 약 1에 집중되어 있지 않은 어레이는 불량한 품질로서 플래깅되고 후속 분석으로부터 배제된다. 어레이가 배제되는 경우, 방법의 이전 단계가 반복된다.
12) Prcomp R 함수를 사용하여 주성분 분석(PCA)을 수행하는 것은 모든 샘플에 걸쳐 0의 평균 및 1의 표준 편차로 정규화된 발현 값을 갖는다. PCA는 데이터에서 대부분의 변이를 유지하면서 유전자 발현 데이터세트의 높은 차원성을 감소시키기 위한 차원성 감소 방법으로서 사용된다. 따라서, PCA의 성능은 다운스트림 분석 및 시각화를 위한 데이터의 더 낮은 차원성 표현을 달성한다.
13) 림마(limma) 패키지 (버전 3.14.4, http://bioinf.wehi.edu.au/limma)에서 구현된 중간 (실험적 베이지안(Bayesian)) t-검정을 사용하여 관심 암/종양 세포에서 및 참조 세포주 MDA-MB-231에서 CDA의 차등 발현을 평가하는 단계;
여기서 마이크로어레이 분석 단계 10 내지 13은 통계적 컴퓨팅(버전 2.15.1)을 위한 R 환경을 사용하여 수행된다.
바람직하게는, 상기 참조 암 세포주가 MDA-MB-231인 참조 암 세포주의 CDA 발현 수준과 비교된 관심 암/종양에서의 CDA 발현 수준은 EMBL-EBI 발현 아틀라스 데이터베이스 (https://www.ebi.ac.uk/gxa/home), GENEVESTIGATOR® 데이터베이스 (https://genevestigator.com/gv/), 암 세포주 백과사전 (https://portals.broadinstitute.org/ccle) 및 인간 단백질 아틀라스 (https://www.proteinatlas.org/)로부터 선택된 데이터베이스를 참조하여 결정된다.
유전자의 발현 수준은 전형적으로 관련 세포/조직에서 RNA 전사체의 총량과 비교하여 그 유전자에 대한 RNA 전사체의 상대적 양의 면에서 제시된다. 발현 수준은 전형적으로 백만 당 전사체 (TPM)의 단위로 제시되며, 즉 관심 세포/조직 내의 모든 1백만 개의 RNA 분자에 대해, [x] 많은 것은 관심 유전자로부터 유래된다. 또, TPM의 측면에서 RNA 전사체의 수준은 통상의 방법, 예컨대 정량적 실시간 PCR 또는 RNA 서열분석 방법에 의해 당업자에 의해 수득될 수 있고, 이러한 정보는 특히 자원 예컨대 TCGA, EMBL-EBI 발현 아틀라스, GENEVESTIGATOR® 데이터베이스 (https://genevestigator.com/gv/), 암 세포주 백과사전 (https://portals.broadinstitute.org/ccle) 및 인간 단백질 아틀라스 (https://www.proteinatlas.org/)로부터 이용가능하다. 이러한 방법이 본원에서 바람직하다. TPM에서 유전자 발현 수준의 결정을 위한 방법론은 예를 들어, 문헌[Wagner 등, (2012) Theory Biosci 131(4):281-285 or Mortazavi A 등, (2008) "Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq." Nature methods 5(7):621-8]에 기재되어 있다.
바람직하게는, CDA를 과발현하는 암성 세포/종양은 140 TPM 초과의 수준으로 CDA RNA 전사체를 함유한다. 반대로, CDA를 과발현하지 않는 암성 세포/종양은 바람직하게는 ≤ 140 TPM (140 TPM 이하) 수준의 CDA RNA 전사체를 함유한다. 대안적으로 볼 때, 본 발명의 바람직한 암성 세포/종양은 ≤140 TPM의 CDA 발현 수준을 갖는다. 따라서, 본 발명에 따라 치료되는 특히 바람직한 암/종양은 CDA를 ≤140 TPM, 보다 바람직하게는 ≤100 TPM 및 보다 더 바람직하게는 ≤50 TPM의 수준으로 발현하는 것이다.
바람직하게는, TPM의 단위로, 관심 암/종양에서 CDA의 발현 수준은 EMBL-EBI 발현 아틀라스 데이터베이스 (https://www.ebi.ac.uk/gxa/home), GENEVESTIGATOR® 데이터베이스 (https://genevestigator.com/gv/), 암 세포주 백과사전 (https://portals.broadinstitute.org/ccle) 및 인간 단백질 아틀라스 (https://www.proteinatlas.org/)로부터 선택된 데이터베이스를 참조하여 수득된다.
바람직하게는, 관심 암/종양에서 TPM의 단위로 CDA의 수준은 정량적 실시간 PCR, 또는 RNA 서열분석 (RNA-seq) 및 정량화에 의해, 상기 암/종양으로부터 유래된 세포를 사용하여 결정된다. 바람직하게는, 사용되는 방법은 RNA 서열분석이다. 바람직하게는, 사용되는 방법은 하기에서 언급되는 "RNA-seq 방법 A"이다.
TPM의 단위로 유전자의 발현 수준은 임의의 공지된 방법을 사용하여 결정될 수 있지만, 바람직하게는 RNA-seq를 사용하여 결정된다. RNA-Seq 방법이 관련 기술분야에 잘 알려져 있고 널리 상업적으로 이용가능하다. 임의의 적합한 RNA-seq 방법이 관심 암에서 TPM의 단위로 CDA 발현 수준을 결정하기 위해 사용될 수 있다. RNA-seq 방법 A로 명명된 하기 방법이 바람직하고, 하기 단계를 포함한다:
1. 관심 암/종양 세포로부터 총 RNA를 추출하는 단계. 이는 표준 RNA 추출 키트, 바람직하게는 QIAGEN AllPrep DNA/RNA Mini kit (Hilden, Germany)를 제조자의 지침에 따라 사용하여 수행될 수 있다.
2. 선택적으로, 추출된 RNA를 바람직하게는 자동화된 전기영동 도구, 바람직하게는 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies)에 의해 순도에 대해 정량화하고 평가하는 단계. Agilent Bioanalyzer는 RNA (및 DNA/단백질)에 대한 사이징, 정량화 및 품질관리를 위해 사용되는 미세유체 플랫폼이고, RNA 샘플의 단편화를 정량화하는 "RNA 무결성 번호" (RIN)를 제공한다. 바람직하게는, 샘플이 적어도 7, 바람직하게는 적어도 8의 RIN을 갖는 경우, 샘플은 단지 공정에서 추가로 사용된다.
3. 바람직하게는 Illumina TruSeqTM RNA Sample Preparation Kit (Illumina, San Diego, CA, USA) 및 관련 프로토콜을 사용하여 RNA-서열분석 라이브러리를 제조하는 단계. 바람직하게는, 이 공정에서 샘플 당 500-1000 μg의 총 RNA가 사용된다. 이러한 키트 및 프로토콜은 관련 기술분야에 잘 알려져 있다. 이 단계는 하기 단계를 포함한다:
3a. 바람직하게는 제조자의 지침에 따라 Ribo-Zero rRNA Removal Kit (Epicentre, Madison, WI, USA)를 사용하여, 추출된 RNA를 처리하여 박테리아 및 진핵 리보솜 RNA를 고갈시키는 단계.
3b. 남아있는 RNA를 역전사효소 및 무작위 육량체로 처리하여 100 내지 150개의 염기 길이, 또는 바람직하게는 200 내지 300개의 염기 길이의 단일-가닥 cDNA 단편을 생성하는 단계.
3c. 단일 가닥 cDNA 단편을 DNA 중합효소 I 및 RNase H로 처리하여 이중 가닥 상보성 DNA 단편 (cDNA)을 생성하는 단계; 및
3d. RNA-seq에 의해 분석될 수 있는 어댑터-cDNA 서열의 라이브러리를 생성하기 위해 cDNA 단편의 말단에 RNA-Seq 어댑터를 결찰시키는 단계. RNA-seq 어댑터는 당업계에 잘 알려져 있고, 임의의 적합한 어댑터가 사용될 수 있다. 어댑터는 서열분석을 허용하는 기능적 요소; 예를 들어, 증폭 요소 및 1차 서열분석 부위를 함유한다. 바람직하게는, 어댑터는 일루미나(Illumina) 인덱싱 어댑터이다. 어댑터는 각 cDNA 단편의 한 말단에 결찰되어 단일-말단 라이브러리(서열분석시 단편 당 하나의 "판독"을 생성함)를 생성할 수 있으며, 이 경우 단계 3b에서 cDNA 단편 길이는 100 내지 150개의 염기이다. 그러나, 바람직하게는, 어댑터는 각각의 cDNA 단편의 양쪽 말단에 결찰되어 쌍형성-말단 라이브러리 (서열분석될 때 단편 당 2개의 "판독물", 소위 "메이트 판독물" 또는 "쌍형성된 판독물을 생성할 것임)를 생성하고, 이 경우에 단계 3b에서의 cDNA 단편 길이는 200-300개의 염기이다.
4. 선택적으로, PCR에 의해 어댑터-cDNA 서열을 증폭시키는 단계. 이 단계는 서열 분석 단계 5가 수행되기에 DNA의 양이 불충분한 경우에 수행될 수 있다. 서열 분석에 필요한 DNA의 양은 당업자에게 잘 알려져 있다 (바람직하게는 DNA의 20pM 용액 70-135 μl, 보다 바람직하게는 125 μl를 단계 5에서 서열분석기의 유동 세포 내로 로딩함). 샘플 중 DNA의 양을 평가하는 방법은 통상적이며, 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 사용되는 방법은 형광분석법이고, 바람직하게는 Qubit® 형광측정기가 사용된다.
5. 바람직하게는 Illumina Flowcell 서열분석기, 바람직하게는 Illumina Flowcell HiSeq 2500 서열분석기 또는 Illumina Flowcell NovaSeq 6000 서열분석기를 사용하여, 바람직하게는 단일-말단 라이브러리가 단계 3에서 생산되는 경우 100 내지 150개 염기쌍의 서열분석 사이클을 사용하여, 보다 바람직하게는 단계 3에서 생산되는 쌍형성-말단(paired-end) 라이브러리와 함께 200 내지 300개의 염기 쌍의 서열분석 주기를 사용하여 어댑터-cDNA 서열을 서열분석하는 단계. 바람직하게는 70 내지 135 μl, 보다 바람직하게는 125 μl의 20pM DNA 용액을 유동 세포에 로딩한다. 수득된 원시 데이터 세트는 분석된 각각의 단편에 대한 고유한 서열 식별자, 그의 서열 (소위 "판독물"), 및 판독물 내의 각각의 염기 위치에서 서열의 서열분석기의 결정에서의 신뢰도의 표시 (소위 프레드(Phred) 품질 점수)을 제공할 것이다.
6. 결정된 서열의 데이터 세트로부터 제거함으로써 판독물의 품질 여과된 데이터 세트를 제조하는 단계:
i) 10 미만의 프레드 품질 점수를 갖는 판독물 내의 염기;
ii) 10 미만의 프레드 품질 점수를 갖는 동일한 판독물 내의 염기의 다운스트림 (즉, 서열분석 방향으로 후속)인 판독물 내 염기;
iii) 임의의 미결정 ("비명칭(uncalled)") 염기 ("N")를 함유하는 판독물;
iv) 상기 오염물 참조 게놈이 E. 콜라이 게놈인 오염물 기준 게놈으로 맵핑되는 판독물; 및
v) 사용된 RNA-seq 라이브러리가 쌍형성-말단 라이브러리인 경우, "메이트 판독물"의 판독물은 단계 6(iii) 내지 6(iv) 중 하나에서 폐기되었다.
7. 품질 여과된 판독물을 대상체 종의 게놈, 즉 바람직하게는 인간 게놈에 정렬시키는 단계. 바람직하게는, 품질-여과된 판독물은 Ensembl 데이터베이스 버전 98로부터의 인간 참조 게놈, 바람직하게는 게놈 인간 GRCh38 및 Ensembl 유전자 참조 특징 데이터베이스 (버전 Ensembl Genomes 45, GENCODE 32)에 정렬된다. 이 단계에 적합한 정렬 도구는 잘 알려져 있고, 널리 이용가능하며, 임의의 적합한 정렬 도구가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 정렬 도구는 TopHat2 (버전 2.1.1) [Trapnell 등, (2010) Nature Biotechnology 28, 511-515]이다.
8. CDA 유전자, 및 선택적으로 임의의 다른 관심 유전자에 대한 판독 카운트의 수의 결정하는 단계. 이러한 단계를 위한 생물정보학적 도구는 잘 알려져 있고, 널리 이용가능하며, 임의의 적합한 도구가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 유전자 당 판독 카운트는 HTSeq 패키지(htseq-count)를 사용하여 결정된다. 따라서, 이 단계는 미가공 판독 카운트 데이터를 제공한다.
9. 단계 8에서 수득된 미가공 판독 카운트 데이터를 백만 당 전사체의 단위 (TPM)로 전환시키는 단계. 이는 당업계에서 통상적으로 사용되는 표준 수학적 작업이다. TPM의 단위로 카운트 데이터를 제공하는 것은 TPM 값의 측정이 i) 유전자 길이; 및 ii) 서열분석 깊이에 대한 미가공 데이터를 정규화하는 것을 포함하기 때문에 유전자 발현 수준의 유의미한 평가를 허용한다.
i) 유전자 길이 정규화와 관련하여, 미가공 데이터에서, 더 높은 판독 카운트가 오직 더 긴 유전자에 대해 관찰될 수 있는데, 이는 유전자가 더 길고 따라서 더 많은 단편이 그 유전자와 정렬되기 때문이다. 유전자 길이에 대한 정규화는 각각의 유전자에 대한 판독 카운트를 유전자 길이(킬로베이스)로 나누는 것을 포함한다.
ii) 서열분석 깊이는 상이한 샘플에서 동일한 유전자 사이의 판독 카운트의 비교를 변경시키는 샘플간 효과이다. 이를 정규화하기 위해, 단계 9i)에서 수득된 킬로베이스 당 판독 카운트를 "백만 당 스케일링 인자"로 나누고, 이는 샘플 중 판독물의 총 수를 100만으로 나눔으로써 그 자체로 수득된다.
RNA-seq를 사용하여 얻은 유전자 발현 데이터는 킬로베이스 백만 당 판독 (RPKM)의 단위로 나타낼 수 있다. 이는 하기에 의해 계산된다:
i. 샘플 내의 판독의 총 수를 1,000,000만큼 나누어 "백만 당 스케일링 인자"를 제공하는 단계;
ii. 서열분석 깊이에 대해 정규화하는 "백만 당" 스케일링 인자에 의해 유전자 당 판독 카운트를 나눔으로써, 백만 당 판독의 단위(RPM)를 제공하는 단계; 및
iii. RPM 값을 유전자의 길이 (킬로베이스)로 나누어 유전자 길이에 대해 정규화함으로써 RPKM의 단위를 제공하는 단계.
유전자 발현의 또 다른 단위는 RPKM과 매우 유사한, 킬로베이스 백만 당 단편 (FPKM)이다. RPKM은 단일-말단 RNA-seq가 사용되는 경우에 적용가능하고, 여기서 모든 판독은 서열분석된 단일 단편에 상응한다. FPKM은 쌍형성-말단 RNA-seq에 적용가능하고, 여기서 2개의 판독은 단일 단편에 상응할 수 있거나, 또는 쌍에서 1개의 판독이 맵핑되지 않은 경우에, 1개 판독은 단일 단편에 상응할 수 있다. RPKM과 FPKM 사이의 유일한 차이는 FPKM 이 2개의 판독물이 1개의 단편에 맵핑될 수 있다는 것을 고려한다는 것이다 (따라서 이는 이 단편을 2회 계수하지 않는다).
TPM은 RPKM 및 FPKM과 매우 유사하다. 유일한 차이는 상기 조작 (i) 내지 (iii)의 순서이다. 따라서, TPM은 다음과 같이 결정된다:
i. 유전자당 판독 카운트를 유전자 길이에 대해 정규화하는 킬로베이스(kilobase)의 유전자의 길이에 의해 나눔으로써 킬로베이스당 판독 (RPK)의 단위를 제공하고;
ii. 샘플 중 총 RPK 값을 1,000,000으로 나누어 "백만 당 스케일링 인자"를 제공하고; 그리고
iii. 단계 (i)에서 얻어진 RPK 값을 단계 (ii)에서 얻은 "백만 당" 스케일링 인자로 나누어, 서열분석 깊이에 대해 정규화함으로써 TPM의 단위를 제공한다.
RPKM 또는 FPKM과 비교하여 TPM을 계산할 때의 유일한 차이는 유전자 길이에 대한 TPM 정규화를 먼저 계산할 때의 유일한 차이점이다. 그러나, 그 결과, TPM의 단위를 사용할 때, 각 샘플 내의 모든 TPM들의 합은 동일하다 - 1백만. 이는 각각의 샘플에서 유전자에 맵핑된 판독의 비율의 보다 유의미한 비교를 허용한다.
TPM의 단위로 CDA의 발현 수준을 결정하는 상기 기재된 RNA-seq 방법 A는 또한 대조군, 즉 상기 정의된 바와 같은 대조군 세포 또는 참조 세포주 (여기서, 상기 참조 세포주는 MDA-MB-231임)와 비교하여, TPM 단위에서 관심 암/종양에서의 CDA 발현 수준을 결정하는데 사용될 수 있다. 이들 구현예에서, RNA-seq 방법 A는 관심 암/종양 세포를 사용하여 수행될 수 있고, 대조군 또는 참조 세포와 함께 반복될 수 있으며, 이어서 결정된 TPM 값이 비교된다. 대안적으로, RNA-seq 방법 A는 관심 암/종양 세포를 사용하여 수행될 수 있고, TPM의 단위로 결정된 CDA 발현 수준은 동일한 방법을 사용하여 대조군 또는 참조 세포주를 사용하여 이전에 수득된 TPM 단위의 CDA 발현 수준을 위한 값과 비교된다.
대안적으로, 유전자의 발현 수준은 당해 분야에서 표준 기술인 마이크로어레이를 통해 결정될 수 있다. 임의의 적합한 마이크로어레이 기술이 본 발명의 문맥에서 사용될 수 있다. 마이크로어레이는 수천 개의 유전자의 발현을 동시에 검출할 수 있게 한다.
마이크로어레이에 의해 결정된 유전자 발현 수준은 임의의 척도, 예를 들어 선형 척도로 표현될 수 있다. 마이크로어레이로부터의 데이터는 또한 바람직하게는 로그 베이스 2 형질전환에 의해 변환될 수 있으며, 이는 연속적인 값의 스펙트럼을 생성하고 유사한 방식으로 상향 및 하향조절된 유전자를 처리하는 이점을 갖는다. 2배로 상향조절된 유전자는 1의 log2 형질전환된 값을 갖는다.
바람직하게는, 암/종양은 로그 베이스 2의 형질전환된 CDA 발현 수준이 11.75 미만인 것이다. 이러한 암/종양은 CDA를 과발현하지 않는 것으로 기재된다. 바람직하게는 암/종양은 로그 베이스 2의 형질전환된 CDA 발현 수준이 11.5 미만, 보다 바람직하게는 11 미만, 더욱 바람직하게는 10.5 미만, 더 바람직하게는 10 미만, 특히 바람직하게는 9.5 미만인 것이다.
바람직하게는, 암/종양은 선형 CDA 발현 수준이 6500 미만인 것이다. 이러한 암/종양은 CDA를 과발현하지 않는 것으로 기재된다. 바람직하게는 암/종양은 선형 CDA 발현 수준이 6000 미만, 더 바람직하게는 5000 미만, 더욱 바람직하게는 4000 미만, 보다 바람직하게는 3000 미만, 특히 바람직하게는 2000 미만, 가장 바람직하게는 1500 미만인 것이다.
바람직하게는, 관심 암/종양에서 CDA의 선형 또는 로그 베이스 2의 형질전환된 발현 수준은 EMBL-EBI 발현 아틀라스 데이터베이스 (https://www.ebi.ac.uk/gxa/home), GENEVESTIGATOR® 데이터베이스 (https://genevestigator.com/gv/), 암 세포주 백과사전 (https://portals.broadinstitute.org/ccle) 및 인간 단백질 아틀라스 (https://www.proteinatlas.org/)로부터 선택된 데이터베이스를 참조하여 수득된다.
당업자는 동일한 암 유형의 종양 사이에 일부 유전자의 발현 수준의 변화가 있을 수 있음을 알고 있다. 예를 들어, 일부 유방암은 CDA를 과발현할 수 있고, 다른 것들은 CDA를 과발현하지 않을 수 있다. 따라서, 바람직하게는, 본원의 어딘가 다른 곳에서 바람직한 것으로 기재된 암/종양은 바람직하게는 CDA가 발현되는 유형의 암/종양이고, 바람직하게는 CDA는,
i) 과발현되고;
ii) 과발현되지 않고;
iii) 저발현되고;
iv) 저발현되지 않고;
v) 과발현되거나 저발현되고; 또는
vi) 과발현되지도 저발현되지도 않는다.
바람직하게는, 암/종양은 CDA가 과발현되지 않는 것이다. 바람직하게는, 암/종양은 CDA가 과발현되는 것이다. CDA 과발현은 상기 정의된 바와 같다.
반대로, 본원에서 바람직하지 않은 것으로 기재된 암은 바람직하게는 CDA가 하기인 유형의 암/종양이다:
i) 과발현되고;
ii) 과발현되지 않고;
iii) 저발현되고;
iv) 저발현되지 않고;
v) 과발현되거나 저발현되고; 또는
vi) 과발현되지도 저발현되지도 않는다.
바람직하게는, 암/종양은 CDA가 과발현되는 것이 아니다. CDA 과발현은 상기 정의된 바와 같다.
바람직한 구현예에서, 암/종양은 젬시타빈 및/또는 사이타라빈 치료에 대해 내성이다. 따라서, 바람직한 것으로 본원의 어딘가에 기재된 암/종양은 바람직하게는 젬시타빈 및/또는 사이타라빈 치료 치료에 내성인 유형의 암/종양이다. 바람직하게는 젬시타빈 및/또는 사이타라빈 내성 암/종양은 뇌암, 바람직하게는 신경교종, 보다 바람직하게는 다형성 교모세포종이다.
인간 단백질 O-6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제 (MGMT)는 알킬화된 DNA 손상을 제거한다. MGMT의 발현은 암 세포, 예컨대 교모세포종 세포를, 종양 세포가 사멸되도록 심각하게 종양 세포를 돌연변이시킴으로써 암 화학요법 활성을 발휘하는 테모졸로마이드의 세포독성 효과에 대해 거의 완전히 내성으로 만든다. 테모졸로마이드는 DNA를 알킬화하여 돌연변이를 유발함으로써 작용한다.
본 실시예에 나타낸 바와 같이, 화학식 (I)의 화합물은 HPRT 검정에서 돌연변이유발성이 아니다. 따라서, 화학식 (I)의 화합물은 MGMT가 발현, 바람직하게는 과발현되는 암을 치료하는데 특히 유용하다. 따라서, 본원의 어딘가에 바람직한 것으로 기재된 암/종양은 바람직하게는 MGMT 가 발현, 바람직하게는 과발현되는 유형의 암/종양이다.
테모졸로마이드 (4-메틸-5-옥소-2,3,4,6,8-펜트아자바이사이클로[4.3.0]노나-2,7,9-트리엔-9-카복사미드)는 다형성 교모세포종에 대한 1차 치료이고, 또한 일부 다른 뇌암의 치료에 사용된다. 그러나, 본 실시예에 나타낸 바와 같이, 테모졸로마이드는 평가된 교모세포종 세포주의 절반 미만을 효과적으로 사멸시키고, 테모졸로마이드 내성 세포주는 본 발명의 화합물에 의해 효과적으로 사멸된다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 암/종양은 테모졸로마이드 내성 암/종양이다.
따라서, 본원의 어딘가에 바람직한 것으로 기재된 암/종양은 바람직하게는 테모졸로마이드 치료에 내성인 유형의 암/종양이다. 바람직하게는, 테모졸로마이드 내성 암/종양은 뇌암, 바람직하게는 신경교종, 더욱 바람직하게는 다형성 교모세포종이다.
본 실시예에 나타낸 바와 같이, 5-플루오로우라실 내성 세포주는 본 발명의 화합물에 의해 효과적으로 사멸된다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 암은 플루오로피리미딘 내성 암이다. 따라서, 본원의 다른 곳에서 바람직한 것으로 기재된 암/종양은 바람직하게는 플루오로피리미딘 치료에 내성인 유형의 암/종양이다. 바람직하게는 플루오로피리미딘 내성 암/종양은 뇌암, 바람직하게는 신경교종, 보다 바람직하게는 다형성 교모세포종이다. 바람직하게는 플루오로피리미딘은 5-플루오로우라실이다.
바람직하게는 암/종양은 테모졸로마이드 및 플루오로피리미딘 치료 둘 다에 대해 내성이다.
암/종양 요법의 문맥에서 용어 "내성"은 관련 기술분야에서 명확하고 잘 이해되는 의미를 갖는다. 내성은 암/종양이 관련 항암제(들)에 의한 치료에 양성으로 반응하지 않는 것, 즉 항암제(들)에 의해 치료가 치료 전의 암, 종양 또는 증상에 비해 암 또는 그의 하나 이상의 증상을 감소, 완화, 개선 또는 제거하거나, 또는 종양 내의 암 세포를 감소 또는 제거하지 않는 것을 의미한다. 암/종양은 치료 초기에 내성이 있을 수 있거나, 치료 동안 내성이 될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 암의 치료 또는 예방에서 화학식 (I)의 화합물은 단독으로 또는 선택적으로 추가의, 즉 하나 이상의 추가의 항암제(들)와 조합되어 사용될 수 있다. 본 발명의 모든 측면 및 구현예에서, 추가의 항암제는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 항암제일 수 있다. 광범위한 상이한 유형의 제제가 암의 치료에 사용하기 위해 공지되어 있거나 제안되며, 이들 중 임의의 것이 화학적 성질 또는 작용 방식에 상관없이 사용될 수 있다.
따라서, 항암제는 천연적으로 또는 합성적으로 유도되거나 제조된 화학적 분자 (예를 들어, 유기 소형 화학적 분자) 및 생물학적 분자, 예컨대 단백질 및 펩타이드 (예를 들면, 하기 논의된 면역치료제)를 포함하였다. 따라서, 항암 약물은 광범위한 상이한 화학적 또는 기능적 부류에 있을 수 있는 화학요법제 또는 약물, 뿐만 아니라 예를 들어 신체 내의 다양한 생리학적 과정 또는 세포, 예를 들어 면역 및/또는 항염증 반응 또는 세포 등을 자극, 활성화 또는 증진시키는 작용을 하는 항체 또는 항체 유도체 및 다른 생물학적 분자를 포함한다.
"화학요법" 부류 중 항암제의 대표적인 예는 비제한적으로 플루다라빈, 젬시타빈, 카페시타빈, 메토트렉세이트, 탁솔, 탁소테르, 머캅토퓨린, 티오구아닌, 하이드록시우레아, 사이타라빈, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 니트로소우레아, 백금 착체 예컨대 시스플라틴, 카보플라틴 및 옥살리플라틴, 미토마이신, 다카바진, 프로카바진, 에토포시드, 테니포시드, 캄파테신, 블레오마이신, 독소루비신, 이다루비신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 플리카마이신, 미톡산트론, L-아스파라기나제, 에피무비신, 5-플루오로우라실, 탁산 예컨대 도세탁셀 및 파클리탁셀, 류코보린, 레바미솔, 이리노테칸, 에스트라무스틴, 에토포시드, 질소 머스타드, BCNU, 니트로소우레아 예컨대 카무스틴 및 로무스틴, 빈카 알카로이드 예컨대 빈블라스틴, 빈크리스틴 및 비노렐빈, 이마티닙 메실레이트, 헥사메틸렌아민, 또는 토포테칸을 포함한다.
항암제는 키나제 억제제, 포스파타제 억제제, ATPase 억제제, 타이르포스틴, 프로테아제 억제제, 허비마이신 A, 게니스테인, 에르브스타틴, 및 라벤더스틴 A를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 항암제는 다음의 부류의 제제: 알킬화제, 식물성 알칼로이드, DNA 토포이성화효소 억제제, 항엽산제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, DNA 항대사제, 탁산, 포도필로톡신, 호르몬 요법, 레티노이드, 광감작제 또는 광역학적 요법에 사용하기 위한 제제, 혈관신생 억제제, 세포분열저지성 제제, 이소프레닐화 억제제, 세포 주기 억제제, 악티노마이신, 블레오마이신, 안트라사이클린, MDR 억제제 및 Ca2+ ATPase 억제제 중 하나 또는 그의 조합으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
추가 항암제는 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 성장 억제 인자, 호르몬, 가용성 수용체, 유인 수용체, 단클론성 또는 다클론성 항체, 단일특이적, 이중특이적 또는 다중-특이적 항체, 모노바디, 폴리바디로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
대안적인 항암제는 성장 또는 조혈 인자 예컨대 에리트로포이에틴 및 트롬보포이에틴, 및 그의 성장 인자 모방체로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
일 대표적인 구현예에서 약물은 소분자, 및 더 특히 소분자 화학요법제이다. 소분자 제제는 2000 Da 미만, 더 특히 1800, 1500, 1200, 1000, 900, 800 또는 700 Da 미만, 전형적으로 1000 Da 미만의 분자량을 갖는 것으로 정의될 수 있다. 예를 들어, 소분자 제제는 100 내지 1000 Da, 예를 들어 100 내지 800 Da 또는 300 내지 700 Da 범위의 크기를 가질 수 있다.
대안적인 구현예에서, 추가의 항암제는 면역요법제이다. 암을 치료하기 위한 면역 반응의 유도는 암 "면역요법"으로 알려져 있다. 면역요법은 예를 들어 세포-기반 요법, 항체 요법 또는 사이토카인 요법을 포함할 수 있다. 모든 3가지 접근법은 암 세포가 종종 면역계에 의해 검출가능한 상이한 세포-표면 마커, 또는 암 항원을 갖는다는 사실을 활용한다. 이들 항원은 가장 흔하게는 단백질이지만, 또한 탄수화물과 같은 다른 분자를 포함할 수 있다. 면역요법의 또 다른 예는 체크포인트 억제에 의한 것이며, 이에 의해 체크포인트 단백질이 억제된다. 이는 하기에서 추가로 논의된다.
따라서, 면역요법은 면역계가 암 세포를 공격하도록 유발하는 데 사용되며, 하기에 추가로 논의되는 바와 같이, 다양한 분자가 면역요법-기반 접근법의 표적일 수 있다. 예를 들어, 암에서의 면역치료적 개입을 위한 표적은 "CD" ("분화 클러스터") 단백질 예컨대 CD52, CD30, CD33, CD20, CD152 (또한 CTLA4로 알려져 있음) 및 CD279 (또한 프로그래밍된 세포사 1 단백질 PD-1로 알려져 있음); 성장 인자 예컨대 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 성장 인자 수용체 예컨대 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 또는 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2); 림프구-활성화 유전자 3 (LAG3); 및 B7 계열 단백질 예컨대 B7-H3 및 B7-H4를 포함한다. 그러나, 이들은 단지 대표적인 예일 뿐이고, 다른 분자는 암에서 면역치료적 개입을 위한 표적일 수 있다.
면역요법제는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질일 수 있다. 면역요법제는 항체, 사이토카인 및 체크포인트 억제제로부터 선택될 수 있다. 전술한 바와 같이 치료적 항암 항체는 체크포인트 단백질을 포함하는 다양한 표적을 가질 수 있다. 따라서, 항체는 체크포인트 억제제일 수 있다.
따라서, 제1 예에서, 면역치료제는 항체이다. 항체는 단클론성 또는 다클론성 항체, 단일특이적, 이중특이적 또는 다중-특이적 항체, 모노바디 및 폴리바디 또는 실제로 당업계에 공지된 많은 항체-유사 또는 항체 유도체 분자 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다. 따라서 용어 "항체"는 본원에서 광범위하게 사용되며, 당업계에 공지된 임의의 항체 및 임의의 항체 단편, 유도체 또는 변이체를 포함한다. 항체는 임의의 편리한 또는 목적하는 종, 부류 또는 하위유형의 것일 수 있다. 또한, 항체는 천연, 유도체화 또는 합성일 수 있다.
따라서, 항체는 다음과 같을 수 있다:
(a) 면역노글로불린의 다양한 부류 또는 하위부류 중 임의의 것, 예를 들어 임의의 동물, 예컨대 통상적으로 사용되는 임의의 동물, 예컨대 양, 토끼, 염소, 또는 마우스 또는 난황으로부터 유래된 IgG, IgA, IgM, IgD 또는 IgE;
(b) 단클론성 또는 다클론성 항체;
(c) 온전한 항체 또는 항체의 단편, 단클론성 또는 다클론성, 여기서 단편은 항체의 결합 영역을 함유하는 단편, 예를 들어 Fc 부분이 없는 단편 (예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 소위 "절반 분자" 단편 (온전한 항체의 중쇄 성분을 연결하는 디설파이드 결합의 환원적 절단에 의해 수득됨). Fv는 2개의 쇄로서 발현되는 경쇄의 가변 영역 및 중쇄의 가변 영역을 함유하는 단편으로서 정의될 수 있고;
(d) 단클론성 항체, 항체의 단편, 인간화 항체, 키메라 항체, 또는 합성적으로 제조되거나 변경된 항체-유사 구조를 포함하는, 재조합 DNA 또는 다른 합성 기술에 의해 생산되거나 변형된 항체.
항체의 기능적 유도체 또는 "등가물", 예를 들어 단쇄 항체가 또한 포함된다. 단쇄 항체는 융합 단쇄 분자로서 적합한 폴리펩티드 링커에 의해 연결된, 경쇄의 가변 영역, 중쇄의 가변 영역을 함유하는 유전자 조작된 분자로서 정의될 수 있다. 항체 및 항체의 단편 및 유도체의 생성 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
바람직한 구현예에서 항체는 단클론성 항체이다.
많은 경우에, 단클론성 항체는 변형이 없는 항체이고, 현재 사용되는 치료 항체의 대부분은 이러한 카테고리에 속한다. 그러나, 본 발명의 일 구현예에서, 항체, 예를 들어 단클론성 항체는 또 추가의 분자, 예컨대 독성 물질 또는 방사성 물질에 접합 또는 융합된다. 따라서, 접합된 또는 융합된 항체는 세포 (예를 들어 약물)에 독성이거나 방사성인 또 다른 분자에 연결된다. 항체는 암 세포의 표면 상의 특이적 항원에 결합하고, 독소 또는 방사선을 종양으로 유도한다.
알려진 및 승인된 항체는 다음을 포함한다: 알렘투주맙, 베바시주맙, 브렌툭시맙 베도틴, 세툭시맙, 젬투주맙 오조가미신, 이브리투모맙 티욱세탄, 이필리무맙, 오파투무맙, 파니투무맙, 리툭시맙, 토시투모맙 및 트라스투주맙.
제2 예에서, 면역치료제는 사이토카인이다. 사이토카인은 면역조절제, 예컨대 인터류킨 (IL) 및 인터페론 (IFN) 및 또한 콜로니 자극 인자, 종양 괴사 인자 (TNF) 및 다른 조절 분자를 포함한다. 사이토카인은 이의 기능, 분비 세포 또는 작용 표적에 기초하여 림포카인, 인터류킨 및 케모카인으로 분류되어 왔다. 각각의 사이토카인은 세포 기능을 변경시키는 세포내 신호전달의 캐스케이드를 개시하는 매칭 세포-표면 수용체를 갖는다. 암의 문맥에서, 사이토카인은 종양 내에 존재하는 많은 세포 유형에 의해 생성된다. 사이토카인은 당업계에 잘 알려져 있으며, 이러한 모든 사이토카인은 본 발명에 따라 사용하기 위해 포함된다. 이와 같이, 일 구현예에서, 면역치료제는 사이토카인이다. 바람직한 구현예에서, 사이토카인은 인터류킨 또는 인터페론이다.
인터류킨은 면역계에 광범위한 효과를 갖는 사이토카인의 군이다. 인터류킨(IL)의 예는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15 및 IL-17이다.
인터페론은 통상적으로 항바이러스 반응에 관여하는 면역계에 의해 생성된 사이토카인이지만, 또한 암의 치료에 사용된다. 인터페론 (IFN)의 3개의 군이 존재한다: 유형 I (IFNα 및 IFNβ), 2형 (IFNγ) 및 상대적으로 새로 발견된 유형 III (IFNλ).
상기 논의된 사이토카인의 모든 공지된 형태가 본 발명에서 사용될 수 있으며, 이는 또한 그의 기능적 등가 변이체, 유도체 및 단편을 포함한다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "사이토카인"은 공지된 사이토카인 폴리펩타이드의 아미노산 서열 변이체, 및 사이토카인 폴리펩타이드의 단편, 또는 그의 유도체를 포함하며, 단, 이러한 단편, 변이체 또는 유도체는 활성이거나 "기능적", 즉 관련 사이토카인의 적어도 하나의 기능 또는 활성 (예를 들어, 생물학적 활성)을 보유한다. 사이토카인은 재조합 폴리펩타이드, 합성 폴리펩타이드일 수 있거나 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 적합한 사이토카인은 상업적으로 이용가능하고 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 인간 사이토카인은 GenScript(Piscataway, NJ, USA)로부터 이용가능하다.
제3 예에서, 면역치료제는 면역 체크포인트를 표적화하는 제제, 즉 체크포인트 억제제이다. 체크포인트 단백질은 세포가 건강하고 세포가 파괴되어야 하는 면역계를 지시함으로써 면역계를 체크한다. 체크포인트 단백질은 T-세포 활성화를 방지함으로써 면역계에 "브레이크(brake)"로서 작용한다. 세포가 그의 표면 상에 충분한 체크포인트 단백질을 갖지 않는 경우, 이는 면역계에 의해 파괴될 수 있다. 암 세포의 경우, 세포가 암성인 것으로 신호전달하는 분자가 있을 수 있지만, 세포 표면 상에 충분한 체크포인트 단백질이 존재하는 경우, 세포는 면역 반응을 회피할 수 있고, 체크포인트 단백질이 일부 암 면역요법에서 성공의 결여에 기여하는 것으로 추측되었다.
몇 개의 체크포인트 억제제는 알려져 있고 본 발명에서 사용될 수 있고, 그 예는 Creelan (2014) Cancer Control 21:80-89에 기재된 억제제이다.
체크포인트 억제제의 예는 다음을 포함한다: 트레멜리무맙 (CP-675,206); 이필리무맙 (MDX-010); 니볼루맙 (BMS-936558); MK-3475 (예전에 람브롤리주맙); 우렐루맙 (BMS-663513); 항-LAG-3 단클론성 항체 (BMS-986016); 및 바비툭시맙 (키메라 3G4). 모든 이들 체크포인트 억제제는 본 발명에서 사용될 수 있다.
면역요법에 대한 대안적 옵션은 면역 세포 요법에 관한 것이고, 본 발명은 또한 이러한 요법, 예를 들어 입양 세포 전달과 조합되어 사용될 수 있다. 암을 치료하기 위한 다수의 T-세포 기반 요법이 개발되었고, 입양 세포 전달 (ACT)로서 공지된 이들 치료는 최근에 점점 더 매력적이게 되었다. 지금까지 3가지 주요 ACT 전략이 이용되었다. 이들 중 첫 번째, 및 가장 개발된 것은 말초 또는 종양 부위 (종양 침윤 림프구 (TIL)로 공지됨)로부터의 환자 자신의 종양-반응성 T-세포의 단리를 수반한다. 이들 세포는 생체외에서 확장되고, 환자에게 재주입된다.
환자 자신의 T-세포를 종양을 인식할 수 있는 수용체로 변형시키는 것을 포함하는 2개의 대체 요법이 이용가능하다. 한 옵션에서, 암 항원에 대한 활성을 갖는 TcR은 단리되고 특성화될 수 있고, TcR을 인코딩하는 유전자는 T-세포 내로 삽입되고 환자에게 재주입될 수 있다. 이 요법은 일부 환자에서 고형 종양을 수축시키는 것으로 나타났지만, 유의한 단점과 연관된다: 사용된 TcR은 환자의 면역 유형에 매칭되어야 한다. 따라서, TcR의 사용에 대한 대안으로서, T-세포에서 키메라 항원 수용체 (CAR)의 발현을 수반하는 요법이 또한 제안되었다. CAR은 TcR 복합체의 신호전달 도메인에 연결된 항체를 포함하는 융합 단백질이고, 적합한 항체가 선택되는 경우에 종양에 대해 T 세포를 지시하는 데 사용될 수 있다. TCR과 달리, CAR은 수령체에 MHC-매칭될 필요가 없다.
대안적으로, 세포는 CAR을 발현하도록 임의로 변형될 수 있는 자연 살해 (NK) 세포일 수 있다.
이와 같이, 본 발명에 따르면, 면역치료제는 세포, 특히 면역 세포, 예컨대 림프구, 특히 상기 기재된 바와 같은 T 세포 또는 NK 세포일 수 있고, 예를 들어 T 세포는 TIL일 수 있거나 TcR 또는 CAR을 발현하도록 변형될 수 있다. NK는 CAR을 발현하도록 변형될 수 있다.
추가의 항암제에 대한 대안적 옵션은 마이크로RNA (miRNA)이다. 마이크로RNA는 식물, 동물 및 일부 바이러스에서 발견되는 작은 비-코딩 RNA 분자 (약 22개 뉴클레오타이드 함유)이며, 이는 RNA 침묵 및 유전자 발현의 전사후 조절에서 기능한다. miRNA는 mRNA 분자 내의 상보적 서열과의 염기쌍 형성을 통해 기능한다. 그 결과, 이들 mRNA 분자는 mRNA 가닥의 2개의 단편으로의 절단, 그의 폴리(A) 테일의 단축을 통한 mRNA의 탈안정화, 또는 mRNA의 단백질로의 덜 효율적인 번역에 의해 침묵된다. miRNA는 상기 언급된 siRNA와 유사하나, 단, miRNA는 그 자체로 폴딩되어 짧은 헤어핀을 형성하는 RNA 전사체의 영역으로부터 유래된 반면, siRNA는 이중-가닥 RNA의 더 긴 영역으로부터 유래된다. 많은 miRNA는 다양한 유형의 암과의 연결을 갖는 것으로 밝혀졌고, 따라서 때때로 "온코미어(oncomir)"로 지칭된다.
마이크로RNA는 암의 치료에서 마이크로RNA-기반 종양학 치료제에 사용될 수 있다. miRNA 치료제를 개발하기 위한 근거는 비정상적으로 발현된 miRNA가 암의 개발에서 중요한 역할을 하고, miRNA 기능을 길항하거나 회복시킴으로써 이들 miRNA 결핍을 교정하는 것이, 예를 들어 miRNA 대체 요법에 의한 치료 이익을 제공할 수 있다는 전제를 기초로 한다.
임의의 적합한 miRNA가 본 발명에 따른 추가의 항암제로서 사용될 수 있다. miRNA는 유리 형태, 즉 또 다른 분자에 결합되지 않을 수 있다. 대안적으로, miRNA는 또 다른 분자, 예를 들어 본원에 논의된 바와 같은 항체에 접합 또는 결합될 수 있다.
가장 바람직하게는, 추가 항암제는 테모졸로마이드, 5-플루오로우라실, 젬시타빈, 사이타라빈 및 글리아델 (RTM)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 추가 항암제는 테모졸로마이드다. 바람직하게는, 추가 항암제는 5-플루오로우라실이다. 바람직하게는 추가 항암제는 젬시타빈이다. 바람직하게는 추가 항암제는 사이타라빈이다. 바람직하게는 추가 항암제는 글리아델 (RTM)이다.
화학식 (I)의 화합물 및 추가의 항암제는 조성물, 즉 약제학적 조성물의 형태로 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 본 발명은 화학식 (I)의 화합물 및 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하고, 임의로 추가의 항암제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
화학식 (I)의 화합물 및 추가의 (즉, 하나 이상의 추가의 또는 제2) 항암제(들)를 포함하는 생성물 (특히 약제학적 생성물)은 암의(즉, 종양의) 치료 또는 예방에서의 개별, 순차적 또는 동시 사용을 위한 조합 제제일 수 있다., 또는 화학식 (I)의 화합물이 추가의 항암제와 공동제형화된 생성물일 수 있다.
따라서, 화학식 (I)의 화합물 및 추가의 항암제는 단일 조성물로 또는 개별 투여를 위한 별도의 조성물로 함께 제형화될 수 있다. 이는 추가의 항암제의 성질 및 그의 선택 또는 필요한 투여 방식에 따라 달라질 것이다.
본 발명에 사용하기 위한 조성물은 약제학적 기술분야에 공지된 기술 및 절차에 따라, 예를 들어 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 사용하여 임의의 편리한 방식으로 제형화될 수 있다. 이러한 제형은 약제학적 또는 수의학적 용도를 위한 것일 수 있다. 이러한 제형에 사용하기에 적합한 희석제, 부형제 및 담체는 당업자에게 공지되어 있다.
본원에 언급된 "약제학적으로 허용 가능한"은 조성물의 다른 성분과 상용성일 뿐만 아니라 수령체에게 생리학상 허용되는 성분을 지칭한다. 조성물 및 담체 또는 부형제 물질, 복용량 등의 성질은 선택 및 목적하는 투여 경로, 치료 목적 등에 따라 통상적인 방식으로 선택될 수 있다.
따라서, "약제학적으로" 또는 "약제학적으로 허용 가능한"은 적절한 경우 포유동물, 특히 인간에게 투여될 때 불리한, 알러지성 또는 다른 유해한 반응을 생성하지 않는 분자 독립체 및 조성물을 지칭한다. 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제는 임의의 유형의 비-독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 제형화 보조제를 지칭한다.
약제학적 조성물은 제형을 위해 약제학적으로 허용 가능한 비히클을 함유한다. 이들은 특히 등장성 멸균 염수 용액 (인산일나트륨 또는 인산이나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 또는 염화마그네슘 등 또는 이러한 염의 혼합물), 또는 경우에 따라 멸균수 또는 생리학적 염수의 첨가시 용액의 투여를 허용하는 건조, 동결-건조 조성물일 수 있다.
본 발명의 화합물은 통상적인 약리학적 투여 형태, 예컨대 정제, 코팅된 정제, 비강 스프레이, 용액, 에멀젼, 리포좀, 분말, 캡슐 또는 지속 방출 형태로 제공될 수 있다. 통상의 제약 부형제뿐만 아니라 통상의 제조 방법이 이들 형태의 제조에 사용될 수 있다.
약제학적 조성물을 제조하기 위해, 본 발명에 따른 유효량의 화학식 (I)의 화합물 또는 추가의 항암 약물을 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 수성 매질 중에 용해 또는 분산시킬 수 있다. 조성물은 임의의 공지된 담체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 비경구 투여에 적합한 제형은 편리하게는 바람직하게는 수령체의 혈액과 등장성이 되도록, 일반적으로 염화나트륨, 글리세린, 글루코스, 만니톨, 소르비톨 등을 사용하여 제조된 약제학적 활성 성분의 멸균 수용액 및/또는 현탁액을 포함한다.
임의의 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 부형제는 특히 보존제 (예컨대 p-하이드록시벤조에이트), 킬레이트제 (예컨대 EDTA), 안정화제, 등장성 조정제, 항균제, 응집제/현탁화제, 습윤제, 용매 및 용매계, 항산화제 및 완충제를 포함한다. 특정 원하는 목적을 위해 약제학적 조성물을 제형화하는 경우에 이러한 부형제 및 그의 양을 선택하고 최적화하는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 능력 내에 있다.
조성물은 바람직하게는 수용액의 형태이다. 이러한 용액은 관련 기술분야에 공지된 방법에 따라 제조된 다음, 주사 바이알 또는 앰풀에 충전된다.
약제학적 조성물의 형태, 투여 경로, 투여량 및 레지멘은 당연히 치료될 암의 성질, 질병의 중증도, 환자의 연령, 체중 및 성별 등, 또는 대안적으로 목적하는 치료 기간에 따라 달라진다.
치료는 선택적으로 추가의 항암제와 함께 화학식 (I)의 화합물의 투여를 포함한다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 화학식 (I)의 화합물은 임의의 적절한 경로를 통해 대상체에게 투여될 수 있다. 화학식 (I)의 화합물을 포함하는 조성물 또는 제형에도 동일하게 적용된다.
화학식 (I)의 화합물, 및 따라서 이를 포함하는 조성물 및 제형은, 예를 들어 경구, 비강, 비경구, 정맥내, 국소, 직장 또는 척추강내 투여에 적합한 형태로 제공될 수 있다. 바람직하게는, 화합물은 전신 (예를 들어, 정맥내) 투여에 적합한 형태로 제시된다.
당업계의 통상적인 또는 표준의 임의의 투여 방식, 예를 들어 주사, 주입, 국소 투여, 흡입, 경피 투여가 의학 분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 내부 및 외부 체표면 등으로 사용될 수 있다. 따라서, 투여 방식은 경구, 비강, 장관, 직장, 질, 경점막, 국소 또는 비경구 투여 또는 흡입을 포함한다. 투여는 종양에 직접 이루어질 수 있다 (종양내 투여).
경구 또는 비경구 투여가 바람직하다. 바람직한 비경구 투여 수단은 정맥내, 근육내, 복강내, 두개내 및 피하 투여, 및 뇌척수액으로의 투여 (척수내 투여)이다. 더욱 바람직하게는, 투여는 복강내 또는 정맥내 투여, 가장 바람직하게는 정맥내 투여이다.
바람직하게는, 투여는 경구 또는 정맥내이다.
정맥내 투여는 정맥내 주사 또는 정맥내 주입, 가장 바람직하게는 정맥내 주입 (예를 들어, 주입 펌프에 의함)일 수 있다.
화학식 (I)의 화합물 및 추가의 항암제는 동일하거나 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 화학식 (I)의 화합물 및 추가의 항암제는 동시에, 별도로 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 화학식 (I)의 화합물 및 추가의 항암제는 순차적으로, 예를 들어 별개의 시간에, 즉 동일한 조성물 중에서 함께 투여되지 않고 투여된다. 대안적 구현예에서, 화학식 (I)의 화합물 및 추가의 항암제는 동시에, 예를 들어 동일한 조성물로 또는 별도의 조성물로 함께 투여된다. 개별 투여의 시기는 화학식 (I)의 특정한 화합물 또는 사용된 특정한 추가의 항암제, 제형 및/또는 투여 방식에 따라 결정될 수 있다. 따라서, 화학식 (I)의 화합물은 추가의 항암제 전에 또는 후에 투여될 수 있다.
예를 들어, 추가의 항암제가 먼저 투여될 수 있고, 화학식 (I)의 화합물은 이후 적합한 시간 간격으로 투여되어 표적 부위로의 추가의 항암제 전달의 최적 시간과 정렬되거나, 또는 그 반대일 수 있다. 이러한 결정은 전적으로 임상의의 일상적인 기술 내에 있다. 따라서, 예를 들어 화학식 (I)의 화합물은 바람직하게는 비경구로, 보다 바람직하게는 정맥내로 추가 항암제의 적어도 또는 최대 20, 30, 40, 50, 60, 70, 또는 90 분 또는 2, 3, 4, 5 또는 6 시간 전에 또는 후에 투여될 수 있다.
용량 및 복용량은 일상적인 방식으로 결정될 수 있고, 분자의 성질, 치료 목적, 환자의 연령, 투여 방식 등에 따라 달라질 수 있다. 상기 기재된 바와 같은 본 발명의 임의의 치료제는 약제학적으로 허용 가능한 부형제와 조합되어 치료 조성물을 형성할 수 있다. 용량은 한 번에 취해진 의약의 명시된 양을 지칭하며, 즉 용어 "단일 용량" 및 용량은 상호교환가능하게 사용된다. 치료 과정은 일정 기간에 걸쳐 다중 용량, 즉 다중 단일 용량을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법 및 용도에서, 바람직하게는 유효량의 화학식 (I)의 화합물, 및 존재하는 경우에 임의적인 추가의 항암제가 투여된다. 다시 말해서, 용량은 바람직하게는 유효량의 화학식 (I)의 화합물, 및 존재하는 경우에 임의적인 추가의 항암제를 포함한다.
실시예에 나타낸 바와 같이, 화학식 (I)의 화합물은 종양을 사멸시키는데 필요한 투여량에 비해 높은 투여량에서 허용된다. 이러한 특성은 많은 화학요법 화합물과 상이하고; 실제로, 대부분의 화학요법 화합물은 암을 사멸시키는데 필요한 용량에서 실질적인 부작용을 갖는다. 본 실시예는, 유리하게는, 화학식 (I)의 화합물은 종양을 사멸시키는데 필요한 용량을 훨씬 초과하는 용량으로 투여될 수 있음을 나타낸다.
실시예에 제시된 바와 같이, 마우스는 300 mg/kg 및 2000 mg/kg의 화학식 (I)의 화합물의 단일 용량을 용인하였지만, 8000 mg/kg의 단일 용량을 용인하지 않았다. 이들 데이터는 마우스에서 화학식 (I)의 화합물의 최대 허용 용량이 적어도 2000 mg/kg, 그러나 8000 mg/kg 미만임을 시사한다. 마우스 용량과 인간 용량 사이의 전환은 0.081의 인자이다 (Nair 등, (2016) Basic Clin Pharm. 7(2): 27-31. 따라서, 실시예의 데이터는 인간에서 화학식 (I)의 화합물의 최대 허용 용량이 적어도 162 mg/kg, 그러나 648 mg/kg 미만임을 나타낸다.
따라서, 바람직하게는, 화학식 (I)의 화합물은 ≤ 405 mg/kg, 바람직하게는 ≤ 324 mg/kg, 더 바람직하게는 ≤ 243 mg/kg, 더 바람직하게는 ≤162 mg/kg, 더 바람직하게는 ≤81 mg/kg, 더 바람직하게는 ≤40.5 mg/kg, 더 바람직하게는 ≤24.3 mg/kg의 용량으로 투여된다. 바람직하게는, 화학식 (I)의 화합물은 적어도 10 mg/kg, 더 바람직하게는 적어도 20 mg/kg, 더 바람직하게는 적어도 30 mg/kg, 더 바람직하게는 적어도 40 mg/kg, 더 바람직하게는 적어도 500 mg/kg, 더 바람직하게는 적어도 100 mg/kg의 용량으로 투여된다.
바람직하게는 화학식 (I)의 화합물은 10 mg/kg 내지 405 mg/kg, 바람직하게는 20 mg/kg 내지 324 mg/kg, 더 바람직하게는 20 mg/kg 내지 243 mg/kg, 더 바람직하게는 30 mg/kg 내지 162 mg/kg, 더 바람직하게는 40 mg/kg 내지 81 mg/kg의 용량으로 투여된다.
이들 용량은 인간 대상체에게 바람직한 용량이다.
복용량, 및 복용 레지멘은 대상체의 연령, 체중, 상태 및 성별, 치료 목적, 치료되고 있는 질환, 환자의 연령 및/또는 상태, 투여 방식 등과 같은 파라미터에 기초하여 달라질 수 있다.
적절한 복용량 및 레지멘이 쉽게 확립될 수 있다. 적절한 복용량 단위는 용이하게 제조될 수 있다. 투약 레지멘은 통상적인 방식으로 결정될 수 있다.
치료는 선택적으로 추가 항암제와 함께 화학식 (I)의 화합물의 단일 투여를 포함할 수 있거나, 또는 선택적으로 추가의 항암제와 동시에 화학식 (I)의 화합물을 반복 투여하는 것을 포함할 수 있다. 화학식 (I)의 화합물 및 추가의 항암제의 투약 레지멘은, 존재하는 경우에, 동일할 필요는 없다. 대안적으로, 치료는 화학식 (I)의 화합물의 단일 투여 및 추가의 항암제의 반복 투여, 또는 그 반대를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 화학식 (I)의 화합물은 바람직하게는 상기 기재된 용량 중 어느 하나로, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6일마다, 보다 바람직하게는 2,3 또는 4일 마다, 더욱 바람직하게는 3일마다 총 2 내지 10회, 보다 바람직하게 3 내지 8회, 더욱 바람직하게 4 내지 6회, 더 바람직하게는 5회의 투여로 투여된다.
그러나, 화합물의 성질, 치료 목적, 치료되는 질환, 환자의 연령 및/또는 상태, 투여 방식 등에 기초하여 적절한 투약 레지멘, 및 그 안의 관련 용량을 결정하는 것은 당업자의 능력 내에 있을 것이다.
본 발명은 또한 화학식 (I)의 화합물 및 추가의 항암제를 포함하는 생성물 또는 키트를 제공한다. 키트 또는 생성물은 본원에 기재된 임의의 용도 또는 방법에서, 즉 암을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위해 사용될 수 있다. 특히, 키트 또는 생성물은 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한 것이다. 바람직하게는, 화학식 (I)의 화합물, 및 선택적으로 또한 추가의 항암제는 비경구 투여, 바람직하게는 i.v. 투여를 위해 제형화된다.
본 발명의 키트의 각각의 구성요소 (즉, 각각의 항암제)은 별개의 구획 또는 용기에 제공될 수 있다. 편리하고 실용적인 경우, 구성요소의 혼합물이 제공될 수 있다. 구성요소는 건조, 예를 들어 결정화, 동결 건조 또는 동결건조 형태로 또는 용액으로 제공될 수 있고, 전형적으로 이러한 액체 조성물은 수성이고 표준 완충제, 예컨대 트리스, HEPES 등으로 완충될 것이다.
바람직하게는, 키트는 암을 치료하는데 사용하기 위한 것이고, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 방법 또는 용도에 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 화합물 (즉 화학식 (I), (IIa), (IIb), (IIIa), (IIIb), (IIIc), (IIId), (Iva), (IVb), (IVc), (IVd), (IVe) 및 (IVf)의 화합물)는 상업적으로 이용가능하거나, 문헌에 공지되어 있거나, 또는 적절한 시약 및 반응 조건을 사용하여 이용가능한 출발 물질로부터 표준 기술에 따른 통상적인 합성 절차에 의해 수득될 수 있다. 이런 점에서, 당업자은 특히 문헌["Comprehensive Organic Synthesis" by B. M. Trost and I. Fleming, Pergamon Press, 1991 and "Protective Groups in Organic Synthesis", 3rd edition, T.W. Greene & P.G.M. Wutz, Wiley-Interscience (1999)]를 언급할 수 있다.
본 발명의 화합물은 예를 들어 Berry and Associates, Toronto Research Chemicals, Sigma Aldrich, Carbosynth, Trilink Biotech 및 다른 잘 알려진 상업적 공급자로부터 상업적으로 이용가능하다.
본 발명은 하기 비제한적인 실시예를 참조하여 추가로 설명될 것이다:
도 1은 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 및 5-히드록시메틸시티딘이 마우스에서 잘 용인되고 마우스 이종이식 모델에서 인간 다형성 교모세포종 종양을 감소시킨다는 것을 보여준다.
도 1 a: 단일 용량 최대 허용 용량 프로토콜. 마우스에게 표시된 용량으로 단일 복강내 주사를 투여하였다. 관련 군의 모든 마우스가 표시된 용량을 용인하였다면, 용량은 표시된 바와 같이 확대되었다.
도 1b: 마우스 체중은 마우스에게 표시된 용량 및 표시된 화합물을 총 5회 용량에 대해 3일마다 복강내로 주사한 후 표시된 시점에 측정하였다.
도 1c 내지 h: U87-MG 세포를 32마리의 면역결핍 마우스의 옆구리에 이식하였다. 종양이 129 내지 131 mm3에 도달한 후, 마우스를 8마리 마우스의 4개의 군으로 나누었다. 음성 대조군을 비히클로 처리하고, 양성 대조군을 40 mg/kg 테모졸로마이드로 1일 1회 5일 동안 처리하고, 처리 군을 2000 mg/kg 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 또는 2000mg/kg 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘으로 3일마다 1회 총 5회 투여하였다. 종양 부피를 3일마다 측정하고 (도 1c), 마우스 체중을 3일 마다 측정하였다 (도 1d). 연구의 완료 시, 종양 성장 억제 백분율을 계산하고 (TGI(%)) (도 1e), 종양을 절제하고, 사진촬영하고 (도 1f), 측정하고 (도 1g), 절편화하고 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다 (도 1h).
도 2는 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 및 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘이 현 뉴클레오타이드 유사체와 관련되지 않은 메카니즘에 의해 다형성 교모세포종을 사멸시킨다는 것을 보여준다:
도 2a: 아넥신(Annexin) V 및 7AAD로 염색된, 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 및 5'-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘 처리된 세포의 유동 세포측정.
도 2b: 5-포르밀시토신, 5-포르밀시티딘, 또는 5-포르밀-2'-데옥시시티딘의 적정으로 처리된 HeLa 세포의 생존 곡선.
도 2c: 5-하이드록시메틸시토신, 5-하이드록시메틸시티딘, 또는 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘의 적정으로 처리된 U87-MG 세포의 생존 곡선.
도 3은 포유동물 세포에서 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 및 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘에 의해 유도된 히포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (HPRT) 유전자에서의 돌연변이의 정량화를 나타낸다. 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 및 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘은 돌연변이 유발성이 아닌 것으로 나타났다.
도 4는 3일의 처리 후 HeLa 세포에 대한 5-포르밀-2'-데옥시시티딘, 5-포르밀시티딘 및 5-클로로-2'-데옥시시티딘의 세포독성 수준 (생존율 %)을 나타낸다.
도 5는 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 (d5fC), 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘 (d5hmC), 5-클로로-2'-데옥시시티딘 (5CldC), 5-브로모-2'-데옥시시티딘 (5BrdC), 5-아이오도-2'-데옥시시티딘 (5IdC), 및 티미딘 대 U87-MG 세포의 세포독성 수준 (생존율 %)을 나타낸다.
도 6은 U87-MG 세포에서 티미딘의 첨가에 의해 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 및 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘의 세포독성 효과(생존율 %)가 구제되지 않는다는 것을 보여주며, 이는 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 및 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘이 티미딘 합성효소를 억제함으로써 작용하지 않음을 나타낸다.
도 7은 U87-MG 세포에서 테모졸로마이드와 조합된 5-포르밀-2'-데옥시시티딘의 세포독성 효과 (생존율 %)를 나타낸다.
도 8은 U87-MG 세포에서 테모졸로마이드와 조합된 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘의 세포독성 효과 (생존율 %)를 나타낸다.
도 9는 U87-MG 세포에 대한 5-메톡시메틸-2'-데옥시우리딘 및 5-아세톡시메틸-2'-데옥시우리딘의 세포독성 효과를 나타낸다. 72시간 동안 처리. 생존을 MTT 검정을 사용하여 정량화하였다.
도 10은 d5fCTP 또는 d5hmCTP로 처리한 후 다양한 세포의 생존율(%)을 나타낸다.
도 10a: 72시간 동안 5-포르밀-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트 (d5fCTP)로 처리한 후의 HeLa의 생존율 %. 생존율을 MTT 검정을 사용하여 정량화하였다.
도 10b: 72시간 동안 5-포르밀-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트 또는 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트로 처리한 후의 U87-MG 세포 (신경종, 등급 IV)의 생존율 %. 생존을 MTT 검정을 사용하여 정량화하였다.
도 11은 다양한 세포주의 CDA 발현 수준을 나타낸다. 값은 정규화된 Log2 CDA 발현 수준이다. 발현 수준은 Affymetrix 인간 게놈 U133 플러스 2.0 어레이 플랫폼 및 Genevestigator 데이터베이스 (https://genevestigator.com/gv/)를 사용하여 결정되었다.
도 12는 다양한 세포주에서의 선형 CDA 발현 수준을 나타낸다. 발현 수준은 Affymetrix 인간 게놈 U133 플러스 2.0 어레이 플랫폼 및 Genevestigator 데이터베이스 (https://genevestigator.com/gv/)를 사용하여 결정되었다.
도 13a 및 13b는 다양한 인간 뇌 종양에서의 CDA 발현 수준을 보여준다. 값은 정규화된 Log2 CDA 발현 수준이다. 발현 수준은 Affymetrix 인간 게놈 U133 플러스 2.0 어레이 플랫폼 및 Genevestigator 데이터베이스 (https://genevestigator.com/gv/)를 사용하여 결정되었다.
도 14a 및 14b는 다양한 인간 뇌 종양에서 선형 CDA 발현 수준을 보여준다. 발현 수준은 Affymetrix 인간 게놈 U133 플러스 2.0 어레이 플랫폼 및 GENEVESTIGATOR® 데이터베이스 (https://genevestigator.com/gv/)를 사용하여 결정되었다.
도 15는 2d5hmC 및 2d5fC가 혈액-뇌 장벽을 통과할 수 있음을 입증하는 PAMPA 검정의 결과를 나타낸다.
실시예
물질 및 방법
동물
하우징, 실험, 및 동물의 처분을 포함한 이러한 작업의 모든 양태는 일반적으로 AAALAC-승인된 실험실 동물 시설에서 문헌[Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition (National Academy Press, Washington, D. C., 2011)]에 따라 수행되었다. 동물 관리 및 사용 프로토콜은 Pharmacology Discovery Services Taiwan, Ltd.에서 IACUC에 의해 검토되고 승인되었다.
세포 배양물
1차 신경교종 신경 줄기 (GNS) 세포 (G7, G14, G144, G166)를, 신경 줄기 세포 배지 (50% DMEM-F12 (Thermofisher, Cat. Nr. 21041025), 50% 신경기초 배지 (Thermofisher, Cat. Nr. 10888-022), N2 (Life Technologies, Cat. Nr. A-003-E) 및 B27 보충물 (Life Technologies, Cat.Nr. 12587010), 1 mM 나트륨 피루베이트 (Life Technologies, Cat.Nr. 11360-039), 2 mM 글루타맥스 (Life Technologies, Cat. Nr. 35050038), 1 mM HEPES (Fisher Scientific, Cat. Nr. BP299-1), 0.1 mM β-머캅토에탄올 (Life Technologies, Cat. Nr. 31350010), 1x 비필수 아미노산 (Life Technologies, Cat. Nr. 11140-035), 0,006 % 소 혈청 알부민 (Sigma, Cat. Nr. A8577-10ML), 4 μg/ml 헤파린 (Sigma, Cat. Nr. H3149-25KU), 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 20ng/ml hEGF (R&D Systems, Cat. Nr. 236-EG-200), 10ng/ml bFGF (Peprotech, Cat. Nr. 100-18B)에서 폴리-D-라이신(Merck Millipore, Cat. Nr. A-003-E) 및 라미닌 (R&D Systems, Cat.Nr. 3446-005-01) 코팅된 플레이트 상에서 배양하였다.
10% 우태아 혈청 및 100 U/ml 페니실린 100 U/ml 스트렙토마이신이 보충된 변형된 맥코이(McCoy) 5a 배지 (Life technologies, Cat.Nr. 36600021)에서 HCT116를 성장시켰다.
10% 우태아 혈청 및 100 U/ml 페니실린 100 U/ml 스트렙토마이신이 보충된 DMEM:F12 배지 (Life Technologies, 21331-020)에서 Arpe 19를 성장시켰다.
10% 우태아 혈청 및 100 U/ml 페니실린 100 U/ml 스트렙토마이신이 보충된 IMDM (Gibco, Cat. Nr. 12440-05)에서 HAP1을 성장시켰다.
10% 우태아 혈청 및 100 U/ml 페니실린 100 U/ml 스트렙토마이신이 보충된 DMEM (Sigma, Cat.Nr. D6429)에서 상기에 언급되지 않은 세포주를 성장시켰다. 모든 세포를 37℃에서 5% CO2 가습 물-재킷형 인큐베이터에서 유지하였다. 세포를 70 내지 90% 합류점으로 통과시켰다.
약물
본 실시예에 사용된 화합물은 다음과 같이 수득하였다 (CAT# = 카탈로그 번호).
Figure pct00010
생존 검정
96-웰 플레이트에서, 100 μl의 상응하는 배지 중 4000개의 세포를 시딩하였다. 다음날, DMSO 중에 희석된 약물을 8개의 농도로 3회 첨가하였다. 약물을 100 μM로부터 출발하여 4배 희석 시리즈로서 첨가하였다. 세포를 약물과 함께 72시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 증식은 제조자의 프로토콜(ATCC, Cat. Nr. 30-1010K)에 따라 MTT 검정으로 평가하였다. 세포 생존을 DMSO만으로 처리된 세포의 생존에 대해 정규화하였다. 실험을 3회 수행하고, 데이터는 9개의 웰의 평균 ± SEM을 나타낸다.
MTD (최대 허용 용량)
5 mL/kg의 투여 부피로 IP 투여를 위해 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘 및 5-포르밀-2'-데옥시시티딘(Berry and Associates)을 디메틸 설폭사이드 (DMSO)/ 솔루톨 (RTM) R HS15/ 포스페이트 완충 염수 (PBS) (5/5/90, v/v/v) 중에서 30 및 200 및 400 mg/mL의 농도로 제형화하였다. 10 또는 20 mL/kg의 투약 부피를 적용하였다.
23±3 g의 수컷 ICR 마우스를 BioLasco Taiwan (Charles River Laboratories Licensee 하에)에 의해 제공하였다. 동물을 사용 전 3일 동안 순응시키고, 우수한 건강으로 확인하였다. 모든 동물을 제어된 온도(20 내지 24℃), 습도(30 내지 70%) 및 12시간의 명/암 사이클을 갖는 위생 환경에서 유지시켰다. 멸균 표준 실험실용 식이 [MFG (Oriental Yeast Co., Ltd., Japan)] 및 고압증기멸균된 수돗물에 대한 자유로운 접근이 승인되었다.
5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘 및 5-포르밀-2'-데옥시시티딘을 체중 23 ± 3 g의 3마리의 수컷 ICR 마우스의 군에 IP 투여하였다. 동물은 300 mg/kg의 초기 용량을 받았다. 동물이 72시간 동안 생존한 경우, 다음 코호트에 대한 용량을 증가시켰다. 하나 이상의 동물이 사망한 경우, 다음 코호트에 대한 용량은 감소하였다. 모든 동물이 상한에서 생존할 때, 또는 3개의 용량 수준이 시험될 때 또는 상한 또는 하한에 도달될 때 시험을 중지하였다. 각각의 용량 수준에서, 동물을 처음 30분 동안, 다시 1, 24, 48 및 72시간 동안 급성 독성 증상 (사망률, 경련, 진전, 근육 이완, 진정 등) 및 자율신경 효과 (설사, 타액분비, 눈물 분비, 혈관확장, 입모 등)의 존재에 대해 관찰하였다. 체중을 투여 전 및 72시간에 기록하였다. 동물을 관찰하고, 화합물 투여 후 매일 치사율을 확인하였다. 조직 수집 없이 모든 동물에 대한 총 검시를 수행하고, 연구 설계 표에 기초하여 다음 용량 수준을 결정하였다.
다수의 MTD
20 mL/kg의 투여 부피에서 IP 투여를 위해 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘 및 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 (Berry and Associates)을 디메틸 설폭사이드 (DMSO)/ 솔루톨 (RTM) R HS15/ 포스페이트 완충 염수 (PBS) (5/5/90, v/v/v) 중에서 15, 50 및 100 mg/mL의 농도로 제형화하였다. 시험 화합물을 총 5회 용량에 대해 3일마다(q3dx5) 투여하였다.
23±3 g의 수컷 ICR 마우스를 BioLasco Taiwan (Charles River Laboratories Licensee 하에)에 의해 제공하였다. 동물을 사용 전 3일 동안 순응시키고, 우수한 건강으로 확인하였다. 모든 동물을 제어된 온도 (20 내지 24℃), 습도 (30 내지 70%) 및 12시간의 명/암 사이클을 갖는 위생 환경에서 유지시켰다. 멸균 표준 실험용 식이 [MFG (Oriental Yeast Co., Ltd., Japan)] 및 고압증기멸균된 수돗물에 대한 자유로운 접근이 승인되었다.
동물은 각각의 치료 (1, 4, 7, 10 및 13일) 후 처음 30분 동안, 그리고 다시 최종 용량 (13일) 후 1, 24, 48 및 72시간에 급성 독성 증상 (사망, 경련, 떨림, 근육 이완, 진정 등) 및 자율신경 효과 (설사, 타액분비, 눈물 분비, 혈관확장, 입모 등)의 존재에 대해 관찰되었다. 동일한 계획에서 사망률을 기록하였다. 또한, 체중을 각 치료 전 및 최종 투여 후 24, 48 및 72 시간에 기록하였다. 조직 수집 없이 모든 동물에 대해 총 검시를 수행하였다.
이종이식
5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘 및 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 (Berry and Associates) 투약 용액을 먼저 적절한 부피의 DMSO를 미리-칭량된 화합물에 첨가하고, 이어서 적절한 부피의 솔루톨 (RTM) 및 PBS (5% DMSO/5% 솔루톨 (RTM)/90% PBS)를 첨가함으로써 각각의 용량 투여 전에 투여 용액을 신선하게 제조하였다. 표준 제제인 테모졸로마이드는 Oslo University Hospital에 의해 분말 형태로 제공되었고, 먼저 적절한 부피의 DMSO를 미리 칭량된 화합물에 첨가하고, 이어서 적절한 부피의 솔루톨 (RTM) 및 PBS (5% DMSO/5% 솔루톨 (RTM)/90% PBS)를 첨가함으로써 각각의 용량 전에 신선하게 제형화되었다. 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘 및 5-포르밀-2'-데옥시시티딘을 20 mL/kg의 용량 부피로 투여하였다. 표준 제제인 테모졸로마이드를 10 mL/kg의 용량 부피로 투여하였다.
인간 뇌 악성 신경교종 세포주 U87-MG (ATCC HTB-14, 상피 교모세포종)를 미국 종균 협회 (ATCC)로부터 입수하였다. 세포를 5% 소 태아 혈청 (FBS)을 함유하는 최소 필수 배지에서 37℃에서 5% CO2와 함께 인큐베이터에서 배양하였다.
BioLasco Taiwan (Charles River Laboratories Licensee 하에)으로부터 입수한 6-7주령의 암컷 (nu/nu) 누드 마우스를 사용하였다. 동물을 개별적으로 환기된 케이지 (IVC, 36 Mini Isolator 시스템)에 수용하였다. 5마리 동물에 대한 할당은 cm 단위로 27 x 20 x 14이었다. 모든 동물을 12-시간 명/암 주기로 제어된 온도 (20-24℃) 및 습도 (30%-70%) 하에 위생 환경에서 유지시켰다. 표준 실험실용 식이 [MFG (Oriental Yeast Co., Ltd., Japan)] 및 고압증기멸균된 수돗물에 대한 자유로운 접근이 승인되었다.
살아있는 U87-MG (ATCC HTB-14) 세포를 암컷 nu/nu 마우스의 우측 옆구리에 피하로 (SC) 이식하였다 (0.2 mL/마우스로 PBS 중 5 x 106 세포/마우스). 군 평균 종양 부피가 대략 129 mm3 내지 131 mm3에 도달했을 때, 종양 이식된 마우스를 4개의 처리군으로 나누고, 각각의 군은 8마리의 동물을 함유하고, 용량 투여를 개시하였다 (1일째로 표시됨).
5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘, 2000 mg/kg의 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 및 상응하는 비히클 (5% DMSO/5% 솔루톨 (RTM)/90% PBS)을 총 5회 투여를 위해 3일마다 1회 복강내로 (IP) 투여하였다. 테모졸로마이드 40 mg/kg을 5회의 총 투여를 위해 1일 1회 경구 (PO) 투여하였다.
종양 부피, 체중, 사망률, 및 명백한 독성의 징후를 모니터링하고, 29일 동안 매주 2회 기록하였다. 종양 부피 (mm3)를 타원체 공식에 따라 길이 x (폭)2 x 0.5로 추정하였다. 종양 성장 억제 (T/C)를 하기 식에 의해 계산하였다:
%T/C = (Tn/Cn) x 100%
Cn: 대조군에서 n일째에 측정된 종양 중량
Tn: 치료군의 n일째에 측정된 종양 중량
%T/C 값 ≤42%는 유의한 항종양 활성 (#)으로 간주되었다.
종양 성장 억제율 (TGI) 퍼센트를 또한 하기 식에 의해 계산하였다:
%TGI = (1 - (Tn/Cn)) Х 100%
%TGI 값 ≥58%는 유의한 항종양 활성 (#)으로 간주되었다.
2원 ANOVA (RTM)에 이어서 본페로니 시험을 또한 사용하여 연구 동안 음성 대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 차이를 확인하였다: 제1일 내지 제29일. 차이는 p < 0.05 (*)에서 유의한 것으로 간주된다.
연구 완료시, 종양을 연구시 모든 동물로부터 절제하고 사진을 찍었다.
HPRT 검정
HPRT 돌연변이유발 검정을 V79 세포에서 수행하였다. 50,000개의 V79 세포를 6 웰 플레이트에서 24시간 동안 3개의 상이한 농도의 d5hmC 또는 d5fC (1, 10, 100 μM)로 처리하였다. DMSO를 음성 대조군으로서 사용하였다. 처리 후, 세포를 필요에 따라 T75 플라스크에서 9일 동안 계대배양하여 HPRT-돌연변이체를 발현시켰다. 10,000개의 세포를 선택 배지 (2.5 μg/ml의 6TG)와 함께 10개의 복제 페트리 디쉬 (100 x 15 mm)에 재분주하였다.
200개의 세포를 선택 배지 없이 4개의 복제 페트리 디쉬(60 x 15 mm) 내로 분주함으로써 생존(상대적 분주 효율)을 결정하였다. 콜로니를 고정시키고, 김사(Giemsa) 염색하고, 7일 후에 계수하였다. 돌연변이체 빈도는 모든 플레이트에서 계수된 돌연변이체의 총 수를 재시딩 플레이팅 효율에 의해 보정된 시딩된 세포의 수로 나눈 것으로 표현된다. 실험을 3회 수행하고, 데이터는 3회 ± SEM의 평균을 나타낸다.
세포자멸사 유동 세포측정
100,000개의 세포를 6-웰 플레이트에 시딩하고, 100 μM의 테모졸로마이드, 2'-데옥시-5-하이드록시메틸시티딘, 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 또는 DMSO와 함께 72시간 동안 인큐베이션하였다. 제조자의 프로토콜에 따라 아넥신 V-7-아미노-액티노마이신 D(7-AAD) 세포자멸적 검출 키트(Nordic Biosite AS, Cat. Nr. 640922)를 사용하여 세포자멸적 세포의 검출을 평가하였다.
형광-활성화된 세포 분류 분석을 LSR Fortessa (BD Biosciences) 상에서 수행하고, 데이터를 FlowJo 소프트웨어 상에서 분석하였다. 모든 실험은 3회 수행하였다.
웨스턴 블랏
웨스턴 블롯을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (문헌 [Towbin 등, 1979. Biotechnology, 24, 145-149). 항-CDA 항혈청 (Abcam, cat nr. Ab82346)을 제조자의 권장 농도에 따라 사용하였다. 단백질은 2차 항체에 접합된 겨자무 과산화효소에 의한 루미놀의 산화에 의해 생성된 신호에 의해 정량화하였다.
실시예 1 : 종양 세포에 대한 세포독성
상기 기재된 바와 같이 성장된 HeLa 세포 (물질 및 방법)를 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘 및 5-포르밀-2'-데옥시시티딘으로 처리하였다. 이들 화합물을 사용한 3일의 처리 후, 세포 생존을 상기 기재된 바와 같이 평가하였다 (물질 및 방법). 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘으로 처리한 후의 생존은 DMSO 처리된 세포와 다르지 않은 반면, 놀랍게도 5-포르밀-2'-데옥시시티딘은 HeLa 세포에 세포독성인 것으로 밝혀졌다.
5-포르밀-2'-데옥시시티딘의 세포독성 효과를 2개의 잘 기재된 세포독성 화합물, 5-플루오로우라실 및 테모졸로마이드와 비교하였다. 5-포르밀-2'-데옥시시티딘은 5-플루오로우라실 (IC50 > 25 μM) 및 테모졸로마이드 (IC50 > 25 μM) 둘 다에 비해 HeLa(IC50 = 0.76μM) 세포에 대해 더 세포독성인 것으로 결정되었다.
5-포르밀-2'-데옥시시티딘이 자궁경부 암종 (HeLa) 세포에 세포독성이라는 지식으로, 연구를 두 방향으로 확장시켰다: (i) 추가 화합물을 평가하였다: 5-카복실-2'-데옥시시티딘; 및 (ii) 광범위한 인간 암 세포주에 대한 그의 세포독성 효과를 평가하였다 (표 1).
Figure pct00011
표 1에 제시된 바와 같이, 5-카복실-2'-데옥시시티딘은 평가된 임의의 암 세포주에서 세포독성 특성을 갖지 않았다. 흥미롭게도, 5-포르밀-2'-데옥시시티딘은 광범위한 인간 암 세포에 세포독성이며, 이는 광범위한 암의 치료에서의 그의 잠재적인 용도를 나타낸다. 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘은 보다 좁은 세포독성 프로파일을 가지며; 실제로 상기 시티딘 유도체는 평가된 2개의 세포주에 대해서만 세포독성이었다: U87-MG, 등급 IV 신경교종 세포 (IC50 > 0.3340 μM) 및 HAP1 만성 골수성 백혈병 세포 (IC50 > 3.027 μm). 이는 상기 화합물이 환자에 의해 잘 용인될 수 있음을 시사한다. 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 및 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘은 다형성 교모세포종 세포주 (U87-MG)에 가장 세포독성인 것으로 관찰되었다.
5-포르밀-2'-데옥시시티딘 및 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘의 가장 큰 세포독성 효과가 신경교종 등급 IV (U87-MG) 세포에서 관찰되었기 때문에, 이들 화합물의 세포독성 활성은 보다 광범위한 환자 유래 등급 IV, 신경교종 세포에서 평가되었다 (표 2). 이전 검정에서 활성의 결여로 인해, 5-카복실-2'-데옥시시티딘은 이러한 보다 엄격한 분석에 포함되지 않았다.
Figure pct00012
표 2에 나타낸 바와 같이, 관련 화합물로 처리한 후, 12개의 등급 IV, 신경교종 세포주 중 5개를 5-포르밀-2'-데옥시시티딘에 의해 사멸시켰고, 12개 등급 IV, 신경아종 세포주 중 6개를 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘에 의해 사멸시켰다. 이는 광범위한 신경교종에 대한 이들 화합물의 능력을 나타낸다. 이들 결과는 등급 IV, 신경교종에 대한 현행 선행 치료인 테모졸로마이드, 및 광범위한 사용 항암 약물인 5-플루오로우라실 둘 다에 대해 기준점이 되었다. 테모졸로마이드는 12종의 신경교종, 등급 IV 세포주 중 5개를 효과적으로 사멸시켰고, 5-플루오로우라실은 12종의 뇌교종, 등급 IV 세포주 중 11개를 사멸시켰다. 따라서, 데이터는 5-포르밀-2'-데옥시시티딘이 등급 IV, 신경교종에 대한 현행 선행 처리만큼 효과적이며, 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘은 등급 IV인 신경교종의 현행 선행 처리보다 더 효과적이라는 것을 입증한다.
또한, 표 2는 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 및 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘 둘 다가 현재의 선행 처리에 내성인 세포주 (테모졸로마이드)에 세포독성이라는 것을 입증한다. 이는 이들 화합물이 이러한 테모졸로마이드 내성 종양에 대한 현재의 치료보다 더 우수하게 수행할 수 있다는 증거를 제공한다. 대안적으로, 표 2는 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 및/또는 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘과 조합된 테모졸로마이드가 최적의 치료일 것임을 나타낸다.
실시예 2: 정상 세포에 대한 세포독성
실시예 1에서 입증된 바와 같이, 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 및 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘은 암, 특히 등급 IV 신경교종, 및 특히 테모졸로마이드 치료에 내성인 암의 치료에 유용한 치료제이다.
본 발명자들은 이들 화합물이 정상 인간 세포를 사멸시키는 정도를 추가로 조사하였고; 정상 인간 세포에 대한 낮은 세포독성이 항암제에 대한 유리한 특성이다. 따라서, 다양한 정상 인간 세포주에서의 이들 화합물의 세포독성을 조사하였다 (표 3). 세포를 성장시키고, 생존 검정을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다 (물질 및 방법).
Figure pct00013
표 3에 나타낸 바와 같이, 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘은 평가된 임의의 정상 세포주에 세포독성이 아니었다. 5-포르밀-2'-데옥시시티딘은 단지 하나의 정상 인간 세포주 (HaCat, 각질형성세포)에만 세포독성이었다. 이들 결과는 이들 화합물이 효과적인 암 화학요법제일 뿐만 아니라 인간에 의해 잘 용인될 수 있음을 나타낸다.
실시예 3: 최대 허용 용량
5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘 및 5-포르밀-2'-데옥시시티딘이 정상 세포에 대해 제한된 효과를 갖기 때문에, 본 발명자들은 암 화학요법과 정상적으로 연관된 부작용을 유발하지 않으면서 화합물을 비교적 높은 용량으로 제공할 수 있다고 생각하였다. 마우스에서 이들 화합물의 최대 허용 용량 (MTD)을 상기 기재된 바와 같이 결정하였다 (물질 및 방법). MTD 계획이 개발되었다 (도 1a). 연구의 종점은 72시간 후 생존이었지만, 동물에서 급성 독성 증상 (사망률, 경련, 떨림, 근육 이완, 진정 등) 및 자율신경 효과 (설사, 타액분비, 눈물 분비, 혈관확장, 입모 등)의 존재를 처음 30분 동안, 및 다시 1, 24, 48 및 72시간에 모니터링하였다. 체중을 투여 전 및 72시간에 기록하였다.
결과는, 마우스가 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 및 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘의 단일 용량 300 mg/kg 및 2000 mg/kg을 견딜 수 있음을 나타내었다. 마우스는 8000 mg/kg의 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 또는 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘의 단일 용량을 견딜 수 없었다 (미도시). 이들 결과는 마우스에서 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 및 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘 둘 다의 최대 허용 단일 용량이 적어도 2000 mg/kg 이상 8000 mg/kg 미만임을 시사한다.
마우스 용량과 인간 용량 사이의 전환은 0.081의 인자이다 (Nair 등, (2016) Basic Clin Pharm. 7(2): 27-31). 따라서, 데이터는 인간에서, 화학식 (I)의 화합물의 최대 허용 단일 용량이 162 mg/kg 이상 648 mg/kg 미만임을 나타낸다.
수일에 걸쳐 다수의 반복 투여 후에 용인될 수 있는 암 화학요법 약물이 유리하다. 따라서, 본 발명자들은 상기 기재된 바와 같이 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 및 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘 둘 다에 대한 반복된 최대 허용 용량 평가를 수행하였다 (물질 및 방법). 이들이 두 처리군 모두에서 단일 용량으로서 잘 용인되기 때문에, 300 mg/kg, 1000 mg/kg, 및 2000 mg/kg 용량을 반복된 다수 용인 용량 평가를 위해 선택하였다.
표시된 화합물을 표시된 용량으로 총 5회 용량에 대해 3일마다 1회 복강내 마우스에게 주사하였다. 생존이 본 연구의 종점이었지만, 연구의 1차 종점은 체중이었고; 동물에서 급성 독성 증상 (사망률, 경련, 떨림, 근육 이완, 진정 등) 및 자율신경 효과 (설사, 타액분비, 눈물 분비, 혈관확장, 입모 등)의 존재를 또한 처음 30분 동안, 다시 1, 24, 48 및 72시간에 모니터링하였다. 체중을 투여 전 및 72시간에 기록하였다.
미처리된 동물에서의 체중은 평가된 임의의 용량에서 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 또는 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘으로 처리된 동물과 통계적으로 상이하지 않았다 (도 1b). 이들 결과는 이들 화합물이 장기간에 걸쳐 표시된 용량에서 잘 용인된다는 것을 나타낸다.
실시예 4: 생체내 세포독성
5-포르밀-2'-데옥시시티딘 및 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시딘을 상기 기재된 바와 같이 교모세포종 다형 마우스 이종이식 모델에서 평가하였다 (물질 및 방법). U87-MG 세포를 누드 마우스의 옆구리에 피하 주사하였다. 종양을 상기 기재된 바와 같이 형성시켰다 (물질 및 방법). 종양이 129 mm3 및 131 mm3에 도달한 후, 동물을 4개의 군 - 2개의 처리군, 음성 대조군 및 양성 대조군으로 나누었다. 2개의 처리군은 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 및 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘이었다. 처리군에서의 마우스는 총 5회 용량에 대해 3일마다 1회 2000 mg/kg 용량의 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 또는 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘을 받았다. 음성 대조군은 비히클을 함유하고 화합물을 함유하지 않은 IP 주사를 제외하고 처리군과 동일하게 처리하였다. 양성 대조군을 40 mg/kg의 테모졸로마이드의 5개의 1일 용량으로 처리하였다.
종양 부피 (도 1c), 체중 (도 1d), 사망률, 및 명백한 독성의 징후를 모니터링하고, 29일 동안 매주 2회 기록하였다. 종양 부피 (mm3)를 타원체 공식에 따라 길이 x (폭)2 x 0.5로 추정하였다. 종양 성장 억제율 백분율(%TGI)을 하기 식을 사용하여 결정하였다: %TGI = (1-[(Tn)/(Cn)]) x 100, 여기서 Tn = "n"일째에 처리된 군의 평균 종양 부피를 의미하고, Cn ="n일째에 대조군의 평균 종양 부피를 의미한다. 음성 대조군과 비교한 %T/C 값 ≤ 42% 또는 퍼센트 TGI 값 ≥ 58%은 유의한 항종양 활성으로 간주되었다. 2원 ANOVA (RTM)에 이어서 본페로니 시험을 또한 사용하여 연구 동안 음성 대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 차이를 확인하였다; 1일째 내지 29일째 (*p<0.05).
도 1c는 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 또는 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘에 의한 처리가 모든 시점에 걸쳐 테모졸로마이드로 달성된 것과 필적하는 종양 부피의 현저한 감소를 초래하였음을 나타낸다.
연구의 마지막에, 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 및 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘 둘 다는 각각 83% 및 93% TGI의 유의한 항종양 활성을 나타내었다 (도 1e). 테모졸로마이드로 처리된 양성 대조군은 94 %TGI를 나타내었다. 모든 화합물은 마우스에 의해 잘 용인되었고, 처리의 결과로서 체중의 유의한 변화가 관찰되지 않았다 (도 1d). 본 연구의 완료 시에, 종양을 마우스로부터 절개하고, 사진촬영하고 (도 1f), 측정하였으며 (도 1g); 두 처리군 모두에서 현저한 세포독성 효과가 관찰되었다.
대조군의 1마리의 마우스는 이 실험 동안 사망하였고, 이 마우스의 종양 부피는 29일째에 보고되지 않았으나; 이 생쥐의 종양 부피가 이전일 동안 포함되었다.
종합하면, 이들 놀라운 결과는, 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 및 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘이 다형성 교모세포종 세포 (신경교종, 등급 IV)를 효율적으로 사멸시키고 정상 세포에 대해 강한 세포독성이 아님을 입증한다. 또한, 이들 화합물은 마우스에서 잘 용인되고, 마우스에서 최소의 부작용과 함께 종양 부피의 현저한 감소를 달성한다. 결과는, 본 발명의 화합물이 인간 암을 치료하는데 사용될 수 있고, 이들은 비-암성 세포를 사멸시키지 않으면서 종양 세포를 사멸시키기 위해 고용량으로 사용될 수 있음을 입증한다. 따라서, 항암 약물로서 이들 화합물을 사용하기 위한 광범위한 치료 윈도우가 존재한다.
실시예 5: 세포독성 대 세포증식억제 효과
상기 세포주 검정은 대사 활성을 측정하고, 따라서 세포 분열의 억제와 세포사를 구별하지 않는다. 따라서, 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 및 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘이 감수성 세포를 사멸시키는지 또는 세포 주기에서 이들을 지연시키는지 여부를 평가하였다. SF-188 등급 IV 신경교종 세포를 지시된 농도의 DMSO, 테모졸로마이드, 5-포르밀-2'-데옥시시티딘, 또는 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘으로 처리하였다. 세포를 수확하고, 아넥신 V (포스파티딜세린에 결합하는 그의 능력에 의해 세포자멸적 세포를 검출함) 및 7AAD (온전한 세포 막을 용이하게 통과하지 않는 DNA 염색; 따라서 손상된 막을 갖는 세포는 선택적으로 염색될 것임)로 염색하고, 상기 기재된 바와 같이 유동 세포측정법에 의해 분석하였다 (물질 및 방법). DMSO 또는 테모졸로마이드로 처리된 SF-188 세포는 유사한 세포측정 프로파일을 얻었고, 테모졸로마이드 처리된 대조군에서 죽은 세포의 양은 약간 증가하였다. 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 또는 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘으로 처리된 대부분의 SF-188 세포는 유동 세포측정 프로파일 (도 2a)에 따라 죽었다. 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 또는 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘에 노출된 SF188 세포는 죽고 세포 주기 체크포인트에서 정지되지 않음이 명백하다.
실시예 6: 2'-데옥시 당 유도체의 요건
널리 사용되는 암 화학요법 약물인 5-플루오로우라실은 세포독성인 다중 변이체를 가지며; 이들 변이체는 뉴클레오사이드 (5-플루오로우리딘 및 5-플루로-2'-데옥시우리딘) 및 핵염기 5-플루로우라실을 포함한다. 본 발명자들은 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 및 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘의 리보뉴클레오사이드 및 핵염기 변이체가 또한 세포독성인지 여부를 평가하였다.
표 I에 나타낸 바와 같이, 5-포르밀-2'-데옥시시티딘은 HeLa 세포에 세포독성이다. HeLa 세포에서의 5-포르밀시티딘 및 5-포르밀시토신의 세포독성을 상기 기재된 바와 같은 생존 검정에서 평가하였다. 놀랍게도, 그리고 5-플루오로우리딘 및 5-플루오로우라실과 대조적으로, 5-포르밀시티딘 및 5-포르밀시토신은 HeLa 세포에 세포독성이 아니었다 (도 2b).
표 I은 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘이 U87-MG 세포에 세포독성임을 보여준다. U87-MG 세포에서 5-하이드록시메틸시티딘 및 5-하이드록시메틸시토신의 세포독성을 상기 기재된 바와 같은 생존 검정으로 평가하였다. 놀랍게도, 그리고 5-플루오로우리딘 및 5-플루오로우라실과는 대조적으로, 5-하이드록시메틸시티딘 및 5-하이드록시메틸시토신은 U87-MG 세포에 세포독성이 아닌 것으로 나타났다 (도 2c).
이들 결과는 2'-데옥시리보스 당이 본 발명의 화합물의 세포독성에 필요함을 나타낸다. 다시, 이 결과는 놀랍게도 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 및 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘이 플루로피리미딘과 근본적으로 상이한 세포 경로를 이용한다는 것을 나타낸다.
실시예 7: 시티딘 탈아미노효소의 비-효과
돌연변이된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드 유사체는 종종 시티딘 탈아미노효소 (CDA)에 의해 뉴클레오타이드 풀(pool)로부터 제거된다. CDA는 젬시타빈 및 시토신 아라비노시드 - 2종의 공통 뉴클레오타이드 유사체 항암제를 불활성화시킨다. CDA에 의해 불활성화되지 않는 항암제가 바람직할 것이다. 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 및 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘은 시티딘 유도체이기 때문에, 본 발명자들은 CDA를 발현하는 세포가 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 및 5-하이드록시에틸-2'-데옥시시타티딘을 사용한 치료에 내성일 것이라고 가정하였다.
그러나, 놀랍게도, 표 4A에 나타낸 바와 같이, CDA 발현과 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 또는 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘에 대한 내성 또는 민감성 사이에 상관관계가 관찰되지 않았다. 표 4의 IC50 데이터는 표 1의 것과 동일하다. 명시된 세포주의 CDA 발현 수준은 EMBL 발현 아틀라스(atlas)를 사용하여 확인하였다(https://www.ebi.ac.uk/gxa/home, 검색 용어 CDA 사용). CDA 발현은 문헌 [Wagner 등, (2012) Theory Biosci 131(4):281-285] 및 [Mortazavi A 등, (2008) "Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq." Nature methods 5(7):621-8]에 기재된 바와 같이, 백만 당 RNA 전사체 (TPM)로서 보고된다. 1 초과의 값이 보고된 경우, 가장 낮은 값이 사용되었다.
Figure pct00014
세포독성과 약물 노출 사이의 선형 상관관계는 불량한 적합성을 나타내었다 (2d5fC에 대한 선형 모델, Rz = 0.00173; 2d5hmC에 대한 선형 모델에서, Rz = 0.02262). EMBL로부터의 데이터와 함께 취한 데이터는 CDA 발현이 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 또는 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘 민감성 또는 내성과 관련이 없음을 시사하였다.
추가로, 다양한 신경교종 세포주의 CDA 발현 수준 (TPM)을 결정하였고, 이를 표 4B에 나타내었다. 명시된 세포주의 CDA 발현 수준은 문헌[Barretina , J 등 (2012) The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483:603- 7]에 기재된 암 세포주 백과사전 (https://portals.broadinstitute.org/ccle)을 사용하여 확인되었다. CDA 발현은 문헌[Wagner 등, (2012) Theory Biosci 131(4):281-285]에 기재된 바와 같이 백만 당 RNA 전사체 (TPM)로서 보고된다. 1 초과의 값이 보고된 경우, 가장 높은 값이 사용되었다.
Figure pct00015
실시예 8: 비-돌연변이유발 효과
교모세포종 다형성-테모졸로마이드-에 대한 현재의 선행 처리는 강력한 돌연변이원이다. 실제로, 테모졸로마이드는 종양 세포를 심각하게 돌연변이시켜 종양 세포를 사멸시킴으로써 그의 암 화학요법 활성을 발휘한다. 테모졸로마이드는 DNA를 알킬화하여 돌연변이를 유발함으로써 작용한다. MGMT-알칼리화된 DNA 손상의 제거를 담당하는 단백질-의 발현은 교모세포종 세포가 테모졸로마이드의 세포독성 효과에 거의 완전히 내성을 갖게 한다.
따라서, 본 발명자들은 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 및 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘이 유사한 작용 메카니즘을 갖는지의 여부를 조사하였다. 이들 화합물의 돌연변이원성을 상기 기재된 바와 같은 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (HPRT) 검정에서 평가하였다 (물질 및 방법). HPRT 검정에서 나타난 바와 같이, 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘 또는 5-포르밀-2'-데옥시시티딘은 평가된 임의의 농도에서 포유동물 세포에 대해 유전독성이 아니었다 (도 3). 이들 결과는 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘 및 5-포르밀-2'-데옥시시티딘이 돌연변이원이 아니라는 것, 즉 그의 세포독성 효과가 돌연변이원 활성에 기인하지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 9: 다른 화합물 대 HeLa 세포의 세포독성
HeLa 세포를 5-포르밀-2'-데옥시시티딘, 5-포르밀시티딘 또는 5-클로로-2'-데옥시시티딘으로 처리하였다. 100, 25, 6.25, 1.56, 0.39, 0.1, 0.02, 또는 0.006 μM의 농도에서 이들 화합물을 사용한 3일의 처리 후, 세포 생존을 상기 기재된 바와 같은 MTT 검정에 의해 평가하였다 (물질 및 방법).
도 4에 나타낸 바와 같이. 5-포르밀시티딘 또는 5-클로로-2'-데옥시시티딘에 의한 처리보다 5-포르밀-2'-데옥시시티딘에 의한 처리 후 현저히 더 큰 세포독성 효과가 관찰된다.
실시예 10: 다른 화합물 대 신경교종 세포의 세포독성
U87-MG 세포 (신경교종, 등급 IV)를 100, 25, 6.25, 1.56, 0.39, 0.1, 0.02, 또는 0.006 μM 농도의 5-포르밀-2'-데옥시시티딘, 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘, 5-카복시-2'-데옥시시티딘, 테모졸로마이드, 5-플루로우라실, 5-브로모-2'-데옥시시티딘, 5-아이오도-2'-데옥시시티딘 또는 5-클로로-2'-데옥시시티딘으로 처리하였다. 이들 화합물로 처리한 지 3일 후에, 세포 생존을 상기 기재된 바와 같은 MTT 검정에 의해 평가하였다 (물질 및 방법).
세포 배양물
U87-MG 세포주를 10% 우태아 혈청이 보충된 DMEM (Sigma, Cat.Nr. D6429)에서 성장시켰다. 모든 세포를 37℃에서 5% CO2 가습 물-재킷형 인큐베이터에서 유지하였다. 세포를 70 내지 90% 합류점으로 통과시켰다.
생존 검정
96-웰 플레이트에에서, 100 μl의 상응하는 배지 중 4000개의 세포를 시딩하였다. 다음날, DMSO에 희석된 약물을 100, 25, 6.25, 1.56, 0.39, 0.1, 0.02, 또는 0.006 μM의 농도로 삼중으로 첨가하였다. 세포를 약물과 함께 72시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 증식을 제조자의 프로토콜 (ATCC, Cat. Nr. 30-1010K)에 따라 MTT 검정으로 평가하였다. 세포 생존을 DMSO만으로 처리된 세포의 생존에 대해 정규화하였다. 실험을 3회 수행하고, 데이터는 9개의 웰의 평균 ± SEM을 나타낸다.
표 5에 나타낸 바와 같이, 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 및 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘 둘 다는 5-브로모-2'-데옥시시티딘, 5-아이오도-2'-데옥시시티딘 및 5-클로로-2'-데옥시시티딘을 포함하는 시험된 다른 화합물보다 놀랍게도 세포독성 대 U87-MG 세포의 관점에서 더 우수하게 수행되었다.
Figure pct00016
추가로, U87-MG 세포를 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 (d5fC), 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘 (d5hmC), 5-클로로-2'-데옥시시티딘 (5CldC), 5-브로모-2'-데옥시시티딘 (5BrdC), 5-아이오도-2'-데옥시시티딘 (5IdC), 및 티미딘으로 처리하였다. 결과는 도 5에 나타낸다. d5hmC 및 d5fC는 신경교종 세포에 대해 5CldC, 5BrdC, dIdC, 및 티미딘 보다 현저하게 더 세포독성이었다.
96-웰 플레이트에서, 100 μl의 상응하는 배지 중 4000개의 세포를 시딩하였다. 다음날, DMSO에 희석된 약물을 100, 25, 6.25, 1.56, 0.39, 0.1, 0.02, 또는 0.006 μM의 농도로 삼중으로 첨가하였다. 세포를 약물과 함께 72시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 증식을 제조자의 프로토콜 (ATCC, Cat. Nr. 30-1010K)에 따라 MTT 검정으로 평가하였다. 세포 생존을 DMSO만으로 처리된 세포의 생존에 대해 정규화하였다. 실험을 3회 수행하고, 데이터는 평균 ± SD를 나타낸다.
실시예 11: 티미딘 합성효소를 통해 매개되지 않는 효과
세포 배양물
U87-MG 세포주를 10% 우태아 혈청이 보충된 DMEM (Sigma, Cat.Nr. D6429)에서 성장시켰다. 모든 세포를 37℃에서 5% CO2 가습 물-재킷형 인큐베이터에서 유지하였다. 세포를 70 내지 90% 합류점으로 통과시켰다.
생존 검정
96-웰 플레이트에서, 100 μl의 상응하는 배지 중 4000개의 세포를 시딩하였다. 다음날, DMSO 중에 희석된 약물을 8개의 농도로 3회 첨가하였다. 약물을 100 μM로부터 출발하여 4배 희석 시리즈로서 첨가하였다. 세포를 약물과 함께 72시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 증식을 제조자의 프로토콜 (ATCC, Cat. Nr. 30-1010K)에 따라 MTT 검정으로 평가하였다. 세포 생존을 DMSO만으로 처리된 세포의 생존으로 정규화하였다. 실험을 3회 수행하고, 데이터는 3개의 웰의 평균 ± SD을 나타낸다.
결과는 도 6에 나타낸다. 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 및 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘에 의한 세포독성은 U87-MG 세포에서 티미딘의 첨가에 의해 구제되지 않는다. 이 결과는 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 및 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘이 티미딘 합성효소를 억제함으로써 작용하지 않음을 나타낸다.
실시예 12: 테모졸로마이드와의 조합 요법
세포 배양물
다형성 교모세포종 세포주 (U87-MG)를 10% 우태 혈청이 보충된 DMEM (Sigma, Cat.Nr. D6429)에서 성장시켰다. 모든 세포를 37℃에서 5% CO2 가습 물-재킷형 인큐베이터에서 유지하였다. 세포를 70 내지 90% 합류점으로 통과시켰다.
생존 검정
96-웰 플레이트에서, 100 μl의 상응하는 배지 중 4000개의 세포를 시딩하였다. 다음날, DMSO 중에 희석된 약물을 8개의 농도로 3회 첨가하였다. 약물을 100 μM로부터 출발하여 4배 희석 시리즈로서 첨가하였다. 세포를 약물과 함께 72시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 증식을 제조자의 프로토콜 (ATCC, Cat. Nr. 30-1010K)에 따라 MTT 검정으로 평가하였다. 세포 생존을 DMSO만으로 처리된 세포의 생존에 대해 정규화하였다. 실험을 3회 수행하였고, 데이터는 이들 실험의 평균을 나타낸다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 테모졸로마이드에 대해 내성인 인간 다형성 교모세포종 세포주를 테모졸로마이드 단독, 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 (d5fC) 또는 d5fC와 테모졸로마이드의 조합으로 처리하였다. 테모졸로마이드와 d5fC의 조합은 어떠한 화합물 단독보다 인간 다형성 교모세포종을 치료하는데 더 효과적이다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 테모졸로마이드에 대해 내성인 인간 다형성 교모세포종 세포주를 테모졸로마이드 단독, 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘 (d5hmC) 또는 d5hmC와 테모졸로마이드의 조합으로 처리하였다. 테모졸로마이드와 d5hmC의 조합은 어떠한 화합물 단독보다 인간 다형성 교모세포종을 치료하는데 더 효과적이다.
따라서, 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘 및 5-포르밀-2'-데옥시시티딘은 테모졸로마이드와 상승작용적으로 작용한다.
실시예 13: 우리딘 유사체
5-메톡시메틸-2'-데옥시우리딘 및 5-아세톡시메틸-2'-데옥시우리딘의 세포독성 효과를 평가하였다.
세포 배양물
U87-MG 세포주를 10% 우태아 혈청이 보충된 DMEM (Sigma, Cat.Nr. D6429)에서 성장시켰다. 모든 세포를 37℃에서 5% CO2 가습 물-재킷형 인큐베이터에서 유지하였다. 세포를 70 내지 90% 합류점으로 통과시켰다.
생존 검정
96-웰 플레이트에서, 100 μl의 상응하는 배지 중 4000개의 세포를 시딩하였다. 다음 날, DMSO 중에 희석된 약물을 8개의 농도로 3회 첨가하였다. 약물을 100 μM로부터 출발하여 4배 희석 시리즈로서 첨가하였다. 세포를 약물과 함께 72시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 증식을 제조자의 프로토콜 (ATCC, Cat. Nr. 30-1010K)에 따라 MTT 검정으로 평가하였다. 세포 생존을 DMSO만으로 처리된 세포의 생존에 대해 정규화하였다. 실험을 3회 수행하였고, 데이터는 9개의 웰의 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 9에서 나타낸 바와 같이, U87-MG, 다형상 교모세포종, 세포주는 증가하는 농도의 5-메톡시메틸-2-데옥시우리딘 또는 5-아세톡시메틸-2'-데옥시우리딘에 의한 처리에서 생존할 수 없다. 따라서, 5-메톡시메틸-2-데옥시우리딘 및 5-아세톡시메틸-2'-데옥시우리딘은 특히 다형성 교모세포종에 대해 효과적인 항암제이다.
실시예 14: 5 - 포르밀 -2'- 데옥시시티딘 -5'- 트리포스페이트 ( HeLa )의 세포독성
세포 배양물
HeLa 세포주를 10% 우태 혈청이 보충된 DMEM (Sigma, Cat.Nr. D6429)에서 성장시켰다. 모든 세포를 37℃에서 5% CO2 가습 물-재킷형 인큐베이터에서 유지하였다. 세포를 70 내지 90% 합류점으로 통과시켰다.
생존 검정
96-웰 플레이트에서, 100 μl의 상응하는 배지 중 4000개의 세포를 시딩하였다. 다음 날, DMSO 중에 희석된 약물을 8개의 농도로 3회 첨가하였다. 약물을 100 μM로부터 출발하여 4배 희석 시리즈로서 첨가하였다. 세포를 약물과 함께 72시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 증식을 제조자의 프로토콜 (ATCC, Cat. Nr. 30-1010K)에 따라 MTT 검정으로 평가하였다. 세포 생존을 DMSO만으로 처리된 세포의 생존에 대해 정규화하였다. 실험을 3회 수행하였고, 데이터는 9개의 웰의 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 10a에서 나타낸 바와 같이, HeLa 자궁경부 암종 세포는 증가하는 농도의 5-포르밀-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트에 의한 처리에서 생존할 수 없다. 이는 인간 암, 예를 들어 자궁경부 암종의 치료에서 5-포르밀-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트의 유용성을 입증한다.
실시예 15: 5 - 포르밀 -2'- 데옥시시티딘 -5'- 트리포스페이트 및 5- 하이드록시메틸 -2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트 (신경교종)의 세포독성
U87-MG 세포 (신경교종, 등급 IV)를 100, 25, 6.25, 1.56, 0.39, 0.1, 0.02, 또는 0.006 μM의 농도에서 5-포르밀-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트 또는 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트로 처리하였다. 이들 화합물로 처리한지 3일 후에, 세포 생존을 상기 기재된 바와 같은 MTT 검정에 의해 평가하였다 (물질 및 방법).
세포 배양물
U87-MG 세포주를 10% 우태아 혈청이 보충된 DMEM (Sigma, Cat.Nr. D6429)에서 성장시켰다. 모든 세포를 37℃에서 5% CO2 가습 물-재킷형 인큐베이터에서 유지하였다. 세포를 70 내지 90% 합류점으로 통과시켰다.
생존 검정
96-웰 플레이트에서, 100 μl의 상응하는 배지 중 4000개의 세포를 시딩하였다. 다음 날, DMSO에 희석된 약물을 100, 25, 6.25, 1.56, 0.39, 0.1, 0.02, 또는 0.006 μM의 농도로 삼중으로 첨가하였다. 세포를 약물과 함께 72시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 증식을 제조자의 프로토콜 (ATCC, Cat. Nr. 30-1010K)에 따라 MTT 검정으로 평가하였다. 세포 생존을 DMSO만으로 처리된 세포의 생존에 대해 정규화하였다. 실험을 3회 수행하였고, 데이터는 적어도 3개의 웰의 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 10b에서 나타낸 바와 같이, 5-포르밀-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트 및 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트 둘 모두는 U87-MG, 신경교종, 세포에 대해 세포독성이었다.
실시예 16: CDA 발현
다양한 신경교종 세포주의 선형 및 로그 기준 2의 형질전환된 CDA 발현 수준을 결정하였다. 명시된 세포주의 CDA 발현 수준을 GENEVESTIGATOR® 데이터베이스 (https://genevestigator.com/gv/)를 사용하여, CDA, 유기체: 호모사피엔스, 플랫폼: Affymetrix Human Genome U133 2.0 Array를 검색함으로써 확인하였다. 결과를 도 11 내지 13 및 표 6에 나타낸다.
도 11은 다양한 암에 대해 결정된 CDA 정규화된 Log2 CDA 발현 수준을 나타낸다. 도 12는 다양한 암에 대해 결정된 선형 CDA 발현 수준을 나타낸다. 도 13a 및 13b는 다양한 인간 뇌 종양에서 CDA 정규화된 Log2 발현 수준을 보여준다. 도 14a 및 14b는 다양한 인간 뇌 종양에서 선형 CDA 발현 수준을 보여준다.
하기 표 6은 다양한 세포주의 CDA 발현 수준 및 이들 세포주에서 2d5hmC 및/또는 2d5fC에 대한 IC50 값을 나타낸다. IC50 값을 상기 기재된 바와 같이 수득하였다 (물질 및 방법 및 실시예 1).
Figure pct00017
하기 표 7은 다양한 세포주의 선형 CDA 발현 수준 및 이들 세포주에서 2d5hmC 및/또는 2d5fC에 대한 IC50 값을 나타낸다. IC50 값을 상기 기재된 바와 같이 수득하였다 (물질 및 방법 및 실시예 1).
Figure pct00018
종합하면, 이들 결과는 중추 신경계의 모든 시험된 암을 포함한 많은 암이 CDA를 과발현하지 않고; 오히려 이들이 낮은 수준의 CDA을 발현한다는 것을 입증한다. 상기 결과는 또한 CDA 발현과 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 또는 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘에 대한 감수성 사이에 상관관계가 없음을 입증한다.
실시예 17: 혈액-뇌 장벽 투과성
혈액 뇌 장벽 투과성을 BioAssay 시스템으로부터의 평행 인공 막 투과성 검정 키트 (PAMPA)를 사용하여 측정하였다. 제조자의 지침은 투과도를 결정하기 위해 따랐다.
제조자의 지침: 1. 별도의 원심분리관에서, 500 μl의 500 μM 테스트 화합물을 제조하였다: DMSO + 475 μL의 PBS 중 10 mM의 시험 화합물 25 μL를 혼합하였다. 투과성 대조군을 사용하는 경우, 이들을 또한 500 μM로 희석하였다: 25 μL 투과성 대조군 + 475 μL의 PBS를 혼합하였다. 2. 별개의 튜브에서, 각각의 시험 화합물 및 대조군에 대한 200 μM 평형 표준을 제조하였다: 80 μL의 500 μM 시험 화합물 또는 대조군을 120 μL의 PBS와 혼합하였다. 화합물이 막을 투과할 수 있고, 완전히 평형에 도달할 수 있다면, 200 μM는 공여체 및 수령체 웰에서 용액의 최종 농도일 것이다. 이어서, 별도의 튜브에서, 5 μL의 DMSO + 245 μL의 PBS를 혼합하여 블랭크 대조군을 제조하였다. 다음날 분석을 위해 평형 표준 및 블랭크 대조군을 확보해 두었다. 3. 300 μL의 PBS를 수용체 플레이트 내의 웰에 첨가하였다. 4. 공여체 플레이트가 여전히 그의 트레이에 있는 상태로, 도데칸 중 4% 레시틴 5 μL를 공여체 플레이트의 웰 막에 직접 첨가하였다. 피펫 팁으로 막을 천공하지 않도록 주의한다. 5. 200 μL의 각각의 500 μM 시험 화합물 및 500 μM의 투과성 대조군을 공여체 플레이트의 웰을 복제하기 위해 첨가하였다. 주의: 본 발명자들은 모든 실험 변수를 적어도 2벌로 수행하는 것을 권장한다. 5. 공여체 플레이트를 수령체 플레이트 웰에 주의하여 넣었다. 상온 또는 37℃에서 18시간 또는 목적하는 인큐베이션 시간 기간 (예를 들어, 16 내지 24시간) 동안 인큐베이션한다. 6. 조심스럽게 공여체 플레이트를 제거하고 분석을 위해 수령체 플레이트 웰에서 액체를 수집한다. 이는 수용체 용액으로 지칭될 것이다. 7. 각각의 시험 화합물 및 투과성 대조군에 대해 100 μL의 수용체 용액 및 평형 표준을 첨가한다. 또한, 100 μL 블랭크 대조군을 UV 플레이트 (Cat # P96UV)의 웰에 첨가한다. 8. 10 nm 간격으로 200 nm 내지 500 nm의 흡수 스펙트럼을 판독하여 시험 화합물의 피크 흡광도를 결정하였다. 블랭크 대조군은 용액 중 DMSO가 아닌 시험 화합물로 인한 피크를 확인하기 위한 것이다. 높은 투과도, 중간 투과도 및 낮은 투과도 대조군에 대한 피크 흡광도는 각각 280 nm, 270 nm 및 270 nm이다.
도 15에 도시된 바와 같이, 2d5hmC 및 2d5fC는 혈액 뇌 장벽을 통과한다.

Claims (26)

  1. 요법에 사용하기 위한 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 입체이성질체, 용매화물, 호변이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염:
    Figure pct00019

    화학식 (I)
    상기 식에서:
    X는 알데하이드, 알코올, 보호된 알코올, 에테르, 에스테르 및 카복실산으로부터 선택된 적어도 하나의 작용기를 함유하는, 1 내지 20개의 비-수소 원자 함유 기이고, 단, X는 -COOH가 아니고;
    W1 및 W2 각각은 독립적으로 O, S 또는 NH이고;
    Y는 H 또는 1 내지 15개의 비-수소 원자 함유 기이고;
    Z는 -OPG, -ORz 또는 -N(RxRy)이되, 여기서 Rx, Ry 및 Rz는 독립적으로 H 또는 1 내지 10개의 비-수소 원자 함유 기이고;
    R1은 H 또는 1 내지 15개의 비-수소 원자 함유 기이고;
    R2는 H, -OH, -OPG, -F, -Cl, -Br, -I, 또는 -N3이고; 그리고
    R3는 H, -F, -Cl, -Br, -I, 또는 -N3이고;
    여기서 PG는 알코올 보호기, 예컨대 아세틸 (Ac), 벤질 (Bn) 또는 벤조일 (Bz)이다.
  2. 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 입체이성질체, 용매화물, 호변이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염:
    Figure pct00020

    화학식 (I)
    상기 식에서:
    X는 알데하이드, 알코올, 보호된 알코올, 에테르, 에스테르 및 카복실산으로부터 선택된 적어도 하나의 작용기를 함유하는, 1 내지 20개의 비-수소 원자 함유 기이고, 단, X는 -COOH가 아니고;
    W1 및 W2 각각은 독립적으로 O, S 또는 NH이고;
    Y는 H 또는 1 내지 15개의 비-수소 원자 함유 기이고;
    Z는 -OPG, -ORz 또는 -N(RxRy)이되, 여기서 Rx, Ry 및 Rz는 독립적으로 H 또는 1 내지 10개의 비-수소 원자 함유 기이고;
    R1는 H 또는 1 내지 15개의 비-수소 원자 함유 기이고;
    R2는 H, -OH, -OPG, -F, -Cl, -Br, -I, 또는 -N3이고; 그리고
    R3는 H, -F, -Cl, -Br, -I, 또는 -N3 이고;
    여기서 PG는 알코올 보호기, 예컨대 아세틸 (Ac), 벤질 (Bn) 또는 벤조일 (Bz)이다.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 화합물은 화학식 (IIa) 또는 화학식 (IIb), 바람직하게는 화학식 (IIa)의 화합물, 또는 그의 입체이성질체, 용매화물, 호변이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염인, 화합물:
    Figure pct00021
    Figure pct00022

    화학식 (IIa) 화학식 (IIb)
    상기 식에서, X, R1 및 R2는 제1항 또는 제2항에서 정의된 바와 같다.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 화학식 (IIIa), (IIIb), (IIIc) 또는 (IIId), 바람직하게는 화학식 (IIIa) 또는 (IIIc)의 화합물, 또는 그의 입체이성질체, 용매화물, 호변이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염인, 화합물:
    Figure pct00023
    Figure pct00024

    화학식 (IIIa) 화학식 (IIIb)
    Figure pct00025

    화학식 (IIIc)
    Figure pct00026

    화학식 (IIId)
    상기 식에서, X는 제1항 또는 제2항에서 정의된 바와 같다.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 X는 -(CH2)n-X'이되, 여기서 n은 0 내지 6이고, X'는 -CHO, -OH, -OR 또는 -OC(=O)R이되, 여기서 R은 메틸인, 화합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 X는 2 내지 20개의 비-수소 원자 함유 기인, 화합물.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 X는 -COOH 또는 -OH가 아닌, 화합물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 X는
    a) -CHO 또는 -CH2OH; 또는
    b) -CH2OCH3 또는 -CH2OC(=O)CH3인, 화합물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 X는 -CHO 또는 -CH2OH인, 화합물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 X는 CH2OH인, 화합물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Z는 -NH2인, 화합물.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 5-포르밀-2'-데옥시시티딘, 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘, 5-메톡시메틸-2'-데옥시우리딘, 5-아세톡시메틸-2'-데옥시우리딘, 5-포르밀-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트 또는 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트, 또는 그의 입체이성질체, 용매화물, 호변이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염인, 화합물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 화합물은 5-포르밀-2'-데옥시시티딘 또는 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘, 또는 그의 입체이성질체, 용매화물, 호변이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염인, 화합물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 화합물은 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘 또는 그의 입체이성질체, 용매화물, 호변이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염인, 화합물.
  15. 제2항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 외배엽, 축주위 중배엽, 또는 측판 중배엽, 바람직하게는 외배엽에서 유래된 조직의 암인, 화합물.
  16. 제2항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 중추신경계의 암, 바람직하게는 뇌암인, 화합물.
  17. 제2항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 신경교종, 바람직하게는 교모세포종인, 화합물.
  18. 제2항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 CDA가 과발현되지 않는 암이고, 바람직하게는 상기 암은 ≤140 전사체/백만 (TPM)의 수준으로 CDA를 발현시키는, 화합물.
  19. 제2항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암의 CDA 발현 수준은 동일한 조건 하에 동일한 방법을 사용하여 측정 시 참조 암 세포주의 CDA 발현 수준의 90% 이하이고, 상기 참조 암 세포주는 MDA-MB-231인, 화합물.
  20. 제2항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 젬시타빈, 사이타라빈, 테모졸로마이드 또는 5-플루오로우라실에 의한 치료에 내성이 있는, 화합물.
  21. 제2항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료는 상기 화합물을 10 mg/kg 내지 405 mg/kg의 용량으로 투여하는 것을 포함하는, 화합물.
  22. 제2항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료는 추가 항암제의 투여를 더 포함하는, 화합물.
  23. 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 정의된 화합물 및 추가 항암제를 포함하는 키트.
  24. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 정의된 화합물 및 선택적으로 추가 항암제를, 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 포함하는 약제학적 조성물.
  25. 제22항, 제23항 또는 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추가 항암제는 젬시타빈, 사이타라빈, 테모졸로마이드, 5-플루오로우라실 및 글리아델 (RTM)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물, 키트 또는 약제학적 생성물.
  26. 대상체의 암을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 정의된 화합물을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하되, 상기 암은 제2항 또는 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같고, 상기 치료는 제2항, 제21항, 제22항 또는 제25항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은, 방법.
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