CN102191233B

CN102191233B - 新颖的10-23脱氧核酶类似物及其用途

Info

Publication number: CN102191233B
Application number: CN201010119905.2A
Authority: CN
Inventors: 刘克良; 何军林; 张迪; 王�琦; 徐亮
Original assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Current assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority date: 2010-03-04
Filing date: 2010-03-04
Publication date: 2014-06-04
Anticipated expiration: 2030-03-04
Also published as: WO2011106997A1; CN102191233A

Abstract

本发明涉及新颖的10-23脱氧核酶类似物及其用途。具体地，本发明涉及一种下式所示的10-23脱氧核酶催化结构域部分被修饰的10-23脱氧核酶类似物：其中各符号如说明书所述。本发明还涉及所述10-23脱氧核酶类似物的制备方法，包含它们的药盒、试剂盒、或组合物以及它们的用途。本发明鉴于各个核苷酸单元在10-23脱氧核酶的催化结构域中的保守性不同，和碱基的功能基对于催化反应的贡献，利用嘌呤核苷和嘧啶核苷的类似物取代其在催化结构域中的位置，获得了催化效率比原型10-23脱氧核酶高的新颖的脱氧核酶类似物。

Description

新颖的10-23脱氧核酶类似物及其用途

技术领域

本发明涉及一类新颖的脱氧核酶类似物，特别是涉及一类新颖的10-23脱氧核酶类似物，以及它们的用途。

背景技术

核酶是一类具有催化核酸裂解活性的天然核酸分子，它利用自身的高级结构和环境中的金属离子、水分子等参与，实现催化裂解核酸的功能。核酶的发现，不但使我们对于核酸的功能有了新的认识，而且为核酸的研究与应用提供了一个新的工具。经过科学家们的努力，已将核酶应用于催化裂解致病基因，使之失活的研究中，因而核酶也成为继反义核酸药物之后的又一类基因治疗候选药物。至今有多种基于核酶的药物处于研发阶段。但核酶的体内应用被如下因素所限制，它们的化学不稳定性和酶不稳定性，和核酶转运至作用靶点需要克服的障碍等。

脱氧核酶的发现，又为改善核酶的药学性质提供了一个选择，因为脱氧核酶的化学和酶稳定性要高的多，而且，合成上更简便。最有潜力的脱氧核酶是10-23脱氧核酶，迄今已对它在针对致癌基因，病毒，和遗传突变基因等方面进行了研究。它的临床应用则受到不能在体内表达的限制，治疗性给药还存在转运技术的困难，但随着基因治疗转运技术的发展，外源性脱氧核酶的转运将会得到解决。另一个缺陷是：其有效性需要远高于生理浓度的二价金属离子(如Mg²⁺)的参与。在一定范围内，Mg²⁺浓度越高，催化效率越高。在模拟生理条件下，2mM MgCl₂，150mM KCl，pH 7.5，37℃，k_cat＝0.01min^-1。而细胞内的Mg²⁺生理浓度仅为0.1-0.2mM，在此浓度下，脱氧核酶的催化效率远远达不到用于治疗目的的要求。因此，寻找在低Mg²⁺浓度下具有高效催化能力的新型脱氧核酶，将是发展脱氧核酶作为基因治疗药物的关键突破点之一。

10-23脱氧核酶与底物结合的示意图如图1所示，图中，N’为底物的核苷酸单体组成，N为10-23脱氧核酶识别域的核苷酸单体组成，N为任一与靶核苷酸N’可以进行W-C互补配对的核苷酸单元；R为嘌呤核苷酸单元，Y为嘧啶核苷酸单元，互补链部分的长度可随靶核酸的序列、碱基组成等因素的变化而变化，脱氧核酶两端的碱基数为n(例如n＝4-50)。

基于脱氧核酶作为基因治疗药物的巨大应用潜力，针对它的化学修饰一方面是为了优化其药学性质，如提高它的酶稳定性和转运效率。另一方面是利用化学修饰探讨其催化机制，指导如何进一步提高其催化效率。迄今，通过化学修饰对这个脱氧核酶的机制和催化效率进行研究已有不少文献报道，但无论在机制上，还是在催化效率上都未取得突破性进展。所进行的化学修饰主要为以下三个方面，(1)逐个消除环内碱基，研究各个碱基对于催化效率的贡献；(2)利用天然碱基对每个环内碱基进行替换，研究碱基上的功能基如氨基和羰基的缺失对于催化反应的影响；(3)利用非天然碱基，如2-氨基腺嘌呤和嘌呤等增加或减去功能基，但其研究范围多数仍然局限在参与Watson-Crick配对的功能基。

在新型核酶的筛选中，还使用了氨基和咪唑基修饰的核苷类似物，这是基于核酸酶的裂解机制而选择的功能基引入策略。利用这些功能基的酸-碱性和成氢键能力，加强2’-O的亲核性，以及促进5’-氧阴离子的质子化，是加速这一反应的主要策略。核酸碱基可能发挥这样的作用，但在生理pH条件下，其酸碱性没有达到最佳值。相关的现有技术可参考后文所附的参考文献。

因此，寻求具有更高催化效能的脱氧核酶，仍是本领域令人期待的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是寻找具有更高催化效能的10-23脱氧核酶类似物。本发明主要选择以氨基、咪唑基、以及羟基为主的功能基，以各种连接臂将它们引入核苷单体，在一定的二价金属离子浓度和pH，37℃的条件下，通过评价它们处于10-23脱氧核酶的催化结构域的各个位点对催化活性的贡献，筛选更高效的脱氧核酶，同时，研究这些功能基特性以及空间取向对催化效率的影响并探讨可能的催化机制。本发明利用化学修饰法对10-23脱氧核酶进行修饰，获得了在近似生理Mg²⁺浓度下，高于原型10-23脱氧核酶的具有高催化效率的10-23脱氧核酶类似物。本发明基于上述发现而得以完成。

发明概述：

本发明第一方面提供了一种10-23脱氧核酶催化结构域部分被修饰的10-23脱氧核酶类似物，其为下式所示：

3’-N₁ N₂ N₃ N₄ N₅ N₆……N_i X₁₅X₁₄C₁₃ X₁₂X₁₁C₁₀ X₉X₈C₇ X₆X₅X₄C₃X₂X₁ R N_i+17N_i+18N_i+19N_i+20……N_n-5’，

或为下式所示：

其中，

N代表该10-23脱氧核酶类似物两端的识别部分，并且两端的碱基数量相同或不同，各自独立地为4至25个；

3’-X₁₅X₁₄C₁₃X₁₂X₁₁C₁₀X₉X₈C₇X₆X₅X₄C₃X₂X₁-5’为催化结构域；

n为4-50的整数；

i为4-33的整数；

所述的催化结构域部分

是10-23脱氧核酶催化结构域部分

中的第1、2、4、5、6、8、9、11、12、14、15号残基中的任一个或多个各自独立地被选自以下式J、式B、式D、式E和式F的核苷类似物取代：

以上式J、式B、式D、式E和式F的核苷类似物中，各取代基各自独立地定义如下：

(1)嘌呤核苷类似物J和D中，Z各自独立地选自碳和氮原子，其中，当Z为碳原子时，7位取代基R¹各自独立地选自：氢、卤素(例如氟、氯、溴、碘)、拟卤素(例如氰基、硫氰基)、羧基、酰胺基(例如CONH₂、CONHR⁷、CONR⁷ ₂)、C_6-20芳香基、C_3-10杂芳香基和杂环结构、R⁷、或L-R⁸，其中：

R⁸选自羟基、氨基、C_6-20芳香基、C_3-10杂芳香基和杂环结构、OR⁷、NHR⁷、NR⁷ ₂、NHCOR⁷(胺酰基)、巯基、SR⁷、CONH₂、CONHR⁷、CONR⁷ ₂、胍基、取代的胍基NH-C(NR⁷ ₂)＝NR⁷、卤素(例如氟、氯、溴、碘)、拟卤素(例如氰基、硫氰基)、羧基，

L是选自以下的连接臂：C_1-10直链或支链烷基臂(例如C_1-6直链或支链烷基臂，如亚甲基、1，2-亚乙基，三亚甲基，四亚甲基)、C_2-10不饱和烷基臂(例如烯键、炔键)、C_3-10环烷基臂(例如C_3-6环烷基)，连接臂还可以是含酰胺键、酯键、醚键、硫醚键的直链和支链结构，

R⁷各自独立地选自C_1-10直链或支链烷基(例如C_1-6直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基)、C_2-10不饱和烷基(例如C_2-4不饱和烷基，例如乙烯基、丙烯基、乙炔基、丙炔基)、C_3-10环烷基(例如C_3-6环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基和环己基)，以及含芳香环的直链和支链结构，

所述芳香基和杂芳香基任选被一个或多个取代基R⁹取代，R⁹的定义与R⁷相同；

(2)嘌呤核苷类似物J，B，D，E的2位取代基R²各自独立地选自：氢、氨基、羟基、卤素(例如氟、氯、溴、碘)、胍基、OR⁷、NHR⁷、NR⁷ ₂、NHCOR⁷(胺酰基)、巯基、SR⁷、C_6-20芳香基、C_3-8杂芳香基和杂环结构、R⁷，或L-R⁸，其中：

R⁷各自独立地选自：C_1-10直链或支链烷基(例如C_1-6直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基)、C_2-10不饱和烷基(例如C_2-4不饱和烷基，例如乙烯基、丙烯基、乙炔基、丙炔基)、C_3-10环烷基(例如C_3-6环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基和环己基)、以及含芳香环的直链和支链结构，

(3)嘌呤核苷类似物J和B的6位取代基R³各自独立地选自：氢、氨基、羟基、卤素(例如氟、氯、溴、碘)、OR⁷、NHR⁷、NR⁷ ₂、NHCOR⁷(胺酰基)、胍基、巯基、SR⁷、C_6-20芳香基、C_3-20杂芳香基和杂环结构、R⁷，或L-R⁸，其中：

(4)嘌呤核苷类似物J和D的8位W可以各自独立地是碳原子或氮原子，其中：

当W为碳原子时，其任选被取代基R¹⁰取代，该取代基R¹⁰各自独立地选自：氢、卤素(例如氟、氯、溴、碘)、拟卤素(例如氰基、硫氰基)、羧基、COOR⁷(酯基)、CONH₂、CONHR⁷、CONR⁷ ₂(酰胺基)、氨基、胍基、OR⁷，NHR⁷、NR⁷ ₂、NHCOR⁷(胺酰基)、巯基、SR⁷、C_6-20芳香基、C_3-10杂芳香基和杂环结构、R⁷、或L-R⁸，其中：

L是选自以下的连接臂：C_1-10直链或支链烷基臂(例如C_1-6直链或支链烷基臂，如亚甲基、1，2-亚乙基，三亚甲基，四亚甲基)、C_2-10不饱和烷基臂(例如烯键、炔键)、C_3-10环烷基臂(例如C_3-6环烷基臂)，连接臂还可以是含酰胺键、酯键、醚键、硫醚键的直链和支链结构，

当W为氮原子时，其未被取代；

(5)腺苷类似物B和E，Z和V所在的五员环为饱和环结构，Z和V各自独立地是碳、氮、氧、硫等原子，其中

当Z为碳原子时，其上的取代基R¹各自独立地选自：氢、卤素(例如氟、氯、溴、碘)、拟卤素(例如氰基、硫氰基)、羧基、酰胺基(例如CONH₂、CONHR⁷、CONR⁷ ₂)、C_6-20芳香基、C_3-20杂芳香基或杂环结构、R⁷、或L-R⁸，其中：

当Z为氮原子时，其取代基为R¹，但不包括卤素和拟卤素；

当V为碳原子时，其各自独立地任选被取代基R¹¹取代，取代基R¹¹的定义与R¹相同；

当V为氮原子时，其取代基R¹¹的定义与R¹相同，但不为卤素和拟卤素取代。

当Z和V为氧或硫原子时，则无取代基；

(6)嘧啶核苷类似物F，其5位和6位的取代基R⁴和R⁵各自独立地选自氢、卤素(氟、氯、溴、碘)、氨基、胍基、拟卤素(氰基、硫氰基)、羧基、COOR⁷(酯基)、CONH₂、CONHR⁷、CONR⁷ ₂(酰胺基)、OR⁷，NHR⁷、NR⁷ ₂、NHCOR⁷(胺酰基)、巯基、SR⁷、C_6-20芳香基和C_3-10杂芳香基和杂环结构、R⁷、或L-R⁸，其中：

(7)核苷类似物J，B，D，E，F，其糖环部分各自独立地选自核糖基、脱氧核糖基、其它五员糖环基、六员糖环基、LNA型、或其他修饰的糖环结构，所述糖环部分的构型各自独立地是D-或L-型，其中该糖环部分为五员糖环时，其2’-位取代基R⁶各自独立地选自氢、氨基、氟原子、甲氧基、乙氧基、丙氧基、甲氧基乙烯氧基、乙氧基乙烯氧基、丙氧基乙烯氧基、甲胺基、二甲胺基、乙胺基、二乙胺基、丙胺基、二丙胺基、环丙胺基。

根据本发明第一方面，具体地说，提供了一种10-23脱氧核酶催化结构域部分被修饰的10-23脱氧核酶类似物，

其为下式所示：

3’-N₁ N₂ N₃ N₄ N₅N₆……N_i X₁₅X₁₄C₁₃ X₁₂X₁₁C₁₀ X₉X₈C₇ X₆X₅X₄C₃X₂X₁ R N_i+17N_i+18N_i+19N_i+20……N_n-5’，

或者为与底物结合时的以下二维结构所示：

其中，

从5’-N’₁至’-N’_m为核酸底物序列，m为底物单体的个数；从3’-N₁到5’-N_n为脱氧核酶的识别域，n为它的个数；X为引入的修饰的核苷酸单体；R为嘌呤单体，Y为嘧啶单体；

N’为脱氧核酶的靶序列组成，5’-N₁’N₂’N₃’N₄’N’₅N’₆……N_i’R YN’_i+3N’_i+4N’_i+5N’_i+6……N’_m-3’，为10-23脱氧核酶类似物的核酸底物序列，其中R为嘌呤核苷酸单体，Y为嘧啶核苷酸单体，多个N’所组成的序列为选自任一基因的片段或全长基因，m≥4。箭头所指处为裂解位点；

N代表该10-23脱氧核酶类似物两端的识别部分，两端的碱基数量相同或不同，各自独立地为4至25个；并且与核酸底物序列中被剪切位点两端的部分序列呈Watson-Crick配对。

3’-X₁₅X₁₄C₁₃ X₁₂X₁₁C₁₀ X₉X₈C₇ X₆X₅X₄ C₃X₂X₁-5’为催化结构域；其中X为修饰的核苷酸单体，C表示碱基为胞嘧啶的核苷酸单体，R为嘌呤核苷酸单体；

n为4-50的整数；

i为4-33的整数；

所述的催化结构域部分

是10-23脱氧核酶催化结构域部分

中的第1、2、4、5、6、8、9、11、12、14、15号残基中的任一个或多个，各自独立地被选自以下式J、式B、、式D、式E和式F的核苷类似物取代：

(1)嘌呤核苷类似物J和D中，7位的原子Z可以各自独立地选自碳、氮原子。其中，

当Z为碳原子时，其上的7位取代基R¹各自独立地选自：氢、卤素(例如氟、氯、溴、碘)、拟卤素(例如氰基、硫氰基)、羧基、酰胺基(例如CONH₂、CONHR⁷、CONR⁷ ₂)、C_6-20芳香基、C_3-10杂环或杂芳香基、R⁷、或L-R⁸，其中：

R⁸选自羟基、氨基、C_6-20芳香基、C_3-10杂环或杂芳香基、OR⁷、NHR⁷、NR⁷ ₂、NHCOR⁷(胺酰基)、巯基、SR⁷、CONH₂、CONHR⁷、CONR⁷ ₂、胍基、取代的胍基NH-C(NR⁷ ₂)＝NR⁷、卤素(例如氟、氯、溴、碘)、拟卤素(例如氰基、硫氰基)、羧基，

R⁷各自独立地选自C_1-10直链或支链的饱和烷基和不饱和烷基(例如C_1-6直链或支链烷基，例如丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基)，C_2-10不饱和烷基(例如C_2-4不饱和烷基，如乙烯基、丙烯基、乙炔基，丙炔基)、C_3-10环烷基(例如C_3-6环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基和环己基)，以及含芳香环的直链和支链结构，

当Z为氮原子时，则无取代；

(2)嘌呤核苷类似物J，B，D，E的2位取代基R²各自独立地选自：氢、氨基、羟基、卤素(例如氟、氯、溴、碘)、OR⁷、NHR⁷、NR⁷ ₂、NHCOR⁷(胺酰基)、胍基、巯基、SR⁷、C_6-20芳香基、C_3-10杂环或杂芳香基、R⁷，或L-R⁸，其中：

R⁷各自独立地选自：C_1-10直链或支链的饱和烷基(例如C_1-6直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基)、C_2-10不饱和烷基(例如C_2-4不饱和烷基，例如乙烯基、丙烯基、乙炔基、丙炔基)、C_3-10环烷基(例如C_3-6环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基和环己基)，以及含芳香环的直链和支链结构，

(3)嘌呤核苷类似物J和B的6位取代基R³各自独立地选自：氢、氨基、羟基、卤素、OR⁷、NHR⁷、NR⁷ ₂、NHCOR⁷(胺酰基)、胍基、巯基、SR⁷、C_6-20芳香基、C_3-10杂环或杂芳香基、R⁷，或L-R⁸，其中：

当W为碳原子时，其任选被取代基R¹⁰取代，各自独立地选自：氢、卤素(例如氟、氯、溴、碘)、拟卤素(例如氰基、硫氰基)、羧基、COOR⁷(酯基)、CONH₂、CONHR⁷、CONR⁷ ₂(酰胺基)、氨基、胍基、OR⁷，NHR⁷、NR⁷ ₂、NHCOR⁷(胺酰基)、巯基、SR⁷、C_6-20芳香基、C_3-10杂环或杂芳香基、R⁷、或L-R⁸，其中：

当W为氮原子时，其未被取代；

(5)嘌呤核苷类似物B和E中，Z和V所在的五员环为饱和环结构，Z和V各自独立地是碳、氮、氧、硫等原子，其中，

当Z为碳原子时，其上的取代基R¹各自独立地选自：氢、卤素(例如氟、氯、溴、碘)、拟卤素(例如氰基、硫氰基)、羧基、酰胺基(例如CONH₂、CONHR⁷、CONR⁷ ₂)、C_6-20芳香基、

C_3-10杂环或杂芳香基、R⁷、或L-R⁸，其中：

当Z为氮原子时，它的取代基为R¹，但不包括卤素和拟卤素；

当V为碳原子时，它的取代基R¹¹，其定义与R¹相同。

当V为氮原子时，其各自独立地任选被取代基R¹¹取代，取代基R¹¹的定义与R¹相同，但不为卤素和拟卤素取代；

当Z和V为氧或硫原子时，则无取代基；

(6)嘧啶核苷类似物F，其5位和6位的取代基R⁴和R⁵各自独立地选自氢、卤素(氟、氯、溴、碘)、拟卤素(氰基、硫氰基)、羧基、COOR⁷(酯基)、CONH₂、CONHR⁷、CONR⁷ ₂(酰胺基)、氨基、胍基、NHR⁷、NR⁷ ₂、NHCOR⁷(胺酰基)、巯基、SR⁷、C_6-20芳香基和C_3-10杂环或杂芳香基、R⁷、或L-R⁸，其中：

L是选自以下的连接臂：G_1-10直链或支链烷基臂(例如C_1-6直链或支链烷基臂，如亚甲基、1，2-亚乙基，三亚甲基，四亚甲基)、C_2-10不饱和烷基臂(例如烯键、炔键)、C_3-10环烷基臂(例如C_3-6环烷基)，连接臂还可以是含酰胺键、酯键、醚键、硫醚键的直链和支链结构，

(7)核苷类似物J，B，D，E，F，其糖环部分各自独立地选自核糖基、脱氧核糖基、其它五员糖环基、六员糖环基、LNA型、或其他修饰的糖环结构[优选地，该糖环部分各自独立地选自脱氧核糖基、LNA型]，所述糖环部分的构型各自独立地是D-或L-型，其中

该糖环部分为五员糖环时，其2’-位取代基R⁶各自独立地选自氢、氨基、氟原子、甲氧基、乙氧基、丙氧基、甲氧基乙烯氧基、乙氧基乙烯氧基、丙氧基乙烯氧基、甲胺基、二甲胺基、乙胺基、二乙胺基、丙胺基、二丙胺基、环丙胺基。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中N代表该10-23脱氧核酶类似物两端的识别部分，两端的碱基数量可以相同，也可以不相同。根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中N代表该10-23脱氧核酶类似物两端的识别部分，并且两端的碱基数量不同。根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中N代表该10-23脱氧核酶类似物两端的识别部分，并且两端的碱基数量相同或不同，各自独立地为4至25个。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中n为4-50的整数。根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中n为10-40的整数。根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中n为15-40的整数。根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中n为20-40的整数。根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中n为4-40的整数。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中i为4-33的整数。根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中i为4-25的整数。根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中i为4-12的整数。根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中i为6-12的整数。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中所述的催化结构域部分是10-23脱氧核酶催化结构域部分中的第1、2、4、5、6、8、9、11、12、14、或15号残基中的任一个被选自式J、式B、式D、式E、和式F的核苷类似物取代。根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中所述的催化结构域部分是10-23脱氧核酶催化结构域部分中的第1、2、4、5、6、8、9、11、12、14、或15号残基中的任2个或更多个被选自式J、式B、式D、式E和式F的核苷类似物取代。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中所述的催化结构域部分是10-23脱氧核酶催化结构域部分中的第5、9、11、12、或15号残基中的任一个被选自式J、式B、式D、式E和式F的核苷类似物取代。根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中所述的催化结构域部分是10-23脱氧核酶催化结构域部分中的第1、2、6、或14号残基中的任一个被选自式J、式B、式D、式E和式F的核苷类似物取代。根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中所述的催化结构域部分是10-23脱氧核酶催化结构域部分中的第4或8号残基中的任一个被选自式J、式B、式D、式E和式F的核苷类似物取代。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中所述的催化结构域部分是10-23脱氧核酶催化结构域部分中的第5、9、11、12、或15号残基中的任一个被选自式J和式B的核苷类似物取代。根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中所述的催化结构域部分是10-23脱氧核酶催化结构域部分中的第1、2、6、或14号残基中的任一个被选自式D和式E的核苷类似物取代。根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中所述的催化结构域部分是10-23脱氧核酶催化结构域部分中的第4或8号残基中的任一个被选自式F的核苷类似物取代。

(1)根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中所述的催化结构域部分是10-23脱氧核酶催化结构域部分中的第5、9、11、12、或15号残基中的任一个被选自以下的的核苷类似物取代：

或

R¹独立地选自：

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中所述的催化结构域部分是10-23脱氧核酶催化结构域部分中的第1、2、6、或14号残基中的任一个被选自以下的的核苷类似物取代：或

其中R¹选自

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中所述的催化结构域部分是10-23脱氧核酶催化结构域部分中的第4或8号残基中的任一个被选自以下的的核苷类似物取代：

R⁴选自

(2)根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中所述的式J、式D的核苷类似物中，7位的原子Z可以各自独立地选自碳、氮原子。其中，

当Z为碳原子时，其上的7位取代基R¹各自独立地选自：氢、卤素(例如氟、氯、溴、碘)、拟卤素(例如氰基、硫氰基)、C_6-20芳香基(例如C₆芳香基，例如苯基)、C_3-10杂环或杂芳香基(例如咪唑基，吡啶基)、羧基、R⁷、或L-R⁸，其中：

R⁸选自羟基、氨基、C_6-20芳香基(例如C₆芳香基，例如苯基)、C_3-10杂环或杂芳香基(例如咪唑基，吡啶基)、OR⁷、NHR⁷、NR⁷ ₂、NHCOR⁷(胺酰基)、胍基、取代的胍基NH-C(NR⁷ ₂)＝NR⁷、巯基、SR⁷、CONH₂、CONHR⁷、CONR⁷ ₂、卤素(例如氟、氯、溴、碘)、拟卤素(例如氰基、硫氰基)、羧基，

L是选自以下的连接臂：C_1-10直链或支链烷基臂(例如C_1-6直链或支链烷基臂，例如亚甲基、1，2-亚乙基、三亚甲基、四亚甲基)、C_2-10不饱和烷基臂(例如C_2-4不饱和烷基臂，例如烯键、炔键)、C_3-10环烷基臂(例如C_3-6环烷基臂)，

R⁷各自独立地选自C_1-10直链或支链烷基(例如C_1-6直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基)、C_2-10不饱和烷基(例如C_2-4不饱和烷基，例如乙烯基、丙烯基、乙炔基、丙炔基)、C_3-10环烷基(例如C_3-6环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基和环己基)。以及含芳香环的直链和支链结构，如苄基，苯乙基，甲氧基苯乙基，叔丁基苯乙基，苯丙基等。

当Z为氮原子时，则无取代基。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中所述的式J、式B、式D、式E的核苷类似物中，2位取代基R²各自独立地选自：氢、氨基、羟基、卤素(例如氟、氯、溴、碘)、C_6-20芳香基、C_3-10杂环或杂芳香基、胍基、OR⁷、NHR⁷、NR⁷ ₂、NHCOR⁷(胺酰基)、巯基、SR⁷、R⁷，或L-R⁸，其中：

R⁸选自羟基、氨基、C_6-20芳香基、C_3-10杂环或杂芳香基、OR⁷、NHR⁷、NR⁷ ₂、NHCOR⁷(胺酰基)、胍基、取代的胍基NH-C(NR⁷ ₂)＝NR⁷、巯基、SR⁷、CONH₂、CONHR⁷、CONR⁷ ₂、卤素(例如氟、氯、溴、碘)、拟卤素(例如氰基、硫氰基)、羧基，

L是选自以下的连接臂：C_1-10直链或支链烷基臂(例如C_1-6直链或支链烷基臂，如亚甲基、1，2-亚乙基，三亚甲基，四亚甲基)、C_2-10不饱和烷基臂(例如烯键，炔键)、C_3-10环烷基臂(例如C_3-6环烷基)，

R⁷各自独立地选自：C_1-10直链或支链烷基(例如C_1-6直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基)、C_2-10不饱和烷基(例如C_2-4不饱和烷基，如乙烯基、丙烯基、乙炔基、丙炔基)、C_3-10环烷基(例如C_3-6环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基和环己基)。以及含芳香环的直链和支链结构，如苄基，苯乙基，甲氧基苯乙基，叔丁基苯乙基，苯丙基等。

当Z为氮原子时，则无取代基。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中所述的式J、式B的核苷类似物中，6位取代基R³各自独立地选自：氢、氨基、羟基、卤素、OR⁷、NHR⁷、NR⁷ ₂、NHCOR⁷(胺酰基)、胍基、巯基、SR⁷、C_6-20芳香基、C_3-10杂环或杂芳香基、R⁷，或L-R⁸，其中：

R⁷各自独立地选自C_1-10直链或支链烷基(例如C_1-6直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基)、C_2-10不饱和烷基(例如C_2-4不饱和烷基，例如乙烯基、丙烯基、乙炔基、丙炔基)、C_3-10环烷基(例如C_3-6环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基和环己基)、以及含芳香环的直链和支链结构，如苄基，苯乙基，甲氧基苯乙基，叔丁基苯乙基，苯丙基等。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中所述的式J、式D的核苷类似物中，8位W可以各自独立地是碳原子或氮原子，其中：

当W为碳原子时，其任选被取代基R¹⁰取代，该取代基R¹⁰各自独立地选自：氢、卤素(例如氟、氯、溴、碘)、C_6-20芳香基、C_3-10杂环或杂芳香基、羧基、COOR⁷(酯基)、CONH₂、CONHR⁷、CONR⁷ ₂(酰胺基)、氨基、胍基、OR⁷，NHR⁷、NR⁷ ₂、NHCOR⁷(胺酰基)、R⁷、或L-R⁸，其中：

L是选自以下的连接臂：C_1-10直链或支链烷基臂(例如C_1-6直链或支链烷基臂，例如亚甲基、1，2-亚乙基、三亚甲基、四亚甲基)、C_2-10不饱和烷基臂(例如烯键、炔键)、C_3-10环烷基臂(例如C_3-6环烷基臂)，

当W为氮原子时，则无取代基。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中所述的式B、式E的核苷类似物中，Z各自独立地是碳原子，其取代基为R¹。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中所述的式B、式E的核苷类似物中，V各自独立地是碳原子或氮原子，其任选被取代基R¹¹取代；

当V为碳原子时，R¹¹各自独立地选自：氢、卤素(例如氟、氯、溴、碘)、拟卤素(例如氰基、硫氰基)、羧基、酰胺基(例如CONH₂、CONHR⁷、CONR⁷ ₂)、C_6-10芳香基、C_3-10杂环或杂芳香基、R⁷、或L-R⁸，其中：

L是选自以下的连接臂：C_1-10直链或支链烷基(例如C_1-6直链或支链烷基，例如亚甲基、1，2-亚乙基、三亚甲基、四亚甲基)、C_2-10不饱和烷基臂(例如C_2-4不饱和烷基臂，例如烯键、炔键)、C_3-10环烷基臂(例如C_3-6环烷基臂)，

当V为氮原子时，其各自独立地任选被取代基R¹¹取代，其定义与R¹相同，但不为卤素和拟卤素取代基；

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中所述的式F的核苷类似物中，其5位和6位的取代基R⁴和R⁵各自独立地选自氢、卤素(氟、氯、溴、碘)、拟卤素(氰基、硫氰基)、羧基、COOR⁷(酯基)、CONH₂、CONHR⁷、CONR⁷ ₂(酰胺基)、氨基、胍基、NHR⁷、NR⁷ ₂、NHCOR⁷(胺酰基)、巯基、SR⁷、C_6-20芳香基(例如C₆芳香基，例如苯基)、C_3-10杂环或杂芳香基(例如C_3-8杂芳香基，例如咪唑基、吡啶基)、R⁷、或L-R⁸，其中：

R⁸选自羟基、氨基、C_6-20芳香基(例如C₆芳香基，例如苯基)、C_3-10杂环或杂芳香基(例如C_3-8杂芳香基，例如咪唑基、吡啶基)、OR⁷、NHR⁷、NR⁷ ₂、NHCOR⁷(胺酰基)、胍基、取代的胍基NH-C(NR⁷ ₂)＝NR⁷、巯基、SR⁷、CONH₂、CONHR⁷、CONR⁷ ₂、卤素(例如氟、氯、溴、碘)、拟卤素(例如氰基、硫氰基)、羧基，

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中所述的式J、式B、式D、式E、和式F的核苷类似物中，其糖环部分各自独立地选自脱氧核糖基、其它五员糖环基、其它六员糖环基、LNA型[优选地，该糖环部分各自独立地选自脱氧核糖基、LNA型]。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中所述的式J、式B、式D、式E和式F的核苷类似物中，其糖环部分各自独立地选自脱氧核糖基，LNA型，其2’-位取代基R⁶各自独立地选自氢、氨基、氟原子、甲氧基、乙氧基、丙氧基、甲氧基乙烯氧基、乙氧基乙烯氧基、丙氧基乙烯氧基。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其基于10-23脱氧核酶的催化结构域的化学修饰，以获得更高效的脱氧核酶，其结构为3’-N₁ N₂ N₃ N₄ N₅N₆……N_iX₁₅X₁₄C₁₃ X₁₂X₁₁C₁₀ X₉X₈C₇ X₆X₅X₄ C₃X₂X₁RN_i+17N_i+18N_i+19N_i+20……N_n-5’。R为嘌呤碱基，与靶序列剪切位点的Y互补；N代表其两端的识别部分，两端的碱基数量相同或不同，从4个到25个不等。被其识别的靶序列的结构为5’-N’₁N’₂N’₃N’₄……N’_i R YN’_i+3N’_i+4N’_i+5N’_i+6……N’_m-3’，R为嘌呤碱基，Y为嘧啶碱基，5’-RY-3’为脱氧核酶的剪切位点，两端为被脱氧核酶识别的序列，靶序列的长度可以从4个到全长的基因序列数目的碱基不等，它们可以是进行基因操作或致病基因的片段。根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，中间的3’-X₁₅X₁₄C₁₃ X₁₂X₁₁C₁₀ X₉X₈C₇ X₆X₅X₄ C₃X₂X₁-5’为催化结构域，X代表修饰的核苷类似物，其设计方式如下：

其中，在10-23脱氧核酶类似物与底物结合的示意图中，N’为底物的核苷酸单体组成，N为10-23脱氧核酶识别域的核苷酸单体组成，N为任一与靶核苷酸N’可以进行W-C互补配对的核苷酸单元。R：嘌呤核苷酸单元，Y为嘧啶核苷酸单元，C为含胞嘧啶碱基的核苷酸单元。互补链部分的长度可随靶核酸的序列、碱基组成等因素的变化而变化，靶的碱基数为m，可以是从4个到全长的基因序列的数目，脱氧核酶类似物的两端的碱基数为n(4-50)。X₁，X₂，X₄，X₅，X₆，X₈，X₉，X₁₁，X₁₂，X₁₄，X₁₅为引入的修饰的结构单元。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中，脱氧核酶的催化结构域中的X₁，X₂，X₄，X₅，X₆，X₈，X₉，X₁₁，X₁₂，X₁₄，X₁₅等位点，可以用如结构通式J，B，D，E，F所示的核苷类似物代替，X所代表的化合物可以是J，B，D，E，F中的任何一个结构：

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中，X₁，X₂，X₆，X₁₄，选择用鸟苷类似物D和E进行修饰；X₅，X₉，X₁₁，X₁₂，X₁₅选择用腺苷类似物J和B进行修饰；X₄和X₈选择用尿苷类似物F进行修饰。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中，

[嘌呤核苷类似物式J和式D中，7位的原子Z可以各自独立地选自碳和氮原子。其中，

当Z为碳原子时，7位的取代基R¹。R¹可以是氢，卤素(氟，氯，溴，碘)，杂环，芳香基和杂芳香基(碳原子数为3-20)，R⁷，或L-R⁸。L-R⁸中，R⁸为羟基，氨基，杂环，芳香基和杂芳香基(碳原子数为3-20)，OR⁷，NHR⁷，NR⁷ ₂，胍基，取代的胍基NH-C(NR⁷ ₂)＝NR⁷，SR⁷，卤素等。R⁷可以是直链烷基，支链烷基，不饱和烷基，环烷基(碳原子数≤10个)，以及含芳香环的直链和支链结构等。

L为连接臂，连接臂可以是直链烷基，支链烷基，不饱和烷基，环烷基(碳原子数≤10个)等。

在杂环，芳香基和杂芳香基(碳原子数为3-20)中，可以有一个或多个取代基，取代基可以为R⁹，它的定义与R⁷相同。

当Z为氮原子时，则无取代基。

嘌呤核苷类似物J，B，D，E中，2位的取代基为R²，可以是氢，氨基，羟基，胍基，卤素，OR⁷，NHR⁷，NR⁷ ₂，SR⁷，杂环，芳香基和杂芳香基(碳原子数为3-20)，R⁷，或L-R⁸。L-R⁸中，R⁸为羟基，氨基，杂环，芳香基和杂芳香基(碳原子数为3-20)，OR⁷，NHR⁷，NR⁷ ₂，胍基，取代的胍基NH-C(NR⁷ ₂)＝NR⁷，SR⁷，卤素等。L为连接臂，连接臂可以是直链烷基，支链烷基，不饱和烷基，环烷基(碳原子数≤10个)等。R⁷可以是直链烷基，支链烷基，不饱和烷基，环烷基(碳原子数≤10个)，以及含芳香环的直链和支链结构等。在芳香基和杂芳香基(碳原子数为3-20)中，可以有一个或多个取代基，取代基可以为R⁹，它的定义与R⁷相同。

嘌呤核苷类似物式J和式B中，6位的取代基为R³，可以是氢，氨基，羟基，胍基，卤素，OR⁷，NHR⁷，NR⁷ ₂，NHCOR⁷(胺酰基)，SR⁷，杂环，芳香基和杂芳香基(碳原子数为3-20)，R⁷，或L-R⁸。L-R⁸中，R⁸为羟基，氨基，杂环，芳香基和杂芳香基(碳原子数为3-20)，OR⁷，NHR⁷，NR⁷ ₂，胍基，取代的胍基NH-C(NR⁷ ₂)＝NR⁷，SR⁷，卤素等。L为连接臂，连接臂可以是直链烷基，支链烷基，不饱和烷基，环烷基(碳原子数≤10个)等。R⁷可以是直链烷基，支链烷基，不饱和烷基，环烷基(碳原子数≤10个)，以及含芳香环的直链和支链结构等。在芳香基和杂芳香基(碳原子数为3-20)中，可以有一个或多个取代基，取代基可以为R⁹，它的定义与R⁷相同。

嘌呤核苷类似物式J和式B中，其2位和6位上的取代基可以相同或不同。

嘌呤核苷类似物J和D，其8位的W可以是碳原子和氮原子。

其中，

当W为碳原子时，其上的取代基为R¹⁰，可以是氢，卤素(氟，氯，溴，碘)，氨基，胍基，OR⁷，NHR⁷，NR⁷ ₂，SR⁷，杂环，芳香基和杂芳香基(碳原子数为3-20)，R⁷，或L-R⁸。L-R⁸中，R⁸为羟基，氨基，芳香基和杂芳香基(碳原子数为3-20)，OR⁷，NHR⁷，NR⁷ ₂，胍基，取代的胍基NH-C(NR⁷ ₂)＝NR⁷，SR⁷，卤素等。R⁷可以是直链烷基，支链烷基，不饱和烷基，环烷基(碳原子数≤10个)，以及含芳香环的直链和支链结构等。L为连接臂，连接臂可以是直链烷基，支链烷基，不饱和烷基，环烷基(碳原子数≤10个)等。在杂环，芳香基和杂芳香基(碳原子数为3-20)中，可以有一个或多个取代基，取代基可以为R⁹，它的定义与R⁷相同。

嘌呤核苷类似物J和D，当8位的W为氮原子时，则无取代基。

嘌呤核苷类似物J和D，Z和W可以相同或不同。

嘌呤核苷类似物B和E，Z和V所在的五员环为饱和环结构，Z和V可以是碳，氮，氧，硫等原子。当Z为碳原子时，其上的取代基为R¹，当V为碳原子时，其上的取代基为R¹¹，其定义与R¹相同；当Z为氮原子时，其上的取代基为R¹，但不包括卤素和拟卤素；当V为氮原子时，其上的取代基为R¹¹，对于它的定义与R¹相同，但不为卤素和拟卤素。当Z和V为氧或硫原子时，则无取代基。

嘧啶核苷类似物F，其5位和6位的取代基R⁴，R⁵，可以是氢，卤素(氟，氯，溴，碘)，杂环，芳香基和杂芳香基(碳原子数为3-20)，R⁷，或L-R⁸。在L-R⁸中，R⁸为羟基，氨基，杂环，芳香基和杂芳香基(碳原子数为3-20)，OR⁷，NHR⁷，NR⁷ ₂，胍基，取代的胍基NH-C(NR⁷ ₂)＝NR⁷，SR⁷，卤素等。R⁷可以是直链烷基，支链烷基，不饱和烷基，环烷基(碳原子数≤10个)，以及含芳香环的直链和支链结构等。L为连接臂，连接臂可以是直链烷基，支链烷基，不饱和烷基，环烷基(碳原子数≤10个)等。在芳香基和杂芳香基(碳原子数为3-20)中，可以有一个或多个取代基，取代基可以为R⁹，它的定义与R⁷相同。

嘧啶核苷类似物F，其5位和6位的取代基R⁴，R⁵，可以相同或不同。

核苷类似物J，B，D，E，F，糖环部分可以是脱氧核糖基，六员糖环基，LNA型，或其他修饰的糖环结构；糖环的构型可以是D-或L-型。

核苷类似物J，B，D，E，F，其五员糖环的2’-位取代基，可以是氢，氨基，氟原子，甲氧基，乙氧基，丙氧基，甲氧基乙烯氧基，乙氧基乙烯氧基，丙氧基乙烯氧基，甲胺基，二甲胺基，乙胺基，二乙胺基，丙胺基，二丙胺基，环丙胺基等]。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，所涉及的核苷类似物J，B，D，E，F中：

[(1)嘌呤核苷类似物J和D中，7位的原子Z可以是碳原子、氮原子。当Z为碳原子时，7位的R¹的取代基优选为氢，氟，氯，溴，碘，氰基，咪唑基，吡唑基，噻吩基，三氮唑基，吡啶基，苯基，苯乙基，乙基苯乙基，苯丙基，甲氧基苯乙基基，乙氧基苯乙基，叔丁基苯乙基，或L-R⁸。在L-R⁸中，R⁸优选为羟基，氨基，咪唑基，胍基，吡唑基，三氮唑基，吡啶基，苯基，甲苯基，乙苯基，丙苯基，甲氧基苯基，乙氧基苯基，叔丁基苯基，萘基，蒽基，甲氧基，乙氧基，甲胺基，二甲胺基，乙胺基，二乙胺基，丙胺基，二丙胺基，环丙胺基。

L优选为2-5个碳原子的直链烷基臂。

L-R⁸可以是羟丙基，(E，Z)羟丙烯基，羟丙炔基，羟丁基，羟戊基，羟己基，甲氧基丙基，乙氧基丙基；胺丙基，(E，Z)胺丙烯基，胺丙炔基，胺丁基，胺戊基，胺己基，甲胺基丙基，二甲胺基丙基，乙胺基丙基，二乙胺基丙基；(2或4-)咪唑乙基，(2或4-)咪唑丙基，(2或4-)咪唑丁基，胍乙基，胍丙基，胍丁基，胍戊基，吡啶乙基，吡啶丙基，苯乙基，甲基苯乙基，乙基苯乙基，叔丁基苯乙基，甲氧基苯乙基，乙氧基苯乙基，苯丙基，苯丁基等。

当Z为氮原子时，则无取代基。

(2)嘌呤核苷类似物J，B，D，E中，2位的取代基R²优选为氢，氨基，胍基，咪唑基，羟基，卤素，或L-R⁸。在L-R⁸中，R⁸优选为羟基，氨基，咪唑基，胍基，吡唑基，噻吩基，三氮唑基，吡啶基，苯基，甲苯基，乙苯基，丙苯基，甲氧基苯基，乙氧基苯基，叔丁基苯基，萘基，蒽基，甲氧基，乙氧基，甲胺基，二甲胺基，乙胺基，二乙胺基，丙胺基，二丙胺基，环丙胺基；

L为2-5个碳原子的直链或支链烷基臂。

L-R⁸可以是羟丙基，(E，Z)羟丙烯基，羟丙炔基，羟丁基，羟戊基，羟己基，甲氧基丙基，乙氧基丙基；胺丙基，(E，Z)胺丙烯基，胺丙炔基，胺丁基，胺戊基，胺己基，甲胺基丙基，二甲胺基丙基，乙胺基丙基，二乙胺基丙基；(2或4-)咪唑乙基，(2或4-)咪唑丙基，(2或4-)咪唑丁基，胍乙基，胍丙基，胍丁基，胍戊基，吡啶乙基，吡啶丙基，苯乙基，甲基苯乙基，乙基苯乙基，甲氧基苯乙基，乙氧基苯乙基，叔丁基苯乙基，苯丙基，苯丁基等。

(3)嘌呤核苷类似物J和D中，其五员环的W优选为碳和氮原子。当W为碳原子时，其取代基R¹⁰可以是氢，卤素(氟，氯，溴，碘)，氨基，胍基，或L-R⁸。在L-R⁸中，R⁸优选为羟基，氨基，咪唑基，胍基，吡唑基，噻吩基，三氮唑基，吡啶基，苯基，甲苯基，乙苯基，丙苯基，甲氧基苯基，乙氧基苯基，叔丁基苯基，萘基，蒽基，甲氧基，乙氧基，甲胺基，二甲胺基，乙胺基，二乙胺基，丙胺基，二丙胺基，环丙胺基；

L为2-5个碳原子的直链或支链烷基臂。

当W为氮原子时，则无取代基。

(4)嘌呤核苷类似物B和E中，其五员环为饱和结构，Z和V优选为碳，氮原子；Z和V可以相同或不同。当Z为碳原子时，其上的取代基为R¹，当V为碳原子时，其上的取代基R¹¹的定义与R¹相同；当Z为氮原子时，其上的取代基为R¹，但不包括卤素和拟卤素；当V为氮原子时，其上的取代基为R¹¹，其定义与R¹相同，但不为卤素和拟卤素取代。当Z和V为氧或硫原子时，则无取代基。

(5)在嘧啶核苷类似物F中，其5位和6位的取代基R⁴，R⁵优选为卤素(氟，氯，溴，碘)，咪唑基，或L-R⁸。在L-R⁸中，R⁸优选为羟基，氨基，咪唑基，胍基，吡唑基，噻吩基，三氮唑基，吡啶基，苯基，甲苯基，乙苯基，丙苯基，甲氧基苯基，乙氧基苯基，叔丁基苯基，萘基，蒽基，甲氧基，乙氧基，甲胺基，二甲胺基，乙胺基，二乙胺基，丙胺基，二丙胺基，环丙胺基；L为1-5个碳原子的直链或支链烷基臂。

L-R⁸可以是羟丙基，(E，Z)羟丙烯基，羟丙炔基，羟丁基，羟戊基，羟己基，甲氧基丙基，乙氧基丙基；胺丙基，(E，Z)胺丙烯基，胺丙炔基，胺丁基，胺戊基，胺己基，甲胺基丙基，二甲胺基丙基，乙胺基丙基，二乙胺基丙基；(2或4-)咪唑乙基，(2或4-)咪唑丙基，(2或4-)咪唑丁基，胍乙基，胍丙基，胍丁基，胍戊基，吡啶乙基，吡啶丙基，苯乙基，甲基苯乙基，乙基苯乙基，甲氧基苯乙基，叔丁基苯乙基，乙氧基苯乙基，苯丙基，苯丁基等。

核苷类似物J，B，D，E，F，糖环部分可以是脱氧核糖基，LNA型；糖环的构型可以是D-或L-型。

核苷类似物J，B，D，E，F，其五员糖环的2’-位取代基，可以是氢，氨基，氟原子，甲氧基，乙氧基，丙氧基，甲氧基乙烯氧基，乙氧基乙烯氧基，丙氧基乙烯氧基等]。

[(1)嘌呤核苷类似物J和D中，其五员环的Z和W优选为碳原子和氮原子；Z和W可以相同或不同。

(2)嘌呤核苷类似物J和D中，7位的原子Z各自独立地选自碳原子、氮原子。当Z为碳原子时，7位的R¹的取代基优选为氢，氟，氯，溴，碘，咪唑基，羟甲基，羟丙基，(E，Z)羟丙烯基，羟丙炔基，羟丁基，羟戊基，羟己基，甲氧基丙基，乙氧基丙基；胺丙基，(E，Z)胺丙烯基，胺丙炔基，胺丁基，胺戊基，胺己基，甲胺基丙基，二甲胺基丙基，乙胺基丙基，二乙胺基丙基；(2或4-)咪唑乙基，(2或4-)咪唑丙基，(2或4-)咪唑丁基，胍乙基，胍丙基，胍丁基，胍戊基，吡啶乙基，吡啶丙基，苄基，苯乙基，甲基苯乙基，乙基苯乙基，叔丁基苯乙基，甲氧基苯乙基，乙氧基苯乙基，苯丙基，苯丁基等。

(3)嘌呤核苷类似物J和D中，其五员环的W优选为碳和氮原子。当W为碳原子时，其取代基R¹⁰各自独立地选自氢，氟，氯，溴，碘，氨基，胍基，咪唑基，羟甲基，羟丙基，(E，Z)羟丙烯基，羟丙炔基，羟丁基，羟戊基，羟己基，甲氧基丙基，乙氧基丙基；胺丙基，(E，Z)胺丙烯基，胺丙炔基，胺丁基，胺戊基，胺己基，甲胺基丙基，二甲胺基丙基，乙胺基丙基，二乙胺基丙基；(2或4-)咪唑乙基，(2或4-)咪唑丙基，(2或4-)咪唑丁基，胍乙基，胍丙基，胍丁基，胍戊基，吡啶乙基，吡啶丙基，苄基，苯乙基，甲基苯乙基，乙基苯乙基，叔丁基苯乙基，甲氧基苯乙基，乙氧基苯乙基，苯丙基，苯丁基等。

当W为氮原子时，则无取代基。

(4)嘌呤核苷类似物J，B，D，E中，2位的取代基R²优选为氢，氨基，羟基，胍基，咪唑基，卤素，羟乙基，羟丙基，(E，Z)羟丙烯基，羟丙炔基，羟丁基，羟戊基，羟己基，甲氧基丙基，乙氧基丙基；胺丙基，(E，Z)胺丙烯基，胺丙炔基，胺丁基，胺戊基，胺己基，甲胺基丙基，二甲胺基丙基，乙胺基丙基，二乙胺基丙基；(2或4-)咪唑乙基，(2或4-)咪唑丙基，(2或4-)咪唑丁基，胍乙基，胍丙基，胍丁基，胍戊基，吡啶乙基，吡啶丙基，苯乙基，甲基苯乙基，乙基苯乙基，甲氧基苯乙基，乙氧基苯乙基，叔丁基苯乙基，苯丙基，苯丁基等。

(5)嘌呤核苷类似物J，B，D，E中，6位的取代基R³优选为氢，氨基，胍基，羟基，咪唑基，卤素，羟乙基，羟丙基，(E，Z)羟丙烯基，羟丙炔基，羟丁基，羟戊基，羟己基，甲氧基丙基，乙氧基丙基；胺丙基，(E，Z)胺丙烯基，胺丙炔基，胺丁基，胺戊基，胺己基，甲胺基丙基，二甲胺基丙基，乙胺基丙基，二乙胺基丙基；(2或4-)咪唑乙基，(2或4-)咪唑丙基，(2或4-)咪唑丁基，胍乙基，胍丙基，胍丁基，胍戊基，吡啶乙基，吡啶丙基，苯乙基，甲基苯乙基，乙基苯乙基，甲氧基苯乙基，乙氧基苯乙基，叔丁基苯乙基，苯丙基，苯丁基等。

(6)嘌呤核苷类似物B和E中，其五员环为饱和结构，Z和V优选为碳，氮原子；Z和V可以相同或不同。当Z为碳原子时，其上取代基为R¹；当V为碳原子时，其上的取代基为R¹¹，其定义与R¹相同；当Z为氮原子时，其上的取代基为R¹，但不包括卤素和拟卤素；当V为氮原子时，其上的取代基为R¹¹，对于它的定义与R¹相同，但不为卤素和拟卤素取代。当Z和V为氧或硫原子时，则无取代基。

(7)在嘧啶核苷类似物F中，其5位和6位的取代基R⁴，R⁵优选为卤素(氟，氯，溴，碘)，咪唑基，羟甲基，羟乙基，羟丙基，(E，Z)羟丙烯基，羟丙炔基，羟丁基，羟戊基，羟己基，甲氧基丙基，乙氧基丙基；胺丙基，(E，Z)胺丙烯基，胺丙炔基，胺丁基，胺戊基，胺己基，甲胺基丙基，二甲胺基丙基，乙胺基丙基，二乙胺基丙基；(2或4-)咪唑乙基，(2或4-)咪唑丙基，(2或4-)咪唑丁基，胍乙基，胍丙基，胍丁基，胍戊基，吡啶乙基，吡啶丙基，苯乙基，甲基苯乙基，乙基苯乙基，甲氧基苯乙基，乙氧基苯乙基，叔丁基苯乙基，苯丙基，苯丁基等。

(8)核苷类似物J，B，D，E，F，糖环部分可以是脱氧核糖基，LNA型，糖环的构型可以是D-或L-型。五员糖环的2’-位取代基，可以是氢，氨基，氟原子，甲氧基，乙氧基，丙氧基，甲氧基乙烯氧基，乙氧基乙烯氧基，丙氧基乙烯氧基等]。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，可以用所涉及的核苷类似物J，B，D，E，F对5个dA位点X₅，X₉，X₁₁，X₁₂，X₁₅进行修饰：

(1)在5个dA位点X₅，X₉，X₁₁，X₁₂，X₁₅的修饰中，化合物J，B，D，E，F都可插入这些位点，代替dA；

(2)在5个dA位点X₅，X₉，X₁₁，X₁₂，X₁₅的修饰中，优选选择化合物J和B代替dA；

(3)在5个dA位点X₅，X₉，X₁₁，X₁₂，X₁₅的修饰中，它们都是可被取代的位置；

(4)在5个dA位点X₅，X₉，X₁₁，X₁₂，X₁₅的修饰中，在单一取代修饰中，以X₉为优选修饰的位点；

(5)在5个dA位点X₅，X₉，X₁₁，X₁₂，X₁₅的修饰中，可以同时对多个位点(2-5个)进行修饰。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，4个dG位置的X₁，X₂，X₆，X₁₄都是可各自独立地任选被所涉及的核苷类似物J，B，D，E，F取代的位置，其中：

(1)在4个dG的位置，X₁，X₂，X₆，X₁₄的修饰中，化合物J，B，D，E，F都可插入这些位点，代替dG；

(2)在4个dG的位置，X₁，X₂，X₆，X₁₄的修饰中，优选选择化合物D和E插入这些位点，代替dG；

(3)在4个dG的位置，X₁，X₂，X₆，X₁₄的修饰中，在单一取代修饰时，以G2和G14为优选修饰的位点；

(4)在4个dG的位置，X₁，X₂，X₆，X₁₄的修饰中，可以同时对多个位点进行修饰。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，两个dT的位置X₄和X₈都是可各自独立地任选被所涉及的核苷类似物J，B，D，E，F取代的位置，其中：

(1)在对两个dT的位置X₄和X₈的修饰中，可同时或单独引入修饰的单体；

(2)在对两个dT的位置X₄和X₈的修饰中，化合物J，B，D，E，F都可插入这些位点，代替dT；

(3)在对两个dT的位置X₄和X₈的修饰中，优选选择化合物F插入这些位点，代替dT。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，利用以上核苷类似物J，B，D，E，F对脱氧核酶的结构域进行修饰时，5个dA的修饰位点(X₅，X₉，X₁₁，X₁₂，X₁₅)，4个dG的修饰位点(X₁，X₂，X₆，X₁₄)，和两个dT的修饰位点(X₄和X₈)，可被多种不同类型的的核苷类似物进行组合取代。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中式J、式B、式D、式E、式F的核苷类似物的单一或组合取代也与天然碱基的缺失(如缺失T8)一起修饰10-23脱氧核酶的催化结构域。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中式J、式B、式D、式E、式F的核苷类似物的单一或组合取代也与天然碱基的替换一起修饰10-23脱氧核酶的催化结构域。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中式J、式B、式D、式E、式F的核苷类似物也可以用于其他天然单体的取代。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中式J、式B、式D、式E、式F的核苷类似物的引入可以与脱氧核酶的抗核酸酶修饰组合。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中所述抗核酸酶修饰的方法有硫代磷酸酯键骨架；2’-氟代，2’-甲氧基，2’-甲氧基乙烯氧基(MOE)，2’-乙氧基修饰，LNA等；以及在3’-端引入翻转的核苷酸单体，获得酶稳定性更高的新型的脱氧核酶类似物。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中所述抗核酸酶的修饰既可用于脱氧核酶的催化结构域，又可用于它的两端识别结构域。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中式J、式B、式D、式E、式F的核苷类似物的引入可以与改善脱氧核酶的转运而进行的修饰组合。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中所述改善转运的办法包括脂质体和阳离子性脂质体，和其他转运材料的包裹；胆固醇，PEG等与脱氧核酶的共价连接等方法。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中金属离子，包括二价金属离子和一价金属离子有助于提高脱氧核酶类似物的催化效率。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中所述二价金属离子选自Mg²⁺、Mn²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺，这些离子能大大提高脱氧核酶类似物的催化效率。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中所述二价金属离子Mg²⁺为优选选择。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中所述二价金属离子Mg²⁺浓度为0.01-50mM。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中所述二价金属离子Mg²⁺浓度优选为0.1-2mM。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中所述一价金属离子选自Na⁺和K⁺，一价金属离子对脱氧核酶类似物的催化反应有促进作用。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中所述一价金属离子Na⁺和K⁺的浓度为0-500mM。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中所述一价金属离子Na⁺和K⁺的浓度优选为50-200mM。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中所述脱氧核酶类似物的催化裂解反应受pH的影响，pH范围为3.0-9.0。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中所述pH值优选为4.0-9.0。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中所述脱氧核酶类似物的两端识别结构域长度各为4-25个碱基长。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中所述根据任一靶核酸的序列片段，设计脱氧核酶类似物的两端识别结构域序列与之互补。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中所述靶核酸片段来源于被操作的目的基因，包括用于基因研究和基因治疗的目的基因。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中这些脱氧核酶类似物可以作为人工内切酶，作为分子生物学工具。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中这些脱氧核酶类似物可以为裂解任何致病基因片段而设计，作为基因治疗的候选药物。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，其为选自本发明实施例制备得到的或者已列举的任一10-23脱氧核酶类似物。

根据本发明第一方面任一项的10-23脱氧核酶类似物，针对血管内皮生长因子mRNA的一段序列，合成了选自下列编号对应的10-23脱氧核酶类似物(表1)：

表1 10-23脱氧核酶类似物所含的修饰位点和修饰单体

编号	10-23脱氧核酶类似物的序列组成	修饰单体所在位置＝核苷类似物单体编号
			DZ01	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA CAA CGA cct gca cct)-3’

			LKDZ22	5’-d(tgc tct cca GGC T1G CTA CAA CGA cct gca cct)-3’	A5＝1
LKDZ23	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CT1 CAA CGA cct gca cct)-3’	A9＝1
			LKDZ24	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA C1A CGA cct gca cct)-3’	A11＝1
LKDZ25	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA CAA CG1 cct gca cct)-3’	A15＝1
			LKDZ26	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA CA1 CGA cct gca cct)-3’	A12＝1

			LKDZ12	5’-d(tgc tct cca GGC T2G CTA CAA CGA cct gca cct)-3’	A5＝2
LKDZ13	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA CAA CG2 cct gca cct)-3’	A15＝2
			LKDZ14	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CT2 CAA CGA cct gca cct)-3’	A9＝2
LKDZ15	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA C2A CGA cct gca cct)-3’	A11＝2

LKDZ16	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA CA2 CGA cct gca cct)-3’	A12＝2

LKDZ17	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA CAA CG3 cct gca cct)-3’	A15＝3
			LKDZ18	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA CA3 CGA cct gca cct)-3’	A12＝3
LKDZ19	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA C3A CGA cct gca cct)-3’	A11＝3
			LKDZ20	5’-d(tgc tct cca GGC T3G CTA CAA CGA cct gca cct)-3’	A5＝3
LKDZ21	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CT3 CAA CGA cct gca cct)-3’	A9＝3

LKDZ27	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CT4 CAA CGA cct gca cct)-3’	A9＝4

LKWQ01	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA CAA CG6 cct gca cct)-3’	A15＝6
			LKWQ02	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA CA6 CGA cct gca cct)-3’	A12＝6
LKWQ03	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA C6A CGA cct gca cct)-3’	A11＝6
			LKWQ04	5’-d(tgc tct cca GGC T6G CTA CAA CGA cct gca ccg)-3’	A5＝6
LKWQ05	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CT6 CAA CGA cct gca cct)-3’	A9＝6

LKWQ06	5’-d(tgc tct cca 11GC TAG CTA CAA CGA cct gca cct)-3’	G1＝11
			LKWQ07	5’-d(tgc tct cca G11C TAG CTA CAA CGA cctgca cct)-3’	G2＝11
LKWQ08	5’-d(tgc tct cca GGC TA11 CTA CAA CGA cct gca cct)-3’	G6＝11
			LKWQ09	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA CAA C11A cct gca cct)-3’	G14＝11

			LKDZ10	5’-d(tgc tct cca GGC 21AG CTA CAA CGA cct gca cct)-3’	T4＝21
LKDZ11	5’-d(tgc tct cca GGC TAG C21A CAA CGA cctgca cct)-3’	T8＝21

LKDZ02	5’-d(tgc tct cca GGC 22AG CTA CAA CGA cct gca cct)-3’	T4＝22
			LKDZ03	5’-d(tgc tct cca GGC TAG C22A CAA CGA cct gca cct)-3’	T8＝22

			LKDZ04	5’-d(tgc tct cca GGC 23AG CTA CAA CGA cct gca cct)-3’	T4＝23
LKDZ05	5’-d(tgc tct cca GGC TAG C23A CAA CGA cctgca cct)-3’	T8＝23

其中，“修饰单体所在位置”表示被取代的单体类型以及该单体所在的位置，“核苷类似物单体编号”表示选自下列编号的核苷类似物单体：

1：R¹＝H 6：R¹＝H 11：R¹＝H

2：R¹＝(CH₂)₃OH 7：R¹＝(CH₂)₃OH 12：R¹＝(CH₂)₃OH

3：R¹＝(CH₂)₃NH₂ 8：R¹＝(CH₂)₃NH₂ 13：R¹＝(CH₂)₃NH₂

4：R¹＝CH₂CH₂C₆H₅ 9：R¹＝CH₂CH₂C₆H₅ 14：R¹＝CH₂CH₂C₆H₅

5：R¹＝CH₂CH₂(4-)Im 10：R¹＝CH₂CH₂(4-)Im 15：R¹＝CH₂CH₂(4-)Im

16：R¹＝H 21：R⁴＝CH₂OH

17：R¹＝(CH₂)₃OH 22：R⁴＝CH₂CH₂OH

18：R¹＝(CH₂)₃NH₂ 23：R⁴＝CH₂CH₂CH₂OH

19：R¹＝CH₂CH₂C₆H₅ 24：R⁴＝CH₂CH₂(4-)Im

20：R¹＝CH₂CH₂(4-)Im。

本发明第二方面提供了本发明第一方面任一项所述10-23脱氧核酶类似物的制备方法，采用通常的亚磷酰胺法固相合成10-23脱氧核酶类似物。

所引入的修饰单体中，各功能基的保护基和脱保护方法随功能基和核苷类似物的种类而不同。如羟基的保护基，可以是叔丁基二甲基硅基，叔丁基二苯基硅基，乙酰基，苯甲酰基，三氟乙酰基等。氨基的保护基有苯甲酰基，乙酰基，三氟乙酰基等。

对于嘌呤类似物，所引入的羟基的保护基可以是叔丁基二甲基硅基，叔丁基二苯基硅基，乙酰基，苯甲酰基，三氟乙酰基。优选选择的保护基是叔丁基二甲基硅基，叔丁基二苯基硅基。

对于嘧啶类似物，所引入的羟基的保护基可以是叔丁基二甲基硅基，叔丁基二苯基硅基，乙酰基，苯甲酰基，三氟乙酰基。优选选择的保护基是叔丁基二甲基硅基，叔丁基二苯基硅基。

叔丁基二苯基硅基和叔丁基二甲基硅基的脱保护方法有两种，第一种是浓氨水，55-60℃，18-20小时。另一种脱保护方法是1M四正丁基氟化铵的四氢呋喃溶液，室温下避光过夜。这两种方法都适合其他天然单体为普通保护基保护的情况。第二种脱保护方法适合要求使用易脱保护基保护的天然单体的情况。

核苷类似物中所引入的氨基，其保护基可以是苯甲酰基，芴甲氧羰酰基，乙酰基，三氟乙酰基。优选选择的保护基是三氟乙酰基。这个保护基保护的单体既适合和普通保护基保护的天然单体联用，又适合与易脱保护基保护的天然单体一起使用。

对所得的10-23脱氧核酶类似物的分离和纯化方法有反相高效液相色谱和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

对所得的10-23脱氧核酶类似物的脱盐的方法有凝胶柱层析和SEP-PAK柱萃取。

根据本发明第二方面的制备方法，针对底物的序列5′-N′₁N′₂N′₃N′₄N′₅N′₆......N′_i R Y N′_i+3N′_i+4N′_i+5N′_i+6......N′_m-3′可以合成相应的以下修饰的10-23脱氧核酶类似物。

其中，

N’为底物的核苷酸单体组成，N为10-23脱氧核酶的核苷酸单体组成。R为嘌呤核苷酸单元，Y为嘧啶核苷酸单元，i为4-33的整数，底物包括进行基因操作和基因治疗的部分序列或全长序列，因此设定m最小为4(例如为4-100的整数)；n为4-50的整数；多个N组成的10-23脱氧核酶的两端识别结构域与底物的序列形成Watson-Crick配对；

N、n、X₁₅、X₁₄、X₁₂、X₁₁、X₉、X₈、X₆、X₅、X₄、X₂、X₁的定义同本发明第一方面任一项所述。

根据本发明第二方面任一项的制备方法，其中所述的底物可以是任意核苷酸单体组成的序列，包括进行基因操作和基因治疗的序列，如血管内皮生长因子的一段序列5’-AGG TGC AGG AUG GAG AGC A-3’。

本发明第三方面提供了一种药盒、试剂盒、或组合物例如药物组合物，包含：i)本发明第一方面任一项所述10-23脱氧核酶类似物，以及任选的ii)载体或赋形剂，特别是药学可接受的载体或赋形剂，和任选的iii)产品技术说明书或使用说明书。在一个实施方案中，所述的载体或赋形剂选自水、氯化钠、葡萄糖、甘露醇、乳糖等。

本发明第四方面提供了本发明第一方面任一项所述10-23脱氧核酶类似物在制备用于基因研究和/或基因治疗的产品(例如药物、药盒、试剂盒)中的用途。

本发明第四方面还提供了本发明第一方面任一项所述10-23脱氧核酶类似物在制备用于作为人工内切酶或者作为分子生物学工具的产品例如药物中的用途。

本发明第四方面还提供了本发明第一方面任一项所述10-23脱氧核酶类似物在制备用于裂解任何致病基因片段的产品例如药物中的用途。

本发明第四方面还提供了本发明第一方面任一项所述10-23脱氧核酶类似物在制备用于作为基因治疗的候选药物的产品例如药物中的用途。

本发明第五方面提供了执行基因研究和/或基因治疗的方法，其包括向有需要的受试体(例如但不限于细胞、离体细胞、组织、离体组织、细菌、病毒、微生物、动物、哺乳动物、人等)施用有效量的本发明第一方面任一项所述10-23脱氧核酶类似物，或者使所述受试体与本发明第一方面任一项所述10-23脱氧核酶类似物接触。

本发明第五方面还提供了执行人工内切酶研究或分子生物学研究的方法，其包括向有需要的受试体(例如但不限于细胞、离体细胞、组织、离体组织、细菌、病毒、微生物、动物、哺乳动物、人等)施用有效量的本发明第一方面任一项所述10-23脱氧核酶类似物，或者使所述受试体与本发明第一方面任一项所述10-23脱氧核酶类似物接触。

本发明第五方面还提供了执行裂解任何致病基因片段的方法，其包括向有需要的受试体(例如但不限于细胞、离体细胞、组织、离体组织、细菌、病毒、微生物、动物、哺乳动物、人等)施用有效量的本发明第一方面任一项所述10-23脱氧核酶类似物，或者使所述受试体与本发明第一方面任一项所述10-23脱氧核酶类似物接触。

根据本发明任一方面的任一项，其中所述的致病基因包括或者延及致癌基因、病毒、遗传突变基因等。

发明详述：

下面对本发明的特征和优点作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

如本发明使用的，术语“动物”是指例如但不限于禽类例如鸡、鸭等以及哺乳动物等的动物。

如本发明使用的，术语“哺乳动物”是指例如但不限于猪、狗、猫、牛、马等的哺乳动物以及人，特别是人。

一些优选的特征或者进一步的特征

本发明基于10-23脱氧核酶进行结构修饰，其结构为3’-N₁N₂N₃N₄N₅N₆……N_iX₁₅X₁₄C₁₃ X₁₂X₁₁C₁₀ X₉X₈C₇ X₆X₅X₄ C₃X₂X₁ R N_i+17N_i+18N_i+19N_i+20……N_n-5’。中间的3’-X₁₅X₁₄C₁₃ X₁₂X₁₁C₁₀ X₉X₈C₇ X₆X₅X₄ C₃X₂X₁-5’为催化结构域，是本发明将要修饰的部分；R为嘌呤碱基，与靶序列剪切位点的嘧啶碱基Y互补；N代表其两端的识别部分，两端的碱基数量相同或不同，从4个到25个不等。被其识别的靶序列的结构为5’-N’₁N’₂N’₃N’₄……N’_i R Y N’_i+3N’_i+4N’_i+5N’_i+6……N’_m-3’，R为嘌呤碱基，Y为嘧啶碱基，5’-RY-3’为脱氧核酶的剪切位点，两端为被脱氧核酶识别的序列，它们可以是进行基因操作或用于基因治疗的致病基因的部分序列或全长序列。本发明修饰的10-23脱氧核酶与底物结合的示意图参见图2，图中，N’为底物的核苷酸单体组成，N为10-23脱氧核酶类似物的识别域的核苷酸单体组成，N为任一与靶核酸N’可以进行W-C互补配对的核苷酸单元。R为嘌呤核苷酸单元，Y为嘧啶核苷酸单元，互补链部分的长度可随靶核酸的序列、碱基组成等因素的变化而变化，靶的碱基数最少为4个，脱氧核酶两端识别域的碱基数为n，从4至50。X₁，X₂，X₄，X₅，X₆，X₈，X₉，X₁₁，X₁₂，X₁₄，X₁₅为引入的修饰的结构单元。

在本发明中，对脱氧核酶的催化结构域中的X₁，X₂，X₄，X₅，X₆，X₈，X₉，X₁₁，X₁₂，X₁₄，X₁₅进行化学修饰，所涉及到的的核苷类似物如以下结构通式J，B，D，E，F所示。X所代表的化合物可以是J，B，D，E，F中的任何一个结构。

在本发明的一个实施方案中，X₁，X₂，X₆，X₁₄，选择用鸟苷类似物D和E进行修饰；X₅，X₉，X₁₁，X₁₂，X₁₅选择用腺苷类似物J和B进行修饰；X₄和X₈选择用尿苷类似物F进行修饰。

在本发明的一个实施方案中，对于以上核苷类似物J、B、D、E、F的定义如下：

(1)嘌呤核苷类似物J和D，其五员环的原子Z各自独立地选自碳原子和氮原子。其中，

当Z为碳原子时，7位的取代基R¹。R¹可以是氢，卤素(氟，氯，溴，碘)，杂环，芳香基和杂芳香基(碳原子数为3-20)，R⁷，或L-R⁸。L-R⁸中，R⁸为羟基，氨基，芳香基和杂芳香基(碳原子数为3-20)，OR⁷，NHR⁷，NR⁷ ₂，胍基，取代的胍基NH-C(NR⁷ ₂)＝NR⁷，SR⁷，卤素，拟卤素，羧基等。R⁷可以是直链烷基，支链烷基，不饱和烷基，环烷基(碳原子数≤10个)，以及含芳香环的直链和支链结构等。

L为连接臂，连接臂可以是直链烷基，支链烷基，不饱和烷基，环烷基(碳原子数≤10个)等，连接臂还可以是含酰胺键，酯键，醚键，硫醚键的直链和支链结构等。

(2)嘌呤核苷类似物J，B，D，E，2位的取代基为R²，可以是氢，氨基，羟基，胍基，卤素，OR⁷，NHR⁷，NR⁷ ₂，SR⁷，芳香基和杂芳香基(碳原子数为3-20)，R⁷，或L-R⁸。L-R⁸中，R⁸为羟基，氨基，芳香基和杂芳香基(碳原子数为3-20)，OR⁷，NHR⁷，NR⁷ ₂，胍基，取代的胍基NH-C(NR⁷ ₂)＝NR⁷，SR⁷，卤素等。R⁷可以是直链烷基，支链烷基，不饱和烷基，环烷基(碳原子数≤10个)，以及含芳香环的直链和支链结构等。在芳香基和杂芳香基(碳原子数为3-20)中，可以有一个或多个取代基，取代基可以为R⁹，它的定义与R⁷相同。

(3)嘌呤核苷类似物J和B，6位的取代基为R³，可以是氢，氨基，羟基，胍基，卤素，OR⁷，OCOR⁷(酯基)，NHR⁷，NR⁷ ₂，SR⁷，芳香基和杂芳香基(碳原子数为3-20)，R⁷，或L-R⁸。L-R⁸中，R⁸为羟基，氨基，芳香基和杂芳香基(碳原子数为3-20)，OR⁷，NHR⁷，NR⁷ ₂，胍基，取代的胍基NH-C(NR⁷ ₂)＝NR⁷，SR⁷，卤素等。R⁷可以是直链烷基，支链烷基，不饱和烷基，环烷基(碳原子数≤10个)，以及含芳香环的直链和支链结构等。在芳香基和杂芳香基(碳原子数为4-20)中，可以有一个或多个取代基，取代基可以为R⁹，它的定义与R⁷相同。

嘌呤核苷类似物J和B，其2位和6位上的取代基可以相同或不同。

(4)嘌呤核苷类似物J和D，其W可以是碳原子和氮原子。当为碳原子时，其上的取代基为R¹⁰，可以是氢，卤素(氟，氯，溴，碘)，氨基，胍基，OR⁷，NHR⁷，NR⁷ ₂，SR⁷，杂环，芳香基和杂芳香基(碳原子数为3-20)，R⁷，或L-R⁸。L-R⁸中，R⁸为羟基，氨基，芳香基和杂芳香基(碳原子数为4-20)，OR⁷，NHR⁷，NR⁷ ₂，胍基，取代的胍基NH-C(NR⁷ ₂)＝NR⁷，SR⁷，卤素等。R⁷可以是直链烷基，支链烷基，不饱和烷基，环烷基(碳原子数≤10个)，以及含芳香环的直链和支链结构等。L为连接臂，连接臂可以是直链烷基，支链烷基，不饱和烷基，环烷基(碳原子数≤10个)等；连接臂还可以是含酰胺键，酯键，醚键，硫醚键的直链和支链结构等。在杂环，芳香基和杂芳香基(碳原子数为3-20)中，可以有一个或多个取代基，取代基可以为R⁹，它的定义与R⁷相同。

嘌呤核苷类似物J和D，当8位的W为氮原子时，则没有取代基。

嘌呤核苷类似物J和D，其五员环的Z和W优选为碳原子和氮原子；Z和W可以相同或不同。

(5)嘌呤核苷类似物B和E，Z和V所在的五员环为饱和环结构，Z和V可以是碳，氮，氧，硫等原子。当Z为碳原子时，其上的取代基为R¹；当V为碳原子时，其上的取代基为R¹¹，其定义与R¹相同；当Z为氮原子时，其上的取代基为R¹，但不包括卤素和拟卤素；当V为氮原子时，其上的取代基为R¹¹，对于它的定义与R¹相同，但不为卤素和拟卤素取代基；Z和V的取代基可以相同或不同。当Z和V为氧或硫原子时，则无取代基。

(6)嘧啶核苷类似物F，其5位和6位的取代基R⁴，R⁵，可以是氢，卤素(氟，氯，溴，碘)，杂环，芳香基和杂芳香基(碳原子数为3-20)，R⁷，或L-R⁸。在L-R⁸中，R⁸为羟基，氨基，杂环，芳香基和杂芳香基(碳原子数为3-20)，OR⁷，NHR⁷，NR⁷ ₂，胍基，取代的胍基NH-C(NR⁷ ₂)＝NR⁷，SR⁷，卤素等。R⁷可以是直链烷基，支链烷基，不饱和烷基，环烷基(碳原子数≤10个)，以及含芳香环的直链和支链结构等。L为连接臂，连接臂可以是直链烷基，支链烷基，不饱和烷基，环烷基(碳原子数≤10个)等。在芳香基和杂芳香基(碳原子数为3-20)中，可以有一个或多个取代基，取代基可以为R⁹，它的定义与R⁷相同。

(7)核苷类似物J，B，D，E，F，其糖环部分可以是脱氧核糖基，其它五员糖环基，六员糖环基，LNA型，或其他修饰的糖环结构；糖环的构型可以是D-或L-型。

在本发明的一个实施方案中，所述核苷类似物J，B，D，E，F，其五员糖环的2’-位取代基，可以是氢，氨基，氟原子，甲氧基，乙氧基，丙氧基，甲氧基乙烯氧基，乙氧基乙烯氧基，丙氧基乙烯氧基，甲胺基，二甲胺基，乙胺基，二乙胺基，丙胺基，二丙胺基，环丙胺基等。

在本发明的一个实施方案中，在嘌呤核苷类似物J和D中，7位的Z原子优选为碳原子和氮原子，当Z为碳原子时，7位的R¹的取代基优选为氢，氟，氯，溴，碘，氰基，咪唑基，吡唑基，吡啶基，苯基，甲苯基，乙苯基，丙苯基，甲氧基苯基，乙氧基苯基，萘基，蒽基，或L-R⁸。在L-R⁸中，R⁸优选为羟基，氨基，咪唑基，胍基，吡唑基，三氮唑基，吡啶基，苯基，甲苯基，乙苯基，丙苯基，甲氧基苯基，乙氧基苯基，萘基，蒽基，甲氧基，乙氧基，甲胺基，二甲胺基，乙胺基，二乙胺基，丙胺基，二丙胺基，环丙胺基；

L优选为1-5个碳原子的直链或支链烷基臂；

L-R⁸可以是羟丙基，(E，Z)羟丙烯基，羟丙炔基，羟丁基，羟戊基，羟己基，甲氧基丙基，乙氧基丙基；胺丙基，(E，Z)胺丙烯基，胺丙炔基，胺丁基，胺戊基，胺己基，甲胺基丙基，二甲胺基丙基，乙胺基丙基，二乙胺基丙基；(2-或4-)咪唑乙基，(2-或4-)咪唑丙基，(2-或4-)咪唑丁基，胍乙基，胍丙基，胍丁基，胍戊基，吡啶乙基，吡啶丙基，苯乙基，甲基苯乙基，乙基苯乙基，甲氧基苯乙基，乙氧基苯乙基，叔丁基苯乙基，苯丙基，苯丁基等。

在本发明的一个实施方案中，在嘌呤核苷类似物J，B，D，E中，2位的取代基R²优选为氢，氨基，羟基，咪唑基，胍基，卤素，或L-R⁸。在L-⁸R中，R⁸优选为羟基，氨基，咪唑基，胍基，吡唑基，吡啶基，苯基，甲苯基，乙苯基，丙苯基，甲氧基苯基，乙氧基苯基，叔丁基苯基，萘基，蒽基，甲氧基，乙氧基，甲胺基，二甲胺基，乙胺基，二乙胺基，丙胺基，二丙胺基，环丙胺基；L为1-5个碳原子的直链或支链烷基臂；

在本发明的一个实施方案中，在嘌呤核苷类似物J和D中，其五员环的W优选为碳和氮原子。当W为碳原子时，其取代基R¹⁰优选为可以是氢，卤素(氟，氯，溴，碘)，氨基，胍基，咪唑基，或L-R⁸。在L-R⁸中，R⁸优选为羟基，氨基，咪唑基，胍基，吡唑基，噻吩基，三氮唑基，吡啶基，苯基，甲苯基，乙苯基，丙苯基，甲氧基苯基，乙氧基苯基，叔丁基苯基，萘基，蒽基，甲氧基，乙氧基，甲胺基，二甲胺基，乙胺基，二乙胺基，丙胺基，二丙胺基，环丙胺基；

L为2-5个碳原子的直链或支链烷基臂。

当W为氮原子时，则无取代基。

在本发明的一个实施方案中，在嘌呤核苷类似物J和D中，其五员环的Z和W，优选为碳和氮原子，Z和W可以相同或不同。

在本发明的一个实施方案中，在嘌呤核苷类似物B和E中，其五员环为饱和结构，Z和V优选为碳，氮原子；Z和V可以相同或不同。当Z为碳原子时，其上的取代基为R¹；当V为碳原子时，其上的取代基为R¹¹，其定义与R¹相同；当Z为氮原子时，其上的取代基为R¹，但不包括卤素和拟卤素；当V为氮原子时，其上的取代基为R¹¹，对于它的定义与R¹相同，但不包括卤素和拟卤素取代基。当Z和V为氧或硫原子时，则无取代基。

在本发明的一个实施方案中，在嘧啶核苷类似物F中，其5位和6位的取代基R⁴，R⁵优选为卤素(氟，氯，溴，碘)，咪唑基，或L-R⁸。在L-R⁸中，R⁸优选为羟基，氨基，咪唑基，胍基，吡唑基，吡啶基，苯基，甲苯基，乙苯基，丙苯基，甲氧基苯基，乙氧基苯基，叔丁基苯基，萘基，蒽基，甲氧基，乙氧基，甲胺基，二甲胺基，乙胺基，二乙胺基，丙胺基，二丙胺基，环丙胺基；L为1-5个碳原子的直链或支链烷基臂；

在本发明的一个实施方案中，在核苷类似物J，B，D，E，F中，糖环部分可以是脱氧核糖基，六员糖环基，LNA型，或其他修饰的糖环结构；糖环的构型可以是D-或L-型。

在本发明的一个实施方案中，在核苷类似物J，B，D，E，F，其五员糖环的2’-位取代基，可以是氢，氨基，氟原子，甲氧基，乙氧基，丙氧基，甲氧基乙烯氧基，乙氧基乙烯氧基，丙氧基乙烯氧基，甲胺基，二甲胺基，乙胺基，二乙胺基，丙胺基，二丙胺基，环丙胺基等。

在本发明的一个实施方案中，本发明利用以上核苷类似物J、B、D、E、F对10-23脱氧核酶进行修饰，获得新颖的脱氧核酶类似物。

在本发明的一个实施方案中，本发明利用以上核苷类似物J、B、D、E、F对5个dA位点X₅，X₉，X₁₁，X₁₂，X₁₅进行修饰，本发明可以采用以下一个或多个更具体的实施方案：

(1)在5个dA位点X₅，X₉，X₁₁，X₁₂，X₁₅的修饰中，它们都是可被取代的位置；

(2)在5个dA位点X₅，X₉，X₁₁，X₁₂，X₁₅的修饰中，在单一取代修饰中，以X₉为优选修饰的位点；

(3)在5个dA位点X₅，X₉，X₁₁，X₁₂，X₁₅的修饰中，可以同时对多个位点(2-5个)进行修饰；

(4)在5个dA位点X₅，X₉，X₁₁，X₁₂，X₁₅的修饰中，核苷类似物J、B、D、E、F都可插入这些位点，代替dA；

(5)在5个dA位点X₅，X₉，X₁₁，X₁₂，X₁₅的修饰中，优选选择核苷类似物J和B代替dA位点中的一个或多个。

在本发明的一个实施方案中，本发明利用以上核苷类似物J、B、D、E、F对10-23脱氧核酶的催化结构域中的4个dG位置X₁，X₂，X₆，X₁₄进行修饰，在该脱氧核酶的4个dG的位置，X₁，X₂，X₆，X₁₄，都是可被取代的位置。本发明可以采用以下一个或多个更具体的实施方案：

(1)在4个dG的位置，X₁，X₂，X₆，X₁₄的修饰中，在单一取代修饰时，以G2和G14为优选修饰的位点；

(2)在4个dG的位置，X₁，X₂，X₆，X₁₄的修饰中，可以同时对多个位点进行修饰；

(3)在4个dG的位置，X₁，X₂，X₆，X₁₄的修饰中，核苷类似物J、B、D、E、F都可插入这些位点，代替dG；

(4)在4个dG的位置，X₁，X₂，X₆，X₁₄的修饰中，优选选择化合物D和E插入这些位点，代替dG。

在本发明的一个实施方案中，本发明利用以上核苷类似物J、B、D、E、F对10-23脱氧核酶的催化结构域中的两个dT的位置X₄和X₈进行修饰，在该脱氧核酶的两个dT的位置X₄和X₈都是可用来修饰的位点。本发明可以采用以下一个或多个更具体的实施方案：

在本发明的一个实施方案中，本发明利用以上核苷类似物J、B、D、E、F对10-23脱氧核酶的催化结构域进行修饰时，5个dA的修饰位点(X₅，X₉，X₁₁，X₁₂，X₁₅)，4个dG的修饰位点(X₁，X₂，X₆，X₁₄)，和两个dT的修饰位点(X₄和X₈)，可各自独立地任选被一种或多种不同类型的核苷类似物J、B、D、E、F进行组合取代。

在本发明的一个实施方案中，以上核苷类似物J、B、D、E、F的单一或组合取代也可以与天然碱基的缺失(如缺失T8)一起修饰10-23脱氧核酶的催化结构域。

在本发明的一个实施方案中，以上核苷类似物J、B、D、E、F的单一或组合取代也可以与天然碱基的替换一起修饰10-23脱氧核酶的催化结构域。

在本发明的一个实施方案中，以上核苷类似物J、B、D、E、F的单一或组合取代也可以用于其他天然单体的取代。

在本发明的一个实施方案中，以上核苷类似物J，B，D，E，F的单一或组合取代可与提高脱氧核酶类似物的稳定性的修饰相结合。抗核酸酶修饰的方法有硫代磷酸酯键骨架；2’-氟代，2’-甲氧基，2’-甲氧基乙烯氧基(MOE)，2’-乙氧基，2’-乙氧基乙烯氧基修饰，LNA等；以及在3’-端引入翻转的核苷酸单体，获得酶稳定性更高的新型的10-23脱氧核酶类似物。

在本发明的一个实施方案中，其中所述的提高脱氧核酶稳定性的修饰既可用于脱氧核酶的催化结构域，又可用于它的两端识别结构域。

在本发明的一个实施方案中，其中式J、式B、式D、式E、式F的核苷类似物的引入可以与改善脱氧核酶的转运而进行的修饰组合。

在本发明的一个实施方案中，其中所述改善转运的办法包括脂质体和阳离子性脂质体，和其他转运材料的包裹；胆固醇，PEG等与脱氧核酶的共价连接等方法。

在本发明的一个实施方案中，对于10-23脱氧核酶类似物的两端识别序列，分别用N₁至N_i，和RN_i+17至N_n示意，N组成其两端的识别部分，与靶序列互补的单体，R为嘌呤碱基，与靶序列剪切位点的Y互补；两端的碱基数量相同或不同，从4个到20个不等。

本发明的10-23脱氧核酶类似物，可以针对任何一段RNA序列，来设计两端的互补序列。

本发明所针对的序列片段，包括用于结构和功能研究的基因，以及用于基因治疗的靶基因。

对于新颖的10-23脱氧核酶类似物的活性评价

本发明脱氧核酶类似物和原型脱氧核酶的裂解底物的活性，在一定条件下进行测试，包括缓冲液的组成和浓度，脱氧核酶类似物的浓度，pH值，和二价金属离子的种类和浓度。

缓冲液的组成与pH的范围有关。根据不同的pH值选择不同的缓冲液。如Na-MES(6.0，6.5)，Na-HEPES(pH 7.0)，Tris-HCl(pH 7.5，8.0，8.5)。已有的工作表明这些反离子对催化反应没有影响。

本发明中，这些脱氧核酶类似物的催化反应受pH的影响，pH条件从3.0到9.0，或者6.0-9.0，以7.0-7.5为合适范围，以接近生理条件的7.5为最佳。

本发明中，这些脱氧核酶类似物的催化反应需要金属离子的参与。尤其是二价金属离子的参与，包括Mg²⁺，Mn²⁺，Zn²⁺，Fe²⁺，Pb²⁺，Ca²⁺等都能促进反应。

二价金属离子中，以Mg²⁺为最佳选择。浓度范围为0.01mM-100mM。以接近细胞内Mg²⁺浓度的0.1-2mM为合适范围，以0.1-0.5mMMg²⁺为最佳的浓度范围。

一价离子对这些脱氧核酶类似物的催化反应也有加速作用。一价离子一般为K⁺，Na⁺，浓度为5-500mM，以50-200mM为最佳浓度。

这些脱氧核酶类似物的催化反应受酶和底物浓度的影响。所以催化反应效率在单一转化率和多重转化率条件下测定。在单一转化率条件下，酶和底物的浓度比为10∶1-1000∶1。在多重转化率条件下，酶和底物的浓度比为1∶10-1∶1000。酶的浓度范围为10μM-0.1nM，底物的浓度范围为100μM-0.1nM。

关于新颖的脱氧核酶类似物的催化机制研究

本发明中，获得了催化效率比原型10-23脱氧核酶更高的脱氧核酶，其中一个新的脱氧核酶类似物的k_obs为原型10-23脱氧核酶的11倍。因此本发明对其催化机制进行了研究。

本发明从影响催化反应的几个因素出发，研究各个因素对催化效率的影响。并且将脱氧核酶类似物和原型脱氧核酶在同样的条件下进行比较。

脱氧核酶类似物的催化反应动力学在单一转化率和多重转化率这两种条件下测定。在单一转化率条件下，底物与酶的浓度比从10∶1到1000∶1，在多重转化率条件下，二者的浓度比从1∶10到1∶1000。酶的浓度范围为0.1nM-100μM，底物的浓度范围为0.1nM-100μM。

pH对催化反应速率的影响：不同的pH条件采用不同的缓冲液组成。所采用的缓冲液从pH3-9.0。

金属离子种类对催化反应的影响，评价二价离子，包括Mg²⁺，Mn²⁺，Zn²⁺，Fe²⁺，Pb²⁺，Ca²⁺等对反应的影响。

比较以上各个因素对修饰的和原型脱氧核酶的影响，发明人认为，本发明修饰的脱氧核酶类似物的化学反应机制与原型是一样的。前者的催化速率增加可能来源于其具有更佳的催化反应构象。

附图说明

图1是10-23脱氧核酶与核酸底物的复合物示意图，其中，R为嘌呤单体，Y为嘧啶单体，N’为核酸底物的核苷酸单体，m为它的个数；N为脱氧核酶的两端的核苷酸单体，n为它的个数，与核酸底物的N’呈Watson-Crick碱基配对；箭头所指为核酸底物被裂解位置。

图2是修饰的10-23脱氧核酶类似物与底物结合的示意图。图中，N’为底物的核苷酸单体组成，N为10-23脱氧核酶识别域的核苷酸单体组成，N为任一与靶核酸N’可以进行W-C互补配对的核苷酸单元。R为嘌呤核苷酸单元，Y为嘧啶核苷酸单元，互补链部分的长度可随靶核酸的序列、碱基组成等因素的变化而变化，底物可以是进行基因操作或基因治疗的部分序列或全长序列，最少可以为4个；脱氧核酶两端的碱基数为n(4-50)。X₁，X₂，X₄，X₅，X₆，X₈，X₉，X₁₁，X₁₂，X₁₄，X₁₅为引入的修饰的结构单元。

图3-图9分别显示了对各个修饰的脱氧核酶类似物与未修饰的10-23脱氧核酶DZ01进行裂解反应比较的结果。

具体实施方式

下面通过具体的实施例和实验例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例和实验例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

实施例1：用于脱氧核酶修饰的核苷类似物的设计

设计的部分核苷类似物单体的结构参见以下化合物1～24(亦可称为核苷类似物1～24)：

1：R¹＝H 6：R¹＝H 11：R¹＝H

2：R¹＝(CH₂)₃OH 7：R¹＝(CH₂)₃OH 12：R¹＝(CH₂)₃OH

3：R¹＝(CH₂)₃NH₂ 8：R¹＝(CH₂)₃NH₂ 13：R¹＝(CH₂)₃NH₂

16：R¹＝H 21：R⁴＝CH₂OH

17：R¹＝(CH₂)₃OH 22：R⁴＝CH₂CH₂OH

18：R¹＝(CH₂)₃NH₂ 23：R⁴＝CH₂CH₂CH₂OH

19：R¹＝CH₂CH₂C₆H₅ 24：R⁴＝CH₂CH₂(4-)Im

20：R¹＝CH₂CH₂(4-)Im

以上各式中，R¹＝CH₂CH₂(4-)Im表示该R¹基团为2-(4-咪唑基)-乙基-，对于R⁴基团亦有类似含义。

参考以上各式，在设计核苷类似物时，对于嘌呤核苷类似物，以它们的五员环修饰为主，如化合物1和11所示，它们的N7和C8的位置发生了交换，并在C7位上进一步引入了以烷基臂(例如C₁-C₆烷基臂，例如C₁-C₄烷基臂)连接的氨基，羟基，咪唑基，以及苯乙基，得到脱氧腺苷类似物2-5和脱氧鸟苷类似物12-15。

在嘌呤核苷类似物的五员环修饰中，将N7以碳原子取代，得到化合物6和16。再进一步在它们的7位上引入以烷基臂(例如C₁-C₆烷基臂，例如C₁-C₄烷基臂)连接的功能基，得到类似物7-10和脱氧鸟苷类似物17-20。

在嘧啶核苷类似物中，以嘧啶核苷的5位修饰为主，如化合物21-24，在五位上分别引入了以烷基臂(例如C₁-C₆烷基臂，例如C₁-C₄烷基臂)连接的羟基，氨基，苯基，和咪唑基。

实施例2：核苷类似物的合成

已知的核苷类似物的化学合成，和为了将它们引入核酸序列所需的相应的亚磷酰胺单体，可以按本领域技术人员所拥有的技能或者文献公开的方法合成，新的核苷类似物和它们的相应的亚磷酰胺单体可以由本实验室设计合成。

本发明中，嘌呤核苷类似物2-5，7-10，12-15，和17-20可以利用单取代的乙炔基与7-碘-7-去氮-8-氮-脱氧腺苷的偶联反应和随后的催化氢化反应得到。

含羟基的嘧啶类化合物21-23按文献方法采用从全合成法获得。23和24可采用5-碘-脱氧尿苷与3-羟基丙炔或咪唑乙炔之间的偶联反应，和随后的催化氢化反应得到。

实施例3：核苷类似物的亚磷酰胺单体的合成

引入的功能基采用适于DNA固相合成的正交保护策略，在亚磷酰胺单体的合成中，需要对引入的羟基和氨基进行正交保护，所选择的保护基必须适合DNA亚磷酰胺法固相合成条件。

以下式I至式VI所示化合物显示了本发明部分脱氧腺苷类似物的亚磷酰胺单体结构：

以下式VII至式XII所示化合物显示了本发明部分脱氧鸟苷类似物的亚磷酰胺单体结构：

以下式XIII至式XVI所示化合物显示了本发明应用的部分嘧啶核苷类似物的亚磷酰胺单体结构：

本发明中，式I、V、VII、X、XIII、XIV、XV所示的单体的合成可参见文献。

本发明中，在嘌呤核苷类似物的亚磷酰胺单体中，式II和VIII的7位的羟基保护基可以是乙酰基，苯甲酰基，硅烷基如叔丁基二甲基硅烷基和叔丁基二苯基硅烷基等。以叔丁基二甲基硅烷基和叔丁基二苯基硅烷基为优选选择等。

在嘌呤核苷类似物的亚磷酰胺单体中，式III和IX的7位的氨基保护基可以是乙酰基，苯甲酰基，三氟乙酰基等，以三氟乙酰基为优选选择。

在嘌呤核苷类似物的亚磷酰胺单体中，式VI和XII的咪唑基可以不保护。

在嘌呤核苷类似物的亚磷酰胺单体中，式I-VI的碱基的6-氨基可采用苯甲酰基或易脱保护基如二(正丁基)氨基甲烯基保护；式VII-XII的碱基的2-氨基用异丁酰基保护。

所有单体的5’-羟基可以用4，4’-二甲氧基三苯甲基(DMT)保护。

对于嘧啶类化合物的亚磷酰胺单体XIII-XVI，它们的5位羟基可以为叔丁基二苯基硅烷基保护；XVI的5位咪唑基可以不需保护。5’位羟基可以为DMT保护。

实施例4：亚磷酰胺单体II的合成

7-(3-羟丙基)-7-去氮-8-氮-脱氧腺苷2和它的亚磷酰胺单体II的合成路线设计示意如下：

(i)3-叔丁基二苯基甲硅烷氧基丙炔

(3-tert-butyldiphenylsiloxypropyne)，Pd(PPh₃)₄，CuI，Et₃N，在DMF中，室温，8h；

(ii)H₂，Pd/C，5atm.，室温；

(iii)1M TBAF，在THF中，室温，10min；

(iv)(C₄H₉)₂NCH(OCH₃)₂，在MeOH中，2h；

(v)DMTCl，在吡啶中，室温；

(vi)(NCCH₂CH₂O)(IPr)₂NPCl，(iPr)₂EtN，在CH₂Cl₂中，室温，30min.

这个核苷类似物的羟丙基引入是借助羟丙炔与7-碘-7-去氮-8-氮-脱氧腺苷的偶联反应引入的，如以上流程所示。羟丙炔的羟基在引入之前被叔丁基二苯基硅烷基(TBDPS)所保护(2a)，是为了获得这个一级羟基与脱氧核糖部分的5’-羟基之间的正交保护。2a经过催化氢化反应，就得中间体2b，它的保护基被1M TBAF/THF脱保护就得到核苷类似物2。将2b的6-氨基用二(正丁基)氨基甲缩醛保护(中间体2c)，它的5’-羟基用DMT保护(中间体2d)后，再经亚磷酰化反应就得到适于DNA固相合成的单体II。

步骤1.1 1-(2-去氧-β-D-赤式-核糖)-3-(3-叔丁基二苯基硅氧丙炔基-1)-1H-吡唑[3，4-d]并嘧啶-4-胺(2a).

将7-碘-8-氮-7-去氮-2’-脱氧腺苷(0.38g，1.0mmol)溶于干燥的DMF(5-50ml)中，向此溶液中加入催化量的Pd[P(C₆H₅)₃]₄和CuI。鼓入氮气，再加入3-叔丁基二苯基硅氧基丙炔(0.57g，2.0mmol)和三乙胺(1-10ml，)，在0-50℃反应5-20小时。经柱层析纯化，得到无色的固体产物(0.45g，84％).TLC(CH₂Cl₂/CH₃OH 9∶1)R_f 0.58.UV(MeOH)：λ_max 206(44 100)，250(12 800)，287(13 700).¹HNMR(DMSO-d₆)：δ1.0(s，9H，tert-Bu)，2.29(m，1H，C2’-H_α)，2.80(m，1H，C2’-H_β)，3.56，3.41(2m，2H，C5’-H)，3.85(m，1H，C4’-H)，4.47(m，1H，C3’-H)，4.73(s，2H，5-C≡CCH₂)，4.81(t，J＝5.8，1H，C5’-OH)，5.32(d，J＝4.4，1H，C3’-OH)，6.58(t，J＝6.4，1H，C1’-H)，7.72-7.44(2m，10H，arom.H)，8.26(s，1H，C2-H).分析计算值C₂₉H₃₃N₅O₄Si.(M 543.69)：C，64.06；H，6.12；N，12.88.实测值C，63.56；H，6.06；N 12.76.

步骤1.2 1-(2-去氧-β-D-赤式-核糖)-3-(3-叔丁基二苯基硅氧丙烷基-1)-1H-吡唑[3，4-d]并嘧啶-4-胺(2b).

在不锈钢的反应器中，将化合物2a(2.9g，3.07mmol)溶于甲醇(20-200ml)和10％Pd/C(0.1-2g)，密闭，通入氢气(5-15kg压力)，并在室温下搅拌5-10小时。停止反应时，先鼓入氮气，再过滤，将滤液浓缩，析出产物为无色固体(2.7g，90.3％)，R_f(CH₂Cl₂/CH₃OH 9∶1)0.53.UV(MeOH)：λ_max 207(48400)，259(8300)，278(8200).

¹HNMR(DMSO-d₆)：δ0.98(s，9H，tBu)，1.94(m，2H，5-CH₂CH₂CH₂OH)，2.16(m，1H，C2’-H_α)，2.73(m，1H，C2’-H_β)，3.02(m，2H，5-CH₂CH₂CH₂OH)，3.36，3.51(2m，2H，C5’-H)，3.76(m，3H，C4’-H，5-CH₂CH₂CH₂OH)，4.41(m，1H，C3’-H)，4.81(t，J＝6.4，1H，C5’-OH)，5.22(d，J＝4.5，1H，C3’-OH)，6.49(t，J＝6.3，1H，C1’-H)，7.10-7.70(2m，12H，arom.H，NH₂)，8.16(s，1H，C2-H).分析计算值C₂₉H₃₇N₅O₄Si.1/2H₂O(M 556.69)，C，62.51；H，6.83；N，12.57.实测值C，62.72；H，6.77；N，12.28.

步骤1.3 1-(2-去氧-β-D-赤式-核糖)-3-(3-叔丁基二苯基硅氧丙烷基-1)-4[(二正丁基)氨基甲烯基]-氨基-1H-吡唑[3，4-d]并嘧啶(2c).

向化合物2b(1.50g，2.81mmol)的甲醇溶液中加入N，N-二正丁基氨基甲酰二甲缩醛(0.58g，2.82mmol)。该反应液在20-60℃搅拌4-20小时后，减压浓缩，经柱层析分离出产物。产物为无色油状液体(1.70g，90％)，R_f(CH₂Cl₂/CH₃OH 15∶1)0.57.UV(MeOH)：λ_max 214(21600)，319(21 500).¹HNMR(DMSO-d₆)：δ0.83，0.90(2t，6H，N＝CHN(CH₂CH₂CH₂CH₃)₂].，0.96(s，9H，tBu)，1.26(m，4H，N＝CHN(CH₂CH₂CH₂CH₃)₂]，1.56(m，4H，N＝CHN(CH₂CH₂CH₂CH₃)₂]，2.06(m，2H，5-CH₂CH₂CH₂OH)，2.19(m，1H，C2’-H_α)，2.77(m，1H，C2’-H_β)，3.07(m，2H，5-CH₂CH₂CH₂OH)，3.37，3.49[2m，6H，N＝CHN(CH₂CH₂CH₂CH₃)₂，C5’-H]，3.72(t，J＝6.4，2H，5-CH₂CH₂CH₂OH)，3.81(m，1H，C4’-H)，4.43(m，1H，C3’-H)，4.80(t，J＝5.9，1H，C5’-OH)，5.25(d，J＝4.5，1H，3’-OH)，6.53(t，J＝6.6，1H，C1’-H)，7.34-7.58(m，10H，arom.H)，8.42(s，1H，C2-H)，8.97[s，1H，N＝CHN(CH₂CH₂CH₂CH₃)₂].分析计算值C₃₈H₅₄N₆O₄Si.1/4H₂O(M691.46)：C，65.94；H，7.88；N，12.15.实测值C，65.65；H，8.19；N，11.94.

步骤1.4 1-[2-去氧-5-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-β-D-赤式-核糖]-3-(3-叔丁基二苯基硅氧丙烷基-1)-4[(二正丁基)氨基甲烯基]-氨基 -1H-吡唑[3，4-d]并嘧啶(2d).

将化合物2c(1.20g，1.78mmol)溶于吡啶(2-10ml)，在20-50℃搅拌，加入DMT-Cl(0.76g，2.23mmol)。反应完毕后，经柱层析分离出产物为无色固体(1.06g，61％).R_f(CH₂Cl₂/CH₃OH 20∶1)0.45.UV(MeOH)：λ_max205(77 300)，318(30 400).¹HNMR(DMSO-d₆)：δ0.80，0.91(t，6H，N＝CHN(CH₂CH₂CH₂CH3)₂)，0.95(m，9H，tBu)，1.20(m，4H，N＝CHN(CH₂CH₂CH₂CH₃)₂)，1.55(m，4H，N＝CHN(CH₂CH₂CH₂CH₃)₂)，1.83(m，2H，5-CH₂CH₂CH₂OH)，2.27(m，1H，C2’-H_α)，2.71(m，1H，C2’-H_β)，3.00(m，4H，C5’-H，5-CH₂CH₂CH₂OH)，3.47[m，4H，N＝CHN(CH₂CH₂CH₂CH₃)₂]，3.64(m，8H，2OCH₃，5-CH₂CH₂CH₂OH)，3.95(m，1H，C4’-H)，4.50(m，1H，C3’-H)，5.28(d，J＝5.0，1H，C3’-OH)，6.58-7.58(m，24H，arom.H，C1’-H)，8.44(s，1H，C2-H)，8.98(s，1H，N＝CHN(CH₂CH₂CH₂CH₃)₂).分析计算值C₅₉H₇₂N₆O₆Si(M 989.33)：C，71.63；H，7.34；N，8.49.实测值C，71.31；H，7.50；N，8.30.

步骤1.5 1-[2-去氧-5-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-β-D-赤式-核糖]-3-(3-叔丁基二苯基硅氧丙烷基-1)-4[(二正丁基)氨基甲烯基]-氨基 -1H-吡唑[3，4-d]并嘧啶3-[(2-氰乙基)N，N-二异丙胺基亚磷酰胺](II).

将化合物2d(0.85g，0.87mmol)溶于干燥的二氯甲烷(10-100ml)中，加入二异丙基乙基胺(1ml，5.75mmol)和二异并胺基亚磷酰氯(0.25g，1.0mmol)。该混合物在20-50℃搅拌1-5小时。将该混合物用二氯甲烷稀释，用5％NaHCO₃溶液和饱和盐水分别洗涤，无水硫酸钠干燥后，浓缩，柱层析分离出产物为无色固体(0.35g，35.4％).R_f(CH₂Cl₂/CH₃OH30∶1)0.61，0.71.¹H NMR(CDCl₃)：δ0.86，0.98(t，6H，N＝CHN(CH₂CH₂CH₂CH₃)₂]，1.01(m，9H，tBu)，1.14-1.40(m，10H，N(CH(CH₃)₂，N＝CHN(CH₂CH₂CH₂CH₃)₂]，1.60(m，4H，N＝CHN(CH₂CH₂CH₂CH₃)₂]，1.94-2.17(m，3H，5-CH₂CH₂CH₂OH，C2’-H_α)，2.36-2.63(m，3H，5-CH₂CH₂CH₂OH，C2’-H_β)，2.92-3.91(m，18H，C5’-H，5-CH₂CH₂CH₂OH，N＝CHN(CH₂CH₂CH₂CH₃)₂，2OCH₃，OCH₂CH₂CN]，4.23(m，1H，C4’-H)，4.80(m，1H，C3’-H)，6.66-7.64(m，24H，arom.H，C1’-H)，8.48(s，1H，C2-H)，8.86(s，1H，N＝CHN(CH₂CH₂CH₂CH₃)₂].³¹P NMR(CDCl₃)：148.75，148.49.

实施例5：核苷类似物3和它的亚磷酰胺单体III的合成

以下反应流程显示了核苷类似物3和它的亚磷酰胺单体的合成。

如以上流程所示，这个核苷类似物的3-氨基丙基的引入是借助3-氨基丙炔与7-碘-7-去氮-8-氮-脱氧腺苷的偶联反应和随后的氢化反应引入的。3-氨基丙炔的氨基在引入前被三氟乙酰基保护。这个化合物的6位氨基被二正丁胺甲酰基保护后，在5’-位引入DMT，继之以在3’-OH发生亚磷酰化，得到单体III用于脱氧核酶类似物的合成。

1)1-(2-去氧-β-D-呋喃核糖)-3-(3-三氟乙酰胺基丙基)-4H-吡唑并 [3，4-d]嘧啶-4-胺(3b).

将化合物3a((2g，5mmol)和Pd/C(10％，1.0g)在甲醇(20-200ml)中混合，置于不锈钢反应釜中，通入氢气(1-5kg)，密封，在30℃搅拌5小时。将反应混合物过滤，滤液浓缩，得到无色固体(1.9g，95％).R_f(CH₂Cl₂/CH₃OH 10∶1)0.45.¹H-NMR(DMSO-d₆)：δ1.87(m，2H，5-CH₂CH₂CH₂)，2.20(m，1H，C2’-H_α)，2.79(m，1H，C2’-H_β)，2.97(m，2H，5-CH₂CH₂CH₂)，3.30(m，2H，5-CH₂CH₂CH₂)，3.37，3.52(2m，C5’-H)，3.79(m，1H，C4’-H)，4.42(m，1H，C3’-H)，4.78(m，1H，C5’-OH)，5.22(d，J＝4.76，1H，C3’-OH)，6.50(t，J＝6.58，1H，C1’-H)，7.35(br，2H，NH₂)，8.16(s，1H，C2-H)，9.41(m，1H，NHCO).¹³C NMR(DMSO-d₆)：δ25.2，27.3，37.9，62.5，71.2，83.7，87.5，98.8，111.6，114.5，117.4，120.2，145.0，154.8，155.9，158.1.

2)1-(2-去氧-β-D-呋喃核糖)-3-(3-三氟乙酰胺基丙基)-4-{[(N，N-二正丁胺基)甲烯基]氨基}-4H-吡唑并[3，4-d]嘧啶(3c).

将化合物3b(1.9g，4.7mmol)溶于甲醇(20-100ml)中，加入N，N-二正丁胺基甲酰二甲缩醛(1.75ml，7mmol)。将此溶液在20-60℃搅拌1-5小时，然后，浓缩此溶液，用柱层析纯化得到无色固体产物(2.1g，82％)。R_f(CH₂Cl₂/CH₃OH 20∶1)0.35.¹HNMR(DMSO-d₆)：δ0.92(2t，J＝7.4，6H，N＝CHN(CH₂CH₂CH₂CH₃)₂]，1.32(m，4H，N＝CHN(CH₂CH₂CH₂CH₃)₂]，1.61(m，4H，N＝CHN(CH₂CH₂CH₂CH₃)₂]，2.00(m，2H，5-CH₂CH₂CH₂)，2.24(m，1H，C2’-H_α)，2.82(m，1H，C2’-H_β)，3.03(m，2H，5-CH₂CH₂CH₂)，3.23-3.60[m，8H，N＝CHN(CH₂CH₂CH₂CH₃)₂，C5’-H，5-CH₂CH₂CH₂]，3.82(m，1H，C4’-H)，4.45(m，1H，C3’-H)，4.77(t，J＝5.7，1H，C5’-OH)，5.24(d，J＝4.5，1H，3’-OH)，6.55(t，J＝6.4，1H，C1’-H)，8.42(s，1H，C2-H)，8.98[s，1H，N＝CHN(CH₂CH₂CH₂CH₃)₂]，9.41(m，1H，NHCO).¹³C NMR(DMSO-d₆：δ13.5，13.6，19.1，19.8，25.7，27.3，28.7，30.4，37.9，45.4，51.4，62.5，71.2，83.8，87.5，106.0，111.6，114.5，117.4，120.2，146.5，155.4，157.2，162.5.下式的分析计算值：C₂₄H₃₆F₃N₇O₄(M 543.58)：C，53.03；H，6.68；N，18.04.实测值：C，52.65；H，6.49；N，17.87.

3)1-[(2-去氧-β-D-呋喃核糖)-5-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)]-3-(3-三氟乙酰胺基丙基)-4-{[(N，N-二正丁胺基)甲烯基]氨基}-4H-吡唑并[3，4-d] 嘧啶(3d)

将化合物3c(1g，1.85mmol)溶于干燥的吡啶(1-5ml)，加入DMTCl(0.75g，2.2mmol)。将此混合物在室温下搅拌1-4小时。然后，将反应液浓缩，用柱层析分离出产物，为无色固体(0.95g，62.5％).R_f(CH₂Cl₂/CH₃OH 20∶1)0.7.¹HNMR(DMSO-d₆)：δ0.93[t，6H，N＝CHN(CH₂CH₂CH₂CH₃)₂]，1.33(m，4H，N＝CHN(CH₂CH₂CH₂CH₃)₂)，1.62(m，4H，N＝CHN(CH₂CH₂CH₂CH₃)₂)，1.77(m，2H，5-CH₂CH₂CH₂)，2.30(m，1H，C2’-H_α)，2.78(m，1H，C2’-H_β)，2.89(m，2H，5-CH₂CH₂CH₂)，3.03-3.13[m，4H，N＝CHN(CH₂CH₂CH₂CH₃)₂]，3.50-3.60(m，C5’-H，5-CH₂CH₂CH₂]，3.67，3.69(2s，2OCH₃)，3.95(m，1H，C4’-H)，4.52(m，1H，C3’-H)，5.27(m，1H，3’-OH)，6.60(m，1H，C1’-H)，6.73-7.30(m，arom.H)，8.44(s，1H，C2-H)，9.00[s，1H，N＝CHN(CH₂CH₂CH₂CH₃)₂]，9.37(m，1H，NHCO).¹³C NMR(DMSO-d₆)：δ13.5，13.6，19.1，19.8，25.7，27.2，28.6，30.4，38.2，45.4，51.4，54.8，54.8，64.9，71.3，83.4，85.1，85.4，106.0，112.8，112.9，114.5，117.4，126.3，127.5，127.6，129.5，129.6，135.6，145.0，146.5，155.4，157.1，157.8，157.9，162.4.下式的分析计算值：C₄₅H₅₄F₃N₇O₆ 0.25H₂O(M 850.45)：C，63.55；H，6.46；N，11.53.实测值：C，63.32；H，6.20；N，11.40.

4)1-[(2-去氧-β-D-呋喃核糖)-5-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)]-3-(3-三氟乙酰胺基丙基)-4-{[(N，N-二正丁胺基)甲烯基]氨基}-4H-吡唑并[3，4-d] 嘧啶3’-[(2-氰乙基)-N，N-二异丙基亚磷酰胺](III)

将化合物3d(0.45g，0.55mmol)溶于干燥的二氯甲烷(5-20ml)，再加入二异丙胺四氮唑盐(0.17g，1.1mmol)和2-氰乙基二异丙基亚磷酰胺(0.55g，1.1mmol)。此混合物在室温下搅拌约2小时。然后用5％NaHCO₃水溶液和盐水洗涤。有机层用无水Na₂SO₄干燥后，浓缩，用柱层析方法纯化，得到无色固体产物(0.45g，80.5％).R_f(CH₂Cl₂/CH₃OH40∶1)0.48，0.50。¹HNMR(DMSO-d₆)：δ0.90-1.81[m，28H，N＝CHN(CH₂CH₂CH₂CH₃)₂，5-CH₂CH₂CH₂)，NCH(CH₃)₂]，2.47-3.18[m，10H，C2’-H，5-CH₂CH₂CH₂)，N＝CHN(CH₂CH₂CH₂CH₃)₂，CH₂CH₂CN]，3.35-3.77[m，14H，C5’-H，5-CH₂CH₂CH₂，2OCH₃，2NCH(CH₃)₂，CH₂CH₂CN]，4.10(m，1H，C4’-H)，4.78(m，1H，C3’-H)，6.61-6.75，7.14，7.28(3m，14H，C1’-H，arom.H)，8.47(2s，1H，C2-H)，9.01[s，1H，N＝CHN(CH₂CH₂CH₂CH₃)₂]，9.40(m，1H，NHCO).³¹P NMR(CDCl₃)：147.16，147.83.

实施例6：核苷类似物4和它的亚磷酰胺单体IV的合成

以下反应流程显示了核苷类似物4和它的亚磷酰胺单体的合成。

(i)H₂，Pd/C，室温，3hr；

(ii)(C₄H₉)₂NCH(OCH₃)₂，在MeOH中，2h；

(iii)DMTCl，在吡啶中，室温，1h；

(iv)(NCCH₂CH₂O)(IPr)₂NPCl，(iPr)₂EtN，在CH₂Cl₂中，室温，30min.

如以上流程所示，这个核苷类似物的苯乙基的引入是借助苯乙炔与7-碘-7-去氮-8-氮-脱氧腺苷的偶联反应和随后的氢化反应引入的。其6位氨基被二正丁胺甲酰基保护后，在5’-位引入DMT，继之以在3’-OH发生亚磷酰化，得到单体IV用于脱氧核酶类似物的合成。

1)1-(2-去氧-β-D-呋喃核糖)-3-苯乙炔基-4H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4- 胺(4a)

将7-碘-7-去氮-8-氮-脱氧腺苷(0.38g，1mmol)置干燥的反应瓶中用干燥DMF(5-50ml)溶解，氮气保护搅拌，加入苯乙炔(0.8-4ml)，搅拌，加入三乙胺(0.2-5ml)，溶液变为黑紫色，于室温搅拌6-30小时。TLC检测反应完全后，减压蒸去溶剂，用柱层析分离，得到产物0.29g，产率81.2％，Rf(CH₂Cl₂/CH₃OH 9∶1)0.48。¹HNMR(d₆-DMSO)：δ8.27(s，1H，H-2)，7.75，7.50(2m，5H，arom.H)，6.58(t，1H，1’H，J＝6Hz)，5.30(d，1H，3’-OH，J＝4.8Hz)，4.79(t，1H，5’-OH，J＝6Hz)，4.44(m，1H，3’H)，3.82(m，1H，4’-H)，2.39(2m，2H，5’-H)，2.81(m，1H，2’-H_β)，2.28(m，1H，2’-H_α)。

元素分析：C₁₈H₁₇N₅O₃(Mol.Wt.351.36)

理论值：C 61.53，H 4.88，N 19.93；

实测值：C 61.43，H 4.88，N 19.97。

2)1(2-去氧-β-D-呋喃核糖)-3-苯乙基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺 (4)

将化合物4a(1.8g，5.06mmol)溶于无水甲醇(50-300ml)中，加入10％Pd/C(1.1-3.2g)，于高压釜中反应4-10小时后，TLC检测反应完全。滤出催化剂，蒸干溶剂，重结晶得固体产物1.7g，产率93.4％，Rf(CH₂Cl₂/CH₃OH 9∶1)0.38。¹HNMR(d₆-DMSO)：δ8.2(s，1H，2-H)，7.27(m，5H，arom.H)，6.50(t，1H，1’-H，J＝6.5Hz)，5.22(d，1H，3’-OH，J＝4.2Hz)，4.79(t，1H，5’-OH，J＝5.7Hz)，4.43(d，1H，3’-H，J＝4.2Hz)，3.80(m，1H，4’-H)，3.31(2m，4H，5’-H，CH₂)，3.01(m，2H，CH₂)，2.74(m，1H，2’-H_β)，2.19(m，1H，2’-H_α)。

元素分析：C₄₈H₅₂N₆O₅.(Mol.Wt.355.39)

理论值：C 60.83，H 5.96，N 19.71；

实测值：C 60.56，H 5.99，N 19.22。

3)1-(2-去氧-β-D-呋喃核糖)-3-苯乙基-4-{[(N，N-二正丁胺基)甲烯基]氨基}-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶(4b)

同中间体2c的合成。化合物13(1.0g，2.85mmol)和合成的N，N-二正丁基氨基甲酰二甲缩醛(0.58g，2.85mmol)于甲醇(4-40ml)中，于20-60℃搅拌反应后，柱层析得无色油状物1.13g，产率94.0％，Rf(CH₂Cl₂/CH₃OH 15∶1)0.57。Rf(CH₂Cl₂/CH₃OH 9∶1)0.64，Rf(CH₂Cl₂/CH₃OH 20∶1)0.25。¹HNMR(d₆-DMSO)：δ8.98(s，1H，N＝CH)，8.42(s，1H，2-H)，7.24(m，5H，arom.H)，6.54(t，1H，1’-H，J＝6.4Hz)，5.25(d，1H，3’-OH，J＝4.48Hz)，4.81(t，1H，5’-OH，J＝5.45Hz)，4.43(m，1H，3’-H)，3.80(m，1H，4’-H)，3.48，3.33[2m，8H，5’-H，N(CH₂)₂，CH₂]；3.09(m，2H，CH₂)，2.78(m，1H，2’-H_β)，2.22(m，1H，2’-H_α)，1.56(m，4H，CH₂，CH₂)，1.29，1.16(2m，4H，CH₂，CH₂)，0.91，0.67(2t，6H，2CH₃)。

元素分析：C₂₇H₃₈N₆O₃.0.5H₂O(Mol.Wt.499.13)

理论值：C 64.91，H 7.71，N 16.83；

实测值：C 65.08，H 7.97，N 16.33。

4)1-[(2-去氧-β-D-呋喃核糖)-5-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)]-3-苯乙基-4-{[(N，N-二正丁胺基)甲烯基]氨基}-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶(4c)

同中间体2d的合成。化合物4b(0.87g，2.07mmol)和DMT-Cl(0.78g，2.28mmol)于干燥吡啶(1-10ml)中反应。柱层析分离得无色泡状固体1.1g，产率66.7％，Rf(CH₂Cl₂/CH₃OH 15∶1)0.57，Rf(CH₂Cl₂/CH₃OH 20∶1)0.45。¹HNMR(d₆-DMSO)：δ9.01(s，1H，N＝CH)，8.47(s，1H，2-H)，7.18～6.63(m，19H，arom.H，1’-H)，5.31(d，1H，3’-OH，J＝4.76Hz)，4.81(t，1H，5’-OH，J＝5.45Hz)，4.54(m，1H，3’-H)，3.98(m，1H，4’-H)，3.63(2s，6H，2OCH₃)，3.48[m，4H，N(CH₂)₂]，3.13(m，4H，5’-H，CH₂)，2.75(m，3H，2’-H_β，CH₂)，2.33(m，1H，2’-H_α)，1.56(m，4H，CH₂，CH₂)，1.30，1.10(2m，4H，CH₂，CH₂)，0.91，0.74(2t，6H，2CH₃)。

元素分析：C₄₈H₅₆N₆O₅.(Mol.Wt.797.00)

理论值：C 72.34，H 7.08，N 10.54；

实测值：C 72.04，H 7.08，N 10.27。

5)1-[(2-去氧-β-D-呋喃核糖)-5-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)]-3-苯乙炔基-4-{[N，N-二正丁胺基)甲烯基]氨基}-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶3’-[(2-氰乙基)-N，N-二异丙基亚磷酰胺](IV)

同亚磷酰胺单体II的合成。化合物4c(0.25g，0.31mmol)和DIEA(1-5ml)及磷酰化试剂(0.1-0.5g)于二氯甲烷(20-50ml)中反应。柱层析得无色泡状固体120mg，产率38.3％，Rf(CH₂Cl₂/CH₃OH 30∶1)0.61，0.67。¹HNMR(CDCl₃)：δ8.88(s，1H，N＝CH)，8.49(s，1H，2-H)，7.28～6.66(m，19H，arom.H，1’H)，4.83(m，1H，3’H)，4.23(m，1H，4’H)，3.82～3.24(m，16H，2OCH₃，N(CH₂)₂，5’H，OCH₂CH₂C)，3.1～2.4(m，6H，2’H_β，CH₂，CH₂，2’H_α，)，1.63～1.07(m，d，22H，2CH₂-CH₂，2CH(CH₃)₂)，0.95，0.80(2t，6H，2CH₃)。³¹P NMR(CDCl₃)：148.75，148.57。

实施例7：利用核苷类似物获得10-23脱氧核酶类似物

以血管内皮生长因子mRNA的一段序列(5’-AGG TGC AGG AUGGA GAG CA-3’，19个碱基)作为底物，合成它的嵌合型序列，5’-d(aggtgc agg)AU-d(gga gag ca)-3’，作为筛选高活性脱氧核酶的靶，其中的5’-AU-3’为RNA单体，为裂解位点。

针对这个嵌合靶序列，合成了相应的10-23脱氧核酶类似物，如表2-4所示，其两端的识别部分(小写字母)为与之互补的片段。

用核苷类似物分别取代在10-23脱氧核酶的催化结构域中相应的天然核苷。脱氧腺苷类似物1-3(其结构分别参见实施例1，下同)分别取代其中的A5，A9，A11，A12，或A15；以4取代A9。脱氧鸟苷类似物11分别取代其中的G1，G2，G6，或G14；脱氧尿苷类似物21-23，分别取代T4或T8。

嘌呤核苷类似物1，分别取代10-23脱氧核酶DZ01的A5，A9，A11，A15，A12，得到本发明的新颖的脱氧核酶类似物LKDZ22，LKDZ23，LKDZ24，LKDZ25，和LKDZ26。

嘌呤核苷类似物2，分别取代10-23脱氧核酶DZ01的A5，A15，A9，A11，A12，得到本发明新颖的脱氧核酶类似物LKDZ12，LKDZ13，LKDZ14，LKDZ15，和LKDZ16。

嘌呤核苷类似物3，分别取代10-23脱氧核酶DZ01的A15，A12，A11，A5，A9，得到本发明的新颖的脱氧核酶类似物LKDZ17，LKDZ18，LKDZ19，LKDZ20，和LKDZ21。

嘌呤核苷类似物4，取代10-23脱氧核酶DZ01的A9，得到本发明的新颖的脱氧核酶类似物LKDZ27。

嘌呤核苷类似物6，分别取代10-23脱氧核酶DZ01的A15，A12，A11，A5，A9，得到本发明的新颖的脱氧核酶类似物LKWQ01，LKWQ02，LKWQ03，LKWQ04，和LKWQ05。

嘌呤核苷类似物11，分别取代10-23脱氧核酶DZ01的G1，G2，G6，G14，得到本发明的新颖的脱氧核酶类似物LKWQ06，LKWQ07，LKWQ08，LKWQ09。

嘧啶核苷类似物21，分别取代10-23脱氧核酶DZ01的T4或T8，得到本发明的新颖的脱氧核酶类似物LKDZ10和LKDZ11。

嘧啶核苷类似物22，分别取代10-23脱氧核酶DZ01的T4或T8，得到修本发明的新颖的的脱氧核酶类似物LKDZ02和LKDZ03。

嘧啶核苷类似物23，分别取代10-23脱氧核酶DZ01的T4或T8，得到本发明的新颖的脱氧核酶类似物LKDZ04和LKDZ05。

在本发明中，LKDZ和LKWQ及其后的阿拉伯数字是用于表示本发明的10-23脱氧核酶类似物的代表符号，其对应的序列与本发明上下文相对应，例如以下表2所列的序列结构。

表2含核苷类似物1，2，3，4和6的10-23脱氧核酶类似物

编号	10-23脱氧核酶类似物的序列组成	修饰碱基所在位置
			DZ01	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA CAA CGA cct gca cct)-3’

			LKDZ22	5’-d(tgc tct cca GGC T1G CTA CAA CGA cct gca cct)-3’	A5＝1
LKDZ23	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CT1 CAA CGA cct gca cct)-3’	A9＝1
			LKDZ24	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA C1A CGA cct gca cct)-3’	A11＝1
LKDZ25	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA CAA CG1 cct gca cct)-3’	A15＝1
			LKDZ26	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA CA1 CGA cct gca cct)-3’	A12＝1

			LKDZ12	5’-d(tgc tct cca GGC T2G CTA CAA CGA cct gca cct)-3’	A5＝2
LKDZ13	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA CAA CG2 cct gca cct)-3’	A15＝2
			LKDZ14	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CT2 CAA CGA cct gca cct)-3’	A9＝2
LKDZ15	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA C2A CGA cct gca cct)-3’	A11＝2
			LKDZ16	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA CA2 CGA cct gca cct)-3’	A12＝2

			LKDZ17	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA CAA CG3 cct gca cct)-3’	A15＝3
LKDZ18	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA CA3 CGA cct gca cct)-3’	A12＝3
			LKDZ19	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA C3A CGA cct gca cct)-3’	A11＝3
LKDZ20	5’-d(tgc tct cca GGC T3G CTA CAA CGA cct gca cct)-3’	A5＝3
			LKDZ21	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CT3 CAA CGA cct gca cct)-3’	A9＝3

			LKDZ27	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CT4 CAA CGA cct gca cct)-3’	A9＝4

			LKWQ01	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA CAA CG6 cct gca cct)-3’	A15＝6
LKWQ02	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA CA6 CGA cct gca cct)-3’	A12＝6
			LKWQ03	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA C6A CGA cct gca cct)-3’	A11＝6
LKWQ04	5’-d(tgc tct cca GGC T6G CTA CAA CGA cct gca cct)-3’	A5＝6
			LKWQ05	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CT6 CAA CGA cct gca cct)-3’	A9＝6

表3含核苷类似物11的10-23脱氧核酶类似物

编号	10-23脱氧核酶类似物的序列组成	修饰单体所在位置
			DZ01	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA CAA CGA cct gca cct)-3’

			LKWQ06	5’-d(tgc tct cca 11GC TAG CTA CAA CGA cctgca cct)-3’	G1＝11
LKWQ07	5’-d(tgc tct cca G11C TAG CTA CAA CGA cctgca cct)-3’	G2＝11
			LKWQ08	5’-d(tgc tct cca GGC TA11 CTA CAA CGA cct gca cct)-3’	G6＝11
LKWQ09	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA CAA C11A cctgca cct)-3’	G14＝11

表4含核苷类似物21-23的10-23脱氧核酶类似物

编号	10-23脱氧核酶类似物的序列组成	修饰单体所在位置
			LKDZ10	5’-d(tgc tct cca GGC 21AG CTA CAA CGA cct gca cct)-3’	T4＝21
LKDZ11	5’-d(tgc tct cca GGC TAG C21A CAA CGA cctgca cct)-3’	T8＝21

LKDZ02	5’-d(tgc tct cca GGC 22AG CTA CAA CGA cctgca cct)-3’	T4＝22
			LKDZ03	5’-d(tgc tct cca GGC TAG C22A CAA CGA cct gca cct)-3’	T8＝22

			LKDZ04	5’-d(tgc tct cca GGC 23AG CTA CAA CGA cct gca cct)-3’	T4＝23
LKDZ05	5’-d(tgc tct cca GGC TAG C23A CAA CGA cct gca cct)-3’	T8＝23

实施例8：10-23脱氧核酶类似物的合成与纯化方法

以血管内皮生长因子的一段序列5’-AGG TGC AGG AU GGA GAGCA-3’为靶序列，但以相应的嵌合序列为实际操作的底物，即；5’-d(AGGTGC AGG)-rAU-d(GGA GAG CA)-3’，剪切位点为RNA残基，识别部分为DNA结构，购自从大连宝生物公司，其它所有脱氧核酶序列均自行合成，在392DNA合成仪上用亚磷酰胺法合成。天然脱氧核苷的亚磷酰胺单体购自Proligo公司，与修饰单体一起合成了如表2-4的脱氧核酶类似物。所有序列经变性凝胶电泳分离纯化，脱盐，和飞行时间质谱测定分子量(表5)。

在脱氧核酶类似物序列的脱保护方法中，有含羟基的修饰单体时，利用浓氨水在55℃孵温16-20小时；或者用1M TBAF/THF在室温下，避光，孵温24小时。

羟基的脱保护方法中，两种脱保护方法都适合与普通保护单体一起脱保护；后者还适合与易脱保护单体的脱保护相结合。

在脱氧核酶类似物序列的脱保护方法中，有含氨基的修饰单体时，利用浓氨水在55℃孵温16-20小时，或者室温下孵温4小时。

氨基的这两种脱保护方法，既适合与普通单体一起脱保护，又适合与易脱保护单体一起脱保护。

表5.用MALDI-TOF测定的10-23脱氧核酶类似物的分子量

编号	计算值	测定值	编号	计算值	测定值
						DZ01	9994.4	9990.5	LKDZ17	10051.5	10053.4
LKDZ02	10024.5	10018.9	LKDZ18	10051.5	10053.2
						LKDZ03	10024.5	10017.7	LKDZ19	10051.5	10052.2
LKDZ04	10038.5	10038.5	LKDZ20	10051.5	10051.8
						LKDZ05	10038.5	10034.9	LKDZ21	10051.5	10051.1
LKDZ10	10010.4	10006.5	LKDZ22	9994.4	9995.5
						LKDZ11	10010.4	10004.4	LKDZ23	9994.4	9995.9
LKDZ12	10052.5	10053.5	LKDZ24	9994.4	9990.1
						LKDZ13	10052.5	10053.1	LKDZ25	9994.4	9995.5
LKDZ14	10052.5	10053.4	LKDZ26	9994.4	9991.2
						LKDZ15	10052.5	10053.7	LKDZ27	10098.6	10099.1
LKDZ16	10052.5	10050.1

LKWQ-01	9992.5	9985.4	LKWQ-06	9994.4	9996.5
						LKWQ-02	9992.5	9984.6	LKWQ-07	9994.4	9995.7
LKWQ-03	9992.5	9986.2	LKWQ-08	9994.4	9994.5
						LKWQ-04	9992.5	9986.5	LKWQ-09	9994.4	9994.8
LKWQ-05	9992.5	9986.2

实施例9：底物的放射性标记方法

底物序列为5’-d(agg tgc agg)-rAU-d(gga gag ca)-3’，以³²P在其5’-端标记。

实施例10：在单一转化率条件下评价各个脱氧核酶类似物与10-23 脱氧核酶的催化能力比较，筛选活性更高的10-23脱氧核酶类似物。

³²P标记的靶5’-d(agg tgc agg)-rAU-d(gga gag ca)-3’，0.1nmol，酶为10nmol，靶与酶的比例为1∶100，在50mM Tris HCl，50mM Mg²⁺，pH8.0的反应体系中进行。终止液含8M Urea和100mM EDTA(分析纯)。分别在0，15min，30min，45min，1h，2h，3h，6h，12h，24h各取5ul，加入等体积的终止液。反应结果用20％聚丙烯酰胺凝胶分析，用磷屏自显影方法显示反应结果。

嘌呤核苷类似物1(其结构参见实施例1，下同)，分别取代10-23脱氧核酶DZ01的A5，A9，A11，A15，A12，得到脱氧核酶类似物LKDZ22，LKDZ23，LKDZ24，LKDZ25，和LKDZ26。催化速率的大小为：LKDZ25＜＜LKDZ22，LKDZ24＜DZ01＜LKDZ26＜＜LKDZ23。

嘌呤核苷类似物2，分别取代10-23脱氧核酶DZ01的A5，A15，A9，A11，A12，得到脱氧核酶类似物LKDZ12，LKDZ13，LKDZ14，LKDZ15，和LKDZ16。催化速率的大小为：LKDZ12＜LKDZ13＜LKDZ15＜LKDZ16＜DZ01＜＜LKDZ14。

嘌呤核苷类似物3，分别取代10-23脱氧核酶DZ01的A15，A12，A11，A5，A9，得到脱氧核酶类似物LKDZ17，LKDZ18，LKDZ19，LKDZ20，和LKDZ21。催化速率的大小为：LKDZ20＜LKDZ17＜LKDZ19＜LKDZ18＜DZ01＜＜LKDZ21。

嘌呤核苷类似物4，取代10-23脱氧核酶DZ01的A9，得到脱氧核酶类似物LKDZ27，它的活性高于DZ01。

在第9位dA被脱氧腺苷类似物1-4取代，都得到催化活性更高的10-23脱氧核酶类似物。

本发明中，通过对10-23脱氧核酶的修饰，找到了一个能提高其催化高速率的修饰位点。

嘌呤核苷类似物11，分别取代10-23脱氧核酶DZ01的G1，G2，G6，和G14，得到脱氧核酶类似物LKWQ06，LKWQ07，LKWQ08，LKWQ09，催化速率大小为LKWQ08＜＜LKWQ06＜LKWQ07～DZ01＜LKWQ09。

本发明中，通过对10-23脱氧核酶的修饰，找到了第二个能提高其催化高效率的修饰位点。

嘧啶核苷类似物21，分别取代10-23脱氧核酶DZ01的T4或T8，得到了LKDZ10和LKDZ11，LKDZ10的催化速率较DZ01慢，LKDZ11的催化速率与DZ01相当。说明T4是较保守的碱基，而T8不是一个保守的碱基。

嘧啶核苷类似物22，分别取代10-23脱氧核酶DZ01的T4或T8，得到了LKDZ02和LKDZ03，LKDZ02的催化速率较DZ01慢，LKDZ03的催化速率与DZ01相当。说明T4是较保守的碱基，而T8不是一个保守的碱基。

嘧啶核苷类似物23，分别取代10-23脱氧核酶DZ01的T4或T8，得到了LKDZ04和LKDZ05，LKDZ04的催化速率较DZ01慢，LKDZ05的催化速率与DZ01相当。说明T4是较保守的碱基，而T8不是一个保守的碱基。

10-23脱氧核酶的两个dT残基，分别对催化活性有不同的影响。

嘧啶核苷类似物21-23取代10-23脱氧核酶的T4时，21的引入对脱氧核酶的影响最小，与原型脱氧核酶DZ01相当。而22和23都使脱氧核酶的催化速率有所降低。

嘧啶核苷类似物21-23取代10-23脱氧核酶的T8时，对脱氧核酶的影响很小，其催化能力与原型脱氧核酶DZ01相当。

实施例11：对高效脱氧核酶LKDZ21的机制研究

在本发明中，通过脱氧腺苷类似物的引入，获得了高效的脱氧核酶LKDZ14，LKDZ21，LKDZ23，LKDZ27，LKWQ09等。

以LKDZ21为例，依据催化条件和效率之间的关系，对10-23脱氧核酶类似物的催化机制进行了评价。

以LKDZ21在接近生理条件下进行了活性的评价。

评价了LKDZ21在单一转化率条件下的催化速率。酶的浓度越高，剪切速率越快。其催化速率大大高于原型DZ01。

在多重转化率条件下评价了LKDZ21的催化速率。它具有比DZ01更高的催化速率。

以接近生理浓度的Mg²⁺为最重要的评价条件，因此分别在含2mM，0.2mM，和0.1mM Mg²⁺的50mM Tris-HCl(pH7.5)的条件下，评价了LKDZ21的催化活性。其催化活性高于DZ01。

在2mM Mg²⁺，50mM Tris-HCl的缓冲液条件下，考察了pH对脱氧核酶的剪切速率的影响。

在pH值分别为6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5的条件下，LKDZ21和DZ01的剪切速率随pH的增加而提高，这与2’-OH的亲核能力加强呈正相关性。

其它二价金属离子的影响，从Mn²⁺，Ca²⁺，Zn²⁺，对脱氧核酶LKDZ21和DZ01的催化速率的影响比较，表明它们对这两种脱氧核酶的催化速率的影响非常相似。Mn²⁺对于反应的加速作用远远大于其他三种离子。其他三种离子对于催化反应的加速作用为Mg²⁺～Ca²⁺＞Zn²⁺。

本发明中，在单一转化条件下(50mM Tris-HCl，pH7.5，50mMMg²⁺)，测定其催化速率常数，有些脱氧核酶类似物比原型10-23脱氧核酶快，有些脱氧核酶类似物则较慢(表6)。每个脱氧核酶类似物的催化反应的速率常数按照以下公式计算。反应的最终裂解百分数定为90％。所采用的数据为三次独立实验的平均结果，这三次结果之间的误差低于20％。

\ln (1 - \frac{P_{t} %}{P_{\infty} %}) = - kt

本发明中，改变底物的裂解位点的碱基组成，共五种底物序列(表7)，评价了LKDZ21和DZ01的催化速率变化。它们表现出相同的剪切行为。对AU和GU的剪切速率接近，而对AC和GC的剪切速率则低得多。对全DNA底物没有剪切作用。

表6含核苷类似物1-4和6的脱氧核酶类似物在单一转化率条件下的催化速率常数

编号	10-23脱氧核酶类似物的序列组成	k_obs(h^-1)
			DZ01	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA CAA CGA cct gca cct)-3’	0.2362

			LKDZ22	5’-d(tgc tct cca GGC T1G CTA CAA CGA cct gca cct)-3’	0.1161
LKDZ23	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CT1 CAA CGA cct gca cct)-3’	0.5439
			LKDZ24	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA C1A CGA cct gca cct)-3’	0.1186
LKDZ25	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA CAA CG1 cct gca cct)-3’	0.049
			LKDZ26	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA CA1 CGA cct gca cct)-3’	0.2044

			LKDZ12	5’-d(tgc tct cca GGC T2G CTA CAA CGA cct gca cct)-3’	0.015
LKDZ13	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA CAA CG2 cct gca cct)-3’	0.0171
			LKDZ14	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CT2 CAA CGA cct gca cct)-3’	1.4565
LKDZ15	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA C2A CGA cct gca cct)-3’	0.0282
			LKDZ16	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA CA2 CGA cct gca cct)-3’	0.1676

			LKDZ17	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA CAA CG3 cct gca cct)-3’	0.1299
LKDZ18	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA CA3 CGA cct gca cct)-3’	0.1551
			LKDZ19	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA C3A CGA cct gca cct)-3’	0.0923
LKDZ20	5’-d(tgc tct cca GGC T3G CTA CAA CGA cct gca cct)-3’	0.0193
			LKDZ21	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CT3 CAA CGA cct gca cct)-3’	2.603

			LKDZ27	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CT4 CAA CGA cct gca cct)-3’	0.7658

			LKWQ-06	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA CAA CGA cct gca cct)-3’	-
LKWQ-07	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA CAA CGA cct gca cct)-3’	0.2454
			LKWQ-08	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA CAA CGA cct gca cct)-3’	-
LKWQ-09	5’-d(tgc tct cca GGC TAG CTA CAA CGA cct gca cct)-3’	0.6363

表7五种底物的序列组成

编号	序列
		Seq01	3’-d(acg aga gg)rU rA d(gga cgt gga)-5’
Seq02	3’-d(acg aga gg)rU rG d(gga cgt gga)-5’
		Seq03	3’-d(acg aga gg)rC rA d(gga cgt gga)-5’
Seq04	3’-d(acg aga gg)rC rG d(gga cgt gga)-5’
		Seq05	3’-d(acg aga gg TA gga cgt gga)-5’

通过比较pH，金属离子，和不同底物等条件对LKDZ21和DZ01的催化速率的影响，我们可以初步推断两者的催化机制是一样的，2’-OH作为亲核试剂进攻邻位的磷原子，得到2’，3’-环磷酸酯和5’-OH为末端的两种产物。LKDZ21的修饰碱基所带来的催化速率增加可能是因为带来了催化结构域构象的优化，从而优化了参与催化反应的各个基团的空间位置，降低了反应能垒。

对各个脱氧核酶类似物与未修饰的10-23脱氧核酶DZ01进行了裂解反应比较，结果见图3-图9。

图3显示了10-23脱氧核酶DZ01和含脱氧腺苷类似物1的脱氧核酶类似物的裂解反应比较。反应条件：脱氧核酶类似物(2000nmol)和底物(20nmol)在Tris-HCl(50mM，pH 7.5)，2mM Mg²⁺的缓冲液中反应。DZ01和LKDZ23的取样时间点为0min，0.5h，1h，1.5h，2h，2.5h，3h，3.5h，4h。LKDZ22，LKDZ24，LKDZ25，LKDZ26的取样时间点为：0min，15min，30min，45min，60min，1.5h，2h，3h，4h，6h，8h。

图4显示了10-23脱氧核酶DZ01和含脱氧腺苷类似物2的脱氧核酶类似物的裂解反应比较。反应条件：脱氧核酶类似物(0.1nmol)和底物(10nmol)在Tris-HCl(50mM，pH 8.0)，50mM Mg²⁺的缓冲液中反应。LKDZ12，LKDZ13，LKDZ15，LKDZ16的取样时间点：0min，15min，30min，45min，60min，1.5h，2h，3h，4h，6h，8h，10h。LKDZ14的取样时间点为0min，10min，20min，30min，40min，50min，60min，75min，90min，105min，120min。

图5显示了10-23脱氧核酶DZ01和含脱氧腺苷类似物3的脱氧核酶类似物的裂解反应比较。反应条件：脱氧核酶类似物(0.1nmol)和底物(10nmol)在Tris-HCl(50mM，pH 8.0)，50mM Mg²⁺的缓冲液中反应。LKDZ17，LKDZ18，LKDZ19，LKDZ20的取样时间点：0min，15min，30min，45min，60min，1.5h，2h，3h，4h，6h，8h，10h。LKDZ21的取样时间点为0min，10min，20min，30min，40min，50min，60min，75min，90min，105min，120min。

图6显示了10-23脱氧核酶DZ01和含脱氧腺苷类似物21的脱氧核酶类似物的裂解反应比较。反应条件：脱氧核酶类似物(0.1nmol)和底物(10nmol)在Tris-HCl(50mM，pH 8.0)，50mM Mg²⁺的缓冲液中反应。取样时间点：0h，0.5h，1h，2h，3h，4h，6h。

图7显示了10-23脱氧核酶DZ01和含脱氧腺苷类似物22的脱氧核酶类似物的裂解反应比较。反应条件：脱氧核酶类似物(0.1nmol)和底物(10nmol)在Tris-HCl(50mM，pH 8.0)，50mM Mg²⁺的缓冲液反应。取样时间点：0h，0.5h，1h，2h，3h，4h，6h。

图8显示了10-23脱氧核酶DZ01和含脱氧腺苷类似物23的脱氧核酶类似物的裂解反应比较。反应条件：脱氧核酶类似物(0.1nmol)和底物(10nmol)在Tris-HCl(50mM，pH 8.0)，50mM Mg²⁺的缓冲液中反应。取样时间点：0h，0.5h，1h，2h，3h，4h，6h。

图9显示了含脱氧鸟苷类似物11的脱氧核酶类似物LKWQ06(b)-LKWQ09(e)与DZ01(a)在单一转化率条件下的裂解活性比较。反应条件：脱氧核酶类似物(2000nmol)和底物(20nmol)比为100∶1，在Tris-HCl(50mM，pH 7.5)，2mM Mg²⁺的缓冲液中反应。取样时间点：0h，0.5h，1h，1.5h，2h，2.5h，3h，3.5h，4h，4.5h，5h，5.5h，6h。

本发明对10-23脱氧核酶的催化结构域进行修饰，获得了更高效的脱氧核酶类似物。这类脱氧核酶类似物同时也保留了原型10-23脱氧核酶的特性，即利用其识别臂对底物的高度专一性识别。原型10-23脱氧核酶的两端的识别结构域是根据靶基因片段而设计的，催化结构域保持不变，已用于针对多种致病基因的研究，如HIV，HBV，HCV等病毒的多个基因片段，和多个肿瘤基因片段。因此，本发明的脱氧核酶类似物，同样可以针对任何靶基因片段而设计，只要已知靶RNA的序列组成，就可以设计相应的脱氧核酶类似物，对其进行高效裂解。因此，这类脱氧核酶类似物和原型脱氧核酶一样，可以用于针对任何目的基因，进行基因操作；或者针对致病基因，作为基因治疗的候选药物。除了实施例中的血管内皮生长因子受体mRNA的片段以外，还可以是选自其他肿瘤基因、病毒基因的mRNA片段，或全长mRNA，或者是处于细胞内的靶mRNA，或者是动物体内的mRNA。因此，它将是一类新型的广谱基因治疗的候选药物。

本发明的新颖的10-23脱氧核酶类似物是在原型10-23脱氧核酶的结构基础上进行改变，以获得某些比原型10-23脱氧核酶更为有利的优点，本领域技术人员根据本发明上下文可以看到通过本发明的技术方案完全可以获得具有期望优点的10-23脱氧核酶类似物。了解原型10-23脱氧核酶针对致病基因的作用以及其相关研究等对于理解本发明的新颖的10-23脱氧核酶类似物的优点和用途是有益的。关于原型10-23脱氧核酶针对致病基因的作用及相关研究的参考文献列举如下，其全部内容通过引用并入本文：

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本发明还提供以下参考文献，以便能更有利地理解本发明：

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Claims

1.10-23脱氧核酶催化结构域部分被修饰的10-23脱氧核酶类似物，其为下式所示：

3’-N₁N₂N₃N₄N₅N₆……N_i X₁₅X₁₄C₁₃X₁₂X₁₁C₁₀X₉X₈C₇X₆X₅X₄C₃X₂X₁R N_i+17N_i+18N_i+19N_i+20……N_n-5’，

或为下式所示：

其中，

n为4-50的整数；

i为4-33的整数；

所述的催化结构域部分

是10-23脱氧核酶催化结构域部分

中的第9号残基被选自以下式J的核苷类似物取代：

以上式J的核苷类似物中，各取代基各自独立地定义如下：

(1)嘌呤核苷类似物J中，Z为碳原子，其中，

7位取代基R¹各自独立地选自：氢、卤素、R⁷、或L-R⁸，其中：

R⁸选自羟基、氨基、苯基、OR⁷、NHR⁷，

L是选自以下的连接臂：C_1-6直链或支链烷基臂，

R⁷各自独立地选自C_1-6直链或支链烷基；

(2)嘌呤核苷类似物J的2位取代基R²为氢；

(3)嘌呤核苷类似物J的6位取代基R³选自：氨基、NHR⁷，其中：

R⁷选自C_1-6直链或支链烷基，

(4)嘌呤核苷类似物J的8位W可以是氮原子；

(5)核苷类似物J，其糖环部分选自脱氧核糖基，所述糖环部分的构型各自独立地是D-或L-型，其中，其2’-位取代基R⁶为氢；和／或

所述的催化结构域部分

是10-23脱氧核酶催化结构域部分

中的第14号残基被选自以下式D的核苷类似物取代：

以上式D的核苷类似物中，各取代基各自独立地定义如下：

(1)嘌呤核苷类似物D中，Z为碳原子，其中，

R⁸选自羟基、氨基、苯基、OR⁷、NHR⁷，

L是选自以下的连接臂：C_1-6直链或支链烷基臂，

R⁷各自独立地选自C_1-6直链或支链烷基；

(2)嘌呤核苷类似物D的2位取代基R²为氢；

(4)嘌呤核苷类似物D的8位W是氮原子；

(5)核苷类似物D，其糖环部分选自脱氧核糖基，所述糖环部分的构型各自独立地是D-或L-型，其中，其2’-位取代基R⁶为氢。

2.权利要求1的10-23脱氧核酶类似物，其中所述卤素选自氟、氯、溴、碘。

3.权利要求1的10-23脱氧核酶类似物，其中所述C_1-6直链或支链烷基臂选自亚甲基、1，2-亚乙基、三亚甲基、四亚甲基。

4.权利要求1的10-23脱氧核酶类似物，其中所述C_1-6直链或支链烷基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基。

5.权利要求1的10-23脱氧核酶类似物，其中N代表该10-23脱氧核酶类似物两端的识别部分，并且两端的碱基数量相同或不同，各自独立地为4至25个，与所针对的靶序列是以Watson-Crick互补配对的。

6.权利要求1的10-23脱氧核酶类似物，其特征在于以下任意一项或任意多项：

a)n为4-50的整数，或者n为10-40的整数，或者n为15-40的整数，或者n为20-40的整数，或者n为4-40的整数；

b)i为4-33的整数，或者i为4-15的整数，或者i为4-12的整数，或者i为6-12的整数。

7.权利要求1的10-23脱氧核酶类似物，其特征在于以下任意一项或任意多项：

a)所述的催化结构域部分是10-23脱氧核酶催化结构域部分中的第9号残基被选自以下的的核苷类似物取代：

R¹独立地选自：

b)所述的催化结构域部分是10-23脱氧核酶催化结构域部分中的第14号残基被选自以下的的核苷类似物取代：

其中R¹选自

8.权利要求1至7任一项的10-23脱氧核酶类似物，其中式J、式D的核苷类似物的单一或组合取代也与天然碱基的缺失一起修饰10-23脱氧核酶的催化结构域。

9.权利要求8的10-23脱氧核酶类似物，其中所述天然碱基的缺失是指缺失T8。

10.权利要求1至7任一项的10-23脱氧核酶类似物，核苷类似物J，D的单一或组合取代可与提高脱氧核酶类似物的稳定性的修饰相结合；抗核酸酶修饰的方法有硫代磷酸酯键骨架；2’-氟代，2’-甲氧基，2’-甲氧基乙烯氧基(MOE)，2’-乙氧基，2’-乙氧基乙烯氧基修饰，LNA；以及在3’-端引入翻转的核苷酸单体，获得酶稳定性更高的新型的脱氧核酶类似物；其中所述的提高脱氧核酶稳定性的修饰既可用于脱氧核酶的催化结构域，又可用于它的两端识别结构域。

11.权利要求1至7任一项的10-23脱氧核酶类似物，式J、式D的核苷类似物的引入可以与改善脱氧核酶类似物的转运而进行的修饰组合，其中所述改善转运的办法包括脂质体和阳离子性脂质体，和其他转运材料的包裹；胆固醇，PEG与脱氧核酶的共价连接。

12.权利要求1至7任一项的10-23脱氧核酶类似物，其为选自下列编号对应的10-23脱氧核酶类似物：

13.权利要求1至12任一项所述10-23脱氧核酶类似物的制备方法，其采用亚磷酰胺法固相合成10-23脱氧核酶类似物。

14.权利要求13的制备方法，其针对以下底物的序列：5′-N′₁N′₂N′₃N′₄N′₅N′₆......N′_i R Y N′_i+3N′_i+4N′_i+5N′_i+6......N′_m-3′，合成相应的10-23脱氧核酶类似物：

其中，

N’为底物的核苷酸单体组成，N为10-23脱氧核酶的识别域的核苷酸单体组成；R为嘌呤核苷酸单元，Y为嘧啶核苷酸单元，i为4-33的整数，m为进行基因操作和基因治疗的部分序列或全长序列的单体个数；n为4-50的整数；多个N组成的10-23脱氧核酶的两端识别结构域与底物的序列形成Watson-Crick配对；

N、n、X₁₅、X₁₄、X₁₂、X₁₁、X₉、X₈、X₆、X₅、X₄、X₂、X₁的定义同权利要求1-12任一项。

15.权利要求14的制备方法，其中所述m为6-1000的整数。

16.权利要求14的制备方法，其中所述m为6-800的整数。

17.权利要求14的制备方法，其中所述m为6-500的整数。

18.权利要求14的制备方法，其中所述m为6-200的整数。

19.权利要求14的制备方法，其中所述m为6-100的整数。

20.权利要求14的制备方法，其中所述m为6-40的整数。

21.一种药盒、试剂盒、或组合物，包含：i)权利要求1至12任一项所述10-23脱氧核酶类似物，以及任选的ii)药学可接受的载体或赋形剂，和任选的iii)产品技术说明书或使用说明书。

22.权利要求21的药盒、试剂盒、或组合物，其中所述组合物为药物组合物。

23.权利要求1至12任一项所述10-23脱氧核酶类似物的用途，其特征在于以下任一项或多项：

所述10-23脱氧核酶类似物在制备用于基因研究和／或基因治疗的产品中的用途；

所述10-23脱氧核酶类似物在制备用于作为人工内切酶或者作为分子生物学工具的产品中的用途；

所述10-23脱氧核酶类似物在制备用于裂解任何致病基因片段的产品中的用途；

所述10-23脱氧核酶类似物在制备用于作为基因治疗的候选药物的产品中的用途。

24.权利要求23的用途，其中所述用于基因研究和／或基因治疗的产品选自用于基因研究和／或基因治疗的药物、药盒、试剂盒。

25.权利要求23的用途，其中所述作为人工内切酶或者作为分子生物学工具的产品是指作为人工内切酶或者作为分子生物学工具的试剂盒。

26.权利要求23的用途，其中所述用于裂解任何致病基因片段的产品是指用于裂解任何致病基因片段的药物。

27.权利要求23的用途，其中所述用于作为基因治疗的候选药物的产品是指用于作为基因治疗的候选药物。