BR112021000641A2 - Nanomaterial de grafeno selecionado a partir de nanofibras de grafeno, composição farmacêutica e método para preparar o produto a partir de nanofibras brutas de grafeno - Google Patents

Abstract

nanomaterial de grafeno selecionado a partir de nanofibras de grafeno, composição farmacêutica e método para preparar o produto a partir de nanofibras brutas de grafeno. produto de grafeno obtido a partir de nanofibras de grafeno (gnfs) tendo uma estrutura de cristal modificada e uma distribuição de tamanho definida. o produto é atóxico e apresenta propriedades biológicas úteis como cicatrização de ferida e melhora da aparência da pele. o produto pode ser usado em terapia.

Description

NANOMATERIAL DE GRAFENO SELECIONADO A PARTIR DE NANOFIBRAS DE GRAFENO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E MÉTODO PARA PREPARAR O PRODUTO A PARTIR DE NANOFIBRAS BRUTAS DE GRAFENO CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A invenção se refere a novos produtos de grafeno, suas composições e seu uso na terapia.

ANTECENDENTES DA INVENÇÃO

[002] A família de materiais à base ou relacionados a grafeno recentemente entrou no centro das atenções após o Prêmio Nobel de Física de 2010, e subsequente explosão no desenvolvimento de diversas aplicações para estes materiais nas áreas de energia, eletrônica, sensores, processamento de luz, medicina e meio-ambiente. Grafeno, o membro "fundador" dessa família, e um material bidimensional feito de átomos de carbono hibridizados com sp2 dispostos em uma malha alveolar hexagonal.

[003] A família estendida dos materiais relacionados ao grafeno inclui grafeno (camada única e multicamada), grafite, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, nanotubos de carbono, fulerenos, diversas nanoestruturas de grafeno de diferentes dimensões dimensionalidades (por exemplo, nanofibras de grafeno, nanopartículas de grafeno, pontos quânticos de grafeno, nanofaixas de grafeno, nanotelas de grafeno, nanodiscos de grafeno, espumas de grafeno, nanopilares de grafeno), quaisquer combinações de outros materiais relacionados a grafeno, materiais substituídos relacionados a grafeno (por exemplo, a substituição de átomos de carbono por N, B, P, S, Si ou outros) e materiais relacionados a grafeno funcionalizados com grupos funcionais reativos (por exemplo,

grupos carboxila, ésteres, amidas, tióis, grupos hidroxila, grupos diol, grupos cetona, grupos sulfonato, grupos carbonila, grupos arila, grupos epóxi, grupos fenóis, ácidos fosfônicos, grupos amina, porfirina, piridina, polímeros e combinações destes).

[004] Diversas publicações descrevem o uso de materiais de grafeno para aplicações médicas.

[005] O documento US2006/0134096 descreve composições e métodos para uso médico de composições contendo grafeno, em particular carbono não poroso, diferente de fulereno ou nanotubos, compreendendo grafeno. Eles são usados topicamente sobre feridas, como adsorvente para toxinas ou em hemodiálise.

[006] O documento EP313353 revela composições farmacêuticas baseadas em nanoestrutura de grafeno para prevenção ou tratamento de doenças neurodegenerativas. A nanoestrutura de grafeno inibe a formação de fibrila causada por dobramento incorreto de proteínas.

[007] O documento US2014/0120081 revela o uso de nanomateriais de carbono para tratar o estresse oxidativo em um indivíduo ao reduzir o nível de espécies reativas de oxigênio. O nanomaterial de carbono é selecionados a partir de nanotubos, grafeno, nanofitas de grafeno, grafite, óxido de grafite, etc., que podem ser funcionalizados.

[008] O documento GB2532449 descreve o nanomaterial funcionalizado para uso no tratamento, profilaxia ou prevenção de câncer ao inibir a proliferação de células- tronco do câncer, em que o nanomaterial é grafeno de monocamada, grafenos de poucas camadas, nanografite, nanotubos de carbono de parede única ou multiparedes, fulerenos,

nanocifres de carbono, nanofibras de carbono ou nanocarbonos amorfos ou parcialmente amorfizados, ou misturas destes. Prefere-se óxido de grafeno.

[009] Guranathan S. and Kim J-H. em International Journal of Nanomedicine, 2016:11, páginas 1927- 1945 revê a síntese, toxicidade, biocompatibilidade e aplicações biomédicas de grafeno e materiais relacionados ao grafeno. Como discutido nesse documento, muitos desses produtos ainda apresentam problemas de toxicidade e biocompatibilidade associadas. O efeito tóxico de grafeno pode ser influenciado pelas propriedades físico-químicas, como tamanho e distribuição, carga superficial, área superficial, número de camadas, dimensões laterais, bioquímica superficial, pureza, estado do particulado, grupos funcionais superficiais e formato. A terapia anticâncer, terapia fototérmica, administração medicamentosa, transfecção de gene, biodetecção, exame por imagem e engenharia tecidual então entre as aplicações biomédicas mencionadas nessa revisão.

[010] Ainda há a necessidade de novos materiais à base de grafeno com baixa ou nenhuma toxicidade, boa biocompatibilidade e capazes de prover um efeito biológico útil e aplicações na terapia.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[011] Descobriram-se novos produtos de grafeno com propriedades notáveis, com baixíssima ou nenhuma toxicidade e que são úteis na terapia.

[012] Em um primeiro aspecto, a invenção é direcionada a um nanomaterial de grafeno selecionado a partir de nanofibras de grafeno, em que o nanomaterial de grafeno apresenta uma distribuição de tamanho de partícula com um dn(90) de 0,60 µm ou menor em número de partículas e um dv(90) de 80,00 µm ou menor em volume de partículas, conforme medido pelo analisador de partículas por difração a laser.

[013] Preferencialmente, a área de superfície específica BET do nanomaterial de grafeno está compreendida entre 100 e 500 m2/g, mais preferencialmente entre 300 e 350 m2/g.

[014] Em outra realização, o volume de poro do nanomaterial de grafeno está entre 0,35 e 0,40 cm3/g.

[015] Também preferiu-se que as impurezas no nanomaterial de grafeno sejam inferiores a 0,01% em peso.

[016] Em outro aspecto, a invenção é direcionada a um nanomaterial de grafeno, como definido acima, para uso como um medicamento. Em uma realização, o medicamento serve para o tratamento de feridas, eczema, psoríase, cicatrizes, úlceras e demais condições que resultam em ruptura da integridade cutânea.

[017] Em outro aspecto, a invenção é direcionada a composições farmacêuticas compreendendo o nanomaterial de grafeno definido acima.

[018] Em um aspecto adicional, a invenção é direcionada ao uso do nanomaterial de grafeno definido acima na terapia.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[019] Figura 1.- Espectroscopia de Raman de GMC- 1

[020] Figura 2.- Absorção – dessorção em N2 de GMC-1

[021] Figura 3A.- Difração de raios X da matéria- prima de GNFs

[022] Figura 3B.- Difração de raios X de GMC-1

[023] Figura 4A.- Comparação da distribuição de tamanho de partícula em número de partículas para a matéria- prima de GNFs e GMC-1.

[024] Figura 4B.- Comparação da distribuição de tamanho de partícula de acordo com a porcentagem de partículas em volume de partículas para matéria-prima de GNFs e GMC-1.

[025] Figura 5.- Ensaios de toxicidade em células Hep-G2 cultivadas tratadas durante 24 horas com GMC-

1. A) Viabilidade terminada por exclusão celular de azul de tripano e B) metabolismo celular determinado por MTT com veículo 1x e 10x concentração de GMC-1. Os valores são representados como média +/- SEM.

[026] Figura 6.- Modelo de roedor com cicatrização de ferida dérmica (Rattus Norvegicus), baseado em biópsias obtidas na área dorsal, foram tratados topicamente a cada 2 dias com uma formulação que inclui 2x GMC-1 ou não (CT). A) Curso temporal de fechamento da área da ferida, B) regeneração dérmica (colagenização e reepitelização) e C) infiltrado inflamatório agudo no 4o dia. Os valores são percentuais contra a ferida de controle interno por animal (não tratado com qualquer formulação) e representados como média +/- SEM. *= P<0,05 vs. CT, valor considerado estatisticamente significativo.

[027] Figura 7.- Análise bioquímica sistêmica de um modelo de roedor de cicatrização de ferida dérmica (Rattus Norvegicus), com base nas biópsias obtidas na área dorsal, tratados topicamente a cada 2 dias com uma formulação que inclui 2x GMC-1 ou não (CT). No 4o dia e a após eutanásia, foram determinados A) creatinina, B) aspartato aminotransferase (AST) e wrCRP (proteína C-reativa de amplo espectro) plasmáticos. D) Nas células mononucleares de sangue periférico (PBMC), determinou-se a alteração de vezes da expressão de mRNA por RT-qPCR para o marcador inflamatório sistêmica da expressão de Interleucina 1-beta (IL-I-beta). Os valores são representados como média+/- SEM.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Matérias-primas de grafeno

[028] Na presente invenção, o termo "grafeno" refere-se a um material que forma uma molécula aromática policíclica com diversos átomos de carbono ligados covalentemente entre si. Os átomos de carbono ligados covalentemente formam um anel de seis membros com uma unidade de repetição.

[029] O termo "Nanofibras de grafeno" (GNFs) se refere a nanoestruturas cilíndricas com camadas de grafeno dispostas como cones, copos ou placas empilhados. A superfície plana do grafeno é inclinada a partir do eixo da fibra, o que expõe as bordas do plana presentes nas superfícies internas e externas das nanofibras de carbono.

[030] O termo "nanotubos de grafeno" (GNTs) refere-se a cilindros concêntricos de parede única ou multiparedes de grafeno onde os planos basais formam uma superfície menos reativa em comparação aos das nanofibras de grafeno, porque são cilíndricos e ocos como um tubo, mas as nanofibras de grafeno são como hastes e geralmente não há espaço interno vazio no interior delas.

[031] O produto da invenção é um nanomaterial à base de carbono derivado de GNF que é submetido a uma série de purificações e tratamentos para se obter um material de grau médico com propriedades biológicas inesperadas.

[032] O nanomaterial de carbono inicial é um material à base de grafeno (nanofibras de grafeno). Em uma realização, as nanofibras de grafeno usadas para preparar o produto da invenção apresentam uma distribuição de tamanho de partícula dn(90) de 4,0 µm ou menor para o número de partículas e um dv(90) de 105,00 µm ou menor para o volume de partículas. Preferencialmente, apresentam uma área superficial de aproximadamente 250 a 400 m2/g.

[033] As matérias-primas usadas para obter o produto da invenção podem ser sintetizadas seguindo uma ampla variedade de métodos, como crescimento epitaxial em carboneto de silício, deposição química de vapor, exfoliação micromecânica ou mecânica de grafite, oxidação química de grafite, redução de óxido de grafite usando redução térmica, química ou multi-etapas, decomposição por catálise de hidrocarbonetos em catalisador metálico, desenrolamento de nanotubos de carbono, deposição eletrostática, etc.

[034] O crescimento epitaxial em carboneto de silício é um método no qual as monocamadas isoladas de grafeno podem ser sintetizadas em um cristal de carboneto de silício monocristalino (SiC), o qual é usado como um substrato. Esse método consiste no aquecimento das pastilhas de SiC a altas temperaturas (> 1100°C) e vácuo elevado. Nas condições mencionadas, os átomos de silício sublimam à obtenção do crescimento epitaxial de grafeno em sua superfície (o átomos de carbono se redispõem, formando o grafeno) [Sutter, P., Epitaxial graphene: How silicon leaves the scene. Nature Materials, 2009. 8(3): p. 171-172.]

[035] No método de decomposição química por vapor, uma fonte de carbono se degrada catalisticamente em um substrato catalítico. A superfície catalítica causa, após a decomposição térmica dos hidrocarbonetos, a dissolução dos átomos de carbono gerados dentro do metal [Jacobberger, R.M., et al., Simple Graphene Synthesis via Chemical Vapor Deposition. Journal of Chemical Education, 2015. 92(11): p. 1903-1907, Lavin-Lopez, M.P., et al., Thickness control of graphene deposited over polycrystalline nickel. New Journal of Chemistry, 2015. 39(6): p. 4414-4423].

[036] A exfoliação micromecânica de grafite consiste na separação da camada mais externa do dito sólido em flocos por meio de raspagem fina, usando um objeto de superfície sólida ou fita adesiva [Geim, A.K. and K.S. Novoselov, The rise of graphene. Nature Materials, 2007. 6(3): p. 183-191]. A exfoliação mecânica permite separar as folhas que formam o grafite suspenso em solventes orgânicos ou aquosos por meio de ondas ultrassônicas. O material obtido é de alta qualidade, no entanto, não é de grande interesse industrial dado seu baixo rendimento e seu alto custo de produção [Lotya, M., et al., Liquid phase production of graphene by exfoliation of graphite in surfactant/water solutions. Journal of the American Chemical Society, 2009. 131(10): p. 3611-3620].

[037] Uma ampla variedade de métodos também pode ser usada para sintetizar nanofibras de grafeno (GNFs), que são especialmente preferidas para preparar o produto da invenção. Por exemplo, o método de deposição química de vapor para a nanofibra de carbono é um método catalítico no qual uma fonte carbonácea é decomposta na presença de um catalisador para cultivar GNFs. As partículas catalíticas de metal de transição como ferro, níquel, cobalto e cobre são usadas como catalisador. O processo de CVD [deposição química de vapor] ocorre a temperaturas que variam entre 500 e 1200°C [Martin- Gullon, I., et al., Differences entre carbon nanofibers produced using Fe and Ni catalysts in a floating catalyst reactor. Carbon, 2006. 44(8): p. 1572-1580]. A deposição eletrostática é um método de produção alternativa de GNFs. Nesse método, o processo de solvente-gel é usado precisando de uma agulha com uma extremidade fina. Para tanto, aplica-se alta voltagem à gota da agulha, fazendo com que a solução saia da agulha em direção a um alvo. Quando a tensão superficial é alta o bastante para a solução, evite entrar em uma gota fina, uma estrutura fibrosa pode ser extraída e coletada na objetiva [Zhang, L., et al., A review: Carbon nanofibers from electrospun polyacrylonitrile and their applications. Journal of Materials Science, 2014. 49(2): p. 463-480].

[038] Os diâmetros e comprimentos médios do material de grafite poroso que são usados para preparar o compósito da invenção são medidos por Microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Purificação e Tratamento

[039] Um nanomaterial de grafeno sintetizado seguindo os métodos relatados acima é usado como matéria-prima para sintetizar o material de grau médico à base de grafeno da invenção. O nanomaterial bruto de grafeno é então submetido a um processo de purificação, usando-se preferencialmente um ácido forte (H2SO4, HCl, HF, HNQ3, HBr, etc.), para remover qualquer metal ou impureza introduzido na estrutura do nanomaterial de grafeno durante o processo de síntese. Qualquer processo capaz de remover impurezas sem afetar as propriedades do material de grafeno pode ser usado. Entre os ácidos, o ácido clorídrico ou fluorídrico são especialmente preferidos, mas o técnico no assunto selecionará o ácido e as condições, dependendo da quantidade e tipo de impurezas presentes. O processo de purificação ocorre preferencialmente a baixas temperaturas (20 a 50°C) durante diversas horas (12 a 24 horas). Caso seja usada uma solução para o processo de purificação, o nanomaterial de grafeno purificado podem ser então enxaguado com água Millipore até pH neutro e então desidratado, por exemplo, desidratado a vácuo.

[040] O nanomaterial de grafeno purificado também é trado para atingir uma distribuição reduzida de tamanho de partícula, o que torna o produto adequado para usos médicos e cosméticos. O nanomaterial de grafeno purificado é, por exemplo, submetido a um processo para reduzir seu tamanho e modificar suas propriedades. Em uma realização, é submetido a um processo de exfoliação a temperatura ambiente, por exemplo, através de ultrassonificação, trituração úmida ou processos híbridos. A ultrassonificação é especialmente preferida devido à simplicidade do processo, que pode ser monitorado adicionalmente através de amostras para verificar se a distribuição desejada de tamanho de partícula é atingida. Após isso, ocorre um processo de delimitação opcional para controlar o tamanho da partícula entre 10 e 100 µm. O técnico no assunto determinará prontamente a técnica necessária para selecionar a distribuição de tamanho de partícula. Por exemplo, essa etapa pode ser atingida por meio de filtração ou centrifugação, preferencialmente filtração a vácuo, por exemplo, através de filtro de vidro sinterizado. A dita etapa de delimitação pode levar vantajosamente partículas com um dn(90) de 0,60 µm ou menor em número de partículas e um dv(90) de 80,00 µm ou menor em volume de partículas.

[041] Finalmente, para controlar que o material de qualidade não esteja arrastando vestígios de outros compostos tóxicos, inclusive contaminação bacteriológica ou endotoxinas e para manter a assepsia e condições de esterilidade, o material também pode ser submetido a um processo de despirogenização padrão por calor, preferencialmente a 200 a 500°C durante 10 a 60 min.

[042] A distribuição resultante de tamanho de partícula pode ser determinada por meios comuns na área, como um analisador de tamanho de partículas, por exemplo, um Mastersizer 2000 da Malvern Pananalytical, como usado nos exemplos.

[043] Portanto, um objeto adicional da invenção é um método para preparação do produto da invenção a partir de nanofibras brutas de grafeno, compreendendo as seguintes etapas: a) Purificação da matéria-prima de grafeno, preferencialmente usando um ácido forte, para remover qualquer metal ou impureza presente na matéria-prima de grafeno; b) Redução do tamanho de partículas do nanomaterial de grafeno purificado, preferencialmente através de um processo de exfoliação, para uma distribuição de tamanho de partícula com um dn(90) de 0,60 µm ou menor em número de partículas e um dv(90) de 80,00 µm ou menor em volume de partículas, conforme medido pelo analisador de partículas por difração a laser; c) Sujeição, opcionalmente, do produto obtido a um processo de despirogenização.

[044] A etapa (b) pode compreender ainda a etapa de delimitação das partículas de acordo com o tamanho da partícula antes da etapa (c). Em uma realização, a etapa de delimitação é atingida por filtração ou centrifugação, preferencialmente filtração a vácuo.

[045] No contexto da presente invenção, uma distribuição de tamanho de partícula com um dn(90) de 0,60 µm ou menor em número de partículas e um dv(90) de 80,00 µm ou menor em volume de partículas pode ser obtido por meio da seguinte etapa (b), incluindo opcionalmente a etapa adicional de delimitação, preferencialmente uma etapa de filtração. Preferencialmente, a filtração é filtração a vácuo com um filtro de vidro sinterizado de tamanho de poro compreendido entre 1 e 20 µm, preferencialmente entre 4 e 20 µm, mais preferencialmente entre 5 e 16 µm. Produto

[046] O produto da invenção é um nanomaterial de grafeno purificado com uma distribuição de tamanho de partícula com um dn(90) de aproximadamente 0,60 µm ou menor em número de partículas e um dv(90) de 80,00 µm ou menor, preferencialmente 70,00 µm ou menor em volume de partículas.

[047] A distribuição de tamanho de partícula é medida por um analisador de tamanho de partícula por difração a laser. Uma distribuição de tamanho de partícula D50 é o valor do diâmetro da partícula em 50% na distribuição cumulativa. Caso D50 apresente um determinado valor, então 50% das partículas na amostra são maiores que esse valor e 50% são menores. A distribuição de tamanho de partícula é o número de partículas que se enquadram em cada uma das diversas faixas de tamanho dadas como um percentual do número total de todos os tamanhos na amostra de interesse. O método mais amplamente usado de descrição da distribuição de tamanho de partículas são os valores d (d10, d50 e d90), que são interceptações para 10%, 50% e 90% da massa cumulativa.

[048] Esses valores podem ser considerados como o diâmetro do material que divide a massa da amostra em uma porcentagem especificada quando as partículas são dispostas em uma base de massa ascendente. O d10 é o diâmetro no qual 10% da massa da amostra é composta de partículas com um diâmetro menor a este valor. O d50 é o diâmetro da partícula que 50% de massa de uma amostra é menor que e 50% da massa de uma amostra é maior que. O d90 é o diâmetro no qual 90% da massa da amostra é composta de partículas com um diâmetro inferior a este valor. Esses valores podem ser aplicados para número de partículas (dn) de volume de partículas (dv).

[049] Uma distribuição com um dn(90) em número de partículas significa o ponto na distribuição de tamanho, até e inclusive, que 90% do número total de material na amostra estão contidos.

[050] Uma distribuição com um dv(90) em volume de partículas significa o ponto na distribuição de tamanho, até e inclusive, 90% do volume total de material na amostra estão contidos.

[051] A distribuição de tamanho de partícula produto da invenção é medida com um Mastersizer 3000 da Malvern Panalytical.

[052] No contexto da presente invenção, o termo "área superfície específica (SSA)" se refere à área superficial total de um material por unidade de massa.

[053] As propriedades de porosidade e área de superfície específica descritas no presente pedido são medidas usando os métodos de Brunnauer-Emmet-Teller ("BET"), aplicados na técnica de adsorção física usando nitrogênio como material absorvente, o qual é bem conhecido ao técnico no assunto.

[054] Em uma realização da invenção, a área de superfície BET do produto da invenção está entre 300 e 350 m2/g.

[055] Em outra realização, o volume de poro do produto da invenção está entre 0,35 e 0,40 cm3/g.

[056] Em uma realização preferida, o produto da invenção possui uma área de superfície BET entre 300 e 350 m2/g e um volume de poro entre 0,35 e 0,40 cm3/g.

[057] O produto da invenção está na forma de nanofibras de grafeno. Composição

[058] Em outro aspecto, a invenção se refere a uma composição farmacêutica compreendendo o produto de grafeno da invenção e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[059] "Composição farmacêutica", como aqui usada, refere-se a composições e entidades moleculares que são fisiologicamente toleráveis e não produzem normalmente uma reação alérgica ou uma reação similar desfavorável como distúrbios gástricos, tontura e similares, quando administradas a um ser humano ou animal. Preferencialmente, o termo "farmaceuticamente aceitável" significa que é aprovado por um órgão regulatório de um governo estadual ou federal e/ou está incluído na Farmacopeia europeia e norte-americana e/ou outras geralmente 10 farmacopeias reconhecidas para uso em animais, e mais particularmente, em seres humanos.

[060] O termo "excipiente" se refere a um veículo, diluente ou adjuvante administrado com o princípio ativo. Esses excipientes farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, como água e óleos, inclusive aqueles provenientes de petróleo, de origem animal, vegetal ou sintética, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares.

[061] Em uma realização preferida, a composição farmacêutica da invenção é adequada para administração tópica à pele, como, por exemplo, cremes, loções, pomadas, microemulsões, pomadas oleosas, géis, emulsões em gel, pastas, espumas, tinturas, soluções, adesivos, curativos e sistemas terapêuticos transdérmicos. Os mais preferidos são cremes ou emulsões em gel.

[062] Cremes ou loções são emulsões de óleo em água. As bases oleosas que podem ser usadas são alcoóis graxos, especialmente aqueles contendo de 12 a 18 átomos de carbono, por exemplo, álcool laurílico, cetílico ou estearílico, ácidos graxos, especialmente aqueles contendo de 10 a 18 átomos de carbono, por exemplo, ácido palmítico ou esteárico, ésteres de ácido graxo, por exemplo, tricaprilocaprato de glicerila (óleo neutro) ou palmitato de cetila, ceras líquidas a sólidas, por exemplo, miristato de isopropila, gordura da lã ou cera de abelhas, e/ou hidrocarbonetos, especialmente substâncias líquidas, semissólidas ou sólidas ou misturas destes, por exemplo, vaselina (petrolato, Vaselina) ou óleo de parafina. Os emulsificantes adequados são substâncias ativas à superfície tendo predominantemente propriedades hidrofílicas,

como emulsificantes não iônicos correspondentes, por exemplo, ésteres de ácido graxo de poliálcoois e/ou adutos de óxido de etileno destes, especialmente ésteres de ácido graxo correspondentes com (poli)etilenoglicol, (poli)propilenoglicol ou sorbitol, a fração de ácido graxo contendo especialmente de 10 a 18 átomos de carbono, especialmente ésteres de ácido graxo glicerol parcial ou ésteres de ácido graxo parcial de poli-hidroxietileno sorbitano, como ésteres de ácido graxo poliglicerol ou ésteres de ácido graxo polioxietileno sorbitano (Tweens), e também ésteres de álcool graxo polioxietileno ou ésteres de ácido graxo, a fração de álcool graxo contendo especialmente de 12 a 18 átomos de carbono e a fração de ácido graxo especialmente de 10 a 18 átomos de carbono, como éster de ácido graxo poli- hidroxietilenoglicerol (por exemplo, Tagat S), ou emulsificantes iônicos correspondentes, como sais de metal alcalino ou sulfato de álcool graxo, especialmente tendo de 12 a 18 átomos de carbono na fração de álcool graxo, por exemplo, lauril sulfato de sódio, cetil sulfato de sódio ou estearil sulfato de sódio, que são geralmente usados na presença de alcoóis graxos, por exemplo, álcool cetílico ou álcool estearílico. Os aditivos à fase aquosa são, entre outros, agentes que impedem os cremes de se ressecarem, por exemplo, umectantes, como poliálcoois, como glicerol, sorbitol, propilenoglicol e/ou polietilenoglicóis, e também conservantes, perfumes, agentes gelificantes, etc.

[063] As pomadas são emulsões de água em óleo que contêm até 70%, mas preferencialmente de aproximadamente 20% a aproximadamente 50%, de água ou fase aquosa. Adequados como fase aquosa são especialmente os hidrocarbonetos, por exemplo, vaselina, óleo de parafina e/ou parafinas rígidas, que, para melhorar a capacidade de ligação à água, contêm preferencialmente compostos hidróxi adequados, como alcoóis graxos ou ésteres destes, por exemplo, álcool cetílico ou alcoóis de gordura de lã, ou gordura de lã ou cera de abelha. Os emulsificantes são substâncias lipofílicas correspondentes, por exemplo, do tipo indicado acima, como ésteres de ácido graxo sorbitano (Spans), por exemplo, oleato de sorbitano e/ou isoestearato de sorbitano. Aditivos à fase aquosa são, entre outros, umectantes, como poliálcoois, por exemplo, glicerol, propilenoglicol, sorbitol e/ou polietilenoglicol, e também conservantes, perfumes, etc.

[064] Microemulsões são sistemas isotrópicos baseados nos quatro componentes a seguir: água, um surfactante, por exemplo, tensoativo, um lipídio, como um óleo não polar ou polar, por exemplo, óleo de parafina, óleos naturais como azeite de oliva ou óleo de milho, e um álcool ou poliálcool contendo grupos lipofílicos, por exemplo, 2-octildodecanol ou glicerol etoxilado ou ésteres de poliglicerol. Se desejado, outros aditivos podem ser adicionados às microemulsões. As microemulsões possuem micelas ou partículas com tamanhos inferiores a 200 nm e são sistemas transparentes ou translúcidos, formam-se espontaneamente e são estáveis. Pomadas graxas são isentas de água e contêm como base especialmente hidrocarbonetos, por exemplo, parafina, vaselina e/ou parafinas líquidas, também gordura natural ou parcialmente sintética, como ésteres de ácido graxo de glicerol, por exemplo, triglicerídeos de ácido graxo de coco, ou preferencialmente óleos endurecidos, por exemplo, óleo de amendoim hidrogenado, óleo de rícino ou ceras, também ésteres parciais de ácido graxo de glicerol, por exemplo, mono e diestearato de glicerol, e também, por exemplo, os alcoóis graxos aumentando a capacidade de absorção de água, emulsificantes e/ou aditivos mencionados em conexão com as pomadas.

[065] Em relação aos géis, faz-se distinção entre os géis aquosos, géis isentos de água e géis com baixo teor de água, cujos géis consistem em materiais edemaciáveis e formadores de gel. São usados especialmente hidrogéis transparentes com base nas macromoléculas inorgânicas ou orgânicas. Componentes inorgânicos de alto peso molecular com propriedades formadoras de gel são predominantemente silicatos contendo água, como silicatos de alumínio, por exemplo, bentonita, silicatos de magnésio-alumínio, por exemplo, Veegum, ou ácido silícico coloidal, por exemplo, Aerosil. Como substâncias orgânicas de alto peso molecular são usadas, por exemplo, macromoléculas naturais, semissintéticas ou sintéticas. Os polímeros naturais e semissintéticos são derivados, por exemplo, de polissacarídeos contendo uma grande variedade de componentes de carboidrato, como celuloses, amidos, goma adragante, goma arábica e ágar-ágar, e gelatina, ácido algínico e sais destes, por exemplo, alginato de sódio, e derivados destes, como alquilceluloses inferiores, por exemplo, metil ou etilcelulose, alquilceluloses inferiores de carboxi ou hidroxi, por exemplo, carboximetil ou hidroxietilcelulose. Os componentes de macromoléculas sintéticas formadoras de gel são, por exemplo, compostos alifáticos insaturados adequadamente substituídos como álcool vinílico, vinilpirrolidona, ácido acrílico ou metacrílico.

[066] Emulsões em gel – também denominadas "emulgéis" – representam composições tópicas que combinam as propriedades de um gel com as de uma emulsão de óleo em água. Em contraste aos géis, contêm um fase lipídica que, devido às suas propriedades de restauração de gordura, possibilita a formulação a ser massageada enquanto, ao mesmo tempo, a absorção direta na pele é apresentada como uma propriedade agradável. Além disso, pode-se observar uma solubilidade elevada para princípios ativos lipofílicos. Uma vantagem das emulsões em gel sobre as emulsões de óleo em água reside no efeito refrescante potencializada provocado pelo frio devido à evaporação do componente de álcool adicional, se presente.

[067] As espumas são administradas, por exemplo, a partir de recipientes pressurizados e são emulsões líquidas de óleo em água na forma de aerossol; hidrocarbonetos não substituídos, como alcanos, por exemplo, propano e/ou butano, são usados como propulsor. Como a fase oleosa são usados, entre outros, hidrocarbonetos, por exemplo, óleo de parafina, alcoóis graxos, por exemplo, álcool cetílico, ésteres de ácido graxo, por exemplo, miristato de isopropila, e/ou outras ceras. Como emulsificantes são usados, entre outros, misturas de emulsificantes com propriedades predominantemente hidrofílicas, como ésteres de ácido graxo polioxietileno sorbitano (Tweens), e emulsificantes com propriedades predominantemente lipofílicas, como ésteres de ácido graxo de sorbitano (Spans). Os aditivos comuns, como conservantes, etc., também são adicionados. Tinturas e soluções geralmente possuem uma base etanólica, à qual pode-se adicionar água e à qual são adicionados, entre outros, poliálcoois, por exemplo, glicerol, glicóis e/ou polietilenoglicol, como umectantes para reduzir a evaporação, e substâncias restauradoras de gordura, como ésteres de ácido graxo com polietilenoglicóis de baixo peso molecular, propilenoglicol ou glicerol, ou seja, substâncias lipofílicas solúveis na mistura aquosa, como uma substituição para as substâncias oleosas removidas da pele pelo etanol e, se necessário, outros adjuntos e aditivos. As tinturas ou soluções adequadas também podem ser aplicadas na forma de spray por meio de dispositivos adequados.

[068] Os sistemas terapêuticos transdérmicos com – em particular – administração local do produto de grafeno da invenção contêm uma quantidade eficaz do produto de grafeno opcionalmente junto a excipiente. Os excipientes úteis compreendem solventes adequados farmacológicos absorvíveis para auxiliar a passagem do princípio ativo através da pele. Os sistemas de administração transdérmica estão, por exemplo, na forma de um adesivo compreendendo (a) um substrato (= camada de suporte ou filme), (b) um matriz contendo o princípio ativo, opcionalmente excipientes e opcionalmente (mas preferencialmente) um adesivo especial para fixação do sistema à pele, e normalmente (c) uma folha de proteção (= revestimento de liberação). A matriz (b) normalmente está presente como uma mistura de todos os componentes ou pode consistir em camadas separadas.

[069] As membranas e matrizes compreendendo o produto de grafeno da invenção também são adequadas para a aplicação tópica do produto, por si mesmas ou como parte de um produto mais complexo, como uma curativo de ferida, uma bandagem, etc. O exemplo dessas membranas ou matrizes são polímeros naturais, como polissacarídeos (alginatos, quitina, quitosona, heparina, condroitina, carragenina), proteoglicanos e proteínas (colágeno, gelatina, fibrina, queratina, fibroína de seda, membrana de casca de ovo); polímeros sintéticos, como hidrogéis ou fibras de matriz extracelular biomimética em micro/nanoescala com base no ácido poliglicólico, ácida poliláctico, ácido poliacrílico, poli-E-caprolactona, polivinilpirrolidona, álcool polivinílico, polietilenoglicol, etc.

[070] Todos esses sistemas são bem conhecidos aos técnicos no assuntos. A fabricação da preparação farmacêutica topicamente administrável é realizada de forma conhecida por si só, por exemplo, ao suspender o produto de grafeno da invenção na base ou, se necessário, em uma porção deste.

[071] As composições de acordo com a invenção também podem compreender aditivos convencionais e adjuvantes para aplicações dermatológicas, como conservantes, especialmente ésteres de parabeno como metilparabeno, etilparabeno, propilparabeno, butilparabeno ou compostos de amônio quaternário como cloreto de benzalcônio, ou doadores de formaldeído como imidazonidinilureia, ou alcoóis como álcool benzílico, fenoxietanol ou ácidos como ácido benzoico, ácido sórbico; ácidos ou bases usados como excipientes tampões de pH; antioxidantes, especialmente antioxidantes fenólicos como hidroquinona, tocoferol e derivados destes, bem como flavonoides, ou antioxidantes diversos como ácido ascórbico, palmitato de ascorbila; perfumes; cargas como caulim ou amido; pigmentos ou corantes; agentes de proteção UV; hidratantes, especialmente glicerina, butilenoglicol, hexilenoglicol, ureia, ácido hialurônico ou derivados destes; agentes antirradicais livres como vitamina E ou derivados destes;

potencializadores de penetração especialmente propilenoglicol; etanol; isopropanol; dimetilsulfóxido; N-metil-2-pirrolidona; ácidos/alcoóis graxos como ácido oleico, álcool oleílico; terpenos como limoneno, mentol, 1-8 cineol; ésteres de alquila como acetato de etila, acetato de butila; agentes de pareamento iônico como ácido salicílico.

[072] Os detalhes adicionais sobre as formulações tópicas adequadas podem ser obtidas por referência a livros padrões como Remington "The science and practice of pharmacy" 22a Edição (2012).

[073] A quantidade do produto de nanomaterial de grafeno da invenção na formulação pode estar na faixa de 0,01% a 10% em peso, preferencialmente de 0,01% a 5% em peso, mais preferencialmente de 0,1% a 3% em peso. Efeitos e usos benéficos

[074] Como evidenciado pelos exemplos abaixo, o produto da invenção é atóxico, também quando aplicado topicamente, e possui boa biocompatibilidade.

[075] Além disso, e surpreendentemente, o produto da invenção demonstrou-se ser eficaz no reparo cutâneo e cicatrização de feridas, como mostrado nos exemplos.

[076] Portanto, o produto de grafeno da invenção, e composições contendo-o, são úteis como medicamento na terapia.

[077] O termo "terapia" ou "terapêutico" é compreendido por significar tratamento ou prevenção de doença em seres humanos ou animais e restauração, correção ou modificação das funções fisiológicas em seres humanos ou animais.

[078] Muitas condições podem compreender a integridade da pele e da função dérmica, como diabetes mellitus, trauma, doenças inflamatórias, anormalidades metabólicas, distúrbios de sangramento, doenças autoimunes como psoríase, entre outros. Portanto, a promoção de cicatrização da lesão cutânea, independente da natureza do agente causador, é de extrema importância. Após lesão à pele, o fechamento da ferida é acionado pela formação de novo epitélio por meio da proliferação e migração direcional de diferentes tipos de célula como queratinócitos ou fibroblastos às margens da ferida. [Bennet NT et al., Am J Surg 1993;166:74-

81.; Wong VW et al., J Biomed Biotechnol. 2011:969618.]

[079] O produto de grafeno da invenção provou-se ser eficaz no reparo de feridas em um modelo de rato e por ser inofensivo em termos de alterações sistêmicas dos marcadores renais, hepáticos ou inflamatórios in vivo.

[080] Portanto, é útil no tratamento de qualquer condição que resulte em ruptura da integridade cutânea, como feridas, cicatrizes, queimaduras, úlceras, psoríase, cortes ou outra forma traumatiza de pele de mamíferos. Essas lesões podem ser causadas por um amplo espectro de eventos e/ou podem ser associadas a outras doenças. As lesões a serem tratadas incluem as associadas à incisão, laceração, abrasão, bolhas, hematoma, punção, penetração, eletricidade, irradiação, produtos químicos, trauma, esmagamento, mordida, queimadura, geada, cirurgia, câncer primário ou metástase, tumor benigno, acne, infecções como infecção bacteriana (que podem ser combinadas com infecção parasítica fúngica ou viral), lesões associadas a diminuição de circulação do sangue, como úlceras na perna e pés associados à insuficiente venosa ou arterial, úlceras de decúbito, feridas por pressão ou escaras e lesões associadas ao diabetes mellitus ou psoríase. Modo de administração

[081] A composição usada no presente método é aplicada preferencialmente de forma tópica.

[082] A dose diária da formulação tópica compreendendo o produto de grafeno da invenção pode depender de diversos fatores, como sexo, idade, peso e condição individual do paciente.

EXEMPLOS Exemplo 1: PREPARAÇÃO DE GMC-1 E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA Matérias-primas

[083] As características texturais, o grau de grafitação e as principais propriedades físico-químicas e térmicas das matérias-primas que podem ser usadas para preparar os nanomateriais de grafeno da invenção estão presentes na Tabela 1 abaixo. Tabela 1: Propriedades físico-químicas de GNFs brutos Características Propriedade GNFs Textura Área superficial (m2/g) 250-400 Grau de DRX: npg a(npg de 6-10 grafitação grafite ~95) RAMAN: ID/IG (ID/IG de 1,0-1,4 grafite ~0,6)b Físico e químicoOdor, cor e aparência Inodoro, pó negro e esponjoso

Conteúdo sólido 100% Solubilidade Condutividade térmica 1400-1600 (W/mK) Térmico Temperatura de oxidação 680 (°C) Decomposição Principalmente CO e térmica/produtos de CO2 oxidação anúmero de planos de grafeno no cristal (npg = Lc/d); d é a faixa do interlaminada; Lc é o tamanho médio do cristal na amostra, em uma direção perpendicular para os planos basais de grafeno bID/IG: quociente entre as intensidades de faixas D e G no espectro RAMAN.

[084] No presente exemplo, as nanofibras de grafeno (GNFs) têm sido usadas para preparar um material de acordo com a invenção.

[085] O nanomaterial de carbono à base de grafeno bruto (GNFs) é submetido a um processo de purificação usando HF para remover metal e impurezas introduzidos na estrutura de GNFs durante o processo de síntese. O processo de purificação ocorre em baixas temperaturas (20 a 50°C) por diversas horas (12 a 24 horas). Após isso, o nanomaterial de carbono purificado é desidratado a vácuo e enxaguado com água Millipore até o pH neutro.

[086] Os GNFs purificados foram então submetidos a um processo de exfoliação durante diversas horas (2 a 5 h) em temperatura ambiente em uma solução com água ou demais solventes. Finalmente, o material é submetido a um processo de despirogenização padrão por calor (200 a 500°C durante 10 a 60 min).

[087] O produto resultante (GMC-1) foi caracterizado da seguinte forma: Análise Elementar de GMC-1

[088] A principal diferença entre GMC-1 e as matérias-primas pode ser observada em sua análise elementar (Tabela 2). Em comparação com os GNFs brutos, GMC-1 é composto apenas de carbono e oxigênio. Não apresenta nenhum traço de impureza que poderia ser prejudicial à saúde humana, conforme confirmada por experimentos toxicológicos. Tabela 2: Análise elementar de CNFs brutos e GMC-1 Elemento CNFs GMC-1 C 80-90 92-95 O 10-15 5-6 Traços de impureza (metais, 0,5-1,5 0,0- suporte catalisador, etc.) 0,01 Espectroscopia de Raman de GMC-1

[089] O espectro de Raman de GMC-1 foi obtida usando um laser 512 nm. Mostra-se (Figura 1), os picos característicos de materiais de carvão. Pico D, 1332 cm-1, e pico G, 1580 cm-1. A banda G corresponde às redes de átomos de carbono, ou seja, à estrutura grafítica ideal, enquanto a banda D se deve à existência de defeitos, tanto no plano basal quando nas margens. As nanofibras de grafeno possuem uma banda D de grande intensidade, maior que a banda G. Um grande pico D pode aparecer nos materiais grafítica caso contenha um grande número de bordas, como no caso dessas nanofibras. O fato de que ambos os picos D e G não apresentam uma largura de banda grande o bastante também mostra a cristalinidade das nanofibras. Análise de Dessorção de Nitrogênio em Absorção de GMC-1

[090] A base para medição da área de superfície total de um sólido por fisiossorção de um gás é detectar o número de moléculas de gás necessário para cobrir a superfície do sólido. Assim que área ocupada pela molécula é conhecida, a área da superfície do sólido pode ser estimada a partir do número de moléculas de gás absorvido, medido volumétrica ou gravimetricamente (Brunauer, Emmett e Teller).

[091] A área de superfície total foi calculada pela equação multiponto BET, enquanto o volume total de poro foi determinado pela quantidade de vapor absorvido a uma pressão relativa P/P0 = 0,99, presumindo que os poros são subsequentemente preenchidos com adsorvato líquido. O tamanho médio do poro, presumido como cilíndrico, foi estimado a partir do valor de volume total de poro e da área de superfície, presumindo que os poros que não foram preenchidos em pressões relativas inferiores a 1 não contribuíram ao volume e área de superfície da amostra de poro.

[092] A análise da área de superfície, volume de poro e área de poro foi feita por absorção-dessorção de N2 a 77 K, usando um QUANTACHROM modele QUADRASORB SI, com seis portas de desgaseificação e três portas de análise, controladas com software (QUADRAWIN) que coleta os valores de pressão relativa para cada volume de N2 dosado. A Figura 2 mostra a área de superfície, volume de poro e tamanho de poro de GMC-

1.

[093] Área de Superfície BET: 300 a 350 m2/g

[094] Volume de poro: 0,35 a 0,4 cm3/g

[095] Tamanho de poro: 5 a 6 nm Difração de raios X de GMC-1

[096] Realizou-se o difratograma de raios X correspondendo a uma amostra de GNFs (Figura 3A). Como observa- se, apresenta um pico em torno de 25,9° que corresponde à distância entre os planos 002 do grafite, ou distância entre as folhas de grafeno. No grafite altamente cristalino, a distância interlaminar é de 0,334 nm. Nesse caso, as nanofibras apresentam uma distância discretamente maior, 0,343 nm, indicativa de que uma cristalinidade de faixa curta e são turboestráticos. O tamanho do cristal na direção perpendicular para o plano 002 (Lc) é de 4,64 nm, indicativo do fato supracitado.

[097] A Figura 3B mostra o difratograma correspondendo a uma amostra do material de acordo com o GMC- 1 da invenção. GNFs e GMC-1 apresentaram os mesmos picos, no entanto, em GMC-1 esses picos apresentaram valor inferior de

28.

[098] A Tabela 3 mostra os parâmetros cristalográficos característicos para GNFs e GMC-1:

[099] Espaço Interlaminar (d002)

[100] Altura da pilha de cristal (Lc)

[101] Tamanho de cristalito no plano (La)

[102] Número de camadas de grafeno no cristal (npg)

[103] em que: λ, comprimento de onda da radiação (λ = 0,15404 nm)

1, posição do ) pico de difração (°) 2, posição do ) pico de difração (°) kl, fator de forma (k=0,9) k2, constante do fator de forma de Warren (k=1,84) FWHM, largura em meia altura do pico de difração correspondente (rad) Tabela 3: Parâmetros de difração de raios X de GNFs e GMC-1 Lc La d (nm) npg (nm) (nm) GNFs 2,19 2,99 0,341740 6,4 GMC-1 2,08 2,8 0,344338 6,05

[104] Quando os GNFs são transformados em GMC-1, a estrutura de cristal do material muda. Dessa forma, observa- se uma redução da altura da pilha de cristal (Lc), do tamanho de cristalito no plano (La) e do número de camadas de grafeno no cristal (Nc) em GMC-1 devido ao processo purificação, limpeza e exfoliação ao qual o material foi submetido. O espaço interlaminar no GMC-1 aumenta devido ao processo de exfoliação apresentado no material. A altura da pilha de cristal (Lc) e o tamanho de cristalito no plano (La) experimentam uma redução devido ao processo de purificação e exfoliação. Distribuição de tamanho de partícula

[105] A distribuição de tamanho de partícula para a matéria-prima GNFs e o produto de acordo com o GMC-1 da invenção foi medida com um Mastersizer 3000 da Malvern Panalytical. O Mastersizer 3000 usa a técnica de difração a laser para medir o tamanho das partículas. Isso ocorre pela medição da intensidade da luz dispersa conforme um feixe de laser atravessa uma amostra de particulado disperso. Esses dados são então analisados para calcular o tamanho das partículas que criam o padrão de disseminação.

[106] A Figura 4A mostra a comparação da distribuição de tamanho de partícula em número de partículas para GNFs e GMC-1.

[107] A Figura 4B mostra a comparação da distribuição de tamanho de partículas de acordo com a porcentagem de partículas em volume de partículas para GNFs e GMC-1.

[108] Os parâmetros d(0,1), d(0,5) e d(0,9) podem ser observados nas Figuras, dn é indicado ao número de partículas e dv é indicado ao volume nas partículas.

[109] Para GNFs, o parâmetro dn(10) significa que os 10% do número de partículas apresentam um tamanho de 1,121 µm ou menor, o parâmetro dn(50) significa que os 50% do número de partículas apresentam um tamanho de 1,573 µm ou menor e o parâmetro dn(90) significa que os 90% do número de partículas apresentam um tamanho de 3,909 µm ou menor. Para GNFs, o parâmetro dv(10) significa que os 10% do volume da amostra são ocupados por partículas com um tamanho de 19,764 µm ou menor, o parâmetro dv(50) significa que os 50% do volume da amostra são ocupados por partículas com um tamanho de 57,711 µm ou menor e o parâmetro dv(90) significa que os 90% da amostra são ocupados por partículas com um tamanho de 103,114 µm ou menor.

[110] No caso de GMC-1, o parâmetro dn(10) significa que os 10% do número de partículas apresentam um tamanho de 0,313 µm ou menor, o parâmetro dn(50) significa que os 50% do número de partículas apresentam um tamanho de 0,394 µm ou menor e o parâmetro dn(90) significa que os 90% do número de partículas apresentam um tamanho de 0,577 µm ou menor. Para GMC-1, o parâmetro dv(10) significa que os 10% do volume da amostra são ocupados por partículas com um tamanho de 10,549 µm ou menor, o parâmetro de dv(50) significa que os 50% do volume da amostra são ocupados por partículas com um tamanho de 39,693 µm ou menor e o parâmetro dv(90) significa que os 90% da amostra são ocupados por partículas com um tamanho de 69,576 µm ou menor.

[111] A comparação na distribuição de tamanho de partícula em número e volume entre GNFs e GMC-1 mostra que GMC-1 possui uma menor distribuição de tamanho de partícula. Em suma, dn(90) para GNFs apresenta um tamanho de 3,909 µm ou menor para o número de partículas e um dv(90) de 103,114 µm ou menor para volume de partículas, ao passo que dn(90) de GMC-1 apresenta um tamanho de 0,577 µm ou menor em número de partículas e um dv(90) de 69,576 µm ou menor em volume de partículas. As Figuras 4A e 4B mostram claramente essa redução em número e volume de partículas em GMC-1 em comparação à matéria-prima usada (GNFs).

ATIVIDADE BIOLÓGICO Estatística

[112] Os dados mostrados são representados como médias ± SEMs de um número variável de experimentos. O teste t de Student foi usado para as 2 amostras em análise de variância uni ou bidirecional para >2 amostras (ANOVA), com um desenho pareado ou não pareado seguido por um teste de comparação múltipla. Os valores de P < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Exemplo 2: ENSAIOS DE TOXICIDADE EM LINHAGENS DE CÉLULAS HEP-G2

[113] Realizamos os testes com GMC-1 em células cultivadas (linhagem de hepatócitos Hep-G2) usadas em estudos farmacológicos e toxicológicos.

[114] Em 6 placas de Petri em poços, 300.000 células foram semeadas por poço e cultivadas com 10% de mídia de cultura suplementado com soro bovino fetal (por padrão, DMEM). As células foram mantidas em condições de incubadora controladas de 37°C, 5% de CO2 e umidade. Assim que atingiram confluência, foram privadas do soro durante 16 horas. O produto foi adicionado como suspensão a diferentes concentrações, mantendo o mesmo volume final durante 24 horas nas mesmas condições de manutenção controlada. Posteriormente, as células foram processadas e a viabilidade/toxicidade foram testadas complementarmente por dois testes indicados na ISSO supracitada: a) Exclusão de azul de tripano, que diferencia células vivas/mortas e b) Atividade metabólica por corante celular com MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazólio).

[115] Os resultados são mostrados na Figura 5. Os dados mostram que GMC-1 é atóxico na linhagem de células Hep-G2 cultivadas. Exemplo 3: CICATRIZAÇÃO DE FERIDA EM MODELO ANIMAL

[116] A cicatrização de ferida cutânea é um processo regenerativo universal para fechar a ferida e reconstruir a barreira epitelial e o tecido conjunto subjacente.

[117] Muitos fatores e condições sistêmicas são agentes causadores que comprometem a função dérmica. Após a lesão à pele, deve-se formar um novo epitélio para fechar a ferida.

[118] A cicatrização da ferida inclui proliferação de migração celular, diferenciação e formação de matriz extracelular. As feridas crônicas como venosa, pé diabético ou úlceras por pressão são caracterizadas por processos de cicatrização não resolvidos, inclusive aumento de colonização bacteriana e/ou infecção, e são causadas por outras condições e doenças, como diabetes mellitus, trauma, doenças inflamatórias, anormalidades metabólicas, distúrbios de sangramento, tabagismo, imunossupressão, desnutrição e obesidade.

[119] Realizamos ensaios de regeneração dérmica em um modelo roedor de cicatrização da ferida. A formulação de GMC-1 foi baseada em um hidrogel com gelatina como principal componente excipiente [X.J. Yang, et al., Polym. Int. 44 (1997) 448-452].

[120] O modelo animal usado é Rattus norvegicus, macho ou fêmea de 3 a 8 meses de idade com peso corporal entre 300 a 500 no início dos experimentos, n=18). Os ratos foram divididos em 2 grupos, tratados com uma formulação que contém o produto ou a mesma formulação sem o produto. Os animais foram anestesiados com isoflurano e a pele dorsal foi raspada. Após higienização com etanol a 70%, foram criadas 5 feridas de espessura na pele dorsal usando punções de biópsia dérmica de 4 mm de diâmetro. Quatro das feridas foram tratadas com um adesivo baseado em uma formulação que compreende GMC-1 ou não (controle). A 5ª biópsia foi deixada descoberta como um controle de fechamento. A formulação é aplicada todo segundo dia. O fechamento da ferida foi monitorado ao longo do tempo por medição planimétrica, na qual foram tiradas fotografias de cada ferida usando uma câmera digital (PowerShot Pro1, Canon) nos dias 0-2 e 4 após a lesão. A área da ferida foi analisada (JImage, NIH). A porcentagem de fechamento da ferida em cada timepoint foi derivada pela seguinte fórmula: (1-[tamanho atual da ferida/tamanho inicial da ferida])x 100. Esse valor é a porcentagem versus o valor de fechamentos da 5ª biópsia (controle interno do animal).

[121] No 4o dia, os animais foram sacrificados e a área da ferida cicatrizada foi excisada, fixada em 10% de formaldeído neutralizado durante 24 h e embebida em parafina. As seções de espessura de 3 µm foram desparafinados em xileno e reidratadas por imersão sucessiva em concentrações descendentes de etanol e foram obtidas as determinações histopatológicas (reepitelização, colagenização e infiltração inflamatória aguda). A epitelização de cada ferida foi pontuada com base nas pontuações individuais determinadas pela análise histopatológica comentada acima.

[122] Os resultados são mostrados na Figura 6. O GMC-1 aplicado topicamente regenera a derme in vivo.

[123] Após a eutanásia, os plasmas e as células mononucleares de sangue periférico (a principal população de leucócitos circulando no sangue) foram preservados e estudados. Obteve-se uma bioquímica geral dos plasmas e diferentes marcadores renais, hepáticos e inflamatórios foram estudados (creatinina, transaminases e proteína C-reativa de amplo espectro, entre outros). As PBMCs foram manipuladas para estudar a expressão do marcador pró-inflamatório Interleucina 1-beta. Essa alteração de expressão foi determinada usando transcripção reversa – reação de cadeia de polimerase quantitativa (RT-qPCR). Foram amplificados 100 ng de DNA convertido (cDNA) do mRNA original extraído das diferentes amostras com ensaios de expressão de gene comercial (TaqMan, Life Technologies). Os valores foram normalizados contra um controle endógeno (beta-actina) e então a alteração de vezes na expressão foi realizada usando o método 2^-deltadeltaCt.

[124] Os resultados são mostrados na Figura 7. O GMC-1 aplicado topicamente sobre uma área cutânea ferida é inofensivo em termos de alterações sistemas dos marcadores renais, hepáticos ou inflamatório in vivo.

Claims (14)

REIVINDICAÇÕES

1. NANOMATERIAL DE GRAFENO SELECIONADO A PARTIR DE NANOFIBRAS DE GRAFENO, caracterizado pelo nanomaterial de grafeno apresentar uma distribuição de tamanho de partícula tendo um dn(90) de 0,60 µm ou menor em número de partícula e um dv(90) de 80,00 µm ou menor em volume de partícula, conforme medido pelo analisador de partículas por difração a laser.

2. NANOMATERIAL DE GRAFENO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por sua área de superfície específica BET estar compreendido entre 100 e 500 m2/g.

3. NANOMATERIAL DE GRAFENO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por sua área de superfície específica BET estar entre 300 e 350 m2/g.

4. NANOMATERIAL DE GRAFENO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por seu volume de poro estar entre 0,35 e 0,40 cm3/g.

5. NANOMATERIAL DE GRAFENO, de grafeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por sua área de superfície específica BET estar entre 300 e 350 m2/g e seu volume de poro estar entre 0,35 e 0,40 cm3/g.

6. NANOMATERIAL DE GRAFENO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelas impurezas no nanomaterial serem inferiores a 0,01% em peso.

7. NANOMATERIAL DE GRAFENO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por ser para uso como um medicamento.

8. NANOMATERIAL DE GRAFENO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por ser para uso no tratamento de feridas, cicatrizes, eczema, queimaduras da pele, úlceras cutâneas ou outras lesões cutâneas.

9. NANOMATERIAL DE GRAFENO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por ser para uso, de acordo com a reivindicação 8, no tratamento de lesões cutâneas produzidas por psoríase, diabetes, câncer, infecções, acne ou redução da circulação sanguínea.

10. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender um produto de nanomaterial de grafeno, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

11. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por ser adequada para uso tópico.

12. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por estar em uma forma selecionada a partir de um creme, uma pomada, uma microemulsão, um gel, uma emulsão em gel, uma pasta, uma espuma, uma tintura, um adesivo, uma curativo, uma membrana, uma matriz ou um sistema de administração transdérmica.

13. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por ser um hidrogel ou um creme.

14. MÉTODO PARA PREPARAR O PRODUTO A PARTIR DE NANOFIBRAS BRUTAS DE GRAFENO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por compreender as etapas de: a) Purificação do material bruto de grafeno, utilizando preferencialmente um ácido forte, para remover qualquer metal ou impureza presente no material bruto de grafeno;

b) Redução do tamanho da partícula do nanomaterial de grafeno purificado, preferencialmente através de um processo de exfoliação, a uma distribuição de tamanho de partícula tendo um dn(90) de 0,60 µm ou menor em número de partículas e um dv(90) de 80,00 µm ou menor em volume de partícula, conforme medido pelo analisador de partículas por difração a laser, c) Opcionalmente, sujeição do produto obtido a um processo de despirogenização.