KR20210031495A - 그래핀 제품 및 그 치료 용도 - Google Patents

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마르틴 마르티네즈 로비라
호제 안토니오 마르티네즈 로비라
마르시아 델 프라도 라빈 로페즈
아마야 로메로 이즈퀴에르도
마누엘 로드리게스 푸욜
디에고 로드리게스 푸욜
세르히오 데 프루토스 가르시아
메르세데스 그리에라 메리노
마르코 안토니오 하템 바키에로
아나 이사벨 오로즈코 아구도
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그래페나노 메디컬 케어, 에스. 엘.
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Abstract

그래핀 나노 섬유(GNF)에서 얻은 그래핀 제품으로, 수정된 결정 구조와 한정된 크기 분포를 갖는다. 이 제품은 독성이 없으며 상처 치유 및 피부 외형 개선과 같은 유용한 생물학적 특성을 갖는다. 이 제품은 치료에 사용될 수 있다.

Description

그래핀 제품 및 그 치료 용도
본 발명은 새로운 그래핀 제품, 그의 조성물 및 치료에서의 그의 용도에 관한 것이다.
그래핀 기반 또는 그래핀 관련 물질 군은 2010년 노벨 물리학상 이후 최근 주목을 받고 있으며, 이후로 에너지, 전자, 센서, 조명 처치, 의학 및 환경 분야에서 이러한 물질에 대한 수많은 응용 분야가 폭발적으로 발전하였다. 이 물질군의 "기초" 요소인 그래핀은 육방정계 벌집 격자(hexagonal honeycomb lattice)에 배열된 sp2-하이브리드 탄소 원자로 이루어진 2차원 물질이다.
그래핀-관련 물질의 확장된 군은 그래핀(단일층 및 다중층), 흑연, 폴리사이클릭 방향족 탄화수소, 탄소 나노튜브, 풀러렌, 상이한 차원의 다양한 그래핀 나노구조체(예를 들어, 그래핀 나노섬유, 그래핀 나노입자, 그래핀 양자점, 그래핀 나노리본, 그래핀 나노메시, 그래핀 나노디스크, 그래핀 폼, 그래핀 나노기둥), 다른 그래핀-관련 물질, 치환된 그래핀-관련 물질(예를 들어, N, B, P, S, Si 등) 및 반응성 작용기들(예를 들어, 카르복실기, 에스테르, 아미드, 티올, 히드록실기, 디올기, 케톤기, 설포네이트기, 카르보닐기, 아릴기, 에폭시기, 페놀기, 포스폰산, 아민기, 포르피린, 피리딘, 중합체 및 이들의 조합)과 기능화된 그래핀-관련 물질의 임의의 조합을 포함한다.
몇몇 간행물은 의료 용도를 위한 그래핀 물질의 사용을 기술한다.
US2006/0134096은 그래핀 함유 조성물, 특히 그래핀을 포함하는, 풀러린 또는 나노튜브가 아닌, 비-다공성 탄소의 의학적 사용을 위한 조성물 및 방법을 기술하고 있다. 이들은 상처, 독소의 흡착제 또는 혈액투석에 국소적으로 사용된다.
EP313353은 신경퇴행성 질환을 예방 또는 치료하기 위한 그래핀 나노구조-기반 약학 조성물을 개시한다. 상기 그래핀 나노구조체는 단백질 미스폴딩에 의한 피브릴 형성을 억제한다.
US2014/0120081은 반응성 산소종의 수준을 감소시킴으로써 대상체에서 산화 스트레스를 치료하기 위한 탄소 나노물질의 사용을 개시한다. 탄소 나노물질은 기능화될 수 있는 나노튜브, 그래핀, 그래핀 나노리본, 흑연, 흑연 산화물 등으로부터 선택된다.
GB2532449는 암 줄기세포의 증식을 억제함으로써 암의 치료, 예방 또는 방지에 사용하기 위한 기능화된 나노물질을 기술하고 있으며, 여기서 나노물질은 단일층 그래핀, 수-층 그래핀, 나노-흑연, 단일-벽 또는 다중-벽 탄소 나노튜브, 풀러렌, 탄소 나노뿔, 탄소 나노섬유, 또는 비정질 또는 부분적으로 비정질화된 나노카본 또는 이들의 혼합물이다. 산화 그래핀이 바람직하다.
국제 나노메디신 저널(International Journal of Nanomedicine), 2016:11, 1927~1945 면에서 구라나단 에스.와 김 제이-에이치.는 그래핀과 그래핀 관련 물질의 합성, 독성, 생체적합성 및 생물의학 응용에 대해 검토한 바 있다. 이 문헌에서 논의된 바와 같이, 이러한 제품들의 다수는 여전히 관련 독성과 생체적합성의 문제점들을 보인다. 그래핀의 독성 효과는 크기 및 분포, 표면 전하, 표면 영역, 층 수, 측면 치수, 표면 화학, 순도, 미립자 상태, 표면 작용기 및 형상과 같은 물리화학적 성질에 의해 영향을 받을 수 있다. 항암 치료, 광열 요법, 약물 전달, 유전자 형질 감염, 바이오센싱, 이미징 및 조직 공학은 이 검토에서 언급된 생물의학 응용 분야 중 하나이다.
독성이 낮거나 전혀없고, 생체적합성이 좋으며, 치료에 유용한 생물학적 효과 및 응용을 제공할 수 있는 새로운 그래핀 기반 물질이 여전히 요구되고 있다.
본 발명자들은 독성이 매우 낮거나 없고, 치료(therapy)에 유용한, 현저한 특성을 갖는 새로운 그래핀 제품을 발견하였다.
첫번째 양태에서, 본 발명은 그래핀 나노섬유로부터 선택된 그래핀 나노물질에 관한 것으로, 상기 그래핀 나노물질은 레이저 회절 입자 분석기로 측정시, 입자 크기 분포가 입자 수 기준 dn(90)이 0.60 ㎛이하이고, 입자 부피기준 dv(90)이 80.00 ㎛ 이하인 입자 크기 분포를 갖는다.
바람직하게는, 그래핀 나노물질의 BET 비표면적은 100 내지 500 ㎡/g, 더 바람직하게는 300 내지 350 ㎡/g이다.
다른 실시예에서, 그래핀 나노물질의 공극 부피는 0.35 내지 0.40 ㎤/g 이다.
또한, 그래핀 나노물질의 불순물은 0.01 중량% 미만인 것이 바람직하다.
다른 양태에서, 본 발명은 약품(medicament)으로서의 용도인 상기 정의된 그래핀 나노 물질에 관한 것이다. 일 실시예에서, 상기 약품은 상처, 습진, 건선, 흉터, 궤양 및 기타 피부 통합성(integrity of skin)의 붕괴를 초래하는 상태의 치료를 위한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 위에 정의된 그래핀 나노물질을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 위에 정의된 그래핀 나노물질을 치료에 사용하는 용도에 관한 것이다.
도 1.- GMC-l의 라만 분광법
도 2.- GMC-l의 N2 흡착 - 탈착
도 3a- GNF 원료의 X-선 회절
도 3b.- GMC-1의 X-선 회절
도 4a.- GNF 원료와 GMC-1에 대한 입자 수 기준 입자 크기 분포 비교.
도 4b.- GNF 원료와 GMC-1에 대한 입자 부피 기준 입자의 비율에 따른 입자 크기 분포 비교.
도 5.- 2x GMC-1으로 24 시간 동안 처치된 배양된 Hep-G2 세포의 독성 분석. A) 트리판 블루 세포 배제에 의해 결정된 생존력 및 B) 비히클 1x 및 10x 농도의 GMC-1을 사용한 MTT에 의해 결정된 세포 대사. 값들은 평균 +/- SEM으로 표시됨.
도 6.- 등 부위(dorsal area)에 걸쳐 달성된 생검에 기초한 진피 상처치유 설치류 모델(Rattus Norvegicus)이 2x GMC-l을 포함하는 제제 또는 이를 포함하지 않는 제제(CT)로 2일마다 국소적으로 처치되었다. A) 상처 부위 폐쇄 시간-코스, B) 진피 재생(콜라겐 형성 및 상피재생) 및 C) 4일마다 급성 염증성 침윤물(infiltrate). 상기 값들은 동물 당 내부 조절 상처(어떠한 제제로도 처리되지 않음)에 대해 백분율로 나타낸 것이고 평균 +/-SEM 으로 표시된다. * = P < 0.05 vs CT, 통계적으로 유의미한 값.
도 7.- 등 부위에 걸쳐 달성된 생검에 기초한 진피 상처치유 설치류 모델(Rattus Norvegicus)이 2x GMC-l을 포함하는 제제 또는 이를 포함하지 않는 제제(CT)로 2일마다 국소적으로 처치된 것에 대한 전신성(systemic) 생화학적 분석. 4일마다 그리고 안락사 이후, A) 크레아티닌, B) 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제(AST) 및 wrCRP(광범위 C-반응성 단백질)를 측정하였다. D) 페리퍼릭(periferic) 혈액 단핵 세포(PBMC)에서, mRNA 발현 폴드 변화가 전신 염증 마커에 대한 RT-qPCR 에 의해 인터루킨 1 -β (IL-l-β) 발현에 의해 결정되었다. 상기 값은 평균 +/-SEM 으로 표시된다.
그래핀 원료
본 발명에서, 용어 "그래핀"은 서로 공유 결합된 다수의 탄소 원자를 갖는 다환 방향족 분자를 형성하는 물질을 의미한다. 공유 결합된 탄소 원자들은 반복 단위로서 6-멤버 링을 형성한다.
용어 "그래핀 나노섬유" (GNFs)는 적층된 콘, 컵 또는 플레이트로서 배열된 그래핀 층을 갖는 원통형 나노구조체를 지칭한다. 그래핀 평면 표면은 섬유 축으로부터 경사져 있으며, 이는 탄소 나노섬유들의 내부 및 외부 표면들 상에 존재하는 평면 에지들을 노출시킨다.
용어 "그래핀 나노튜브" (GNTs)는 그래핀의 단일 벽 또는 다중-벽 동심 원통을 지칭하며, 여기서 기저면은 튜브와 같이 원통형 및 중공이기 때문에 막대기와 같이 일반적으로 내부에 빈 공간이 존재하지 않는 그래핀 나노섬유와 비교하여 덜 반응성인 표면을 형성한다.
본 발명의 제품은 예상치 못한 생물학적 특성을 갖는 의료 등급 물질을 얻기 위해 일련의 정제 및 처치를 받는 GNF로부터 유도된 탄소-기반 나노물질이다.
출발 탄소 나노물질은 그래핀 기반 물질(그래핀 나노 섬유)이다. 일 실시예에서, 본 발명의 제품을 제조하는데 사용되는 그래핀 나노섬유는 입자 수 기준(in number of particle) 입자 크기 분포 dn(90)이 4.0 ㎛ 이하이고, 입자 부피 기준(in volume particle) 105.00 ㎛ 이하의 dv(90)을 갖는다. 바람직하게는, 이들은 약 250-400 ㎡/g 의 표면적을 갖는다.
본 발명의 제품을 얻기 위해 사용되는 원료는 탄화규소 상 에피택셜 성장, 화학기상증착, 흑연의 마이크로기계적 또는 기계적 박리, 흑연의 화학적 산화, 열적, 화학적 또는 다단계 환원을 이용한 흑연 산화물의 환원, 금속 촉매 상에서의 탄화수소의 촉매 분해, 언롤링(unrolling) 탄소 나노튜브, 전기 방사 등의 광범위한 방법에 따라 합성될 수 있다.
탄화규소 상 에피택셜 성장은 기판으로 사용되는 단결정 탄화규소 결정(SiC) 상에서 그래핀으로부터 분리된 단일층들이 합성될 수 있는 방법이다. 이 방법은 고온(>1100 ℃) 및 고진공으로 SiC 웨이퍼를 가열하는 것을 포함한다. 언급된 조건 하에서 실리콘 원자는 표면에서 그래핀의 에피택셜 성장을 얻으며 승화한다(탄소 원자는 스스로 재배열하여 그래핀을 형성한다) [셔터, 피., 애피택셜 그래핀: 실리콘은 그 장면에서 어떻게 떠나는가. 네이쳐 머티리얼스, 2009. 8(3): 171-172 면.]
화학기상증착 방법에서 탄소원은 촉매 기판상에서 촉매적으로 분해된다. 촉매 표면은 탄화수소의 열분해 후 금속 내부에서 생성된 탄소 원자의 분해를 유발한다 [자코버거, 알.엠. 등, 화학기상증착을 통한 간단한 그래핀 합성. 화학 교육 저널, 2015. 92(11): 1903-1907 면, 라빈-로페즈, 엠.피. 등, 다결정 니켈 위로 증착된 그래핀의 두께 제어. 화학 뉴 저널, 2015. 39(6): 4414-4423 면]
흑연의 미세기계적 박리는 고체 표면체 또는 접착 테이프를 이용하여, 미세 스크래핑에 의해 박편에서 상기 고체의 최외각 층을 분리하는 것으로 구성된다 [가임, 에이.케이. 및 케이.에스. 노보셀로프, 그래핀의 상승. 네이쳐 머티리얼스, 2007. 6(3): 183-191 면] 기계적 박리가 초음파를 이용하여 유기 또는 수성 용매에 현탁된 흑연을 형성하는 시트를 분리하는 것을 허용한다. 얻어진 재료는 고품질이지만 낮은 수율과 높은 생산 비용을 감안할 때 산업적 관심이 크지 않다 [로티아, 엠. 등, 계면 활성 성분/물 용액에서 흑연의 박리에 의한 그래핀의 액상 생산. 미국 화학 학회지, 2009. 131(10): 3611-3620 면]
또한, 본 발명의 제품을 제조하는데 특히 바람직한 그래핀 나노섬유 (GNFs)를 합성하기 위해 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 탄소 나노섬유를 위한 화학기상증착 방법은 탄소원이 촉매의 존재하에서 분해되어 GNFs를 성장하는 촉매법이다. 촉매로는 철, 니켈, 코발트, 구리와 같은 전이금속 촉매 입자가 사용된다. CVD 공정은 500 내지 1200℃ 범위의 온도에서 이루어진다 [마틴-굴론, 아이. 등, 부유 촉매 반응기에서 Fe와 Ni 촉매를 사용하여 생산된 탄소 나노 섬유들의 차이점. 카본, 2006. 44(8): 1572-1580 면] 전기 방사는 GNF의 대체 생산 방법이다. 이 방법에서, 졸-겔 공정은 미세 팁을 갖는 니들을 필요로 한다. 이를 위해, 니들의 드롭(drop)에 높은 전압이 인가되어, 용액이 니들로부터 타겟쪽으로 나오게 한다. 용액에 대한 표면 장력이 충분히 높으면 미세한 방울이 들어가는 것을 피하고, 섬유질 구조가 추출되어 목적물 내에 수집될 수 있다 [장, 엘. 등, 리뷰: 전기 방사된 폴리아크릴로니트릴로부터의 탄소 나노섬유 및 그 용도. 재료 과학 저널, 2014. 49(2): 463-480 면]
본 발명의 합성물을 제조하는데 사용되는 다공성 흑연 재료의 평균 직경 및 길이는 투과 전자현미경(TEM)에 의해 측정된다.
정제 및 처치
상기 보고된 방법에 따라 합성된 그래핀 나노물질은 본 발명의 그래핀-기반 의료 등급 물질을 합성하기 위한 원료로 사용된다. 그 후, 합성 공정 동안 그래핀 나노물질 구조체에 도입된 임의의 금속 또는 불순물을 제거하기 위해, 바람직하게는 강산(H2S04, HCl, HF, HNO3, HBr 등)을 사용하는 정제 공정이 그래핀 나노 원료 물질에 수행된다. 그래핀 물질의 특성에 영향을 주지 않으면서 불순물을 제거할 수 있는 임의의 공정이 사용될 수 있다. 산, 염산 또는 불화수소산 중에서 특히 바람직하지만, 당업자는 존재하는 불순물의 양 및 유형에 따라 산 및 조건을 선택할 것이다. 정제 공정은 바람직하게는 수 시간(12 내지 24 시간) 동안 저온(20 내지 50 ℃)에서 일어난다. 정제 공정을 위해 용액을 사용하면, 정제된 그래핀 나노물질은 중성 pH가 될 때까지 밀리포어(Millipore) 물로 세척될 수 있고, 그런 다음 건조, 예를 들어 진공 건조될 수 있다.
정제된 그래핀 나노물질은 또한 감소된 입자 크기 분포를 달성하도록 처치되어, 의료 및 미용적 용도에 적합한 제품이된다. 정제된 그래핀 나노 물질은, 예를 들어, 그 크기를 감소시키고 그 특성을 변형시키는 과정을 겪는다. 일 실시예에서, 이는 예를 들어 초음파 처치, 습식 밀링(wet milling) 또는 하이브리드(hybrid) 프로세스를 통해 실온에서 박리 공정을 겪는다. 초음파 처치가 공정의 단순화로 인해 특히 바람직하고, 이는 원하는 입자 크기 분포의 달성 여부 체크를 위해 샘플들을 통해 추가적으로 모니터링될 수 있다. 그 후, 10-100 ㎛ 사이의 입자 크기를 제어하기 위한 선택적인 한정 단계(delimination process)가 수행된다. 당업자는 입자 크기 분포를 선택하는데 필요한 기술을 쉽게 결정할 것이다. 예를 들어, 이 단계는 여과 또는 원심분리, 바람직하게는 가령 소결 유리 필터를 통한 진공 여과를 통해 달성할 수 있다. 상기 한정 단계는 바람직하게는 입자 수 기준 60 ㎛ 이하의 dn(90) 및 입자 부피 기준 80.00 ㎛ 이하의 dv(90)을 갖는 입자를 초래할 수 있다.
마지막으로, 상기 등급 물질이 세균성 오염 또는 내독소(endotoxin)를 포함하는 다른 독성 화합물의 흔적을 끌지않고, 무균 및 멸균 상태를 유지하기 위해, 상기 물질은 또한 열, 바람직하게는 200-500 ℃ 에서 10-60 분 동안, 가열에 의한 표준 발열성 물질 제거(standard depyrogenization) 공정을 겪을 수 있다.
결과적인 입자 크기 분포는, 예시들에 사용된 바와 같이, 입자 크기 분석기, 예를 들어 맬번 파날리티컬(Malvern Panalytical)에서 나온 마스터사이저 2000(Mastersizer 2000)과 같은 당업계에서 흔한 수단에 의해 결정될 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 다음 단계를 포함하는, 그래핀 나노섬유 원료로부터 본 발명의 제품을 제조하는 방법이다:
a) 상기 그래핀 원료 내에 존재하는 임의의 금속 또는 불순물을 제거하기 위해, 바람직하게는 강산을 사용하여, 상기 미가공 그래핀 물질을 정제하는 단계,
b) 레이저 회절 입자 분석기에 의해 측정된 바에 따라, 입자 수 기준 0.60 ㎛ 이하인 dn(90) 및 입자 부피 기준 80.00 ㎛ 이하의 dv(90)을 갖는 입자 크기 분포로, 바람직하게는 박리 공정을 통해, 정제된 그래핀 나노물질의 입자 크기를 감소시키는 단계,
c) 선택적으로, 얻어진 제품에 발열성 물질 제거 공정을 적용하는 단계.
단계 (b) 는 단계 (c) 이전에 입자 크기에 따라 입자를 한정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 한정 단계는 여과 또는 원심분리, 바람직하게는 진공 여과에 의해 달성된다.
본 발명의 명세서에서, 입자 수 기준 0.60 ㎛ 이하인 dn(90) 및 입자 부피 기준 80.00 ㎛ 이하의 dv(90)을 갖는 입자 크기 분포가 단계 (b) - 선택적으로 추가 한정 단계, 바람직하게는 여과 단계를 포함 - 에 의해 수득될 수 있다. 바람직하게, 상기 여과는 1 내지 20 ㎛, 바람직하게는 4 내지 20 ㎛, 보다 바람직하게는 5 내지 16 ㎛ 사이의 공극 크기의 소결된 유리 필터를 이용한 진공 여과이다.
제품
본 발명의 제품은 입자 수 기준 약 0.60 ㎛ 의 dn(90) 및 입자 부피 기준 80.00 ㎛ 이하, 바람직하게는 70.00 ㎛ 이하의 dv(90)을 갖는 입자 크기 분포를 갖는 정제된 그래핀 나노물질이다.
입자 크기 분포는 레이저 회절 입자 크기 분석기에 의해 측정된다. 입자 크기 분포 D50은 누적 분포의 50% 에서의 입자 직경의 값이다. D50이 특정 값을 가지면, 샘플 내의 입자들의 50%는 이 값보다 크고, 50%는 더 작다. 입자 크기 분포는 대상 샘플에서 모든 크기의 총 수에 대한 백분율로 주어진 다양한 크기 범위 각각에 속하는 입자의 수이다. 입자 크기 분포를 설명하는 가장 널리 사용되는 방법은 누적 질량의 10 %, 50 % 및 90 %에 대한 절편(intercept)인 d값들(d10, d50 및 d90)이다.
이 값들은 입자가 오름차순 질량 기준으로 배열될 때 샘플 질량을 지정된 백분율로 나누는 재료의 직경으로 생각할 수 있다. d10은 샘플 질량의 10 %가 이 값보다 작은 직경을 가진 입자로 구성되는 직경이다. d50은 샘플 질량의 50 %가 더 작고 샘플 질량의 50 %가 더 큰 입자의 직경이다. d90은 샘플 질량의 90 %가 이 값보다 작은 직경을 가진 입자로 구성되는 직경이다. 이 값들은 입자 수(dn) 및 입자 부피(dv)에 적용할 수 있다.
입자 수 기준 dn(90)인 분포란 샘플에 포함된 총 재료 수의 90 %까지 및 이를 포함하는 크기 분포의 지점을 의미한다.
입자 부피 기준 dv(90)인 분포란 샘플에 포함된 총 재료 부피의 90%까지 및 이를 포함하는 크기 분포의 지점을 의미한다.
본 발명의 제품의 입자 크기 분포는 맬번 파날리티컬의 마스터사이저 3000으로 측정된다.
본 명세서에서, "비 표면적(SSA)"이라는 용어는 단위 질량당 물질의 총 표면적을 의미한다.
본 발명에 기술된 다공성 및 비 표면적의 특성은 이 분야의 기술자에게 잘 알려진, 질소를 흡착 물질로 사용하는 물리적 흡착 기법에 적용되는, Brunnauer-Emmet-Teller("BET") 방법을 사용하여 측정된다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 제품의 BET 표면적은 300 내지 350 ㎡/g 이다.
다른 실시예에서, 본 발명의 제품의 기공 부피는 0.35-0.40 cm3/g이다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 제품은 300-350 m2/g의 BET 표면적 및 0.35-0.40 cm3/g의 기공 부피를 갖는다.
본 발명의 제품은 그래핀 나노 섬유의 형태이다.
조성물
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 그래핀 제품 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물(pharmaceutical composition)에 관한 것이다.
본 명세서에 사용되는 "약학 조성물"은 생리학적으로 허용가능한 조성물 및 분자 본체(molecule entity)에 관한 것으로, 인간 또는 동물에 투여될 때, 일반적으로 알러지 반응 또는 위 질환, 어지럼증 등과 같은 유사한 부정적 반응을 일으키지 않는 조성물 및 분자 본체에 관한 것이다. 바람직하게는, 용어 "약학적으로 허용가능한"은 주 또는 연방 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 및/또는 유럽의 미국 약전에 포함되거나 및/또는 동물, 보다 구체적으로는 사람에 대한 사용 용도로 일반적으로 10개의 인식된 약전에 포함된 것을 의미한다.
용어 "부형제"는 활성 성분과 함께 투여되는 비히클, 희석제 또는 보조제를 의미한다. 약학 부형제는 물, 오일 등의 멸균액일 수 있는데, 여기에는 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 원료로부터 기원된 것, 이를테면 땅콩 오일, 대두유, 광유, 참기름 및 이와 유사한 것이 포함된다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 약학 조성물은 예를 들어 크림, 로션, 연고, 마이크로 에멀젼, 지방 연고, 겔, 에멀젼-겔, 페이스트, 폼, 팅크, 용액, 패치, 밴드 및 약용 시스템과 같이 피부에 국소 투여하기에 적합하다. 가장 바람직한 것은 크림 또는 에멀젼 겔이다.
크림 또는 로션은 오일-인-워터 에멀젼이다. 사용될 수 있는 유성 베이스는 지방 알코올, 특히 12 내지 18개의 탄소 원자를 함유하는 것들, 예를 들어 라우릴, 세틸 또는 스테아릴 알코올, 지방산, 특히 10 내지 18개의 탄소 원자를 함유하는 것들, 예를 들어 팔미트 산 또는 스테아르 산, 지방 산 에스테르, 예를 들어 글리세릴 트리카프릴로카프레이트(중성 오일) 또는 세틸 팔미테이트, 액체 내지 고체 왁스, 예를 들어 이소프로필 미리스테이트, 양모 왁스 또는 밀랍 및/또는 탄화수소, 특히 액체, 반고체 또는 고체 물질 또는 이들의 혼합물, 예를 들어 석유 젤리(페트롤레이텀, 바셀린) 또는 파라핀 오일이다. 적합한 유화제는 주로 친수성 특성을 갖는 표면 활성 물질, 이를테면 상응하는 비이온성 유화제, 예를 들어 폴리알콜의 지방산 에스테르 및/또는 이의 에틸렌 옥사이드 부가물, 특히 (폴리)에틸렌 글리콜을 갖는 상응하는 지방산 에스테르, (폴리)프로필렌 글리콜 또는 소르비톨, 특히 10 내지 18개의 탄소 원자를 함유하는 지방산 모이어티, 특히 부분 글리세롤 지방산 에스테르 또는 폴리히드록시에틸렌 소르비탄의 부분 지방산 에스테르, 이를테면 폴리글리세롤 지방산 에스테르 또는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르(T weens), 및 또한 폴리옥시에틸렌 지방 알코올 에테르 또는 지방산 에스테르, 특히 12 내지 18개의 탄소 원자를 함유하는 지방 알코올 모이어티 및 특히 10 내지 18개의 탄소 원자를 함유하는 지방산 모이어티, 예컨대 폴리히드록시 에틸렌 글리세롤 지방산 에스테르(예를 들어, Tagat S), 또는 상응하는 이온성 유화제, 이를테면 지방 알코올 설페이트의 알칼리 금속 염, 특히 지방 알코올 모이어티 내에 12 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 것, 예를 들어 일반적으로 세틸 알코올 또는 스테 아릴 알코올과 같은 지방 알코올 존재하에 사용되는 나트륨 라우릴 설페이트, 나트륨 세틸 설페이트 또는 나트륨 스테아릴 설페이트이다. 수성 상(aqueous phase)에 대한 첨가제는 특히 크림이 건조되는 것을 방지하는 제제, 예를 들어 글리세롤, 소르비톨, 프로필렌 글리콜 및/또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리 알코올과 같은 습윤제, 그리고 방부제, 향수, 겔화제 등이다.
연고는 최대 70%, 바람직하게는 약 20% 내지 약 50%의 물 또는 수성 상을 함유하는 워터-인-오일 에멀젼이다. 지방 상(fatty phase)으로 적합한 것은 특히 탄화수소, 예를 들어 석유 젤리, 파라핀 오일 및/또는 경질 파라핀이며, 이는 수분 결합 능력을 개선하기 위해 바람직하게는 가령 세틸 알콜 또는 양모 왁스 알코올, 또는 양모 왁스 또는 밀랍과 같은 지방 알코올 또는 그것의 에스테르 등의 적절한 히드록시 화합물을 함유한다. 유화제는 상응하는 친유성 물질, 예를 들어 소르비탄 지방산 에스테르(Span), 예를 들어 소르비탄 올레에이트 및/또는 소르비탄 이소스테아레이트 등의 상술한 유형의 물질이다. 수성 상에 대한 첨가제는 특히 습윤제, 예컨대 폴리알콜, 예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨 및/또는 폴리에틸렌 글리콜, 그리고 방부제, 향료 등이다.
마이크로 에멀젼은 하기 4개의 성분들을 기초로 하는 등방성 시스템이다: 물, 계면 활성 성분(예를 들어, 장력 활성 성분), 비극성 또는 극성 오일과 같은 지질(예를 들어, 파라핀 오일, 또는 올리브 또는 옥수수 오일과 같은 천연 오일), 및 알코올 또는 친유성 그룹을 함유하는 폴리 알코올(예를 들어, 2-옥틸도데칸올 또는 에톡살화된 글리세롤 또는 폴리 글리세롤 에스테르). 필요에 따라 다른 첨가제를 마이크로에멀젼에 첨가할 수 있다. 마이크로 에멀젼은 크기가 200nm 미만인 미셀(micell) 또는 입자를 가지며 투명하거나 반투명 시스템이며 자발적으로 형성되고 안정적이다. 지방 연고는 물이 없으며, 특히 탄화수소를 베이스로 함유하는데, 예를 들어 파라핀, 석유 젤리 및/또는 액체 파라핀, 또한 천연 또는 부분 합성 지방, 예를 들어 글리세롤의 지방산 에스테르, 예를 들어 코코넛 지방산 트리글리세라이드, 또는 바람직하게는 경화된 지방, 예를 들어 수소화 땅콩 오일, 피마자 오일 또는 왁스, 또한 글리세롤의 지방산 부분 에스테르, 예를 들어 글리세롤 모노-및 디-스테아레이트, 및 또한 예를 들어 수분 흡수 능력을 증가시키는 지방 알코올, 유화제 및/또는 연고와 관련하여 언급된 첨가제를 함유한다.
겔과 관련하여, 수성 겔, 무수 겔 및 수분 함량이 낮은 겔로 구분되며, 겔은 팽윤성 겔 형성 물질로 구성된다. 무기 또는 유기 거대 분자를 기반으로 한 특히 투명한 하이드로 겔이 사용된다. 겔 형성 특성을 갖는 고 분자량 무기 성분은 알루미늄 실리케이트, 예를 들어 벤토나이트, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 예를 들어 비검(Veegum), 또는 콜로이드 규산, 예를 들어 에어로실(Aerosi) 등의 주로 수분 함유 실리케이트이다. 고 분자량 유기 물질로는 예를 들어 천연, 반합성 또는 합성 거대 분자가 사용된다. 천연 및 반합성 중합체는 예를 들어 셀룰로스, 전분, 트라가 칸트, 아라비아 고무 및 한천, 젤라틴, 알긴산 및 이의 염, 예를 들어 알긴산 나트륨과 같은 매우 다양한 탄수화물 성분을 함유하는 다당류로부터 유도되고, 그 유도체, 예컨대 저급 알킬 셀룰로오스, 예를 들어 메틸-또는 에틸-셀룰로오스, 카르복시-또는 히드록시-저급 알킬 셀룰로오스, 예를 들어 카르복시 메틸-또는 히드 록시 에틸-셀룰로오스이다. 합성 겔 형성 거대 분자의 성분은 예를 들어 비닐 알코올, 비닐 피롤리딘, 아크릴 또는 메타크릴 산과 같은 적절하게 치환된 불포화 지방족 화합물이다.
에멀젼 겔("에멀겔"이라고도 함)은 겔의 특성과 오일-인-워터 에멀젼의 특성을 결합한 국소 조성물을 이른다. 이것은 겔과는 달리 지방을 회복시키는 특성으로 인해 제형이 마사지되도록 하는 한편, 동시에 피부에 직접 흡수되는 것이 상쾌한 특성으로 경험된다. 또한 친유성 활성 성분에 대한 용해도가 증가하는 것을 관찰 할 수 있다. 오일-인-워터 에멀젼에 비해 에멀젼 겔의 한 가지 장점은 추가 알코올 성분(존재한다면)의 증발로 인한 냉기로 인해 발생하는 향상된 냉각 효과에 있다.
폼(foam)은 예를 들어 가압 용기로부터 투여되며 에어로졸 형태의 액체 오일-인-워터 에멀젼이고; 프로판 및/또는 부탄 등의 알칸과 같은 비치환 탄화수소가 추진제로 사용된다. 유 상(oil phase)으로, 특히 탄화수소, 예를 들어 파라핀 오일, 지방 알코올, 예를 들어 세틸 알코올, 지방산 에스테르, 예를 들어 이소 프로필 미리스테이트 및/또는 기타 왁스가 사용된다. 유화제로서, 특히 폴리 옥시 에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르(Tweens)와 같이 주로 친수성 특성을 갖는 유화제 및 소르비탄 지방산 에스테르(Spans)와 같이 주로 친유성 특성을 갖는 유화제의 혼합물이 사용된다. 방부제 등과 같은 통상적인 첨가제도 첨가된다. 팅크(tinture) 및 용액은 일반적으로 에탄올 베이스를 갖는데, 여기에 물이 첨가될 수 있고, 특히 증발 감소를 위한 습윤제로서 이를테면 글리세롤, 글리콜 및/또는 폴리에틸렌 글리콜 등의 폴리 알콜, 및 에탄올에 의해 피부에서 제거된 지방 물질의 대체물로 지방 복원 물질, 예를 들어 저 분자량 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤을 갖는 지방산 에스테르, 즉 수성 혼합물에 용해되는 친유성 물질 및, 필요한 경우, 기타 부가물 및 첨가제가 첨가된다. 적절한 팅크 또는 용액은 적절한 장치를 사용하여 스프레이 형태로 적용될 수도 있다.
본 발명의 그래핀 제품을 -특히- 국부적으로 전달하는 경피 치료 시스템은 유효량의 그래핀 제품과 함꼐 선택적으로 담체(carrier)를 함유한다. 유용한 담체는 피부를 통한 활성 성분의 통과를 돕기 위해 흡수 가능한 약리학적 적합한 용매를 포함한다. 경피 전달 시스템은 예를 들어 (a) 기질(= 지지층 또는 필름), (b) 활성 성분, 선택적으로 담체 및 선택적으로 (그러나 바람직하게는) 피부에 상기 시스템을 부착시키기 위한 특수 접착제를 함유한 매트릭스, 및 일반적으로 (c) 보호 호일 (= 릴리스 라이너)를 포함하는 패치 형태이다. 매트릭스 (b)는 일반적으로 모든 성분의 혼합물로 존재하거나 별도의 층으로 구성될 수 있다.
본 발명의 그래핀 제품을 포함하는 매트릭스 및 멤브레인은 또한 그 자체로서 또는 상처 드레싱, 붕대 등과 같이 보다 복잡한 제품의 일부로서 본 제품의 국소 적용에 적합하다. 이러한 멤브레인 또는 매트릭스의 예로는 다당류(알기네이트, 키틴, 키토산, 헤파린, 콘드로이틴, 카라기난), 프로테오글리칸 및 단백질(콜라겐, 젤라틴, 피브린, 케라틴, 실크 피브로인, 달걀 껍질 막)과 같은 천연 중합체; 폴리 글리콜산, 폴리 락트산, 폴리 아크릴산, 폴리-카프로락톤, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리 비닐 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 등을 기반으로 한 하이드로 겔 또는 생체 모방 세포외 매트릭스 마이크로/나노스케일 섬유와 같은 합성 중합체가 있다.
이러한 모든 시스템은 당업자에게 잘 알려져 있다. 국소 투여 가능한 약학 제제의 제조는 그 자체로 공지된 방식으로, 예를 들어 본 발명의 그래핀 제품을 베이스 또는 필요하다면 그의 일부에 현탁시킴으로써 수행된다.
본 발명에 따른 조성물은 또한 피부과적 적용을 위한 통상적인 첨가제 및 보조제, 이를테면 보존제, 특히 메틸 파라벤, 에틸 파라벤, 프로필 파라벤, 부틸 파라벤과 같은 파라벤 에스테르, 또는 벤잘 코늄 클로라이드와 같은 4차 암모늄 화합물, 또는 이미다조니디닐 우레아와 같은 포름 알데히드 공여체, 또는 벤질 알코올과 같은 알콜, 페녹시 에탄올 또는 벤조산, 소르브 산과 같은 산; pH 완충 부형제로 사용되는 산 또는 염기; 항산화제, 특히 하이드로 퀴논, 토코페롤 및 이의 유도체와 같은 페놀계 항산화제, 및 플라보노이드, 또는 아스코르브 산, 아스코르빌 팔미테이트와 같은 기타 항산화제; 향수; 카올린 또는 전분과 같은 충전제; 안료 또는 착색제; 자외선 차단제; 보습제, 특히 글리세린, 부틸렌 글리콜, 헥실렌 글리콜, 우레아, 히알루론산 또는 이의 유도체; 비타민 E 또는 그 유도체와 같은 자유 라디칼 방지제; 침투 향상제, 특히 프로필렌 글리콜; 에탄올; 이소프로판올; 디메틸 설폭사이드; N-메틸-2-피롤리돈; 올레산, 올레일 알코올과 같은 지방산/알코올; 리모넨, 멘톨, 1-8 시네올과 같은 테르펜; 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트와 같은 알킬 에스테르; 살리실산과 같은 이온 페어링 에이전트를 포함할 수 있다.
적합한 국소 제형에 대한 자세한 내용은 레밍턴(Remington)의 "약학의 과학과 실습" 제22판(2012)과 같은 표준 교과서를 참조하여 얻을 수 있다.
제형에서 본 발명의 그래핀 나노 물질 제품의 양은 0.01 % 내지 10 % w/w, 바람직하게는 0.01 % 내지 5 % w/w, 더 바람직하게는 0.1 % 내지 3 % w/w 범위일 수 있다.
유익한 효과 및 용도
하기 예시들에 의해 입증된 바와 같이, 본 발명의 제품은 국소 적용의 경우에도 독성이 없으며 우수한 생체 적합성을 갖는다.
또한, 놀랍게도, 본 발명의 제품은 예시들에 나타난 바와 같이, 피부 재생 및 상처 치유에 효과적임을 나타내었다.
따라서, 본 발명의 그래핀 제품 및 이를 함유하는 조성물은 치료약으로 유용하다.
용어 "치료" 또는 "치료적"은 사람이나 동물의 질병을 치료 또는 예방, 사람이나 동물의 생리학적 기능을 바로잡거나 수정하는 것을 의미하는 것으로 이해된다.
예를 들면, 진성 당뇨병, 민감성(trauma), 염증성 질환, 대사 이상, 출혈 장애, 자가면역 질환 이를테면 건선 등과 같이 많은 조건들이 피부 통합성 및 진피 기능을 손상시킬 수 있다. 따라서, 원인 요소들(causative agents)의 성질에 관계없이, 피부 병변 치유 촉진이 가장 중요하다. 피부에 상해 후, 상처 폐쇄(closure)는 각질형성세포 또는 섬유아세포와 같은 상이한 세포 유형들이 상처 가장자리로 방향성 이동 및 증식함에 따라 새로운 상피가 형성됨으로써 진행된다. [베넷 엔티 등, 암 제이 서그 1993; 166:74-81.; 웡 브이더블유 등, 제이 바이오메드 바이오테크놀. 2011:969618.]
본 발명의 그래핀 제품은 생쥐 모델에서 상처의 회복에 효과적인 것으로 입증되었고, 생체내에서 신장, 간 또는 염증성 마커의 전신(systemic) 변화 측면에서 무해한 것으로 입증되었다.
따라서, 이것은 상처, 흉터, 화상, 궤양, 건선, 자상 또는 민감성 포유류 피부와 같은 피부 통합성의 붕괴를 초래하는 임의의 조건을 치료하는데 유용하다. 이러한 병변들은 광범위한 이벤트들에 의해 야기될 수 있고 및/또는 다른 질병들과 연관될 수 있다. 치료될 병변은 절개, 열상, 찰과상, 수포, 용혈, 천공, 침투, 전기, 조사, 화학적, 민감성, 파쇄, 물림, 화상, 동상, 수술, 원발성 암 또는 전이, 양성 종양, 여드름, 감염 이를테면(기생충 감염의 바이러스 또는 진균과 결합될 수 있는) 세균 감염과 관련된 병변, 예를 들면, 정맥 부전 또는 동맥 부전, 욕창 궤양, 압박 궤양 또는 욕창과 같이 혈액의 순환 저하와 관련된 병변, 및 당뇨병 또는 건선과 관련된 병변을 포함한다.
투여 모드
본 방법에서 사용되는 조성물은 바람직하게는 국소적으로 적용된다.
본 발명의 그래핀 제품을 포함하는 국소 제형의 1일 투여량은 환자의 성별, 연령, 체중 및 개별 상태와 같은 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다.
예시
예 1:
GMC-1 준비 및 물리 화학적 특성
원료
본 발명의 그래핀 나노 물질을 제조하는데 사용될 수 있는 원료의 조직적 특성, 흑연화 정도, 주요 물리 화학적 및 열적 특성은 하기 표 1에 제시되어 있다.
GNF 원료의 물리 화학적 특성
특성 물성 GNF
조직상 표면적(m2/g) 250-400
흑연화 정도 DRX: npga (흑연≒95 로부터 npg) 6-10
라만: ID/IG(흑연≒0.6 로부터 ID/IG)b 1.0-1.4

물리적 및 화학적		 향, 색상 및 외형 무향, 검은색 가루, 스폰지
고형물 100%
용해도
열전도도(W/mK) 1400-1600
열적 산화 온도(℃) 680
열분해/산화 산물 주로 CO 및 CO2
a 결정의 그래핀 평면 수 (npg = Lc/d); d는 층간 범위; Lc는 샘플 내에서 그래핀의 기저면에 수직인 결정의 평균 크기임
b lD/IG : 라만(RAMAN) 스펙트럼에서 D와 G 대역의 강도 사이의 몫.
이 예에서 본 발명에 따른 물질을 제조하는데 그래핀 나노 섬유(GNF)가 사용되었다.
그래핀 원료 기반 탄소 나노 물질(GNF)은 합성 과정에서 GNF 구조에 도입된 금속과 불순물을 제거하기 위해 HF를 사용하여 정제 공정을 거친다. 정제 공정은 저온(20-50℃)에서 수 시간(12-24 시간) 동안 진행된다. 그 후 정제된 탄소 나노물질을 진공 건조하고 중성 pH가 될 때까지 밀리포어 물로 세척한다.
정제된 GNF는 물 또는 다른 용매가 있는 용액에서 실온에서 수 시간 (2-5 시간) 동안 박리 과정을 거쳤다. 마지막으로, 상기 물질은 열(200-500 ℃, 10-60 분)에 의해 표준 발열성 물질 제거 과정을 거친다.
결과 제품(GMC-1)은 다음과 같이 특성화되었다:
GMC-1의 원소 분석
GMC-1과 상기 원료의 주요 차이점은 원소 분석에서 확인할 수 있다(표 2). GNF 원료와 비교할 때 GMC-1은 탄소와 산소로만 구성된다. 독성 실험에서 확인된 바와 같이, 인체 건강에 해로울 수 있는 불순물 흔적은 보이지 않는다.
원료 CNF 및 GMC-1의 원소 분석
요소 CNF GMC-1
C 80-90 92-95
O 10-15 5-6
불순물 트레이스(금속, 촉매 서포트 등) 0.5-1.5 0.0-0.01
GMC-1의 라만 분광
512nm 레이저를 사용하여 GMC-1의 라만 스펙트럼을 얻었다. 이는 석탄 물질의 특징적인 피크(도 1)를 보여준다. 피크 D, 1332cm-1 및 피크 G, 1580cm-1. G 밴드는 탄소 원자의 네트워크, 즉 이상적인 흑연 구조에 해당하는 반면, D 밴드는 기저면과 가장자리 모두에 결함이 있다. 그래핀 나노섬유는 밴드 G보다 더 큰 강도의 밴드 D를 갖는다. 이러한 나노 섬유의 경우와 같이, 많은 수의 모서리를 포함하는 경우 흑연 재료에 큰 D 피크가 나타날 수 있다. 피크 D와 G 모두 대역폭이 너무 높지 않다는 사실은 나노 섬유의 결정성을 보여준다.
GMC-1의 흡수-질소 탈착 분석
기체의 물리적 흡착에 의해 고체의 총 표면적을 측정하는 기초는 고체의 표면을 덮는데 필요한 기체 분자의 수를 검출하는 것이다. 분자가 차지하는 면적을 알면, 체적 또는 중량 측정(Brunauer, Emmett and Teller)된 흡수된 기체 분자의 수로부터 고체의 표면적을 추정할 수 있다.
총 표면적은 다점 BET 방정식으로 계산된 반면, 기공이 액체 흡착물로 채워진다고 가정하여 총 기공 부피는 상대 압력 P/P0 = 0.99 에서 흡착된 증기의 양에 의해 결정되었다. 1 미만의 상대 압력에서 채워지지 않은 기공은 기공 샘플의 부피와 표면적에 기여하지 않는다는 가정하에, 원통형으로 가정된 평균 기공 크기는 총 기공 부피 값과 표면적에서 추정되었다.
표면적, 기공 부피 및 기공 면적의 분석은 콴타크롬(QUANTACHROM) 모델 콰드라솔브 에스아이(QUADRASORB SI) 모델을 사용하여 77K에서 N2의 흡착-탈착에 의해 이루어졌고, 6개의 탈기 포트와 3개의 분석 포트가 투여된 N2의 부피 각각에 대한 상대 압력 값을 수집하는 소프트웨어(QUADRA WIN)에 의해 제어되었다. 도 2는 GMC-1의 표면적, 기공 부피 및 기공 크기를 보여준다.
BET 표면적 : 300-350 m2/g
기공 부피 : 0.35-0.4 cm3/g
기공 크기 : 5-6 nm
GMC-1의 X-선 회절
GNF 샘플에 해당하는 X-선 회절도가 수행되었다(도 3a). 관찰된 바와 같이, 흑연의 평면 002 사이의 거리 또는 그래핀 시트 사이의 거리에 해당하는 약 25.9° 근처에서 피크를 나타낸다. 결정성이 높은 흑연에서 층간 거리는 0.334nm이다. 이 경우 나노섬유들은 0.343nm로 약간 더 큰 거리를 가지는데, 이는 이들이 단거리 결정도를 가지며 터보스트래틱(turbostratic)함을 나타낸다. 평면 002(Lc)에 수직인 방향의 결정 크기는 4.64 nm이며, 이는 위에서 언급한 사실을 나타낸다.
도 3b는 본 발명 GMC-1에 따른 물질의 샘플에 해당하는 회절도를 보여준다. GNF 및 GMC-1은 동일한 피크들을 나타내지만 GMC-1에서는 이러한 피크들이 더 낮은 2θ 값을 나타낸다.
표 3은 GNF 및 GMC-1에 대한 특징적인 결정학적 매개 변수를 보여준다:
층간 공간 (d002)
결정 스택 높이 (Lc)
면내 결정 크기 (La)
결정 내 그래핀 층 수 (npg)
Figure pct00001
여기서,
λ, 방사 파장 (λ= 0.15404 nm)
θ1, 회절 피크 위치 (°)
θ2, 회절 피크 위치 (°)
kl, 폼 팩터 (k = 0.9)
k2, 워렌(Warren) 폼 팩터 상수 (k = 1.84)
FWHM, 해당 회절 피크의 절반 높이에서의 너비 (rad)
표 3 : GNF 및 GMC-1의 X-선 회절 매개 변수
Figure pct00002
GNF가 GMC-1로 변환되면 물질의 결정 구조가 변한다. 이러한 방식으로, GMC-1에서 물질에 가해진 정제, 세척 및 박리 공정으로 인해 결정 스택 높이(Lc), 면내 결정 크기(La) 및 결정 내 그래핀 층 수(Nc)의 감소가 관찰된다. GMC-1의 층간 공간은 물질에서 경험된 박리 과정으로 인해 증가한다. 결정 스택 높이(Lc) 및 면내 결정 크기(La)는 정제 및 박리 과정으로 인해 감소를 겪는다.
입자 크기 분포
본 발명에 따른 원료 GNF 및 본 발명의 GMC-1에 따른 제품의 입자 크기 분포는 맬번 파날리티컬의 마스터사이저 3000을 사용하여 측정되었다. 마스터사이저 3000은 레이저 회절 기술을 사용하여 입자 크기를 측정한다. 이는 레이저 빔이 분산된 미립자 샘플을 통과할 때 산란되는 빛의 강도를 측정함으로써 수행된다. 그런 다음, 이 데이터를 분석하여 산란 패턴을 생성한 입자의 크기를 계산한다.
도 4a는 GNF 및 GMC-1에 대한 입자 수 기준 입자 크기 분포의 비교를 보여준다.
도 4b는 GNF 및 GMC-1에 대한 입자 부피 기준 입자 비율에 따른 입자 크기 분포의 비교를 보여준다.
도면에서 매개 변수 d(0.1), d(0.5) 및 d(0.9)를 볼 수 있으며, dn은 입자 수를, dv는 입자의 부피를 나타낸다.
GNF의 경우, dn(10) 매개 변수는 입자 수의 10 %가 1.121㎛ 이하의 크기임을 의미하고, dn(50) 매개 변수는 입자 수의 50 %가 1.573㎛ 이하의 크기임을 의미하며, dn(90) 매개 변수는 입자 수의 90 %가 3.909㎛ 이하의 크기를 가짐을 의미한다. GNF의 경우, dv(10) 매개 변수는 샘플 부피의 10 %를 19.764㎛ 이하 크기의 입자가 차지함을 의미하고, dv(50) 매개 변수는 샘플 부피의 50 %를 57.711 ㎛ 이하 크기의 입자가 차지함을 의미하며, dv(90) 매개 변수는 샘플의 90 %를 103.114㎛ 이하 크기의 입자가 차지한다는 것을 의미한다.
GMC-1의 경우, dn(10) 매개 변수는 입자 수의 10 %가 0.313㎛ 이하의 크기임을 의미하고, dn(50) 매개 변수는 입자 수의 50 %가 0.394㎛ 이하의 크기임을 의미하며, dn(90) 매개 변수는 입자 수의 90 %가 0.577㎛ 이하의 크기를 가짐을 의미한다. GMC-1의 경우, dv(10) 매개 변수는 샘플 부피의 10 %를 10.549㎛ 이하 크기의 입자가 차지함을 의미하고, dv(50) 매개 변수는 샘플 부피의 50 %를 39.693 ㎛ 이하 크기의 입자가 차지함을 의미하며, dv(90) 매개 변수는 샘플의 90 %를 69.576㎛ 이하 크기의 입자가 차지한다는 것을 의미한다.
GNF와 GMC-1 사이의 수와 부피 기준 입자 크기 분포 비교는 GMC-1이 입자 크기 분포가 더 낮음을 보여준다. 요약하면, GNF의 dn(90)은 입자 수 기준 3,909 ㎛ 이하의 크기, 및 입자 부피 기준 103.114 ㎛ 이하인 dv(90)을 가지는 반면, GMC-1의 dn(90)은 입자 수 기준 0.577 ㎛ 이하의 크기, 및 입자 부피 기준 69.576 ㎛ 이하의 dv(90)을 갖는다. 도 4a 및 4b는 사용된 원료(GNF)와 비교하여 GMC-1에서 입자의 수와 부피에 대한 이러한 감소를 명확하게 보여준다.
생물학적 활성
통계
표시된 데이터는 다양한 실험 횟수의 평균 ± SEM으로 표시된다. 2개의 샘플에 대해 스튜던츠 t 검정(student's t test)이 사용되었고, 2개 초과의 샘플에 대해 일방향 또는 양방향 변량 분석이 사용되었으며(ANOVA), 쌍을 이루거나 쌍을 이루지 않은 설계와 다중 비교 검정이 이어졌다. P < 0.05의 값은 통계적으로 유의미한 것으로 간주되었다.
예 2 : HEP-G2 세포주의 독성 분석
본 발명자들은 약리학 및 독성학 연구에 사용되는 배양된 세포(간세포주 Hep-G2)에 대해 GMC-1을 테스트했다.
6 웰(6 wells) 배양 접시들에서, 300,000 개의 세포를 웰당 씨드하고 10 % 우태 혈청 보충 배양 배지로 성장시켰다(디폴트로, DMEM). 세포는 37 ℃, 5 %의 CO2 및 습도의 제어된 인큐베이터 조건 하에서 유지되었다. 밀집(confluence)에 도달하면 16시간 동안 혈청을 박탈하였다. 제품을 동일한 제어된 유지 조건에서 24시간 동안 동일한 최종 부피를 유지하며 상이한 농도로 현탁액으로 첨가하였다. 이후, 세포를 프로세싱하였고 위에서 언급된 ISO에서 지적된 두 가지 테스트에 의해 생존력/독성을 보완적으로 테스트하였다:
a) 살아있는/죽은 세포를 구별하는 트라이판 블루(Trypan Blue) 배제 및
b) MTT (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라조륨브로미드)로 세포 염색에 의한 대사 활성.
결과는 도 5에 나타나 있다. 이 데이터는 GMC-1이 배양된 Hep-G2 세포주에서 무독성임을 보여준다.
예 3 : 동물 모델에서의 상처 치유
피부 상처 치유는 상처를 폐쇄하고 상피 장막(epithelial barrier) 및 하부 연결 조직을 재건하는 보편적인 재생 프로세스이다.
진피 기능을 위태롭게 하는 원인 요소들로는 많은 인자들과 전신 조건들이 있다. 피부 손상 후, 상처를 폐쇄하기 위해 새로운 상피가 형성되어야 한다.
상처 치유는 세포 이동 증식, 분화 및 세포외 기질 형성을 포함한다. 정맥, 당뇨 발, 또는 압력 궤양과 같은 만성 상처는 증가된 세균 집락화 및/또는 감염을 포함하는 미분해 치유 과정을 특징으로 하며, 이들은 당뇨병, 민감성, 염증성 질환, 대사 이상, 출혈 장애, 흡연, 면역 억제, 영양실조 및 비만과 같은 다른 조건들 및 질병들에 의해 야기된다.
우리는 설치류 모델의 상처 치유에서 진피 재생 분석을 수행하였다. GMC-l 의 제형은 주 부형제 성분으로 젤라틴을 갖는 하이드로겔을 기초로 한다 [엑스.제이. 양, 등, 폴리엠. 인트. (1997) 448-452]
사용된 동물 모델은 래트(Rattus norvegicus), 수컷 또는 암컷, 실험 개시 시점 3-8 개월령, 300-500 체중(n=18)이다. 래트를 2개의 그룹으로 나누고, 본 제품 또는 동일한 제형을 함유하는 제제로 처리하였다. 이 동물은 이소플루란으로 마취되었고, 등 피부가 면도되었다. 70% 에탄올로 살균한 후, 4 mm 직경의 진피 생검 펀치를 사용하여 등 피부에 5개의 두께 상처를 생성하였다. 4개의 상처는 GMC-l을 포함하는 제형 또는 포함하지 않는 제형(대조군)에 기초한 패치로 처치되었다. 5번째 생검은 폐쇄의 대조군으로서 덮지 않고 놔두었다. 상기 제형은 2일째마다 적용되었다. 시간에 따라 측면법 측정(planimetric measurement)에 의해 상처 폐쇄를 모니터링하였다(손상 후 0-2 및 4일째에 각 상처의 사진을 디지털 카메라(PowerShot Pro1, Canon)를 사용하여 촬영함). 상처 부위를 분석하였다(JImage, NIH). 각 시점마다 상처 폐쇄 비율을 다음 공식으로 유도했다: (1-[현재 상처 크기/최초 상처 크기])x100. 이 값은 5번째 생검 폐쇄값(동물의 내적 컨트롤)에 대해 비율화되었다.
4일째에 동물을 희생시켰고 치유된 상처부위를 절제하고, 10% 중화된 포름알데히드에 24시간 동안 고정시키고 파라핀에 매립하였다. 3 ㎛ 두께 섹션들을 자일렌에서 탈왁스하고, 하강 농도의 에탄올에 연속적인 침적에 의해 재수화(rehydrate)하였고, 조직병리학적 판단(상피재생, 콜라겐화 및 급성 염증 침투)을 하였다. 상술한 조직병리학적 분석에 의해 결정된 개별 점수들에 기초하여 각 상처의 상피화(epithelitation)를 점수화하였다.
그 결과가 도 6에 나타나 있다. 국소 적용된 GMC-1이 체내에서 진피를 재생시켰다.
안락사 후, 혈장과 주변 혈액 단핵 세포(혈액 내에서 순환하는 메인 백혈구 집단)를 보존하여 연구하였다. 혈장의 일반적인 생리가 이루어지고 상이한 신장, 간 및 염증 마커가 연구되었다(크레아티닌, 트랜스아미나제 및 기타 넓은 범위의 C-반응성 단백질). PBMCs는 전염증성 마커 인터루킨 l-β 의 발현을 연구하기 위해 조작되었다. 발현 변화는 역전사-정량 중합 효소 연쇄 반응 (RT-qPCR)을 사용하여 결정되었다. 상이한 샘플들에서 추출한 오리지날 mRNA의 100ng의 변환된 DNA(cDNA)를 상용 유전자 발현 분석(TaqMan, Life Technologies)으로 증폭하였다. 내인성 대조군(베타-액틴)에 대해 값들을 정규화한 다음, 2^-deltadeltaCt 방법을 사용하여 발현의 폴드 변화를 수행하였다.
결과는 도 7에 나타나 있다. 피부 상처 부위에 걸쳐 국소 적용된 GMC-l은 생체 내에서 신장, 간 또는 염증성 마커의 전신성 변화의 측면에서 무해하다.

Claims (14)

  1. 그래핀 나노섬유에서 선택되는 그래핀 나노물질로서, 상기 그래핀 나노물질은, 레이저 회절 입자 분석기로 측정시, 입자 수 기준 dn(90)이 0.60 ㎛ 이하이고 입차 부피 기준 dv(90)이 80.00 ㎛ 이하인 입자 크기 분포를 갖는 그래핀 나노물질.
  2. 제 1 항에 있어서, BET 비 표면적이 100 내지 500 m2/g인 그래핀 나노물질.
  3. 제 2 항에 있어서, BET 비 표면적이 300-350 m2/g인 그래핀 나노물질.
  4. 제 1 항에 있어서, 기공 부피가 0.35-0.40 cm3/g인 그래핀 나노물질.
  5. 제 1 항에 있어서, BET 비 표면적이 300-350 m2/g이고 기공 부피가 0.35-0.40 cm3/g인 그래핀 나노물질.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노물질의 불순물이 0.01 중량 % 미만인 그래핀 나노물질.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 그래핀 나노물질의 약품으로서의 용도.
  8. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 그래핀 나노물질의 상처, 흉터, 습진, 피부 화상, 피부 궤양 또는 기타 피부 병변의 치료용 용도.
  9. 제 8 항에 있어서, 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 그래핀 나노물질의 건선, 당뇨병, 암, 감염, 여드름 또는 혈액순환 저하로 생성된 피부 병변의 치료용 용도.
  10. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 그래핀 나노물질 제품을 포함하는 약학 조성물 및 약학적으로 수용가능한 부형제.
  11. 국소 사용에 적합한 제 10 항에 따른 약학 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서, 크림, 연고, 마이크로 에멀전, 겔, 에멀전 겔, 페이스트, 발포체, 팅크, 패치, 붕대, 멤브레인, 매트릭스 또는 경피 전달 시스템으로부터 선택된 형태인 약학 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 하이드로겔 또는 크림인 약학 조성물.
  14. 그래핀 나노섬유 원료로부터 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 제품을 제조하는 방법으로서,
    a) 상기 그래핀 원료 내에 존재하는 임의의 금속 또는 불순물을 제거하기 위해, 바람직하게는 강산을 사용하여, 상기 그래핀 원료를 정제하는 단계,
    b) 레이저 회절 입자 분석기에 의해 측정시, 입자 수 기준 0.60 ㎛ 이하인 dn(90) 및 입자 부피 기준 80.00 ㎛ 이하의 dv(90)을 갖는 입자 크기 분포로, 바람직하게는 박리 공정을 통해, 정제된 그래핀 나노물질의 입자 크기를 감소시키는 단계,
    c) 선택적으로, 수득된 제품에 발열성 물질 제거 공정을 적용하는 단계
    를 포함하는 제조 방법.
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