CN112437752B - 石墨烯产品和其化妆品应用 - Google Patents

Abstract

石墨烯产品来自石墨烯纳米纤维(GNFs)，其具有改性的晶体结构和限定的粒径分布。所述产品为无毒的并且具有生物学特性，例如伤口愈合，改善皮肤外观。所述产品能够用于治疗。

Description

石墨烯产品和其化妆品应用

技术领域

本发明涉及新型石墨烯产品，其组合物和用于化妆品的应用。

背景技术

在2010年诺贝尔物理学奖之后，石墨烯基或石墨烯相关材料家族逐渐备受关注，随后这些材料在能源、电子、传感器、光处理、医学和环境领域的众多应用开发中出现爆炸式增长。石墨烯是该家族的“创始”成员，是由sp²-杂化碳原子排列成六边形蜂窝晶格制成的二维材料。

石墨烯相关材料的延伸家族包括石墨烯(单层和多层)、石墨、多环芳烃、碳纳米管、富勒烯、不同尺寸的各种石墨烯纳米结构(例如，石墨烯纳米纤维，石墨烯纳米颗粒，石墨烯量子点，石墨烯纳米带，石墨烯纳米网格，石墨烯纳米盘，石墨烯泡沫，石墨烯纳米柱)，其他与石墨烯有关的材料、与经取代的石墨烯有关的材料的任意组合(例如，碳原子被N，B，P，S，Si或其他取代)以及被反应性官能团官能化的石墨烯相关材料(例如羧基，酯，酰胺，硫醇，羟基，二醇基，酮基，磺酸酯基，羰基，芳基，环氧基，酚基，膦酸，胺基，卟啉，吡啶，聚合物及其组合)。

多个公开文件描述了石墨烯用于医学应用。

US2006/0134096描述了包含富石墨烯组合物和医学上使用的方法，特别是无孔碳，除了富勒烯或纳米管，其还包含石墨烯。它们局部用于伤口，作为毒素的吸附剂或用于血液透析。

EP313353公开了用于预防或治疗神经退行性疾病的基于石墨烯纳米结构的药物组合物。石墨烯纳米结构抑制了由蛋白质错误折叠引起的原纤维形成。

US2014/0120081公开了碳纳米材料用于通过降低活性氧种类的水平来治疗受试者的氧化应激的用途。碳纳米材料选自可以被官能化的纳米管、石墨烯、石墨烯纳米带、石墨、氧化石墨等。

GB2532449描述了通过抑制癌症干细胞的增殖而用于治疗、预防或防治癌症的功能化纳米材料，其中所述纳米材料是单层石墨烯、多层石墨烯、纳米石墨、单壁或多壁碳纳米管、富勒烯、碳纳米角(nanohorns)、碳纳米纤维或无定形或部分无定形的纳米碳或其混合物。氧化石墨烯是优选的。

Guranathan S.和Kim J-H，国际纳米医学杂志，2016：11，第1927-1945页，回顾了石墨烯和石墨烯相关材料的合成、毒性、生物相容性和生物医学应用。如该文件中所讨论的，这些产品中的许多仍然存在相关毒性和生物相容性的问题。石墨烯的毒性作用会受到物理化学性质(例如大小和分布、表面电荷、表面积、层数、横向尺寸、表面化学性质、纯度、颗粒状态、表面官能团和形状)的影响。抗癌治疗、光热疗法、药物递送、基因转染、生物传感、成像和组织工程是本文所提及的生物医学应用。

仍然需要新的基于石墨烯的材料，其具有低毒性或无毒性，良好的生物相容性并且能够提供有用的生物学作用和在化妆品中的应用。

发明内容

现在，我们发现了新的石墨烯产品，其具有非凡的性能、低毒性或无毒性，并且可用于化妆品。

在第一方面，本发明涉及选自石墨烯纳米纤维的石墨烯纳米材料，其中通过激光衍射颗粒分析仪检测，所述石墨烯纳米材料粒径分布的dn(90)为0.60μm或更小的粒子数和dv(90)为80.00μm或更小体积粒子。

优选地，石墨烯纳米材料的BET比表面积在100和500m²/g之间，更优选在300-350m²/g之间。

在另一个实施方案中，石墨烯纳米材料的孔体积在0.35-0.40cm³/g之间。

还优选地，石墨烯纳米材料中的杂质小于0.01％重量。

在另一方面，本发明涉及限定为化妆品的石墨烯纳米材料的用途。优选地，化妆品用于皮肤的治疗。

在另一方面，本发明涉及以上所述的石墨烯纳米材料在改善皮肤外观，优选减少皮肤脂肪组织，优选减少皮下脂肪中的用途。

在另一方面，本发明涉及用于预防或减少皮下脂肪组织的体积增加和/或脂肪团块形成的美容治疗方法，其特征在于本发明的石墨烯或包含其的组合物，施用到皮肤。优选地，美容治疗用于减少蜂窝织炎(cellulitis)、皱纹和/或静脉曲张。

优选地，化妆品用于皮肤的局部治疗。

在另一方面，本发明考虑了用于化妆品用途的本发明的石墨烯纳米材料或包含其的组合物，用于预防或减少脂肪组织的体积增加和/或脂肪块的形成，其中所述纳米材料或所述组合物被施用到皮肤。

在另一方面，本发明涉及包含以上所述的石墨烯纳米材料的化妆品组合物。

附图说明

图1是GMC-1的拉曼光谱；

图2是GMC-1在N₂中的吸附-解吸；

图3A是GNFs原料的X-射线衍射；

图3B是GMC-1的射线衍射；

图4A是GNFs原料和GMC-1的粒子数粒度分布比较；

图4B是根据针对GNFs原料和GMC-1的粒子体积重的粒子百分数的粒度分布比较。

图5是用2x GMC-1或溶媒(CT)处理24小时的培养脂肪细胞(由3t3l1细胞系分化)的毒性测定。A)通过台盼蓝细胞排除法测定的生存力，以及B)MTT与溶媒一起和10x GMC-1浓度测定的细胞代谢。该值表示为平均值+/-SEM。

图6是脂肪分化标记在培养脂肪模型中的表达。用2x GMC-1或溶媒(CT)处理来自啮齿动物(褐家鼠)的培养的脂肪细胞(从3T3L1细胞系分化出的)或分离的内脏白色脂肪组织外植体24小时。通过RT-qPCR测定内脏白色脂肪组织中分化标志物PPARγ(A，B)和C)炎症脂肪因子IL-6(C)和胰岛素敏感性标志物GLUT4(D)的mRNA表达倍数变化。该值表示为平均值+/-SEM。*＝P＜0.05vs对照，该值被认为是统计学显著的。

具体实施方式

石墨烯原料

在本发明中，术语“石墨烯”是指形成具有多个碳原子彼此共价键合的多环芳族分子的材料。共价键合的碳原子形成六元环作为重复单元。

术语“石墨烯纳米纤维”(GNFs)是指圆柱纳米结构，其中石墨烯层排列为堆叠的圆锥体、杯状或平板状。石墨烯平面表面从纤维轴倾斜，从而暴露出存在于碳纳米纤维的表面和外表面上的平面边缘。

术语“石墨烯纳米管”(GNTs)是指石墨烯的单壁或多壁同心圆柱体，与石墨烯纳米纤维相比，其基面形成的较低反应性的表面，因为它们像管一样呈圆柱形和中空，但是石墨烯纳米纤维是像杆一样，并且杆内通常没有内部的空白空间。

本发明的产品是衍生自GNF的碳基纳米材料，其经过一系列纯化和处理以获得具有意想不到的生物学特性的医学级材料。

起始碳纳米材料是基于石墨烯的材料(石墨烯纳米纤维)。在一个实施方案中，用于制备本发明的产品的石墨烯纳米纤维的粒径分布dn(90)的粒子数为4.0μm或更小，而dv(90)的体积粒子为105.00μm或更小。优选地，它们具有约250-400m²/g的表面积。

可以通过多种方法合成用于获得本发明产品的原料，例如在碳化硅上外延生长、化学气相沉积、石墨的微机械或机械剥离、石墨的化学氧化，利用热还原氧化石墨等、化学或多步还原、碳氢化合物在金属催化剂上的催化分解、展开的碳纳米管、静电纺丝等。

在碳化硅上进行外延生长是一种方法，其中可以在用作衬底的单晶碳化硅晶体(SiC)上合成从石墨烯分离的单层。此方法包括将SiC晶片加热到高温(>1100℃)和高真空。在提到的条件下，硅原子升华，从而在表面上获得石墨烯的外延生长(碳原子重新排列，形成石墨烯)[Sutter，P.，外延石墨烯：硅如何离开现场。自然材料，2009.8(3)：p.171-172。

在化学气相分解法中，碳源在催化基质上催化分解。碳氢化合物热分解后，催化表面导致金属内部生成的碳原子溶解[Jacobberger，R.M.等人，通过化学气相沉积进行的简单石墨烯合成。化学教育杂志，2015.92(11)：p。1903-1907年，Lavin-Lopez，M.P.等.]

沉积在多晶镍上的石墨烯的厚度控制。新化学杂志，2015.39(6)：p.4414-4423]。

石墨的微机械剥离包括使用固体表面物体或胶带通过精细刮削将薄片中的所述固体的最外层分离出来[Geim，A.K.和K.S.Novoselov，石墨烯的兴起.自然材料，2007.6(3)：p.183-191]。机械剥离允许通过超声波分离在有机或水性溶剂中形成悬浮石墨的薄片。所获得的材料质量高，但是，由于其收率低且生产成本高，因此没有很大的工业价值[Lotya，M.等人，通过在表面活性剂/水溶液中剥离石墨来液相生产石墨烯。美国化学学会杂志，2009年。131(10)：p.3611-3620]。

也可以使用多种方法来合成石墨烯纳米纤维(GNFs)，这对于制备本发明的产品是特别优选的。例如，用于碳纳米纤维的化学气相沉积法是一种催化方法，其中碳质源在催化剂的存在下分解成生长的GNFs。过渡金属催化颗粒如铁、镍、钴和铜用作催化剂。CVD工艺在500至1200℃之间的温度下进行[Martin-Gullon，I.等人，在浮动催化剂反应器中使用Fe和Ni催化剂生产的碳纳米纤维之间的差异。Carbon，2006.44(8)：p.1572-1580]。静电纺丝是GNFs的另一种生产方法。在这种方法中，使用溶胶-凝胶工艺需要一根细小针头。为此，将高电压施加到针头的液滴上，导致溶液从针头中流向目标。当溶液的表面张力足够高时，避免进入细小的液滴，可以从目标中提取并收集纤维结构[Zhang,L.，et al.，Areview：静电纺聚丙烯腈的碳纳米纤维及其应用。材料科学学报，2014.49(2)：p.463-480]。

用于制备本发明的复合材料的多孔石墨材料的平均直径和长度通过透射电子显微镜(TEM)测量。

纯化和处理

按照以上报道的方法合成的石墨烯纳米材料用作合成本发明的基于石墨烯的医用级材料的原料。然后对粗石墨烯纳米材料进行纯化工艺，优选使用强酸(H₂SO₄、HCl、HF、HNO₃、HBr等)，以去除合成过程中引入到石墨烯纳米材料结构中的任何金属或杂质。可以使用能够去除杂质而不影响石墨烯材料的性能的任何方法。在酸中，特别优选盐酸或氢氟酸，但是技术人员将根据存在的杂质的量和类型选择酸和条件。纯化过程优选在低温(20-50℃)下进行数小时(12-24小时)。如果将溶液用于纯化过程，则纯化的石墨烯纳米材料然后可以用Millipore水洗涤至中性pH，然后干燥，例如真空干燥。

还对纯化的石墨烯纳米材料进行了处理，以实现减小的粒度分布，这使得该产品适用于医疗和化妆品用途。对纯化的石墨烯纳米材料进行例如处理以减小其尺寸并改变其性能。在一个实施方案中，在室温下对其进行剥离处理，例如通过超声处理、湿磨或混合处理。由于该过程的简单性，超声处理是特别优选的，超声处理还可以通过样品进行监测，以检查是否达到所需的粒度分布。之后，进行可选的定界过程(delimitation)以将粒子大小控制在10-100μm之间。技术人员将容易地确定选择粒度分布所需的技术。例如，该步骤可通过过滤或离心，优选真空过滤，例如通过烧结玻璃过滤器，来实现。所述定界步骤可以有利地形成dn(90)为0.60μm或更小粒子数量并且dv(90)的体积粒子为80.00μm或更小体积。

最后，为了控制等级材料不会拖曳其他有毒化合物的痕迹，包括细菌污染或内毒素，并且为了保持杀菌和无菌条件，还可以通过加热(最好在200-500℃持续10-60分钟)来将所述材料进行标准的脱热原。

所得的粒度分布可以通过本领域中的常规手段来确定，例如粒度分析仪，例如，在实施例中使用的来自Malvern Pananalytical的Mastersizer 2000。

因此，本发明的另一目的是一种由粗石墨烯纳米纤维制备本发明产品的方法，其包括以下步骤：

a)纯化石墨烯原料，优选使用强酸，以除去石墨烯原料中存在的任何金属或杂质，

b)缩小纯化的石墨烯纳米材料的粒径，优选地通过剥离工艺，将dn(90)减小至0.60μm或更小粒子数量，dv(90)的小于80.00μm或更小粒子体积，其通过激光衍射粒子分析仪测量，

c)可选地，对获得的产物经受脱热原过程。

步骤(b)可以进一步包括在步骤(c)之前根据粒度对粒子进行定界的步骤。在一个实施方案中，定界步骤通过过滤或离心，优选真空过滤来实现。

在本发明的上下文中，可以通过以下步骤(b)获得dn(90)为0.60μm或更小粒子数量且dv(90)为80.00μm或更小的粒子体积，可选地包括另外的定界步骤，优选过滤步骤。优选地，过滤是利用孔径在1至20μm之间，优选在4至20μm之间，更优选在5至16μm之间的烧结玻璃过滤器进行的真空过滤。

产品

本发明的产品是具有粒度分布的纯化的石墨烯纳米材料，其dn(90)约为0.60μm或更小粒子数，dv(90)为80.00μm或更小，优选为70.00μm或更小粒子体积。

粒度分布通过激光衍射粒度分析仪测量。粒径分布D50是累积分布中50％的粒径值。如果D50具有某个值，则样品中50％的粒子大于此值，而50％较小。粒度分布是落入各个尺寸范围内的粒子数，以目标样本中所有大小的总数的百分比。描述粒度分布的最广泛使用的方法是d值(d10，d50和d90)，其解释为累积质量的10％，50％和90％。

这些值可以认为是材料的直径，当粒子按质量递增排列时，该直径会将样品质量分成指定的百分比。d10是样品质量的10％由直径小于此值的粒子组成的直径。d50是样品质量的50％小于此值且质量的50％大于此值的粒子的直径。d90是样品质量的90％由直径小于此值的粒子组成的直径。这些值可以应用于粒子数(dn)和粒子体积(dv)。

粒子数为dn(90)的分布是指尺寸分布中的点，直到和包含该点，包括样品中材料总数的90％。

粒子体积具有dv(90)的分布是指尺寸分布中的点，直至和包括该点，其中包含样品中材料总体积的90％。

用Malvern Panalytical的Mastersizer 3000测量本发明产物的粒度分布。

在本发明的上下文中，术语“比表面积(SSA)”是指每质量单位的材料的总表面积。

本申请中描述的孔隙率和比表面积的性质是使用Brunnauer-Emmet-Teller(“BET”)方法测量的，该方法在物理吸附技术中使用了氮作为吸附材料，这对于本领域技术人员是众所周知的。

在本发明的一个实施方案中，本发明产品的BET表面积为300-350m²/g。

在另一个实施方案中，本发明产品的孔体积在0.35-0.40cm³/g之间。

在一个优选的实施方案中，本发明的产品具有300-350m²/g的BET表面积和0.35-0.40cm³/g的孔体积。

本发明的产品为石墨烯纳米纤维的形式。

组合物

在另一方面，本发明涉及化妆品组合物，其包含本发明的石墨烯产品和一种或多种化妆品可接受的赋形剂。

如本文所用，术语“化妆品组合物”是指旨在施加到消费者的皮肤上以调节皮肤状况和/或改善皮肤外观的组合物，包括减少皮下脂肪。

除了作为活性成分的本发明的石墨烯产品之外，本发明的化妆品组合物还可包括常规的辅助赋形剂，例如稳定剂、增溶剂、维生素、颜料和香料。

化妆品组合物可以以本领域常规使用的任何制剂来制备。例如，化妆品组合物可以以例如悬浮液、乳剂、糊剂、糊剂、凝胶剂、霜剂、乳液、粉末、油、粉末粉底、乳液粉底、蜡粉底和喷雾的制剂制备，但是它们的制剂不限于此。化妆品组合物可以以防晒霜、软化化妆品水、收敛化妆品水、营养化妆品水、营养霜、按摩霜、精油、眼霜、包装、喷雾剂或粉末的制剂制备。

术语“赋形剂”是指与活性成分一起施用的溶媒、稀释剂或佐剂。化妆品赋形剂可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物来源、植物来源或合成来源，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。

在一个优选的实施方案中，本发明的化妆品组合物适合于局部施用于皮肤，例如乳霜、乳液、软膏、微乳剂、脂肪软膏、凝胶、乳状凝胶、糊剂、泡沫、酊剂(tinctures)、溶液、贴剂、绷带和透皮递送系统。最优选的是乳霜、水凝胶或乳状凝胶。

乳霜或乳液是水包油乳液。使用的油基是脂肪醇，尤其是含有12至18个碳原子的脂肪醇，例如月桂醇、鲸蜡基或硬脂醇；脂肪酸，尤其是含有10至18个碳原子的脂肪酸，例如棕榈酸或硬脂酸；脂肪酸酯，例如甘油三癸酸酯(中性油)或鲸蜡基棕榈酸酯，液体至固体蜡(例如肉豆蔻酸异丙酯，羊毛蜡或蜂蜡)和/或碳氢化合物，尤其是液体，半固体或固体物质或它们的混合物，例如石油膏(矿脂，凡士林)或石蜡油。合适的乳化剂是具有主要亲水性质的表面活性物质，例如相应的非离子型乳化剂，例如多元醇的脂肪酸酯和/或其环氧乙烷加合物，特别是相应的脂肪酸酯与(聚)乙二醇，(聚)丙二醇或山梨糖醇，尤其是含有10至18个碳原子的脂肪酸基团，尤其是聚羟基乙烯脱水山梨糖醇的部分甘油脂肪酸酯或部分脂肪酸酯，例如聚甘油脂肪酸酯或聚氧乙烯脱水山梨糖醇酐脂肪酸酯(T weens)，以及聚氧乙烯脂肪醇醚或脂肪酸酯，特别是包含12至18个碳原子的脂肪醇部分和尤其是10至18个碳原子的脂肪酸部分，例如聚羟基乙烯甘油脂肪酸酯(例如Tagat S)，或相应的离子型乳化剂，例如脂肪醇硫酸盐的碱金属盐，尤其是具有脂肪醇基团中的12至18个碳原子，例如月桂基硫酸钠、鲸蜡基硫酸钠或硬脂基硫酸钠，通常在脂肪醇例如鲸蜡醇或硬脂醇的存在下使用。水相的添加剂尤其是防止乳霜干燥的试剂，例如保湿剂，例如多元醇，例如甘油、山梨糖醇、丙二醇和/或聚乙二醇，以及防腐剂、香料、胶凝剂等。

软膏是油包水型乳剂，其含有至多70％，但优选约20％至约50％的水或水相。尤其适合作为脂肪相的是烃，例如石油膏，石蜡油和/或硬石蜡，其为了改善水结合能力优选包含合适的羟基化合物，例如脂肪醇或其酯，例如鲸蜡醇或羊毛蜡醇或羊毛蜡或蜂蜡。乳化剂是对应的亲脂性物质，例如上述类型的亲油物质，例如山梨糖醇脂肪酸酯(Spans)，例如脱水山梨糖醇油酸酯和/或脱水山梨糖醇异硬脂酸酯。水相的添加剂尤其是保湿剂，例如多元醇，例如甘油、丙二醇、山梨糖醇和/或聚乙二醇，以及防腐剂、香料等。

微乳剂是基于以下四个成分的各向同性体系：水、表面活性剂(例如张力活性剂)、脂质(例如非极性或极性油，例如石蜡油)、天然油(例如橄榄油或玉米油)和含有亲脂性基团的醇或多元醇，例如2-辛基十二烷醇或乙氧基化甘油或聚甘油酯。如果需要，可以将其他添加剂添加到微乳液中。微乳液的胶粒或微粒尺寸小于200nm，是透明或半透明的体系，呈自发性、稳定的。脂肪软膏是无水的，并且包含特别是作为基的烃，例如石蜡、石油膏和/或液体石蜡，还包含天然或部分合成的脂肪，例如甘油的脂肪酸酯，例如椰子脂肪酸甘油三酸酯，或优选硬化油，例如氢化坚果油(groundnut oil)，蓖麻油或蜡，还有甘油的脂肪酸偏酯，例如单硬脂酸甘油酯和二硬脂酸甘油酯，以及例如增加吸水能力的脂肪醇，乳化剂和/或与软膏相关的添加剂。

关于凝胶，在水性凝胶、无水凝胶和具有低水含量的凝胶之间进行区分，所述凝胶由可溶胀的、形成凝胶的材料组成。特别使用基于无机或有机大分子的透明水凝胶。具有凝胶形成特性的高分子量无机组分主要是含水的硅酸盐，例如硅酸铝，例如膨润土、硅酸铝镁，例如Vegegum，或胶体硅酸，例如Aerosil。作为高分子量有机物质，例如使用天然、半合成或合成的大分子。例如天然和半合成聚合物，衍生自含有多种碳水化合物组分的多糖，例如纤维素、淀粉、黄芪胶(tragacanth)、阿拉伯树胶和琼脂胶、以及明胶、海藻酸及其盐(例如海藻酸钠盐)，以及它们的衍生物，例如低级烷基纤维素，例如甲基或乙基纤维素，羧基或羟基低级烷基纤维素，例如羧甲基或羟乙基纤维素。合成凝胶形成大分子的成分，例如，为适当取代的不饱和脂族化合物，例如乙烯醇、乙烯基吡咯烷、丙烯酸或甲基丙烯酸。

乳状凝胶(Emulsion-gels)-也称为“乳胶(emulgels)”-代表热门的组合物，其结合了凝胶的特性和水包油乳剂的特性。与凝胶不同的是，它们包含脂质相，该脂质相由于其脂肪恢复特性而使该制剂能够按摩使用(massage)，同时，直接吸收到皮肤中也具有令人愉悦的特性。此外，可以观察到对亲脂性活性成分的溶解度增加。乳状凝胶优于水包油乳液的一个优点在于增强的冷却效果，这是由于附加的醇组分(如果存在)的蒸发而引起的冰凉感而引起的。

泡沫，例如是从加压容器中施用的，并且是以气雾剂形式的液体水包油乳状液。未取代的烃，例如烷烃，例如丙烷和/或正丁烷，用作推进剂。作为油相，尤其使用烃，例如石蜡油、脂肪醇(例如鲸蜡醇)、脂肪酸酯(例如肉豆蔻酸异丙酯)，和/或其他蜡。作为乳化剂，尤其使用具有亲水性的乳化剂的混合物，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯(T weens)和具有亲脂性的乳化剂，例如脱水山梨糖醇脂肪酸酯(Spans)。还添加了常规添加剂，例如防腐剂等。酊剂和溶剂通常具有乙醇基(base)，可以向其中添加水，并向其中添加多元醇，例如甘油、乙二醇和/或聚乙二醇，作为用于减少蒸发的保湿剂，以及脂肪修复物质，例如具有低分子量聚乙二醇、丙二醇或甘油的脂肪酸酯，即可溶于水性混合物的亲脂性物质，用以代替被乙醇从皮肤上去除的脂肪类物质，以及必要时，添加其他助剂和添加剂。合适的酊剂或溶剂也可以通过合适的装置以喷雾形式施加。

具有(特别是)局部递送本发明的石墨烯产品的透皮递送系统含有有效量的石墨烯产物，其可选地与载体一同使用。可用的载体包含可吸收的药理学适用的溶剂，以帮助活性成分通过皮肤。透皮递送系统，例如以贴剂的形式，其包含(a)基质(＝背衬层或膜)，(b)含有活性成分的基质，可选地载体和可选地(但是优选地)用于将所述系统贴于皮肤上的特殊粘合剂，和通常(c)使用保护性衬底(＝防粘衬里)。基质(b)通常以所有组分的混合物形式存在或可以由单独的层组成。

包含本发明所述的石墨烯产品的膜和基质，通过其本身或作为更复杂产品(例如伤口敷料、绷带等)的一部分也适用于局部使用。此种实施例中，此类膜或基质为天然聚合物，例如多糖(藻酸盐、几丁质、壳聚糖、肝素、软骨素、卡拉胶)、蛋白聚糖和蛋白质(胶原蛋白、明胶、纤维蛋白、角蛋白、丝素蛋白、蛋壳膜)；基于聚乙醇酸、聚乳酸、聚丙烯酸、聚-ε-己内酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙二醇等的水凝胶或仿生细胞外基质微/纳米纤维等合成聚合物。

所有这些体系都是本领域技术人员所熟知的。可局部施用的药物或化妆品制剂的制造以本身已知的方式实现，例如通过将本发明的石墨烯产品悬浮在基底中，或者，在必要时悬浮在其部分中。

根据本发明所记载的组合物，其还可包含用于皮肤病学应用的常规添加剂和佐剂，例如防腐剂，尤其是对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯或季铵化合物，如苯扎氯铵，或咪唑烷基脲等甲醛供体，或苯甲醇、苯氧乙醇等醇或苯甲酸、山梨酸等酸；用作pH缓冲赋形剂的酸或碱；抗氧化剂，尤其是对苯二酚、生育酚及其衍生物等酚类抗氧化剂，以及黄酮类化合物，或其它抗氧化剂，如抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯；香料；填料，如高岭土或淀粉；色素或着色剂；紫外线屏蔽剂；保湿剂，尤其是甘油、丁烯二醇、己二醇、尿素、透明质酸或其衍生物；抗自由基剂，如维生素E或其衍生物；渗透性促进剂，特别是丙二醇；乙醇；异丙醇；二甲亚砜；N-甲基-2-吡咯烷酮；脂肪酸/醇，如油酸、油酸醇；萜烯，如柠檬烯、薄荷醇、1-8桉叶脑；烷基酯，如乙酸乙酯、乙酸丁酯；离子配对剂，如水杨酸。

该组合物可组成面膜、洁面、保护、治疗或护理霜，用于面部或身体(例如，日霜、夜霜、化妆去污霜、粉底霜或防晒霜)、化妆卸妆乳或乳液、凝胶或用于护理皮肤的泡沫，如清洁乳液。

更多有关合适的局部制剂的细节，可参考标准教科书，如“Harry'sCosmeticology”第9版(2015)，化学出版公司。

制剂中，本发明所述的石墨烯纳米材料产品的量可在0.01％至10％w/w、优选0.01％至5％w/w、更优选0.1％至3％w/w的范围内。

有益效果和用途

如下面的实例所证明，本发明的产品是无毒的，在局部使用的情况下也是无毒的，并且具有良好的生物相容性。

此外，令人惊讶的是，本发明的产品在体外和离体培养均实质性地改变了脂肪组织的组织表型，因此，其在化妆品的应用方案中可用作减脂剂。

因此，本发明的石墨烯产品及其组合物可用作化妆品。术语“化妆品”可理解为，旨在改善皮肤或其附属器官的美学外观。它是非治疗性的。

肥胖和/或超重与一些称为脂肪细胞的细胞的表型变化和反应有关，这些细胞积累或释放形成甘油三酯的自由脂肪酸和甘油的动态过程是不平衡的。[Saponaro C等人，《营养素》，2015年，79453-9474；Tontonoz P.等人，《年鉴》.版次.生物化学.200877:289-312]

在饮食过于丰富或人们不进行体育锻炼的情况下，其体内积累的脂肪就会出现严重的不平衡，会逐渐产生包括脂肪组织面积增加，皮下脂肪组织增厚引起的皮肤变形在内的问题。

本发明所述的石墨烯产品经证明，在体外和离体培养的脂肪细胞和脂肪库的表型可塑性修饰中是有效的。

因此，本发明所述的石墨烯产品以及包含它的化妆品组合物可用于皮肤中脂肪沉积以及减少蜂窝组织炎和皱纹的美容性治疗。

根据如上所述，本发明还涉及一种旨在防止或减少脂肪组织体积增加和/或脂肪块形成的美容性治疗方法和/或一种减肥方法，包括在全身或局部应用包含本发明所记载的石墨烯产品的组合物。可在易发生脂肪代谢障碍的部位进行涂抹，如腹部、大腿顶部或手臂，或面部的某些部位，如面部底部。该方法通过改变脂肪细胞表型来改善人体及皮肤的外观。

因此，本发明的石墨烯产品可用于非治疗性(例如化妆品)治疗(“非治疗性用途”)，例如为了美观效果而增强脂肪分布，例如四肢、腹部和/或臀部的脂肪分布。本发明所记载的石墨烯产品的美容用途包括减少皮下脂肪，这将改善由于皮下脂肪积聚而引起的蜂窝组织炎或其他由于皮下脂肪堆积而造成的变形，(如)消除皱纹、静脉曲张和其他皮肤缺陷或(其他)易于改善的外观。

皮下脂肪团位于真皮内。在皮下，真皮的深层、脂肪细胞或成脂细胞(adipocytes)聚集在一起形成小叶，小叶由相互平行并垂直于皮肤表面的分隔物(成排的胶原纤维)分隔。脂肪细胞是一个大细胞，其体积的80％由一个或多个脂质液泡组成。其大小不一。如果液泡中的脂肪过多，脂肪细胞的体积就会增加，真皮结缔组织就会增厚。

脂肪细胞中脂肪积聚的另一个影响是使到达组织的血液减少，这会导致液体积聚、肿胀、组织损伤和坏死。这对身体和整体外观具有负面影响，例如形成静脉曲张。因此，本发明所记载的产品以及包含它的组合物可用于防止或修复这种损伤。优选地，本发明的产品可用于静脉曲张的美容治疗。

在另一实施例中，本发明的石墨烯产品和包含其的化妆品组合物可用于化妆品皮肤修复。

施用方式

优选地，本方式中使用的组合物局部使用。

包含本发明石墨烯产品的局部制剂的每日剂量可取决于各种因素，例如性别、年龄、体重和患者的个体状况。

实施例

实施例1

GMC-1的制备及其理化性质研究

原料

可用于制备本发明石墨烯纳米材料的原材料的结构特征、石墨化程度以及主要物理-化学和热性质呈现在下表1中。

表1:GNFs原料的理化性质

a晶体中的石墨烯面数(npg＝Lc/d)；d是层间范围；Lc是样品中晶体在垂直于石墨烯基面方向上的平均尺寸

^b ID/IG:拉曼光谱中D带和G带强度的商。

在本实施例中，石墨烯纳米纤维(GNFs)已用于制备本发明所记载的材料。

利用HF对粗石墨烯基碳纳米材料(GNFs)进行纯化处理，以去除合成过程中混入的GNFs结构中的金属和杂质。纯化过程在低温(20-50℃)下进行数小时(12-24小时)。之后，将纯化的碳纳米材料真空干燥并用Millipore(密理博)水洗涤至中性pH。

纯化后的GNFs在室温下用水或其他溶剂的溶液中进行数小时(2-5小时)的剥离过程。最后，通过加热(200-500℃，10-60分钟)对材料进行标准化脱热原过程。

所得产物(GMC-l)的特性如下：

GMC-1的元素分析

GMC-l和原料之间的主要差异可在其元素分析中观察到(表2)。与未经处理的GNFs相比，GMC-l仅由碳和氧组成。毒理学实验证实，它不含任何可能危害到人体健康的杂质。

表2：未经处理的GNFs和GMC-1的元素分析

元素	CNFs	GMC-1
			C	80-90	92-95
O	10-15	5-6
			杂质(金属，催化剂载体等)	0.5-1.5	0.0-0.01

GMC-1的拉曼光谱

使用512nm激光获取GMC-l的拉曼光谱。其显示了(图1)炭原料的特征峰。D峰1332cm^-1，G峰1580cm^-1。G带对应于碳原子网，即理想状态下的石墨结构，而D带则是由于(实际情况下)基面和边缘部分的存在。石墨烯纳米纤维的D带强度比G带大。如果石墨材料中含有大量的边缘部分，就会如这些纳米纤维一样出现一个大的D峰。峰D和峰G都没有太高的带宽这一事实也表明了纳米纤维具有结晶性。

GMC-1吸附脱氮分析

通过气体物理吸附测量固体总表面积的原理是检测覆盖固体表面所需的气体分子数量。一旦知道了分子所占的面积，固体的表面积就可以通过体积法或重量法测量(Brunauer、Emmett和Teller)，根据吸收的气体分子的数量来估算。

假设孔隙中随后充满液体吸附质，则总比表面积由多点BET方程计算，而总孔隙体积由相对压力P/P₀＝0.99下吸附的蒸汽量确定。平均孔径，假设其为圆柱形，则可根据总孔隙体积值和表面积进行估算，假设相对压力小于1时，未填充的孔隙对孔隙样品的体积和表面积没有影响。

采用QUANTACHROM模型QUADRASORB-SI模型，在77K下通过N₂的吸附-解吸进行比表面积、孔隙体积和孔隙面积的分析，该模型具有六个脱气口和三个分析口，由软件(QUADRA-WIN)进行控制，该软件收集每体积N₂的相对压力值。图2显示了GMC-1的表面积、孔隙孔体积以及孔径。

BET表面积：300-350m²/g

孔隙体积：0,35-0,4cm³/g

孔径：5-6nm

GMC-1的X射线衍射分析

进行了GNFs样品所对应的X射线衍射图(图3A)。据观察，它在25.9°附近出现一个峰值，其对应于石墨平面002之间的距离，或石墨烯片之间的距离。在高度结晶的石墨中，其层间距为0.334nm。在这种情况下，纳米纤维的距离略大，为0.343nm，这表明它们具有短程结晶性并且呈现出涡轮层状。在垂直于平面002(Lc)的方向上的晶体尺寸为4.64nm，也同样可以表明上述事实。

图3B表示本发明所记载的材料样品GMC-l所对应的衍射图。GNFs和GMC-l呈现相同的峰，但是在GMC-l中，这些峰呈现较低的值2θ。

表3显示了GNFs和GMC-l的特征晶体学参数：

层间空间(d002)

晶体堆叠高度(Lc)

面内微晶大小(La)

晶体中石墨烯层数(npg)

其中：

λ，辐射波长(λ＝015404nm)

θ1，衍射峰位(°)

θ2，衍射峰位(°)

k_l，形状系数(k＝0,9)

k₂，沃伦形状系数常数(k＝l，84)

FWHM，对应衍射峰半高宽度(rad)

表3:GNFs和GMC-l的X射线衍射参数

	Lc(nm)	La(nm)	d(nm)	npg
					GNFs	2.19	2.99	0.341740	6.4
GMC-1	2.08	2.8	0.344338	6.05

当GNFs转变为GMC-l时，材料的晶体结构发生变化。通过这种方式，在GMC-l中观察到由于材料经过提纯、清洁和剥落过程，晶体堆叠高度(Lc)、面内微晶大小(La)和晶体中石墨烯层的数量(Nc)降低。GMC-l中的层间空间由于材料试验中的剥离过程而增大。实验a的晶体堆叠高度(Lc)和面内微晶大小(La)由于纯化和剥离过程而减小。

粒径分布

使用Malvern Panalytical的Mastersizer 3000测量原料GNFs和本发明所记载的产品GMC-l的粒径分布。Mastersizer 3000使用激光衍射技术来测量粒子的大小。测量过程是通过测量激光束通过分散粒子样品时的散射光强度来实现的。然后对这些数据进行分析，以计算产生散射图案的粒子的大小。

图4A显示了GNFs和GMC-1的粒径分布(以粒子数计)的比较。

图4B显示了根据GNFs和GMC-1的粒子体积百分比对粒子大小分布的比较。

在图中可以观察到参数d(0.1)、d(0.5)和d(0.9)，dn是指粒子的数量，dv是指粒子的体积。

对于GNFs，dn(l0)参数表示10％的粒子数的大小为1.121μm或更小，dn(50)参数表示50％的粒子数的大小为1.573μm或更小，dn(90)参数表示90％的粒子数的大小为3.909μm或更小。对于GNFs，dv(l0)参数意味着样品体积的10％被尺寸为19.764μm或更小的粒子占据，dv(50)参数表示样品体积的50％被尺寸为57.711μm或更小的粒子占据，dv(90)参数表示样品体积的90％被尺寸为103.114μm或更小的粒子占据。

在GMC-l的情况下，dn(l0)参数表示10％的粒子数具有0.313μm或更小的尺寸，dn(50)参数表示50％的粒子数具有0.394μm或更小的尺寸，dn(90)参数表示90％的粒子数具有0.577μm或更小的尺寸。对于GMC-l，dv(l0)参数表示样品体积的10％被粒径为10.549μm或更小的粒子占据，dv(50)参数表示样品体积的50％被尺寸为39.693μm或更小的粒子占据，dv(90)参数表示样品体积的90％被尺寸为69.576μm或更小的粒子占据。

在GNFs和GMC-l的粒径分布在数量和体积上的对比中表明，GMC-l具有较低的粒径分布。综上所述，GNFs粒子数的dn(90)为3,909μm或更小，粒子体积的dv(90)为103,114μm或更小，而GMC-l粒子数的dn(90)为0.577μm或更小，粒子体积的dv(90)为69.576μm或更小。图4A和4B清楚地显示了与所用原材料(GNFs)相比，GMC-l中粒子数量和体积较小。

生物活性

统计

所示数据表示为可变数量实验的平均值±SEM。对2个样本进行Student's t检验，对>2个样本进行单因素或双因素方差分析(ANOVA)，采用配对或非配对设计，然后进行多重比较检验。P<0.05的值具有统计学意义。

实施例2:GMC-1对脂肪细胞的毒性试验

脂肪组织分布在不同的部位，从皮下到腹腔(内脏脂肪)。组织是由脂肪细胞或成脂细胞形成的，也可由前脂肪细胞和免疫细胞形成。脂肪组织的主要功能是调节和代谢甘油三酯和产生调节激素。除了脂肪库所在的位置外，传统上脂肪组织分为A)白色脂肪组织，其主要功能是积聚脂质滴作为能量储备，B)棕色脂肪组织，其主要功能是通过大量线粒体产热，C)米色脂肪组织，它存在于WAT中，但其却具有BAT的形态和功能特征。考虑到来自这些不同脂肪库的脂肪细胞的分化状态，从完全成熟的脂肪细胞到未分化的脂肪细胞，它们的表达模式是可改变的，因此这些细胞具有重要的表型可塑性[Luo L.，Liu M.；控制代谢的脂肪组织.内分泌杂志.。2016年12月；23l(3)：R77-R99.]。

在研究GMC-l的功能活性之前，我们首先测试了悬浮液中，在脂肪细胞系3T3L1培养条件下培养的脂肪细胞的产品活力和毒性，作为6孔培养皿中体外分化脂肪细胞的模型，培养皿每孔培养300000个细胞，并让其在添加了10％胎牛血清的培养基(默认情况下，DMEM)中生长。细胞在37℃、5％CO₂和湿度的受控培养箱条件下培养。一旦他们到达汇合点，将血清移除16小时。在相同的控制维持条件下，将产品作为悬浮液滴入其中，在相同的控制条件下，在不同浓度中以相同的最终体积保持24小时。之后，对细胞进行处理，并通过药理学和毒理学研究中所述的两项试验对其活力和毒性进行补充试验：

a)台盼蓝排除法，区分活/死细胞，以及

b)用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)细胞染色法测定代谢活性。

结果如图5所示。结果表明，GMC-l对培养的脂肪细胞无毒。

实施例3:GMC-1对脂肪细胞和脂肪库的体外功能测定。

肥胖和脂肪堆积的增加与2型糖尿病和代谢综合症等多种病理状态有关，这是因为，堆积脂肪的脂肪细胞与慢性炎症有关，即产生较低的保护性激素(如瘦素，脂联素)以及增加促炎激素(或肌肽)的产生，如白细胞介素-6(IL-6)。[Luo L.，Liu M.；控制新陈代谢的脂肪组织.内分泌杂志.2016年12月；23l(3)：R77-R99。]

在美容方面，皮下脂肪组织的增加可能会逐渐表现为皮下脂肪组织增厚而引起的皮肤变形，而皮下脂肪组织增厚会造成不期望的皮肤外观以及蜂窝组织炎。

考虑到脂肪细胞的分化状态，促脂肪生成转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体g(PPARγ)的表达至关重要。另一方面，胰岛素依赖性葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)的表达增加与胰岛素敏感性的改善相关。

因此，WAT中PPARγ表达的增加意味着促肥胖状态的增加，而WAT中GLUT4表达的增加意味着胰岛素抵抗力的降低。

我们在体外和离体实验中研究了GMC-l修饰脂肪组织表型的能力。

如本部分所述，功能性研究是基于脂肪细胞的表型可塑性。因此，我们检测了白细胞介素-6(IL-6)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和白细胞介素-6(IL-6)等基因的表达，以及葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)[Jung，U.J.和Choi，M.S.肥胖症及其代谢并发症：脂肪因子的作用以及肥胖症、炎症、胰岛素抵抗、血脂异常和非酒精性脂肪肝病之间的关系。国际分子科学杂志。2014年4月11日；15(4)：6184-223；；Armoni，M.等。GLUT4基因的转录调控：从PPARγ和FOXOl到FFA和炎症。内分泌代谢趋势。2007年4月；18(3)：100-7.]

治疗后(24小时)，两种溶液均使用无毒浓度的2x GMC-l(20microg/ml)便捷悬浮液或普通溶媒作为对照。首先，利用融合性完全分化的脂肪细胞，可通过操纵脂肪细胞系3T3l1的培养条件获得。第二步，使用雄性或雌性，3-8个月大，体重在300-500之间(n＝18)的，体重相近、经过机械分离的正常体重的啮齿类动物(褐家鼠)的内脏(附睾区)进行切片[Gao，X.等人.在磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶缺陷小鼠中，白色脂肪组织中的脂肪生成减少有助于抵抗高脂肪饮食诱导的肥胖。生物嵌合与生物物理学学报1851(2015)152-162]，应用逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)来检测其表达变化。用商用基因表达分析法(TaqMan，Life Technologies)扩增从不同样本中提取100ng、由原始mRNA转化的DNA(cDNA)。通过分子内标(β-肌动蛋白)来使上述数值标准化，然后使用2^-deltadeltaCt法来体现表达中的折叠变化。

结果如图6所示。GMC-l在体外和离体培养(实验中)均能改变脂肪细胞的表型可塑性。

Claims (11)

1.一种石墨烯纳米材料在制备化妆品方面的用途，其中所述石墨烯纳米材料选自石墨烯纳米纤维，所述石墨烯纳米材料的粒径分布的dn(90)为0.60μm或更小粒子数，粒子体积dv(90)为80.00μm或更小体积粒子，粒径分布通过激光衍射粒子分析仪测得。

2.根据权利要求1所述的石墨烯纳米材料在制备化妆品方面的用途，其中，所述化妆品具有减少皮肤的脂肪组织的功效。

3.一种石墨烯纳米材料在制备用于防止或减少脂肪组织体积增加和/或形成脂肪块的化妆品方面的用途，其中，将所述石墨烯纳米材料施用于皮肤；所述石墨烯纳米材料选自石墨烯纳米纤维，所述石墨烯纳米材料的粒径分布的dn(90)为0.60μm或更小粒子数，粒子体积dv(90)为80.00μm或更小体积粒子，粒径分布通过激光衍射粒子分析仪测得。

4.根据权利要求3所述石墨烯纳米材料在制备用于防止或减少脂肪组织体积增加和/或形成脂肪块的化妆品方面的用途，其中，所述化妆品还具有减少蜂窝组织炎、皱纹和/或静脉曲张的功效。

5.包含石墨烯纳米材料的组合物在制备用于防止或减少脂肪组织体积增加和/或形成脂肪块的化妆品方面的用途，其中，将所述包含石墨烯纳米材料的组合物施用于皮肤；所述石墨烯纳米材料选自石墨烯纳米纤维，所述石墨烯纳米材料的粒径分布的dn(90)为0.60μm或更小粒子数，粒子体积dv(90)为80.00μm或更小体积粒子，粒径分布通过激光衍射粒子分析仪测得。

6.根据权利要求5所述包含石墨烯纳米材料的组合物在制备用于防止或减少脂肪组织体积增加和/或形成脂肪块的化妆品方面的用途，其中，所述化妆品还具有减少蜂窝组织炎、皱纹和/或静脉曲张的功效。

7.一种化妆品组合物，其中，所述化妆品组合物包含石墨烯纳米材料产品以及美容上可接受的赋形剂，所述石墨烯纳米材料选自石墨烯纳米纤维，所述纳米材料的粒径分布的dn(90)为0.60μm或更小粒子数，粒子体积dv(90)为80.00μm或更小体积粒子，粒径分布通过激光衍射粒子分析仪测得。

8.根据权利要求7所述的化妆品组合物，其中所述组合物适于局部使用。

9.根据权利要求7或8所述的化妆品组合物，其中，所述化妆品组合物是选自乳霜、乳液、软膏、微乳剂、凝胶、糊剂、泡沫、酊剂、贴剂、绷带和膜中的任意形式。

10.根据权利要求9所述的化妆品组合物，其中，所述化妆品组合物为选自乳霜、水凝胶、脂肪软膏或乳状凝胶的形式。

11.一种由石墨烯纳米纤维原料制备石墨烯纳米材料的方法，包括以下步骤：

a)使用强酸，在20-50℃下纯化石墨烯纳米纤维原料，以去除石墨烯纳米纤维原料中存在的杂质，其中所述强酸为H₂SO₄、HCl、HF、HNO₃或HBr；

b)缩小纯化的石墨烯纳米纤维材料的粒径，通过剥离工艺将dn(90)减小至0.60μm或更小粒子数量，dv(90)减小至80.00μm或更小粒子体积，粒径分布通过激光衍射粒子分析仪测得，

c)可选地，对所获得的产物进行脱热原处理。