BRPI1105312A2 - Composições farmacêuticas compreendendo extrato de arrabidaea chica, verlot em sistemas de liberação micro e nanoparticulados e lipossomais, processos de fabricação e uso dos mesmos - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÕES FARMACÉUTICAS COMPREENDENDO EXTRATO DE ARRABIDAEA CHICA VERLOT EM SISTEMAS DE LIBERAÇÃO MICRO e NANOPARTICULADOS E LIPOSSOMAS, PROCESSOS DE FABRICAÇÃO E USO DOS MESMOS. A presente invenção se refere a composições farmacêuticas compreendendo extrato de Arrabidaea chica em sistemas de liberação micro e nanoparticulados, e lipossomas, bem como processos de obtenção e uso dos mesmos para a cicatrização de lesões cutâneas.

Description

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS COMPREENDENDO EXTRATO DE ARRABIDAEA CHICA VERLOT EM SISTEMAS DE LIBERAÇÃO MICRO E NANOPARTICULADOS E LIPOSSOMAIS, PROCESSOS DE FABRICAÇÃO E USO DOS MESMOS

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CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a composições farmacêuticas compreendendo extrato de Arrabidaea chica em sistemas de liberação micro e nano particulados e lipossomas, bem como processos de obtenção das mesmas.

As formulações da presente invenção compreendem sistemas de liberação micro e nanoparticulados poliméricos ou lipossomas que garantem a proteção e estabilidade do extrato bruto da A. chica com atividade cicatrizante. A presente invenção também descreve processos para a

fabricação de sistemas de liberação micro e nanoparticulados poliméricos ou lipossomas compreendendo extrato de A. chica. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO 2 0 Características da planta

Arrabidaea chica (Humb. and Bonpl.) B. Verlot é membro da família Bignoniaceae, a qual abrange 120 gêneros e 800 espécies, e se distribui pela América tropical desde o sul do México até o Brasil central (Devia et al., 2002). No Brasil, as plantas dessa família são encontradas desde a Floresta Amazônica, Cerrado e Mata Atlântica. Popularmente A.chíca é conhecida como pariri (no Pará), crajiru (no Amazonas), puca-panga, coapiranga, chica ou cipó-cruz (Von- Poserf 2000).

No nordeste do Brasil, A. chica é usada em tatuagens pelos índios devido aos pigmentos carajurina e carajurona (Corrêa, 1926; Chapman et al., 1927; Zorn et al., 2001). As folhas submetidas à fermentação e manipuladas como as anileiras {índigo fera spp.) fornecem matéria corante vermelho-escuro ou vermelho-tijoio. Algumas tribos preparam uma infusão das folhas para o tratamento de conjuntivite aguda, e uma pasta, na forma de cataplasma, contra ataque de insetos. Na medicina popular, as folhas dessa espécie são usadas na preparação de chás com propriedades adstringentes para o tratamento de diarréia, anemia, leucemia, icterícia e albuminuria. Quando aplicada topicamente, são atribuídos à espécie A. chica propriedades terapêuticas para enfermidades da pele (psoríase, feridas, úlceras) (Takemura et al., 1995). Há ainda relatos de eficácia anti-inflamatória (Oliveira et al., 2009), antibacteriana e antifúngica (Barata, 2006; Hofling et al., 2010), contra câncer de boca, de útero e leucemia (Kalil Filho et al., 2000); e eficácia contra dermatófitos de Trypanosoma cruzi (Trichophyton mentagrophytes) (Barbosa et al., 2008) .

As espécies pertencentes ao gênero Arrabidaea são usadas na medicina tradicional para assepsia de feridas e tratamento de desordens intestinais (Corrêa, 1926) . Pauletti et al. (2003) descobriram novas glicosilxantonas isoladas do caule de A. samydoides que apresentaram propriedades antioxidantes. Alcerito et al. (2002) isolaram quatro flavonóides com atividade antifúngica das folhas de A. brachypoda.

O gênero Arrabidaea é fonte de antocianinas, flavonóides e taninos (Harborne, 1967; Takemura, 1995; Zorn et al., 2001; Alceritol. 2002; Devia et al., 2002; Pauletti et al., 2003).

O primeiro estudo fitoquímico das folhas de A. chica

relata o isolamento de 3-deoxiantocianidina, a carajurina (Chapman et al., 1927). Posteriormente, Scogin (1980) e Harborne & Willians (2001) propuseram que a ocorrência deste raro pigmento em Bignoniaceae era provavelmente restrita a A. chica. Estudos posteriores resultaram no isolamento de antocianinas, fitoesteróis, 7,4'-di-hidroxi- 5-metaxiflavona e 6,3',4'-tetrahidroxi-5-metoxiflavona (carajuruflavona) (Takemura et al.,1995).

Devia et al. (2002) purificou por HSCCC (cromatografia contra corrente) e elucidou as estruturas das 3- deoxiantocianidina por RMN de 1H e 13C, HPLC-MS e incluindo análises de cristalografia de Raio X para carajurina.

Williams & Grayer (2004) citam o isolamento de novas agliconas, destacando-se a 3-deoxiantocianidina, a 6,7,3'- trihidroxi-5-dimetoxiflavilium (1) e a 6,7,3',4'- tetrahidoxi-5-metoxi-flavilium (2), provenientes das partes aéreas da A. chica juntamente com a conhecida 6,7-di- hidroxi-5,4'-dimetoxiflavilium (carajurina). Formulações cosméticas ou farmacêuticas têm empregado

extratos de Carajiru como componentes de protetores solares ou produtos para cuidados da pele: em produtos de maquiagem, como antioxidante inibindo formação de rugas e melhorando a tonicidade da pele ou como agente anti- inflamatório. Os extratos da planta também são utilizados como material corante em formulações cosméticas (Xavier, 2003). 0 extrato de Carajiru é utilizado juntamente com extratos de outras plantas no tratamento de pele, antienvelhecimento, tratamento de cabelos, e cavidade oral (Chiyoko, 2001), assim como antifúngico e antimicrobiano (Barata, 2006) .

Outras atribuições da espécie Arrabidaea chica

Além das propriedades desenvolvidos no CPQBA-UNICAMP

descritas acima, comprovaram que o

estudos extrato bruto de A. chica induz a proliferação de fibroblastos in vitro e estimula a síntese de colágeno in vivo e in vitro, além de apresentar moderada capacidade antioxidante e atividade antiulcerogênica (Jorge 2008). Portanto, A. chica também possui propriedades terapêuticas potenciais para enfermidades da pele.

A pele

A pele é o maior órgão do corpo, correspondendo a 16% do seu peso, que serve como barreira contra agentes externos. É constituída por duas camadas denominadas epiderme e derme.

A epiderme é a camada mais externa constituída por tecido epitelial tendo como principais tipos celulares os melanócitos, as células de Langerhans e os queranócitos (Junqueira & Carneiro, 1999) . Sob a epiderme, localiza-se a derme que é constituída por tecido conjuntivo. Esse tecido conjuntivo é firme, flexível e elástico, além de nutrir e sustentar a epiderme devido à presença de vasos sangüíneos, terminações nervosas e vasos linfáticos. Apresenta apêndices dérmicos como unhas, cabelos e glândulas (Junqueira & Carneiro, 1999) . O tecido conjuntivo é composto por diversos tipos celulares incluindo células cartilaginosas, células ósseas e fibroblastos, os quais são especializados na secreção da matriz extracelular rica em fibras de colágeno e fibra elástica, responsáveis pela arquitetura estrutural do corpo. As células do tecido adiposo e as musculares lisas também fazem parte das células do tecido conjuntivo (Alberts et al., 2004).

Agentes químicos, físicos, microbiológicos e mecânicos podem causar lesões teciduais. A perda da integridade de extensas porções de pele pode levar a grande disfunção, ou mesmo morte (Balbino et al., 2005) .

Cicatrização

A cicatrização é um processo complexo e dinâmico que

resulta na restauração da função e da continuidade anatômica. Este processo pode ser dividido em três fases: inflamatória, proliferativa e remodelamento. Alterações em uma destas fases levam a uma lentidão no processo cicatricial ou até mesmo à sua interrupção (Mavioso, 2003) .

Os macrófagos, que aparecem na fase inflamatória, liberam fatores de crescimento e citocinas, cruciais na maturação da fase inflamatória e iniciação do processo de cura da ferida. Os fatores de crescimento como IGF-I e TGF- β, são responsáveis pela proliferação de fibroblastos. 0 IGF-I aumenta a expressão da cadeia pró-alfa 1 (I) e pró- alfa 1 (I-II) do pró-colágeno em cultura de fibroblastos da derme (Pimentel, 2001; Balbino, 2005).

Em patologias como a diabetes, o aparecimento de neuropatia diabética pode levar a ocorrência de ulcerações nos pés (pé diabético) em conseqüência da disfunção endotelial que impede uma ação eficaz dos mediadores da inflamação. Essa deficiência cicatricial pode, em muitos casos, colaborar com o processo que leva à amputação do membro (Kakizawa et al., 2004) .

0 interesse na pesquisa de novas substâncias ativas de origem vegetal tem aumentado significativamente. Em particular, crescem também as investigações de extratos vegetais que auxiliem no processo cicatricial, principalmente de úlceras de diabéticos e aquelas provocadas pelo efeito colateral do uso de alguns medicamentos e também quimioterápicos. A avaliação da ação desses extratos é feita nas três etapas do processo cicatrizante (Newman, 2008; Cragg & Newmanf 2009) .

Mucosite

A mucosite induzida por quimioterapia e radioterapia ainda representa um dos principais efeitos colaterais indesejáveis do tratamento do câncer (Sonis et al., 2001; Elting et al., 2003). A toxicidade ao trato gastrintestinal vem sendo a maior preocupação clinica dentre os efeitos adversos do uso de quimioterápicos. Essa toxicidade é freqüentemente a maior causa de morbidade relacionada ao tratamento (Yánez et al., 2003) . Cicatrização e utilização de bisfosfonatos

Os bisfosfonatos são um grupo de medicamentos, utilizados no tratamento de doenças ósseas como osteoporose e doença de Paget, e como coadjuvantes no tratamento de mieloma múltiplo e doenças malignas metastáticas. Esses fármacos inibem a função osteoclástica e dessa forma a Iise óssea {Marx, 2007) ; além de possuírem ação apoptótica em fibroblastos e queratinócitos causando também ulcerações mucosas (Scheper et al., 2009) . Tem sido observada em pacientes usuários crônicos dos bisfosfonatos uma importante complicação, denominada de osteonecrose dos maxilares e caracterizada clinicamente por exposições ósseas persistentes na região maxilofacial (Bagan et al., 2006) . Dessa forma, é necessário o desenvolvimento de um tratamento que seja efetivo para a promoção da cicatrização óssea e epitelial da cavidade oral, processos prejudicados em pacientes usuários de bisfosfonatos.

Angiogênese

O processo cicatricial inicia-se a partir de uma injúria que desencadeia uma cascata complexa e organizada de eventos celulares e moleculares. Pode ser dividida em três fases distintas e superpostas: fase inflamatória, fase proliferativa e fase de remodelagem. Cada uma dessas fases envolve a produção e secreção de substâncias com atividade sinalizadora e estimuladora no processo, como as citocinas e fatores de crescimento (Madri et al., 1996) .

Angiogênese é resultado de processos seqüenciais iniciados com a ativação de células endoteliais, migração para brotamento de novos vasos, e maturação desses vasos circundados por células musculares lisas e pericitos (Hirschi et al., 2002).

A formação de vasos sangüíneos é um processo complexo, requer um balanço finamente harmônico entre numerosos sinais estimulantes e inibitórios, como integrinas, angiopoietinas, quimiocinas, moléculas juncionais, sensores de oxigênio, inibidores endógenos e muitos outros.

Durante a fase de angiogênese, o plexo vascular expande-se progressivamente por meio do brotamento de vasos e remodelagem em uma cadeia vascular fortemente organizada e estereotipada de grandes vasos ramificados em outros menores (Carmeliet, 2005).

Novos microvasos tornam-se maduros quando túbulos contínuos ligam-se por anastomose um ao outro e uma nova membrana basal é formada (Peattie et al., 2004) .

Depois do nascimento, o processo angiogênico só ocorre em eventos específicos, como no desenvolvimento do corpo lúteo, no endométrio uterino da fêmea preparando-a para a reprodução, no desenvolvimento da placenta durante a gravidez, na cicatrização de feridas cutâneas e na regeneração óssea (Cai et al., 2005).

Micro e nanoformulações

Na última década, a utilização de micro e nano partículas encapsulando compostos bioativos, cuja ação biológica na forma livre já é conhecida, tem trazido grandes benefícios para terapêutica. A incorporação de fármacos em sistemas de liberação modifica a sua apresentação ao sistema biológico, aumentando a sua eficiência de ação (Vasir et al., 2003; Granada et al., 2007) . A encapsulação permite não só a preservação da atividade do bioativo através da sua proteção contra as agressões do meio externo, como luz, oxigênio e o próprio meio biológico, mas também proporciona a sua liberação gradativa ou sustentada e direcionamento para o sítio específico de ação, também chamado de vetorização.

Dessas características resulta uma maior eficiência no aproveitamento do composto administrado, reduzindo-se assim as doses e a freqüência de administração (Mehnert, 2001; Granada et al., 2007). A encapsulação e liberação sustentada modificam a farmacocinética e a farmacodinâmica de bioativos, de forma que a formulação contendo um bioativo encapsulado constitui um novo medicamento em relação à sua forma livre. Os avanços no desenvolvimento da tecnologia de encapsulação têm permitido o preparo de micro e nanoparticulas com propriedades fisico-quimicas e biológicas requeridas para uma determinada aplicação específica. Uma cápsula ou invólucro eficiente deve carrear o bioativo e facilitar a sua absorção (Santana et al., 2007) .

Inúmeras técnicas permitem encapsular um material ativo, podendo ser divididas em métodos físicos: atomização (spray drying) , pulverização em banho térmico, leito fluidizado, extrusão centrífuga com múltiplos orifícios, co-cristalização e liofilização {freeze drying); métodos químicos: inclusão molecular e polimerização interfacial, reticulação química; métodos físico-químicos: coacervação, separação por fase orgânica (emulsão) pulverização em agente formador de reticulação e envolvimento lipossômico (Jackson & Lee, 1991; Risch & Reineccius, 1988; Shahidi & Hanr 1993) .

Partículas produzidas por atomização A secagem por atomização ou spray drying, pode ser

definida como a transformação de um material fluido (solução, dispersão ou pasta) em partículas secas, na forma de pó (Ré, 1998) . O processo é contínuo e envolve basicamente as seguintes etapas: formação de uma emulsão ou suspensão do agente encapsulante e do material ativo, atomização em uma câmara de secagem contendo ar quente circulando e evaporação do solvente, com conseqüente secagem das goticulas atomizadas (Jackson & Lee, 1991;

Shahidi & Han, 1993) . A rápida evaporação provocada pela técnica, mantém a temperatura das goticulas relativamente baixa, sem afetar o produto final (Filková & Mujumdar, 1995; Ré, 2000). 0 spray dryer é um equipamento de simples utilização, amplamente empregado para a obtenção de microparticulas. Uma maior produtividade pode ser obtida ajustando as variáveis do processo, entre elas: temperatura do ar de entrada e saída, fluxo de ar ou fluído de arraste, distribuição de temperatura e umidade (Filková & Mujumdar, 1995) .

Segundo Wendel & Çelik (1998) e Filková & Mujumdar

(1995), embora o spray drying seja uma tecnologia inicialmente cara, em razão do alto custo do equipamento, muitas são as razões pelas quais ela é muito utilizada. As vantagens dessa tecnologia incluem a obtenção de partículas de alta qualidade (uniformes e esféricas) , a possibilidade de secar produtos à pressão atmosférica, a facilidade em relação à produção de grandes volumes em operação contínua, utilizando-se equipamentos de fácil operação, com boa eficiência, a ampla aplicabilidade e flexibilidade da técnica por permitir o processamento de várias matérias primas e a rapidez. Esses fatores somados possibilitam a comercialização de um produto de excelente qualidade a um custo relativamente baixo.

A seleção do material formador de parede depende de

uma série de fatores, entre eles a não reatividade com o material a ser encapsulado, as propriedades fisico-quimicas do material (como massa molar, solubilidade e difusibilidade), o processo utilizado para fabricação das microparticulas e a aplicação final destas (Jackson & Lee, 1991) .

Entre os materiais formadores de parede de partículas mais usados está a goma arábica. A goma arábica é um exsudato formado em resposta a algum dano na planta, extraído do tronco e ramos de espécies de Acacia, em especial Acacia senegal L. É vastamente utilizada como material encapsulante devido a sua excelente propriedade emulsificante, estabilizante e sua ação protetora contra oxidação (Buffo et al., 2001). Outro exemplo de material formador de parede de

microparticulas é a maltodextrina. A maltodextrina é, por definição, um amido modificado, obtido a partir da conversão do amido, cujas principais características são: excelente proteção contra oxidação de voláteis encapsulados, ausência de capacidade emulsificante e baixa retenção de voláteis (Inglett et al., 1988).

Para aumentar a efetividade da microencapsulação, misturas entre diferentes agentes encapsulantes são sugeridas (Ré 1998; Fernandes et al., 2008; Bae & Lee, 2008) . Os resultados obtidos por Thevenet (1995) indicaram que uma mistura 1:1 de goma arábica e maltodextrina foi quase tão eficiente quanto goma arábica pura para estabilização oxidativa de óleo essencial de laranja (Azeredo, 2005) .

Partículas de quitosana

A quitosana é um biopolímero obtido da desacetilação da quitina. A quitina é o segundo polímero mais abundante na natureza, depois da celulose, e é o principal componente do exoesqueleto de crustáceos, a produção de quitosana é, portanto, economicamente viável (Pedro et al., 2009).

A aplicação da quitosana na encapsulação de fármacos para sistemas de liberação data da década de noventa e constitui um campo de pesquisa novo e promissor. Dentre as técnicas mais utilizadas para obtenção das partículas está a gelificação ionotrópica.

A gelificação ionotrópica consiste na reticulação iônica da quitosana com contra-íons multivalentes. A interação eletrostática se refere à interação que ocorre entre cargas eletrostáticas opostas, ou seja, as cargas positivas da quitosana interagem com as cargas negativas do agente de reticulação, promovendo a sua reticulação iônica. Esse processo visa principalmente reduzir a sua solubilidade no meio ao qual estão expostas. 0 agente de reticulação ou de ligação cruzada (crosslinking) , interage com a quitosana, reduzindo os poros da sua matriz. Em conseqüência, as partículas tornam-se mais rígidas, com menor capacidade de intumescimento, e prolongam o tempo de liberação do bioativo encapsulado (Silva, 2006) .

Entre os agentes de reticulação mais empregados está o tripolifosfato de sódio (TPP), que é atóxico e promove a reticulação iônica da quitosana em condições relativamente fáceis e com baixo custo de processo. Ao contrário da maioria dos agentes reticulantes, ele não apresenta graves restrições no manuseio e armazenamento (Vandelli et al., 1995) .

As partículas são formadas pela adição de uma solução à outra sob agitação magnética ou mecânica (Shu & Zhu, 2000). O fármaco ou bioativo pode ser adicionado à solução de - -quitosana (Janes et al., 2001; Shu & Zhu, 2000), ou à solução de TPP (Vila et al., 2002).

Partículas de ácido hialurônico

O ácido hialurônico (AH) é um polissacarídeo linear, de ocorrência natural, composto de unidades dissacaridicas repetitivas formadas por ligações β-1,4 ácido-D-glicurônico (β-1,3) N-acetil-D-glicosamina.

A estrutura primária do AH consiste nessas repetições, com mais de cinco pontes de hidrogênio entre cada dois dissacarideos vizinhos. A estrutura secundária é formada como uma hélice de fita dupla por uma rotação de 180° de cada unidade dissacaridea, comparada àquelas a frente e atrás da cadeia. A estrutura terciária em folha-β é energeticamente estabilizada pela presença de pontes de hidrogênio intermoleculares. As interações hidrofóbicas e pontes de hidrogênio em parceria com a repulsão eletrostática contrária possibilitam um grande número de moléculas para agregar formando matrizes de AH (Brown & Jones, 2005).

O AH é o maior polímero dos tecidos conjuntivos, encontrado em alta concentração no fluído sinovial de junções, fluído vítreo do olho, cartilagem, cordão umbilical e crista das aves (Segura et al., 2005). O AH é encontrado em quantidades variadas em todos os

tecidos de animais adultos, em frutas (caju) e em bactérias (gram negativas); é o mais simples glicosaminoglicano (GAG), sendo o único não sulfatado presente na matriz extracelular de vertebrados (Peattie et al., 2004). É especialmente prevalente durante a cicatrização de feridas e no fluido sinovial das articulações (Drury & Mooney, 2003) . Na ECM de tecidos conectivos, forma um suporte por ligar outras GAGs e proteoglicanos, que são mantidos através de interações especificas HA-proteína (Peattie et al.f 2004). 0 AH interage com outras macromoléculas e participa na regulação de células (migração celular, diferenciação e adesão) durante processos morfogenéticos e patológicos (Huang et al., 2003). É degradado pela enzima hialuronidase que possui a habilidade de clivar as ligações β-1,4 e β-1,3 das cadeias de sua molécula (Gonçalves, 2007) .

O AH solúvel tem sido usado em aplicações clinicas incluindo cirurgia ocular, visco-suplementação para artrite e cicatrização de feridas (Rosier & 0'keef, 2000). Entretanto, suas propriedades mecânicas pobres, degradação rápida e depuração in vivo, limitam sua aplicação clinica direta.

Para melhorar as propriedades mecânicas, grau de degradação e depuração, o AH pode ser modificado quimicament.e por ligações covalentes cruzadas tornando-o menos solúvel. A modificação química típica de AH envolve grupos ácidos carboxílicos e/ou grupos alcoóis da cadeia principal. O grupo ácido carboxílico pode ser modificado por esterificação e ligação cruzada com di-hidrazida. (Segura et al., 2005). OBJETIVOS DA INVENÇÃO

Constitui um objetivo da presente invenção fornecer composições farmacêuticas compreendendo extrato de Arrabidaea chica veiculado em sistemas de liberação microparticulados, como em matrizes compreendendo maltodextrina, goma arábica e goma de cajueiro ou misturas dos mesmos.

Constitui outro objetivo da presente invenção fornecer

composições farmacêuticas compreendendo sistemas de liberação micro e nanoparticulados poliméricos, compreendendo biopolimeros, como quitosana e ácido hialurônico.

Constitui outro objetivo da presente invenção fornecer

composições farmacêuticas compreendendo extrato de Arrabidaea chica veiculado em lipossomas.

Constitui mais um objetivo da presente invenção fornecer sistemas de liberação micro e nanoparticulados

compreendendo extrato de Arrabidaea chica. Os sistemas de liberação micro ou nanoparticulados da presente invenção podem ser baseados em matrizes compreendendo maltodextrina, goma arábica e goma de cajueiro ou misturas dos mesmos, quitosana, ácido hialurônico ou outros polímeros. Constitui um objetivo adicional da presente invenção fornecer lipossomas compreendendo extrato de Arrabidaea chica. Os lipossomas da presente invenção podem ser contatados com polietilenoglicol (PEG) para serem peguilados.

Constituem outros objetivos da presente invenção processos para a produção dos sistemas de liberação micro e nanoparticulados e lipossomas compreendendo extrato de Arrabidaea chica. Constitui um objetivo complementar da presente

invenção o uso do extrato de Arrabidaea chica para a preparação de micro e nanopartícuias, lipossomas e composições farmacêuticas compreendendo os mesmos para o tratamento de lesões cutâneas. DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

As figuras a seguir fazem parte do presente relatório e estão aqui incluídas a fim de ilustrar determinados aspectos da invenção. 0 objeto da presente invenção pode ser melhor entendido com referência a uma ou mais dessas figuras, em combinação com a descrição detalhada da modalidade preferida aqui apresentada.

Na Figura 1 são representadas estruturas químicas de agliconas isoladas das folhas de A. chica.

Na Figura 2 estão representadas as estruturas moleculares da quitina e quitosana.

A Figura 3 é uma representação da reticulação da quitosana com o tripolifosfato de sódio.

A Figura 4 é uma representação da estrutura molecular do ácido hialurônico, composto por repetições dissacaridicas de ácido glicurônico e N-acetilglicosamina. Fonte: disponível em www.talbotcentral.ucr.edu.

A Figura 5 apresenta os grupos alvo para a modificação química do ácido hialurônico (grupos OH e/ou COOH). Fonte: PRESTWICH, 2001.

A Figura 6 é um fluxograma da obtenção do extrato bruto e das micropartículas produzidas por atomização (spray drying) .

A Figura 7 é um gráfico comparando o diâmetro médio dos lipossomas convencionais e peguilados vazios e na presença do extrato de A. chica.

A Figura 8 é um gráfico comparando a polidispersidade dos lipossomas convencionais e peguilados vazios e na presença do extrato de A. chica. A Figura 9 é um gráfico comparando o potencial zeta

dos lipossomas convencionais e peguilados vazios e na presença do extrato de A. chica.

A Figura 10 é um gráfico comparando a condutividade elétrica dos lipossomas convencionais e peguilados vazios e na presença do extrato de A. chica.

A Figura 11 é um gráfico comparando a concentração do extrato presente em lipossomas convencionais e peguilados após rompimento.

A Figura 12 é a curva de vazão dos lipossomas

covencionais (LC) e lipossomas peguilados (LP).

A Figura 13 é um gráfico representando o diâmetro médio de LC após ensaio de elasticidade.

A Figura 14 é um gráfico representando o diâmetro médio de LP após ensaio de elasticidade.

A Figura 15 é um gráfico representando os resultados do ensaio de cicatrização, a porcentagem de contração das feridas após 10 dias de tratamento.

A Figura 16 é um gráfico demonstrando a quantificação de antocianinas de Arrabidaea chica por HPLC-DAD. Pig 1: 6,7,3',4'- tetrahidroxi-5-metoxi-flavilium; Pig. 2: 6,7,3'- trihidroxi-5-metoxiflavilium; Pig 3: Crajurina - 6,7-di- hidroxi-5,4'-dimetoxiflavilium. FAC: extrato sem

microencapsular; MAC: extrato microencapsulado. A Figura 17 é um gráfico representando a avaliação da

atividade angiogência em membrana corioalantóide (CAM). AH livre, microparticulas de AH nas condições de preparo de 1500 e 200*/1000**, A. chica livre (5, 10 e 25 mg/mL) . As barras verticais representam o desvio padrão da média. DESCRIÇÃO DOS ANEXOS

O Anexo 1 é uma microscopia de varredura das estruturas obtidas na preparação das partículas de AH contendo o ativo Arrabidaea chica. A: condição de 1.500 e 200 rpm, B: condição de 1500 e 1000 rpm. Aumento no negativo: 5000 x.

O Anexo 2 é uma microscopia de varredura para avaliação da razão Ativo (A. chica):AH. Relações molares das preparações: A e B: 1:1; C e D: 0,75:1; E e F: 0,5:1; G e H: 1,25:1; Ar C, EeG. foram preparadas nas condições de 1.500 e 1.000 rpm, e B, D, FeH nas condições de preparo de 1.500 e 200 rpm. Aumento no negativo: A: 3000 χ; Β: - H: 5.OOOx.

O Anexo 3 são fotográficas do ensaio de cicatrização. Observações visuais após dez dias de tratamento com: A) Salina (controle negativo) B) Extrato bruto de A. chica lg/mL C) extrato microencapsulado de A.chica lg/mL.

O Anexo 4 são fotografias para avaliação da atividade angiogência em membrana corioalantóide (CAM). A: Controle negativo absoluto (salina); B: AH livre; C: micropartícuias de AH condição 1500 e 200 rpm; D: micropartí cuias de AH condição 1.500 e 1.000 rpm E: A. chica 5 mg/mL; F: A. chica mg/mL; G: A. chica 25 mg/mL. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A seguir são descritas configurações exemplares das modalidades da presente invenção. Portanto, tal descrição não deve ser interpretada como uma limitação do escopo da presente invenção, mas somente como uma descrição de modalidades exemplares.

Em uma modalidade, a presente invenção descreve composições farmacêuticas compreendendo extrato de Arrabidaea chica veiculado em sistemas de liberação microparticulados. As composições farmacêuticas da presente invenção

foram formuladas com o propósito de proporcionar um medicamento fitoterápico eficaz para o tratamento de lesões cutâneas. Conforme explicado acima, o extrato de A. chica contém compostos químicos eficazes na cicatrização de lesões cutâneas, com propriedade angiogênica e indutora da proliferação de fibroblastos e da síntese de colágeno. As estruturas dos compostos químicos biologicamente ativos mais importantes encontrados na planta Arrabidaea chica são ilustradas na Figura 1. De acordo com uma modalidade da presente invenção,

"lesão cutânea" é qualquer anomalia na pele ou mucosa que tem como característica a perda de tecido, podendo ser causada por hipóxia, agentes físicos, agentes químicos (terapêuticos ou não) , agentes infecciosos, reações imunológicas, distúrbios genéticos, distúrbios nutricionais ou outros.

Verificou-se experimentalmente que quando o extrato de A. chica é veiculado em sistemas de liberação micro e nanoparticulados ou lipossomas, e depois incorporado em composições farmacêuticas tópicas convencionais, como cremes, pomadas, loções e géis, a biodisponibilidade dos compostos bioativos é bastante aumentada em relação à incorporação direta do extrato bruto. Além disso, quando incluídos em sistemas micro ou nanoparticulados, os compostos bioativos ficam protegidos de fenômenos oxidativos degradantes, o que proporciona um tratamento muito mais eficiente de lesões cutâneas.

Na presente invenção, os extratos da planta A. chica foram submetidos a diferentes metodologias para formação de sistemas de liberação particulados para proteção de seus compostos ativos. Os processos de obtenção dos extratos das folhas de A. chica foram realizados através da utilização da mistura dos solventes etanol, água e ácido cítrico. 0 fluxograma do processo de obtenção do extrato de A. chica se encontra na Figura 2.

Em uma modalidade da presente invenção, as aplicações terapêuticas dos extratos de A. chica são conseguidas pela veiculação dos mesmos em sistemas micro e nanoparticulados de liberação ou lipossomas.

Sistemas de liberação micro ou nanoparticulados, de acordo com a presente invenção, podem ser obtidos por vários métodos, incluindo, mas não se limitando a métodos físicos, como atomização (spray drying), pulverização em banho térmico, leito fluidizado, extrusão centrífuga com múltiplos orifícios, co-cristalização, Iiofilização; métodos químicos, como inclusão molecular e polimerização interfacial; e métodos físico-químicos, como coacervação, separação por fase orgânica e pulverização em agente formador de reticulação.

De acordo com a presente invenção, "lipossomas" são vesículas esféricas formadas por bicamadas concêntricas de fosfolipídios, que se organizam espontaneamente em meio aquoso. Os lipossomas são classificados tanto com relação ao seu tamanho e número de lamelas, quanto a sua interação com o meio biológico.

De acordo com os diâmetros médios os lipossomas são divididos em três categorias, a saber, vesículas multil amelares (MLV), formas lipossomais formadas por bicamadas fosfolipídicas concêntricas intercaladas por compartimentos aquosos, cujo diâmetro varia de 400 a 3500 nm; vesículas unilamelares grandes (LUV), formas lipossomais constituídas por apenas uma bicamada fosfolipídica, mas com uma grande cavidade aquosa e cujo diâmetro varia de 200 a 1000 nm; e vesiculas unilamelares pequenas (SUV), formas lipossomais constituídas por apenas uma bicamada fosfolipídica e um pequeno compartimento aquoso, cujo diâmetro varia de 20 a 50 nm (Scarpa et al.,1998) .

De acordo com a carga, lipossomas podem ser classificados como catiônicos (carga positiva), aniônicos (carga negativa) e neutros (sem carga). Os extratos de A. chica da presente invenção podem ser

veiculados em qualquer tipo de lipossoma.

Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece composições farmacêuticas, como cremes e géis, compreendendo extrato de Arrabidaea chica em sistemas de liberação microparticulados, como em matrizes compreendendo maltodextrina, goma arábica e goma de cajueiro ou misturas dos mesmos. Particularmente, o sistema de liberação microparticulado compreende uma mistura de maltodextrina e goma arábica numa proporção de 2:8 a 8:2. Particularmente, o sistema de liberação microparticulado compreende uma mistura de maltodextrina e goma.de cajueiro-numa proporção de 2:8 a 8:2. Particularmente, o sistema de liberação microparticulado compreende uma mistura de goma arábica e goma de cajueiro numa proporção de 2:8 a 8:2. Em uma modalidade preferida, o extrato de A. chica e a matriz do sistema de liberação microparticulado estão presentes na formulação em uma proporção de 2:8 a 8:2.

Em outra modalidade da presente invenção, a micro ou nanoparticula compreendendo o extrato de A. chica é constituída por uma matriz encapsuladora de biopolímero.

De acordo com a presente invenção, "biopolímeros" são compostos químicos de elevada massa molecular constituídos por unidades estruturais menores (monômeros), que se repetem em cadeia e são produzidos por seres vivos. Exemplos de biopolímeros úteis para a presente invenção são carboidratos, proteínas, glicoproteínas, lipoproteínas e lipídeos, particularmente ácido algínico, alginato, quitina, quitosana, ácido hialurônico, celulose, colágeno, queratina, gelatina, cutina, suberina, entre outros.

Em uma modalidade preferida da invenção, são fornecidas composições farmacêuticas compreendendo micro e nanopartículas de biopolímero, como quitosana e ácido hialurônico. As estruturas químicas destes compostos são mostradas nas figuras 3 a 6.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece composições farmacêuticas compreendendo extrato de Arrabidaea chica veiculado em lipossomas. Particularmente, o lipossoma é formado por uma lipoproteína. Lipoproteínas adequadas para os lipossomas da presente invenção podem ser Dioleilfosfatidilcolina (DOPC), Dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), Dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC),

Diestearoilfosfatidilcolina (DSPC),

Dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE),

Diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE),

Dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG),

Dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG),

Dipalmitoilfosfatidilserina (DPPS) e

Diestearoilfosfatidilserina (DSPS) . Particularmente, a lipoproteína é fosfatidilcolina de ovo. Em uma modalidade preferida, os lipossomas da presente invenção podem ser contatados com polietilenoglicol (PEG) para serem peguilados.

Em uma modalidade específica, as composições

farmacêuticas da presente invenção compreendem um ou mais excipientes, veículos, conservantes e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. Como "excipientes, veículos, conservantes e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis", deve-se entender quaisquer substâncias comumente usadas na formulação de composições farmacêuticas tópicas, incluindo, mas não se limitando a água, cera de abelhas, óleo mineral, sais inorgânicos, Lanette N®, Cetiol V®, propilenoglicol, Nipagin, Nipazol, Polawax®, Natrosol HHR®, Carbopol, Natrosol, trietanolamina, hidróxido de sódio, miristato de isopropila, etanol, óleo de silicone, Germall 115, uréia, silicone, alantoína, mentol, cânfora, ácido glicólico, ácido salicilico, ácido esteárico, ácido lático, e outros corantes, conservantes e estabilizantes.

Em outra modalidade da presente invenção é descrito um processo para a produção de sistemas de liberação micro e nanoparticulados e lipossomas compreendendo extrato de Arrabidaea chica e formulações compreendendo os mesmos.

Em uma modalidade, o processo para preparar

microparticulas de acordo com a presente invenção compreende as etapas de:

Adicionar um ou mais materiais formadores de parede a um recipiente;

- Incorporar o extrato bruto de A. chica à matriz então formada; e

- Submeter a mistura à atomização.

De acordo com a presente invenção, a atomização pode ser efetuada em qualquer aparelhagem adequada, como

atomizadores (spray dryers) de bocal de um único fluido, bocal pneumático e atomizador rotatório.

Em outra modalidade, a presente invenção descreve um processo para a veiculação do extrato de A. chica em micro e nanoparticulas poliméricas. Em uma modalidade preferida, é descrito um processo para fabricar micro e nanopartículas poliméricas de quitosana compreendendo as etapas de:

- Preparar uma solução de quitosana; Adicionar ácido acético glacial;

- Agitar; e

- Reticular a quitosana com contra-ions multivalentes. Em uma concretização especifica, os contra-ions

multivalentes são tripolifosfatos (TPP).

Em outra modalidade, é descrito um processo para fabricar micro e nanopartículas poliméricas de ácido hialurônico compreendendo as etapas de:

Adicionar óleo mineral e um agente emulsificante a um recipiente sob constante agitação;

Adicionar à mistura então obtida uma solução de um primeiro agente químico reticulante sob constante agitação;

Adicionar à emulsão então obtida uma solução de um segundo agente químico reticulante sob constante agitação;

- Adicionar à mistura então obtida uma solução diluída de um ácido inorgânico forte sob constante agitação para a primeira reação de reticulação;

- Retirar as partículas formadas da fase oleosa Separar as fases aquosa e oleosa; - Centrifugar a fração aquosa descartando o sobrenadante;

Ressuspender as partículas;

Adicionar uma solução diluída de um ácido inorgânico forte sob constante agitação; Coletar as partículas; Ressuspender as partículas;

- Centrifugar a suspensão;

- Separar o sobrenadante contendo as nanopartícuias;

- Separar o sedimentado, contendo as micropartícuias.

- Congelar as suspensões contendo as partículas em nitrogênio (N2) líquido; e

- Liofilizar as suspensões.

Em uma concretização específica, o primeiro agente reticulante é di-hidrazida adípica. Em outra concretização específica, o segundo agente reticulante é l-etil-3-(3-dimetilamino-propil) carbodi-imida.

Preferencialmente, a primeira reação de reticulação ocorre em agitação constante por 12 a 24 horas. Em uma concretização adicional, a ressuspensão das partículas é feita em uma solução de agentes reticulantes ou água destilada. Preferivelmente os agentes reticulantes são selecionados de di-hidrazida adípica l-etil-3-(3- dimetilamino-propil) carbodi-imida. Em outra modalidade, é descrito um processo para fabricar lipossomas compreendendo extrato de A. chica, compreendendo as etapas de:

- Adicionar um fosfolipidio em um recipiente;

- Solubilizar o fosfolipidio em um ou mais solventes orgânicos;

- Evaporar o solvente;

Hidratar o filme com tampão;

Deixar a dispersão lipossomal em repouso sob refrigeração; e

- Reduzir e homogenizar o tamanho das partículas.

Em uma concretização preferida, o fosfolipidio é fosfatidilcolina de ovo. Em outra concretização preferida, o solvente é selecionado de qualquer solvente orgânico ou mistura de solventes orgânicos, como metanol, etanol, éter metílico, éter etílico, acetona, formol, diclorometano, clorofórmio, tetraclorometano ou misturas dos mesmos. Preferivelmente, a redução de homogeneização do tamanho das partículas foi feita por extrusão. Em uma concretização preferida da presente invenção, o

processo de fabricação de lipossomas compreende ainda a etapa de incubar os lipossomas formados em solução de polietilenoglicol preparada em tampão. Preferivelmente, a incubação é feita na proporção molar fosfolipídio:PEG 10:90 a 90:10, mais preferivelmente de 80:20 a 20:80, e ainda mais preferivelmente de 40:60 a 60:40.

Em uma concretização complementar da presente invenção, é descrito o uso do extrato de Arrabidaea chica como matéria prima para a preparação de micro e nanoparticulas, lipossomas e composições farmacêuticas compreendendo os mesmos para o tratamento de lesões cutâneas. Em uma concretização preferida, o extrato de A. chica é micro ou nanoencapsulado. Preferivelmente, a microcápsula compreende uma matriz encapsuladora selecionada do grupo consistindo em maltodextrina, goma arábica e goma de cajueiro e misturas das mesmas. Em outra concretização, a micro ou nanoparticula compreende uma matriz encapsuladora de biopolimero, preferivelmente quitosana ou ácido hialurônico. Em uma concretização adicional, o extrato é veiculado em lipossomas. EXEMPLOS

Para permitir uma melhor compreensão da presente invenção e demonstrar claramente os avanços técnicos obtidos, são agora apresentados como exemplos os resultados dos diferentes ensaios efetuados com relação a esta invenção.

Os extratos de A.chica usados nos experimentos reportados a seguir são oriundos das folhas da planta, disponíveis no Banco de Germoplasma n° de acesso 06 (exsicata 1348) do Centro de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas da UNICAMP, localizado no município de Paulínia (22° 45' 00' ' Sul e 47°10' 21" Oeste) .

Folhas das partes inferior, média e superior foram coletadas, procurando-se obter uma amostra representativa das diferentes partes da planta. 0 material vegetal (exsicata 1348) foi identificado e classificado a partir da coleção de plantas medicinais e aromáticas (CPMA) do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA)-Unicamp.

Exemplo 1: Produção de partículas por atomização (spray drying)

Produção do extrato etanólico de A.chica

0 processo de extração segue o protocolo metodológico descrito por Oliveira (2001) com modificações.

Coleta das folhas: As folhas coletadas foram secas em estufa ventilada, à 40°C durante 48 horas, e moídas no moinho tipo martelo com peneira de 40 mesh e posteriormente foram embaladas a vácuo.

Extração: Pesou-se o material vegetal seco e moído e foi realizada a extração com solução etanol/H20, acidifiçada com ácido cítrico, na proporção de 1:5. Repetiu-se o processo por 3 vezes de 1,50 h cada. - Concentração do extrato: Após filtração do material vegetal, o filtrado foi concentrado, sob vácuo e protegido da luz, até redução de 80% do volume final (Fluxograma 1).

- Neutralização: O extrato bruto foi então neutralizado até pH 7,00.

Produção das micropartícuias por atomização

O extrato concentrado e neutro foi submetido à microencapsulação pelo método de atomização, utilizando-se o equipamento spray dryer (Figura 2) . - Material formador de parede: Como material formador de parede foi empregado goma arábica, maltodextrina e goma do cajueiro.

Mistura de diferentes materiais formadores de parede: Para a confecção de diferentes tipos de microparticulas, utilizou-se misturas entre 2 tipos de materiais formadores de parede, em diferentes proporções (tabelas 1 e 2). Tabela 1: relação de proporções utilizadas entre duas matrizes diferentes para a composição do material formador de parede, AeB representam as diferentes matrizes

A (%) B(%) 80 20 70 30 50 50 70 80

Tabela 2: Matrizes e possibilidades de suas combinações para as proporções descritas entre A e B na Tabela 1:

Material (A) Material (B) Maltodextrina Goma arábica Maltodextrina Goma de cajueiro Goma arábica Goma de cajueiro Goma arábica Maltodextrina Goma de cajueiro Goma arábica Goma de cajueiro Maltodextrina

- Matrizes sem mistura: As matrizes foram compostas também com apenas um material formador de parede: ou maltodextrina ou goma arábica ou goma de cajueiro na proporção de 100%.

Incorporação do extrato de A. chica à matriz da micropartícuia: A incorporação do extrato de A. chica é feita através da mistura de diferentes proporções do extrato da planta com o material formador de parede, ou a mistura de materiais formadores de parede (descritas nos itens anteriores) . O extrato de A. chica é misturado, sob agitação, ao material formador de parede determinado. As diferentes proporções utilizadas para incorporação do extrato ao material formador de parede estão descritas na Tabela 3:

Tabela 3: relação de proporções utilizadas entre o extrato bruto de A.chica e o material formador de parede utilizado

Extrato de A.chica (%) Material formador de parede(%) 80 70

Processamento das micropartícuias: As microparticulas foram produzidas pelo método de atomização, utilizando um spray dryer Buchi B-2 90, nas condições operacionais baseadas em Rodrigues (2004), ou seja, 150°C ± 5°C de ar de entrada, 90-110°C , 5°C de ar de saída, 30% de sólidos totais, pressão de ar de 1 bar, fluxo de ar 10 L/min, vazão da bomba 10 mL/min, 20% de recheio (extratos e composto isolado) em relação aos sólidos totais. Como material formador de parede foi empregado goma arábica, maltodextrina, goma do cajueiro ou misturas das mesmas, conforme indicado nas Tabelas 1 e 2. As condições de processamento das microparticulas são mostradas na Tabela 4 .

Tabela 4: Condições do processamento de microencapsulação por atomização (spray drying) do extrato bruto de Arrabidaea chica.

Variáveis Valores pré determinados Extrato bruto seco: matriz (p/p) * Solvente H2O Temperatura do ar de entrada (0C) 150 Temperatura de unidade de refrigeração (0C) 10 Vazão de bombeamento do líquido (mL/min) 10-20 Vazão de nitrogênio (L/h) 470-600 Tensoativo Tween 80

* Diferentes proporções entre extrato bruto e matriz, bem como diferentes tipos de matrizes foram utilizados. Vide quadros 1 e 2.

Estocagem do material processado: As microparticulas foram estocadas em frascos âmbar rosqueáveis, vedados. Uma parte do material foi destinada ao estudo de estabilidade acelerada.

- Estudo de estabilidade acelerada: Os extratos brutos e microencapsulados de A. chica foram mantidos em câmara climática onde as condições de temperatura e umidade relativa de equilíbrio (URE) foram mantidas constantes em condições drásticas, conforme estabelecido pela Anvisa (RE n°l-2005) para o estudo de estabilidade acelerada (Anvisa, 2009). Os extratos foram avaliados em diferentes tempos.

- Análise Qualitativa e Quantitativa por Cromatografia Liquida de Alta Eficiência (CLAE): As frações e substâncias puras foram dissolvidas em solvente apropriado, grau CLAE, e analisadas por cromatografia liquida de alta eficiência, com detector de arranjo de diodos (UV), nas condições baseadas em Devia et al. (2005). Exemplo 2: Produção de lipossomas

Etapas envolvidas na produção dos lipossomas de Arrabidaea chica:

Material formador de lipossomas: Os compostos utilizados para a produção de lipossomas foram fosfatidilcolina de ovo adotando o método de Bangham, por meio de hidratação do filme seco de lipidios.

Preparação do filme lipidico: Para preparar o filme lipídico, o fosfolipídio foi pesado para concentração de ImM em balão de fundo redondo, seguido de solubilização em solução de clorofórmio-metanol na razão 9:1 (v/v). Após evaporação do solvente o filme foi hidratado com tampão HEPES (lOmM; pH 7,4). A dispersão lipossomal ficou em repouso por 2 horas sob refrigeração, para acomodação dos fosfolipídios na bicamada.

Redução e homogeneização dos lipossomas: A redução e homogeneização dos tamanhos foi feita por extrusão, empregando membranas de policarbonato sobrepostas, de diâmetro de IOOnm, utilizando extrusora de aço inox e nitrogênio para pressurização.

- Armazenamento: Os lipossomas foram armazenados sob refrigeração e ao abrigo da luz.

Produção dos lipossomas elásticos: Para produção dos lipossomas elásticos, os lipossomas convencionais preparados foram incubados em solução de polietilenoglicol (PEG-8L; ImM) preparada em tampão HEPES. A incubação foi realizada 2 horas após o processo de extrusão, na proporção molar de 60:40, fosfolipidio:PEG. 0 polietilenoglicol confere a capacidade de penetração em camadas mais profundas da epiderme, beneficiando assim o tratamento da lesão.

Produção de lipossomas contendo extrato de A.chica: Para o preparo dos lipossomas contendo o extrato de A. chica, a solução de hidratação foi composta de tampão HEPES juntamente com o extrato nas concentrações de 0,5mM; ■ ImM; 2mM; 3mM e 5mM. Os lipossomas passaram por um processo de ultrafiltração para separação do ativo não encapsulado. Exemplo 3: Produção de partículas de quitosana Etapas envolvidas na produção das micro e nanoparticulas de Arrabidaea chica:

Técnica de preparação das partículas de quitosana: As partículas de quitosana foram preparadas pela técnica de gelificação ionotrópica, que consiste na reticulação iônica da quitosana com contra-íons multivalentes. Nessa técnica, as partículas são formadas pela adição de uma solução à outra sob agitação magnética ou mecânica. 0 agente gelificante empregado para reticulação foi o tripolifosfato de sódio (TPP) .

Preparo de soluções de quitosana: A primeira etapa consistiu no preparo da solução de quitosana. Inicialmente a quitosana foi suspensa em 50 mL de água Milli-Q e em seguida adicionou-se o ácido acético glacial, para facilitar a dissolução. A mistura foi feita sob agitação mecânica (rotor do tipo pá dentada - 1.500 rpm) por 24 h a temperatura ambiente (25°C). Completou-se o volume para 100 mL e agitou-se por mais 24h em temperatura ambiente (25°C). Estocagem da solução: A solução foi estocada em refrigerador (5°C) para prevenir a proliferação de microrganismos. Durante o processo de agitação, o recipiente foi fechado com filme plástico para evitar a evaporação do solvente.

Produção de partículas: Para a produção das partículas empregou-se o reticulante TPP.

Análise do diâmetro das partículas: A análise do diâmetro das partículas formadas foi realizada após cada adição de agente gelificante, através de alíquotas retiradas do meio. As alíquotas foram retornadas ao meio reacional, para manter a quantidade inicial de quitosana, e prosseguia-se com nova adição do agente reticulante.

Congelamento das partículas para análise morfológica: Ao final do experimento, as partículas obtidas foram . congeladas com nitrogênio líquido e liofilizadas para a análise da morfologia.

Produção de partículas contendo o princípio ativo: Para a produção das partículas contendo o ativo, o mesmo foi incorporado na solução de quitosana e ou na solução do agente gelificante.

Exemplo 4: Produção das partículas de ácido hialurônico

Etapas envolvidas na produção das micro e nanopartícuias de ácido hialurônico encapsulando o extrato bruto de A. chica: 2 0 - Método de obtenção das micro e nanopartícuias poliméricas: As micro e nanopartícuias poliméricas foram obtidas através do método de emulsão A/0 (água/óleo). 0 polímero ácido hialurônico foi reticulado quimicamente com di-hidrazida do ácido adípico, segundo protocolo de Yun et al. (2004) adaptado por Kubo (2005) e Ferre-Souza (2007).

Processo de reticuiação do ácido hialurônico: O processo inicia-se com a adição de 80 mL óleo mineral (VETEC/Rio de Janeiro; BRA) e ImL agente emulsificante Span 80 (monooleato de sorbitan - tensoativo/ SIGMA/St. Louis; USA) a um béquer de 250 mL, iniciando agitação constante em agitador automático de pá dentada 1500 rpm. Em seguida IOOmg di-hidrazida adipica (ADH) (SIGMA/St. Louis; USA) dissolvida em 10 mL HNa 0,5% (Galena® 50 mg, 1,24.10-4 mol) foram adicionados, e mantidos sob agitação durante 30 minutos, formando a emulsão A/O.

Transcorrido o tempo, ocorre a adição de 120 mg 1- etil-3-(3-dimetilamino-propil) carbodi-imida (EDCI)

(SIGMA/St. Louis; USA) dissolvidos em 2 mL de água Mili-Q à emulsão e agitação por mais 30 minutos.

Adequação do meio para a primeira reação de reticuiação química: No intuito de adequar o meio para a primeira reação de reticuiação química adiciona-se 1000 mL de HCl 0,1 mol/L, e a reação ocorre em agitação constante por 24 horas. Para a retirada das partículas formadas da fase oleosa, é realizada a lavagem da emulsão com 150 mL de álcool isopropílico (IPA) sob agitação em Shacker orbital a 200 rpm por 20 min. A separação das fases (água/óleo) é realizada com funil de separação. A porção aquosa, contendo as partículas é então centrifugada por 5 minutos a 1500 rpm e o sobrenadante descartado. A ressuspensão das partículas é realizada com 100 mg de ADH e 120 mg EDCI dissolvidos em 100 mL de IPA 90% sob agitação de 200 rpm.

- Segunda reação de reticulação: Para a segunda reação de reticulação adiciona-se HCl, e agitação constante por mais 24 horas.

Coleta das partículas: A coleta das partículas é realizada por centrifugação 5 minutos a 1.500 rpm e adição de IPA 90%, repetindo-se o processo por três vezes. O material é então ressuspendido em 10 mL de água destilada, centrifugado por mais 15 min a 5.000 rpm e separado o sobrenadante, contendo as nanopartículas, do sedimentado, contendo as micropartículas. As partículas são então congeladas em nitrogênio (N2) líquido e Iiofilizadas.

Obtenção de partículas poliméricas contendo o extrato ativo de A.chica: Na obtenção de partículas poliméricas contendo o extrato ativo da Arrabidaea chica, o mesmo é adicionado ao processo após a formação da emulsão A/O e dá- se seqüência a metodologia descrita inicialmente.

Exemplo 5: Caracterização dos lipossomas convencionais (LC) e peguilados (LP)

Diâmetro médio

Os resultados do diâmetro médio dos LC e LP estão apresentados na Tabela 5 e na Figura 7.

Tabela 5: Diâmetro médio e desvio padrão de LC e LP.

Lipossomas Vazios Tipo Diâmetro médio(nm) + desvio padrão LC 110 ± 1,09 LP 59,41 ± 1, 70 Lipossomas Convencionais (LC) Concentração inicial de Diâmetro médio (nm) + Λ. chica(mM) desvio padrão 0, 5 96,49 ± 0, 98 1,0 94,37 ± 1, 16 2, 0 98,38 ± 0, 53 3, 0 114,7 ± 0, 46 5, 0 106,96 ± 1,29 Lipossomas Peguilados (LP] Concentração inicial de Diâmetro médio(nm) + A. chica(mM) desvio padrão 0, 5 78,15 ± 2, 09 1,0 74,36 ± 2, 84 2,0 85,71 ± 0, 93 3, 0 83,92 ± 0,26 5, 0 89,14 ± 0,76 Na Figura 7 pode-se verificar que o diâmetro médio dos lipossomas convencionais foi maior que o diâmetro médio dos lipossomas peguilados tanto para os lipossomas vazios quanto contendo o extrato. A encapsulação da A. chica em LC produziu uma pequena diminuição, de aproximadamente 12% no diâmetro médio, em relação aos lipossomas vazios, até a concentração de 2mM, quando o diâmetro foi semelhante ao dos vazios. Os LP sofreram aumento em relação aos vazios de aproximadamente 32%, em toda a faixa de concentração. Polidispersidade

A análise de polidispersidade demonstra a variabilidade de diâmetros dos lipossomas na amostra e pode ser considerada uma ferramenta para analisar o polimorfismo das vesiculas, portanto não apresenta unidade de medida. Os resultados de polidispersidade dos lipossomas convencionais e elásticos estão apresentados na Tabela 6 e na Figura 8.

Tabela 6: Polidispersidade e desvio padrão de LC e LP.

Lipossomas Vazios Tipo Polidispersidade desvio padrão + LC- 0,26 ± 0,02 LP 0,41 ± 0,01 Lipossomas Convencionais (LC) Lipossomas Vazios Concentração inicial de Polidispersidade + A. chica(mM) desvio padrão 0, 5 0,21 ± 0, 01 1,0 0,20 ± 0, 01 2, 0 0,17 ± 0, 00 3, 0 0,16 ± 0, 01 5, 0 0,17 ± 0, 01 Lipossomas Peguilados (LP] Concentração inicial de Polidispersidade ± A. chica(mM) desvio padrão 0, 5 0,55 ± 0, 32 1,0 0,40 ± 0, 02 2, 0 0,22 ± 0,01 3, 0 0,26 ± 0, 01 5, 0 0,29 ± 0, 03

Verifica-se que inicialmente os LP apresentaram polidispersidade maior em relação aos vazios e posteriormente a polidispersidade decresce. Os LC apresentam polidispersidade aproximadamente constante em toda a faixa de concentração.

A caracterização dos lipossomas produzidos mostrou as seguintes propriedades: os lipossomas vazios apresentaram diâmetro médio em torno de IOOnm (LC) e 60 nm (LP) , com baixa polidispersidade, (da ordem de 0,2). Esse resultado demonstra a eficiência da extrusão em membranas de policarbonato como processo de redução e homogeneização de tamanhos. O menor tamanho dos lipossomas com PEG-8L deve- se à sua distribuição entre os lipossomas e as suas próprias micelas (menores que os lipossomas), gerando um diâmetro médio global menor que os LC. Em ambos os casos, o diâmetro médio dos lipossomas está na faixa considerada adequada para a aplicação percutânea pretendida.

É interessante comparar os resultados do diâmetro médio de lipossomas, após a encapsulação do extrato nas várias concentrações. Pode-se verificar que para os LC houve uma variação em torno de 15%, em relação aos LC vazios, o que se explica pela contração do empacotamento da bicamada lipídica devido à presença de grupos hidrofóbicos nas moléculas do extrato. Sabe-se que a molécula predominante no extrato, a carajurina (um tipo de antocianina) que possui um esqueleto hidrofóbico, com anéis benzênicos, e grupos hidrofilicos, que resultam em um caráter hidrofilico da molécula como um todo.

No caso dos LP, houve aumento de cerca de 30% do diâmetro com na presença do extrato, que pode ser atribuído à presença de agregados de antocianinas no meio, que podem conter o PEG que não foi incorporado nos lipossomas. Observa-se que em ambos os casos os maiores diâmetros foram observados à maiores concentrações iniciais do extrato.

Quanto à polidispersidade, os resultados indicam que em ambos os casos a polidispersidade pode ser considerada baixa (menor que 0,5), tanto nos lipossomas vazios quanto contendo o extrato. Potencial zeta

A análise do potencial zeta determina a densidade de carga na camada adjacente à superfície das partículas. Pode ser utilizada como uma ferramenta para determinar a presença do extrato na superfície dos lipossomas, e a estabilidade da formulação. Os resultados de potencial zeta dos lipossomas convencionais e peguilados estão apresentados na Tabela 7 e na Figura 9.

Tabela 7: Potencial zeta de LC e LP.

Lipossomas Vazios Tipo Potencial zeta (mV) ± desvio padrão LC LP -27,00 ± 1,55 -19,5 ± 3,44 Lipossomas Convencionais (LC) Concentração inicial de Potencial zeta (mV) ± A. chica(mM) desvio padrão 0, 5 -23,13 ± 0,75 1,0 -29, 57 ± 1,17 2,0 -28,2 ± 1,04 3, 0 -30,6 ± 1,01 5, 0 -28,33 ± 1,07 Lipossomas Peguilados (LP Concentração inicial de Potencial zeta (mV) ± A. chica(mM) desvio padrão 0, 5 -12,55 ± 0,25 1, o -9,59 ± 4,23 2, 0 -26,27 ± 2,11 3, 0 -21,73 ± 8,13 5, 0 -28,17 ± 1,53

Pode-se notar que tanto para LC quanto para LP os valores de potencial zeta foram negativos. Nota-se densidade negativa mais acentuada para os LC, em todas as concentrações, quando comparados aos LP. A variação do potencial zeta não foi muito significativa entre as concentrações de LC e apresentaram ligeira diminuição para as menores concentrações de extrato para os LP.

Condutividade elétrica

A análise de condutividade elétrica demonstra a capacidade que a dispersão de lipossomas possuem em conduzir eletricidade. Pode ser utilizada como uma ferramenta para determinar a contribuição do extrato na condutividade da solução. Os resultados de condutividade elétrica dos lipossomas convencionais e peguilados estão apresentados na Tabela 8 e na Figura 10. Tabela 8: Condutividade elétrica de LC e LP.

Lipossomas Vazios Tipo Condutividade elétrica (mS/cm) ± desvio padrão LC 0,01 ± 0,00 LP 0,02 ± 0,00 Lipossomas Convencionais (LC) Concentração inicial de Condutividade elétrica A. chica(mM) (mS/cm) ± desvio padrão 0, 5 0,01 ± 0, 00 1,0 0,01 ± 0, 00 2, 0 0, 02 ± 0, 00 3, 0 0, 02 ± 0, 00 5, 0 0,02 ± 0, 00 Lipossomas Peguilados (LP) Concentração inicial de Condutividade elétrica A. chica(mM) (mS/cm) ± desvio padrão 0, 5 0, 01 + 0, 00 1,0 0, 02 + 0, 00 2,0 0, 03 ± 0, 00 3, 0 0, 02 + 0, 00 5, 0 0, 02 + 0, 00

Observa-se que a condutividade dos LP é, em média, 21% maior que a dos LC. A presença de A. chica nos LP aumenta a condutividade das dispersões com a concentração, atingindo um máximo em ImM, e reduzindo-se após essa concentração a valores semelhantes às dispersões dos lipossomas vazios.

A encapsulação nos LC não sofre variação significativa até ImM, porém atinge um máximo em 2mM, reduzindo-se em seguida, a valores próximos dos LP vazios.

A baixa condutividade elétrica deve-se ao caráter zwiteriônico dos fosfolipídios da lecitina. A condutividade dos LP foi maior devido à presença das micelas de PEG na dispersão, e devido a camada de solvatação gerada pelas caudas hidrofilicas da cadeia polimérica do PEG-8L. A presença do extrato aumentou a condutividade do meio, devido à presença dos agregados de antocianinas principalmente nas maiores concentrações, o que é mostrado mais claramente nos LC.

Eficiência de Encapsulação e Carregamento do extrato encapsulado

A Tabela 9 apresenta os resultados da encapsulação da A. chica em LC e LP. Pode-se verificar os valores de absorbância inicial para cada concentração de extrato, além dos valores do A. chica não encapsulada após a ultrafiltração.

Tabela 9: Balanço de massas por concentração.

Amostras Concent ração Concent ração Concentração inicial no filtrado na dispersão (mg/mL) (mg/mL) retida (mg/mL) Lipossomas Convencionais 0, 5 0, 67 0, 13 0, 52 1,0 1, 20 0, 17 0, 55 2, 0 2,21 0, 24 0, 58 3, 0 2,78 0,23 0, 60 5, 0 3, 30 0, 30 0, 59 Lipossomas Peguilados 0, 5 0, 67 0, 07 0, 60 1,0 1, 19 0, 05 0, 63 2, 0 2,21 0, 22 0, 61 .3,0 2,7 8 0, 37 0, 59 5, 0 3, 30 0, 46 0, 59

Os resultados da concentração de A. chica determinados após o rompimento dos lipossomas e por diferença entre as suas concentrações inicial e não encapsulada, estão presentes na Tabela 10 e Figura 11.

Tabela 10: Concentração de A. chica no interior dos lipossomas.

Amostras Concentração Concentração Diferença interior na dispersão entre lipossomas retida concentrações rompidos (mg/mL) (%) (mg/mL) Lipossomas Convencionais (LC 0,5 0, 10 0, 52 42, 1 1,0 0, 07 0, 55 48, 3 2,0 0, 06 0, 58 51, 3 3, 0 0, 07 0, 60 52, 5 5, 0 0, 05 0, 59 54, 1 Lipossomas Peguilados (LP) 0, 5 0, 03 0, 60 57, 4 1,0 0, 04 0, 63 59, 0 2, 0 0, 06 0, 61 55, 3 3,0 0, 05 0,59 54, 4 5, 0 0, 03 0, 59 56, 4

Observam-se diferenças da ordem de 50%, no balanço de massa na separação do extrato não encapsulado. Essas diferenças são decorrentes principalmente das perdas durante a ultrafiltração, decorrentes da retenção da A. chica na membrana. 0 carregamento dos lipossomas e a eficiência de encapsulação estão dispostos na Tabela 11. Tabela 11: Carregamento e Eficiência de encapsulação de LC e LP + A. chica.

Amostras Carregamento Eficiência de (%) encapsulação (%) Lipossomas Convencionais (LC) 0, 5 13, 15 14, 92 1,0 9,21 5, 83 2, 0 8, 0 2,71 3, 0 9, 21 2, 52 5, 0 6, 57 1, 51 Lipossomas Peguilados (LP) 0, 5 4, 47 4, 48 1,0 5,26 3, 33 2, 0 8, 0 2, 71 3, 0 6, 57 1, 80 5, 0 4,0 0, 91

Pode-se verificar que a eficiência de encapsulação para os LC, atinge seu valor máximo, de aproximadamente 15%, já na primeira concentração de A. chica utilizada (0,5mM). Os LP apresentam o mesmo padrão de eficiência de encapsulação, com valor máximo na primeira concentração, seguido de decréscimo de eficiência em maiores concentrações. Observa-se que a porcentagem de carregamento dos LC atinge seu máximo a 0,5mM de extrato também, enquanto os LP atingem o máximo com 2mM. Os valores aparentemente baixos da eficiência de encapsulação estão na faixa dos valores observados para compostos de caráter anfifilico e com carga.

Ensaio de elasticidade

Foram selecionadas as amostras de lipossomas obtidas com concentrações iniciais de A. chica de 0,5mM e ImM, de lipossomas convencionais e peguilados para o ensaio de elasticidade.

Pode-se observar no gráfico representado na Figura 12, que a vazão aumenta com a pressão de extrusão. Para os lipossomas, inicialmente observa-se uma resistência ao escoamento em todas as amostras, em baixas pressões. Essa resistência é semelhante para os LC e LP contendo o extrato, e para os LC vazios. No entanto, os LP vazios, apresentam as maiores vazões com a pressão, e pouca resistência inicial ao escoamento, com a sua curva mais próxima à da água.

A análise do diâmetro dos lipossomas convencionais e peguilados após a permeação estão dispostas nas Figuras 13 e 14, respectivamente.

Observa-se na Figura 14 que para os LC vazios o

diâmetro aumenta com a pressão. A presença do extrato retém esse aumento, mantendo o diâmetro médio semelhante ao estado inicial, ou seja, antes da extrusão.

Nota-se que o diâmetro médio dos LP vazios também aumentou com a pressão. Diferentemente dos LC, a presença do extrato contribuiu para o aumento do diâmetro com a concentração, principalmente quando a concentração inicial do extrato foi 0,5 mM.

Os resultados de permeação em membranas de policarbonato mostram que o PEG induz elasticidade nos LP, mantendo a sua integridade. Nota-se que na curva de vazão volumétrica, os lipossomas peguilados apresentaram maior facilidade em atravessar a membrana de nanoporos, indicando aumento da elasticidade dos lipossomas em relação aos convencionais.

Tanto os LC vazios quanto os LP vazios apresentaram aumento do diâmetro médio com o aumento da pressão aplicada, indicando que o extrato também contribuiu para a elasticidade das vesiculas, devido à sua presença na membrana, alterando o empacotamento.

Exemplo 6: Caracterização de partículas poliméricas

A obtenção das partículas com a adição da A. chíca (ativo) foi realizada em duas condições de agitação: 1.500 rpm na primeira reação de reticulação e 200/1.000 rpm na segunda reação de reticulação. Inicialmente adotou-se um excesso de ativo na razão de 2 partes de ativo para 1 parte de polímero (2:1).

Na obtenção das partículas com o excesso de ativo pode-se observar a formação de aglomerados com a maioria das partículas coalescidas e poucas estruturas em delimitação de esferas, como exemplificadas no Anexo IAe 9 B respectivamente.

Para uma melhor adequação da proporção ativo:polímero, quatro proporções foram estudadas.

Proporção A. chica:AH

Nas quatro proporções de ativo testadas (1:1; 1:0,75; 1:0,5 e 1:0,25) nas duas condições de preparo previamente estabelecidas, apenas a menor proporção na condição de preparo de 1.500 e 200 rpm apresentou formação eficiente de partículas esféricas, enquanto que nas outras concentrações e condições de preparo houve apenas a formação de aglomerados ou formação escassa de partículas esféricas, como exemplificado no Anexo 2 H e A-G, respectivamente. Diâmetro médio das partículas poliméricas formadas As nanoparticulas obtidas apresentaram geometria esférica, diâmetro médio de 295,3 nm em intensidade e número, com índice de polidispersidade de 0,108 e as micropartículas apresentaram diâmetro médio de 3 ym e desvio padrão de ± 1 μπι.

Potencial Zeta das nanoparticulas contendo ativo (Arrabidaea chica)

Na análise do potencial elétrico no plano hidrodinâmico de cisalhamento (Potencial Zeta) das nanoparticulas contendo ativo, realizada em equipamento Zetasizer Nano Series-ZS, apresentaram um potencial Zeta de + 50 mV, o que confere estabilidade às partículas dessa amostra.

Exemplo 7: Atividade indutora de crescimento celular

A Figura 15 demonstra os resultados do ensaio de cicatrização, usando como parâmetro a porcentagem de contração das feridas após 10 dias de tratamento.

Os ferimentos tratados com salina (controle) tiveram contração de 53,5%, contra 75% nos ferimentos tratados com extrato bruto de A. chica e 84% nos ferimentos tratados com extrado de A. chica microencapsulados. Fotografias dos ferimentos avaliados neste ensaio podem ser visualizadas no Anexo 3. Exemplo 8: Comparação entre o teor de princípios ativos no extrato bruto e microencapsulado

Para avaliar e melhorar a qualidade do extrato garantindo maior estabilidade, analisou-se de forma comparativa o extrato bruto de A. chica livre (EB) e microencapsulado (EBM) por atomização, quando submetidos a condições drásticas em câmara climatizada (40°C e 75% de umidade), por um período de 180 dias, avaliando quali e quantitativamente o teor de antocianidinas e a manutenção da atividade antiulcerogênica de EB e EBM nos em diferentes tempos.

Após 3 horas de exposição na câmara, já foram observadas alterações na coloração do EB, e após a metade do tempo total de exposição, foi bastante evidente a alteração de coloração assim como a contração do material. Comparativamente ao EB, a análise visual das amostras de EBM, submetidas às mesmas condições, identificou perda da intensidade da coloração, ao longo dos 90 dias.

Os resultados obtidos nas análises por CLAE-DAD para as amostras de EB e EBM (estudo de estabilidade) estão apresentados nas Tabelas 12 e Figura 16.

Tabela 12: Teor relativo das três antocianidinas nas amostras de EB (FAC) e EBMft. EB (%p/p) * EBM (%p/p) * Tempo m/z m/ ζ m/ ζ m/z301 m/z285 m/z 299 (dias) 301 285 299 0 5, 6 15,1±2 22,9±3 1,05±0, 2,54±0, 3,83±0, ±1, 1 ,8 ,7 12 32 4 2,5+0, 7,4±2, 15,9±4 0,97±0, 2,32±0, 3,38±0, 69 3 ,3 02 07 1 2±0, 2 5,8±0, 13,5±1 0,8 6±0, 2,01±0, 2,88±0, 6 ,2 03 08 05 60 1,5±0, 4,3±0, 11,3±0 0,69±0, 1,60±0, 2,51±0, 08 3 ,5 03 07 06 90 1,3+0, 3,7+0, 11,5±0 0,57±0, 1,28±0, 2,04+0, 07 4 ,9 02 06 09

* resultados expressos como média ± desvio padrão; # (20% aproximadamente do extrato bruto)

A amostra de EB, após 90 dias na câmara, apresentou redução do teor em aproximadamente 77% de 6,7,3',4'- tetrahidroxi-5-metoxiflavilium m/ζ 301, 75, 5% de 6,7- trihidroxi-5-metoxiflavilium m/ζ 285 e 50% de carajiruna m/ζ 299. Ou seja, houve uma maior queda na concentração dos compostos m/z 301 e 285. Em contra partida, a amostra de EBM, após o mesmo período na câmara, apresentou redução do teor em aproximadamente 46% de 6,7,3',4'-tetrahidroxi-5- metoxiflavilium m/z 301, 50% de 6,7-trihidroxi-5- metoxiflavilium m/z 285 e 35% de carajiruna m/z 299.

Em modelos de úlcera gástrica de ratos induzida por etanol/HCl, os extratos de EB e EBM, submetidos ao teste de estabilidade, foram comparados quanto sua capacidade em reduzir a lesões ulcerativas nas doses de 100, 300 e 1.000 mg/Kg, para cálculo da DE50 (Dose Efetiva necessária para reduzir em 50 % o índice de lesão ulcerativa, ILU) . O EBM manteve a ação antiulcerogênica no tempo 30 equivalente ao tempo 0, sendo 8 vezes mais efetivo que o EB. Já no tempo 90, a dose máxima avaliada (1.000 mg/kg) do EB não foi capaz de reduzir em 50% as lesões ulcerativas, enquanto EBM preciso dobrar a dose para atingir 50% de redução do ILU. A Tabela 13 apresenta os valores de DE50 obtidos para as amostras EB e EBM nos tempos 0, 30 e 90 dias. Tabela 13: Análise comparativa dos valores de DE50 (mg/Kg)

DE50 Tempo EB EBM (dias) (mg/Kg) (mg/Kg) 0 170,262 104,692 886,224 114,627 90 >1000 220,573 A análise comparativa tanto com os resultados analíticos obtidos pelo CLAE quanto os resultados de atividade antiulcerogênica, demonstram que o processo de microencapsulação foi capaz de proteger não apenas as três antocianidinas empregadas como marcadores químicos, mas também os demais componentes do extrato, o que preservou sua ação farmacológica.

Os estudos de mecanismo de citoproteção iniciados em tese de mestrado (Jorge, 2008) demonstraram que a atividade antiulcerogênica não estava relacionada com a ação do oxido nítrico, nem com os grupos sulfidrila não proteicos da mucosa e nem com a atividade das prostaglandinas, sugerindo-se uma possível ação do extrato sobre a secreção ácida. Assim, neste projeto a atividade anti-secretória do EB foi avaliada através da do ensaio de ligadura de piloro. Neste experimento, observou-se que o EB reduziu o volume da secreção gástrica, porém não houve alteração na produção ácida. Com base nesses resultados, propõe-se a continuidade deste estudo para a investigação da relação entre a atividade antiulcerogênica do EB e atividade local sobre a produção de muco.

Dando continuidade ao estudo de atividade cicatrizante cutânea, avaliou-se o potencial angiogênico do EB através de testes de angiogênese em membrana corioalantóide (CAM) de ovos, segundo Wilting et al., 1991 & 1992} e no dorso de camundongos, segundo Huang et al., 2003. No ensaio CAM, dentre as concentrações testadas, a de lOOmg/mL indicou maior potencial indutor da angiogênese. Já no teste de angiogênese em ovo embrionado de galinha e camundongos, ainda em fase de implementação, foi possível verificar macroscópicamente um aumento do número de vasos sangüíneos em relação o grupo salina. No entanto as análises histológias, ainda não foram concluídas. Assim, os resultados obtidos demonstraram a

importância do microencapsulação para manutenção das antocianidinas do EB bem como suas ações farmacológicas. Os testes preliminares de angiogênese, apontam para uma provável ação angiogênica do extrato. Para aplicação as partículas podem ser empregadas nas

seguintes formulações:

Exemplo 9: Teste da atividade angiogênica em membrana corioalantóide (CAM)

A atividade angiogênica das partículas foi avaliada através da contagem de vasos sangüíneos em membrana corioalantóide (CAM).

Os ovos de galinha (Gallus domesticus) linhagem Rhoss foram incubados em estufa automática produzida pela Brasmatic Ind. e Com. LTDA, com controle de temperatura (38 °C) e umidade (65%), deslocados lateralmente a cada 15 minutos, durante os 5 primeiros dias de incubação. Ao final deste prazo, os ovos foram submetidos à abertura circular (1,0 cm de diâmetro) em sua base maior, onde está localizada a câmara de ar, com auxilio de uma micro- retifica marca Dremel.

Após a realização da abertura, utilizando-se de seringa e salina estéreis, depositou-se uma gota de salina (NaCl 0,9% p/v) de forma a auxiliar na retirada da membrana da casca, expondo a MCA já vascularizada. A abertura, então, foi vedada com fita crepe e o ovo novamente incubado, porém, sem agitação periódica e com a base furada voltada para cima. Ao final do 13° dia de incubação, os discos de papel de filtro, veiculando 3 μΐ; da solução a ser testada em cada grupo (AH livre, partículas vazias preparadas pela condição de agitação 1500 e 200*/1000**, A. chica 5, 10 e 25 mg/mL) e salina estéril (controle negativo), foram depositados diretamente sobre a membrana de forma cuidadosa e estéril. Os ovos voltaram à incubação até o 16° dia, quando foram retirados da incubadora. Em seguida, as CAMs foram fixadas em solução de formol a 10 % por 5 min, retiradas do embrião e fotografadas sobre um fundo branco, em tamanho 640X480 pixels e formato de RGB 24 bites. As fotografias foram tratadas com Software Corel Photo Paint 11 de modo que o brilho e a saturação permitissem melhor visualização dos vasos sangüíneos que foram contados macroscopicamente.

As partículas vazias, assim como a A. chica livre nas

três concentrações ensaiadas, apresentaram um aumento na vascularização (Anexo 4) expressa pelo aumento no número de vasos sangüíneos (Figura 17). Exemplo 10: Formulações Creme base

Para possibilitar a utilização terapêutica dos diferentes extratos de A. chica (extratos bruto, microencapsulados, nanoparticulados e lipossomais), foi elaborada uma formulação de creme base. O creme foi preparado aquecendo-se os componentes da

fase oleosa e aquosa (água) até 70°C, vertendo-se a fase aquosa sobre a oleosa, com agitação manual constante até o resfriamento. Na temperatura de 35°C, o extrato foi adicionado, dissolvido em propilenoglicol, previamente solubilizado em ultrassom. Verificou-se o pH da formulação, e se quando necessário o mesmo foi ajustado até pH 7 com trietanolamina.

Tabela 14: Composição da formulação de creme base Componente Quantidade (g) Fase oleosa ± 65eC Ácido esteárico 12 Miristato de isopropila* 5 Álcool cetílico 0, 01 Nipazol (g) 3 Fase aquosa ± 65sC Propilenoglicol 5 Trietanolamina 0,7 Nipagim 0, 08 Agua (mL) 74, 21

Formulação 50% creme base com 50% de extrato livre ou encapsulado.

Um controle também foi obtido, utilizando-se o extrato bruto livre, ou seja, sem estar encapsulado Hidrogel

A Tabela 15 mostra a composição da formulação, que foi realizado com o aquecimento de todos os componentes, exceto propilenoglicol, extrato, até a geleificação. Após resfriamento adicionou-se o propilenoglicol com o extrato solubilizado com o auxílio do ultrassom. Verifica-se o pH se necessário corrigi-lo com trietanolamina. Tabela 15: Composição da formulação do hidrogel

Componente Quantidade (g) Carbopol 940® 0, 25 Extrato bruto encapsulado em propilenoglicol* 3, 0 H2O ultrapura, MilleQ (mL) 100 Trietanolamina q.s.p. pH 7, 0

* A quantidade de extrato encapsulado incorporado na formulação foi ajustada, uma vez que o mesmo continha goma arábica em sua composição.

Um controle também foi obtido, utilizando-se o extrato bruto livre, ou seja, sem estar encapsulado. Tabela 16: Condições do processamento de microencapsulação por atomização (spray drying) do extrato bruto de Arrabidaea chica Verlot.

Variáveis Valores pré determinados Extrato bruto seco: matriz (p/p) * Solvente H2O Temperatura do ar de entrada (0C) 180 Temperatura de unidade de refrigeração (0C) 10 Vazão de bombeamento do liquido (mL/min) 10-20 Vazão de nitrogênio (L/h) 470-600 Tensioativo Tween 80

* Diferentes proporções entre extrato bruto e matriz, bem como diferentes tipos de matrizes foram utilizados. Vide tabelas 1 e 2. REFERÊNCIAS

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Claims (52)

1. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de compreender extrato de Arrabidaea chica em sistemas de liberação micro e nanoparticulados.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o sistema de liberação microparticulado compreende uma matriz encapsuladora selecionada do grupo consistindo em maltodextrina, goma arábica e goma de cajueiro e misturas das mesmas.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o sistema de liberação microparticulado compreende uma mistura de maltodextrina e goma arábica numa proporção de 2:8 a 8:2.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o sistema de liberação microparticulado compreende uma mistura de maltodextrina e goma de cajueiro numa proporção de 2:8 a 8:2.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o sistema de liberação microparticulado compreende uma mistura de goma arábica e goma de cajueiro numa proporção de 2:8 a 8:2.

6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de compreender o extrato de Arrabidaea chica e a matriz do sistema de liberação microparticulado em uma proporção de2:8 a 8:2.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os sistemas de liberação micro e nanoparticulados são micro e nanopartículas compreendendo uma matriz encapsuladora de biopolímero.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o biopolímero é quitosana.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o biopolímero é ácido hialurônico.

10. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de compreender extrato de Arrabidaea chica veiculado em lipossomas.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o lipossoma é formado por uma lipoproteína.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a lipoproteína é fosfatidilcolina de ovo.

13. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizada pelo fato de que os lipossomas são peguilados.

14. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente um ou mais excipientes, veículos, conservantes e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.

15. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de ser um creme.

16. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de ser um gel.

17. Sistemas de liberação micro e nanoparticulados caracterizado pelo fato de compreender extrato de Arrabidaea chi ca.

18. Sistema de liberação microparticulado, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de compreender uma matriz encapsuladora selecionada do grupo consistindo em maltodextrina, goma arábica e goma de cajueiro e misturas das mesmas.

19. Sistema de liberação microparticulado, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de compreender uma mistura de maltodextrina e goma arábica numa proporção de 2:8 a 8:2.

20. Sistema de liberação microparticulado, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de compreender uma mistura de maltodextrina e goma de cajueiro numa proporção de 2:8 a 8:2.

21. Sistema de liberação microparticulado, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de compreender uma mistura de goma arábica e goma de cajueiro numa proporção de 2:8 a 8:2.

22. Sistema de liberação microparticulado, de acordo com a qualquer uma das reivindicações 17 a 21, caracterizado pelo fato de compreender o extrato de Arrabidaea chica e a matriz encapsuladora em uma proporção de 2:8 a 8:2.

23. Sistema de liberação microparticulado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 22, caracterizado pelo dato de ser produzida por atomização.

24. Sistema de liberação microparticulado, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de compreender uma matriz encapsuladora de biopolimero.

25. Sistema de liberação microparticulado, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o biopolimero é quitosana.

26. Sistema de liberação microparticulado, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o biopolimero é ácido hialurônico.

27. Lipossoma caracterizado pelo fato de compreender extrato de Arrabidaea chica.

28. Lipossoma, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de ser formado por uma lipoproteína.

29. Lipossoma, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a lipoproteína é fosfatidilcolina de ovo.

30. Lipossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 29, caracterizado pelo fato de ser peguilado.

31. Processo para a preparação de microparticulas compreendendo extrato de Arrabidaea chica caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: - Adicionar um ou mais materiais formadores de parede a um recipiente; Incorporar o extrato bruto de A. chica à matriz então formada; e - Submeter a mistura à atomização.

32. Processo para a preparação de microparticulas de quitosana compreendendo extrato de Arrabidaea chica caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: - Preparar uma solução de quitosana; - Adicionar ácido acético glacial; Agitar; e Reticular a quitosana com contra-íons multivalentes.

33. Processo, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que os contra-íons multivalentes são tripolifosfatos .

34. Processo para a preparação de micro e nanopartícuias de ácido hialurônico compreendendo extrato de Arrabidaea chica caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: - Adicionar óleo mineral e um agente emulsificante a um recipiente sob constante agitação; Adicionar ã mistura então obtida uma solução de um primeiro agente químico reticulante sob constante agitação; Adicionar à emulsão então obtida uma solução de um segundo agente químico reticulante sob constante agitação; Adicionar à mistura então obtida uma solução diluída de um ácido inorgânico forte sob constante agitação para a primeira reação de retitulação; - Retirar as partículas formadas da fase oleosa - Separar as fases aquosa e oleosa; - Centrifugar a fração aquosa descartando o sobrenadante; - Ressuspender as partículas; Adicionar uma solução diluída de um ácido inorgânico forte sob constante agitação; Coletar as partículas; Ressuspender as partículas; - Centrifugar a suspensão; - Separar o sobrenadante contendo as nanopartículas; Separar o sedimentado, contendo as micropartículas. - Congelar as suspensões contendo as partículas em nitrogênio (N2) liquido; e Liofilizar as suspensões.

35. Processo, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o primeiro agente reticulante é di-hidrazida adípica.

36. Processo, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o segundo agente reticulante é l-etil-3-(3-dimetilamino-propil) carbodi-imida.

37. Processo, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a primeira reação de retitulação ocorre em agitação constante por 12 a 24 horas.

38. Processo, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a ressuspensão das partículas é feita em uma solução de agentes reticulantes ou água destilada.

39. Processo, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que os agentes reticulantes são selecionados de di-hidrazida adípica l-etil-3-(3- dimetilamino-propil) carbodi-imida.

40. Processo para a preparação de lipossomas compreendendo extrato de Arrabidaea chica caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: Adicionar um fosfolipídio em um recipiente; - Solubilizar o fosfolipídio em um ou mais solventes orgânicos; Evaporar o solvente; - Hidratar o filme com tampão; Deixar a dispersão lipossomal em repouso sob refrigeração; e - Reduzir e homogenizar o tamanho das partículas.

41. Processo, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo dato de que o fosfolipídio é fosfatidilcolina de ovo.

42. Processo, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo dato de que o solvente é selecionado de clorofórmio e metanol ou misturas dos mesmos.

43. Processo, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo dato de que a redução de homogeneização do tamanho das partículas foi feita por extrusão.

44. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 43, caracterizado pelo fato de ainda compreender a etapa de incubar os lipossomas formados em solução de polietilenoglicol preparada em -tampão.

45. Processo, de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pelo fato de que a incubação é feita na proporção molar fosfolipídio:PEG de 60:40.

46. Uso de extrato de Arrabidaea chica caracterizado pelo fato de ser para preparar um medicamento para tratar lesões cutâneas.

47. Uso, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o extrato é microencapsulado.

48. Uso, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que a microcápsula compreende uma matriz encapsuladora selecionada do grupo consistindo em maltodextrina, goma arábica e goma de cajueiro e misturas das mesmas.

49. Uso, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que a microcápsula compreende uma matriz encapsuladora de biopolímero.

50. Uso, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o biopolímero é quitosana.

51. Uso, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o biopolímero é ácido hialurônico.

52. Uso, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o extrato é veiculado em lipossomas.