BR112016007460B1 - Processo para a preparação de xanthohumol - Google Patents

Abstract

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE XANTHOHUMOL A invenção fornece um processo para a preparação de xanthohumol, em que um extrato que contém xanthohumol é misturado com água, uma solução de sal de metal de transição é adicionada à mistura obtida e, então, o precipitado de xanthohumol obtido é coletado e seco para se obter o xanthohumol de pureza mais alta que 90%.

Description

[0001] A invenção fornece um processo para a preparação de xanthohumol de alta pureza a partir de resíduos de lúpulo pós-extração, planta de lúpulo granulada ou lúpulos. Devido à alta pureza do xanthohumol obtido, o mesmo pode ser usado com êxito em suplementos dietéticos, bebidas e como um ingrediente de produto terapêutico.

[0002] O Xanthohumol (Xn), ou ((E)-1-[2,4-dihidróxi-6-metóxi-3-(3-metilbut-2- enil)-fenil]-3-(4-hidroxifenil)-prop-2-en-1-ona) é um composto de ocorrência natural do grupo de calconas preniladas, em que a fonte principal do mesmo é a inflorescência fêmea de Humulus Lupus (lúpulo). O mesmo está presente apenas em traços na cerveja. O composto é constituído por dois anéis de benzeno ligados pela porção de carbonila insaturada α,β:

[0003] A presença de um grupo hidróxi livre na molécula torna a mesma de isomerização fácil à flavanona adequada - um intermediário na via de biossíntese de flavonoide. Em contraste com os outros ingredientes de lúpulos, o xanthohumol é mais lipofílico, em que o recurso é conectado com a presença do substituinte prenilado em sua estrutura. Deve-se observar que, em sistemas biológicos vivos, as porções preniladas (farnesil ou geranilgeranil) facilitam a anexação de várias moléculas intracelulares a uma membrana celular, determinado suas atividades adequadas. De maneira semelhante, sugere-se que, no caso de xanthohumol, tais porções possam modular significativamente a atividade biológica do composto e, além disso, influenciar suas propriedades físico-químicas e distribuição subcelular.

[0004] Estudos in vitro e in vivo também sugerem que o xanthohumol reduz os processos inflamatórios e oxidativos por meio de diversos mecanismos. Os principais são: eliminação de radicais livres de oxigênio e suas formas reativas (RTF), inibição de atividade de ciclooxigenase (COX I e COX II), redução em produção de prostaglandina, NO, TNFα, NFKB e neutralização de peroxidação de fosfolipídeo de membrana.

[0005] A atividade antioxidante e anti-inflamatória de xanthohumol está conectada à presença dos grupos hidróxi e o substituinte prenilado em sua molécula. A porção de carbonila insaturada α, β também é importante. A porção participa na reação de Michel com nucleófilos biologicamente importantes, por exemplo: L-cisteína em proteínas e outras moléculas que contêm o grupo sulfidrila. Desse modo, adutos covalentes que ocasionam a perda de atividade biológica de várias moléculas ligadas por xanthohumol são obtidos.

[0006] O espectro amplo de atividade de xanthohumol é devido, provavelmente, à capacidade do composto de ligar moléculas biológicas importantes. Um dos exemplos mais bem conhecidos é a influência de xanthohumol na polimerase α sintetase, topoisomerase I, fosfatase alcalina, aromatase, diacil glicerol aciltransferase, proteínas de via de sinalização de MAPK, FAK quinase, Akt e STAT ou fatores de transcrição NF-KB. A redução induzida por Xn de atividades das ditas proteínas induz efeitos de célula pleiotrópicos como uma consequência de distúrbios de proliferação, ciclo celular, adesão e migração em células tumorais.

[0007] Também são relevantes as informações em relação às propriedades de neuroproteção. No modelo de rato de isquemia focal induzida por MCAO, que reflete a isquemia cerebral focal in vivo, o xanthohumol reduz significativamente a área de necrose isquêmica do cérebro. Sugere-se, portanto, que o xanthohumol também reduz um efeito neurotóxico induzido pelo peptídeo β-amiloide (Aβ). O Aβ é conhecido por mediar o mecanismo de radical livre e é uma das principais causas de doença de Alzheimer, através do aumento da produção de radicais livres e da peroxidação de lipídios em células do nervo, que consequentemente leva a sua apoptose.

[0008] Além disso, com exceção de seu efeito em receptores, o mecanismo da atividade de xanthohumol pode estar conectado a sua atividade seletiva para membranas de lipídeo. Os estudos sobre mecanismos de interação de xanthohumol com membranas de lipídeo modelo indicam uma grande modificação de propriedades dinâmicas e estruturais de uma membrana. Até mesmo concentrações muito pequenas de xanthohumol interagem fortemente com fragmentos hidrofílicos de membrana de lipídio para influenciar alterações na espessura de bicamada. Sabe-se também que os neonicotinoides, devido a sua hidrofobicidade alta, penetram nas membranas de lipídeo muito facilmente. A interação de xanthohumol com a membrana de lipídeo pode reduzir significativamente sua penetração por neonicotinoides, o que pode explicar sua forte atividade, além do bloqueio de receptores de nicotina.

[0009] Em relação a sua estrutura química, o xanthohumol é um polifenol, no entanto, ao contrário dos polifenóis, o mesmo é escassamente solúvel em água quente, mas dissolve prontamente em álcoois ou misturas de água/álcool.

[0010] Uma boa fonte de xanthohumol são os resíduos de lúpulo pós-extração, que compreendem resíduos da produção de extrato de lúpulo usado pela indústria de fermentação para a fabricação de cerveja. Estima-se que os resíduos de lúpulo pós-extração contenham até 1% de xanthohumol, dependendo da espécie de uma planta de lúpulo.

[0011] Várias tecnologias para a preparação de xanthohumol são conhecidas na técnica. O pedido de patente no DE 199 39 350 A1 descreve um processo para a preparação de um extrato de lúpulo enriquecido com xanthohumol, em que misturas de água e etanol foram usadas para a extração. O extrato obtido continha 5 a 15% de xanthohumol.

[0012] A patente no EP 1 424 385 B1 revela um método de extração de xanthohumol do material que contém xanthohumol bruto através do uso de CO2 comprimido como um solvente sob uma pressão acima de 50.000 KPa (500 bar) e em temperaturas acima de 60 °C.

[0013] O pedido no CN 101440029 revela um método de extração de xanthohumol da planta de lúpulo e de produtos que contêm xanthohumol, em que a extração com um solvente orgânico auxiliada por ultrassons é conduzida, seguida por mistura com diatomito, filtração, lavagem com mistura de água/metanol, concentração, precipitação e secagem para se obter o xanthohumol de 86% de pureza.

[0014] A patente no EP 2 187 899 B1 revela um processo para a preparação de uma composição de teor de xanthohumol alto a partir de uma planta de lúpulo, em que um sal é adicionado a uma solução que contém xanthohumol à concentração na faixa de 0,05 a 5,0 M, seguido pelo aumento de pH de 10,5 a 12,0, filtração do precipitado obtido, acidificação do filtrado para pH 7 a 8 para se obter o precipitado de xanthohumol de 40 a 95% de pureza.

[0015] O pedido de patente no US 11/790.365 revela um processo para a preparação do pó de teor de xanthohumol alto (60 a 90%), que compreende suspender um extrato enriquecido com xanthohumol em uma solução alcalina, separar os produtos insolúveis, neutralizar e precipitar o xanthohumol dissolvido com um ácido e isolar o produto.

[0016] A patente no CN 101433592 revela o uso de várias resinas de adsorção para preparar xanthohumol de alta pureza.

[0017] Em conclusão, a análise da técnica anterior revela, de maneira inequívoca, que há uma necessidade de se desenvolver um processo simples e não dispendioso para a preparação de xanthohumol de alta pureza.

[0018] O problema é solucionado por um processo recentemente desenvolvido para a preparação de xanthohumol a partir de resíduos de lúpulo pós-extração, planta de lúpulo granulada ou lúpulos.

[0019] Portanto, a invenção se refere a um processo para a preparação de xanthohumol, em que: a) um extrato que contém xanthohumol é misturado com água; b) uma solução de sal de metal de transição é adicionada à mistura obtida; c) o precipitado de xanthohumol obtido é coletado e seco para se obter o xanthohumol de pureza mais alta que 90%.

[0020] De preferência, na etapa b) a concentração do sal na mistura é ajustada dentro da faixa de 0,001 M a 10 M, mais preferencialmente, na etapa b) a concentração do sal na mistura é ajustada dentro da faixa de 0,001 M a 0,05 M ou acima de 5 M.

[0021] De preferência, adicionalmente, após o sal ser adicionado na etapa b: b1) a solução é alcalinizada para o nível de pH acima de 7; b2) o primeiro precipitado é removido por filtração, e o filtrado é acidificado para o nível de pH abaixo de 7; b3) o filtrado acidificado é concentrado para se obter o precipitado de xanthohumol.

[0022] De preferência, na etapa b1) a solução é alcalinizada para o nível de pH na faixa de 7,5 a 10,5 o acima de 12.

[0023] De preferência, o extrato que contém xanthohumol é obtido por extração dos resíduos de lúpulo pós-extração, lúpulos, planta de lúpulo granulada ou uma mistura dos mesmos com um solvente orgânico miscível em água, em que o solvente é usado em uma quantidade de 0,1 a 10 litros por 1 kg do material bruto.

[0024] De preferência, como um solvente orgânico miscível em água, cetonas e álcoois ou uma mistura dos mesmos são usados, mais preferencialmente, como um solvente orgânico miscível em água, acetona, metanol, etanol, propanol ou uma mistura dos mesmos são usados.

[0025] De preferência, a extração é conduzida em uma temperatura na faixa de 5 a 65 °C.

[0026] De preferência, o extrato que contém xanthohumol é misturado com água em uma razão na faixa de 0,1 a 5 litros de água por 1 litro do extrato, mais preferencialmente, o extrato que contém xanthohumol é misturado com água em uma razão na faixa de 1 a 3 litros de água por 1 litro do extrato.

[0027] De preferência, na etapa b) uma concentração de um sal de metal de transição é fornecida dentro da faixa de 0,01 M a 0,05 M.

[0028] De preferência, como um sal de metal de transição, um sal de cobre(II) ou um sal de zinco(II) é usado.

[0029] De preferência, como um sal de metal de transição, um sal de cloreto, um sal de nitrato ou um sal de sulfato é usado.

[0030] De preferência, como um sal de metal de transição, cloreto de cobre(II), sulfato de cobre(II) ou cloreto de zinco(II) ou sulfato de zinco(II) é usado.

[0031] O processo, de acordo com a invenção, permite obter o xanthohumol de pureza de pelo menos 90% (geralmente acima de 95%) em um bom rendimento. O processo, de acordo com a invenção, não necessita do uso de sistemas de cromatografia complexos ou resinas sustentadas.

[0032] A pureza do xanthohumol obtido foi determinada pela técnica de HPLC na coluna SUPELCOSIL LC-PAH de 15 cm x 4,6 mm, 5 μm de tamanho de grão, temperatura de coluna de 20 °C, Fase A - 95% de acetonitrila, 0,3% de HCOOH; Fase B - 2% de acetonitrila, 0,3% de HCOOH, taxa de fluxo de 2 ml/min, 20 μl de injeção, detecção no comprimento de onda de 370 e 290 nm.

[0033] A invenção foi ilustrada pelos seguintes exemplos de trabalho.

[0034] EXEMPLO 1

[0035] 250 g de resíduos de lúpulo pós-extração foram pesados e despejados com acetona (0,75 l). Após agitação mecânica por 1 hora, o extrato formado foi filtrado através de um papel de filtro. O filtrado obtido (0,65 l) foi lavado com água (1,3 l). Então, a solução foi adicionada com uma solução aquosa de CuCl2 (concentração de 10 g/l) no volume de 300 ml por 1 litro do filtrado (a concentração final de 0,022 M). Após se adicionar cloreto de cobre, o pH da solução foi estabilizado em ~4,5. Praticamente imediatamente após o despejamento de cloreto de cobre, ocorreu a precipitação no extrato de aglomerados de uma substância verde de humulonas residuais e clorofila se separando de uma solução amarela em que o xanthohumol foi encontrado. Após uma hora, NaOH foi adicionado para precipitar um excesso de cobre aumentando-se o pH para cerca de 10. Após 1 hora, foi observada a precipitação de uma massa lamacenta e precipitado de hidróxido de cobre no fundo do recipiente. Os precipitados foram removidos por filtração em um papel de filtro. O filtrado obtido foi acidificado com HCl para pH 6 e concentrado em um evaporador giratório para produzir um precipitado cristalino de xanthohumol que foi removido por filtração e seco em uma estufa (temperatura de 50 a 60 °C) para proporcionar 206 mg de xanthohumol de 97,8% de pureza de HPLC. O rendimento do processo de extração de xanthohumol foi de 82% com base no teor total de xanthohumol nos resíduos de lúpulo.

[0036] EXEMPLO 2

[0037] O xanthohumol foi obtido conforme o Exemplo 1, exceto que, após se adicionar o cloreto de cobre, a borra verde precipitada foi removida por filtração e o filtrado foi concentrado em um evaporador giratório para render o precipitado cristalino de xanthohumol de 90,8% de pureza de HPLC.

[0038] EXEMPLO 3

[0039] O xanthohumol foi obtido conforme o Exemplo 1, exceto que o cloreto de cobre foi substituído por uma solução de sulfato de zinco (ZnSO4) na concentração de 10 g/l. Após a adição da solução de sal de zinco, o pH da solução foi estabilizado em ~6, e precipitação foi observada. Após cerca de uma hora, NaOH foi adicionado com o aumento de pH para cerca de 10. Após 1 hora, mais precipitado foi observado no fundo do recipiente. O precipitado foi removido por filtração em um papel de filtro. O filtrado obtido foi acidificado com HCl para pH 6 e concentrado em um evaporador giratório para render o precipitado cristalino de xanthohumol, que foi removido por filtração e seco em uma estufa (temperatura de 50 a 60 °C) para proporcionar xanthohumol de 97,8% de pureza de HPLC com o rendimento de 79% com base no teor total de xanthohumol nos resíduos de lúpulo.

[0040] EXEMPLO 4

[0041] 250 g de resíduos de lúpulo pós-extração foram pesados e despejados com 0,75 litros de metanol puro. Após agitação mecânica por 1 hora, o extrato formado foi filtrado em um papel de filtro. O filtrado obtido foi despejado com água em uma razão de volume de 1:2 (uma parte do filtrado para duas partes de água). Então, a solução foi adicionada com a solução aquosa de CuCl2 (na concentração de 10 g/l) em um volume de 300 ml por 1 litro do filtrado (concentração final do sal de 0,022 M). Após 1 hora, foi observada precipitação no extrato de aglomerados de uma substância verde se separando de uma solução amarela. NaOH foi, então, adicionado para aumentar o pH para 10. Após 1 hora, um precipitado verde lamacento foi observado no fundo do recipiente. O extrato formado foi filtrado em um papel de filtro. O extrato obtido foi acidificado com HCl para pH 6. As quantidades restantes do solvente foram removidas em um evaporador e uma suspensão de cristais de xanthohumol foi obtida. A suspensão foi filtrada através de um papel de filtro para render o xanthohumol, que foi seco em uma estufa a 55 °C para proporcionar 196 mg de xanthohumol de 95,8% de pureza com o rendimento de cerca de 78% com base no teor total de xanthohumol nos resíduos de lúpulo.

[0042] EXEMPLO 5

[0043] O xanthohumol foi obtido conforme o Exemplo 4, exceto que, em vez de cloreto de cobre(II), o sulfato de cobre(II) (CuSO4) foi usado na concentração de 10 g/l e o xanthohumol foi obtido com 94,8% de pureza.

[0044] EXEMPLO 6

[0045] O xanthohumol foi obtido conforme o Exemplo 1, exceto que concentrações mais altas de cloreto de cobre(II) foram usadas - na faixa de 0,022 M a 0,044 M. O xanthohumol foi obtido com a pureza na faixa de 96,3 a 97,8%.

[0046] EXEMPLO 7

[0047] O xanthohumol foi obtido conforme o Exemplo 1, exceto que a razão entre o extrato da primeira etapa para a quantidade de artigo adicionada de 1:1 e a concentração de CuCl2 de 0,022 M foram usadas, para render o xanthohumol de 96,8% de pureza.

[0048] EXEMPLO 8

[0049] O xanthohumol foi obtido conforme o Exemplo 1, exceto que 2-propanol no lugar de acetona e a concentração de CuCl2 de 0,022 M foram usados para render o xanthohumol com 93,8% de pureza.

[0050] EXEMPLO COMPARATIVO 1

[0051] 250 g de resíduos de lúpulo pós-extração foram pesados e despejados com acetona (0,75 l). Após agitação mecânica por 1 hora, o extrato formado foi filtrado através de um papel de filtro. O filtrado obtido foi concentrado para render o xanthohumol de 32,8% de pureza.

[0052] EXEMPLO COMPARATIVO 2

[0053] 250 g de resíduos de lúpulo pós-extração foram pesados e despejados com acetona (0,75 l). Após agitação mecânica por 1 hora, o extrato formado foi filtrado através de um papel de filtro. O filtrado obtido (0,65 l) foi despejado com água (1,3 l). Então, a solução foi adicionada com a solução aquosa de NaCl (na concentração de 30 g/l) no volume de 300 ml por 1 litro do filtrado. Então, NaOH foi adicionado para elevar o pH para cerca de 12. O precipitado formado foi removido por filtração através de um papel de filtro. O filtrado obtido foi acidificado com HCl para pH 5 e concentrado em um evaporador giratório para se obter um precipitado de xanthohumol, que foi removido por filtração e seco em uma estufa (temperatura de 50 a 60 °C) para render o xanthohumol de 84,8% de pureza de HPLC.

[0054] EXEMPLO COMPARATIVO 3

[0055] O xanthohumol foi obtido conforme o Exemplo comparativo 2, exceto que o NaCl não foi usado. O xanthohumol foi obtido com 58% de pureza de HPLC - como resultado apenas de alcalinização para pH 12.

[0056] Com base nos exemplos de trabalho descritos acima, pode ser confirmado que o processo, de acordo com a invenção, permite obter o xanthohumol de uma alta pureza por um processo excepcionalmente simples e não dispendioso. É evidente para um indivíduo versado na técnica que o xanthohumol obtido pelo processo inventivo pode ser adicionalmente purificado de acordo com métodos conhecidos.

Claims (11)

1. Processo para preparação de xanthohumol, caracterizado pelo fato de que: a) um extrato que contém xanthohumol é misturado com água; b) uma solução de sal de metal de transição é adicionada à mistura obtida; c) o precipitado de xanthohumol obtido é coletado e seco para se obter o xanthohumol de pureza mais alta que 90%, em que na etapa b) a concentração do sal na mistura é ajustada dentro da faixa de 0,001 M a 10 M; na etapa b1) a solução é alcalinizada para o nível de pH na faixa de 7,5 a 10,5, a extração é conduzida a uma temperatura na faixa de 5 a 65 °C; em que como um sal de metal de transição, um sal de cobre(II) ou um sal de zinco(II) é usado.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa b) a concentração do sal na mistura é ajustada dentro da faixa de 0,001 M a 0,05 M.

3. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que, adicionalmente, após a adição do sal na etapa b: b1) a solução é alcalinizada para o nível de pH variando entre 7,5 a 10,5; b2) o primeiro precipitado é removido por filtração, e o filtrado é acidificado para o nível de pH variando entre 5 a 6; b3) o filtrado acidificado é concentrado para se obter o precipitado de xanthohumol.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o extrato que contém xanthohumol é obtido pela extração de resíduos de lúpulo pós-extração, lúpulos, planta de lúpulo granulada ou uma mistura dos mesmos com um solvente miscível em água orgânico, em que o dito solvente é usado em uma quantidade de 0,1 a 10 litros por 1 kg do material bruto.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que, como um solvente miscível em água orgânico, cetonas e álcoois ou uma mistura dos mesmos são usados.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que, como um solvente miscível em água orgânico, acetona, metanol, etanol, propanol ou uma mistura dos mesmos são usados.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o extrato que contém xanthohumol é misturado com água em uma razão na faixa de 0,1 a 5 litros de água por 1 litro do extrato.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o extrato que contém xanthohumol é misturado com água em uma razão na faixa de 1 a 3 litros de água por 1 litro do extrato.

9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que na etapa b) a concentração de um sal de metal de transição é fornecida dentro da faixa de 0,01 M a 0,05 M.

10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que, como um sal de metal de transição, um sal de cloreto, um sal de nitrato ou um sal de sulfato é usado.

11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que, como um sal de metal de transição, cloreto de cobre(II), sulfato de cobre(II) ou cloreto de zinco(II) ou sulfato de zinco(II) é usado.