BR112013022889B1 - Dispositivo centrípeto fluídico para testar componentes de um material biológico em um fluido, aparelho de teste e método de teste usando tal dispositivo centrípeto fluídico - Google Patents

Dispositivo centrípeto fluídico para testar componentes de um material biológico em um fluido, aparelho de teste e método de teste usando tal dispositivo centrípeto fluídico Download PDF

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Régis Peytavi
Sébastien Chapdelaine
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UNIVERSITé LAVAL
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Abstract

dlsposltlvo centrípeto fluídico um aparelho centrípeto fluídico para testar componentes de um material biológico em um fluido é apresentado. o dispositivo centrípeto fluídico está adaptado para ser recebido dentro de um suporte giratório. o aparelho compreende uma camada de componente fluídico tendo características fluídicas em pelo menos uma face frontal e uma camada de componente inferior ligada a uma parte traseira da camada de componente fluídico criando, desse modo, uma rede fluídica através da qual o fluido flui sob força centrípeta. em uma modalidade, a característica fluídica pode ser uma câmara de enchimento inferior acoplada a um canal de entrada para receber o fluido, a entrada de câmara sendo fornecida em um lado externo da câmara de enchimento inferior. em outra modalidade, a característica fluídica pode ser uma câmara de retenção acoplada a um canal de entrada para receber o fluido, um recipiente integralmente fornecido na câmara de retenção e contendo um diluente liquido, o recipiente mantendo o diluente liquido no recipiente até ele liberar o mesmo na câmara de retenção mediante aplicação de uma força externa ao recipiente, restaurando, assim, a conexão fluídica entre o diluente liquido e o fluido na câmara de retenção. além disso, a câmara de retenção pode ter um receptáculo de dissociação de fluxo para receber o fluido localizado no lado externo da câmara de retenção e interromper uma conexão fluídica entre a entrada e a saída da câmara de retenção. um aparelho de teste e um método de teste usando um dispositivo centrípeto fluídico para testar componentes de um material biológico em um fluido são também fornecidos.

Description

REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDOS CORRELATOS
[0001] O presente pedido reivindica prioridade do Pedido Provisório US 61/450.373 depositado em 8 de Março de 2011, a descrição do qual sendo aqui incorporada por referência.
CAMPO TÉCNICO
[0002] A invenção refere-se a dispositivos centrípetos fluídicos.
ANTECEDENTES DA TÉCNICA
[0003] Os diagnósticos moleculares compreendem a detecção de compostos moleculares úteis para a identificação de doenças, espécie, indivíduos, etc. Estes compostos moleculares podem ser, por exemplo, íons, metabólitos, açúcares, ácidos graxos, aminoácidos, ácidos nucleicos, proteínas ou lipídios. O teste de ácido nucléico (NAT) compreende a identificação de ácidos nucleicos específicos de agentes patogênicos, ou a identificação de sequências de ácidos nucleicos específicas relacionadas com doenças como o câncer, doenças genéticas, a assinatura genética de espécies ou indivíduos ou marcadores para medicina personalizada. Protocolos de NAT muitas vezes começam com uma etapa de preparação da amostra em que as células são lisadas para liberar os seus ácidos nucleicos. Os ácidos nucleicos são, então, preparados especificamente, a fim de estarem preparados para um processo de amplificação do alvo, como, por exemplo, reação em cadeia da polimerase (PCR) ou Amplificação de Recombinase Polimerase (RPA) de amplificação isotérmica ou outros métodos de amplificação de ácidos nucleicos. A amplificação alvo produz amplicons que podem ser analisados em tempo real, ou seja, durante a amplificação, ou no final da amplificação em gel de agarose ou em um microarranjo, por exemplo. Os processos de amplificação também existem para a amplificação de um sinal gerado pela detecção do analito e estas abordagens de amplificação de sinal podem também estar associadas com processos de amplificação alvo. Estas tecnologias exigem protocolos complexos realizados por pessoal altamente qualificado em instalações dedicadas. Por estas razões, nem todos os laboratórios, hospitais ou centros de saúde podem executar diagnósticos moleculares.
[0004] Há uma necessidade de automatizar protocolos de diagnósticos moleculares complexos. Algumas abordagens contam com unidades robóticas de alto rendimento, que geralmente são muito caras e podem exigir muito espaço. Há uma crescente necessidade de desenvolver instrumentos mais compactos e instrumentações móveis, tal como diagnóstico em Ponto de Cuidado (POC), e de miniaturizar e integrar as etapas de um ensaio - da preparação da amostra até a resposta - em um único dispositivo descartável (por exemplo, dispositivos de laboratório em chip ou micro Total Analysis Systems: pTAS).
[0005] Uma das principais etapas difíceis para integrar em um sistema microfluídico descartável é a preparação de amostra. A preparação de amostra geralmente começa com uma etapa de lise celular, que pode ser química e/ou mecânica. Em seguida, para remover ou pelo menos controlar inibidores potenciais do processo de teste, os ácidos nucleicos podem ser purificados. As técnicas mais comuns usadas para purificar ácidos nucleicos são baseadas em adsorção em fase sólida dos ácidos nucleicos, sob condições específicas de pH e sal. Inibidores de reação enzimáticos, tais como proteínas, metais e outras moléculas são purificados a partir dos ácidos nucleicos adsorvidos na fase sólida. Os ácidos nucleicos são, então, recuperados da fase sólida usando uma solução de eluição apropriada. Todo o processo requer soluções diferentes, que precisam ser armazenados e liberados, uma matriz de fase sólida e diferentes câmaras de reação. Isso complica o processo para integração em um cartucho microfluídico compacto descartável.
[0006] No desenvolvimento de dispositivos fluídicos, existe uma necessidade de deslocar fluidos dentro e fora das diferentes zonas de processamento de uma maneira controlada. Os componentes de bombeamento e de válvulas são normalmente usados.
[0007] Alguns desenvolveram unidades fluídicas permitindo a automação de diagnósticos moleculares. Por exemplo, existe um cartucho de preparação da amostra com uma válvula rotativa e uma bomba de pistão para movimentar os fluidos nos reservatórios diferentes. Existe também lise mecânica usando ultrassons e partículas duras. Outros dispositivos utilizam um conjunto de plástico flexível, para lisar as células e transferir os fluidos entre setores do recipiente comprimindo o material flexível a um local específico. Estas unidades fluídicas requerem que vários atuadores sejam capazes de desempenhar as tarefas.
[0008] O uso de plataformas centrípetas fornece um formato simples e eficaz para a aplicação de opções de bombeamento e de válvula. Ao girar, pressão de fluido induzida centrifugamente provoca fluxo de fluido no interior do dispositivo fluídico.
[0009] O bombeamento centrípeto fornece muitas vantagens sobre os outros métodos de bombeamento alternativos, tais como uma seringa, pistão, bombeamento peristáltico, ou eletro-osmótico. Os bombeamentos centrípetos têm requisitos de energia elétrica menor (a única atuação ativa sendo a necessária para a rotação), é independente do pH do fluido ou força iônica, e não precisa de quaisquer interconexões ou tubagens fluídicas externas. Consequentemente, diferentes etapas de ensaio requerendo diferentes propriedades de amostra e tampão (por exemplo, energia de superfície, pH) podem ser combinadas em um único dispositivo centrípeto fluídico.
[0010] Outra vantagem de bombeamento centrípeto é que uma válvula pode ser implementada pelo projeto geométrico dos microcanais fluídicos de tal modo que as forças capilares equilibram a força centrífuga devido à rotação do disco. Através do projeto de estruturas microfluídicas com válvulas capilares de diferentes formas e em diferentes posições em relação ao centro de rotação do dispositivo centrípeto fluídico, o fluxo de líquido pode ser interrompido e retomado, controlando a velocidade de rotação.
[0011] Uma vez que a maioria dos processos analíticos para material biológico requer várias etapas, as válvulas passivas podem ser difíceis de aplicar de forma robusta. Para uma maior robustez, existe uma necessidade de implementar válvulas ativas em um dispositivo centrípeto. Por exemplo, é possível bloquear um canal microfluídico utilizando um material de mudança de fase tal como bujão de cera de parafina. Este tipo de válvula é independente da velocidade de rotação e pode ser acionada pelo calor. Por exemplo, um bujão de partículas de geração de calor e os materiais de mudança de fase podem também ser usados. As partículas absorvem as ondas eletromagnéticas a partir de um dispositivo externo (por exemplo, laser, lâmpada de IR) e o material de mudança de fase se funde com o calor gerado pelas partículas. As válvulas de material de mudança de fase foram descritas para bloquear um canal fluídico (Patente US 7.837.948) e usadas em um dispositivo de teste de ácido nucléico centrípeto (Publicação EP 2375256).
[0012] Algumas abordagens de válvulas ativas para dispositivos centrípetos são baseadas em atuação por uma onda eletromagnética. Por exemplo, um fecho de válvula em um local desejado pode ser aberto sem contato por meio de ablação a laser e sem perfurar a camada externa do dispositivo microfluídico (ver, por exemplo, Publicação EP 1930635, Publicação de Pedido de Patente PCT W02004/050242, Publicação de Pedido de Patente US 2009/0189089, Patente US 7.709.249, Patente US 7.323.660).
[0013] A atuação de uma válvula de material de mudança de fase pode ser feita por meio de eletrodos que formam um aquecedor resistivo para o próprio substrato. Os eletrodos geram calor a uma região específica de interesse na rede microfluídica para fundir o material de mudança de fase.
[0014] Ainda permanece uma necessidade de um dispositivo centrípeto fluídico melhorado com controle de fluxo de amostra.
SUMÁRIO
[0015] O dispositivo centrípeto fluídico aqui descrito pode permitir a combinação de estruturas simplificadas e atuadores que garantem a preparação da amostra, a medição do volume, deslocamento controlado do volume em um mínimo de câmaras e canais, enquanto permitindo o armazenamento de ambos reagentes secos e molhados necessários para a amplificação e detecção multiplex de ácidos nucleicos.
[0016] O dispositivo centrípeto fluídico descrito é bem adequado para ser implementado em sistemas de ponto de cuidado ou topo de bancada para processar simultaneamente várias amostras e render resultados rápidos.
[0017] De acordo com um primeiro aspecto da invenção, é fornecido um dispositivo centrípeto fluídico em que as macroestruturas e microestruturas combinadas asseguram um método de preparação da amostra simplificado. Os fluidos podem ser movidos com a força centrípeta aplicada a um rotor, que fornece uma força centrípeta. O processo é simplificado, a fim de minimizar o uso de líquidos e robustamente utilizar válvulas simples.
[0018] E m conformidade com um segundo aspecto da invenção, é fornecido um método para extrair e preparar os ácidos nucleicos, a fim de controlar os inibidores potenciais presentes em uma amostra que pode interferir com a amplificação e/ou detecção. Além disso, o circuito de fluidos pode fornecer uma medição pré e pós-lise do volume da amostra. Isto permite a definição de volume. A definição de volume pode ser conseguida por subtração de um volume de líquido definido pela diferença entre os 2 meniscos. Isto permite o uso de um dispositivo de coleta simples, em vez das micropipetas de elevada precisão habituais necessárias para medir com precisão pequenos volumes introduzidos no dispositivo centrípeto fluídico, o que facilita enormemente a manipulação por parte do operador.
[0019] De acordo com um terceiro aspecto da invenção, é fornecido um dispositivo centrípeto fluídico combinando preparação de amostra e detecção de amplificação de ácido nucléico em tempo real multiplex. O dispositivo centrípeto fluídico inclui um receptáculo de entrada em comunicação fluídica com uma câmara de enchimento de fundo (que pode ser usada para a homogeneização, lise celular, controle de inibidores e concentração de micróbios) em comunicação fluídica com uma câmara de retenção, em comunicação fluídica com uma área de detecção que pode utilizar um canal de distribuição, para dividir a amostra em duas ou mais câmaras de detecção, se necessário, para a amplificação e detecção. Os canais e as câmaras do dispositivo centrípeto fluídico podem ser autoventilados por um sistema de ciclo fechado fornecendo deslocamento de ar, enquanto mantendo o sistema fechado ajudando, assim, a impedir a contaminação.
[0020] De acordo com um quarto aspecto da invenção, é fornecido um instrumento para controlar as funções do dispositivo centrípeto fluídico. O sistema compreende componentes mecânicos, tais como um motor para girar o dispositivo centrípeto fluídico, ímãs para mover o membro translocável no dispositivo centrípeto fluídico, elementos térmicos para controlar a temperatura do dispositivo fluídico, componentes ópticos para medir os sinais de fluorescência e uma interface de máquina eletrônica e humana, por exemplo, com um dispositivo de tela de toque.
[0021] Em uma modalidade, o instrumento fornece um controle da temperatura do ar em zonas múltiplas do dispositivo centrípeto fluídico.
[0022] Em uma modalidade, o instrumento fornece um controle de temperatura em múltiplas zonas em um dispositivo centrípeto colocando elementos térmicos em contato com o dispositivo centrípeto fluídico de rotação.
[0023] De acordo com um amplo aspecto, é fornecido um dispositivo centrípeto fluídico para testar componentes de um material biológico em uma amostra de fluido, o aparelho compreendendo uma camada de componente fluídico com um lado posterior substancialmente plano, a camada de componente fluídico tendo uma forma adaptada para ser recebida dentro de um suporte giratório, o suporte giratório tendo um centro de rotação e com uma borda exterior, a camada de componente fluídico se estendendo radialmente entre o centro de rotação e a borda exterior, um lado interno da camada de componente fluídico sendo localizado em direção ao centro de rotação e um lado externo da camada de componente fluídico sendo localizado em direção à borda exterior, a camada de componente fluídico sendo formada para incluir: um receptáculo de entrada de amostra para receber a amostra, o receptáculo de entrada de amostra se estendendo para fora a partir da camada de componente fluídico e estando localizado próximo do lado interno, o receptáculo de entrada de amostra terminando em uma saída de amostra; um canal de entrada para circular a amostra de fluido, o canal de entrada sendo acoplado à saída da amostra em uma extremidade e a uma entrada de câmara na outra extremidade; uma câmara preenchível de fundo acoplada ao canal de entrada na entrada de câmara para receber a amostra de fluido, a entrada de câmara sendo fornecida a um lado externo da câmara preenchível de fundo.
[0024] Em uma modalidade, o aparelho compreende ainda uma tampa para o receptáculo de entrada de amostra para fechar o acesso ao receptáculo de entrada de amostra.
[0025] Em uma modalidade, a câmara preenchível de fundo é de forma oblonga e estende-se radialmente entre o lado interno e o lado externo.
[0026] Em uma modalidade, a câmara preenchível de fundo inclui pelo menos um membro translocável que transloca dentro da câmara preenchível de fundo, em resposta a um campo magnético flutuante externo.
[0027] Em uma modalidade, o membro translocável que transloca em resposta a um campo magnético flutuante é formado de material paramagnético.
[0028] Em uma modalidade, o membro translocável que transloca em resposta a um campo magnético flutuante é um disco ou uma esfera.
[0029] Em uma modalidade, o membro translocável é ferromagnético.
[0030] Em uma modalidade, a câmara preenchível de fundo compreende ainda, pelo menos, um objeto que não reage em resposta a um campo magnético flutuante.
[0031] Em uma modalidade, o objeto é, pelo menos, um de uma esfera, uma esfera de vidro, uma esfera de zircônio, uma resina, e uma pasta de esferas e de resina.
[0032] Em uma modalidade, o objeto é revestido com um material quelante adaptado para interagir com os componentes da amostra.
[0033] Em uma modalidade, cada um do objeto e do membro translocável é maior em tamanho do que o tamanho da entrada de câmara.
[0034] Em uma modalidade, a câmara preenchível de fundo é uma câmara de homogeneização.
[0035] Em uma modalidade, a câmara preenchível de fundo é uma câmara de lise.
[0036] Em uma modalidade, a câmara preenchível de fundo é uma câmara de clarificação.
[0037] Em uma modalidade, a câmara preenchível de fundo é uma câmara de concentração de alvo.
[0038] Em uma modalidade, o aparelho compreende ainda uma câmara de transbordamento acoplada a uma saída de excesso para a câmara preenchível de fundo, a saída de excesso permitindo a saída de uma parte da amostra de fluido a partir da câmara preenchível de fundo para a câmara de transbordamento.
[0039] Em uma modalidade, a saída de excesso é fornecida próxima do lado interno da câmara preenchível de fundo.
[0040] Em uma modalidade, a saída de excesso é fornecida em um lado longitudinal da câmara preenchível de fundo.
[0041] Em uma modalidade, o aparelho compreende ainda uma descarga de saída para a câmara preenchível de fundo, a descarga de saída permitindo a saída da amostra a partir da câmara preenchível de fundo.
[0042] Em uma modalidade, a descarga de saída está localizada em um lado longitudinal da câmara preenchível de fundo.
[0043] Em uma modalidade, cada objeto e o membro translocável são maiores em tamanho do que o tamanho da descarga de saída.
[0044] Em uma modalidade, a saída de excesso é localizada mais próxima do lado interno do que a descarga de saída.
[0045] Em uma modalidade, o aparelho compreende ainda uma câmara de retenção, a câmara de retenção sendo acoplada à descarga de saída de um lado interno da câmara de retenção, a câmara de retenção sendo localizada mais próxima do lado externo da camada de componente fluídico do que a câmara preenchível de fundo.
[0046] Em uma modalidade, a câmara de retenção é acoplada à descarga de saída através de um canal de transferência, o canal de transferência para a circulação de pelo menos uma porção da amostra de fluido da câmara preenchível de fundo para a câmara de retenção.
[0047] Em uma modalidade, o aparelho compreende ainda um recipiente integralmente fornecido na câmara de retenção e contendo um reagente líquido, o recipiente estando adaptado para manter o reagente líquido no recipiente e para liberar o reagente líquido na câmara de retenção por aplicação de uma força externa na câmara de retenção.
[0048] De acordo com um aspecto amplo, é fornecido um dispositivo centrípeto fluídico para a mistura de um reagente líquido, com uma amostra de fluido, o aparelho compreendendo uma camada de componente fluídico com um lado posterior substancialmente plano, a camada de componente fluídico tendo uma forma adaptada para ser recebida dentro de um suporte giratório, o suporte giratório tendo um centro de rotação e uma borda exterior, a camada de componente fluídico se estendendo radialmente entre o centro de rotação e a borda exterior, um lado interno da camada de componente fluídico sendo localizado em direção ao centro de rotação e um lado externo da camada de componente fluídico sendo localizado em direção à borda exterior, a camada de componente fluídico sendo formada para incluir: um receptáculo de entrada de amostra para receber a amostra, o receptáculo de entrada de amostra se estendendo para fora a partir da camada de componente fluídico e sendo localizado próximo do lado interno, o receptáculo de entrada de amostra terminando em uma saída de amostra, uma câmara de retenção acoplada ao receptáculo de entrada de amostra para receber a amostra de fluido dentro da câmara de retenção, um recipiente integralmente fornecido na câmara de retenção e contendo um reagente líquido, o recipiente estando adaptado para manter o reagente líquido no recipiente e para liberar o reagente líquido na câmara de retenção, após aplicação de uma força externa para a câmara de retenção.
[0049] Em uma modalidade, o aparelho compreende ainda um canal de entrada para circular a amostra de fluido a partir da saída da amostra para uma entrada de câmara de retenção da câmara de retenção.
[0050] Em uma modalidade, da câmara de retenção tem um receptáculo para receber a amostra de fluido.
[0051] Em uma modalidade, o receptáculo está localizado no lado externo da câmara de retenção.
[0052] Em uma modalidade, um volume de capacidade do receptáculo é pelo menos igual a um volume de capacidade da amostra transferida para a câmara de retenção.
[0053] Em uma modalidade, o recipiente inclui um reagente seco.
[0054] Em uma modalidade, o reagente seco é um reagente controle de inibidor.
[0055] Em uma modalidade, a câmara de retenção é uma câmara de diluição.
[0056] Em uma modalidade, o receptáculo da câmara de retenção é esvaziado após a liberação do diluente.
[0057] Em uma modalidade, o recipiente é feito de um vidro, vidro capilar, termoplástico polimérico e/ou material sensível ao calor.
[0058] Em uma modalidade, o reagente líquido é um agente de diluição.
[0059] Em uma modalidade, o reagente líquido é um de água, tampão, íon, polímero, proteína, açúcar, ácido nucléico e/ou uma parte secável de uma solução.
[0060] Em uma modalidade, o recipiente tem uma tampa feita de um material sensível ao calor, adaptado para ser fundido a uma temperatura de fusão, permitindo que o reagente líquido percorra de dentro do recipiente para fora do recipiente na câmara de retenção.
[0061] Em uma modalidade, o recipiente é feito de material sensível ao calor.
[0062] Em uma modalidade, a força externa é uma de força mecânica, elétrica, eletromagnética, de calor, de choque e acústica.
[0063] Em uma modalidade, o recipiente tem uma abertura liberável.
[0064] Em uma modalidade, a câmara de retenção tem uma saída de distribuição para a câmara de retenção, a saída de distribuição sendo localizada em um lado externo da câmara de retenção, a saída de distribuição sendo acoplada a um canal de distribuição transversal em um lado interno do canal de distribuição transversal em uma primeira extremidade transversal do canal de distribuição, o canal de distribuição transversal tendo uma série de pelo menos uma cubeta fornecida a um lado externo do canal de distribuição transversal.
[0065] Em uma modalidade, a saída de distribuição é acoplada ao canal de distribuição por meio de um canal de transferência.
[0066] Em uma modalidade, as cubetas incluem um reagente seco.
[0067] Em uma modalidade, o reagente seco é para amplificação e pode incluir uma enzima.
[0068] Em uma modalidade, as cubetas incluem um conjunto de iniciadores.
[0069] Em uma modalidade, o reagente seco na cubeta é coberto por um filme de material sensível ao calor ou de mudança de fase, com uma densidade inferior à da água.
[0070] Em uma modalidade, o material sensível ao calor é uma cera.
[0071] Em uma modalidade, a cubeta está adaptada para ser opticamente interrogada por pelo menos um parâmetro.
[0072] Em uma modalidade, a cubeta tem um corpo de cubeta com pelo menos uma janela opticamente transparente no corpo de cubeta, as janelas opticamente transparentes sendo alinhadas com um percurso de luz de uma fonte de luz adaptada para projetar a luz de um comprimento de onda predeterminado ao longo do caminho da luz.
[0073] Em uma modalidade, o parâmetro é um de fluorescência, absorbância, e colorimetria.
[0074] Em uma modalidade, o parâmetro é a fluorescência e em que a cubeta inclui uma de solução de fluorescência na cubeta, partículas cobertas com fluoróforo em uma solução na cubeta, partículas de fluoróforo na parede interior da cubeta.
[0075] Em uma modalidade, a cubeta é uma câmara de detecção.
[0076] Em uma modalidade, a cubeta é uma câmara de amplificação.
[0077] Em uma modalidade, a cubeta é uma câmara de amplificação do ácido nucléico.
[0078] Em uma modalidade, o canal de distribuição transversal inclui uma câmara de resíduos em uma segunda extremidade transversal do canal de distribuição.
[0079] Em uma modalidade, a câmara de resíduos inclui um vedante ativado por calor, adaptado para vedar a entrada na cubeta, acoplado ao canal de distribuição.
[0080] Em uma modalidade, o vedante ativado por calor, é uma cera.
[0081] Em uma modalidade, pelo menos uma da entrada de câmara, saída de excesso, a descarga de saída, a saída de distribuição incluindo uma válvula antirrefluxo.
[0082] Em uma modalidade, pelo menos uma da entrada de câmara, a saída de excesso, a descarga de saída, a saída de distribuição incluindo uma válvula de ruptura, a válvula de ruptura abrindo a uma força centrípeta aplicada predeterminada no aparelho.
[0083] Em uma modalidade, a válvula antirrefluxo e a válvula de ruptura sendo fornecida em uma única válvula de ruptura antirrefluxo.
[0084] Em uma modalidade, a camada de componente fluídico é feita de um material plástico.
[0085] Em uma modalidade, o material plástico é um de material policarbonato, polipropileno, PDMS, COC, SU-8.
[0086] Em uma modalidade, a camada de componente fluídico é vedada na parte de trás substancialmente plana, com uma folha de material plástico.
[0087] Em uma modalidade, a folha de material plástico uma é de material de policarbonato, polipropileno, PDMS, COC, SU-8.
[0088] Em uma modalidade, a camada de componente fluídico é vedada com a folha de material de plástico através de métodos de ligação tais como adesivo, material adesivo sensível à pressão, transferência de calor, ligação por solvente, adesivo curável por UV, ligação por ultrassom, soldadura a laser, ligação por RF.
[0089] Em uma modalidade, a característica de ruptura das válvulas de ruptura é uma combinação da sua distância a partir do centro de rotação, do material plástico que constitui a placa de suporte, do material que constitui a vedação e a geometria da própria válvula moldada no material plástico.
[0090] Em uma modalidade, o canal de distribuição, as cubetas e a câmara de resíduos são fornecidos em uma porção da placa do membro de suporte que se estende além da borda exterior do suporte giratório.
[0091] Em uma modalidade, a camada de componente fluídico é retangular.
[0092] Em uma modalidade, o suporte é um disco.
[0093] Em uma modalidade, a forma da camada de componente fluídico é uma seção cônica de um anel.
[0094] Em uma modalidade, a seção cônica do anel é uma fração de um anel.
[0095] Em uma modalidade, a seção cônica de um anel é de um oitavo de um anel.
[0096] Em uma modalidade, o aparelho compreende ainda saídas de ventilação de pelo menos uma da câmara de transbordamento, da câmara de retenção e do canal de distribuição, as saídas de ventilação sendo conectadas a um canal de autoventilação.
[0097] Em uma modalidade, o canal de autoventilação é acoplado à entrada da amostra no recipiente de um lado interno do receptáculo de entrada de amostra.
[0098] Em uma modalidade, a camada de componente fluídico está adaptada para ser, pelo menos parcialmente aquecida.
[0099] Em uma modalidade, a camada de componente fluídico está adaptada para ser de temperatura controlada.
[0100] Em uma modalidade, a camada de componente fluídico está adaptada para ser dividida em pelo menos duas seções distintas controláveis por temperatura.
[0101] Em uma modalidade, uma primeira das duas seções distintas controláveis por temperatura inclui a câmara preenchível de fundo e a câmara de retenção.
[0102] Em uma modalidade, uma primeira das duas seções distintas controláveis por temperatura inclui, pelo menos, a câmara de retenção.
[0103] Em uma modalidade, a primeira seção inclui o receptáculo de entrada de amostra, o canal de entrada, a câmara de transbordamento e o canal de medição.
[0104] Em uma modalidade, uma segunda das duas seções distintas controláveis por temperatura inclui, pelo menos, o canal de distribuição e as cubetas.
[0105] Em uma modalidade, a segunda das duas seções inclui a câmara de transbordamento e uma porção do canal de transferência.
[0106] Em uma modalidade, a amostra de fluido é, pelo menos, uma de sangue, aspiração da faringe nasal, fluido oral, líquido de esfregaço bucal ressuspenso, líquido de esfregaço nasal ressuspenso, líquido ressuspenso de esfregaço anal, líquido ressuspenso de esfregaço vaginal, saliva urina (pura ou diluída).
[0107] De acordo com um amplo aspecto, é fornecido um aparelho de teste usando um dispositivo centrípeto fluídico para testar componentes de um material biológico em uma amostra de fluido, o aparelho compreendendo pelo menos um do dispositivo centrípeto fluídico, um conjunto de rotor, um suporte para receber pelo menos um do dispositivo centrípeto fluídico usando a camada de componente fluídico, o suporte sendo acoplado ao rotor, um motor para girar o conjunto de rotor, um controlador de velocidade para o motor controlar pelo menos uma de uma duração, aceleração e uma velocidade de rotação do conjunto de rotor; um subsistema de condicionamento de temperatura para controlar uma temperatura de pelo menos uma porção do dispositivo centrípeto microfluídico; um subsistema de excitação para excitar a amostra do dispositivo centrípeto fluídico e a obtenção de um resultado de teste; uma interface de usuário para receber um comando de usuário e para enviar um comando para pelo menos um de controlador de velocidade, subsistema de condicionamento da temperatura e subsistema de excitação.
[0108] Em uma modalidade, o suporte é um conjunto de rotor que compreende uma parte inferior de um rotor que recebe o dispositivo centrípeto fluídico e um anel de pressão para fixar o dispositivo centrípeto fluídico.
[0109] Em uma modalidade, o aparelho de teste compreende ainda um invólucro para o aparelho de teste tendo uma base, paredes e uma tampa articulada, o invólucro envolvendo o conjunto de rotor, o suporte, o motor, o subsistema de condicionamento de temperatura e o subsistema excitação.
[0110] Em uma modalidade, o aparelho de teste compreende ainda ímãs permanentes fornecidos sob o rotor.
[0111] Em uma modalidade, o subsistema de condicionamento de temperatura controla a temperatura de duas zonas do dispositivo centrípeto fluídico.
[0112] Em uma modalidade, o aparelho de teste compreende ainda os compartimentos criados por pelo menos um do invólucro, parede de separação de invólucro, conjunto de rotor, parede de isolamento do rotor, suporte, isolamento da tampa e a parede de isolamento da tampa.
[0113] Em uma modalidade, o aparelho de teste compreende ainda os materiais de isolamento que podem ser usados para controlar a transferência de calor entre os compartimentos.
[0114] Em uma modalidade, o subsistema de condicionamento de temperatura compreende um elemento térmico localizado em um dos acima e debaixo de uma zona de aquecimento.
[0115] Em uma modalidade, o elemento térmico é uma bobina de aquecimento resistivo.
[0116] Em uma modalidade, o aparelho de teste compreende ainda um termopar no interior de cada zona de aquecimento para medir a temperatura individual de cada zona.
[0117] Em uma modalidade, o aparelho de teste compreende ainda um ventilador que força a entrada de ar à temperatura ambiente na zona de aquecimento.
[0118] Em uma modalidade, o aparelho de teste compreende ainda uma porta de saída para ejetar o ar quente para fora da zona de aquecimento.
[0119] Em uma modalidade, o subsistema de excitação inclui uma fonte de luz, e elementos ópticos para forma um feixe de excitação.
[0120] Em uma modalidade, o subsistema de excitação inclui um módulo de detecção para recolher a luz emitida por espécies de interesse dentro do dispositivo centrípeto fluídico.
[0121] De acordo com um aspecto amplo, é fornecido um método de teste usando um dispositivo centrípeto fluídico para testar componentes de um material biológico em uma amostra de fluido, o método compreendendo fornecer pelo menos um do dispositivo centrípeto fluídico; fornecer um aparelho de teste; fornecer uma amostra de fluido com o material biológico; carregar a amostra de fluido no receptáculo de entrada de amostra do dispositivo centrípeto fluídico; colocar o dispositivo centrípeto fluídico no suporte do aparelho de teste, fornecer um comando de usuário para iniciar uma sequência de teste; girar o conjunto de rotor a uma primeira velocidade para transferir a amostra de fluido a partir do receptáculo de entrada de amostra na câmara preenchível de fundo.
[0122] Em uma modalidade, a rotação inclui ainda esvaziar parte da amostra na câmara de transbordamento.
[0123] Em uma modalidade, o método de teste compreende ainda girar o conjunto de rotor a uma segunda velocidade para ativar o movimento do membro de translocação dentro da câmara preenchível de fundo.
[0124] Em uma modalidade, o método de teste compreende ainda girar o conjunto de rotor a uma terceira velocidade para clarificar a amostra e romper a saída de medição, em que um volume medido da amostra se transfere para a câmara de retenção.
[0125] Em uma modalidade, o volume medido se transfere para o receptáculo da câmara de retenção.
[0126] Em uma modalidade, o método de teste compreende ainda a rotação do conjunto de rotor a uma quarta velocidade.
[0127] E m um modalidade, o método de teste compreende ainda o aquecimento da câmara de retenção, liberando, assim, o reagente líquido do recipiente.
[0128] E m uma modalidade, o método de teste compreende ainda girar o conjunto de rotor a uma quinta velocidade para romper a saída da câmara de retenção.
[0129] Em uma modalidade, o método de teste compreende ainda manter as cubetas a uma temperatura abaixo de 65°C.
[0130] Em uma modalidade, o método de teste compreende ainda manter as cubetas a uma temperatura abaixo de 35°C.
[0131] Em uma modalidade, o método de teste compreende ainda o aquecimento das cubetas a uma primeira temperatura.
[0132] Em uma modalidade, o método de teste compreende ainda o aquecimento das cubetas a uma segunda temperatura.
[0133] Em uma modalidade, o método de teste compreende ainda ciclagem da temperatura das cubetas entre uma temperatura de teste alta, baixa e média.
[0134] Em uma modalidade, o método de teste compreende ainda tomar a medição da fluorescência tendo pelo menos um comprimento de onda de excitação no final de cada ciclo de temperatura.
[0135] Em uma modalidade, o método de teste compreende ainda registrar medições de fluorescência.
[0136] De acordo com um aspecto amplo, é fornecido um método de teste usando um dispositivo centrípeto fluídico para testar componentes de um material biológico em uma amostra de fluido, o método compreendendo fornecer pelo menos um do dispositivo centrípeto fluídico; fornecer um aparelho de teste; fornecer uma amostra de fluido com o material biológico; carregar a amostra de fluido no receptáculo de entrada de amostra do dispositivo centrípeto fluídico; colocar o dispositivo centrípeto fluídico no suporte do aparelho de teste, fornecer um comando de usuário para iniciar uma sequência de testes, girar o conjunto de rotor a uma primeira velocidade para transferir a amostra de fluido a partir do receptáculo de entrada de amostra na câmara de retenção; aquecer a câmara de retenção, liberando, assim, o reagente líquido do recipiente.
[0137] Em uma modalidade, o método compreende girar o conjunto de rotor a uma quinta velocidade para romper a saída da câmara de retenção.
[0138] Em uma modalidade, a amostra se transfere para o receptáculo da câmara de retenção.
[0139] De acordo com outro aspecto amplo da presente invenção, é fornecido um aparelho centrípeto fluídico para testar componentes de um material biológico em um fluido. O dispositivo centrípeto fluídico é adaptado para ser recebido dentro de um suporte giratório. O aparelho compreende uma camada de componente fluídico tendo características fluídicas em pelo menos uma face frontal e uma camada de componente de fundo ligada a uma parte traseira da camada de componente fluídico criando, desse modo, uma rede fluídica através da qual o fluido flui mediante a força centrípeta. Um aparelho de teste e um método de teste usando um dispositivo centrípeto fluídico para testar componentes de um material biológico em um fluido são também fornecidos.
[0140] Em uma modalidade, a característica fluídica pode ser uma câmara preenchível de fundo acoplada a um canal de entrada para receber o fluido, a entrada de câmara sendo fornecida a um lado externo da câmara preenchível de fundo.
[0141] Em outra modalidade, a característica fluídica pode ser uma câmara de retenção acoplada a um canal de entrada para receber o fluido, um recipiente integralmente fornecido na câmara de retenção e contendo um diluente líquido, o recipiente mantendo o diluente líquido no recipiente até que ele se libera na câmara de retenção após aplicação de uma força externa para o recipiente, restaurando, assim, a conexão fluídica entre o diluente líquido e o fluido na câmara de retenção.
[0142] Além disso, a câmara de retenção pode ter um receptáculo de dissociação de fluxo para receber o fluido, localizado no lado externo da câmara de retenção e interromper uma conexão fluídica entre a entrada e a saída da câmara de retenção.
[0143] De acordo com outro aspecto amplo da presente invenção, é fornecido um aparelho centrípeto fluídico para testar componentes de um material biológico em um fluido, o dispositivo centrípeto fluídico tendo uma forma adaptada para ser recebido dentro de um suporte giratório, o suporte giratório tendo um centro de rotação e uma borda exterior, o dispositivo centrípeto fluídico se estendendo radialmente entre o centro de rotação e a borda exterior, um lado interno do dispositivo centrípeto fluídico sendo localizado em direção ao centro de rotação e um lado externo do dispositivo centrípeto fluídico sendo localizado em direção à borda exterior, o aparelho compreendendo: uma camada de componente fluídico tendo características fluídicas em, pelo menos, uma face frontal, as características fluídicas incluindo um canal de entrada para circular o fluido, o canal de entrada sendo acoplado a uma entrada de câmara, uma câmara preenchível de fundo acoplada ao canal de entrada na entrada de câmara para receber o fluido, a entrada de câmara sendo fornecida a um lado externo da câmara preenchível de fundo, e uma camada de componente de fundo ligada a uma parte traseira da camada de componente fluídico criando, assim, uma rede fluídica através da qual o fluido flui mediante a força centrípeta.
[0144] Em uma modalidade, o aparelho centrípeto fluídico compreende ainda um receptáculo de entrada para receber fluido, o receptáculo de entrada se estendendo para fora a partir da camada de componente fluídico em uma face frontal da camada de componente fluídico e sendo localizado próximo do lado interno, o receptáculo de entrada terminando em uma saída do receptáculo de entrada, o canal de entrada sendo acoplado à saída do receptáculo de entrada em uma extremidade oposta à entrada de câmara.
[0145] Em uma modalidade, a câmara preenchível de fundo inclui, pelo menos, um membro translocável que transloca dentro da câmara preenchível de fundo, em resposta a um campo magnético flutuante externo.
[0146] Em uma modalidade, a câmara preenchível de fundo compreende, pelo menos, um objeto não responsivo a um campo magnético flutuante e em que o objeto é, pelo menos, um de uma esfera, um zeólito, uma partícula, uma partícula de filtração, uma esfera de vidro, uma esfera de zircônio, uma resina, uma pasta de esfera e resina.
[0147] Em uma modalidade, pelo menos um do objeto e do membro translocável é revestido com pelo menos um de um quelante e um material ligante adaptado para interagir com os componentes do fluido.
[0148] Em uma modalidade, o aparelho centrípeto fluídico compreende ainda uma câmara de transbordamento acoplada a uma saída de excesso para a câmara preenchível de fundo, a saída de excesso permitindo a saída de parte do fluido a partir da câmara preenchível de fundo para a câmara de transbordamento, em que a saída de excesso é fornecida próxima do lado interno da câmara preenchível de fundo em um lado longitudinal da câmara preenchível de fundo.
[0149] Em uma modalidade, o aparelho centrípeto fluídico compreende ainda uma descarga de saída para a câmara preenchível de fundo, a descarga de saída permitindo a saída do fluido a partir da câmara preenchível de fundo, em que a descarga de saída está localizada no lado longitudinal da câmara preenchível de fundo, a descarga de saída sendo localizada mais próxima do lado externo da câmara preenchível de fundo que a saída de excesso, um volume de medição da câmara preenchível de fundo sendo definido entre a descarga de saída e a saída de excesso.
[0150] Em uma modalidade, o aparelho centrípeto fluídico compreende ainda descarga de saída para a câmara preenchível de fundo, a descarga de saída permitindo a saída do fluido a partir da câmara preenchível de fundo, em que a descarga de saída está localizada sobre um lado longitudinal da câmara preenchível de fundo.
[0151] Em uma modalidade, o aparelho centrípeto fluídico compreende ainda uma válvula de ruptura na descarga de saída, a válvula de ruptura abrindo a uma força centrípeta predeterminada aplicada sobre o aparelho, a válvula de ruptura impedindo o fluido de sair da câmara preenchível de fundo até a abertura.
[0152] Em uma modalidade, o aparelho centrípeto fluídico compreende ainda uma câmara de retenção, a câmara de retenção sendo acoplada à descarga de saída de um lado interno da câmara de retenção, sendo a câmara de retenção localizada mais próxima do lado externo da camada de componente fluídico do que a câmara preenchível de fundo, em que a câmara de retenção é acoplada à descarga de saída através de um canal de medição, o canal de medição para circular pelo menos uma porção do fluido a partir da câmara preenchível de fundo para a câmara de retenção.
[0153] Em uma modalidade, o aparelho centrípeto fluídico compreende ainda um recipiente integralmente fornecido na câmara de retenção e contendo um diluente líquido, o recipiente estando adaptado para manter o diluente líquido dentro do recipiente e para liberar o diluente líquido na câmara de retenção mediante aplicação de uma força externa para o recipiente, em que a força externa é uma de força mecânica, elétrica, eletromagnética, de calor, e de choque acústico, restaurando, assim, a conexão fluídica entre o diluente líquido e o fluido na câmara de retenção.
[0154] Um aparelho centrípeto fluídico para testar componentes de um material biológico em um fluido, o dispositivo centrípeto fluídico tendo uma forma adaptada para ser recebida dentro de um suporte giratório, o suporte giratório tendo um centro de rotação e com uma borda exterior, o dispositivo centrípeto fluídico se estendendo radialmente entre o centro de rotação e a borda exterior, um lado interno do dispositivo centrípeto fluídico sendo localizado em direção ao centro de rotação e um lado externo do dispositivo centrípeto fluídico sendo localizado em direção à borda exterior, o aparelho compreendendo: uma camada de componente fluídico tendo características fluídicas em pelo menos uma face frontal, as características fluídicas incluindo um canal de entrada para circular o fluido, o canal de entrada sendo acoplado a uma saída de receptáculo de entrada, uma câmara de retenção, a câmara de retenção sendo acoplada ao canal de entrada através da saída de receptáculo de entrada para receber fluido dentro da câmara de retenção; um recipiente integralmente fornecido na câmara de retenção e contendo um diluente líquido, o recipiente estando adaptado para manter o diluente líquido no recipiente e para liberar o diluente líquido na câmara de retenção mediante aplicação de uma força externa para o recipiente, em que a força externa é uma de força mecânica, elétrica, eletromagnética, de calor, de choque e acústico, restaurando, assim, a conexão fluídica entre o diluente líquido e o fluido na câmara de retenção; e uma camada de componente de fundo ligada a uma parte traseira da camada de componente fluídico criando, assim, uma rede fluídica através da qual o fluido flui mediante a força centrípeta.
[0155] Em uma modalidade, a câmara de retenção tem um receptáculo de dissociação de fluido para receber o fluido, em que o receptáculo de dissociação de fluido está localizado no lado externo da câmara de retenção, o receptáculo de dissociação de fluido interrompendo uma conexão fluídica entre a saída e a entrada do receptáculo e uma saída de distribuição da câmara de retenção.
[0156] Em uma modalidade, o receptáculo de dissociação de fluido inclui um reagente seco.
[0157] Em uma modalidade, a câmara de retenção tem uma saída de distribuição para a câmara de retenção, a saída de distribuição sendo localizada em um lado externo da câmara de retenção, a saída de distribuição estando acoplada a um canal de distribuição transversal a um lado interno do canal de distribuição transversal a uma primeira extremidade transversal do canal de distribuição, o canal de distribuição transversal tendo uma série de pelo menos uma cubeta fornecida a um lado externo do canal de distribuição transversal.
[0158] Em uma modalidade, pelo menos uma das cubetas inclui pelo menos um de um reagente desidratado e um material de mudança de fase.
[0159] Em uma modalidade, a cubeta está adaptada para ser opticamente interrogada para pelo menos um parâmetro, o parâmetro é um de fluorescência, absorbância, e colorimetria.
[0160] Em uma modalidade, o canal de distribuição transversal inclui uma câmara de resíduos em uma segunda extremidade transversal do canal de distribuição.
[0161] Em uma modalidade, a câmara de resíduos inclui um material de mudança de fase.
[0162] Em uma modalidade, o canal de distribuição, as cubetas e a câmara de resíduos são fornecidos a uma porção do componente de camada fluídica que se estende além da borda exterior do suporte giratório.
[0163] Em uma modalidade, a camada de componente fluídico está adaptada para ser dividida em pelo menos duas seções distintas controláveis por temperatura, em que uma primeira das duas seções distintas controláveis por temperatura inclui, pelo menos, a câmara de retenção e uma segunda das duas seções distintas controláveis por temperatura inclui pelo menos o canal de distribuição e as cubetas.
[0164] Um aparelho centrípeto fluídico para testar componentes de um material biológico em um fluido, o dispositivo centrípeto fluídico tendo uma forma adaptada para ser recebida dentro de um suporte giratório, o suporte giratório tendo um centro de rotação e uma borda exterior, o dispositivo centrípeto fluídico se estendendo radialmente entre o centro de rotação e a borda exterior, um lado interno do dispositivo centrípeto fluídico sendo localizado em direção ao centro de rotação e um lado externo do dispositivo centrípeto fluídico sendo localizado em direção à borda exterior, o aparelho compreendendo: uma camada de componente fluídico tendo características fluídicas em, pelo menos, uma face frontal, as características fluídicas incluindo um receptáculo de entrada para receber fluido, o receptáculo de entrada se estendendo para fora a partir da camada de componente fluídico em uma face frontal da camada de componente fluídico e sendo localizado próximo do lado interno, o receptáculo de entrada terminando em uma saída de receptáculo de entrada; um canal de entrada para circular o fluido, o canal de entrada sendo acoplado à saída do receptáculo de entrada a uma extremidade e a uma entrada de câmara na outra extremidade; uma câmara preenchível de fundo acoplada ao canal de entrada na entrada de câmara para receber o fluido, a entrada de câmara sendo fornecida a um lado externo da câmara preenchível de fundo, e uma câmara de retenção, a câmara de retenção sendo acoplada à câmara preenchível de fundo para receber o fluido dentro da câmara de retenção; uma saída de distribuição para a câmara de retenção, a saída de distribuição sendo localizada em um lado externo da câmara de retenção; um canal de distribuição transversal tendo uma série de pelo menos uma cubeta fornecida em um lado externo do canal de distribuição transversal, a saída de distribuição sendo acoplada ao canal de distribuição transversal a um lado interno do canal de distribuição transversal em uma primeira extremidade transversal do canal de distribuição, uma câmara de resíduos em uma segunda extremidade transversal do canal de distribuição, e uma camada de componente de fundo ligada a uma parte traseira da camada de componente fluídico, criando assim uma rede fluídica através da qual o fluido flui mediante a força centrípeta.
[0165] Um aparelho de teste usando um dispositivo centrípeto fluídico para testar componentes de um material biológico em um fluido, o aparelho compreendendo: pelo menos um do dispositivo centrípeto fluídico, um conjunto de rotor, um suporte para receber pelo menos um de dispositivo centrípeto fluídico usando a camada de componente fluídico, o suporte sendo acoplado ao rotor, um motor para girar o conjunto de rotor; um controlador de velocidade para o motor controlar pelo menos um de uma duração e uma velocidade de rotação do conjunto de rotor; um subsistema de condicionamento de temperatura para controlar uma temperatura de pelo menos uma porção do dispositivo centrípeto microfluídico; um subsistema de detecção para detectar uma característica do fluido; uma interface de usuário para receber um comando de usuário e para enviar um comando para pelo menos um controlador de velocidade, o subsistema de condicionamento de temperatura, o subsistema de excitação e o subsistema de detecção.
[0166] Em uma modalidade, o subsistema de condicionamento de temperatura controla a uma temperatura de pelo menos duas zonas do dispositivo centrípeto fluídico.
[0167] Um método de teste usando um dispositivo centrípeto fluídico para testar componentes de um material biológico em um fluido, o método compreendendo: fornecer pelo menos um do dispositivo centrípeto fluídico; fornecer um aparelho de teste, fornecer um fluido com o material biológico, carregar o fluido no receptáculo de entrada do dispositivo centrípeto fluídico; colocar o dispositivo centrípeto fluídico no suporte do aparelho de teste; fornecer um comando de usuário para iniciar uma sequência de testes; girar o conjunto de rotor a uma primeira velocidade para transferir o fluido do receptáculo de entrada para a câmara preenchível de fundo.
Definições
[0168] Neste relatório, o termo “dispositivo centrípeto fluídico” destina-se a significar uma rede fluídica com o fluido motivado pela ação da rotação.
[0169] Neste relatório, o termo “Macro” nas expressões “Estrutura Macro” e “Geometria Macro” destina-se a significar uma característica do dispositivo centrípeto fluídico maior que 1 mm. Em particular, as dimensões de “Macro Estrutura” são, por exemplo, de cerca de 1 mm a cerca de 10 mm.
[0170] Neste relatório, o termo “Micro” nas expressões “Micro Estrutura” e “Micro Geometria” destina-se a significar uma característica do dispositivo centrípeto fluídico menor que 1 mm. Em particular, dimensões de “Micro Estrutura” cerca de 1 pm a cerca de 1 mm.
[0171] Neste relatório, o termo “Amostra”, destina-se a significar qualquer suspensão de fluido, solução ou mistura a ser analisada. Em particular “amostra” pode ser uma amostra “biológica” ou “amostra biológica em bruto” e destina-se a significar qualquer espécie biológica de interesse a partir do sangue, componentes do sangue, nasal e/ou da faringe e/ou fluido corporal oral, o líquido de esfregaço nasal e/ou oral e/ou da faringe ressuspenso, líquido ressuspenso de esfregaço anal/vaginal, a saliva, o exsudato da ferida, fezes e urina.
[0172] Neste relatório, o termo “Diluente” destina-se a significar uma determinada quantidade de líquido que pode servir para diluir uma amostra.
[0173] Neste relatório, o termo “Receptáculo” destina-se a significar um elemento de dispositivo centrípeto fluídico projetado para receber uma certa quantidade de fluido.
[0174] Neste relatório, o termo “Canal” destina-se a significar um caminho de microestrutura ou macroestrutura de um dispositivo centrípeto fluídico permitindo o fluxo de fluido entre as câmaras de dispositivos centrípetos fluídicos, receptáculos, e receptáculos de amostras.
[0175] Neste relatório, o termo “Entrada” destina-se a significar uma abertura para uma câmara de dispositivo centrípeto fluídico permitindo que o fluido entre.
[0176] Neste relatório, o termo “Saída” destina-se a significar uma abertura para uma câmara de dispositivo centrípeto fluídico permitindo que o fluido saia.
[0177] Neste relatório, o termo “válvula de ruptura” ou “válvula fluídica” é usado indiferentemente e pretende significar uma microestrutura em um dispositivo centrípeto fluídico tendo a função principal de ajudar a impedir que o líquido flua abaixo de uma certa quantidade de pressão aplicada sobre o líquido, tipicamente pela força centrípeta criada pela rotação do dispositivo centrípeto fluídico. O fluxo flui através de “válvula de ruptura” quando a pressão supera a força produzida pela tensão superficial do líquido.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0178] Tendo assim descrito geralmente a natureza da invenção, será feita referência aos desenhos anexos, mostrando a título de ilustração modalidades exemplares dos mesmos nos quais:
[0179] A FIG. 1A é uma vista em perspectiva de um conjunto de rotor mantendo um dispositivo centrípeto fluídico; a FIG. 1B representa uma vista oblíqua, explodida, de um dispositivo centrípeto fluídico em uma parte inferior de um rotor; a FIG. 1C ilustra uma vista oblíqua de um dispositivo centrípeto fluídico; a FIG. 1D é uma vista em corte de um dispositivo centrípeto fluídico.
[0180] A FIG. 2A ilustra um ventilador fluídico conectado ao receptáculo de entrada; a FIG. 2B ilustra uma tampa para o receptáculo de entrada descrito na FIG. 2A.
[0181] A FIG. 3A ilustra a construção fluídica de uma câmara de enchimento de fundo; a FIG. 3B ilustra uma construção alternativa da câmara de enchimento de fundo com uma conexão de porta.
[0182] A FIG. 4A ilustra uma construção alternativa da câmara de enchimento de fundo incluindo um membro translocável; a FIG. 4B ilustra uma construção alternativa da câmara de enchimento de fundo incluindo um membro translocável e reagentes secos.
[0183] A FIG. 5 ilustra uma construção alternativa da câmara de enchimento de fundo, incluindo uma câmara de transbordamento.
[0184] A FIG. 6 ilustra uma construção alternativa da câmara de enchimento de fundo incluindo uma saída de medição.
[0185] A FIG. 7A ilustra uma construção alternativa da câmara de enchimento de fundo, incluindo um membro translocável, reagentes secos, câmara de transbordamento e uma saída de medição; a FIG. 7B ilustra uma construção alternativa da câmara de enchimento de fundo incluindo um membro translocável, reagentes secos, filtro, câmara de transbordamento e uma saída de medição, a FIG. 70 ilustra a construção alternativa da FIG. 7B após a dissociação do filtro por um membro translocável.
[0186] A FIG. 8A ilustra o enchimento da câmara de enchimento de fundo mostrada na FIG. 7A, a FIG. 8B ilustra a translocação do transbordamento de líquido para o elemento 309, a FIG. 80 ilustra a etapa de definição de volume; a FIG. 8D ilustra a translocação do membro translocável; a FIG. 8E ilustra a peletização na parte inferior da câmara de enchimento de fundo de elementos 308 e 307, a FIG. 8F ilustra a translocação do volume medido a partir da câmara inferior para a câmara 313.
[0187] A FIG. 9A ilustra uma vista em corte da geometria de entrada e de saída para ajudar a impedir que o objeto e/ou esfera translocável localizado no material de fase sólida saia da câmara de enchimento de fundo, a FIG. 9B ilustra uma vista superior da geometria de entrada e saída para ajudar a impedir que as esferas e/ou objeto translocável localizado no material de fase sólida saia da câmara de enchimento de fundo.
[0188] A FIG. 10A ilustra uma estrutura fluídica para misturar ou diluir a amostra; a FIG. 10B ilustra o fluido contido em um receptáculo de câmara de retenção, a FIG. 10C ilustra reagentes secos no receptáculo da câmara de retenção, a FIG. 10 D ilustra um recipiente de líquido no interior de uma câmara de retenção.
[0189] A FIG. 11A ilustra o recipiente líquido em um receptáculo de câmara de retenção antes do aquecimento; a FIG. 11B ilustra o fluido contido no receptáculo de câmara de retenção, durante o início do processo de aquecimento, a FIG. 110 ilustra a liberação de líquido a partir do recipiente de fluido dentro da câmara de retenção; a FIG. 11D ilustra a mistura do lisado com o fluido liberado do recipiente de líquido; a FIG.11E ilustra a translocação do lisado diluído a partir da câmara de retenção para a câmara 513.
[0190] A FIG. 12 ilustra uma construção alternativa do recipiente de líquido.
[0191] A FIG. 13 representa uma construção fluídica incluindo uma câmara de enchimento de fundo com câmara de transbordamento e uma saída de medição conectada fluidicamente a uma câmara de retenção.
[0192] A FIG. 14A descreve a construção fluídica de cubetas de detecção de um dispositivo centrípeto fluídico; a FIG. 14B ilustra uma construção alternativa da cubeta de detecção com reagentes secos pré-armazenados; a FIG. 140 ilustra uma construção alternativa da cubeta de detecção com reagentes secos pré-armazenados nas cubetas e pré-armazenados na cera da cubeta nas próprias cubetas, a FIG. 14D ilustra uma construção alternativa da cubeta de detecção com reagentes secos pré- armazenados em cubetas e pré-armazenados em cera de cubeta em uma câmara de resíduos.
[0193] A FIG. 15 ilustra a construção fluídica descrita na FIG. 14D, quando as cubetas são aquecidas e cheias por uma amostra.
[0194] A FIG. 16 representa uma construção fluídica incluindo a câmara de retenção e cubetas de detecção.
[0195] A FIG. 17 representa uma construção fluídica para a preparação e detecção da amostra;
[0196] A FIG. 18 representa uma vista em perspectiva de um instrumento que pode ser utilizado para executar uma série de dispositivos centrípetos fluídicos simultâneos.
[0197] A FIG. 19 representa uma vista oblíqua da arquitetura interior do aparelho ilustrado na FIG. 18.
[0198] A FIG. 20 mostra um diagrama de vários módulos de um instrumento.
[0199] A FIG. 21 ilustra múltiplas regiões de controle da temperatura da zona em um dispositivo centrípeto fluídico.
[0200] A FIG. 22 ilustra uma modalidade alternativa das regiões de controle da temperatura de zona múltipla sobre um dispositivo centrípeto fluídico.
[0201] A FIG. 23 é uma vista em corte transversal do sistema de controle de temperatura do ar de zona dupla com o instrumento ilustrado na FIG. 18.
[0202] A FIG. 24 mostra uma vista em corte esquemático de um módulo de excitação de múltiplos comprimentos de onda.
[0203] A FIG. 25 ilustra perfis espectrais de LEDs, filtro de excitação e divisors de feixe dicróicos adaptados para excitar corantes fluorescentes FAM e Texas Red.
[0204] A FIG. 26 ilustra uma vista em seção esquemática de um módulo de detecção.
[0205] A FIG. 27 ilustra perfis espectrais de um filtro interferencial de banda de passagem de banda dupla adaptado para a detecção de corantes fluorescentes FAM e Texas Red.
[0206] A FIG. 28 ilustra perfis espectrais do filtro interferencial de banda de passagem de penta-banda adaptado para a detecção de corantes fluorescentes comuns.
[0207] A FIG. 29 é um fluxograma das etapas envolvidas para processar um ensaio de PCR utilizando o instrumento ilustrado na FIG. 21.
[0208] As FIGS. 30A, 30B, 30C ilustram a velocidade do rotor e as temperaturas do dispositivo centrípeto fluídico ao longo do tempo para processar a PCR, utilizando o instrumento ilustrado na FIG. 18.
[0209] Deve-se notar que ao longo dos desenhos anexos, características semelhantes são identificadas por numerais de referência.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0210] Conjunto da estrutura de dispositivo centrípeto fluídico
[0211] As FIG. 1A e FIG. 1B mostram um exemplo de conjunto de rotor 1003. Uma parte inferior exemplar do rotor 2 formada para receber até oito dispositivos centrípetos fluídicos 1. O conjunto de rotor inclui um rotor da parte inferior 2 e anel de pressão 7 para reter o dispositivo centrípeto fluídico 1 inserido entre os mesmos. A parte do corpo do conjunto de rotor do anel de pressão superior foi removida na FIG. 1B.
[0212] O dispositivo centrípeto fluídico 1 é composto por pelo menos duas camadas de componentes. Como mostrado nas FIGS. 1C e 1 D, a camada fluídica tem características sobre a face inferior e/ou face superior do dispositivo centrípeto fluídico 1. A camada fluídica 3 é composta do receptáculo de entrada 5, câmaras 6a, 6b, 6c, canais e válvulas fluídicas. Deve-se entender que a camada fluídica 3 pode ser feita por meio de diversas camadas ligadas juntas. A camada inferior fina 4 está ligada à camada fluídica 3. A superfície inferior da camada fluídica 3, quando combinada à camada inferior fina 4, forma uma rede fluídica de reservatórios fechados, canais e válvulas através da qual o fluido flui mediante a força centrípeta.
[0213] A camada fluídica 3 e camada inferior fina 4 podem ser feitas de material termoplástico. O material termoplástico pode ser, pelo menos, um dos copolímeros cíclicos de olefina (COC), policarbonato (PC), poliestireno (PS), polioximetileno (POM), perfluoralcoxi (PFA), cloreto de polivinila (PVC), polipropileno (PP), polimetil- metacrilato (PMMA), copolímero de olefina cíclico (COC), poliamida (PA), polisulfona (PSU), polivinilideno (PVDF) bem como outros materiais conhecidos pelos versados na técnica. Eles podem ser utilizados com modificações de superfície ou sem modificações de superfície. A modificação da superfície pode ser aplicada a uma ou ambas as faces ou sobre uma região específica de interesse em uma ou ambas as faces.
[0214] Várias técnicas de combinação para montar a camada fluídica do dispositivo centrípeto fluídico 3 com a camada inferior plana 4 estão disponíveis, tais como ligação térmica, ligação de radiofrequência, soldadura por laser, ligação ultrassónica, adesão ou adesão sensível à pressão, e outras técnicas conhecidas pelos versados na técnica.
[0215] E m uma modalidade exemplar, a técnica de combinação permite incorporar o reagente seco ou líquido no interior do dispositivo centrípeto fluídico antes da montagem.
[0216] E m outra modalidade exemplar, a técnica de combinação está a uma temperatura de cerca de 4°C até cerca de 80°C.
[0217] E m uma modalidade exemplar, a rotação do dispositivo centrípeto fluídico é criada pela colocação do dispositivo centrípeto fluídico em um rotor dedicado 2, o qual é girado em torno de um centro de rotação. O rotor 2 tem um centro de rotação e uma borda exterior, neste caso, uma circunferência. O dispositivo centrípeto fluídico 1 se estende radialmente entre o centro de rotação e a borda exterior. O mesmo se estende além da borda exterior no exemplo representado. Um lado interno do dispositivo centrípeto fluídico 1 está localizado na direção do centro de rotação e um lado externo do dispositivo centrípeto fluídico 1 está localizado na direção da borda exterior.
[0218] O dispositivo centrípeto fluídico pode ser uma porção de um disco tendo um diâmetro interno de cerca de 5 mm e um diâmetro externo de cerca de 20 mm a cerca de 50 mm. A porção de um disco pode ser de 1/8 de um disco. Não há limitações para a forma do dispositivo centrípeto fluídico e para o número de dispositivos centrípetos fluídicos que um rotor pode receber.
[0219] Em uma modalidade alternativa, o dispositivo centrípeto fluídico tem uma forma de disco e o rotor está adaptado para receber um único dispositivo centrípeto fluídico.
[0220] Em outra modalidade alternativa, a forma do dispositivo centrípeto fluídico corresponde a uma lâmina de microscópio padrão de 25 mm x 75 mm. O rotor pode ser adaptado para receber entre 2 a 12 lâminas de microscópio.
Camada fluídica
[0221] A FIG. 1C ilustra a estrutura da face superior da camada fluídica 3 incluindo o receptáculo de entrada 5 para receber uma amostra e vários reservatórios 6a, 6b, 6c. A forma de cada reservatório é adaptada aos requisitos e funções implementadas no dispositivo centrípeto fluídico 1.
[0222] A FIG. 1D ilustra uma vista em corte da camada fluídica 3 com a camada inferior fina 4. Em uma modalidade exemplar, o projeto de camada fluídica 3 pode ser adaptado para o processo de moldagem por injeção. Pode ser vantajoso, para algumas aplicações, respeitar uma espessura de parede uniforme. Por exemplo, uma espessura de parede pode ser de cerca de 0,7 a 1,2 mm. Pode ser vantajoso, para algumas aplicações, assegurar um ângulo de inclinação constante. As faces verticais podem ter um ângulo de inclinação de cerca de 0,5° até 5o.
[0223] Receptáculo de entrada, canais ventilados e tampa de entrada de amostra do dispositivo centrípeto fluídico
[0224] As FIGS. 2A e 2B ilustram uma modalidade exemplar de um receptáculo de entrada. O receptáculo de entrada 5 é fluidamente conectado a uma câmara 901. A saída ventilada 816 é conectada ao canal de saída e câmara ventilada 905.
[0225] Em uma modalidade, a câmara ventilada 905 é conectada ao receptáculo de entrada 5, com a conexão de ventilação de entrada 906 na face superior do dispositivo centrípeto fluídico próximo da porção interior do receptáculo de entrada 5.
[0226] Em uma modalidade exemplar, uma cobertura 907 inclui a peça de base 908 em contato direto com o receptáculo de entrada 5, um braço de conexão flexível 909, e uma tampa 910 ligada à peça de base 908 através do braço de conexão 909. A cobertura 907 pode ser colocada em uma configuração fechada com a tampa 910 presa sobre a peça de base 908 ou pode ser colocada em uma configuração aberta, como mostrado na FIG. 2B. Neste aspecto particular, a peça de base 908 é projetada para permitir a comunicação entre a câmara ventilada 905 e câmara 901 via conexão de ventilação de entrada 906 até quando a cobertura 907 está na configuração fechada.
[0227] Em uma modalidade alternativa (não ilustrada), a câmara ventilada 905 é desconectada da câmara 901 (conexão de ventilação de entrada 906 está ausente). A ventilação de ar é fornecida por um orifício fornecido na peça de base 908 da cobertura 907 que permite a comunicação de ar entre a câmara 901 e a câmara ventilada 905 através da cavidade livre formada entre a peça de base 908 e a tampa 910 quando a cobertura 907 está na configuração fechada.
Câmara preenchível de fundo
[0228] As FIGS. 3A e 3B ilustram a câmara preenchível de fundo da rede fluídica. Neste exemplo, o receptáculo de entrada 5 está conectado fluidicamente à câmara preenchível de fundo 315 com o canal de entrada 302. A conexão entre o receptáculo de entrada e o canal de entrada pode ser, opcionalmente, feita através de uma conexão de porta 303 ou a saída do receptáculo de entrada pode ser diretamente conectada ao canal de entrada.
[0229] Em uma modalidade, o material de cromatografia de fase sólida específico (tal como material de troca iônica) pode ser colocado dentro do receptáculo 5. Durante a centrifugação, para encher a câmara preenchível de fundo, o material de cromatografia de fase sólida vai encher o canal 302 permitindo a formação de uma coluna de exclusão capaz de adsorver um inibidor de amplificação de ácido nucleic a partir da amostra em bruto.
[0230] A entrada inferior 304 da câmara preenchível de fundo 315 está localizada no lado externo da câmara preenchível de fundo 315. Uma vez que o fluxo da amostra será a partir do receptáculo de entrada 5 para o lado externo da câmara preenchível de fundo, o lado externo da câmara preenchível de fundo é referido como a parte inferior da câmara preenchível de fundo. Um canal de ventilação 305a é conectado à saída de câmara 306 no lado interno da câmara preenchível de fundo.
[0231] A dimensão da câmara está compreendida entre vários centímetros de largura, com vários centímetros de altura e vários milímetros de profundidade. Em uma modalidade exemplar, a dimensão da câmara 315 está compreendida entre 1 cm de largura, 2 cm de altura e 2 mm de profundidade. Em uma outra modalidade exemplar, as dimensões são 0,5 cm de largura, 1,5 cm de altura e 1,3 mm de profundidade.
Reagentes e membros translocáveis
[0232] Referindo-se agora às FIGS. 4A e 4B, a câmara preenchível de fundo pode opcionalmente conter um objeto de membro translocável 307. O membro translocável pode ser ferromagnético e pode mover-se na câmara em resposta a um campo magnético flutuante. Em uma modalidade exemplar, o campo magnético de flutuação é gerado pela rotação do dispositivo centrípeto fluídico acima fixo a ímãs colocados alternativamente em uma posição radial correspondente ao interior e das bordas exteriores da câmara preenchível de fundo. Em outra modalidade, o campo magnético de flutuação é gerado pela rotação de ímãs acima de um dispositivo centrípeto fluídica fixo.
[0233] Em uma modalidade exemplar, ímãs fixos são ímãs permanentes feitos de material magnético de terras raras. Em outra modalidade eles são eletroímãs.
[0234] A câmara pode também conter, opcionalmente, material sólido 308 que não responde a um campo magnético. O material sólido pode ser utilizado para fornecer uma reação química ou bioquímica e pode incluir o sal, tampão ou enzima. O material sólido pode ser usado para purificar a amostra por adsorção de inibidores enzimáticos e pode incluir uma matriz de cromatografia, um suporte sólido para a afinidade de ligação, uma extração de fase sólida, um material quelante, resinas aniônicas e catiônicas e diferentes tipos de zeólitos. 0 material sólido pode ser utilizado para a ruptura de células e pode incluir matriz dura. O material sólido pode ser utilizado para controle do processo e pode incluir células ou esporos bacterianos. O material sólido pode ser utilizado para concentrar o lisado utilizando matriz higrométrica para absorção de líquidos. O material sólido pode ser funcionalizado com ligantes, tais como anticorpos específicos e pode ser usado para capturar alvos dentro da câmara preenchível de fundo. O material sólido pode ser um filtro capaz de interromper ou aprisionar micróbios alvos dentro da câmara preenchível de fundo. O material sólido pode ser funcionalizado com porções de troca iônica capazes de adsorver os micróbios alvos na sua superfície, imobilizando-os para dentro da câmara preenchível de fundo. Estes materiais sólidos diferentes podem ser usados sozinhos ou em combinação.
[0235] Quando os materiais sólidos são de matriz dura para a parede da célula e ruptura da membrana, o material pode ser feito de sílica ou de esferas de zircônio com diâmetros de cerca de 50 pm a cerca de 200 pm. As esferas podem ser opcionalmente revestidas com agente quelante para a absorção dos inibidores enzimáticos.
[0236] Em uma modalidade exemplar, o objeto translocável é um disco metálico e o material sólido é composto por esferas duras misturadas com esporos e resinas aniônicas e catiônicas.
Transbordamento
[0237] A FIG. 5 ilustra outra interconexão fluídica da câmara preenchível de fundo que inclui uma câmara de transbordamento 309 conectada fluidicamente à saída de transbordamento 310 da preenchível de fundo pelo canal de transbordamento 311. O canal de transbordamento é colocado próximo da parte interior da câmara sobre um dos lados longitudinais da câmara. A câmara de transbordamento está localizada em direção a borda exterior do dispositivo centrípeto fluídico com respeito à saída de transbordamento 310 e a câmara de transbordamento é ventilada através do canal de ventilação 305b. Esta configuração permite fazer a definição de volume na câmara preenchível de fundo enquanto ventilando simultaneamente a câmara preenchível de fundo e a câmara de transbordamento 309. O volume da câmara de transbordamento está compreendido entre 100 pl e vários mililitros. Em uma modalidade exemplar, o volume da câmara de transbordamento está compreendido entre 150 a 200 pl.
Medição
[0238] A FIG. 6 ilustra uma descarga de saída 312 opcional para a câmara preenchível de fundo para conectar fluidamente a câmara preenchível de fundo a uma câmara posterior 313 com o canal de transferência 314. A descarga de saída está localizada em um dos lados longitudinais da câmara preenchível de fundo. A descarga de saída pode ser uma válvula de ruptura tendo dimensão micrométrica. A dimensão da válvula micrométrica pode ser de 1 a 100 pm de profundidade, 10 pm a 1 mm de largura e alguns microns até alguns milímetros de comprimento. Em uma modalidade exemplar, a dimensão da válvula micrométrica está compreendida entre 30 e 75 pm de profundidade, de 70 a 120 pm de largura e 0,5 a 1,5 mm de comprimento. A descarga de saída pode ser colocada a qualquer distância entre as bordas interiores e exteriores da câmara preenchível de fundo, enquanto a descarga de saída é colocada em uma posição externa em relação à saída de transbordamento. A distância entre a descarga de saída e a saída de transbordamento vai definir o volume a ser medido e enviado para a câmara seguinte.
[0239] O volume de fluido medido pela descarga de saída pode estar compreendido entre 10 a e 50 pl. Em uma modalidade exemplar, o volume definido é de 20 pl.
[0240] A FIG. 7A ilustra uma câmara preenchível de fundo tendo algumas das configurações opcionais descritas acima. O receptáculo de entrada 5 é fluidamente conectado ao canal de entrada 302, a câmara preenchível de fundo 315 e a entrada inferior 304. Uma câmara de transbordamento 309 está conectada fluidicamente à câmara preenchível de fundo através da saída de transbordamento 310 e do canal de transbordamento 311. A descarga de saída 312 permite a transferência de líquidos localizados entre a saída de transbordamento e a descarga de saída de uma câmara posterior 313 através do canal de saída 312. A câmara contém o membro translocável 307 e material sólido 308.
[0241] A FIG. 7B ilustra uma câmara preenchível de fundo com uma rolha alvo 316. A rolha é colocada de modo a forçar a amostra através dela. Água e pequena molécula passarão, mas o alvo será mantido. Dado que a maioria do líquido carregado para dentro do receptáculo de entrada 5 vai fluir através do transbordamento 309 por meio da rolha alvo 316, o alvo será concentrado na pequena porcentagem de líquido presente na câmara preenchível de fundo.
[0242] A FIG. 7C mostra a liberação das bactérias aprisionadas após a rolha de patógeno ser dissociada pelo movimento translocável do membro translocável 307. O alvo pode ser, pelo menos, um de células, bactérias, fungos, vírus, etc. Em uma modalidade, a rolha alvo 316 é um filtro de exclusão de tamanho. Em outra modalidade, a rolha alvo 316 é uma resina de troca iônica. Em outra modalidade, a rolha de patógeno 316 inclui esferas funcionalizadas com anticorpos específicos.
[0243] A FIG. 8 ilustra a progressão fluídica na câmara preenchível de fundo descrita na FIG. 7. As FIGS. 8A a FIG. 8F descrevem o movimento fluido sequencial na câmara preenchível de fundo. O enchimento da câmara ocorre na FIG. 8A, o transbordamento de líquido para a câmara de transbordamento ocorre na FIG. 8B e FIG. 8C, a homogeneização da amostra e lise acionadas pelo movimento translocável ocorre na FIG. 8D, a clarificação por sedimentação de materiais insolúveis ocorre na FIG. 8E e a transferência dos líquidos medidos para a próxima câmara ocorre na FIG. 8F.
[0244] Referindo-se agora às FIG. 9A e FIG. 9B, a geometria da entrada inferior 304 e a saída de transbordamento opcional 310 e a descarga de saída opcionais 312 estão adaptadas para ajudar a impedir que o objeto translocável e/ou esferas saiam da câmara preenchível de fundo. Em uma modalidade, a menor dimensão do objeto translocável e as esferas contidas no material sólido deverá ser maior do que a largura 317a ou profundidade 318a e maior do que a largura 317b ou profundidade 318b.
Câmara de Retenção
[0245] Uma modalidade exemplar de uma estrutura fluídica para reter e/ou diluir uma amostra está ilustrada nas FIGS. 10A a 10D. Nesta modalidade, um canal de entrada de fluido 401 está fluidamente conectado com a entrada 402, localizada no lado interno da câmara 403. A saída de ventilação 404 está localizada no lado interno da câmara, para permitir o deslocamento de ar na câmara. O reservatório tem um volume de cerca de 1 pl a cerca de 2 ml. A saída 405 do reservatório está localizada no lado externo da câmara, e é geralmente uma válvula de ruptura.
[0246] No exemplo de modalidade da FIG. 10A, a câmara de retenção tem um receptáculo 406 opcional localizado no lado externo da câmara. O recipiente é geralmente adaptado para conter líquido 407 proveniente do canal de entrada, para ajudar a impedir que o líquido esteja em contato com a saída de câmara 405 a partir da entrada inicial na câmara de retenção, como mostrado na FIG. 10B.
[0247] Opcionalmente, o receptáculo pode conter reagentes secos 408 como mostrado na FIG. 10C. Os reagentes secos 408 podem ser, mas não estão restritos a, enzimas, tampão e/ou produtos químicos.
[0248] Na modalidade exemplar ilustrada na FIG. 10D, a câmara de retenção pode incluir, opcionalmente, um recipiente de líquido 409 colocado dentro da câmara de retenção e contendo um diluente 410. O diluente pode ser, mas não está limitado a, água, tampão ou uma parte de tampão que não pode ser seca. O recipiente de líquido 409 é geralmente, mas não necessariamente, feito de um material tolerante ao calor e/ou um material de mudança de fase sensível. O material tolerante ao calor pode ter um ponto de fusão acima de 100°C e pode ser um de vidro, polímero termoplástico, bem como outros materiais conhecidos pelos versados na técnica. O material de mudança de fase pode se fundir e solidificar a uma determinada temperatura. A fase sólida pode ser inferior a cerca de 45°C e a temperatura de fase de fusão pode ser entre cerca de 45°C e 85°C. O material de mudança de fase pode ser de cera, cera de parafina, cera microcristalina, cera sintética, cera natural, cola ou outros materiais de vedação conhecidos dos versados na técnica.
[0249] As estruturas acima descritas podem ser usadas como um novo tipo de válvula que chamamos de Válvula de Dissociação de Fluxo. A Válvula de Dissociação de Fluxo contém dois elementos, um receptáculo de dissociação de fluxo para interromper a conexão fluídica entre a entrada e a saída de uma câmara de retenção, e um recipiente de líquido que inclui um diluente que pode ser liberado por aplicação de uma força externa. A liberação do diluente restaura a conexão fluídica dentro do circuito.
[0250] Em uma modalidade exemplar, uma extremidade do material de mudança de fase 411 do recipiente 410 libera o líquido quando a câmara de retenção é aquecida acima de uma certa temperatura. O recipiente de líquido pode ajudar a impedir a evaporação do líquido incluído por um período de cerca de 1 a 3 anos, e tem uma capacidade de um microlitro a dois mililitros.
[0251] A FIG. 11 ilustra a progressão fluídica do movimento do fluido sequencial na modalidade da câmara de retenção. Mostrado na FIG. 11A está o líquido 407 proveniente da entrada, a qual está no receptáculo, na FIG. 11B, a câmara de retenção é aquecida 416 e a extremidade do material de mudança de fase está fundindo 411a, 411b, na FIG. 11C, o diluente 410 é liberado, na FIG. 11 D, o líquido 407 proveniente da entrada é misturado com o diluente 410, e na FIG. 11E, o diluído 415 é evacuado pela válvula de saída de ruptura 405.
[0252] Uma modalidade exemplar alternativa é ilustrada na FIG. 12 para diluir um fluido em uma câmara de retenção. Um diluente da câmara 412 pode estar localizado acima ou sobre o lado interno da câmara de retenção 403. O líquido é liberado na câmara de retenção ativando uma válvula de material de mudança de fase 413 colocada na saída de diluente 414. Nesta modalidade exemplar, a válvula de material de mudança de fase é uma válvula de cera ativada pelo calor acima de cerca de 50°C. Em outra modalidade, o calor é gerado por uma onda eletromagnética tal como radiação infravermelha, laser, micro-ondas e quaisquer outros materiais conhecidos dos versados na técnica. Em uma modalidade alternativa (não ilustrada), o líquido a partir do recipiente de líquido pode ser introduzido mecanicamente. Por exemplo, um mecanismo de perfuração pode ser ativado por um êmbolo. Em uma outra modalidade alternativa (não ilustrada), o líquido a partir do recipiente de diluente pode ser liberado por um atuador eletromagnético.
[0253] Uma modalidade exemplar de um sistema de medição de fluido conectada à câmara de retenção é mostrada na FIG. 13. Neste exemplo, a saída de amostra 303 está conectada fluidicamente à câmara preenchível de fundo 315, através da entrada inferior 304. Uma câmara de transbordamento 309 é conectada à câmara preenchível de fundo 315 com a saída de transbordamento 310 e canal de transbordamento 311. A saída de medição 312 permite transferir o líquido contido, entre a saída de transbordamento 310 e a saída de medição 312 da câmara 315, para o receptáculo da câmara de retenção 406 através do canal de medição 314 e entrada de câmara de retenção 402.
[0254] Após o aquecimento, o diluente 410 contido no recipiente de diluição 409 é liberado na câmara de retenção 403. O líquido liberado 410 se mistura com o volume medido contido no receptáculo da câmara de retenção 406. Uma vez que o diluente e o volume medido são misturados em conjunto, o volume total é suficientemente grande para levar a diluição em contato com a saída 405 atuando como uma válvula de ruptura. Assim, a liberação do líquido de recipiente 409 leva um líquido para o lugar certo, na hora certa e também reativa o circuito fluídico. Com efeito, antes do recipiente de líquido ser aquecido, o líquido proveniente da câmara 315 é retido no receptáculo 406. Nesta modalidade particular, o receptáculo da câmara de retenção permite uma elevada taxa de ruptura RPM para a válvula de ruptura de saída de medição 312 e ajuda a impedir que o líquido sai da câmara de retenção, controlando a localização do fluido para ajudar a impedir o contato com a válvula de saída da câmara de retenção 405. O mecanismo desta nova Válvula de Dissociação de Fluxo se dissocia da válvula de ruptura de saída de medição 312 da válvula de saída passiva 405, permitindo um robusto controle fluídico sem a necessidade de válvulas ativa complexa.
[0255] Em outra modalidade exemplar, o material de mudança de fase 411 do recipiente de líquido 409 tem uma densidade superior à do líquido medido 407 retido no receptáculo 406 e o diluente 410. Quando aquecido, o líquido 410 contido no recipiente de líquido 409 é liberado para dentro da câmara 403. O material de mudança de fase 411 irá mover-se abaixo da mistura de diluente 410 e de fluido 407 e deslocar este último de modo que pode estar em contato com a saída 405 que pode atuar como uma válvula de ruptura. Nesta modalidade particular, a câmara de retenção pode ser esvaziada, uma vez que o líquido de maior densidade é liberado.
[0256] Em algumas modalidades, os reagentes secos 408 podem ser armazenados na câmara de retenção 403.
Cubeta, câmara de detecção e câmara de distribuição
[0257] A FIG. 14 ilustra uma modalidade de um arranjo de cubetas de detecção fluídica. No exemplo de modalidade da FIG. 14A, uma amostra do reservatório 601 está conectada fluidicamente a um ou mais cubetas de detecção 602a, 602b e 602c por meio do canal de entrada 603, do canal de distribuição 604 e entradas de cubetas. No exemplo mostrado, o número de cubetas é três. A extremidade do canal de distribuição 604 está conectada fluidicamente à câmara de resíduo 605 e uma saída de ventilação 606 está localizada próxima da extremidade de distribuição do canal 604.
[0258] Em uma modalidade exemplar da FIG. 14B, os reagentes secos 607a, 607b e 607c foram armazenados em cubetas respectivas 602a, 602b, 602c. Os reagentes secos podem ser conjuntos de iniciadores, misturas de enzimas, sondas de fluorescência e sais para executar a detecção e/ou processo de amplificação enzimática. O fluido transferido em cubetas vai voltar a suspender os reagentes secos.
[0259] Em outra modalidade mostrada na FIG. 14C, um material de mudança de fase sensível ao calor 608 pode ser colocado diretamente no interior de cada cubeta, por exemplo, na parte superior de reagentes secos 607. O material de mudança de fase sensível ao calor 608 pode ter uma gravidade específica mais baixa do que a gravidade específica do fluido de entrada. Por exemplo, o ponto de fusão do material 608 é superior a 50°C e tem uma gravidade específica inferior a um. Em uma modalidade exemplar, o material de mudança de fase é a cera. Nesta modalidade, o volume da cubeta menos o volume do material de mudança de fase define o volume da reação de amplificação que é, geralmente, entre 5 e 100 pl. Após aquecimento, o material de mudança de fase vai fundir e mediante a força centrípeta vai passar para a entrada de cubeta 610. Nesta modalidade, uma entrada de cubeta bem projetada, quando cheia com o material de mudança de fase vai ajudar a impedir a evaporação e a contaminação cruzada entre cada cubeta.
[0260] Em outra modalidade ilustrada na FIG. 14D, a câmara de resíduo pode conter um material de mudança de fase sensível ao calor 612 com uma gravidade específica menor do que a gravidade específica da amostra. Por exemplo, o ponto de fusão do material é superior a 50°C e possui uma gravidade específica inferior a 1. Em uma modalidade exemplar, o material de mudança de fase é a cera. Tal como ilustrado na FIG. 15, quando a câmara de resíduo 605, o canal de distribuição 604 e as cubetas 602 são aquecidas 611, e, quando um excesso de fluido 609 entra na câmara de resíduo 605, a cera fundida 612b se move dentro do canal de distribuição 604 no topo das entradas de cubetas.
[0261] Em uma outra modalidade, um material de mudança de fase 612 é colocado no resíduo. O líquido proveniente da câmara de retenção é trazido para o canal de distribuição com uma temperatura inferior ao ponto de fusão do material de mudança de fase presente nos resíduos.
[0262] Em uma modalidade, um material de mudança de fase é colocado em ambas as cubetas e nos resíduos. Nesta modalidade particular, o ponto de fusão do material de mudança de fase 612 colocado no resíduo é igual ou inferior ao ponto de fusão do material de mudança de fase 608 colocado em cubetas.
[0263] A FIG. 16 mostra outra modalidade exemplar, na qual uma câmara de retenção 403, tal como descrita acima é conectada fluidicamente ao canal de distribuição 604. Em uma modalidade, a saída de ventilação 606 do canal de distribuição e a saída de ventilação 404 da câmara de retenção podem, opcionalmente, ser fundidas em um único canal de ventilação 704, próximo da saída de ventilação 404 da câmara de retenção 403.
[0264] A FIG. 17 mostra outra modalidade exemplar em que uma porta de amostra 303 está conectada fluidamente à câmara preenchível de fundo 315, na qual a câmara inclui um membro translocável 307 e esferas duras 308. A câmara preenchível de fundo é conectada a uma câmara de transbordamento 309 e uma saída de medição de válvula de ruptura 312 está fluidamente conectada a uma entrada de câmara de retenção 402. A câmara de retenção 403 inclui um receptáculo 406 e um recipiente de líquido 409, como descrito acima, para permitir a diluição do fluido. O fluido diluído atinge a saída 405 e é transferido para as cubetas 602, através da saída da válvula de ruptura 405 da câmara de retenção 403 e os resíduos 605 contêm cera 612. Nesta modalidade exemplar, os reagentes secos 607 e cera (não ilustrado) são armazenados em cubetas. As saídas ventiladas 606, 404 e 815 das cubetas, a câmara de retenção e a câmara preenchível de fundo são fundidas em conjunto para permitir a ventilação dos circuitos fluídicos completos através de uma porta de ventilação única 816.
Configuração Exemplar do Instrumento
[0265] A FIG. 18 ilustra um instrumento exemplar 1000 para processar um dispositivo centrípeto fluídico, tal como apresentado acima. O aparelho 1000 é, nesta modalidade exemplar, de 30 cm de largura x 30 cm de profundidade x 20 cm de altura. Ele inclui uma base 1001, uma tampa de dobradiça 1002 e um conjunto de rotor 1003 colocado no interior do recinto de centrifugação 1004. O conjunto de rotor 1003 colocado no interior do recinto de centrifugação 1004 gira em um plano paralelo à base do instrumento.
[0266] A FIG. 19 mostra o instrumento de 1000, em mais detalhe, em especial os componentes localizados dentro da base 1001. O movimento rotacional do conjunto de rotor 1003 é produzido pelo motor 1005, localizado abaixo do recinto de centrifugação 1004. O controlador 1008 fornece um microprocessador, uma memória, eletrônicos e software para controle do instrumento 1000. Neste exemplo, o controlador fornece interface de protocolo de comunicação de hardwire, como Ethernet, serial, digital I/O e analógico I/O. Nesta modalidade exemplar, o LCD de tela de toque 1006 fornece uma interface gráfica de usuário (GUI) usada para operar o software do instrumento embutido no controlador 1008. O LCD se comunica com o controlador utilizando um protocolo de comunicação serial. O controlador se comunica com controladores de motor 1010 e a placa de aquisição de sinal óptico 1011, utilizando ligações seriais. A placa de condicionamento de temperatura 1012 é conectada a entradas analógicas e placas de controle de fontes de excitação 1013 é conectada à saída digital do controlador 1008.
[0267] Este instrumento exemplar 1000 fornece múltiplos controles de zona de temperatura para controlar a temperatura nas regiões de interesse predeterminadas de um dispositivo centrípeto fluídico. Nesta modalidade exemplar, o recinto de centrifugação 1004, conjunto de rotor 1003 e tampa 1001 são projetados para assegurar um controle de temperatura do ar de zona dupla.
[0268] O módulo de excitação 1007 fornece pelo menos um comprimento de onda de excitação. O caminho do feixe de excitação vai para cima para excitar as espécies fluorescentes dentro das cubetas de dispositivos centrípetos fluídicos a partir da face inferior.
[0269] O módulo de detecção 1009 está localizado na parte de trás do recinto de centrifugação. O módulo de detecção 1009 aloja os elementos ópticos que recolhem a luz emitida por espécies fluorescentes no dispositivo centrípeto fluídico em, pelo menos, um comprimento de onda. Nesta modalidade exemplar, o detector é um PMT.
Visão Geral das Funções do Instrumento
[0270] O instrumento inclui módulos integrados: motor 1005, recinto de centrifugação 1004, controlador de temperatura de zona múltipla 2000, ópticos 1014, controlador 1008 e uma interface de máquina-humana 1006. Deve-se entender que o arranjo dos vários componentes ou módulos mostrados na FIG. 20 é exemplificativo e não se destina a ser limitativo.
Recinto de centrifugação
[0271] O conjunto de rotor 1003 é colocado no interior de um recinto de centrifugação 1004 que gira para controlar o movimento de fluido para dentro do dispositivo centrípeto fluídico 1. O movimento rotacional do conjunto de rotor é produzido pelo motor 1005. O conjunto de rotor pode ser fixado de forma permanente no interior do recinto centrífugo ou pode ser removido do recinto centrífugo para permitir a colocação do(s) dispositivo(s) centrípeto(s) fluídico(s) em que o rotor antes de colocar o interior do invólucro do rotor centrífugo. O conjunto de rotor pode girar em um plano paralelo à base do instrumento ou, alternativamente, em um plano perpendicular à base do instrumento. As velocidades de revolução do conjunto rotor pode variar entre 0 e 10000 RPM no sentido horário e/ou anti-horário com uma taxa de aceleração entre 0 e 20000 RPM/s. Por exemplo, a sequência de rotação é realizada automaticamente pelo controlador 1008.
[0272] Um íman permanente (não representado) pode ser colocado no interior do recinto de centrifugação para ativar magneticamente membro translocável 307 localizado na parte inferior da câmara de enchimento de fundo de algumas modalidades de dispositivos centrípetos fluídicos. Um exemplo de ação magnética para um disco fluídico centrífugo foi descrito por Kido et al., em “A novel, compact disk- like centrifugal microfluidics system for cell lysis and sample homogenization”, Colloids Surfaces B: Biointerfaces, 58 (2007) 44-51.
Controle de temperatura da zona múltipla
[0273] O instrumento 1000 também permite que o controlador de temperatura de zona múltipla 2000 para modular a temperatura de regiões predeterminadas de interesse (ROI), 1300, 1302 de um dispositivo centrípeto fluídico. O aquecimento/resfriamento pode ser alcançado com técnicas resistivas (fio de nicromo, aquecedor de cerâmica), com ou sem ventilador, as técnicas térmicas (Peltier), lâmpada de halogênio de aquecimento, bem como outros sistemas de aquecimento/resfriamento conhecidos dos versados na técnica.
[0274] Fazendo agora referência à FIG. 21, uma vista superior simplificada de um dispositivo centrípeto fluídico ilustra esquematicamente duas áreas de ROI 1300, 1302. Nesta modalidade exemplar, as duas áreas de ROI estão não sobrepostas e em forma de anel. O aquecimento/resfriamento de ROI diferente pode ser atingido de forma independente em pontos de tempo específicos.
[0275] Voltando à FIG. 20, os aquecedores 2001 a e 2001 b pode aquecer o ar e o ar quente força a ROI selecionada do dispositivo centrípeto fluídico a ser aquecida e, consequentemente, o fluido a ser aquecido. O recinto de centrifugação 1004 pode compreender uma estrutura de isolamento para confinar o ar aquecido para os respectivos compartimentos do recinto centrífugo para garantir o controle de temperatura de ROI de dispositivo fluídico centrípeto. A temperatura do ar aquecido em cada compartimento pode ser medida por um sensor de temperatura. O sensor de temperatura pode ser de termopares, termistores, detectores de temperatura de resistência (RTD), bem como outros sensores de temperatura conhecidos dos versados na técnica. Um ciclo de realimentação de controle de temperatura pode ser aplicado sobre o controlador 1008 para controlar com precisão a temperatura do ar.
[0276] Em algumas modalidades, um ventilador pode ser utilizado para recircular o ar quente em torno de uma ROI. Em alternativa, ou além disso, um ventilador pode forçar o ar fresco ser aquecido por um aquecedor antes de contatar a ROI de interesse.
[0277] Em algumas modalidades, pelo menos uma ventilação (não representada) permite que o ar quente saia do compartimento do recinto centrífugo. A ventilação pode ser aberta momentâneamente ou permanentemente.
[0278] Em algumas modalidades, ventilador 2002, pode ser utilizado para resfriar uma ROI específica do dispositivo centrípeto fluídico. O ventilador pode ser utilizado para forçar o ar frio (temperatura ambiente) a entrar em um determinado compartimento do recinto centrífugo para resfriar uma ROI específica do dispositivo centrípeto fluídico.
[0279] Em algumas modalidades, pelo menos uma ROI do dispositivo centrípeto fluídico pode ser mantida abaixo de 35°C durante o aquecimento de outra ROI entre 25°C e 99°C.
[0280] Preferencialmente, um algoritmo de circuito de realimentação de temperatura pode ser aplicado sobre o controlador 1008 para fazer uma incubação isotérmica de pelo menos uma das ROI do dispositivo centrípeto fluídico. Alternativamente ou em adição, os algoritmos de circuito de realimentação de temperatura podem ser implementados para realizar o ciclo térmico em pelo menos uma ROI do dispositivo centrípeto fluídico.
[0281] Em uma modalidade, a incubação isotérmica de uma ROI pode ser usada para controlar a inibição da amplificação do ácido nucléico, mais especificamente, para controlar a inibição da amplificação por PCR. Alternativamente ou em adição, a incubação isotérmica pode ser usada para aquecer o material de mudança de fase. Em uma modalidade mais específica, a ROI de interesse dentro do dispositivo centrípeto fluídico inclui, pelo menos, a câmara de retenção da modalidade do dispositivo centrípeto fluídico descrito acima.
[0282] Em uma modalidade, a incubação isotérmica de pelo menos uma ROI de um dispositivo centrípeto fluídico pode ser usada para realizar uma amplificação de ácidos nucleicos isotérmica. Em uma modalidade mais específica, a ROI compreende as cubetas de uma modalidade do dispositivo centrípeto fluídico descrito acima.
[0283] Em uma outra modalidade, o ciclo térmico de pelo menos uma ROI de um dispositivo centrípeto fluídico pode ser utilizado para a amplificação por PCR executada. Em uma modalidade mais específica, a ROI compreende as cubetas de uma modalidade do dispositivo centrípeto fluídico descrito acima.
[0284] Fazendo agora referência à FIG. 22, a temperatura do fluido pode ser controlada em ROI mais específica 2201, 2202a, 2202b, 2202c de um dispositivo centrípeto fluídico. Pode ser adequado impedir o aquecimento de áreas desnecessárias do dispositivo centrípeto fluídico para minimizar a massa térmica e aumentar a taxa de aquecimento/resfriamento. A temperatura em cada ROI específica pode ser controlada pela colocação de elementos de aquecimento/resfriamento e sensores de temperatura em contato com a face inferior e/ou a face superior do dispositivo centrípeto fluídico no rotor. A energia pode ser transmitida aos elementos de aquecimento por meio de anéis deslizantes (não mostrado) colocado entre o motor e o conjunto de rotor. Dados do sensor de temperatura também podem ser transmitidos através do conjunto de anel deslizante e/ou sem fio.
[0285] Em outra modalidade alternativa, um subcontrolador pode ser integrado no conjunto de rotor rotativo para implementar o ciclo de realimentação de controle de temperatura de um ou mais elementos de aquecimento diretamente para o rotor. A energia elétrica pode ser fornecida para a placa eletrônica de rotação por uma das baterias colocadas na placa eletrônica rotativa, transferência de energia de indução entre a peça não rotativa e a placa de eletrônico colocada no rotor ou com uma interface de anel deslizante entre o motor e o rotor. A interface de comunicação entre este subcontrolador e o controlador 1008 pode ser implementada através de comunicação serial por meio de um anel deslizante, comunicação de RF ou qualquer outro modo de transmissão sem fio. Em algumas modalidades, a temperatura pode ser medida em diferentes ROIs em um dispositivo centrípeto fluídico. O condicionamento do elemento de detecção e a conversão de analógico para digital podem ser aplicados diretamente sobre o controlador de rotação, evitando, assim, a transmissão do sinal analógico do sensor através de um anel deslizante e diminuindo o ruído. Esta modalidade é adequada para calibrar a reação de amplificação enzimática, tal como a amplificação por PCR. Em uma modalidade alternativa, o controlador de rotação pode ser utilizado para medir o sinal elétrico do eletrodo revestido sobre uma das camadas do dispositivo centrípeto fluídico. O eletrodo pode ser utilizado para detectar a presença de líquido em várias ROIs do dispositivo centrípeto fluídico.
[0286] A FIG. 23 ilustra o controle de temperatura do ar de zona dupla. Neste exemplo, existem dois compartimentos: compartimento #1 1301 para aquecer a câmara de retenção 403 e o compartimento #2 1303 para aquecer e resfriar a área de cubetas 602 do dispositivo centrípeto fluídico 1. O confinamento de ar em cada área é alcançado através de uma combinação de compartimentos delimitados pelo recinto de centrifugação 1004, parede de separação do recinto de centrifugação 1304, parte inferior do rotor 2, parede de isolamento do rotor 1305, anel de pressão 7, isolamento da tampa 1307 e a parede de isolamento tampa 1308. Os materiais de isolamento podem ser usados para controlar a transferência de calor entre os componentes adjacentes e/ou combinados e também para impedir o fluxo de calor não controlado fora do recinto de centrifugação 1004. Para gerar calor no interior de cada compartimento, um elemento térmico 1309a é colocado sob o dispositivo centrípeto fluídico no compartimento #2 1303, e um elemento de aquecimento 1309b é colocado acima do dispositivo centrípeto fluídico no compartimento #1 1301. Termopares 1310a e 1310b são colocados dentro de cada compartimento para medir a temperatura individual do compartimento. No instrumento 1000, os elementos de aquecimento em ambos os compartimentos são bobinas de aquecimento resistivo. Para controlar a taxa de resfriamento do compartimento #2 1303, o soprador 3111 força o ar à temperatura ambiente a entrar no compartimento #2 1303. Quando o soprador 3111 está soprando ar para dentro, a porta de saída 3112 é aberta para ejetar o ar quente do lado de fora do compartimento #2 1303. Um algoritmo de circuito de realimentação de temperatura é implementado no controlador electrónico 1008 para controlar com precisão a temperatura em cada compartimento. Esta configuração permite que uma taxa de aquecimento de ar para ambos os compartimentos seja, por exemplo, entre 1 a 20°C/s. A taxa de resfriamento de ar do compartimento #2 1303 é, por exemplo, entre 0,1 a 20°C/s. Algoritmos de circuito de alimentação de controle pode ser implementado para realizar a incubação isotérmica de cada região de interesse do dispositivo centrípeto fluídico e programas de ciclos térmicos, como a amplificação por PCR para o compartimento #2 1303.
Óptica
[0287] Voltando à FIG. 20, a óptica 1014 do instrumento exemplar 1000 inclui dois módulos: o módulo de excitação 1007 e o módulo de detecção 1009. Estes dois módulos são opticamente configurados para interrogar um líquido 1608 no dispositivo centrípeto fluídico. É adequado para a medição de espécies fluorescentes nas cubetas do dispositivo centrípeto fluídico 1. Em algumas modalidades, a óptica de fluorescência pode ser utilizada para realizar a detecção isotérmica em tempo real ou de PCR em tempo real.
[0288] Em uma outra modalidade, a óptica 1014 apenas inclui um módulo de detecção para interrogar o líquido no dispositivo centrípeto fluídico.
[0289] O módulo de excitação 1007 inclui fonte(s) de luz e os elementos mecânicos e ópticos para ambas as formas espectrais e espaciais de um feixe de excitação. Várias fontes de luz podem ser alojadas em um módulo de excitação e as suas saídas podem ser acopladas a um único caminho do feixe. Alternativamente, um atuador pode permitir a comutação entre as fontes de luz para excitar as espécies fluorescentes em diferentes comprimentos de onda. Em uma modalidade, a seleção de comprimento de onda e de ajuste de energia saída é realizada automaticamente pelo controlador 1008 do instrumento.
[0290] Em uma modalidade, as fontes de luz são de diodo emissor de luz (LED). Em outra modalidade, lâmpadas de laser, de halogênio ou mercúrio podem ser utilizadas.
[0291] Em algumas modalidades, o módulo de excitação 1007 contém 1 a 6 LEDs para excitar as espécies fluorescentes em 1 a 6 diferentes comprimentos de onda. Cada LED pode ser espectralmente filtrado por um filtro interferencial de banda de passagem único, antes de serem acoplados a um único caminho do feixe. Alternativamente, um filtro interferencial de banda de passagem múltiplo pode ser utilizado para os LEDs de filtro depois de serem acoplados a um único caminho do feixe.
[0292] O módulo de detecção 1009 compreende elementos ópticos para coletar a luz emitida por espécies de interesse dentro do dispositivo centrípeto fluídico. Os elementos ópticos podem ser lente, para moldar a luz espacialmente recolhida, um filtro interferencial fotodetector para selecionar uma banda de comprimento de onda correspondente ao espectro de emissão da espécie fluorescente. Em uma modalidade, o detector é um PMT. em uma outra modalidade, os detectores podem serfotodiodos.
[0293] Em algumas modalidades, o módulo de detecção pode detectar 1 a 6 diferentes comprimentos de onda para um único detector. Cada comprimento de onda pode ser filtrado por um filtro interferencial de banda de passagem único e um atuador pode permitir a comutação entre o filtro para detectar sequencialmente as espécies fluorescentes. Alternativamente, um filtro interferencial de banda de passagem múltiplo pode ser utilizado para impedir a necessidade de um atuador mudar entre os comprimentos de onda. Neste caso, todos os comprimentos de onda serão detectados simultaneamente pelo detector. Pode ser necessário excitar as espécies fluorescentes sequencialmente com o módulo de excitação para distinguir cada espécie. Por exemplo, esta tarefa é realizada automaticamente pelo controlador 1008.
[0294] A FIG. 24 ilustra uma vista em corte esquemática que ilustra um módulo de excitação 1007 de acordo com uma modalidade da invenção. Nesta modalidade, o combinador de feixes 1607 é composto por dois LEDs 1601 a e 1601 b, duas lentes de fonte 1602a e 1602b, dois filtros de excitação 1603a e 1603b, um espelho dicróico 1604, uma abertura 1605 e lentes de projeção 1606a e 1606b. Depois de ter sido focalizada através de uma lente 1602a, a luz do LED 1601a é espectralmente filtrada pelo filtro 1603a. Então, a luz passa através do divisor de feixe dicróico 1604 e a focalização de lente 1602a é na abertura 1605. A luz emitida pelo LED 1601b é moldada e a lente usando o filtro 1602b e filtro 1603b também é focalizada sobre a abertura 1605, refletindo sobre o divisor de feixes 1604. A abertura 1605 filtra espacialmente a luz emitida a partir dos dois LEDs 1601a e 1601b. A luz é então projetada para a amostra 1608 no dispositivo centrípeto fluídico 1 através de um par de lentes 1606a e 1606b para excitar as espécies fluorescentes.
[0295] A FIG. 25 ilustra as características espectrais dos LEDs exemplares 1601a e 1601b, filtros 1602a e 1602b e divisor de feixes 1604. As características espectrais do divisor de feixes permitem combinar LED azul e LED âmbar com potência de pico em, respectivamente, 471 nm e 590 nm. Este arranjo espectral é bem adequado para excitar tanto carboxifluoresceína (5-FAM) e/ou Texas Red® utilizado em amplificação por PCR em tempo real.
[0296] Fazendo agora referência à FIG. 26, a vistas em seção lateral esquemáticas ilustram um módulo de detecção exemplas para recolher a luz emitida pelas espécies fluorescentes de interesse em dois comprimentos de onda a partir de amostra 1608 localizada no dispositivo centrípeto fluídico 1. A fluorescência emitida é coletada e colimada pela lente objetiva 1801. Em seguida, depois de ter sido filtrada espectralmente através do filtro interferencial 1802 tendo duas bandas de transmissão correspondente ao espectro de emissão da espécie fluorescente, o caminho de feixe de fluorescência 1807 é moldado separadamente em dois planos por duas lentes cilíndricas 1803 e 1804. O feixe é então filtrada espacialmente pela parada de campo de abertura retangular 1805 e o fotocatodo retangular de PMT 1806.
[0297] A FIG. 27 ilustra a característica espectral do filtro de banda dupla. Esta configuração espectral permite a transmissão centrada a 524 nm e 628 nm. Esta configuração é adequada para a detecção de 5-carboxifluoresceína (5-FAM) e Texas Red® utilizados em amplificação por PCR tempo real. Além disso, este módulo pode ter várias configurações, dependendo das necessidades da aplicação pretendida.
[0298] A FIG. 28 mostra características espectrais mais complexas, com 5 bandas de transmissão: [420-460 nm], [510-531 nm], [589-623 nm], [677-711 nm] e [769-849 nm]. Este filtro de passagem de banda múltipla é bem adaptado para a detecção sequencial dos cinco corantes seguintes: AlexaFluor350, 5-carboxifluoresceína (5- FAM), Texas Red®, Cy5, e Alexa 750.
Método de teste para amplificação por termociclagem
[0299] A FIG. 29 ilustra um exemplo de fluxo de trabalho usando o instrumento 1000 e exemplo de dispositivo centrípeto fluídico da FIG. 17 para realizar a preparação da amostra de material biológico, controlar os inibidores potenciais e detectar com uma PCR em tempo real. Este fluxograma lista exemplos de temperaturas, durações, velocidades e etapas.
[0300] A primeira etapa 1201 consiste em colocar uma amostra biológica no receptáculo de entrada 5. Em seguida, coloca-se o dispositivo centrípeto fluídico no instrumento e pressiona-se o botão start 1202. A partir deste ponto, o instrumento vai cuidar de todo o processo. A rotação irá começar na velocidade #1 1203 para transferir o líquido do receptáculo de entrada 5 para a câmara de lise 315 e evacuar parte da amostra para a câmara de transbordamento 309. A velocidade de rotação vai mudar para a velocidade #2 1204 para ativar o movimento do membro de translocação 307 dentro da câmara de lise de preenchível inferior. ímãs permanentes colocados sob rotor 2 criam um campo magnético flutuante quando os dispositivos centrípetos fluídicos giram sobre ele. Depois de um período predeterminado de tempo, a rotação é alterada de novo para a velocidade# 3 1205 para clarificar o lisado e romper a saída de medição 312.
[0301] O volume medido é transferido para o receptáculo da câmara de retenção 406. Na etapa 1206, a rotação é alterada de novo para a velocidade #4. O compartimento #1 é aquecido de modo que a ROI #1 do dispositivo centrípeto fluídico atinge 95°C durante 3 minutos, por exemplo, para controlar os inibidores potencialmente presentes na amostra biológica. Este aquecimento também vai fundir a tampa de cera do recipiente de líquido 411 para liberar diluente 410 dentro da câmara de retenção 403. Deve-se notar que o compartimento #2 do instrumento e ROI #2 do dispositivo centrípeto fluídico são mantidos a uma temperatura inferior a 35°C, por exemplo, por ativação do ventilador, se necessário.
[0302] No final da etapa 1206, o lisado é geralmente bem misturado com o diluente e está pronto para ser transferido para dentro do canal de distribuição e cubetas 602. A transferência é feita por aquecimento do compartimento #2 a uma temperatura tal que a ROI #2 atinge uma temperatura acima de 50°C, por exemplo, para fundir a cera 608 na câmara de resíduo 605 e alterar a rotação para a velocidade #3, etapa 1207. A saída do reservatório de diluição 405 rompe e o líquido é transferido para as cubetas 602 para voltar a suspender os reagentes secos da PCR pré-armazenados 607. Na etapa 1208, a velocidade de rotação é alterada para a velocidade #4 e a enzima de partida quente contida nos reagentes 607 é ativada por aquecimento do compartimento #2, de modo que a ROI #2 do dispositivo centrípeto fluídico atinge 94°C, por exemplo, por um período entre 3 a 10 minutos, dependendo dos reagentes específicos utilizados.
[0303] Durante este tempo, a zona de aquecimento como #1 se resfria naturalmente até uma temperatura de cerca de 45°C. Continuando na velocidade de rotação #4, o protocolo de ciclagem de PCR em tempo real 1209 é iniciado. A temperatura no compartimento #2 é ciciada de modo que a temperatura na ROI #2 é ciciada entre cerca de 95°C, 56°C e 72°C durante períodos que variaram respectivamente, de 1 a 15 s, de 0 a 15 s e de 1 a 20 s. No fim de cada ciclo de 72°C, a medição da fluorescência é tomada em 1 a 6 diferentes comprimentos de onda de excitação/detecção simultaneamente ou sequencialmente. A ciclagem é feita 35 a 45 vezes. A curva de fluorescência de PCR em tempo real é então analisada e interpretada por um algoritmo baseado em computador. Os resultados são registrados em um banco de dados e, opcionalmente, transmitidos ao operador de teste ou para um médico.
[0304] A FIG. 30A ilustra o perfil de velocidade de rotação, o perfil temperatura térmica de ROI #1 e ROI #2, para a modalidade exemplar descrita em relação com a FIG. 29. A FIG. 30B ilustra o período antes da PCR em tempo real e a FIG. 30C ilustra três ciclos da detecção por PCR em tempo real.
[0305] Em outra modalidade, o instrumento pode alternativamente processar a preparação da amostra e a detecção isotérmica em tempo real. A amplificação isotérmica utilizada pode ser, mas não está limitada a, RMA (amplificação mediada por ribonuclease), HDA (Amplificação Dependente de Helicase), RPA (Amplificação de Recombinase Polimerase) e SPIA (Amplificação Isotérmica de Iniciador Único), LAMP (Amplificação Isotérmica mediada por Circuito), SDA (Amplificação de deslocamento de fita), NASBA (Amplificação Baseada na Sequência de Ácidos Nucleicos), wGA (Amplificação do Genoma Inteiro), pWGA (Amplificação do Genoma Inteiro Baseada em Primase), ICAN (Amplificação Iniciada por Iniciadores Isotérmicos e Quiméricos de Ácidos Nucleicos), EXPAR (Reação de Amplificação Exponencial), NEAR (Reação de Amplificação Enzimática de Entalhe), RCA (Amplificação de Círculo de Rolamento), TMA (Amplificação Mediada por Transcrição).
[0306] Será reconhecido por aqueles versados na técnica que uma pluralidade de dispositivos centrípetos fluídicos pode ser fabricada com as aplicações específicas em mente, o que permite a definição do volume da amostra, homogeneização da amostra, lise da amostra, medição da amostra, diluição da amostra, mistura da amostra e detecção da amostra.
Método de teste para a amplificação isotérmica
[0307] Em uma modalidade alternativa do diagrama de fluxo ilustrado na FIG. 29, as etapas 1207, 1208, 1209 e 1210 são modificadas para realizar a preparação da amostra de material biológico, controlar os inibidores potenciais e detectar com uma amplificação isotérmica em tempo real. Em uma modalidade mais particular, a amplificação isotérmica em tempo real é Amplificação por Recombinase Polimerase em tempo real (RPA em tempo real).
[0308] As etapas são as seguintes: carregar uma amostra biológica para o receptáculo de entrada 5. Em seguida, coloca-se o dispositivo centrípeto fluídico no instrumento e pressiona-se o botão start. A partir deste ponto, o instrumento vai cuidar de todo o processo. A rotação iniciará a uma velocidade #1 para transferir o líquido do receptáculo de entrada 5 para a câmara de lise 315 e evacuar parte da amostra para a câmara de transbordamento 309. A velocidade de rotação será alterada para a velocidade #2 para ativar o movimento do membro de translocação 307 dentro da câmara de lise de preenchível inferior. ímãs permanentes colocados sob o rotor 2 criam um campo magnético flutuante quando os dispositivos centrípetos fluídicos giram sobre ele. Depois de um período predeterminado de tempo, a rotação é alterada de novo para a velocidade #3 para clarificar o lisado e romper a saída de medição 312.
[0309] 0 volume medido é transferido para o receptáculo da câmara de retenção 406. A rotação é alterada novamente para a velocidade #4. O compartimento #1 é aquecido de modo que na ROI #1 do dispositivo centrípeto fluídico a temperatura é de 95°C durante 3 minutos, por exemplo, para controlar os inibidores potencialmente presentes na amostra biológica. Este aquecimento também vai fundir a tampa de cera do recipiente de líquido 411 para liberar o diluente 410 dentro da câmara de retenção 403. Deve-se notar que o compartimento #2 é mantido a uma temperatura inferior de modo que a ROI # 2 é mantida a uma temperatura inferior a 35°C, por exemplo, por ativação do soprador, se necessário.
[0310] O lisado é geralmente bem misturado com o diluente e é resfriado a uma temperatura igual ou inferior a 42°C e pronto para ser transferido para dentro do canal de distribuição e cubetas 602. Nesta modalidade, o diluente é a água e magnésio. A transferência é feita mantendo o compartimento #2, a uma temperatura de modo a que a ROI #2 é mantida a 37-42°C, e alterando a rotação para a velocidade #3. A saída do reservatório de diluição 405 rompe e o líquido é transferido para as cubetas 602 para voltar a suspender os reagentes secos da PCR pré-armazenados 607. Nesta modalidade, o reagente seco 607 compreende sonda fluorescente de RPA, iniciadores, recombinase, polimerase, exonuclease, agente de aglomeração, GP32, uvsY e uvsX. A velocidade de rotação é alterada para a velocidade #4 e o compartimento #2 é aquecido de modo a que a ROI #2 atinge 37-42°C.
[0311] Durante este tempo, a zona de aquecimento #1 se resfria naturalmente até uma temperatura abaixo de 45°C. A medição da fluorescência é tomada em 1 a 6 diferentes comprimentos de onda de excitação/detecção simultaneamente ou sequencialmente a cada poucos minutos. A etapa de amplificação é interrompida após 20 minutos. O sinal de fluorescência de RPA em tempo real é então analisado e interpretado por um algoritmo baseado em computador. Os resultados são registrados em um banco de dados e, opcionalmente, transmitidos ao operador de teste ou para um médico.
[0312] E m outra modalidade, o instrumento pode alternativamente processar a preparação da amostra e detecção isotérmica em tempo real. A amplificação isotérmica utilizada pode ser, mas não está limitada a, RMA (amplificação mediada por ribonuclease), HDA (Amplificação Dependente de Helicase), RPA (Amplificação de Recombinase Polimerase) e SPIA (Amplificação Isotérmica de Iniciador Único), LAMP (Amplificação Isotérmica mediada por Circuito), SDA (Amplificação de Deslocamento de Fita), NASBA (Amplificação Baseada na Sequência de Ácidos Nucleicos), wGA (Amplificação do Genoma Inteiro), pWGA (Amplificação do Genoma Inteiro Baseada em Primase), ICAN (Amplificação Iniciada por Iniciadores Isotérmicos e Quiméricos de Ácidos Nucleicos), EXPAR (Reação de Amplificação Exponencial), NEAR (Reação de Amplificação Enzimática de Entalhe), RCA (Amplificação de Círculo de Rolamento), TMA (Amplificação Mediada por Transcrição).
[0313] Será reconhecido por aqueles versados na técnica que uma pluralidade de dispositivos centrípetos fluídicos pode ser fabricada com as aplicações específicas em mente, o que permite a definição do volume da amostra, homogeneização da amostra, lise da amostra, medição da amostra, diluição da amostra, mistura da amostra e detecção da amostra.
Exemplo 1
[0314] O exemplo seguinte é ilustrativo e não é destinado a ser limitante.
[0315] O presente exemplo refere-se à detecção da presença de estreptococos do Grupo B de um esfregaço vaginal - anal de mulher grávida.
[0316] O dispositivo centrípeto fluídico utilizado para os fins do presente exemplo tem a forma externa descrita na FIG. 1C e é composto dos seguintes elementos fluídicos mostrados e descritos na FIG. 17. Tabela 1. Sumário dos detalhes das estruturas de dispositivo centrípeto fluídico
Figure img0001
Figure img0002
[0317] O recipiente de líquido foi fabricado usando o seguinte protocolo: fechar uma extremidade do canudo de plástico com cola quente; carregar 140 pl de água tratada por PCR; vedar o recipiente com cera de parafina fundida.
[0318] O dispositivo centrípeto fluídico foi montado utilizando o seguinte protocolo: colocar o disco paramagnético na câmara de lise; carrregar 60 pl de pasta de esferas de vidro; carregar 2 pl de iniciadores em cada cubeta; carregar 0,5 pl de sonda TaqMan; secar a pasta e iniciadores sob vácuo durante a noite, colocar o recipiente de líquido na câmara de retenção; dispensar cera de parafina de baixo ponto de fusão na câmara de resíduo.
[0319] As etapas seguintes são feitas em uma caixa de luvas sob atmosfera de Argônio: colocar uma esfera de OmniMix HS por cubeta de detecção; colar a camada inferior fina para a camada fluídica usando o adesivo sensível à pressão, colocar o dispositivo centrípeto fluídico montado em um saco de alumínio com dessecante e vedar o saco.
Experimento
[0320] Durante um estudo clínico, os esfregaços vaginais/anais foram coletados de mulheres grávidas usando tecnologia de válvulas de pressão Clinical Packaging preenchidas com 600 pL de Tris EDTA 10 mM (TE).
[0321] Após a ressuspensão do esfregaço com os 600 pl de TE, uma quantidade de 170 pl da diluição do esfregaço são colocados diretamente no receptáculo de entrada do dispositivo centrípeto fluídico acima descrito.
[0322] O dispositivo centrípeto fluídico é atado no instrumento e o protocolo seguinte é executado no instrumento de controle de temperatura de zona dupla para a preparação da amostra.
[0323] Os parâmetros para a medição, lise e controle de inibidores de PCR utilizados neste exemplo são os seguintes: Tabela 2. Carregamento da câmara preenchível de fundo
Figure img0003
Tabela 3. Etapa de Lise
Figure img0004
Tabela 4. Etapa de clarificação e transferência para o receptáculo da câmara de  retenção
Figure img0005
Tabel 5. Controle de Inibidore de PCR
Figure img0006
Tabela 6. Enchimento da cubeta por PCR
Figure img0007
[0324] O dispositivo centrípeto fluídico é então transferido para um rotor adaptado especificamente projetado para funcionar em um RotorGene para processar o PCR em tempo real usando as seguintes condições. Tabela 7. Condições de Processo
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Resultados:
[0325] Os esfregaços foram verificados positivos para a presença de detecção de GBS a CT de 28,30.
Exemplo 2
[0326] O exemplo seguinte é ilustrativo e não se destina a ser limitativo
[0327] O presente exemplo refere-se ao uso de uma modalidade exemplar do dispositivo centrípeto fluídico para detectar a presença de estreptococos do Grupo B em esfregaços vaginais-anais de mulheres grávidas.
[0328] O dispositivo centrípeto fluídico utilizado para os fins do presente exemplo tem a forma externa descrita na FIG. 1C e é composto dos seguintes elementos fluídicos mostrados e descritos na FIG. 17. Tabela 8. Sumário dos detalhes das estruturas de dispositivos centrípetos fluídicos
Figure img0009
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[0329] O recipiente de líquido foi fabricado usando o seguinte protocolo: carregar 120 pl do diluente líquido de PCR; vedar o tubo de polialômero com bastão cola quente BAP 5-4.
[0330] O dispositivo centrípeto fluídico foi montado utilizando o seguinte protocolo: colocar o disco paramagnético na câmara de lise; carregar 60 pl de pasta de esferas de vidro; carregar 4,6 pl de reagentes de PCR, em cada cubeta; secar a pasta e os reagentes de PCR sob calor e vácuo; colocar o recipiente de líquido na câmara de retenção; dispensar a cera de parafina de baixo ponto de fusão na câmara de resíduo.
[0331] Ligar as camadas pré-montados 9795R/467 MP/policarbonato para a camada fluídica e aplicar uma pressão utilizando uma prensa com um torque de 90 in.lbs. Colocar o dispositivo centrípeto fluídico montado em um saco de alumínio com dessecante e vedar o saco.
Experimento
[0332] Durante um estudo clínico, os esfregaços vaginais/anais foram coletados de mulheres grávidas usando a tecnologia de válvulas de pressão de Embalagem Médica enchidas com 600 pL de Tris EDTA 10 mM (TE).
[0333] Após a ressuspensão, os esfregaços com os 600 pl de TE, 170 pl da diluição do esfregaço são colocados diretamente no receptáculo de entrada de amostra do dispositivo centrípeto fluídico acima descrito.
[0334] O dispositivo centrípeto fluídico é colocado no instrumento e o seguinte protocolo é executado no instrumento de controle de temperatura de zona dupla para a preparação da amostra.
[0335] Os parâmetros para a medição, lise e controle de inibidores de PCR utilizados neste exemplo são os seguintes: Tabela 9. Carregamento da câmara preenchível de fundo
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Tabela 10. Etapa de Lise
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Tabela 11. Etapa de clarificação e transferência para o receptáculo da câmara de  retenção
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Tabela 12. Controle de inibidores de PCR por aquecimento e diluição do fluido
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Tabela 13. Enchimento da cubeta de PCR
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[0336] O dispositivo centrípeto fluídico é então transferido para um rotor adaptado especificamente projetado para funcionar em um RotorGene para processar PCR em tempo real usando as seguintes condições. Tabela 14. Condições de Termociclagem
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Resultados:
[0337] Os esfregaços foram verificados positivos para a presença de detecção por GBS a CT entre 27 e 32.
Exemplo 3
[0338] O seguinte exemplo é ilustrativo e não se destina a ser limitativo.
[0339] O presente exemplo refere-se ao uso de uma modalidade exemplar do dispositivo centrípeto fluídico para detectar a presença do gene da beta-globina humano a partir de uma amostra de esfregaço de bochecha humana, Escherichia coli a partir de amostras de urina humana, e Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) a partir de amostras de esfregaços de nariz humano. Tabela 15. Lista de iniciadores de amplificação selecionados e sondas de detecção para os diferentes ensaios
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a A letra minúscula na sonda Taqman-LNA indica Ácidos Nucleicos Bloqueados (LNA™). Tabela 16. Sumário de detalhes das estruturas do dispositivo centrípeto fluídico
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[0340] Os dispositivos centrípetos fluídicos utilizados para os fins do presente exemplo têm a forma externa descrita na FIG. 1C e são compostas por elementos fluídicos mostrados e descritos na FIG. 17.
[0341] Os dispositivos centrípetos fluídicos utilizados para a finalidade deste exemplo continham os componentes listados na Tabela 16.
[0342] O recipiente de líquido foi fabricado usando o seguinte protocolo: carregar 120 pl da diluente líquido de PCR; vedar o tubo de polialômero com bastão de cola quente BAP 5-4.
[0343] O dispositivo centrípeto fluídico foi montado utilizando o seguinte protocolo: colocar o disco paramagnético na câmara de lise; carregar 60 pl de suspensão de esferas de vidro; carregar4,6 pl de reagentes de PCR, em cada cubeta; secara pasta e os reagentes de PCR sob calor e vácuo; colocar o recipiente de líquido na câmara de retenção; dispensar cera de parafina de baixo ponto de fusão de na câmara de resíduo.
[0344] Ligar as camadas pré-montadas 9795R/467 MP/policarbonato à camada fluídica e aplicar uma pressão utilizando uma prensa com um torque de 90 in.lbs. Experimento
[0345] Um esfregaço de escovar rosto foi coletado de um voluntário humano utilizando esfregaço de Embalagem médica com tecnologia de válvulas de pressão preenchidas com 600 pL de Tris EDTA 10 mM (TE). O esfregaço foi colocado em contato com a superfície interior da bochecha e girado durante 30 s. O esfregaço foi colocado de volta a sua manga e a válvula de pressão foi quebrada para liberar 600 pl de TE. Depois de 5 minutos de tempo de espera, o esfregaço é colocado em vórtice durante 1 minuto. Esta amostra diluída suspensa serviu para teste.
[0346] As amostras de urina coletadas de pacientes foram diluídas a 1/56 em TE. Esta amostra diluída serviu para testes.
[0347] Durante um estudo clínico, os esfregaços nasais foram coletados de voluntários e ressuspendidos em 600 pL de TE. Esta amostra diluída suspensa serviu para teste.
[0348] Um volume de 140 pl das amostras diluídas é colocado diretamente no receptáculo de entrada de amostra do dispositivo centrípeto fluídico acima descrito.
[0349] Os dispositivos centrípetos fluídicos são colocados no instrumento e os protocolos foram realizados de acordo com as Tabelas 9, 10, 11, 12, e 13.
[0350] Em alguns testes, o protocolo foi interrompido e reiniciado na etapa 8 para examinar a posição do fluido na câmara de retenção do receptáculo.
[0351] A termociclagem foi realizada sob as condições listadas na Tabela 17 ou na Tabela 18, dependendo do ensaio. Tabela 17. Condições de termociclagem para o ensaio da beta-globina
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Tabela 18. Condições de termociclagem para ensaios de UTI e MRSA
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Resultados:
[0352] Os controles internos não revelaram nenhuma inibição ou apenas uma inibição mínima de amostras. Todas as amostras já conhecidas para conter o DNA alvo por outro método de teste foi realmente encontrado positivo com o dispositivo centrípeto fluídico e similarmente, as amostras já conhecidas como sendo negativas para o DNA alvo tiveram de fato resultados negativos com o dispositivo centrípeto fluídico.
[0353] Este exemplo ilustra a versatilidade da tecnologia centrípeta fluídica da presente invenção para a detecção de ácidos nucleicos a partir de uma variedade de amostras e células biológicas. As amostras fecais diluídas foram também testadas com êxito para a detecção de agentes patogênicos bacterianos responsáveis pela diarreia.
Exemplo 4
[0354] O exemplo seguinte é ilustrativo e não se destina a ser limitativo.
[0355] O presente exemplo refere-se ao uso de uma modalidade exemplar do dispositivo centrípeto fluidificado e, mais especificamente, da câmara preenchível de fundo e outros elementos da presente invenção para concentrar as células e micróbios. Tabela 19. Sumário dos detalhes das estruturas de dispositivos centrípetos fluídicos.
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[0356] Os dispositivos centrípetos fluídicos utilizados para os fins do presente exemplo têm a forma externa descrita na FIG. 1C e são compostos por elementos fluídicos mostrados e descritos na FIG. 17.
[0357] Os dispositivos centrípetos fluídicos utilizados para a finalidade deste exemplo continham os componentes listados na Tabela 19.
[0358] O dispositivo centrípeto fluídico foi montado utilizando o seguinte protocolo: colocar o disco paramagnético na câmara de lise; carregar 60 pl de pasta de esferas de vidro; secar a pasta durante a noite sob vácuo; ligar as camadas pré-montadas 9795R/467 MP/policarbonato para a camada fluídica e aplicar uma pressão utilizando uma prensa com um torque de 90 in.lbs.
Experimento
[0359] 10 pl (105 Unidades Formadora de Colônia; CFU) de uma cultura diluída da bactéria Enterococcus faecalis foram misturadas com 190 pl de TE.
[0360] A mistura de 200 pl foi colocada diretamente no receptáculo de entrada de amostra do dispositivo centrípeto fluídico acima descrito.
[0361] Os dispositivos centrípetos fluídicos foram colocados no instrumento e os seguintes protocolos foram realizados de acordo com as Tabelas 9 e 10.
[0362] Os dispositivos centrípetos fluídicos foram desmontados, removendo as camadas sensíveis à pressão, de modo que o líquido na câmara preenchível de fundo e na câmara de transbordamento pudesse ser colhido e diluído para realizar contagens de células bacterianas presentes em cada uma das câmaras.
Resultados:
[0363] As contagens revelaram que o número de células bacterianas foi superior na câmara preenchível de fundo em comparação com o número de células bacterianas presentes na câmara de transbordamento por um fator de 1,5 a 3 vezes.
[0364] As modalidades acima descritas destinam-se a ser um exemplo apenas. O escopo da invenção é, portanto, destinado a ser limitado apenas pelas reivindicações anexas.

Claims (49)

1. Dispositivo centrípeto fluídico para testar componentes de um material biológico em um fluido, o referido dispositivo centrípeto fluídico tendo uma forma adaptada para ser recebida dentro de um suporte giratório, o referido suporte giratório tendo um centro de rotação e uma borda exterior, o referido dispositivo centrípeto fluídico se estendendo radialmente entre o referido centro de rotação e a referida borda exterior, um lado interno do referido dispositivo centrípeto fluídico sendo localizado em direção ao referido centro de rotação e um lado externo do referido dispositivo centrípeto fluídico sendo localizado em direção à referida borda exterior, o dispositivo caracterizado pelo fato de que compreende: uma camada de componente fluídico tendo características fluídicas em pelo menos uma face frontal, as referidas características fluídicas incluindo: um canal de entrada para circulação do referido fluido, o referido canal de entrada sendo acoplado a uma entrada de câmara; uma câmara preenchível de fundo acoplada ao referido canal de entrada na referida entrada de câmara para receber o referido fluido, a referida entrada de câmara sendo fornecida em um lado externo da referida câmara preenchível de fundo; em que a referida câmara preenchível de fundo compreende pelo menos um membro translocvel diferente de esferas que transloca dentro da referida câmara preenchível de fundo em resposta a um campo magnético flutuante externo, a câmara preenchível de fundo e o membro translocável sendo configurados e dimensionados para permitir a translocação do membro translocável dentro da câmara preenchível de fundo, enquanto previne saída do membro translocável a partir da câmara preenchível de fundo; uma descarga de saída para a referida câmara preenchível de fundo, a referida descarga de saída permitindo saída do referido fluido a partir da referida câmara preenchível de fundo, em que a descarga de saída é localizada em um lado longitudinal da referida câmara preenchível de fundo; uma câmara de transbordamento acoplada a uma saída de excesso para a referida câmara preenchível de fundo, a referida saída de excesso permitindo a saída de parte do referido fluido a partir da referida câmara preenchível de fundo para a referida câmara de transbordamento, em que a referida saída de excesso é fornecida próxima ao referido lado interno da referida câmara preenchível de fundo em um lado longitudinal da referida câmara preenchível de fundo; uma saída de ventilação conectada a um canal de ventilação, a referida saída de ventilação sendo acoplada a referida câmara de transbordamento para ventilar simultaneamente a referida câmara preenchível de fundo e a referida câmara de transbordamento; e uma camada de componente de fundo ligada a uma parte traseira da referida camada de componente fluídico criando, assim, uma rede fluídica através da qual o referido fluido flui sob força centrípeta.
2. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um receptáculo de entrada para receber o referido fluido, o referido receptáculo de entrada se estendendo para fora a partir da referida camada de componente fluídico em uma face frontal da referida camada de componente fluídico e sendo localizado próximo ao referido lado interno, o referido receptáculo de entrada terminando em uma saída de receptáculo de entrada, o referido canal de entrada sendo acoplado à referida saída de receptáculo de entrada em uma extremidade oposta à referida entrada de câmara. câmara preenchível de fundotranslocávelcâmara preenchível de fundo
3. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a câmara preenchível de fundo compreende pelo menos um objeto não responsivo a um campo magnético flutuante e em que o referido objeto é pelo menos um de uma esfera, uma zeólita, uma partícula, uma partícula de filtração, uma esfera de vidro, uma esfera de zircônio, uma resina, uma pasta de esfera e de resina.
4. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um do referido objeto e do referido membro translocável é revestido com pelo menos um de um quelante e um material ligante adaptado para interagir com componentes do referido fluido.
5. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma descarga de saída para a referida câmara preenchível de fundo, a referida descarga de saída permitindo saída do referido fluido a partir da referida câmara preenchível de fundo, em que a referida descarga de saída é localizada no referido um lado longitudinal da referida câmara preenchível de fundo, a referida descarga de saída estando localizada mais próxima do referido lado externo da referida câmara preenchível de fundo do que a referida saída de excesso, um volume de medição da referida câmara preenchível de fundo sendo definido entre a referida descarga de saída e a referida saída de excesso.
6. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma válvula de ruptura na referida descarga de saída, a referida válvula de ruptura abrindo a uma força centrípeta predeterminada aplicada no referido aparelho, a referida válvula de ruptura impedindo que o referido fluido saia da referida câmara preenchível de fundo até a referida abertura.
7. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma câmara de retenção, a referida câmara de retenção sendo acoplada à referida descarga de saída em um lado interno da referida câmara de retenção, a referida câmara de retenção sendo localizada mais próxima do referido lado externo da referida camada de componente fluídico do que a referida câmara preenchível de fundo, em que a referida câmara de retenção é acoplada à referida descarga de saída através de um canal de medição, o referido canal de medição para circular pelo menos uma porção do referido fluido a partir da referida câmara preenchível de fundo para a referida câmara de retenção.
8. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um recipiente integralmente fornecido na referida câmara de retenção e contendo um diluente líquido, o referido recipiente sendo adaptado para manter o referido diluente líquido no referido recipiente e liberar o referido diluente líquido na referida câmara de retenção mediante aplicação de uma força externa ao referido recipiente, em que a referida força externa é uma de força mecânica, elétrica, eletromagnética, de calor, de choque e acústica, restaurando, assim, a conexão fluídica entre o referido diluente líquido e o referido fluido na referida câmara de retenção.
9. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que a referida câmara de retenção tem uma saída de distribuição para a referida câmara de retenção, a referida saída de distribuição sendo localizada em um lado externo da referida câmara de retenção, a referida saída de distribuição sendo acoplada a um canal de distribuição transversal em um lado interno do referido canal de distribuição transversal em uma primeira extremidade transversal do referido canal de distribuição, o referido canal de distribuição transversal tendo uma série de pelo menos uma cubeta fornecida em um lado externo do referido canal de distribuição transversal.
10. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que a referida pelo menos uma cubeta inclui pelo menos um de um reagente seco e um material de mudança de fase.
11. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que a referida pelo menos uma cubeta é adaptada para ser opticamente investigada para pelo menos um parâmetro, o referido parâmetro é um dentre fluorescência, absorbância e colorimetria.
12. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que o referido canal de distribuição transversal inclui uma câmara de resíduos em uma segunda extremidade transversal do referido canal de distribuição.
13. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que a referida câmara de resíduos inclui um material de mudança de fase.
14. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que o referido canal de distribuição, a referida pelo menos uma cubeta e a referida câmara de resíduos são fornecidos em uma porção do referido componente de camada fluídica o qual se estende além da referida borda exterior do referido suporte giratório.
15. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que a referida camada de componente fluídico é adaptada para ser dividida em pelo menos duas seções distintas controláveis por temperatura, em que uma primeira das referidas duas seções distintas controláveis por temperatura inclui pelo menos a referida câmara de retenção e uma segunda das referidas duas seções distintas controláveis por temperatura inclui pelo menos o referido canal de distribuição e as referidas cubetas.
16. Aparelho de teste usando um dispositivo centrípeto fluídico para testar componentes de um material biológico em um fluido, o aparelho de teste caracterizado pelo fato de que compreende: pelo menos um do referido dispositivo centrípeto fluídico como definido na reivindicação 1; um conjunto de rotor; um suporte para receber o referido pelo menos um do referido dispositivo centrípeto fluídico utilizando a referida camada de componente fluídico, o referido suporte sendo acoplado ao referido rotor; um motor para girar o referido conjunto de rotor; um controlador de velocidade para o referido motor para controlar pelo menos uma de uma duração e uma velocidade de rotação do referido conjunto de rotor; um subsistema de condicionamento de temperatura para controlar uma temperatura de pelo menos uma porção do referido dispositivo centrípeto microfluídico; um subsistema de detecção para detectar uma característica do referido fluido; uma interface de usuário para receber um comando de usuário e para enviar um comando para pelo menos um do referido controlador de velocidade, do referido subsistema de condicionamento de temperatura, do referido subsistema de excitação e do referido subsistema de detecção.
17. Aparelho de teste, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o referido subsistema de condicionamento de temperatura controla uma temperatura de pelo menos duas zonas do referido dispositivo centrípeto fluídico.
18. Método de teste usando um dispositivo centrípeto fluídico para testar componentes de um material biológico em um fluido, o método caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer pelo menos um do referido dispositivo centrípeto fluídico como definido na reivindicação 1; fornecer um aparelho de teste como definido na reivindicação 16; fornecer um fluido com material biológico; carregar o referido fluido no referido receptáculo de entrada do referido dispositivo centrípeto fluídico; colocar o referido dispositivo centrípeto fluídico no referido suporte do referido aparelho de teste; fornecer um comando de usuário para iniciar uma sequência de teste; girar o referido conjunto de rotor a uma primeira velocidade para transferir o referido fluido a partir do referido receptáculo de entrada para a referida câmara preenchível de fundo.
19. Método de teste, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o fluido é selecionado a partir do grupo consistindo em sangue, aspiração da faringe nasal, fluido oral, líquido a partir de esfregaço bucal ressuspenso, líquido a partir de esfregaço nasal ressuspenso, líquido ressuspenso a partir de esfregaço anal, líquido ressuspenso a partir de esfregaço vaginal, saliva e urina.
20. Método de teste, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de testar pelo menos um componente selecionado a partir do grupo consistindo em íons, açúcares, metabólitos, ácidos graxos, aminoácidos, ácidos nucleicos, proteínas e lipídios.
21. Dispositivo centrípeto fluídico para testar componentes de um material biológico em um fluido, o referido dispositivo centrípeto fluídico tendo uma forma adaptada para ser recebida dentro de um suporte giratório, o referido suporte giratório tendo um centro de rotação e uma borda exterior, o referido dispositivo centrípeto fluídico se estendendo radialmente entre o referido centro de rotação e a referida borda exterior, um lado interno do referido dispositivo centrípeto fluídico sendo localizado em direção ao referido centro de rotação e um lado externo do referido dispositivo centrípeto fluídico sendo localizado em direção à referida borda exterior, o dispositivo caracterizado pelo fato de que compreende: uma camada de componente fluídico tendo características fluídicas em pelo menos uma face frontal, as referidas características fluídicas incluindo: uma câmara de retenção para receber o referido fluido, a referida câmara de retenção sendo acoplada a um canal de entrada de fluido para receber o referido fluido dentro da referida câmara de retenção; e um recipiente integralmente fornecido na referida câmara de retenção, o referido recipiente contendo um diluente líquido, o referido container compreendendo adicionalmente um primeiro material de mudança de fase para liberar o referido diluente dentro da câmara de retenção; e uma camada de componente de fundo ligada à referida camada de componente fluídico, a camada de componente fluídico e a camada de componente de fundo criando uma rede fluídica, o referido fluido fluindo através da referida rede fluídica sobre força centrípeta.
22. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a referida câmara de retenção compreende um receptáculo de dissociação de fluido, em que o referido receptáculo de dissociação de fluido é localizado em um lado externo da referida câmara de retenção entre o canal de entrada de fluido e um interior da câmara de retenção, o referido receptáculo de dissociação de fluido interrompendo uma conexão fluídica entre o canal de entrada de fluido e a câmara de retenção.
23. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o referido receptáculo de dissociação de fluido inclui um reagente seco.
24. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a referida câmara de retenção tem uma saída de distribuição para a referida câmara de retenção, a referida saída de distribuição sendo localizada em um lado externo da referida câmara de retenção, a referida saída de distribuição sendo acoplada a um canal de distribuição em um lado interno do referido canal de distribuição em uma primeira extremidade transversal do referido canal de distribuição, o referido canal de distribuição tendo pelo menos uma cubeta fornecida em um lado externo do referido canal de distribuição.
25. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 24, caracterizadopelo fato de que a referida pelo menos uma cubeta inclui pelo menos um de um reagente seco e um segundo material de mudança de fase.
26. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 24, caracterizadopelo fato de que a referida cubeta é adaptada para ser opticamente investigada para pelo menos um parâmetro, em que o referido parâmetro é um dentre fluorescência, absorbância e colorimetria.
27. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 24, caracterizadopelo fato de que o referido canal de distribuição inclui uma câmara de resíduos em uma segunda extremidade do referido canal de distribuição.
28. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que a referida câmara de resíduos inclui um terceiro material de mudança de fase.
29. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 28, caracterizadopelo fato de que o referido canal de distribuição, a referida pelo menos uma cubeta e a referida câmara de resíduos são fornecidos em uma porção da referida camada de componente fluídico que se estende além da referida borda exterior do referido suporte giratório.
30. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato de que a referida camada de componente fluídico compreende pelo menos duas seções distintas controláveis por temperatura.
31. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que o referido recipiente é adaptado para manter o referido diluente líquido no referido recipiente e liberar o referido diluente líquido na referida câmara de retenção mediante aplicação de uma força externa ao referido recipiente, em que a referida força externa é uma de força mecânica, elétrica, eletromagnética, de calor, de choque e acústica, permitindo, assim, a conexão fluídica entre o referido diluente líquido e o referido fluido na referida câmara de retenção.
32. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que compreende adicionalmente uma câmara preenchível de fundo, em que a referida câmara preenchível de fundo é acoplada ao referido canal de entrada para fornecer fluido à câmara de retenção.
33. Dispositivo, de acordo a reivindicação 32, caracterizadopelo fato de que a referida câmara preenchível de fundo inclui pelo menos um membro translocável que transloca dentro da referida câmara preenchível de fundo em resposta a um campo magnético flutuante externo.
34. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 32, caracterizadopelo fato de que a câmara preenchível de fundo compreende pelo menos um objeto não responsivo a um campo magnético flutuante e em que o referido objeto é pelo menos um de uma esfera, um zeólito, uma partícula, uma partícula de filtração, uma esfera de vidro, uma esfera de zircônio, uma resina, uma pasta de esfera e de resina.
35. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 34, caracterizadopelo fato de que pelo menos um do referido objeto e do referido membro translocável é revestido com pelo menos um de um quelante e um material ligante adaptado para interagir com componentes do referido fluido.
36. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 32, caracterizadopelo fato de que compreende adicionalmente uma câmara de transbordamento acoplada a uma saída de excesso para a referida câmara preenchível de fundo, a referida saída de excesso permitindo saída de parte do referido fluido da referida câmara preenchível de fundo para a referida câmara de transbordamento, em que a referida saída de excesso é fornecida próxima do referido lado interno da referida câmara preenchível de fundo em um lado longitudinal da referida câmara preenchível de fundo.
37. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma descarga de saída para a referida câmara preenchível de fundo, a referida descarga de saída permitindo saída do referido fluido a partir da referida câmara preenchível de fundo, em que a referida descarga de saída é localizada no referido um lado longitudinal da referida câmara preenchível de fundo, a referida descarga de saída estando localizada mais próxima do referido lado externo da referida câmara preenchível de fundo do que a referida saída de excesso, um volume de medição da referida câmara preenchível de fundo sendo definido entre a referida descarga de saída e a referida saída de excesso.
38. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma válvula de ruptura na referida descarga de saída, a referida válvula de ruptura abrindo a uma força centrípeta predeterminada aplicada no referido aparelho, a referida válvula de ruptura impedindo que o referido fluido saia da referida câmara preenchível de fundo até a referida abertura.
39. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a referida câmara de retenção é acoplada à referida descarga de saída em um lado interno da referida câmara de retenção, a referida câmara de retenção sendo localizada mais próxima do referido lado externo da referida camada de componente fluídico do que a referida câmara preenchível de fundo, em que a referida câmara de retenção é acoplada à referida descarga de saída através de um canal de medição, o referido canal de medição para circular pelo menos uma porção do referido fluido a partir da referida câmara preenchível de fundo para a referida câmara de retenção.
40. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma descarga de saída para a referida câmara preenchível de fundo, a referida descarga de saída permitindo a saída do referido fluido a partir da referida câmara preenchível de fundo, em que a referida descarga de saída é localizada em um lado longitudinal da referida câmara preenchível de fundo.
41. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um receptáculo de entrada para carregar o fluido compreendendo o referido material biológico.
42. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o material de mudança de fase é um material tolerante ao calor liberando o referido diluente em uma certa temperatura.
43. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a referida câmara de retenção compreende um receptáculo de dissociação de fluxo localizado em um lado externo da referida câmara de retenção, o receptáculo de dissociação de fluxo compreendendo um reagente.
44. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o reagente é isolado a partir de um interior da câmara de retenção por um quarto material de mudança de fase que é um material tolerante ao calor liberando o referido reagente em uma certa temperatura.
45. Aparelho de teste usando um dispositivo centrípeto fluídico para testar componentes de um material biológico em um fluido, o aparelho de teste caracterizado pelo fato de que compreende: pelo menos um do referido dispositivo centrípeto fluídico como definido na reivindicação 21. um conjunto de rotor; um suporte para receber o referido pelo menos um do referido dispositivo centrípeto fluídico utilizando a referida camada de componente fluídico, o referido suporte sendo acoplado ao referido rotor; um motor para girar o referido conjunto de rotor; um controlador de velocidade para o referido motor para controlar pelo menos uma de uma duração e uma velocidade de rotação do referido conjunto de rotor; um subsistema de condicionamento de temperatura para controlar uma temperatura de pelo menos uma porção do referido dispositivo centrípeto fluídico; um subsistema de detecção para detectar uma característica do referido fluido; uma interface de usuário para receber um comando de usuário e para enviar um comando para pelo menos um do referido controlador de velocidade, do referido subsistema de condicionamento de temperatura, do referido subsistema de excitação e do referido subsistema de detecção.
46. Aparelho de teste, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o referido subsistema de condicionamento de temperatura controla uma temperatura de pelo menos duas zonas do referido dispositivo centrípeto fluídico.
47. Método de teste usando um dispositivo centrípeto fluídico para testar componentes de um material biológico em um fluido, o método caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer um aparelho de teste com pelo menos um do dispositivo centrípeto fluídico como definido na reivindicação 45; fornecer um fluido com material biológico; carregar o referido fluido no referido receptáculo de entrada do referido dispositivo centrípeto fluídico; colocar o referido dispositivo centrípeto fluídico no referido suporte do referido aparelho de teste; fornecer um comando de usuário para iniciar uma sequência de teste; girar o referido conjunto de rotor para fluir o referido fluido através da referida rede fluídica.
48. Método de teste, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o fluido é selecionado a partir do grupo consistindo em sangue, aspiração da faringe nasal, fluido oral, líquido a partir de esfregaço bucal ressuspenso, líquido a partir de esfregaço nasal ressuspenso, líquido ressuspenso a partir de esfregaço anal, líquido ressuspenso a partir de esfregaço vaginal, saliva e urina.
49. Método de teste, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de testar pelo menos um componente selecionado a partir do grupo consistindo em íons, açúcares, metabólitos, ácidos graxos, aminoácidos, ácidos nucleicos, proteínas e lipídios.
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