BR112013019515B1

BR112013019515B1 - processo para a preparação de um extrato enriquecido em dihidrochalconas

Info

Publication number: BR112013019515B1
Application number: BR112013019515-0A
Authority: BR
Inventors: Boehlendorf Bettina; Kilpert Claus; Hug Hubert; Kammerer Judith; Carle Reinhold
Original assignee: Dsm Ip Assets Bv
Priority date: 2011-01-31
Filing date: 2012-01-19
Publication date: 2019-11-19
Also published as: KR20140006011A; JP5935127B2; EP2670762A1; KR101980922B1; CN103347890B; BR112013019515A2; US20130302504A1; CN103347890A; US8993037B2; WO2012104145A1; EP2670762B1; PL2670762T3; JP2014506567A; ES2530804T3

Abstract

processo para a preparação de um extrato enriquecido em dihidrochalconas a presente invenção refere-se a um processo melhorado para a preparação de um extrato enriquecido em dihidrochalconas, e mais especificamente enriquecido em florizina, começando a partir de uma fração de polifenólicos proveniente de processamento industrial de maçã. a invenção também se refere a um extrato de dihidrochalcona obtido por este processo, e a um alimento ou um produto nutracêutico que compreende um extrato de dihidrochalcona do presente invento.

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM EXTRATO ENRIQUECIDO EM DIHIDROCHALCONAS

A presente invenção refere-se a um processo melhorado para a preparação de um extrato enriquecido em dihidrochalconas, e mais especificamente enriquecido em floridzina, a partir de uma fração de polifenol seca proveniente de processamento industrial de maçã. A invenção também se refere a um extrato de dihidrochalcona obtido por este processo.

O crescimento mundial da indústria de horticultura tem gerado grandes quantidades de resíduos de frutas. Estes resíduos são geralmente uma boa fonte de carboidratos, proteínas, vitaminas, minerais, antioxidantes, e outros metabólitos secundários bioativos. Maçãs são amplamente utilizadas na indústria de alimentos para produzir diferentes tipos de bolos de maçã, sucos de maçã e sidras e gera, em paralelo, grandes quantidades de fluxos de resíduos de bagaço de maçã, ou pele de maçã ambos contendo grande quantidade de metabólitos nutricionalmente interessantes. Bagaço de maçã tem a forma de uma mistura heterogênea de sementes, núcleos, caules, pele e parênquima. Bagaço de maçã é uma das principais fontes de pectina, um agente gelificante comum de comida, e também pode ser utilizado para produções biotecnológicas. Em maçãs, compostos fenólicos estão presentes em várias partes do fruto e podem ser classificados em várias classes: derivados do ácido hidroxicinâmicos, flavano-3-óis monoméricos e oligoméricos, dihidrochalconas, flavonóis etc. Um uso eficiente de subprodutos de maçã é um tópico crescente que pode ser considerado como um processo

Petição 870190071068, de 25/07/2019, pág. 7/12

2/12 essencial para a realização da rentabilidade e/ou sustentabilidade na indústria de maçã.

Florizina (glicose, 1-[2-(beta-D-glucopiranosiloxi)4,6-di-hidroxifenil]-3-(4-hidroxifenil)-1-propanona); CAS : 60-81-1 é um membro da classe das dihidrochalconas dos compostos orgânicos. É constituída por uma fração de glicose e dois anéis aromáticos ligados por um espaçador de alquil. A florizina é um produto natural, que tem sido encontrado em, e isolado a partir de várias árvores frutíferas, inclusive a raiz, casca, brotos, folhas e frutos de macieiras, e de todas as partes de morangueiros. Além disso, a florizina é um conhecido potente bloqueador da captação de glicose (WO 2001/15706), que é utilizado para tratar as formas não patológicas de obesidade (EP 1 338 270) .

Florizina e/ou extratos naturais enriquecidos em florizina podem ser preparados por etapas de extração múltipla que requerem geralmente um passo cromatográfico caro (WO 2007/124102; 35 EP 1 243 586), ou um passo seletor enzimático (Will et al LWT (2007), 40: 1344-1351) . Porém, as tecnologias de purificação descritas na arte anterior, até à data, são relativamente caras, em relação ao tempo de consumo, e difícil de operar em escala industrial a partir de uma corrente de resíduos industriais uma vez que todas elas envolvem um passo cromatográfico ou enzimático.

Devido à crescente procura de florizina no mercado, o objeto da presente invenção foi fornecer um processo para a preparação de florizina que é fácil de executar e oferece vantagens econômicas, como um resultado de altos rendimentos. Além disso, o processo de presente invenção

3/12 produz um produto mais claro, que é mais estável e contém quantidades muito baixas de estruturas de orto-dihidroxi fenol indesejado, por exemplo: quercetina e seus derivados, flavonóis, flavanóis e ácidos hidroxicinâmicos. Isto é particularmente importante devido pequenas quantidades de quercetina e seus derivados presentes numa preparação de florizina tenderem a oxidar-se durante a armazenagem, desse modo, fazendo a preparação de florizina se tornar castanho o que é indesejável para utilização em formulações de alimentos.

Surpreendentemente, foi descoberto que o processo do presente invento proporciona maior rendimento de dihidrochalcona e menos estruturas de orto-dihidroxi fenol em um custo muito baixo de processamento comparado com a utilização de outras tecnologias. Além disso, o processo da presente invenção envolve apenas extração e precipitação seletiva de produtos colaterais indesejados, tornando este processo significativamente mais rentável em comparação com qualquer processo da técnica anterior.

Assim, a presente invenção proporciona um processo para a preparação de um extrato enriquecido em dihidrochalconas e derivados destes, em que o referido processo compreende os passos de:

(A) extração de um extrato seco de polifenóis com um solvente de grau alimentar, (B) alcalinização do extrato a partir de (a), (C) oxidação da solução resultante de (b), (D) filtração ou centrifugação da mistura de (c), (E) opcionalmente, evaporação da solução resultante de (d) para remover o solvente residual, e solubilização do

4/12 material seco em água, (F) secagem do extrato resultante.

Dihidrochalconas e seus derivados, significa qualquer composto selecionado de: floridzina, floretina, floretina2'-Ο-β-D-xilopiranosil-(1—6)-β-D-glucopiranósido, e outros glicosideos de floretina.

Numa forma de realização particular, a matéria-prima utilizada como material de partida é um extrato seco de polifenol derivado do processamento industrial de maçã. É para ser entendido pelo termo maçã, maçã doméstica e selvagem. A matéria-prima pode ser bagaço de maçã como um resíduo da produção de suco de maçã ou cidra, ou ainda um extrato de polifenóis purificado derivada de bagaço de maçã ou pele de maçã. Mais preferencialmente, a matéria-prima utilizada como material de partida é um extrato seco derivado de polifenóis a partir do processo de produção de pectina de maçã. Ainda mais preferido, é um extrato seco de polifenóis resultado do processo de produção de pectina como descrito no documento WO 2001/78859. Além disso, quando o extrato seco de polifenol é derivado de processo industrial de maçã, ele preferivelmente compreende, pelo menos um, de preferência pelo menos 5, mais preferivelmente pelo menos 8% em peso de florizina. Ele também pode compreender até 5% de quercetina e seus derivados.

Numa outra forma de realização, o passo de extração (passo (a)) do processo de acordo com a presente invenção é realizado com um solvente de grau alimentar puro, com água ou com uma mistura de água e solvente. A mistura águasolvente compreende desde 1 até 99% por volume de água, de preferência até 50, mais preferivelmente até 30, ainda mais

5/12 preferivelmente até 10% em volume de água. De preferência, o solvente de grau alimentício de acordo com a presente invenção é selecionado a partir de: propano, butano, pentano, hexano, ciclohexano, heptano, metanol, etanol, butano-l-ol, butano-2-ol, 3-metil-l-butanol, propano-l-ol, 2-metil-l-propanol, isopropanol, 1-pentanol, acetato de metila, acetato de etila, formato de etila, acetato de butila, acetato de isobutila, acetato de propila, acetato de isopropila, acetona, etilmetilcetona, metíl-isobutilcetona, diclometano, éter etílico, éter dietílico, éter terc-butilmetílico, 1,1,1,2-tetrafluoretane, anisola, cumeno.

Numa outra forma de realização, o solvente de extração do passo (a) é selecionado a partir de: metanol, etanol, e isopropanol. Solvente de extração de grau alimentar ainda mais preferível é 100% de isopropanol em vista de sua eficiência na extração de florizina e seletividade contra a extração de quercetina e derivados destes.

Para assegurar um rendimento elevado, e um processo de extração rápido, é crítico que o passo de extração de acordo com a presente invenção (etapa (a)) seja o mais eficiente possível. Portanto, em outra forma de realização, o extrato seco de polifenol seguido da adição do solvente, é tratado com ultrasom até solubilização completa ou dispersão de partículas. Numa forma de realização preferida uma quantidade de 100 a 1000 Watts de ultrasons é aplicada em um banho de água de 10 litros. Então, a extração é melhor realizada de acordo com procedimentos padrão conhecidos pelos peritos na arte. Ela pode ser realizada por quaisquer meios convencionais para introduzir forças de

6/12 cisalhamento na mistura de extrato e solvente ajustando o tempo de extração em função da temperatura e da pressão aplicada. Numa forma de realização preferida, a extração é realizada com agitação durante pelo menos 10 minutos à temperatura ambiente (entre 18°C a 25°C).

Numa outra forma de realização, o processo de extração do passo (a) é realizado com uma proporção de solvente para extrato seco de polifenol compreendida entre 500/1 e 10/1 litro/kg, de preferência entre 500/1 e 50/1 litro/kg, mais preferencialmente entre 300/1 e 80/1 litro/kg.

Numa outra forma de realização, o passo de alcalinização (b) é realizado por adição de uma base até o pH estar compreendido entre pH 7 e pH 14, de preferência compreendido entre pH 8 e pH 14, ainda mais preferivelmente compreendido entre pH 9 e pH 14. Para esta etapa de alcalinização, qualquer base forte tendo um pK_b menor do que 4,5, de preferência inferior a 2, pode ser utilizado. De preferência, hidróxido de sódio (NaOH) é utilizado em uma concentração tão elevada quanto possível, para evitar a adição de grandes quantidades de solução alcalina aquosa no solvente de extração. Opcionalmente, o passo de alcalinização pode ser realizado nas mesmas condições do início do processo de extração.

Numa outra forma de realização, a etapa de oxidação (etapa (c)) é realizada por borbulhamento de ar atmosférico no extrato alcalinizado do passo (b). A extensão da oxidação é ajustada dependendo do volume de solvente e da quantidade de polifenóis. Em uma forma de realização preferida, 10 a 80 litros de ar são borbulhadas por 100 ml de solvente contendo lg de extrato seco de polifenol. A

7/12 extensão da oxidação é melhor controlada por CLAE por medição da oxidação completa das estruturas orto-dihidroxi fenólicas.

Numa outra forma de realização, no final do processo de oxidação do passo (c) , uma proteína é adicionada à solução de oxidação, onde a proteína está carregada positivamente no pH da solução de oxidação. A proteína carregada positivamente atua como um potente agente de refinamento. Qualquer proteína carregada positivamente pode ser utilizada, mas em uma forma de realização preferida, é utilizada gelatina. A concentração da proteína carregada positivamente é para ser otimizada dependendo da composição da solução de oxidação de acordo com os procedimentos de refinamento padrão.

Numa outra forma de realização, uma proteína rica em lisina e/ou cisteina é adicionada à solução de oxidação. De preferência, proteínas ricas em lisina e/ou cisteina são proteínas de origem vegetal. Em formas de realização particulares, a proteína rica em lisina e/ou cisteina, contém pelo menos 8% de aminoácidos representados pela lisina e cisteina, de preferência, pelo menos, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, ou, pelo menos, 22%.

Numa outra forma de realização, quando proteínas são adicionadas, o pH da solução oxidada é ajustado no final da reação até o ponto isoelétrico da proteína acima mencionada usando um ácido ou uma base.

A etapa de filtração ou centrifugação (d) é realizada de acordo com os procedimentos padrão, a fim de remover quaisquer partículas não solubilizadas. 0 sobrenadante resultante é então opcionalmente submetido à evaporação do

8/12 solvente. Isto pode ser realizado por qualquer tecnologia de evaporação padrão. O passo de secagem (f) pode ser realizado por liofilização ou secagem por pulverização de acordo com procedimentos padrão.

A presente invenção também fornece um extrato de dihidrochalcona obtido pelo processo da invenção. Numa forma de realização preferida, o extrato de dihidrochalcona compreende menos de 1% em peso em estruturas de ortodihidroxi fenóis. Mais preferencialmente, ele compreende menos de 0,5% em peso de quercetina e/ou seus derivados.

Numa forma de realização preferida, o extrato de dihidrochalcona de acordo com o presente invento compreende mais de 10% de dihidrochalconas e menos de 1% em peso de quercetina e/ou derivados destes, mais preferencialmente, menos de 0,5% em peso de quercetina e/ou derivados destes.

A invenção também proporciona um alimento ou um produto nutracêutico compreendendo uma dihidrochalcona extraída de acordo com a presente invenção.

A invenção é ainda ilustrada pelos exemplos seguintes.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Enriquecimento de dihidrochalconas, especialmente da florizina, a partir de um extrato de polifenol.

Nesta experiência, quantidades de 0,5 g (± 0.0025 g) de extrato de polifenóis (Herbstreith & Fox; Neuenburg, DE) foram agitados com 50 ml de etanol em 100 ml frascos de vidro com tampa de rosca por 30 minutos, a 300 rpm (5.000 Hz) em um banho de água, e as amostras foram expostas a ultrasons durante os 30 segundos iniciais. Todas as experiências foram realizadas em quadruplicatas.

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Para análises em CLUE-DAD/EM, alíquotas de 2 ml foram centrifugadas (3 minutos a 13.2000 rpm (0.2200 Hz) ) e subsequentemente diluídas a 1:6 (v:v) com metanol/água (1:1 v:v) . O remanescente foi ajustado para uma valor de pH de 11 por adição de NaOH e, posteriormente, alíquotas de 2 ml foram retiradas por análise de CLUE-DAD/EM. Em seguida, os extratos básicos foram oxidados durante 15 minutos por meio de aborbulhamento de ar com um fluxo de 1,3 litros/minuto, e os precipitados foram separados por centrifugação (3220 rcf, durante 15 minutos). Os sobrenadantes foram transferidos em frascos volumétricos de 50 ml e ajustados com etanol. Alíquotas de 200 μΐ das soluções foram retiradas para análise em CLUE-DAD/EM. Além disso, o etanol foi removido utilizando um roto-evaporador a 30°C, e o resíduo foi quantificado gravimetricamente.

Além disso, todas as amostras foram liofilizadas. Para este propósito, 5 mL de água foram adicionados a amostra seca por roto-evaporação, para dissolvê-la antes do seu congelamento, em uma mistura de isopropanol/ gelo seco, seguida por liofilização.

Baseado no conteúdo da florizina dos extratos de etanol antes e depois da oxidação, quantificados por CLUEDAD/EM a Àmax = 285 nm, a quantidade de florizina do liofilizado, bem como a sua proporção no liofilizado, foram calculados (Tabela 1). Além disso, a diminuição do conteúdo de quercetina e dos seus derivados durante o processo foi monitorado por CLUE-DAD/EM a À_max = 37 0 nm.

Tabela 1: Enriquecimento de florizina durante o processo (valores médios das quadruplicates)

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Descrição da amostra	Quantidade do extrato inicial (g)	Concentração de Florizina no extrato (g/L)	mg de Floridzina / 50 mL de extrato	Conteúdo de Florizina do extrato (%)
Após extração	0,5011	0, 93	46, 6	9,3
Após adição de NaOH	0,5011	0,86	43,3	8, 6
Após oxidação	0,5011	0,76	38,0	7,6

Após a liof ilização, o peso do extrato (média de 4 experimentos) foi 256 mg. O liofilizado continha 14,9% de peso de florizina, e 203 mg de compostos não-Florizina.

Exemplo 2: Enriquecimento de dihidrochalconas, 5 especialmente da florizina, a partir de um extrato de polifenol.

Nesta experiência, quantidades de 0,5 g (± 0,0025 g) de extrato de polifenóis (Herbstreith & Fox; Neuenbürg, DE) foram agitados com 50 ml de isopropanol em frascos de vidro 10 de 100 ml com tampa de rosca por 30 minutos a 300 rpm (5.000 Hz) em um banho de água, e as amostras foram expostas a ultrasons durante os 30 segundos iniciais. Todas as experiências foram realizadas em quadruplicate.

Para análises de CLUE-DAD/EM, alíquotas de 2 ml foram 15 centrifugadas (3 minutos a 13,2000 rpm (0,2200 Hz)) e subsequentemente diluídas 1:6 (v:v) com metanol/água (1:1, v:v). O remanescente foi ajustado para um valor de pH entre 10,50 e 10,98 por adição de 1,1 ml de NaOH 1M, e, subsequentemente, de alíquotas 2 ml foram retiradas para

11/12 análise de CLUE-DAD/EM. Em seguida, os extratos básicos foram oxidados durante 15 minutos por borbulhamento de ar com um fluxo de 1,3 litros/minuto, e os precipitados foram separados por centrifugação (3220 rcf, durante 15 minutos). Os sobrenadantes foram transferidos em frascos volumétricos de 50 ml e ajustados com isopropanol. Alíquotas de 200 μΐ destas soluções foram retiradas para análise de CLUE-DAD/EM. Além disso, o isopropanol foi removido utilizando um rotoevaporador a 30°C, e o resíduo foi quantificado gravimetricamente.

Além disso, todas as amostras foram liofilizadas. Para este fim, 5 mL de água foram adicionados a amostra seca por roto-evaporação para dissolvê-la antes do seu congelamento, em uma mistura de isopropanol/gelo seco, seguida por liofilizaçâo.

Com base no conteúdo de florizina dos extratos de isopropanol antes e após a oxidação, quantificados por CLUE-DAD/EM a Ã_max = 285 nm, a quantidade de florizina do liofilizado, bem como a sua proporção, foram calculados (Tabela 1). Além disso, a redução do conteúdo de quercetina e dos seus derivados durante o processo foi monitorado por CLUE-DAD/EM a Ã_max = 37 0 nm.

Quantidade de quercetina e seus derivados no extrato seco de polifenol: 10 mg.

Quantidade de quercetina e seus derivados no produto purificado: menos do que 0,2 mg.

Tabela 2: Enriquecimento de Florizina durante o processo (valores médios das quadruplicatas)

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Descrição da amostra	Quantidade do extrato inicial (g)	Concentração de Florizina no extrato (g/L)	mg de Floridzina / 50 mL de extrato	Conteúdo de Florizina do extrato (%)
Após extração	0,5012	1,05	52,4	10,5
Após adição de NaOH	0,5012	0, 63	31,4	6, 3
Após oxidação	0,5012	0, 55	27, 4	5, 5

Após a oxidação e liofilização, o peso do extrato (média dos 4 experimentos) foi 111,7 mg. 0 liofilizado continha 24,5% em peso de floridzina.

Claims

1. Processo para a preparação de um extrato enriquecido em dihidrochalconas e seus derivados, CARACTERIZADO pelo fato de que os derivados são selecionados de: floridzina, floretina, floretina-2'-O-p-Dxilopiranosil-(1-6)-e-D-glucopiranósido, e outros glicosídeos de floretina, o referido processo compreendendo os passos de:

(a) extração de um extrato seco de polifenóis com um solvente de grau alimentar, (b) alcalinização do extrato a partir de (a), (c) oxidação da solução resultante de (b), (d) filtração ou centrifugação da mistura de (c), (e) opcionalmente, evaporação da solução resultante de (d) para remover o solvente residual, e solubilização do material seco em água, (f) secagem do extrato resultante.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o extrato seco de polifenol é derivado de processamento industrial de maçã.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o extrato seco de polifenol é derivado a partir do processo de produção de pectina de maçã.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o passo (a) é realizado com um solvente de grau alimentar puro, com água, ou com uma mistura de água e solvente.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o solvente é selecionado a

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2/3 partir de: propano, butano, pentano, hexano, ciclohexano, heptano, metanol, etanol, butano-1-ol, butano-2-ol, 3metil-1-butanol, propano-1-ol, 2-metil-1-propanol, isopropanol, 1-pentanol, acetato de metila, acetato de etila, formato de etila, acetato de butila, acetato de isobutila, acetato de propila, acetato de isopropila, acetona, etilmetilcetona, metilisobutilcetona, diclorometano, éter etílico, éter dietílico, éter tercbutilmetílico, 1,1,1,2-tetrafluoretano, anisola, cumeno.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o solvente utilizado no passo (a) é selecionado a partir de: metanol, etanol, e isopropanol.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que no passo (a) a proporção do solvente para o extrato seco de polifenol está compreendida entre 500/1 e 10/1 litro/kg.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a alcalinização do passo (b) é realizada por adição de uma

base até o pH estar compreendido entre pH 7 e pH 14. 9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o

passo de oxidação (c) é realizado borbulhando ar atmosférico para dentro da solução.

10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que no passo (c) uma proteína é adicionada à solução de oxidação como um agente de refinamento, em que a proteína está carregada positivamente ao pH da solução de oxidação.

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11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que no passo (c) uma proteína rica em lisina e/ou cisteína é adicionada à solução de oxidação.

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12. Processo, de acordo com a reivindicação 10 ou 11,

CARACTERIZADO pelo fato de que no passo (c) o pH da solução oxidada é ajustado ao ponto isoelétrico da proteína.

13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de o passo 10 de secagem (f) ser realizado por secagem por pulverização.