BR112013016204B1

BR112013016204B1 - composição, uso da mesma, processo para a fabricação de um emulsificante estável, e, processo para a fabricação de uma bebida

Info

Publication number: BR112013016204B1
Application number: BR112013016204A
Authority: BR
Inventors: Yin Baoru; H Leuenberger Bruno; Vidoni Olivia; Yao Ping; Deng Wei
Original assignee: Dsm Ip Assets Bv
Priority date: 2010-12-23
Filing date: 2011-12-14
Publication date: 2020-02-04
Also published as: DK2654457T3; ES2711621T3; EP2654457B1; JP2014506126A; KR102022126B1; EP2654457A1; KR20140017535A; JP6061201B2; WO2012084624A1; BR112013016204A2; WO2012084624A9; CN103269605A

Abstract

composição, uso da mesma, processo para a fabricação de um emulsificante estável, e, processo para a fabricação de uma bebida a presente invenção refere-se a composições que compreendem a) 0,1 a 70% em peso com base na composição de um ou mais ingredientes ativos solúveis em gordura; b) uma ou mais proteínas vegetais escolhidas a partir do grupo de proteínas adequadas para aplicação alimentícia; e c) um ou mais polissacarídeos solúveis de soja; em que a soma da quantidade de proteína(s) e da quantidade de polissacarídeo(s) representa 10 a 85% em peso com base na composição em matéria seca e, em que a razão de peso de proteína(s) para polissacarídeo(s) é escolhida como 1:b, com a condição de que b esteja contido entre 0,5 e 15.

Description

COMPOSIÇÃO, USO DA MESMA, PROCESSO PARA A FABRICAÇÃO DE UM EMULSIFICANTE ESTÁVEL, E, PROCESSO PARA A FABRICAÇÃO DE UMA BEBIDA

A presente invenção refere-se a composições que compreendem uma ou mais proteínas vegetais, um ou mais polissacarídeos solúveis de soja e um ou mais ingredientes ativos solúveis em gordura. Essas composições podem ser usadas para o enriquecimento, fortificação e/ou coloração de alimentos, bebidas, ração animal e/ou cosméticos. A presente invenção também se refere à preparação de tais composições. A presente invenção se refere, ainda, a um processo para a fabricação de uma bebida misturando-se as composições com ingredientes de bebidas. A presente invenção também se refere a bebidas obteníveis por meio desse processo.

Composições para enriquecer, fortificar ou colorir os alimentos, bebidas, ração animal ou cosméticos que contêm ingredientes ativos solúveis em gordura, por exemplo, betacaroteno, são conhecidos na técnica. O Beta-Caroteno é um composto corante preferível devido à sua intensa e, para as aplicações mencionadas acima, cor laranja muito agradável. Já que os produtos finais nos quais esses corantes, nutrientes e/ou aditivos são usados geralmente são composições aquosas, tais como bebidas, compostos adicionais têm que ser adicionados para evitar a separação de fases de gordura (óleo) no produto, que tornaria o produto correspondente inaceitável.

Portanto, ingredientes ativos solúveis em gordura são frequentemente combinados com compostos auxiliares, tais como amidos ou gelatina de peixe, a fim de evitar a separação de fase na composição aquosa final. Esses compostos

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2/50 auxiliares, entretanto, frequentemente têm uma influência negativa nas propriedades de coloração e nas propriedades nutricionais dos produtos finais. É desejável, portanto, desenvolver novas composições de ingredientes ativos solúveis em gordura, que contêm compostos auxiliares aperfeiçoados, que têm propriedades muito boas em relação ao sabor, emulsificação, estabilidade de emulsão, capacidade de formação de filme e/ou cor do produto final em que são usadas.

As proteínas têm sido usadas como emulsificantes em produtos alimentícios por muitos anos [E. Dickinson, D.J. McClements, Molecular basis of protein functionality, em: E. Dickinson, D.J. McClements (Eds.), Advances in Food Colloids, Blackie Academic & Professional, Londres, Reino Unido, 1995, páginas 26 a 79]. Entretanto, a capacidade de emulsificação pode ser perdida no ponto isoelétrico ou próximo do mesmo, isto é, em um determinado pH específico de proteína no qual a solubilidade e a carga líquida da proteína particular são mínimas. Além disso, a estabilidade de emulsão diminui devido à triagem da repulsão eletrostática de proteína na presença de alta concentração de sais. A maior parte das proteínas tem um ponto isoelétrico abaixo de pH 7. A maior parte dos alimentos e bebidas são ácidos; portanto a estabilidade de emulsão pobre no ponto isoelétrico limita a aplicabilidade de proteínas na indústria de alimentos e bebidas.

A estabilidade de emulsões de óleo em água que contêm proteína depende fortemente da estrutura e densidade de carga do emulsificante adsorvido na superfície de gotícula de emulsão. As camadas de adsorção de proteínas evitam que a

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3/50 coalescência gota a gota estabilize os filmes de emulsão. Entretanto, emulsões estabilizadas por proteínas são altamente sensíveis aos estresses ambientais como resistência iônica e pH e [Rungnaphar Pongsawatmanit, Thepkunya Harnsilawat, David J. McClements, Colloids e Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects, 287, 59 a 67, 2006]. Quando o pH aquoso se aproxima do ponto isoelétrico de uma proteína e/ou quando a concentração de sal é alta, a repulsão eletrostática das camadas de proteína diminui e, portanto, a precipitação de proteína, coalescência de gotícula de emulsão e formação de creme ocorrem [Eric Dickinson Soft Matter, 2008, 4, 932 a 942].

As proteínas como emulsificantes não funcionam de modo eficaz em valores de pH próximos de seu ponto isoelétrico porque se precipitam [N.G. Diftisa, C.G. Biliaderisb, V.D. Kiosseoglou, Food Hydrocolloids 19 (2005) 1025 a 1031].

A estabilidade de emulsão pode ser aprimorada formandose conjugados de proteína-polissacarídeo produzidos através de ligação covalente [Eric Dickinson Soft Matter, 2008, 4,

932 a 942]. Os conjugados de proteína-polissacarídeo têm propriedades aprimoradas de emulsificação e propriedades de estabilização estérica, especialmente sob condições em que a proteína sozinha tem solubilidade pobre [Eric Dickinson Soft Matter, 2008, 4, 932 a 942].

O aprimoramento de propriedades de emulsificação de proteína de soja mediante a conjugação com polissacarídeo também foi relatado [N. Diftis e V. Kiosseoglou, FoodChemistry, 81, 1, 2003; N. Diftis e V. Kiosseoglou, Food

Hydrocolloids, 20, 787, 2006; N.G. Diftis, et al., Food

Hydrocolloids, 19, 1025, 2005; N. Diftis e V. Kiosseoglou,

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Food Chemistry, 96, 228]. As conjugações de proteínapolissacarídeo podem aprimorar as propriedades de emulsificação de proteínas, especialmente através da redução do tamanho das gotículas de óleo e estabilização de emulsão. Esses conjugados podem ser produzidos por reações do tipo Maillard entre proteína e polissacarídeo ou por outras reações. Xu e Yao, (Langmuir 2009, 25 (17), 9714 a 9720) também descreveram emulsões de óleo em água preparadas a partir de conjugados de proteína de soja-dextrano. Os conjugados são adsorvidos na interface junto com constituintes de proteína não reagida, acentuando as forças de estabilização estérica de gotículas de óleo. Entretanto, a reação do tipo Maillard é um processo demorado que é pouco propício a reações de escala industrial. Portanto, o uso de tais conjugados permanece inadequado em aplicações de alimentos e bebidas.

Portanto, ainda existe necessidade de composições que compreendem ingredientes ativos solúveis em gordura para o enriquecimento, fortificação e/ou coloração de alimentos, bebidas, ração animal, cosméticos ou composições farmacêuticas que não apresentam os problemas mencionados acima.

Portanto, é um objetivo da presente invenção fornecer composições de ingredientes ativos solúveis em gordura que têm as propriedades desejadas conforme indicado acima, por exemplo, propriedades muito boas em relação à clareza óptica e estabilidade de emulsão e/ou uma estabilidade de cor e intensidade de cor aprimorada (sempre que for aplicável). Também é um objetivo da invenção aprimorar o processo para a preparação de composições de ingredientes ativos solúveis

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5/50 em gordura.

Esse objetivo foi resolvido por uma composição que compreende:

a) 0,1 a 70% em peso com base na composição de um ou mais ingredientes ativos solúveis em gordura, preferencialmente 0,1 a 30% em peso;

b) uma ou mais proteínas vegetais escolhidas a partir do grupo de proteínas adequadas para aplicação alimentícia; e

c) um ou mais polissacarídeos solúveis de soja;

em que a soma da quantidade de proteína(s) e da quantidade de polissacarídeo(s) representa 10 a 85% em peso com base na composição em matéria seca, preferencialmente 25 a 85% em peso, mais preferencialmente, 35 a 85% em peso e em que a razão de peso de proteína(s) para polissacarídeo(s) é escolhida como 1:b com a condição de que b esteja contido entre 0,5 e 15.

Conforme usado no presente documento, a expressão ingrediente ativo solúvel em gordura se refere a vitaminas selecionadas a partir do grupo que consiste em vitamina A, D, E, K e derivados das mesmas; ácidos graxos poliinsaturados; ingredientes para a saúde lipofílicos; carotenoides; e substâncias flavorizantes ou de aroma bem como misturas dos mesmos.

Os ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs), que são adequados, de acordo com a presente invenção, são ácidos carboxílicos mono ou poli-insaturados que têm preferencialmente 16 a 24 átomos de carbono e, em particular, 1 a 6 ligações duplas, que têm preferencialmente 4 ou 5 ou 6 ligações duplas.

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Os ácidos graxos insaturados podem pertencer à série n6 e à série n-3. Exemplos preferenciais de ácidos poliinsaturados n-3 são ácido eicosapenta-5,8,11,14,17-enoico e ácido docosahexa-4,7,10, 13,16,19-enoico; exemplos preferenciais de um n-6 ácido poli-insaturado são ácido araquidônico e ácido gama linoleico.

Derivados preferenciais dos ácidos graxos poliinsaturados são seus ésteres, por exemplo, glicerídeos e, em particular, triglicerídeos; com preferência particular os ésteres etílicos. Triglicerídeos de ácidos graxos poliinsaturados n-3 e n-6 são especialmente preferenciais.

Os triglicerídeos podem conter 3 ácidos graxos insaturados uniformes ou 2 ou 3 ácidos graxos insaturados diferentes. Os mesmos também podem conter parcialmente ácidos graxos saturados.

Quando os derivados são triglicerídeos, normalmente três ácidos graxos poli-insaturados n-3 diferentes são esterificados com glicerina. Em uma modalidade preferencial da presente invenção, usam-se triglicerídeos, em que 30% da parte de ácido graxo é de ácidos graxos n-3 e, desses, 25% são ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa. Em uma modalidade preferencial adicional ROPUFA® '30' n-3 Alimentos Óleo (DSM Nutritional Products Ltd, Kaiseraugst, Suíça) disponível comercialmente é usado.

Em outra modalidade preferencial da presente invenção, o éster de PUFA é ROPUFA® 75' n-3 EE. ROPUFA 75' n-3 EE é óleo marinho refinado em forma de éster etílico com um teor mínimo de 72% de éster etílico de ácido graxo n-3. O mesmo é estabilizado com tocoferóis misturados, palmitato de ascorbila, ácido cítrico e contém extrato de alecrim.

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Em outra modalidade preferencial da presente invenção, o éster de PUFA é ROPUFA® '10' n-6 Óleo, um óleo de prímula refinado com um mínimo 9% de ácido gama linoleico que é DLalfa-tocoferol e palmitato de ascorbila.

De acordo com a presente invenção, pode ser vantajoso usar óleos de ocorrência natural (um ou mais componentes) que contêm triglicerídeos de ácidos graxos poli-insaturados, por exemplo, óleos marinhos (óleos de peixe) e/ou óleos vegetais, mas também óleos extraídos de biomassa fermentada ou plantas geneticamente modificadas.

Os óleos preferenciais que compreendem triglicerídeos de ácidos graxos poli-insaturados são óleo de oliva, óleo de semente de girassol, óleo de semente de prímula, óleo de borragem, óleo de semente de uva, óleo de soja, óleo de amendoim, óleo de gérmen de trigo, óleo de semente abóbora, óleo de nozes, óleo de semente de gergelim, óleo de colza (canola), óleo de semente de groselha, óleo de semente de kiwi, óleo a partir de fungos específicos e óleos de peixe.

Exemplos preferenciais para ácidos graxos poliinsaturados são, por exemplo, ácido linoleico, ácido linolênico, ácido araquidônico, ácido docosahexaênico, ácido eicosapentaênico e similares.

De acordo com a presente invenção, ingredientes lipofílicos para a saúde preferenciais são resveratrol; ligústico; ubiquinonas e/ou ubiquinóis (um ou mais componentes) selecionados a partir de coenzima Q 10 (também chamada de CoQ10), coenzima Q 9 e/ou suas formas reduzidas (os ubiquinóis correspondentes); genisteína e/ou ácido alfalipoico.

Os ingredientes ativos solúveis em gordura

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8/50 especialmente preferenciais da invenção são carotenoides, especialmente beta-caroteno, licopeno, luteína, bixina, astaxantina, apocarotenal, beta-apo-8'-carotenal, beta-apo12'-carotenal, cantaxantina, criptoxantina, citranaxantina e zeaxantina. O beta-caroteno tem a máxima preferência.

Em uma modalidade preferencial da invenção, a composição compreende entre 0,1 e 70% em peso, mais preferencialmente entre 0,1 e 30% em peso, mais preferencialmente entre 0,2 e 20% em peso, com a máxima preferência entre 0,5 e 15% em peso de um ou mais ingredientes ativos solúveis em gordura, com base na composição total.

De acordo com a presente invenção, a(s) proteína(s) vegetal(is) preferencial(is) é(são) derivada(s) de soja, lupina (por exemplo, L. albus, L. angustifolius ou variedades dos mesmos), ervilha e/ou batata. As proteínas podem ser isoladas de qualquer parte da planta, incluindo frutos (como, por exemplo, grãos de soja), sementes (incluindo sementes preparadas ou processadas) e similares; ou de farinha integral ou produtos desnatados como pedaços, flocos etc.

Para a composição da presente invenção, são especialmente preferenciais proteína de ervilha e soja, a proteína de soja ainda mais preferencial é a proteína de soja solúvel em ácido (Soyasour 4000K, com um teor de proteína superior ou igual a 60% em peso). Soyasour 4000K tem a máxima preferência, com um teor de proteína superior ou igual a 80% em peso, umidade, inferior ou igual a 7,5% em peso, gordura inferior ou igual a 1,5% em peso, pH 3,6 a 6,4). Isso pode ser obtido a partir de Jilin Fuji Proteína Co. Ltd. A fonte de proteína de ervilha preferencial é de

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Cosucra SA (Warcoing, Bélgica)

A expressão polissacarídeo solúvel de soja, conforme usado no presente documento, se refere a um polissacarídeo solúvel de Soja com um teor superior ou igual a 60% em peso de polissacarídeos. O polissacarídeo solúvel de soja com a máxima preferência é o polissacarídeo solúvel de soja com um teor superior ou igual a 70% em peso de polissacarídeos, menor ou igual a 10% em peso de proteína, menor ou igual a 1% em peso de gordura, menor ou igual a 8% em peso de umidade, menor ou igual a 8% em peso de cinzas e um pH contido entre a 6. Isso pode ser obtido a partir de Fuji Co., Ltd.

É preferível escolher a razão de peso de proteína(s) para polissacarídeo(s) como 1:b, com a condição de que b esteja contido entre 0,5 e 15, com preferência especial b é escolhido a partir da faixa de a partir de 1 a 7, mais preferencialmente a partir de 3 a 7, com a máxima preferência a partir de 4 a 5.

Em uma modalidade especialmente preferencial da presente invenção, emulsificantes de proteína-polissacarídeo solúvel de soja estáveis são formados por aquecimento subsequente da emulsão.

Consequentemente, a invenção também se refere a um processo para a fabricação de uma composição emulsificante, conforme indicado acima, que compreende as etapas seguintes (o processo pode ser executado com o uso dos ingredientes em quantidades conforme especificado no presente documento):

I) suspender a proteína em água;

II) opcionalmente remover proteína não dissolvida da suspensão da etapa I);

III) misturar um ou mais polissacarídeos solúveis de soja em uma

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10/50 razão de peso de proteína(s) para polissacarídeo(s) de a partir de 1:0.5 a 1:15;

IV) ajustar o pH a um valor contido entre 3 e 5 de modo que complexos eletrostáticos de proteína-polissacarídeo sejam formados;

V) adicionar a fase orgânica, que compreende os um ou mais ingredientes ativos solúveis em gordura ao complexo;

VI) homogeneizar a mistura da etapa V) com um processo de emulsificação convencional conhecido pelo indivíduo versado na técnica;

VII) aquecer a emulsão a uma temperatura contida entre 70 a 95 °C, preferencialmente 80 a 90°C por pelo menos 45 minutos, preferencialmente, pelo menos 1 hora;

VIII) opcionalmente secar a emulsão da etapa VII).

De acordo com a presente invenção, as proteínas preferenciais são proteínas vegetais conforme descrito acima.

A etapa de secagem pode ser executada com qualquer processo de secagem convencional conhecido pelo indivíduo versado na técnica, são preferenciais a secagem por aspersão e/ou o processo de captura de pó, em que gotículas de suspensão aspergidas são capturadas em um leito de um absorvente, tal como amido ou silicato de cálcio ou ácido silícico ou carbonato de cálcio ou misturas dos mesmos, e subsequentemente secas.

A emulsão da etapa VII) pode ser usada como tal ou seca para uso posterior.

A homogeneização pode ser realizada com técnicas de emulsificação padrão como ultrassom ou homogeneização de

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11/50 alta pressão (80 MPa a 120 MPa (800 a 1200 bar)).

O ultrassom gera ondas de alta pressão e de baixa pressão alternadas em líquidos, levando à formação e colapso violento de pequenas bolas de vácuo. Esse fenômeno, chamado cavitação, causa jatos de líquido impingente de alta velocidade e forças de cisalhamento de forte hidrodinâmica, combinados com compressão, aceleração, queda de pressão e impacto, causando a desintegração de partículas e dispersão por todo o produto bem como a mistura de reagentes. (Encyclopedia of emulsion technology, 1983, Volume 1 , P.

Walstra, página 57, Ed P. Becher, ISBN: 0-8247-1876-3)

No caso do processo de homogeneização de alta pressão, a mistura que já contém as fases orgânica e aquosa é passada através de uma fenda na válvula de homogeneização; isso cria condições de alta turbulência e cisalhamento, combinados com compressão, aceleração, queda de pressão e impacto, causando a desintegração de partículas e dispersão por todo o produto. O tamanho das partículas depende da pressão de operação usada durante o processo e o tipo de fenda selecionada. (Food and Bio Process Engineering, Dairy Technology, 2002, H.G. Kessler, Ed A. Kessler, ISBN 3-9802378-5-0).

A homogeneização com a máxima preferência para executar a presente invenção é a homogeneização de alta pressão de acordo com (Donsi et al. J. Agric. Food Chem., 2010, 58:

10653 a 10660) em vista da eficácia e alto rendimento dessa tecnologia para produzir nanoemulsões.

A presente invenção também se refere ao complexo de proteína vegetal-polissacarídeo solúvel de soja obtenível por um processo conforme descrito acima e, preferencialmente, em que a proteína vegetal é proteína de

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12/50 soja ou proteína de ervilha.

A presente invenção também se destina ao uso de composições conforme descrito acima para o enriquecimento, fortificação e/ou coloração de alimentos, bebidas, ração animal e/ou cosméticos, preferencialmente para o enriquecimento, fortificação e/ou coloração de bebidas.

Outros aspectos da invenção são alimentos, bebidas, ração animal, cosméticos que contêm uma composição conforme descrito acima.

Bebidas nas quais a forma do produto da presente invenção pode ser usada como um corante ou um ingrediente aditivo podem ser bebidas carbonatadas, por exemplo, águas gaseificadas aromatizadas, refrigerantes ou bebidas minerais, bem como bebidas não carbonatadas, por exemplo, águas aromatizadas, sucos de frutas, ponches de frutas e formas concentradas dessas bebidas. As mesmas podem ser à base de frutas naturais ou sucos vegetais ou sabores artificiais. Também estão incluídas bebidas alcoólicas e pós de bebida instantânea. Além disso, bebidas que contêm açúcar, bebidas dietéticas com adoçantes não calóricos e artificiais também estão incluídas.

Além disso, produtos lácteos, obtidos a partir de fontes natural ou sintéticas, estão dentro do escopo dos produtos alimentícios em que as formas do produto da presente invenção podem ser usadas como um corante ou como um ingrediente nutricional. Exemplos típicos de tais produtos são bebidas de leite, sorvete, queijo, iogurte e similares. Produtos substitutos do leite tais como bebidas de leite de soja e produtos de tofu também estão contidos nessa faixa de aplicação.

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Também estão incluídos doces que contêm as formas do produto da presente invenção como um corante ou como um ingrediente aditivo, tais como produtos de confeitaria, balas, gomas, sobremesas, por exemplo, sorvete, geleias, pudins, pós instantâneos de pudim e similares.

Também estão incluídos cereais, lanches, cookies, massa, sopas e molhos, maionese, molhos de salada e similares que contêm as formas do produto da presente invenção como um corante ou um ingrediente nutricional. Além disso, preparações de frutas usadas para produtos lácteos e cereais também estão incluídos.

A concentração final dos um ou mais ingredientes ativos solúveis em gordura, carotenoides preferenciais, especialmente beta-caroteno, que é adicionado por meio das composições da presente invenção aos produtos alimentícios podem preferencialmente ser a partir de 0,1 a 50 ppm, particularmente a partir de 1 a 30 ppm, mais preferencialmente 3 a 20 ppm, por exemplo, cerca de 6 ppm, com base no peso total das composições alimentícias e dependendo do produto alimentício particular a ser colorido ou fortificado e do grau pretendido de coloração ou fortificação.

As composições alimentícias desta invenção são preferencialmente obtidos adicionando-se a um produto alimentício o ingrediente ativo solúvel em gordura na forma de uma composição desta invenção. Para a coloração ou fortificação de um produto alimentício ou farmacêutico desta invenção, uma composição pode ser usada de acordo com métodos por si sós conhecidos para a aplicação de formas de produto sólido dispersível em água.

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Em geral, a composição pode ser adicionada tanto quanto uma solução mãe aquosa, uma mistura de pó seco ou uma prémescla com outros ingredientes alimentícios adequados de acordo com a aplicação específica. Misturas podem ser feitas, por exemplo, com o uso de um mesclador de pó seco, um misturador de baixo cisalhamento, um homogeneizador de alta pressão ou um misturador de alto cisalhamento dependendo da formulação da aplicação final. Conforme estará prontamente claro, tais aspectos técnicos estão dentro do conhecimento do especialista.

A invenção também se refere a um processo para a fabricação de uma bebida que compreende as etapas de homogeneizar a Composição, de acordo com a presente invenção e misturar 1 a 50 ppm com base no teor solúvel em gordura, preferencialmente 5 ppm da emulsão com outros ingredientes usuais de bebidas.

Além disso, a presente invenção se refere a bebidas obteníveis pelo processo para a fabricação de uma bebida conforme descrito acima.

Breve descrição das figuras:

A Figura	1	mostra	o resultado de DLS	em	tempo real
(espalhamento	de	luz dinâmico) de emulsões digeridas por 170
minutos.
A Figura	2	mostra	(A) o potencial ζ	de	solução de

proteína de ervilha e sobrenadante como uma função de pH. (B) o potencial ζ de proteína de ervilha individual e soluções de polissacarídeo de soja como uma função de pH.

A	Figura	3	mostra	os	espectros	visíveis	da	emulsão	de
β-caroteno antes	e após	a	adição de	FeCIa.
A	Figura	4	mostra	os	espectros	visíveis	da	emulsão	de

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15/50 β-caroteno antes e após a adição de FeCIa. A emulsão foi digerida por tipsina e pectinase.

A presente invenção é ilustrada adicionalmente pelos exemplos a seguir, que não se destinam a ser limitadores.

Exemplos

Exemplo 1: Produção de uma emulsão estável com proteína de soja/polissacarídeo solúvel de soja

Materiais

Proteína de soja é de Jilin Fuji Protein Co. Ltd. (Soyasour 4000K, proteína de soja solúvel em ácido; ASSP) com teor de proteína de 88 % (base seca). Tem um ponto isoelétrico em torno de pH 4,7. Polissacarídeos solúveis de soja (SSP) com 70 a 80% em peso de polissacarídeos foram obtidos a partir de Fuji Co., Ltd.

Preparação de emulsão de proteína/polissacarídeo solúvel de soja

A preparação dos complexos é realizada in situ em duas etapas: primeiramente, misturar os dois produtos (ASSP e

SSP) antes da homogeneização e, então, aquecer a emulsão a 80 °C para fixar a estrutura criada. A proteína de soja solúvel em ácido (ASSP) e o polissacarídeo solúvel de soja (SSP) são misturados em pH 3,25 e agitados por 3 a 4 horas. Adicionou-se, então, óleo de soja à solução de mistura aquosa de ASSP-SSP. A solução resultante foi homogeneizada à temperatura ambiente com um homogeneizador (FJ200-S, Shanghai Specimen Model Co) a 10.000 rpm (166,67 Hz) por 1 minuto e imediatamente homogeneizada a 80 MPa (800 bar) por 2,5 minutos. (AH100D, ATS engineering Inc). Finalmente, a emulsão foi aquecida a 80 °C por 1 hora.

Medição de Tamanho Partícula

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Amostras de emulsão recém-diluídas com o mesmo pH e concentração de NaCl foram usadas para cada medição de espalhamento de luz dinâmico (DLS). As medições foram executadas em um Autocalibrador Malvern 4700 (Malvern Instruments, Worcs, Reino Unido) equipado com um correlacionador de tempo digital multi-τ (Malvern PCS7132) e um laser de estado sólido (Compass 315M-100, Coherent Inc.; potência de saída ~ 100 mW, λ = 532 nm). As medições foram realizadas a 25 °C e a um ângulo de espalhamento fixo de 90°. As funções de correlação de tempo medidas foram analisadas por um Programa Automático equipado com o correlacionador. O tamanho de partícula (diâmetro hidrodinâmico médio z, Dh) foi obtido por análise de modo automático. Dois lotes de amostras foram medidos e os dados médios foram relatados.

Exemplo 2: Estabilidade da emulsão em alta concentração de sal

A proteína de soja ASSP e o polissacarídeo solúvel de soja SSP foram misturados em pH 3,25. A condição de homogeneização é conforme a seguir: concentração de proteína de 5 mg/ml, razão de peso de proteína para polissacarídeos 1:5, 10% de fração de volume de óleo, 80 MPa (800 bar) de homogeneização por 2,5 minutos, seguidos por um processo de aquecimento ou não. Após o armazenamento de um dia para o outro a 4 °C, o pH das emulsões resultantes foi ajustado a

5,0 ou 6,0 e adicionou-se NaCl, então, as emulsões foram mantidas a 4 °C para se investigar a estabilidade a longo prazo. A distribuição de tamanho de gotícula das emulsões foi medida por espalhamento de luz dinâmico (DLS). As amostras de DLS foram preparadas diluindo-se as emulsões com

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17/50 solução aquosa recém-preparada que tem o mesmo valor de pH e a mesma concentração de sal.

Após o processo de aquecimento, as distribuições de tamanho de goticula das emulsões do não se alteraram significativamente em comparação com as emulsões sem aquecimento. Entretanto, suas estabilidades são diferentes conforme mostrado na Tabela 1 e na Tabela 2. As emulsões aquecidas exibem uma estabilidade a longo prazo em pH 5,0 e 6,0 em meio que contém sal.

Tabela 1: Tamanho de partícula de emulsões recémpreparadas/emulsões aquecidas em pH 5 e pH 6 em diferentes concentrações de cloreto de sódio. O experimento foi repetido com dois lotes diferentes identificados como (1) e (2) para avaliar a reprodutibilidade dos dados.

	Tamanho da Paticula, nm
Concentração de NaCl (M)	0,02	0,05	0,1	0,15	0,20
Emulsão a pH 5	(1)	285	301	365	396	406
(2)	284	309	378	403	412
Emulsão aquecida a pH 5	(1)	255	268	292	293	306
(2)	263	267	294	299	307
Emulsão a pH 6	(1)	343	363	435	460	486
(2)	346	372	434	466	489
Emulsão aquecida a pH 6	(1)	286	276	294	297	301
(2)	287	279	298	304	299

Tabela 2:

Tamanho de partícula de emulsões/emulsões aquecidas em pH 5 e pH 6 em diferentes concentrações de cloreto de sódio após 108 dias de armazenamento. O experimento foi repetido com dois lotes diferentes identificados como (1) e (2) para avaliar a reprodutibilidade dos dados. As emulsões não aquecidas em pH 5 e 6 meio que contém NaCl 0,15 e 0,2 M apresentaram formação de creme durante o armazenamento. As emulsões aquecidas tinham

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18/50 aparência homogênea após o armazenamento.

	Tamanho da Paticula, nm
Concentração de NaCI (M)	0,02	0,05	0,1	0,15	0,20
Emulsão a pH 5	(1)	295	329	353	350	628
(2)	301	333	359	387	625
Emulsão aquecida a pH 5	(D	289	291	309	311	322
(2)	284	287	308	311	334
Emulsão a pH 6	(D	383	372	513	702	805
(2)	397	406	547	709	827
Emulsão aquecida a pH 6	(1)	287	301	321	353	344
(2)	285	304	328	351	350

Exemplo 3: Estabilidade da emulsão em pH diferente

As emulsões foram preparadas em pH 3,25, com uma concentração de proteína de 5 mg/ml e uma razão de peso de proteína para polissacarídeos 1:5, 10% de fração de volume de óleo, 80 MPa (800 bar) de homogeneização por 2,5 minutos, aquecimento a 80 °C por 1 hora ou sem aquecimento. Então, o pH das emulsões foi ajustado em valores diferentes e as emulsões foram armazenadas a 4 °C para se investigar a estabilidade. Para as emulsões submetidas a processo de aquecimento, as emulsões tinham o pH homogêneo na faixa de 2 a 8 após 140 e 145 dias de armazenamento. Entretanto, a formação de creme apareceu para as emulsões não aquecidas em meio de pH 7 e 8 após 20 dias de armazenamento; posteriormente, também aconteceu formação de creme para as emulsões não aquecidas em meio de pH 2 e pH 6. A Tabela 3 mostra que os tamanhos aumentam em pH 2 e também aumentam a partir de pH 5 a 8; as emulsões não aquecidas aumentam muito mais do que as emulsões aquecidas antes e após o armazenamento. O resultado mostrado na Tabela 3 ainda confirma que o processo de aquecimento é necessário para aumentar a estabilidade das emulsões preparadas por

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19/50 homogeneização de alta pressão.

Tabela 3: Tamanho de partícula de emulsões em pH diferente de emulsões recém-preparadas e armazenadas por 140 a 145 dias. O experimento foi repetido com dois lotes diferentes identificados como (1) e (2) para avaliar a reprodutibilidade dos dados.

		Tamanho da Paticula, nm
PH	3,25	2	3	4	5	6	7	8
Emulsão Fresca	(1)	238	400	239	239	263	327	457	507
(2)	227	434	230	224	283	338	428	481
Emulsão opós 145 dias de armazenamento	(1)	254	634	262	271	289	425	571	654
Emulsão opós 140 dias de armazenamento	(2)	256	753	248	230	272	412	583	643
Emulsão Fresca aquecida	(1)	245	263	245	239	256	280	314	321
(2)	232	283	236	229	262	284	299	314
Emulsão aquecida após 145 dias de armazenamento	(1)	264	293	266	276	289	312	344	378
Emulsão aquecida após 140 dias de armazenamento	(2)	257	304	243	250	275	312	340	367

Exemplo 4: Tamanho de partícula de emulsões aquecidas recém-preparadas realizadas com proteína de Soja sozinha ou polissacarídeos solúveis de Soja sozinhos em pH diferente.

A estabilidade das emulsões preparadas com proteínas de soja solúveis em ácido individuais (ASSP) e polissacarídeos solúveis de soja individuais (SSP) também foi investigada (vide Tabela 4) em comparação com emulsões de complexo de ASSP/SSP. As emulsões foram preparadas na condição de pH 3,25, concentração de proteína de 5 mg/ml ou concentração de polissacarídeo de 25 mg/ml, 10% de fração de volume de óleo, 80 MPa (800 bar) de homogeneização por 2,5 minutos,

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20/50 aquecimento a 80 °C por 1 hora. Então, o pH das emulsões foi ajustado em valores diferentes e as emulsões foram armazenadas a 4 °C. Para as emulsões de ASSP frescas, a formação de creme apareceu em pH na faixa de 5 a 8. Após 1 semana de armazenamento, a formação de creme apareceu para todas as amostras, exceto para a emulsão de ASSP em pH 3,25. Esse resultado sustenta a conclusão de que as emulsões de complexo de ASSP/SSP são superiores a emulsões de ASSP e SSP individuais.

Tabela 4: Tamanho de partícula de emulsões de SSP ou ASSP recém-preparadas em pH diferente. O experimento foi repetido com dois lotes diferentes identificados como (1) e (2) para avaliar a reprodutibilidade dos dados.

	Tamanho da Partícula, nm
PH	3,25	3	4	5	6	7	8
Emulsão de SSP aquecida	(D	519	630	1024	1088	997	980	834
(2)	544	609	863	975	908	854	817
Emulsão de ASSP aquecida	(D	247	268	313	formação de creme
(2)	254	278	316	formação de creme

Exemplo 5: Influência de pH de complexação de proteina/polissacarideo em homogeneização

A homogeneização foi realizada em valores de pH diferentes para investigar a influência da formação de complexo na estabilidade das emulsões. A condição de homogeneização é conforme a seguir: ajustar soluções de ASSP e SSP para o pH desejado, misturar soluções de ASSP e SSP com o mesmo pH, concentração de proteína de 5 mg/ml, razão de peso de proteína para polissacarídeos 1:5, 10% de fração de volume de óleo, 80 MPa (800 bar) de homogeneização por 3 a 4 minutos. Os resultados mostrados na Tabela 5 e 6 indicam que a homogeneização na faixa de pH de 3 a 4 pode produzir

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21/50 emulsões estáveis. Nessa faixa de pH, ASSP e SSP formam complexos eletrostáticos, indicando que a formação de complexo é essencial para produzir as gotículas com a estrutura de membrana de complexo de ASSP/SSP em interface de óleo em água e uma capa de SSP que estabiliza as gotículas em solução aquosa.

Tabela 5: Resultado de DLS de emulsões frescas homogeneizadas em pH diferente. O experimento foi repetido com dois lotes diferentes identificados como (1) e (2) para avaliar a reprodutibilidade dos dados.

	Homogeneização pH
3	3,25	3,50	3,75	4	5	6	7	8
Tamnho da (1)	224	232	227	236	242	393	-	-	-
Partícula, (nm)	223	224	230	231	232	493	4532	4621	2132

Tabela 6: Resultado de DLS das emulsões mostradas na

Tabela 5 após 2 meses de armazenamento. O experimento foi repetido com dois lotes diferentes identificados como (1) e (2) para avaliar a reprodutibilidade dos dados.

	Homogeneização pH
3	3,25	3,50	3,75	4	5	6	7	8
Tamanhoda Partícula, (nm)	(1)	220	229	223	235	211	Formação de creme	-	-	-
(2)	225	228	227	219	220	formação de creme

Exemplo 6: Digestão de SSP na emulsão com enzima

A emulsão foi preparada em pH 3,25, concentração de proteína de 5 mg/ml, razão de peso de proteína para polissacarídeos 1:5, 10% de fração de volume de óleo, 80 MPa (800 bar) de homogeneização por 2,5 minutos e aquecimento a 80 °C por 1 hora como no exemplo 1. Então, o polissacarídeo de soja na emulsão foi hidrolisado por pectinase. Para monitorar a alteração de tamanho por medição de DLS em tempo

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22/50 real, a hidrólise foi realizada a 25°C e pH 5,0 para reduzir a taxa de hidrólise. Durante a medição de DLS, 3 μΐ de 0,5% de solução de pectinase foram adicionados em uma cuveta de poliestireno que contém emulsão diluída que foi preparada diluindo-se 5 μΐ da emulsão original com 3 ml de solução aquosa de pH 5,0. Então, o tamanho de gotícula foi medido a cada 10 minutos nos primeiros 80 minutos e a cada 15 minutos por mais 90 minutos. Os dados conforme mostrado (Figura 1) revelam que o tamanho de gotícula diminui de 262 nm para 219 nm e estabiliza. A partir da diminuição do valor Dh antes e após a digestão, pode-se estimar que a camada de polissacarídeo das gotículas é de cerca de 22 nm.

Exemplo 7: Solubilidade de proteína de ervilha em solução aquosa

A proteína de ervilha ((Pisane® F9) junto à CosucroSA Bélgica) foi dissolvida em água com uma concentração aparente de 22 mg/ml. A solução foi ajustada para pH 1 a 10 com solução de NaOH ou HCI. Após o equilíbrio de um dia para o outro, as soluções foram centrifugadas a 5.000 rpm (83,34 Hz) ou 7.800 rpm (130,01 Hz) por 30 minutos. Os sobrenadantes foram liofilizados e, então, os pós foram pesados para estimar a solubilidade de proteína de ervilha em pH diferente. Os dados são mostrados na Tabela 7.

Tabela de pH de 1

Solubilidade de proteína de ervilha na faixa

10. A concentração original de proteína de ervilha foi mg/ml.

PH	Concentração de proteína de sobrenadante (mg/ml_)
Centrifugação a 7800 rpm (130,01 Hz)	Centrifugação a 5000 rpm (83,34 Hz)
1	13,2	19_f2
2	13,8	19,8
3	5,0	16,0
4	2,4	2,4
0/2019, pág. &4/66	2,4	2,2

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23/50 ^a O pH original da solução aquosa de proteína é 6,8; o dado representa um valor médio (n = 6).

A Tabela 7 mostra que as concentrações de proteína são cerca de 2 mg/ml em pH 4 e 5, em que é próximo do ponto isoelétrico de proteína de ervilha. Em pH 1 a 3 e 7 a 10, após a centrifugação a 5.000 rpm (83,34 Hz), as concentrações de proteína são de cerca de 40% mais alotas do que aquelas após a centrifugação a 7.800 rpm (130,01 Hz). Esse resultado indica que a maior parte da proteína é de agregados dispersíveis. A solubilidade de proteína de ervilha em pH 3,0 e 4,0 é muito menor do que da proteína de soja solúvel em ácido, que permanece 20 mg/ml após 10.000 rpm (166,67 Hz) a centrifugação em pH 3,0 e 4.0 por 23 mg/ml de solução original.

Preparou-se adicionalmente uma solução de proteína de ervilha de 50 mg/ml, então, alterou-se o pH para 3,0 e 3,25 para investigar a solubilidade. Os dados na Tabela 8 revelam que em pH 3,25, após a centrifugação a 5.000 rpm (83,34 Hz) por 30 minutos, cerca de 67% dos agregados de proteína foram removidos.

Tabela 8: Solubilidade de proteína de ervilha em solução de pH 3,0 e 3,25. A concentração original de proteína foi de mg/ml. A solução de proteína foi ajustada para pH 3,0 ou

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3,25 então a centrifugação por 30 minutos.

pH	Concentração de proteína (mg/mL)
Centrifugação a 7800 rpm (130,01 Hz)	Centrifugação a 5000 rpm (83,34 Hz)
3,0	18,2	19,2
3,25	15,2	16,3

Exemplo 8: Potenciais ζ de solução de proteína de ervilha

Os potenciais ζ de solução de proteína de ervilha antes e após a centrifugação a 5.000 rpm (83,34 Hz) não são significativamente diferentes (Figura 2A) . A Figura 2B mostra os potenciais ζ das soluções de proteína e de polissacarídeo de soja. O potencial ζ zero de proteína de ervilha é de cerca de pH 4,8. A proteína de ervilha e o polissacarídeo de soja portam cargas opostas na faixa de pH de 3,0 a 4,8, nessa faixa de pH, a proteína de ervilha e o polissacarídeo de soja podem formar complexos eletrostáticos.

Exemplo 9: Emulsões de complexo de proteína de ervilha/polissacarídeo de soja preparadas a partir de solução de proteína de ervilha sem centrifugação

A solução mãe de polissacarídeo de pH 3,25 foi diluída com a mesma solução aquosa de pH seguida por 0,5 hora de agitação. Então, adicionou-se a solução mãe de proteína de ervilha de pH 3,25 (sem centrifugação) . A concentração de proteína final na solução misturada foi de 5 mg/ml, a razão de peso de proteína para polissacarídeo (WR) foi de 1:5. Após a solução aquosa misturada ter sido agitada por 3,5 horas, adicionou-se óleo de soja para alcançar uma fração de volume de 10%. A mistura foi pré-emulsifiçada com o uso de

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25/50 um homogeneizador (FJ200-S, Shanghai Specimen Model Co.) a

10.000 rpm (166,67 Hz) por 1 minuto e

foi imediatamente

emulsificada com o uso de um homogeneizador de alta pressão (AH100D, ATS Engineering Inc.) a 85 MPa (85 MPa (850 bar)) por 4 minutos, seguida por um tratamento de aquecimento a 80 °C por 1 hora. Após o armazenamento de um dia para o outro a 4 °C, as emulsões resultantes foram ajustadas a diferentes valores de pH e adicionou-se NaCl. As emulsões que contêm

valor de pH e concentração de NaCl

projetados foram

armazenadas a 4 °C para se investigar a estabilidade. O resultado de espalhamento de luz dinâmico (DLS) das emulsões é mostrado na Tabela 9. Após 26 dias de armazenamento, as emulsões estavam homogêneas. Após armazenamento adicional, as emulsões no meio que contém NaCl 0,2 M apresentaram formação de creme. As emulsões em meio sem sal de pH 5 e 6 apresentaram uma pequena camada de soro no fundo. A camada

de soro é inferior a 10% em comparação

com o volume da

emulsão total após 180 dias de armazenamento.

Tabela 9: Resultado de DLS das emulsões de complexo preparadas em pH 3,25 a partir de proteína de ervilha sem centrifugação no início do experimento e após armazenamento de 26 dias. A emulsão foi aquecida a 80 °C por 1 hora. O experimento foi repetido com dois lotes diferentes identificados como (1) e (2) para avaliar a reprodutibilidade dos dados.

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26/50

Amostra	Intensidade	D_h (nm)	PDI
pH3,25 (emulsificante pH)	(1)	40	284	0,14
(2)	36	280	0,21
pH5	(1)	37	319	0,25
(2)	40	309	0,27
pH6	(1)	38	321	0,26
(2)	43	306	0,23
pH5+0,2M NaCI	(1)	36	312	0,27
(2)	37	325	0,29
pH6+0,2M NaCI	(1)	36	316	0,26
(2)	32	322	0,27

Após 26 dias de armazenamento

Condição de armazenamento	Intensidade	D_h (nm)	PDI
pH3,25 (emulsificante pH)	(1)	55	275	0,13
(2)	52	264	0,10
pH5	(1)	57	320	0,19
(2)	55	315	0,22
pH6	(1)	55	353	0,20
(2)	41	341	0,16
pH5+0,2M NaCI	(1)	33	379	0,22
(2)	32	361	0,22
pH6+0,2M NaCI	(1)	39	414	0,28
(2)	39	380	0,20

Alterou-se a temperatura de aquecimento para 90 °C por 1 hora a fim de tornar os filmes interfaciais de óleo-água mais estáveis. A outra condição de emulsificação é a mesma, conforme descrito acima. Após a emulsificação e aquecimento em pH 3,25, a emulsão foi alterada para pH 4, 5, 6 e adicionou-se NaCI para se investigar a estabilidade. Após 94 dias de armazenamento na faixa de pH de 3,25 a 6, as emulsões tinham aparência homogênea e os tamanhos de gotícula são

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27/50 menores do que 350 nm (Tabela 10). Para as emulsões armazenadas no meio de sal por 94 dias, a formação de creme apareceu. Esse resultado demonstra que as emulsões são estáveis na faixa de pH de 3,25 a 6 que pode ser usado em bebidas sem sal. No estudo a seguir, as emulsões foram aquecidas a 90 °C por 1 h.

Além da emulsificação em pH 3,25, a emulsificação também foi realizada em pH 3,0, 3,5, 3,75 e 4,0. As emulsões resultantes produzidas na faixa de pH de 3,5 a 4,0 não são estáveis por causa da solubilidade inferior da proteína de ervilha nessa faixa de pH. A emulsão produzida em pH 3,0 não é tão estável quanto o pH 3,25.

Tabela 10: Resultado de DLS das emulsões de complexo preparadas em pH 3,25 a partir de proteína de ervilha sem centrifugação. A emulsão foi aquecida a 90 °C por 1 hora. Os resultados são mostrados por material recém-preparado e após 94 dias.

Amostra	Condição de armazenamento	Intensidade	D_h (nm)	PDI
pH 3,25 (emulsificante pH)	Preparado recentemente	58	265	0,15
Após 94 dias	29	257	0,15
pH 4	Preparado recentemente	59	260	0,18
Após 94 dias	25	241	0,16
pH 5	Preparado recentemente	53	273	0,16
Após 94 dias	28	289	0,09
pH 6	Preparado recentemente	58	309	0,18
Após 94 dias	28	335	0,10
pH 4 + 0,2M NaCI	Preparado recentemente	46	286	0,20
Após 94 dias	Formação de creme
pH 5 + 0,2M NaCI	Preparado recentemente	46	313	0,20
Após 94 dias	Formação de creme
pH 6 + 0,2M NaCI	Preparado recentemente	41	320	0,21
Após 94 dias	Formação de creme

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28/50

Exemplo 10: Emulsões de complexo de proteína de ervilha/polissacarideo de soja preparadas a partir de solução de proteína de ervilha centrifugada em pH 3,25

A fim de produzir uma emulsão estável em meio de sal, produziram-se, então, emulsões a partir de solução de proteína que havia sido centrifugada em pH 3,25 para remover agregados indiscerníveis. A concentração de proteína final em solução aquosa é de aproximadamente 4 mg/ml e de polissacarídeo foi 25 mg/ml. A outra condição é a mesma mencionada acima. Os tamanhos de gotícula das emulsões resultantes são mostrados na Tabela 11. As emulsões estavam homogêneas após 87 dias de armazenamento em pH 5 e 6 com e sem NaCl 0,2 Μ; o tamanho de gotícula (Dh) não se altera significativamente após o armazenamento em meios diferentes.

Tabela 11: Resultados de DLS das emulsões de complexo preparadas em pH 3,25 a partir de duas amostras dadas. As amostras foram medidas quando recém-preparadas e após armazenamento de 87 dias.

Amostra	Armazenamento	Amostra 1^a	Amostra 2^b
Intensidade	D_h (nm)	PDI	Intensidade	D_h (nm)	PDI
pH 3,25 (emulsificante PH)	Recente	58±7	260±3	0,12±0,02	47±7	269±0	0,17±0,02
87 dias	35±3	287±1	0,18±0,02	33±2	294±1	0,19±0,01
pH 5	Recente	46±12	258±1	0,16±0,06	54±8	266±5	0,17±0,01
87 dias	33±2	289±9	0,13±0,07	31 ±2	303±6	0,16±0,01
pH 6	Recente	46±13	296±3	0,12±0,01	52±6	300±3	0,14±0,01
87 dias	29±1	290±2	0,22±0,02	31±3	324±9	0,18±0,01
pH5+0,2M NaCl	Recente	38±2	276±0	0,16±0,03	34±0	276±4	0,16±0,02
87 dias	22±0	262±11	0,28±0,02	27±2	277±5	0,17±0,02
pH6+0,2M NaCl	Recente	42±5	278±5	0,17±0,04	38±3	280±5	0,17±0,02
87 dias	21±1	271±16	0,25±0,05	28±0	311±3	0,21±0,01

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29/50 ^a A solução mãe de proteína com uma concentração de 50 mg/ml foi ajustada para pH 3,25, então a centrifugada a 5.000 rpm por (83,34 Hz) 30 minutos.

^b A centrifugação foi executada a 7.800 rpm (130,01 Hz) em vez de 5000 rpm (83,34 Hz).

Exemplo 11: Emulsões de complexo de proteína de ervilha/polissacarídeo de soja preparadas a partir de solução de proteína de ervilha centrifugada em pH 6,8.

A fim de aumentar a taxa de utilização da proteína de ervilha e também obter uma emulsão estável em meio de sal, alterou-se o pH de centrifugação. A solução de proteína de ervilha original tem pH 6,8 e a solução de polissacarídeo de soja original tem pH 5,3. Centrifugou-se a solução de proteína em pH 6,8, nesse pH a taxa de utilização de proteína é de cerca de 73%. Então misturou-se a solução de proteína com a solução de polissacarídeo de soja que tinha pH 5,3 (sem ajuste de pH), ou misturaram-se as mesmas em pH 7,0 (com ajuste de pH). A mistura de proteína/polissacarídeo foi adicionalmente ajustada para pH 3,75. A Tabela 12 mostra que não há precipitados em pH 3,75, indicando que o polissacarídeo pode proteger a de precipitação. A mistura misturada em pH 7,0, depois alterada para pH 3,75 tem tamanho de partícula menor e intensidade maior, indicando uma complexação melhor entre a proteína e o polissacarídeo. Quando se mistura em pH 5,3, os agregados de proteína podem inibir a ligação proteína com o polissacarídeo. As misturas na Tabela 12 foram usadas para produzir emulsões em pH 3,25; o tamanho de gotícula é mostrado na Tabela 13. Já que a solução de complexo de proteína de ervilha/polissacarídeo de soja misturada em pH 7,0 produziu gotículas menores, adotou

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30/50 se a condição a seguir para produzir emulsões no estudo a seguir: uma solução de proteína de ervilha de pH 6,8 foi centrifugada a 5.000 rpm (83,34 Hz) por 30 minutos, o pH do sobrenadante resultante e o pH da solução de polissacarídeo de soja foram ajustados a pH 7,0, respectivamente, seguido pela mistura das soluções de proteína e polissacarídeo em pH 7,0, então alterou-se a mistura para pH de emulsificação.

Tabela 12: Resultados de DLS de solução de complexo em pH 3,75. A solução de proteína foi centrifugada em pH 6,8. As soluções de proteína e polissacarídeo foram misturadas em pH diferente.

Amostra	Concentração de proteína (mg/ml_)^a	Concentração de polissacarídeo (mg/ml_)^a	WR^b	Intensidade	Dh(nm)	PDI
Mistura ajustada^c	5	25	1:5	152112	759157	1,00
Mistura não ajustada^d	139116	1460151	1,00

^a A concentração de amostras de DLS. ^b A razão de peso de proteína para polissacarídeo.

^c As soluções de proteína e polissacarídeo foram ajustadas para pH 7,0 antes da mistura.

^d O pH não estava ajustado antes da mistura.

Tabela 13: Resultados de DLS das emulsões preparadas em pH 3,25 a partir das misturas mostradas na Tabela 12.

pH Emulsionado	Amostra	Intensidade	D_h (nm)	PDI
3,25	Ajustada	29±3	301 ±9	0,20+0,02
Não ajustada	28±2	319±10	0,22±0,05

Investigou-se, adicionalmente, a solução de complexo

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31/50 com razões de peso diferentes de proteína de ervilha para polissacarídeo de soja (WR). Os dados na Tabela 14 sustentam adicionalmente que a complexação pode destruir os agregados de proteína individual e polissacarídeo individual, formando partículas de complexo menores.

Tabela 14: Resultados de DLS de soluções de complexo de proteína, polissacarídeo e proteína/polissacarídeo em pH 3,75. As soluções de proteína e polissacarídeo foram ajustadas para pH 7,0 antes da mistura; então a mistura foi alterada para pH 3,75.

Amostra	Concentração de Proteína (mg/mL)	Concentração de polissacarídeo (mg/mL)	Intensidade	Dh(nm)	PDI
Proteína	5	0	126±3	1122±48	0,52±0,48
polissacarídeo	0	25	30±5	704±2	1,00
WR 2:1	5	2,5	145±12	178±2	0,60±0,01
WR 1:1	5	5	146±16	190±7	0,59±0,08
WR 1:2	5	10	136±21	334±59	0,81 ±0,08
WR 1:3	5	15	130±9	397±42	0,62±0,10
WR 1:4	5	20	127±8	590±129	0,92±0,04
WR 1:5	5	25	121±9	741±137	0,82±0,18
WR 1:6	5	30	134±17	928±110	0,92±0,08

Exemplo 12: Emulsões de complexo de proteína de ervilha/polissacarídeo de soja preparadas a partir de solução de proteína de ervilha centrifugada em pH 6,8. As soluções de proteína e de polissacarídeo de soja foram ajustadas para pH 7,0 antes da mistura.

No estudo a seguir, o procedimento de produção das emulsões é conforme a seguir. A solução aquosa de proteína de ervilha (pH 6,8) foi centrifugada a 5.000 rpm (83,34 Hz) por 30 minutos, as soluções de proteína e de polissacarídeo de soja foram ajustadas para pH 7,0, respectivamente, então

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32/50 foram misturadas e agitadas por 2 horas. A mistura foi adicionalmente ajustada para pH de emulsificação. Após agitação por mais 4 horas, adicionou-se óleo de soja a 10% de fração de volume. A mistura foi pré-emulsificada com o uso de um homogeneizador a 10.000 rpm (166, 67 Hz) por 1 minuto e foi imediatamente emulsificada com o uso de um homogeneizador de alta pressão a 80 MPa (800 bar) por 3 minutos, seguida por um tratamento de aquecimento a 90 °C por 1 hora. Após o armazenamento de um dia para o outro a 4 °C, as emulsões resultantes foram ajustadas para diferentes valores de pH e adicionou-se NaCl. As emulsões que contêm valor de pH e concentração de NaCl projetados foram armazenadas a 4 °C para se investigar a estabilidade.

(1) Influência de pH de emulsificação

As emulsões complexas foram produzidas na faixa de pH de 2,5 a 7. Os resultados de DLS (Tabela 15) indicam que as emulsões produzidas na faixa de pH de 3,5 a 4,25 são estáveis em meios de pH 5 e 6 com NaCl 0,2 M; as emulsões estavam homogêneas após o armazenamento. Na faixa de pH de 3,5 a 4,25, a atração eletrostática é mais forte entre a proteína e o polissacarídeo, conforme mostrado na Figura 2, que beneficia a complexação. No estudo a seguir, usou-se pH 3,75 como o pH de emulsificação.

Tabela 15: Tamanhos de partículas das emulsões de complexo produzidas em pH diferentes. A concentração de proteína foi de 5 mg/ml e a WR foi de 1:5 em solução aquosa.

Medições foram realizadas no material recém-preparado e dependendo dos lotes após armazenamento de 29, 37 ou 52 dias (d).

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Emulsifi cante de pH	Armaze namento	Como preparado	pH 5	pH 6	pH 5 + 0,2M NaCI	pH 6 + 0,2M NaCI
2,50	recente	732131	23721192	2042135	46861373	39951353
3,00	recente	32816	331110	34716	8181109	66212
37d	305	336	293	337	536
52 d	301	288	375	534	463
3,25	recente	299113	298113	324110	465154	442149
37d	265	279	306	337	395
52 d	289	312	363	369	452
3,50	recente	302118	29914	32115	38313	37513

	37d	264	308	300	330	389
52 d	291	308	359	411	429
3,75	recente	292117	295111	31415	33319	346119
37d	253	262	266	268	292
52 d	286	310	367	370	399
4,00	recente	291115	30917	328115	360125	34819
37d	245	270	284	270	318
52 d	300	327	382	403	437
4,25	recente	28813	30011	321+5	35011	35213
37d (1)	268	281	313	345	422
37 d (2)	266	288	337	347	387
4,50	recente	30618	32619	35418	473120	448118
37d (1)	316	320	356	534	613
37 d (2)	303	291	322	501	532
5,00	recente	555113	56616	597113	1156115	95010
29 d (1)	595	523	558	formação de creme
29 d (2)	621	600	501	formação de creme
6,00	recente	Formação de creme	—
7,00	recente

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	37d	264	308	300	330	389
52 d	291	308	359	411	429
3,75	recente	292±17	295±11	314±5	333±9	346±19
37d	253	262	266	268	292
52 d	286	310	367	370	399
4,00	recente	291±15	309±7	328±15	360±25	348±9
37d	245	270	284	270	318
52 d	300	327	382	403	437
4,25	recente	288±3	300±1	321 ±5	350±1	352±3
37d (1)	268	281	313	345	422
37 d (2)	266	288	337	347	387
4,50	recente	306±8	326±9	354±8	473±20	448±18
37d (1)	316	320	356	534	613
37 d (2)	303	291	322	501	532
5,00	recente	555±13	566±6	597±13	1156±15	950±0
29 d (1)	595	523	558	formação de creme
29 d (2)	621	600	501	formação de creme
6,00	recente	Formação de creme
7,00	recente

(2) Influência da razão de peso de proteína de ervilha para polissacarídeo de soja (WR)

Fixar a concentração de proteína a 5 mg/ml e alterar a concentração de polissacarídeo de 2,5 para 30 mg/ml, isto é, alterar a WR de 2:1 para 1:6. A Tabela 16 indica que quando a WR está na faixa de 1:2 a 1:6, o tamanho de gotícula não é influenciado pelo ambiente significativamente, sugerindo que as gotículas de óleo foram cobertas por polissacarídeo suficiente. Escolheu-se a WR de 1:4 e 1:5 para estudo adicional.

Tabela 16: Resultado de DLS das emulsões de complexo produzidas em pH 3,75 com WR diferente. A concentração de proteína foi de 5 mg/ml.

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Amostra	Como preparado (pH3,75)	Ajustado para pH 5
Intensidade	D_h (nm)	PDI	Intensidade	D_h (nm)	PDI
WR2:1	16±2	567±9	0,54±0,01	22±2	624±49	0,38±0,23
WR1:1	34±8	367±27	0,23±0,01	38±2	350±10	0,15±0,10

WR1:2	53±4	292±11	0,12±0,01	48±1	279±3	0,14±0,01
WR1:3	48±8	284±12	0,13±0,03	48±2	282±5	0,14±0,02
WR1:4	48±4	280±13	0,12±0,01	50±4	284±2	0,15±0,07
WR1:5	52±8	288±12	0,15±0,01	52±4	296±4	0,15±0,03
WR1:6	57±3	281±11	0,14±0,05	52±3	298±6	0,14±0,03
Amostra	Ajustado para pH 6	Ajustado para pH 5 + 0,2M NacI
Intensidade	D_h (nm)	Intensidade	Intensidade	D_h (nm)	PDI
WR2:1	19±1	618±24	0 64±0,02	19±3	2816±344	1,00±0
WR1:1	36±1	342±14	0,20±0,08	26±2	1522±689	0,62±0,38
WR1:2	49±1	284±1	0,09±0,07	40±2	358±15	0,13±0,08
WR1:3	51 ±3	301 ±9	0,12±0,05	44±4	331 ±9 J	0,10±0,03
WR1:4	49±1	312±14	0,12±0,06	43±2	326±14	0,12±0,07
WR1:5	46±1	323±6	0,09±0,07	44±2	322±8	0,10±0,08
WR1:6	54±5	329±14	0,12±0,04	45±2	310±10	0,14±0,07
Amostra	Ajustado para pH 6 + 0,2M NaCI
Intensidade	D_h (nm)	PDI
WR2:1	14+1	1538±369	0,70±0,30
WR1:1	26±1	850±251	58±0,42
WR1:2	42±2	354±9	0,13±0,08
WR1:3	40±2	338±13	0,12±0,02
WR1:4	43±0	335±18	0,14±0,05
WR1:5	38±2	331±11	0,15±0,08
WR1:6	45±3	331±15	0,12±0,05

(3) Influência de homogeneização de alta pressão (HPH)

Alterou-se a pressão de homogeneização de 80 MPa para 120 MPa (800 para 1200 bar). Os dados na Tabela 17 demonstram que a pressão não tem influência significativa no tamanho de gotícula e estabilidade das emulsões. No estudo a seguir, fixou-se a condição de HPH a 80 MPa (800 bar) por 3 minutos.

Tabela 17: Resultado de DLS das emulsões de complexo produzidas em pH 3,75 com condição de HPH diferente. A concentração de proteína foi de 5 mg/ml.

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Amostra³	WR	pH3,75 (Como preparado)	Ajustado para pH 5
Intensidade	D_h (nm)	PDI	Intensidade	D_h (nm)	PDI
800-3	1:4	4713	26511	0,1410,03	3818	278113	0,1710,02
1:5	4512	281 ±3	0,1710,03	3018	29513	0,1610,03
1000-3	1:4	52111	27016	0,1610,01	4014	28010	0,1610,02
1:5	5111	27514	0,1210,04	3412	28711	0,1510,05
1200-3	1:4	44112	25811	0,1210,04	4818	26414	0,1610,04
1:5	5612	26613	0,1310,03	38110	27510	0,1610,02
Amostra’	WR	Ajustado para pH 6	Ajustado para pH 5 + 0,2 NaCl
Intensidade	D_h (nm)	PDI	Intensidade	D_h (nm)	PDI
800-3	1:4	4218	28315	0,1410,05	4016	311114	0,2010,02
1:5	2819	31113	0,2110,07	3715	31513	0,1910,02
1000-3	1:4	3615	29912	0,1810,05	3812	30611	0,1610,02
1:5	4017	306113	0,1910,02	4012	30812	0,1210,01
1200-3	1:4	4818	27215	0,1210,03	3715	30217	0,1810,01
1:5	38114	282118	0,1610,02	40110	29212	0,1610,02
Amostra’	WR	Ajustado para pH 6 + 0,2 NaCl
Intensidade	D_h (nm)	PDI
800-3	1:4	4416	314113	0,1810,02
1:5	3818	332110	0,2210,03
1000-3	1:4	4014	31212	0,1910,04
1:5	34 ±2	32112	0,1810,01
1200-3	1:4	4214	298110	0,1410,02
1:5	4211	30510	0,1810,03

^a Amostras preparadas por condições de HPH diferentes. As figuras representam o valor de intensidade de pressão e a duração do processo de HPH. Por exemplo, 800-3 indica que a amostra foi homogeneizada a 80 MPa (800 bar) por 3 minutos.

(4) Influência de tratamento de calor

A emulsão produzida em pH 3,75, 80 MPa (800 bar) por 3 minutos a partir de complexos de WR de 1:4 com uma concentração de proteína de 5 mg/ml foi dividida em 2 partes. Uma foi aquecida a 90 °C por 1 hora, a outra não foi. Então, as emulsões foram alteradas para pH 2 a 8 e adicionou-se NaCl 0,2 M. Os dados na Tabela 18 indicam que as emulsões

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37/50 aquecidas são estáveis contra alterações de pH e concentração de sal. O aquecimento pode induzir à desnaturação de proteína e formar filmes interfaciais de óleo-água irreversíveis compostos por proteína de ervilha e polissacarídeo de soja. Durante o armazenamento em meios diferentes, as emulsões não aquecidas apresentam formação de creme em todos os meios que contêm sal e também formação de creme em meios sem sal de pH 7 e 8. Contrariamente, as emulsões aquecidas são homogêneas em todos os meios com e sem sal. A Tabela 18 também mostra que as emulsões não aquecidas são estáveis na faixa de pH de 3 a 5, as emulsões são homogêneas e os tamanhos de gotícula do não se alteram após o armazenamento. Esse resultado sugere que a emulsão não aquecida pode encapsular compostos bioativos liofílicos sensíveis ao calor e a emulsão pode ser usada em bebidas sem sal.

Tabela 18: Resultados de DLS das emulsões de complexo preparadas em pH 3,75, 80 MPa (800 bar) por 3 minutos a partir de complexos de WR de 1:4 com uma concentração de proteína de 5 mg/ml. O aquecimento foi realizado a 90 °C por 1 hora. Medições foram realizadas no material recémpreparado e após armazenamento de 92 dias.

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	Emulsões sem aquecimento	Emulsões aquecidas
PH Ajustado	Arm aze namento	Intensi dade	D_h(nm)	PDI	Intensi dade	D_h (nm)	PDI
pH2	recente	30±3	390±12	0,30±0,04	30±4	312±12	0,22±0,02
92 dias	Formação de creme	-	-	-
99 dias	-	-	-	41±1	362±3	0,26±0,01
pH3	recente	38±2	271 ±4	0,11 ±0,03	37±5	282±6	0,17±0,02
92 dias	54±1	289±2	0,11±0	-	-	-
99 dias	-	-	-	49±1	280±4	0,15±0,01
pH4	recente	38±4	270±8	0,17±0	38±3	274±4	0,18±0,06
92 dias	50±5	304±6	0,17±0,02	-	-	-
99 dias	-	-	-	49±1	279±1	0,17±0,01
pH5	recente	38±4	280±3	0,16±0,01	36±1	280±8	0,23±0,01
92 dias	44±1	327±14	0,13±0,01	-	-	-
99 dias	-	-	-	50±1	301 ±2	0,20±0
pH6	recente	28±3	364±8	0,27±0,10	37±1	320±25	0,26±0,08
92 dias	Formação de creme	-	-	-
99 dias	-	-	-	45±1	323±1	0,15±0,07

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pH7	recente	24±1	495±41	0,26±0,03	34 ±2	316±14	0,17±0,01
92 dias	Formação de creme	-	-	-
99 dias	-	-	-	50±3	351 ±2	0,21 ±0,02
pH8	recente	22±6	514±26	0,47±0,07	38±1	326±10	0,17±0,02
92 dias	Formação de creme	-	-	-
99 dias	-	-	-	37±3	573±8	0,24±0,05
pH2+0,2 M NaCI	recente	19±0	1036±1 52	1,00±0	24±2	342±3	0,24±0,02
92 dias	Formação de creme	-	-	-
99 dias	-	-	-	38±1	400±42 1	0,18±0,02
pH3+0,2 M NaCI	recente	26±2	342±12	0,20±0,08	28±1	312±6	0,21 ±0
92 dias	Formação de creme	-	-	-
99 dias	-	-	-	34±3	344±31	0,17±0,05
pH4+0,2 M NaCI	recente	30±1	297+1	0,20±0,04	30±0	293±1	0,15±0,01
92 dias	Formação de creme	-	-	-
99 dias	-	-	-	37±1	338±3	0,17±0,01
pH5+0,2 M NaCI	recente	21±2	479±28	0,41 ±0,07	26±0	316±6	0,20±0,05
92 dias	Formação d	e creme	-	-	-
99 dias	-	-	-	35±2	355±1	0,13±0
pH6+0,2 M NaCI	recente	20±2	740±70	0,74±0,26	26±2	320±1	0,25±0,04
92 dias	Formação c	e creme	-	-	-
99 dias	-	-	-	38±2	364±5	0,16±0,04
pH7+0,2 M NaCI	recente	20±0	692±24	0,62±0,04	28±2	323±8	0,20±0,07
92 dias	Formação de creme	-	-	-
99 dias	-	-	-	34 ±0	343±11	0,17±0
pH8+0,2 M NaCI	recente	15±0	680±44	0,96±0,04	29±0	336±2	0,19±0,01
92 dias	Formação de creme	-	-	-
99 dias				Formação de creme

Exemplo 13: Emulsões de complexo de proteína de ervilha/polissacarideo de soja preparadas a partir de solução de proteína de ervilha sem centrifugação. As soluções de proteína e de polissacarídeo de soja foram ajustadas para pH 7,0 antes da mistura.

1) emulsões preparadas a partir da solução de proteína de ervilha sem centrifugação.

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As soluções de proteína e de polissacarídeo de soja foram ajustadas para pH 7,0, respectivamente, então foram misturadas e agitadas por 2 horas. A concentração de proteína foi de 5 mg/ml e a WR foi de 1:4. A mistura foi adicionalmente ajustada para pH de emulsificação. Após agitação por mais 4 horas, adicionou-se óleo de soja a 10% de fração de volume. A mistura foi pré-emulsifiçada com o uso de um homogeneizador a 10.000 rpm (166, 67 Hz) por 1 minuto e foi imediatamente emulsificada com o uso de um homogeneizador de alta pressão a 80 MPa (800 bar) por 4 minutos, seguida por um tratamento de aquecimento a 90 °C por 1 hora. Após o armazenamento de um dia para o outro a 4 °C, as emulsões resultantes foram ajustadas a diferentes valores de pH e adicionou-se NaCl. As emulsões que contêm valor de pH e concentração de NaCl projetados foram armazenadas a 4 °C para se investigar a estabilidade (Tabela 19) . Investigou-se, adicionalmente, a estabilidade das emulsões produzidas em pH 3,5 e 3,75 em meios diferentes (Tabela 20) . Os dados na Tabela 19 e 20 indicam que as emulsões preparadas a partir de solução de proteína de ervilha não centrifugada também são estáveis contra alterações de pH e concentração de sal.

Tabela 19: Tamanho de gotícula das emulsões de complexo preparadas a partir da solução de proteína de ervilha sem centrifugação.

pH de Emulsificação	Como preparado	pH 5	pH 6	pH 5 + 0,2M NaCl	pH 6 + 0.2M NaCl
3,0	261	300	309	381	349
3,25	265	301	306	349	345
3,5	263	294	305	320	305
3,75	236	319	327	328	323
4,0	245	316	320	345	329

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Tabela 20: Resultados de DLS das emulsões de complexo preparadas em pH 3,5 a partir da solução de proteína de ervilha sem centrifugação.

Emulsão aquecida:

Emulsão aquecida recente Após 55 dias de armazenamento

Armazenamento	Intensidade	D_h (nm)	PDI	Intensidade	D„ (nm)	PDI
Como Preparado	32±2	267±6	0,16±0,01	52±2	278±3	0,11±0,01

(pH 3,5)
pH2	28±2	326±7	0,17±0,03	41±1	370±6	0,22±0,02
pH 3	31±1	276±4	0,13±0,01	49±1	279±1	0,16±0,03
pH 4	33±2	250±15	0,16±0,03	48±2	282±1	0,14±0,01
pH 5	31±1	300±11	0,14±0,04	46±1	301 ±3	0,14±0,04
pH 6	31±1	306±3	0,18±0,02	48±6	319±4	0,20±0,01
pH 7	30±0	327±1	0,17±0,02	41 ±4	323±16	0,19±0,01
pH 8	27±5	311 ±7	0,20±0,01	45±4	341 ±6	0,21±0,01
pH 2+0,2M NaCI	27±0	322±4	0,22 ±0,01	29±3	353±13	0,17±0,10
pH 3+0,2M NaCI	29±1	291±0	0,16±0,02	36±1	321±13	0,15±0,01
pH 4+0,2M NaCI	30±3	280±6	0,20±0,03	38±10	298±13	0,11±0,02
pH 5+0,2M NaCI	27±2	300±2	0,16±0,01	37±11	336±16	0,15±0,04
pH 6+0,2M NaCI	29±1	300±1	0,18±0,01	34±7	367±12	0,21±0
pH 7+0,2M NaCI	29±1	309±8	0,20±0,01	31±3	438±11	0,23±0,04
pH 8+0,2M	28+0	307±3	0,17±0,02	36±6	457±18	0,26±0,04

NaCI

Emulsão não aquecida:

Condição de Armazenamento	Emulsão sem aquecimento recente	Após 55 dias de armazenamento
Intensidade	D„ (nm)	PDI	Intensidade Dh (nm)	PDI
Como
preparado	32±0	255±2	0,15±0,01	55±1 287±3	0,14±0,01
(pH 3,5)
pH2	20±2	529±3	0,58 ±0,05	Formação de creme
pH 3	30±2	263±4	0,16±0,04	55±1 289±1	0,13±0,01
pH 4	30±5	250±6	0,17±0,02	54±1 296±4	0,17±0,01
pH 5	27±3	303±6	0,12±0,05	50±0 341±4	0,21±0,02
pH 6	21±3	421±24	0,22 ±0,07	Formação de creme
pH 7	17±3	611±147	0,59±0,29

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pH 8	1512	6681229	0,7510,25
pH 2+0.2M NaCI	1411	9651110	1,010
pH 3+0,2M NaCI	2214	411154	0,2310,05
pH 4+0,2M NaCI	26+2	30416	0,2310,01
pH 5+0,2M NaCI	1413	6041171	0,7110,29
pH 6+0,2M NaCI	14+3	9691400	0,7910,21

pH 7+0,2M

NaCI

--------- Formação de creme pH 8+0,2M

NaCI

2) Emulsão preparada com 20% e 30% de fração de volume de óleo.

A solução de proteína de ervilha sem centrifugação e a solução de polissacarídeo de soja foram ajustadas para pH 7,0, respectivamente, então foram misturadas e agitadas por 2 horas. A concentração de proteína foi de 5 mg/ml e a WR foi de 1:4. A mistura foi adicionalmente ajustada para pH 3,5 e então adicionou-se óleo de soja a 20% e 30% de fração de volume. A mistura foi emulsificada a 80 MPa (800 bar) por 4 minutos, seguido por um tratamento de aquecimento a 90 °C por 1 hora. Os dados na Tabela 21 indicam que o tamanho de gotícula aumenta com o teor de óleo, então, a estabilidade das emulsões diminui com o aumento do teor de óleo.

Tabela 21: Resultados de DLS das emulsões preparadas com 20% e 30% de fração de volume de óleo antes e após 55 dias de armazenamento. As emulsões foram aquecidas a 90 °C por 1 hora.

20% de óleo:

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Amostra		recém preparado	Após 55 dias de armazenamento
Grupo	Intensidade	D_h(nm)	PDI	Intensidade	D_h(nm)	PDI
Como preparado (pH 3,5)	(1)	60	387	0,24	46	424	0.28

»	(2)	61	401	0,24	45	387	0,14
pH 5	(1)	67	412	0,25	43	460	0,17
»	(2)	56	440	0,28	50	428	0,24
pH 6	(1)	66	427	0,28	35	486	0,23
»	(2)	59	446	0,33	52	432	0,22
pH 5 + 0,2 M NaCI	(1)	64	405	0,23	35	556	0,14
»	(2)	65	470	0,27	36	561	0,36
pH 6 + 0,2 M NaCI	(1)	61	462	0,26	32	545	0,19
	(2)	54	488	0,28	30	528	0,28

Óleo de 30%:

Amostra	recém preparado	Após 3 dias armazenado
Intensidade	Dh(nm)	PDI	Intensidade Dh (nm) PDI
As prepared (pH 3,5)	57	576	0,28	Formação de creme
pH 5	53	621	0,29
pH 6	49	644	0,30
pH 5 + 0,2 M NaCI	50	678	0,37
pH 6 + 0,2 M NaCI	42	699	0,41

Exemplo 14: Capacidade de emulsificação e estabilidade de proteína de ervilha individual

Uma solução de proteína de ervilha individual com a concentração de 5 mg/ml foi ajustada a pH 3, 4, 5, 6 e 7, seguido por emulsificação. As emulsões produzidas em pH 4, 5 e 6 apresentaram formação de creme imediatamente após a emulsif icação. Para a emulsão produzida em pH 3 e 7, o tamanho de gotícula é 290 e 358 nm antes do aquecimento, 273 e 398 nm após o aquecimento, respectivamente. As emulsões aquecidas e não aquecidas produzidas em pH 3 e 7 foram alteradas para pH 2 a 8 e adicionou-se NaCI. O resultado de DLS mostrou que os tamanhos de gotícula aumentam agudamente

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44/50 para amostras preparadas frescas (dados não mostrados); a formação de creme apareceu para todas as amostras em uma semana exceto para a emulsão produzida em pH 3,0 sem alteração de pH e adição de sal.

O resultado acima sustenta a conclusão de que as emulsões de complexo de proteína de ervilha/polissacarídeo de soja são superiores às emulsões de proteína de ervilha individual e polissacarídeo de soja individual.

Exemplo 15: Encapsulamento de β-caroteno nas gotículas de emulsão de complexo

Adicionou-se β-caroteno em óleo de soja com uma concentração de 1 mg/ml. The fase oleosa foi aquecida a 70 °C por 2 horas sob atmosfera de nitrogênio para dissolver o β-caroteno. A emulsão foi preparada em pH 3,75, 80 MPa (800 bar) por 4 minuto com 10% de fração de volume de óleo, 5 mg/ml de proteína de ervilha e 20 mg/ml de fase aquosa de polissacarídeo. Após a emulsificação, o β-caroteno foi encapsulado nas gotículas; o β-caroteno foi de 0,1 mg/ml na emulsão. A emulsão resultante foi ajustada a pH diferente para se investigar a estabilidade. Embora todas as emulsões tenham aparência homogênea após 11 dias de armazenamento em pH diferente, o resultado de DLS mostrado na Tabela 22 indica que as emulsões encapsuladas são estáveis na faixa de pH de 3, 4 e 5, em que os tamanhos de gotícula do não se alteram significativamente.

Tabela 22: Resultado de DLS do β-caroteno encapsulado na emulsão. A emulsão foi produzida em pH 3,75 e a concentração de β-caroteno foi de 0,1 mg/ml.

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Amostra	Armazenamento	Intensidade	Dh(nm)	PDI
pH 3,75 (emulsificante pH)	recente	28±2	258±1	0,15±0,03
86 dias	58±1	301 ±4	0,12±0,01
pH 2	recente	24±0	441 ±4	0,27±0,02
86 dias	Formação de creme
pH 3	recente	36±1	272±1	0,18±0,01
86 dias	56±1	296±2	0,14±0,02
pH 4	recente	36±1	265±1	0,18±0,01
86 dias	61±3	310±5	0,16±0,0
pH 5	recente	30±0	285±3	0,09±0,03
86 dias	56±4	334±4	0.23±0.06
pH 6	recente	25+1	365+2	0,19±0,01
86 dias	Formação de creme
pH 7	recente	20±1	614±4	0,38±0,01
86 dias	Formação de creme
pH 8	recente	24±1	551±10	0,38±0,01
86 dias	Formação de creme

Para demonstrar adicionalmente a estabilidade do βcaroteno encapsulado, os espectros visíveis de emulsões de β-caroteno foram medidos antes e após a adição de FeCIa (vide Figura 3) . Para esse experimento, incubou-se o material encapsulado com FeCIa. Uma emulsão foi preparada misturandose 5 μΐ de emulsão de beta-caroteno com 3 ml de água, à qual adicionou-se 20 μΐ de FeCIa a uma concentração de 10 mg/ml. A concentração de β-caroteno final foi de 1,67 x 10 ³ mg/ml. A solução padrão para a medição contém os mesmos componentes com as mesmas concentrações mas sem β-caroteno. Esse experimento mostrou que a banda de absorção característica de emulsão de β-caroteno não se altera após a adição de FeCIa demonstrando que o β-caroteno carregado não pode reagir com FeCIa, confirmando, desse modo, que a emulsão pode proteger o β-caroteno da oxidação durante o armazenamento.

Além disso, a fim de medir a atividade da emulsão de βcaroteno, o β-caroteno foi liberado por digestão de

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46/50 polissacarídeo de soja e proteína de ervilha com o uso de pectinase e tipsina, respectivamente. O processo é conforme a seguir: adicionou-se emulsão de β-caroteno de 5 μΐ em 2,6 ml de pH 8.2. Tampão Tris (20 mM) e 400 μΐ de solução de tipsina preparada dissolvendo-se a tipsina no tampão Tris com concentração de tipsina de 2 mg/ml foi adicionada. A concentração de β-caroteno na mistura foi de 1,67 x 10 ³ mg/ml. Após a medição de espectro visível, adicionou-se 20 μl de FeCI3 10 mg/ml à mistura. Esses resultados (Figura 4) mostram que a banda de absorção característica de β-caroteno não se altera na presença de FeCI3. Então, a mistura foi ajustada a pH 5,0 e 40 μl de solução de pectinase e adicionouse 20 μl de FeCI3 10 mg/ml à mistura. Os espectros visíveis, então, mostraram que a banda de absorção característica de β-caroteno desaparece, demonstrando que o β-caroteno liberado pode reagir com FeCI3. Durante a medição de espectro, a solução padrão contém os mesmos componentes com as mesmas concentrações mas sem β-caroteno. O experimento controle confirmou que na emulsão de β-caroteno, a banda de absorção característica de β-caroteno não se altera na presença de FeCI3, quando se adiciona tipsina ou pectinase apenas.

Exemplo 16: Encapsulação de Vitamina E nas gotículas de emulsão de complexo

Primeiramente usou-se vitamina E pura as a fase oleosa para produzir emulsões. A emulsão foi preparada em pH 3,25, 80 MPa (800 bar) por 3 minutos com 10% de fração de volume de óleo, 5 mg/ml de proteína de ervilha e 20 mg/ml de fase aquosa de polissacarídeo. A emulsão foi aquecida a 90 °C por

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47/50 hora. O resultado de DLS mostrado na Tabela 23 indica que as emulsões não são estáveis em meios de sal.

Tabela 23: Resultado de DLS das emulsões preparadas em pH 3,25. Vitamina E com uma fração de volume de 10% foi usada como fase aquosa.

Amostra	Armazenamento	Intensidade	D_h (nm)	PDI
pH 3,25(emulsificante pH)	recente	67	317	0,16
	37 dias	26	297	0,18
pH 5	recente	55	296	0,13
	37 dias	24	307	0,17
pH 6	recente	44	357	0,10
	37 dias	23	350	0,31
pH 5+0,2M NaCI	recente	33	1827	1,0
	37 dias	Formação de creme
pH 6+2M NaCI	recente	29	1060	1,0
	37 dias	Formação de creme

Considerando a viscosidade de vitamina E, a fase oleosa foi alterada para 40% de vitamina E e 60% de mistura de óleo de soja. A outra condição é a mesma mencionada acima. A emulsão foi produzida em pH 3,75. Os dados na Tabela 24 mostram que os tamanhos de gotícula não são sensíveis às alterações de pH e concentração de sal, sugerindo que as emulsões estarão estáveis nesses meios.

Tabela 24: Resultado de DLS das emulsões preparadas em pH 3,75 com uma fração de volume de óleo de 10%. A fase oleosa foi composta por 40% de vitamina E e 60% de óleo de so j a.

Condição de Armazenamenti	Emulsão aquecida recente	Após 55 dias de armazenamento
Inten j sidade	D_h(nm)	PDI	Inten sidade	D„ (nm)	PDI
Como preparado (pH 3,75)	3010	28411	0,1310	6515	298110	0,1410,01
pH 2	2813	350135	0,2510,02	3817	344±3	0,2210,01
pH 3	3011	28415	0,1710,02	6417	29715	0,1410,02

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pH 4	31±2	279±2	0,20±0,03	64±5	300±5	0,16±0,02
pH 5	32±1	316±16	0,20±0,01	57±8	293±9	0,16±0,02
pH 6	29±0	330±17	0,23±0,06	60±10	378±31	0,28±0,07
pH 7	29±1	342±5	0,26 ±0,01	62±6	342±13	0,21 ±0,03
pH 8	31±1	344±20	0,21±0,02	59±9	380±2	0,23±0,02
pH 2+0,2M NaCl	26±2	364±13	0,34 ±0,06	50±0	415±12	0,23±0,02
pH 3+0,2M NaCl	27±2	329±7	0,23±0,02	51 ±7	398±41	0,25±0,05
pH 4+0,2M NaCl	27±2	292±10	0,21±0,03	60±2	363±13	0,20±0,01
pH 5+0,2M NaCl	28±2	323±2	0,19±0,02	58±1	400±33	0,24±0,01
pH 6+0,2M NaCl	27±3	324±1	0,26±0,02	53±1	363±5	0,20±0,07
pH 7+0,2M NaCl	32±2	317±2	0,25±0,03	Formação de creme
pH 8+0,2M NaCl	32±3	322±3	0,23±0,01

Exemplo 17: Influência da razão de peso de proteína de soja para polissacarídeo de soja (WR) na estabilidade de emulsões de proteína de soja/polissacarídeo de soja.

A Tabela 25 mostra emulsões de proteína de soja/polissacarídeo de soja preparadas a partir de razões de peso diferentes de proteína de soja para polissacarídeo (WR) . Os dados na Tabela 24 revelam que as emulsões preparadas a partir da WR de complexos de 1:2 a 1:6 são estáveis contra alterações de pH e concentração de sal, bem como armazenamento de longo prazo.

Tabela 25: Influência da razão de peso de proteína de soja para polissacarídeo (WR) nos tamanhos de gotícula das emulsões em meios diferentes. As emulsões foram produzidas em pH 3,25. A concentração de proteína foi de 5 mg/ml em solução aquosa e a fração de volume de óleo foi 10%.

Amostra	D_h (nm)
pH 3,25 (emulsifi cante pH)	pH 5	pH 6	pH 5 + 0,2 M NaCl	pH 6 + 0,2 M NaCl
Preparado recete	WR2:1	367 ± 15	379 ± 32	415 ±38	2445 ± 345	2265 ± 489
WR 1:1	302 ±3	343 ± 28	348 ± 28	1184 ± 219	11681285
WR 1:2	265 ± 18	271 ±6	292 ±4	346 ± 81	391 ± 1

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	WR 1:3	255+ 12	275 + 8	289 ±1	320 ± 50	326 + 40
WR 1:4	263 ± 15	289 ±6	302 ±4	315 ±21	325 ± 30
WR 1:5	273 ± 11	298 ± 1	312+4	317 + 11	322 ± 1
WR 1:6	272± 2	326 ±12	342 ± 14	327 ± 11	342 ±8
WR 1:7	297± 2	342 ±2	381 ±2	450 ± 1	498 ±3
Após 45 dias de armazena mento	WR 2:1	390 ± 11	Formação de creme
WR 1:1	305 ±16
WR 1:2	277 ± 18	307 ±6	294+ 19	419±165	409 + 144
WR 1:3	265+ 10	296 ±6	303 ± 28	369±109	336 ± 64
WR 1:4	274 ± 15	300 ±5	307 ± 28	346 ± 61	351 ± 64
WR 1:5	275 + 0	308 ±6	320+ 18	339 + 37	353 + 37
WR 1:6	280 + 4	337 + 12	345 + 16	351 + 26	365 + 25
WR 1:7	304 + 4	Formação de creme

Exemplo 18: Influência da razão de peso de proteína de ervilha para polissacarídeo de soja (WR) na estabilidade de emulsões de proteína de ervilha/polissacarídeo de soja. Usou-se solução de proteína de ervilha sem centrifugação.

As soluções de proteína e de polissacarídeo de soja foram ajustadas para pH 7,0, respectivamente, então foram misturadas e agitadas por 2 horas. A concentração de proteína foi de 5 mg/ml e a WR foi alterada de 1:1 para 1:6. A mistura foi emulsificada em pH 3,5 com 10% de fração de óleo a 80 MPa (800 bar) por 4 minutos e seguida por um tratamento de aquecimento a 90 °C por 1 hora. Os dados na Tabela 26 confirmam que os valores de WR adequados estão na faixa de 1:2 a 1:6.

Tabela 26: Influência da razão de peso de proteína de ervilha para polissacarídeo de soja (WR) no tamanho de gotícula de emulsões de complexo de proteína de ervilha/polissacarídeo de soja preparadas a partir de solução de proteína de ervilha sem centrifugação.

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Preparado recente:

WR	Condiçaõ de armazenamento
	Corno pH 5 pH 6 pH 5+0,2M pH 6+0,2M

preparado	NaCl	NaCl
1:1	258	276	280	638	400
1:2	276	303	316	315	314

1:3	268	297	310	292	297
1:4	274	314	315	291	288
1:5	271	322	315	284	292
1:6	286	326	327	299	305

Após 63 dias armazenado

WR	Condição de armazenamento
Como preparado	pH 5	pH 6	pH 5+0,2M NaCl	pH 6+0,2M NaCl
1:1	244	242	238	Formação de creme
1:2	268	246	288	328	336
1:3	275	274	284	313	317
1:4	281	286	302	324	352
1:5	288	294	301	314	394
1:6	297	305	308	344	393

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende:

a) 0,1 a 70% em peso com base na composição de um ou mais ingrediente(s) ativo(s) solúvel (solúveis) em gordura selecionado(s) a partir do grupo consistindo em ingredientes para a saúde lipofílicos; carotenoides bem como misturas dos mesmos;

b) uma ou mais proteína(s) vegetal (vegetais) selecionada(s) a partir do grupo consistindo em proteína de soja, proteína de lupina, proteína de ervilha e proteína de batata; e

c) um ou mais polissacarídeo(s) solúvel (solúveis) de soja;

em que o(s) ingrediente(s) para a saúde lipofílico(s) (um ou mais compostos) é(são) selecionado(s) a partir do grupo que consiste em resveratrol; ligústico; ubiquinonas e/ou ubiquinóis (um ou mais componentes), coenzima Q 10 preferida, coenzima Q 9 e/ou suas formas reduzidas (os ubiquinóis correspondentes); genisteína e ácido alfalipoico, e em que a soma da quantidade de proteína(s) e da quantidade de polissacarídeo(s) representa 10 a 85% em peso com base na composição em matéria seca e em que a razão de peso de proteína(s) para polissacarídeo(s) é escolhida como 1:b, com a condição de que b esteja contido entre 0,5 e 15.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os carotenoides são selecionados a partir de beta-caroteno, licopeno, luteína, bixina, astaxantina, apocarotenal, beta-apo-8'-carotenal, beta-apo-12'-carotenal, cantaxantina, criptoxantina, citranaxantina e/ou zeaxantina.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as proteínas vegetais são proteína de ervilha ou soja.

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4. Processo para a fabricação de um emulsificante estável, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas a seguir:

I) suspender a proteína em água;

II) opcionalmente remover a proteína não dissolvida da suspensão da etapa I);

III) misturar um ou mais polissacarídeo(s) solúvel (solúveis) de soja em uma razão de peso de proteína(s) para polissacarídeo(s) de a partir de 1:0,5 a 1:15;

IV) ajustar o pH para um valor compreendido entre 3 e 5;

V) adicionar a fase orgânica compreendendo os um ou mais ingrediente(s) ativo(s) solúvel (solúveis) em gordura ao complexo; em que os ingredientes ativos solúvel (solúveis) em gordura é/são selecionados a partir do grupo consistindo em carotenoides, resveratrol; ligústico; ubiquinonas e/ou ubiquinóis (um ou mais componentes), coenzima Q 10 preferida, coenzima Q 9 e/ou suas formas reduzidas (os ubiquinóis correspondentes); genisteína e ácido alfa-lipoico,

VI) homogeneizar a mistura da etapa V) com um processo de emulsificação convencional conhecido pelo indivíduo versado na técnica;

VII) aquecer a emulsão a uma temperatura compreendida entre 70 a 95°C, preferencialmente, 80 a 90°C, por pelo menos 45 minutos, preferencialmente, pelo menos 1 hora;

VIII) opcionalmente secar a emulsão da etapa VII).
5. Uso de uma composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que é para o enriquecimento, fortificação e/ou coloração de alimentos, bebidas, ração animal, cosméticos ou composições farmacêuticas.
6. Processo para a fabricação de uma bebida, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de misturar uma composição conforme definida em qualquer uma das

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3/3 reivindicações 1, 2 ou 3 com ingredientes usuais adicionais de bebidas.