BG63149B1

BG63149B1 - Употреба на флупиртин за предпазване и лечение назаболявания, свързани с увреждане на хематопоетичната клетъчна система

Info

Publication number: BG63149B1
Application number: BG102404A
Authority: BG
Inventors: Gabriela Pergande; Werner Mueller
Original assignee: Asta Medica Aktiengesellschaft
Priority date: 1995-11-07
Filing date: 1998-04-24
Publication date: 2001-05-31
Also published as: BR9611588A; EP0859613B1; UA51682C2; US6034111A; KR100512673B1; NO981898D0; WO1997017072A2; HU225742B1; CA2189705A1; US6034112A; PL186537B1; CZ298115B6; SK58698A3; HUP9901659A2; WO1997017072A3; ATE316789T1; CN1116037C; CZ128398A3; SK284601B6; AU711207B2

Abstract

Флупиртинът или неговите соли намират приложение като лекарствено средство за профилактика и лечение на заболявания, свързани с увреждане на хематопоетичната клетъчна система, например на лимфоцитите. Те могат да се прилагат и при лечението на пациенти, заразени с HIV, както и при заболели от СПИН.

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася до използване на флупиртин или негови соли като лекарствено средство за профилактика и лечение на заболявания, свързани с увреждане на хематопоетичната клетъчна система, например на лимфоцитите.

Предшестващо състояние на техниката

Флупиртинът е известно, въведено централно действащо, неопиатно аналгетично средство.

Той проявява своето аналгетично действие чрез различни от опиат/опиоид - аналгетиците механизми на действие (№ске1, В., ΡοδΙβΓβά, МейЛ. 63 (8ирр1. 3), 19 (1987); 8ге1епу, I., №скеЕ В., ВогЬе, Н.О., Вгипе К., ВгЛ. РЬагтасоЕ 143 89 (1989)). Чрез електрофизиологични изследвания е доказано, че флупиртинът може да въздейства както върху супраспиналното, така и върху спиналното ниво на ноцицептивното събитие (Сапззоп, К.Н., 1ита, I., ЕигЛ.РЬагтаиоЕ 143, 89 (1987); В1еуег, Н., Сапззоп К.Н., Егке1, НЛ., 1игпа, 1., Еиг. 1.РЬагтасоЕ 151, 259 (1988); №ске1, В., А1есНег, А., Роз1£гай МесЕ

I. 63 (5иррЕ 3) 41 (1987)).

Флупиртинът се използва също за лечение и при акутни болезнени състояния, предизвикани от заболявания на двигателния апарат.

Той се прилага успешно и при пациенти с дегенеративни или ревматични заболявания.

Освен добрите аналгетични качества, флупиртинът има и релаксиращи мускулите свойства, така че може да се прилага и при лечението на крампи на мускули при при заболявания, основаващи се на крампи на мускулатурата (ϋΕ 4 022 442).

При изследванията на релаксиращото мускулатурата действие на флупиртин при плъх е установено, че може да се инхибира действието на флупиртин чрез екситаторната аминокиселина Ν-метил-О-аспартат (ΝΜϋΑ). Вследствие на това ΝΜϋΑ - антагонистично действие флупиртинът е подходящ за лечение на заболявания на централната нервна система, чиито посредник е ΝΜϋΑ, като например церебрална исхемия, невродегенеративни заболявания, епилептични пристъпи (ϋΕ 4 327 516).

От химическа гледна точка флупиртин представлява 2-амино-З-етоксикарбониламино-б-(р-флуоро-бензиламино) пиридин.

Синтезът на флупиртин и неговите фармацевтично приложими соли е описана в ΩΕ 1 795 858, ϋΕ 3 133 519 и ϋΕ 3 416 609.

Установено е, че флупиртинът е в състояние да инхибира апоптоничната смъртност на клетките от хематопоетичната клетъчна система, например на лимфоцитите.

Техническа същност на изобретението

С това се създава възможността, флупиртинът да се прилага за лечение на заболявания, свързани с увреждане на хематопоетичната клетъчна система.

Особено важно е това при лечението на заразени с Н1У пациенти или такива, заболели от СПИН.

Примерни изпълнения

Фармакологичните изследвания съгласно изобретението изясняват по-добре новата активност

Фармакологични изследвания

Материали

Флупиртин малеат [2-амино-З-етоксикарбонилами но-6- (р-флуоробензиламино) пиридин-малеат], за получаването на Н1У1-£р120 се използва Н1У-1 вирусния щам НТЬУ 1ΙΙΒ (Ρορονΐο е! аЕ, 1984). Полученият изолиран £р120-препарат е >95% чист, което се доказва чрез полиакриламид-гелелектрофореза (МиеНег е! аЕ, 1988).

Опити за използване на антиретровирусно средство

Методологията за използването на Н1У е описана по-рано (5апп е! аЕ, 1997). Клетки от човешки Т-лимфобластни линии СЕМ (вложена концентрация: 1 χ 10⁵ клетки/т1 се суспендират в средата и се заразяват с Н1У-1-вирус (щам НТЬУ ΙΙΙΒ). За целта се избира 50-кратна от инфекциозната доза от 50% клетъчна култура [ССЮ_Я]. ССЮ_М означава тази инфекциозна доза, при която се заразяват 50% от клетките в милилитър клетъчна суспенсия. Култури от по 1 т1 се инкубират в продължение на 5 дни. 2 Н преди заразяването се прибавя към клетките флупиртин в различни концентрации. Броят на живите клетки се определя при използване на 3- [4,5-диметилтиазол-2-ил] -2,5-дифенилтетразол-бромид [МТТ] колориметричната опитна система (БкиШего е! а1., 1988). Отчитането се осъществява с Е1Л8А - Кеадег, както по-рано е описано (МиеИег е1 а!., 1991). След инкубирането заразените СЕМ-клетки проявяват 2,16, а заразените клетки 0,13 удвояващи нараствания.

Кръвни проби

Проби от човешка периферна кръв се получават от (I) 12 заразени с Н1У-1 хомосексуални мъже (средна възраст: 35 години, интервал на възрастта от 22 до 42 години, както и (II) от 8 здрави, Ηΐν-1-серонегативни и освен това от еднаква рискова група мъже, от приблизително еднаква възрастова група (средна възраст: 30 години; интервал на възрастта от 22 до 42 години). Пациентите се определят съгласно класификацията на “Сеп1ег Гог О1зеа8е Соп1го1 (СОС)”. Изследванията с Н1У-1-серопозитивни пациенти се провеждат с кръвни проби от асимптоматични вирусоносители (СОС: ΑΙ, А2, среден брой на СО4-клетките 407/ μΐ, интервал: от 209 до 698/ μΐ). Никой от пациентите не показва данни за туморни заболявания или симптоматични инфекции и не е бил подложен 10 седмици преди взимането на кръв на имунопотискащо лечение, като например с коротикостероиди.

Клетъчни препарати и тяхното обработване

Мононуклеарни клетки [ΜΝΖ] се получават от хепаринизирана кръв чрез центрофугиране през ПсоП-Нурацие-плътностен-градиент и се обогатяват (ΚοδδοΙ е1 а!., 1990). 0,5 χ 10⁶ клетки се култивират в културална среда при краен обем 500 μΐ, за целта се използва МЕМ-среда, която е обогатена с 10 тМ ΗΕΡΕδ-буфер, 2,6% натриев бикарбонат, 100 и/1 пеницилин, 100 μ^/πιΐ стрептомицин, 10% зародишен телешки серум [ΡΚδ] и 1 тМ глутамат. Където е посочено, веднага след изолирането клетките се третират с химическото вещество.

Индукция на апоптозата с реактивен кислород

Реактивни кислородни радикали се получават при използване на хипоксантин- [ХН] и ксантиноксидаза [ΧΟϋΙ - система (Вгиск е! ак, 1994).

Мононуклеарните клетаки се суспендират за 24 Ь в общ обем 500 μΐ МЕМ среда (както по-горе е описано). Към тази смес се прибавят 0 до 80 ши/ш1 ХОО и 1 тМ НХ. При концентрация 80 ти/т1 ΧΟΏ (δί&ηκ, МиепсЬеп, РК.С) подлежат > 90% от лимфоцитите на апоптотична клетъчна смъртност.

Ако не е доказано друго, за следващите проучвания се използва 10 ти/ш1 от ензима ΧΟϋ и I тМ НХ. При тези условия на инкубиране около 50% от клетките подлежат на апоптоза. Изгодно е, тази степен на апоптоза да се спазва, когато се касае за изпитания, за да се определи дали дадено съединение представлява потенциален инхибитор и/или стимулатор на апоптотична клетъчна смъртност. Флупиртинът се прибавя към клетките 6 Ь преди прибавянето на произвеждащата кислородни радикали система; инкубирането приключва след един ден.

Анализ на клетките посредством протичаща цитометрия

Апоптозата се измерва чрез протичащ цитометър РАСБсап (ВесЮп - Оюкшзоп) при аргон-лазерно възбуждане и при дължина на вълната 488 пт, съгласно публикувания метод (ЗсЬппд е1 ак, 1994). Лимфоцитите се разделят с помощта на оптичен метод. Това се извършва чрез комбиниране на светлинно разсейване напред като мярка за големината на клетките [Р5С] и разсейване под прав ъгъл, като мярка за повърхностното състояние [88С]. За оцветяване на апоптотичните ΜΝΖ-клетки, те се инкубират в продължение на 20 πιΐη при 4°С при отсъствие на светлина с 20 μΐ/πιΐ 7-аминоактиномицин ϋ [7ΑΑϋ] (51£та), разтворен в ΡΒδ. След това клетките могат да се анализират в протичащия цитометър в оцветяващия разтвор. Червената флуоресценция, предизвикана от 7ΑΑϋ, се улавя през филтър с дължина на вълната 650 пт.

7-ΑΑΏ прониква в апоптотичните клетки въз основа на дезинтегрирането на кле3 тъчната мембрана и тогава оцветява ДНК по метода на интеркалациониране. Анализът на данните се извършва чрез ΕΥ8Ι8 II програмата.

Средните канални числа се преизчисляват за среден флуоресцентен интензитет, клетъчна големина и повърхностното състояние.

1п зйи-флуоресцентно маркиране се извършва посредством прибавяне на ΤάΤ, както и маркиране на повърахността.

За дефиниране на определена клетъчна-субпопулация, която е преминала през апоптотична обработка, клетките се третират с терминал-трансферазна система [ΤάΤ]. Използва се методиката на Согсгуса е! а1., (1993) с малки изменения. Клетките в суспензия се промиват два пъти в РВЗ (СИЬсо) и се фиксират в продължение на 10 πιίη при 4°С в 1%-ен параформалдехид (Шедег йе Наеп). След това клетките се промиват два пъти в РВЗ [към който е прибавен 5% АВсерум и 0,5% говежди серумен албумин (В8А) [. По-нататък клетките се правят на пелети и се суспендират отново в 50 1 от 2,5 тМ кобалт-хлориден разтвор, към който са прибавени 0,5 пМ биотин-16-άυΤΡ и 25 и ΤάΤ. Прибавя се буфер от 200 шМ калиев какодилат, 25 шМ трис-НС1 и 0,25 ш£/ш1 В8А; инкубирането се извършва при 37°С в продължение на 30 πιίη, съгласно указанията на производителя (ВоеЬппяег МаппЬеш, МаппЬеип, РКО. След това клетките се промиват два пъти в РВЗ [към който е прибавен 5% АВ-серум и 0,5% говежди серумен албумин (В8А)] и отново се суспендират в 100 μΐ буфериран оцветяващ разтвор, който съдържа 5 μκ/πιΐ флуресцеин-изотиоцианат [Р1ТС] маркиран авидин /чистота за клетъчен анализ/. За едновременно повърхностно маркиране клетките се третират допълнително още с 20 μβ/ιπΙ фикоеритрин-маркирани моноклонални анти-СОЗ-антитела (Вес1оп - Οϊοϊςίпзоп).

Флуоресценцията се определя количествено чрез протичаща цитометрия, както е описано от НаШ^еП (1987).

Резултати

Третиране на Н1У-1 заразени СЕМклетки с флупиртин

СЕМ-клетки се третират предварително в продължение на 2 К с флупиртин и след това остават или незаразени или се заразяват в паралелна проба с Н1У-1.

След 5 дни се отчитат броят на клетките в съответните проби. Както се вижда от фигура 1, концентрацията на клетките се променя както в незаразените, така и в заразените култури без това значително да зависи от третирането с флупиртин (Р > 0,1).

Флупиртин се прибавя към пробите в крайна концентрация между 0,1 и 30 μ®/т1. Концентрацията на клетките при незаразените проби възлиза на 446 880 ±31 020 клетки в щ|, в заразените с Н1У-1 проби 108 420± 6 710 клетки/т1.

Тези резултати показват, че флупиртин не действа токсично на клетките, освен това обаче няма и влияние върху Н1У-1заразата ΐη νϊίτο при използваните условия на инкубиране.

Нагласяне на хипоксантин/ксантиноксидазната система.

Концентрацията на ксантин-оксидазата [ΧΟϋ] се подбира така, че да се образува около 50% апоптотични клетки.

Апоптотичните клетки показват флуоресцентен интензитет от > 10 арбитрарни канални числа. При 0 ти ΧΟϋ само 6,6 ± 2,1% от клетките лежат над тази “си1 οίί” гранична линия от > 10 арбитражни канални числа, т.е. около 6,6% са апоптотични. При увеличаване на концентрацията на ΧΟϋ процентната част от апоптотични клетки се увеличава и достига при 80 ти ΧΟϋ стойност от 93,2 6,8% апоптотични клетки. При 10 ти ΧΟϋ преминават около 50% (точно 54,6 ±6,1) от клетките през един апоптотичен процес.

При отсъствие на ΧΟϋ клетките показват Р5С/83С разпределителен профил, както следва:

- големина на клетките 349 ± 27 (арбитражно канално число) срещу състояние на повърхността 112 ± 15. При ензимна концентрация от 80 ти, големината на клетките намалява и достига до стойност от около 256 ± 22, докато измененията в повърхностното състояние се повишават на 180 ± 29. Такива промени показват характерна апоптоза, основана на морфологични изменения на клетките.

При 10 ти ΧΟϋ клетките показват разпределителен профил, който е прибли4 зително в средата на показаните по-горе крайни стойности. Ако не е казано друго, от ензима се използват 10 ти.

Ефект на флупиртин върху спонтанния апоптосерат при човешки лимфоцити.

Периферни кръвни мононуклеарни клетки (ΜΗΖ) от здрави източници, както и от заразени с Н1У-1 пациенти се изследват с оглед на спонтанна апоптоза. Клетките се анализират един ден след взимането на кръв от опитните лица.

Както се вижда от фигура 2, 6,32 ± 0,82% от мононуклеарните клетки от контролните групи на незаразените опитни лица показват апоптоза, докато в 28,42 ± 7,84% от клетките на заразените с Н1У-1 пациенти протича апоптоза. ΜΗΖ от двете групи се третират в продължение на 24 Н с флупиртин в концентрации от 0,1 до 30 μΐ/тк Както е дадено на фигура 2, скоростта на спонтанната апоптоза на лимфоцитите под влиянието на флупиртин не се променя значително (Р > 0,1). Това се отнася както до клетки от здрави опитни лица, така и при клетки от Н1У-1 заразени пациенти.

Намаляване на индуцирана апоптоза в мононуклеарни клетки чрез флупиртин

ΜΗΖ от здрави опитни лица, както и от Н1У-1 заразени пациенти се третират с ΗΧ/ΧΟϋ - системата (образуване на кислородни радикали) за индуциране на апоптоза. Флупиртин се прибавя към клетъчните проби 6 Ь преди индуктор-експозирането в различни концентрации. Както е показано на фигура 3, флупиртин при концентрации между 0,1 и 3,0 ц§/ш1 предизвиква значително намаляване на апоптотичната клетъчна смъртност (Р < 0,001). При концентрация на флупиртин от 10 μβ/πιΐ защитният ефект е значителен само при пробите с левкоцити от заразени опитни лица. При концентрации от 0,3 до 3,0 μβ/ιηΐ флупиртин защитният ефект на лекарственото средство е найясно изявен и задържа индуцираната апоптоза най-силно.

Намаляване на индуцираната апоптоза при пробите с лимфоцити от здрави опитни лица възлиза на около 40%, а при тези с Н1У-1 заразени пациенти на около 60%.

Апоптозата в лимфоцити се доказва и чрез метода на ДНК-фрагментацията. След инкубиране на клетките с ΗΧ/ΧΟϋ - система се екстрахира ДНК от клетките, разделят се според големината в агарозен гел и след това се пренасят върху ΒίοΙ. ДНК се разпада на стълбообразна шарка от фрагменти от 180 основни чифта и многократно от тях. Такава шарка на фрагментиране е характерна за разрушаване на ДНК, което настъпва при апоптотични процеси (АУуШе, 1980). Клетките, които са третирани с Ιμβ/т! флупиртин, не показват за разлика от тях ДНК-фрагментация.

Налични са представителани ϋοΙ-61οΐ5, които показват ефектът на флупиртин върху клетки, които прекарват както спонтанна, така и индуцирана апоптоза.

За провеждането на тази серия от експерименти апоптозата се индуцира в мононуклеарни клетки чрез НХ/20 пШ ΧΟϋ-система. При тези условия, в отсъствие на флупиртин, стават 64,2 ± 7,9% от клетките апоптотични.

Ако, обаче, тези клетки се третират в продължение на 24 Ь с флупиртин, тогава частта на апоптотични клетки значително намалява на 18,3 ± 5,8%.

Тези резултати еднозначно показват, че флупиртин е многообещаващо лекарствено средство, например за лечение на индуцирана апоптотична клетъчна смъртност на лимфоцити при пациенти заразени със СПИН.

В ϋΕ 08 43 43 27 516 е описана неврозащитната активаност на флупиртин, например при церебрална исхемия, МогЬиз АкНетег, МогЬиз Рагкшзоп, инфекциозно индуцирани невродегенеративни заболявания като СПИН - енцефалопатия или заболяването на ЗакоЬ-СгеиШеЮ.

СПИН-енцефалопатията с напредваща деменция представлява неврологично усложнение на СПИН-заболяването. Като причина за получаването на СПИН-енцефалопатията се счита, между другото, индуцираното от Ηΐν (ер 120) освобождаване на ΝΜϋΑ-агонистично действащи невротоксини, като холинова киселина от заразени макрофаги, които водят в крайна сметка до отмиране на нервните клетки.

СПИН-енцефалопатията и СПИН-заболяването (придобит имунодефицитен синдром) са заболявания засягащи различани системи от органи. При първото заболяване се касае, както вече беше казано, до неврологично усложнение на СПИН-заболяването (апоптоза на нервните клетки), докато второто заболяване представлява “придобита имунна недостатъчност” която се основава на смущение на клетъчната имунна система с изразено намаляване на Т-Хелфер-клетките (апоптоза на една от съставките на хематопоетичната клетъчна система).

Предимство на изобретението е активността на флупиртина, инхибирането на индуцираната апоптоза на клетки на хематопоетичната клетъчна система, например на лимфоцити, тъй като досега не е доказано съществуването на ΝΜϋΑ-рецептори извън централната нервна система. В резултат на това не е било възможно, дори за специалист от областта, от защитата на нервните клетки с флупиртин да се заключи, че ще има защита на клетките на хематопоетичната клетъчна система.

Други заболявания, на които може профилактично и лечебно въз основа на актиавността на флупиртина да се въздейства, са следните:

- индуцирана от лекарства (като цитостатици, кортикостероиди), отровни вещества, лъчи и от други заболявания невропения/лимфоцитопения,

- индуцирана от лекарства или инфекциозно (например Н1У) тромбоцитопения.

Флупиртинът може да се прилага за профилактика и лечение по известен начин в следните формулировки:

таблетки, покрити с филм таблетки, твърди желатинови капсули, меки желатинови капсули, пелети, гранули, супозитории, микрокапсули, водни или маслени суспензии, маслени разтвори, инжекционни разтвори за мускулно приложение, инжекционни разтвори за венозно приложение.

Подходящи соли за получаване на лекарственото средство са всички физиологично поносими соли на флупиртина, например хидрохлорид, малеат, сулфат и глюконат на флупиртина.

Съдържанието на флупиртин в лекарствените средства съгласно изобретението е от 0,1 πΐβ до 3000 πΐβ, за предпочитане от 10 ш£ до 500 гп£. Споменатите единични дози на лекарственото средство могат да се прилагат от 1 до 5 пъти, предимно от 1 до 3 пъти дневно.

Данните за дозировките се отнасят винаги до флупиртин като база. Ако се използват соли на флупиртина, то тогава съответните количества трябва да се преизчислят въз основа на молекулните тегла.

Фармацевтичното и галенично преработване на съединенията от изобретението се извършва по известните стандартни методи. Примерно флупиртин и носителите и/ или спомагателните вещества се смесват чрез бъркане или хомогенизиране, при което се работи при температури предимно между 20 и 80°С, за предпочитане от 20 до 50°С.

Описание на приложените фигури фигура 1 представлява инкубиране на незаразени [0] и заразени с Н1У-1 СЕМ клетки [.] с различни концентрации флупиртин. Дадени са средните стойности от 10 успоредни опита; стандартните отклонения не са по-високи от 10%;

фигура 2 - ефект на флупиртина върху спонтанната апоптоза на лимфоцити, получени от незаразени опитни лица (светли колонки) и заразени с Н1У-1 пациенти (диагонално щриховани колонки). След един ден клетките се анализират чрез протичаща цитометрия. Изследват се лимфоцитите от 12 заразени пациенти и 8 незаразени опитни лица. Дадени са средните стойности и стандартните отклонения;

фигура 3 - дадено е намалението на индуцирана апоптотична смъртност на лимфоцити след третиране с флупиртин. На ΜΝΖ от незаразени опитни лица (светли колонки) и заразени с Н1У-1 пациенти (диагонално щриховани колонки) се предизвиква апоптотична смъртност посредством НХ/ ΧΟϋ-система. Флупиртинът се прибавя към клетките 6 К преди генериращата кислородни радикали система. След един ден клетките се анализират чрез протичаща цитометрия. Дадени са стойностите за общата апоптоза, като от тях са изваждат стойностите за спонтанната апоптоза. С това посочените стойности представляват данните за индуцираната апоптоза. Изследват се лимфоцитите от 12 заразени пациенти и 8 незаразени опитни лица. Дадени са средните стойности и стандартните отклонения.

Claims

Патентни претенции

1. Използване на флупиртин или негови фармацевтично приложими соли за лечение на заболявания, които са свързани с увреждане на хематопоетичната клетъчна система.
2. Използване на флупиртин или негови фармацевтично приложими соли съгласно претенция 1 за лечение на заразени с

Ηΐν пациенти и заболели от СПИН пациенти.
3. Използване съгласно претенция 1, характеризиращо се с това, че флупиртинът 5 или негови соли за получаване на съответните форми на приложение се комбинира с фармацевтично приемливи носители и/или спомагателни вещества.