SK284601B6 - Použitie flurpirtinu na prípravu liečiva na liečenie HIV alebo AIDS - Google Patents

Abstract

Použitie flurpirtinu alebo jeho farmaceuticky použiteľných solí na prípravu liečiva na liečenie pacientov infikovaných HIV alebo chorých na AIDS.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka použitia flurpirtinu alebo jeho farmaceutický použiteľných solí na prípravu liečiva s novou oblasťou aplikácie.

Doterajší stav techniky

Flupirtin je známe zavedené, centrálne pôsobiace analgetikum neopiátového typu.

Analgetické účinky odvodzuje flupirtin od iných mechanizmov pôsobenia ako opiátovo-opoidné analgetiká (Nickel B., Postgrad. Med. J. 63 (dod. 3), str. 19, 1987; Szelenyi I., Nickel B., Borbe H. O., Brune K., Br. J. Phafmacol., 143, str. 89, 1989). Elektrofyziologickými testami sa preukázalo, že flupirtin zasahuje tak na supraspinálnej, ako na spinálnej rovine do nococeptívneho diania (Carisson K. H., Juma I. Eur. J. Pharmacol., 143, str. 89, 1987; Bleyer H., Carisson K. H., Erkel H. J., Juma I. Eur. J. Pharmacol., 151, str. 259, 1988; Nickel B., Aledter A. Postgrad. Med. J., 63 (dod. 3), str. 41, 1987).

Flupirtin sa používa tiež pri akútne bolestivých stavoch vyvolaných ochorením pohybového aparátu alebo reumatickými ochoreniami.

Popri dobrých analgetických vlastnostiach má flupirtin tiež svalové relaxačné účinky, takže sa flupirtin môže aplikovať na ošetrovanie svalového napätia alebo pri ochoreniach spočívajúcich na svalovom napätí (nemecký patentový spis DE 40 22 442).

Pri skúmaní svalovo relaxačného účinku flupirtinu na potkanoch sa tiež zistilo, že účinok flupirtinu sa môže tlmiť exitatomou aminokyselinou N-metyl-D-aspartát (NMDA). Na základe tohto antagonistického účinku NMDA sa flupirtin hodí tiež na ošetrovanie chorôb centrálneho nervového systému, sprostredkovaných NMDA, ako napríklad mozgovej ischémie, neurodegeneratívnych ochorení a epileptických záchvatov (nemecký patentový spis DE 43 27 516).

Z chemického hľadiska je flupirtin 2-amino-3-etoxykarbonylamino-6-(p-fluórbenzylamino)pyridín. Syntéza flupirtinu a jeho farmaceutický vhodných solí je opísaná v nemeckých patentových spisoch DE 17 95 858, DE 31 33 519aDE34 16 609.

S prekvapením sa teraz zistilo, že flupirtin je schopný tlmiť apoptické vymieranie buniek hematopoetického bunkového systému, napríklad lymfocytov.

Tým sa otvára možnosť aplikovať flupirtin na účely liečby ochorení súvisiacich s poškodzovaním hematopoetického bunkového systému.

Za osobitný význam sa pokladá liečba pacientov infikovaných HlV/pacientov s AIDS.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je použitie flurpirtinu alebo jeho farmaceutický použiteľných solí na prípravu liečiva na liečenie pacientov infikovaných HIV alebo chorých na AIDS.

Vynález objasňujú, žiadnym spôsobom však neobmedzujú nasledujúce príklady praktického rozpracovania pomocou priložených obrázkov.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obr. 1 je znázornená inkubácia neinfikovaných (prázdne koliesko) a HIV-1 -infikovaných (plné koliesko) buniek s rôznymi koncentráciami flupirtinu. Sú uvedené stredné hodnoty desiatich paralelných pokusov; odchýlky nepresahujú 10 %. Na osi X je uvedená koncentrácia drogy v pg/ml, na osi y koncentrácia buniek v 10'³.ml.

Na obr. 2 je znázornený účinok flupirtinu na spontánnu apoptózu lymfocytov získaných od zdravých jedincov (prázdne stĺpce) a HIV-1-infikovaných pacientov (plné stĺpce). Po jednom dni boli bunky analyzované prietokovou cytometriou. Skúmali sa lymfocyty dvanástich infikovaných pacientov a ôsmich zdravých jedincov. Udané sú stredné hodnoty a smerodajné odchýlky. Na osi x je uvedená koncentrácia drogy v pg/ml, na osi y spontánna apoptóza v percentách.

Na obr. 3 je zníženie indukovaného apoptického odumierania lymfocytov po ošetrení flupirtinom. NMZ zdravých jedincov (prázdne stĺpce) a HIV-1-infikovaných pacientov (plné stĺpce) boli privedené systémom HX/XOD k apoptickému odumieraniu. Flupirtin sa pridával do buniek 6 hodín pred systémom generujúcim kyslíkový radikál. O deň neskoršie boli bunky analyzované prietokovou cytometriou. Zistili sa hodnoty celkovej apoptózy; od nich sa odrátali hodnoty spontánnej apoptózy. Tým udávajú uvedené hodnoty mieru indukovanej apoptózy. Na osi x je uvedená koncentrácia drogy v pg/ml, na osi y indukovaná apoptóza v percentách. Hviezdička nad stĺpcami znamená p <0,001.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Farmakologické skúšky

Materiál

Flupirtin-maleát [2-amino-3-etoxykarbonylamino-6-(p-fluór-benzylamino)piridinmaleát], na prípravu HIV-1-gpl20 sa použije vírusový kmeň HIV-1 HTLB_mB (Popovic a kol., 1984). Získaný izolovaný prostriedok gpl20 má čistotu vyššiu ako 95 % podľa elektroforézy pri použití polyakrylamidového gélu (Miiller a kol., 1988).

Antiretrovirusová skúšobná násada

Metodológia pre násadu HIV-1 už bola skôr opísaná (Sarin a kol., 1987). V médiu sa suspendujú bunky línie ľudských T-lymfoblastov CEM (koncentrácia 1 x 10⁵ buniek/ml) a infikujú sa vírusom HIV-1 (kmeň HTLVIIIB). Na to sa zvoli 50-násobok 50 % infekčnej dávky do bunkovej kultúry (CCID₅₀). CCID₃₀ je infekčná dávka, pri ktorej infikovaných 50 % buniek v ml bunkovej suspenzie. Jednomililitrové kultúry sa inkubujú 5 dni. Dve hodiny pred infikovaním sa k bunkám pridá flupirtin v rôznych koncentráciách. Počet žijúcich buniek sa stanoví pomocou kolorimetrického testovacieho systému 3-[4,5-dimetyltiazol-2-ylJ-2,5-difenyltetrazolín-bromidu (MTT) (Scudiero a kol., 1988). Vyhodnocuje sa čítačom ELISA, ako to bolo publikované (Múller a kol., 1991). Po inkubácii podstúpili neinfikované bunky CEM 2,15 a infikované bunky 0,13 delenie.

Krvné vzorky

Vzorky ľudskej periférnej krvi sa odoberú (1) od dvanástich homosexuálnych mužov infikovaných HIV-1 (stredný vek 35 rokov, rozsah 22 - 43 rokov) a (2) od ôsmich zdravých HIV-1-séronegatívnych mužov vystave ných inak rovnakému riziku približne rovnakej vekovej skupiny (stredný vek 30 rokov, rozsah 23 až 35 rokov). Pacienti sa zaradia podľa klasifikácie „Centers of Disease Control (CDC)“ (CDC, 1992). Testy s HIV-1-séropozitívnymi pacientmi sa uskutočnia s vzorkami krvi predpokladaných nosičov vírusu (CDC: Al, A2, stredný počet buniek CD4 407/μ1, rozsah: 209 až 698/μ1). Žiadny z pacientov nemá známky nádorového ochorenia, symptomatickej infekcie alebo nebol desať týždňov pred odberom krvi podrobený imunitu potlačujúcemu ošetreniu napríklad kortikosteroidmi.

Príprava buniek a ich ošetrenie

Monoklonálne bunky (MNZ) sa získajú a obohatia z heparinovanej krvi odstredením s gradicntom hustoty FicolHypaque (Rossol a kol., 1990). V kultivačnom médiu sa kultivuje 0,5 x 10^c buniek v konečnom objeme 500 μΐ; ako médium sa použije médium MEM, ktoré bolo obohatené 10 mM tlmivého roztoku HEPES, 2,6 % hydrogenuhličitanu sodného, 100 U/l penicilínu, 100 pg/ml streptomycínu, 10 % zárodočného teľacieho séra (FKS) a 1 mM glutamátu. Kde je to uvedené, boli bunky okamžite po izolácii ošetrené chemickou látkou.

Vyvolanie apoptózy reaktívnym kyslíkom

Reaktívne kyslíkové radikály sa pripravia pri použití systémov hypoxantínoxidázy (HX) a xantínoxidázy (XOD) (Bruckakol., 1994).

MNZ sa suspendujú 24 hodín v celkovom objemu 500 μΐ média MEM (ako je opísané). Táto násada sa pridá k 0 až 80 mU/ml XOD a 1 mM HX. Pri koncentrácii 80 mU/ml XID (Sigma, Munchen, FRG) uhynulo viac ako 90 % lymfocytov apoptickou smrťou.

Pokiaľ to nie je uvedené inak, použije sa v nasledujúcich štúdiách 10 mU/ml enzýmu XOD a 1 mM HX. Za týchto inkubačných podmienok podstúpi asi 50 % buniek apoptózu. Je výhodné tento stupeň apoptózy dodržať, pokiaľ sa má zistiť, či určitá zlúčenina predstavuje potenciálny inhibítor a/alebo stimulátor apoptického usmrtenia buniek. Flupirtin sa bunkám pridáva pred prísadou systému produkujúceho kyselinový radikál; inkubácia sa po jednom dni ukončí.

Analýza buniek pomocou prietokovej cytometrie

Apoptóza sa meria pri budení paprskom argónového laseru v prietokovom cytometri FACScan (Becton-Dickinson) pri vlnovej dĺžke 488 nm opísaným spôsobom (Schmid a kol., 1994). Lymfocyty sa oddelia optickými metódami a tým sa charakterizujú, k tomu dôjde kombináciou dopredného rozptylu svetla ako miery pre veľkosť buniek (FSC) s pravouhlým rozptylom svetla ako miery stavu povrchu (SSC). Na zafarbenie apoptických buniek MNZ sa bunky rozpustia s 20 pg/ml 7-amino-aktinomycinu D (7-AAD) (Sigma) v PBS a inkubujú sa 20 minút pri 4 °C pri vypnutom svetle. Nakoniec sa bunky analyzujú prietokovým cytometrom vo farbiacom roztoku. Červená fluorescencia vyvolaná 7 AAD sa zachytáva filtrom s vlnovou dĺžkou 650 nm. 7-AAD prenikne do apoptických buniek na základe rozkladu bunkovej membrány a v nadväznosti na to zafarbí DNA interkalačným postupom. Analýza údajov prebehne programom LYSIS II. Stredné kanálové čísla sa prerátajú na strednú intenzitu fluorescencie, veľkosť buniek a stav povrchu.

Fluorescenčné značenie in situ pomocou systému TdT a značenie povrchu

Na definovanie určitej subpopulácie buniek, ktorá podstúpila apoptický pochod, sa bunky ošetria systémom Terminál Transferase (TdT). Použije sa spôsob podľa Gorczycy a kol. (1993) s nepatrnými úpravami. Bunky v suspenzii sa dvakrát premyjú v PBS (Gibco) a potom sa fixujú 1 % paraformaldehydom (Riedel a Haen) 10 minút pri teplote 4 °C. Potom sa bunky premyjú dvakrát PBS [do ktorého bolo pridané 5 % séra AB a 0,5 % albumínu hovädzieho séra (BSA)]. Bunky sa potom peletujú a resuspendujú sa v 50 μΐ 2,5 mM roztoku chloridu kobaltu, ktorý bol pridaný do 0,5 nM Biotin-lôdUTP a 25 U TdT. Táto násada sa tlmi 200 mM kakodylátu draselného, 25 mM Tris-HCl a 0,25 g/ml BSA; inkubácia prebieha 30 minút pri teplote 37 °C podľa údajov výrobcu (Boehringer Mannheim, Mannheim, FRG). Bunky sa potom dvakrát premyjú PBS (5 % AB-sérum a 0,50 BSA) a resuspendujú sa v 100 μΙ tlmeného farebného roztoku, ktorý obsahuje 5 pg/ml fluoresceinizo-tiokyanátom (F1TC) značeného avidinu (čistota pre bunkovú analýzu). K súčasnému značeniu povrchu sa bunky dodatočne ošetria 20 pg/ml monoklonálnou protilátkou CD3 značenou phycoretrinom (Becton-Dickinson). Fluorescencia sa kvantiflkuje prietokovou cytometriou, ktorú opísal Halliwell (1987).

Výsledky

Ošetrenie buniek CEM infikovaných HIV-1 flupirtinom

Bunky CEM sa predbežne ošetrujú dve hodiny flupirtinom a zostanú neinfikované alebo sa infikujú HIV-1 v paralelnej násade.

Po piatich dňoch sa bunky v uvedených násadách zrátajú. Ako vyplýva z obr. 1, nezmenila sa koncentrácia buniek tak v neinfikovaných, ako v infikovaných kultúrach v závislosti od ošetrenia flupirtinom podstatne, (p >0,1).

Flupirtin sa pridával do násad v konečných koncentráciách 0,1 až 30 pg/ml. Koncentrácia buniek v neinfikovaných násadách robila 446880 ±31020 buniek/ml, v HIV-1 infikovaných násadách 108420 ±6710 buniek/ml.

Tieto výsledky ukazujú, že flupirtin na bunky nepôsobí toxicky, inak však nepôsobí tiež žiadnym účinkom na infekciu HIV-1 in vitro za použitých inkubačných podmienok.

Nastavenie systému hypoxantínoxidáza/xantínoxidáza

Koncentrácia xantínoxidázy (XID) sa volí tak, aby sa percentuálny podiel apoptických buniek nastavil na približne 50 %.

Apoptické bunky majú intenzitu fluorescencie väčšiu ako 10 arbitrárnych kanálových počtov. Pri 0 mU XOD bolo len 6,6 ±2,1 % nad touto „cut-off hranicou väčšou ako 10 arbitrárnych kanálových počtov, bolo teda 6,6 % apoptických. Pri rastúcej koncentrácii XOD percentuálny podiel apoptických buniek stúpa a dosahuje pri 80 mU XOD hodnoty 93,2 ±6,8 %. Pri 10 mU XOD prechádza apoptickým procesom približne 50 % (presne 54,6 ±6,1) buniek.

V neprítomnosti XOD majú bunky nasledujúci obrazec rozdelenia FSC/SSC:

Veľkosť buniek 349 ±27 (arbitrárny počet kanálov) proti stavu povrchu 112 ±15. Pri koncentrácii enzýmov 80 mU veľkosť buniek klesá a dosahuje hodnoty 256 ±22, zatiaľ čo stupeň stavu povrchu narastá na 180 ±29. Také zmeny naznačujú charakteristickú apoptózu podmienenú morfologickou zmenou buniek. Pri 10 mU XOD majú bunky obrazec rozdelenia, ktorý je približne uprostred týchto prv ukázaných extrémnych hodnôt. Pokiaľ to nie je uvedené inak, nasadzovalo sa 10 mU na enzým.

Vplyv flupirtinu na spontánnu mieru apoptózy pri ľudských lymfocytoch

Vzorky periférnej krvi zdravých jedincov aj pacientov infikovaných HIV-1 sa skúmajú z hľadiska spontánnej apoptózy. Bunky sa analyzujú jeden deň po odbere krvi. Ako vyplýva z obr. 2, majú bunky MNZ kontrolných skupín neinfikovaných jedincov 6,32 ±7,84 % buniek po tomto časovom období apoptózy, zatiaľ čo 28,42 ±7,84 % buniek pacientov infikovaných HIV-1 podstúpi apoptózu. MNZ obidvoch skupín sa ošetrí počas 24 hodín flupirtinom v koncentráciách 0,1 až 30 μ g/ml. Ako ukazuje obr. 2, miera spontánnej apoptózy lymfocytov sa pôsobením flupirtinu významne nemení (p > 0,1). To platí pre bunky tak zdravých jedincov ako HIV-1-infikovaných pacientov.

Znižovanie indukovanej apoptózy v mononukleámych bunkách pôsobením flupirtinu

NMZ zdravých jedincov a HIV-1-infikovaných pacientov sa spracovávajú systémom HX/XOD (vytváranie kyslíkových radikálov) na indukciu apoptózy. Flupirtin sa pridáva bunkovým násadám 6 hodín pred vystavením účinku induktoru v rôznych koncentráciách. Ako ukazuje obr. 3, nespôsobuje flupirtin pri koncentráciách 0,1 až 3,0 pg/ml významné zníženie apoptického zániku buniek (p < 0,001). Pri koncentráciách flupirtinu 10 pg/ml je protektívny účinok ešte len pri skúške s lymfocytmi infikovaných pacientov významný. Pri koncentráciách 0,3 až 3 pg/ml je ochranný účinok liečiva najvýraznejší a tlmí induktívnu apoptózu najsilnejšie.

Zníženie indukovanej apoptózy v násadách s lymfocytmi zdravých jedincov je približne 40 % a pri infikovaných pacientoch približne 60 %.

Apoptóza v lymfocytoch bola tiež preukázaná metódou fragmentácie DNA. Po inkubácii buniek systémom HX/XOD sa DNA z buniek extrahuje, v agarovom géli sa rozdelí podľa veľkosti a prenesie sa na blot.

DNA sa rozpadla na rebríku podobný vzor fragmentov so 180 pármi báz a ich násobkami. Taký vzor fragmentov je charakteristický pre rozrušenie DNA, ku ktorému dochádza pri apoptických procesoch (Wyllie, 1980). Bunky, ktoré boli ošetrené flupirtinom, nemajú na rozdiel od toho žiadnu fragmentáciu DNA.

Reprezentatívne dot-bloty, ktoré ukazujú účinok flupirtinu na bunky, ktoré podstupujú tak spontánnu, ako indukovanú apoptózu, sú rovnako k dispozícii.

Na realizáciu tejto série pokusov bola v MNZ pomocou HX/20 mU systému XOD apoptóza znížená. Za týchto podmienok sa stalo v prítomnosti flupirtinu 64,2 ±7,9 % buniek apoptických.

Ak však boli tieto bunky ošetrované 24 flupirtinom, klesol počet apoptických buniek významne na 18,3 ±5,8 %. Tieto výsledky jasne dokladajú, že flupirtin je nádejné liečivo napríklad na ošetrovanie indukovaného apoptického bunkového odumierania lymfocytov pri pacientoch s AIDS.

V nemeckej zverejnenej prihláške vynálezu číslo DE-OS 43 27 516 je opísaný neuroprotektívny účinok flupirtinu, napríklad pri mozgovej ischémii, Alzheimerovej a Parkinsonovej chorobe, infekčných indukovaných neurodegeneratívnych ochoreniach, ako je AIDS-encefalopatia alebo Jakob-Creuzfeldovo ochorenie.

Indikácia AIDS-encefalopatia s pokročilou demenciou predstavuje neurologickú komplikáciu ochorenia AIDS. Za príčinu pre vznik AIDS-encefalopatie sa okrem iných považuje HIV (gp 120) indukované uvoľňovanie NMDA-agonisticky pôsobiacich neurotoxínov ako je kyselina chinolínová z infikovaných makrofágov, ktoré nakoniec vedie k odumieraniu nervových buniek.

AIDS-encefalopatia a ochorenie AIDS (získaný syndróm imunitnej nedostatočnosti) sú ochorenia postihujúce rôzne systémy orgánov. Pri prvom ochorení ide, ako bolo preukázané, o neurologickú komplikáciu ochorenia AIDS (apoptózu nervových buniek), zatiaľ čo druhé ochorenie predstavuje „získanú imunitnú nedostatočnosť“, ktorá spočíva v poruche bunkového imunitného systému s výrazným zmenšením T-pomocných buniek (apoptóza súčasti hematopoetického bunkového systému).

Objavený účinok flupirtinu, tlmenie indukovanej apoptózy buniek hcmatopoetickcho bunkového systému, napríklad lymfocytov, bol o to prekvapivejší, že existencia receptorov NMDA mimo centrálneho nervového systému nebola dosiaľ preukázaná. V dôsledku toho nebolo tiež pre pracovníkov v odbore možné usudzovať z ochrany nervových buniek flupirtinom na ochranu buniek hematopoetického bunkového systému.

Ako ďalšie ochorenia, ktoré môžu byť profylaktický a terapeuticky ošetrované na základe pôsobenia flupirtinu podľa vynálezu, je možné menovať:

- neutropenie/lymfozytopenie vyvolané liečivami (ako cytostatikami, kortikosteroidmi), jedmi, žiarením a inými chorobami,

- liečivami alebo infekciami (napríklad HIV) vyvolané trombozytopenie.

Flupirtin môže na účely profylaxie a liečby podávaný známym spôsobom vo formách ako sú tablety, tablety potiahnuté filmom, tvrdé želatínové kapsuly, mäkké želatínové kapsuly, pelety, granuláty, dražé, čapíky, mikrokapsuly, vodné alebo olejové suspenzie, olejové roztoky, injekčné roztoky na intramuskulámu aplikáciu, injekčné roztoky na intravenóznu aplikáciu.

Vhodnými soľami na výrobu liečiv sú všetky fyziologicky vhodné soli flupirtinu. Do úvahy prichádzajú napríklad hydrochlorid, maleát, sulfát a glukonát flupirtinu.

Obsah flupirtinu vo farmaceutických prostriedkoch podľa vynálezu je 0,1 mg až 3000 mg, výhodne 10 mg až 500 mg. Jenotlivé dávky liečiv môžu byť podávané denne 1 až 5 x, výhodne 1 až 3 x.

Dávkové údaje sa vťahujú vždy k flupirtinu ako základu. Keď sa použijú soli flupirtinu, musia sa prerátať na molové hmotnosti.

Farmaceutický a galenicky sa so zlúčeninami podľa vynálezu zaobchádza obvyklým postupom, známymi spôsobmi. Napríklad sa flupirtin a nosiče a pomocné látky miešaním dobre zhomogenizujú, pričom sa výhodne pracuje pri teplote 20 až 80 °C výhodne 20 až 50 °C. Skúmali sa lymfocyty dvanástich infikovaných pacientov a ôsmych zdravých jedincov. Udané sú stredné hodnoty a smerodajné odchýlky.

Priemyselná využiteľnosť

Flupirtin alebo jeho soli na výrobu farmaceutických prostriedkov na profylaxiu a terapiu ochorení súvisiacich s poškodzovaním hematopoetického bunkového systému, napríklad lymfocytov, najmä v prípade pacientov infikovaných HIV.

Claims (2)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použitie flurpirtinu alebo jeho farmaceutický použiteľných solí na prípravu liečiva na liečenie pacientov infikovaných Hl V alebo chorých na AIDS.
2. 2. Použitie podľa nároku 1, pri ktorom sa flurpirtin alebo jeho soli kombinujú s farmaceutický vhodnými nosičmi a/alebo pomocnými látkami.