HU225742B1

HU225742B1 - Use of flupirtin for producing pharmaceutical compositions suitable for the prevention and treatment of diseases which are associated with damage to the haemopoietic cell system

Info

Publication number: HU225742B1
Application number: HU9901659A
Authority: HU
Inventors: Werner E G Mueller; Gabriela Dr Pergande
Original assignee: Meda Pharma Gmbh & Co Kg
Priority date: 1995-11-07
Filing date: 1996-10-23
Publication date: 2007-07-30
Also published as: RU2200555C2; NO981898D0; ATE316789T1; DK0859613T3; BG63149B1; TW393317B; CN1116037C; EP0859613A2; HUP9901659A2; NO315074B1; DE59611327D1; HK1016508A1; WO1997017072A3; EP0859613B1; SK58698A3; CA2189705C; AU711207B2; BR9611588A; PL326629A1; CZ298115B6

Description

A találmány tárgyát a flupirtin vagy sóinak, mint gyógyszerhatóanyagnak az alkalmazása képezi, olyan betegségek profilaxisára és gyógyítására alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására, amelyek a hematopoetikus sejtrendszer, például a limfociták károsításával vannak összefüggésben.

A flupirtin egy ismert, bevezetett, centrális hatású, nem opiatikus analgetikum.

A flupirtin más hatásmechanizmussal fejti ki analgetikus hatásait, mint az opiát/opioid analgetikumok [Nickel, B.: Postgrad. Med. J., 63, (3. függ.), 19. oldal (1987); Szelényi I., Nickel B., Borbe H. 0., Bruke K., Br, J. Pharmacol, 143, 89. oldal (1989)]. Elektrofiziológiás vizsgálatokkal kimutatták, hogy a flupirtin mind a gerincoszlop feletti, mind a gerincoszlopsíkban be tud avatkozni a nociceptív jelenségekbe [Carisson K. H., Jurna I.: Eur. J. Pharmacol, 143, 89. oldal (1987); Bleyer H., Carisson K. H., Erkel H. J., Jurna I.: Eur. J. Pharmacol 151, 259. oldal (1988); Nickel B., Aledter A.: Postgrad. Med. J., 63, (3. függ.), 41. oldal (1987)].

A flupirtint a mozgási apparátus megbetegedései által okozott akut fájdalmi állapotok esetében is felhasználják gyógyításra.

Eredményesen alkalmazzák továbbá a flupirtint degeneratív és reumatikus betegségekben szenvedő betegeknél is.

A jó analgetikus tulajdonságok mellett a flupirtinnek izomlazító hatása is van, úgyhogy a flupirtin izomfeszültségek vagy ezeken alapuló megbetegedések kezelésére is használható (DE 40 22 422 számú német szabadalmi leírás).

Ezen túlmenően a flupirtin izomlazító hatásának patkányokon végzett vizsgálata során azt találták, hogy a flupirtinhatás az exitatórikus N-metil-D-aszpartát (NMDA) aminosavval megszüntethető. Ennek az NMDA-antagonisztikus hatásnak alapján a flupirtin az NMDA által közvetített CNS-megbetegedések, mint például az agyi ischaemia, neurodegeneratív megbetegedések, epileptikus rohamok kezelésére is alkalmas (DE 43 27 516 számú német szabadalmi leírás).

Kémiai szempontból a flupirtin 2-amino-3-etoxikarbonil-amino-6-(p-fluor-benzil-amino)-piridin.

A flupirtin szintézisét és gyógyszerészetileg használható sóit a 17 95 858, a 31 33 519 és a 34 16 609 számú német szabadalmi leírások írják le.

Azt találtuk, hogy a flupirtin olyan hatással is rendelkezik, hogy képes megakadályozni a hematopoetikus sejtrendszer sejtjeinek, például a limfocitáknak a pusztulását.

Ezáltal lehetőség nyílik ama, hogy a flupirtint olyan betegségek kezelésére használjuk fel, amelyek a hematopoetikus sejtrendszer károsodásával járnak.

Különös jelentősége van itt a HIV-fertőzött betegek/AIDS-es betegek kezelésének.

Az új, találmány szerinti hatást farmakológiai vizsgálatok kapcsán kívánjuk közelebbről ismertetni.

Farmakológiai vizsgálatok

Anyagok

Flupirtin-maleát [2-amino-3-etoxi-karbonil-amino-6(p-fluor-benzil-amino)-piridin-maleátj

HIV-1-gp120 preparálására a HTLVm_B HIV-1 vírustörzset használtuk fel (Popovic és mások, 1984). A kapott, izolált gp120 preparátum 95%-osnál nagyobb tisztaságú volt, amit poliakrilamid-gélelektroforézissel mutattunk ki (Müller és mások, 1988).

Antiretrovirális kísérleti elrendezés

A HIV-1-felhasználás módszerét már korábban leírták (Sárin és mások, 1987). Az emberi T-limfoblaszt CEM vonal sejtjeit (beojtási koncentráció: 1*10⁵ sejt/ml a közeg) szuszpendáltuk és HIV-1 vírussal (HTLV_tn_Btörzs) fertőztük. Ehhez az 50%-os sejttenyészeti fertőző dózis 50-szeresét választottuk (CCID₅₀). A CCIDsq az a fertőző dózis, amelynél a sejtszuszpenzió egy ml-ében lévő sejtek 50%-át fertőzzük meg. 1 ml-es tenyészeteket 5 napig inkubáltunk. A fertőzés előtt 2 órával a sejtekhez különböző koncentrációban flupirtint adtunk. Az élő sejtek számát 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazólium-bromid (MTT) felhasználásával kolometriás vizsgálati módszerrel határoztuk meg (Scudero és mások, 1988). A kiértékelés egy ELISA leolvasóval történt, mint ezt korábban publikálták (Müller és mások, 1991). Az inkubálás után a nem fertőzött CEM-sejtek 2,16, a fertőzött sejtek 0,13 lépésben duplázódtak meg.

Vérminták

Perifériás emberi vérmintákat vettünk (i) 12 HIV-1fertőzött homoszexuális férfitól (átlagéletkor: 35 év; korhatárok: 22-43 év), valamint 8 egészséges, HIV-1szeronegatív és különben egyforma kockázatú férfitól, akik hasonló korcsoportba tartoztak (átlagéletkor: 30 év; korhatárok: 23-35 év). A pácienseket a „Centere of Diseas Control (CDC)” osztályozásnak megfelelően soroltuk be (CDC, 1992). A HIV-1-szeropozitív pácienseken a vérvizsgálatokat aszimptomatikus vírushordozókkal végeztük (CDC: Α1, A2, átlagos CD-4 sejtszám 407/μΙ, határok: 209-698/μΙ). Egyik páciens sem mutatta tumormegbetegedés, szimptomatikus fertőzés jelét, és a vérvétel előtt 10 héttel nem esett át immunszuppresszív, például kortikoszteoridokkal végzett kezelésen.

Sejtpreparátumok és ezek kezelése

Heparinlzált vérből centrifugálással egy Ficoll-Hypaque-sűrűséggradienssel egy sejtmagú sejteket nyertünk ki, és azokat felszaporítottuk (Rossol és mások, 1990). 0,5* 10⁶ sejtet tenyésztettünk tenyészközegben 500 μΙ végső térfogatban; közegként MÉM közeget használtunk, ami 10 mM HEPES-pufferrel, 2,6% nátrium-bikarbonáttal, 100 U/l penicillinnel, 10 pg/ml streptomycinnel, 10% magzati borjúszérummal (FKS) és 1 mM glutamáttal volt feldúsítva. Ahol lehetett, a sejteket az izolálás után azonnal kezeltük a vegyszerrel.

Az apoptózis indukálása reakcióképes oxigénnel

A reakcióképes oxigéngyököket a hipoxantin (HX)és xantinoxidáz (XOD)-rendszer alkalmazásával állítottuk elő (Bruck és mások, 1994).

MNZ-t 24 órán át 500 μΙ össztérfogatú (fentiekben leírt) MÉM közegben szuszpendáltunk. Ehhez 0-80 mU/ml XOD-t és 1 mM HX-et adtunk. 80 mU/ml XOD-nél (Sigma cég gyártmánya, München) a limfociták több mint 90%-a apoptotikus sejthalált szenvedett.

Ha azt másként nem említjük, az alábbi vizsgálatokhoz az XOD enzim 10 mU/ml-ét és 1 mM HX-et

HU 225 742 Β1 használtunk. Ilyen inkubációs körülmények között a sejtek mintegy 50%-a apoptózison ment át. Ennek az apoptózisfoknak a betartása előnyös, ha azt akarjuk megvizsgálni, hogy egy bizonyos vegyület az apoptikus sejthalálnak potenciális inhibitora és/vagy stimulátora-e. A flupirtint az oxigéngyökképző rendszer hozzáadása előtt 6 órával adtuk a sejtekhez; az inkubálást egy nap múlva befejeztük.

Sejtek analízise átfolyásos citometriával

Az apoptózist egy FACScan típusú átfolyásos citométerrel (Becton-Dickinson gyártmánya), argonlézergerjesztéssel 488 nm hullámhosszon mértük a publikált módszer (Schmid és mások, 1994) szerint. A limfocitákat optikai módszerekkel választottuk el, és így jellemeztük, ez egy kombinált fényszórásos módszerrel történt, melynek során az előreszórt fény a sejtek nagyságának mértéke (FSC), a derékszögű szórás pedig a felületminőség (SSC) mértéke. Az apoptotikus MNZ sejtek megfestése céljából ezeket 20 pg/ml 7-amino-aktinomicin D-vel [7-AAD] (Sigma gyártmány) PBS-ben oldottuk, 20 percig 4 ’C-on fény kizárása mellett inkubáltuk. Ezután a sejteket az átfolyási citométerrel a színezékoldatban analizáltuk. A 7-AAD által előidézett vörös színű fluoreszcenciát 650 nm-es szűrővel határoztuk meg.

A 7-AAD a sejtmembrán szétesése következtében az apoptotikus sejtekbe hatol, és ezután abban egy interkaláris folyamat révén a DNS-t megszínezi. Az adatanalízis a LYSIS II programmal történt.

Az átlagos csatornaszámokat átlagos fluoreszcenciaintenzitásra, sejtnagyságra és felületminőségre számítottuk át.

In situ fluoreszcencia jelölés a TdT rendszerrel, valamint felületi jelölés

Annak érdekében, hogy egy meghatározott sejtpopulációt, ami apoptotikus folyamaton megy át, definiáljunk, a sejteket a terminális-transzferáz rendszerekkel (TdT) kezeltük. Kis módosításokkal Gorczyca és mások módszerét (1993) alkalmaztuk. Szuszpendált sejteket kétszer PBS-sel (Gibco gyártmány) mostunk, és ezután 1%-os paraformaldehiddel (Riedel de Haen gyártmány) 10 percig 4 ’C-on fixáltuk. Ezután a sejteket kétszer PBS-ben mostuk [amihez 5% AB-szérumot és 0,5% szarvasmarha-szérumalbumint (BSA) adtunk). A sejteket ezenkívül szemcséztük és újraszuszpendáltuk 50 μΙ 2,5 mmol-os kobalt-klorid-oldatban, amihez 0,5 mM biotin-16-dUTP-t és 25 U TDT-t adtunk. Az anyagot 200 mM kálium-kakodiláttal, 25 mM Tris-HCI-dal és 0,25 mg/ml BSA-val pufferoltuk; az inkubálás 37 ’C-on 30 percig történt a gyártó cég (Boehringer Mannheim, Mannheim) előírásának megfelelően. A sejteket ezután kétszer PBS-ben mostuk (5% AB-szérum és 0,5% BSA), és 100 μΙ olyan pufferolt színezékoldatban szuszpendáltuk újra, ami 5 pg/ml fluoreszcein-izotiocianáttal (FITC) jelölt avidint tartalmazott. Az egyidejű felületi megjelölés céljára a sejteket még ezután 20 pg/ml fikoeritrinnel jelölt monoklonális Anti-CD3 antitesttel (Becton-Dickinson gyártmánya) kezeltük.

A fluoreszcenciát a Halliwell által leírt (1987) átfolyásos citometriával kvantifikáltuk.

Eredmények

HIV-1-gyel fertőzött CEM-sejtek kezelése fíupirtinnel

CEM-sejteket 2 órán át flupirtinnel előkezeltünk, és azok ezután nem fertőzöttek maradtak, vagy egy párhuzamos kísérletben HIV-1-gyel fertőztük őket.

nap múlva meghatároztuk az egyes sarzsok sejtszámait. Mint az 1. ábrából látható, a sejtek koncentrációja sem a nem fertőzött, sem a fertőzött kultúrákban nem változott jelentősen a flupirtinkezeléstől függően (P>0,1).

A sejtsarzsokhoz 0,1-30 pg/ml végső koncentrációk közötti koncentrációban flupirtint adtunk. A nem fertőzött kultúrákban a sejtkoncentráció 446,880±31,020 sejt/ml, a HIV-1-gyel fertőzött kultúrákban 108,420±6,170 sejt/ml volt.

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a flupirtin nem hat toxikusán a sejtekre, de az alkalmazott inkubációkörülmények között nem befolyásolja in vitro a ΗIV-1-fertőzést sem.

A hipoxantin/xantinoxidáz rendszer beállítása

A xantinoxidáz (XOD)-koncentrációt úgy választottuk meg, hogy az apoptotikus sejtek százalékos részaránya mintegy 50% volt. Az apoptotikus sejtek fluoreszcenciaintenzitása nagyobb, mint 10 önkényes csatornaszám. 0 mU XOD-értéknél csak a sejtek 6,6±2,1%-a volt e felett a 10-nél nagyobb önkényes „cut ofT csatornaszám-határvonal felett, vagyis azok apoptotikusak voltak. Az XOD növekvő koncentrációjával az apoptotikus sejtek százalékos mennyisége nőtt, és 80 mU XOD-értéknél elérte a 93,2±6,8%-ot. 10 mU XOD-értéknél a sejtek mintegy 50%-a (pontosan 54,6±6,1%-a) átment egy apoptotikus folyamaton.

XOD távollétében a sejtek a következő FSC/SSC eloszlásképet mutatják.

Sejtméret 349±27 (önkényes csatornaszám) 112±15 felületminőség mellett. 80 mU enzimkoncentrációnál a sejtek nagysága csökkent és a 256±22 értéket érte el, míg a felületminőség foka 180±29-re nőtt. Az ilyen változások egy jellegzetes apoptózist mutatnak, ami a sejtek morfológiájának változásán alapszik. 10 mU XOD-nél a sejtek olyan eloszlásképet mutatnak, ami ezeknek az előzőleg említett szélső értékeknek a közepére esik. Ha másként nem említjük, úgy 10 mU enzimet használtunk fel.

Flupirtin hatása a spontán apoptoszerátumokra emberi limfocitáknál

Perifériás vér-MNZ-t vizsgáltunk egészséges kísérleti alanyoknál, valamint HIV-1-gyel fertőzött pácienseknél a spontán apoptózis tekintetében. A sejteket a kísérleti alanyokból történt vérvétel után egy nappal analizáltuk.

Mint a 2. ábrán látható, a nem fertőzött kontroll kísérleti alanyok MNZ-sejtjeinek 6,32±0,82%-a ez után az idő után apoptózist mutat, míg a HIV-1-gyel fertőzött páciensek sejtjeinek 28,42±7,84%-a esett át apoptózison. Mindkét csoport MNZ-jét 0,1-30 pg/ml koncentrációban flupirtinnel kezeltük. Mint ezt a 2. ábrán foglaltuk össze, a limfociták spontán apoptózisának sebessége flupirtinbehatás alatt jelentősen nem változott

HU 225 742 Β1 (P>0,1). Ez érvényes mind az egészséges kísérleti alanyok, mind a HIV-1-fertőzött páciensek sejtjeire.

Az indukált apoptózis flupirtinnel történő csökkentése egy sejtmagú sejtekben Úgy az egészséges kísérleti alanyok, mint a

HIV-1-gyel fertőzött páciensek MNZ-jét HX/XOD rendszerrel kezeltük (oxigéngyökök képzése) az apoptózis indukálása céljából. Az indukció megkezdése előtt 6 órával a sejtsarzsokhoz különböző koncentrációban flupirtint adtunk. Mint a 3. ábrából látható, a flupirtin 0,1 és 3,0 μ/ml közötti koncentrációban az apoptotikus sejthalál jelentős csökkentését idézte elő (P>0,001). 10 pg/ml-es flupirtinkoncentrációnál a védőhatás már csak a fertőzött kísérleti alanyok limfocitáival végzett vizsgálatoknál volt jelentős. 0,3-3,0 pg/ml flupirtinkoncentrációnál volt a gyógyszer védőhatása a legerőteljesebb, itt gátolta legerősebben az indukált apoptózist.

Az előidézett apoptózis csökkentése egészséges kísérleti alanyok limfocitás sarasaiban mintegy 40%-os, HIV-1-gyel fertőzött pácienseknél mintegy 6%-os volt.

Az apoptózist a limfocitákban a DNS-fragmentálás módszerével is kimutattuk. A sejtek HX/XOD rendszerrel végzett inkubálása után a DNS-t extraháltuk a sejtekből, agarózgélen szétválasztottuk, és ezután nagyság szerint egy „blot”-ra vittük át.

A DNS 180 bázispárból és ennek sokszorosaiból álló töredékek egy létraszerű mintázatára esett szét. Az ilyen fragmentálódási minta jellemző az olyan DNS-roncsolódásra, ami apoptotikus folyamatoknál lép fel (Wyllie, 1980). Azok a sejtek, amelyeket 1 pg/ml flupirtinnel kezeltünk, ezzel szemben nem mutattak DNS-fragmentálódást.

Jelen vannak jellegzetes pont-„blot”-ok is, amelyek a flupirtinnek olyan sejtekre gyakorolt hatását mutatják, amelyek mind spontán, mind indukált apoptózison átmentek.

Ennek a kísérletsorozatnak a végrehajtására az MNZ-ben a HX/20 mU XOD rendszerrel apoptózist indukáltunk. Ilyen körülmények között - flupirtin távollétében - a sejtek 64,2±7,9%-a lett apoptotikus.

Ha azonban ezeket a sejteket 24 órán át flupirtinnel kezeltük, akkor az apoptotikus sejtek száma szignifikánsan 18,3±5,8%-ra csökkent.

Ezek az eredmények egyértelműen mutatják, hogy a flupirtin egy sokat ígérő gyógyszer például AIDS-betegek limfocitái indukált apoptotikus sejtpusztulásának kezelésére,

A 43 27 516 számú német szabadalmi leírás leírja a flupirtin hatását agyi ischaemia, Morbus Alzheimer-, Morbus Parkinson-fertőzéssel indukált neurodegenerációs megbetegedések, mint AIDS-enkefalopátia vagy Jacob-Creutzfeld-betegség esetén.

Az előrehaladóan súlyosbodó AIDS-enkefalopátia-indikáció az AIDS-megbetegedések egy neurológiai komplikációja. Az AIDS-enkefalopátia fellépésének okát többek között abban látjuk, hogy a fertőzött makrofágokból NMDA-antagonisztikusan ható HÍV (gp120) indukált neurotoxinok, mint például kinolsav szabadul fel, ami végül is az idegsejtek pusztulásához vezet.

Az AIDS-enkefalopátia és az AIDS-megbetegedés („acquired immunodeficiency syndrome”) különböző szervrendszereket érintő megbetegedések. Az első betegségnél, mint már említettük, az AIDS-megbetegedés egy neurológiai komplikációjáról van szó (az idegsejtek apoptózisa), míg a második betegség egy „szerzett immunelégtelenség”, ami azon alapszik, hogy a sejt immunrendszerében zavar lép fel, ami a T-helper sejtek erőteljes csökkenésén alapul (a hematopoetikus sejtrendszer egyik komponensének apoptózisa).

A flupirtin eddigi alkalmazásai NMDA-antagonista hatásán alapulnak. A flupirtin találmány szerinti új hatása, azaz a hematopoetikus sejtrendszer sejtjei, például a limfociták indukált apoptózisának megszüntetése annál is inkább meglepő, mert eddig a központi idegrendszeren kívül nem mutatták ki NMDA-receptorok jelenlétét. Tehát a szakembernek nem volt lehetősége arra, hogy az idegsejtek flupirtinnel történő védelméből a hematopoetikus sejtrendszer sejtjeinek védelmére következtessen.

További betegségekként, melyek a flupirtin találmány szerinti hatásossága alapján profilaktikusan vagy terápiásán kezelhetők, a következőket említjük meg példaképpen:

- a gyógyszerek (mint citosztatikumok, kortikoszteoridok), mérgező anyagok, sugárzás és egyéb megbetegedések által indukált neurotopénia/limfocitopénia,

- gyógyszerek vagy fertőzések (például HÍV) indukálta trombocitopénia.

A flupirtin profilaxiás és terápiás kezelésére ismert módon a következő gyógyszerformákban adagolható: tabletták, fóliatabletták, keményzselatin-kapszulák, lágyzselatin-kapszulák, szemcsék, granulátumok, drazsék, kúpok, mikrokapszulák, vizes vagy olajos szuszpenziók, olajos oldatok, intramuszkuláris injekciós oldatok, intravénás injekciós oldatok.

A gyógyszer előállítására alkalmas sók mind a flupirtin fiziológiásán elviselhető sói. Szóba jöhet például a flupirtin hidrokloridja, maleátja, szulfátja és glukonátja.

A találmány szerinti gyógyszerek flupirtintartalma 0,1-3000 mg, előnyösen 10-500 mg. A nevezett gyógyszerdózisegységek naponta 1-5-ször, előnyösen 1-3-szor adhatók be.

A dózisadatok mindig a flupirtinre, mint bázisra vonatkoznak. Ha a flupirtin sóit használjuk, akkor a molekulatömeget megfelelően át kell számolni.

A találmány szerinti vegyületek gyógyszerészeti és galenikus kezelése a szokásos standardmódszerekkel történik. így például a flupirtint és/vagy segédanyagokat keveréssel vagy homogenizálással jól összekeverjük, és eközben általában 20 °C és 80 °C, előnyösen 20 °C és 50 °C közötti hőmérsékleten dolgozunk.

Az ábrák leírása

1. ábra: nem fertőzött [O] és HIV-1-gyel fertőzött [·] CEM-sejtek különböző flupirtinkoncentrációval. 10 párhuzamos mérés átlageredményét tüntetjük fel; a standard eltérések 10%-nál kisebbek voltak.

HU 225 742 Β1

2. ábra: nem fertőzött kísérleti alanyokból (üres oszlopok) és Hl V-1-gyei fertőzött páciensekből (satírozott oszlopok) nyert limfociták spontán apoptózisára gyakorolt flupirtinhatás. Egy nap múlva a sejteket átfolyásos citometriával analizáltuk. 12 fertőzött páciens és 8 nem fertőzött kísérleti alany limfocitáit vizsgáltuk; a középértékeket és a standard eltéréseket adjuk meg.

3. ábra: a limfociták indukált apoptotikus kipusztulásának csökkenése flupirtinnel történt kezelés után. Nem fertőzött kísérleti alanyok (üres oszlopok) és HIV-1-gyel fertőzött páciensek (satírozott oszlopok) MNZ-jét a HX/XOD rendszerrel apoptotikusan kipusztltottuk. A flupirtint az oxigéngyökképző rendszer előtt 6 órával adtuk a sejtekhez. Egy nappal később a sejteket átáramoltatásos citometriával analizáltuk. Meghatároztuk az össz-apoptózisértékeket; ezekből kivontuk a spontán apoptózisértékeket. Ily módon az ábrázolt értékek az indukált apoptózisértékeket tüntetik fel. 12 fertőzött páciens és 8 nem fertőzött kísérleti alany limfocitáit vizsgáltuk; az átlagértékeket és a standard eltéréseket adjuk meg.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Flupirtin hatóanyag vagy gyógyszerészetileg felhasználható sóinak alkalmazása hematopoetikus sejtrendszer károsodásával együtt járó betegségek kezelésére alkalmas, a hematopoetikus sejtrendszer sejtjeinek apoptotikus sejthalálát gátló gyógyszerkészítmény előállítására.
2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a hematopoetikus sejtrendszer károsodásával kapcsolatos betegség AIDS, az AIDS-enkefalopátiát kivéve.
3. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a flupirtint vagy sóját gyógyszerészetileg alkalmas hordozó- és/vagy segédanyagokkal megfelelő alkalmazási formákká alakítjuk.