UA51682C2 - Флюпіртин як активна речовина для профілактики та лікування захворювань, пов'язаних з індуктивним апоптозом лімфоцитів - Google Patents

Abstract

Винахід відноситься до медицини і стосується застосування флюпіртину або його солей для профілактики та лікування захворювань, пов'язаних з індуктивним апоптозом лімфоцитів, зокрема ВІЛ-інфекції та СНІДу.

Description

Опис винаходу

Винахід стосується використання флюпіртіну або його солей як лікарського засобу для профілактики та 2 лікування захворювань, пов'язаних з пошкодженням клітин системи кровотворення, таких як, наприклад, лімфоцитів.

Флюпіртін є відомим, призначеним для внутрішнього з введення, центрально діючим неопіумним анальгетиком.

Свої анальгетичні дії флюпіртін виявляє через інші діючі механізми, аніж опіат/опісідні анальгетики 70 (Міске! В., Розідгад.Меа.).63 (Биррі. 3), 19 (1987); ЗлеІепуі !, Міске! В., Вогре И.О., Вгипе К.

Вг.).Рпагтасої. 143, 89 (1989)). В електрофізіологічних дослідженнях було виявлено, що флюпіртін здатен втручатися у ноцицептивні "події як на надспинномозковому, так і на спинномозковому рівнях. (Сагізвзоп К.У.,

Уцгпа 1. Еиг.9У.Рпаптасої. 143,89 (1987); Віеуег Н., Сагіввоп К.Н., Етке! Ну., дигпа 1. Ешг.).Рпаптасо). 151,259 (1988); Міскеї! В., АІедіег А. Розідгад.Меа.). 63 (Биррі. 3)41 (1987)). 19 Флюпіртін використовується також для лікування у випадках гострого болю, спричиненого захворюваннями апарату руху.

Крім того, флюпіртін призначається для ефективного лікування пацієнтів, які мають дегенеративні та ревматичні захворювання. Поряд з хорошими анальгетичними якостями флюпіртін має властивості розслаблювати м'язи, завдяки чому він може застосовуватись для лікування м'язових судом або захворювань, викликаних судомами м'язів (ОЕ 40 22 442).

В подальших дослідженнях міорелаксаційної дії флюпіртіну, яке було проведене на пацюках, було встановлено, що дія флюпіртіну може гальмуватись через збуджуючу амінокислоту М-метил-О-аспартат (ММОА).

Виходячи з антагоністичного ефекту ММОА флюпіртін підходить також для лікування захворювань центральної нервової системи, таких як церебральна ішемія, нейродегенеративні захворювання, епілептичні припадки (ОЕ 43 с 27 516). З точки зору хімічного аналізу флюпгпіртін містить (3 2-аміно-3-етоксикарбоніламіно-6-(р-фтор-бензиламіно)-піридин.

Синтез флюпіртіну та його фармацевтичне придатних солей описаний в патентах ОЕ 17 95 858, ОЕ 31 33 519 та ОЕ 34 16 609.

Було також зроблене цікаве відкриття, що флюпіртін спроможний гальмувати апоптоз клітин системи сч кровотворення, наприклад, лімфоцитів. Завдяки цьому з'являється можливість застосовувати флюпіртін для с лікування хвороб, пов'язаних з пошкодженням клітин системи кровотворення.

Особливого значення при цьому набуває лікування ВІЛ- інфікованих /хворих на СНІД пацієнтів. ее,

Ефект, що випливає згідно винаходу, необхідно пояснити детальніше на основі фармакологічних досліджень. «--

Фармакологічні дослідження 3о Флюпіртін-малеат; (2-аміно-3- етоксикарбоніламіно-6-(р-фтор-бензиламіно)-піридин-малеаті, о для приготування ВІЛ-1-др 120 був введений штам вірусу ВІЛ-1Т-клітинного лейкозу людини НТІМ (|в (Ророміс еї аї.., 1984). Чистота отриманого виділеного препарату др 120 була більш 9595, що було підтверджено електрофорезом в поліакріламідному гелі (Миїег еї аї.,1988). «

Вивчення антиретровірусної активності З 70 Методика приготування ВІЛ-1 була вже описана раніше (Загіп еї аЇ, 1987). Клітини лінії фібробластів с людини СЕМ (щільність посіву 1 х 109 клітин /см"У) були суспендовані у середовищі та інфіковані вірусом ВІЛ-1 :з» (штам НТІМув ). Для цього використовували 50- одиниць 5095 - ної інфекційної дози ВІЛ для культур клітин (ССІОво). ССІОко- це інфекційна доза, при якій інфікується 5095 клітин на см клітинної суспензії. 1см? культури 415 був інкубований протягом 5 днів. Флюпіртін додавався до клітин в різних концентраціях за 2 години до сл зараження. Кількість живих клітин визначалась при застосуванні 3- (4,5-диметилтіазол-2-ил|-2,5-дифенілтетразолій-бромід |МТТ| калориметричної тестової системи. (Зсцадіего еї -й аІ.,1988). Оцінку результатів проводили за допомогою рідера для ЕГ ІЗА, як це відзначалось в публікаціях о раніше (МиШег еї аї.,1991). Після інкубації двократні розведення неінфікованих клітин СЕМ мали показник 2,16, а інфікованих - 0,13. й й (о) Аналізи крові

Кз Зразки периферійної крові були (ї) отримані від дванадцяти ВІЛ-1 інфікованих гомосексуалістів |вік 22-43 роки, середній вік 35 років), а також (ії) від восьми здорових чоловіків, серонегативних по ВІЛ-1, подібної групи ризику приблизно однакової вікової групи (вік 23-35 років, середній вік ЗО років). Пацієнти були розділені згідно класифікації "Центра контролю над захворюваннями" (ЦКЗ, 1992). Дослідження серопозитивних по ВІЛ-1 пацієнтів були проведені на основі аналізів крові безсимптомних вірусоносіїв (ЦКЗ: А1, А2; середнє (Ф) число клітин СО 4 -407/мкл, розкид - : 209-698/мкл). Жоден з пацієнтів не виявляв ознак пухлинних г захворювань, симптоматичних інфекцій та не проходив за 10 тижнів до здачі аналізів крові лікування, яке б пригнічувало імунну систему, наприклад, лікування кортикостероїдами. во Клітинні препарати та лікування ними

Мононуклеарні клітини (ІМНК)) були виділені та концентровані з гепаринізованої крові центрифугуванням за допомогою градієнтів Фікол-Гіпаг-Діхте (Боввої ейа!., 1990). 0,5 х 106 клітин були культивовані в бактеріологічному середовищі в кінцевому об'ємі 5О0Омкл; в якості середовища використовувалось МЕМ середовище, з додаванням ТММ буферу НЕРЕЗ5, 2,690 бікарбонату натрію, 100ум.од./ мл пеніциліну, 10Омкг/мл 65 стрептоміцину, 1095 фетальної сироватки великої рогатої худоби (ФС) та 1ММ глютамату. В разі необхідності, на клітини діяли хімічними речовинами відразу ж після виділення.

Індукція апоптозу реактивним киснем

Реактивні радикали кисню були отримані при застосуванні системи гіпоксантину (ГК) та ксантиноксидази (КОД) (Вгьск еї а!., 1994).

МНК суспендували протягом 24 годин в загальному об'ємі 500мкл мінімального підтримуючого середовища

МЕМ (як це описано вище).

В цю вихідну суміш додавали від 0 до 8Оміллі од.акт/мл КОД та 1мМ ГК. При концентрації 8- міллі од.акт./мл КОД (Зідта, Мьпспеп, ЕКС)» 9095 лімфоцитів зазнавали апоптоз.

За відсутністю інших умов, для наступних досліджень були введені 10 міллі од.акт/мл ферменту КОД та 1мММ 7/0 ГК. При цих умовах інкубації 5095 клітин зазнавали апоптоз. Є доцільним витримувати цей ступінь апоптозу, і, якщо це піддається контролю, встановити, чи являє встановлена сполука потенційним інгібітором або стимулятором апоптозу.

Флюпірітін додавався до клітин за 6 годин до застосування системи, яка виділяє радикал кисню; інкубація завершувалась через день.

Аналіз клітин методом проточної цитометрії

Апоптоз вимірювався в проточному цитометрі ГАСзЗсап (Весіоп-ОісКіпгоп) стимуляцією аргонового лазера при довжині хвиль 488нм методом, відомим з публікацій (Зсптід еї аЇ., 1994). Лімфоцити були розділені оптичним методом і характеризувались тим, що процес відбувався завдяки комбінації поступального переднього світлорозсіювання як виміру для розміру клітин (Е5СІ)| з перпендикулярним розсіюванням як виміру для го поверхової структури |ЗЗС). Для підфарбовування апоптозних МНК клітин останні ресуспендували в забуференому фізіологічному розчині (ЗФР) з 20мкг/мл 7-аміноактиноміцину Ю (7-ААОС)І (Зідта) протягом 20 хвилин при 4"С в темряві. Нарешті, клітини могли аналізуватись за допомогою проточного цитометра в підфарбованому розчині. Червона флюоресценція, обумовлена 7 ААО, реєструвалась фільтром з довжиною хвиль 6б5Онм. 7-ААО входить в апоптозні клітини за рахунок дезинтеграції клітинних мембран і підфарбовує ДНК сч ов Завдяки інтеркаляції. Аналіз даних проводився з використанням програми ГУЗІЗ ЇЇ.

Середня кількість каналів була перерахована на середню інтенсивність флюоресценції, розміри клітин та і) структуру поверхні.

Флюоресцента мітка іп зйи способом суміші Тат, а також мічення поверхні

Для визначення субпопуляції клітин, які зазнають апоптоз, клітини обробляли за допомогою системи кінцевої с зо трансферази |Тат). Застосовувався метод Согсгус еї а! (1993) з незначними модифікаціями. Клітини в суспензії промивали двічі ЗФР (бірсо), а після цього фіксували в 195 параформальдегіді (Ківеде! ае Наеп) протягом 10 со хвилин при 47С. Потім клітини двічі промивали ЗФР (з додаванням 595 АВ-сироватки та 0,595 бичого «я сироваточного альбуміну (БСА). Надалі клітини осаджували за допомогою Б5Омкл 2,5ММ розчину хлориду кобальту з додаванням 0,5НМ біотину- 16-ДОТР та 25 од.акт. Тат і ресуспендували. Ця суміш була стабілізована (87 зв Завдяки буферу з 200мММ какодилату калію, 25ММ тріс-НСІ та 0,25мг/мл бичого сироваточного альбуміну; ю інкубація відбувалася при 37"С 30 хвилин, відповідно даним виробника (Воейгіпдег Мапппеїт, Мапппеїт, ЕКС).

Клітини промивали двічі ЗФР (595 АВ- сироватки та 0,596 БСА) та суспендували удруге в 100 мкл буферного підфарбованого розчину, який містив 5мкг/мл флюресцеїін-ізотіоцианату |ФІТЦІ, міченого авідином ( аналіз чистоти клітин). Для одночасного мічення поверхні клітини обробляли додатково 2Омкг/мл міченими « фікоеритрином моноклональними анти-СОЗ антитілами (Весіоп-Оіскіпзоп). з с Флюоресценцію вимірювали за допомогою проточної цитометрії, як це було описано у НаїЇїмеї! (1987).

Результати ;» Лікування флюпіртіном інфікованих ВІЛ-1 СЕМ клітин

Клітини СЕМ обробляли протягом 2 годин і залишали після цього неінфікованими або паралельно інфікували

ВІЛ-1. Через 5 днів була визначена кількість клітин у відповідних сумішах. Як показано на схемі 1, залежність с концентрації клітин в неінфікованих та інфікованих культурах від концентрації флюпіртіну була незначною (Р» 0,1). - Флюпіртін додавався до суміші в кінцевій концентрації від 0,1 до ЗОмкг/см З. Концентрація клітин в р дод до су Ц центрац дод центрац (о) неінфікованій суміші складала 446.880 ж 31.020 клітин/смУ, в ВІЛ-1 інфікованій суміші 108.420 ж 6.710 о 50 клітин/см. Ці результати свідчать про те, що флюпіртін не має токсичного впливу на клітини, а подалі не впливає на інфекцію ВІЛ-1 іп міго. кі» Встановлення системи гіпоксантин/ксантин оксидази

Концентрація ксантин-оксидази (КОД) була вибрана такою, щоб процент частин апоптозних клітин становив приблизно 5095. Апоптозні клітини виявляють флюоресцентну інтенсивність » 10 довільної кількості каналів. 22 При 0 міллі од.акт. КОД 6,6 ж 2,190 клітин знаходяться над цією "відрізаною" лінією межі з 210 довільної о кількості каналів, тобто 6,695 були апоптозними. При збільшенні концентрації КОД процентна частина апоптозних клітин збільшується і досягає при 80 міллі од.акт. КОД значення 93,2 ї 6,895 апоптозних клітин. При 10 міллі іме) од.акт. приблизно 5095 (точніше 54,6 ж 6,1) клітин зазнають апоптоз. У випадку відсутності КОД клітини ЕС /55С виявляють такий зразок розподілу: 60 Розміри клітин 349 т 27 (довільна кількість каналів) у порівнянні зі структурою поверхні 112 ж- 15. При концентрації ферменту 80 міллі од.акт. розміри клітин зменшуються і досягають значення 256 5 22, в той час як ступінь структури поверхні збільшується на 180 ж- 29. Такі зміни свідчать про характерний апоптоз, що базується на морфологічних змінах клітин. При 10 міллі од.акт. КОД клітини виявляють зразок розподілу, що знаходиться в середині екстремальних значень, виявлених вище. Якщо не зазначено інакше, вводять 10 міллі б5 од.акт. ферменту.

Вплив флюпіртіну на спонтанний приріст апоптозу лімфоцитів людини

Периферійна кров МНК здорових, так само як і ВІЛ-1 інфікованих досліджувалась на спонтанний апоптоз.

Клітини аналізували через день після забору крові в групі досліджуваних. На схемі 2 показано, що 6,32 х 0,82 до МНК клітин у контрольних групах неінфікованих досліджуваних зазнають апоптоз у цих часових межах, в той часяк 28,42 ж 7,8495 клітин інфікованих ВІЛ-1 пацієнтів переживають апоптоз.

МНК обох груп обробляють протягом 24 годин флюпіртіном в концентрації від 0,1 до ЗОмкг/см 9. Згідно схеми 2 витікає, що приріст спонтанного апоптозу лімфоцитів під впливом флюпіртіну не характеризується значною зміною значень ( Р » 0.1). Це стосується клітин здорових досліджуваних, так само як і інфікованих

ВІЛ-1 пацієнтів. 70 Зменшення індуктивного апоптозу в мононуклеарних клітинах завдяки флюпіртіну

МНК здорових досліджуваних, а також ВІЛ-1 інфікованих пацієнтів обробляли системою ГК/КОД (утворення радикалів кисню) для індукції апоптозу. Флюпіртін додавали до клітинної суміші за 6 годин перед індукційною експозицією в різних концентраціях. Як показано на схемі 3, флюпіртін в концентрації між 0,1 та З,Омкг/см З спричиняв значне зменшення апоптозу клітин (Р 0,001). При концентрації флюпіртіну 1Омкг/см? захисний ефект 75 відзначався лише в пробах з лімфоцитами інфікованої групи досліджуваних.

При концентрації від 0,3 до 3,Омкг/см? флюпіртіну захисний ефект лікувального засобу був найбільше вираженим і сильніше всього гальмував індуктивний апоптоз.

Зменшення індуктивного апоптозу в суміші з лімфоцитами здорових досліджуваних складав приблизно 40965, а в групах інфікованих ВІЛ-1 пацієнтів-приблизно 6095.

Апоптоз був виявлений в лімфоцитах також методом ДНК-фрагментації. Після інкубації клітин системою

ГК/КОД з клітин була виділена ДНК, розділена в агарозному гелі та перенесена блоттінгом відповідно розмірам.

ДНК розпалась на кристалоподібний зразок, що має вигляд східців, і складається з фрагментів 180 пар основ з багатьма гранями. Подібний фрагментарний візерунок характерний для деструкції ДНК, що виникає в апоптозних процесах (МУуїЇйе ,1980). Клітини, які обробляють 1мкг/см З флюпіртіном, не виявляють, навпаки, с ніякої фрагментації ДНК. о

Так само існують і репрезентативні дот-блоттінги, які виявляють ефект флюпіртіну на клітинах, що переживають спонтанний та індуктивний апоптоз.

Для проведення цієї серії експериментів в МНК був викликаний апоптоз способом системи ГК/20 міллі од.акт.

КОД. За цих умов при відсутності флюпіртіну 64,2 ж 7,995 клітин виявилися апоптозними. с

Коли ж ці клітини обробляли протягом 24 годин флюпіртіном, число апоптозних клітин значно зменшувалося со на 18,3 ж 5,895.

Ці показники однозначно свідчать про те, що флюпіртін є перспективним засобом для лікування, наприклад, ісе) індуктивного апоптозу лімфоцитів у пацієнтів, хворих на СНІД. «-

В ОБ-О5 43 27 526 описуються нейропротективна дія флюпіртіну, наприклад, при церебральній ішемії, 3о хворобах Альцгеймера, Паркінсона, спричинених інфекційними нейродегенеративними захворюваннями, такими о як СНІД-енцефалопатія або хвороба Якоба-Крейтцфельдта.

СНІД-енцефалопатія з прогресуючою деменцією являє неврологічне ускладнення захворювання на СНІД.

Причиною виникнення СНІД-енцефалопатії вважається, поряд з іншими факторами, викликаними ВІЛ (др 120), « вивільнення ММОА-агоністично діючих нейротоксинів, таких як хінолінова кислота, з інфікованих макрофагів, які в результаті приводить до відмирання нервових клітин. З с СНІД-енцефалопатія і захворювання на СНІД (синдром набутого імунодефіциту) є захворюваннями, що "» стосуються різних систем органів. У випадку з першим захворюванням мова іде, як вже було зазначено, про " неврологічне ускладнення хвороби на СНІД (апоптоз нервових клітин), в той час як друге захворювання являє "набуту імунну недостатність, яка зумовлена порушенням системи клітинного імунітету з різко вираженим зменшенням Т-хелперних клітин (апоптоз клітин - складових частин системи кровотворення). о Дія флюпіртіну, згідно винаходу, - гальмування індуктивного апоптозу клітин системи кровотворення, як - наприклад, лімфоцитів, - була тим більше вражаючою, що існування рецепторів ММОА зовні центральної нервової системи до цього не було виявлено. Відповідно до цього для спеціаліста не існувало можливості

Ме, перейти від захисту нервових клітин флюпіртіном до захисту клітин системи кровотворення.

Го! 20 Можна назвати наступні захворювання, що піддаються профілактиці та лікуванню, виходячи з ефективної дії флюпіртіну, підтвердженої на основі винаходу. г» - нейтропенія/лімфоцитофенія, викликані медикаментами (такими як цитостатики, кортикостероїди), отруйними речовинами, опроміненням, та інші диспластичні захворювання. - тромбоцитопенія, спричинена інфекційним або медикаментозним шляхом. 59 Флюпіртін може дозуватися для профілактичних та лікувальних цілей відомим шляхом в наступних формах

Ф! застосування: таблетки, таблетки в целофановій упаковці, капсули із жорсткого желатину, капсули з м'якого желатину, гранули, речовини в гранулах, драже, гемороїдальні свічки, мікрокапсули, водяні або масляні де суспензії, масляні розчини, розчини ін'єкцій для внутрішньом'язового застосування, ін'єкційні розчини для внутрішньовенного застосування. 6о Потрібні солі для виробництва ліків є всі фізіологічно сумісними солями флюпіртіну. Наприклад, мова може їти про гідрохлорид, малеат, сульфат та глюжонат флюпіртіну.

Вміст флюпіртіну у об'єктах винаходу складає 0,1мг -3 б0Омг, доцільніше 5Омг-50Омг. Названі окремі дози ліків можуть застосовуватись 1-5 разів, переважно 1-3 рази на день.

Флюпіртін є завжди основою для даних по дозуванню. Якщо застосовуються солі флюпіртіну, розрахунки бо проводяться відповідно до молекулярної маси.

Фармацевтичні та галенові операції виконуються згідно традиційних методів. Наприклад, флюпіртін та/або допоміжні речовини та речовини-носії добре перемішують та гомогенізують при температурі між 20 та 802С, переважно від 20 до 5070.

Опис схем

Схема 1

Інкубація неінфікованих (о | та ВІЛ-1 - інфікованих клітин СЕМ | І | з різною концентрацією флюпіртіну.

Наводяться середні значення 10 паралельних експериментів; середні відхилення були не вище 10905.

Схема 2 70 Ефект флюпіртіну , отриманий на спонтанному апоптозі лімфоцитів неінфікованих досліджуваних |відкрите мозолисте тіло |та ВІЛ-1 - інфікованих пацієнтів | ді(агональне смужкове мозолисте тіло). Через день клітини були проаналізовані за допомогою проточної цитометрії. Лімфоцити 12 інфікованих і 8 неінфікованих пацієнтів були досліджені; середнє значення і відхилення від норми наводяться.

Схема З

Зменшення індуктивного апоптозу лімфоцитів після лікування флюпіртіном. МНК неїінфікованих досліджуваних (відкрите мозолисте тіло) та інфікованих ВІЛ-1 пацієнтів (діагональне смужкове мозолисте тіло) були доведені за допомогою ГК/КОД системи до апоптозного відмирання. Флюпіртін додавався клітинам за 6 годин перед генеруючою системою кисневого радикалу. Наступного дня клітини були проаналізовані за допомогою проточної цитометрії. Результати загального апоптозу були реєстровані; виходячи з цього були Відраховані показники спонтанного апоптозу. Досліджувались лімфоцити 12 інфікованих та 8 неінфікованих пацієнтів; середні показники та відхилення від норми надаються.

Claims (2)

Формула винаходу с 7 у у ї о

1. Застосування флюпіртину або його фармацевтично придатних солей як активної речовини для лікування або попередження хвороб, пов'язаних з індуктивним апоптозом лімфоцитів.

2. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що лікування включає лікування ВІЛ-інфікованих або хворих на СНІД пацієнтів. с зо З. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що флюпіртин або його солі являють собою комбінації з речовинами-носіями та/або допоміжними фармацевтично придатними речовинами для відповідних форм со застосування. У Те; Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних /ж7- мікросхем", 2002, М 12, 15.12.2002. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і ю науки України.

-

. и? 1 - (о) (ее) Ко) іме) 60 б5