CZ298115B6

CZ298115B6 - Flupirtin nebo jeho farmaceuticky prijatelné solik príprave léciv k osetrování nemocí souvisejících s poskozováním hematopoetického bunecného systému

Info

Publication number: CZ298115B6
Application number: CZ0128398A
Authority: CZ
Inventors: Pergande@Gabriela; E. G. Müller@Werner
Original assignee: Meda Pharma Gmbh & Co. Kg
Priority date: 1995-11-07
Filing date: 1996-10-23
Publication date: 2007-06-27
Also published as: EP0859613B1; US6034111A; ZA968783B; HUP9901659A3; PL186537B1; WO1997017072A3; NO315074B1; PL326629A1; CA2189705C; HUP9901659A2; BR9611588A; EP0859613A2; US6034112A; CN1201391A; MX9803610A; AU1716597A; CA2189705A1; AU711207B2; HU225742B1; DE59611327D1

Abstract

Pouzití flupirtinu nebo jeho farmaceuticky prijatelných solí k príprave léciv k osetrování nemocí souvisejících s poskozováním hematopoetického bunecného systému, napríklad lymfocytu. Zvlástní význam má pro osetrování pacientu infikovaných HIV.

Description

Flupirtin nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli k přípravě léčiv k ošetřování nemocí souvisejících s poškozováním hematopoetického buněčného systému (57) Anotace:

Použití flupirtinu nebo jeho farmaceuticky přijatelných solí k přípravě léčiv k ošetřování nemocí souvisejících s poškozováním hematopoetického buněčného systému, například lynifocytú. Zvláštní význam má pro ošetřování pacientů infikovaných HIV.

LZ. ZVČJll^ bO

Flupirtin nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli k přípravě léčiv k ošetřování nemocí souvisejících s poškozováním hcmatopoetického buněčného systému

Oblast techniky

Vynález se týká použití flupirtinu nebo jeho farmaceuticky přijatelných solí k přípravě léčiv k profylaxi a terapii nemocí souvisejících s poškozováním hematopoetického buněčného systému, například lymfocytů.

io

Dosavadní stav techniky

Flupirtin jc známé zavedené, centrálně působící analgetikum neopiátového typu.

Analgelické účinky odvozuje flupirtin od jiných mechanismů působení než opiátově-opioidní analgetika (Nickel B., Postgrad, Med. J. 63 (dod. 3). str. 19. 19871 Szelenyi I.. Nickel B., Borbc H.O., Brune K., Br. J. Pharmacol 143. str. 89 1989). Elektrofyziologickými testy sc prokázalo, že flupirtin zasahuje jak na supraspinální, tak na spinální rovině do nococeptivního dní (Carisson 20 K.H., Jurna 1., Eur. .1. Pharmacol 143, str. 89 1987; Bleyer H.. Carisson K.H., Erkel H.J., Jurna 1.,

Eur. J. Pharmacol Ι5Ε str. 259 . 1988; Nickel B.. Alcdter A., Postgrad Med. J. 63 (dod. 3) str. 41, 1987).

Flupirtinu sc používá také při akutně bolestivých stavech vyvolaných onemocněním pohybového 25 ústrojí jako léčiva.

S úspěchem se také aplikuje flupirtin u Pacientů s degenerativními nebo revmatickými nemocemi.

Vedle dobrých analgctickýeh vlastností má flupirtin také svalové relaxační účinky, takže se flupirtin může aplikovat k ošetřování svalového napětí nebo při onemocnění spočívající na svalovém napětí (německý patentový spis DE 40 22 442).

Při zkoumání svalově relaxačního účinku flupirtinu na krysách se také zjistilo, že účinek flupir35 tinu se může tlumit exitatorní aminokyselinou N-mcthyl-D-aspartát (NMDA). Na základě tohoto antagonistického účinku kNMDA se flupirtin hodí také k ošetřování nemocí centrálního nervového systému, zprostředkovaných NMDA, jako například mozkové ischcmic. neurodegenerativních onemocnění a epileptických záchvatů (německý patentový spis číslo DE 43 27 516).

Z chemického hlediska jc flupirtin 2-am i no-3-ethoxy karbony lam ino-6-(p-fluorbenzy lam ino)pyridin. Syntéza flupirtinu a jeho farmaceuticky vhodných solí je popsána v německých patentových spisech číslo DE 17 95 858, DE 31 33 519 aDE34 16 609.

S překvapením se nyní zjistilo, že flupirtin je schopen tlumit apoptotické vymírání buněk hemato45 poetického buněčného systému, například lymfocytů.

Tím se otevírá možnost aplikovat flupirtin k léčení onemocnění souvisejících s poškozováním hematopoetického buněčného systému.

Zvláštní význam se přičítá léčení pacientů infikovaných IliV/pacientů s AIDS.

νζ. ώ'/σιι.ι ου

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je použití flupirtinu nebo jeho farmaceuticky přijatelných solí k přípravě léčiv k ošetřování nemocí souvisejících s poškozováním hematopoetického buněčného systému, přičemž léčivo brzdí apoptózovou smrt buněk hematopoetického buněčného systému.

Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení pomocí přiložených obrázků.

Přehled obrázku na výkresech

Na obr. I je znázorněna inkubace neinfikovaných (prázdné kolečko) a HlV-l-infikovaných (plně kolečko) buněk s různými koncentracemi Flupirtinu. Jsou udány střední hodnoty deseti paralelních pokusů; směrodatné odchylky nepřesahující 10 %. Na ose x je uvedena koncentrace drogy v pg/ml, na ose y koncentrace buněk v 10'³ ml.

Na obr. 2 je účinek flupirtinu na spontánní apoptózu lynifocytů získaných od zdravých jedinců (prázdné sloupce) a HlV-l-infíkovaných pacientů (plné sloupce). Po jednom dni byly buňky analyzovány průtokovou cytometrií. Zkoumaly se lymfocyty dvanácti infikovaných pacientů a osmi zdravých jedinců. Udány jsou střední hodnoty a směrodatné odchylky.

Na ose x je uvedena koncentrace drogy v pg/nl. na ose y spontánní apoptóza v procentech.

Na obr. 3 jc snížení indukovaného apoptotického odumírání lymfocytů po ošetření flupirtinem. NMZ zdravých jedinců (prázdné sloupce) a HIV-1-infikovaných pacientů (plné sloupce) byly přivedeny systémem HX/XOD k apoptickému odumření. Flupirtin se přidával do buněk 6 hodin před systémem generujícím kyslíkový radikál. O den později byly buňky analyzovány průtokovou cytometrií. Zjistily se hodnoty celkové apoptózy; od nich se odečetly hodnoty spontánní apoptózy. Tím udávají uvedené hodnoty míru indukované apoptózy.

Na ose x je uvedena koncentrace drogy v ^ig/ml. na ose y indukovaná apoptóza v procentech. Hvězdička nad sloupci znamená p menší než 0,001.

Příklady provedení vynálezu

Farmakologické zkoušky

Materiály

Flupirtin-maleát [2 amino- 3-ethoxy karbony lam ino-6-(p-fluorbenzylamino)pyrimidinmaleát]. k přípravě HIV-1-gpl20 se použije virového kmene HIV—I HTEB|[_Uj (Popovic a kol. 1984). Získaný izolovaný prostředek gpl20 má čistotu vyšší než 95% podle elektroforézy za použití polyakrylamidovcho gelu (Miillcr a kol, 1988).

Antirctrovirálni zkušební násada

Metodologie pro násadu HIV-1 už byla dříve popsána (Sarin a kol., 1987). V médiu se suspendují buňky linie lidských 1 -lymfoblastů GEM (koncentrace 1x10' buněk/ml) a infikují sc virem HIV-1 (kmen IITEV^J. K tomu se zvolí 50-násobek 50% infekční dávky do buněčné kultur}' [CCIDso]. CCID joje infekční davka, pri kteie je infikováno 50 /o buněk v ml bunccne suspenze. Jedno—mililitrové kultur}' se inkubují 5 dní. Dvě hodiny před infikováním sc k buňkám přidá Flupirtin v různých koncentracích. Počet žijících buněk se stanoví pomocí kolorimetrického (/ HO testovacího systému 3-[4.5-dimethylthiazol-2-y 1]-2.5-difenyltetrazolinbromidu [MTT] (Scudiero a kol, 1988). Vyhodnocuje se čítačem ELISA. jako bylo publikováno (Muller a kol.. 1991). Po inkubaci prodělaly ncinfikované buňky CEM 2.15 a infikované buňky 0,13 dělení.

Krevní vzorky

Vzorky lidské periferní krve se odeberou (i) od dvanácti homosexuálních mužů infikovaných H1V-I [střední věk 35 let. rozsah 22 až 43 let] a (ii) po osmi zdravých HIV- 1 servonegativních mužů vystavených jinak témuž riziku přibližně stejné věkové skupiny (střední věk 30 let. rozsah io 23 až 35 let). Pacienti sc zařadí podle klasifikace ..Centers of Disease Control (CDC) (CDC.

1992). Testy sc HIV-l-scrvopozitivními pacienty' se provedou se vzorky krve předpokládaných nosičů viru (CDC: AI. A2, střední počet buněk CD4 407/μΙ. rozsah: 209 až 698/μΙ). Žádný z pacientů nevykazuje známky nádorového onemocnění, symp to matické infekce nebo nebyl deset týdnů před odběrem krve podroben imunitu potlačujícímu ošetření například kortikosteroi15 dy.

Přípravky buněk a jejich ošetření

Mononukleární buňky [MNZ] se získají a obohatí z heparinovanc krve odstředěním z gradientem 20 hustoty Ficol Hypaquc (Rossol a kol. 1990). V kultivačním médiu se kultivuje 0.5x10⁶ buněk v konečném objemu 500 μΙ: jako médium se použije médium MEM, které bylo obohaceno 10 inM pufru HEPES, 2,6 % hydrogenuhličitanu sodného, 100 U/l penicillinu, 100 pg/ml streptomycinu, 10 % zárodečného telecího séra [FKS] a 1 mM glutamátu. Kde je to uvedeno, byly buňky okamžitě po izolování ošetřeny chemickou látkou.

Vyvolání apoptózy reaktivním kyslíkem

Reaktivní kyslíkové radikály se připraví za použití systémů hypoxanthinoxidázy [HX] a Xanthinoxidázy [XOD] (Bruck a kol., 1994).

NMZ se suspendují 24 hodin v celkovém objemu 500 μΙ média MEM (jak shora popsáno). Tato násada se přidá k 0 až 80 mU/nml XOD a 1 mM HX. Při koncentraci 80 mU/ml XID (Sigma. Můnchen. FRD) uhynulo více než 90 % lymfocytú apoptotickou smrtí.

Pokud není uvedeno jinak, použije se v následujících studiích 10 mU/ml enzymu XOD a 1 mM HX. Za těchto inkubačních podmínek prodělá asi 50 % buněk apoptózu. Je výhodné tento stupeň apoptózy dodržet, pokud se má zjistit zda určitá sloučenina představuje potenciální inhibitor a/nebo slimulálor apoptotického usmrcení buněk. Flupirtin se buňkám přidává 6 hodin před přísadou systému produkujícího kyslíkový radikál: inkubace se po jednom dni ukončí.

Analýza buněk pomocí průtokové cytomerie

Apoptóza se měří při buzení paprskem argonového laseru v průtokovém cyto metru FACScan (Bertou Dickinson) při vlnové délce 488 nm popsaným způsobem (Schmidt a kol., 1994). Lym4? focyty sc oddělí optickými metodami a tím se charakterizují, k tomu dojde kombinací dopřednčho rozptylu světla jako míry pro velikost buněk [FSC] s pravoúhlým rozptylem světla jako míry stavu povrchu [SSC], K zabarvení apoptických buněk MNZ se buňky rozpustí se 20 pg/ml Ίaminoaklinomycinu D [7-AAD] (Sigma) a PBS a inkubují se 20 minut při teplotě 4 °C při vypnutém světle. Nakonec se buňky analyzují průtokovým cytometrem v barvicím roztoku. 50 Červená fluorescence vyvolaná 7-AAD sc zachycuje filtrem s vlnovou délkou 650 nm. 7-AAD pronikne do apoplolických buněk na základě rozkladu buněčné membrány a v závislosti na to zabarví DNA interkalaěním postupem. Analýza dat proběhne programem LYS1S 11. Střední kanálová čísla se přepočtou na střední intenzitu fluorescence, velikost buněk a stav povrchu.

-3 CZ 298H5 R6

Fluorescenční značení in silu pomocí systému TdT a značení povrchu

K definování určité subpopulace buněk, která prodělala apoptotický pochod, se buňky ošetří systémem Terminál Transferáze [TdT], Použije se způsob Gorczyca a kol. (1993) s nepatrnými úpravami. Buňky v suspenzi se dvakrát promyjí v PBS (Gibco) a nato se fixují 1% paraformaldehydem (Riedel a Haen) 10 minut při teplotě 4 °C. Nato se buňky promyjí dvakrát PF.BS [do kterého bylo přidáno 5 % séra ΛΒ a 0.5 % albuminu hovězího séra (BSA)]. Buňky sc pak peletují a resLispendují se v 50 μΐ 2.5 mM roztoku chloridu kobaltu, který byl přidán do 0.5 nM Biotin16-dUTP a 25 U TdT. Tato násada sc pufruje 200 mM kakodylátu draselného, 25 mM Tris-HCI a 0.25 g/ml BSA; inkubace probíhá 30 minut při teplotě 37 °C podle údajů výrobce (Boehringer Mannheim Mannheim. FRG). Buňky se pak dvakrát promyjí PBS [5%-séruni a 0.50 BSA) a resuspendují sc ve 100μ1 pufrovaného barevného roztoku, který obsahuje 5 pg/rnl fluoresceinisothiokyanátem [FlTCj značeného a vid inu [čistota pro buněčnou analýzu], K současnému značení povrchu se buňky dodatečně ošetří 20 pg/ml monoklonální protilátkou CD3 značenou phycoretrinem (Bccton-Dickinson). Fluorescence se kvantifikuje průtokovou cytometrií, kterou popsal Halliwcll (1987).

Výsledky

Ošetření buněk CEM infikovaných ΗϊV—1 Flupirtinem

Buňky CEM se předběžně ošetřují dvě hodiny fluipirtinem a zůstanou návazně neinfi kované nebo sc infikují 111V I v paralelní násadě.

Po pěti dnech se buňky v uvedených násadách spočítají. Jak vyplývá z obr. 1, nezměnila se koncentrace buněk jak v neinfíkovaných. tak v infikovaných kulturách v závislosti na ošetření Flupirtinem podstatně. (P větší než 0,1).

Flupirtin se přidával do násad v konečných koncentracích 0.1 až 30 pg/ml. Koncentrace buněk v neinfíkovaných násadách obnášela 446,88 L 31,020 buněk/ml. v H1V-1 infikovaných násadách 108,420 ± 6.710buněk/ml.

Tyto výsledky ukazují, že flupirtin na buňky nepůsobí toxicky, jinak však nepůsobí také žádný účinek na infekci H1V-I in vitro za použitých inkubačních podmínek.

Nastavení sy sté mu hy poxan t h i nox i dá za/xanth inox idáza

Koncentrace xanthinoxidázy [XID] se volí tak, aby sc percentuelní podíl apoptickýeh buněk nastavil na přibližně 50 %.

Apoptotické buňky vy kazují intenzitu fluorescence větší než 10 arbitrárních kanálových počtů. Při 0 mU XOD bylo jen 6.6 ± 2,1 % nad touto „eut-off¹ hranicí větší než 10 arbitrárních kanálových počtů, bylo tedy 6.6% apoptickýeh. Při rostoucí koncentraci XOD percentuelní podíl apoptotických buněk stoupá a dosahuje při 80 mU XOD hodnoty 93.2 ± 6,8 %. Při 10 mU XOD prochází apoptotickým procesem přibližně 50 % (přesně 54,6 ± 6,1) buněk.

V nepřítomnosti XOD vykazují buňky následující obrazec rozdělení FSC/SSC;

Velikost buněk 349 ± 27 (arbitrální počet kanálů) vůči stavu povrchu 1 12 ± 15. Při koncentraci enzymů 80 mU velikost buněk klesá a dosahuje hodnoty 256 ± 22, zatímco stupeň stavu povrchu narůstá na 180 ± 29, Takové změny naznačují charakteristickou apoptózu podmíněnou morfologickou změnou buněk. Při 10 mlJ XOD vykazují buňky obrazec rozdělení, který jc přibližně uprostřed těchto prve ukázaných extrémních hodnot. Pokud není uvedeno jinak, nasazovalo se 10 mlJ na enzym.

-4 C7. 298115 B6

Vliv Flupirtinu na spontánní míru apoptózy u lidských lymfocytů

Vzorky periferní krve zdravých jedinců i pacientů infikovaných HIV—l se zkoumají / hlediska 5 spontánní apoptózy. Buňky sc analyzují jeden den po odebrání krve. Jak vyplývá z obr. 2, vykazují buňky MNZ kontrolních skupin neinfikovaných jedinců 6.32 ± 7,84 % buněk po tomto časovém období apoptózy, zatímco 28,42 .t 7,84% buněk pacientů infikovaných HIV-1 prodělává apoptóza. MNZ obou skupin se ošetří po 24 hodin Flupirtincin v koncentracích 0,1 až 30 pg/ml.

Jak obr. 2 ukazuje, míra spontánní apoptózy lymfocytů se působením Flupirtinu významně nemělo ní (P větší než 0,1). To platí pro buňky jak zdravých jedinců tak HI V-1 - infikovaných pacientů.

Snižování indukované apoptózy v mononukleárních buňkách působením flupirtinu

NMZ zdravých jedinců a HIV—1 infikovaných pacientů se zpracovávají systémem ÍÍX/XOD 15 (vytváření kyslíkových radikálů) k indukci apoptózy. Flupirtin se přidává buněčným násadám hodin před vystavením účinku induktoru v různých koncentracích. Jak ukazuje obr. 3, nezpůsobuje flupirtin při koncentracích 0.1 až 3,0 pg/ml významné snížené apoptického zániku buněk (P menší než 0,001). Při koncentraci flupirtinu 10 pg/ml je protektivní účinek ještě jenom m při zkoušce s lymfocyty infikovaných pacientů významný. Při koncentracích 0,3 až 3,0 pg/ml je ochranný účinek léčiva nejvýraznější a tlumí induktivní apoptózu nejsilnčji.

Snížení indukované apoptózy v násadách s lymfocyty zdravých jedinců jc přibližně 40% a u infikovaných pacientů přibližně 60%.

Apoptóza v lymfocytech byla také prokázána metodou fragmentace DNA. Po inkubaci buněk systémem HX/XOD se DNA z buněk extrahuje, v agarovém gelu sc rozdělí podle velikosti a přenese se na blot.

DNA se rozpadla na žebříku podobný vzor fragmentů se 180 párů bází a jejich násobky. Takový 30 vzor fragmentů je charakteristický pro rozrušení DNA. ke kterému dochází při apoptotických procesech (Wyllie, 1980). Buňky, které byly ošetřeny Flupirtinem nevykazují na rozdíl od toho žádnou fragmentaci DNA.

Reprezentativní dot-bloty, které ukazují účinek flupirtinu na buňky, které prodělávají jak spon35 tánní, tak indukovanou apoptózu jsou rovněž k dispozici.

K provedení této série pokusů byla v MNZ pomocí HX/20 mlJ systému XOD apoptóza snížena. Za těchto podmínek se stalo - v přítomnosti Flupirtinu 64,2 ± 7,9 % buněk apoptotických.

Jestliže však byly tyto buňky ošetřovány 24 hodin Flupirtinem, klesl počet apoptotických buněk významně na 18,3 ± 5,8 %.

Tyto výsledky jasně dokládají, že flupirtin je mnohoslibným léčivem například k ošetřování indukovaného apoptického buněčného odumírání lymfocytů u pacientů s AIDS.

V německé zveřejněné přihlášce vynálezu číslo DF-OS 43 27 516 je popsán ncuroprotektivní účinek flupirtinu, například u mozkové ischcrnie, Alzheimerově a Parkinsonovč nemoci, infekčních indukovaných ncurodegerativních onemocnění, jako je AIDS-cncefaíopatie nebo Jakob Creuzfeldovo onemocnění.

Indikace AIDS-enccfalopatie s pokročilou demencí představuje neurologickou komplikaci onemocnění AIDS. Za příčinu pro vznik AIDS-cncefalopatie sc kromě jiného považuje HIV (gp 120) indukované uvolňování NMDA-agonisticky působících neuroloxinů jako je kyselina chinolinová z infikovaných makrofágů, které nakonec vede k odumírání nervových buněk AIDS

- 5 CZ 298Π5 B6 encefalopatie a onemocnění AIDS (získaný syndrom imunitní nedostatečnosti) jsou onemocnění postihující různé systémy orgánu. Při prvním onemocnění jde. jak bylo prokázán, o neurologickou komplikaci onemocnění AIDS (apoptózu nervových buněk), zatímco druhé onemocnění představuje ..získanou imunitní nedostatečnost^, která spočívá v poruše buněčného imunitního systému s výrazným zmenšením T--pomocných buněk (apoptóza součástí hematopoetického buněčného systému).

Vynalezený účinek flupirtinu, tlumení indukované apoptózy buněk hematopoetického buněčného systému, například lymfocytů. byl o to překvapivější, že existence receptorú NMDA mimo centrální nervový systém nebyla dosud prokázána. V důsledku toho nebylo také pro pracovníky v oboru možné usuzovat z ochrany nervových buněk Flupírtinem na obranu buněk hematopoetického buněčného systému.

Jako další onemocnění, která mohou být profylakticky a terapeuticky ošetřována na základě působení flupirtinu podle vynálezu lze například jmenovat:

neutropenie/lymfocytopenie vyvolané léčivy (jako cytostatiky, kortikosteroidy), jedy, zářením a jinými nemocemi léčivy nebo infekcemi (například HIV) vyvolané thrombocytopcnie.

Flupirtin může být k profylaxi a léčení podáván o sobě známým způsobem ve formách, jako jsou tablety, tablety povlečené filmem, tvrdé želatinovc kapsle, měkké želatinové kapsle, pelety, granuláty, dražé, čípky, mikrokapsle, vodné nebo olejové suspenze, olejové roztoky, injekční roztoky k intramuskulární aplikaci, injekční roztoky k inlravcnosní aplikaci.

Vhodnými solemi pro výrobu léčiv jsou všechny fyziologicky vhodné soli flupirtinu. V úvahu připadají například hydrochlorid. maleát, sulfát a glukonat flupirtinu.

Obsah flupirtinu ve farmaceutických prostředcích podle vynálezu je 0,1 mg až 3000 mg, s výhodou 10 mg až 500 mg. Jednotlivé dávky léčiv mohou být podávány denně 1 až 5x, s výhodou 1 až 3x.

Dávkové údaje se vztahují vždy k flupirtinu jako základu. Použijí-li se soli flupirtinu. musejí sc připočítat na molekulové hmotnosti.

Farmaceuticky a galonicky se se sloučeninami podle vynálezu zachází obvyklými o sobě známými způsoby. Například se Flupirtin a nosiče a pomocné látky míšením dobře zhomogenizují. přičemž se s výhodou pracuje při teplotách 20 až 80 °C s výhodou 20 až 50 °C. Zkoumaly sc lymfocyty dvanácti infikovaných pacientů a osmi zdravých jedinců. Udány jsou střední hodnoty a směrodatné odchylky.

Průmyslová využitelnost

Flupirtin nebo jeho soli pro výrobu farmaceutických prostředků k profy laxi a k terapii onemocnění souvisejících s poškozováním a hematopoetického buněčného systému, například lymfocytů zvláště v případě pacientů infikovaných HIV.

-6CZ. 2981B6

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

5 1, Použití flupirtinu nebo jeho farmaceuticky přijatelných solí k přípravě léčiv k ošetřování nemocí souvisejících s poškozováním hematopoetického buněčného systému, přičemž léčivo brzdí apoptózovou smrt buněk hematopoetického buněčného systému.
2. Použití účinné látky flupirtinu nebo jeho farmaceuticky použitelných solí podle nároku I io k přípravě léčiv pro ošetřování pacientů infikovaných H1V/AIDS.
3, Použití podle nároku 1 flupirtinu nebo jeho soli v kombinaci s farmaceuticky vhodnými nosiči a/nebo s pomocnými látkami pro příslušné formy použití.

3 výkresy

CZ. ZVflll? 150

-8CZ 29811S tíb pg/ml obr. 2